JP2022553415A - 触媒抗体３８ｃ２に関する新規共役化学 - Google Patents

触媒抗体３８ｃ２に関する新規共役化学 Download PDF

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Abstract

本発明は反応性リジン残基（Ｌｙｓ９９）のアリール化による改変触媒抗体３８Ｃ２を提供する。Ｌｙｓ９９残基は、メチルスルホンフェニルオキサジアゾール（ＭＳ－ＰＯＤＡ）などのヘテロアリールメチルスルホニル化合物でアリール化される。また本発明は、メチルスルホニル化合物を介して３８Ｃ２に部位特異的に結合した化学物質部分を含む抗体結合化学物質（例えば、抗体薬剤複合体）を提供する。さらに本発明は、抗体結合化学物質を作成する方法および抗体結合化学物質の治療用途を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月２３日に出願された米国仮特許出願番号第６２／９２５，０５１号に基づく優先権の利益を主張する。その優先出願の開示内容全体が参照としていかなる観点からも本出願に組み入れられる。
政府援助についての説明
本発明は米国国立衛生研究所により授与された助成金番号ＣＡ１７４８４４の下で政府援助によってなされたものである。連邦政府は本発明において一定の権利を有している。
抗体低分子物質複合体は、基礎研究および疾患の診断と治療に広く用いられている。例えば、食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可され、現在市場化されている治療用抗体低分子物質複合体としては、５種類の抗体薬剤複合体および１種類の放射性免疫複合体が挙げられる。これらはいずれも部位特異的生体共役反応方略によって抗体と低分子物質を複合体化させたものではないが、近年、天然または工学的に改変した、固有の反応性を有するアミノ酸または炭水化物を利用することにより高度に均一な抗体低分子物質複合体が得られるようになっている。分子的に明確な抗体低分子物質複合体構築物の製造および利用を容易なものとすることにより、抗体低分子物質複合体は豊富な前臨床および臨床パイプラインを背景として最先端試薬となっている。
触媒抗体３８Ｃ２の活性部位に存在し、固有の反応性を示すリジン残基（Ｌｙｓ９９）を基盤として、触媒抗体３８Ｃ２およびそのヒト化型であるｈ３８Ｃ２は、高度に均一な抗体低分子物質複合体の構築に関する生体共役反応モジュールとして利用されている。Ｌｙｓ９９は深い疎水性ポケットの底に存在する。表面に存在するＬｙｓ残基とは異なり、Ｌｙｓ９９は生理的ｐＨで脱プロトン化されており高い求核性を有する。求電子性β－ジケトンまたはβ－ラクタム基で誘導体化された低分子物質であって、埋もれたＬｙｓ９９残基のε－アミノ基と共にそれぞれエナミノンまたはアミド付加物を生成する低分子物質は、部位特異的共有結合性共役反応に利用されている。低分子物質にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の薬物動態特性および薬力学的特性を付与する目的の生体共役反応モジュールとしてｈ３８Ｃ２を利用する、化学的にプログラムされた抗体は、既に第Ｉ相および第ＩＩ臨床試験において試験が行われている。さらに、Ｔ細胞誘導性二重特異性抗体は、細胞表面受容体を標的とする低分子物質を免疫療法の効力と結びつけるために、ｈ３８Ｃ２生体共役反応モジュールを備えている。最後に、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）を基盤とする抗体薬剤複合体（ＡＤＣ）では、穏和な条件下で、高細胞傷害性ペイロードに対して迅速、正確、効率的かつ安定した共役反応を行うための生体共役反応モジュールとして、ｈ３８Ｃ２を利用している。
それにもかかわらず、より低分子の化学物質および分子に対する抗体共役反応に関しては、代替法およびより良好な手段についての満たされていないニーズが存在する。本発明は、当該技術分野におけるこのニーズおよびその他のニーズを対象とする。
一局面においては、本発明は修飾または官能基化された触媒抗体３８Ｃ２分子を提供する。これらの改変型抗体では、反応性リジン残基Ｌｙｓ９９がアリール化されている。好ましくは、改変型３８Ｃ２抗体はヒト化３８Ｃ２（ｈ３８Ｃ２）に由来する。典型的には、Ｌｙｓ９９残基はヘテロアリールメチルスルホニル化合物でアリール化される。いくつかの実施形態においては、アリール化に利用するヘテロアリールメチルスルホニル化合物は、メチルスルホンフェニルオキサジアゾール（ＭＳ－ＰＯＤＡ）である。
別の一局面においては、本発明は抗体化学物質共役化合物を提供する。これらの化合物は、ヘテロアリールメチルスルホニル化合物リンカーを介して３８Ｃ２抗体の反応性残基Ｌｙｓ９９に結合した化学物質部分を含む。好ましくは、抗体化学物質複合体を作成するための触媒抗体３８Ｃ２はヒト化３８Ｃ２である。いくつかの実施形態においては、利用する３８Ｃ２抗体はＩｇＧ１またはＦａｂである。いくつかの実施形態においては、抗体３８Ｃ２に対する共役反応の前に、化学物質部分をヘテロアリールメチルスルホニル化合物で誘導体化する。これらの実施形態のいくつかにおいては、化学物質部分を誘導体化するヘテロアリールメチルスルホニル化合物は、メチルスルホンフェニルオキサジアゾール（ＭＳ－ＰＯＤＡ）である。
いくつかの実施形態においては、共役化合物の化学物質部分は薬剤部分または細胞傷害剤である。これらの実施形態のいくつかにおいては、複合体の薬剤部分はＭＭＡＦである。本発明の別のいくつかの抗体化学物質複合体においては、化学物質部分は標的化部分である。これらの実施形態のいくつかにおいては、標的化部分は葉酸またはＬＬＰ２Ａである。
本発明の一部の抗体化学物質複合体は、二重可変ドメイン抗体薬剤複合体（ＤＶＤ－ＡＤＣ）である。これらの実施形態のいくつかにおいては、第２の改変型ドメインは、腫瘍抗原またはマーカー（例えば、ＨＥＲ２）を特異的標的とする。
いくつかの関連する実施形態においては、本発明は、本明細書中に記載の有効量の抗体化学物質複合体、および任意選択的に、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。他のいくつかの実施形態においては、本発明は、対象の癌を治療する方法を提供する。該方法は、本発明の医薬品組成物を治療が必要な対象に投与することを含む。これらの方法に用いる医薬組成物中の抗体化学物質複合体は、腫瘍を標的とするＤＶＤ抗体薬剤化合物であってもよく、ここで該化合物は、化学物質が薬剤部分または細胞傷害性分子である抗体化学物質複合体、あるいは本明細書に記載の化学的にプログラムされた抗体である。
別の一局面においては、本発明は化学物質を触媒抗体３８Ｃ２に結合させる方法を提供する。該方法は：
（ａ）誘導体化化学物質を生成するために該化学物質をヘテロアリールメチルスルホニル化合物と反応させること；
および
（ｂ）該誘導体化化学物質を触媒抗体３８Ｃ２と反応させて、化学物質と触媒抗体３８Ｃ２とを結合させること、
を含む。いくつかの方法においては、利用する該化学物質は薬剤部分または標的化部分である。これらの方法の一部においては、該化学物質は低分子物質または核酸物質である。
本発明の趣旨と利点は、本明細書の残りの部分および特許請求の範囲を参照することによってさらに詳細に理解することができる。
触媒抗体ｈ３８Ｃ２中の反応性Ｌｙｓ残基のヘテロアリール化。（Ａ）Ｌｙｓ９９のε－アミノ基とＭＳ－ＰＯＤＡとの反応であって、穏和な条件下の提案される反応。その両側のＣｙｓ残基およびトレオニン（Ｔｈｒ）残基の側鎖をそれぞれＲ１およびＲ２とする。（Ｂ）ｈ３８Ｃ２の疎水性ポケット（ボックス）に存在するＰＯＤＡ結合Ｌｙｓ９９のインシリコ・ドッキングモデル。Ｆａｂ’の重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）を青色、軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）を緑色で示す。原子間距離（Å単位）は、ＰｙＭＯＬソフトウェアで算出した。 ｈ３８Ｃ２のＬｙｓ９９に対するＭＳ－ＰＯＤＡの部位特異的共役反応。（Ａ）この研究に用いたフルオレセインのＭＳ－ＰＯＤＡ誘導体（化合物１）およびＴＡＭＲＡのβ－ラクタムハプテン誘導体（化合物２）の構造。（Ｂ）未精製のフルオレセイン結合およびＴＡＭＲＡ結合（５当量）ｈ３８Ｃ２（「Ｌｙｓ」）、ならびにｈ３８Ｃ２＿Ｌｙｓ９９Ａｌａ（「Ａｌａ」）ＩｇＧ１を、非還元条件下または還元性条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、クマシーブルー染色およびゲル内蛍光で分析した。（Ｃ）還元し、脱グリコシル化した（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）非複合体型（左）および化合物１結合型（右）ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析。非複合体型の重鎖および軽鎖の予想質量は、それぞれ４９４６０および２３９５５Ｄａであった。化合物１結合型の重鎖の予想質量は５００５５Ｄａであった。３４７８１ＤａのピークはＰＮＧａｓｅ Ｆに対応する。（Ｄ）化合物１に対する共役反応前および後の、ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１の触媒活性。検出可能な蛍光アルデヒド（相対蛍光単位（ＲＦＵ））およびアセトンへと変換される、メタドールのレトロアルドール変換を利用して、非複合体型（●）および複合体型（■）抗体（１μＭ）を測定した。複合体化したｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１の触媒活性は完全に消失し、２つの反応性Ｌｙｓ残基に関する定量的共役反応が明らかとなった。３回の平均±標準偏差（ＳＤ）の値をプロットした。 フルオレセインのＭＳ－ＰＯＤＡ誘導体とｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１との間の複合体の、ヒト血漿内安定性。ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１を化合物１と結合し、３７℃でヒト血漿と共に０日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、および８日間インキュベートした；これらを、還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥ後に、クマシーブルー染色（上）およびゲル内蛍光（下）で分析した。ＨＳＡ、ヒト血清アルブミン；ＨＣ、重鎖；ＬＣ、軽鎖。 ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１の化学プログラミング。（Ａ）この研究に用いた、葉酸（化合物３）およびＬＬＰ２Ａ（化合物４）のβ－ラクタムハプテン誘導体の構造、ならびに葉酸（化合物５）およびＬＬＰ２Ａ（化合物６）のＭＳ－ＰＯＤＡ誘導体の構造。（Ｂ）（左）５当量の化合物２～６に対する共役反応前および後の、ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１（１μＭ）の触媒活性（３回の平均±ＳＤ）。（右）１当量、２当量、および５当量の化合物３および５に対する共役反応前および後の、ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１（１μＭ）の触媒活性（３回の平均±ＳＤ）。 化学的にプログラムされたｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１の結合試験。（Ａ）β－ラクタムハプテン（化合物３）またはＭＳ－ＰＯＤＡ（化合物５）を介して葉酸を結合したｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１のＥＬＩＳＡ。組換えヒトＦＯＬＲ１を含むＴＢＳをコーティングに用いた；３％（ｖ／ｖ）脱脂粉乳を含むＴＢＳをブロッキングに用いた；およびＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＦｃγ特異的断片ｐＡｂを検出に用いた。複合体化していないｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１を陰性対照として用いた（３回の平均±ＳＤ）。（Ｂ）ＦＯＬＲ１陽性ヒトＩＧＲＯＶ－１細胞および染色用のＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ特異的ｐＡｂを用いた、同抗体複合体および陰性対照のフローサイトメトリー分析。（Ｃ）β－ラクタムハプテン（化合物４）またはＭＳ－ＰＯＤＡ（化合物６）を介してＬＬＰ２Ａを結合したｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１のＥＬＩＳＡ。１ｍＭのＭｎＣｌ２を添加したＴＢＳ中の組換えヒトインテグリンα４β１をコーティングに用い（３回の平均±ＳＤ）、（Ａ）に記載のようにＥＬＩＳＡを実施した。（Ｄ）１ｍＭのＭｎＣｌ２存在下でインテグリンα４β１陽性ヒトＪｕｒｋａｔ細胞を用いた、同抗体複合体および陰性対照のフローサイトメトリー分析。細胞は（Ｂ）と同様に染色した。 ＤＶＤ－ＡＤＣの構築と特徴付け。（Ａ）この研究に用いた、ＭＭＡＦのβ－ラクタムハプテン誘導体（化合物７）およびＭＭＡＦのＭＳＰＯＤＡ誘導体（化合物８）の構造。（Ｂ）５当量の化合物８に対する共役反応前および後の、ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１（１μＭ）の触媒活性（３回の平均±ＳＤ）。（Ｃ）還元し、脱グリコシル化した（ＰＮＧａｓｅ Ｆ） 化合物８結合抗ＨＥＲ２ ＤＶＤ－ＩｇＧ１のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析。非複合体型の重鎖および軽鎖の予想質量は、それぞれ６３８７８および３６１７５Ｄａであった。化合物８結合型の重鎖の予想質量は６４９８０Ｄａであった。３４７８１ＤａのピークはＰＮＧａｓｅ Ｆに対応する。（Ｄ）ＨＥＲ２陽性ヒトＳＫ－ＢＲ－３およびＫＰＬ－４細胞、ならびにＨＥＲ２陰性ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と共に３７℃で７２時間インキュベートした後の、細胞傷害性に関する化合物７結合抗ＨＥＲ２ ＤＶＤ－ＩｇＧ１（■）と化合物８結合抗ＨＥＲ２ ＤＶＤ－ＩｇＧ１（●）との間の比較。非複合体型抗ＨＥＲ２ ＤＶＤ－ＩｇＧ１（◆）を陰性対照として用いた。３回の平均±ＳＤの値をプロットした。 ＰＯＤＡ結合Ｌｙｓ９９のインシリコ・ドッキングモデルにおける低分子物質－抗体相互作用。ｈ３８Ｃ２＿Ａｒｇ Ｆａｂ（ＰＤＢ ＩＤ ６Ｕ８５）の結晶構造を出発点として、Ａｒｇ９９をアジド－（ＰＥＧ）４－ＰＯＤＡ誘導体化Ｌｙｓ残基で置換し、インシリコでエネルギー最小化について調べた。低分子物質－抗体相互作用は、それぞれＶＨまたはＶＬ残基への相互作用に関する積み重ね棒グラフとして示される４種類の相互作用に分類される。積み重ね棒グラフは、特異的相互作用が維持されるシミュレーション時間１００％に対応する１．０の値を有する軌道の経路全体について正規化を行ったものである。ＶＨのＴｙｒ１０１およびＶＬのＴｙｒ１０１は、１．０を超える値を有するが、理由はそれらが多重接触するためである。 非還元抗ＨＥＲ２ ＤＶＤ－ＡＤＣの質量分析。脱グリコシル化した（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）非還元の非複合体型（Ａ）および化合物８結合型（Ｂ）抗ＨＥＲ２ ＤＶＤ－ＩｇＧ１のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析。非複合体型ＤＶＤ－ＩｇＧ１の予想質量は２００，１０６Ｄａであった。化合物８結合型のＤＶＤ－ＩｇＧ１の予想質量は２０２，３１０Ｄａであった。
低分子物質の部位特異的結合について固有の反応性を示すリジン残基（Ｌｙｓ９９）を活用することにより、化学的にプログラムされた抗体および抗体薬剤複合体の構築には、ヒト化触媒抗体ｈ３８Ｃ２が生体共役反応モジュールとして用いられてきた。β－ラクタムで官能基化された低分子物質でｈ３８Ｃ２を処理すると、共有結合性共役反応が起こり、それによってＬｙｓ９９残基のε－アミノ基と安定なアミド結合が選択的に形成されることが、以前に明らかにされている。
本発明は部分的には、ペイロード官能基化についてさらなる選択肢を提供する目的で本発明者らが行った代替的共役化学の研究に基づく。本明細書中で詳細に説明するように、本発明者らは、ｈ３８Ｃ２の複合体化のために薬剤または低分子化合物を官能基化する目的でヘテロアリールメチルスルホンを利用し、そのような代替的な共役化学によって、従来のマレイミド共役反応に比較して血清中での高安定性が付与されるか否かについて検討した。ｈ３８Ｃ２の埋もれたＬｙｓ９９残基のε－アミノ基およびヘテロアリールメチルスルホンによって官能基化された低分子物質は適合性電子対供与体／受容体系を提供する、という仮説を本発明者らは立てた。そこで、本発明者らは、そのような生体物質複合体の効率、部位特異的性、および安定性について分析を行った。メチルスルホンオキサジアゾール誘導体を用いたＬｙｓのアリール化によって生成した化学的にプログラムされた抗体およびＡＤＣとβラクタム誘導体を用いたＬｙｓのアミド化によって生成した化学的にプログラムされた抗体およびＡＤＣとを、機能アッセイで直接比較した。葉酸、ＬＬＰ２ＡおよびＭＭＡＦの共役反応によって本明細書中に例示するように、それらの研究によって、この代替的生体共役反応方略の実用性、多用途性、および有用性が実証された。
現在のところ：
（ｉ）化学的にプログラムされた抗体、二重特異性抗体、およびキメラ抗原受容体；
ならびに
（ｉｉ）抗体薬剤複合体および抗体ｓｉＲＮＡ複合体、に関しては、ｈ３８Ｃ２の治療用途すべてにおいて、β－ラクタムハプテンを基盤とする共役反応が必要である。代替的な共役化学を提供することによって、本発明は、アクセス可能なペイロード空間をさらに拡張する。例えば、β－ラクタムハプテンを基盤とする共役化学には適合しないペイロードが、ヘテロアリールメチルスルホニルの官能性には適合することがあり得る。
本発明をさらに詳細に説明する前に、本発明が記載の特定の局面のみに限定されるものではなく、当然、変更変形はあり得るものだということを理解されたい。本明細書中の専門用語は、特定の局面のみを説明する目的であって、限定することを意図するものではないことも理解されたい。本発明の範囲は、付属の特許請求項によってのみ限定される。
値の範囲を示す場合には、その範囲の上限値と下限値との間の、（文脈がそうでないことを明確に示すのではない限り）下限値の単位の１０分の１までの各中間値、および言及されたその範囲内に存在する他の言及された値または中間値は、本発明に含まれることを理解されたい。これらの小範囲の上限値と下限値は、おのおのが独立にその小範囲に含まれてもよく、言及される範囲内で特に除外される限界値を除き、それらもまた本発明内に包含される。言及される範囲が一方または両方の限界値を含む場合は、含まれるそれらの限界値の一方または両方を除外した範囲もまた本発明に含まれる。
本明細書において、特定の範囲は、用語「約（ａｂｏｕｔ）」に続く数値で提示される。用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、本明細書において、それに続く数字の文字通り正確な数字、ならびに該用語に続く数字に近似またはおおよその数字を提示するために用いられる。ある数字が具体的に言及された数に近似またはおおよその数字であるか否かを判定する際に、言及されてはいない、近似またはおおよその数字は、それが提示されている文脈において、具体的に言及される数字と実質的に等価物をもたらす数字であってもよい。
本明細書に引用のすべての公表物および特許は、あたかもそれぞれ個々の公表物または特許が具体的かつ個別に参照として本明細書の一部を構成するが如く本明細書に参照として組み入れられ、また引用される公表物に関連する方法および／または材料を開示および説明するために参照として本明細書に組み入れられる。いずれの公表物の引用も、出願日に先立つそれらの開示に関するものであり、先行発明を理由としてそのような公表物に先行するものである権利が与えられないことの承認と解釈すべきではない。さらに、示した公表物の日付は、実際の公表日と異なる可能性もあり、個別に確認する必要もあり得る。
本発明の実施においては、特に明記されていない限り、当該分野における技術に含まれる分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を利用することができる。そのような技術は、文献において詳細に説明されている。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２８９巻：固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｊ． Ｎ． Ａｂｅｌｓｏｎ， Ｍ． Ｉ． Ｓｉｍｏｎ， Ｇ． Ｂ． Ｆｉｅｌｄｓ （編集）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； 第１版 （１９９７） （ＩＳＢＮ－１３： ９７８－０１２１８２１９０６）；米国特許第４，９６５，３４３号および第５，８４９，９５４号；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ． Ｙ．，（第３版、２０００）；Ｂｒｅｎｔら、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （ｒｉｎｇｂｏｕ、編集 ２００３）；Ｂａｒｂａｓら、ファージディスプレイ：実験室マニュアル（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）， ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ （２００４）；Ｄａｖｉｓら、分子生物学の基礎的方法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ（１９８６）；酵素学の方法：分子クローニング技術の指針（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）， １５２巻， Ｓ． Ｌ． ＢｅｒｇｅｒとＡ． Ｒ． Ｋｉｍｍｅｒｌ、編集， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＵＳＡ （１９８７）；蛋白質科学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＣＰＰＳ））（Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎら、編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）；細胞生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＣＰＣＢ））（Ｊｕａｎ Ｓ． Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら、編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）；動物細胞の培養：基礎的技術と特定用途に関するマニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）， Ｒ． Ｉａｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（第７版、２０１５）； および動物細胞培養法（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ）， Ｊｅｎｎｉｅ Ｐ． Ｍａｔｈｅｒ およびＤａｖｉｄ Ｂａｒｎｅｓ、編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（第１版、１９９８）を参照のこと。以下の節は、本発明の組成物および方法の実施に関する指針を提供する。
本開示を読めば当業者には明白なことであるが、本明細書中に説明および例示される個々の局面のそれぞれが、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、容易に分離することのできる、または他の複数の局面のいずれかの特徴と組み合わせることのできる個別の要素および特徴を有している。提示されるいずれの方法も、示される手順または論理的に可能である任意の順序で実施することができる。本明細書中に記載のものと類似および同等の、いずれの方法および材料も、本発明の実施または試行に利用することができるが、代表的な例示的方法および材料を以下に説明する。
他で特段に明示しない限り、本明細書中で用いる技術用語および科学用語はいずれも、本発明が含まれる技術分野の当業者に通常理解されるものと同一の意味を有する。以下の参考文献は、本発明において用いる用語の多くのものについて、一般的定義を当業者に提供する：アカデミック出版局科学技術辞典（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｍｏｒｒｉｓ（編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（第１版、１９９２）；オックスフォード生化学および分子生物学辞書（Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｓｍｉｔｈら（編集）、オックスフォード大学出版局（改訂版、２０００）；化学エンサイクロペディア辞書（Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｋｕｍａｒ（編集）、Ａｎｍｏｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｐｖｔ． Ｌｔｄ． （２００２）；微生物学および分子生物学辞書（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら（編集）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（第３版、２００２）；化学辞書（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｈｕｎｔ（編集）、Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（第１版、１９９９）；医薬辞書（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、Ｎａｈｌｅｒ （編集）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；有機化学辞書（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ＫｕｍａｒとＡｎａｎｄａｎｄ（編集）、Ａｎｍｏｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｐｖｔ． Ｌｔｄ．（２００２）；および生物学辞書（Ａ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｐａｐｅｒｂａｃｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）、ＭａｒｔｉｎとＨｉｎｅ（編集）、オックスフォード大学出版局（第４版、２０００）。これらの用語を具体的に本発明に用いる場合には、その一部については本明細書中で詳細な説明をさらに示す。
本明細書および付属の特許請求の範囲で用いる、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」については、文脈が明確にそうではないことを示すのではない限り、複数への参照をも含むことに留意されたい。特許請求の範囲はいかなる任意選択的要素も排除するように起草され得ることにも留意されたい。すなわち、この表現は、請求要素の言及に関連する「専ら（ｓｏｌｅｌｙ）」、「唯一（ｏｎｌｙ）」などの排他的な用語の使用または「否定的」限定の使用のための先行詞となることが意図されている。
本明細書で同義語として用いられる用語「免疫グロブリン」または「抗体」は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から成る基本的な４本鎖のヘテロ四量体糖蛋白質を指す。各Ｌ鎖は１つのジスルフィド共有結合で１本のＨ鎖に連結されるが、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに依存して１つ以上のジスルフィド結合で互いに連結される。各Ｈ鎖およびＬ鎖はＮ末端およびＣ末端を有しており、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有している。各Ｈ鎖はＮ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）が続く。各Ｌ鎖はＮ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その後に１つの定常ドメイン（ＣＬ）が続く。ＶＬはＶＨと並列し、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と並列する。特定のアミノ酸残基が、Ｌ鎖およびＨ鎖の可変ドメイン間の境界面を形成すると考えられている。１つのＶＨと１つのＶＬとが対合して、単一抗原結合部位を形成する。
いずれの脊椎動物種のＬ鎖も、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる明確に異なる２種類のうちのいずれか１つに分類することができる。重鎖（ＣＨ）定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンを、異なるクラスまたはアイソタイプに分類することができる。免疫グロブリンには５つのクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、それぞれがα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる重鎖を有する。γおよびαのクラスは、ＣＨ配列と機能の比較的わずかな差異に基づいて、さらにサブクラスに分類される；例えば、ヒトは以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２。
免疫グロブリンの「可変領域」または「可変ドメイン」は、免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖のＮ末端ドメインを指す。Ｈ鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と呼ばれることもある。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と呼ばれることもある。これらのドメインは一般的に免疫グロブリンのうちで最も可変性のある部分であり、抗原結合部位を含む。
用語「可変」は、可変ドメインの特定のセグメントは免疫グロブリン間で配列が大きく異なるということを意味する。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、特定免疫グロブリンの特定抗原に対する特異性を規定する。しかし、その最も可変性のあるドメインの１１０アミノ酸の列びにわたって、可変性が均一に分布するわけではない。それよりもむしろ、Ｖ領域はフレームワーク領域と呼ばれる１５～３０アミノ酸の比較的不変の領域（ＦＲ）から成るが、これらはそれぞれ、「超可変領域」と呼ばれる極端に可変性であるより短い９～１２アミノ酸の領域で隔てられている。天然のＨ鎖とＬ鎖の可変ドメインはそれぞれ、主にβシート構造をとる４つのＦＲであって、該βシート構造に連結するループを形成し、時には該βシート構造の一部を成すこともある３つの超可変領域と連結する４つのＦＲから成る。各鎖の超可変領域はＦＲによって他の鎖の超可変領域と互いに近接し、免疫グロブリンの抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、免疫学的に興味深い蛋白質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは直接的には免疫グロブリンの抗原結合に関与しないが、多様なエフェクター機能を示す（免疫グロブリンの抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）への関与など）。
「無損傷の」免疫グロブリンは、抗原結合部位ならびにＣＬおよび少なくともＨ鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であってもよい。無損傷の免疫グロブリンは、１種類以上のエフェクター機能を有し得る。
本明細書に記載の目的に利用する「裸の免疫グロブリン」は、薬剤部分に結合していない免疫グロブリンである。
「免疫グロブリン断片」は、無損傷の免疫グロブリンの一部、好ましくは無損傷の免疫グロブリンの抗原結合領域または可変領域を含む。免疫グロブリン断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体；線状免疫グロブリン（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２［１９９５］を参照のこと）；一本鎖免疫グロブリン分子；および免疫グロブリン断片から形成される多重特異性免疫グロブリンが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリン断片は、すべての可能な代替断片形態を含む。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリン断片は二重特異性であってもよい。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリン断片は二重パラトープであってもよい。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリン断片は三重特異的であってもよい。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリン断片は多量体であってもよい。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリン断片は無損傷の免疫グロブリンの抗原結合部位を含み、したがって抗原に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリン断片は抗原に結合する能力を有する単一可変ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリン断片は、活性、特性、薬物動態学的挙動およびインビボ効力を調整するためにさらに改変される（ペプチド付加、ペグ化、ヘシル化、グリコシル化などであるが、これらのみに限定されるものではない）。
免疫グロブリンをパパイン消化することにより、２つの同一な抗原結合断片が生成するが、これを「Ｆａｂ」断片と呼ぶ；残りのものは「Ｆｃ」断片であるが、容易に結晶化し得ることに因んでこのように命名された。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖（ＶＨ）可変領域ドメインおよび１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）ならびに完全長のＬ鎖から成る。各Ｆａｂ断片は抗原結合について一価であり、すなわち単一抗原結合部位を有する。免疫グロブリンをペプシン処理すると単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が得られるが、これは大雑把に言えば２価の抗原結合活性を有するジスルフィドによって架橋された２つのＦａｂ断片に対応し、抗原結合能を保持している。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の付加的な残基（免疫グロブリンヒンジ領域の１つ以上のシステインを含む）を有していることにおいて、Ｆａｂ断片と異なる。本明細書中では、Ｆａｂ’－ＳＨは定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’を意味する。Ｆ（ａｂ’）２免疫グロブリン断片は元来、Ｆａｂ’断片の対として作成されたものであり、両者間のヒンジシ部を繋ぐシステインを有している。そのほかにも免疫グロブリン断片の化学結合が知られている。
Ｆｃ断片は、ジスルフィドで互いに連結された２つのＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。免疫グロブリンのエフェクター機能はＦｃ領域の配列によって決まるが、この領域は特定種類の細胞上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）が認識する部分でもある。
「Ｆｖ」は完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小免疫グロブリン断片である。この断片は１つの重鎖と１つの軽鎖の可変領域ドメインの非共有結合性の強固な会合によって生じる二量体から成る。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種においては、１つの重鎖と１つの軽鎖の可変領域ドメインを柔軟なペプチドリンカーによって共有結合で連結することも可能であり、二本鎖Ｆｖ種の構造と類似した「二量体」構造で軽鎖と重鎖が会合し得る。これら２つのドメインの折りたたみによって、６つの超可変ループ（Ｈ鎖およびＬ鎖のそれぞれから３ループ）が生ずるが、これらは抗原結合のためのアミノ酸残基を免疫グロブリンに提供し抗原結合特異性を付与する。しかし、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、典型的には完全な結合部位よりも親和性は劣るが、抗原認識能および抗原結合能を有している。本明細書中においてＤＶＤ免疫グロブリン分子に言及する場合には、用語「Ｆｖ」は重鎖および軽鎖の第１および第２の可変ドメインの両方を含む結合断片を指す。
「一本鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略されるが、これは免疫グロブリンのＶＨおよびＶＬドメインを連結することによって生成する単一ポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合について所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの総説に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、モノクローナル抗体の薬理学（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇとＭｏｏｒｅ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）；および、抗体工学（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編集、オックスフォード大学出版局（１９９５）を参照のこと。本明細書中においてＤＶＤ免疫グロブリン分子に言及する場合に、用語「ｓｃＦｖ」は重鎖および軽鎖の第１および第２の可変ドメインの両方を含む結合断片を指す。
本明細書中の「二重可変ドメイン（ＤＶＤ）化合物」または「二重可変ドメイン（ＤＶＤ）免疫複合体」は、免疫グロブリンの第１および第２の可変ドメイン（ＦａｂなどのＩｇの抗原結合断片を含む）およびリンカーを介して第２の可変ドメインに共有結合した薬剤部分を有する化合物を指す。本明細書中の用語「二重可変ドメイン免疫グロブリン」または「ＤＶＤ－Ｉｇ」は、免疫グロブリン分子であって、そのＨ鎖およびＬ鎖の両方が第１の可変ドメインに隣接する第２可変ドメインを含む、免疫グロブリン分子を指す。ＤＶＤ－ＩｇのＬ鎖はしたがって、以下のドメインのＮ末端からＣ末端までを含む：ＶＬ１－ＶＬ２－ＣＬ。ＤＶＤ－ＩｇのＨ鎖はしたがって、以下のドメインのＮ末端からＣ末端までを含む：ＶＨ１－ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３。ＶＬ１とＶＨ１とが共に対を成して第１の抗原結合部位を形成する。ＶＬ２とＶＨ２とが共に対を成して第２の抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態においては、本発明のＤＶＤ化合物は、Ｆａｂ断片などのＩｇの抗原結合断片である免疫グロブリン要素を含むＤＶＤ－Ｆａｂである。本発明の様々なＤＶＤ化合物を作成する一般的方法は、当該技術分野において報告がある；例えば、Ｎａｎｎａら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８：１１１２、２０１７。
他で特段に明示しない限り、用語「免疫グロブリン」または「抗体」は、具体的には天然のヒトおよび非ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＭ抗体（天然の変異体を含む）を含む。
用語「ポリペプチド」は、本明細書中では最も広義な意味で用いられ、ペプチド配列をも含む。用語「ペプチド」とは、一般的にはペプチド結合で共有結合により連結される最大約３０アミノ酸、好ましくは最大約６０アミノ酸を含むアミノ酸の直線状分子鎖のことである。
本明細書中の用語「モノクローナル」は、実質的に均一な免疫グロブリンの集団から取得した抗体または免疫グロブリン分子（例えば、ＤＶＤ Ｉｇ分子）を指す；すなわち、その集団を含む個々の免疫グロブリンは、さほど多くない量で存在し得る天然の可能な変異を除外すれば、同一である。モノクローナルな免疫グロブリンは、高度に特異的であり、単一抗原部位を標的とする。さらに、典型的には、異なる抗原決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル免疫グロブリンは抗原上の単一決定基を標的とする。修飾語「モノクローナル」は、免疫グロブリンの実質的に均一な集団から取得されるという免疫グロブリンの特徴を示すものであって、特定の方法によって抗体を作成することを必要とすると解釈すべきではない。例えば、本発明に準拠するモノクローナル免疫グロブリンは、ＫоｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５）が最初に報告したハイブリドーマ法によって作成することもできるが、あるいは組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作成することもできる。
本明細書中のモノクローナル免疫グロブリンは、具体的には「キメラ」免疫グロブリンを含み、ならびに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片をも含むが、「キメラ」免疫グロブリンとは、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の生物種に由来する抗体の対応する配列と同一または相同的であり、該鎖の残りの部分が別の生物種に由来する抗体の対応する配列と同一または相同的である抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５）。
非ヒト（例えば、齧歯類、例えば、マウスおよびウサギ）免疫グロブリンの「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む免疫グロブリンである。ヒト化免疫グロブリンはほとんどの部分においてヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であるが、ヒト化免疫グロブリンでは、レシピエントの超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性、および最大結合数を有する、非ヒト生物種（ドナー抗体）（マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ニワトリ、ウシまたは非ヒト霊長類など）の超可変領域の残基で置換されている。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基も対応する非ヒト型残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体はレシピエント抗体にもドナー抗体にも存在しない残基を含んでいることもある。これらの改変を加えるのは、抗体の性能をさらに高めるためである。一般には、ヒト化免疫グロブリンは、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的にすべて含み、ここで、すべてまたは実質的にすべての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、かつ、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域に対応する。ヒト化免疫グロブリンは、任意選択的に免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃも含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、（１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９；および、Ｐｒｅｓｔａ （１９９２） Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：５９３－５９６を参照のこと。
本明細書中の用語「ヒト免疫グロブリン」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する免疫グロブリンを含むことが意図される。本発明のヒト免疫グロブリンは、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダム突然変異または部位特異的突然変異誘発により、あるいはインビボの体細胞突然変異により導入した変異）を、例えばＣＤＲおよび特にＣＤＲ３に含み得る。しかし、本明細書中の用語「ヒト免疫グロブリン」は、他の哺乳動物種（マウスなど）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に導入されている免疫グロブリンを含むことは意図されていない。
本明細書において、「単離した」免疫グロブリンとは、組換え宿主細胞中のその自然な環境の要素から識別され分離されている、および／または回収されている。免疫グロブリンの自然的環境からの混入成分は、免疫グロブリンの診断または治療における利用を妨げ得る物質であり、酵素、ホルモン、およびその他の蛋白質性または非蛋白質性溶質、ならびに免疫グロブリンの作成中に生成する望ましくない副産物を含むことがある。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の免疫グロブリンであって単離した免疫グロブリンを：
（１）ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはＳＥＣ－ＨＰＬＣ法で判定する場合に、重量で９５％超、または重量で９８％超、または重量で９９％超に精製する；
（２）アミノ酸シーケンサーを利用して、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を明らかにするのに充分な程度に精製する；
または
（３）還元条件下のまたは非還元性条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥで、クマシーブルーあるいは、好ましくは、銀染色に基づいて均一になるまで精製する。通常、単離免疫グロブリンは少なくとも１工程の精製工程で調製される。
用語「特異的結合」または「に特異的に結合する」または「に対して特異的である」は、結合標的に対する結合部分の結合（標的抗原に対する免疫グロブリンの結合、例えば、特定ポリペプチド上、ペプチド上、またはその他の標的（例えば、糖蛋白質である標的）上のエピトープなど）を指し、非特異的相互作用（例えば、非特異的相互作用はウシ血清アルブミンまたはカゼインに対する結合であってもよい）とは明らかに異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子に対する結合と比較して、結合部分または免疫グロブリンの、標的分子に対する結合を判定することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似の対照分子、例えば、過剰の非標識標的、との競合によって判定することができる。この場合には、標識標的のプローブヘの結合が、過剰な非標識標的で競争的に阻害されれば、特異的結合が示唆される。本明細書中に説明されるような特定のポリペプチド標的上の特定ポリペプチドまたはエピトープについての、用語「特異的結合」または「に特異的に結合する」または「に対して特異的である」は、例えば、標的に関するＫｄであって、少なくとも約２００ｎＭ、あるいは少なくとも約１５０ｎＭ、あるいは少なくとも約１００ｎＭ、あるいは少なくとも約６０ｎＭ、あるいは少なくとも約５０ｎＭ、あるいは少なくとも約４０ｎＭ、あるいは少なくとも約３０ｎＭ、あるいは少なくとも約２０ｎＭ、あるいは少なくとも約１０ｎＭ、あるいは少なくとも約８ｎＭ、あるいは少なくとも約６ｎＭ、あるいは少なくとも約４ｎＭ、あるいは少なくとも約２ｎＭ、あるいは少なくとも約１ｎＭ以上のＫｄを有する分子によって示され得る。場合によっては、用語「特異的結合」は、分子が特定ポリペプチドに結合する、あるいは特定ポリペプチド上のエピトープに結合するが、他のいかなるポリペプチドまたはポリペプチドのエピトープにも実質的に結合しない、結合を指す。
「結合親和性」は、分子（例えば、免疫グロブリン）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の総計強度を指す。他で特段に明示しない限り、本明細書中の「結合親和性」は、結合ペア（例えば、免疫グロブリンと抗原）の構成員間の１：１相互作用を反映する固有結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表す。例えば、Ｋｄは、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭまたはそれよりも高強度であってもよい。親和性は、本明細書中に記載の方法を含む、当該技術分野において公知の通常の方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般的に、抗原にゆっくりと結合し容易に解離する傾向を示し、一方、高親和性抗体は一般的により高速に抗原に結合し、より長い間結合した状態を保つ傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が、当該技術分野において公知である。
本明細書中の「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、免疫グロブリンと標的のペアについて適切な技術により（例えば、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、例えば、固定化抗原ＣＭ５チップを備えたＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００またはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を用いて２５℃で）測定される解離定数を指す。
用語「複合体」、「結合した」、および「共役反応」は、任意および全ての形式の共有結合または非共有結合性結合を指し、直接的な遺伝子融合または化学的融合、リンカーまたは架橋剤を介した結合、および非共有結合性会合が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。
本明細書中の用語「融合」は、ヌクレオチドコード配列のインフレームの組み合わせによる１本のポリペプチド鎖中の、異なる起源のアミノ酸配列の組み合わせを指す。用語「融合」は、２つの末端のうちの一方への融合に加えて、内部融合、すなわち、ポリペプチド鎖内部への異なる起源の配列の挿入をも明示的に含む。本明細書中の用語「融合」は、異なる起源のアミノ酸配列の組み合わせを指す。
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンに特異的結合可能な分子決定基を含む。特定の局面において、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性である表面分子集団（アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなど）を含み、特定の局面においては、特異的な３次元構造特性、および／または特異的電荷特性を有することがある。エピトープは、免疫グロブリンが結合する抗原の領域である。「結合領域」は、結合分子が結合した結合標的上の領域である。
用語「標的」または「結合標的」は最も広義の意味で用いられ、具体的には、ポリペプチドを含むが、これのみに限定されるものではなく、核酸、炭水化物、脂質類、細胞、および自然に存在する時に生物学的機能を有する、または有していないその他の分子をも含む。
用語「抗原」は、免疫グロブリンに結合することのできる、あるいは細胞性免疫応答を惹起することのできるもの、またはその断片を指す。免疫原は、生物、具体的には動物、より具体的にはヒトを含む哺乳動物において免疫応答を惹起することのできる抗原を指す。用語「抗原」は、上記の定義のような、抗原決定基またはエピトープとして知られる領域を含む。
本発明の免疫グロブリンの「抗原結合部位」または「抗原結合領域」は典型的には、各可変ドメイン内の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であって、抗原に対する結合部位の親和性に様々な程度に寄与する相補性決定領域を含む。各可変ドメインには、３つの重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）および３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）が存在する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、抗体／抗原複合体の配列および／または構造情報における可変性にしたがって定義されているＣＤＲおよびＦＲ領域に関する収集アミノ酸配列データベースと比較することにより、判定される。より少ない数のＣＤＲから成る機能的抗原結合部位（すなわち、その場合には結合特異性が３つ、４つまたは５つのＣＤＲで決定される）もまた、本発明の範囲に含まれる。６ＣＤＲから成る完全なセットよりも少ない場合でも、一部の結合標的に対する結合では充分なものであり得る。したがって、１つのＶＨまたは１つのＶＬドメインのＣＤＲだけでも充分な場合もある。さらに、特定の抗体では、抗原に対してＣＤＲ非関連結合部位を有していることもある。そのような結合部位は、特に本定義の範囲に含まれる。
本出願中で用いられる用語「宿主細胞」は、本発明に準拠する免疫グロブリンを産生するように工学的に改変することのできる細胞系を意味する。一局面においては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を宿主細胞として用いる。いくつかの実施形態においては、大腸菌を宿主細胞として用いることもできる。
本明細書中においては、発現「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養」は、同義語として用いられ、そのような名称はいずれも子孫細胞をも含む。したがって、「形質転換細胞」および「形質転換した細胞」という言葉は、目的対象とする細胞および、継代数にかかわらずそれに由来する培養物を含む。全子孫細胞が、意図した変異または意図しない変異により、ＤＮＡの内容について全く同一でなくてよいことも、理解されたい。元々の形質転換細胞をスクリーニングした時と同一である機能または生物学的活性を有する変異子孫細胞も包含される。
核酸が他の核酸配列と機能的関係で配置される場合には、その核酸は「制御可能に連結されて」いる。例えば、あるポリペプチドが、その分泌に関する蛋白質前駆体として発現する場合には、プレ配列または分泌リーダーについてのＤＮＡが、そのポリペプチドのＤＮＡに制御可能に連結されている；ある配列の転写にプロモーターまたはエンハンサーが影響を与える場合には、そのプロモーターまたはエンハンサーはコード配列に制御可能に連結されている；あるいは、翻訳を促進するようにリボソーム結合部位が配置されている場合には、そのリボソーム結合部位はコード配列に制御可能に連結されている。一般的に、「制御可能に連結されている」は、連結されるＤＮＡ配列が連続したものであり、それが分泌リーダーの場合であれば、連続してかつリーディングフレームが合致していることを意味する。しかし、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、利用し易い制限酵素認識部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合には、通常の実施に準じて合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを利用する。
ペプチドまたはポリペプチド配列（すなわち、本明細書中で特定するｈ３８Ｃ２抗体のポリペプチド配列）に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列化し、必要に応じて、保存性置換についは配列同一性の一部と見なさず、最大配列同一性％を達成するためにギャップを導入した後の、特定ペプチドまたはポリペプチドの配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合（％）であると定義される。アミノ酸配列同一性（％）を評価する目的の配列整列化は、当該技術分野の技術範囲に含まれる各種の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピューターソフトウェアを用いて、実施することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最良の整列化を達成するために必要なアルゴリズムを含む、整列化を判定する適切なパラメータを決定することができる。
「治療する」または「治療」は、標的とする病態または障害を予防する、または緩徐にする（低減する）ことが目的である治療処置ならびに予防的方法または予防手段の両方を指す。治療を必要とする対象は、既に障害に罹患している対象ならびに障害に罹患し易い対象、または障害が予防されなければならない対象を含む。例えば、本発明の方法の目的とする免疫複合体を治療量で受容した後、その対象または哺乳動物が、下記の１種類以上について観察可能な、および／または測定可能な低下または消失を示す場合には、該対象または哺乳動物において、癌が良好に「治療」される：すなわち、
癌細胞数の減少または癌細胞の消失；
腫瘍サイズの減少；
軟組織および骨への癌の広がりを含む、末梢臓器への癌細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度の緩徐および好ましくは停止）；
腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の緩徐および好ましくは停止）；
腫瘍増殖のある程度の阻害；
および／または
特定の癌に関連する症状のうちの１種類以上についてのある程度の軽減；
罹患率および／または死亡率の低下、
および
生活の質に関する問題の改善。
一局面において、本発明はヘテロアリールメチルスルホニル化合物リンカーで官能基化した反応性Ｌｙｓ９９残基を有する改変３８Ｃ２触媒抗体を提供する。３８Ｃ２触媒抗体およびそのヒト化変異体は、当該技術分野において公知であり、当該分野で広くその特徴付けが行われている；例えば、Ｗａｇｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０、１７９７－１８００、１９９５；Ｂａｒｂａｓ、ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８、２０８５－２０９２、１９９７；および、Ｒａｄｅｒら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３２、８８９－８９９、２００３。３８Ｃ２抗体の重鎖可変領域は、リンカーと反応することのできる、固有の反応性を示す単一のリジン残基（Ｌｙｓ９９）を含み、これが薬剤部分との共役反応における連結部位を提供する。したがって、３８Ｃ２抗体の可変ドメインを含む免疫グロブリン分子は、薬剤部分またはその他の化学物質との共役反応に利用可能である、前記のような連結部位を２か所（各重鎖に１か所ずつ）含む。反応性リジン残基がリンカーと結合すれば、３８Ｃ２抗体は最早その触媒活性を示さない。触媒抗体３８Ｃ２の活性部位にある反応性リジン残基（Ｌｙｓ９９）を部位特異的生体共役反応に利用することにより作成した抗体結合薬剤化合物については、複数の例が存在する。例えば、Ｒａｄｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １００、５３９６－５４００、２００３；Ｒａｄｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２、１８６－１９７、２０１４；および米国特許第８，２５２，９０２号を参照のこと。これらの例では、３８Ｃ２抗体の反応性Ｌｙｓ９９残基への薬剤部分の連結は、β－ジケトンまたはβ－ラクタムを基盤とするリンカー部分を用いた官能基化によって達成される。
代替的な不可逆的共有結合性共役化学を利用することによって、本発明の改変３８Ｃ２抗体化合物は、生体共役反応の代替的な手段を提供する。典型的には、本発明の改変またはリンカー官能基化３８Ｃ２抗体化合物は、ヘテロアリールメチルスルホニル化合物によって官能基化されている３８Ｃ２触媒抗体を含む。本発明の実施には、様々なヘテロアリールメチルスルホニル化合物を利用することができる。これらは、当該技術分野において公知の多くのメチルスルホニル５員単環式化合物（フェニルテトラゾール類またはフェニルオキサジアゾール類）を含む。例えば、Ｔｏｄａら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ、５２：１２５９２－６、２０１３；およびＰａｔｔｅｒｓｏｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、２５：１４０２－７、２０１４を参照のこと。いくつかの実施形態においては、抗体３８Ｃ２を官能基化する、あるいは化学物質部分（例えば、薬剤化合物）を誘導体化するヘテロアリールメチルスルホニル化合物は、本明細書に例示するようなメチルスルホンフェニルオキサジアゾール（ＭＳ－ＰＯＤＡ）である。
関連する局面においては、本発明は、ヘテロアリールメチルスルホニル化合物リンカーを介して触媒抗体３８Ｃ２に部位特異的に結合した少なくとも１種類の薬剤を含む抗体化学物質複合体を提供する。これらの抗体化学物質複合体は、例えば、抗体結合低分子薬剤および抗体結合核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）薬剤などの抗体結合薬剤（ＡＤＣ）、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体結合薬剤、化学的にプログラムされた抗体、二重特異性抗体、およびキメラ抗原受容体を含む。別の関連する局面においては、本発明は、有効量の本発明の抗体化学物質複合体および任意選択的に薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。別の関連する局面においては、本発明は、本明細書に記載の抗体化学物質複合体を作成する方法を提供する。いくつかの実施形態においては、まず上述のヘテロアリールメチルスルホニル化合物で３８Ｃ２抗体を官能基化し、次いで官能基化した抗体を化学物質部分（薬剤部分または標的化部分など）と反応させることによって、本発明の抗体化学物質複合体を作成する。他のいくつかの実施形態においては、まず化学物質部分を、本明細書に例示するようなヘテロアリールメチルスルホニル化合物で誘導体化し、次いで誘導体化化学物質部分を抗体と反応させることもできる。いくつかの好ましい実施形態においては、化学物質部分を誘導体化するメチルスルホニル化合物はＭＳ－ＰＯＤＡである。
本発明のリンカー官能基化３８Ｃ２抗体および抗体化学物質複合体は、日常的に実施される方法（例えば、本明細書に例示するような組換え体発現）によって容易に作成することができる。ヘテロアリールメチルスルホニル化合物による３８Ｃ２抗体（例えば、ｈ３８Ｃ２）の官能基化は、公知の化学技術または本明細書に例示するプロトコルに準拠して容易に実施することができる。例えば、本明細書中の実施例５および図１～２を参照のこと。同様に、メチルスルホニル化合物による化学物質部分の誘導体化および誘導体化化学物質部分と３８Ｃ２抗体の複合体化は、本明細書に例示するプロトコル（実施例５を参照のこと）に準拠して容易に実施することができる。例えば、本発明の抗体薬剤複合体を作成するための、薬剤部分の誘導体化は、ＭＳ－ＰＯＤＡ誘導体化ＭＭＡＦに関して本明細書に例示する方法を用いて実施することができる。同様に、本発明の化学的にプログラムされた抗体を作成するための、標的化部分の誘導体化は、ＭＳ－ＰＯＤＡ誘導体化葉酸またはＬＬＰ２Ａに関して本明細書に例示する方法を用いて実施することができる。メチルスルホニル化合物でハプテンまたは薬剤部分を誘導体化する方法についても、当該技術分野において報告がある。例えば、Ｔｏｄａら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ、５２：１２５９２－６、２０１３を参照のこと。
メチルスルホニル化合物で化学物質部分（例えば、薬剤部分または標的化部分）が誘導体化されれば、当該技術分野において公知の方法または本明細書に例示した具体的なプロトコルに準拠して、本発明の抗体化学物質複合体（例えば、ＡＤＣ）を容易に構築することができる。例えば、本明細書中の実施例５および図６；Ｒａｄｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２、１８６－１９７、２０１４；Ｔｏｄａら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ、５２：１２５９２－６、２０１３；およびＰａｔｔｅｒｓｏｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、２５：１４０２－７、２０１４を参照のこと。典型的には、ｈ３８Ｃ２－フルオレセイン複合体およびｈ３８Ｃ２－ＭＭＡＦ複合体について本明細書に例示するように、３８Ｃ２抗体と反応させる場合に、誘導体化化学物質をモル過剰で用いる。ＤＶＤ－Ｉｇ抗体化合物は、本明細書に例示するプロトコルおよび当該技術分野において報告されている方法に準拠して作成することができる。例えば、Ｎａｎｎａら、Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ．８：１１１２、２０１７；およびＷＯ２０１７／０４９１３９を参照のこと。
本発明のリンカー官能基化３８Ｃ２抗体化合物または抗体化学物質複合体においては、いずれか一方または両方の抗体アーム中のＬｙｓ９９残基をヘテロアリールメチルスルホニル化合物で官能基化することができる。したがって、いくつかの実施形態においては、抗体化合物または抗体化学物質複合体中の３８Ｃ２抗体は、両方の抗体アームにおいてヘテロアリールメチルスルホニル化合物で官能基化されたＬｙｓ９９残基を含むホモ二量体分子である。これらの実施形態のいくつかにおいては、抗体化学物質複合体（例えば、ＡＤＣ）は、ヘテロアリールメチルスルホニル化合物リンカーを介して反応性Ｌｙｓ残基に結合した同一化学物質部分（例えば、薬剤部分）を含み得る。いくつかの実施形態においては、抗体化合物または抗体化学物質複合体中の３８Ｃ２抗体は、１つの抗体アームにおいてのみヘテロアリールメチルスルホニル化合物リンカーで官能基化された、または同リンカーを含むヘテロ二量体分子である。そのような分子の重鎖ヘテロ二量体化は、例えば、ノブと穴（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）変異によって実現できる。これらの実施形態のいくつかにおいては、抗体化学物質複合体は、ヘテロアリールメチルスルホニル化合物リンカーを介して１つの抗体アームに結合した第１の化学物質（例えば、薬剤部分）およびジケトンまたはβ－ラクタムを基盤とするリンカーを介して他方の抗体アーム結合した第２の化学物質（例えば、異なる薬剤部分）を含むことができる。
全長３８Ｃ２抗体（例えば、ＩｇＧ１）またはその抗体断片のいずれかを、本発明の実施に用いることができる。３８Ｃ２に由来する好適な抗体断片（または「抗原結合断片」）としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖが挙げられる。本発明のリンカー修飾または官能基化３８Ｃ２抗体化合物または抗体化学物質複合体のいくつかの好ましい実施形態においては、利用する抗体はヒト化３８Ｃ２抗体（ｈ３８Ｃ２）またはその抗原結合断片のみである。本発明のいくつかの抗体化学物質複合体は、ヘテロアリールメチルスルホニル化合物で官能基化または誘導体化された３８Ｃ２を含む二重可変ドメイン（ＤＶＤ）化合物（例えば、ＤＶＤ－ＦａｂまたはＤＶＤ－Ｉｇ）または二重特異性抗体である。これらの実施形態のいくつかにおいては、ＤＶＤ－Ｉｇは、標的抗原（例えば、腫瘍細胞表面抗原または受容体（本明細書に例示するＨＥＲ２など））に結合する第１の可変ドメインおよびヘテロアリールメチルスルホニル化合物リンカーを介して薬剤部分に結合した第２の可変ドメイン（３８Ｃ２）を含む。
本発明の抗体化学物質複合体は、様々な化学物質またはペイロード（例えば、薬剤）を目的の特定標的に送達するために用いることができる。ペイロードは、生物学的に活性な部分（薬剤部分および発現修飾部分など）ならびに非生物学的に活性な部分（検出可能部分（例えば、検出可能標識）など）を広く含むが、これらのみに限定されるものではない。薬剤部分の非限定的な例としては、標的細胞を死滅させることのできる、または標的細胞の増殖を停止させることのできる細胞毒性剤および細胞増殖抑制剤が挙げられる。いくつかの実施形態においては、利用する薬剤部分は、毒素、化学療法剤、抗生物質、放射性同位体、キレートした放射性同位体、および核酸分解酵素である。いくつかの実施形態においては、本発明のＡＤＣの薬剤部分は、ポリマー薬剤から成る重合化した薬剤であってもよい。例えば、ＡＤＣ中のペイロードは、Ｍｅｒｓａｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）によって開発されたＦｌｅｘｉｍｅｒ技術で作成した重合化薬剤であってもよい。例えば、Ｙｕｒｋｏｖｅｔｓｋｉｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１５、７５：３３６５－７２を参照のこと。
様々な実施形態において、本発明のＡＤＣ中のペイロードは、以下から成る群から選択される薬剤部分である：オーリスタチン；ドロスタチン；セマドチン；アマニチン（α－アマニチンが挙げられるが、これのみに限定されるものではない）；モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）；モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）；メイタンシノイド類（ＤＭ１、ＤＭ３およびＤＭ４が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない）；ピロロベンゾジアゼピン類（ＰＢＤ：単量体および二量体ＰＢＤが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない）；インドリノベンゾジアゼピン（二量体インドリノベンゾジアゼピン類が挙げられるが、これのみに限定されるものではない）；エンジイン類（カリケアマイシン類およびチアンシマイシン類が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない）；カンプトテシン（ＳＮ－３８が挙げられるが、これのみに限定されるものではない）；ドキソルビシン（ＭＭＤＸまたはその生体活性化産物（例えば、ＰＮＵ－１５９６８２など）が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない）；デュオカルマイシン。いくつかの実施形態においては、本発明のＡＤＣ中の薬剤部分は、以下から成る群から選択される：Ｖ－ＡＴＰアーゼ阻害剤、アポトーシス促進剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、蛋白質ＣＲＭ１核外搬出阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、蛋白質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化薬、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤。
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体化学物質複合体は、所定の生物学的応答を修飾する薬剤部分を含むＡＤＣである。薬剤部分は、古典的化学治療薬に限定されるものと解釈すべきではない。例えば、薬剤部分は所望の生物学的活性を有する蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドであってもよい。そのような蛋白質としては、例えば、毒素（アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素など）、蛋白質（腫瘍壊死因子、α－インターフェロン、β－インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子、サイトカイン、アポトーシス剤、抗血管新生剤など）、または生物応答修飾物質（例えば、リンホカインなど）を挙げることができる。いくつかの実施形態においては、薬剤部分は、細胞毒素、薬剤（例えば、免疫抑制剤）または放射性毒素であってもよい。細胞毒素の例としては、タキサン類、ＤＮＡ－アルキル化薬（例えば、ＣＣ－１０６５類似体）、アントラサイクリン類、ツブリシン類似体、デュオカルマイシン類似体、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、メイタンシノイド類、および反応性ポリエチレングリコール部分を含む細胞傷害性薬剤、ｔａｘｏｎ、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン（ｄｅｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンおよびその類似体またはホモログが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。
薬剤部分としてはさらに、例えば、抗代謝産物（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、細胞増殖阻害剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）を挙げることができる。例えば、米国特許公開第２００９０３０４７２１号を参照のこと；本文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。本発明の抗体、抗体断片（抗原結合断片）または機能的同等物に複合体形成させることのできる細胞毒素の他の非限定的な例としては、デュオカルマイシン類、カリケアマイシン類、メイタンシン類およびオーリスタチン類、およびそれらの誘導体が挙げられる。
本発明の抗体化学物質複合体中のペイロードはまた、放射性免疫複合体と呼ばれる細胞傷害性放射性医薬品を作成するための放射性同位体またはキレートした放射性同位体であってもよい。診断あるいは治療に用いられる抗体に結合することのできる放射性同位体の例としては、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０、ルテチウム１７７、ビスマス２１３およびアスタチン２１１が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。放射性免疫複合体を調製する方法は、当該技術分野において確立されている。例えば、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（ＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）などの放射性免疫複合体が市販されており、また類似の方法が本発明の抗体を用いた放射性免疫複合体の調製に利用できる。いくつかの実施形態においては、大環状キレート化剤は、リンカー分子を介して免疫グロブリンに連結することのできる１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＤＯＴＡ）である。
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体化学物質複合体のペイロードは近赤外線（ＮＩＲ）光免疫療法（ＰＩＴ）の光吸収体であってもよい。ＰＩＴは、腫瘍の急速かつ特異的な破壊を誘導する新規腫瘍標的抗癌プラットフォームである。この治療は、薬剤（癌標的化光活性化可能な抗体複合体）および腫瘍部位に光を照射するデバイス系から成る。ＰＩＴの独自性は、高い腫瘍特異性を達成する癌細胞の分子標的化を、患者の腫瘍の腫瘍形成機構のいかんに関わらず広域スペクトルの抗癌活性をもたらす癌細胞破壊の生物物理学的メカニズムと組み合わせたものであるという点にある。例えば、Ｍｉｔｓｕｎａｇａら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．１７：１６８５－９２、２０１１を参照のこと。例えば、本発明のＤＶＤ化合物は、ＮＩＲ ＰＩＴ光吸収体（例えば、ＩＲ７００）および腫瘍細胞を標的とする抗原結合可変ドメイン領域を含むものであってもよい。
様々な実施形態において、本発明の抗体化学物質複合体のペイロードは、単一薬剤単位または複数の同一薬剤単位（同薬剤部分に存在する２、３、４、５、６、７、８、９、または１０薬剤単位など）であってもよい。いくつかの実施形態においては、薬剤部分は、同薬剤部分に２種類の異なる薬剤単位を含む。例えば、いくつかの局面においては、単一薬剤部分は、ＭＭＡＦ薬剤単位およびＰＢＤモノマー薬剤単位の両方を含むものであってもよい。さらに、特定の局面においては、目的とする免疫複合体は、免疫複合体の第１のアームに結合した第１の薬剤部分、および免疫複合体の第２のアームに結合した第２の薬剤部分を含むものであってもよい。したがって、様々な薬剤部分のいずれの組み合わせも、リンカーを介して目的とするＤＶＤ－Ｉｇに結合することができる。
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体化学物質複合体の化学物質部分は発現修飾部分である。発現修飾部分としては、非蛋白質コードＲＮＡ（「ｎｐｃＲＮＡ」）が挙げられるが、これのみに限定されるものではない。いくつかの実施形態においては、ｎｐｃＲＮＡは、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ前駆体、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ＲＮＡおよびそれをコードする前駆体、ヘテロクロマチンｓｉＲＮＡ（ｈｃ－ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、トランス作用ｓｉＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）、天然のアンチセンスｓｉＲＮＡ（ｎａｔ－ｓｉＲＮＡ）、トレーサーＲＮＡ（ｔｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体化学物質複合体の化学物質部分は検出可能部分である。検出可能部分としては、直接的に検出される標識または部分（蛍光、発色性、電子密度、化学発光、および放射性標識など）、ならびに間接的に検出される部分（酵素またはリガンドなど）、例えば、酵素反応または分子相互作用を通じて検出される部分が挙げられるが、これのみに限定されるものではない。例示的な標識としては、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉ、蛍光色素分子（希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体など、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）を含むローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなど）、ルセリフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン類、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖質酸化酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、色素前駆体の酸化に過酸化水素を用いる酵素（ＨＲＰ、ラクトパーオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼなど）との結合、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカルなどが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。
別の一局面において、本発明は、各種の治療または診断に本明細書中に記載の抗体化学物質複合体（例えば、ＤＶＤ－ＡＤＣ）を用いる方法を提供する。本発明の抗体化学物質複合体の特定の利用は、抗体化合物に結合したペイロードまたは薬剤部分に依存する。ＤＶＤを基盤とするＡＤＣを用いる場合には、該特定の利用はＤＶＤの第２の可変ドメインによって認識される標的分子にも依存する。つまり、本明細書に記載の抗体化学物質複合体は多くの特異的癌療法において容易に利用することができる。そのような治療用途は、例えば、本明細書に例示する、腫瘍を標的とする公知の抗体または抗原結合可変ドメインによる、薬剤部分の腫瘍への送達を含む。それらはまた、直接に腫瘍細胞を標的とするのではない治療、例えば、Ｔ細胞、その他の免疫細胞、および腫瘍支持細胞を標的とする抗体ｓｉＲＮＡ複合体も含む。それらは、その他の非従来型癌治療法、例えば、腫瘍（ならびに非腫瘍細胞）を処置する近赤外線（ＮＩＲ）光免疫療法（ＰＩＴ）の利用をさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に例示するような特定の腫瘍抗原、例えば、ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞を標的とするＤＶＤ－ＡＤＣ化合物を利用する方法を提供する。好適な種類の癌としては、血液がん、癌腫、肉腫、黒色腫、および中枢神経系癌が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。他のいくつかの実施形態において、本発明の化合物（例えば、ＤＶＤを基盤とするＡＤＣ）は、非腫瘍学的適応症（感染性疾患、自己免疫疾患、心臓血管疾患、代謝性疾患など）の治療にも利用できる。例えば、Ｂｅｃｋら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１７， １６：３１５－３３７を参照のこと。
実施例
以下に実施例を示すが、これは本発明を具体的に説明する目的であり、本発明を限定するものではない。
実施例１：インシリコでのＬｙｓ９９アリール化
本発明者らは、ｈ３８Ｃ２のＬｙｓ９９におけるε－アミノ基の求核反応性に着目して、アクセス可能なペイロード空間をさらに拡張可能な代替的な不可逆的共有結合性共役化学について調べた。Ｌｙｓ９９の微小環境は疎水性であるため、本発明者らは、抗体共役反応について報告のあるＬｙｓアリール化が好適な経路を提供するのではないかという仮説を立てた。具体的には、工学的に改変した遊離のＣｙｓ残基と抗体との間の、マレイミドを基盤とする共役反応に対する、血清中で安定な代替として、ヘテロアリールメチルスルホニル化合物を試験することに興味を抱いた。本発明者らの研究は、メチルスルホンフェニルオキサジアゾール（ＭＳ－ＰＯＤＡ）に焦点を置くものであった（図１Ａ）。
Ｌｙｓ９９のε－アミノ基について提案された、ＭＳ－ＰＯＤＡとの反応に基づいて（図１Ａ）、本発明者らは、ｈ３８Ｃ２の疎水性ポケット内に該化合物を収めるために計算機モデル化を利用した。これは、Ｌｙｓ９９Ａｒｇ突然変異を有するｈ３８Ｃ２ Ｆａｂについて最近解明された結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ ６Ｕ８５）に基づくものであった。Ａｒｇ９９をアジド－（ＰＥＧ）４－ＰＯＤＡ誘導体化Ｌｙｓ残基で置換しインシリコのエネルギー最小化について調べた。疎水性ポケット内でＰＯＤＡと相互作用する残基を同定し、それらの原子間距離を算出した（図１Ｂ）。２つのチロシン（Ｔｙｒ）残基、ＶＨのＴｙｒ１０１および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＴｙｒ１０１が、π－πスタッキングによるＰＯＤＡフェニル環との相互作用に最も重要であった（図７）。ＶＬのＴｙｒ１０１およびトリプトファン（Ｔｒｐ）残基、ＶＨのＴｒｐ４７が、ＰＯＤＡのオキサジアゾール環とπ－πスタッキング相互作用をすることが分かった。水分子によって架橋される複数の水素結合もまた、この相互作用に寄与していた（図７）。まとめると、Ｌｙｓ９９に対する共有結合性共役反応において、ＭＳ－ＰＯＤＡはハプテン様化合物として作用し得ることが、計算機モデル化によって示唆された。
実施例２：フルオレセインのＭＳ－ＰＯＤＡ誘導体で精査したＬｙｓ９９のアリール化
本実施例では、フルオレセインのＭＳ－ＰＯＤＡ誘導体を用いた効率的、選択的、かつ安定なＬｙｓ９９アリール化について精査した内容を説明する。Ｌｙｓ９９に対する共有結合性共役反応をインビトロで精査するために、本発明者らは、前述のフルオレセインのＭＳ－ＰＯＤＡ誘導体（化合物１；図２Ａ）を用いた。比較のために、本発明者らは以前に報告したテトラメチルローダミンのβ－ラクタムハプテン誘導体（ＴＡＭＲＡ）も用いた（化合物２；図２Ａ）。Ｌｙｓ９９の共役反応を精密化するために、本発明者らはＬｙｓ９９Ａｌａ突然変異を有するｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１のクローン化、発現、精製も行った。ＰＢＳ中でｈ３８Ｃ２およびｈ３８Ｃ２＿Ｌｙｓ９９Ａｌａ ＩｇＧ１を５倍モル過剰（反応性Ｌｙｓ残基当たり５当量）の化合物１および２と共に室温で４時間インキュベートした後、非複合体化抗体と共に未精製の抗体複合体を、還元および非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離しクマシーブルー染色およびゲル内蛍光で分析した（図２Ｂ）。両方の化合物ともｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１の５０ｋＤａの重鎖には共役反応を起こすが、２５ｋＤａの軽鎖には起こさないことが、この分析によって明らかになった。ｈ３８Ｃ２＿Ｌｙｓ９９Ａｌａに対しては全く共役反応が検出されず、このことは反応性Ｌｙｓ９９残基に対する部位特異的共役反応であることを示している（図２Ｂ）。ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理（Ｎ－グリコシル化を除去する）とジチオスレイトール（ＤＴＴ）処理（鎖間ジスルフィド架橋を還元する）を行った非複合体化抗体を質量分析したところ、検出された分子量は４９，３８４Ｄａ（重鎖；翻訳後修飾のない場合に予想される分子量：４９，４６０Ｄａ）および２３，９５３Ｄａ（軽鎖；２３，９５５Ｄａ）であった（図２Ｃ）。それに一致して、ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１と化合物１の反応によって得られた抗体複合体は、重鎖の分子量が６９４Ｄａ増加していることが示され、このことは１分子のＰＯＤＡ－フルオレセイン分子による共有結合性共役反応であることを示唆している。非複合体型重鎖は約５％のみ検出され、複合体型軽鎖も多重結合重鎖も検出されなかったことから（図２Ｃ）、この共役反応は高効率で選択的であるといえるようだ。ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１の２か所のハプテン結合部位に対する共役反応が選択的であることは、Ｌｙｓ９９が媒介する触媒活性の完全消失からも示された（図２Ｄ）。
次に、本発明者らは、抗体複合体をヒトの血漿と共に３７℃で最長８日間インキュベートすることにより、Ｌｙｓ９９：ＰＯＤＡ付加体の安定性について調べた。還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析後に行ったクマシーブルー染色およびゲル内蛍光によって、血漿蛋白質への蛍光の転移は全く検出されず、付加体が高度に安定性であることが明らかになった（図３）。
実施例３：ＭＳ－ＰＯＤＡ媒介化学プログラミング
本発明者らは、ｈ３８Ｃ２のＬｙｓ９９に対するＭＳ－ＰＯＤＡのフルオレセイン誘導体の効率的、選択的、かつ安定的な共役反応に着目し、化学プログラミングを含む、ｈ３８Ｃ２の公知の治療的有用性に関連したＭＳ－ＰＯＤＡ共役反応について調べた。異なる２種類の細胞表面受容体の低分子物質結合部位に対する高特異性または親和性をｈ３８Ｃ２に付与するために、本発明者らは、葉酸のβ－ラクタムハプテン誘導体およびＭＳ－ＰＯＤＡ誘導体（それぞれ化合物３および５；図４Ａ）およびＬＬＰ２Ａの同誘導体（それぞれ化合物４および６；図４Ａ）を合成した。β－ラクタム官能基化リガンドと比較して、ＭＳ－ＰＯＤＡ含有構築物はより直接的に合成が行えることに留意されたい。ＭＳ－ＰＯＤＡ部分は容易に入手可能な市販の試薬を用いて調製することができ、リガンドへの導入は中間体精製を必要としない固相樹脂上で直接行える。対照的に、β－ラクタムで官能基化したリガンドの合成は、典型的には反応産物の精製が必要なアジド－アルキンのクリック反応（ｃｌｉｃｋ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を含んでいる。葉酸（ビタミンＢ９）は、ナノモルレベルの親和性で葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１または葉酸受容体α）に結合するが、卵巣癌、肺癌、およびその他の癌では過剰に発現する。ＬＬＰ２Ａは、インテグリンα４β１の開放型立体構造に対するピコモルレベル親和性のリガンドであり、Ｌａｍおよびその共同研究者らが、１－ビーズ－１－化合物組み合わせペプチド模倣体ライブラリーをスクリーニングすることによって同定した。インテグリンα４β１の開放型の立体構造（活性化インテグリンα４β１）は、悪性Ｂ細胞およびその他の血液がんならびに固形悪性腫瘍でそのレベルが上昇し、輸送と転移に関与している。したがって、ＦＯＬＲ１およびインテグリンα４β１はいずれも癌治療薬の有望な標的となっている。
ＰＢＳ中でｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１を５倍モル過剰の化合物３～６と室温で４時間インキュベートして非複合体化化合物を除去した後に、インキュベートした全混合物が触媒活性を完全に失い、β－ラクタムハプテンおよびＭＳ－ＰＯＤＡ媒介性共役反応の効率が同程度であることを確認した（図４Ｂ）。１倍および２倍モル過剰（それぞれ１当量および２当量）の場合には、２種類の求電子試薬間で触媒活性の部分的消失に関して有意差が認められなかった（図４Ｂ）。葉酸誘導体およびＬＬＰ２Ａ誘導体による化学的プログラムの場合に、ｈ３８Ｃ２は触媒活性を失うと共に、それぞれＦＯＬＲ１およびインテグリンα４β１に結合する能力を獲得した。このことは、プレートのコーティングに組換えＦＯＬＲ１およびＭｎ２＋活性化インテグリンα４β１を用い、また検出に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＦｃγポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を用いたＥＬＩＳＡを実施することによって、初めて明らかになった（図５ＡおよびＣ）。次いで、ＦＯＬＲ１陽性ヒト卵巣癌細胞株ＩＧＲＯＶ－１（図５Ｂ）およびＭｎ２＋活性化インテグリンα４β１表出ヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ（図５Ｄ）を用いてフローサイトメトリー分析を行い、化学プログラミングを確認した。従来のβ－ラクタムハプテン媒介性化学プログラミングと新規のＭＳ－ＰＯＤＡ媒介性化学プログラミングの間には、有意差が認められなかった。これにより、反応性Ｌｙｓ残基のアリール化がｈ３８Ｃ２の化学プログラミングに好適であることが実証された。
実施例４：ＭＳ－ＰＯＤＡを介した抗体薬剤複合体の構築
次に、本発明者らは、乳癌細胞上のＨＥＲ２を標的とするトラスツズマブを基盤とする外側のＦｖ、および高度に細胞傷害性である薬剤の部位特異的共役反応を促進する、ｈ３８Ｃ２を基盤とする内側のＦｖから成るＤＶＤ－ＡＤＣの構築を目的とするＭＳ－ＰＯＤＡ媒介性共役反応について調べた。この概念は、図６Ａに化合物７として示すチューブリン重合化阻害剤モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）のβ－ラクタムハプテン誘導体について導入されたものである。工学的に改変したＣｙｓ残基を有する抗体との部位特異的共役反応について、対応するＭＭＡＦのＭＳ－ＰＯＤＡ誘導体（化合物８；図６Ａ）を、本発明者らは以前に報告している。
ＤＶＤ ＩｇＧ１を前述と同様に、化合物７または８と共にインキュベートした。非複合体化化合物を除去した後、触媒活性の消失によってＬｙｓ９９共役反応の確認を行った（図６Ｂ）。次いで、ＭＳ－ＰＯＤＡ共役反応により構築したＤＶＤ－ＡＤＣの質量分析を行った。ＰＮＧａｓｅおよびＤＴＴによる処理後の非複合体型ＤＶＤ ＩｇＧ１に観察された分子量は、６３，８５９Ｄａ（重鎖；翻訳後修飾のない場合に予想される分子量：６３，８７８Ｄａ）および３６，１７０Ｄａ（軽鎖；３６，１７５Ｄａ）であった。複合体化したＤＶＤ ＩｇＧ１では、重鎖の分子量が１，１０２Ｄａ増加しており、このことは１分子のＰＯＤＡ－ＭＭＡＦ分子による共有結合性共役反応であることを示唆している。フルオレセインのＭＳ－ＰＯＤＡ誘導体について認められるように、この共役反応は高効率（約９５％）で選択的であり、複合体化した軽鎖も多重結合重鎖も検出されなかった（図６Ｃ）。ＤＴＴ処理を行わなかった場合には、非複合体型および複合体型ＤＶＤ ＩｇＧ１に観察された分子量は、それぞれ２００，０５２Ｄａおよび２０２，２７２Ｄａであり、２つの反応性Ｌｙｓ９９残基のそれぞれに対して１分子のＰＯＤＡ－ＭＭＡＦ分子による共役反応であることを示唆している（図８）。
ＤＶＤ－ＡＤＣの均一的な構築が確認されたので、本発明者らは次に、強力かつ選択的な細胞傷害性を媒介する能力について試験を行った。ＭＳ－ＰＯＤＡで構築したＤＶＤ－ＡＤＣおよびβ－ラクタムハプテンで構築したＤＶＤ－ＡＤＣは、ＨＥＲ２陽性ヒト乳癌細胞株ＳＫ－ＢＲ－３およびＫＰＬ－４を、それぞれＩＣ５０値、０．２１ｎＭおよび０．３４ｎＭ、ならびに０．１ｎＭおよび０．０９ｎＭで死滅させた（図６Ｄ）。どちらも、ＨＥＲ２陰性ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１については、試験した最高濃度である最大１００ｎＭでも死滅させることはなかった（図６Ｄ）。まとめると、ｈ３８Ｃ２を基盤とする内側のＦｖを有するＤＶＤ ＩｇＧ１の２つの反応性Ｌｙｓ９９残基に対する細胞傷害性薬剤のＭＳ－ＰＯＤＡ媒介性共役反応は、以前にβ－ラクタムハプテン媒介性共役反応を用いて報告しているＤＶＤ－ＡＤＣと質的に同等であるという結論になる（Ｎａｎｎａら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８、１１１２、２０１７）。全体的に見れば、本発明者らの研究は、触媒抗体ｈ３８Ｃ２の反応性Ｌｙｓ９９残基のアリール化を基盤として、治療的用途に適するｈ３８Ｃ２の新規共役化学を確立するものである。この新しいアプローチは、β－ラクタムハプテン媒介性共役反応方略に勝る合成上の顕著な利点を与える。
実施例５：材料と方法
細胞株：ヒト卵巣癌細胞株ＩＧＲＯＶ－１はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１ｘペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む；いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの製品である）を添加した葉酸欠乏ＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。ヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔは、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳおよび１ｘペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。ヒト乳癌細胞株ＳＫ－ＢＲ－３およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１はＡＴＣＣから購入した。ヒト乳癌細胞株ＫＰＬ－４は、紅林淳一博士（川崎医科大学；川崎、日本）の許可の下に、テキサス州立大学ＭＤアンダーソン癌センター（ヒューストン、テキサス）の研究試料提供契約に基づいて上野直人博士から提供されたものである。３種類の細胞株はいずれも、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳおよび１ｘペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地で培養した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞は、１ｘペニシリン－ストレプトマイシン（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの製品である）を添加したＥｘｐｉ２９３発現培地で培養した。
計算機モデル化：Ｌｙｓ９９Ａｒｇ突然変異（ＰＤＢ ＩＤ ６Ｕ８５）を有するｈ３８Ｃ２ Ｆａｂの結晶構造では、インシリコでＡｒｇ９９をアジド－（ＰＥＧ）４－ＰＯＤＡ誘導体化Ｌｙｓ残基で置換し、Ｐｒｉｍｅソフトウェア（Ｓｃｈｒоｄｉｎｇｅｒ）を用いたエネルギー最小化を行った；また、Ｄｅｓｍｏｎｄソフトウェア（Ｓｃｈｒоｄｉｎｇｅｒ）をＯＰＬＳ＿２００５力場と共に用いて分子動力学シミュレーションを行った。ＴＩＰ３水、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および対イオンを含む各方向１０Åの斜方晶ボックス中で、当該座標部を溶媒和させた。拘束／非拘束最小化および等温等圧集団の短いシミュレーションから成るＮＰＴ緩和プロトコルを用いて、この系を予め平衡化した。次いで、１０ナノ秒の分子動力学シミュレーションを一定温度（３００Ｋ）および一定圧力（１．０１３２５バール）で実施した。シミュレーションの質分析によれば、シミュレーションの経過中にシステム容積、圧力、温度、およびポテンシャルエネルギーの有意な揺動はなかった。１ナノ秒～１０ナノ秒のシミュレーション座標を用いて、リガンド（アジド－（ＰＥＧ）４－ＰＯＤＡ）と抗体（ｈ３８Ｃ２ Ｆａｂ）との間の顕著な相互作用を分析および判定した。モデルの図および原子距離を、ＰｙＭＯＬを用いて作成および算出した（Ｓｃｈｒоｄｉｎｇｅｒ）。（注記：結晶構造物６Ｕ８５は、独立した結晶構造６ＤＺＲ１５（その３８９Ｃα原子についての標準偏差（ＲＭＳＤ）は０．４４６Å）とほぼ同一である；６ＤＺＲとは異なり、６Ｕ８５は、疎水性ポケットのＡｒｇ９９と塩橋を形成する硫酸イオンは含んでいない）。
ＭＳ－ＰＯＤＡおよびβ－ラクタムハプテン誘導体の合成：化合物１（ＭＳ－ＰＯＤＡ－フルオレセイン）、２（β－ラクタム－ハプテン－ＴＡＭＲＡ）、７（ＭＳ－ＰＯＤＡ－ＭＭＡＦ）、および８（β－ラクタム－ハプテン－ＭＭＡＦ）の合成は報告されている。化合物３（βラクタム－ハプテン－葉酸）、化合物４（β－ラクタム－ハプテン－ＬＬＰ２Ａ）、化合物５（ＭＳ－ＰＯＤＡ－葉酸）、および化合物６（ＭＳ－ＰＯＤＡ－ＬＬＰ２Ａ）の合成および１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、ＨＲＭＳ、およびＬＣ－ＭＳによるそれらの特徴付けについてはさらに詳細を以下に示す。
抗体：ｈ３８Ｃ２のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列は公開されている。精製ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１は、Ｃａｒｌｏｓ Ｆ． Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ（スクリプス研究所（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の研究室から提供されたものである。ｈ３８Ｃ２＿Ｌｙｓ９９Ａｌａ ＩｇＧ１を作成するために、ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１の軽鎖および変異重鎖をコードする配列を哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４にＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）でクローン化した。ＥｘｐｉＦｅｃｔアミン２９３トランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて製造元の指示にしたがい、３×１０６細胞／ｍＬの密度のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を上記２種類のプラスミドで同時形質転換した。形質転換細胞を３７℃、５％ＣＯ２で５日間培養した後、培養上清を回収して、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ機器（いずれもＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの製品）と共に１ｍＬのＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムを用いた親和性クロマトグラフィーにより精製した。抗ＨＥＲ２ ＤＶＤ－ＩｇＧ１の配列、クローニング、発現、および精製については、以前に報告されている（Ｎａｎｎａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０３３、３９－５２、２０１９）。
抗体共役反応：１０μＭのｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１またはｈ３８Ｃ２＿Ｌｙｓ９９Ａｌａ ＩｇＧ１を、１００μＭ（反応性Ｌｙｓ残基当たり５当量）の化合物１（ＭＳ－ＰＯＤＡ－フルオレセイン）または化合物２（β－ラクタム－ハプテン－ＴＡＭＲＡ）と共にＰＢＳ中、室温で３時間インキュベートした。２．５μｇの還元および非還元共役反応混合物を、１０ウェルＮｕＰＡＧＥ４～１２％ビストリス蛋白質ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に載せた。蛍光バンドをＥ－ｇｅｌ Ｉｍａｇｅｒで青い光として視覚化し、次いでゲルをＰａｇｅＢｌｕｅ蛋白質染色液で染色した（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの製品）。化学的にプログラムされたｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１＿３、＿４、＿５、および＿６、ならびに２種類のＡＤＣ（抗ＨＥＲ２ ＤＶＤ－ＩｇＧ１＿７および＿８）を同様に構築し、ｉｌｌｕｓｔｒａ ＮＡＰ－５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製して３０ｋＤａのＭＷＣＯを備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ０．５ｍＬ遠心フィルターで濃縮した。
質量分析：５０ｍＭのＤＴＴを用いて、１０μＭの非複合体化抗体および複合体化抗体をＰＢＳ中室温で１０分間還元した後、３７℃で一晩ＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により酵素的脱グリコシル化を行った。水で希釈した後、Ａｇｉｌｅｎｔのエレクトロスプレーイオン化飛行時間（ＥＳＩ－ＴＯＦ）型質量分析計でデータを取得した。デコンボリューションによる質量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＣｏｎｆｉｒｍソフトウェアを用いて取得した。
触媒活性アッセイ：１μＭの非複合体型抗体および複合体化抗体を３ウェルずつ、各ウェル当たり９８μＬで９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に分注した。次に、１０ｍＭのメタドールを２μＬ加え、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍ５測定機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて５分間隔の蛍光測定（励起／発光を３３０／４５２ｎｍに設定）を室温で１時間行った。
ヒト血漿中での安定性アッセイ：１ｍｇ／ｍＬのｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１＿１を含むＰＢＳを等容量のヒトの血漿（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合し３７℃でインキュベートした。０日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、および８日後に、２μＬずつ分注して凍結し、－８０℃で保存した。還元条件下で、すべての時点の分注標品を、１０ウェルＮｕＰＡＧＥ４～１２％ビストリス蛋白質ゲルを用いて分析した。蛍光バンドをＥ－ｇｅｌ Ｉｍａｇｅｒ青い光として視覚化した後、ゲルをＰａｇｅＢｌｕｅ蛋白質染色液で染色した。
ＥＬＩＳＡ：Ｔｒｉｓ緩衝性食塩水（ＴＢＳ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で１００ｎｇ／２５μＬに希釈した１００ｎｇの組換えヒト葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）および１ｍＭのＭｎＣｌ２を添加したＴＢＳで１００ｎｇ／２５μＬに希釈した組換えヒトインテグリンα４β１（いずれもＲ＆Ｄシステムの製品）を９６穴ハーフエリアマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れて、４℃で一晩インキュベートした。３％（ｖ／ｖ）脱脂粉乳を含むＴＢＳで１時間ブロッキングを行った後、ＦＯＬＲ１またはインテグリンα４β１をコーティングしたウェルに、それぞれ、５μｇ／ｍＬの非複合体型ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１、ならびに葉酸（化合物３および５）またはＬＬＰ２Ａを有する化学的にプログラムされたｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１（化合物４および６）を加えて、１時間インキュベートした。次いで、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＴＢＳでウェルを３回、洗浄した。３％（ｖ／ｖ）脱脂粉乳を含むＴＢＳで１：２，０００希釈したＨＲＰ結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ｐＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、室温で１時間インキュベートした。上記と同様に３回の洗浄後に、ＢｉｏＦＸ ＡＢＴＳ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）を、製造元の指示にしたがいウェルに加えた。Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍ５機器を用いて４０５ｎｍの吸光度を検出した。実験は３回繰り返した。
フローサイトメトリー分析：０．０２％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）および１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡを含むＴＢＳで希釈した、葉酸を有する化学的にプログラムされたｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１（化合物３および５）と一緒にＩＧＲＯＶ－１細胞（１×１０５）を室温で１時間インキュベートした。同時に、１ｍＭのＭｎＣｌ２を添加したＦＡＣＳ緩衝液中で、同一数のＪｕｒｋａｔ細胞を、ＬＬＰ２Ａを有する化学的にプログラムされたｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１（化合物４および６）と共にインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後に、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１，０００希釈したＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ｐＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を細胞に添加して１時間インキュベートした。前記と同様に３回洗浄した後に、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を含むＰＢＳに細胞を懸濁して、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ機器でフローサイトメトリーを行った。データの分析はＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いて行った。
細胞毒性アッセイ：以前に報告されている方法（Ｈｗａｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２６：１２２９－１２３９、２０１９）にしたがい、ＳＫ－ＢＲ－３（ウェルあたり５×１０３）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ウェルあたり３×１０３）、およびＫＰＬ－４（３×１０３ウェルあたり）を９６穴組織培養プレートに播種した。段階的に１０倍希釈（０．００１～１００ｎＭ）したＡＤＣ（抗ＨＥＲ２ ＤＶＤ－ＩｇＧ１＿７および８）を、陰性対照の抗ＨＥＲ２ ＤＶＤ－ＩｇＧ１と共にウェルに加え、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃で７２時間インキュベートした。次いで、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造元の指示にしたがって細胞生存率を測定し、未処理細胞の割合（％）としてプロットした。ＩＣ５０値（平均値±ＳＤ）の算出には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた。
葉酸およびＬＬＰ２ＡのＭＳ－ＰＯＤＡおよびβ－ラクタムハプテン誘導体の合成：
一般的方法：感湿性化合物を含む実験はいずれも、無水条件下（アルゴン陽圧下）で標準的な注射筒、カニューレ、およびセプタム器具を用いて行った。市販の試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ、Ａｃｒｏｓ、Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ、Ａｍｂｅｅｄ、およびＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入した。溶媒は（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから）無水物形態で購入し、さらに乾燥処理を行わずに用いた。クロマトグラフィーには、ＨＰＬＣ－グレードのヘキサン、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、およびメタノールを用いた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ Ｒｆ ２００ｉ機器をヘキサン／ＥｔＯＡｃまたはＤＣＭ／エタノールのいずれかの勾配で用いた。Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ４００ＭＨｚ測定器を用いてＮＭＲスペクトルを記録した。カップリング定数はヘルツ（Ｈｚ）で表し、ピークシフトはＣＤＣｌ３（１Ｈ ７．２６ｐｐｍ、１３Ｃ ７７．１６ｐｐｍ）に対して相対的なδ（ｐｐｍ）で表す。低分解能質量スペクトル（ＥＳＩ）の測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＬＣ／ＭＳＤ－ＳＬシステムで行った。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析計を用いた陽イオン、ＥＳＩ分析により取得したが、その際のＨＰＬＣ試料導入には、短いナローボアＣ１８逆相（ＲＰ）カラムおよびアセトニトリル（ＭｅＣＮ）－Ｈ２Ｏ勾配を用いた。調製用ＨＰＬＣによる精製は、Ｗａｔｅｒｓ２５４５ バイナリポンプ（ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配）を用いて行ったが、その際、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－Ｃ１８（５μｍ、２５０ｘ２１ｍｍ）調製用カラムを用い、検出には紫外２１０ｎｍを用いた。半調製用ＨＰＬＣによる精製は、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズのクォータナリポンプ（ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配）を用いて行ったが、その際、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｉｘ－Ｃ１８（５μｍ、２５０ｘ１０ｍｍ）半調製的カラムを流速３ｍＬ／分で用い、検出には紫外２１０ｎｍを用いた。分析用ＨＰＬＣによる精製ペプチドの分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズのクォータナリポンプ（ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配）を用いて行ったが、その際、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－Ｃ１８（５μｍ、２５０ｘ４ｍｍ）分析カラムを流速１ｍＬ／分で用い、検出には紫外２１０ｎｍを用いた。
２－（２－オキソ－２－（（４－（３－オキソ－３－（２－オキソアゼチジン－１－イル）プロピル）フェニル）アミノ）エトキシ）－Ｎ－（プロパ－２－イン－１－イル）アセトアミド（１４）の合成：β－ラクタム－ハプテン－アルキン１４の合成は、化合物１０および１３のカップリング反応（スキーム１）によって行った。無水ジグリコール酸９をプロパルギルアミンで処理することによって、化合物１０を調製した。。化合物１２を、文献（Ｍａｇａｎｏら、Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ． １８、１４２－１５１、２０１４）に記載の方法にしたがって合成した；水素化によって対応するアニリン含有１３とし、次いで、１０とのカップリングに用いて１４を得た。詳細には、Ｐｄ／Ｃ（１０％（ｗ／ｗ）、４３ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）を１－（３－（４－ニトロフェニル）プロパノイル）アゼチジン－２－オン（１２）（１００ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）のＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）溶液に添加した。この混合物を真空脱気してから、その容器にＨ２を吹き込んだ。室温で６時間撹拌した後、混合物をセライトで濾過し濾液を真空で濃縮した。得られた粗生成物１３のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；１５ｍＬ）溶液に、ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ；８０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）、１０（７６ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ；８５ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を添加して、その混合物を室温で２．５時間撹拌した。ＤＭＦを蒸発によって除去し、Ｈ２Ｏを加えて、混合物をクロロホルム（ＣＨＣｌ３）で３回抽出した。有機層を塩水で洗浄してから（Ｎａ２ＳＯ４で）乾燥させて、粗生成物をシリカゲルＣｏｍｂｉＦｌａｓｈクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ勾配、０～１００％、３０分間）で精製することによって、１４をオフホワイトの粉末（８９ｍｇ、５９％、１２から２工程で取得）として取得した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ ８．３８（ｓ、１Ｈ）、７．４７（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．２０（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、６．８１（ｓ、１Ｈ）、４．１５－４．１１（ｍ、６Ｈ）、３．５６（ｔ、Ｊ＝５．３Ｈｚ、２Ｈ）、３．０４－２．９３（ｍ、６Ｈ）、２．２６（ｔ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ １７０．２１、１６８．３４、１６６．５６、１６５．１４、１３７．１５、１３５．１９、１２９．２７、１２０．５３、７９．１０、７２．１１、７１．６４、７１．２７、３８．１４、３６．６５、３６．０１、２９．５４、２８．９２。Ｃ１９Ｈ２２Ｎ３Ｏ５についてのＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：３７２．１５５４［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値：３７２．１５５２。
Figure 2022553415000001
 スキーム１：化合物１４の合成。（ａ）プロパルギルアミン、ＴＨＦ、室温、１日、４３％；（ｂ）塩化チオニル、０℃～６０℃、１．５時間、次いで、アゼチジン－２－オン、ｎ－ＢｕＬｉ、ＴＨＦ、－７８℃～室温、一晩、２４％；（ｃ）Ｐｄ／Ｃ、Ｈ２、ＥｔＯＡｃ、室温、６時間；（ｄ）１０、ＥＤＣ・ＨＣｌ、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ、ＤＭＦ、２．５時間、５９％（１２から２工程で取得）。
Figure 2022553415000002
 スペクトル１：化合物１４の１Ｈ－ＮＭＲ
Figure 2022553415000003
 スペクトル２：化合物１４の１３Ｃ－ＮＭＲ
ペプチド固相合成（ＳＰＰＳ）の一般的手順：予めＳＰＰＳ樹脂を振盪しながらＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）で膨潤させた（２０分間）。特定のペプチドにはＳｉｅｂｅｒ Ａｍｉｄｅ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０．７１ｍｍｏｌ／ｇ）を利用した；該当する場合には、その結合伸長法を説明する。樹脂上のフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）脱保護は、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて振盪しながら行った（１０分間）。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（樹脂を基準に、２．０～４．０当量）はＮＭＰに溶解し、振盪しながら（１分間）ＨＡＴＵ（アミノ酸に対して０．９５モル当量）およびＤＩＥＡ（アミノ酸に対して２．０モル当量）を添加することにより予め活性化した。樹脂をＮＭＰで洗浄し、洗浄した樹脂にＨＡＴＵで活性化したアミノ酸の溶液を加えた。カップリング反応液を室温で振盪し、用いた当量数とアミノ酸の立体容積に応じて２時間から一晩、反応させた。カイザーテスト（Ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔ）を用いて、カップリング反応液を定期的に検査し、反応の完了を確認した。反応完了後に、樹脂を濾過しＮＭＰで洗浄してから、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて振盪しながら（１０分間）、Ｆｍｏｃ－脱保護を行った。ペプチド１７および６については、アリルアルコール（樹脂を基準に、２００当量）の存在下において２％（ｖ／ｖ）ヒドラジン一水和物のＮＭＰ溶液で処理することにより（２時間、２回）、Ｌｙｓのε－アミンＤｄｅ基を開裂させた。Ｌｙｓのε－アミンのＡｌｌｏｃ基脱保護には、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（樹脂を基準に、０．３０当量）およびＰｈＳｉＨ３（樹脂を基準に、１０当量）を含むＣＨＣｌ３溶液による処理を用いたが、この際、アルゴンガスを泡立つように通気して充分脱気を行った（２０分間、３回）。Ａｌｌｏｃ脱保護後、樹脂を０．５０％（ｗ／ｖ）ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物のＤＭＦ溶液（２０分間、３回）で処理して残存Ｐｄ金属を除去した。無水ジグリコール酸９によるカップリングを、ＮＭＰ中のＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；樹脂を基準に、４．０当量）の存在下で行った（３時間）。次いで、ＨＡＴＵ（アミノ酸に対して０．９５モル当量）およびＤＩＥＡ（アミノ酸に対して２．０モル当量）を用いて振盪しながら（室温、３～４時間）、樹脂に４－（５－（メチルスルホニル）－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）アニリン（１８、Ａｍｂｅｅｄ、樹脂を基準に、２．０当量）を結合させた。完了した樹脂からの切断は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５（４．０ｍＬ、２時間）のカクテルを用い全脱保護で行った。混合物を濾過し、その濾液を冷ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）に加えた。得られた沈殿物を冷Ｅｔ２Ｏで洗浄した（３回）。粗生成物ペプチドを、ＭｅＣＮおよびＨ２Ｏを含む０．１％ＴＦＡに溶解し、調製用ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて精製した。必要に応じ、半調製用ＲＰ－ＨＰＬＣを用いてさらに精製を行った。ＨＰＬＣ溶離液は以下であった；Ａ：０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ；Ｂ：０．１％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ。
Ｃｕ触媒性アジド－アルキン環化付加反応の一般的手順：ＦＯＬＲ１またはインテグリンα４β１（１．０当量）のいずれかを標的とするアジド含有ペプチドをＨ２Ｏ（５．０ｍＭ）に溶解し、１４（１．１当量）のＤＭＳＯ溶液（ペプチドを基準に５．０ｍＭ）と混合した。これとは別に、Ｈ２Ｏに溶解した４．０％（ｗ／ｖ）ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．１３当量）、ＤＭＳＯに溶解した０．１０Ｍのトリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）（０．２５当量）、およびＨ２Ｏに溶解した０．５０Ｍのアスコルビン酸ナトリウム（５．０当量）を組み合わせた；この混合物を上記ペプチド溶液に加えて、暗所でインキュベートした（１～６日間）。得られた粗ペプチドを、以下から成る勾配を用いた調製用ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した：０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ；Ｂ：０．１％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ。
アジド葉酸およびアジド－ＬＬＰ２Ａペプチドの合成：ＦＯＬＲ１またはインテグリンα４β１のいずれかを標的とするアジドペプチドの合成は、Ｆｍｏｃを基盤とする標準的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）プロトコルを用いて実施したが、この際、該プロトコルでは、ヒドラジン処理で選択的に脱保護し、ペプチド樹脂作成の最終工程で官能基化を可能とするＦｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）－ＯＨを用いた（スキーム２）。葉酸含有ペプチド（１６）は、α－保護グルタミン酸残基を有するＴＦＡ保護プテロイン酸類似体を用いて、Ｓｉｅｂｅｒ Ａｍｉｄｅ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０．７１ｍｍｏｌ／ｇ）結合ペプチド（１５）から合成した。２％（ｖ／ｖ）ヒドラジン一水和物を含むＮＭＰで、Ｌｙｓのε－アミンＤｄｅ保護基を除去した後、アジド酢酸によるカップリングでアジド基を導入した。完了した樹脂からの切断をＴＦＡカクテルで行い、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製して１６を取得した（スキーム２）。ＬＬＰ２Ａ含有ペプチド（１７）は、Ｆｍｏｃ－１－アミノシクロヘキサンカルボン酸（Ｆｍｏｃ－Ａｃｈ－ＯＨ）、Ｆｍｏｃ－Ｌ－α－アミノアジピン酸δ－ｔｅｒｔ－ブチルエステル（Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａａｄ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ）、およびＦｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）－ＯＨを用いた逐次カップリングによって、Ｓｉｅｂｅｒ Ａｍｉｄｅ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０．７１ｍｍｏｌ／ｇ）結合ペプチド（１５）から合成した。得られた樹脂に４－（Ｎ’－（２－メチルフェニル）尿素）フェニル酢酸（ＭＰＵＰＡ）ＮＨＳエステルをカップリングし、次いでＰｄ（ＰＰｈ３）４／ＰｈＳｉＨ３処理によりＡｌｌｏｃ基を選択的に除去した後、ｔｒａｎｓ－３－（３－ピリジル）アクリル酸によるカップリングを行った（Ａｇａｒｗａｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．２６、１７６－１９２、２０１５）。アクリル酸部分の望ましくない水素化を回避するために、アリルアルコール（２００当量）存在下で２％（ｖ／ｖ）ヒドラジンを含むＮＭＰを用いた処理により、Ｌｙｓのε－アミンＤｄｅ保護基を除去した（Ｗａｇｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８、２０８５－２０９２、１９９５）。次いで、アジド酢酸処理によりアジド基を導入し、完了した樹脂をＴＦＡカクテルで処理してＲＰ－ＨＰＬＣで精製することによりペプチド（１７）を取得した（スキーム２）。
Figure 2022553415000004
Figure 2022553415000005
Figure 2022553415000006
β－ラクタム－ハプテン－葉酸３およびβ－ラクタム－ハプテン－ＬＬＰ２Ａ ４の合成：化合物３および４（図４）は、それぞれ、アジドペプチド１６および１７、ならびに１４のＣｕ触媒性アジド－アルキン環化付加反応を利用して合成した（スキーム３）。
Figure 2022553415000007
Figure 2022553415000008
Figure 2022553415000009
ＭＳ－ＰＯＤＡ－葉酸５およびＭＳ－ＰＯＤＡ－ＬＬＰ２Ａ ６の合成：化合物５および６（図４）の合成は、Ｌｙｓのε－アミンＤｄｅ保護基の除去後に、アジド酢酸ＮＨＳエステルよりもむしろ、無水ジグリコール酸９および市販のＭＳ－ＰＯＤＡアニリン誘導体１８を用いてカップリングを行ったことを除いて、１６および１７の合成に関する上記の処置と同様に実施した（スキーム４）。
Figure 2022553415000010
Figure 2022553415000011
Figure 2022553415000012
上記において本発明を全体にわたって開示し、また上述の代表的な実施形態を参照しながら具体的に説明した。本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく本発明に様々な変更を加え得ることを理解されたい。また、本明細書に引用のすべての公表物、特許および特許出願は、その全体が参照として明確に本明細書に組み入れられ、いかなる観点からも、あたかもそれぞれが個別に参照として本明細書の一部を構成するが如く本明細書に参照として組み入れられるものであることにさらに留意されたい。参照として組み入れられた内容に含まれる定義が本開示における定義に矛盾する場合に限り、その定義は除外される。

Claims (20)

  1. アリール化残基Ｌｙｓ９９を含む改変触媒抗体３８Ｃ２。
  2. 請求項１の改変触媒抗体３８Ｃ２であって、ここで該触媒抗体がヒト化３８Ｃ２（ｈ３８Ｃ２）である、改変触媒抗体３８Ｃ２。
  3. 請求項１の改変触媒抗体３８Ｃ２であって、ここで残基Ｌｙｓ９９がヘテロアリールメチルスルホニル化合物でアリール化される、改変触媒抗体３８Ｃ２。
  4. 請求項３の改変触媒抗体３８Ｃ２であって、ここで該ヘテロアリールメチルスルホニル化合物がメチルスルホンフェニルオキサジアゾール（ＭＳ－ＰＯＤＡ）である、改変触媒抗体３８Ｃ２。
  5. 触媒抗体３８Ｃ２および化学物質部分を含む抗体化学物質複合体であって、ここで化学物質部分が、ヘテロアリールメチルスルホニル化合物を介して、該抗体の反応性残基Ｌｙｓ９９に結合している、抗体化学物質複合体。
  6. 請求項５の抗体化学物質複合体であって、ここで該触媒抗体３８Ｃ２がヒト化３８Ｃ２である、抗体化学物質複合体。
  7. 請求項５の抗体化学物質複合体であって、ここで該触媒抗体３８Ｃ２がＩｇＧ１またはＦａｂである、抗体化学物質複合体。
  8. 請求項５の抗体化学物質複合体であって、ここで抗体３８Ｃ２に対する共役反応の前に、該化学物質部分がヘテロアリールメチルスルホニル化合物で誘導体化される、抗体化学物質複合体。
  9. 請求項５の抗体化学物質複合体であって、ここで該ヘテロアリールメチルスルホニル化合物がメチルスルホンフェニルオキサジアゾール（ＭＳ－ＰＯＤＡ）である、抗体化学物質複合体。
  10. 請求項５の抗体化学物質複合体であって、ここで該化学物質部分が薬剤部分または細胞傷害剤である、抗体化学物質複合体。
  11. 請求項１０の抗体化学物質複合体であって、ここで該薬剤部分がＭＭＡＦである、抗体化学物質複合体。
  12. 請求項１０の抗体化学物質複合体であって、二重可変ドメイン抗体薬剤複合体（ＤＶＤ－ＡＤＣ）である、抗体化学物質複合体。
  13. 請求項１２の抗体化学物質複合体であって、腫瘍抗原を特異的に標的とする可変ドメインを含む、抗体化学物質複合体。
  14. 請求項５の抗体化学物質複合体であって、ここで該化学物質部分が標的化部分である、抗体化学物質複合体。
  15. 請求項１４の抗体化学物質複合体であって、ここで該標的化部分が葉酸またはＬＬＰ２Ａである、抗体化学物質複合体。
  16. 化学物質を触媒抗体３８Ｃ２に結合させる方法であって、該方法が：
    （ａ）誘導体化化学物質を生成するために、該化学物質をヘテロアリールメチルスルホニル化合物と反応させること；
    および
    （ｂ）該誘導体化化学物質を触媒抗体３８Ｃ２と反応させて、化学物質と触媒抗体３８Ｃ２とを結合させること、
    を含む、方法。
  17. 請求項１６の方法であって、ここで該化学物質が薬剤部分または標的化部分である、方法。
  18. 請求項１６の方法であって、ここで該化学物質が低分子物質または核酸物質である、方法。
  19. 有効量の、請求項１０の抗体化学物質複合体および任意選択的に薬学的に許容可能な担体を含む医薬品組成物。
  20. 対象における癌を治療する方法であって、治療が必要な対象に請求項１９の医薬品組成物を投与することを含む、方法。
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