JP2022550743A - 組換えインターロイキン－１５アナログ - Google Patents

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Abstract

本発明は、アミノ酸配列が、ＩＬ－１５アミノ酸配列およびＩＬ－１５アミノ酸配列のＣ末端に付加した１または複数のアミノ酸を含み、この１または複数のアミノ酸は、正電荷を帯びたアミノ酸を含む、ＩＬ－１５アナログを開示する。本発明のＩＬ－１５アナログは、大腸菌における発現が高く、発現量は野生型ＩＬ－１５の約２０倍であり、かつその生体外細胞活性には有意差がない。本発明は、脂肪酸鎖を結合することにより、ＩＬ－１５アナログの半減期を向上させ、その持効性を向上させたＩＬ－１５アナログの複合体をさらに開示する。本発明は、ＩＬ－１５タンパク質医薬品の産業化への基盤を確立する。【選択図】図３

Description

本発明は、分子生物学分野に属し、具体的には、組換えインターロイキン－１５アナログおよびその発現に関する。
インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）は、約１２～１４ｋＤのサイトカインであり、天然のヒトインターロイキン１５成熟ペプチドは、１１４個アミノ酸を含有し、４個のシステイン残基を含み、Ｃｙｓ３５とＣｙｓ８５、Ｃｙｓ４２とＣｙｓ８８が結合し、形成された２対の分子内ジスルフィド結合が、ＩＬ－１５の立体配座および生物学的活性の保持のために重要な役割を果たしている。
大多数のサイトカインと同様に、ＩＬ－１５は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を促進するなど、個体の正常な免疫反応において作用する。 ＩＬ－１５とＩＬ－２は、共通の受容体ＩＬ－２Ｒβ鎖およびγ鎖を有するため、その生物学的活性が類似している。しかしながら、異なるα鎖受容体を有するため、ＩＬ－２はＴｒｅｇ細胞を活性化させ、Ｔｅｆｆ細胞およびＮＫ細胞のアポトーシス（ＡＩＣＤ）を誘導し、臨床用途が極めて制限される。同ファミリーのＩＬ－１５には、Ｔｒｅｇ活性化およびＡＩＣＤの機能がないため、ＩＬ－１５は、治療において大きな潜在性を秘めている。
ＩＬ－１５受容体のαサブユニットとＩＬ－１５は親和性が高く、生理的状態でＩＬ－１５の多くがαサブユニットと複合体（ＩＬ－１５－Ｒα）を形成し、受容体のβ鎖およびγ鎖サブユニットに対するＩＬ－１５の親和性を増強し、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化させる。そのため、ＡＬＴＯＲや恒瑞等の企業は、αサブユニットの特徴を利用し、融合または非融合の方法を用いて、ＩＬ－１５とαサブユニット（またはその一部）によって複合体を形成しており、動物試験において良好な生物学的利用能および安定性が示されている。
ＩＬ－１５受容体のαサブユニットは、骨髄系細胞表面に発現し、マクロファージ、抗原提示細胞、ならびにＮＫ細胞およびＴ細胞を含み、同様に生体内の抗腫瘍において重要な役割を果たしている。そのため、ＩＬ－１５－Ｒα複合体は生体内のαサブユニットに依存せず、ＩＬ－１５単体の安定性を高めるが、天然のＩＬ－１５とは機能的に微妙な違いがあり、このような違いによって、生体内の抗腫瘍において本質的な違いが現れる可能性がある。
ＩＬ－１５は、ＩＬ－２よりも高い安全性および活性を有しているが、タンパク質医薬品として、天然の野生型のＩＬ－１５には原核生物および真核生物発現の発現量が低く、精製が困難であり、半減期が短いなど、医薬品開発における明らかなボトルネックが存在してことにより、産業化が難しいため、その外因性発現について研究し、高い生産効率を得る必要がある。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ再生により得られたＩＬ－１５アナログのＮ末端またはＣ末端においてヒト血清アルブミン結合体脂肪酸鎖を結合し、持効性の効果を達成することもでき、腫瘍等の治療に対して一定の意義を有する。
従来技術におけるＩＬ－１５の生産効率の低さに鑑み、本発明は、発現量が高く、精製が相対的に簡単なＩＬ－１５アナログを提供する。また、本発明は、ＩＬ－１５の半減期を向上させ、その持効性を向上させたＩＬ－１５アナログの複合体をさらに提供する。
本発明の一態様において、ＩＬ－１５アナログを提供し、１つの具体的な実施形態において、このＩＬ－１５アナログのアミノ酸配列は、ＩＬ－１５アミノ酸配列およびＩＬ－１５アミノ酸配列のＣ末端に付加した１または複数のアミノ酸を含む。
さらに、前記１または複数のアミノ酸は、正電荷を帯びたアミノ酸を含む。
さらに、ＩＬ－１５アナログのアミノ酸配列は、次の特徴を有する。ＩＬ－１５－Ｘａ－Ｙｂ－Ｚｃ。式中、Ｘ、ＹおよびＺはＣ末端に付加したアミノ酸配列を表し、ａ、ｂおよびｃはアミノ酸の個数を表す。
ＸおよびＺは任意のアミノ酸またはその組み合わせであり、ａおよびｃは０～２０である。Ｙは正電荷を帯びたアミノ酸もしくはその組み合わせ、または正電荷を帯びたアミノ酸および他の任意のアミノ酸の組み合わせであり、ｂは１～７である。
さらに、正電荷を帯びたアミノ酸は、Ｈ、ＲおよびＫである。
選択可能に、前記Ｘは、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｌ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｔ、Ｇのいずれか１つまたはその組み合わせを含む。
選択可能に、ＩＬ－１５アナログのアミノ酸配列は、次の特徴を有する。ＩＬ－１５－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｘａ－Ｙｂ－Ｚｃ。式中、ＬｉｎｋｅｒはＩＬ－１５アミノ酸配列とＣ末端に付加したアミノ酸配列との間にあるリンカー配列を表す。
さらに、Ｌｉｎｋｅｒは（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＳ）ｎまたは（ＧＡＰＱ）ｎであり、ｎは０～１０である。
さらに、ＸａはＬＰＢＴＧを含み、Ｂは任意のアミノ酸であり、Ｌｉｎｋｅｒは（ＧＳ）ｎである。
選択可能に、ＩＬ－１５アナログのアミノ酸配列は、次に示すとおりである。ＩＬ－１５－ＧＳＧＳＧＳ－ＨＨＨＨＨＨ、ＩＬ－１５－ＧＳ－ＨＨＨＨＨＨ、ＩＬ－１５－ＰＬＡＳＴＫＫＲ、ＩＬ－１５－ＬＰＫＳＡＫＫＫ、ＩＬ－１５－ＫＫＫＫＫＫＫ、ＩＬ－１５－（ＧＡＰＱＧＡＰＱ）－ＬＶＥＳＡＨＨＨ、ＩＬ－１５－ＧＳ－ＬＶＳＳＡＨＨＫ、ＩＬ－１５－ＧＳ－ＬＩＥＨＨＲＲＫ、ＩＬ－１５－ＧＳ－ＩＶＥＨＲＫＫＫ、ＩＬ－１５－ＧＳ－ＶＰＫＴＧＲＲＲ、ＩＬ－１５－ＧＳ－ＬＶＡＳＧＫＫ、ＩＬ－１５－ＧＳ－ＨＲＫＳＧＨＨＨ、ＩＬ－１５－ＧＳ－ＬＰＫＴＧＲＨＫ、ＩＬ－１５－ＫＫＫＴＧＲＲＨ、ＩＬ－１５－ＬＰＲＳＧＲＨＫ、ＩＬ－１５－ＬＶＥＴＨＨＨＨ、ＩＬ－１５－ＶＲＰＥＴＨＨＨ、ＩＬ－１５－ＫＫＫ、ＩＬ－１５－ＲＨＨＨＨ、ＩＬ－１５－ＫＲＥＴＨＨＨＨ、ＩＬ－１５－ＧＳ－ＬＰＥＴＧ－ＧＳＧＧＳＨＨＨＨＨＨ、ＩＬ－１５－ＨＬＥＴＧＫＫＫ、ＩＬ－１５－ＨＶＥＳＧＲＲＲ、ＩＬ－１５－ＲＲＨＴＧＫＫＫ、ＩＬ－１５－ＨＶＫＴＧＨＨＨ、ＩＬ－１５－ＨＶＫＳＧＲＨＨ、ＩＬ－１５－ＨＶＫＳＳＨＲＨ、ＩＬ－１５－ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ－ＬＶＫＳＧＨＨＨ、ＩＬ－１５－ＲＰＫＳＧＨＨＫ、ＩＬ－１５－ＫＫＣ、ＩＬ－１５－ＬＨＫＡＧＫＨＨ、ＩＬ－１５－Ｋ、ＩＬ－１５－ＫＫ。
さらに、ＩＬ－１５のアミノ酸配列は、次のものから選ばれる。
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるアミノ酸配列
２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるアミノ酸配列を１または複数のアミノ酸の置換、欠失または付加により生成したアミノ酸配列
３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列
本発明の２つ目の態様において、上記のＩＬ－１５アナログをコードするヌクレオチド配列を提供する。
本発明の３つ目の態様において、原核生物系において上記のＩＬ－１５アナログを発現するＩＬ－１５アナログの製造方法を提供する。
さらに、ＩＬ－１５アナログをコードするヌクレオチド配列を原核生物発現ベクターに連結し、原核生物発現生物宿主菌に導入し、誘導によりＩＬ－１５アナログを発現する。
選択可能に、ＩＬ－１５アナログは、封入体の方式で発現し、封入体を再生する。
選択可能に、封入体を８Ｍ尿素溶液に溶解し、イオン交換および逆相クロマトグラフィー法によって精製する。
選択可能に、原核生物発現ベクターはｐＥＴ４１ａであり、発現宿主菌は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＣ４１（ＤＥ３）である。
本発明の４つ目の態様において、上記のＩＬ－１５アナログをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供する。
本発明の５つ目の態様において、上記のＩＬ－１５アナログをコードするヌクレオチド配列が形質転換された宿主菌を提供する。
本発明の６つ目の態様において、ＩＬ－１５アナログのアミノ酸配列が、ＩＬ－１５アミノ酸配列およびＩＬ－１５アミノ酸配列のＣ末端に付加した１または複数のアミノ酸を含み、ＩＬ－１５アナログが脂肪酸鎖に結合している、ＩＬ－１５アナログの複合体を提供する。
さらに、前記ＩＬ－１５アナログのアミノ酸配列は、次の特徴のいずれかを有する。
１）ＩＬ－１５－Ｘａ－Ｙｂ－Ｚｃ、式中、Ｘ、ＹおよびＺはＣ末端に付加したアミノ酸配列を表し、ａ、ｂおよびｃはアミノ酸の個数を表す、ＸおよびＺは任意のアミノ酸またはその組み合わせであり、ａおよびｃは０～２０である。Ｙは正電荷を帯びたアミノ酸もしくはその組み合わせ、または正電荷を帯びたアミノ酸および他の任意のアミノ酸の組み合わせであり、ｂは１～７である。
２）ＩＬ－１５－Ｌｉｎｋｅｒ１－Ｘａ－Ｙｂ－Ｚｃ、式中、ＬｉｎｋｅｒはＩＬ－１５アミノ酸配列とＣ末端に付加したアミノ酸配列との間にあるリンカー配列を表す。
さらに、ＸａはＬＰＢＴＧを含み、Ｂは任意のアミノ酸であり、Ｌｉｎｋｅｒは（ＧＳ）ｎであり、ｎは０～１０である。
さらに、脂肪酸鎖は－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯＯＨである。式中、ｍは１２～１９である。
さらに、ＩＬ－１５アナログは、前記脂肪酸鎖とｉｎ ｖｉｔｒｏカップリングの方式で結合している。
さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏカップリングの方式は、次のものを含む。
１）酵素反応によってカップリングを行い、酵素反応方式の脂肪酸鎖Ｎ末端がいずれもＧＧＧ（アミノ酸ｇｌｙｃｉｎｅ）を有する
２）ＩＬ－１５アナログに導入された自由システイン残基とカップリングを行う
３）ＩＬ－１５アナログのＮ末端アミノ基とカップリングを行う
さらに、酵素反応によってカップリングを行う際に、脂肪酸鎖Ｎは、グリシンを３個有する。
ＩＬ－１５アナログに導入された自由システイン残基とカップリングを行う際に、脂肪酸鎖は、マレイミドエステルまたはハロゲン化反応基を有する。
ＩＬ－１５アナログのＮ末端アミノ基とカップリングを行う際に、脂肪酸鎖は、ホルミル基またはスクシンイミドエステル官能基を有する。
選択可能に、ＩＬ－１５アミノ酸配列の末端に、－ＧＳ－ＬＰＥＴＧを含む配列を付加する。
代替方法として、脂肪酸鎖から選ばれたもの：ＧＧＧ－ＰＥＧ２－Ｌｙｓ－（ＣＨ２）１６－ＣＯＯＨ及びＮＨＳ－ＰＥＧ２－ＰＥＧ２－γ－Ｇｌｕ－（ＣＨ２）１７－ＣＯＯＨ， ＧＧＧ－ＰＥＧ４－ＰＥＧ４－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ－（ＣＨ２）１７－ＣＯＯＨ、ＧＧＧ－ＰＥＧ４－γ－Ｇｌｕ－γ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＣＨ２）１７－ＣＯＯＨ、ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－γ－Ｇｌｕ－γ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－ＧＧＧ、ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯＮＨ－γ－Ｇｌｕ－γ－Ｇｌｕ－ＰＥＧ２－Ｌｙｓ－Ｂｒ、ＧＧＧ－γ－Ｇｌｕ－Ｃ２ＤＡ－２ＯＥＧ－γ－Ｇｌｕ－（ＣＨ２）１７－ＣＯＯＨ、ＧＧＧ－γ－Ｇｌｕ－Ｃ２ＤＡ－２ＯＥＧ－γ－Ｇｌｕ－（ＣＨ２）１９－ＣＯＯＨ、ＧＧＧ－ＯＥＧ－Ｃ２ＤＡ－２ＯＥＧ－γ－Ｇｌｕ－（ＣＨ２）１９－ＣＯＯＨ、ＧＧＧ－ＯＥＧ－Ｃ２ＤＡ－２ＯＥＧ－γ－Ｇｌｕ－Ｔｒｘ－（ＣＨ２）１９－ＣＯＯＨ、ＣＨＯ－ＰＥＧ２－ＰＥＧ２－γ－Ｇｌｕ－（ＣＨ２）１７－ＣＯＯＨ及びＭａｌ－Ｃ２ＤＡ－２ＯＥＧ－γ－Ｇｌｕ－Ｔｎ－（ＣＨ２）１９－ＣＯＯＨ。
本研究によって、ＩＬ－１５のＣ末端にアミノ酸を付加することは、大腸菌におけるＩＬ－１５の発現に寄与することがわかり、かつ正電荷を帯びたアミノ酸は、ＩＬ－１５の発現を著しく増強できることがわかった。本発明のＩＬ－１５アナログは、大腸菌における発現が高く、発現量はＣ末端に追加のアミノ酸を有さないＩＬ－１５の約２０倍以上であった。本発明のＩＬ－１５アナログ本体の全部または大部分に天然野生型ＩＬ－１５のアミノ酸配列が保たれており、そのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞活性には有意差がなく、これは、ＩＬ－１５タンパク質医薬品の産業化への基盤を確立する。
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏカップリングの方式によって脂肪酸鎖をＩＬ－１５アナログと連結し、ＩＬ－１５アナログ－脂肪酸鎖カップリング生成物を形成するものである。脂肪酸鎖がアルブミンの配位子であることにより、血液中のアルブミンと結合することができるため、生体内に入ったＩＬ－１５アナログ－脂肪酸鎖がＩＬ－１５アナログ－脂肪酸鎖－アルブミン複合体を形成する。分子量を増大させ、腎臓のろ過作用から逃れさせることができるとともに、アルブミンがＦｃＲｎと結合することにより、それによって誘導される再循環経路を介して細胞内のリソソームの加水分解によって誘導される保護機序を回避し、ＩＬ－１５アナログ－脂肪酸鎖の持効機序を達成する。本発明のＩＬ－１５アナログの複合体は、中国の大部分の企業が採用的しているＩＬ－１５受容体αサブユニットと共発現して複合体を形成する医薬品形式を採用しておらず、天然ＩＬ－１５と同様の細胞生物学モデルを保っており、すなわち、ＩＬ１５Ｒα受容体との結合を完全に保つことにより、シグナル伝達に関与して機能する。
本発明の比較例における大腸菌中で野生型ＩＬ－１５が発現したＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。 本発明の実施例における大腸菌中でＩＬ－１５アナログが発現したＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。ＩＬ－１５アナログ１～３および５～８のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。 ＩＬ－１５アナログ９～１３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。 ＩＬ－１５アナログ４およびアナログ１４～１８のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。 ＩＬ－１５アナログ１９～２７のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。 ＩＬ－１５アナログ２８～３３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。 アナログ３４～４３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図であり、そのうちアナログ３８－～ ４３－は、Ｃ末端に特定のアミノ酸が付加されていないことを表す。 アナログ３４～４３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図であり、そのうちアナログ３８－～ ４３－は、Ｃ末端に特定のアミノ酸が付加されていないことを表す。 ＩＬ－１５およびＩＬ－１５アナログ１～３３の発現量比較図である（単位：ｍｇ／ｍｌ／１０ＯＤ）。 再生し精製したＩＬ－１５およびＩＬ－１５アナログ１１、１８、２１、２８のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。図中、Ｍａｒｋｅｒ左側は還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果であり、電気泳動ローディングバッファーに還元剤２－メルカプトエタノールを加えた。Ｍａｒｋｅｒ右側は非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果であり、電気泳動ローディングバッファーに還元剤２－メルカプトエタノールを加えなかった。 実施例３におけるＲＰ－ＵＰＬＣでＩＬ－１５アナログを検出した複合体純度クロマトグラムである（純度＞９５％）。 実施例３におけるＬＣ－ＭＳでＩＬ－１５アナログを同定した複合体分子量である。 実施例４におけるＬＣ－ＭＳでＩＬ－１５アナログを同定した複合体分子量である。 実施例７におけるマウス生体内でのＩＬ－１５アナログ２１およびＩＬ－１５アナログの複合体の腫瘍抑制効果図である。
以下、実施例を組み合わせ、本発明についてさらに説明するが、これらの実施例の目的は例証にすぎず、本発明の保護範囲を制限するためのものではないと理解すべきである。
以下の実施例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの分子クローニング：実験室マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載の条件、またはメーカーが推奨する条件などの常套の条件による。採用した試薬は、特に説明がない場合、いずれも市販されている、または一般ルートで入手可能な試薬である。
本発明の具体的な実施形態において、正電荷を帯びたアミノ酸は、ロイシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。
形質転換の基礎としたＩＬ－１５のアミノ酸配列は、次のものから選ぶ。
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるアミノ酸配列
２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるアミノ酸配列を１または複数のアミノ酸の置換、欠失または付加により生成したアミノ酸配列
３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列
本発明の具体的な実施形態において、ＩＬ－１５のＣ末端に１または複数のアミノ酸、特に正電荷を帯びたアミノ酸を付加することにより、ＩＬ－１５の発現、特に原核生物発現系における発現を高めることができる。
いくつかの具体的な実施形態において、ＩＬ－１５アナログのアミノ酸配列は、次の一般式によって表すことができる。ＩＬ－１５－Ｘａ－Ｙｂ－Ｚｃ、すなわち、ＩＬ－１５のＣ末端にアミノ酸配列Ｘａ－Ｙｂ－Ｚｃが付加されている。式中、Ｘ、ＹおよびＺはＣ末端に付加したアミノ酸配列を表し、ａ、ｂおよびｃはアミノ酸の個数を表す。ＸおよびＺは任意のアミノ酸またはその組み合わせであり、ａおよびｃは０～２０である。Ｙは正電荷を帯びたアミノ酸もしくはその組み合わせ、または正電荷を帯びたアミノ酸および他の任意のアミノ酸の組み合わせであり、ｂは１～７である。
いくつかの具体的な実施形態において、ＩＬ－１５アナログのアミノ酸配列は、次の一般式によって表すことができる。ＩＬ－１５－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｘａ－Ｙｂ－Ｚｃ、すなわち、ＩＬ－１５のＣ末端にＬｉｎｋｅｒ配列、およびアミノ酸配列Ｘａ－Ｙｂ－Ｚｃが付加されている。式中、Ｘ、ＹおよびＺはＣ末端に付加したアミノ酸配列を表し、ａ、ｂおよびｃはアミノ酸の個数を表す。ＸおよびＺは任意のアミノ酸またはその組み合わせであり、ａおよびｃは０～２０である。Ｙは正電荷を帯びたアミノ酸もしくはその組み合わせ、または正電荷を帯びたアミノ酸および他の任意のアミノ酸の組み合わせであり、ｂは１～７である。
いくつかの選択可能な具体的な実施形態において、Ｌｉｎｋｅｒは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＳ）ｎまたは（ＧＡＰＱ）ｎであってよく、ｎは１～５である。
いくつかの具体的な実施形態において、ＩＬ－１５アナログのアミノ酸配列の上記一般式におけるＸａは、ＬＰＢＴＧを含み、Ｂは任意のアミノ酸であり、Ｌｉｎｋｅｒは（ＧＳ）ｎであり、ｎは０～１０である。１つの具体的な実施形態において、このＩＬ－１５アナログは、ＩＬ－１５アミノ酸配列の末端に、－ＧＳ－ＬＰＥＴＧを含む配列が付加されている。
いくつかの具体的な実施形態において、ＩＬ－１５アナログの持効性を高めるため、ＩＬ－１５アナログをｉｎ ｖｉｔｒｏで脂肪酸鎖とカップリングする。脂肪酸鎖のｉｎ ｖｉｔｒｏカップリングの方式は、次のものであってよい。
１）Ｎ末端アミノ基とのカップリングは、例えば、ホルミル基またはスクシンイミドエステル等を用いる。
２）定点での導入する自由システイン残基とのカップリングは、例えば、ＩＬ－１５アナログＣ末端に自由なシステイン残基を導入し、マレイミド基またはハロゲン化基を用いる。
３）酵素反応により、例えば、Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ酵素は、ＩＬ－１５ Ｃ末端に有する小ペプチドＬＰＥＴＧを利用することができ、Ｎ末端にＧＧＧを有する脂肪酸鎖をこれとカップリングする（Ｂｅｎｔｌｅｙ ＭＬら （２００８）． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８３： １４７６２～１４７７１）。脂肪酸鎖の構成は、表１に示す構成を含んでもよい。
Figure 2022550743000002
大腸菌における実施例１の野生型ＩＬ－１５およびＩＬ－１５アナログの発現
１．１ 発現ベクターの構築
野生型ＩＬ－１５ヌクレオチド配列は、上海生工公司が合成した。
（１） プライマー設計
付加する必要のある異なるアミノ酸の塩基配列をリバースプライマーに導入することにより、ＩＬ－１５のＣ末端配列を変えた。野生型ＩＬ－１５、構築したＩＬ－１５アナログのアミノ酸配列、ヌクレオチド配列および構築時に使用したプライマー配列を表２に示す。
Figure 2022550743000003
Figure 2022550743000004
Figure 2022550743000005
Figure 2022550743000006
Figure 2022550743000007
Figure 2022550743000008
アナログ３４～４３は、野生型ＩＬ－１５に変異を導入してＩＬ－１５変異体を形成した後、ＩＬ－１５変異体の基礎の上でＣ末端に配列ＧＳＬＰＥＴＧＧＳＧＧＳＨＨＨＨＨＨを付加して形成されたものであり、アナログ３４－～４３－は、変異導入後に形成されたＩＬ－１５変異体である。変異アナログ３４～４３およびＣ末端にＧＳＬＰＥＴＧＧＳＧＧＳＨＨＨＨＨＨ配列を付加していないアナログ３８－～アナログ４３－のヌクレオチド配列は、金唯智公司が合成し、ｐＥＴ４１ａベクターにクローニングした。
Figure 2022550743000009
Figure 2022550743000010
（２） ＰＣＲ増幅
３種類の場合に分けた。
１種類目は、リバースプライマーを１個しか必要とせず、ＰＣＲを計１サイクル行った。試料注入体系：５０ μＬ（１管配置）
プライマー：フォワードプライマーおよびリバースプライマー。鋳型：ＩＬ－１５。アニーリング温度：６１℃。伸長時間：３０秒
２種類目は、リバースプライマーを２個必要とし、ＰＣＲを計２サイクル行った。
１サイクル目のＰＣＲの試料注入体系：２０ μＬ（１管配置）
プライマー：フォワードプライマーおよびリバースプライマー１。鋳型：ＩＬ－１５。アニーリング温度：６１℃。伸長時間：３０秒
２サイクル目のＰＣＲの試料注入体系：５０ μＬ（１管配置）
プライマー：フォワードプライマーおよびリバースプライマー２。鋳型：１サイクル目のＰＣＲ産物。アニーリング温度：６１℃。伸長時間：３０秒
３種類目は、リバースプライマー３個とし、ＰＣＲを計３サイクル行った。
１サイクル目のＰＣＲの試料注入体系：２０ μＬ（１管配置）
プライマー：フォワードプライマーおよびリバースプライマー１。鋳型：ＩＬ－１５。アニーリング温度：６１℃。伸長時間：３０秒
２サイクル目のＰＣＲの試料注入体系：２０ μＬ（１管配置）
プライマー：フォワードプライマーおよびリバースプライマー２。鋳型：１サイクル目のＰＣＲ産物。アニーリング温度：６１℃。伸長時間：３０秒
３サイクル目のＰＣＲの試料注入体系：５０ μＬ（１管配置）
プライマー：フォワードプライマーおよびリバースプライマー３。鋳型：２サイクル目のＰＣＲ産物。アニーリング温度：６１℃。伸長時間：３０秒
ＰＣＲ試料注入体系：２０ μＬ
５×ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ（登録商標） ＦａｓｔＰｆｕ Ｆｌｙ ｂｕｆｆｅｒ４ μＬ
フォワードプライマー（５ μＭ）１．２ μＬ
リバースプライマー（５ μＭ）１．２ μＬ
ｄＮＴＰｓ （２．５ ｍＭ）１．６ μＬ
鋳型０．５ μＬ
Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．４ μＬ
ｄｄＨ２Ｏを２０ μＬ補充
ＰＣＲ試料注入体系：５０ μＬ
５×ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ（登録商標） ＦａｓｔＰｆｕ Ｆｌｙ ｂｕｆｆｅｒ１０ μＬ
フォワードプライマー（５ μＭ）３ μＬ
リバースプライマー（５ μＭ）３ μＬ
ｄＮＴＰｓ （２．５ ｍＭ）４ μＬ
鋳型０．５ μＬ
Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１ μＬ
ｄｄＨ２Ｏを５０ μＬ補充
ＰＣＲ反応手順：

Figure 2022550743000011
（３） ベクター酵素切断
反応系：３０ μＬ、よく混ぜた後３７℃で一晩置いた。

Figure 2022550743000012
（４） ゲルからのＰＣＲ産物および酵素切断したベクターの回収
（５） 組換えローディング
反応系：２０ μＬ

Figure 2022550743000013
ベクターとセグメントのモル比は２：１であり、３７℃で３０ 分反応させ、直ちに氷上で冷却し、ＤＨ５αに導入して形質転換した。
（６） 菌検査
１．５ｍＬの遠心管にＡｍｐ含有ＬＢ培地０．５ ｍＬを加え、良好に成長したシングルコロニーを接種し、合計５管接種し、３７℃でシェーカーで振とう培養した。３ 時間培養した後、１ μＬ取って鋳型とし、菌液ＰＣＲを行った。
反応系：１０ μＬ
Figure 2022550743000014
PCR反応手順：
Figure 2022550743000015
ＰＣＲ完了後に、アガロースゲル電気泳動で検出し、陽性クローンを３個選択してシーケンシング（生物工学）を行った。
（７） 陽性菌液の保存およびプラスミドの抽出
正確にシーケンシングされた陽性クローンを、Ａｍｐ耐性のＬＢ液体培地５ ｍＬに接種し、接種量は１０ μＬとした。菌液５００ μＬを取り１．５ ｍＬの遠心管に加え、４０％のグリセロール５００ μＬを加え、保存に用いた。名称、宿主菌、日付を書き、パラフィルムを用いて封をし、－８０℃の冷蔵庫に入れて保存した。
残りの菌液を遠心分離して菌体を収集し、プラスミド抽出に用いた。
１．２ 野生型ＩＬ－１５およびＩＬ－１５アナログのタンパク質発現
（１） ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換
ａ） プラスミド２ μＬを取り、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル１００ μＬに加え、直ちによく混ぜ、氷上に３０ 分置いた。
ｂ） ４２℃で９０ 秒熱ショック活性化し、２ 分急速に氷浴した。
ｃ） ＬＢ培地５００ μＬを加え、３７℃、ｒｐｍ≦２００で６０ 分振とう培養した。
ｄ） ６０００ｒｐｍで１分遠心分離し、大部分の上清を捨て、約１００－１５０ μＬを残し、菌体を再懸濁した後、Ａｍｐ含有ＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。
（２） 小量発現
ａ） 保菌：単クローンをＡｍｐ耐性のＬＢ培地１ ｍＬ中に１個取り、３７℃、２２０ ｒｐｍで約５時間振とう培養し、４０％グリセロール１ｍＬを加え、２管に分け、－８０℃で凍結保存した。
ｂ） 前のステップの管にＡｍｐ含有ＬＢ液体培地２．５ ｍＬを加え、３７℃、２２０ ｒｐｍで一晩振とう培養した。
ｃ） 一晩培養した菌液を、１：５０の比でＡｍｐ含有ＬＢ培地２０ｍｌに移し、３７℃、２２０ ｒｐｍでＯＤ６００＝０．６まで培養し（約３時間）、最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを加え、３７℃、２２０ ｒｐｍで３時間培養した。
（３） ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる発現量の同定
ａ） 培養液のＯＤ６００を測定し、菌液１０ＯＤを取り、１００００ｒｐｍで２分遠心分離し、上清を捨てた。
ｂ） １ ｍＬ溶解液 （１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、 ｐＨ ８．０）で菌体を再懸濁し、氷上に置き、超音波の条件１３０Ｗ、４分、ｏｎ ３秒、ｏｆｆ ３秒で超音波処理して細胞を溶解した。
ｃ） 超音波処理終了後、８０μＬを取ってＴ（ｌｙｓｉｓ ｔｏｔａｌ）とマークし、残りの液体を１２０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、上清（ｌｙｓｉｓ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ、Ｓ）および沈殿（ｌｙｓｉｓ ｐｅｌｌｅｔ、Ｐ）を得た。Ｔ、ＰおよびＳ ８０μＬにそれぞれ５×Ｒｅｄｕｃｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ２０μＬを加え、各試料を１２．５μＬ（０．１ＯＤ）取り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行った。
ＩＬ－１５野生型の電気泳動図は、図１に示すとおりであり、全溶解液であっても、上清または沈殿であっても、基本的に野生型ＩＬ－１５の発現が検出されなかった。ＩＬ－１５アナログ１～アナログ３３の電気泳動図は、図２ａ～図２ｅに示すとおりであり、ＩＬ－１５アナログの発現量は、野生型ＩＬ－１５よりも著しく高かったが、Ｃ末端にＧＳＬＰＥＴＧＧＳＧＧＳＨＨＨＨＨＨ配列を有するＩＬ－１５アナログ（アナログ３４～４３）の発現量も、図２ｆおよび２ｇに示したように、Ｃ末端に配列を有していないＩＬ－１５アナログ（アナログ３８－ ～ ４３－）よりも著しく高かった。
（４） ＨＰＬＣによる発現量の同定
ａ） 発現後に細胞１０ＯＤを収集し、１０ｍＭ、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ １ｍｌを用いて、再懸濁した。
ｂ） 超音波処理して破砕し、条件はゲル電気泳動の試料処理（上述（３））の条件と同じとした。
ｃ） 破砕した試料を、１２０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、上清を捨てた。
ｄ） 沈殿を、新たに配合した８Ｍ Ｕｒｅａ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、 １０ｍＭ ＤＴＴ １ｍｌで、室温で約１時間振とう溶解した。
ｅ） ０．２μｍシリンジフィルターでろ過し、ロードして高速クロマトグラフィー分析を行った。Ｃ４分析カラムを用いて、０．１％ ＴＦＡを含む脱イオン水を移動相Ａとし、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルを移動相Ｂとし、次いで、２０％Ｂから６０％Ｂの勾配で１５分間分析した。
ＨＰＬＣ定量結果は、図３に示したとおりであり、ＩＬ－１５アナログ１～３３の発現量は、野生型ＩＬ－１５の発現量よりも２０倍程度高かった。
実施例２ ＩＬ－１５アナログｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞活性実験
２．１ ＩＬ－１５アナログの準備
封入体で発現したＩＬ－１５アナログ１１、アナログ１８、アナログ２１およびアナログ２８を８Ｍ尿素溶液に溶解し、イオン交換および逆相クロマトグラフィー法によって精製し（具体的な方法は、Ｙｕｎｉｅｒ Ｒｏｄｒiｇｕｅｚ－Aｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ４７：９， ８８９－９００を参照）、比較的純粋なタンパク質を精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図は図４に示すとおりであった。
２．２ ＣＴＬＬ－２細胞実験
ＣＴＬＬ－２細胞の増殖実験は、一般的に用いられている細胞レベルでインターロイキン刺激免疫細胞活性を測定する実験である。そのため、ここでは、ＣＴＬＬ－２細胞に対する野生型ＩＬ－１５およびＩＬ－１５アナログの増殖効果によって、ＩＬ－１５アナログの生物学的活性を見た。
１）ＣＴＬＬ－２細胞の準備：ＦＢＳおよびＲａｔ－Ｔ－Ｓｔｉｍを含有する培養液を用いて細胞を再懸濁した。
２）試料注入：９６ウェル培養プレートに細胞を接種し、各ウェル０．１ ｍｌとした。同時に、測定する試料ＩＬ－１５アナログ１１、１８、２１および２８のタンパク質（すなわち、２．１で調製したタンパク質）をそれぞれ連続希釈し、各ウェルに０．１ ｍｌを加え、希釈濃度ごとにいずれも３ウェル設けた。培養液対照ウェル（１００ μＬ細胞＋１００ μＬ培養液）をさらに設けた。３７度、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。
３）ＭＴＳ添加：各ウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標） ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを２０μｌ加え、３７度、５％ＣＯ２で２～４時間インキュベートした。
４）測定：マイクロプレートリーダーで波長４９０ ｎｍにおける吸光度（Ａ）を測定し、ＥＣ５０値を計算した。
結果は表３に示すとおりであり、ＩＬ－１５アナログおよび野生型ＩＬ－１５の細胞活性には有意差が認められなかった。
Figure 2022550743000016
実施例３ ＩＬ－１５アナログの複合体の調製（酵素反応法）
精製したＩＬ－１５アナログ２１（ＩＬ－１５－ＧＳ－ＬＰＥＴＧ－ＧＳＧＧＳＨＨＨＨＨＨ）を用いて、ペプチド転移酵素ＳｏｒｔａｓｅＡ酵素を触媒とする結合反応によってＮ末端にＧＧＧを有する脂肪酸鎖（８１６３６６）とＩＬ－１５－ＧＳ－ＬＰＥＴＧ－ＧＳＧＧＳＨＨＨＨＨＨとを結合した。反応は、Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ：ＩＬ－１５：脂肪酸鎖の割合を１：６：３０として行い、反応ｂｕｆｆｅｒは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌとし、ｐＨ８．０、室温で３時間反応させた後に精製した。精製は、逆相クロマトグラフィーＣ８（賽分科技）を採用し、結合していないＩＬ－１５アナログ２１、反応していない脂肪酸鎖および結合した生成物を分け、最終生成物の純度をＵＰＬＣで検査した（図５参照）。ＬＣ－ＭＳ（図６）の同定により、ＩＬ－１５アナログ２１は、すでに脂肪酸鎖と結合し、ＩＬ－１５アナログ２１－８１６３６６を形成していることがわかった。
実施例４ ＩＬ－１５アナログの複合体の調製（ＩＬ－１５アナログＮ末端アミノ基に脂肪酸鎖を結合）
精製したＩＬ－１５アナログ２１を用いて、スクシンイミドエステルを有する脂肪酸鎖（８２００４４）によって、中性ｐＨにおいてＮ末端のアミノ基と結合した。反応は、ＩＬ－１５：脂肪酸鎖の割合を１：１として行い、反応ｂｕｆｆｅｒはＰＢＳとし、ｐＨ７．２で室温で１時間反応させた後に精製した。精製は、逆相クロマトグラフィーＣ８（賽分科技）を採用し、結合していないＩＬ－１５、反応していない脂肪酸鎖および結合した生成物を分け、最終生成物をＬＣ－ＭＳで同定し、図７に示すように、ＩＬ－１５はすでに脂肪酸鎖に結合し、ＩＬ－１５アナログ２１－８２００４４を形成していることがわかった。
実施例５ ＩＬ－１５アナログ２１とＩＬ－１５アナログの複合体およびＩＬ１５Ｒα受容体の結合実験
本実施例で用いたＩＬ－１５アナログの複合体は、実施例３において調製したものである。
本実施例では、バイオレイヤー干渉法（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｏｒｙ、ＢＬＩ）を採用し、標的タンパク質と受容体との間の親和性を測定した。方法は、Ｅｓｔｅｐ，Ｐら、Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ，２０１３．５（２）：ｐ．２７０－８を参照することができる。実験で用いた受容体タンパク質ＩＬ１５Ｒα－ｈｉｓは、北京志道生物科技有限公司が製造したものである。緩衝液の配合は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０とした。受容体ＩＬ１５Ｒα－ｈｉｓは、ＨＩＳＩＫセンサ（Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社、製品番号＃１８－５１２０）に予め固定化しておき、次いで確立された方法で、ｂａｓｅｌｉｎｅ、ｌｏａｄｉｎｇ、ｂａｓｅｌｉｎｅ、ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎのステップで行った。データ取得および分析作業は、それぞれＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ソフトウェアＤａｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ １１．０およびＤａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ １１．０を採用して行った。
ＩＬ－１５アナログおよびＩＬ－１５アナログの脂肪酸鎖の結合生成物と、ＩＬ１５Ｒα受容体との親和性は、表４に示すとおりであった。結合前のＩＬ－１５アナログに比べ、ＩＬ－１５アナログの脂肪酸鎖結合生成物とＩＬ１５Ｒα受容体との親和性は、有意差が認められなかった。

Figure 2022550743000017
実施例６ マウス生体内におけるＩＬ－１５アナログ２１とＩＬ－１５アナログの複合体の半減期
本実施例で用いたＩＬ－１５アナログの複合体は、実施例３において調製したものである。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス８匹を４匹ずつ２群に分け、各時点で２匹から循環採血した。マウスの尾にＩＬ－１５ ０．５ｍｇ／ｋｇを静脈注射し、投与直後、１０分、３０分、１．５時間、４時間後に採血し、マウスの尾に持効性ＩＬ－１５ ０．５ｍｇ／ｋｇを静脈注射し、投与直後、１時間、２時間、４時間後に採血し、各時点で眼窩から５０－１００μｌ採血した。血清を取り、ＩＬ－１５ ＥＬＩＳＡアッセイを行った。
半減期の計算公式：ｔ１／２＝０．６９３／ｋ、ｋ＝（ｌｎｃ０－ｌｎｃ）／ｔにより、ＩＬ－１５の半減期は約５分であり、持効性ＩＬ－１５は１．５時間に達することがわかった。
実施例７ マウス生体内におけるＩＬ－１５アナログ２１およびＩＬ－１５アナログの複合体の腫瘍抑制実験
本実施例で用いたＩＬ－１５アナログの複合体は、実施例３において調製したものである。
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス１５匹を無作為に３群に分け、それぞれ試薬対照群（ＰＢＳ）、ＩＬ－１５群および持効性ＩＬ－１５群とし、各群マウス５匹とした。Ｄａｙ１に、マウスの頸背部皮下にＢ１６－Ｆ１０細胞を２×１０５／１００ μＬ／匹で接種した。４日目～８日目に、ＰＢＳ群およびＩＬ－１５群にそれぞれ静脈注射（ｉ．ｖ．）の方式で５日連続で投与し、投与量は２０ μｇ／１００ μＬ／匹または１００μＬ／匹（ＰＢＳ群）とした。ＩＬ－１５アナログの複合体群は、Ｄａｙ４およびＤａｙ７に同様の投与方法で２回投与し、各回の同じ投与量は２０ μｇ／１００ μＬ／匹とした。Ｄａｙ１０より腫瘍の大きさの観察を開始し、６日間観察を続けた。
結果は図８に示すとおりであり、対照群と比べ、ＩＬ－１５および持効性ＩＬ－１５は、いずれも著しい腫瘍抑制作用を有した。

Claims (24)

  1. アミノ酸配列が、ＩＬ－１５アミノ酸配列およびＩＬ－１５アミノ酸配列のＣ末端に付加した１または複数のアミノ酸を含むことを特徴とするＩＬ－１５アナログ。
  2. 前記１または複数のアミノ酸が、正電荷を帯びたアミノ酸を含むことを特徴とする請求項１に記載のＩＬ－１５アナログ。
  3. 前記ＩＬ－１５アナログのアミノ酸配列が、次の特徴を有することを特徴とする請求項２に記載のＩＬ－１５アナログ。ＩＬ－１５－Ｘａ－Ｙｂ－Ｚｃ（式中、Ｘ、ＹおよびＺはＣ末端に付加したアミノ酸配列を表し、ａ、ｂおよびｃはアミノ酸の個数を表す。
    ＸおよびＺは任意のアミノ酸またはその組み合わせであり、ａおよびｃは０～２０である。Ｙは正電荷を帯びたアミノ酸もしくはその組み合わせ、または正電荷を帯びたアミノ酸および他の任意のアミノ酸の組み合わせであり、ｂは１～７である。）
  4. 正電荷を帯びたアミノ酸は、Ｈ、ＲおよびＫであることを特徴とする請求項３に記載のＩＬ－１５アナログ。
  5. 前記Ｘは、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｌ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｔ、Ｇのいずれか１つまたはその組み合わせを含むことを特徴とする請求項４に記載のＩＬ－１５アナログ。
  6. 前記ＩＬ－１５アナログのアミノ酸配列が、次の特徴を有することを特徴とする請求項３に記載のＩＬ－１５アナログ。
    ＩＬ－１５－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｘａ－Ｙｂ－Ｚｃ（式中、ＬｉｎｋｅｒはＩＬ－１５アミノ酸配列とＣ末端に付加したアミノ酸配列との間にあるリンカー配列を表す。）
  7. Ｌｉｎｋｅｒは（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＳ）ｎまたは（ＧＡＰＱ）ｎであり、ｎは０～１０であることを特徴とする請求項６に記載のＩＬ－１５アナログ。
  8. ＸａはＬＰＢＴＧを含み、Ｂは任意のアミノ酸であり、Ｌｉｎｋｅｒは（ＧＳ）ｎであることを特徴とする請求項７に記載のＩＬ－１５アナログ。
  9. 前記ＩＬ－１５のＣ末端に付加した１または複数のアミノ酸が、ＧＳＧＳＧＳ－ＨＨＨＨＨＨ、ＧＳ－ＨＨＨＨＨＨ、ＰＬＡＳＴＫＫＲ、ＬＰＫＳＡＫＫＫ、ＫＫＫＫＫＫＫ、（ＧＡＰＱＧＡＰＱ）－ＬＶＥＳＡＨＨＨ、ＧＳ－ＬＶＳＳＡＨＨＫ、ＧＳ－ＬＩＥＨＨＲＲＫ、ＧＳ－ＩＶＥＨＲＫＫＫ、ＧＳ－ＶＰＫＴＧＲＲＲ、ＧＳ－ＬＶＡＳＧＫＫ、ＧＳ－ＨＲＫＳＧＨＨＨ、ＧＳ－ＬＰＫＴＧＲＨＫ、ＫＫＫＴＧＲＲＨ、ＬＰＲＳＧＲＨＫ、ＬＶＥＴＨＨＨＨ、ＶＲＰＥＴＨＨＨ、ＫＫＫ、ＲＨＨＨＨ、ＫＲＥＴＨＨＨＨ、ＧＳ－ＬＰＥＴＧＧＳＧＧＳＨＨＨＨＨＨ、ＨＬＥＴＧＫＫＫ、ＨＶＥＳＧＲＲＲ、ＲＲＨＴＧＫＫＫ、ＨＶＫＴＧＨＨＨ、ＨＶＫＳＧＲＨＨ、ＨＶＫＳＳＨＲＨ、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ－ＬＶＫＳＧＨＨＨ、ＲＰＫＳＧＨＨＫ、ＫＫＣ、ＬＨＫＡＧＫＨＨ、Ｋ、ＫＫであることを特徴とする請求項１に記載のＩＬ－１５アナログ。
  10. 前記ＩＬ－１５アミノ酸配列は、次のものから選ばれることを特徴とする請求項１に記載のＩＬ－１５アナログ。
    １）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるアミノ酸配列。
    ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるアミノ酸配列を１または複数のアミノ酸の置換、欠失または付加により生成したアミノ酸配列。
    ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列。
  11. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のＩＬ－１５アナログをコードするヌクレオチド配列。
  12. 原核生物系において請求項１～１０のいずれか１項に記載のＩＬ－１５アナログを発現することを特徴とするＩＬ－１５アナログの製造方法。
  13. 前記ＩＬ－１５アナログをコードするヌクレオチド配列を原核生物発現ベクターに連結し、原核生物発現生物宿主菌に導入し、誘導により前記ＩＬ－１５アナログを発現することを特徴とする請求項１２に記載のＩＬ－１５アナログの製造方法。
  14. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のＩＬ－１５アナログをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
  15. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のＩＬ－１５アナログをコードするヌクレオチド配列が形質変換されたことを特徴とする宿主菌。
  16. ＩＬ－１５アナログのアミノ酸配列が、ＩＬ－１５アミノ酸配列およびＩＬ－１５アミノ酸配列のＣ末端に付加した１または複数のアミノ酸を含み、ＩＬ－１５アナログが脂肪酸鎖に結合していることを特徴とするＩＬ－１５アナログの複合体。
  17. 前記ＩＬ－１５アナログのアミノ酸配列が、次の特徴のいずれかを有することを特徴とする請求項１６に記載のＩＬ－１５アナログの複合体。
    １）ＩＬ－１５－Ｘａ－Ｙｂ－Ｚｃ（式中、Ｘ、ＹおよびＺはＣ末端に付加したアミノ酸配列を表し、ａ、ｂおよびｃはアミノ酸の個数を表す、ＸおよびＺは任意のアミノ酸またはその組み合わせであり、ａおよびｃは０～２０である。Ｙは正電荷を帯びたアミノ酸もしくはその組み合わせ、または正電荷を帯びたアミノ酸および他の任意のアミノ酸の組み合わせであり、ｂは１～７である。）
    ２）ＩＬ－１５－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｘａ－Ｙｂ－Ｚｃ（式中、ＬｉｎｋｅｒはＩＬ－１５アミノ酸配列とＣ末端に付加したアミノ酸配列との間にあるリンカー配列を表す。）
  18. ＸａはＬＰＢＴＧを含み、Ｂは任意のアミノ酸であり、Ｌｉｎｋｅｒは（ＧＳ）ｎであり、ｎは０～１０であることを特徴とする請求項１７に記載のＩＬ－１５アナログの複合体。
  19. 前記脂肪酸鎖は－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯＯＨ（式中、ｍは１２～１９）であることを特徴とする請求項１７または１８に記載のＩＬ－１５アナログの複合体。
  20. 前記ＩＬ－１５アナログは、前記脂肪酸鎖とｉｎ ｖｉｔｒｏカップリングの方式で結合していることを特徴とする請求項１７に記載のＩＬ－１５アナログの複合体。
  21. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏカップリングの方式は、次のものを含むことを特徴とする請求項２０に記載のＩＬ－１５アナログの複合体。
    １）酵素反応によってカップリングを行い、酵素反応方式の脂肪酸鎖Ｎ末端がいずれもＧＧＧを有する。
    ２）前記ＩＬ－１５アナログに導入された自由システイン残基とカップリングを行う。
    ３）前記ＩＬ－１５アナログのＮ末端アミノ基とカップリングを行う。
  22. 酵素反応によってカップリングを行う際に、脂肪酸鎖末端は、グリシンを３個有し、
    ＩＬ－１５アナログに導入された自由システイン残基とカップリングを行う際に、脂肪酸鎖は、マレイミドエステルまたはハロゲン化反応基を有し、
    ＩＬ－１５アナログのＮ末端アミノ基とカップリングを行う際に、脂肪酸鎖は、ホルミル基またはスクシンイミドエステル官能基を有することを特徴とする請求項２１に記載のＩＬ－１５アナログの複合体。
  23. 前記ＩＬ－１５アナログは、ＩＬ－１５アミノ酸配列の末端に、－ＧＳ－ＬＰＥＴＧを含む配列が付加されていることを特徴とする請求項１６に記載のＩＬ－１５アナログの複合体。
  24. 前記脂肪酸鎖が、ＧＧＧ－ＰＥＧ２－Ｌｙｓ－（ＣＨ２）１６－ＣＯＯＨ、ＮＨＳ－ＰＥＧ２－ＰＥＧ２－γ－Ｇｌｕ－（ＣＨ２）１７－ＣＯＯＨ、ＧＧＧ－ＰＥＧ４－ＰＥＧ４－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ－（ＣＨ２）１７－ＣＯＯＨ、ＧＧＧ－ＰＥＧ４－γ－Ｇｌｕ－γ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＣＨ２）１７－ＣＯＯＨ、ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－γ－Ｇｌｕ－γ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－ＧＧＧ、ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯＮＨ－γ－Ｇｌｕ－γ－Ｇｌｕ－ＰＥＧ２－Ｌｙｓ－Ｂｒ、ＧＧＧ－γ－Ｇｌｕ－Ｃ２ＤＡ－２ＯＥＧ－γ－Ｇｌｕ－（ＣＨ２）１７－ＣＯＯＨ、ＧＧＧ－γ－Ｇｌｕ－Ｃ２ＤＡ－２ＯＥＧ－γ－Ｇｌｕ－（ＣＨ２）１９－ＣＯＯＨ、ＧＧＧ－ＯＥＧ－Ｃ２ＤＡ－２ＯＥＧ－γ－Ｇｌｕ－（ＣＨ２）１９－ＣＯＯＨ、ＧＧＧ－ＯＥＧ－Ｃ２ＤＡ－２ＯＥＧ－γ－Ｇｌｕ－Ｔｒｘ－（ＣＨ２）１９－ＣＯＯＨ、ＣＨＯ－ＰＥＧ２－ＰＥＧ２－γ－Ｇｌｕ－（ＣＨ２）１７－ＣＯＯＨおよびＭａｌ－Ｃ２ＤＡ－２ＯＥＧ－γ－Ｇｌｕ－Ｔｎ－（ＣＨ２）１９－ＣＯＯＨから選ばれることを特徴とする請求項１６に記載のＩＬ－１５アナログの複合体。
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