JP2022548167A - １型糖尿病のためのプロインスリンペプチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、ペプチドに関する。ペプチドは、特にＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプを有する患者において、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防に使用することができる。本発明はまた、診断又は治療有効性を判定する方法、ペプチドを利用する方法、並びにＴ１Ｄ関連抗原ドライバーを特定する方法、対象をＴ１Ｄの高いリスクにあるとして、及び患者をＴ１Ｄ治療に好適であるかつ／又はＴ１Ｄ治療に応答するとして特定する方法にも関する。

Description

本発明は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防に使用することができる、１つ以上のペプチドに関する。
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、代謝機能不全、最も顕著にはグルコース代謝の調節不全を特徴とする自己免疫疾患であり、特徴的な長期の血管合併症及び神経学的合併症を伴う。Ｔ１Ｄは、最も一般的な自己免疫疾患の１つであり、米国では２５０人に１人が罹患しており、毎年約１０，０００～１５，０００人の新規症例が報告されており、発症率は上昇している。Ｔ１Ｄの有病率が最も高いのは、北ヨーロッパである。
Ｔ１Ｄは、絶対的なインスリン欠乏を特徴とし、患者の生存を外因性インスリンに依存させる。高血糖の症状を伴うＴ１Ｄの急性臨床発症の前には、長い無症候性の前臨床期間があり、この期間の間にインスリン産生β細胞が徐々に破壊される。
β細胞は再生しないため、一度発症すると、生涯にわたって合成インスリンの注射による治療が必要となる。一旦確立されると、糖尿病は、患者、患者の家族、及び社会にとって大きな負担となる。インスリンの最新の投薬量、調製物、及び送達システムにより、血中グルコースを妥当な範囲内に維持することができるが、数年間にわたって、その疾患の合併症が必然的に発生する。糖尿病の最も一般的な重篤な合併症は、腎不全、失明、及び神経機能の喪失である。糖尿病患者の寿命は、平均で１０年短縮される。この背景を踏まえると、Ｔ１Ｄを治療又は予防する新しい手段を検討することが重要である。
Ｔ１Ｄは、全ての自己免疫疾患と同様に、自己抗原遭遇に応答した免疫系の不適切な活性化、特に特定のＨＬＡ分子によって免疫系に対して提示される短いペプチド配列によって生じる。状態は臨床的に良好に管理できることが増えているが、依然として、生活の質及び平均余命に負の影響を及ぼす。
１型糖尿病における自己寛容の喪失の原因については議論が続いているが、ＨＬＡ系が主要な遺伝的危険因子を構成していることは十分に確立されている。ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２（ＤＲＢ１＊０３：０１－ＤＱＡ１＊０５：０１－ＤＱＢ１＊０２：０１）は、１型糖尿病患者の約３４％に見られる最も一般的なハプロタイプであり（Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５７（４）：１０８４－１０９２）、したがって、主要な、特定可能な疾患コホートを表す。ＨＬＡ分子の抗原提示特性を考慮すると、ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２に関連する糖尿病のリスクは、可能性のある糖尿病誘発性自己抗原のペプチドエピトープの選択的提示に関連していることが想定される。したがって、これらの自己抗原及び特定の疾患決定領域の特定は、疾患の病因を理解するための重要なステップである。
臨床研究において疾患関連エピトープを発見しようという試みは、一般に、抗原提示細胞上の候補ＨＬＡ分子に結合したペプチドの溶出若しくは予測、及び／又は１型糖尿病を有する対象におけるＴ細胞応答のインビトロ試験を含む。このアプローチにより、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）及び膵島抗原－２（ＩＡ－２）を含む、いくつかの膵島抗原から複数の潜在的に関連するＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２制限エピトープが得られた（Ｄｉ Ｌｏｒｅｎｚｏ ＴＰ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８（１）：１－１６）。興味深いことに、一般にヒト及びマウスの両方において１型糖尿病の初期段階に関与していると考えられているプロインスリン（Ｎａｒｅｎｄｒａｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ ２（４）：２０４－２１０）は、ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２によって提示される糖尿病関連エピトープの強力な供給源として特定されていない。しかしながら、最近のある研究では、プロインスリンＣ－ペプチドの領域が、１型糖尿病を有する対象において、ＨＬＡ－ＤＱ２制限ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を生成するとして強調されている（Ｓｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１５（４２）：１０７３２－１０７３７）。
マウスモデルにおける前臨床データは、「ドライバーＴ細胞」、すなわち、自己抗原の単一のペプチド領域に焦点を合わせたＴ細胞のコホートが存在することを示唆していることが多い。これらの重要性は、それらが疾患に対してより大きな影響を有することである。その治療上の帰結として、ドライバーＴ細胞を無効にすることができれば、疾患制御に対する効果は、第２の選択肢であるサブドミナントな標的／Ｔ細胞を使用するよりも良好となる。ドライバーＴ細胞及び抗原に由来する関連するペプチドは、ヒトの疾患において見出すことが非常に困難であり得る。疾患が時間とともに進行するにつれて、多くのサブドミナントＴ細胞クローン及び標的が関与するようになり得、ドライバーＴ細胞／標的をマスクする可能性がある。
本発明は、ヒト１型糖尿病に関連するドライバーＴ細胞の分子標的を特定する方法に対処する。これらのペプチドを特定することにより、ペプチド免疫療法によって、最も重要な疾患ドライバーを無力化することができるであろう。これは、自己免疫が開始されていない個体においては、特に重要かつ有効である。
本発明者らは、糖尿病感受性ＨＬＡトランスジェニックマウスを使用したエピトープ発見へのインビボアプローチを利用してきた。抗原及びペプチドの疾患関連性を、感受性動物において自己免疫性糖尿病の発症を促進するそれらの能力によって調査した。当該技術分野において使用されるＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２トランスジェニックマウスは、糖尿病を自然発生的に発症しない（ｄｅ Ｋａｕｗｅ ＡＬ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８２（１２）：７４４０－７４５０）。この疾患表現型を促進するために、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドで、１型糖尿病の高リスク遺伝子（ＤＲＢ１＊０３：０１－ＤＱＡ１＊０５：０１－ＤＱＢ１＊０２：０１）を発現し、かつ、ラットインスリンプロモーター（ＲＩＰ）及びヒトＣＤ４下における共刺激分子ＣＤ８０（Ｂ７．１）のヒトＣＤ８０β細胞特異的発現を有する、新規なＨＬＡトランスジェニックマウスを作製した。糖尿病の浸透率を加速し、かつ拡大する機序としてのアジュバント抗原プライミングの適用は、ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２バックグラウンドにおける糖尿病誘発性ドライバーとしての特定の膵島抗原の重要性を示す。本発明者らは、インビボで疾患関連抗原性ドライバーを特定するための新規なＨＬＡ誘導アプローチを強調し、ペプチド免疫療法において寛容を誘導するために使用することができる新規な非天然のペプチドを特定した。本発明者らは、これまでに報告されていなかったＢ鎖のＣ末端で開始される領域に対して、プロインスリンの糖尿病誘発作用を指摘した。
本発明のマウス又はヒトのプロインスリンのＢ２３－Ｃ２０領域に由来するペプチドは、これまでに、ＨＬＡ－ＤＲ３制限又はＨＬＡ－ＤＱ２制限のいずれにも特定されていなかった。更に、これまでの研究で、この領域の糖尿病誘発性を任意のハプロタイプと関連付けて直接的に実証しているものはなく、実際、選択したＨＬＡバックグラウンドに対して抗原アジュバントプライミングを使用して抗原及びエピトープの潜在的な糖尿病誘発性及び相対的優位性を調査するアプローチは、提案されていなかった。
Ｂ－Ｃジャンクションに対するＴ細胞の反応性を調べた研究はほとんどなく、ＨＬＡ－ＤＲ３／ＤＱ２制限応答については更に少ない。Ｓｅｍａｎａらは、これまでに、糖尿病患者において、プロインスリンペプチドＣ３－１６に対するＨＬＡ－ＤＲ制限ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を見出しているが、これらは、ＨＬＡについて分析されていなかった（Ｓｅｍａｎａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ １２（４）：２５９－２６７）。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１／ＤＱＢ１＊０３０２遺伝子型（ＨＬＡ－ＤＲ４／ＤＱ８ハプロタイプ）の自己抗体陽性個体では、長いＢ１１－Ｃ２４ペプチドが頻繁に認識される（Ｄｕｒｉｎｏｖｉｃ－Ｂｅｌｌｏ Ｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ １８（１）：５５－６６）。Ｓｏらは、２２個のＴ細胞クローンのうち３個でＣ２－１１及びＣ３－１４に対するＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を特定したが、ＨＬＡ－ＤＱ８制限を伴った（Ｓｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１５（４２）：１０７３２－１０７３７．）。Ｔ細胞応答を生成することができるＨＬＡ－ＤＱ２制限ペプチドは、全てがＣ－ペプチドのＣ末端近くに位置していた。Ｒｕｄｙら（Ｒｕｄｙ Ｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ Ｍｅｄ １：６２５－６３３）は、糖尿病を有さないが自己抗体の存在に起因してこの疾患を発症する高いリスクにある対象において、単一プロインスリンペプチドＢ２４－Ｃ４に対するＴ細胞応答を調べた。Ｔ細胞応答は、１０人中６人の対象に存在していた。対象は、ＨＬＡ－ＤＲ３若しくはＨＬＡ－ＤＲ４、又はこれらのヘテロ接合性であり、応答は、いずれの特定のハプロタイプにも関連していなかった。Ｒａｊｕら（Ｒａｊｕ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５８：２１－２９）は、同じペプチドで免疫付与した後に、ＨＬＡ－ＤＱ８について、トランスジェニックマウスにおいてプロインスリンの１０個のオーバーラップするペプチドのそれぞれに対するＴ細胞応答を試験した。ＤＱ８マウスにおいて、Ｂ１－Ｂ２４及びＢ２０－Ｃ１０に対してＤＱ８制限応答が見られた。これらのマウスは糖尿病を有しておらず、この研究は、いずれの疾患見識も提供しない。
入手可能な先行技術のいずれも、特にＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプにおいて、有意な治療可能性を有する本特許請求のペプチドを開示していない。
本発明は、特にＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプを有する患者において、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防に使用することができる、ペプチドを提供する。
本発明の第１の態様では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも７８％の相同性を有するペプチドが、提供される。
配列番号１は、残基Ｂ３０－Ｃ１３を含む、ＰＩのフラグメントである。
配列番号２は、残基Ｂ２９－Ｃ１１を含む、ＰＩのフラグメントである。
配列番号３は、残基Ｃ－１－Ｃ１４を含む、ＰＩのフラグメントである。
配列番号４は、残基Ｂ２９－Ｃ１４を含む、ＰＩのフラグメントである。
配列番号５は、残基Ｂ２３－Ｃ２０を含む、ＰＩのフラグメントである。
本発明者らは、驚くべきことに、これらの新規な非天然のペプチドを、ペプチド免疫療法において寛容性を誘導するために使用することができることを発見した。本発明者らは、これまでに報告されていなかったＢ鎖のＣ末端で開始されるこの領域に対して、プロインスリンの糖尿病誘発作用を指摘した。
ペプチドは、ＰＣ１／３（プロホルモン変換酵素としても知られているプロタンパク質変換酵素１、及びプロホルモン変換酵素３、又はＰＣ１／３と略されることが多い神経内分泌変換酵素１）によって天然に切断されるＲ：Ｒモチーフに由来する少なくとも１つのＲの存在に起因して、天然には存在せず、ＰＣ１／３は、プロホルモンプロインスリンの通常のプロセシングの一部として、Ｂ鎖とＣ鎖の間でＲ：Ｒモチーフを切断してインスリンとＣペプチドにする。
これらのペプチドは、これまでに、ＨＬＡ－ＤＲ３制限又はＨＬＡ－ＤＱ２制限のいずれにも特定されていなかった。
本明細書に記載される場合、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合又は修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドイソスターによって互いに結合されたアミノ酸を含む、任意のペプチドを指す。ペプチドは、一般に、天然に存在するアミノ酸を含むが、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスによって、又は当該技術分野において周知の化学修飾技術によってのいずれかで修飾されたアミノ酸配列を含んでもよい。そのような修飾は、基本的な文書において十分に説明されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ末端又はカルボキシル末端を含む、ペプチドの任意の場所において生じ得る。同じタイプの修飾が、所与のペプチドのいくつかの部位に同じ程度又は異なる程度で存在し得ることが理解されよう。また、所与のペプチドは、多数のタイプの修飾を含み得る。
ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも７８％の相同性を有する。いくつかのの実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の相同性を有する。特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列を有する。更なる実施形態では、ペプチドは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を有する。
アミノ酸が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列を有さない場合、アミノ酸の変更は、保存的であること、すなわち、アミノ酸は、類似の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、及びサイズ）を有する異なるアミノ酸に変更されることが好ましい。
好ましくは、ペプチドの組み合わせを構成するペプチドは、単離されたペプチドである。「単離された」という用語は、ペプチドが、そのもともとの環境から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在するペプチドは単離されていないが、天然の系において同時に存在する材料のうちの一部又は全てから分離している同じペプチド又はそのようなペプチドのフラグメントは、単離されている。そのようなペプチドは、ベクターの一部であってもよく、かつ／又はペプチドは、組成物の一部であってもよく、依然として、そのようなベクター又は組成物がその天然の環境の一部ではないという点で、単離されている。
好ましい実施形態では、上記のペプチドのうちの２つ以上を含むペプチドの組み合わせが提供される。
本発明の第２の態様は、本発明のペプチド又はペプチドの組み合わせと、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的に許容される組成物に関する。
好ましくは、システインを含む医薬組成物。組成物内の遊離システインの存在は、本発明のペプチドが鎖間ジスルフィド結合を形成し、したがって沈殿する任意の傾向を安定化する。医薬組成物は、ペプチド２ｍｇ当たり１～５ｍｇのＬ－システイン、好ましくはペプチド２ｍｇ当たり２～４ｍｇのＬ－システイン、及び最も好ましくはペプチド２ｍｇ当たり２．５ｍｇのＬ－システインを含み得る。
医薬組成物は、ヒト及び獣医学医薬においてヒト又は動物に使用するためのものであり得、典型的には、１つ以上の好適な賦形剤を含むこととなる。治療的使用に許容される賦形剤は、医薬分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。薬学的賦形剤の選択は、意図される投与経路及び標準的な薬務に関連して選択され得る。医薬組成物は、賦形剤として、又はそれに加えて、任意の好適な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、又は可溶化剤を含み得る。
保存剤、安定化剤、及び色素が、医薬組成物中に提供されてもよい。保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。酸化防止剤及び懸濁化剤もまた、使用され得る。
異なる送達系に応じて、異なる組成物／製剤要件が存在し得る。例として、本発明の医薬組成物は、非経口的に送達されるように製剤化されてもよく、その場合、組成物は、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、皮下、又は腹腔内経路による送達のために、注射可能な形態で製剤化される。非経口投与の場合、組成物は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩類又は単糖類を含有し得る滅菌水溶液の形態で使用されるのが最も良好であり得る。組成物はまた、経鼻、経口、又は経皮を含む、経口又は局所経路によって投与されるように製剤化されてもよい。好ましくは、組成物は、皮内経路によって送達されるように製剤化される。
皮内投与経路としては、任意の皮膚アクセス手段、例えば、マイクロニードルベースの注射及び注入システム（又は皮内空間を正確に標的とする他の手段）、皮内空間への液体又は粉末のニードルレス又はニードル不使用の衝撃式注射、マントゥータイプの皮内注射、マイクロデバイスを介した強化されたイオントフォレーシス、並びに皮膚への組成物の付着のためのパッチの使用を含む、皮膚への流体、固体、又は他の投薬形態の直接的な付着を使用するものが挙げられる。
典型的には、医師によって、個々の対象に最も好適な実際の投薬量が決定され、投薬量は、具体的な患者の疾患、年齢、体重、及び応答に応じて変動することとなる。ヒトに適切な投薬量は、例えば、体表面積（ＢＳＡ）の正規化を使用して、当業者によって決定することができる。例えば、医薬組成物は、単回用量当たり約０．１μｇ～１５ｍｇの総ペプチド、好ましくは単回用量当たり１μｇ～１２ｍｇの総ペプチドを含み得る。好ましい一実施形態では、単回用量当たり２４０μｇ（６０ｋｇの成人ヒトに対して正規化した１μｇの用量のＢＳＡ）の総ペプチドが投与される。別の好ましい実施形態では、単回用量当たり１２ｍｇの総ペプチドが投与される。２つ以上のペプチドが投与される場合、好ましくは、ペプチドは、等モル比で存在する。
好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、少なくとも１か月に１回、好ましくは最大１２回の投与で少なくとも１か月に１回投与される。
医薬組成物はまた、寛容性促進アジュバント及び／又は寛容性促進細胞を含み得る。寛容性促進アジュバントとしては、ＩＬ－１０、組換えコレラ毒素Ｂサブユニット（ｒＣＴＢ）、Ｔｏｌｌ様受容体２のリガンド、並びに抗ＣＤ３、共刺激ブロッカー、及び免疫チェックポイント調節剤など、免疫応答を調節する生物学的製剤及びモノクローナル抗体が挙げられ、これらは、ペプチドの組み合わせと同時投与され得る。寛容性促進細胞としては、制御性Ｔ細胞、未成熟樹状細胞、及びビタミンＤ３（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）又はその類似体で処置した樹状細胞が挙げられる。好ましくは、本発明のペプチドのうちの１つ以上は、ビタミンＤ３又はその類似体で処置した樹状細胞の表面にコンジュゲートされている。
本発明のペプチド又はペプチドの組み合わせは、薬学的に許容される組成物内のナノ粒子上にコーティングすることができる。ナノ粒子は、炭素系ナノ粒子、セラミックナノ粒子、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、若しくは脂質系ナノ粒子、又はこれらの混合物であり得る。
一実施形態では、ペプチド又はペプチドの組み合わせは、ナノ粒子に結合しているＭＨＣ複合体に結合することによって、ナノ粒子上にコーティングされている。
本発明の第３の態様は、治療に使用するための本発明の薬学的に許容される組成物に関する。
本発明の第４の態様は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防に使用するための、本発明の薬学的に許容される組成物に関する。
Ｔ１Ｄが「治療」される場合、これは、Ｔ１Ｄの１つ以上の臨床症候が緩和されることを意味する。Ｔ１Ｄの症状が完全に改善され、その結果、症状がもはや患者に存在しなくなるという意味ではないが、いくつかの方法では、これが当てはまる場合がある。「治療」により、結果として、Ｔ１Ｄ症状のうちの１つ以上は、治療前よりも重症度が低くなる。
好ましくは、本発明の医薬組成物は、患者がＤＲ３ハプロタイプを有する（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防に使用するためのものである。好ましくは、患者は、ＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプを有する。本発明者らは、驚くべきことに、また具体的に、ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２バックグラウンドに対する糖尿病誘発性ドライバーとしての本特許請求のペプチドの重要性を実証した。
本発明の第５の態様は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防のための医薬品の製造に使用するための本発明の薬学的に許容される組成物に関する。
本発明の第６の態様は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防の方法であって、本発明の薬学的に許容される組成物は、Ｔ１Ｄを有する患者、又はＴ１Ｄの高いリスクにあるとして特定された非糖尿病個体に投与される、方法、に関する。
好ましくは、本発明の薬学的に許容される組成物は、β細胞量が残っている患者に投与される。
本発明の第７の態様は、本発明のペプチド又はペプチドの組み合わせを含む、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防のためのキットに関する。
本発明の第８の態様は、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する。
本発明の第９の態様は、本発明のペプチドのうちのいずれか１つを発現するベクターに関する。
ベクターは、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターを含む、本発明のペプチドを発現するための任意の適切なベクターであり得る。ウイルスベクターには、パルボウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、又は単純ヘルペスウイルスが含まれる。パルボウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり得る。ベクターは、好ましくは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターである。より好ましくは、ベクターは、ｒＡＡＶベクターである。
本発明によるベクターは、遺伝子送達ベクターであり得る。そのような遺伝子送達ベクターは、ウイルス遺伝子送達ベクター又は非ウイルス遺伝子送達ベクターであり得る。
したがって、本発明は、哺乳動物細胞における本発明のペプチドの導入及び／又は発現のためのベクターとして使用するための、動物パルボウイルス、特に感染性のヒトＡＡＶ又はサルＡＡＶなどのディペンドウイルス、及びその構成成分（例えば、動物パルボウイルスゲノム）に基づく遺伝子送達ベクターを提供する。したがって、本明細書で使用される「パルボウイルス」という用語は、任意のタイプのＡＡＶなどのディペンドウイルスを包含する。
本発明の第１０の態様は、Ｔ１Ｄを自然発生的に発症する遺伝子改変動物に関し、動物は、ＤＲ３ハプロタイプ、好ましくはＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプを有する。好ましくは、動物は、非ヒト哺乳動物、特に、霊長類である。あるいは、動物は、齧歯動物、特にマウスであってもよく、又はイヌ、ネコ、ヒツジ、若しくはブタであってもよい。好ましくは、動物は、ラットインスリンプロモーター（ＲＩＰ）下においてヒトＣＤ８０を発現する細胞を含む。
本発明の第１１の態様は、Ｔ１Ｄ関連抗原ドライバーを特定するための方法であって、上記の動物をプロインスリンのＢ２３－Ｃ２０領域に由来するペプチドでプライミングすることと、疾患の進行が加速された場合にペプチドを抗原ドライバーとして特定することと、を含む、方法、に関する。
一実施形態では、疾患の進行は、プライミングが行われなかった場合よりも５０％速く進行する場合に加速されていると見なされる。好ましくは、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも７８％の相同性を有するペプチドから選択される。一実施形態では、ペプチドは、上述のようにアジュバントと組み合わせて投与される。ペプチドは、ペプチド当たり最大１ｍｇの投薬量で投与され得る。
本発明の第１２の態様は、診断又は治療有効性を判定する方法であって、（ａ）Ｔ１Ｄを有するか又はＴ１Ｄ感受性であると疑われる個体に由来するＣＤ４リンパ球を提供すること、（ｂ）個体によって発現されるものと同一のアレルのクラスＩＩ ＭＨＣ分子を表面上に有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団を提供することであって、ＡＰＣの集団は、本発明のペプチド又はペプチドの組み合わせ、及び本発明のペプチドのうちの１つ以上に結合しているクラスＩＩ ＭＨＣ分子と接触している、提供すること、又は（ｃ）個体によって発現されるものと同一のアレルのクラスＩＩ ＭＨＣ分子を含む可溶性ペプチド－ＨＬＡ多量体試薬を提供することであって、ＭＨＣ分子は、本発明のペプチドの組み合わせの１つ以上のペプチドに結合していることと、（ｄ）（ｂ）のＡＰＣの集団又は（ｃ）のペプチド－ＨＬＡ多量体を（ａ）のＣＤ４リンパ球と接触させることと、（ｅ）個体がＴ１Ｄを有するか又はＴ１Ｄに感受性であることの指標として、ＣＤ４リンパ球がクラスＩＩ ＭＨＣ結合ペプチドを認識するかどうかを判定することと、を含む、方法、に関する。
そのようなＡＰＣは、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、若しくは樹状細胞、又は全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。ＡＰＣはまた、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、又は樹状細胞に由来する不死化細胞株であってもよい。対象がヒトである場合、ヒトＴ細胞はクラスＩＩ ＭＨＣ分子を発現することができるため、ＡＰＣはまた、Ｔ細胞であってもよい。本方法は、ＣＤ４リンパ球がクラスＩＩ ＭＨＣ結合ペプチドを認識する場合に、本発明のペプチド又はペプチドの組み合わせを個体に投与することを更に含む。
本発明の第１３の態様及び第１４の態様は、それぞれ、対象をＴ１Ｄの高いリスクにあるとして特定する方法、及び患者をＴ１Ｄ治療に好適であるとして特定する方法に関し、本方法は、本発明のペプチド又はペプチドの組み合わせのうちのいずれか１つに対する免疫応答が検出された場合に、対象又は患者が、ＤＲ３ハプロタイプ、好ましくは、ＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプを有するかどうかを判定することを含む。
当業者であれば、本発明のペプチドに対するＣＤ４ Ｔ細胞による免疫応答を測定する方法に精通しているであろう。例としては、酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）、ペプチド－ＨＬＡ四量体アッセイ、又はインビトロ刺激アッセイに続く増殖若しくはサイトカイン産生ＣＤ４ Ｔ細胞の検出が挙げられる。
本発明の第１５の態様は、対象を、免疫療法のレスポンダーであるか、又は本発明のペプチド若しくはペプチドの組み合わせでの再治療を必要とするかのいずれかとして特定する方法に関し、本方法は、本発明のペプチド又はペプチドの組み合わせのいずれか１つに対する免疫応答が検出されるかどうかを判定することを含む。
ここでも、免疫応答は、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ、ペプチド－ＨＬＡ四量体アッセイ、又はインビトロ刺激アッセイに続く増殖若しくはサイトカイン産生ＣＤ４ Ｔ細胞の検出によって、検出することができる。免疫応答がない場合、又は実際に対象の免疫応答が低下している場合、対象は、免疫療法に応答している。対象の免疫応答が増加した場合、それらは、本発明のペプチド又はペプチドの組み合わせによる更なる治療を必要とし得る。
当業者であれば、本発明の全ての態様が、例えば、ペプチド、ペプチドの組み合わせ、その使用、薬学的に許容される組成物、又は治療の方法に関連するかどうかにかかわらず、本発明の全ての他の態様に等しく適用可能であることを理解するであろう。特に、例えば、ペプチドの態様は、本発明の他の態様、例えば、ペプチドの使用よりも詳細に説明されてきた可能性がある。しかしながら、当業者であれば、本発明の特定の態様についてより詳細な情報が提供されている場合、この情報は、一般に、本発明の他の態様に等しく適用可能であることを理解するであろう。
本発明は、これより、以下の図を参照して単なる例として詳細に説明される。
図１は、ＤＲ３ＤＱ２ｘＲＩＰ－Ｂ７．１マウスが免疫媒介性糖尿病を自然発生的に発症することを示す。（ａ）雄性３２匹及び雌性２４匹を、６～７週齢から３５週齢まで、糖尿病について毎週モニタリングした。マンテル－コックスのログランク検定による統計分析。ｎ．ｓ．＝有意差なし。（ｂ）糖尿病が確認されたマウスから得られた凍結膵臓切片の免疫組織化学的二重染色の代表的な画像。インスリンは赤色に染色されており、免疫細胞は茶色に染色されている。２０倍対物レンズ。矢印は、Ｌｙ６Ｇ＋細胞を示す。（ｃ～ｄ）抗ヒトＧＡＤ６５タンパク質（ｃ）及び抗マウスプロインスリン－２オーバーラッピング３０量体ペプチド（ｄ）のＩｇＧ自己抗体ＥＬＩＳＡ。ｃ＋ｄ：８～２３週齢のマウスから横断的に得られた血清の分析。水平方向の線は、中央値を示す。ダネットの多重比較検定。齢数層ごとに１０～２２個のサンプル。ＥＬＩＳＡは、同じサンプルで並行して実行した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図２は、マウスプロインスリン－２ペプチドによるアジュバントプライミングが糖尿病を促進することを示す。（ａ）７～１２週齢のＤＲ３ＤＱ２ｘＲＩＰ－Ｂ７．１マウスを、ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄアジュバント中、１００μｇのマウスプロインスリン－２ペプチド（♂６匹、♀４匹）、ヒトＧＡＤ６５タンパク質（♂５匹、♀３匹）、又はＩＡ－２の３７７アミノ酸のＣ末端領域（♂７匹、♀２匹）のうちのいずれか、及びＰＢＳのみの対照（♂５匹、♀３匹）で０日目及び１４日目に皮下で、２００ｎｇの百日咳毒素で０日目及び１日目又は２日目に腹腔内投与で、チャレンジした。マウスを、プライミング後最大２０週間、糖尿病について毎週モニタリングした。灰色の破線は、実験の０日目に１２週齢のマウスにおいて予測される自然発生型糖尿病のレベルを示している（図１のデータに基づき、性別で正規化されている）。マンテル－コックスのログランク検定による統計分析。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｂ～ｅ）ＰＢＳ（ｂ）、マウスプロインスリン－２ペプチド（ｃ）、ヒトＧＡＤ６５（ｄ）、又はヒトＩＡ－２のフラグメント（ｅ）で免疫付与した群におけるそれぞれの個々のマウスの血中グルコースレベル。 図３は、マウスプロインスリン－２ペプチドＢ２３－Ｃ２０が、糖尿病誘発性を媒介することを示す。（ａ）７～８週齢のＤＲ３ＤＱ２ｘＲＩＰ－Ｂ７．１マウス（それぞれの群において♂３匹、♀３匹）を、ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄアジュバント中、１００μｇのマウス３０量体プロインスリン－２ペプチドＢ１－３０、Ｂ２３－Ｃ２０、Ｃ１０－Ａ６、又はＣ２５－Ａ２１のいずれかで０日目及び１４日目に皮下で、２００ｎｇの百日咳毒素で０日目及び１日目又は２日目に腹腔内投与で、チャレンジした。マウスを、プライミング後最大２０週間、糖尿病について毎週モニタリングした。灰色の破線は、図１のデータに基づき、性別で正規化されている、実験の０日目に８週齢のマウスにおいて予測される自然発生型糖尿病のレベルを示している。マンテル－コックスのログランク検定による統計分析。＊＊＊Ｂ２３－Ｃ２０とＢ１－３０又はＣ１０－Ａ６とを対比して、ｐ＜０．００１。††Ｂ２３－Ｃ２０とＣ２５－Ａ２１とを対比して、ｐ＜０．０１。残りは有意性なし。（ｂ～ｅ）Ｂ１－３０（ｂ）、Ｂ２３－Ｃ２０（ｃ）、Ｃ１０－Ａ６（ｄ）、又はＣ２５－Ａ２１（ｅ）で免疫付与した群のそれぞれの個々のマウスの血中グルコースレベル。 図４は、プロインスリン－２ Ｂ２３－Ｃ２０の分析及び比較を示す。（ａ）上部：マウスプロインスリン－２とヒトプロインスリンの同等の領域とのアラインメント。四角で囲まれたアミノ酸は同一であり、網掛けは類似である。下部：より詳細な分析のために生成した６つのオーバーラップする１４～１５量体のマウスペプチド。（ｂ）６つ全てのマウスペプチドのＨＬＡ－ＤＲ３及びＨＬＡ－ＤＱ２についての結合予測。ＶＤ－１４ペプチドについては、必要とされる最小限の１５アミノ酸長に達するように、配列における先行するグルタミン（Ｑ）が予測に追加されている。予測されたＨＬＡ結合コア及び親和性は、ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ予測法を使用して、オンラインＩＥＤＢ分析リソース（http://tools.immuneepitope.org/mhcii/）で生成した。（ｃ）マウスペプチドのヒト同等物のＨＬＡ－ＤＲ３及びＨＬＡ－ＤＱ２についての結合予測。予測されたＨＬＡ結合コア及び親和性は、ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ予測法を使用して、オンラインＩＥＤＢ分析リソース（http://tools.immuneepitope.org/mhcii/）で生成した。 図５は、ＭＥ－１５ペプチド（Ｂ２９－Ｃ１１）が糖尿病誘発性のＢ２３－Ｃ２０のコア領域をカバーしていることを示す。（ａ）１０～１４週齢のＤＲ３ＤＱ２ｘＲＩＰ－Ｂ７．１マウスを、ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄアジュバント中、１００μｇのＧＰ－１５（♂２匹、♀３匹）、ＹＡ－１５（♂２匹、♀３匹）、ＭＥ－１５（♂３匹、♀２匹）、ＲＧ－１５（♂３匹、♀２匹）、ＤＡ－１５（♂２匹、♀３匹）、又はＶＤ－１４（♂３匹、♀２匹）ペプチドのいずれかで０日目及び１４日目に皮下で、２００ｎｇの百日咳毒素で０日目と１日目又は２日目に腹腔内投与で、チャレンジした。マウスを、プライミング後最大２０週間、糖尿病について毎週モニタリングした。灰色の破線は、実験の０日目に１４週齢のマウスにおいて予測される自然発生型糖尿病のレベルを示している（図１のデータに基づき、性別で正規化されている）。マンテル－コックスのログランク検定による統計分析。＊ＲＧ－１５とＹＡ－１５との対比でｐ＜０．０５、＊＊ＭＥ－１５とＧＰ－１５、ＹＡ－１５、又はＶＤ－１４との対比でｐ＜０．０１。†ＭＥ－１５とＤＡ－１５との対比でｐ＜０．０５。残りは有意差なし。（ｂ～ｆ）ＧＰ－１５（ｂ）、ＹＡ－１５（ｃ）、ＭＥ－１５（ｄ）、ＲＧ－１５（ｅ）、ＤＡ－１５（ｆ）、ＶＤ－１４（ｇ）で免疫付与した群のそれぞれの個々のマウスの血中グルコースレベル。 図６は、ＲＩＰ．ＣＤ８０ｘＤＲ３ＤＱ２マウスにおける加速される糖尿病に対する寛容性誘導。（ａ）投薬のスケジュール。７～８週齢のマウス（１群当たりｎ＝７）を、ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄアジュバント中、３０量体のマウスプロインスリン－２ペプチドＢ２３－Ｃ２０での０日目及び１４日目における抗原性プライミングによる糖尿病発症の加速の前及び後に、ＰＢＳ中の可溶性１４／１５量体ペプチドで皮下（ｓ．ｃ．）処置した。百日咳毒素を、０日目及び２日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。（ｂ）１４／１５量体ペプチドＭＥ－１５（♀１匹、♂６匹）、ＹＡ－１５（♀４匹、♂３匹）、又はＶＤ－１４（♀３５匹、♂４匹）で処置したマウスの糖尿病発症率。マンテル－コックスのログランク検定による統計分析。ＭＥ－１５とＹＡ－１５との対比でｐ＜０．０１、ＭＥとＶＤ－１４との対比でｐ＜０．０５。 図７は、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイによって検出されたヒトドナーにおける抗原特異的応答を示す。ヒトドナーにおけるプロインスリンＢ３０－Ｃ１３に対する応答。ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２（ａ）又は任意の他のハプロタイプ（ｂ）のいずれかを有する個体から得られたＰＢＭＣを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってＩＦＮγの検出の前にヒトプロインスリン由来ペプチドＢ３０－Ｃ１３又はＣ１９－Ａ３でインビトロで刺激した。ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２の個体はｎ＝３、非ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２はｎ＝６。＊ｐ＜０．０５、比の対応のあるｔ検定。 図８Ａは、１型糖尿病と最近診断され、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイによって検出されるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３：０１－ＤＱＡ１＊０５：０１－ＤＱＢ１＊０２：０１遺伝子型（ＨＬＡ－ＤＲ３／ＤＱ２）を有する、ヒトドナーにおける抗原特異的応答を示す。プロインスリンＢ２３－Ｃ２０、Ｂ２９－Ｃ１１、Ｂ２９－Ｃ１４、Ｂ３０－Ｃ１３、及びＣ－１－Ｃ１４ペプチドに対する応答が、示されている。ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２を有する５人の１型糖尿病患者（＃１～＃５として特定）から得られたＰＢＭＣを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７（炎症促進性応答）並びにＩＬ－１０（制御性応答）の検出の前に、ヒトプロインスリン由来ペプチドＢ２３－Ｃ２０、Ｂ２９－Ｃ１１、Ｂ２９－Ｃ１４、Ｂ３０－Ｃ１３、及びＣ－１－Ｃ１４でインビトロで刺激した。（ａ）データは、それぞれのペプチドについてアッセイしたＰＢＭＣ１００万個当たりのレスポンダーＣＤ４ Ｔ細胞の未加工のカウント数として示す。灰色の網掛けは、それぞれのサイトカインアッセイの陰性対照の上限を示す（それぞれ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７、及びＩＬ－１０アッセイの希釈対照に応答する平均０．４、０．２、及び０．２のＣＤ４ Ｔ細胞。 （ｂ）図８Ａのまとめの表であり、それぞれの患者／ペプチドの陽性応答（網掛けの枠）を示す。
実施例１
材料及び方法
動物
ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２トランスジェニック（Ｂ６．ｈＣＤ４．ＤＲ３－ＤＱ２．ＭＨＣＩＩ－／－マウス（以前に説明されており（ｄｅ Ｋａｕｗｅ ＡＬ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８２（１２）：７４４０－７４５０）、Ｊ．ＭｃＣｌｕｓｋｅｙから入手）を、ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２＋ｈｕＣＤ４＋ＩＡ／ＩＥ－／－ＲＩＰ．Ｂ７．１＋マウス（以下、ＤＲ３ＤＱ２ｘＲＩＰ－Ｂ７．１と称する）を得るために、ＲＩＰ－Ｂ７．１－トランスジェニック動物（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｉｎｓ２－ＣＤ８０）３Ｂ７Ｆｌｖ／Ｏｒｌ，ＥＭＭＡ，Ｏｒｌｅａｎｓ，Ｆｒａｎｃｅ；ＩＤ ００２１６）と交配させた。Ｂ６．１２９Ｓ２－Ｈ２－ＡｂｌｔｍｌＧｒｕ Ｔｇ（ＨＬＡ－ＤＲＡ／Ｈ２－Ｅａ，ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１／Ｈ２－Ｅｂ）１Ｋｉｔｏマウスを、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｉｎｓ２－ＣＤ８０）３Ｂ７Ｆｌｖ／Ｏｒｌと交配させることによって得られるＤＲ４ｘＲＩＰ－Ｂ７．１マウスは、これまでに説明されている（Ｖｅｒｈａｇｅｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ８（１）：１４１０６）。全ての動物は、ＫＣＬ生物学サービスユニットで特定病原体除去条件下において、個別に換気されたケージ内で、１２時間の明暗サイクルで飼育し、餌と水は自由に与えた。実験は、Ｍ．Ｐｅａｋｍａｎが保有するプロジェクトライセンス下において、英国内務省の規制に従って実施した。全ての作業は評価の対象となり、Ｇｕｙの動物福祉及び倫理審査委員会（ＡＷＥＲＢ）によって現地で承認されている。
プライミング抗原
全てのマウスプロインスリン－２ペプチドは、Ａｌｍａｃ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，ＵＫ）又はＧＬＳ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）のいずれかによって９５％を超える純度でカスタム製造された。ヒトＩＡ－２の３７７アミノ酸のｃ末端フラグメントは、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ（Ｓｃｈｉｌｔｉｇｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）によって産生された。組換えヒトＧＡＤ６５（Ｔ細胞ＧＡＤ）は、Ｄｉａｍｙｄ Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。予測されたＨＬＡ結合コア及び親和性は、ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ予測法を使用して、オンラインＩＥＤＢ分析リソース（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｍｈｃｉｉ／）で生成した。
糖尿病の誘発とモニタリング
全てのマウスは、Ｄｉａｓｔｉｘストリップ（Ｂａｙｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、非誘発性糖尿について定期的にモニタリングした。一部のマウスは、自然発生型糖尿病への進行を注意深く監視するために、６～７週齢から、交互の尾側部における尾静脈の最小限の穿刺、並びにＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｖｅｒｉｏメーター及びストリップ（Ｌｉｆｅｓｃａｎ，Ｈｉｇｈ Ｗｙｃｏｍｂｅ，ＵＫ）を使用した分析によって、高血糖について毎週モニタリングした。マウスは、確認された糖尿に加えて、血中グルコースの読み取り値が１６．７ｍｍｏｌ／Ｌ（３００ｍｇ／ｄＬ）を超えた後に、糖尿病と見なした。疾患加速実験については、動物を、それぞれの群について同等の齢数及び性別の拡がりを達成するために、示されるように等しいか又は類似のサイズの群に分配した。マウス（６～１４週齢）に、ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，ＵＳＡ）中、１００μｇのペプチド又はタンパク質で尾の付け根に皮下（ｓ．ｃ．）でプライミングし、１４日目に鼠径部への皮下分配で２回目の用量を受容させた。マウスは、ＰＢＳ中、２００ｎｇの百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与を、０日目及び１日目又は２日目に受けた。マウスを、次いで、高血糖及び糖尿について毎週モニタリングした。寛容性誘導を調べるための実験では、マウスに、水溶液中の１０μｇのペプチドの皮下注射を３～４日間隔で受容させ、合計６回の注射を行った。寛容性レジメンは、アジュバント抗原プライミングの１週間前に開始した。糖尿病が検出されるとすぐに、マウスを、倫理的な承認に従って人道的に殺処分した。
組織学
ＯＣＴコンパウンド（Ｃｅｌｌｐａｔｈ，Ｎｅｗｔｏｗｎ，ＵＫ）に包埋された膵臓を、液体窒素で冷却したイソペンタン（Ｓｉｇｍａ）中で凍結させた。１０μｍの切片を、アセトン中に固定した後、まずウサギ抗マウスインスリン（Ａｂｅａｍ）で染色し、Ｖｅｃｔｏｒ Ｉｍｐｒｅｓｓ抗ウサギＡＰ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）で検出し、Ｖｅｃｔｏｒ ＩｍｍＰｒｅｓｓ Ｒｅｄで顕色処理した。組織内の免疫細胞を、マウスＣＤ４（クローンＧＫ１．５、ヒトＣＤ４も認識する）、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、Ｌｙ６Ｇ、及びＢ２２０に対するビオチン化抗体（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ａｌｔｒｉｎｃｈａｍ，ＵＫ）から入手）で染色し、それらを、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓから入手したＡＢＣ試薬及びＤＡＢ溶液を使用して検出した。核をヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）で染色した後、スライドをＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）で封入した。画像は、Ｚｅｎソフトウェアを使用してＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ Ａ１顕微鏡で取得した。画像のクロッピングも変更も使用しなかった。
自己抗体ＥＬＩＳＡ
プロインスリン－２ペプチド又は組換えヒトＧＡＤ６５を、ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中のＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にコーティングした。希釈した血清（ＰＢＳ ５％ＢＳＡ中、Ｓｉｇｍａ）又は対照（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手したマウスＩｇＧ２ａ抗インスリンクローンＩＣＢＴＡＣＬＳ及びアイソタイプ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから入手したマウスＩｇＧ１抗ＧＡＤ６５クローンＮ－ＧＡＤ６５及びアイソタイプ）を、室温で２時間インキュベートした後、ビオチン－抗マウスＩｇＧ、ストレプトアビジン－ＨＲＰ、及び高感度ＴＭＢ溶液（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手）で検出し、４５０ｎｍで読み取った。それぞれのプレートにおける関連する対照抗体の滴定濃度（１～１０００ｎｇ／ｍＬ）を使用して、データを正規化し、血清抗体レベルに任意の単位を割り当てた。
ヒトβ細胞から放出されるＣ－ペプチドフラグメントの分析
インビボで利用可能なＣ－ペプチドフラグメントの完全な能力を調べるために、本発明者らは、（ｉ）膵島細胞による上清への分泌、及び（ｉｉ）細胞内顆粒への分泌を分析した。
（ｉ）分泌
ヒト膵島を、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１倍ＤＰＢＳで洗浄し、２．５ｍＭグルコースを含有するＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液中で、３７°Ｃ、５％ ＣＯ２において、３０分間前処理した。次いで、緩衝液を、２．５ｍＭ又は２５ｍＭのいずれかのグルコースを含有するＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液に交換し、膵島を、３７°Ｃ、５％ ＣＯ２において、３０分間インキュベートした。それぞれの条件下において上清中の分泌物を回収し、４°Ｃで５分間、４００ｘｇで遠心分離して、あらゆる残留細胞をペレット化した。分泌上清を回収し、タンパク質／フラグメントを単離し、Ｃ１８逆相樹脂精製によって精製した。
（ｉｉ）細胞内顆粒
膵島を、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１倍ＤＰＢＳ中、３００ｘｇで３分間、室温で３回洗浄した。膵島細胞を、０．５ｍＬ／１，０００ ＩＥＱ（膵島相当）の濃度でＡｃｃｕｔａｓｅ（３７°Ｃに予熱）に取り込み、３７°Ｃの水浴で１０分間インキュベートした。チューブを、１分ごとに反転させ、更に、５分及び１０分後に５ｍＬの血清学的ピペットで５回上下にピペッティングし、単一細胞懸濁液を得た。懸濁液を、３５μｍのナイロンメッシュを通して濾過し、１倍ＤＰＢＳ ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ中、３００ｘｇで３分間洗浄した。細胞を、２ｍＬの１倍ＤＢＰＳ ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁した。１４μｍの細孔サイズのＢａｌｃｈホモジナイザー（Ｉｓｏｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、細胞内成分をインタクトに保ちながら細胞膜を破壊した。単一細胞ライセートを、ホモジナイザーに１０回通した。ホモジナイズした細胞を、４°Ｃで１５分間、１，０００ｘｇで遠心分離して、細胞内内容物を放出させ、回収した。ペレットを、１倍ＤＰＢＳ ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁させ、再度遠心分離した。上清中の細胞内内容物を、再度回収し、プールした後、４°Ｃで１５分間、５，０００ｘｇで遠心分離して、クリノソーム（crinosome）が濃縮された高密度の細胞内コンパートメントを含むペレットを得た。このスピンから得られた上清を、再度４°Ｃで４５分間、２０，０００ｘｇで遠心分離して、インスリン分泌性顆粒が濃縮された低密度の細胞内コンパートメントを含むペレットを得た。クリノソームが濃縮されたペレット及び顆粒が濃縮されたペレットの両方を、１倍ＤＰＢＳ中に取り、急速凍結させて－８０°Ｃで保管した。氷上で解凍し、プロテイナーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標），Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の添加によって、これらの細胞内コンパートメントの内容物を放出させ、この凍結解凍サイクルを、合計５回繰り返した。
（ｉ）分泌された上清、及び（ｉｉ）細胞内顆粒において得られたタンパク質及びフラグメントを、５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）／５０％ ｄｄＨ２Ｏで湿潤させ、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／９９．９％ ｄｄＨ２Ｏで平衡化し、２％ ＡＣＮ／０．１％ ＴＦＡ／９７．９％ ｄｄＨ２Ｏですすいだ、Ｃ１８逆相樹脂（Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳ）によって精製した後、サンプル（０．２％ ＴＦＡの最終濃度に調整）を、Ｃ１８カラムにロードした。サンプルを、２％ ＡＣＮ／０．１％ ＴＦＡ／９７．９％ ｄｄＨ２Ｏで洗浄し、タンパク質及びタンパク質フラグメントを、８０％ ＡＣＮ／０．１％ ＴＦＡ／１９．９％ ｄｄＨ２Ｏで溶出させ、真空遠心濃縮装置を使用して乾燥させた。乾燥したサンプルを、２％ ＡＣＮ／０．１％ギ酸／９７．９％ ｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁した。クロマトグラフィー分離は、Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＮａｎｏＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＫ）を使用して実行した。ペプチドを、７５μｍ×５０ｃｍのＣ１８カラムにおいて、０．１％ギ酸中の水（Ａ）及び０．１％ギ酸中の８０％アセトニトリル（Ｂ）の線形液体クロマトグラフィーグラジエントを使用して、逆相クロマトグラフィーによって分離した。６５分間かけて２％ Ｂから５０％ Ｂまで、３００ｎＬ／ｍの流速でグラジエントを送達して、ペプチドを溶出させた。溶出液を、Ｘｃａｌｉｂｕｒ ｖ４．１で動作するＯｒｂｉｔｒａｐ－Ｆｕｓｉｏｎ－Ｌｕｍｏｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＫ）を使用したエレクトロスプレーイオン化によってイオン化した。機器は、フルＭＳスキャン及びＭＳ／ＭＳフラグメンテーションとの間の３秒間のサイクル時間を定義することにより、「ユニバーサル」方法を使用して取得するようにプログラムした。ＭＳ／ＭＳデータは、ＰｅａｋｓＳｔｕｄｉｏ（バージョン７．５、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、Ｕｎｉｐｒｏｔ（http://www.uniprot.org/uniprot/）からダウンロードしたレビュー済みのＳｗｉｓｓｐｒｏｔ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓデータベースの現在のバージョンに対して分析した。
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
新しいヘパリン処理血液から単離したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。告知に基づく同意書を、全ての参加者から取得した。９６ウェルプレートのうちの３つのウェルにわたり均等に分割した１×１０６個のＰＢＭＣを、１０％（ｗ／ｖ）ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ培地中のヒトプロインスリンＢ３０－Ｃ１３（配列番号１）、Ｃ１９－Ａ３（配列番号４９）、Ｂ２３－Ｃ２０（配列番号５）、Ｂ２９－Ｃ１１（配列番号２）、Ｂ２９－Ｃ１４（配列番号４）、若しくはＣ－１－Ｃ１４（配列番号３）ペプチド（全て１０μｇ／ｍＬで使用、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによってカスタム製造）、又は希釈液のみで、４８時間刺激した。サイトカイン分泌アッセイは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７、及びＩＬ－１０のＥＬＩＳＰＯＴキット（Ｕ－ＣｙＴｅｃｈ）を製造業者の指示に従って使用して行い、プレートを、自動化されたＥＬＩＳＰＯＴ Ｂｉｏｒｅａｄｅｒ ６０００（Ｂｉｏ－Ｓｙｓ）及び関連するソフトウェアを使用して分析した。データは、ペプチド刺激後の３連ウェルにおけるスポットの総数を、希釈剤のみの対照ウェルのスポットの総数で除したもの（刺激指数［ＳＩ］）、又はレスポンダーＣＤ４ Ｔ細胞／１０６ＰＢＭＣとして表す。
統計分析
全ての分析は、示されている適切な試験を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８ソフトウェアで実行した。
実施例２
ＤＲ３ＤＱ２ｘＲＩＰ－Ｂ７．１マウスにおける自然発症型糖尿病
本発明者らが以前に説明した自然発生の膵島炎又は糖尿病を示さないＤＲ４ｘＲＩＰ－Ｂ７．１モデルとは異なり（Ｖｅｒｈａｇｅｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ８（１）：１４１０６）、ＤＲ３ＤＱ２ｘＲＩＰ－Ｂ７．１マウスは、自然発生的に糖尿病を発症する（図１ａ）。いずれのモデルも、いずれの齢数においても比較的高いベースライン血中グルコースレベルを示すが、ＤＲ３ＤＱ２ｘＲＩＰ－Ｂ７．１マウスのみが、糖尿に加えて、１６．７ｍｍｏｌ／Ｌを上回るレベルを生じる。３５週齢までに、モニタリングした全ての動物の４６％（５６匹中２６匹）が、自己免疫性糖尿病を発症した。雄性動物及び雌性動物で、疾患発症率（それぞれ、１６／３２対１０／２４）及び平均発症齢（それぞれ、２４．２週±７．３（標準偏差）対２４．８±８．５）は、類似していた。脾腫、悪液質、嗜眠、又は皮膚／眼の異常によって証明される他の免疫媒介性状態の明らかな兆候は、検出されなかった。糖尿病を有する全てのマウスは、膵島に重度の免疫浸潤を示した。この浸潤は高度に多様で、リンパ系細胞及び骨髄系細胞の両方が、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ、及びＣＤ１１ｃを発現し、全ての膵島において豊富に見出された（図１ｂ）。Ｌｙ６Ｇ＋顆粒球細胞は、一部の膵島では、より少数で見出された。６～８週齢（ｎ＝５）、１０週齢（ｎ＝１０）、１２週齢（ｎ＝７）、１６～２０週齢（ｎ＝５）、又は３５週齢（ｎ＝１３）でさえも、本発明者らが組織学的に調べた非糖尿病マウスにおいて、顕著な免疫細胞浸潤は観察されなかったが、一部の膵島の中程度の浸潤が検出された６週齢の雄性１匹を除く。これは、膵島炎表現型が病気に伴うものであり、糖尿病への急速な進行をもたらし、疾患と強く関連していることを示唆する。ヒトＨＬＡＤＲ３－ＤＱ２患者における１型糖尿病の発症は、大多数がＧＡＤ６５及びインスリンに対する自己抗体の存在を特徴とするため、マウスの血清を、ヒトプロインスリンに最も類似するアイソフォームであるマウスプロインスリン－２の長さにまたがるマウス３０量体ペプチドに対する抗体、及びマウス相当物と９５％を上回る配列相同性を有するヒトＧＡＤ６５に対する抗体について試験した。図１ｃ～図１ｄに示されるように、漸増週齢でマウスの群を比較した場合、抗プロインスリン－２抗体のレベルには有意な増加があったが、抗ＧＡＤ６５抗体のレベルには増加がなかった。
実施例３
プロインスリンはＤＲ３ＤＱ２ｘＲＩＰ－Ｂ７．１マウスにおける糖尿病誘発性抗原である
高リスクのトランスジェニックＨＬＡを保有するマウスにおける糖尿病の自然発症は、自己免疫プロセスが疾患発症の中心であることを示唆しており、それによって、本発明者らは特定の自己抗原が疾患ドライバーであるかどうかという問題に取り組むように促された。抗原が「ドライバー」特性を有する場合、アジュバントを使用して候補分子に対して動物をプライミングすることにより、疾患の進行が加速するであろうという仮説を試験した。したがって、マウスを、ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄアジュバント中、マウスのプロインスリン－２の長さとオーバーラップし、その長さにまたがる個々の３０量体ペプチド、組換えヒトＧＡＤ６５、ヒト膵島抗原－２（ＩＡ－２）の３７７アミノ酸の細胞内領域、又はＰＢＳのみのいずれかで、プライミングした（図２ａ～図２ｆ）。重要なことに、これらの状態のうち、プロインスリンペプチドでのプライミングのみが、糖尿病の発症を明確に促進し、対照刺激又は自然発症で観察されるものを上回って発症率を増加させた。これは、予想外の発見であった。これまでの研究では、主として、ＧＡＤ６５及びＩＡ－２が、ＨＬＡ－ＤＲ３及びＨＬＡ－ＤＱ２制限要素を使用して１型糖尿病を有する対象由来のＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＴ細胞クローンによって認識される標的膵島抗原であると特定していた（Ｄｉ Ｌｏｒｅｎｚｏ ＴＰ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８（１）：１－１６．）。更に、若齢における糖尿病の環境的決定因子の研究（the Environmental Determinants of Diabetes in the Young study）では、抗ＧＡＤ６５自己抗体が、典型的に、ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプを有する疾患感受性個体において最初に現れることが示唆されている。対照的に、抗インスリン自己抗体は、通常、ＨＬＡ－ＤＲ４－ＤＱ８ハプロタイプを有するリスク対象において最初に出現する（Ｋｒｉｓｃｈｅｒ ＪＰ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ４０（９）：１１９４－１２０２及びＫｒｉｓｃｈｅｒ ＪＰ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ５８（５）：９８０－９８７）。これらは、それぞれＧＡＤ６５及びインスリンに対する免疫寛容の喪失を伴う異なる病理学的プロセスを特徴とする、潜在的に重要な疾患のエンドタイプを表している。これを踏まえると、ＧＡＤ６５が新しいＤＲ３ＤＱ２ｘＲＩＰ－Ｂ７．１モデルにおいて疾患の最も強力な抗原性ドライバーであろうと予測されていた可能性があるが、これは、そうではないことが判明した。
２０週間の実験の終わりまでに、アジュバント中のプロインスリンペプチドでプライミングした全てのマウス（１０／１０）が、糖尿病を発症した（平均発症時間はプライミング後７７±３８．６（標準偏差）日）。膵臓の免疫浸潤は、これらの抗原チャレンジ動物における強度又は多様性に関して、自然発生型糖尿病を有するマウスにおいて観察されたものと差はなかった（図示せず）。これらの発見は、ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２の状況におけるプロインスリンの免疫認識の、このモデルにおける糖尿病を引き起こす事象としての重要性を示す。
実施例４
プロインスリンの特定の領域が、このモデルにおける糖尿病の誘導に関与している
次に、本発明者らは、４つのプロインスリン－２ペプチドのそれぞれを個別に用いてこれらのアジュバントプライミング実験を繰り返すことによって、ＤＲ３ＤＱ２ｘＲＩＰ－Ｂ７．１マウスにおいて糖尿病を促進するように相互作用するプロインスリンの優性領域が存在するかどうかを調べた（図３ａ～図３ｆ）。Ｂ２３－Ｃ２０ペプチドでのプライミングは、糖尿病の非常に急速な発症を伴い、最も明白な疾患の悪化をもたらした（プライミング後８４日までに１００％の発症率、平均発症はプライミング後４９±１６．２（標準偏差）日）。対照的に、残りの３つのペプチドは、自然発生で予想されるものと著しく異ならない疾患発症率を示した。
次に、本発明者らは、抗原プライミングによる疾患加速（ＡＰＤＡ）作用を媒介するＢ２３－Ｃ２０におけるコア配列を見出そうと考えた。これに取り組むための系統的なアプローチの１つは、目的とされる領域にわたって、１つのアミノ酸がオフセットされた複数のペプチドを作製することである。しかしながら、このアプローチでは、任意の好適な長さの数百個の可能性のある選択肢を試験する必要があり、正しい検出力の研究で試験するためには数千匹ものマウスが必要となる。したがって、本発明者らは、革新的なステップを使用して、Ｂ２３－Ｃ２０のドライバー領域を特定した。
β細胞を調べて、天然に生成されるＣ－ペプチドのフラグメントがあるかどうか（又は実際にＣ－ペプチドが常にインタクトで生成されるかどうか）を具体的に特定した。これによって、どのペプチド種がＢ２３－Ｃ２０領域から天然に存在しており、インビボで疾患のドライバーとなる可能性があるかを確立することができる。
本発明者らは、ヒトβ細胞（ｎ＝６の総サンプル）から異なるタイプの顆粒を精製し、質量分析を使用して内容物を調べた。
以下の表１は、ヒトβ細胞顆粒の目的とされる領域（Ｂ２３からＣ－ペプチドまで）のペプチドを示す。
Figure 2022548167000001
Ｂ鎖とＣ－ペプチドの両方に由来する残基を含むペプチドは存在しない。この理由は、プロホルモンプロインスリンの通常のプロセシングの一部として、配列Ｂ２３－Ｃ２０内のＲ：Ｒを切断してインスリンとＣ－ペプチドにする、ＰＣ１／３（プロホルモン変換酵素としても知られているプロタンパク質変換酵素１、及びプロホルモン変換酵素３、又はＰＣ１／３と略されることが多い神経内分泌変換酵素１）の非常に高い効率性である。インビボで実際に生成される配列における最初の種は、プロインスリン残基３２（ＲＥＡ）で開始する。したがって、一部の状況では、Ｎ末端のＲが残る。更に、β細胞によって生成されるＣ－ペプチドの多数の部分配列が存在する。これらは、従来の抗原プロセシングを必要とせずにＨＬＡ－ＤＲ３／ＤＱ２に直接的に結合し、Ｔ細胞と結合して疾患を引き起こし得る。
次いで、更に、マウスの所見をどの程度移行できるかを調べ、ドライバー抗原／エピトープとＨＬＡとの潜在的な相互作用を理解するために、本発明者らは、マウスプロインスリン－２及びヒトプロインスリンの関連領域をアライメントした（図４ａ）。ヒトプロインスリン及びマウスプロインスリン－２のＢ２３－Ｃ２０領域は、２３／３０（７７％）のアミノ酸が同一であり、更に３／３０（１０％）が種間で類似しており、高い相同性を示す。次いで、更に、優性な疾患誘導作用を有する領域を指摘するために、Ｂ２３－Ｃ２０の長さにまたがる６つのオーバーラップする１４／１５量体ペプチドを生成した。ピログルタミン酸の形成を防止するために、Ｎ末端のグルタミン（Ｑ）残基又はグルタミン酸（Ｅ）残基を有する配列は避け、予測できない特性を有するペプチドが得られた。配列のうちの１つであるＲＧ－１５は、水溶液に非常に高度に不溶性であった（ただし、ジメチルスルホキシドには可溶性）。これは、ＨＬＡ－ＤＲ３及びＨＬＡ－ＤＱ２の両方について、ＭＥ－１５のものと同一の予測された結合コアを有する（図４ｂ）。予測された結合親和性に基づいて、１４／１５量体ペプチドのいずれも、使用した予測ツールによってＨＬＡ－ＤＲ３又はＨＬＡ－ＤＱ２への強力な結合剤として分類されなかった。重要なことに、ペプチドのヒト同等物について予測された結合コア及び親和性は、全般的に、マウス配列と同等であった（図４ｃ）。
ＭＥ－１５（Ｂ２９－Ｃ１１）ペプチドでのアジュバントプライミングは、フォローアップ中に、自然発生で予想されるよりも顕著に高い疾患発症率をもたらした。疾患はまた、この実験において試験した他の１４／１５量体ペプチドのいずれと比較しても、大幅に加速されており（図５ａ～図５ｆ）、したがって、ＭＥ－１５ペプチドが、ＨＬＡに結合し、免疫細胞と相互作用して糖尿病を引き起こす、最小限のコアアミノ酸配列を含むことが強く示唆された。ＲＧ－１５はまた、疾患を引き起こし得るが、更にＣ末端側にオフセットされたペプチド（ＤＡ－１５及びＶＤ－１４）は、引き起こさない。したがって、単一のＲを含むＣ－ペプチドの最もＮ末端側の領域は、ＨＬＡ－ＤＲ３／ＤＱ２バックグラウンドで発生する１型糖尿病の抗原性ドライバーを含む領域を定義する。
前臨床モデルにおける更なる重要な部分は、このアプローチにより、実際に、ＤＲ３／ＤＱ２バックグラウンドでのヒト疾患における潜在的に価値のある寛容原性特性を有するペプチドを特定することができると示すことであった。本発明者らは、Ｂ２３－Ｃ２０を使用して疾患を誘導し、ＭＥ－１５の寛容原性特性を調べた（図６）。ＭＥ－１５ペプチドの寛容原性効作用が実証された。したがって、このＢ：Ｃジャンクション領域における最も強力な疾患ドライバー特性を有するペプチドはまた、寛容原性である。これは、ＨＬＡ－ＤＲ３／ＤＱ２結合特性を有するＭＥ－１５などのペプチドが、糖尿病発症の自然な経過における免疫寛容の破壊及び疾患の加速に重要であり得ること、並びに十分に早期にかつ寛容原性（高溶解性、非アジュバント）経路を介して投与された場合、治療能力も有することを示唆する。
目的とされるプロインスリン領域のヒト及びマウスの同等物の間の類似性は、これらの発見がヒトの治療に高度に関連していることを示している。これを裏付けるために、ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプを有するドナーに由来するヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞の、ヒトプロインスリンペプチドＢ３０－Ｃ１３に対する応答を分析した。これにより、ＨＬＡ－ＤＲ３－ＤＱ２ドナーが、このハプロタイプを有さないドナーよりも、Ｂ３０－Ｃ１３に対してより高い応答を示したことが示された（図７）。更に、Ｂ３０－Ｃ１３に対する応答は、ＨＬＡ－ＤＲ４制限であることがこれまでに示されている本発明者らの対照ペプチドＣ１９－Ａ３に対するものよりも高かった（Ａｒｉｆ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１３（３）：４５１－４６３）。
実施例５
ＨＬＡ－ＤＲ３／ＤＱ２陽性である１型糖尿病を有する新規発症患者において、５つのペプチドを試験した（図８）。炎症性サイトカイン応答が、ペプチドの全てに応答して見られ、それらのペプチドが、Ｔ１Ｄにおいて強力に免疫原性であることが示された。更に、ＩＦＮ－γ応答及びＩＬ－１７応答の両方が観察され、これらは、疾患における細胞損傷と関連している。これらの対象においては、免疫制御性（ＩＬ－１０）応答もまたあり、これらのペプチドが、Ｔ１Ｄ疾患の状況で寛容原性であることを示唆している。
本明細書に引用されている全ての特許及び文献の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
Figure 2022548167000002
Figure 2022548167000003
Figure 2022548167000004

Claims (42)

  1. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも７８％の相同性を有するペプチド。
  2. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の相同性を有する、請求項１に記載のペプチド。
  3. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載のペプチド。
  4. 配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のペプチド。
  5. 請求項１から４のいずれか一項に記載のペプチドのうちの２つ以上を含むペプチドの組み合わせ。
  6. 請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチドの組み合わせと、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的に許容される組成物。
  7. システインを更に含む、請求項６に記載の薬学的に許容される組成物。
  8. 治療に使用するための、請求項６又は７に記載の薬学的に許容される組成物。
  9. １型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防に使用するための、請求項８に記載の薬学的に許容される組成物。
  10. 患者は、ＤＲ３ハプロタイプを有する、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防に使用するための、請求項９に記載の薬学的に許容される組成物。
  11. 前記患者は、ＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプを有する、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防に使用するための、請求項１０に記載の薬学的に許容される組成物。
  12. １型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防のための医薬品の製造に使用するための、請求項６又は７に記載の薬学的に許容される組成物。
  13. 患者は、ＤＲ３ハプロタイプを有する、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防のための医薬品の製造に使用するための、請求項１２に記載の薬学的に許容される組成物。
  14. 前記患者は、ＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプを有する、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防のための医薬品の製造に使用するための、請求項１３に記載の薬学的に許容される組成物。
  15. 前記ペプチド又は前記ペプチドの組み合わせは、ナノ粒子上にコーティングされている、請求項６から１５のいずれかに記載の薬学的に許容される組成物。
  16. 前記ペプチド又は前記ペプチドの組み合わせは、前記ナノ粒子に結合しているＭＨＣ複合体に結合することによって、前記ナノ粒子上にコーティングされている、請求項１５に記載の薬学的に許容される組成物。
  17. 前記組成物は、静脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、経鼻、経口、又は表皮経路を含む、非経口、経口、又は局所経路によって送達されるように製剤化される、請求項６から１６のいずれかに記載の薬学的に許容される組成物。
  18. 前記組成物は、皮内経路によって送達されるように製剤化される、請求項１７に記載の薬学的に許容される組成物。
  19. １型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療又は予防の方法であって、請求項６又は７に記載の薬学的に許容される組成物は、Ｔ１Ｄを有する患者、又はＴ１Ｄの高いリスクにあるとして特定された非糖尿病個体に投与される、方法。
  20. 前記患者は、ＤＲ３ハプロタイプを有する、請求項１４に記載の治療又は予防の方法。
  21. 前記患者は、ＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプを有する、請求項２０に記載の治療又は予防の方法。
  22. 本発明の薬学的に許容される組成物は、β細胞量が残っている患者に投与される、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の治療又は予防の方法。
  23. 前記薬学的に許容される組成物は、静脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、経鼻、経口、又は表皮経路を含む、非経口、経口、又は局所経路によって投与される、請求項１９から２２に記載の治療又は予防の方法。
  24. 前記薬学的に許容される組成物は、皮内経路によって投与される、請求項２３に記載の治療又は予防の方法。
  25. 請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチドの組み合わせを含む、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を治療又は予防するためのキット。
  26. 請求項１から４のいずれか一項に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列。
  27. 請求項１から４に記載のペプチドのうちのいずれか１つ及びそれらの混合物を発現するベクター。
  28. Ｔ１Ｄを自然発生的に発症する遺伝子改変動物であって、前記動物は、ＤＲ３ハプロタイプ、好ましくはＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプを有する、遺伝子改変動物。
  29. 前記動物は、齧歯動物、好ましくはマウスである、請求項２８に記載の遺伝子改変動物。
  30. 前記動物は、ラットインスリンプロモーター（ＲＩＰ）下においてＣＤ８０を発現する、請求項２９に記載の遺伝子改変動物。
  31. ＴＩＤ関連抗原ドライバーを特定するための方法であって、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の動物を、プロインスリンのＢ２３－Ｃ２０領域に由来するペプチドでプライミングすることと、疾患の進行が加速された場合にペプチドを抗原ドライバーとして特定することと、を含む、方法。
  32. 疾患の進行は、プライミングが行われなかった場合よりも５０％速く進行する場合に加速されていると見なされる、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ペプチドは、請求項１から４に記載のペプチドから選択される、請求項３１又は３２に記載の方法。
  34. 前記ペプチドは、アジュバントと組み合わせて投与される、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記ペプチドは、ペプチド当たり最大１ｍｇの投薬量で投与される、請求項３１から３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 診断又は治療有効性を判定する方法であって、
    （ａ）Ｔ１Ｄを有するか若しくはＴ１Ｄに感受性であると疑われる個体に由来するＣＤ４リンパ球を提供すること、
    （ｂ）前記個体によって発現されるものと同一のアレルのクラスＩＩ ＭＨＣ分子を表面上に有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団を提供することであって、前記ＡＰＣの集団は、請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチド若しくはペプチドの組み合わせ、及び請求項１から４に記載のペプチドのうちの１つ以上に結合しているクラスＩＩ ＭＨＣ分子と接触している、提供すること、又は
    （ｃ）前記個体によって発現されるものと同一のアレルのクラスＩＩ ＭＨＣ分子を含む可溶性ペプチド－ＨＬＡ多量体試薬を提供することであって、前記ＭＨＣ分子は、請求項１から５に記載のペプチドの組み合わせの１つ以上のペプチドに結合している、提供することと、
    （ｄ）（ｂ）の前記ＡＰＣの集団又は（ｃ）の前記ペプチド－ＨＬＡ多量体を、（ａ）の前記ＣＤ４リンパ球と接触させることと、
    （ｅ）前記個体がＴ１Ｄを有するか若しくはＴ１Ｄに感受性であることの指標として、前記ＣＤ４リンパ球が前記クラスＩＩ ＭＨＣ結合ペプチドを認識するかどうかを判定することと、
    を含む、方法。
  37. 前記個体は、ＤＲ３ハプロタイプを有することが疑われる、請求項３６に記載の診断又は治療有効性を判定する方法。
  38. 前記個体は、ＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプを有することが疑われる、請求項３７に記載の診断又は治療有効性を判定する方法。
  39. 前記ＣＤ４リンパ球が前記クラスＩＩ ＭＨＣに結合したペプチドを認識する場合に、請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチドの組み合わせを前記個体に投与することを更に含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 対象を、Ｔ１Ｄの高いリスクにあるとして特定する方法であって、請求項１から５に記載のペプチド又はペプチドの組み合わせのうちのいずれか１つに対する免疫応答が検出された場合に、前記対象が、ＤＲ３ハプロタイプ、好ましくはＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプを有するかどうかを判定することを含む、方法。
  41. 患者を、Ｔ１Ｄ治療に好適であるとして特定する方法であって、請求項１から５に記載のペプチド又はペプチドの組み合わせのうちのいずれか１つに対する免疫応答が検出された場合に、前記患者が、ＤＲ３ハプロタイプ、好ましくはＤＲ３－ＤＱ２ハプロタイプを有するかどうかを判定することを含む、方法。
  42. 対象を、免疫療法のレスポンダーであるか、又は本発明のペプチド若しくはペプチドの組み合わせでの再治療を必要とするかのいずれかとして特定する方法であって、前記方法は、本発明のペプチド又はペプチドの組み合わせのうちのいずれか１つに対する免疫応答が検出されるかどうかを判定することを含む、方法。
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