CN114631028A - 方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于鉴定致耐受肽的方法。本发明还涉及在此类方法中使用和通过此类方法生产的产品。本发明还涉及此类致耐受肽在治疗疾病中的用途。

Description

方法
发明领域
本发明涉及鉴定致耐受肽的方法。本发明还涉及在此类方法中使用和通过此类方法生产的产品。本发明还涉及此类致耐受肽在治疗疾病中的用途。
发明背景
在适应性免疫应答中，T淋巴细胞能够识别蛋白质抗原的内部表位。抗原呈递细胞(APC)摄取蛋白质抗原并将其降解为短肽片段。肽可以与细胞内的主要组织相容性复合物(MHC)I类或II类分子结合，并被携带到细胞表面。当与MHC分子一起呈递在细胞表面时，肽可以由T细胞识别(通过T细胞受体(TCR))，在这种情况下，肽是T细胞表位。
T细胞表位在对任何抗原(无论是自身或外来的)的适应性免疫应答中起核心作用。已经通过使用实验模型证明了T细胞表位在超敏性疾病(包括过敏、自身免疫性疾病和移植排斥)中所起的核心作用。通过用合成肽(基于T细胞表位的结构)联合佐剂的免疫，可能诱导免疫或过敏性疾病。
相反，已经显示通过施用可溶形式的肽表位，可能诱导对特定肽表位的免疫耐受。已经证明施用可溶性肽抗原是在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE——多发性硬化症(MS)模型)中(Metzler and Wraith(1993)Int.Immunol.5:1159-1165；Liu and Wraith(1995)Int.Immunol.7:1255-1263；Anderton and Wraith(1998)Eur.J.Immunol.28:1251-1261)；和关节炎、糖尿病和葡萄膜视网膜炎的实验模型(如上所述在Anderton和Wraith(1998)中综述)抑制疾病的有效手段。也已经证明这是治疗EAE中持续性疾病的方法(Anderton andWraith(1998)如上,Streeter et al.(2015)Neurology,Neuroimmunology,Neuroinflammation vol.2,no.3,e93)。
使用致耐受肽来治疗或预防疾病已经引起相当大的关注。其原因之一是已经显示某些致耐受表位可以下调T细胞对同一组织内不同抗原的应答。这种被称为“旁观者抑制”的现象意味着应该有可能使用特定的致耐受肽诱导对给定抗原内的多于一个表位(优选所有表位)和给定疾病的多于一种抗原的耐受。Anderton and Wraith(1998)如上，Wraith(2016)Nature 530:422-423)。这将消除识别特定疾病中所有致病抗原的需要。
肽也是有利的治疗选择，因为它们相对较低的成本，以及可以生产具有改变的免疫特性或改变的溶解度的肽类似物的事实。因此可以修饰肽以改变它们与MHC或TCR的相互作用。
这种方法的一个可能问题是，并非所有充当T细胞表位的肽都能够诱导耐受。髓鞘碱性蛋白(MBP)肽89-101是免疫后的免疫显性抗原，并且在引发T细胞反应性和诱导EAE方面也是非常有效的免疫原。然而，已经证明该肽在溶液中施用时在诱导耐受上无效(Anderton and Wraith(1998)，如上)。
本发明人先前已经表明，如果肽表位具有适当的特性以由未成熟的APC呈递而无需抗原加工，则该肽可以诱导免疫耐受。因此，观察到一些T细胞表位是致耐受的，而另一些表位不能诱导耐受，因此可以通过以下事实来解释：一些表位在它们能够由MHC分子呈递之前需要进一步加工。这些需要进一步加工的表位在以可溶形式施用时不诱导耐受，尽管它们在联合佐剂注射时能够诱导疾病。
不需要进一步加工的表位能够诱导耐受，并且已经由发明人称为“apitope”(抗原加工非依赖性表位)。
该发现为选择致耐受T细胞表位提供了基于规则的方法，该方法消除了在体内检查肽的致耐受能力的需要，并且特别有利于开发治疗或预防没有可用的动物模型的疾病的策略。
即使对于具有动物模型的疾病，选择方法也应该使耐受诱导组合物的开发更简单和更安全，因为它提供了一种机制，据此可以在体内使用之前，在体外在人T细胞(识别抗原连同人MHC分子)上测试肽的耐受诱导能力。
然而，发明人现在已经开发了用于选择和/或鉴定致耐受肽的改良方法。该方法通过选择具有与致耐受肽相关的多种特性的肽来稳健和严格地筛选致耐受肽。此外，发明人已经开发了用于测试肽的与致耐受相关的特性的更有效的方法，以及更好地模拟抗原肽选择的自然过程的方法。因此，这些改良的方法使鉴定致耐受肽的整个过程在选择将在体内具有致耐受作用的肽上更高效和更有效，并且可以比用本领域先前已知的方法更快地鉴定致耐受肽。
发明概述
本发明涉及如本文所述的几种方法(或阶段)，它们可以组合进行，以实现鉴定致耐受肽的有效方法。方法或阶段可以包括以下任何内容：
T细胞表位的鉴定-CLIP置换测定法
在一个方面，本发明提供了鉴定包含T细胞表位的肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)将主要组织相容性复合物II类(MHCII)和II类相关不变链肽(CLIP)的复合物(MHCII-CLIP)与肽接触；
(ii)添加对抗原具有特异性的T细胞；和
(iii)测量所述T细胞的活化。
导致T细胞活化的肽可以包含T细胞表位。
CLIP肽可以具有序列PVSKMRMATPLLMQA。
在另一个方面，本发明提供了测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)将主要组织相容性复合物II类(MHCII)和II类相关不变链肽(CLIP)的复合物(MHCII-CLIP)与肽接触；
(ii)添加对抗原具有特异性的T细胞；和
(iii)测量所述T细胞的活化。
导致T细胞活化的肽在未进行加工的情况下能够与MHCII结合。
在另一个方面，本发明提供了CLIP在鉴定致耐受肽的方法中的用途。
在一方面，T细胞活化可以通过测量分泌的IL-2的水平或任何其他合适的方法来测量。本领域技术人员将知道用于测量细胞因子水平的合适技术，例如通过ELISA方法或其他合适的方法。
体外竞争测定法
在另一个方面，本发明提供了测试肽对存在于APC上的MHCII的结合亲和力的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)向MHCII添加测试肽；
(ii)添加对照肽；
(ii)添加对对照肽具有特异性的T细胞；和
(iii)测量T细胞活化。
在该测定中，对照肽是已知的能够与MHCII结合的致耐受肽。首先将测试肽添加至MHCII/APC，然后添加对照肽。如果T细胞经激活，则对照肽置换了测试肽，因此测试肽与对照肽相比具有较低的相对结合亲和力。换言之，如果对照肽特异性T细胞活化降低，则测试肽以相似或更高的亲和力结合MHCII，从而阻止用对照肽替换。
在一方面，对照肽可以是SEQ ID NO:10的对照肽。例如，当MHCII为HLA-DR2时。
在另一方面，本发明提供了由序列KKGPRCLTRYYSSFVNMEGKK(SEQ ID No.10)组成的肽在测试肽对MHCII的结合亲和力的方法中的用途。
一方面，对照肽可以是SEQ ID NO:5的对照肽。例如，当MHCII为HLA-DR3或HLA-DR4时。
在另一方面，本发明提供了由序列KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.5)组成的肽在测试肽对MHCII的结合亲和力的方法中的用途。
体内MCII加载测定
在一方面，可以修饰肽以提高溶解度。WO2014/072958中描述了修饰FVIII肽以提高其溶解度。WO2015/019302中描述了修饰促甲状腺激素受体(TSHR)肽以提高其溶解度。WO2018/127830中描述了修饰S-抗原(S-Ag)肽以提高其溶解度。
在另一方面，本发明涵盖方法，该方法可以确定肽是否足够可溶以使其通过液相并最终在注射时进入脾。在脾中，肽随后可以结合树突状细胞上的MHCII并被呈递。
因此，在另一方面，本发明提供了用于测试肽的体内溶解度的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供来自已注射肽的小鼠的树突状细胞；
(ii)将所述树突状细胞与对所述肽具有特异性的T细胞共培养；和
(iii)测量T细胞活化。
在一方面，T细胞可以是原代T细胞、T细胞克隆或T细胞杂交瘤。
离体耐受
在另一方面，本发明提供了测试肽诱导对抗原的耐受的能力的离体方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供来自已注射肽的动物的T细胞；
(ii)用抗原刺激所述T细胞；和
(iii)测量T细胞活化。
在一方面，T细胞活化可以通过测量BrdU掺入、EdU掺入、Ki67水平、IL2分泌、IL17分泌和/或IFNγ分泌来测量。
患者细胞对肽的识别
一方面，可以进行如本文所述的CLIP置换测定，其中步骤(ii)包括添加已从患者分离的PBMC。例如测定可以用于确认肽被呈递至患者细胞。
在疾病模型中测试功效
在一方面，本发明可以涵盖在所讨论疾病的合适动物模型中测试经鉴定的肽的步骤。本领域技术人员将知道合适的疾病模型。例如，用于测试FVIII肽的动物模型描述于WO2014/072958。用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽免疫诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型描述于WO2014/111840。用于测试促甲状腺激素受体(TSHR)肽的格雷夫斯病的动物模型描述于WO2015/019302。
生物标志物测定
在另一个方面，本发明提供了确定肽对细胞因子分泌的影响的方法，其包括测量已经注射了肽的小鼠的血清细胞因子水平。响应于肽而分泌的细胞因子的模式表明该肽结合MHCII并在体内激活T细胞。重复注射肽后细胞因子分泌模式的变化，诸如增加的IL10分泌，指示耐受诱导。
在一方面，小鼠可以是HLA-DR转基因小鼠。
在一个方面，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，其包括以下步骤：
(i)根据本文所述的方法进行CLIP置换测定；和/或
(ii)根据本文所述的方法进行体外竞争测定；和/或
(iii)根据本文所述的方法进行体内MCII加载测定；和/或
(iv)根据本文所述的方法对患者PBMC进行CLIP置换测定；和/或
(v)根据本文所述的方法进行离体耐受测定；和/或
(vi)在疾病模型中测试肽的功效；和/或
(vii)根据本文所述的方法进行生物标志物测定。
在另一个方面，本发明提供了通过本发明的方法鉴定的致耐受肽。
在另一个方面，本发明提供了包含通过本发明的方法鉴定的致耐受肽的组合物。
在另一个方面，本发明提供了治疗和/或预防受试者疾病的方法，其包括向受试者施用本发明的肽或组合物的步骤。
在另一方面，本发明提供了用于治疗和/或预防疾病的致耐受肽或组合物。
在另一个方面，本发明提供了本发明的致耐受肽或组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
附图说明
图1-CLIP置换测定法
肽交换后MBP特异性T细胞系对HLA-DR2单体的应答。与CLIP肽结合的生物素化HLA-DR2(DRB1*1501)单体附接到中性亲和素包被的96孔板。将孔与指定浓度的MBP 83-99(MBP的优势HLA-DR2限制性表位)温育16小时并清洗板。对照孔用预加载有MBP 83-99肽的DR2单体包被。对MBP具有特异性的T细胞系与单体在37℃下温育24小时，并通过测量分泌的IL-2来评估应答。
图2-APIPS测定法
T细胞对固定的抗原呈递细胞(APC)呈递的肽的应答以识别apitope(抗原加工非依赖性表位)
A.在指定的蛋白质或肽存在下，将TSHR特异性杂交瘤与作为APC的来自HLA-DR转基因小鼠的新鲜或固定脾细胞共培养。在这些培养物的上清液中测量响应杂交瘤的IL-2的分泌。
B.将从用CFA中的肽D免疫的HLA-DR转基因小鼠分离的CD4+T细胞与作为APC的新鲜或固定的VAVY细胞共培养。向这些培养物中添加蛋白质或肽抗原，并在上清液中测量响应CD4+细胞的IFNg分泌。
C.将来自肽F特异性(HLA-DR转基因)小鼠T细胞系(TCL)的细胞与作为APC的VAVY细胞共培养。向这些培养物中添加蛋白质或肽抗原，并在上清液中测量响应TCL的IFNg分泌。
图3-体外竞争测定法
对照肽特异性T细胞杂交瘤与测试肽竞争后的应答。在固定的表达HLA-DR的抗原呈递细胞(APC)存在下培养对照肽特异性T细胞杂交瘤。在37℃下向这些培养物中添加测试肽和对照肽48小时。通过测量分泌的IL-2来评估T细胞杂交瘤的应答。减少的IL-2的分泌表明测试肽的结合有利于对照肽。
图4-体内MHCII载荷测定法
肽特异性CD4+T细胞对体内加载在树突状细胞上的肽的应答。用100μg的肽N(HLA-DR非结合)或肽O(HLA-DR结合)皮下注射HLA-DR转基因小鼠。注射后2h，解剖脾并分离CD11c+细胞(树突状细胞)。这些CD11c+细胞与肽特异性CD4+细胞在37℃下共培养72h。在这些培养物的上清液中测量IFNγ以评估CD4+T细胞对肽的应答。
图5-离体耐受测定法
对经肽处理和未处理小鼠的淋巴结(A)和脾(B)中的蛋白质抗原的响应。用皮下注射(0,1；1；10和3x 100μg每隔一天)致耐受(肽Q)或非致耐受(肽P)肽的剂量递增方案，或对照注射(PBS)处理HLA-DR转基因小鼠。之后，用CFA中的肽抗原免疫小鼠，并在10天后，解剖淋巴结和脾。在蛋白质抗原(SAg)或阳性对照(PPD)存在下，将淋巴结和脾细胞在37℃下体外培养3天。通过测量培养物的上清液中的IFNg水平来评估细胞对蛋白质抗原的响应。*p<0.05
图6-生物标志物测定法
用CFA中的肽B免疫HLA-DR转基因小鼠。在免疫后第21天，皮下注射100μg的肽C。注射后2小时，收集血液并通过电化学发光测定(MSD)分析血清细胞因子水平。*p<0.05，**p<0.01
图7-鉴定致耐受肽的方法
显示鉴定致耐受肽的方法的流程图。括号中的数字是指可以使用本文所述的每种测定法的地方：(1)CLIP置换测定法，(2)竞争测定法，(3)MHCII载荷测定法，(4)离体耐受测定法，(5)生物标志物测定法。
发明详述
本发明涉及选择或鉴定致耐受肽的方法。
如本文所用，术语“致耐受的”是指能够诱导耐受。“致耐受肽”是在治疗超敏性病症诸如自身免疫性疾病中可能有效的肽。可以在动物模型和临床试验中测试致耐受性。
某些特性与致耐受性有关。例如，致耐受的肽可能具有以下一种或多种特性：
·该肽包含一个T细胞表位
·肽在不经加工的情况下可以与MHCII结合
·肽对MHCII具有相对高的亲和力
·肽的可溶性足以施用和在体内循环，从而能够与体内APC上的MHCII缔合
·肽在离体测定中诱导耐受
诸如上面列出的那些性质可能表明该肽可能是致耐受的，或者对于该肽是致耐受的可能是重要的或甚至是必需的。
本发明的方法涉及测试肽的与致耐受性相关的特性。通过这种方式，可以在动物模型和人临床试验中测试致耐受肽之前对其进行鉴定。
本发明的方法通过测试、分析或评估给定肽是否具有对肽为致耐受的是指示性、重要或必要性的多种特性来鉴定致耐受肽，诸如上面列出的两种或更多种特性，诸如三或更多种，诸如四种或更多种，诸如上面列出的所有五种特性。
本发明用于鉴定致耐受肽的方法可以设想为筛选过程。测试了肽的与致耐受肽相关的特定特性。不考虑缺乏测试特性的肽，而保留具有所测试特性的肽。然后测试了保留肽的与致耐受肽相关的另一特性，并重复该过程，每次测试保留肽的不同特性并保留具有该特性的肽。以这种方式，一大堆潜在的致耐受肽可以缩窄为极有可能在治疗上有效的少数致耐受肽。
因此，本发明的方法提供了用于鉴定致耐受肽的稳健和严格的方法。与先前用于鉴定致耐受肽的方法相比，本发明的方法可以减少鉴定的“假阳性”(即肽被用于进一步测试，诸如动物模型或临床试验，但最终证明在治疗上无效)的数量，从而节省时间、金钱和其他资源。
因此，本发明的一个方面提供了鉴定致耐受肽的方法，其包括
鉴定包含T细胞表位的肽，和/或
测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力，和/或
测试肽对MHCII的结合亲和力，和/或
测试肽的体内溶解度，和/或
测试肽诱导抗原耐受的能力，和/或
测试肽对体内细胞因子分泌的影响。
此类方法可根据本文所述的本发明进行。在进一步的方面，本发明涉及用于测试、分析或评估肽的一种或多种与致耐受肽相关的特性的改良方法。
本发明的一个这样的方面提供了鉴定包含T细胞表位的肽的方法，其比以前的方法更有效。这些方法在本文中称为“CLIP置换测定法”。
本发明的另一个这样的方面提供了测试肽对MHCII的结合亲和力的方法，该方法比以前的方法更生理学上相关。这些方法在本文中也称为“竞争测定法”。
本发明的另一个这样的方面提供了测试肽的体内溶解度的方法，其给出了比以前的体外方法更治疗性相关的结果。这些方法在本文中称为“MHCII载荷测定法”。
本发明的另一个这样的方面提供了测试肽诱导抗原耐受的能力的方法。这些方法在本文中称为“离体耐受测定法”。
本发明的另一个这样的方面提供了确定肽对细胞因子分泌的影响的方法。这些方法在本文中被称为“生物标志物测定法”。
这些用于测试肽特性的改良方法可以用作上述鉴定致耐受肽的方法的部分。换言之，鉴定致耐受肽的本发明的方法可以包括测试肽与致耐受肽相关的特性的本发明的方法中的一种或多种。
在一些实施方案中，鉴定致耐受肽的方法包括
鉴定包含T细胞表位的肽的本发明的方法，和/或
测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力的本发明的方法，和/或
测试肽对MHCII的结合亲和力的本发明的方法，和/或
测试肽的体内溶解度的本发明的方法，和/或
测试肽诱导抗原耐受的能力的本发明的方法，和/或
测试肽对体内细胞因子分泌的影响的本发明的方法。
肽
术语“肽”在正常意义上用于意指一系列残基，通常是L-氨基酸，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羧基之间的肽键相互连接。该术语包括修饰肽和合成肽类似物。
本发明的肽可以使用化学方法制备(Peptide Chemistry,A practicalTextbook.Mikos Bodansky,Springer-Verlag,Berlin.)。例如，可以通过固相技术合成肽(Roberge JY et al.(1995)Science 269:202-204)，从树脂上裂解，并通过制备型高效液相色谱法(例如，Creighton(1983)Proteins Structures And Molecular Principles,WHFreeman and Co,New York NY)纯化。例如，可以根据制造商提供的说明使用ABI 43 1A肽合成仪(Perkin Elmer)来实现自动化合成。
或者，可以通过重组方式，或通过从较长的多肽上切割，然后修饰其一个或两个末端来制备肽。肽的组成可以通过氨基酸分析或测序(例如，Edman降解规程)来确认。
出于实际目的，肽可能显示出各种其他特征。例如，重要的是肽在体内足够稳定以用于治疗。肽的体内半衰期可以是至少10分钟(例如游离形式)、15分钟、30分钟、4小时或24小时。
肽还可以在体内表现出良好的生物利用度。肽可以在体内维持构象，使其能够在细胞表面与MHC分子结合而不受应有的阻碍。
序列同一性可以通过任何方便的方法来评估。然而，为了确定序列之间的序列同一性程度，进行序列多重比对的计算机程序是有用的，例如Clustal W(Thompson et al.,(1994)Nucleic Acids Res.,22:4673-4680)。比较和比对序列对的程序，如ALIGN(Myerset al.,(1988)CABIOS,4:1-17)；FASTA(Pearson et al.,(1988)PNAS,85:2444-2448；Pearson(1990),Methods Enzymol.,183:63-98)和缺口BLAST(Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)也可以用于此目的。此外，欧洲生物信息学研究所的Dali服务器提供基于结构的蛋白质序列比对(Holm(1993)J.Mol.Biol.,233:123-38；Holm(1995)Trends Biochem.Sci.,20:478-480；Holm(1998)Nucleic Acid Res.,26:316-9)。
可以使用标准BLAST参数测定多序列比对和同一性百分比计算(使用来自所有可用生物的序列，矩阵Blosum 62，缺口成本：存在11，扩展1)。
或者，可以使用以下程序和参数：程序：AlignPlus 4，版本4.10(Sci Ed CentralClone Manager Professional Suite)。DNA比较：全局比较，标准线性评分矩阵，错配罚分＝2，开放缺口罚分＝4，扩展缺口罚分＝1。氨基酸比较：全局比较，BLOSUM 62评分矩阵。
因此，本发明的范围包括所规定或给定序列的变体，只要变体保留亲本的功能活性，即变体在功能上是等同的，换句话说，它们具有或表现出如本文所定义的亲本肽的活性。此类变体可以包含例如：一个或多个，例如1到14个氨基酸的亲本序列的氨基酸替代、添加或缺失(包括一个或两个末端的截短)。
还包括功能等同的衍生物，其中一种或多种氨基酸是化学衍生的，例如经化学基团替代的氨基酸。
本发明的肽可以配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基形成)，且其与无机酸(诸如，例如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸和马来酸)形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸和普鲁卡因的有机碱。
抗原
如本文所用，术语“抗原”是指诱导免疫应答的实体。对抗原的不适当免疫应答导致疾病。例如，对抗原的过度活跃的免疫应答可能导致超敏性病症诸如过敏。在自身免疫性疾病中，针对属于身体部分的物质产生免疫应答，因此被称为“自身抗原”。
本发明的方法鉴定了能够诱导抗原耐受(即降低对抗原的免疫应答)的肽。因此，这些致耐受肽可以用于治疗与对抗原的不适当免疫应答相关的疾病。每种此类疾病与特异性抗原的不耐受有关，每种疾病的抗原不相同。例如，已知自身免疫性疾病多发性硬化(MS)与髓鞘结合蛋白(MBP)不耐受有关，而格雷夫斯病与促甲状腺激素受体(TSHR)不耐受有关。
因此，每种疾病的治疗需要鉴定可以诱导对特异性抗原的耐受的肽，该抗原在该特定疾病的病因学中诱导不适当的免疫应答。
因此，本发明的方法可以用于鉴定诱导对任何蛋白质抗原的耐受的肽。在一些实施方案中，抗原可以是MBP、因子VIII(FVIIi)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘蛋白脂质蛋白(PLP)、TSHR、心肌肌球蛋白或S-抗原。衍生自这些抗原的致耐受肽已经用于证明本发明方法的功效(参见图1-6)。
“抗原呈递细胞”(APC)是在其表面呈递抗原用于免疫系统细胞识别的细胞。APC包括树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的APC已经从动物中分离(“原代APC”)。在一些实施方案中，APC来自APC系(即永生化APC)。
T细胞
如本文所用，术语“T细胞”是指表达T细胞受体的细胞，其能够通过增殖和/或分泌细胞因子来响应结合T细胞受体的肽。在一些实施方案中，T细胞是CD4+细胞。
在一些实施方案中，T细胞可以是原代T细胞(从受试者分离的T细胞)。
在一些实施方案中，T细胞可以是T细胞克隆。T细胞克隆是通过刺激分离的T细胞增殖而产生的具有相同抗原特异性的T细胞。
在一些实施方案中，T细胞可以是T细胞系。T细胞系是已经永生化的T细胞，诸如通过用病毒诸如Epstein-Barr病毒(EBV)转化。
在一些实施方案中，T细胞可以是T细胞杂交瘤。T细胞杂交瘤是原代T细胞与永生细胞的融合，产生可以由T细胞受体信号传导激活的永生细胞。
如本文所用，术语“T细胞活化”是指T细胞对其T细胞受体由肽结合的应答。这种应答通常包括T细胞的增殖和/或增加的细胞因子分泌和/或活化标志物的表达。因此可以通过测量T细胞的增殖和/或测量细胞因子的水平和/或测量活化标志物的表达来测量、评估或分析T细胞活化。
在一些实施方案中，可以通过测量T细胞的增殖来评估T细胞活化。用于测量T细胞增殖的技术是本领域已知的，包括测量掺入到增殖细胞的复制DNA中的3H-胸苷、5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)或5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)。
在一些实施方案中，可以通过测量细胞因子水平来评估T细胞活化。在一些实施方案中，可以通过测量白细胞介素2(IL2)水平来评估T细胞活化。在一些实施方案中，可以通过测量干扰素γ(IFNγ)水平来评估T细胞活化。
T细胞在本文中可以描述为对特定表位、肽或抗原具有特异性，或者可以描述为“肽特异性”或“抗原特异性”。这些术语意指T细胞响应所讨论的实体而被激活(即增殖和/或增加细胞因子产生和/或增加活化标志物的表达)。T细胞可能携带与所讨论的实体或所讨论的实体的部分结合的T细胞受体，作为激活T细胞的部分。例如，“肽特异性T细胞”可以是携带T细胞受体的T细胞，该T细胞受体能够与结合到APC上的MHCII的特定肽缔合。对特定抗原具有特异性的T细胞可能携带T细胞受体，该受体能够通过抗原加工与衍生自该抗原的肽结合并结合APC上的MHCII呈递。
Apitope
在适应性免疫应答中，T淋巴细胞能够识别蛋白质抗原的表位。抗原呈递细胞(APC)摄取蛋白质抗原并将其降解为短肽片段。肽可能与细胞内的主要组织相容性复合物(MHC)结合并被携带到细胞表面。当结合MHC分子呈递在细胞表面时，肽可以通过T细胞受体(TCR)由T细胞识别，在这种情况下，肽是T细胞表位。
因此，表位是衍生自抗原的肽，其能够与MHC分子的肽结合槽结合并由T细胞识别。
本发明人先前已经确定，肽与MHC分子结合并呈递给T细胞而无需进一步加工的能力与肽在体内诱导耐受的能力之间存在联系(WO 02/16410)。如果肽太长而无法在没有进一步加工(例如修剪)的情况下结合MHC分子的肽结合槽，或者以不适当的构象结合，则它在体内将不致耐受。另一方面，如果肽具有适当的大小和构象，可以以正确的形式直接与MHC肽结合槽结合以呈递给T细胞，则可以预测该肽可以用于耐受诱导。
因此，可以通过研究肽是否可以在体外无需进一步抗原加工而与MHC分子结合并呈递给T细胞来研究肽的致耐受能力。
不需要进一步加工的表位能够诱导耐受，并且已被发明人称为apitope(抗原加工非依赖性表位)。
与MHC II类分子结合的肽的长度通常在8到20个氨基酸之间，更通常在10到17个氨基酸之间，并且可以更长(例如最多40个氨基酸)。这些肽位于沿MHC II肽结合槽的延伸构象中，该MHC II肽结合槽(与MHC I类肽结合槽不同)在两端均是开放的。肽主要通过主链原子与排列在肽结合槽内的保守残基接触而保持在原位。
耐受
T细胞表位在对任何抗原(无论是自身抗原还是外来抗原)的适应性免疫应答中发挥核心作用。已经通过使用实验模型证明了T细胞表位在超敏性(自身免疫性)疾病(包括过敏和移植排斥)中所起的核心作用。通过注射合成肽(基于T细胞表位的结构)结合佐剂，可以诱导自身免疫或过敏性疾病。
相反，已经显示通过施用可溶形式的肽表位可能诱导对特定抗原的免疫原性耐受。已经证明可溶性肽的施用是抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE-多发性硬化(MS)模型)中疾病的有效手段(Metzler and Wraith(1993)Int.Immunol.5:1159-1165；Liu andWraith(1995)Int.Immunol.7:1255-1263；Anderton and Wraith(1998)Eur.J.Immunol.28:1251-1261；de Souza(2018)Neuro.Ther.7:103-128)；和关节炎、糖尿病和葡萄膜视网膜炎的实验模型(在Anderton and Wraith(1998)中综述，如上)。这也已经证明是治疗EAE中持续性疾病的方法(Anderton and Wraith(1998)，如上)。
耐受是对抗原的响应失败。对自身抗原的耐受是免疫系统的基本特征。当失去对自身抗原的耐受时，可能导致自身免疫性疾病。适应性免疫系统必须保持对多种感染因子作出应答的能力，同时避免自身组织中包含的自身抗原的自身免疫攻击。这在很大程度上是通过胸腺中高亲和力T淋巴细胞的阴性选择来控制的(中枢耐受)。然而，并非所有自身抗原均在胸腺中表达，因此自身反应性胸腺细胞的死亡仍然不完全。因此，外周组织中成熟的自身反应性T淋巴细胞也可以通过某些机制获得耐受(外周耐受)。Anderton et al.(1999)Immunological Reviews 169:123-137中给出了对中枢和外周耐受机制的综述。另见Wraith(2016)Nature 530:422-423。
耐受可能是由在至少部分CD4+T细胞中诱导无反应性引起的，或特征在于至少部分CD4+T细胞中诱导无反应性。为了激活T细胞，肽必须与能够向T细胞传递两个信号的“专业”APC缔合。第一信号(信号1)由APC细胞表面的MHC-肽复合物递送，并通过TCR由T细胞接受。第二信号(信号2)由APC表面的共刺激分子，诸如CD80和CD86递送，并由T细胞表面的CD28接受。人们认为，当T细胞在不存在信号2的情况下接受信号1时，它不被激活，实际上变为无反应性。无反应性T细胞对随后的抗原攻击难以抵抗，并且可能能够抑制其他免疫应答。认为无反应性T细胞与介导T细胞耐受有关。
在结合MHC分子呈递之前需要加工的肽不诱导耐受，因为它们必须由成熟的抗原呈递细胞加工。成熟的抗原呈递细胞(诸如巨噬细胞、B细胞和树突状细胞)能够加工抗原，但也能够将信号1和2递送至T细胞，导致T细胞活化。另一方面，Apitope将能够直接与未成熟APC上的MHC II类结合。因此，它们将在没有共刺激的情况下呈递至T细胞，从而导致T细胞无反应性和耐受。
当然，apitope也能够与成熟APC细胞表面的MHC分子结合。然而，免疫系统含有比成熟APC更丰富的未成熟APC(有人认为少于10％的树突状细胞被激活，Summers et al.(2001)Am.J.Pathol.159:285-295)。因此，apitope的默认位置将是无反应性/耐受，而不是活化。
已经显示，当诱导耐受时，抗原特异性CD4+T细胞增殖的能力降低。同样，这些细胞产生的IL2、IFNγ和IL4的产生被下调，但IL10的产生增加。已经证明在肽诱导耐受状态的小鼠中中和IL10可以完全恢复对疾病的易感性。已经提出调节细胞群持续处于产生IL10并介导免疫调节的耐受状态(Burkhart et al.(1999)Int.Immunol.11:1625-1634)。
因此，可以通过各种技术监测耐受的诱导，其包括：
(a)降低对体内以肽为靶表位的疾病的易感性；
(b)在CD4+T细胞中诱导无反应性(其可以通过随后在体外用抗原攻击来检测)；
(c)CD4+T细胞群的变化，其包括
(i)增殖减少；
(ii)例如IL2、IFNγ和IL4的产生下调；和
(iii)IL10的产量增加。
如本文所用，术语“致耐受的”意指能够诱导耐受。
本发明的方法旨在鉴定致耐受肽。特别地，本发明的方法可以用于鉴定作为在动物模型和临床试验中进一步测试的良好候选物的肽；本发明的方法提供了表明这些肽可能治疗上有效的强有力的指征。因此，术语“致耐受肽”可以指作为在动物模型和临床试验中进一步测试的候选物并且可能对治疗自身免疫性疾病有效的肽。
鉴定包含T细胞表位的肽
本领域已知有多种方法可以鉴定给定抗原内的T细胞表位。
天然加工的表位可以通过对从载有抗原的APC中洗脱的肽进行质谱分析来鉴定。这些APC要么被鼓励摄取抗原，要么通过用适当的基因转化而被迫在细胞内产生蛋白质。通常，APC与溶液中的蛋白质温育，或者适当地靶向APC细胞表面。在37℃下温育后，细胞在去污剂中裂解，并通过例如亲和层析纯化II类蛋白。用合适的化学介质(例如酸性条件)处理纯化的MHC导致肽从MHC中洗脱。分离该肽库并且其概况与以相同方式处理的对照APC的肽比较。(例如通过质谱法)分析蛋白质表达/喂养细胞特有的峰并鉴定肽片段。此规程通常生成有关通过抗原加工从特定抗原生成的肽范围(通常在“嵌套集合”中找到)的信息。
鉴定表位的另一种方法是在体外测定中筛选重叠并跨越抗原长度的肽合成文库。例如，可以使用长度为15个氨基酸并且重叠5或10个氨基酸的肽。在包含抗原呈递细胞和T细胞的抗原呈递系统中测试肽。例如，抗原呈递系统可以是鼠脾细胞制剂、来自扁桃体或PBMC的人细胞制剂。或者，抗原呈递系统可以包含特定的T细胞系/克隆和/或特定抗原呈递细胞类型。
T细胞活化可以通过T细胞增殖(例如使用3H-胸苷掺入)或细胞因子产生来测量。TH1型CD4+T细胞的活化可以例如通过IFNγ产生来检测，该IFNγ产生可以通过标准技术诸如ELISPOT测定来检测。
重叠肽研究通常表明抗原表位所在的区域。然后可以通过测量对截短肽的应答来评估特定T细胞的最小表位。例如，如果在重叠文库中获得对包含残基1-15的肽的响应，则在两末端处截短的组(即1-14、1-13、1-12等和2-15、3-15,4-15等)可以用于识别最小表位。
本发明人已经开发了鉴定包含T细胞表位的肽的更快方法。该方法在本文中称为CLIP置换测定。
CLIP置换测定法
主要组织相容性复合物(MHC)是多亚单位的细胞表面蛋白复合物，其结合抗原并将其展示在抗原呈递细胞表面用于T细胞识别。MHC分为三组：MHC I类、II类和III类。MHCII类(MHCII)通常在巨噬细胞、树突状细胞和B细胞的表面表达。
II类相关不变链肽(CLIP)是能够与MHCII的肽结合槽结合的肽，它协助MHCII在抗原呈递细胞中的形成和转运。
CLIP是作为称为HLA-DR抗原相关不变链(简称“不变链”)的多肽的部分合成的。在内质网(ER)中，不变链的区段与尚未完全组装的新合成MHCII复合物的肽结合槽结合。不变链由此阻断ER中发现的肽与MHCII的肽结合槽的结合。此外，不变链的N端细胞质尾部中的信号促进将不变链-MHCII复合物从ER输出到内体区室，而不是细胞表面。在内体区室中，组织蛋白酶S切割不变链，留下称为CLIP的片段(氨基酸86-100)，其结合在MHCII复合物的肽结合槽中。不变链的其余部分被降解。
在内体内，外源性蛋白质(即潜在抗原)由各种蛋白酶解折叠和降解(即它们进行“抗原加工”)。选择来自能够从MHCII中置换CLIP的降解的外源性蛋白的肽用于抗原呈递。
基于抗原肽能够从MHCII肽结合槽中置换CLIP的概念，发明人开发了鉴定包含T细胞表位的肽的方法。如果肽可以置换与MHCII结合的CLIP并激活T细胞，则该肽似乎包含T细胞表位。
具体而言，CLIP置换测定可以用于鉴定抗原中的T细胞表位。含有MHCII-CLIP单体的孔与一系列肽一起温育，这些肽覆盖了预测与MHCII结合的抗原区域(即预测包含T细胞表位的区域)。将呈递能够在没有抗原加工的情况下与MHCII结合并且具有足以置换CLIP的亲和力的肽。对抗原具有特异性的T细胞用于筛选肽的呈递。
因此，CLIP置换测定模拟并再现抗原衍生肽与MHCII结合的天然加工。因此，通过CLIP置换测定选择的肽模拟天然加工的T细胞表位，因此使相关细胞参与耐受诱导。
CLIP置换测定还提供了鉴定T细胞表位的高通量方法，因为许多不同的肽可以用非常少的操作同时测试。例如，在具有包被MHCII-CLIP的孔的96孔板中，可以通过直接添加肽然后是T细胞来测试48个重复样品。
因此，在一个方面，本发明提供了鉴定包含T细胞表位的肽的方法，其包括将肽添加到具有结合的II类相关不变链肽(CLIP)的MHCII(MHCII-CLIP)中，添加对抗原具有特异性的T细胞，和测量T细胞活化。
如果待测试肽包含T细胞表位，则该肽可能与MHCII结合并置换CLIP。然后，对抗原具有特异性的T细胞将通过其T细胞受体与肽结合并激活。因此T细胞活化表明待测试肽包含T细胞表位。
在一些实施方案中，该测定包括：
(i)选择对完整抗原应答(即对抗原的天然加工表位应答)的T细胞；
(ii)制备MHCII-CLIP复合物并将其黏附到组织培养板的孔中；
(iii)用覆盖预测的MHCII结合区域的一系列肽温育孔；和
(iv)添加T细胞并测量T细胞活化。
此外，如果肽可以置换与MHCII结合的CLIP并活化T细胞，则该肽能够与MHCII结合而不需要进行加工。只有那些能够在没有抗原加工的情况下结合并具有足以置换CLIP的亲和力的肽将被呈递，从而提供对于apitope的高通量筛选。
因此，在另一方面，本发明提供了测试肽在未进行加工的情况下结合MHCII的能力的方法，该方法包括将肽添加到MHCII-CLIP，添加对抗原具有特异性的T细胞，和测量T细胞活化。
在一些实施方案中，肽衍生自抗原(即肽具有与抗原的部分相同的氨基酸序列)。在一些实施方案中，肽衍生自预测结合MHCII的抗原区域。在一些实施方案中，肽衍生自预测结合的含有T细胞表位的抗原区域。
在一些实施方案中，肽是设计为覆盖抗原中预测含有T细胞表位或预测与MHCII结合的区域的多种肽之一。这些预测可能是在计算机上进行的。
在一些实施方案中，该方法平行地进行多次，在每种情况下使用不同的肽，诸如来自设计为覆盖抗原中预测含有T细胞表位或预测与MHCII结合的区域的多种肽的不同肽。因此，包含T细胞表位并且能够在不进行抗原加工的情况下与MHCII结合的肽选自该多种肽。
在一些实施方案中，T细胞是原代T细胞。在一些实施方案中，T细胞是T细胞克隆。在一些实施方案中，T细胞是T细胞杂交瘤。在一些实施方案中，T细胞来自T细胞系。在一些实施方案中，T细胞来自从受试者分离的外周血单个核细胞(PBMC)。
在一些实施方案中，MHCII可以是人白细胞抗原-DR同种型2(HLA-DR2)。在一些实施方案中，MHCII可以是人白细胞抗原-DR同种型2(HLA-DR3)。
在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量细胞因子分泌来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量IL2分泌来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量IFNγ分泌来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量IL2分泌和IFNγ分泌来测量。
在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量T细胞增殖来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量3H-胸苷掺入来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量BrdU掺入来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量EdU掺入来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量Ki67水平来测量。
在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量细胞因子分泌和T细胞增殖两者来测量。
在一些实施方案中，CLIP包含序列PVSKMRMATPLLMQA。
在一些实施方案中，该方法是体外方法。
MHCII的组分可以作为重组蛋白生产。特别地，MHCIIα和β链可以在细菌诸如大肠杆菌中表达，然后折叠并组装成具有标签肽的MHCII复合物。用于表达重组蛋白质、纯化此类蛋白质和将蛋白质组装成复合物的方法在本领域中是已知的。Day et al.(2003)J.Clin.Investig.112:831-842描述了表达MHCII-CLIP的方法。
MHCII-CLIP复合物可以组装然后附于培养板，诸如培养板的孔。
因此，在一些实施方案中，MHCII-CLIP附于培养板。在添加生物素-MHCII-CLIP复合物之前，通过用中性亲和素包被板，可以将MHCII-CLIP复合物生物素化以使其能够附于培养板。在一些实施方案中，MHCII-CLIP包含生物素。在一些实施方案中，MHCII-CLIP通过生物素-中性亲和素附于培养板。
在另一个方面，本发明提供了CLIP在本发明方法中的用途，其用于鉴定包含T细胞表位的肽或用于测试该肽在未进行加工的情况下余MHCII结合的能力。在一些实施方案中，CLIP包含序列PVSKMRMATPLLMQA(SEQ ID No.1)。
CLIP置换测定鉴定包含T细胞表位的肽，并测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力。如本文所述，包含T细胞表位和能够在不加工的情况下成为MHCII的特性与致耐受肽相关。因此，CLIP置换测定可以用于鉴定致耐受肽。
因此，在另一方面，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，其包括将肽添加到具有结合CLIP的MHCII，添加对抗原具有特异性的T细胞，和测量T细胞活化。
在一些实施方案中，CLIP置换测定可以与本文所述的一种或多种其他方法组合，用于测试肽的与致耐受相关的特性。因此，在一些实施方案中，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，其包括将肽添加到MHCII-CLIP、添加对抗原具有特异性的T细胞和测量T细胞活化，其中该方法进一步包括鉴定包含T细胞表位的肽的方法，和/或测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力的方法，和/或测试肽对MHCII的结合亲和力的方法，和/或测试肽的离体和体内溶解度的方法，和/或测试肽诱导抗原耐受能力的离体方法，和/或确定肽对细胞因子分泌的影响的方法。
在一些实施方案中，CLIP置换测定用于鉴定人T细胞表位。测定中使用的T细胞可以是来自患有超敏性疾病诸如自身免疫性疾病的受试者的T细胞。因此，T细胞将对受试者对其超敏的抗原特异。使用该测定法评估的肽可以设计为覆盖受试者对其超敏的抗原区域。
在一些实施方案中，CLIP置换测定与HLA-DR转基因小鼠中T细胞表位的鉴定平行使用。
非抗原加工依赖性呈递系统(APIPS)
在鉴定致耐受肽时，一旦鉴定出表位，下一步是研究它是否也表现为apitope(即能够在不进行加工的情况下与MHCII结合)。
apitope必须在不需要抗原加工的情况下被呈递至T细胞。在鉴定出含有T细胞表位的肽后，可以使用免加工系统鉴定apitope。
可以使用本文所述的本发明的CLIP置换测定法测试肽在不进行加工的情况下结合MHCII的能力。可替代地或另外地，可以使用非抗原加工依赖性呈递系统(APIPS)测试在不进行加工的情况下结合MHCII的能力。
APIPS的实例包括：
a)固定的APC(有或无CD28抗体)；
b)含有I类或II类MHC分子的脂质膜(具有或不具有CD28抗体)；和
c)以板结合形式纯化的天然或重组MHC(具有或不具有CD28抗体)。
已知使用固定APC来研究T细胞应答，例如在研究中通过测量对截短肽的应答来研究多肽内的最小表位(Fairchild et al.(1996)Int.Immunol.8:1035-1043)。可以使用例如甲醛(通常是多聚甲醛)或戊二醛来固定APC。
脂质膜可以使用人工脂质制备(可以是平面膜或脂质体)，或者可以是来自APC的质膜/微粒体级分。
在使用中，APIPS可以应用于组织培养板的孔中。然后添加肽抗原，并通过添加所选择的T细胞，如原代T细胞、T细胞杂交瘤、T细胞系或T细胞克隆来检测肽与APIPS的MHC部分的结合。T细胞的活化可以通过本领域已知的任何方法来测量，例如通过3H-胸苷掺入或细胞因子分泌。
因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括通过用肽处理APIPS、向APIPS添加对肽具有特异性的T细胞和测量T细胞活化来测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力。
在一些实施方案中，APIPS包括固定的APC。在一些实施方案中，APC是原代APC，诸如脾细胞。在一些实施方案中，APC来自APC系，诸如MGAR细胞或VAVY细胞。
在一些实施方案中，添加到APIPS的T细胞是原代T细胞。在一些实施方案中，T细胞是T细胞克隆。在一些实施方案中，T细胞是T细胞杂交瘤。
在一些实施方案中，T细胞来自T细胞系。
在一些实施方案中，MHCII可以是人白细胞抗原-DR同种型2(HLA-DR2)。在一些实施方案中，MHCII可以是人白细胞抗原-DR同种型2(HLA-DR3)。
在一些实施方案中，APC是脾细胞并且T细胞是T细胞杂交瘤。在一些实施方案中，APC来自APC系并且T细胞是原代T细胞。
在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量细胞因子分泌来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量IL2分泌来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量IFNγ分泌来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量IL2分泌和IFNγ分泌来测量。
在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量T细胞增殖来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量BrdU掺入来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量EdU掺入来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量Ki67水平来测量。
在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量细胞因子分泌和T细胞增殖来测量。
在本发明的鉴定致耐受肽的方法中，可以使用APIPS测定来代替本文所述的CLIP置换测定或除本文所述的CLIP置换测定之外使用APIPS测定来测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力。使用CLIP置换测定和APIPS测定可以特别可靠地鉴定能够在未进行加工的情况下与MHCII结合的肽。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，其包括如本文所述的CLIP置换测定和如本文所述的APIPS测定。在一些实施方案中，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，其包括将肽添加到MHCII-CLIP，添加对该肽具有特异性的T细胞，并测量T细胞活化，然后用该肽处理APIPS，将对肽具有特异性的T细胞添加至APIPS，并测量T细胞活化。
此外，在一些实施方案中，APIPS测定可以与本文所述的一种或多种其他方法组合，用于测试肽与致耐受相关的特性。因此，在一些实施方案中，本发明提供了测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力的方法，该方法包括用肽处理APIPS，将对肽具有特异性的T细胞添加至APIPS，和测量T细胞活化，其中该方法进一步包括鉴定包含T细胞表位的肽的方法，和/或测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力的方法，和/或测试肽对MHCII的结合亲和力的方法，和/或测试肽的体内溶解度的方法，和/或测试肽诱导抗原耐受的能力的离体方法，和/或确定肽对细胞因子分泌的影响的方法。
在一些实施方案中，APIPS测定在CLIP置换测定之后进行。
测试亲和力-体外竞争测定法
为了具有致耐受性，肽应该对MHCII具有相对高的亲和力。可以使用本领域已知的技术测量分子的结合亲和力。然而，本发明人已经建立了功能性“竞争测定”，用于分析肽与MHCII的结合，其根据鉴定致耐受肽的要求定制。
在本发明的竞争测定中，测试肽和对照肽竞争结合MHCII。在与MHCII结合方面竞争胜过对照肽的测试肽对MHCII具有相对高的亲和力，因此很可能是致耐受肽。
因此，在另一方面，本发明提供了测试肽对MHCII的结合亲和力的方法，其包括向MHCII添加测试肽和对照肽，添加对对照肽具有特异性的T细胞，和测量T细胞活化。
在一些实施方案中，MHCII位于抗原呈递细胞(APC)上。在一些实施方案中，APC是固定的。在一些实施方案中，APC是“新鲜的”，即不是固定的。在一些实施方案中，APC是原代APC。在一些实施方案中，APC来自APC系。在一些实施方案中，APC是MGAR细胞。在一些实施方案中，APC是VAVY细胞。在一些实施方案中，APC是BM14细胞。
在一些实施方案中，MHCII是HLA-DR2。在一些实施方案中，对照肽由序列KKGPRCLTRYYSSFVNMEGKK(SEQ ID No.10)组成。该对照肽序列对HLA-DR2具有特异性。
在一些实施方案中，MHCII是HLA-DR3。在一些实施方案中，MHCII是HLA-DR4。在一些实施方案中，MHCII对照肽由序列KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.5)组成。该对照肽序列对HLA-DR3和HLA-DR4具有特异性。
在一些实施方案中，T细胞是原代T细胞。在一些实施方案中，T细胞是T细胞克隆。在一些实施方案中，T细胞是T细胞杂交瘤。在一些实施方案中，T细胞来自T细胞系。
在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量细胞因子分泌来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量IL2分泌来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量IFNγ分泌来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量两个IL2来测量分泌和IFNγ分泌。
在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量T细胞增殖来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量3H-胸苷掺入来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量BrdU掺入来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量EdU掺入来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量Ki67水平来测量。
在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量细胞因子分泌和T细胞增殖来测量。
在一些实施方案中，在对照肽之前将测试肽添加至MHCII。在一些实施方案中，在添加对照肽之前，将测试肽与MHCII温育约15至45分钟。
在一些实施方案中，该方法是体外方法。
在另一个方面，本发明提供了由序列KKGPRCLTRYYSSFVNMEGKK(SEQ ID No.10)组成的对照肽在本发明的方法中的用途。
在另一方面，本发明提供了由序列KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.5)组成的对照肽在本发明的方法中的用途。
在一些实施方案中，本发明的竞争测定可以与本文所述的一种或多种其他方法组合，用于测试肽的与致耐受性相关的特性。因此，在一些实施方案中，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，其包括本发明的竞争测定。在一些实施方案中，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，其包括将测试肽和对照肽添加到MHCII，添加对对照肽具有特异性的T细胞，和测量T细胞活化，其中该方法进一步包括鉴定包含T细胞表位的肽的方法，和/或测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力的方法，和/或测试肽的体内溶解度的方法，和/或测试肽诱导抗原的耐受的能力的离体方法，和/或确定肽对细胞因子分泌的影响的方法。
在一些实施方案中，本发明的竞争测定在，诸如通过本发明的CLIP置换测定鉴定为包含T细胞表位的肽上进行。在一些实施方案中，本发明的竞争测定在，诸如通过本发明的CLIP置换测定或通过APIPS测定鉴定为能够在未进行加工的情况下结合MCII的肽上进行。在一些实施方案中，首先通过本发明的CLIP置换测定，然后通过APIPS测定，然后通过本发明的竞争测定来测试肽。
在一些实施方案中，本发明的竞争测定与APIPS测定组合。换言之，APIPS测定和竞争测定同时进行。
测试溶解度-MHCII载荷测定法
树突状细胞是一类表达在淋巴器官(淋巴结和脾)中发现的MHCII的抗原呈递细胞。可以在不进行抗原加工的情况下在体内结合脾树突状细胞上的MHCII的肽可以诱导耐受。然而，为了到达淋巴器官中的树突状细胞，肽必须足够的可溶解以通过液相。肽能够结合脾树突状细胞上的MHCII的程度可以称为“MHCII载荷”。
本发明人已经鉴定了肽在体内结合树突状细胞上的MHCII的能力与其诱导耐受的能力之间的直接相关性。因此，在鉴定潜在用于治疗疾病的致耐受肽时，了解这些肽是否可以在体内与树突状细胞上的MHCII结合是有用的。发明人已经开发了测试肽的这种特性的测定法，本文称为MHCII载荷测定法。
因此，在另一个方面，本发明提供了测试肽的体内溶解度的方法，该方法包括将来自已注射肽的小鼠的树突状细胞与对该肽具有特异性的T细胞共培养，并测量T细胞活化，其中T细胞是原代T细胞、T细胞克隆或T细胞杂交瘤。
术语“树突状细胞”可以指CD11c+细胞。可以使用本领域已知的技术分离此类细胞。
在一些实施方案中，T细胞是原代T细胞。在一些实施方案中，T细胞是T细胞克隆。在一些实施方案中，T细胞是T细胞杂交瘤。
在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量细胞因子分泌来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量IL2分泌来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量IFNγ分泌来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量IL2分泌和IFNγ分泌来测量。
在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量T细胞增殖来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量3H-胸苷掺入来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量BrdU掺入来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量EdU掺入来测量。在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量Ki67水平来测量。
在一些实施方案中，T细胞活化可以通过测量细胞因子分泌和T细胞增殖来测量。
在一些实施方案中，小鼠是HLA-DR2转基因(HLA-DR2tg)或HLA-DR3转基因(HLA-DR3tg)小鼠。
在一些实施方案中，已经用约100μg的肽注射小鼠。在一些实施方案中，已经皮下注射小鼠。
在一些实施方案中，树突状细胞是从小鼠的脾中收获的。
在一些实施方案中，本发明的MHCII载荷测定可以与本文所述的一种或多种其他方法组合，用于测试肽的与致耐受性相关的特性。因此，在一些实施方案中，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，其包括本发明的MHCII载荷测定。在一些实施方案中，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，该方法包括将来自已注射肽的小鼠的树突状细胞与对该肽具有特异性的T细胞共培养，并测量T细胞活化，其中该T细胞是原代T细胞、T细胞克隆或T细胞杂交瘤，其中该方法进一步包括鉴定包含T细胞表位的肽的方法，和/或测试肽在未进行加工的情况下结合MHCII的能力的方法，和/或测试肽对MHCII的结合亲和力的方法，和/或测试肽诱导抗原的耐受的能力的离体方法，和/或确定肽对细胞因子分泌的影响的方法.
在一些实施方案中，本发明的MHCII载荷测定在，诸如通过本发明的CLIP置换测定鉴定为包含T细胞表位的肽上进行。在一些实施方案中，本发明的MHCII载荷测定在，诸如通过本发明的CLIP置换测定或通过APIPS测定鉴定为能够在未进行加工的情况下结合MCII的肽上进行。在一些实施方案中，本发明的MHCII载荷测定在通过本发明的竞争测定鉴定为对MHCII具有高亲和力的肽上进行。
在一些实施方案中，首先通过本发明的CLIP置换测定，然后通过APIPS测定，然后通过本发明的竞争测定，然后通过本发明的MHCII载荷测定来测试肽。
测试致耐受性-离体耐受测定法
在另一个方面，本发明提供了测试肽诱导抗原耐受的能力的离体方法，其包括提供来自已经注射肽的动物的T细胞，用抗原刺激T细胞，和通过测量BrdU掺入、EdU掺入、Ki67水平、IL2分泌和/或IFNγ分泌来测量T细胞活化。该方法在本文中被称为“离体耐受测定”。
BrdU(5-溴-2’-脱氧尿苷)和EdU(5-乙炔基-2’-脱氧尿苷)是胸苷的合成核苷类似物。可以通过对BrdU或EdU具有特异性的抗体检测掺入复制细胞的新合成DNA中的BrdU或EdU，从而用作增殖细胞的标志物。在一些实施方案中，T细胞活化通过测量BrdU掺入来测量。在一些实施方案中，T细胞活化通过测量EdU掺入来测量。
Ki-67是参与核糖体RNA转录的核蛋白。Ki-67在细胞周期中存在于细胞中，但在非分裂细胞中不存在。因此，Ki-67可以用作增殖细胞的标志物。用针对Ki-67的抗体染色可以用于测量细胞增殖。在一些实施方案中，T细胞活化通过测量Ki67水平来测量。
在一些实施方案中，T细胞活化通过测量IL2分泌来测量。
在一些实施方案中，T细胞活化通过另外测量IFNγ分泌来测量。
在一些实施方案中，动物已经用抗原免疫。在一些实施方案中，在动物第一次注射肽后约10-20天用抗原免疫动物。在一些实施方案中，在动物第一次注射肽后约15天用抗原免疫动物。在一些实施方案中，在用抗原免疫动物后约10天用抗原刺激T细胞。在一些实施方案中，用抗原刺激T细胞约48-96小时。在一些实施方案中，用抗原刺激T细胞约72小时。在一些实施方案中，已经使用剂量递增方案注射肽。
在一些实施方案中，动物是小鼠。在一些实施方案中，小鼠是HLA-DR2tg或HLA-DR3tg小鼠。在一些实施方案中，T细胞在淋巴结细胞和脾细胞的样品中。
在一些实施方案中，动物是人。在一些实施方案中，T细胞在外周血单个核细胞(PBMC)样品中。
在一些实施方案中，本发明的离体耐受测定可与本文所述的一种或多种其他方法组合以测试肽的与致耐受性相关的特性。因此，在一些实施方案中，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，其包括本发明的离体耐受测定。在一些实施方案中，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，其包括提供来自已注射肽的动物的T细胞，用抗原刺激T细胞，以及通过测量BrdU掺入、EdU掺入、Ki67水平和/或IL2分泌测量T细胞活化，其中该方法进一步包括鉴定包含T细胞表位的肽的方法，和/或测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力的方法，和/或测试肽对MHCII的结合亲和力的方法，和/或测试肽在体内溶解度的方法，和/或确定肽对细胞因子分泌的影响的方法。
在一些实施方案中，本发明的离体耐受测定在，诸如通过本发明的CLIP置换测定鉴定为包含T细胞表位的肽上进行。在一些实施方案中，本发明的离体耐受测定在，诸如通过本发明的CLIP置换测定或通过APIPS测定鉴定为能够在为进行加工的情况下结合MCII的肽上进行。在一些实施方案中，本发明的离体耐受测定在通过本发明的竞争测定鉴定为对MHCII具有高亲和力的肽上进行。在一些实施方案中，本发明的离体耐受测定在通过本发明的MHCII载荷测定鉴定为具有良好体内溶解度的肽上进行。
在一些实施方案中，首先通过本发明的CLIP置换测定，然后通过APIPS测定，然后通过本发明的竞争测定，然后通过本发明的MHCII载荷测定，然后通过本发明的离体耐受测定来测试肽。
生物标志物测定法
在另一个方面，本发明提供了确定肽对细胞因子分泌的影响的方法，其包括测量已注射肽的小鼠的血清细胞因子水平。
响应肽而分泌的细胞因子的模式表明该肽与MHCII结合并在体内激活T细胞。重复注射肽后细胞因子分泌模式的变化，诸如IL10分泌增加，表明耐受诱导。
在一些实施方案中，在注射肽之前约15-25天用肽免疫小鼠。
在一些实施方案中，在注射肽之前约21天用肽免疫小鼠。
在一些实施方案中，用约100μg的肽注射小鼠。
在一些实施方案中，小鼠是HLA-DRtg小鼠。
在一些实施方案中，使用电化学发光测量细胞因子水平。
在一些实施方案中，测量IL2水平。
在一些实施方案中，测量白细胞介素6(IL6)水平。
在一些实施方案中，测量白细胞介素10(IL10)水平。
在一些实施方案中，测量白细胞介素12/白细胞介素23p40(IL12/IL23p40)水平。
在一些实施方案中，测量白细胞介素17(IL17)水平。
在一些实施方案中，测量IFNγ水平。
在一些实施方案中，本发明的生物标志物测定可以与本文所述的一种或多种其他方法组合，用于测试肽与致耐受性相关的特性。因此，在一些实施方案中，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，其包括本发明的生物标志物测定。在一些实施方案中，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，其包括确定肽对细胞因子分泌的影响，包括测量已注射该肽的小鼠的血清细胞因子水平，其中该方法进一步包括鉴定包含T细胞表位的肽的方法，和/或测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力的方法，和/或测试肽对MHCII的结合亲和力的方法，和/或测试肽的体内溶解度的方法，和/或测试肽诱导抗原的耐受的能力的方法。
在一些实施方案中，本发明的生物标志物测定在诸如通过本发明的CLIP置换测定鉴定为包含T细胞表位的肽上进行。在一些实施方案中，本发明的生物标志物测定在，诸如通过本发明的CLIP置换测定或通过APIPS测定鉴定为能够在未进行加工的情况下结合MCII的肽上进行。在一些实施方案中，本发明的生物标志物测定在通过本发明的竞争测定鉴定为对MHCII具有高亲和力的肽上进行。在一些实施方案中，本发明的生物标志物测定在通过本发明的MHCII载荷测定鉴定为具有良好体内溶解度的肽上进行。
在一些实施方案中，首先通过本发明的CLIP置换测定，然后通过APIPS测定，然后通过本发明的竞争测定，然后通过本发明的MHCII载荷测定，然后通过本发明的离体耐受测定，然后通过本发明的生物标志物测定来测试肽。
鉴定致耐受肽的方法
在另一个方面，本发明提供了选择或鉴定致耐受肽的方法，其包括本发明的任何方法。
本文所述的本发明方法可以单独，或联合一些或所有其他本发明的方法用于鉴定致耐受肽的方法中。
本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，其包括
使用根据本发明的方法鉴定包含T细胞表位的肽，和/或
使用根据本发明的方法测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力，和/或
使用根据本发明的方法测试肽对MHCII的结合亲和力，和/或
使用根据本发明的方法测试肽的体内溶解度，和/或
使用根据本发明的方法测试肽诱导抗原的耐受的能力，和/或
使用根据本发明的方法确定肽对细胞因子分泌的影响。
在一些实施方案中，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，该方法包括
使用根据本发明的CLIP置换测定鉴定包含T细胞表位的肽，和/或
使用根据本发明的CLIP置换测定测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力，和/或
使用根据本发明的APIPS测定测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力，和/或
使用根据本发明的竞争测定测试肽对MHCII的结合亲和力，和/或
使用根据本发明的MHCII载荷测定测试肽的体内溶解度，和/或
使用根据本发明的离体耐受测定测试肽诱导抗原耐受的能力，和/或
使用根据本发明的生物标志物测定确定肽对细胞因子分泌的影响。
在一些实施方案中，本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，该方法包括
鉴定包含T细胞表位的肽和/或用于测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力的方法，其包括将肽添加到MHCII-CLIP、添加对抗原具有特异性的T细胞和测量T细胞活化，和/或
通过用肽处理非抗原加工依赖性呈递系统(APIPS)，将对肽具有特异性的T细胞添加至APIPS，并测量T细胞活化来测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力的方法，和/或
测试肽对MHCII的结合亲和力的方法，其包括向MHCII添加测试肽和对照肽，添加对对照肽具有特异性的T细胞，和测量T细胞活化，和/或
测试肽的体内溶解度的方法，其包括将来自已注射肽的小鼠的树突状细胞与对肽具有特异性的T细胞共培养，并测量T细胞活化，其中T细胞是原代T细胞，T细胞克隆或T细胞杂交瘤，和/或
测试肽诱导抗原的耐受的能力的离体方法，其包括提供来自已注射肽的动物的T细胞，用抗原刺激T细胞，以及通过测量BrdU掺入，EdU掺入、Ki67水平、IL2分泌和/或IFNγ分泌来测量T细胞活化，和/或
确定肽对细胞因子分泌的影响的方法，其包括测量已注射肽的小鼠的血清细胞因子水平。
在一些实施方案中，用于鉴定致耐受肽的方法包括选自以下的一种方法：CLIP置换测定法、APIPS测定法、竞争测定法、MHCII载荷测定法、离体耐受测定法、生物标志物测定法。在一些实施方案中，该方法包括选自其中的两种测定法。在一些实施方案中，该方法包括选自其中的三种测定法。在一些实施方案中，该方法包括选自其中的四种测定法。在一些实施方案中，该方法包括选自其中的五种测定法。在一些实施方案中，该方法包括所有列出的六种测定法。
在一些实施方案中，给定肽可以在选自本文所述方法的第一种方法中测试，然后在选自本文所述方法的第二种方法中测试，然后在选自本文所述方法的第三种方法中测试，然后在选自本文所述的方法的第四种方法中测试，然后在选自本文所述的方法的第五种方法中测试，然后在选自本文所述的方法的第六种方法中测试。
图7显示了本发明的方法如何适用于鉴定致耐受肽的总体方法的示意图。T细胞表位可以在计算机上预测并在HLA转基因小鼠和/或人原代血单核细胞培养物中鉴定。从这些经鉴定的表位中，可以使用本发明的CLIP置换测定和/或APIPS测定来选择apitope。可以使用本发明的竞争测定来测试这些apitope对MHCII的结合亲和力。在以这种方式筛选了apitope之后，可以进一步修饰它们以改善它们的物理性质，例如溶解度，并使用本发明的MHCII载荷测定测试结合MHC II类的能力。那些表现出结合树突状细胞上的MHCII能力的肽可以在离体耐受模型和疾病模型(如果合适)中进一步测试诱导耐受的能力。这些治疗候选物也可以在本发明的生物标志物测定中进行测试。以这种方式，建立了鉴定用于治疗自身免疫性疾病的潜在治疗性肽的工作流程。
本发明的方法不限于特定组合或特定顺序。优选地，首先进行CLIP置换测定。在优选的实施方案中，本发明的方法按以下顺序进行：CLIP置换测定、APIPS测定、竞争测定、MHCII载荷测定、离体耐受测定、生物标志物测定。
本发明提供了鉴定致耐受肽的方法，该方法包括
鉴定包含T细胞表位的肽，
测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力，
测试肽对MHCII的结合亲和力，
测试肽的体内溶解度，和
测试肽诱导抗原的耐受的能力。
通过本发明的方法选择的肽及其组合物
在另一个方面，本发明提供了通过本发明的方法鉴定的致耐受肽。
在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含通过本发明的方法鉴定的致耐受肽。在一些实施方案中，组合物包含通过本发明方法鉴定的多于一种致耐受肽，诸如两种或更多种此类肽，诸如三种或更多种此类肽。肽可以衍生自相同或不同的靶抗原。
该组合物可以是试剂盒的形式，其中apitope中的一些或每个分别被提供用于同时、分开或相继施用。
可替代地(或另外)，如果组合物(或其任何部分)以多剂量施用，每个剂量可以单独包装。
组合物可以包含治疗或防治有效量的肽或每种肽和任选地药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
此外，在本发明的组合物中，肽或每种肽可以与任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包被剂或增溶剂混合。
治疗方法
在另一个方面，本发明提供了治疗和/或预防受试者疾病的方法，其包括向受试者施用通过本发明的方法鉴定的致耐受肽的步骤。
在另一个方面，本发明提供了治疗和/或预防受试者疾病的方法，其包括向受试者施用包含通过本发明的方法鉴定的致耐受肽的组合物的步骤。
在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：
(i)鉴定疾病的抗原
(ii)鉴定抗原的致耐受肽；和
(iii)向受试者施用致耐受肽。
在另一个方面，本发明提供了通过本发明的方法鉴定的用于治疗和/或预防疾病的致耐受肽。
在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含通过本发明的方法鉴定的用于治疗和/或预防疾病的致耐受肽。
在另一方面，本发明提供了通过本发明的方法鉴定的致耐受肽在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
在另一个方面，本发明提供了包含通过本发明的方法鉴定的致耐受肽的组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
疾病
在一些实施方案中，疾病是超敏性病症。在一些实施方案中，疾病是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，疾病是过敏。在一些实施方案中，疾病是移植物排斥。
MHC II类的apitope可能对由CD4+T细胞应答介导的疾病特别有用。例如，由不适当或过度的CD4+T细胞应答引起或维持的疾病。
这种肽可能在治疗超敏性病症中特别有用。超敏性反应包括：
(i)过敏，由对无害外来物质的不适当响应引起；
(ii)自身免疫性疾病，由对自身组织抗原的响应引起；和
(iii)移植物排斥，由对移植物的响应引起。
过敏的实例包括但不限于：花粉热、外源性哮喘、昆虫叮咬和螫刺过敏、食物和药物过敏、过敏性鼻炎、支气管哮喘、慢性支气管炎、过敏综合征、荨麻疹、血管性水肿、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、结节性红斑、多形性红斑、Stevens-Johnson综合征、鼻结膜炎、结膜炎、皮肤坏死性小静脉炎、炎症性肺病和大疱性皮肤病。
自身免疫性疾病的实例包括但不限于：类风湿性关节炎(RA)、重症肌无力(MG)、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)、格雷夫斯病、炎性肠病、自身免疫性葡萄膜炎、多发性肌炎和某些类型的糖尿病、系统性血管炎、多发性肌炎-皮肌炎、系统性硬化症(硬皮病)、舍格伦综合征、强直性脊柱炎和相关的脊椎关节病、风湿热、过敏性肺炎、过敏性支气管肺曲霉病、无机粉尘尘肺病、结节病、自身免疫性溶血性贫血、免疫性血小板疾病、冷冻病诸如冷冻纤维蛋白原血症和自身免疫性多内分泌病。
临床医学上常移植多种组织，包括肾、肝、心肺、皮肤、角膜和骨髓。目前，除角膜和一些骨髓移植物外的所有移植物通常均需要长期免疫抑制。
施用
在一些实施方案中，肽或组合物经皮下施用。
在一些实施方案中，肽或组合物经皮内施用。
在一些实施方案中，肽通过粘膜途径施用。
在一些实施方案中，肽经鼻内施用。
在一些实施方案中，肽在不存在佐剂的情况下以可溶形式施用。
研究表明，当以可溶形式腹膜内(ip)、静脉内(iv)或鼻内(in)或口服给予时，肽可以诱导T细胞耐受(Anderton and Wraith(1998)，如上；Liu and Wraith(1995)，如上；Metzler and Wraith(1999)Immunology 97:257-263)。
在小鼠中的研究表明，诱导耐受所需的肽施用持续时间取决于受体中T细胞的前体频率(Burkhart et al(1999)，如上)。在许多实验性研究中，已经表明需要重复剂量的肽来诱导耐受(Burkhart et al(1999)，如上)。因此，肽的准确剂量和给药数目将取决于个体，然而，在优选的实施方案中，施用多个剂量。
如果同时施用多种肽，它们可以是适合单剂量或多剂量施用的“混合物”的形式。或者，可以优选给予多剂量但在剂量之间改变肽的相对浓度。
在一些实施方案中，肽或组合物以多剂量施用。在优选的实施方案中，可以遵循“剂量递增”方案，其中以递增的浓度给予患者多个剂量。这种方法已经用于，例如磷脂酶A2肽在针对蜂毒过敏的免疫治疗应用中(Müller et al(1998)J.Allergy ClinImmunol.101:747-754和Akdis et al(1998)J.Clin.Invest.102:98-106)。
实施例
材料和方法
此处描述了以下实施例中使用的材料和方法。
小鼠
DR3tg小鼠在特定的无病原体条件下在Charles River(英国)或Innoser(荷兰或比利时)饲养。DR3tg品系最初由Strauss等人创建(Strauss et al,Immunogenetics1994)。简而言之，使用的基因组构建体是pUC 13中HLA-DRA基因组克隆的6kb NdeI片段和cos 4.1的24kb ClaIxSalI片段，cos4.1是含有DRB1*0301的B基因的粘粒(pTCF)。含有1-2μg/mL的每种构建体的溶液用于共同注射到与C57BL/6雄性交配的(C57BL/6xDBA/2)F1供体的受精卵中。后来将后代培育成缺乏小鼠MHC II类分子表达的IA-β敲除C57BL/6遗传背景(AB0小鼠)。这些DR3tg小鼠表达HLA-DRB1*0301分子，但不表达小鼠MHC-II分子。通过回交到C57BL/6和B10.Q来维持小鼠。通过用EcoRI消化并用DRA cDNA的1.35kb BamHI片段和DRB1*0301cDNA的1.25kb BamHI片段探测的尾部DNA的Southern印迹分析来鉴定转基因小鼠。
DR2tg小鼠在特定的无病原体条件下在Charles River(英国)或Innoser(荷兰或比利时)饲养。HLA-DR2转基因(DR2tg)小鼠最初获得自Lars Fugger(Madsen et al.,Nature Genetics 1999)。简而言之，使用含有小鼠MHCII启动子的pDOI-5表达载体来表达DRα和DRβ链cDNA(DRA*0101和DRB1*1501)。将构建体注射到(DBA/2xC57BL/6)F1交配的受精卵中。将小鼠回交到缺乏小鼠MHC II类分子表达的IA-β敲除C57BL/6遗传背景(AB0小鼠)中。DR2tg小鼠表达HLA-DRB1*1501分子，但不表达小鼠MHC分子。
DR4tg小鼠品系最初由Lars Fugger等人创建(Fugger et al,PNAS USA1994)。通过在IA-b敲除(B6；129S2-H2dlAb1-Ea/J)小鼠上培育来实现内源性MHC II类缺失。
动物研究得到了哈塞尔特大学的“动物实验伦理委员会”(ECD)的批准，并在无病原体设施中以最高标准的护理进行。
蛋白质和肽
所有单肽均由Severn Biotech(Kidderminster,UK)合成并-80℃下以20mg/ml的DMSO(Sigma-Aldrich)或4mg/ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的贮备溶液贮存。用N端游离胺和C端酰胺合成肽。人SAg(S-arrestin)在HEK293F细胞(QBiologicals,EurofinsAmatsigroup,Ghent,Belgium)中产生。通过使用Chesapeake PERL技术PERLXpress(Savage,MD,US)在粉斑夜蛾(Trichoplusia ni)幼虫表达系统中生产TSHR人重组胞外结构域(TSHRECD,AA19-417)。
肽的序列在下表1中给出。
表1
Figure BDA0003530267120000341
Figure BDA0003530267120000351
*肽J是来自前列腺酸性磷酸酶(PAP)的已知HLA-DR2结合肽，其描述于Klyushnenkova et al.Prostate.2007；67(10):1019–28)。
TSHR序列(SEQ ID No.19)–UniProtKB数据库(https://www.uniprot.org/)中的条目P16473：
MRPADLLQLVLLLDLPRDLGGMGCSSPPCECHQEEDFRVTCKDIQRIPSLPPSTQTLKLIETHLRTIPSHAFSNLPNISRIYVSIDVTLQQLESHSFYNLSKVTHIEIRNTRNLTYIDPDALKELPLLKFLGIFNTGLKMFPDLTKVYSTDIFFILEITDNPYMTSIPVNAFQGLCNETLTLKLYNNGFTSVQGYAFNGTKLDAVYLNKNKYLTVIDKDAFGGVYSGPSLLDVSQTSVTALPSKGLEHLKELIARNTWTLKKLPLSLSFLHLTRADLSYPSHCCAFKNQKKIRGILESLMCNESSMQSLRQRKSVNALNSPLHQEYEENLGDSIVGYKEKSKFQDTHNNAHYYVFFEEQEDEIIGFGQELKNPQEETLQAFDSHYDYTICGDSEDMVCTPKSDEFNPCEDIMGYKFLRIVVWFVSLLALLGNVFVLLILLTSHYKLNVPRFLMCNLAFADFCMGMYLLLIASVDLYTHSEYYNHAIDWQTGPGCNTAGFFTVFASELSVYTLTVITLERWYAITFAMRLDRKIRLRHACAIMVGGWVCCFLLALLPLVGISSYAKVSICLPMDTETPLALAYIVFVLTLNIVAFVIVCCCYVKIYITVRNPQYNPGDKDTKIAKRMAVLIFTDFICMAPISFYALSAILNKPLITVSNSKILLVLFYPLNSCANPFLYAIFTKAFQRDVFILLSKFGICKRQAQAYRGQRVPPKNSTDIQVQKVTHDMRQGLHNMEDVYELIENSHLTPKKQGQISEEYMQTVL
S-Ag序列(SEQ ID No.20)–UniProtKB数据库(https://www.uniprot.org/)中的条目P10523：
MAASGKTSKSEPNHVIFKKISRDKSVTIYLGNRDYIDHVSQVQPVDGVVLVDPDLVKGKKVYVTLTCAFRYGQEDIDVIGLTFRRDLYFSRVQVYPPVGAASTPTKLQESLLKKLGSNTYPFLLTFPDYLPCSVMLQPAPQDSGKSCGVDFEVKAFATDSTDAEEDKIPKKSSVRLLIRKVQHAPLEMGPQPRAEAAWQFFMSDKPLHLAVSLNKEIYFHGEPIPVTVTVTNNTEKTVKKIKAFVEQVANVVLYSSDYYVKPVAMEEAQEKVPPNSTLTKTLTLLPLLANNRERRGIALDGKIKHEDTNLASSTIIKEGIDRTVLGILVSYQIKVKLTVSGFLGELTSSEVATEVPFRLMHPQPEDPAKESYQDANLVFEEFARHNLKDAGEAEEGKRDKNDVDE
T细胞系(TCL)的建立
用50μg在CFA中乳化的肽(肽/CFA)在尾的根部中皮下免疫HLA-DRtg小鼠。免疫后十天，收获引流淋巴结(LN)和脾。根据制造商的说明，分离LN细胞和脾细胞并使用Magnisort小鼠CD4分离试剂盒(ThermoFisher Scientific)通过阴性选择分离CD4+T细胞。辐照(3000rad)脾细胞用作抗原呈递细胞(APC)。在0,1；1；2.5或5μg/ml的肽存在下在6孔板中的X-vivo 15培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50U/mL链霉素；Lonza)中培养5x106APC+2.5x106 CD4+T细胞。在第4天，添加20U/ml的rIL-2(R&DSystems,Abingdon,UK)。在第7天，对TCL细胞进行计数并与新鲜的APC、肽和IL-2一起培养，所有这些与上述浓度相同。在第10天，添加20U/ml的rIL-2。在第14天，照此使用TCL培养物，或选择CD4+细胞。
实施例1–CLIP置换测定法
测试了已知的致耐受肽MBP 83-99从MHCII中置换CLIP的能力。MBP83-99是MBP的优势HLA-DR2限制性表位，其具有序列ENPVVHFFKNIVTPRTP(SEQ ID No.2)。
使用中性亲和素和生物素将具有结合CLIP的MHCII(HLA-DR2)(MHCII-CLIP)附于96孔板的孔。特别地，96孔板在4℃下用PBS中的15μg/ml中性亲和素包被过夜。用清洗缓冲液(0.1％BSA/PBS)将板清洗两次，并在室温下用PBS中的1％BSA封闭2小时。用清洗缓冲液将板清洗两次，然后添加PBS中的0.125μg/ml的生物素-MHCII-CLIP，在室温下在潮湿的气氛中温育2小时。用清洗缓冲液将板清洗4次，留下MHCII-CLIP包被的孔。用具有结合MBP83-99(而不是CLIP)的MHCII包被阳性对照孔。
将含有MHCII-CLIP的孔与不同浓度的MBP 83-99温育16小时，然后清洗。
将对MBP具有特异性的T细胞系添加到孔中并在37℃下温育24小时。
通过测量分泌的IL2来评估T细胞活化。结果如图1所示。当将30μM或3μM的MBP 83-99添加到MHCII-CLIP(“CLIP单体”)中时，T细胞活化，表明在这些浓度下，MBP 83-99可以从MHCII中置换CLIP。
实施例2–APIPS测定法
使用不同类型的APC和T细胞的三种组合进行APIPS测定。
使用的APC的类型是来自HLA-DRtg小鼠的原代脾细胞或细胞系APC。
使用的T细胞类型是T细胞杂交瘤、T细胞系或原代T细胞。
对于每种组合，将5x104 T细胞与肽(10或25μg/ml)和APC(5x104脾细胞或2.5x104细胞系细胞)一起培养。
对于每种组合，使用固定和非固定的(“新鲜”)APC。为了固定APC，在室温下用0.5％多聚甲醛(Merck，Darmstadt，Germany)(pH7)温育细胞2分钟(如果APC是原代脾细胞)或5分钟(如果APC是细胞系)。通过添加0.4M甘氨酸(Sigma-Aldrich)并在RPMI-10％FCS中清洗细胞来停止固定反应。
对于每种组合，测量T细胞对人S-Ag或TSHR(10或25μg/ml)的反应性以识别隐蔽表位。
通过使用ELISA(R&D Systems,Abingdon,UK)测量细胞因子水平来评估T细胞活化。
A.使用脾细胞APC与T细胞杂交瘤进行APIPS测定
将抗原特异性T细胞杂交瘤克隆与已知的致耐受TSHR肽和来自HLA-DRtg小鼠(APC)的脾细胞一起温育48小时。
通过测量IL2产生来评估T细胞杂交瘤活化。结果如图2A所示。数据显示T细胞杂交瘤响应脾细胞APC呈递的肽而活化。因此，T细胞杂交瘤和脾细胞是用于APIPS测定的有效T细胞-APC组合。
B.使用细胞系APC与T细胞系进行APIPS测定
T细胞系与已知的致耐受S-Ag肽和APC细胞系一起温育24小时。使用的APC细胞系是VAVY细胞(表达HLA-DR3)或MGAR细胞(表达HLA-DR2)。
通过测量IFNγ产生来评估T细胞活化。结果如图2B所示。数据显示T细胞系响应APC细胞系呈递的肽而活化。因此，T细胞系和APC细胞系是用于APIPS测定的有效T细胞-APC组合。
C.使用细胞系APC与原代T细胞进行APIPS测定
将原代T细胞与已知的致耐受S-Ag肽和APC细胞系一起温育24小时。使用的APC细胞系是VAVY细胞(表达HLA-DR3)或MGAR细胞(HLA-DR2表达)。
为了生成原代肽特异性原代T细胞，用50μg在CFA中乳化的肽(肽/CFA)在尾的根部中皮下免疫HLA-DRtg小鼠。免疫后十天，收获引流淋巴结(LN)和脾。根据制造商的说明，分离LN细胞和脾细胞并使用Magnisort小鼠CD4分离试剂盒(ThermoFisher Scientific)通过阴性选择分离CD4+T细胞。
通过测量IFNγ产生来评估T细胞活化。结果如图2C所示。数据显示原代T细胞响应APC细胞系呈递的肽而活化。因此，原代T细胞和APC细胞系是用于APIPS测定的有效T细胞-APC组合。
实施例3–竞争测定法
使用已知对MHCII具有良好亲和力(肽J和L)和对MHCII具有不良亲和力(肽K和M)的测试肽来测试用于评估测试肽对MHCII的结合亲和力的体外竞争测定。
将对对照肽具有特异性的T细胞杂交瘤克隆与固定的APC和测试肽一起温育。在温育期间，测试肽与APC上的MHCII结合。
特别地，在RPMI-1640培养基(补充有15％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、50U/mL青霉素和50U/mL链霉素；Lonza)中在50μg/ml、10μg/ml和1μg/ml测试肽存在下，将T细胞杂交瘤克隆(5x105个细胞)与5x105个固定的APC在96孔平底板中共培养0.5小时。为了固定APC，在室温(RT)下用0.5％多聚甲醛(Merck,Darmstadt,Germany)(pH7)温育细胞5分钟。通过添加0.4M甘氨酸(Sigma-Aldrich)并在补充的RPMI-1640培养基中清洗细胞来停止固定反应。
使用的APC是MGAR细胞(表达HLA-DR2)和VAVY细胞(表达HLA-DR3)。
在与测试肽温育0.5小时后，将对照肽以0.0125μg/ml和0.2μg/ml之间的浓度范围添加到培养物中。
48小时后，通过测量分泌的IL2来评估T细胞杂交瘤的反应。结果如图3所示。特别地，图3A和3B分别显示了表达HLA-DR2的APC(MGAR细胞)的数据，图3C和3D分别显示了表达HLA-DR3的APC(VAVY细胞)的数据。
肽H(参见图3A和3B的x轴)是HLA-DR2结合的对照肽，并具有序列KKGPRCLTRYYSSFVNMEGKK(SEQ ID No.10)。
肽C(参见图3C和3D的x轴)是HLA-DR3结合的对照肽，并具有序列KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.5)。
体外竞争测定清楚地表明肽是否可以结合MHCII。
特别地，当不添加测试肽时，T细胞活化水平随着对照肽浓度的增加而增加(参见图3A-3D中的0μg/ml线)。对照肽可以在无竞争的情况下与MHCII结合，并从而以浓度依赖性方式活化T细胞。
在足够数量的可以与MHCII结合的测试肽的情况下，增加对照肽浓度对T细胞活化几乎没有影响(参见图3A和3C中的50和10μg/ml线)。测试肽在MHCII结合方面的竞争胜过对照肽，因此T细胞的活化较少。
相反，如果测试肽不能与MHCII结合，则增加对照肽浓度会增加T细胞活化至与不存在测试肽时相同的程度(参见图3B和3D中的50、10和1μg/ml线，其显示与0μg/ml线没有区别)。测试肽不与对照肽竞争MHCII结合，因此对照肽可以以浓度依赖性方式活化T细胞。
实施例4–体内MHCII载荷测定法
使用已知具有不良溶解度的肽(肽O)和已知具有良好溶解度的肽(肽N)测试了用于评估肽的溶解度的体内MHCII载荷测定。将测试肽注射到小鼠中并评估肽结合树突状细胞上的MHCII的程度。
特别地，用在100μl PBS中100μg的肽于胁腹中皮下注射HLA-DRtg小鼠。对照动物接受100μl PBS的皮下注射。2小时后，收获脾并制备单细胞悬浮液。根据制造商的说明(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)，使用CD11c微珠阳性选择CD11c+细胞(脾树突状细胞)。达到>92％的平均纯度。
将1x105个CD11c+细胞与1x105个CD4+细胞(原代T细胞)在圆底96孔板中的X-vivo15培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50U/mL链霉素；Lonza)中共培养。CD4+细胞分离自经50μg在CFA中乳化的肽(肽/CFA)在尾的根部中皮下免疫的HLA-DRtg小鼠。免疫后十天，收获引流淋巴结(LN)和脾。根据制造商的说明，分离LN细胞和脾细胞并使用Magnisort小鼠CD4分离试剂盒(ThermoFisher Scientific)通过阴性选择分离CD4+T细胞。
72小时后，收集CD11c+-CD4+共培养物的上清液。通过IFNγELISA(R&DSystems,Abingdon,UK)分析CD4+T细胞活化。在平行实验中，评估了CD4+T细胞对体外添加的肽的应答，以确保T细胞识别CD11c+细胞呈递的肽。
体内测定的结果如图4所示。不溶性肽(肽N)不会导致T细胞活化，而可溶性肽(肽O)导致T细胞活化，这表明该测定可以鉴定具有合适溶解度的肽。
实施例5–离体耐受测定法
HLA-DRtg小鼠在第-15、-13和-11天分别在胁腹区域中皮下注射0.1μg、1μg和10μg的肽，然后在第-8、-6天和-4天注射3次100μg肽(剂量递增方案)。在第0天，用在CFA中乳化的50μg抗原(亲本肽)(肽/CFA)在尾的根部中皮下免疫小鼠。
免疫后十天，收获引流淋巴结(LN)和脾。在96孔平底板中的X-vivo 15培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50U/mL链霉素；Lonza)中分离并培养LN细胞和脾细胞。
为了研究抗原诱导的细胞增殖，用不同的抗原浓度(0-25μg/ml)或用12.5μg/ml纯化蛋白衍生物(PPD；引发对照；Statens serum institut,Copenhagen,Denmark)培养0.5x106个细胞/孔(200μl/孔)72小时。72小时后，收获上清液并贮存在-80℃下直至进一步分析。
通过细胞因子ELISA(R&D Systems,Abingdon,UK)评估上清液中的IFNγ浓度并测量细胞活化。结果如图5所示。
实施例6–生物标志物测定法
为了确定注射致耐受肽对体内细胞因子分泌的影响，用在CFA中乳化的50μg肽C(序列KKKYVSIDVTLQQLEKKK,SEQ ID No.5)(肽/CFA)在尾的根部中皮下免疫小鼠。
免疫后21天用100μg的肽或媒介物注射小鼠。
注射后2小时，收集这些小鼠的血液，并根据制造商的说明使用电化学发光测定法(U-plex测定法；Meso Scale Diagnostics(MSD))分析血清细胞因子水平。
测定结果如图6所示。
本发明还涉及如以下编号段落中定义的以下方面：
1.用于鉴定包含T细胞表位的肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)将主要组织相容性复合物II类(MHCII)和II类相关不变链肽(CLIP)的复合物(MHCII-CLIP)与肽接触，
(ii)添加对抗原具有特异性的T细胞；和
(iii)测量所述T细胞的活化。
2.用于测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)将主要组织相容性复合物II类(MHCII)和II类相关不变链肽(CLIP)的复合物(MHCII-CLIP)与肽接触；
(ii)添加对抗原具有特异性的T细胞；和
(iii)测量所述T细胞的活化。
3.根据段落1或2的方法，其中T细胞是原代T细胞、T细胞克隆或T细胞杂交瘤，或者来自T细胞系。
4.根据段落3的方法，其中T细胞来自T细胞系。
5.根据段落3的方法，其中T细胞来自从受试者分离的外周血单个核细胞(PBMC)。
6.根据段落1-5中任一项的方法，其中MHCII是人白细胞抗原-DR(HLA-DR)同种型2(HLA-DR2)、HLA-DR3或HLA-DR4。
7.根据段落6的方法，其中MHCII是HLA-DR2。
8.根据段落1-7中任一项的方法，其中T细胞活化通过测量细胞因子分泌和/或T细胞增殖来测量。
9.根据段落8的方法，其中T细胞活化通过测量白细胞介素2(IL2)分泌和/或干扰素γ(IFNγ)分泌来测量。
10.根据段落9的方法，其中T细胞活化通过测量IL2分泌来测量。
11.根据段落8-10中任一项的方法，其中T细胞活化通过测量3H-胸苷掺入、BrdU掺入、EdU掺入或Ki67水平来测量。
12.根据段落1-11中任一项的方法，其中CLIP包含序列PVSKMRMATPLLMQA(SEQ IDNo.1)。
13.根据段落1-12中任一项所述的方法，其中方法是体外方法。
14.根据段落13的方法，其中将MHCII-CLIP附于培养板。
15.根据段落1-14中任一项的方法，其中MHCII-CLIP包含生物素。
16.根据段落15的方法，其中MHCII-CLIP通过生物素-中性亲和素附于培养板。
17.CLIP在根据段落1-16中任一项的方法中的用途。
18.根据段落17的用途，其中CLIP包含序列PVSKMRMATPLLMQA(SEQ ID No.1)。
19.用于测试肽对MHCII的结合亲和力的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)向MHCII添加测试肽，
(ii)添加对照肽
(iii)添加对对照肽具有特异性的T细胞；和
(iii)测量T细胞活化。
20.根据段落19的方法，其中MHCII在抗原呈递细胞(APC)上。
21.根据段落20的方法，其中APC是固定的。
22.根据段落20的方法，其中APC是新鲜的。
23.根据段落19-22中任一项的方法，其中APC是原代APC或来自APC系。
24.根据段落23的方法，其中APC是MGAR细胞。
25.根据段落23的方法，其中APC是VAVY细胞。
26.根据段落23的方法，其中APC是BM14细胞。
27.根据段落19-26中任一项的方法，其中MHCII是HLA-DR2、HLA-DR3或HLA-DR4。
28.根据段落27的方法，其中MHCII是HLA-DR2。
29.根据段落28的方法，其中对照肽由序列KKGPRCLTRYYSSFVNMEGKK(SEQ IDNo.10)组成。
30.根据段落27的方法，其中MHCII是HLA-DR3或HLA-DR4。
31.根据段落30的方法，其中对照肽由序列KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.5)组成。
32.根据段落19-31中任一项的方法，其中T细胞是原代T细胞、T细胞克隆或T细胞杂交瘤，或者来自T细胞系。
33.根据段落32的方法，其中T细胞是T细胞杂交瘤。
34.根据段落19-33中任一项的方法，其中T细胞活化通过测量细胞因子分泌和/或T细胞增殖来测量。
35.根据段落34的方法，其中T细胞活化通过测量IL2分泌和/或IFNγ分泌来测量。
36.根据段落35的方法，其中T细胞活化通过测量IL2分泌来测量。
37.根据段落33-36中任一项的方法，其中T细胞活化通过测量3H-胸苷掺入、BrdU掺入、EdU掺入或Ki67水平来测量。
38.根据段落19-37中任一项的方法，其中在对照肽之前将测试肽添加至MHCII。
39.根据段落38的方法，其中在添加对照肽之前将测试肽与MHCII温育约15至45分钟。
40.根据段落19-39中任一项的方法，其中方法是体外方法。
41.由序列KKGPRCLTRYYSSFVNMEGKK(SEQ ID No.10)组成的肽在根据段落19-40中任一项的方法中的用途。
42.由序列KKKYVSIDVTLQQLEKKK(SEQ ID No.5)组成的肽在根据段落19-40中任一项的方法中的用途。
43.用于测试肽的体内溶解度的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供来自已注射肽的小鼠的树突状细胞；
(ii)将所述树突状细胞与对所述肽具有特异性的T细胞共培养；和
(iii)测量所述T细胞的活化。
44.根据段落43的方法，其中T细胞是原代T细胞、T细胞克隆或T细胞杂交瘤。
45.根据段落44的方法，其中T细胞是原代T细胞。
46.根据段落43-44中任一项的方法，其中小鼠是HLA-DR2转基因(HLA-DR2tg)或HLA-DR3转基因(HLA-DR3tg)小鼠。
47.根据段落43-46中任一项的方法，其中T细胞活化通过测量细胞因子分泌和/或T细胞增殖来测量。
48.根据段落47的方法，其中T细胞活化通过测量IL2分泌和/或IFNγ分泌来测量。
49.根据段落48的方法，其中T细胞活化通过测量IL2分泌来测量。
50.根据段落48的方法，其中T细胞活化通过测量IFNγ分泌来测量。
51.根据段落47-50中任一项的方法，其中T细胞活化通过测量3H-胸苷掺入、BrdU掺入、EdU掺入或Ki67水平来测量。
52.根据段落43-51中任一项的方法，其中已经用约100μg的肽注射小鼠。
53.根据段落43-52中任一项的方法，其中已经皮下注射小鼠。
54.根据段落43-54中任一项的方法，其中从小鼠的脾收获树突状细胞。
55.用于测试肽诱导对抗原的耐受的能力的离体方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供来自已注射肽的动物的T细胞；
(ii)用抗原刺激所述T细胞；和
(iii)测量所述T细胞的活化。
56.根据段落55的方法，其中T细胞活化通过测量BrdU掺入、EdU掺入、Ki67水平、IL2分泌和/或IGNγ分泌来测量。
57.根据段落56的方法，其中T细胞活化通过测量Ki67水平来测量。
58.根据段落56的方法，其中T细胞活化通过测量IFNγ分泌来测量。
59.根据段落55-58中任一项的方法，其中动物已经用抗原免疫。
60.根据段落59的方法，其中在动物第一次注射肽后约10-20天用抗原免疫动物。
61.根据段落60的方法，其中在动物第一次注射肽后约15天用抗原免疫动物。
62.根据段落59-61中任一项的方法，其中在用抗原免疫动物后约10天用抗原刺激T细胞。
63.根据段落55-62中任一项的方法，其中用抗原刺激T细胞约48-96小时。
64.根据段落63的方法，其中用抗原刺激T细胞约72小时。
65.根据段落55-64中任一项的方法，其中已经使用剂量递增方案注射肽。
66.根据段落55-65中任一项的方法，其中动物是小鼠。
67.根据段落66的方法，其中小鼠是HLA-DR2tg、HLA-DR3tg或HLA-DR4tg小鼠。
68.根据段落66或67的方法，其中T细胞在淋巴结细胞和脾细胞的样品中。
69.根据段落55-68中任一项的方法，其中动物是人。
70.根据段落69的方法，其中T细胞在外周血单个核细胞(PBMC)的样品中。
71.用于确定肽对细胞因子分泌的影响的方法，其包括测量已注射肽的小鼠的血清细胞因子水平。
72.根据段落71的方法，其中在注射肽之前约15-25天用肽免疫小鼠。
73.根据段落72的方法，其中在注射肽之前约21天用肽免疫小鼠。
74.根据段落71-73中任一项的方法，其中用约100μg的肽注射小鼠。
75.根据段落71-74中任一项的方法，其中小鼠是HLA-DRtg小鼠。
76.根据段落71-75中任一项的方法，其中使用电化学发光测量细胞因子水平。
77.根据段落71-76中任一项的方法，其中测量IL2水平。
78.根据段落71-77中任一项的方法，其中测量白细胞介素6(IL6)水平。
79.根据段落71-78中任一项的方法，其中测量白细胞介素10(IL10)水平。
80.根据段落71-79中任一项的方法，其中测量白细胞介素12/白细胞介素23p40(IL12/IL23p40)水平。
81.根据段落71-80中任一项的方法，其中测量白细胞介素17(IL17)水平。
82.根据段落71-81中任一项的方法，其中测量IFNγ水平。
83.用于鉴定致耐受肽的方法，其包括以下步骤：
(i)根据段落1-16中任一项进行CLIP置换测定，和/或
(ii)根据段落19-40中任一项进行体外竞争测定，和/或
(iii)根据段落43-54中的任一项进行MHCII载荷测定，和/或
(iv)根据段落55-70中的任一项对患者PBMC进行CLIP置换测定，和/或
(v)在疾病模型中测试肽的功效；和/或
(vi)根据段落71-82中的任一项进行生物标志物测定。
84.根据段落83的方法，其进一步包括通过以下测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力
用肽处理抗原加工非依赖性呈递系统(APIPS)，
将对肽具有特异性的T细胞添加到APIPS，和
测量T细胞活化。
85.根据段落84的方法，其中APIPS包括：
(i)固定的APC
(ii)包含MHCII的脂质膜；或
(iii)板结合的MHCII。
86.根据段落85的方法，其中APC是原代APC或来自APC系。
87.根据段落86的方法，其中原代APC是脾细胞。
88.根据段落86的方法，其中APC是MGAR细胞。
89.根据段落86的方法，其中APC是VAVY细胞。
90.根据段落84-89中任一项的方法，其中添加到APIPS的T细胞是原代T细胞、T细胞克隆或T细胞杂交瘤，或者来自T细胞系。
91.根据段落90的方法，其中T细胞是原代T细胞。
92.根据段落84-91中任一项的方法，其中T细胞活化通过测量细胞因子分泌和/或T细胞增殖来测量。
93.根据段落92的方法，其中T细胞活化通过测量IL2分泌和/或IFNγ分泌来测量。
94.根据段落93的方法，其中T细胞活化通过测量IFNγ分泌来测量。
95.根据段落92-94中任一项的方法，其中T细胞活化通过测量3H-胸苷掺入、BrdU掺入、EdU掺入或Ki67水平来测量。
96.用于鉴定致耐受肽的方法，其包括
鉴定包含T细胞表位的肽，
测试肽在未进行加工的情况下与MHCII结合的能力，
测试肽对MHCII的结合亲和力，
测试肽的体内溶解度，和
测试肽诱导抗原的耐受的能力。
97.通过根据前述段落中任一项的方法鉴定的致耐受肽。
98.组合物，其包含根据段落97的致耐受肽。
99.用于治疗和/或预防受试者的疾病的方法，其包括向受试者施用根据段落97的肽或根据段落98的组合物的步骤。
100.根据段落99的方法，其包括以下步骤：
(i)鉴定疾病的抗原
(ii)鉴定抗原的致耐受肽；和
(iii)向受试者施用致耐受肽。
101.根据段落99或100的方法，其中肽或组合物以多剂量施用。
102.根据段落99-101中任一项的方法，其中肽或组合物经皮下施用。
103.根据段落99-101中任一项的方法，其中肽或组合物经皮内施用。
104.根据段落97的致耐受肽或根据段落98的组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
105.根据段落97的致耐受肽或根据段落98的组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

Claims (25)

1.用于鉴定包含T细胞表位的肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)将主要组织相容性复合物II类(MHCII)和II类相关不变链肽(CLIP)的复合物(MHCII-CLIP)与肽接触，
(ii)添加对抗原具有特异性的T细胞；和
(iii)测量所述T细胞的活化。
2.用于测试肽在不经过加工的情况下与MHCII结合的能力的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)将主要组织相容性复合物II类(MHCII)和II类相关不变链肽(CLIP)的复合物(MHCII-CLIP)与肽接触；
(ii)添加对抗原具有特异性的T细胞；和
(iii)测量所述T细胞的活化。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述T细胞是原代T细胞、T细胞克隆或T细胞杂交瘤，或者来自T细胞系。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述T细胞来自T细胞系。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述T细胞来自从受试者分离的外周血单个核细胞(PBMC)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中MHCII是人白细胞抗原-DR(HLA-DR)同种型2(HLA-DR2)、HLA-DR3或HLA-DR4。
7.根据权利要求6所述的方法，其中MHCII是HLA-DR2。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中通过测量细胞因子分泌和/或T细胞增殖来测量T细胞活化。
9.根据权利要求8所述的方法，其中通过测量白细胞介素2(IL2)分泌和/或干扰素γ(IFNγ)分泌来测量T细胞活化。
10.根据权利要求9所述的方法，其中通过测量IL2分泌来测量T细胞活化。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中通过测量3H-胸苷掺入、BrdU掺入、EdU掺入或Ki67水平来测量T细胞活化。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中CLIP包含序列PVSKMRMATPLLMQA(SEQID No.1)。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述方法是体外方法。
14.根据权利要求13所述的方法，其中将MHCII-CLIP附于培养板。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中MHCII-CLIP包含生物素。
16.根据权利要求15所述的方法，其中MHCII-CLIP通过生物素-中性亲和素(neutravidin)附于培养板。
17.CLIP在根据权利要求1-16中任一项所述的方法中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中CLIP包含序列PVSKMRMATPLLMQA(SEQ ID No.1)。
19.用于测试肽对MHCII的结合亲和力的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)向MHCII添加测试肽，
(ii)添加对照肽，
(iii)添加对所述对照肽具有特异性的T细胞；和
(iii)测量T细胞活化。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述MHCII在抗原呈递细胞(APC)上。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述APC是固定的。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述APC是新鲜的。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述APC是原代APC或来自APC系。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述APC是MGAR细胞。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述APC是VAVY细胞。
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