JP2022544712A - 酵素的ｒｎａキャッピング法 - Google Patents

Abstract

本明細書において、インビトロでＲＮＡを効率的にキャッピングするための方法が提供される。一部の実施形態において、キャッピング反応は、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャッピング酵素又はその変異体を使用して高温でなされうる。他の実施形態において、キャッピング反応は、アメーバの大型ウイルス由来のキャッピング酵素、例えば、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）、ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）若しくはムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）又はこれらの変異体を含みうる。方法を実施するための組成物及びキットもまた提供される。

Description

本出願は、参照によりその全体において本出願に組み込まれる、２０１９年８月２３日に出願された米国仮出願第６２／８９０，８２１号に対する優先権を主張する。

非キャッピング合成ＲＮＡへの、キャップの付加は、多くの真核細胞内の、効率的なタンパク質発現のために重要である。さらに、キャッピングされていないＲＮＡ（少なくとも、５’－三リン酸を有するＲＮＡ）は、自然免疫応答を活性化させることが報告されている（Ｐｉｃｈｌｍａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６、３１４：９９７～１００１；Ｄｉａｍｏｎｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１４、２５：５４３～５５０）。このように、多くの治療適用において、合成ＲＮＡへと、キャップを付加することが、強く所望されている（例えば、タンパク質置換治療の他、予防的ワクチン接種又は治療的ワクチン接種）。

現行において、ＲＮＡをキャッピングするのに、２つの方法が使用されている。第１の方法において、合成ＲＮＡ（例えば、インビトロで転写されたＲＮＡ）は、ＲＮＡキャッピング酵素を使用して、キャッピングＲＮＡへと転換される。他の方法（一般に、「共転写キャッピング」と称される）において、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）などのキャップアナログ及びキャッピングされたジヌクレオチドが、インビトロにおける転写反応物へと添加される。共転写法において、キャップは、インビトロ転写時に、共転写により、ＲＮＡ分子へと組み込まれる。

共転写キャッピング法と比較して、酵素的ＲＮＡキャッピング法は、キャッピングＲＮＡの高収率を達成しうる。しかし、酵素的ＲＮＡキャッピング反応は、非効率的であり、このため、大量の酵素が使用される、又はキャッピングされたＲＮＡが、キャッピングされていないＲＮＡから精製されなければならない。さらに、酵素的ＲＮＡキャッピング反応（キャッピング反応の完了の後における、キャッピングされたＲＮＡの百分率として表される）の効率は、ＲＮＡ配列により変動する場合があり、差違は、一般に、ＲＮＡ構造に帰せられる（例えば、Ｆｕｃｈｓ、ＲＮＡ．、２０１６、２２：１４５４～６６を参照されたい）。

Ｐｉｃｈｌｍａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６、３１４：９９７～１００１ Ｄｉａｍｏｎｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１４、２５：５４３～５５０ Ｆｕｃｈｓ、ＲＮＡ．、２０１６、２２：１４５４～６６

したがって、合成ＲＮＡへと、キャップを付加するための、より効率的な方式が、依然として必要とされている。

（発明の要旨）
本開示は、とりわけ、インビトロでＲＮＡを効率的にキャッピングするための方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、（ｉ）キャッピングされていない標的ＲＮＡを含むＲＮＡ試料、（ｉｉ）配列番号１、７又は２０と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一）であるアミノ酸配列を含むＲＮＡキャッピング酵素、（ｉｉｉ）グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）又は修飾ＧＴＰ、（ｉｖ）緩衝剤及び任意選択的に（ｖ）メチル基ドナーを、４０℃～６０℃の範囲の温度で接触させて、キャッピングされた標的を形成する（例えば、効率的に形成する）ステップを含みうる。キャッピングＲＮＡの収率（５０％）／酵素濃度（ｎＭ）により決定される効率は、３７℃における酵素のキャッピング効率と比較して、少なくとも２倍又は少なくとも３倍改善されうる。キャッピングされていない標的ＲＮＡは、任意選択的に、修飾ヌクレオチドを含まない場合もあり、１つ以上の修飾ヌクレオチド（例えば、シュードウリジン）を含む場合もある。

一部の実施形態において、方法は、（ｉ）キャッピングされていない標的ＲＮＡを含むＲＮＡ試料、（ｉｉ）ＲＮＡトリホスファターゼ（ＴＰアーゼ）活性、グアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴアーゼ）活性及びグアニン－Ｎ７メチルトランスフェラーゼ（Ｎ７ ＭＴアーゼ）活性を有する単鎖ＲＮＡキャッピング酵素、（ｉｉｉ）ＧＴＰ又は修飾ＧＴＰ、（ｉｖ）緩衝剤及び任意選択的に（ｖ）メチル基ドナーを、３７℃～６０℃の範囲の温度で接触させて、キャッピングされた標的ＲＮＡを形成する（例えば、効率的に形成する）ステップを含みうる。単鎖ＲＮＡキャッピング酵素（例えば、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）、ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）又はムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）などの巨大ウイルス由来のＲＮＡキャッピング酵素）は、（ａ）（ｘ）配列番号２、（ｙ）配列番号３及び／若しくは（ｚ）配列番号４と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一）アミノ酸配列；又は（ｂ）（ｘ）配列番号５及び／若しくは（ｙ）配列番号６と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一）であるアミノ酸配列を含みうる。例えば、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）、ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）又はムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）などの巨大ウイルスのＲＮＡキャッピング酵素は、（ａ）配列番号２、（ｂ）配列番号３、（ｃ）配列番号４、（ｄ）配列番号５、及び／又は（ｅ）配列番号６と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一）であるアミノ酸配列を含みうる。ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）（単鎖ＲＮＡキャッピング酵素の例である）由来のＲＮＡキャッピング酵素は、（ａ）配列番号７、（ｂ）配列番号８、（ｃ）配列番号９、（ｄ）配列番号１０、（ｅ）配列番号１１及び／又は（ｆ）配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含みうる。

一部の実施形態において、キャッピングされていない標的ＲＮＡは、少なくとも２００ｎｔの長さ（例えば、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ又は少なくとも１，０００ｎｔ）であることが可能であり、治療用タンパク質又は治療用ワクチンなどのポリペプチドをコードしうる。治療用ＲＮＡを含む、二次構造を有する標的ＲＮＡは、本開示の方法を使用して、より効率的にキャッピングされうる。効率は、キャッピングＲＮＡの収率（５０％）／酵素濃度（ｎＭ）として規定されうる。任意の実施形態において、方法は、第１の温度（例えば、３７℃～６０℃）において接触させ、温度を上昇又は低下させる（例えば、３７℃～６０℃へと）ステップを含む場合があり、この場合、第２の温度は、第１の温度と異なる。例えば、方法は、３７℃の第１の温度で１～１２０分間にわたり接触させ、温度を４５℃又は５０℃へと、１～１２０分間にわたり上昇させるステップを含みうる。一部の実施形態において、方法は、温度を３７℃～６０℃の第３の温度へと１～１２０分間にわたり上昇又は低下させるステップを含みうる。キャッピング法は、一部の実施形態において、インビトロで１時間以内に７０％を超えるＣａｐ０ ＲＮＡを生成しうる（例えば、共転写により生成しうる）。

一部の実施形態において、成分及び／又はこれらの組合せは、ＲＮアーゼを含まないことが可能であり、接触させるステップは、任意選択的に（ｖ）１つ以上のＲＮアーゼ阻害剤をさらに含みうる。

キャッピングされていないＲＮＡは、固相オリゴヌクレオチド合成化学反応を使用して、又はポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ又はＨｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を、インビトロにおける転写反応において使用して、ＤＮＡ鋳型を転写することにより、例えば、キャッピングされていない標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型及びポリメラーゼを接触させることにより合成されうる。

任意の実施形態において、接触させるステップは、ＳＡＭ及び／又はキャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼ酵素（２’ＯＭＴアーゼ）を接触させることをさらに含みうる。

任意の実施形態において、接触させるステップは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）を、単一の場所、例えば、単一のマイクロ流体表面内、単一の反応試験管内又は他の反応容器内において接触させることを含みうる。

本明細書においてまた、キャッピングされていない標的ＲＮＡ、ＴＰアーゼ活性、ＧＴアーゼ活性及びＮ７ ＭＴアーゼ活性を有する単鎖ＲＮＡキャッピング酵素、ＧＴＰ並びに緩衝剤を含む組成物も提供される。一部の実施形態において、組成物は、３７℃～６０℃の範囲の温度を有しうる。一部の実施形態において、組成物は、ＲＮアーゼを含まないことが可能であり、任意選択的に１つ以上のＲＮアーゼ阻害剤を含みうる。一部の実施形態において、単鎖ＲＮＡキャッピング酵素は、（ａ）（ｘ）配列番号２、（ｙ）配列番号３及び／若しくは（ｚ）配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；又は（ｂ）（ｘ）配列番号５及び／若しくは（ｙ）配列番号６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含みうる。単鎖ＲＮＡキャッピング酵素は、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｄ５ｂ（配列番号７）、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｅ１２（配列番号８）、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＳＴ１（配列番号９）、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＬＣ９（配列番号１０）、ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）（配列番号１１）又はムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）（配列番号１２）のＲＮＡキャッピング酵素と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含みうる。一部の実施形態において、組成物は、ＲＮＡを転写するための、ＤＮＡ鋳型、ポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージポリメラーゼ）及びリボヌクレオチドをさらに含みうる。一部の実施形態において、組成物は、ＳＡＭ及び／又はキャップ２’ＯＭＴアーゼをさらに含みうる。一部の実施形態において、キャッピングされていない単一の標的ＲＮＡは、少なくとも２００ｎｔの長さ（少なくとも３００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ又は少なくとも１，０００ｎｔ）であることが可能であり、治療用タンパク質又は治療用ワクチンなどのポリペプチドをコードしうる。

キットもまた提供される。一部の実施形態において、キットは、保管用緩衝剤中に存在する、ＴＰアーゼ活性、ＧＴアーゼ活性及びＮ７ ＭＴアーゼ活性を有する単鎖ＲＮＡキャッピング酵素；及び濃縮反応緩衝剤を含みうる。一部の実施形態において、キットは、ＲＮＡを転写するための、ＤＮＡ鋳型、ポリメラーゼ及びリボヌクレオチドをさらに含みうる。一部の実施形態において、キットは、ＳＡＭ及び／又はキャップ２’ＯＭＴアーゼをさらに含みうる。メチルトランスフェラーゼを利用する方法、組成物及びキットの例はまた、反応ミックス中に、ＳＡＭも含みうる。単鎖ＲＮＡキャッピング酵素は、（ａ）（ｘ）配列番号２、（ｙ）配列番号３及び／若しくは（ｚ）配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；又は（ｂ）（ｘ）配列番号５及び／若しくは（ｙ）配列番号６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含みうる。単鎖ＲＮＡキャッピング酵素は、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｄ５ｂ（配列番号７）、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｅ１２（配列番号８）、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＳＴ１（配列番号９）、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＬＣ９（配列番号１０）、ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）（配列番号１１）又はムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）（配列番号１２）のＲＮＡキャッピング酵素と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含みうる。

一部の実施形態において、ＲＮＡキャッピング酵素は、配列番号２０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有しうる。一部の実施形態において、ＲＮＡキャッピング酵素融合体は、（ａ）配列番号７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列及び（ｂ）配列番号２０の１４１９～１５８７位と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含みうる。

使用されたモデルＲＮＡ分子に予測される二次構造を示す図である。５’末端において、最小の二次構造を有するように、ＲＮＡ１をデザインした。それらの５’末端において、平滑末端、１塩基又は２塩基の突出を含有しながら、予測される同じアンフォールディングの最小自由エネルギー（ＭＦＥ）を呈するように、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３及びＲＮＡ４をデザインした。ＲＮＡ Ｆｏｌｄ Ｗｅｂｓｅｒｖｅｒ（Ｖｉｅｎｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｗｉｅｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して、３７℃及び４５℃における二次構造及びアンフォールディングの最小自由エネルギーを計算した。モデル化されたＲＮＡ分子は、以下の配列：ＲＮＡ１：配列番号１３、ＲＮＡ２：配列番号１４、ＲＮＡ３：配列番号１５、ＲＮＡ４：配列番号１６を有する。 異なる反応温度のＲＮＡにおける、１Ｈ３Ｃ２及びＶＣＥのＲＮＡキャッピング活性を示す図である。ｍ７ＧｐｐｐキャッピングＲＮＡの量は、酵素のＲＮＡキャッピング活性の尺度である。各バーは、４回の独立の実験の平均の結果を表し、誤差バーは、標準偏差を指し示す。図において示される通り、Ｈ３Ｃ２及びＶＣＥのいずれも、４５℃において、最大のＲＮＡキャッピング活性を呈する。ＶＣＥのキャッピング活性が、５０℃以上において、急激に低下したのに対し、Ｈ３Ｃ２は、５０℃、５２℃及び５５℃において、有意なキャッピング活性を保持した。 キャッピング酵素濃度の関数としての３７℃、４５℃、５０℃及び５５℃におけるＲＮＡキャッピング活性を示す図である。図３Ａは、ＶＣＥの活性を示す。 キャッピング酵素濃度の関数としての３７℃、４５℃、５０℃及び５５℃におけるＲＮＡキャッピング活性を示す図である。図３Ｂは、Ｈ３Ｃ２の活性を示す。各条件下におけるキャッピング活性の定量的比較については、表１を参照されたい。 多様な温度における、１５０ｎｔのＲＮＡ上の推定ＲＮＡキャッピング酵素による、ＲＮＡキャッピング活性を示す図である。レーン１～６は、ＡＭＮ８３５６１（Ｈ３Ｃ２）（レーン１）、ＡＩＢ５２０５５（レーン２）、ＳＭＥ６５０２６（レーン３）、ＳＭＨ６３６２９（レーン４）、ＡＡＶ５０６５１のアミノ酸１～６６８（ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素のＮ末端領域）（レーン５）又はＶＰ＿００７３５４４１０（ムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素）（レーン６）の、インビトロ翻訳の生成物を使用するキャッピング反応を示す。レーン７において、精製Ｈ３Ｃ２（２０ｎＭ）を使用した。これらの実験において使用された、１５０ｎｔのＲＮＡのリボヌクレオチド配列は、

（配列番号１７）である。図４Ａは、３７℃におけるキャッピング活性を示す。
多様な温度における、１５０ｎｔのＲＮＡ上の推定ＲＮＡキャッピング酵素による、ＲＮＡキャッピング活性を示す図である。レーン１～６は、ＡＭＮ８３５６１（Ｈ３Ｃ２）（レーン１）、ＡＩＢ５２０５５（レーン２）、ＳＭＥ６５０２６（レーン３）、ＳＭＨ６３６２９（レーン４）、ＡＡＶ５０６５１のアミノ酸１～６６８（ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素のＮ末端領域）（レーン５）又はＶＰ＿００７３５４４１０（ムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素）（レーン６）の、インビトロ翻訳の生成物を使用するキャッピング反応を示す。レーン７において、精製Ｈ３Ｃ２（２０ｎＭ）を使用した。これらの実験において使用された、１５０ｎｔのＲＮＡのリボヌクレオチド配列は、

（配列番号１７）である。図４Ｂは、４５℃におけるキャッピング活性を示す。
多様な温度における、１５０ｎｔのＲＮＡ上の推定ＲＮＡキャッピング酵素による、ＲＮＡキャッピング活性を示す図である。レーン１～６は、ＡＭＮ８３５６１（Ｈ３Ｃ２）（レーン１）、ＡＩＢ５２０５５（レーン２）、ＳＭＥ６５０２６（レーン３）、ＳＭＨ６３６２９（レーン４）、ＡＡＶ５０６５１のアミノ酸１～６６８（ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素のＮ末端領域）（レーン５）又はＶＰ＿００７３５４４１０（ムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素）（レーン６）の、インビトロ翻訳の生成物を使用するキャッピング反応を示す。レーン７において、精製Ｈ３Ｃ２（２０ｎＭ）を使用した。これらの実験において使用された、１５０ｎｔのＲＮＡのリボヌクレオチド配列は、

（配列番号１７）である。図４Ｃは、５０℃におけるキャッピング活性を示す。
多様な温度における、１５０ｎｔのＲＮＡ上の推定ＲＮＡキャッピング酵素による、ＲＮＡキャッピング活性を示す図である。レーン１～６は、ＡＭＮ８３５６１（Ｈ３Ｃ２）（レーン１）、ＡＩＢ５２０５５（レーン２）、ＳＭＥ６５０２６（レーン３）、ＳＭＨ６３６２９（レーン４）、ＡＡＶ５０６５１のアミノ酸１～６６８（ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素のＮ末端領域）（レーン５）又はＶＰ＿００７３５４４１０（ムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素）（レーン６）の、インビトロ翻訳の生成物を使用するキャッピング反応を示す。レーン７において、精製Ｈ３Ｃ２（２０ｎＭ）を使用した。これらの実験において使用された、１５０ｎｔのＲＮＡのリボヌクレオチド配列は、

（配列番号１７）である。図４Ｄは、５５℃におけるキャッピング活性を示す。
多様な温度における、１５０ｎｔのＲＮＡ上の推定ＲＮＡキャッピング酵素による、ＲＮＡキャッピング活性を示す図である。レーン１～６は、ＡＭＮ８３５６１（Ｈ３Ｃ２）（レーン１）、ＡＩＢ５２０５５（レーン２）、ＳＭＥ６５０２６（レーン３）、ＳＭＨ６３６２９（レーン４）、ＡＡＶ５０６５１のアミノ酸１～６６８（ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素のＮ末端領域）（レーン５）又はＶＰ＿００７３５４４１０（ムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素）（レーン６）の、インビトロ翻訳の生成物を使用するキャッピング反応を示す。レーン７において、精製Ｈ３Ｃ２（２０ｎＭ）を使用した。これらの実験において使用された、１５０ｎｔのＲＮＡのリボヌクレオチド配列は、

（配列番号１７）である。図４Ｅは、６０℃におけるキャッピング活性を示す。
ＡＭＨ８３５６１（Ｈ３Ｃ２）へとマッピングされるファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｄ５ｂ、Ｅ１２、ＳＴ１及びＬＣ９（配列番号７～１０）キャッピング酵素のアミノ酸配列の間において、９０％以上の配列同一性を呈する保存的領域を示す図である。保存的領域を、Ｆａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０１、Ｆａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０３及びＦａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０５と名指す。Ｈ３Ｃ２キャッピング酵素、すなわち、ＴＰアーゼ、ＧＴアーゼ及びＮ７ ＭＴアーゼの機能的ドメインを指し示す。 ＡＭＨ８３５６１（Ｈ３Ｃ２）へとマッピングされるファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｄ５ｂ、Ｅ１２、ＳＴ１及びＬＣ９（配列番号７～１０）キャッピング酵素のアミノ酸配列の間において、９０％以上の配列同一性を呈する保存的領域を示す図である。保存的領域を、Ｆａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０１、Ｆａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０３及びＦａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０５と名指す。Ｈ３Ｃ２キャッピング酵素、すなわち、ＴＰアーゼ、ＧＴアーゼ及びＮ７ ＭＴアーゼの機能的ドメインを指し示す。 ＡＭＨ８３５６１（Ｈ３Ｃ２）へとマッピングされるファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｄ５ｂ、Ｅ１２、ＳＴ１及びＬＣ９（配列番号７～１０）キャッピング酵素のアミノ酸配列の間において、９０％以上の配列同一性を呈する保存的領域を示す図である。保存的領域を、Ｆａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０１、Ｆａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０３及びＦａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０５と名指す。Ｈ３Ｃ２キャッピング酵素、すなわち、ＴＰアーゼ、ＧＴアーゼ及びＮ７ ＭＴアーゼの機能的ドメインを指し示す。 ＡＭＨ８３５６１（Ｈ３Ｃ２）へとマッピングされるファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｄ５ｂ、Ｅ１２、ＳＴ１及びＬＣ９（配列番号７～１０）キャッピング酵素のアミノ酸配列の間において、９０％以上の配列同一性を呈する保存的領域を示す図である。保存的領域を、Ｆａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０１、Ｆａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０３及びＦａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０５と名指す。Ｈ３Ｃ２キャッピング酵素、すなわち、ＴＰアーゼ、ＧＴアーゼ及びＮ７ ＭＴアーゼの機能的ドメインを指し示す。 ＹＰ＿００７３５４４１０（アカンタアメーバ・ポリファーガ・ムームーウイルス（Ａｃａｎｔｈａｎｏｍｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素；ｍｏｕｍｏｕ ＣＥ）（配列番号１２）へとマッピングされるアカンタアメーバ・ポリファーガ・ミミウイルス（Ａｃａｎｔｈａｎｏｍｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）（ＡＡＶ５０６５１、配列番号１１）及びアカンタアメーバ・ポリファーガ・ムームーウイルス（Ａｃａｎｔｈａｎｏｍｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素のアミノ酸配列の間において、９０％以上の配列同一性を呈する保存的領域を示す図である。保存的領域を、ｍｏｕｍｏｕ＿ＣＲ＿０３（配列番号６）及びｍｏｕｍｏｕ＿ＣＲ＿０４（配列番号７）と名指す。ｍｏｕｍｏｕ ＣＥ、すなわち、ＴＰアーゼ、ＧＴアーゼ及びＮ７ ＭＴアーゼの機能的ドメインを、このアライメント中において、アライメントされた配列の上方における破線により指し示す。保存的領域を強調する。 ＹＰ＿００７３５４４１０（アカンタアメーバ・ポリファーガ・ムームーウイルス（Ａｃａｎｔｈａｎｏｍｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素；ｍｏｕｍｏｕ ＣＥ）（配列番号１２）へとマッピングされるアカンタアメーバ・ポリファーガ・ミミウイルス（Ａｃａｎｔｈａｎｏｍｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）（ＡＡＶ５０６５１、配列番号１１）及びアカンタアメーバ・ポリファーガ・ムームーウイルス（Ａｃａｎｔｈａｎｏｍｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素のアミノ酸配列の間において、９０％以上の配列同一性を呈する保存的領域を示す図である。保存的領域を、ｍｏｕｍｏｕ＿ＣＲ＿０３（配列番号６）及びｍｏｕｍｏｕ＿ＣＲ＿０４（配列番号７）と名指す。ｍｏｕｍｏｕ ＣＥ、すなわち、ＴＰアーゼ、ＧＴアーゼ及びＮ７ ＭＴアーゼの機能的ドメインを、このアライメント中において、アライメントされた配列の上方における破線により指し示す。保存的領域を強調する。 ＹＰ＿００７３５４４１０（アカンタアメーバ・ポリファーガ・ムームーウイルス（Ａｃａｎｔｈａｎｏｍｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素；ｍｏｕｍｏｕ ＣＥ）（配列番号１２）へとマッピングされるアカンタアメーバ・ポリファーガ・ミミウイルス（Ａｃａｎｔｈａｎｏｍｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）（ＡＡＶ５０６５１、配列番号１１）及びアカンタアメーバ・ポリファーガ・ムームーウイルス（Ａｃａｎｔｈａｎｏｍｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素のアミノ酸配列の間において、９０％以上の配列同一性を呈する保存的領域を示す図である。保存的領域を、ｍｏｕｍｏｕ＿ＣＲ＿０３（配列番号６）及びｍｏｕｍｏｕ＿ＣＲ＿０４（配列番号７）と名指す。ｍｏｕｍｏｕ ＣＥ、すなわち、ＴＰアーゼ、ＧＴアーゼ及びＮ７ ＭＴアーゼの機能的ドメインを、このアライメント中において、アライメントされた配列の上方における破線により指し示す。保存的領域を強調する。 ４５℃において実施されたＲＮＡキャッピング反応が、ヘアピンＲＮＡの効率的キャッピングを容易とすることを示す図である。３７℃（白色バー）において、Ｈ３Ｃ２及びＶＣＥのいずれも、最小の５’二次構造を有するＲＮＡ１を、効率的にキャッピングした（図１を参照されたい）。３７℃において、安定的な５’二次構造を有する、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３及びＲＮＡ４（図１を参照されたい）、は、３７℃において、キャッピングされない、又はキャッピングが低度であった（白色バー）。しかし、Ｈ３Ｃ２は、４５℃（グレーバー）において、４つのＲＮＡ全てを、効率的にキャッピングした。４５℃において、ＶＣＥは、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２を、効率的にキャッピングし、ＲＮＡ３及びＲＮＡ４を、部分的にキャッピングした（グレーバー）。 ４５℃において実施されたＲＮＡキャッピング反応が、長鎖ＲＮＡの効率的キャッピングを容易とすることを示す図である。濃度を上昇させるＨ３Ｃ２又はＶＣＥを、４００ｎＭのｆｌｕｃ ＲＮＡ（１．７ｋｂ）と共に、１０μＬの１×ＲＮＡキャッピング緩衝剤（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８）中、０．５ｍＭのＧＴＰ及び０．１ｍＭのＳＡＭの存在下、３７℃又は４５℃において、３０分間にわたりインキュベートした。次いで、オリゴ誘導型ＲＮアーゼＨ切断により、ｆｌｕｃ ＲＮＡの最初の２４ｎｔを切断した。切断された２４ｎｔ断片内のキャッピングの程度を、１５％の尿素ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により解析した。バンド強度を定量し、各条件下におけるキャッピングの割合を計算するのに使用した。計算値を、酵素濃度に対してグラフ化し、改変ヒル式へと当てはめて、５０％のキャッピングが達成される酵素濃度（Ｃａｐ_５０）を導出した。Ｈ３Ｃ２について、Ｃａｐ_５０値は、３７℃又は４５℃において、それぞれ、３３．６ｎＭ及び０．９６ｎＭであった。ＶＣＥについて、Ｃａｐ_５０値は、３７℃又は４５℃において、それぞれ、１０３ｎＭ及び２．９７ｎＭであった。Ｈ３Ｃ２及びＶＣＥのいずれについても、４５℃における反応は、基質ＲＮＡのうちの５０％をキャッピングするのに必要とされる酵素の数量を、３７℃より実質的に減少させた。 ４５℃において実施されたＲＮＡキャッピング反応が、３７℃におけるより効率的な、ｆｌｕｃ ＲＮＡ以外の長鎖ＲＮＡのキャッピングを容易とすることを示す図である。１００ｎＭのＨ３Ｃ２又はＶＣＥを、５００ｎＭのｃｌｕｃ ＲＮＡ（１．８ｋｂ）又はＣＦＴＲ ＲＮＡ（４．０ｋｂ）と共に、１０μＬの１×ＲＮＡキャッピング緩衝剤（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８）中、０．５ｍＭのＧＴＰ及び０．１ｍＭのＳＡＭの存在下、３７℃又は４５℃において、３０分間にわたりインキュベートした。熱安定性ＲＮアーゼＨ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用することにより、規定された５’断片を切断し、ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ Ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）とＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）との組合せを使用することにより、これらを精製した。高解像度ＬＣ／ＭＳワークフローを使用する、Ｎｏｖａｔｉａ ＬＬＣ（Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＰＡ）により、精製された５’断片についてのインタクト質量分析を実行した。キャッピング分子種及び非キャッピング分子種の質量強度を使用して、キャッピングされたＲＮＡの割合を計算した。 高反応温度が、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）ＲＮＡキャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼ（ＭＴアーゼ）の酵素活性を増強することを示す図である。化学合成された５μＭのＣａｐ－０２５－ｎｔ ＲＮＡ（ｍ７Ｇｐｐｐ２５ｍｅｒ）を、２０μＬの１×ＲＮＡキャッピング緩衝剤中に、１００Ｕのワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャップ２’ＯＭＴアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ ＭＡ）の存在下、表示の温度で３０分間にわたり、２００μＭのＳＡＭと共に反応させた。７０℃において、１０分間にわたり加熱することにより、反応を停止させた。ＲＮＡを、反応成分から精製し、ヌクレオシド及びキャップ構造へと消化し、ＵＰＬＣにより解析した。４５℃及び５０℃において反応を実行することにより、３７℃より多くのＣａｐ－１ ＲＮＡを作出することができる。 Ｃａｐ－１構造の「ワンポット」式作出が、４５℃において、３７℃より効率的であることを示す図である。この実験において、５μＭの化学合成５’三リン酸リボヌクレオチドオリゴ（ｐｐｐ２５ｍｅｒ）を、２００Ｕのワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャップ２’ＯＭＴアーゼと共に、４０μＬの１×ＲＮＡキャッピング緩衝剤中、５０ｎＭのＨ３Ｃ２又はＶＣＥ、１ｍＭのＧＴＰ及び０．２ｍＭのＳＡＭの存在下、３７℃又は４５℃において、３０分間にわたりインキュベートした。反応物及び生成物の相対数量は、直接的なＬＣ／ＭＳ解析から導出した。本図において示される通り、ワンポット酵素反応の実施は、４５℃において、３７℃より多くのＣａｐ－１構造のＲＮＡをもたらす。 市販の酵素及び推奨される反応温度を使用する、１．７ｋｂのｆｌｕｃ転写物のための、１ステップ式キャッピングＲＮＡ合成が、著明量のＣａｐ－０ ＲＮＡ又はＣａｐ－１ ＲＮＡをもたらさないことを示す図である。表示の成分を、推奨される酵素濃度において使用して、３７℃で１時間にわたり反応を実行した（詳細について、実施例７を参照されたい）。ＤＮアーゼＩ処理の後において、Ｑｕｂｉｔ ＲＮＡ ＢＲキットを使用して、転写アウトプットを測定した。キャッピングＲＮＡ合成反応の生成物を、ＬＣ／ＭＳにより解析した。対応する質量の質量強度を使用して、異なる５’基を含有する転写物の割合を推定した。データ点は、別途指し示されない限りにおいて、三連実験の平均である。 高濃度のＨ３Ｃ２キャッピング酵素及び高温を使用して、キャッピングｆｌｕｃ転写物を合成する１ステップ法を示す図である。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを、０．５ｍＭのＨ３Ｃ２ ＲＮＡキャッピング酵素と共に使用して、１ステップ式キャッピングＲＮＡ合成を、３７又は４５℃において、１時間にわたり実行した。ｐｐｐキャッピングＲＮＡ、ｐｐキャッピングＲＮＡ、ＧｐｐｐキャッピングＲＮＡ及びｍ７ＧｐｐｐキャッピングＲＮＡの割合は、キャピラリー電気泳動を使用して推定した。データ点は、二連実験の平均である。 高キャッピング酵素濃度を、４５又は５０℃において使用する、１ステップ式Ｃａｐ－０ ＲＮＡ合成又は１ステップ式Ｃａｐ－１ ＲＮＡ合成を示す図である。キャッピングＲＮＡ合成反応の生成物を、ＬＣ／ＭＳにより解析した。対応する質量の質量強度を使用して、異なる５’基を含有する転写物の割合を推定した。データ点は、別途指し示されない限りにおいて、三連実験の平均である。 Ｈ３Ｃ２：Ｔ７融合体タンパク質を、３７℃で又は４５℃において使用する、１ステップ式Ｃａｐ－０ ＲＮＡ合成を示す図である。融合タンパク質は、４５℃、１時間において、９８％のＣａｐ－０転写物をもたらした。キャッピングＲＮＡ合成反応の生成物を、ＬＣ／ＭＳにより解析した。対応する質量の質量強度を使用して、異なる５’基を含有する転写物の割合を推定した。データ点は、別途指し示されない限りにおいて、二連実験の平均である。 キャッピング酵素であるＶＣＥ及びＨ３Ｃ２が、１．８ｋｂのｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物を、効率的にキャッピングすることを示す図である。５００ｎＭの非修飾転写物又はシュードウリジンｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物を、１００ｎＭのＨ３Ｃ２又はＶＣＥと共に、１０ｍＬの１×ＲＮＡキャッピング緩衝剤（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８）中、０．５ｍＭのＧＴＰ及び０．１ｍＭのＳＡＭの存在下、３７℃において、３０分間にわたりインキュベートした。キャッピング反応を、実施例９に記載された通りに、ＲＮアーゼＨ／インタクトＬＣ／ＭＳワークフローにより解析した。ＶＣＥ及びＨ３Ｃ２は、それぞれ、６８．４％又は１００％のｍ７Ｇｐｐｐキャッピングシュードウリジンを含有するｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物をもたらした。とりわけ、いずれのキャッピング酵素も、ウリジン対応物より大きな割合の、シュードウリジン含有ｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物をキャッピングする。 ＲＮＡの数量が大きい場合のＣａｐ－１形成効率を示す図である。合計２５０ピコモル（１４５ｍｇ）の約１８００ｎｔのＲＮＡのｃｌｕｃ／Ａ１２０インビトロ転写物を、１×ＲＮＡキャッピング緩衝剤（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ）、０．５ｍＭのＧＴＰ、０．１ｍＭのＳＡＭ、１０Ｕ／μＬのワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼ及び５００ｎＭのＨ３Ｃ２を含有する、５００μＬの反応物中、４５℃において、１時間にわたりキャッピングした。Ｃａｐ－１形成の効率は、実施例１０に記載された通りに、ＲＮアーゼＨ／インタクトＬＣ／ＭＳにより評価した。これらの反応条件下において、シュードウリジンを含有するｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物のうちの５４．８％が、Ｃａｐ－１であったのに対し、ウリジン対応物のうちの４７．７％が、Ｃａｐ－１であった。反応条件の最適化（実施例１０に記載される）は、Ｃａｐ－１形成の収率を改善しうる。結果は、二連実験の平均である。 Ｃａｐ－１ ｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物が、インビボにおいて、機能的に活性であることを示す図である。Ｃａｐ－１ ｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物は、ウリジン又はシュードウリジンを含有し、ＨＥＫ２９３細胞へとトランスフェクトされている。キャッピングｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物の翻訳効率を、キャッピングｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞による、非キャッピングｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に照らした、相対ルシフェラーゼ活性として、トランスフェクションの４時間後において測定した。ルシフェラーゼアッセイは、ｒＵを含有するキャッピング転写物及びシュードウリジンを含有するキャッピング転写物が、それぞれ、非キャッピング対照の１０又は２０倍のルシフェラーゼ活性を呈したことを示すことから、Ｈ３Ｃ２及びワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）２’メチルトランスフェラーゼによりキャッピングされたＲＮＡが、４５℃において、機能的に活性であったことを指し示す。 複数の温度ステップは、単一容器式キャッピングＲＮＡ合成の転写アウトプット及びキャッピング効率を改善しうることを示す図である。ＶＣＥキャッピング酵素又はＨ３Ｃ２キャッピング酵素とペアにされたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用する、単一容器式キャッピングＲＮＡ合成反応を、実施例１１に記載される通り、１．７ｋｂのｆｌｕｃ転写物のために実施したが、この場合、反応物を３７℃で３０分間にわたりインキュベートするのに続き、２８℃～５０℃の間の温度で３０分間にわたり第２のインキュベーションを行った。ＤＮアーゼＩ／Ｑｕｂｉｔ法を使用して、転写アウトプットを査定した。ＲＮアーゼＨ／Ｋｌｅｎｏｗによるフィルイン及び尿素ＰＡＧＥ法により、キャッピングの割合を推定した。最高度のキャッピング率を示した試料を、インタクトＬＣ／ＭＳ解析にかけた。ＶＣＥについて、ｍ７Ｇｐｐｐ転写物の形成効率が、第２の反応温度を４５℃としたときにピークに達したのに対し、Ｈ３Ｃ２について、ｍ７Ｇｐｐｐ形成効率は、第２の反応温度を５０℃としたときにピークに達した。他方、Ｔ７ ＲＮＡＰによる転写アウトプットは、ＶＣＥ又はＨ３Ｃ２とペアにされた場合、４５℃においてピークに達した、被験温度の下端及び上端（それぞれ、２８℃及び５０℃）における、低転写活性を反映する。よって、３７℃における３０分間に続く、４５℃における３０分間による、タンデムの温度ステップは、本実施例において、転写アウトプットと、キャッピング効率との最適の均衡をもたらした。反応時間、反応温度及び温度ステップの数など、反応条件に対する改変は、転写収率及びｍ７Ｇキャッピング転写物の割合をさらに改善しうる。

本開示の態様は、実施形態、節の小見出し、図面、説明及び例に照らして、さらに理解されうるが、それらのいずれもが、本開示の範囲全体を、いかなる形においても限定しないものと理解されるものとする。したがって、下記において明示される特許請求の範囲は、本開示の範囲及び精神を念頭に置いて理解されるべきである。

本明細書において記載及び例示される個別の実施形態の各々は、個別の構成要素及び特色を有するが、これらは、本教示の範囲又は精神から逸脱しない限りにおいて、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特色から、たやすく分離される場合もあり、これらとたやすく組み合わされる場合もある。列挙される任意の方法は、列挙されるイベントの順序において実行される場合もあり、論理的に可能な、他の任意の順序において実行される場合もある。反応温度、反応の持続時間、反応成分（例えば、酵素、基質）及び／又は反応物の濃度を含むがこれらに限定されない、開示される反応条件は変動しうる。

別途規定されない限りにおいて、本明細書において使用される、全ての技術用語及び学術用語は、本開示が属する技術分野の当業者により、一般に理解される意味と同じ意味を有する。さらに、本明細書において、ある特定の用語は、本開示の実施形態に照らして、かつ、言及の明確さ及び容易さを目的として規定される。

一般に理解される用語及び記号の典拠は、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ及びＢａｋｅｒ、「ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、２版（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２版（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７５）；Ｓｔｒａｃｈａｎ及びＲｅａｄ、「Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、２版（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）；Ｇａｉｔ編、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８４）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、「Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」、２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９４）並びにＨａｌｅ及びＭａｒｋｈａｍ、「Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、Ｎ．Ｙ．（１９９１）など、標準的な論考及び教科書を含みうる。

文脈により別途明示的に指示されない限りにおいて、本明細書及び付属の特許請求の範囲において使用される、単数形の「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、複数の指示対象を含むことに注意されたい。したがって、例えば、「１つのタンパク質」という用語は、１つ以上のタンパク質、すなわち、単一のタンパク質及び複数のタンパク質を指す。特許請求の範囲は、任意選択的な要素を除外するように起草されうることに、さらに注意されたい。このように、本言明は、請求項要素の列挙に関する、例えば、「単に」、「だけ」などの除外的用語法の使用又は「否定的」限定の使用のための先行詞として用いられるように意図される。

数値範囲は、範囲を規定する数を含む。全ての数は、整数を上回る整数の中点及び整数を下回る整数の中点を包摂する、すなわち、２という数は、１．５～２．５を包摂するように理解されるものとする。２．５という数は、２．４５～２．５５を包摂するなどである。指定されない限りにおいて、試料の数値が提示される場合、各数値は、単独において、値の範囲内の中間値を表し、併せて、範囲の端点を表しうる。

本開示の文脈において、「緩衝剤」とは、酸又はアルカリが、溶液へと添加される場合に、溶液が、ｐＨの変化に抵抗することを可能とする薬剤を指す。本発明の組成物、キット及び方法において使用されうる、適切な非自然発生の緩衝剤の例は、例えば、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＭＯＰＳ、トリシン又はＭＥＳを含む。

本開示の文脈において、「～をキャッピングすること」とは、Ｎｐｐｐ－部分の、ＲＮＡの５’末端への酵素的付加を指し、この場合、Ｎは、Ｇ又は修飾Ｇなどのヌクレオチドである。修飾Ｇは、グアニン環のＮ７位において、メチル基を有する場合もあり、リボースの２又は３位において、標識を付加される場合もあり、一部の実施形態において、標識は、オリゴヌクレオチドの場合もあり、フルオロフォアなどの検出用標識の場合もあり、ビオチン又はデスチオビオチンなどの捕捉部分の場合もあり、この場合、標識は、任意選択的に、例えば、リンカーにより、ヌクレオチドのリボースへと連結されうる。例えば、ＷＯ２０１５／０８５１４２を参照されたい。キャップは、キャッピング反応において、どの酵素が存在するのか、及び／又はＳＡＭが存在するのかどうかに応じて、Ｃａｐ－０構造、Ｃａｐ－１構造又はキャップ２構造（Ｒａｍａｎａｔｈａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０１６、４４：７５１１～７５２６において総説されている）を有しうる。

本開示の文脈において、「ＤＮＡ鋳型」とは、インビトロ転写反応において転写される二本鎖ＤＮＡ分子を指す。ＤＮＡ鋳型は、転写される領域の上流において、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター又はＳＰ６プロモーター）を有する。

本開示の文脈において、「融合体」とは、互いと共有結合的に接続された（例えば、ペプチド結合により）、２つ以上のポリペプチド、サブユニット又はタンパク質を指す。例えば、タンパク質融合体は、レポータータンパク質へと共有結合的に接続された、目的のタンパク質を含む、非自然発生のポリペプチドを指す場合がある。代替的に、融合体は、ペプチド結合により互いと直接接続された、又はペプチドリンカーを介して接続された、２つのタンパク質又は２つのタンパク質ドメインを含む、非自然発生のポリペプチド鎖の組合せを含みうる。

本開示の文脈において、「インビトロ転写」（ＩＶＴ）とは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）鋳型が、鋳型からコピーされたＲＮＡ分子を含有する生成物を生成するように、ＤＮＡにより方向付けられるＲＮＡポリメラーゼ（典型的に、バクテリオファージポリメラーゼ）によりコピーされる無細胞反応を指す。

本開示の文脈において、「ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＲＮＡキャッピング酵素」とは、ＲＮＡをキャッピングすることが可能な、単鎖ＲＮＡキャッピング酵素（例えば、検出可能なＴＰアーゼ活性、ＧＴアーゼ活性及びＮ７ ＭＴアーゼ活性を有する）であって、例えば、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｄ５ｂ（配列番号７）、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｅ１２（配列番号８）、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＳＴ１（配列番号９）又はファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＬＣ９（配列番号１０）に対する、少なくとも９０％の同一性を有する酵素を含む単鎖ＲＮＡキャッピング酵素を指す。「Ｈ３Ｃ２ ＲＮＡキャッピング酵素」、「Ｈ３Ｃ２キャッピング酵素」又は「Ｈ３Ｃ２」とは、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｄ５ｂ（配列番号７）由来のＲＮＡキャッピング酵素を指す。別途明示的に述べられない限りにおいて、同様の特性、効果及び／又は利益を伴う、本明細書において開示される例示及び例を目的とする、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＲＮＡキャッピング酵素は、互いと互換的でありうる。

本開示の文脈において、「Ｈ３Ｃ２融合体」とは、ＲＮＡを、鋳型ポリヌクレオチドから合成することが可能であり、ＲＮＡをキャッピングすることが可能な二機能性酵素であって、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）及びポリメラーゼに対して、Ｎ末端側又はＣ末端側に配置されるファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＲＮＡキャッピング酵素を含む融合体を指す。Ｈ３Ｃ２融合体は、リーダー及び／又はリンカー（例えば、ポリメラーゼとＨ３Ｃ２との間に）をさらに含みうる。Ｈ３Ｃ２融合体は、例えば、配列番号２０に対する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有しうる。Ｈ３Ｃ２：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合体は、Ｈ３Ｃ２融合体の例である。

本開示の文脈において、「Ｈ３Ｃ２変異体」とは、各場合に、配列番号７、８、９、１０、１１及び／又は１２に対する、少なくとも８０％、少なくとも８５％少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ３Ｃ２、Ｈ３Ｃ２融合体及びＲＮＡをキャッピングすることが可能な酵素を指す。

本開示の文脈において、「修飾ヌクレオチド」（修飾ＮＴＰ、修飾ＡＴＰ、修飾ＧＴＰ、修飾ＣＴＰ及び修飾ＵＴＰへの言及を含む）とは、任意の非カノニカルのヌクレオシド、ヌクレオチド又はこれらの対応するリン酸化形を指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の骨格修飾又は塩基修飾を含みうる。修飾ヌクレオチドの例は、ｄｌ、ｄＵ、８－ｏｘｏ－ｄＧ、ｄＸ及びＴＨＦを含む。修飾ヌクレオチドのさらなる例は、米国特許公開第ＵＳ２０１７００５６５２８Ａ１号、同第ＵＳ２０１６００３８６１２Ａ１号、同第ＵＳ２０１５／０１６７０１７Ａ１号及び同第ＵＳ２０２０００４００２６Ａ１号において開示されている修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、自然発生のヌクレオチドを含む場合もあり、非自然発生のヌクレオチドを含む場合もある。

本開示の文脈において、「非自然発生の」とは、天然において存在しないポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、脂質又は組成を指す。このようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、脂質又は組成は、１つ以上の点において、自然発生のポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、脂質又は組成と異なりうる。例えば、ポリマー（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は炭水化物）は、構成要素（例えば、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、又は糖分子）の種類及び配列において異なりうる。ポリマーは、それが連結された分子（複数可）に照らして、自然発生のポリマーと異なりうる。例えば、「非自然発生の」タンパク質は、ポリペプチド（例えば、融合タンパク質）、脂質、炭水化物又は他の任意の分子への化学結合（例えば、ペプチド結合、リン酸結合、ジスルフィド結合、エステル結合及びエーテル結合並びに他の結合を含む共有結合）を有することにより、その二次構造、三次構造又は四次構造において、自然発生のタンパク質と異なりうる。同様に、「非自然発生の」ポリヌクレオチド又は核酸は、核酸の５’末端、３’末端及び／又は５’末端と３’末端との間における１つ以上の他の修飾（例えば、標識又は他の部分の付加）（例えば、メチル化）を含有しうる。「非自然発生の」組成は、以下の点：（ａ）天然において組み合わされていない成分を有すること、（ｂ）天然において見出されない濃度において成分を有すること、（ｃ）除外がなければ、自然発生の組成において見出される、１つ以上の成分の除外、（ｄ）天然において見出されない形態、例えば、乾燥形態、凍結乾燥形態、結晶形態、水性形態を有すること及び（ｅ）天然に見出される成分を超える、１つ以上のさらなる成分（例えば、緩衝剤、洗浄剤、染料、溶媒又は保存剤）を有することのうちの１つ以上において、自然発生の組成と異なりうる。本明細書において言及される、全ての刊行物、特許及び特許出願は、各個別の刊行物、特許又は特許出願が、参照により組み込まれることが、具体的に、かつ、個別に指し示された場合と同じ程度において、参照により本明細書に組み込まれる。

本開示の文脈において、「ＲＮＡ試料」又は「試料」とは、標的ＲＮＡを含む場合もあり、これを含まない場合もある組成物を指す。例えば、ＲＮＡ試料は、このような標的ＲＮＡを含むことが既知である、若しくはこれを含むことが疑われる場合もあり、かつ／又はＲＮＡ試料は、標的ＲＮＡの存在について査定される組成物の場合もある。ＲＮＡ試料は、自然発生の標的ＲＮＡ（例えば、細胞、組織又は生物から抽出された標的ＲＮＡ）、インビトロ転写により生成された標的ＲＮＡ及び／又は化学合成されたＲＮＡを含みうる。

本開示の文脈において、「単鎖ＲＮＡキャッピング酵素」とは、単一のポリペプチド鎖が、ＴＰアーゼ活性、ＧＴアーゼ活性及びＮ７ ＭＴアーゼ活性を含むキャッピング酵素を指す。ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）、ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）及びムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素は、単鎖ＲＮＡキャッピング酵素の例である。Ｈ３Ｃ２融合体は、単鎖ＲＮＡキャッピング酵素のさらなる例である。ＶＣＥは、ヘテロ二量体であり、このように、単鎖ＲＮＡキャッピング酵素ではない。

本開示の文脈において、「単一のキャッピングされていない標的ＲＮＡ分子種」とは、本質的に同じ配列を有する標的ＲＮＡ分子の混合物を指す。インビトロ転写により作製される転写物及び固相合成により作製されるＲＮＡオリゴヌクレオチドは、例示的な、単一のキャッピングされていない標的ＲＮＡ分子種である。このような混合物中の、ある特定量のＲＮＡ生成物は、切断されうることが認識される。単一のキャッピングされていない標的ＲＮＡ分子種は、場合によって、修飾ヌクレオチド（例えば、天然において見出されない、非カノニカルヌクレオチド）を含有しうる。細胞からのＲＮＡの調製物は、異なる配列を有する、自然発生のＲＮＡ分子の、錯雑とした混合物を含有し、このような調製物は、キャッピングされていない標的ＲＮＡ分子種を含有するだけでなく、また、多種多様な非標的ＲＮＡも含有する。一部の実施形態において、キャッピングされていない標的ＲＮＡ分子種は、単一のＲＮＡ分子種である。

本開示の文脈において、「標的ＲＮＡ」とは、目的のポリリボヌクレオチドを指す。ポリリボヌクレオチドは、治療用ＲＮＡ又はその前駆体（例えば、キャッピングされた治療用ＲＮＡの、キャッピングされていない前駆体）である場合もあり、これを含む場合もある。標的ＲＮＡは、細胞内転写から生じる場合もあり、インビトロ転写から生じる場合もある。標的ＲＮＡは、混合物、例えば、インビトロにおける転写反応混合物、細胞又は細胞溶解物中に存在しうる。標的ＲＮＡは、キャッピングされていない場合がある。所望される、又は要求される場合、標的ＲＮＡは、例えば、キャッピングとの同時処理として、デキャッピング酵素と接触させる場合もあり、キャッピングの前の前処理として、デキャッピング酵素と接触させる場合もある。

本開示の文脈において、「キャッピングされていない」とは、（ａ）キャップを有さないＲＮＡ及び（ｂ）キャッピング酵素のための基質として使用されうるＲＮＡを指す。キャッピングされていないＲＮＡは、典型的に、三リン酸化５’末端又は二リン酸化５’末端を有する。インビトロで転写されたＲＮＡは、５’末端において、三リン酸基を有する。

本開示の文脈において、「変異体」とは、自然発生のアミノ酸配列（すなわち、自然発生のタンパク質のアミノ酸配列に対する、１００％未満の配列同一性を有する）と異なるが、自然発生のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。

本明細書において、様々なインビトロＲＮＡキャッピング法が提供される。方法の一部の実施形態は、部分的に、配列番号１のＶＣＥが、特に、二次構造を有するＲＮＡについて、４５℃において、３７℃と比較して、有意に活性を増大させる（図２並びに下記の表１及び２を参照されたい）ことの発見に基づく。例えば、タンパク質をコードするインビトロ転写ＲＮＡへと、キャップを付加するのに使用する場合、４５℃において、３７℃と比較して、３０分の１未満の量の酵素を使用して、同じ量のキャッピング生成物が生成されうる（表６を参照されたい）。加えて、４５℃の反応におけるインキュベーションは、ＶＣＥが、キャップを、５’末端（例えば、図１に例示される通り、分子内の別の配列と塩基対合して、平滑末端又は１若しくは２ヌクレオチドの３’突出若しくは５’突出をもたらすことが予測される５’末端）において、二次構造を有する、キャッピングされていないＲＮＡオリゴヌクレオチドへと、効率的に付加することを可能とする。このようなＲＮＡは、３７℃において、ＶＣＥを使用すると、キャッピングが極めて非効率的である（図９を参照されたい）。したがって、一部の実施形態において、方法は、ＲＮＡ、ＶＣＥ又はその変異体、ＧＴＰ又は修飾ＧＴＰ、ＳＡＭ及び緩衝剤を含む反応ミックスを、４２℃～４７℃、例えば、４４℃～４６℃の範囲の温度でインキュベートして、キャップ構造を、キャッピングされていない標的ＲＮＡへと、効率的に付加するステップを含みうる。方法のこれらの実施形態は、インビトロで転写される、２００ｎｔを超える長さのＲＮＡ及び５’末端において二次構造を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドなど、二次構造を有する、又はこれを有することが予測されるＲＮＡに、特に有用である。

方法の他の実施形態は、部分的に、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｄ５ｂ由来のＲＮＡキャッピング酵素（配列番号７；Ｈ３Ｃ２キャッピング酵素の例であり、本明細書において、「Ｈ３Ｃ２」と略称される）が、ほぼ全ての被験温度で、ＶＣＥより有意に効率的にＲＮＡをキャッピングすることが可能（図２並びに下記の表１及び６を参照されたい）であり、ＶＣＥと同様に、４５℃において、キャップを、インビトロで転写されたＲＮＡへと、効率的に付加するのに使用されうることの発見に基づく。例えば、４５℃において、３７℃と比較して、３０分の１未満の量のファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｄ５ｂ（Ｈ３Ｃ２）を使用して、同じ量のキャッピング生成物が生成されうる（表６を参照されたい）。加えて、反応物を、４５℃においてインキュベートすることは、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｄ５ｂ（Ｈ３Ｃ２）が、キャップを、５’末端において二次構造を有する、キャッピングされていないＲＮＡオリゴヌクレオチドへと、効率的に付加することを可能とする。このようなＲＮＡは、３７℃において、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｄ５ｂ（Ｈ３Ｃ２）を使用すると、キャッピングが極めて非効率的である（図９を参照されたい）。ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＳＴ１、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＬＣ９、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｅ１２、ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）及びムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）を含む、アメーバの他の巨大ウイルス由来のキャッピング酵素についてもまた調べ、高温において活性であることを見出した。このように、一部の実施形態において、方法は、ＲＮＡを含む試料、単鎖キャッピング酵素、ＧＴＰ又は修飾ＧＴＰ及び緩衝剤を含む反応ミックスを、３７℃～６０℃の範囲の温度、例えば、３７℃～４２℃、４２℃～４７℃、４７℃～５２℃又は５２℃～６０℃においてインキュベートして、インビトロでキャップ構造をキャッピングされていない標的ＲＮＡへと効率的に付加するステップを含みうる。方法のこれらの実施形態は、インビトロで転写される、２００ｎｔを超える長さのＲＮＡ及び５’末端において二次構造を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドなど、二次構造を有する、又は二次構造を有することが予測されるＲＮＡに、特に有用である。

ＲＮＡ基質のより効率的なキャッピングは、キャッピング反応物へと添加される酵素を少なくしてキャッピングすること、同じ量の酵素を使用して、より多くのキャッピングＲＮＡ（反応物中のＲＮＡの百分率としての）を生成すること、反応を早期に終結させること及び／又は５’末端において二次構造を有するＲＮＡを、より効率的にキャッピングすることを支援しうる。

限定せずに述べると、反応温度、反応の持続時間、反応成分の濃度（例えば、ＳＡＭ、無機ピロホスファターゼ、ＮＴＰ、転写物鋳型）及び酵素（例えば、キャッピング酵素、ポリメラーゼ及びこれらの融合体）を含む、開示される反応条件は、変動しうる。例えば、Ｈ３Ｃ２：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合体タンパク質は、Ｃａｐ－０転写物の割合及び転写アウトプットとの関係において、Ｃａｐ－０ ＲＮＡの合成効率をさらに改善しうる。加えて、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼなどのキャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼの、反応物中への組入れは、高効率において、Ｃａｐ－１転写物を作出しうる。どの酵素が使用されるのか及び反応ミックス中の他の成分に応じて、開示される方法は、Ｇｐｐｐキャップを有するＲＮＡ、７－メチルグアニル酸キャップ（すなわち、ｍ７Ｇｐｐｐキャップ又は「キャップ０」）を有するＲＮＡ又はｍ７Ｇｐｐｐキャップを有するＲＮＡであって、ＲＮＡ内の第１のヌクレオチド内及び／又は第２のヌクレオチド内に、付加修飾を有するＲＮＡを作製するのに使用されうる（すなわち、「キャップ１」及び「キャップ２」；Ｆｅｃｈｔｅｒ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．、２００５、８６：１２３９～４９を参照されたい）。例えば、反応ミックス中に、ＳＡＭが存在しない場合、Ｇｐｐｐキャップを有するＲＮＡが生成されうる。反応ミックスが、キャッピング酵素に加えて、ＳＡＭを含む場合、キャップ０ ＲＮＡが生成されうる。反応ミックスが、ＳＡＭに加えて、他の酵素、例えば、キャップ２’ＯＭＴアーゼを含む場合、キャップ１ ＲＮＡ及び／又はキャップ２ ＲＮＡが生成されうる。反応ミックスは、上記において明示的に記載された成分に加えて、他の成分を含みうる。

一部の実施形態において、反応ミックス中の、キャッピングされていないＲＮＡは、固相オリゴヌクレオチド合成化学反応（例えば、Ｌｉら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２０１２、７７：９８８９～９８９２を参照されたい）により調製される場合があり、この場合、試料中のＲＮＡは、１０～５００塩基、例えば、２０～２００塩基の範囲の長さを有しうる。他の実施形態において、反応ミックス中の、キャッピングされていないＲＮＡは、転写される領域の上流において、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター又はＳＰ６プロモーター）のためのプロモーターを含有する二本鎖ＤＮＡ鋳型が、鋳型からコピーされたＲＮＡ分子を含有する生成物を生成するように、ＤＮＡにより方向付けられるＲＮＡポリメラーゼ（典型的に、バクテリオファージポリメラーゼ）によりコピーされる、無細胞インビトロ転写（ＩＶＴ）反応において調製されうる。いずれの実施形態においても、本方法においてキャッピングされるＲＮＡ試料は、単一のＲＮＡ分子種（合成オリゴヌクレオチド又は転写物）を含有する。加えて、反応ミックスは、ＲＮアーゼ含まずであることが可能であり、任意選択的に１つ以上のＲＮアーゼ阻害剤を含みうる。試料中のＲＮＡは、ヌクレオチドの非天然配列を含有する場合があり、一部の実施形態において、非自然発生のヌクレオチドを含有しうる。一部の実施形態において、インビトロにおける転写反応は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性変異体（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３１７９及び米国出願第１５／５９４，０９０号を参照されたい）を援用しうる。これらの実施形態において、ＲＮＡは、ＲＮＡの免疫原性を低減するために、４４℃より高い温度（例えば、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃又は少なくとも６０℃であり、約７０℃又は７５℃以下の温度）において転写されうる（例えば、ＷＯ２０１８／２３６６１７を参照されたい）。場合によって、キャッピングされていないＲＮＡは、例えば、必要に応じて、ＲＮＡキャッピング酵素及びＧＴＰ／修飾ＧＴＰを、反応がその経過をたどった後における、インビトロにおける転写反応物へと付加することにより、それが作製された直後にキャッピングされうる。一部の実施形態において、インビトロにおける転写反応において作製されたＲＮＡは、キャッピングの前に精製されうる。

一部の実施形態において、試料中のＲＮＡは、治療用ＲＮＡでありうる。これらの実施形態において、本方法の生成物は、キャッピングされたＲＮＡの、キャッピングされていないＲＮＡからの精製を伴わずに使用されうる。これらの実施形態において、本反応の生成物は、製剤を作製するのに、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わされる場合があり、この場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」とは、経皮投与手段、経口投与手段、静脈内投与手段、又は当技術分野において使用される他の投与手段を介する、生存哺乳動物への投与と適合性である、任意の溶媒である。薬学的に許容可能な賦形剤の例は、例えば、ＵＳ２０１７／０１１９７４０に記載されている賦形剤を含む。製剤は、インビボにおいて、例えば、その例が、ヒト又は任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ又は霊長動物）を含む対象へと投与されうる。対象に応じて、ＲＮＡ（修飾ＲＮＡ又は非修飾ＲＮＡ）は、ＲＮＡを、細胞へと直接注入することにより導入される場合もあり、これを取り巻く媒体を介して、間接的に導入される場合もある。投与は、標準化法により実施されうる。ＲＮＡは、ネイキッドＲＮＡの場合もあり、対象、例えば、ヒトへの投与に適する形態に製剤化される場合もある。製剤は、液体製剤（溶液、懸濁液、分散液）、局所製剤（ゲル、軟膏、液滴、クリーム）、リポソーム製剤（ＵＳ９，６２９，８０４Ｂ２；ＵＳ２０１２／０２５１６１８Ａｌ；ＷＯ２０１４／１５２２１１；ＵＳ２０１６／００３８４３２Ａ１において記載されているリポソーム製剤など）を含みうる。ＲＮＡ生成物が導入される細胞は、インビトロ細胞（すなわち、合成媒体上においてインビトロで培養された細胞）でありうる。したがって、ＲＮＡ生成物は、細胞にトランスフェクトされるＲＮＡ生成物でありうる。ＲＮＡ生成物が導入される細胞は、インビボ（哺乳動物の一部である細胞）でありうる。したがって、導入は、インビボにおいて、ＲＮＡ生成物を、対象へと投与することによりなされうる。ＲＮＡ生成物が導入される細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて存在しうる（哺乳動物から摘出された組織、例えば、軟部組織の一部である細胞又は哺乳動物の血液から単離された組織）。

治療適用のために、ｍＲＮＡを製造するのに、数グラム単位の合成を支援するようにスケーラブルである、費用効果的かつ合理的な方式による、大量の、均一にキャッピングされたｍＲＮＡ転写物の合成が所望又は要求される場合がある。ｍＲＮＡ製造のための現行の手法は、インビトロ転写反応においてｍＲＮＡキャップアナログを使用するので高価である。代替的に、インビトロ転写に続く、酵素を使用するｍＲＮＡキャッピング（スケールアップするのがより困難な、より複雑な工程）により、５’－三リン酸ＲＮＡを生成するために、個別の反応物が要求される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びキャッピング酵素を使用する、インビトロにおける、キャッピングＲＮＡの、１ステップ式合成は、合理的製造工程でありうる。両方の酵素による、単一容器式反応は、そうでなければ法外となる、合成ｍＲＮＡキャップアナログの費用を削減する、又は排することが可能であり、数グラム単位の（及びこれを超える）合成を支援するように、このワークフローをスケールアップすることの煩雑さを軽減しうる。

方法
本明細書において、キャッピングされたＲＮＡを効率的に生成するための方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、熱活性Ｈｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びＨ３Ｃ２ ＲＮＡキャッピング酵素を含み、予測外に、熱活性ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）ｍＲＮＡキャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼを含む。驚くべきことに、３７℃より実質的に高温の反応温度は、単一の反応物による、キャッピングされたｍＲＮＡの合成を可能とする。一部の実施形態において、ＲＮＡの転写操作及びキャッピング操作は、単一の反応物中、高温（例えば、４０℃～６０℃）において実施されうる。例えば、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼを伴う又は伴わない、ＲＮＡポリメラーゼ及び個別のキャッピング酵素は、キャッピングＲＮＡ合成反応において、同時に使用されうる。ＲＮＡの転写操作とキャッピング操作との組合せは、例えば、Ｈ３Ｃ２を含む融合タンパク質、単一サブユニットのＲＮＡキャッピング酵素及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ又はＨｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにより達成されうる。本明細書において記載される方法は、高レベルのＣａｐ－０ ＲＮＡ又はＣａｐ－１ ＲＮＡの合成を達成しうる。

一部の実施形態において、キャッピング法は、任意選択的にＳＡＭの存在又は非存在下で、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、熱活性Ｈｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＨ３Ｃ２融合体）、標的ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、キャッピング酵素（例えば、ＶＣＥ、Ｈ３Ｃ２、Ｈ３Ｃ２融合体）、ＮＴＰ、緩衝剤を接触させるステップを含みうる。ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）は、非修飾ＡＴＰ、修飾ＡＴＰ（ｍ６ＡＴＰ、ｍ１ＡＴＰ）、非修飾ＣＴＰ、修飾ＣＴＰ（例えば、ｍ５ＣＴＰ）、非修飾ＧＴＰ、修飾ＧＴＰ、非修飾ＵＴＰ、修飾ＵＴＰ（例えば、シュードウリジン三リン酸、ｍｌシュードウリジン三リン酸）、２’Ｏメチル化を含有するＮＴＰ及び／又はこれらの組合せを含みうる。一部の実施形態において、キャッピング法は、ＳＡＭの存在又は非存在下で、キャッピング酵素（例えば、ＶＣＥ、Ｈ３Ｃ２、Ｈ３Ｃ２融合体）、標的ＲＮＡ並びにグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及び／又は修飾ＧＴＰを接触させるステップを含みうる。一部の実施形態において、キャッピング法は、キャッピング酵素（例えば、ＶＣＥ、Ｈ３Ｃ２、Ｈ３Ｃ２融合体）、標的ＲＮＡ並びにグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及び／又は修飾ＧＴＰ、Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（例えば、熱活性ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）ｍＲＮＡ キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼ）を接触させるステップを含みうる。

一部の実施形態に従う、接触させるステップは、単一の場所において（例えば、単一のステップにおいて）、例えば、任意の表面（例えば、プレート又はビーズ）において、又は任意の容器（例えば、試験管、フラスコ、バイアル、カラム、容器、バイオリアクター又は他の空間）内において実施されうる。一部の実施形態において、接触させるステップは、一部の対象エレメント又は全ての対象エレメントを、任意の所望の順序において、又は共時的に接触させるステップを含みうる。一部の実施形態において、接触させるステップは、一部の対象エレメント又は全ての対象エレメントを、緩衝剤の存在下で接触させるステップを含みうる。例えば、接触させるステップは、ＳＡＭの存在又は非存在下で、キャッピング酵素（例えば、ＶＣＥ、Ｈ３Ｃ２、Ｈ３Ｃ２融合体）、標的ＲＮＡ、ＧＴＰ及び緩衝剤を、任意の順序において、又は共時的に接触させることを含みうる。一部の実施形態において、接触させるステップは、４０℃～６０℃（例えば、４０℃で、４２℃、４４℃、４５℃、４６℃、４８℃、５０℃、５２℃、５４℃、５５℃、５６℃、５８℃又は６０℃）の温度で、任意の所望の時間、例えば、１分間～１２０分間（例えば、１分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、４５分間、６０分間、７５分間、９０分間、１０５分間又は１２０分間）にわたり接触させることをさらに含みうる。本明細書において開示される実施形態のうちのいずれかにおいて、接触させるステップは、２５℃～６０℃の第１の温度で接触させ、第１の温度と異なる、２５℃～６０℃の第２の温度へと冷却又は加熱することをさらに含む場合があり、この場合、任意選択的に、第１の温度又は第２の温度のうちの少なくとも１つは、４０℃以上である。第１の温度は、所望量のキャッピングされていない標的ＲＮＡを生成する、安定化させる、かつ／又は保持するように選択される場合があり、第２の温度は、所望量のキャッピングされた標的ＲＮＡを生成する、安定化させる、かつ／又は保持するように選択されうる。各温度は、任意の所望の時間（例えば、１分間～１２０分間）にわたり維持されうる。例えば、第１の温度は、１～３０分間の第１の時間にわたり、３７℃であることが可能であり、第２の温度は、１～３０分間の第２の時間にわたり、２８℃、３２℃、３７℃、４５℃又は５０℃でありうる。開示される実施形態のうちのいずれにおいて、接触させるステップは、１つの対象物を、別の対象物と直接的に接触させること、２つの対象物を、併せて、表面上に、又は容器内において、それらが、さらなる振盪若しくは混合を伴い、又は伴わずに、物理的に、かつ／又は化学的に相互作用しうるように、十分に近接させることを含みうる。接触させるステップは、１つの対象物を、別の対象物と直接的に接触又は近接させる初期動作及び／又は２つの対象物の、互いとの接触を許容する、又は優先する条件を維持することを含みうる。

一部の実施形態において、方法は、ＲＮＡ（例えば、鋳型により方向付けられたＲＮＡ又は方向付けられていないＲＮＡ）をインビトロで合成して、キャッピングされていない標的ＲＮＡを生成するステップ及び標的ＲＮＡ（例えば、単一ステップの反応）をキャッピングするステップを含みうる。ＲＮＡを鋳型から合成するステップは、例えば、任意選択的にＳＡＭの存在又は非存在下で、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、熱活性Ｈｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＨ３Ｃ２融合体）を、鋳型（例えば、ＲＮＡ鋳型又はＤＮＡ鋳型）、１つ以上のＮＴＰ及び緩衝剤と接触させて、キャッピングされていない標的ＲＮＡを生成することを含みうる。ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）は、非修飾ＡＴＰ、修飾ＡＴＰ（ｍ６ＡＴＰ、ｍ１ＡＴＰ）、非修飾ＣＴＰ、修飾ＣＴＰ（例えば、ｍ５ＣＴＰ）、非修飾ＧＴＰ、修飾ＧＴＰ、非修飾ＵＴＰ、修飾ＵＴＰ（例えば、シュードウリジン三リン酸、ｍｌシュードウリジン三リン酸）、２’Ｏメチル化を含有するＮＴＰ及び／又はこれらの組合せを含みうる。標的ＲＮＡをキャッピングするステップは、例えば、Ｈ３Ｃ２（例えば、Ｈ３Ｃ２又はＨ３Ｃ２融合体）を、標的ＲＮＡ並びにグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及び／又は修飾ＧＴＰと接触させて、キャッピングされた標的ＲＮＡを生成することを含みうる。一部の実施形態において、キャッピング法は、２５℃～６０℃の温度で標的ＲＮＡをＨ３Ｃ２融合体と接触させるステップを含みうる。一部の実施形態において、キャッピング法は、標的ＲＮＡをデキャッピング酵素と接触させて、既存のキャップを除去し、かつ／又はこれがキャッピングされていないことを確認するステップを含みうる。

キャッピングは、例えば、キャッピング酵素（例えば、ＶＣＥ、Ｈ３Ｃ２、Ｈ３Ｃ２融合体）を、標的ＲＮＡ、Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（例えば、熱活性ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）ｍＲＮＡ キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼ）、ＳＡＭ、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、修飾ＧＴＰ及び／又は緩衝剤と接触させるステップを含みうる。例えば、キャッピングは、キャッピング酵素、標的ＲＮＡ、ＧＴＰ（任意選択的に修飾ＧＴＰを伴う又は伴わない）及び任意選択的に緩衝剤を接触させるステップを含みうる。キャッピングは、単一の容器内において（例えば、単一のステップにおいて）、キャッピング酵素、標的ＲＮＡ、ＧＴＰ（任意選択的に修飾ＧＴＰを伴う又は伴わない）、Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ＳＡＭ及び任意選択的に緩衝剤を接触させるステップを含みうる。キャッピングは、単一の容器内において（例えば、単一のステップにおいて）、例えば、標的ＲＮＡをコードする標的ＲＮＡ鋳型（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、ポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、熱活性Ｈｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＨ３Ｃ２融合体）、ＮＴＰ（任意選択的に１つ以上の修飾ＮＴＰを組み入れる又は除外する）、キャッピング酵素（例えば、ＶＣＥ、Ｈ３Ｃ２、Ｈ３Ｃ２融合体）及び／又は緩衝剤を接触させることにより、既存の標的ＲＮＡをキャッピングするステップ及び／又は標的ＲＮＡを合成若しくはキャッピングするステップを含みうる。

組成物
開示される方法に関連する、様々な組成物もまた提供される。一部の実施形態において、組成物（例えば、反応ミックス）は、標的ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡ試料中の）及び／又は標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型を含みうる。一部の実施形態において、組成物は、ＴＰアーゼ活性、ＧＴアーゼ活性及びＮ７ ＭＴアーゼ活性を有する単鎖ＲＮＡキャッピング酵素、ＧＴＰ、ＳＡＭ並びに緩衝剤を含みうる。組成物は、３７℃～６０℃の範囲の温度、例えば、３７℃～４２℃、４２℃～４７℃、４７℃～５２℃又は５２℃～６０℃を有しうる。一部の実施形態において、組成物は、ＲＮアーゼが、阻害される、不活化される、又は非存在である結果として、ＲＮアーゼ活性を含まない場合がある。例えば、ＲＮアーゼを含まない組成物は、１つ以上のＲＮアーゼ阻害剤を含みうる。一部の実施形態において、組成物は、ＲＮＡを転写するための、プロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ鋳型、プロモーターの位置において転写を誘発するバクテリオファージポリメラーゼ及びＮＴＰをさらに含みうる。一部の実施形態において、組成物は、キャップ２’ＯＭＴアーゼを含みうる。単鎖ＲＮＡキャッピング酵素は、（ａ）配列番号２、３若しくは４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；又は（ｂ）配列番号５若しくは６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含みうる。一部の実施形態に従う組成物は、Ｈ３Ｃ２融合体Ｎ末端からＣ末端の順序において、（ａ）ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＲＮＡキャッピング酵素（例えば、Ｈ３Ｃ２ ＲＮＡキャッピング酵素）及びＲＮＡポリメラーゼ又は（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ及びＨ３Ｃ２ ＲＮＡキャッピング酵素を含み、Ｈ３Ｃ２融合体は、任意選択的に、リーダー（例えば、融合体内に作動可能に配置された）及び／又はＨ３Ｃ２とＲＮＡポリメラーゼとの間に配置されたリンカーをさらに含みうる。一部の実施形態において、本段落において言及された成分のうちのいずれか又は全ては、単一の容器内において組み合わされる場合もあり、他の形において組み入れられる場合もある。成分、例えば、単一の容器内の成分は、乾燥形態（例えば、無水形態及び／又は凍結乾燥形態）において存在する場合もある。言及された成分のうちの１つ以上を伴う容器はまた、水性媒体も含有しうる。

キット
本開示によりまた、上記において記載された、本方法を実施するためのキットも提供される。一部の実施形態において、キットは、上記において列挙された成分のうちのいずれか１つ以上を含有しうる。例えば、キットは、ＴＰアーゼ活性、ＧＴアーゼ活性及びＮ７ ＭＴアーゼ活性を有する単鎖ＲＮＡキャッピング酵素を含有し得、酵素は、保管用緩衝剤中及び反応緩衝剤中（例えば、５倍又は１０倍の濃縮反応緩衝剤でありうる）に存在し得る。一部の実施形態において、キットは、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを転写するための、バクテリオファージポリメラーゼ及びＮＴＰを含みうる。加えて、キットは、ＳＡＭ及びキャップ２’ＯＭＴアーゼを含みうる。上記の議論から明らかとなる通り、酵素は、（ａ）配列番号２、３若しくは４；又は（ｂ）配列番号５若しくは６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含みうる。

所望に応じて、キットの多様な成分が、個別の容器中に存在する場合もあり、ある特定の適合性の成分が、単一の容器へとあらかじめ組み合わされる場合もある。上述の成分に加えて、対象キットは、キットの構成要素を使用して、本方法を実施するための指示書、すなわち、ＲＮＡをキャッピングするための指示書をさらに含みうる。

全ての試薬は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及び／又は表示の供給元から入手可能である。

［実施例１］ 高温における、Ｈ３Ｃ２及びＶＣＥのＲＮＡキャッピング活性
１０ｎＭの精製ＶＣＥ ＲＮＡキャッピング酵素又は精製Ｈ３Ｃ２ ＲＮＡキャッピング酵素を、その３’末端において、蛍光基（ＦＡＭ）を含有する５００ｎＭのＲＮＡ１（図１）と共に、１０μＬの１×ＲＮＡキャッピング緩衝剤（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）中、０．５ｍＭのＧＴＰ及び０．１ｍＭのＳＡＭの存在下、２３℃～６５℃の範囲の温度で３０分間にわたりインキュベートした。５０ｍＭのＥＤＴＡ １μＬの添加に続く、７０℃において１０分間にわたる熱不活化により、反応をクエンチングした。クエンチングされた反応物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用するキャピラリー電気泳動により解析した。３０分間のキャッピング反応後において、ｍ７Ｇｐｐｐ－ＲＮＡ１、非メチル化Ｇｐｐｐ－ＲＮＡ１、非キャッピングｐｐ－ＲＮＡ１及び非キャッピングｐｐｐ－ＲＮＡ１に対応するピーク面積を定量し、ｍ７Ｇｐｐｐ－ＲＮＡ１の割合を計算するのに使用した図２において、各バーは、４回の独立の実験の平均を表す。誤差バーは、４回の反復についての標準偏差を表す。低酵素濃度（１０ｎＭ）において、Ｈ３Ｃ２及びＶＣＥのいずれもが、４５℃において、最高度のキャッピング活性を呈したのに対し、Ｈ３Ｃ２は、５０℃及び５５℃においても、ＶＣＥより高度のキャッピング活性を保持したことが明らかである。

ＶＣＥ及びＨ３Ｃ２のＲＮＡキャッピング活性を、異なる反応温度でよりよく定量するために、複数の希釈率にわたる酵素を、同じ反応条件で下、それぞれ、３７℃、４５℃、５０℃又は５５℃において、３０分間にわたりインキュベートした。ｍ７Ｇｐｐｐ－ＲＮＡ１の割合についての計算値を、酵素濃度に対してグラフ化し、ヒルの式からの導出式へと当てはめて、５０％のキャッピングが達成される酵素濃度（Ｃａｐ_５０）を導出した。図３Ａ～３Ｂ及び表１に示される通り、それぞれ、３７℃、４５℃、５０℃又は５５℃、３０分間で、０．５ｕＭのｐｐｐ－ＲＮＡ１のうちの５０％の、ｍ７Ｇｐｐｐ－ＲＮＡ１への転換は、３．０６ｎＭ、０．９４ｎＭ、４．０８ｎＭ及び３０．００ｎＭのＶＣＥを要求する。さらに、５０℃以下において、４００ｎＭ以上のＶＣＥは、０．５ｕＭのＲＮＡのうちの＞９０％を、３０分間でキャッピングする。Ｈ３Ｃ２について、０．６９ｎＭ、０．６７ｎＭ、２．１５ｎＭ又は２１．３ｎＭの酵素は、それぞれ、３７℃、４５℃、５０℃又は５５℃、３０分間で、ｐｐｐ－ＲＮＡ１のうちの５０％を、ｍ７Ｇｐｐｐ－ＲＮＡ１へと転換しうる。加えて、５０ｎＭのＨ３Ｃ２は、５５℃以下、３０分間で、ｐｐｐ－ＲＮＡ１のうちの＞９０％を効果的にキャッピングする。

［実施例２］ Ｈ３Ｃ２オーソログについての同定及び試験
ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｄ５ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号：ＡＭＮ８３５６１）から精製されたＲＮＡキャッピング酵素であるＨ３Ｃ２は、インビトロ条件下の６０℃以下において活性であった。配列同一性により、他のファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）株における、いくつかの推定オーソログを同定した。他のファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）株及び類縁の巨大ウイルスである、アカンタアメーバ・ポリファーガ・ミミウイルス（Ａｃａｎｔｈａｎｏｍｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）及びアカンタアメーバ・ポリファーガ・ムームーウイルス（Ａｃａｎｔｈａｎｏｍｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）由来の推定ＲＮＡキャッピング酵素の遺伝子生成物は、５５℃～６０℃以下のＲＮＡキャッピングにおいて活性であることが見出された。同定されたオーソログ遺伝子のＯＲＦを合成し、標的遺伝子の発現を、Ｔ７プロモーターの制御下に置くように、Ｔ７発現ベクターへと挿入した。製造元の推奨に従い、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用するＰＣＲにより、Ｔ７発現カセットを増幅した。製造元の指示書に従い、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＰＣＲ ＆ ＤＮＡ ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して、増幅されたＴ７発現カセットを精製した。製造元の指示書に従い、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）インビトロタンパク質合成キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して、精製されたＴ７発現カセットを、インビトロ転写／翻訳にかけた。表示のＧｅｎｂａｎｋ受託番号を伴う遺伝子生成物を含有するＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ反応生成物（図４Ａ～４Ｅ）を、ＲＮＡキャッピングアッセイにおいて使用した。略述すると、１×ＲＮＡキャッピング緩衝剤（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）中に２μＬのＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ生成物、０．４ｍＭの１５０ｎｔのインビトロ転写物であるＲＮＡ、４μＭのＧＴＰ、０．１ｍＭのＳＡＭ及び微量の^３２Ｐ－α－ＧＴＰから構成される、５０μＬのＲＮＡキャッピング反応物を、氷上においてアセンブルした。反応物を、５つの等量部分へと分け、これらの各々を、表示の温度で３０分間にわたりインキュベートした。１０μＬの２× ＲＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を、反応物へと添加することにより、反応を停止させ、変性化ポリアクリルアミド電気泳動及びオートラジオグラフィーにより解析した。キャッピング活性は、表示の基質ＲＮＡの位置において移動するＸ線シグナルにより指し示される。図４Ａ～４Ｅに示される通り、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＳＴ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＳＭＥ６５０２６；レーン３）及びファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＬＣ９（ＳＭＨ６３６２９；レーン４）由来の推定ＲＮＡキャッピング酵素、ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＶ５０６５１のアミノ酸１～６６８；Ｂｅｎａｒｒｏｃｈら、２００８；レーン５）のＮ末端画分及びムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＹＰ＿００７３５４４１０；レーン６）が、１５０マーのＲＮＡを、５５℃以下の温度でキャッピングするのに対し、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｄ５ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＭＮ８３５６１；Ｆ１３Ｃ２；レーン１）、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）Ｅ１２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＩＢ５２０５５；レーン２）及び精製Ｆ１３Ｃ２（レーン７）由来のＲＮＡキャッピング酵素は、１５０マーのＲＮＡを、６０℃以下の温度でキャッピングする。

［実施例３］ 配列解析
配列アライメント解析は、６０アミノ酸長又は１１１アミノ酸長の３つの領域が、５５℃以下において活性である、４つのファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＲＮＡキャッピング酵素の間において、９０％以上のアミノ酸配列同一性を呈することを明らかにした（図５）。保存的領域である、Ｆａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０１は、Ｆ１３Ｃ２のＴＰアーゼドメイン内の６０アミノ酸にわたる。Ｆａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０３は、グアノシンＮ７メチルトランスフェラーゼドメインのＮ末端における１１１アミノ酸にわたる。Ｆａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０５は、Ｆ１３Ｃ２のグアノシンＮ７メチルトランスフェラーゼドメインのＣ末端側における６０アミノ酸にわたる。Ｆａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０１（Ｆ１３Ｃ２の配列のアミノ酸４３～１０２に対応する）のアミノ酸配列は、ＦＤＫＬＫＰＤＧＥＩＴＴＴＭＲＶＳＮＡＤＧＭＡＲＥＩＴＦＧＧＧＶＫＴＧＥＭＦＶＫＫＱＮＩＣＶＦＤＶＶＤＩＦＳＹＫＶＡＶＳ（配列番号２）である。Ｆａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０３（Ｆ１３Ｃ２の配列のアミノ酸５３７～６４７に対応する）のアミノ酸配列は、ＧＦＹＧＮＮＹＫＩＡＳＤＩＹＬＮＹＩＤＶＦＮＦＤＤＬＷＫＹＮＰＧＹＦＥＫＮＫＳＤＩＹＩＡＰＮＫＹＲＲＹＬＩＫＳＬＦＮＫＹＩＫＮＡＫＷＶＩＤＡＡＡＧＲＧＡＤＬＨＬＹＫＡＥＣＶＥＮＬＬＡＩＤＩＤＰＴＡＩＳＥＬＩＲＲＲＮＥＩＴＧＤＶＦＮＦＤＤＬＷＫＹＮＰＧＹＦＥＫＮＫＳＤＩＹＩＡＰＮＫＹＲＲＹＬＩＫＳＬＦＮＫＹＩＫＮＡＫＷＶＩＤＡＡＡＧＲＧＡＤＬＨＬＹＫＡＥＣＶＥＮＬＬＡＩＤＩＤＰＴＡＩＳＥＬＩＲＲＲＮＥＩＴＧ（配列番号３）である。Ｆａｕｓｔｏ＿ＣＲ＿０５（Ｆ１３Ｃ２の配列のアミノ酸７７８～８７３に対応する）のアミノ酸配列は、ＫＹＳＩＫＲＬＹＤＳＤＫＬＴＫＴＧＱＫＩＡＶＬＬＰＭＳＧＥＭＫＥＥＰＬＣＮＩＫＮＩＩＳＭＡＲＫＭＧＬＤＬＶＥＳＡＮＦＳＶ（配列番号４）である。

以下の表は、ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素のアミノ酸配列の間の配列同一性をまとめる。

図６は、保存的ドメインの他、ＴＰアーゼ領域、ＧＴアーゼ領域及びＭＴアーゼ領域の配列を示す、多様なファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＲＮＡキャッピング酵素配列のアライメントを示す。

配列アライメント解析はまた、６７アミノ酸長又は１１１アミノ酸長の２つの領域が、５５℃以下において活性である、アカンタアメーバ・ポリファーガ・ミミウイルス（Ａｃａｎｔｈａｎｏｍｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）と、アカンタアメーバ・ポリファーガ・ムームーウイルス（Ａｃａｎｔｈａｎｏｍｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）ＲＮＡキャッピング酵素との間において、９０％以上の配列同一性を呈することも明らかにした（図７）。保存的領域である、ｍｏｕｍｏｕ＿ＣＲ＿０３（ムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）配列のアミノ酸５７６～６４２に対応する）は、ＧＴアーゼドメインとグアノシンＮ７メチルトランスフェラーゼドメインとの間の６７アミノ酸にわたる。ｍｏｕｍｏｕ＿ＣＲ＿０４（ムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）配列のアミノ酸６７２～７８２に対応する）は、グアノシンＮ７メチルトランスフェラーゼドメインのＮ末端における１１１アミノ酸にわたる。ｍｏｕｍｏｕ＿ＣＲ＿０３のアミノ酸配列は、ＩＮＤＮＴＶＶＥＦＩＦＤＮＦＫＩＤＭＤＤＰＹＫＷＩＰＩＲＴＲＹＤＫＴＥＳＶＱＫＹＨＫＫＹＧＮＮＬＨＩＡＮＲＩＷＫＴＩＴＮＰＩＴＥＤＩＩ（配列番号５）である。ｍｏｕｍｏｕ＿ＣＲ＿０４のアミノ酸配列は、ＹＹＱＫＮＴＳＮＡＡＧＭＲＡＦＮＮＦＩＫＳＮＭＩＴＴＹＣＫＤＧＤＫＶＬＤＩＧＣＧＲＧＧＤＬＩＫＦＩＨＡＧＩＥＥＹＶＧＩＤＩＤＮＮＧＬＹＶＩＮＤＳＡＦＮＲＹＫＮＬＫＫＴＩＫＮＩＰＰＭＴＦＩＮＡＤＡＲＧＬＦＮＬＥＡＱＥＫＩＬＰ（配列番号６）である。

以下の表は、ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）ＲＮＡキャッピング酵素のアミノ酸配列と、ムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）ＲＮＡキャッピング酵素のアミノ酸配列との間の配列同一性をまとめる。

図８は、保存的ドメインの他、ＴＰアーゼ領域、ＧＴアーゼ領域及びＭＴアーゼ領域の配列を示す、ミミウイルス属（Ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）配列及びムームーウイルス属（Ｍｏｕｍｏｕｖｉｒｕｓ）配列のアライメントを示す。

［実施例４］ ４５℃におけるＲＮＡキャッピング反応は、短鎖モデルヘアピンＲＮＡにおけるキャッピング効率を増強する
キャッピング効率について査定するのに、図１に例示される短鎖ＲＮＡを、本明細書において記載される通りにデザインした。３７℃におけるＭＦＥを－１．５ｋｃａｌ／モルとする、又は４５℃におけるＭＦＥを－０．７３ｋｃａｌ／モルとする、短いヘアピン構造及び非構造化５’末端を有するように、対照ＲＮＡ（ＲＮＡ１）をデザインした（図１）。３７℃におけるアンフォールディングの理論的最小自由エネルギー（ＭＦＥ）を－７．２ｋｃａｌ／モルとする、又は４５℃におけるＭＦＥを－５．４ｋｃａｌ／モルとする（ＲＮＡＦｏｌｄ ｓｅｒｖｅｒ：ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ）安定的ヘアピン構造を形成するように、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３及びＲＮＡ４をデザインした。それらの５’末端において、平滑末端、１塩基又は２塩基の突出を有するように、それぞれの最小自由エネルギー構造を有するＲＮＡ２、ＲＮＡ３及びＲＮＡ４を、さらにデザインした（図１）。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によりＲＮＡを生成した。キャッピング反応のために、５０ｎＭのＨ３Ｃ２又はＶＣＥを、５００ｎＭのＲＮＡ基質と共に、１０μＬの１×ＲＮＡキャッピング緩衝剤（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）中、０．５ｍＭのＧＴＰ及び０．１ｍＭのＳＡＭの存在下、３７℃又は４５℃において、３０分間にわたりインキュベートした。３７℃において、Ｈ３Ｃ２は、非構造化５’末端を有することが予測されるＲＮＡ１のうちの１００％及び５’末端において２塩基の突出構造を有することが予測されるＲＮＡ４のうちの２２％をキャッピングした（図９）。Ｈ３Ｃ２は、これらの条件下において、ＲＮＡ２及びＲＮＡ３をキャッピングすることが不可能であった。４５℃において、Ｈ３Ｃ２は、４つのＲＮＡ基質全ての１００％をキャッピングした。ＶＣＥは、３７℃において、ＲＮＡ１のうちの８０％だけをキャッピングすることが可能であった。４５℃において、ＶＣＥは、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２のうちの１００％及びＲＮＡ３及びＲＮＡ４のうちの約６０％をキャッピングした。

［実施例５］ ４５℃におけるＲＮＡキャッピング反応は、長鎖ＲＮＡにおけるキャッピング効率を増強する
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃｆｌｕｃ）を含有する、１７６６ｎｔのＲＮＡを生成した。４００ｎＭのｆｌｕｃ ＲＮＡを、表示濃度のＨ３Ｃ２又はＶＣＥと共に、１０μＬの１×ＲＮＡキャッピング緩衝剤（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８）中、０．５ｍＭのＧＴＰ及び０．１ｍＭのＳＡＭの存在下、３７℃又は４５℃において、３０分間にわたりインキュベートした。次いで、ＲＮアーゼを方向付けて、２５ｎｔの５’断片を切り出すようにデザインされた、最終濃度を２．５μＭとするターゲティングオリゴ（ＴＯ）を、各キャッピング反応物へと添加し、次いで、これを、８０℃において、３０秒間にわたり加熱して、キャッピング酵素を不活化し、次いで、室温へと、ゆっくり冷却した。熱安定性ＲＮアーゼＨ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を、０．５Ｕ／μＬの最終濃度において、各反応物へと添加するのに続き、３７℃において、１時間にわたるインキュベーションを行った。次いで、ＲＮアーゼＨ反応物を、１５％の尿素ポリアクリルアミドゲルを介する電気泳動により解析した。製造元の指示書に従い、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、ゲルを染色し、次いで、Ｃｙ２チャネルを使用する、Ａｍｅｒｓｈａｍ（登録商標）Ｔｙｐｈｏｏｎ（登録商標）ＲＧＢ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）スキャナーを使用して走査した。キャッピングバンド及び非キャッピングバンドの強度を、同じレーンのＴＯの強度に照らして正規化した。正規化値を使用して、各条件下においてキャッピングされたＲＮＡの割合を計算した。計算値を、酵素濃度に対してグラフ化し、ヒルの式からの導出式へと当てはめて、５０％のキャッピングが達成される酵素濃度（Ｃａｐ_５０）を導出した。Ｈ３Ｃ２について、Ｃａｐ_５０値は、３７℃又は４５℃において、それぞれ、３３．６ｎＭ及び０．９６ｎＭであった。ＶＣＥについて、Ｃａｐ_５０値は、３７℃又は４５℃において、それぞれ、１０３ｎＭ及び２．９７ｎＭであった（図１０及び下記の表６）。いずれの酵素についても、キャッピング反応を、４５℃において実行する場合、５０％のキャッピングを達成するのに、実質的に少量の酵素が必要とされた。

下記に示される通り、これらの酵素の活性は、反応物１μＬ当たりのミリ単位において表すことができる：

キャッピング効率の温度による増強が、他の長鎖ＲＮＡ分子においても達成されうることを示すために、シプリジナ属（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）ルシフェラーゼ（ｃｌｕｅ；１８２３ｎｔ）及び嚢胞性線維症膜貫通受容体（ＣＦＴＲ；４７１２ｎｔ）のインビトロ転写物を使用して、質量分析リードアウトにより、Ｈ３Ｃ２及びＶＣＥのキャッピング効率について研究した。略述すると、０．５μＭのｃｌｕｅインビトロ転写物又はＣＦＴＲインビトロ転写物を、１００ｎＭのＨ３Ｃ２又はＶＣＥと共に、容量を１００μＬとする反応物中、０．１ｍＭのＳＡＭ及び０．５ｍＭのＧＴＰの存在下、３７℃又は４５℃において、３０分間にわたりインキュベートした。５’デオキシヌクレオチド及び３’リボヌクレオチド並びにＴＥＧ－デスチオビオチン基から構成される、２．５μＭのターゲティングオリゴの存在下、８０℃において、３０秒間にわたり加熱することにより、反応を停止させた。反応物を、０．１℃／秒の速度において、２５℃へと冷却した。次いで、最終濃度を０．５Ｕ／μＬとし、３７℃において、１時間にわたる、熱安定性ＲＮアーゼＨ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を伴うインキュベーションにより、反応物をＲＮアーゼＨによる切断にかけた。次いで、ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ Ｂｅａｄｓを使用するサイズ選択及びストレプトアビジン磁気ビーズを使用する標的選択を使用して、ＲＮアーゼＨ切断反応物の５’断片を精製した。略述すると、１００μＬのＲＮアーゼＨ切断反応物を、２００μＬのＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ Ｂｅａｄｓへと添加し、室温において、５分間にわたりインキュベートした。次いで、ビーズを、磁界下に置き、清明化された上清を回収し、２００μＬのビーズ懸濁液に由来する、あらかじめ清浄化されたＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズへと添加した。室温において、５分間にわたりインキュベートした後、ビーズを、磁界下に置いた。清明化された上清を、２００μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１に由来する、あらかじめ清浄化されたビーズへと添加した。２００μＬの洗浄緩衝剤（５ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＮａＣｌ）による、４回にわたる洗浄の後、清浄化されたビーズを、５０μＬのビオチン溶出緩衝剤（１ｍＭのビオチン、５ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、０．１ＭＮａＣｌ、０．１ＭＮａＣｌ）と共に、３７℃で１時間にわたりインキュベートすることにより、結合されたＲＮＡを溶出させた。次いで、溶出されたＲＮＡを、外部の委託業者である、Ｎｏｖａｔｉａ ＬＬＣにより実施されるＬＣ／ＭＳにより解析して、標的の相対質量を決定した。ＲＮＡキャッピングの程度は、キャッピングされたＲＮＡ分子種と、キャッピングされていないＲＮＡ分子種との質量強度比により評価した。

図１１に示される通り、Ｈ３Ｃ２及びＶＣＥのいずれも、４５℃のｃｌｕｅ ＲＮＡ及びＣＦＴＲ ＲＮＡにおいて、３７℃より大きなキャッピング活性を呈する。

［実施例６］ 高温の三リン酸ＲＮＡ上における、Ｃａｐ－１構造の、効率的なワンポット式酵素的合成
ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャップ２’ＯＭＴアーゼが、高温において活性であるのかどうかを検証するために、１００Ｕのワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャップ２’ＯＭＴアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加する前に、２０μＬの１×ＲＮＡキャッピング緩衝剤（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）中に、化学合成された５μＭのＣａｐ－０ ＲＮＡ１（２５ｎｔ）及び２００μＭのＳＡＭを含有する反応物を、３７℃、４５℃又は５０℃で１分間にわたりあらかじめ加熱した。前加熱温度で３０分間にわたり反応を進行させ、次いで、７０℃において、１０分間にわたり加熱することにより、これを停止させた。Ｏｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎキット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ、Ｔｈｏｒｏｌｄ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、ＲＮＡを、反応成分から精製した。次いで、ヌクレオチド消化ミックス反応緩衝剤（５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４、１ｍＭのＺｎＣｌ_２）を含有する２０μＬの反応物中に２μＬのヌクレオチド消化ミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）と共に、３７℃で１時間にわたりインキュベートすることにより、精製されたＲＮＡを、ヌクレオチド及びキャップ構造へと消化した。次いで、メタノール及び１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）からなる勾配移動相を伴う、Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ（商標）ＨＳＳ Ｔ３ ＸＰカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）（２．１×１００ｍｍ、２．５ｍｍ）上のＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）により、ヌクレオチド消化反応物を解析した。図１２に示される通り、４５℃及び５０℃において、３７℃より多くのＣａｐ－０ ＲＮＡがメチル化された。

高温の５’三リン酸ＲＮＡ上におけるＣａｐ－１構造のワンポット式酵素的合成を裏付けるために、化学合成された５μＭの５’三リン酸ＲＮＡ１を、２００Ｕのワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャップ２’ＯＭＴアーゼ（最終濃度を５Ｕ／μＬとする）と共に、１×ＲＮＡキャッピング緩衝剤（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）を含有する、４０μＬの反応物中、５０ｎＭのＨ３Ｃ２又はＶＣＥ、１ｍＭのＧＴＰ及び０．２ｍＭのＳＡＭの存在下、３７℃又は４５℃において、３０分間にわたりインキュベートした。ＬＣ／ＭＳにより、反応物を直接解析して、質量及び相対質量を決定した。５０ｎＭのＶＣＥとペアにしたところ、５Ｕ／μＬの２’ＯＭＴアーゼは、３７℃において、約５０％のＣａｐ－０１ ＲＮＡを作出するのにとどまったのに対し、４５℃において、１００％Ｃａｐ－１ ＲＮＡを作出した（図１３）。５０ｎＭのＨ３Ｃ２とペアにしたところ、５Ｕ／ｍＬのワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）２’ＯＭＴアーゼは、３７℃において、約９０％のＣａｐ－０１ ＲＮＡを作出し、４５℃において、１００％Ｃａｐ－１ ＲＮＡを作出した（図１３）。したがって、４５℃における反応の実施は、ＶＣＥの存在下において、Ｃａｐ－１ ＲＮＡの収率を、ほぼ倍増させ、Ｈ３Ｃ２の存在下において、Ｃａｐ－１ ＲＮＡの収率を増大させた。

［実施例７］ 個別のＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡキャッピング酵素及びキャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼを使用する、Ｃａｐ－０ ＲＮＡ及びＣａｐ－１ ＲＮＡの１ステップ式合成
Ａ．ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャッピング酵素による１ステップ式キャッピングＲＮＡ合成は、非効率的である
製造元により、それぞれの反応物について推奨される通り、１．７ｋｂのｆｌｕｃ転写物（配列番号１８）の転写及びキャッピングに適応である、５Ｕ／μｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；型番：Ｍ０２５１）、Ｈｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；型番：Ｍ０６５８）、１Ｕ／μｌのワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャッピング酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；型番：Ｍ２０８０）及び５Ｕ／μｌのワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）ｍＲＮＡキャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；型番：Ｍ０３６６）を使用した。反応物は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用する場合に、１×Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ緩衝剤（４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミジン）を含有した、又はＨｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用する場合に１×Ｈｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ緩衝剤（４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．９、６０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミジン）を含有した。反応に、１９ｍＭのＭｇＣｌ_２及び５ｍＭずつのＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰの各々及び０．５ｍＭのＳＡＭを補充した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャッピング酵素について推奨される反応温度及び持続時間である、３７℃で１時間にわたり反応を実行した。

各反応物について、１時間にわたるインキュベーションの後におけるインビトロ転写の収率について評価するために、１μＬの反応ミックスを、１×ＤＮアーゼＩ反応緩衝剤（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．６、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２０．５ｍＭのＣａＣｌ_２）及び０．５Ｕ／μＬのＤＮアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する、４μＬの溶液へと添加し、３７℃において、３０分間にわたりインキュベートした。次いで、製造元の指示書に従い、Ｑｕｂｉｔ ＲＮＡ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＤＮアーゼＩ反応物を、全ＲＮＡ濃度について解析した。転写物のサイズ及び完全性について検証するために、２％のＥ－Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、Ｔｙｐｈｏｏｎ ＲＧＢスキャナー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して撮像される画像と共に使用して、ＤＮアーゼＩ反応物を解析した。結果を、図１４における転写アウトプットとして示す。

ＲＮＡキャッピングの程度について解析するために、ＲＮアーゼＨによる切断に続く、インタクトＬＣ／ＭＳ解析により、１ステップ式キャッピングＲＮＡ合成について解析した。略述すると、５’デオキシヌクレオチド及び３’リボヌクレオチド並びにＴＥＧ－デスチオビオチン基（配列番号１９）から構成される、２．５μＭのターゲティングオリゴ（ＴＯ－１）の存在下、８０℃において、３０秒間にわたり加熱することにより、ステップ式キャッピングＲＮＡ合成を停止させた。反応物を、０．１℃／秒の速度において、２５℃へと冷却した。次いで、反応物を、最終濃度を０．５Ｕ／μＬとする、熱安定性ＲＮアーゼＨ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；型番：Ｍ０５２３）を伴う、３７℃で１時間にわたるインキュベーションによる、ＲＮアーゼＨ切断にかけた。キャピラリー電気泳動を使用する、５’基の解析を容易とするため、ＦＡＭ標識化ヌクレオチドを、ＲＮアーゼＨ切断断片の３’末端へと添加した。略述すると、５μＬのＲＮアーゼＨ反応物を回収し、２×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２、０．５ｍＭのｄＡＴＰ、０．０５ｍＭのＦＡＭ－１２－ｄＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）及び０．２５Ｕ／μＬのＤＮＡポリメラーゼＩ大型（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する、５μｌの溶液へと添加した。反応物を、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。一部の場合に、キャッピングの成功について検証するのに、Ｋｌｅｎｏｗ反応物の小画分を、尿素ＰＡＧＥ上において解析した。略述すると、２μＬのＫｌｅｎｏｗ反応物を回収し、８μＬの２×ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）へと添加した。次いで、混合物を、１５％の尿素ポリアクリルアミドゲルを介する電気泳動により解析した。ゲル画像は、Ｃｙ２チャネルを使用するＴｙｐｈｏｏｎ ＲＧＢスキャナー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により収集した。

キャピラリー電気泳動又は質量分析を使用して、カップリングされた転写／キャッピング反応生成物の５’基状態について解析するために、次いで、ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ Ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用するサイズ選択により、Ｋｌｅｎｏｗ反応生成物（デスチオビオチニル化ターゲティングオリゴへとアニーリングされたままのＲＮアーゼＨ切断生成物）を精製し、次いで、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して選択した。略述すると、４５μＬのヌクレアーゼ含まず水を、５μＬのＲＮアーゼＨ切断反応物へと添加し、次いで、これを、１００μＬのＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｅａｄｓ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）へと添加し、室温において、５分間にわたりインキュベートした。次いで、ビーズを、磁石に隣接して、室温において、２分間にわたり静置した。清明化された上清を回収し、１００μＬのビーズ懸濁液に由来するあらかじめ清浄化されたＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｅａｄｓへと添加した。次いで、室温において、５分間にわたりインキュベートした後、ビーズを、磁石に隣接して、室温において、２分間にわたり静置した。清明化された上清を、５０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に由来する、あらかじめ清浄化されたビーズへと添加した。５０μＬの低煙濃度洗浄緩衝剤（５ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、６０ｍＭのＮａＣｌ）による、４回にわたる洗浄の後、清浄化されたビーズを、１０μＬのヌクレアーゼ含まず水中においてインキュベートすることにより、結合されたＲＮＡを溶出させた。次いで、ＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）１２０ ＬＩＺ ｄｙｅ Ｓｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（１６キャピラリーアレイ）又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（９６キャピラリーアレイ）上のキャピラリー電気泳動により、溶出されたＲＮＡを解析した。ＰｅａｋＳｃａｎｎｅｒソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び自社製のソフトウェア一式を使用して、反応生成物について解析した。ｍ７Ｇｐｐｐ－ＲＮアーゼＨ切断転写物、非メチル化Ｇｐｐｐ－ＲＮアーゼＨ切断転写物、非キャッピングｐｐ－ＲＮアーゼＨ切断転写物及びｐｐｐ－ＲＮアーゼＨ切断転写物に対応するピーク面積を定量し、ｐｐｐ転写物、ｐｐ転写物、Ｇｐｐｐ転写物及びｍ７Ｇｐｐｐ転写物中の、キャッピングＲＮＡ合成反応の割合を計算するのに使用した。

質量分析を使用して、ｍ７ＧｐｐｐＧｍキャッピングＲＮＡ（Ｃａｐ－１）、ｍ７ＧキャッピングＲＮＡ（Ｃａｐ－０）、非メチル化ＧキャッピングＲＮＡ及び非キャッピングＲＮＡの相対数量を決定するために、外部の委託業者である、Ｎｏｖａｔｉａ ＬＬＣ（Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＰＡ）又は社内施設により実施されるＬＣ／ＭＳを使用して、関与性の分子種のインタクト質量を決定した。ＲＮＡキャッピングの程度は、関与性のＲＮアーゼＨ切断生成物の質量強度比により評価した。

図１４は、現在市販されている反応条件を使用する、１ステップ転写の結果を示す。バー１とバー２とを比較したところ、ＶＣＥの存在は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの転写アウトプットに著明に影響を及ぼさず、検出可能なｍ７ＧｐｐｐＧ（Ｃａｐ－０）転写物をもたらさなかった。所望されないキャッピング反応中間体である、小さな割合（５．４％）の非メチル化ＧキャッピングＲＮＡが検出された。また、転写物のうちの約５０％は、別のキャッピング反応中間体である、５’二リン酸基も含有する。バー３に示される通り、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼを、反応物中に組み入れたところ、転写アウトプットは、著明な影響を受けず、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ（Ｃａｐ－１）転写物が検出された。転写物のうちの約５０％は、５’二リン酸基を有し、１５％は、非メチル化Ｇキャッピング中間体を有した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼではなく、Ｈｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したところ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ反応と同様の結果が観察された（ＶＣＥの存在は、Ｈｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの転写に、著明な影響を与えず、検出可能なレベルのＣａｐ－０転写物をもたらさなかった）。ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼの、反応物への添加は、Ｃａｐ－１転写物をもたらさなかった。これらの結果から、インビトロにおけるｍＲＮＡの合成（すなわち、ＲＮＡ合成に続く、ｍＲＮＡキャッピング）のための、現在のところ標準的な、酵素試薬及び反応条件は、インビトロにおける、単一の反応物中のキャッピングｍＲＮＡの生成（すなわち、１ステップ式キャッピングＲＮＡ合成）を支援しない。

Ｂ．ファウストウイルス属（Ｆａｕｓｔｏｖｉｒｕｓ）ＲＮＡキャッピング酵素であるＨ３Ｃ２は、インビトロの１ステップ反応において、転写物を効率的にキャッピングする
実施例７Ａの試薬及び条件は、インビトロの１ステップ反応において、キャッピングされた転写物を生成するのに無効であるので、新たな酵素及び反応条件を、インビトロで１ステップ式キャッピングＲＮＡ合成を行う、それらの能力について調べた。図１３は、高濃度のＨ３Ｃ２キャッピング酵素を、３７℃又は４５℃において使用した、１ステップ式キャッピングＲＮＡ合成の結果を示す。

３７℃において、０．５ｍＭのＨ３Ｃ２キャッピング酵素は、キャピラリー電気泳動により測定される通り、２４．１％もの非メチル化Ｇキャッピング転写物を伴う、１２％のｍ７Ｇｐｐｐキャッピング転写物をもたらした。他方、４５℃において、６１％もの転写物が、ｍ７Ｇｐｐｐキャップを有し、非メチル化Ｇキャップを有する転写物は、１．４％だけであった。いずれの温度においても、転写アウトプットは、Ｈ３Ｃ２キャッピング酵素を伴わない場合の５０～６０％であった。よって、Ｈ３Ｃ２濃度の増大及び反応温度の上昇は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びＨ３Ｃ２ ＲＮＡキャッピング酵素を使用する、１ステップ式キャッピングＲＮＡ合成におけるＣａｐ－０転写の収率を改善する。

Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｈｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＶＣＥ、Ｈ３Ｃ２及びワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼの異なる組合せを使用して、４５℃及び５０℃において、Ｃａｐ－０の、１ステップ式キャッピングＲＮＡ合成を実施することにより、酵素試薬及び反応温度の範囲を、さらに拡張することの影響について調べた。具体的に述べると、５Ｕ／μＬのワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）ｍＲＮＡキャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼの存在又は非存在下で、０．５ｍＭのＶＣＥキャッピング酵素又はＨ３Ｃ２キャッピング酵素を、表示の通り、それらのそれぞれの反応緩衝剤中に、５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ又はＨｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと共に使用して、実施例７Ａに記載された通りに、１ステップ式キャッピングＲＮＡ合成を実行した。４５又は５０℃で１時間にわたり反応を実行した。

図１４は、この精査の拡張の結果についてまとめる。バー１～５において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、４５℃において、キャッピングＲＮＡ合成反応を実行した。Ｈ３Ｃ２キャッピング酵素の存在下において、転写物のうち、８４％は、ｍ７Ｇｐｐｐキャッピング（Ｃａｐ－０）され、８％は、非メチル化Ｇキャッピングされた（バー２）。Ｈ３Ｃ２及びキャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼの両方の存在下において、転写物のうち、８７％は、ｍ７ＧｐｐｐＧｍキャッピング（Ｃａｐ－８７）され、６％は、非メチル化Ｇキャッピングされ、Ｃａｐ－０は、検出されなかった（バー３）。ＶＣＥを使用したところ、転写物のうちの７６％は、Ｃａｐ－０構造を有し、２４％は、非メチル化Ｇキャップ構造を有した（バー４）。ＶＣＥ及びキャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼの両方の存在下において、転写物のうちの５５％は、Ｃａｐ－１構造を有し、３６％は、Ｃａｐ－０構造を有し、８％は、非メチル化Ｇキャップ構造を有した。４５℃において、Ｈ３Ｃ２又はＶＣＥが、反応物中に存在する場合に、ＲＮＡ収率は、著明な影響を受けなかった。しかし、キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼ及びキャッピング酵素のうちのいずれかが存在する場合、ＲＮＡ収率は、０．１４ｍｇ／μＬから、０．０９ｍｇ／μＬへと低下した。４５℃において、Ｈｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するキャッピングＲＮＡ合成反応（バー６～１０）において、キャッピングされる転写物の割合は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するキャッピングＲＮＡ合成反応と比較して小さかった（バー１～５）。Ｈ３Ｃ２キャッピング酵素及びＶＣＥキャッピング酵素は、それぞれ、４５％（バー７）及び５０％（バー９）のＣａｐ－０転写物をもたらした。キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼを伴うＨ３Ｃ２は、４４％のＣａｐ－１転写物、３９％非メチル化Ｇキャッピング転写物をもたらし、検出可能なＣａｐ－０転写物をもたらさなかった（バー８）。キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼを伴うＶＣＥは、１９％のＣａｐ－１転写物、２２％のＣａｐ－０転写物及び４２％非メチル化Ｇキャッピング転写物をもたらした（バー１０）。興味深いことに、キャッピング酵素又はキャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼの存在下において、Ｈｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、４５℃において実行された反応の転写アウトプットは、有意な影響を受けなかった（バー６～１０）。Ｈｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、５０℃において、キャッピングＲＮＡ合成反応を実行したところ、Ｈ３Ｃ２キャッピング酵素は、８０％のＣａｐ－０転写物及び２０％の非メチル化Ｇキャッピング転写物をもたらした（バー１２）。Ｈ３Ｃ２及びキャップＴＯメチルトランスフェラーゼの両方の存在下において、転写物のうちの７１％は、Ｃａｐ－１構造を含有し、２％は、Ｃａｐ－０構造を含有し、２６％は、非メチル化Ｇキャップ構造を含有した（バー１３）。ＶＣＥを使用したところ、転写物のうち、５５％は、非メチル化Ｇキャップ構造を有し、Ｃａｐ－０は、検出されなかった。ＶＣＥ及びキャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼの両方が存在する場合、転写物のうちの２３％は、Ｃａｐ－０構造を有し、３１％は、非メチル化Ｇキャップ構造を有した。

まとめると、本実施例は、Ｈ３Ｃ２ ＲＮＡキャッピング酵素を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ又はＨｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと共に使用して、インビトロでＣａｐ－０ ＲＮＡを８０％以下の効率においてもたらす、１ステップ式反応条件（表７）を提供する。本実施例はまた、Ｈ３Ｃ２ ＲＮＡキャッピング酵素、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）ｍＲＮＡキャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ又はＨｉ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと共に使用して、Ｃａｐ－１ ＲＮＡを、７０～８０％の効率においてもたらす、１ステップ式反応条件（表８）についても記載する。

［実施例８］ Ｈ３Ｃ２：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合体タンパク質を使用する、１ステップＣａｐ－０ ＲＮＡの合成
可撓性であると推定されるリンカー配列（配列番号２０）により連結された、Ｈ３Ｃ２ ＲＮＡキャッピング酵素と、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼとから構成されるタンパク質を生成するのに、融合構築物を調製した。融合タンパク質は、Ｅ．コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）により発現される、Ｔ７プロモーター又はｔａｃプロモーターの制御下にあるＤＮＡ配列（配列番号２１）によりコードされ、標準的なクロマトグラフィー法を使用して精製された。

１．７ｋｂのｆｌｕｃ転写物のための、１ステップ式キャッピングＲＮＡ合成反応は、実施例７において指し示された通りに、１９ｍＭのＭｇＣｌ_２及び５ｍＭずつのＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰの各々及び０．１ｍＭのＳＡＭを補充された、１×Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ緩衝剤中、０．５ｍＭのＨ３Ｃ２：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合体の存在下において実施した。比較のために、０．５ｍＭのＨ３Ｃ２キャッピング酵素を伴う又は伴わない、５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含有する反応を行った。反応物を、３７又は４５℃において、１時間にわたり実行した。ＲＮＡ収率並びにキャッピング転写及び非キャッピング転写の割合は、実施例７において指し示された通りに測定及び解析した。

結果を、図１５に示す。反応を、３７℃において実施したところ、Ｈ３Ｃ２：Ｔ７融合タンパク質は、７５％のｍ７Ｇｐｐｐキャッピング（Ｃａｐ－０）転写物及び２０％の非メチル化Ｇキャッピング転写物をもたらした（バー１）。同じ条件下において、個別の酵素である、Ｈ３Ｃ２だけ及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼだけは、１２％のＣａｐ－０転写物及び２７％の非メチル化Ｇキャッピング転写物をもたらした（バー２）。転写アウトプットは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼだけが存在する場合の０．４５ｍｇ／μＬ（バー３）から、Ｈ３Ｃ２を添加した場合の０．３９ｍｇ／μＬへと減少し、Ｈ３Ｃ２：Ｔ７融合体を、転写に使用した場合の０．１９ｍｇ／μＬへとさらに減少した。４５℃において、Ｈ３Ｃ２：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合体は、個別の酵素を使用した場合における、６０％のＣａｐ－０転写物及び６％の非メチル化Ｇキャッピング転写物（バー５）と比較した、９５％のＣａｐ－０転写物及び５％の非メチル化Ｇキャッピング転写物（バー４）をもたらした。３７℃において実施された反応と同様に、転写アウトプットは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼだけが存在する場合の０．３１ｍｇ／μＬ（バー６）から、Ｈ３Ｃ２を添加した場合の０．１８ｍｇ／μＬ又はＨ３Ｃ２：Ｔ７融合体を、転写に使用した場合の０．１２ｍｇ／μＬｍｇ／μＬへと減少した。

こうして、記載された反応条件下において、本実施例は、Ｈ３Ｃ２：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合体タンパク質を使用する、効率的な（例えば、９８％という高効率の）、インビトロ１ステップ式Ｃａｐ－０ ＲＮＡ合成を裏付ける。

［実施例９］ ＲＮＡキャッピング酵素は、シュードウリジンを含有する、インビトロ転写物を、効率的にキャッピングする
シュードウリジン三リン酸（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は非修飾ウリジン三リン酸（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）の存在下において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）を使用するインビトロ転写により、１２０ｎｔのポリ（Ａ）テールを伴う、シプリジナ属（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）ルシフェラーゼタンパク質（ｃｌｕｃ／Ａ１２０）をコードする約１８００ｎｔのＲＮＡを合成した。５００ｎＭの非修飾転写物又はシュードウリジンｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物を、１００ｎＭのＨ３Ｃ２又はＶＣＥと共に、１０ｍＬの１×ＲＮＡキャッピング緩衝剤（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８）中、０．５ｍＭのＧＴＰ及び０．１ｍＭのＳＡＭの存在下、３７℃において、３０分間にわたりインキュベートした。次いで、５’断片を切り出すように、ＲＮアーゼを方向付けるようにデザインされたターゲティングオリゴ（ＴＯ）を、各キャッピング反応物へと添加して、２．５ｍＭの最終ＴＯ濃度を達成した。次いで、ＴＯを転写物とアニーリングさせ、キャッピング酵素を不活化させるように、各反応物を、８０℃において、３０秒間にわたり加熱し、室温へと、ゆっくりと冷却した。熱安定性ＲＮアーゼＨ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、０．５Ｕ／μＬの最終濃度において、各反応物へと添加し、３７℃において、１時間にわたりインキュベートした。次いで、反応生成物を精製し、実施例７に記載された通りに、インタクトＬＣ／ＭＳにより解析した。図１６に示される通り、ＶＣＥ及びＨ３Ｃ２は、それぞれ、シュードウリジンを含有するｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物のうちの、６８．４％又は１００％を、ｍ７Ｇｐｐｐキャッピングした。とりわけ、いずれのキャッピング酵素も、ウリジン対応物より大きな割合の、シュードウリジン含有ｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物をキャッピングする。

［実施例１０］ Ｃａｐ－１キャッピングのスケールアップ及び機能アッセイ
合計２５０ピコモル（１４５ｍｇ）の約１８００ｎｔのｃｌｕｃ／Ａ１２０インビトロ転写物を、１×ＲＮＡキャッピング緩衝剤（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）、０．５ｍＭのＧＴＰ、０．１ｍＭのＳＡＭ、１０Ｕ／μＬのワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ Ｍ０３６６）及び５００ｎＭのＨ３Ｃ２を含有する、５００μＬの反応物中、４５℃で１時間にわたりキャッピングした。Ｃａｐ－１形成の効率は、実施例７に記載された通りに、ＲＮアーゼＨ／インタクトＬＣ／ＭＳにより評価した。酸性フェノール及びクロロホルムに続き、エタノール沈殿並びにヌクレアーゼ含まず水中の再水和を使用して、ＲＮＡを精製した。Ｑｕｂｉｔ ＲＮＡ（Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ）キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により、ＲＮＡ濃度を推定した。キャッピングｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物の翻訳効率を、キャッピングｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞による、非キャッピングｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に照らした、相対ルシフェラーゼ活性として測定した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ トランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞に、２５０ｎｇの精製ｃｌｕｃ／Ａ１２０転写物をトランスフェクトした。ＢｉｏＬｕｘ（登録商標）Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ）を使用して、トランスフェクションの４時間後において、１０μＬの培養培地上清について、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０マイクロプレート照度計を使用して、発光を測定した。図１７に示される通り、スケールアップキャッピング反応は、ｒＵ及びシュードウリジンを含有するｃｌｕｃ／Ａ１２０上において、それぞれ、４７．７％及び５４．８％のＣａｐ－１形成を達成し、実施例５及び図１１における結果と符合した。三連におけるルシフェラーゼアッセイ結果は、ｒＵ及びシュードウリジンを含有する精製キャッピング転写物からの翻訳効率が、高ルシフェラーゼ活性を呈したこと（図１８）を示したことから、ｒＵ及びシュードウリジンを含有する精製キャッピング転写物からの翻訳効率が、高ルシフェラーゼ活性を呈したこと（図１８）を指し示す。反応容量、酵素及び反応成分の濃度、反応時間及び反応温度など、反応条件に対する改変は、ＲＮＡの数量が大きい場合のＣａｐ－１形成効率及び結果として得られるＣａｐ－１ ＲＮＡの翻訳効率を改善することに注目されたい。

［実施例１１］ 複数の温度ステップを伴う、単一容器式キャッピングＲＮＡ合成
実施例７において指し示された通りに、１．７ｋｂのｆｌｕｃ転写物のための単一容器式キャッピングＲＮＡ合成反応を実施した、すなわち、５Ｕ／ｕｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；型番：Ｍ０２５１）を、５００ｎＭのワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ）キャッピング酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；型番：Ｍ２０８０）又はＨ３Ｃ２キャッピング酵素を伴い又は伴わずに、３７℃において、３０分間にわたりインキュベートするのに続き、２８℃、３２℃、３７℃、４５℃又は５０℃における、さらに３０分間にわたるインキュベーションを行った。反応物は、１×Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ緩衝剤（４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミジン）を含有し、１９ｍＭのＭｇＣｌ_２及び５ｍＭずつのＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰの各々及び０．５ｍＭのＳＡＭを補充された。転写アウトプットを、実施例７に記載された通りに、ＤＮアーゼＩ／Ｑｕｂｉｔ定量により解析した。実施例７において指し示された通りにＲＮアーゼＨ切断に続く、ＫｌｅｎｏｗによるＦＡＭ－ｄＣＴＰのフィルイン及び尿素－ＰＡＧＥにより、反応物のキャッピング効率を査定した。インタクト質量分析計により、選択された反応物を、さらに解析した。図１９に示される通り、ＶＣＥについて、ｍ７Ｇｐｐｐ形成効率が、第２の反応温度を４５℃としたときにピークに達したのに対し、Ｈ３Ｃ２について、ｍ７Ｇｐｐｐ形成効率は、第２の反応温度を５０℃としたときにピークに達した。Ｔ７ ＲＮＡＰによる転写アウトプット、他方、ＶＣＥ又はＨ３Ｃ２とペアにされた場合、４５℃においてピークに達したことから、被験温度の下端及び上端（それぞれ、２８℃及び５０℃）における、低転写活性を反映する。よって、３７℃における３０分間に続く、４５℃における３０分間による、タンデムの温度ステップは、本実施例において、転写アウトプットと、キャッピング効率との最適の均衡をもたらした。反応時間、反応温度及び温度ステップの数など、反応条件に対する改変は、転写収率及びｍ７Ｇキャッピング転写物の割合をさらに改善しうる。

Claims (27)

1. インビトロでＲＮＡをキャッピングするための方法であって、
   （ｉ）キャッピングされていない標的ＲＮＡを含むＲＮＡ試料；
   （ｉｉ）配列番号１、７又は２０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＲＮＡキャッピング酵素；
   （ｉｉｉ）グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）又は修飾ＧＴＰ
   （ｉｖ）緩衝剤；及び
   （ｖ）メチル基ドナー
   を、４０℃～６０℃の温度で接触させて、キャッピングされた標的ＲＮＡを形成するステップ
   を含む方法。
2. インビトロでＲＮＡを効率的にキャッピングするための方法であって、
   （ｉ）キャッピングされていない標的ＲＮＡを含むＲＮＡ試料；
   （ｉｉ）ＲＮＡトリホスファターゼ（ＴＰアーゼ）活性、グアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴアーゼ）活性及びグアニン－Ｎ７メチルトランスフェラーゼ（Ｎ７ ＭＴアーゼ）活性を有する単鎖ＲＮＡキャッピング酵素；
   （ｉｉｉ）グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）又は修飾ＧＴＰ
   （ｉｖ）緩衝剤；及び
   （ｖ）メチル基ドナー
   を、３７℃～６０℃の温度で接触させて、キャッピングされた標的ＲＮＡを形成するステップ
   を含む方法。
3. キャッピングされていない標的ＲＮＡが、少なくとも２００ｎｔの長さである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 接触させるステップが、温度を、３７℃～６０℃の第２の温度へと上昇又は低下させることをさらに含み、前記第２の温度が、第１の温度と異なる、請求項１又は２又は３に記載の方法。
5. 単鎖ＲＮＡキャッピング酵素が、
   （ａ）（ｘ）配列番号２、（ｙ）配列番号３及び／若しくは（ｚ）配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；又は
   （ｂ）（ｘ）配列番号５及び／若しくは（ｙ）配列番号６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
   を含む、請求項２に記載の方法。
6. 単鎖ＲＮＡキャッピング酵素が、（ａ）配列番号７、（ｂ）配列番号８、（ｃ）配列番号９、（ｄ）配列番号１０、（ｅ）配列番号１１又は（ｆ）配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
7. （ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）が、ＲＮアーゼを含まず、接触させるステップが、任意選択的に（ｖ）１つ以上のＲＮアーゼ阻害剤を接触させることをさらに含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
8. 固相オリゴヌクレオチド合成化学反応を使用して、キャッピングされていないＲＮＡを合成するステップをさらに含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
9. キャッピングされていないＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型及びポリメラーゼを接触させて、キャッピングされていないＲＮＡを生成することにより、キャッピングされていないＲＮＡを合成するステップをさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
10. メチル基ドナーが、Ｓ－アデノシルメチオニンであり、接触させるステップが、（ｖｉ）キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼ酵素を接触させることをさらに含む、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
11. キャッピングされていない標的ＲＮＡが、１つ以上のシュードウリジンを含む、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
12. 接触させるステップが、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び任意選択的に（ｖ）を単一の場所において接触させることをさらに含む、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
13. （ｉ）キャッピングされていない標的ＲＮＡ；
    （ｉｉ）ＲＮＡトリホスファターゼ（ＴＰアーゼ）活性、グアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴアーゼ）活性及びグアニン－Ｎ７メチルトランスフェラーゼ（Ｎ７ ＭＴアーゼ）活性を有する単鎖ＲＮＡキャッピング酵素；
    （ｉｉｉ）グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）；
    （ｉｖ）緩衝剤；及び
    （ｖ）メチル基ドナー
    を含む組成物。
14. ３７℃～６０℃の範囲の温度を有する、請求項１３に記載の組成物。
15. ＲＮアーゼを含まず、任意選択的に（ｖ）１つ以上のＲＮアーゼ阻害剤を含む、請求項１２に記載の組成物。
16. 単鎖ＲＮＡキャッピング酵素が、
    （ａ）（ｘ）配列番号２、（ｙ）配列番号３及び／若しくは（ｚ）配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；又は
    （ｂ）（ｘ）配列番号５及び／若しくは（ｙ）配列番号６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
    を含む、請求項１３～１５のいずれかに記載の組成物。
17. 単鎖ＲＮＡキャッピング酵素が、（ａ）配列番号７、（ｂ）配列番号８、（ｃ）配列番号９、（ｄ）配列番号１０、（ｅ）配列番号１１又は（ｆ）配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３～１６のいずれかに記載の組成物。
18. ＲＮＡを転写するための、ＤＮＡ鋳型、バクテリオファージポリメラーゼ及びリボヌクレオチド三リン酸をさらに含む、請求項１３～１７のいずれかに記載の組成物。
19. 任意選択的に（ｖｉ）Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）及び（ｖｉｉ）キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼ酵素を含む、請求項１３～１８のいずれかに記載の組成物。
20. キャッピングされていない標的ＲＮＡが、１つ以上のシュードウリジンを含む、請求項１３～１９のいずれかに記載の組成物。
21. 保管用緩衝剤中に存在する、ＲＮＡトリホスファターゼ（ＴＰアーゼ）活性、グアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴアーゼ）活性及びグアニン－Ｎ７メチルトランスフェラーゼ（Ｎ７ ＭＴアーゼ）活性を有する単鎖ＲＮＡキャッピング酵素；及び
    反応緩衝剤
    を含むキット。
22. 標的ＲＮＡをコードする鋳型ポリヌクレオチドを転写するための、バクテリオファージポリメラーゼ及びリボヌクレオチドをさらに含む、請求項２０に記載のキット。
23. Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、キャップ２’Ｏメチルトランスフェラーゼ酵素（２’ＯＭＴアーゼ）、又はＳＡＭ及び２’ＯＭＴアーゼの両方をさらに含む、請求項２１又は２２に記載のキット。
24. 単鎖ＲＮＡキャッピング酵素が、
    （ａ）（ｘ）配列番号２、（ｙ）配列番号３及び／若しくは（ｚ）配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；又は
    （ｂ）（ｘ）配列番号５及び／若しくは（ｙ）配列番号６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
    を含む、請求項２０～２３のいずれかに記載のキット。
25. 単鎖ＲＮＡキャッピング酵素が、（ａ）配列番号７、（ｂ）配列番号８、（ｃ）配列番号９、（ｄ）配列番号１０、（ｅ）配列番号１１又は（ｆ）配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２０～２３のいずれかに記載のキット。
26. 配列番号２０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＲＮＡキャッピング酵素。
27. （ａ）配列番号７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列及び（ｂ）配列番号２０の１４１９～１５８７位と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＲＮＡキャッピング酵素融合体。

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