JP2022537340A - 固体の共晶抽出 - Google Patents

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Abstract

本発明は、以下に関する：深共晶溶媒（ＤＥＳ）をハイドロトロピック剤として使用した生物学的抽出物を調製するための方法および使用、深共晶溶媒（ＤＥＳ）をハイドロトロピック剤として使用して形成された生物学的抽出物を精製するための方法、前記方法および使用を用いて得られた生物学的抽出物、および、生物学的抽出物の、食品、フレーバーおよびフレグランス、医薬品、化粧品、栄養補助食品およびサプリメント（食品サプリメントおよびスポーツ用サプリメント等）などにおける使用。

Description

本発明は以下に関する：深共晶溶媒（ＤＥＳ）をハイドロトロピック剤として使用した生物学的抽出物を調製するための方法および使用、深共晶溶媒（ＤＥＳ）をハイドロトロピック剤として使用して形成された生物学的抽出物を精製するための方法、前記方法および使用を用いて得られた生物学的抽出物、および、生物学的抽出物の、食品、フレーバーおよびフレグランス、医薬品、化粧品、栄養補助食品およびサプリメント（食品サプリメントおよびスポーツ用サプリメント等）などにおける使用。
植物材料に存在するもの等の天然分子は、多種多様な液体有機溶媒、例えばアルコール、アセトンまたはヘキサンなどにより抽出、可溶化、および／または安定化可能であるが、しかしこれらの溶媒は主に石油由来であり、環境に有害な揮発性有機化合物を放出するという固有の問題がある。
超臨界流体、主に二酸化炭素もこの目的に使用することができるが、これらは、産業レベルでは多くの場合に費用効果が低い。
水は、一般に再生可能であると考えられている天然溶剤である。しかし、その高い極性は、抽出される分子のプロファイルを大幅に制限する。典型的には、親油性／非水溶性分子の抽出は容易ではない。
したがって、既存の抽出方法を改善して、親油性／非水溶性活性化合物の比率が異なる改善された品質の生物学的抽出物を調製すると共に、揮発性有機化合物の排出を減らすことによってかかる方法の環境への影響を低減する必要がある。
ハイドロトロピック剤は水溶性有機化合物であり、「ＭＨＣ」（最小ハイドロトロピック濃度）として知られる特定の濃度以上で、通常の条件下では水にほとんど溶けない有機化合物の溶解度を大幅に向上させる。
最小ハイドロトロピック濃度（ＭＨＣ）は、ハイドロトロープが凝集体を形成し始めた時およびその後の濃度であり、すなわち、化合物を希釈した場合に観察されるものとは異なり、かつハイドロトロピック挙動とは異なる物理的特性を持つ、新しい微小環境である。
ＭＨＣは、表面張力、導電率、動的および静的光散乱の測定などのいくつかの物理化学的方法を使用して（RE, Coffman, DO, Kildsig, Self-association of nicotinamide in aqueous solution: Light-scattering and vapor pressure osmometry studies (1996) 85(8): 848-853）、または親油性化合物の可溶化曲線をプロットすることによって（可溶化溶質の含有量に対するハイドロトロープ濃度）、決定することができる。スーダンレッド（Sudan red）またはジスパースレッド１３（disperse red 13）という、分光光度法で簡単に分析できる２つの親油性色素を、参照として使用することができる。
「ハイドロトロピー」という用語はCarl A. Neuberg（C. Neuberg, Hydrotropic phenomena, Biochem. Z. 76 (1916) 107）によって新造され、「ハイドロトロープ」または「ハイドロトロピック剤」と呼ばれる特定の両親媒性分子構造の、水中に存在する場合に難溶性化合物の水溶性を高める能力を説明する。
ハイドロトロープは典型的には両親媒性であり、イオン性（アニオン性、カチオン性、双性イオン性）または非イオン性であり得て（レゾルシノール、ニコチンアミド、アルキルポリグリコシドなど）、様々な構造、例えば芳香族、脂肪族、または環状などを有し得る。
それらはミセルのようなコロイドを形成しないが、溶質と非共有相互作用を形成することによって溶解度を改善すると考えられている（V. Kumar, C. Raja, C. Jayakumar, A review on solubility enhancement using hydrotropic phenomena, Int. J. Pharm. Pharm. Sci. 6 (2014) 1-7）。
ハイドロトロピック分子は、π－πまたは引力双極子－双極子相互作用などのファンデルワールス相互作用を介して、水溶液中に難溶性の分子と相互作用すると考えられている（M. Neumann, C. Schmitt, K. Prieto, et al., The photo physical determination of the minimum hydrotrope concentration of aromatic hydrotropes, J. Colloid. Interface. Sci. 315 (2007) 810-813）。
ハイドロトロープは典型的に、その中に疎水性画分と親水性画分の両方を含有する。界面活性剤と比較すると、それらは非常に小さな疎水性画分のみを含有する（N. Kapadiya, I. Singhvi, K. Mehta, K. Gauri, D. Sen, Hydrotropy: a promising tool for solubility enhancement: a review, Int. J. Drug Dev. Res. 3 (2011) 26-33）。
近年、少なくとも２つの成分の結合によって形成される新しいクラスの溶媒が、従来の溶媒の代替として出現した（Welton T. Room-temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis. Chem. Rev. 1999, 99, 2071-2084; Smith EL, AP Abbott, KS Ryder. Deep Eutectic Solvents (DESs) and their applications. Chem. Rev. 2014, 114, 11060-11082）。これらの新しい溶媒は、深共晶溶媒（ＤＥＳ）として知られている。
ＤＥＳは、単離されたその成分の融点よりもはるかに低い融点を有する化合物の混合物である。その名称は、１８８４年に英国の医師Guthrieによって初めて使用された「簡単に溶ける」を意味するギリシャ語の「eutektis」に由来する。Abbott et al.によりEP 1324979において、共晶混合物の形成による融点の低下は分子間水素結合の確立に起因すると記載されたこの現象は、化学種間の空間の体積を増加させ、それによってその移動度を増加させて、液体またはより低い粘性となるようにする効果がある。
しかし、ＤＥＳの一般的な欠点の１つは、粘度が比較的高いために、抽出および配合溶媒または合成用の反応媒体としての使用が妨げられることである。実際、それらの高粘度は、化学種の物質移動を妨げるだけでなく、取り扱いの困難さにもつながる（例えば、濾過、デカンテーション、および溶解）。さらに、それらの分解点が一般にそれらの沸点（もしあれば）より前に到達されるという事実のために、抽出物または配合物からのその除去は、蒸留または真空蒸発などの費用効果の高い技術では不可能である。
本明細書における明らかに以前に公開された文書のリストまたは議論は、必ずしもその文書が最先端または一般的な知識の一部であることの承認として解釈されるべきではない。
生物学的抽出物を提供する方法
本発明者らは、驚くべきことに、そして予想外に、親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物を含む固体の生物学的抽出物が、生物学的材料（植物の生物学的材料、藻類の生物学的材料、動物の生物学的材料および／または原核生物の生物学的材料など）を、水およびＤＥＳを含む抽出溶液と組み合わせる／混合することによって得ることができることを見出した。
本発明は、以下を含む、固体の生物学的抽出物を提供するための方法を提供する：
ｉ）生物学的材料（植物の生物学的材料、藻類の生物学的材料、動物の生物学的材料および／または原核生物の生物学的材料など）を、水およびＤＥＳを含む抽出溶液と混合すること；
ｉｉ）未溶解の生物学的材料を、（ｉ）で得られた溶液から除去すること；
ｉｉｉ）凝集塊および／または沈殿物を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に水を加えることおよび／または冷却することにより、得ること；
ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた固形物を、溶液から収集すること；および
ｖ）任意に、ステップ（ｉｖ）で得られた固形物を乾燥すること。
以下では、この方法を本発明の方法と呼ぶ。
本発明の方法の特定の態様において、ステップｉ）において抽出溶液は、ＤＥＳおよび約０．５％未満の水、約０．１未満、約０．０１、０．００１、０．０００１未満または約０．００００１％未満の水を含む。
本発明の方法の特定の態様において、ステップｉ）において、ＤＥＳを含む抽出溶液は、水を含まない。
したがって特定の態様において、以下を含む、固体の生物学的抽出物を提供するための方法が提供される：
ｉ）生物学的材料（植物の生物学的材料、藻類の生物学的材料、動物の生物学的材料および／または原核生物の生物学的材料など）を、ＤＥＳを含む抽出溶液と混合すること；
ｉｉ）未溶解の生物学的材料を、（ｉ）で得られた溶液から除去すること；
ｉｉｉ）凝集塊および／または沈殿物を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に水を加えることおよび／または冷却することにより、得ること；
ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた固形物を、溶液から収集すること；および
ｖ）任意に、ステップ（ｉｖ）で得られた固形物を乾燥すること、
ここで、ステップｉ）の溶液は水を含まない。
本発明はまた、生物学的材料（植物の生物学的材料、藻類の生物学的材料、動物の生物学的材料および／または原核生物の生物学的材料など）から固体の生物学的抽出物を提供するための、水およびＤＥＳを含む抽出溶液の使用を提供し、ここで該使用は、以下を含む：
ｉ）生物学的材料（植物の生物学的材料、藻類の生物学的材料、動物の生物学的材料および／または原核生物の生物学的材料など）を、水およびＤＥＳを含む抽出溶液と混合すること；
ｉｉ）未溶解の生物学的材料を、（ｉ）で得られた溶液から除去すること；
ｉｉｉ）凝集塊および／または沈殿物を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に水を加えることおよび／または冷却することにより、得ること；
ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた固形物を、溶液から収集すること；および
ｖ）任意に、ステップ（ｉｖ）で得られた固形物を乾燥すること。
この使用を、以下において本発明の使用と呼ぶ。
本発明の使用の特定の態様において、ステップｉ）において、抽出溶液は、ＤＥＳおよび約０．５％未満の水、約０．１未満、約０．０１、０．００１、０．０００１未満または約０．００００１％未満の水を含む。
本発明の使用の特定の態様において、ステップｉ）において、ＤＥＳを含む抽出溶液は水を含まない。
本明細書に記載の方法および使用において、抽出溶媒は、水およびＤＥＳを含み得るか、それらからなり得るか、またはそれらから本質的になり得る。
本発明の方法および使用の特定の態様において、ステップｉ）において、抽出溶液は、ＤＥＳおよび約０．５％未満の水、約０．１未満の水、約０．０１、０．００１、０．０００１未満または約０．００００１％未満の水を含む。
任意に、抽出溶媒または溶液は、ＤＥＳを含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得、および前記溶液は、水を含まない、すなわち実質的に水を含まない。本明細書で使用する場合、用語「実質的に含まない」は、記載される抽出物が低濃度の水（例えば、抽出物の最大で０．１重量％または０．０１重量％または０．００１重量％または０．０００１重量％までの水）を含み得ることを意味する。
生物学的抽出物が、ステップ（ｉ）から（ｖ）を含む本明細書に記載の方法または使用を用いて得られる場合、生物学的抽出物は、例えば粗製固体または半固体の生物学的抽出物であると見なされ得る。
本明細書で使用する場合、用語「固体の生物学的抽出物」は、生物学的抽出物の少なくとも５０重量％、例えば少なくとも７５重量％または少なくとも９０重量％または９９重量％が、閉じ込められていない場合にその形状と密度を保持する物質の形態であることを意味することを意図している。
本明細書で使用する場合、用語「水およびＤＥＳを含む抽出溶液または溶媒」は、ＤＥＳの最小ハイドロトロピック濃度（ＭＨＣ）以上の濃度でＤＥＳを含有する水溶液を意味することを意図している。
本明細書で使用する「ＤＥＳを含む抽出溶媒または溶液は水を含まない」という用語は、ＤＥＳの最小ハイドロトロピック濃度（ＭＨＣ）以上の濃度でＤＥＳを含有する溶液であって、ここで溶液が水を実質的に含まないものを意味することを意図している。
本明細書で使用する場合、用語「最小ハイドロトロピック濃度（ＭＨＣ）」とは、その濃度を超えるとハイドロトロープが親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性である化合物を可溶化し始める、ハイドロトロープの臨界濃度である。ＭＨＣは、表面張力、導電率、動的および静的光散乱の測定などの、いくつかの物理化学的方法を使用して（RE, Coffman, DO Kildsig, Self-association of nicotinamide in aqueous solution: Light-scattering and vapor pressure osmometry studies (1996) 85(8): 848-853）、または親油性化合物の可溶化曲線（可溶化溶質の含有量に対するハイドロトロープ濃度）をプロットすることによって、決定することができる。分光光度法で簡単に分析できる親油性色素であるジスパースレッド１３を、参照として使用することができる。
本明細書で使用する場合、用語「植物の生物学的材料」は、植物の根および／または植物の地上部分から、例えば葉、花、茎、樹皮、果実または種子またはそれらの組織などから得られたかまたは得ることができる、材料である。例えば植物の生物学的材料は、植物の葉から得ることができる。
本明細書で使用する場合、用語「藻類の生物学的材料」は、大型藻類または微細藻類源から、例えば海藻、淡水藻類、または真核生物の単一細胞微細藻類生物の培養集団などから得られたかまたは得ることができる、材料である。
本明細書で使用する場合、用語「動物の生物学的材料」は、動物源から、例えばムスクなどの哺乳動物の腺からの分泌物などから得られたかまたは得ることができる、材料である。
本明細書で使用する場合、用語「原核生物の生物学的材料」いう用語は、細菌などの単細胞生物から得られたかまたは得ることができる、材料である。
当業者によって理解されるように、本明細書で使用する「から得ることができる」という用語は、植物および／または藻類および／または動物および／または原核生物の生物学的材料が、植物／藻類／動物／原核生物から直接得ることができる、または植物／藻類／動物／原核生物から単離することができる、または例えば化学合成または酵素的生産によって代替の供給源から得ることができることを意味する。一方で、本明細書で使用する「得られた」という用語は、抽出物が、植物／藻類／動物／原核生物の供給源に直接由来することを意味する。
本明細書で使用する場合、用語「液体」は、液体内の原子または分子が互いに接触したまま自由に移動でき、その容器の形をとるような物質の状態を意味する。典型的には液体は、粘度として２０℃で約１ｃＰ～２０℃で約１０，０００ｃＰ、例えば２０℃で約５０ｃＰ～２０℃で約５，０００ｃＰを有するであろう。
ＤＥＳが抽出溶液中に存在するため、本明細書に記載の方法または使用によって得られる生物学的抽出物は、水溶液への溶解度が限られている化合物、すなわち親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性の化合物に富む。
したがって、本発明はまた、親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物を、生物学的材料（植物の生物学的材料、藻類の生物学的材料、動物の生物学的材料および／または原核生物の生物学的材料など）から提供する方法を提供し、これは以下を含む：
ｉ）生物学的材料（植物の生物学的材料、藻類の生物学的材料、動物の生物学的材料および／または原核生物の生物学的材料など）を、水およびＤＥＳを含む抽出溶液と混合すること；
ｉｉ）未溶解の生物学的材料を、（ｉ）で得られた溶液から除去すること；
ｉｉｉ）凝集塊および／または沈殿物を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に水を加えることおよび／または冷却することにより、得ること；
ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた固形物を、溶液から収集すること；および
ｖ）任意に、ステップ（ｉｖ）で得られた固形物を乾燥すること。
本発明の方法の特定の態様において、ステップｉ）において、ＤＥＳを含む抽出溶液は水を含まない。本発明の方法の特定の態様において、ステップｉ）において、抽出溶液は、ＤＥＳおよび、約０．５％未満の水、および約０．１未満、約０．０１、０．００１、０．０００１未満または約０．００００１％未満を含む。
本発明はまた、水およびＤＥＳを含む抽出溶液の、親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物を生物学的材料（植物の生物学的材料、藻類の生物学的材料、動物の生物学的材料および／または原核生物の生物学的材料など）から提供するための使用を提供し、ここで使用は、以下を含む：
ｉ）生物学的材料（植物の生物学的材料、藻類の生物学的材料、動物の生物学的材料および／または原核生物の生物学的材料など）を、水およびＤＥＳを含む抽出溶液と混合すること；
ｉｉ）未溶解の生物学的材料を、（ｉ）で得られた溶液から除去すること；
ｉｉｉ）凝集塊および／または沈殿物を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に水を加えることおよび／または冷却することにより、得ること；
ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた固形物を、溶液から収集すること；および
ｖ）任意に、ステップ（ｉｖ）で得られた固形物を乾燥すること。
特定の態様において、ステップｉ）において抽出溶液は、ＤＥＳおよび約０．５％未満の水、約０．１未満、約０．０１、０．００１、０．０００１未満または約０．００００１％未満の水を含む。
特定の態様において、ステップｉ）において、ＤＥＳを含む抽出溶液は、水を含まない。
本明細書で使用する場合、用語「富む（enriched）」とは、生物学的抽出物が、約０．０５重量％以上の、水溶液への溶解度が制限される抽出物化合物、すなわち親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性である化合物を含むことを意味する。
例えば、粗製固体または半固体の生物学的抽出物は、水溶液への溶解度が制限されている化合物、すなわち親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性の化合物の抽出物を、約２重量％以上、約５重量％以上、約１０重量％以上、約２０重量％以上、または約４０重量％以上を含み得る；すなわち、生物学的粗製抽出物は、水溶液への溶解度が制限されている化合物、すなわち、親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性である化合物の抽出物を、約２重量％～約６０重量％、または、水溶液への溶解度が制限されている化合物、すなわち、親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性である化合物の抽出物を、約５重量％～約４０重量％、含み得る。
本明細書で使用する場合、用語「親油性」とは、化合物が脂肪、油、脂質、およびヘキサンまたはトルエンなどの無極性溶媒に溶解できることを意味する。例えば、化合物の少なくとも約９０％は、脂肪、油、脂質、およびヘキサンまたはトルエンなどの無極性溶媒に溶解することができ、または少なくとも約９５％または少なくとも約９９％または約１００％が、溶解することができる。
本明細書で使用する場合、用語「非水溶性」は、化合物が、２０℃で約１ｇ／Ｌ未満、例えば約０．５ｇ／Ｌ未満等の、水への溶解度を有することを意味する。例えば、水への約０．００１ｇ／Ｌ～約１ｇ／Ｌの溶解度は、水に実質的に不溶性である。
本明細書で使用する場合、用語「疎水性」は、化合物が非常に低い水への溶解度を有することを意味する。例えば、化合物は、２０℃で１ｇ／Ｌ未満、例えば０．５ｇ／Ｌ未満の水への溶解度を有する。例えば、約０．００１ｇ／Ｌ～約１ｇ／Ｌの水への溶解度は、水に実質的に不溶性である。
本明細書で使用する場合、用語「油溶性」は、化合物が油への高い溶解度を有することを意味する。例えば、化合物は、約５ｇ／Ｌ以上、例えば約１０ｇ／Ｌ以上または約２０ｇ／Ｌ以上の、油への溶解度を有する。
水溶液への溶解度が制限されている化合物、すなわち、本発明の生物学的抽出物に存在し得る親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性である化合物としては、限定はされないが、以下が挙げられる：生物学的材料（すなわち、植物および／または藻類および／またはおよび／または動物および／または原核生物の生物学的材料）からの、以下を包含するフェノール化合物：フェノール酸（サリチル酸、ロスマリン酸またはカフェー酸など）、フェノール性エステル、フェノール性ジテルペン（カルノシン酸およびその誘導体など）、フラボノイド（ヘスペリジンまたはルテオリングルクロニドなど）、セコイリドイド、クルクミノイド（クルクミン、デメトキシクルクミンまたはビスデメトキシクルクミンおよびその誘導体など）、ビキシン、カプサイシノイド、カンナビノイド、ピラノアントシアニン、スチルベン、フェノールアルコール、フェノール脂質（ショウガオールまたはユビキノールなど）、シリマリン、アルカロイド、脂質、フェニルプロパノイド、クマリン（ジメトキシクマリンなど）、有機酸（リンゴ酸または酒石酸など）、以下を包含するテルペノイド：モノテルペノイド、セスキテルペノイド（ターメロン、クルクマジオン、プロクルクマジオールまたはデヒドロクルジオンなど）、ジテルペノイド（カルノシン酸またはヒドロキシクリプトタンシノンなど）、サポニン、リグナン、アントラキノン、グルコシノラート、スルフォラファンおよびイソチオシアナート、トリテルペノイド（ウルソール酸など）、サポゲニンまたはカロテノイド、およびそれらの混合物。例えば、生物学的抽出物は、上に列挙された化合物の１つ以上またはそれらの混合物を含み得る。
これらの化合物は、典型的には、天然の生物学的フレーバー剤、および味覚修飾剤、甘味料、フレグランス、殺虫剤、抗微生物剤（antimicrobial）、タンパク質、酵素、着色料、色素、界面活性剤、抗酸化剤、キレート剤、乳化剤、テクスチャライザー、ビタミン、および／または栄養、化粧品または医薬的関心のある生物活性化合物であり得る。
本発明の方法で使用される生物学的材料（すなわち、植物および／または藻類および／または動物および／または原核生物の生物学的材料）は、生物学的材料からの流体などの液体形態、すなわち、植物または果物からのジュースであり得る。代替的に生物学的材料は、新鮮なまたは乾燥した生物学的材料などの固体の形態であり得、これは任意に、粉砕および／またはすり潰された生物学的材料、すなわち、生物学的材料から得られたかまたは得ることができる、粉砕またはすり潰された材料であり得る。
生物学的材料は、好ましくは植物の生物学的材料である。植物の生物学的材料は、植物の根および／または植物の地上部分から、例えば葉、花、茎、樹皮、皮（peel）、果実および／または種子、またはそれらの組織（果実の外皮（rind）など）など、またはそれらの混合物から得られたかまたは得ることができる。例えば、植物の生物学的材料は、植物の葉、根、または果実の外皮であり得る。
植物の生物学的材料は、シソ科（バジル、ミント、ローズマリー、セージ、セイボリー、マジョラム、オレガノ、ヒソップ、タイム、ラベンダー、エゴマおよびそれらの混合物など）から、得られたかまたは得ることができる。例えば、植物の生物学的材料は、ローズマリーおよび／またはセージであり得る。植物の生物学的材料はまた、以下から得られたかまたは得ることができる：柑橘類属（C. sinensis、C. medica、C. reticulateなど）、ウコン属（Curcuma longaなど）、ショウガ（Zingiber officinale）、サクラ属（P. africana, P. armenicana, P. dulcis, P. aviumなど）、（桜の花など）、Gardenia jasminoides（ガーデニアフルーツなど）、イワヒバ（Sellaginella）属、Olea europaea（オリーブの葉など）、トクサ、クリスマム（シーフェンネル）、エリコノバラ、サフランの花、Jambuの花、ラヴァンデュラ属（Lavandula x intermedia、Lavandula angustifolia、Lavandula latifoliaなど）、オオアザミ（Silybum marianum）、緑茶、グリーンコーヒー、クローブの葉、ザクロ、籾殻など。
生物学的材料がローズマリーおよび／またはセージなどの植物材料である場合、本発明の方法を使用して得られる生物学的抽出物は、生物学的材料中に存在するカルノシン酸および／またはその誘導体および／または他の親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物に富むことができる。例えば、生物学的抽出物は、以下に富むことができる：カルノシン酸、１２－メトキシカルノシン酸、カルノソール、ロスマリン酸、パルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２－ｎ６）、リノレン酸（１８：３－ｎ３）、グルコン酸、リンゴ酸、酒石酸、サリチル酸、カフェー酸、ネピトリン、ウルソール酸、アピゲニン、ルテオリングルクロニド、ルテオリン－Ｏ－（Ｏ－アセチル）グルクロニド異性体、ジオスメチン、ヒスピズリン（Hispidulin）、シルシマリチン、クロロフィル色素、スクテラレイン、ネペチン、ジメトキシクマリン、ラムナジン、ロスマノール、エピロスマノール、エピイソロスマノール、ヒドロキシクリプトタンシノン、ジンゲロール、エピロスマノールメチルエーテルおよびその異性体、ユビキノール、パラミルチオイック酸（para-miltioic acid）、ロスマジアール、ロスマリジフェノール、Ｏ－メチルカルノソール、ゲンクワニン、テトラヒドロヒドロキシロスマキノン、ショウガオールおよびそれらの混合物。
生物学的材料がウコンなどの植物材料である場合、本発明の方法を使用して得られる生物学的抽出物は、生物学的材料中に存在する、クルクミンおよび／またはその誘導体および／または他の親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物に富むことができる。例えば、生物学的抽出物は、以下に富むことができる：Ａｒ－ターメロン、クルクミン、ジヒドロクルクミン、デメトキシクルクミン、デヒドロデメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミン、デヒドロビスデメトキシクルクミン、クルクマジオン、プロクルクマジオール、デヒドロクルジオン、デオキシビスデメトキシクルクミン、デオキシデヒドロビスデメトキシクルクミン、Ｏ－デメチルデメトキシクルクミンおよびそれらの混合物。
生物学的材料が植物材料である場合、本発明の方法を使用して得られる生物学的抽出物は、生物学的材料中に存在する親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物に富むことができ、これは例えば以下である：シソ科（バジル、ミント、ローズマリー、セージ、セイボリー、マジョラム、オレガノ、ヒソップ、タイム、ラベンダー、エゴマおよびそれらの混合物など）、柑橘類属（C. sinensis、C. medica、C. reticulateなど）、ウコン属（Curcuma longaなど）、ショウガ（Zingiber officinale）、サクラ属（P. africana, P. armenicana, P. dulcis, P. aviumなど）、（桜の花など）、Gardenia jasminoides（ガーデニアフルーツなど）、イワヒバ（Sellaginella）属、Olea europaea（オリーブの葉など）、トクサ、クリスマム（シーフェンネル）、エリコノバラ、サフランの花、Jambuの花、ラヴァンデュラ属（Lavandula x intermedia, Lavandula angustifolia, Lavandula latifoliaなど）、オオアザミ（Silybum marianum）、緑茶、グリーンコーヒー、クローブの葉、ザクロ、籾殻など。
例えば、生物学的抽出物が、ステップ（ｉ）から（ｖ）を含む本明細書で定義される方法または使用によって提供される固体の生物学的抽出物である場合、抽出物は、少なくとも約２重量％の、カルノシン酸、ヘスペリジン、クルクミン、クルクミノイド、またはビキシンおよび／またはそれらの誘導体の抽出物、例えば、少なくとも約５重量％または約１０重量％の、カルノシン酸、ヘスペリジン、クルクミン、クルクミノイド、またはビキシンおよび／またはそれらの誘導体の乾燥固体または半固体抽出物を、含み得る。
本明細書で定義される方法または使用において、ＤＥＳは、メチルアミン、有機酸、糖、ポリオール、アミノ酸および尿素から選択される少なくとも２つの化合物から得ることができる。前述のように、本明細書で定義される方法または使用において、ＤＥＳは、水有りまたは水無しで配合され得る（例えば、本質的に水を含まないＤＥＳを含む溶液など）。
本明細書に記載の方法および使用において用いられるＤＥＳを提供するために使用し得るメチルアミンは、Ｎ－トリメチルアミンオキシド（ＴＭＡＯ）、ベタイン、グリセロホスホコリン、カルニチン、ホマリン、塩化コリン、ジメチルスルホノプロピオナート（ＤＭＳＰ）を包含するメチルスルホニウム溶質およびそれらの誘導体、例えば、ベタインハライド（ベタインＨＣｌ）などのそれらのハライド形態から、選択することができる。
本明細書に記載の方法および使用において用いられるＤＥＳを提供するために使用し得る有機酸は、以下から選択することができる：レブリン酸、乳酸、リンゴ酸、マレイン酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、クエン酸、シトラコン酸、グルタル酸、グリコール酸、酢酸、アコニチン酸、酒石酸、アスコルビン酸、マロン酸、シュウ酸、グルクロン酸、ノイラミン酸、シアル酸、シキミン酸、フィチン酸、ガラクツロン酸、イズロン酸、ヒアルロン酸、ヒドロキシクエン酸、ラクトン誘導体およびそれらの誘導体。
本明細書に記載の方法および使用において用いられるＤＥＳを提供するために使用し得る糖は、トレハロース、グルコース、スクロース、ラクトース、リボース、ガラクトース、フルクトースなどおよびそれらの誘導体から選択することができる。
本明細書に記載の方法および使用において用いられるＤＥＳを提供するために使用し得るポリオールは、グリセロール、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、リビトール、アルドニトール、プロパンジオール、イノシトール、ペンチレングリコール、およびそれらの誘導体（ｏ－メチル－イノシトールなど）から選択することができる。
本明細書に記載の方法および使用において用いられるＤＥＳを提供するために使用し得るアミノ酸は、グリシン、プロリン、タウリン、リシンなどおよびそれらの誘導体（例えば、エクトイン、サルコシン、テアニン、ジメチルグリシンなど）から選択することができる。
誤解を避けるために、本明細書に記載の方法および使用において用いられるＤＥＳは、メチルアミン、有機酸、糖、ポリオール、アミノ酸および尿素、ならびにそれらの組み合わせから選択される少なくとも２つの化合物から得ることができる（すなわち、１つ以上のメチルアミン；１つ以上のメチルアミンと１つ以上の有機酸など）。
例えば、本明細書に記載の方法および使用において用いられるＤＥＳは、ベタインと尿素、または塩化コリンと尿素を含むか、またはそれらからなるか、または本質的にそれらからなり得る。
別の態様において、本明細書に記載の方法および使用において用いられるＤＥＳは、グリセロールとベタイン、またはグリセロールと塩化コリンを含むか、またはそれらからなるか、または本質的にそれらからなり得る。
別の態様において、本明細書に記載の方法および使用において用いられるＤＥＳは、リンゴ酸と塩化コリンを含むか、またはそれらからなるか、または本質的にそれらからなることができる。
別の態様において、本明細書に記載の方法および使用において用いられるＤＥＳは、乳酸とベタイン、またはレブリン酸とベタインを含むか、またはそれらからなるか、または本質的にそれらからなり得る。
別の態様において、本明細書に記載の方法および使用において用いられるＤＥＳは、ピルビン酸とベタイン、またはソルビトールとベタインを含むか、またはそれらからなるか、または本質的にそれらからなり得る。別の態様において、本明細書に記載の方法および使用において用いられるＤＥＳは、尿素と塩化コリン、ソルビトールとレブリン酸、プロリンとレブリン酸、ベタインとレブリン酸、ベタインとプロリン、ベタインとグルコース、プロリンとグルコース、リシンとレブリン酸、グリセロールとソルビトール、グリセロールと乳酸、グルコースとレブリン酸、キシリトールとレブリン酸、ソルビトールと乳酸、尿素とベタインＨＣｌ、またはグリセロールとレブリン酸を含むか、またはそれらからなるか、または本質的にそれらからなり得る。
ＤＥＳに２つの成分が存在する場合、成分のモル比は約４：１～約１：４の範囲、例えば約２：１～約１：２または約１：１などであり得る。特に、２つの成分のモル比は、約１：０．５～約１：４であり得る。
前述のように、ＤＥＳは、メチルアミン、有機酸、糖、ポリオール、アミノ酸および尿素から選択される少なくとも２つの化合物から得ることができ、様々な組み合わせを作成できる。
ＤＥＳに３つの成分（有機酸、糖およびポリオールなど）が存在する場合、成分のモル比は約４：１：１～約１：４：４の範囲、または約１：４：１～約４：１：４、または約１：１：４～約４：４：１など、例えば約２：２：１～約１：１：２または約１：２：２または約１：１：１などであり得る。
例えば、本明細書に記載の方法および使用において用いられるＤＥＳは、ベタインと尿素、塩化コリンと尿素、グリセロールとベタイン、グリセロールと塩化コリン、リンゴ酸とコリン、乳酸とベタイン、またはレブリン酸とベタインを、約４：１～約１：４のモル比で、例えば約２：１～約１：２または約１：１などで含むか、またはそれらからなり得る。
例えば、本明細書に記載の方法および使用において用いられるＤＥＳは、ピルビン酸とベタイン、ソルビトールとベタイン、尿素と塩化コリン、ソルビトールとレブリン酸、プロリンとレブリン酸、ベタインとレブリン酸、ベタインとプロリン、ベタインとグルコース、プロリンとグルコース、リシンとレブリン酸、グリセロールとソルビトール、グリセロールと乳酸、グルコースとレブリン酸、キシリトールとレブリン酸、ソルビトールと乳酸、尿素とベタインＨＣｌ、またはグリセロールとレブリン酸を、約４：１～約１：４のモル比で、例えば約２：１～約１：２または約１：１などで含むか、またはそれらからなるか、またはそれらから本質的になり得る。
ＤＥＳは、商業的供給源から入手し、水に添加して抽出溶液を形成するか、またはＤＥＳを任意の既知の方法で個別に調製することができる。
代替的に、水およびＤＥＳを含む抽出溶液は、本明細書に記載の方法および使用の間に調製することができる。前に述べたように、ＤＥＳは水有りまたは水無しで配合することができる（例えば、ＤＥＳを含む溶液であって、溶液が本質的に水を含まないものなど）。後者の場合、ＤＥＳを含む溶液であって、溶液が水を含まないもの（本質的に水を含まないもの）は、他の成分、例えばエタノール、メタノールなどの他の溶媒を有し得る。
したがって本明細書に記載の方法および使用は、ステップ（ｉ）の前に、以下を含む、抽出溶液を調製するステップを含み得る：（ａ）メチルアミン、有機酸、糖、ポリオール、アミノ酸および尿素から選択される２つ以上の化合物を組み合わせて、ＤＥＳを形成すること；および（ｂ）（ａ）の生成物を水で希釈すること。本明細書に記載の方法および使用の特定の態様においては、ステップ（ｉ）の前に、以下を含む、抽出溶液を調製するステップを含み得る：（ａ）メチルアミン、有機酸、糖、ポリオール、アミノ酸および尿素から選択される２つ以上の化合物を組み合わせて、本質的に水を含まないＤＥＳを形成すること。
（ｂ）で形成されたＤＥＳの希釈に使用される水は０％～９０％であり、例えば約０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、３０または約４０％から、約９０、８０、７０、６０または約５０％までである。好ましい態様において、使用される水は約５％～約３０％、例えば約１０％、２０％、２５％、または約３０％である。
例えば、本明細書に記載の方法および使用は、ステップ（ｉ）の前に、以下のステップを含み得る：
（ａ）ベタインと尿素、または塩化コリンと尿素を、モル比１：２で組み合わせて、ＤＥＳを形成すること。
例えば、本明細書に記載の方法および使用は、ステップ（ｉ）の前に、以下のステップを含み得る：
（ａ）ベタインと尿素、または塩化コリンと尿素を、モル比１：２で組み合わせてＤＥＳを形成すること；および
（ｂ）（ａ）の生成物を水で希釈すること。
ＤＥＳのさらなる組み合わせは、以下であり得る：グリセロール：ベタイン（モル比２：１）、グリセロール：ベタイン（モル比１：１）、グリセロール：ベタイン（モル比１：２）、グリセロール：塩化コリン（モル比２：１）、グリセロール：塩化コリン（モル比１：１）、グリセロール：塩化コリン（モル比１：２）、リンゴ酸：塩化コリン（モル比１：１）、乳酸：ベタイン（モル比３：１）、乳酸：ベタイン（モル比２：１）、乳酸：ベタイン（モル比１：１）、レブリン酸：ベタイン（モル比３：１）、レブリン酸：ベタイン（モル比２：１）、レブリン酸：ベタイン（モル比２：１）、レブリン酸：ベタイン（モル比２：１）、レブリン酸：ベタイン（モル比２：１）、レブリン酸：ベタイン（モル比２：１）、ピルビン酸：ベタイン（２：１モル）、尿素：ベタイン（モル比２：１）、尿素：ベタイン（モル比１：１）、尿素：ベタインＨＣｌ（２：１モル）、尿素：塩化コリン（モル比２：１）、ベタイン：ソルビトール（モル比２：１）、ベタイン：ソルビトール（モル比１：１）、ベタイン：ソルビトール（モル比１：１）、ベタイン：ソルビトール（モル比１：１）、ベタイン：ソルビトール（モル比１：２）、ベタイン：ソルビトール（モル比１：２）、プロリン：レブリン酸（モル比１：１）、ベタイン：プロリン（モル比１：１）、ベタイン：プロリン（モル比１：２）、プロリン：グルコース（モル比３：１）、プロリン：グルコース（モル比２：１）、プロリン：グルコース（モル比１：１）、プロリン：グルコース（モル比１：１）、プロリン：グルコース（モル比１：２）、ベタイン：グルコース（モル比３：１）、ベタイン：グルコース（モル比２：１）、ベタイン：グルコース（モル比１：１）、ベタイン：グルコース（モル比１：２）、ベタイン：グルコース（モル比１：２）、リシン：レブリン酸（モル比１：１）、リシン：レブリン酸（モル比１：２）、ソルビトール：レブリン酸（モル比１：１）、ソルビトール：レブリン酸（モル比１：１）、キシリトール：レブリン酸（モル比１：１）、グルコース：レブリン酸（モル比１：１）、グルコース：レブリン酸（モル比１：２）、グリセロール：ソルビトール（モル比１：１）、グリセロール：乳酸（モル比１：１）、ソルビトール：乳酸（モル比１：１）、またはグリセロール：レブリン酸（モル比１：１）。
ＤＥＳおよび水のさらなる組み合わせは、以下であり得る：グリセロール：ベタイン（モル比２：１）＋３０％の水、グリセロール：ベタイン（モル比２：１）＋２５％の水、グリセロール：ベタイン（モル比２：１）＋２０％の水、グリセロール：ベタイン（モル比２：１）＋１０％の水、グリセロール：ベタイン（モル比１：１）＋２０％の水、グリセロール：ベタイン（モル比１：２）＋３０％の水、グリセロール：塩化コリン（モル比２：１）＋０％の水、グリセロール：塩化コリン（モル比１：１）＋１０％の水、グリセロール：塩化コリン（モル比１：２）＋２０％の水、リンゴ酸：塩化コリン（モル比１：１）＋３０％の水、リンゴ酸：塩化コリン（モル比１：１）＋２０％の水、乳酸：ベタイン（モル比３：１）＋１０％の水、乳酸：ベタイン（モル比２：１）＋３０％の水、乳酸：ベタイン（モル比２：１）＋２５％の水、乳酸：ベタイン（モル比２：１）＋２０％の水、乳酸：ベタイン（モル比２：１）＋１０％の水、乳酸：ベタイン（モル比２：１）＋５％の水、乳酸：ベタイン（モル比１：１）＋１０％の水、レブリン酸：ベタイン（モル比３：１）＋２５％の水、レブリン酸：ベタイン（モル比２：１）＋３０％の水、レブリン酸：ベタイン（モル比２：１）＋２５％の水、レブリン酸：ベタイン（モル比２：１）＋２０％の水、レブリン酸：ベタイン（モル比２：１）＋１０％の水、レブリン酸：ベタイン（モル比２：１）＋５％の水、ピルビン酸：ベタイン（２：１モル）＋２５％の水、水中９５０ｇ／Ｌでの尿素：ベタイン（２：１モル）、水中９５０ｇ／Ｌでの尿素：ベタイン（１：１モル）、０％の水での尿素：ベタインＨＣｌ（２：１モル）、０％の水での尿素：塩化コリン（２：１モル）、ベタイン：ソルビトール（２：１モル）＋３０％の水、ベタイン：ソルビトール（１：１モル）＋５０％の水、ベタイン：ソルビトール（１：１モル）＋３０％の水、ベタイン：ソルビトール（１：１モル）＋２０％の水、ベタイン：ソルビトール（１：２モル）＋５０％の水、ベタイン：ソルビトール（１：２モル）＋３０％の水、ベタイン：ソルビトール（１：２モル）＋２０％の水、プロリン：レブリン酸（モル比１：１）＋２０％の水、ベタイン：プロリン（モル比１：１）＋３０％の水、ベタイン：プロリン（モル比１：２）＋３０％の水、プロリン：グルコース（モル比３：１）＋２０％の水、プロリン：グルコース（モル比２：１）＋２０％の水、プロリン：グルコース（モル比１：１）＋２０％の水、プロリン：グルコース（モル比１：１）＋３０％の水、プロリン：グルコース（モル比１：２）＋２０％の水、ベタイン：グルコース（モル比３：１）＋２０％の水、ベタイン：グルコース（モル比２：１）＋２０％の水、ベタイン：グルコース（モル比１：１）＋２０％の水、ベタイン：グルコース（モル比１：２）＋５０％の水、ベタイン：グルコース（モル比１：２）＋３０％の水、ベタイン：グルコース（モル比１：２）＋２０％の水、リシン：レブリン酸（モル比１：１）＋２０％の水、リシン：レブリン酸（モル比１：２）＋２０％の水、ソルビトール：レブリン酸（モル比１：１）＋３０％の水、ソルビトール：レブリン酸（モル比１：１）＋２０％の水、キシリトール：レブリン酸（モル比１：１）＋２０％の水、グルコース：レブリン酸（モル比１：１）＋３０％の水、グルコース：レブリン酸（モル比１：２）＋３０％の水、グリセロール：ソルビトール（１：１モル比）＋２０％の水、グリセロール：乳酸（モル比１：１）＋２０％の水、ソルビトール：乳酸（モル比１：１）＋２０％の水、またはグリセロール：レブリン酸（モル比１：１）＋２０％の水。
ＤＥＳのハイドロトロープとしての使用は、予想外の驚くべきことであることに注意すべきである。
したがって本発明はまた、ＤＥＳのハイドロトロープとしての使用を提供する。
本発明の方法および使用において、驚くべきことにそして予想外に、メチルアミン、有機酸、糖、ポリオール、アミノ酸および尿素から選択される２つ以上の化合物の、約４：１～約１：４のモル比での、例えば約２：１～約１：２または約１：１などでの組み合わせが、相乗的なハイドロトロピック効果を提供することが見出されている。例えば、２つの成分のモル比が約１：０．５～約１：４である場合、化合物それ自体のハイドロトロピック効果と比較して、相乗的なハイドロトロピック効果が観察される。
例えば、本発明の方法は、以下を含むか、または以下からなることができる：
ｉ）植物の生物学的材料（例えば、シソ科の種の植物、例えばローズマリーおよび／またはセージから、または柑橘類属の植物、例えばC. sinensis、C. medica、C. reticulateなどから、またはショウガ科の植物、例えばCurcuma longaからの）を、水およびＤＥＳを含む抽出溶液と混合すること；および
ｉｉ）未溶解の植物の生物学的材料を、（ｉ）で得られた溶液から除去すること；ｉｉｉ）凝集塊および／または沈殿物を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に水を加えることおよび／または冷却することにより、得ること；
ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた固形物を、溶液から収集すること；および
ｖ）任意に、ステップ（ｉｖ）で得られた固形物を乾燥すること。
本発明の使用は、水およびＤＥＳを含む抽出溶液の、植物の生物学的材料（例えば、シソ科の種の植物、例えばローズマリーおよび／またはセージから、または柑橘類属の植物、例えばC. sinensis、C. medica、C. reticulateなどから、またはショウガ科の植物、例えばCurcuma longaからの）からの生物学的抽出物および／または親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物を提供するための使用を含み得て、ここで該使用は、以下を含む：
ｉ）植物の生物学的材料（ローズマリーおよび／またはセージおよび／またはCurcuma longa、および／またはCitrus sinensisなど）を、水およびＤＥＳを含む抽出溶液と混合すること；および
ｉｉ）未溶解の植物の生物学的材料を、（ｉ）で得られた溶液から除去すること；ｉｉｉ）凝集塊および／または沈殿物を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に水を加えることおよび／または冷却することにより、得ること；
ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた固形物を、溶液から収集すること；および
ｖ）任意に、ステップ（ｉｖ）で得られた固形物を乾燥すること。
抽出溶液中に存在するＤＥＳの濃度は、少なくともＤＥＳの最小ハイドロトロピック濃度（ＭＨＣ）である。例えば、最小ハイドロトロピック濃度（ＭＨＣ）の約１～約２０倍、例えば約２～約１６倍または約４～約８倍などである。
ＤＥＳは、抽出溶媒中に、抽出溶媒の重量に対して約９９重量％以下、例えば、９０重量％以下または８０重量％以下の濃度で存在し得る；例えば、ＤＥＳは、抽出溶媒中に、抽出溶媒の重量に対して約７０重量％以下または約６０重量％以下、または抽出溶媒の重量に対して約５０重量％以下、または媒抽出溶媒の重量に対して約４０重量％以下、または抽出溶媒の重量に対して約３０重量％以下、または抽出溶媒の重量に対して約２０重量％以下の濃度で存在し得る。
例えば、ＤＥＳは、抽出溶媒中に、抽出溶媒の約２重量％または約２．５重量％～約９９重量％、例えば、約５重量％～約９０重量％または約７．５重量％～約８０重量％；または抽出溶媒の重量に対して１０重量％～約７０重量％、または約１５重量％～約６０重量％の濃度で存在し得る。
ＤＥＳは、抽出溶媒中に、約１ｇ／Ｌ～約９９９ｇ／Ｌの濃度で存在し得る。
本発明の方法の特定の態様において、ステップｉ）において、抽出溶液は、ＤＥＳおよび約０．５％未満の水、約０．１未満、約０．０１、０．００１、０．０００１未満または約０．００００１％未満の水を含む。
本発明の方法または使用の特定の態様において、ステップｉ）において、ＤＥＳを含む抽出溶液は、水を含まない。
本発明の方法のステップ（ｉ）において、生物学的材料および、水およびＤＥＳを含む抽出溶液の混合は、当技術分野で知られている技術を使用して、例えば、攪拌、冷浸（maceration）、パーコレーションまたは注入、例えば磁気攪拌または機械的攪拌、押し出し、高せん断またはローターステーター支援抽出（rotor-stator-assisted extraction）（例えば、１０００～５０００ｒｐｍ）を使用して、実施することができる。
攪拌は、任意の適切な毎分回転数（ｒｐｍ）で行うことができ、例えば攪拌は、約１ｒｐｍまたは約１０ｒｐｍまたは約５０ｒｐｍから約５００ｒｐｍで行うことができる。機械的攪拌の場合、これは典型的には約１ｒｐｍ～５００ｒｐｍで、例えば約１０ｒｐｍ～約２００ｒｐｍなどで行うことができる。
本発明の方法のステップ（ｉ）において、生物学的材料を、水およびＤＥＳを含む抽出溶液、またはＤＥＳを含み水を含まない抽出溶液、またはＤＥＳと約０．５％未満の水、約０．１未満、約０．０１、０．００１、０．０００１未満または約０．００００１％未満の水とを含む抽出溶液と、約１５℃～約１００℃の温度で、例えば２０℃～約６０℃または約２０℃～約８０℃または約２５℃の温度で、混合することができる。
本発明の方法のステップ（ｉ）において、生物学的材料を、水およびＤＥＳを含む抽出溶液、またはＤＥＳを含み水を含まない抽出溶液、またはＤＥＳおよび約０．５％未満の水、約０．１未満、約０．０１、０．００１、０．０００１未満または約０．００００１％未満の水を含む抽出溶液と、約１０バール（１０００ＫＰａ）～約１０００バール（１０００００ＫＰａ）の圧力で、または約２０バール（２０００ＫＰａ）～約１００バール（１０００ＫＰａ）の圧力で、混合することができる。
本発明の方法のステップ（ｉ）において、生物学的材料を、水およびＤＥＳを含む抽出溶液、またはＤＥＳを含み水を含まない抽出溶液、またはＤＥＳおよび約０．５％未満の水、約０．１未満、約０．０１、０．００１、０．０００１未満または約０．００００１％未満の水を含む抽出溶液と、約１分から少なくとも約４８時間、少なくとも２４時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約５時間、例えば約５分～約１時間、または約５分～約３０分、混合することができる。
ステップ（ｉｉ）において、ステップ（ｉ）で得られた溶液中に存在する任意の固体の生物学的材料は、当技術分野で知られている任意の手段、例えば、濾過、静的または動的デカンテーション、および／または遠心分離によって除去することができる。
上記の方法または使用において、抽出溶媒は、生物学的材料（植物の生物学的材料、藻類の生物学的材料、動物の生物学的材料および／または原核生物の生物学的材料など）の親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％を、例えば、約１０％～約８０％、または約２０％～約６０％、または約２０％～約８０％を、回収することができる。
水溶液への溶解度が制限されている化合物、すなわち、本発明の生物学的抽出物に存在し得る親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性である化合物としては、限定はされないが、以下が挙げられる：生物学的材料（すなわち、植物および／または藻類および／またはおよび／または動物および／または原核生物の生物学的材料）からの、フェノール酸（サリチル酸、ロスマリン酸またはカフェー酸など）を含むフェノール化合物、フェノール性エステル、フェノール性ジテルペン（カルノシン酸およびその誘導体など）、フラボノイド（ヘスペリジンまたはルテオリングルクロニドなど）、セコイリドイド、クルクミノイド（クルクミンおよびその誘導体など）、セスキテルペノイド（ターメロン、クルクマジオン、プロクルクマジオールまたはデヒドロクルジオンなど）、ジテルペノイド（カルノシン酸またはヒドロキシクリプトタンシノンなど）、サポニン、リグナン、アントラキノン、グルコシノラート、スルフォラファンおよびイソチオシアナート、トリテルペノイド（ウルソール酸など）、サポゲニンまたはカロテノイド、およびそれらの混合物。例えば、生物学的抽出物は、上に列挙された化合物の１つ以上またはそれらの混合物を含み得る。
ステップ（ｉｉｉ）で添加された水は、ＤＥＳの濃度を最小ハイドロトロピック濃度（ＭＨＣ）近くかそれより下に低下させる。これを達成するために必要な水の量は、水溶液（または溶液）に存在するＤＥＳのＭＨＣ、および抽出溶媒に存在する少なくとも１つのハイドロトロピック剤の量に依存する。例えば、水を加えて、ＤＥＳの濃度を約２から約１０００、約１００、約５０、約４０、約３０、約２０倍に、例えば約２～約２０、例えば約３～約１０、例えば約５～９など、または約４～約６倍に、希釈することができる。例えば、ＤＥＳのＭＨＣが抽出溶媒の２０重量％であった場合、十分な水を添加して、ＤＥＳの濃度を抽出溶媒の２０重量％近くまたはそれより下に低下させる。
抽出溶液中のＤＥＳの濃度をＭＨＣの近くまたはそれより下に低下させると、ＤＥＳの存在によってのみ溶解する溶液中にある任意の化合物を、溶液から凝集および／または沈殿させる効果がある。その後、この固形物を収集することができる。
例えば、本発明の方法は、以下を含むか、または以下からなることができる：
ｉ）植物の生物学的材料（例えば、シソ科の種の植物、例えばローズマリーおよび／またはセージから、または柑橘類属の植物、例えばC. sinensis、C. medica、C. reticulateなどから、またはショウガ科の植物、例えばCurcuma longaからの）を、水（５０、３０、２５、２０、１０、０％など）およびＤＥＳ（例えば尿素とベタイン、グリセロールとベタイン、ピルビン酸とベタイン、塩化コリンと尿素、グリセロールと塩化コリン、リンゴ酸と塩化コリン、レブリン酸とベタイン、乳酸とベタイン、ソルビトールとレブリン酸、ベタインとソルビトール、プロリンとレブリン酸、ベタインとプロリン、ベタインとグルコース、プロリンとグルコース、リシンとレブリン酸、グリセロールとソルビトール、グリセロールと乳酸、グルコースとレブリン酸、キシリトールとレブリン酸、ソルビトールと乳酸、尿素とベタインＨＣｌ、またはグリセロールとレブリン酸を、モル比４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３または１：４にて）を含む抽出溶液と、混合すること；および
ｉｉ）未溶解の植物の生物学的材料を、（ｉ）で得られた溶液から除去すること；ｉｉｉ）凝集塊および／または沈殿物を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に水を加えることおよび／または冷却することにより、得ること；
ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた固形物を、溶液から収集すること；および
ｖ）任意に、ステップ（ｉｖ）で得られた固形物を乾燥すること、
ここで、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液にステップ（ｉｉｉ）で加えられた水は、ＤＥＳの体積またはステップ（ｉｉ）で得られた溶液の体積の約２から約１００倍、例えば約２～約３０、例えば約４～約８、例えば約８～約１０倍である。
特定の態様において、ステップｉ）において、ＤＥＳを含む抽出溶液は水を含まない。別の特定の態様において、ステップｉ）において、抽出溶液は、ＤＥＳおよび、約０．５％未満の水、約０．１未満、約０．０１、０．００１、０．０００１未満または約０．００００１％未満の水を含む。
凝集および／または沈殿する固形物は実質的に、生物学的材料に存在する親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物である化合物であって、これは、ＤＥＳの存在によってのみ溶解性である前記生物学的材料から、本発明の方法を使用して抽出される化合物である。
この凝集／沈殿により、本発明の方法を使用して得られた生物学的抽出物（すなわち、生物学的材料に存在する親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物）を収集することが可能となるが、これは、溶液から固体形態が生成されるからである。この固形物は、当技術分野で知られている技術を使用して非常に簡単に収集することができる。これにより、生物学的抽出物（すなわち、本発明の方法を使用して抽出される、生物学的材料に存在する親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物）の非常に簡単で費用効果が高く効率的な回復（recuperation）が可能となる。
ステップ（ｉｖ）において、固形物は、濾過、静的または動的デカンテーション、および／または遠心分離などの当技術分野で知られている技術を使用して収集され得る。
ステップ（ｖ）において、固形物は、以前に定義されたような当技術分野で知られている技術を使用して乾燥され得る。
粗製固体または半固体の生物学的抽出物は、上記で定義されているように通常は水溶液に溶解しない化合物に富んでおり、例えば、これらを抽出物の約２重量％以上、約４重量％以上、約５重量％以上または１０重量％以上または２０重量％以上で含む。例えば、生物学的材料が植物材料、例えばローズマリー、セージ、Curcuma longa、または柑橘類などである場合、粗製固体または半固体の生物学的抽出物は、フェノール性ジテルペン（例えば、上記で定義された生物学的材料に存在する、カルノシン酸、クルクミノイド、クルクミン、またはヘスペリジンおよび／またはその誘導体および／または他の親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物）に富んでおり、例えばこれらを、約２％以上、約４％以上、約５％以上または１０％以上または２０％以上含む。
例えば、本発明の方法は、以下を含むか、または以下からなることができる：
ｉ）植物の生物学的材料（例えば、シソ科の種の植物、例えばローズマリーおよび／またはセージから、または柑橘類属の植物、例えばC. sinensis、C. medica、C. reticulateなどから、またはショウガ科の植物、例えばCurcuma longaからの）を、水（５０、３０、２５、２０、１０、または０％など、または約０．５％未満の水、約０．１、０．０１、０．００１、０．０００１未満または約０．００００１％未満の水）およびＤＥＳを含む抽出溶液と、混合すること；
ｉｉ）未溶解の生物学的材料を、（ｉ）で得られた溶液から除去すること；
ｉｉｉ）凝集塊および／または沈殿物を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に水を加えることおよび／または冷却することにより、得ること；
ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた固形物を、溶液から収集すること；および
ｖ）任意に、ステップ（ｉｖ）で得られた固形物を乾燥すること。
ステップ（ｉｉｉ）において、水を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に任意の適切な速度で加えることができる。例えば水は、約０．０１ｍＬ／秒（例えば、滴下）から約５ｍＬ／秒以上の速度で加えることができる。
ステップ（ｉｉｉ）において、水は、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に任意の温度で加えることができる。例えば水は、約１５℃から約４０℃の温度、例えば約２０℃から約３０℃などで添加することができる。水は、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に、冷却しながら加えることができる。例えば、水は、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に、溶液が約０℃～約１０℃の温度に冷却されている間、例えば約２．５℃～約５℃に冷却されている間に加えることができ、または、約０℃～約１０℃の温度に、例えば約２．５℃～約５℃などに予冷された水を使用することができる。
ステップ（ｉｉｉ）において、水が一旦加えられると、溶液を攪拌して凝集／沈殿を誘発することができる。溶液は、任意の適切な速度で攪拌することができる。例えば溶液は、磁気攪拌を使用して約１３０ｒｐｍ～約５００ｒｐｍで、または機械的攪拌を使用して約１ｒｐｍ～約５００ｒｐｍで攪拌することができる。
本発明の一側面において、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液を冷却することで置き換えてもよく、固形物の溶液からの沈殿が引き起こされる（例えば、結晶化して溶液から分離する）。
ステップ（ｉｉｉ）が冷却に置き換えられる場合、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液の冷却は、約０℃～約１０℃の温度で、例えば約２．５℃～約５℃などで行うことができる。
本発明の方法は、ステップ（ｖｉ）をさらに含み得、ここでステップ（ｖｉ）において、粗製固体の生物学的抽出物は、約１から約３回以上、例えば約１０回または約１００回まで、１～１００容量の水（例えば、約１、１０、２０、３０または４０から約１００、９０、８０、７０、６０または５０容量の水、例えば２～４容量の水）で洗浄され、得られる固形物が収集される。
本発明者らは、驚くべきことに、粗製（未洗浄）および／または精製（洗浄）の固体の生物学的抽出物の収量は、ステップ（ｉｉｉ）および／または洗浄ステップ（ｖｉ）の間に塩を水に添加すると、さらに増加させることができることを見出した。したがって、さらなる態様において、ステップ（ｖｉ）で洗浄するために使用される水および／またはステップ（ｉｉｉ）の水は、塩化ナトリウムなどの１つ以上の塩を含み得る。ステップ（ｉｉｉ）および／またはステップ（ｖｉ）の水に加えられる塩（例えば塩化ナトリウム）の量は、約０．１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、例えば、約２～約５ｇ／Ｌ、例えば約３ｇ／Ｌであることができる。
ステップ（ｖｉ）を含む本発明の方法は、精製された固体の生物学的抽出物を提供する。必要に応じて、精製された生物学的固体を乾燥させて、抽出物中に存在する任意の残留水を低減／除去することができる。
当技術分野で知られている任意の適切な乾燥技術、例えば、限定はされないが、凍結乾燥、噴霧乾燥、オーブン乾燥、熱乾燥、または真空乾燥などを使用することができる。
例えば、本発明は、以下を含む、精製された固体の生物学的抽出物を提供する方法を提供する：
ｉ）生物学的材料（植物の生物学的材料、藻類の生物学的材料、動物の生物学的材料および／または原核生物の生物学的材料など）を、水（５０、３０、２５、２０、１０、または０％など、または約０．５％未満の水、約０．１、０．０１、０．００１、０．０００１未満または約０．００００１％未満の水）およびＤＥＳ（例えば尿素とベタイン、グリセロールとベタイン、ピルビン酸とベタイン、塩化コリンと尿素、グリセロールと塩化コリン、リンゴ酸と塩化コリン、レブリン酸とベタイン、乳酸とベタイン、ソルビトールとレブリン酸、ベタインとソルビトール、プロリンとレブリン酸、ベタインとプロリン、ベタインとグルコース、プロリンとグルコース、リシンとレブリン酸、グリセロールとソルビトール、グリセロールと乳酸、グルコースとレブリン酸、キシリトールとレブリン酸、ソルビトールと乳酸、尿素とベタインＨＣｌ、またはグリセロールとレブリン酸）を含む抽出溶液と、組み合わせること；および；
ｉｉ）未溶解の生物学的材料を、（ｉ）で得られた溶液から除去すること；
ｉｉｉ）凝集塊および／または沈殿物を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に水を加えることおよび／または冷却することにより、得ること；
ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた固形物を、溶液から収集すること；および
ｖ）任意に、ステップ（ｉｖ）で得られた固形物を乾燥すること；
ｖｉ）ステップ（ｉｖ）または（ｖ）で得られた固形物を、約１～約１０回、１～１０００容量の水で洗浄し、得られた固形物を回収すること；および
ｖｉｉ）任意に、ステップ（ｖｉ）で得られた固形物を乾燥すること。
本発明はまた、水およびＤＥＳを含む抽出溶液の、生物学的材料（植物の生物学的材料、藻類の生物学的材料、動物の生物学的材料および／または原核生物の生物学的材料など）から生物学的抽出物および／または親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物を提供するための使用を提供し、ここでの使用は以下を含む：
ｉ）生物学的材料（植物の生物学的材料、藻類の生物学的材料、動物の生物学的材料および／または原核生物の生物学的材料など）を、水（５０、３０、２５、２０、１０、または０％など、または約０．５％未満の水、約０．１、０．０１、０．００１、０．０００１未満または約０．００００１％未満の水）およびＤＥＳを含む抽出溶液と、混合すること；および；
ｉｉ）未溶解の生物学的材料を、（ｉ）で得られた溶液から除去すること；
ｉｉｉ）凝集塊および／または沈殿物を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に水を加えることおよび／または冷却することにより、得ること；
ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた固形物を、溶液から収集すること；および
ｖ）任意に、ステップ（ｉｖ）で得られた固形物を乾燥すること；
ｖｉ）ステップ（ｉｖ）または（ｖ）で得られた固形物を、約１～約１０回、１～１０００容量の水で洗浄し、得られた固形物を回収すること；および
ｖｉｉ）任意に、ステップ（ｖｉ）で得られた固形物を乾燥すること。
生物学的材料およびＤＥＳは、以前に定義されたとおりである。
ステップ（ｖｉ）での洗浄は、抽出物に存在する残留ＤＥＳの濃度を低下させる。驚くべきことに、そして予期せぬことに、本発明者らは、洗浄ステップ（ｖｉ）が、精製された固体の生物学的抽出物に存在する親油性／非水溶性化合物の濃度を低下させず、実際、抽出物中に存在するかかる化合物の濃度を増加し得ることを見出した。例えば、生物学的材料が植物材料、例えばローズマリーおよび／またはセージ、またはCurcuma longaなどであり、生物学的抽出物が、生物学的材料に存在するカルノシン酸および／またはその誘導体またはクルクミノイドおよび／またはクルクミン、および／または他の親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物に富む場合、抽出物を洗浄することは、精製された抽出物中の生物学的材料に存在するカルノシン酸および／またはその誘導体またはクルクミノイドおよび／またはクルクミン、および／または他の親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物の濃度を大幅に低下はさせず、実際、抽出物中に存在するかかる化合物の濃度を増加させ得る。
したがって、精製された固体の生物学的抽出物を提供する本明細書に記載の方法および使用において、得られる生物学的抽出物は、ＤＥＳ、特に、前に記載された少なくとも１つのＤＥＳの抽出物の約５重量％未満、例えば２％未満または１％未満または０．１％未満、または０．０４％未満を含み得る。例えば、得られた生物学的抽出物は、実質的にＤＥＳを含まない可能性がある。
本明細書で使用する場合、用語「実質的に含まない」とは、記載されている抽出物が、少量（例えば、最大で抽出物の０．１重量％または０．０１重量％または０．００１重量％または０．０００１重量％まで）のＤＥＳを含み得ることを意味し、ただしＤＥＳの存在は、抽出物の本質的な特性には影響しないものとする。
本発明の方法は、以下を含むか、または以下からなることができる：
ｉ）植物の生物学的材料（例えば、シソ科の種の植物、例えばローズマリーおよび／またはセージから、または柑橘類属の植物、例えばC. sinensis、C. medica、C. reticulateなどから、またはショウガ科の植物、例えばCurcuma longaからの）を、水（５０、３０、２５、２０、１０、または０％など、または約０．５％未満の水、約０．１、０．０１、０．００１、０．０００１未満または約０．００００１％未満の水）およびＤＥＳを含む抽出溶液と、混合すること；および；
ｉｉ）未溶解の生物学的材料を、（ｉ）で得られた溶液から除去すること；
ｉｉｉ）凝集塊および／または沈殿物を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に水を加えることおよび／または冷却することにより、得ること；
ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた固形物を、溶液から収集すること；および
ｖ）任意に、ステップ（ｉｖ）で得られた固形物を乾燥すること；
ｖｉ）任意に、ステップ（ｉｖ）または（ｖ）で得られた固形物を、約１～約１０回水で洗浄し、得られた固形物を回収すること；および
ｖｉｉ）任意に、ステップ（ｖｉ）で得られた固形物を乾燥すること。
必要に応じて、ステップ（ｉ）の前に、生物学的材料（すなわち、植物および／または藻類および／または動物および／または原核生物の生物学的材料）を、水およびＤＥＳを含む抽出溶液と混合する前に、乾燥および／または例えば粉末に粉砕することができる。
抽出物が、ステップ（ｉ）から（ｖｉｉ）を含む方法または使用を用いて得られる場合、抽出物は、精製された生物学的抽出物であると見なされ得る。
ステップ（ｉ）から（ｖｉｉ）を含む本明細書に記載の方法または使用によって得られる精製された生物学的抽出物は、水溶液への溶解度が制限されている化合物、すなわち親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性の化合物の乾燥精製抽出物を、約１０重量％以上、約２０重量％以上、約４０重量％以上、または約６０重量％以上含み得る。例えば、精製された生物学的抽出物は、約１０重量％～約８０重量％の、水溶液への溶解度が制限されている化合物、すなわち親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性である化合物の抽出物を、または約２０重量％～約６０重量％の抽出物を含み得る。
例えば、抽出物は、少なくとも約１０重量％の、以下の物質の乾燥精製抽出物を含み得る：生物学的材料（すなわち、植物および／または藻類および／またはおよび／または動物および／または原核生物の生物学的材料）からの、以下を包含するフェノール化合物：フェノール酸（カルノシン酸、ロスマリン酸またはカフェー酸など）、フェノール性エステル、フェノール性ジテルペン（サリチル酸、およびその誘導体など）、フラボノイド（ヘスペリジンまたはルテオリングルクロニドなど）、セコイリドイド、クルクミノイド（クルクミンおよびその誘導体、デメトキシクルクミンまたはビスデメトキシクルクミンなど）、ビキシン、カプサイシノイド、カンナビノイド、ピラノアントシアニン、スチルベン、フェノールアルコール、フェノール脂質（ショウガオールまたはユビキノールなど）、シリマリン、アルカロイド、脂質、フェニルプロパノイド、クマリン（ジメトキシクマリンなど）、有機酸（リンゴ酸または酒石酸など）、以下を包含するテルペノイド：モノテルペノイド、セスキテルペノイド（ターメロン、クルクマジオン、プロクルクマジオールまたはデヒドロクルジオンなど）、ジテルペノイド（カルノシン酸またはヒドロキシクリプトタンシノンなど）、サポニン、リグナン、アントラキノン、グルコシノラート、スルフォラファンおよびイソチオシアナート、トリテルペノイド（ウルソール酸など）、サポゲニンまたはカロテノイド、およびそれらの混合物。
例えば、生物学的抽出物は、上に列挙された化合物の１つ以上またはそれらの混合物を含み得る。
誤解を避けるために、本発明の所与の側面、特徴またはパラメータについて示された選好、オプション、特定の特徴などは、文脈が別段の指示をしない限り、本発明の同じまたは他の側面、特徴およびパラメータについて示されるように、任意のおよび他のすべての選好、オプション、特定の特徴などと組み合わせて開示されたと見なされるべきである。
本明細書で使用する「約」という用語は、例えば、測定可能な値（組成物または反応混合物中の特定の成分の重量など）を指す場合、指定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または特に±０．１％の変動を指す。
本発明のいくつかの側面において、本発明の方法は、本明細書に記載のステップからなるか、または本質的にそれからなることができる。
誤解を避けるために、本明細書において、「含むこと（comprising）」または「含む（comprises）」という用語を使用する場合、記載されている方法は列挙されたステップを含まなければならないが、任意に追加のステップを含んでもよいことを意味する。「本質的に～からなること」または「本質的に～からなる」という用語を使用する場合、記載されている発明の方法は、列挙されたステップを含まなければならず、マイナーな追加のステップも、それが方法の本質的な特性に影響しないとの条件で、含み得ることを意味する。「～からなること」または「～からなる」という用語を使用する場合、記載されている発明の方法は、列挙されたステップのみを含まなければならないことを意味する。
生物学的抽出物
本発明はまた、以前に記載の方法または使用を用いて得られた生物学的抽出物も提供し、これは以下では「本発明の抽出物」と呼ぶこともある。
生物学的抽出物は、例えば、粗製固体または半固体の生物学的抽出物または精製された生物学的抽出物であり得る。
生物学的抽出物は、水溶液への溶解度が制限されている化合物、すなわち、親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性の化合物に富み得る。
例えば、粗製生物学的抽出物は、約２重量％以上、約５重量％以上、約１０重量％以上、約２０重量％以上、または約４０重量％以上の、水溶液への溶解度が制限されている化合物、すなわち親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性の化合物の抽出物を含み得る；すなわち粗製生物学的抽出物は、約２重量％～約６０重量％の、水溶液への溶解度が制限されている化合物、すなわち親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性である化合物の抽出物を含み得、または約５重量％～約４０重量％の、水溶液への溶解度が制限されている化合物、すなわち親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性である化合物の抽出物を含み得る。
精製された生物学的抽出物は、約１０重量％以上、約２０重量％以上、約４０重量％以上、または約６０重量％、または約７０重量％以上の、水溶液への溶解度が制限されている化合物、すなわち親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性である化合物の、乾燥精製抽出物を含み得る；すなわち、精製された生物学的抽出物は、約１０重量％～約８０重量％の、水溶液への溶解度が制限されている化合物、すなわち親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性である化合物の抽出物を、または約２０重量％～約６０重量％の抽出物を含み得る。
例えば、粗製生物学的抽出物は、約２重量％以上、約５重量％以上、約１０重量％以上、約２０重量％以上、または約４０重量％以上の、次の物質の抽出物を含み得る：以下を包含するフェノール化合物：フェノール酸（サリチル酸、ロスマリン酸またはカフェー酸など）、フェノール性エステル、フェノール性ジテルペン（カルノシン酸およびその誘導体など）、フラボノイド（ヘスペリジンまたはルテオリングルクロニドなど）、セコイリドイド、クルクミノイド（クルクミンおよびその誘導体、デメトキシクルクミンまたはビスデメトキシクルクミンなど）、ビキシン、カプサイシノイド、カンナビノイド、ピラノアントシアニン、スチルベン、フェノールアルコール、フェノール脂質（ショウガオールまたはユビキノールなど）、シリマリン、アルカロイド、脂質、フェニルプロパノイド、クマリン（ジメトキシクマリンなど）、有機酸（リンゴ酸または酒石酸など）、以下を包含するテルペノイド：モノテルペノイド、セスキテルペノイド（ターメロン、クルクマジオン、プロクルクマジオールまたはデヒドロクルジオンなど）、ジテルペノイド（カルノシン酸またはヒドロキシクリプトタンシノンなど）、サポニン、リグナン、アントラキノン、グルコシノラート、スルフォラファンおよびイソチオシアナート、トリテルペノイド（ウルソール酸など）、サポゲニンまたはカロテノイド、およびそれらの混合物；すなわち、粗製生物学的抽出物は、約２重量％～約６０重量％、または約５重量％～約４０重量％の、次の物質の粗製抽出物を含み得る：以下を包含するフェノール化合物：フェノール酸（サリチル酸、ロスマリン酸またはカフェー酸など）、フェノール性エステル、フェノール性ジテルペン（カルノシン酸およびその誘導体など）、フラボノイド（ヘスペリジンまたはルテオリングルクロニドなど）、セコイリドイド、クルクミノイド（クルクミンおよびその誘導体、デメトキシクルクミンまたはビスデメトキシクルクミンなど）、ビキシン、カプサイシノイド、カンナビノイド、ピラノアントシアニン、スチルベン、フェノールアルコール、フェノール脂質（ショウガオールまたはユビキノールなど）、シリマリン、アルカロイド、脂質、フェニルプロパノイド、クマリン（ジメトキシクマリンなど）、有機酸（リンゴ酸または酒石酸など）、以下を包含するテルペノイド：モノテルペノイド、セスキテルペノイド（ターメロン、クルクマジオン、プロクルクマジオールまたはデヒドロクルジオンなど）、ジテルペノイド（カルノシン酸またはヒドロキシクリプトタンシノンなど）、サポニン、リグナン、アントラキノン、グルコシノラート、スルフォラファンおよびイソチオシアナート、トリテルペノイド（ウルソール酸など）、サポゲニンまたはカロテノイド、およびそれらの混合物。
精製された生物学的抽出物は、約１０重量％以上、約２０重量％以上、約４０重量％以上、または約６０重量％以上、または約７０重量％以上の、カルノシン酸および／またはヘスペリジンの乾燥精製抽出物を含み得、すなわち、精製された生物学的抽出物は、約１０重量％～約８０重量％のカルノシン酸および／またはヘスペリジンの抽出物、または約２０重量％～約６０重量％の抽出物を含み得る。
精製された生物学的抽出物は、約１０重量％以上、約２０重量％以上、約４０重量％以上、または約６０重量％以上、または約７０重量％以上の、クルクミノイドおよび／またはクルクミンの乾燥精製抽出物を含み得、すなわち、精製された生物学的抽出物は、約１０重量％～約８０重量％のクルクミンおよび／またはクルクミノイドの抽出物、または約２０重量％～約６０重量％の抽出物を含み得る。
本発明の生物学的抽出物において、残存するＤＥＳ（特に前述の少なくとも１つのＤＥＳ）のパーセンテージは、ＤＥＳの抽出物の５重量％未満、例えば、ＤＥＳの抽出物の重量の２重量％未満または１重量％未満または０．１重量％未満、または約０．０４重量％未満であり得る。例えば、得られた生物学的抽出物は、実質的にＤＥＳを含まない可能性がある。
本明細書で使用する場合、用語「実質的に含まない」とは、記載されている抽出物が、少量（例えば、最大で抽出物の０．１重量％または０．０１重量％または０．００１重量％または０．０００１重量％まで）のＤＥＳを含み得ることを意味し、ただし、ＤＥＳの存在は、抽出物の本質的な特性には影響しないものとする。
本発明の生物学的抽出物の使用
本発明の生物学的抽出物を使用して、以下を提供することができる：生物学的材料（すなわち、植物および／または藻類および／または動物および／または原核生物の生物学的材料）からの、以下を包含するフェノール化合物：フェノール酸（サリチル酸、ロスマリン酸またはカフェー酸など）、フェノール性エステル、フェノール性ジテルペン（カルノシン酸およびその誘導体など）、フラボノイド（ヘスペリジンまたはルテオリングルクロニドなど）、セコイリドイド、クルクミノイド（クルクミンおよびその誘導体など）、ビキシン、カプサイシノイド、カンナビノイド、ピラノアントシアニン、スチルベン、フェノールアルコール、フェノール脂質（ショウガオールまたはユビキノールなど）、シリマリン、アルカロイド、脂質、フェニルプロパノイド、クマリン（ジメトキシクマリンなど）、有機酸（リンゴ酸または酒石酸など）、以下を包含するテルペノイド：モノテルペノイド、セスキテルペノイド（ターメロン、クルクマジオン、プロクルクマジオールまたはデヒドロクルジオンなど）、ジテルペノイド（カルノシン酸またはヒドロキシクリプトタンシノンなど）、サポニン、リグナン、アントラキノン、グルコシノラート、スルフォラファンおよびイソチオシアナート、トリテルペノイド（ウルソール酸など）、サポゲニン、サポニンまたはカロテノイド、およびそれらの混合物。
例えば、生物学的抽出物は、上に挙げた化合物の１つ以上またはそれらの混合物を含み得て、これらは以下として使用し得る：天然の生物学的フレーバー剤、および味覚修飾剤、甘味料、フレグランス、殺虫剤、抗微生物剤、タンパク質、酵素、着色料、色素、界面活性剤、抗酸化剤、キレート剤、乳化剤、テクスチャライザー、ビタミン、および／または栄養、化粧品または医薬的関心のある生物活性剤。
例えば、生物学的抽出物は、抗酸化および／または抗微生物活性（anti-microbial activity）（例えば、抗菌活性（anti-bacterial activity））および／または抗炎症活性を提供する化合物において高レベルで存在し得る。したがって本発明は、本明細書に記載の方法によって得られる植物および／または藻類および／または動物および／または原核生物の生物学的材料から得られる抗酸化剤を含む、生物学的抽出物を提供する。
本発明はまた、本明細書に記載の方法によって得られる生物学的抽出物の、抗酸化剤としての使用を提供する。抗酸化剤抽出物は、以下に記載されるような組成物および／または製品に使用することができる。
したがって、本発明は、本明細書に記載の方法によって、植物および／または藻類および／または動物おおよび／または原核生物の生物学的材料から得られる、１つ以上の抗炎症剤、着色料または色素、ビタミン、界面活性剤、フレーバー剤、フレグランスおよび／または味覚修飾剤を含む、生物学的抽出物を提供する。
本発明はまた、本明細書に記載の方法によって得られる生物学的抽出物の、抗炎症剤、着色料または色素、ビタミン、界面活性剤、フレーバー剤、フレグランスおよび／または味覚修飾剤としての使用を提供する。抗炎症剤、着色料または色素、ビタミン、界面活性剤、フレーバー剤、フレグランスおよび／または味覚修飾剤の抽出物は、以下に記載される組成物および／または製品に使用され得る。
本発明はまた、本明細書に記載の方法によって得られる生物学的抽出物（クルクミン、デメトキシクルクミンまたはビスデメトキシクルクミンを含むウコン抽出物など）の、関節の健康、認知（神経炎症）、心臓代謝、スポーツ回復、および／または消化器の健康のための抗炎症剤としての使用も提供する。
したがって、本発明はまた、本明細書に記載の方法によって得られる植物および／または藻類および／または動物および／または原核生物の生物学的材料から得られた、抗微生物剤（例えば、抗菌剤）、抗炎症剤、ビタミン、着色料または色素、界面活性剤、フレーバー剤、フレグランスおよび／または味覚修飾化合物を含む、生物学的抽出物を提供する。
本発明はまた、本明細書に記載の方法によって得られる生物学的抽出物の、抗微生物剤（例えば、抗菌剤）、抗炎症剤、着色料または色素、ビタミン、界面活性剤、フレーバー剤、フレグランスおよび／または味覚修飾剤としての使用も提供する。抗微生物性抽出物（例えば、抗菌剤）または抗炎症剤、着色料または色素、ビタミン、界面活性剤、フレーバー剤、フレグランスおよび／または味覚修飾剤を、以下に記載される組成物および／または製品に使用することができる。
本発明の生物学的抽出物（これは、抗酸化剤および／または抗微生物剤（例えば、抗菌剤）、抗炎症剤、ビタミン、着色料または色素、界面活性剤、フレーバー剤、フレグランスおよび／または味覚修飾剤であり得る）を使用して、栄養補助食品組成物、ヒトまたは動物用の食品もしくは食品製品（例えば機能性食品組成物など、すなわち食品、飲料、飼料もしくはペットフード、または食品、飲料、飼料もしくはペットフードサプリメントなど）、栄養サプリメント、フレグランスまたはフレーバー、医薬品（医薬組成物または製剤）、獣医学用組成物、ワイン醸造もしくは化粧品配合物を提供することができる。
栄養補助食品組成物、ヒトまたは動物用の食品もしくは食品製品（例えば機能性食品組成物など、すなわち食品、飲料、飼料もしくはペットフード、または食品、飲料、飼料もしくはペットフードサプリメントなど）、栄養サプリメント、フレグランスまたはフレーバー、医薬品（医薬組成物または製剤）、獣医学用組成物、ワイン醸造もしくは化粧品配合物は、経口または非経口的に投与することができ、または局所、直腸、経鼻、耳介、膣および／または眼への適用とすることができる。
したがって本発明は、栄養補助食品組成物、ヒトまたは動物用の食品もしくは食品製品（例えば機能性食品組成物など、すなわち食品、飲料、飼料もしくはペットフード、または食品、飲料、飼料もしくはペットフードサプリメントなど）、栄養サプリメント、フレグランスまたはフレーバー、医薬品（医薬組成物または製剤）、獣医学用組成物、ワイン醸造もしくは化粧品配合物において使用するための、生物学的抽出物を提供する。
本発明はまた、生物学的抽出物、および任意に１つ以上の薬学的／獣医学的に許容し得る成分、例えば賦形剤または担体または（機能性）食品許容成分およびそれらの混合物などを適宜含む、栄養補助食品組成物、ヒトまたは動物用の食品もしくは食品製品（例えば機能性食品組成物など、すなわち食品、飲料、飼料もしくはペットフード、または食品、飲料、飼料もしくはペットフードサプリメントなど）、栄養サプリメント、フレグランスまたはフレーバー、医薬品（医薬組成物または製剤）、獣医学用組成物、ワイン醸造もしくは化粧品配合物も提供する。
必要に応じて、生物学的抽出物は、栄養補助食品組成物、ヒトまたは動物用の食品もしくは食品製品（例えば機能性食品組成物など、すなわち食品、飲料、飼料もしくはペットフード、または食品、飲料、飼料もしくはペットフードサプリメントなど）、栄養サプリメント、フレグランスまたはフレーバー、医薬品（医薬組成物または製剤）、獣医学用組成物、ワイン醸造もしくは化粧品配合物内の他の生物学的に活性な化合物と、組み合わせることができる。
本明細書で使用する場合、薬学的または獣医学的に許容し得る賦形剤への言及は、当業者に知られているような薬学的または獣医学的に許容し得るアジュバント、希釈剤および／または担体を指し得る。
食品に許容し得る成分には、当技術分野で知られているもの（本明細書で薬学的に許容し得る賦形剤とも呼ばれるものを含む）が含まれ、天然または非天然であることができ、すなわち、それらの構造は天然に生じ得るか、またはそうではない。場合によっては、それらは天然化合物に由来し、使用前に改変することができる（例：マルトデキストリン）。
一態様において、本明細書に記載の方法によって得られる生物学的抽出物は、カルノシン酸が豊富であり、ヒマワリ、オリーブ油、コーン油または菜種油などの食品グレードの油と配合される。好ましい態様において、カルノシン酸に富む抽出物は、約１～３０％、例えば約２０～３０％、例えば約１～１０％、例えば約４～５％の濃度のヒマワリ油と配合される。
別の態様において、本明細書に記載の方法によって得られる生物学的抽出物（カルノシン酸に富む抽出物、またはひまわり油に配合されたカルノシン酸に富む抽出物など）は、食品または飲料（例えばマヨネーズ、肉など）の製造に使用される。好ましい態様において、生物学的抽出物（カルノシン酸に富む抽出物、またはヒマワリ油に配合されたカルノシン酸に富む抽出物など）は、１０～１００倍または１０００または１００００倍に希釈される。
「薬学的または獣医学的に許容し得る」とは、組成物の追加の成分が一般に安全で毒性がなく、生物学的にもそれ以外でも望ましくないわけではないことを意味する。例えば、追加の成分は一般に、無菌で発熱物質を含まない。かかる成分は、本発明の抽出物と適合性がありそのレシピエントに有害ではないという意味で、「許容し得る」ものでなければならない。したがって「薬学的に許容し得る賦形剤」には、単に賦形剤として作用することを意図する、すなわちそれ自体が生物学的活性を有することを意図しない、製剤の一部を形成するために使用される任意の化合物が含まれる。
当業者は、本発明の抽出物（例えば、医薬または獣医学用組成物などの組成物の形態において）が、患者または対象（例えば、ヒトまたは動物の患者または対象）に、任意の適切な経路、例えば経口、直腸、経鼻、肺、頬側、舌下、経皮、大槽内、腹腔内、または非経口（皮下、筋肉内、髄腔内、静脈内および皮内を含む）の経路などによって、投与され得ることを理解するであろう。
本発明の抽出物は、経口投与することができる。かかる場合に、本発明による医薬または獣医学用組成物は、経口経路による投与のために特別に製剤化され得る。
経口投与用の医薬または獣医学用組成物には、固形剤形、例えばハードまたはソフトカプセル剤、錠剤、トローチ、糖剤、丸剤、ロゼンジ、粉末剤および顆粒剤などが含まれる。適切な場合、それらは、腸溶コーティングなどのコーティングで調製することができ、または当技術分野で周知の方法に従って、徐放性または長期放出などの有効成分の制御放出を提供するように製剤化することができる。
経口投与用の液体剤形には、水剤、乳剤、水性または油性懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。
経口投与を目的とするもの等の本明細書に記載の組成物（例えば、医薬または獣医学または食品の組成物）は、当業者に知られている方法に従って、例えば組成物の成分を一緒に混合することなどによって、調製することができる。
本発明の組成物は、食品成分または医薬品成分などの１つ以上の追加の成分、および賦形剤、例えば甘味剤、フレーバー剤、着色料および保存剤などを含有し得る。本発明の組成物は、活性成分（単数または複数）を、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容し得る賦形剤（または成分）と混合して、含有し得る。これらの賦形剤（または成分）は、例えば、以下のものであり得る：不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなど；造粒剤および崩壊剤、例えばコーンスターチ、マルトデキストリンまたはアルギン酸など；結合剤、例えばデンプン、ゼラチンまたはアカシア；または潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルクおよびそれらの混合物。
本発明の固体組成物は、コーティングされていないか、または既知の技術によりコーティングされて、胃腸管での崩壊および吸収を遅延させ、それによってより長期間にわたって持続的な作用を提供し得る。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を使用することができる。
本発明の液体組成物は、上記で定義されたようにコーティングされていないかまたはコーティングされ得るカプセル内に含まれ得る。
適切な医薬または獣医学用担体には、不活性な固体希釈剤または充填剤、滅菌水溶液、および様々な有機溶媒が含まれる。固体担体の例は、ラクトース、白土（terra alba）、スクロース、シクロデキストリン、マルトデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、アラビアガム、加工デンプン、およびセルロースの低級アルキルエーテル、サッカロース、シリカ、およびそれらの混合物である。液体担体の例は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレンおよび水である。
さらに、担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの、当技術分野で知られている任意の徐放性材料を、単独で、またはワックスと混合して含み得る。
適切な医薬担体には、不活性な固体希釈剤または充填剤、滅菌水溶液、および様々な有機溶媒が含まれる。固体担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、シクロデキストリン、マルトデキストリン、デキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、水酸化マグネシウム；ステアリン酸、アラビアガム、加工デンプン、およびセルロースの低級アルキルエーテル、サッカロース、二酸化ケイ素である。液体担体の例は、シロップ、野菜油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレンおよび水である。さらに、担体または希釈剤は、当技術分野で知られている任意の徐放性材料、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどを、単独で、またはワックスと混合して含み得る。
本明細書で使用する「担体」という用語はまた、天然生成物であるか、またはそれが由来する天然生成物とは異なるように変換または改変された天然由来の生成物を指し得、例えばマルトデキストリンである。
障害、および処置される対象、ならびに投与経路に応じて、本発明の抽出物は、様々な用量（すなわち、それを必要とする患者に投与される場合のように、治療上有効な用量）で投与され得る。これに関して、当業者は、本発明の文脈において哺乳動物、特にヒトに投与される用量は、合理的な時間枠にわたって哺乳動物の治療反応に影響を与えるのに十分であるべきであることを、理解するであろう。当業者は、正確な用量および組成物の選択ならびに最も適切な送達レジメンもまた、とりわけ、製剤の薬理学的特性、処置される状態の性質および重症度、ならびにレシピエントの身体的状態および精神的鋭敏さ、ならびに処置を受ける患者の年齢、状態、体重、性別および反応、および疾患の病期／重症度によって、影響を受けることを認識するであろう。
医薬または獣医学または食品の組成物は、本発明の抽出物を治療上有効な量で含む。本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、「治療有効量」、「有効用量」、または「治療有効用量」と同義であり、本発明で使用される場合、所望の治療効果を達成するのに必要な本発明の抽出物の最小用量を指し、炎症に関連する症状を軽減するのに十分な用量を含む。本明細書に記載の疾患または状態を処置する際の有効性は、個人の改善を観察することにより、１つ以上の臨床症状、および／または状態に関連する生理学的指標に基づいて、決定することができる。本明細書に記載の疾患または状態の改善はまた、同時治療の必要性の低減によっても示すことができる。
さらに、本発明の抽出物の反復投与が使用される場合、本発明の抽出物の有効量はさらに、投与の頻度、本発明の抽出物の半減期、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない要因に依存する。
栄養補助食品組成物、ヒトまたは動物用の食品もしくは食品製品（例えば機能性食品組成物など、すなわち食品、飲料、飼料もしくはペットフード、または食品、飲料、飼料もしくはペットフードサプリメントなど）、栄養サプリメント、フレグランスまたはフレーバー、医薬品（医薬組成物または製剤）、獣医学用組成物、ワイン醸造もしくは化粧品配合物における生物学的抽出物の量は、用途に応じて異なるであろう。
典型的には、栄養補助食品組成物、ヒトまたは動物用の食品もしくは食品製品（例えば機能性食品組成物など、すなわち食品、飲料、飼料もしくはペットフード、または食品、飲料、飼料もしくはペットフードサプリメントなど）、栄養サプリメント、フレグランスまたはフレーバー、医薬品（医薬組成物または製剤）、獣医学用組成物、ワイン醸造もしくは化粧品配合物に存在する生物学的抽出物の量は、栄養補助食品組成物、ヒトまたは動物用の食品もしくは食品製品（例えば機能性食品組成物など、すなわち食品、飲料、飼料もしくはペットフード、または食品、飲料、飼料もしくはペットフードサプリメントなど）、栄養サプリメント、フレグランスまたはフレーバー、医薬品（医薬組成物または製剤）、獣医学用組成物、ワイン醸造もしくは化粧品配合物の約０．０００１重量％～約１００重量％、例えば約０．００１％～約５０％または約０．０１％～約３０％であろう。
本発明の医薬または獣医学または食品の組成物は、本発明の抽出物および任意に担体からなるか、または本質的にそれらからなり得る。
誤解を避けるために、本明細書において「含むこと（comprising）」または「含む（comprise）」という用語を使用する場合、記載されている抽出物または組成物は、列挙された成分（単数または複数）を含有しなければならないが、任意に追加の成分を含有し得ることを意味する。「～から本質的になること」または「～から本質的になる」という用語を使用する場合、記載されている抽出物または組成物は、列挙された成分（単数または複数）を含有しなければならず、また少量（例えば、最大５重量％、または最大１重量％または０．１重量％まで）の他の成分も含有し得ることを意味し、ただし、任意の追加の成分が抽出物または組成物の本質的な特性に影響を及ぼさないとの条件のもとである。「～からなること」または「～からなる」という用語を使用する場合、記載されている抽出物または組成物は、列挙された成分（単数または複数）のみを含有しなければならないことを意味する。
図１は、異なるベタイン：尿素混合物の、室温での色素「ジスパースレッド１３」の水溶液への溶解度に対する効果を、５２５ｎｍの吸光度で測定して示した図である。すべての溶液は、蒸留水中ｐＨの制御なしで調製した。結果は、３回の実験（独立）の平均±Ｓｄとして表す。挿入図：尿素対ベタインのモル分率（％）の関数としてのＳｍａｘ。 図２は、異なるベタイン：尿素混合物の、室温での色素「ジスパースレッド１３」の水溶液への溶解度に対する効果を、５２５ｎｍでの吸光度で測定して示した図である。すべての溶液は、ｐＨ７のリン酸緩衝液で調製した。必要に応じて、最終的なハイドロトロピック溶液を濃塩酸でｐＨ７．０に調整した。添加したＨＣｌの量は試験したすべての混合物の総量の１％未満であったため、濃度の補正は行わなかった。結果は、３回の実験（独立）の平均±Ｓｄとして表す。挿入図：尿素対ベタインのモル分率（％）の関数としてのＳｍａｘ。
図３は、異なる塩化コリン：尿素混合物の、室温でのジスパースレッド１３の水溶液への溶解度に対する効果を、５２５ｎｍの吸光度で測定して示した図である。すべての溶液は、蒸留水中ｐＨの制御なしで調製した。結果は、３回の実験（独立）の平均±Ｓｄとして表す。挿入図：尿素対塩化コリンのモル分率（％）の関数としてのＳｍａｘ。 図４は、尿素対ベタインのモル分率（％）の関数としての、カルノシン酸のＳｍａｘを示す図である。 図５は、尿素対ベタインのモル分率（％）の関数としての、ヘスペリジンのＳｍａｘを示す図である。 図６は、尿素対ベタインのモル分率（％）の関数としての、クルクミンのＳｍａｘを示す図である。 図７は、１：１または２：１の尿素：ベタイン深共晶を室温（ＲＴ）で０．５、１、２、３、７、または１６時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の粗製（未洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。すべての溶媒は、９５０ｇ／ＬのＤＥＳを水中に含む。すべての抽出について、植物：溶媒の重量比は１：１０（１０Ｍと表示）であり、沈殿は９倍量の水を室温で使用して得た。
図８は、１：１または２：１の尿素：ベタイン深共晶を室温（ＲＴ）で０．５、１、２、または３時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の精製（洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。すべての溶媒は、９５０ｇ／ＬのＤＥＳを水中に含む。植物：溶媒の重量比は、１：１０（１０Ｍと表示）、１：１５（１５Ｍと表示）、または１：２０（２０Ｍと表示）であり、沈殿は、９倍量の水を室温で使用して得た。抽出物は１、２または５回洗浄した。 図９は、１０％の水を含有する１：２のベタイン：レブリン酸深共晶を室温（ＲＴ）で１時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の粗製（未洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。植物：溶媒の重量比は、１：１０（１０Ｍと表示）または１：１５（１５Ｍと表示）であり、沈殿は両方の条件において、９倍量の水を室温で使用して得た。 図１０は、５、１０、２０、２５、または３０％の水を含有する１：２のベタイン：レブリン酸深共晶を室温（ＲＴ）で０．２５、０．５、１、２、または３時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の精製（洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。植物：溶媒の重量比は、１：６（６Ｍと表示）、１：８（８Ｍと表示）、１：１０（１０Ｍと表示）、または１：１５（１５Ｍと表示）であった。沈殿は、１．５、２、３、４、または９倍量の水を室温または４℃で使用して得た。
図１１は、１０％の水を含有する１：１または１：２のベタイン：乳酸深共晶を室温（ＲＴ）で１時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の粗製（未洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。植物：溶媒の重量比は１：１０（１０Ｍと表示）または１：１５（１５Ｍと表示）であり、沈殿は、９倍量の水を室温で使用して得た。 図１２は、５、１０、２０、または２５％の水を含有する１：２または１：３のベタイン：乳酸深共晶を室温（ＲＴ）で１時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の精製（洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。植物：溶媒の重量比は、１：８（８Ｍと表示）、１：１０（１０Ｍと表示）、または１：１５（１５Ｍと表示）であり、沈殿は、４または９容量の水を室温で使用して得た。図の最初の試料（左から）は、沈殿水を２μｍフィルターで濾過した後に得たものである。他のものは遠心分離されている。
図１３は、２０または２５％の水を含有する１：２のベタイン：グリセロール深共晶を室温（ＲＴ）で１時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の粗製（未洗浄）または精製（洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。植物：溶媒の重量比は１：１０（１０Ｍと表示）であり、沈殿は、４または９倍量の水を室温で使用して得た。 図１４は、２０、３０、または５０％の水を含有する１：１、１：２または２：１のベタイン：ソルビトール深共晶を室温（ＲＴ）で０．５、１、または２時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の精製（洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。植物：溶媒の重量比は１：８（８Ｍと表示）または１：１０（１０Ｍと表示）であり、沈殿は、４倍量の水を室温で使用して得た。 図１５は、２０または５０％の水を含有する１：１または１：２のベタイン：ソルビトール深共晶を６０℃で０．５時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の精製（洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。植物：溶媒の重量比は１：８（８Ｍと表示）または１：１０（１０Ｍと表示）であり、沈殿は、４倍量の水を室温で使用して得た。 図１６は、２０または３０％の水を含有する１：１のソルビトール：レブリン酸深共晶を室温（ＲＴ）で０．５時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の精製（洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。植物：溶媒の重量比は１：１０（１０Ｍと表示）であり、沈殿は、４倍量の水を室温で使用して得た。
図１７は、３０％の水を含有する１：２のベタイン：プロリン深共晶を室温（ＲＴ）で０．５、１、または２時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の精製（洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。植物：溶媒の重量比は１：１０（１０Ｍと表示）であり、沈殿は、４倍量の水を室温で使用して得た。 図１８は、３０％の水を含有する１：２のベタイン：プロリン深共晶を６０℃で０．５または２時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の精製（洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。植物：溶媒の重量比は１：１０（１０Ｍと表示）であり、沈殿は、４倍量の水を室温で使用して得た。 図１９は、２０または３０％の水を含有する１：１、１：２、２：１または３：１のプロリン：グルコース深共晶を６０℃または室温（ＲＴ）で０．５、１、または２時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の精製（洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および、質量収率（Ｃ）を示す図である。植物：溶媒の重量比は１：１０（１０Ｍと表示）であり、沈殿は、４倍量の水を室温で使用して得た。 図２０は、２０、３０、または５０％の水を含有する１：１、１：２、２：１、および３：１のベタイン：グルコース深共晶を６０℃で０．５、１、または２時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の精製（洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。植物：溶媒の重量比は１：１０（１０Ｍと表示）であり、沈殿は、４倍量の水を室温で使用して得た。
図２１は、２５％の水を含有する１：２のベタイン：ピルビン酸深共晶を室温（ＲＴ）で０．５時間使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の精製（洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。植物：溶媒の重量比は、１：８（８Ｍと表示）、１：１０（１０Ｍと表示）、または１：１５（１５Ｍと表示）であり、沈殿は、４倍量の水を室温で使用して得た。 図２２は、以下を使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率（Ａ）、最終の粗製（未洗浄）または精製（洗浄）抽出物のＣＡ含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である：外から添加された水を含まない２：１の尿素：塩化コリン深共晶、２０％の水を含有する１：１グリセロール：乳酸深共晶、２０％の水を含有する１：１グリセロール：レブリン酸深共晶、２０％の水を含有する１：１のソルビトール：乳酸深共晶、２０％の水を含有する１：１のキシリトール：レブリン酸深共晶、３０％の水を含有する１：２のグルコース：レブリン酸深共晶、２０％の水を含有する１：１のプロリン：レブリン酸深共晶、および２０％の水を含有する１：１のリシン：レブリン酸深共晶。抽出は、６０℃または室温（ＲＴ）で０．５または１時間実施した。植物：溶媒の重量比はすべての溶媒で１：１０（１０Ｍと表示）であり、沈殿は、４または９倍量の水を室温で使用して得た。
図２３は、以下を使用して得た、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸（ＣＡ）抽出の回収率を示す図である：外から添加された水を含まない２：１の尿素：ベタインＨＣｌ深共晶、１０、２０、または３０％の水を含有する様々なモル比（１：１、１：２または２：１）でのベタイン：グリセロール深共晶、２０または３０％の水を含有する１：１のリンゴ酸：塩化コリン深共晶、０、１０、または２０％の水を含有する様々なモル比（１：１、１：２または２：１）でのグリセロール：塩化コリン深共晶、２０％の水を含有する１：１のグリセロール：ソルビトール深共晶、２０％の水を含有する１：２のリシン：レブリン酸深共晶、および３０％の水を含有する１：１のベタイン：プロリン深共晶。すべての抽出は、室温（ＲＴ）で０．５または１時間、植物と溶媒の重量比１：１０（１０Ｍと表示）で実施した。
図２４は、尿素：ベタイン深共晶を使用して得たローズマリーの粗製（未洗浄）および精製（洗浄）抽出物の、Rancimatアッセイにより測定された抗酸化活性を示す図である。 図２５は、ベタイン：レブリン酸深共晶を使用して得たローズマリーの精製（洗浄）抽出物の、Rancimatアッセイにより測定された抗酸化活性を示す図である。 図２６は、Rancimatアッセイにより測定された防護係数と、最終抽出物のカルノシン酸含有量（％）との間の線形の正の相関を示す図である。 図２７は、水中の塩（ＮａＣｌ）の含有量の、上清のＣＡ含有量として表されるカルノシン酸（ＣＡ）水溶性に対する効果を示す図である。
図２８は、粉砕したウコンの根を３０分間抽出した後に、様々なＤＥＳおよび温度（室温、ＲＴ、または６０℃）を使用した得た、活性回収率（Ａ）、最終抽出物における含有量（Ｂ）、および質量収率（Ｃ）を示す図である。使用した溶媒は、２０％の水を含有する１：１のソルビトール：レブリン酸、２０％の水を含有する１：１のプロリン：レブリン酸、３０％の水を含有する１：２のベタイン：グリセロール、２５％の水を含有する１：２のベタイン：レブリン酸、および１０％の水を含有する１：２のベタイン：乳酸であった。すべての溶媒について、植物：溶媒の重量比は１：１０であり、沈殿は、４倍量の水を室温で使用して得た。 図２９は、粉砕したオレンジの皮を、様々なＤＥＳを使用して室温で３０分間抽出する間の、ヘスペリジンの回収率を示す図である。使用した溶媒は、２０％の水を含有する１：１のソルビトール：レブリン酸、２０％の水を含有する１：１のプロリン：レブリン酸、３０％の水を含有する１：２のベタイン：グリセロール、２５％の水を含有する１：２のベタイン：レブリン酸、および１０％の水を含有する１：２のベタイン：乳酸であった。すべての溶媒について、植物：溶媒の重量比は１：１０であった。
本発明を、以下の非限定的な例を参照してさらに説明する。
材料および方法
色素「ジスパースレッド１３」の可溶化
尿素（≧９８％、U5378、Sigma）およびベタイン（≧９９％、61962、Sigma）は分析グレードであった。尿素とベタインを、シリカと共にデシケーターに保管することにより湿気を避けるように注意した。塩化コリンの場合は、かかる注意は湿気を避けるには不十分であり、エタノールで再結晶化し、乾燥剤としてのＰ２Ｏ５と共にデシケーターに保管した。
所望の量のベタインおよび／または尿素粉末を、蒸留水またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ、６７ｍＭ）にｐＨ７．０で溶解して、１００ｍＬの溶液を形成した。
水またはＰＢＳ中の、尿素：ベタイン混合物における尿素の濃度は、０．０２５～８．３Ｍの範囲であった。
水またはＰＢＳ中の純粋な尿素溶液の濃度は０．０２５～１０．１Ｍの範囲であり、後者の値は、尿素の飽和レベルに対応する。
最後に、水またはＰＢＳ中の純粋なベタインの濃度は０．０２５～５．４Ｍの範囲であり、後者はベタインの飽和レベルに対応する。
ＰＢＳ中の尿素および／またはベタインの溶液は、濃ＨＣｌを使用して７．０のｐＨを提供するように調整した。添加されたＨＣｌの量は、ベタインおよび／または尿素の最終モル濃度を計算する際に考慮した。
１０ｍＬのオスモライト溶液を、５ｍｇのジスパースレッド１３を過剰に含むバイアル（最終濃度：３６４８２７、Sigma）に加え、１６時間磁気攪拌し（５００ｒｐｍ）、濾過した（０．４５μｍ）。濾液中のジスパースレッド１３の濃度は、５２５ｎｍで測定する（Shimadzu UV-1800、日本）。
例
例１．ベタイン：尿素混合物の、非緩衝水性媒体中のジスパースレッド１３に対する可溶化特性
ベタインは、テンサイジュースで最初に発見されたグリシンのトリメチル化形態である。これは、カルボン酸基（ＣＯＯ－）の２つの酸素原子を介して水素結合アクセプターの役割を果たすことができる、豊富な天然資源である。尿素は、第一級アミン基を介した強力な水素結合供与体として知られている。
この例では、異なるモル比の無水の尿素：ベタイン（Ｕ：Ｂ）混合物を最初に調製し、次に異なる濃度で、すなわち１．５ｇ／Ｌから、Ｕ：Ｂ比がそれぞれ１：０、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、および０：１の場合に対する飽和レベルである６０７、８１３、９８５、９５７、７９５、７４１、および６３３ｇ／Ｌまでの範囲の濃度で、蒸留水に可溶化した。
これらの液体混合物を、溶媒の可溶化特性をスクリーニングするための疎水性プローブとして使用される過剰のジスパースレッド１３と混合した。図１から観察されるように、ジスパースレッド１３の吸光度は、水中の深共晶濃度の増加に伴って、指数関数的に（約５２５ｎｍ）増加する。これは、共晶組成（１：２、ベタイン：尿素）およびその他（共晶混合物ではなく包晶混合物と呼ばれる）が、水中でハイドロトロープとして振る舞うことを明確に実証する。
ＭＨＣは次のように減少する：１：３のＵ：Ｂ＞１：２のＵ：Ｂ＞１：１のＵ：Ｂ＞２：１のＵ：Ｂ＞３：１のＵ：Ｂ＞尿素。
さらに重要なことに、最大のＳｍａｘ（特定の溶質のハイドロトロープによる最大可溶化能力）は、２成分系の共晶組成に対応する１：２のベタイン：尿素比で観察された。これは、Ｓｍａｘをベタインに対する尿素のモル分率（％）の関数としてプロットした図１の挿入図で、最もよく観察される。
これは、この例で試験したすべての混合物の中で、ジスパースレッド１３を可溶化する能力が最も高い溶媒が、９８５ｇ／Ｌの水の濃度（飽和レベルまたはＣｍａｘ）における２：１のＵ：Ｂ溶液であったことを意味する。
この例において、尿素およびＵ：Ｂ混合物のハイドロトロピーにプラトーがないことを考慮すると、水中の深共晶の最大達成可能な濃度（飽和レベル）（Ｃｍａｘ、ｘ軸、図１）は、ジスパースレッド１３の最大達成可能な可溶化値に対応する（Ｓｍａｘ、ｙ軸、図１）。言い換えると、Ｃｍａｘは、特定の溶質のＳｍａｘへの到達を可能にするハイドロトロープ濃度である。ここで、深共晶での濃度が高いほど、可溶化されたジスパースレッド１３の濃度が高くなる（合体効果（colligative effect））。最適化されたＳｍａｘが共晶組成に対して臨界的に観察されるという事実は、前例のない発見である。
さらに、尿素のみではハイドロトロピック挙動を示すが、このことは、ベタインのみの場合、すなわち、ジスパースレッド１３をかかる認定には少なすぎるだけしか増加させなかったベタインのみの場合には、該当しない。このように、特定の比率（共晶組成、すなわちここでは２：１のＵＢ）での尿素のベタインへの添加は、ジスパースレッド１３を可溶化するための対応する混合物の、強力な相乗効果をもたらす。
例２．ベタイン：尿素混合物の、緩衝化されｐＨ７に調整された水性媒体中のジスパースレッド１３に対する可溶化特性
Ｕ：Ｂモル比の臨界性（criticality）が単にｐＨ効果によるものではないことを確認するために（ｐＨは、尿素とベタインの比および水溶液中のそれらの濃度によっても異なる）、第２の一連の実験を、ジスパースレッド１３を同じＵ：Ｂ混合物に、ただしｐＨ＝７のリン酸緩衝液中に溶解することにより、実施した。
深共晶の高濃度には、濃ＨＣｌ溶液でｐＨを７に調整することが必要であり、その理由は、緩衝液の緩衝効果が、ベタインによって誘発されるｐＨの上昇に対抗するのに必ずしも十分ではなかったためであった。添加されたＨＣｌの量は、試験したすべての混合物で総容量の１％未満であったため、濃度の補正は行わなかった。
得られた結果は、蒸留水（ｐＨの制御なし）を用いた例１に見られる結果に近く、深共晶のハイドロトロピーは主にｐＨによって決定されるのではなく、むしろ両方の成分間の臨界モル比によって制御されることを示している。（図２）。
したがって、さらなる実験を蒸留水中で実施した。以前に観察されたように、水中の飽和レベルでの共晶組成（２：１のＵＢ）は、ジスパースレッド１３色素を可溶化するための最良の条件を提供する。例１と全く同じ相乗効果が、尿素とベタインの間でｐＨ７においても観察される。
例３．塩化コリン：尿素混合物の、非緩衝水性媒体中のジスパースレッド１３に対する可溶化特性
塩化コリン（ＣｈＣｌ）はメチルアミン塩であり、バイオマスから抽出することも、非常に高い原子経済プロセスを介して化石埋蔵物から容易に合成することもできる。尿素などの水素結合ドナーと組み合わせて、例えばモル比２：１の尿素：ＣｈＣｌにおいて、ＣｈＣｌは、１２℃で液体の深共晶溶媒を生成することができる（図３）。
例４．ベタイン：尿素混合物の、非緩衝水性媒体中のカルノシン酸に対する可溶化特性
この例では、異なるモル比の無水の尿素：ベタイン（Ｕ：Ｂ）混合物を最初に調製し、次に飽和レベル、すなわちＵ：Ｂ比が１：０、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、および０：１の場合についてそれぞれ６０７、８１３、９８５、９５７、７９５、７４１、および６３３ｇ／Ｌで、これを蒸留水に可溶化した。これらの液体混合物を、様々な溶媒の可溶化特性をスクリーニングするための疎水性プローブとして使用されるジテルペン抗酸化剤である、過剰のカルノシン酸と混合した。
図４から、最大のカルノシン酸Ｓｍａｘ（カルノシン酸の深共晶による最大可溶化能力）が、２成分系の共晶組成に対応する１：２のベタイン：尿素比で観察されたことがわかる。これは、この例で試験したすべての混合物の中で、カルノシン酸を可溶化する能力が最も高い溶媒が、９８５ｇ／Ｌの水の濃度（飽和レベルまたはＣｍａｘ）の２：１のＵ：Ｂ溶液であることを意味する。さらに、２：１のＵ：Ｂ混合物で正味の相乗効果が得られた。
例５．ベタイン：尿素混合物の、非緩衝水性媒体中のヘスペリジンに対する可溶化特性
この例では、異なるモル比の無水の尿素：ベタイン（Ｕ：Ｂ）混合物を最初に調製し、次に飽和レベル、すなわちＵ：Ｂ比が１：０、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、および０：１の場合にそれぞれ６０７、８１３、９８５、９５７、７９５、７４１、および６３３ｇ／Ｌで、これを蒸留水に可溶化した。これらの液体混合物は、様々な溶媒の可溶化特性をスクリーニングするための疎水性プローブとして使用されるフラボノイド生物活性物質であるヘスペリジンと混合した。
図５から、最大のヘスペリジンＳｍａｘ（深共晶によるヘスペリジンの最大可溶化能力）が、１：２と１：１の両方のベタイン：尿素比で観察されたことがわかり、これは、２成分系の共晶組成に近い組成、または正確にその組成に対応する。
このことは、この例で試験したすべての混合物の中で、ヘスペリジンを可溶化する能力が最も高い溶媒は、（ｉ）９８５ｇ／Ｌの水の濃度での２：１のＵ：Ｂ溶液、および（ｉｉ）９５７ｇ／Ｌの水の濃度での１：１のＵ：Ｂ溶液、を有する溶液（どちらの場合も、飽和レベルまたはＣｍａｘ）であることを意味する。さらに、純粋なベタインまたは純粋な尿素の飽和溶液と比較して、これら２つの溶媒で正味の相乗効果が得られた。
例６．ベタイン：尿素混合物の、非緩衝水性媒体中のクルクミンに対する可溶化特性
この例では、異なるモル比の無水の尿素：ベタイン（Ｕ：Ｂ）混合物を最初に調製し、次に飽和レベル、すなわちＵ：Ｂ比が１：０、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、および０：１の場合にそれぞれ６０７、８１３、９８５、９５７、７９５、７４１、および６３３ｇ／Ｌで、蒸留水に可溶化した。これらの液体混合物は、様々な溶媒の可溶化特性をスクリーニングするための疎水性プローブとして使用されるフェノール性生物活性物質かつ色素である、過剰のクルクミンと混合した。
図６から、最大のクルクミンＳｍａｘ（深共晶によるクルクミンの最大可溶化能力）が、１：１の尿素：ベタイン比で観察されたことがわかり、これは、２成分系の共晶組成に近い組成に対応する。このことは、この例で試験したすべての混合物の中で、ヘスペリジンを可溶化する能力が最も高い溶媒が、９５７ｇ／Ｌの水の濃度（飽和レベルまたはＣｍａｘ）の１：１のＵ：Ｂ溶液であることを意味する。さらに、純粋なベタインまたは純粋な尿素の飽和溶液と比較して、この溶媒で正味の相乗効果が得られた。実際、他のすべての組み合わせも、それらの可溶化特性に関して相乗効果を示す。
例７．尿素：ベタイン深共晶を使用したローズマリーの抽出、遠心分離とその後の濾過によるケーキの除去、貧溶媒として水を使用した深共晶からの抽出物の分離、および遠心分離による粗製抽出物の回収
両方とも飽和レベル（９５０ｇ／Ｌ）に近い２：１の尿素：ベタイン（ＵＢ２／１＿９５０ｇ／Ｌ）混合物および１：１の尿素：ベタイン（ＵＢ１／１＿９５０ｇ／Ｌ）混合物の、均一水溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬのこの深共晶溶液（植物：溶媒、１：１０）を用いて、室温で０．５、１、２、３、７、または１６時間インキュベートし、濃縮溶液を、遠心分離とそれに続く濾過によって植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は２７～４３％であった（図７ａ）。次に、濾液を９倍量の水で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。沈殿物を遠心分離により回収し、真空オーブン内で４５℃で一晩乾燥した。最後に、乾燥ペレット（以下「粗製抽出物」と呼ぶ）を収集した。それらには、１１～１９％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図７ｂ）。最終的な質量収率は１．２～４．２％であった（図７ｃ）。
例８．尿素：ベタイン深共晶を使用したローズマリーの抽出、遠心分離とその後の濾過によるケーキの除去、貧溶媒として水を使用した深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および残留深共晶の水での洗浄手順による除去
ここでは、例７で行ったプロセスを、最後に追加の洗浄手順を用いて再現した。両方とも飽和レベル（９５０ｇ／Ｌ）に近い、２：１の尿素：ベタイン（ＵＢ２／１＿９５０ｇ／Ｌ）混合物および１：１の尿素：ベタイン（ＵＢ１／１＿９５０ｇ／Ｌ）混合物の、均一の水溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬのこの深共晶溶液（植物：溶媒、１：１０）を用いて、室温で０．５、１、２、または３時間インキュベートし、濃縮溶液を、遠心分離とそれに続く濾過によって植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は２８～６５％であった（図８ａ）。次に、濾液を９倍量の水で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、抽出物から残留深共晶を除去し（以下、「無溶媒の共晶抽出物」または「洗浄抽出物」と呼ぶ）、カルノシン酸濃度をさらに増加させる。真空オーブン内で４５℃で一晩乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に１７～３３％のカルノシン酸が含有されており（ＨＰＬＣ定量）（（図８ｂ）、これは、例７に記載の洗浄手順を使用しないプロセスと比較して、カルノシン酸含有量の重要な改善を表している。最終的な質量収率は、０．８～２．４％の範囲の値で同時に減少し（図８ｃ）、これは工業標準に関して依然として十分に許容され得る。
例９．飽和レベル（９５０ｇ／Ｌ）に近い２：１の尿素：ベタイン混合物を室温で２時間使用して例７（粗製抽出物）および８（精製抽出物）で得られたローズマリー抽出物の化学的特性付け
表１は、共晶ローズマリー抽出物であって、洗浄手順の適用前（図７の試料「UB2/1_950 g/L_10M_RT_2h_10vol_crude」に対応する粗製抽出物）、および適用後（図８の試料「UB2/1_950 g/L_10M_RT_2h_10vol_1washed」に対応する精製抽出物）の前記抽出物に見出される、いくつかの同定された化合物を示す。記号＋は存在を意味し、記号－は不在を意味する。
表１．洗浄手順の適用前（粗製抽出物）および適用後（精製抽出物）の共晶ローズマリー抽出物中で同定された化合物
Figure 2022537340000001
Figure 2022537340000002
例１０．ベタイン：レブリン酸ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、および遠心分離による粗製抽出物の回収
１０％の水を含有する１：２のベタイン：レブリン酸混合物（ＢＬｅ１／２＿１０％ｗ）の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）または３００ｍＬ（植物：溶媒、１：１５）のこの深共晶溶液と共に室温で１時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は７３～７６％であった（図９ａ）。次に、濾液を９倍量の水で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。沈殿物を遠心分離により回収し、一晩凍結乾燥した。最後に、乾燥ペレット（以下「粗製抽出物」と呼ぶ）を収集した。それらには、２９～３１％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図９ｂ）。最終的な質量収率は６．３～１１％であった（図９ｃ）。
例１１．ベタイン：レブリン酸ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
ここでは、例１０で実施したプロセスを、最後に追加の洗浄手順を用いて再現した。５％（ＢＬｅ１／２＿５％ｗ）、１０％（ＢＬｅ１／２＿１０％ｗ）、２０％（ＢＬｅ１／２＿２０％ｗ）、２５％（ＢＬｅ１／２＿２５％ｗ）、および３０％（ＢＬｅ１／２＿３０％ｗ）の水を含有する１：２のベタイン：レブリン酸混合物の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、１２０ｍＬ（植物：溶媒、１：６）、１６０ｍＬ（植物：溶媒、１：８）、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）、または３００ｍＬ（植物：溶媒、１：１５）のこの深共晶溶液と共に、室温で０．２５、０．５、１、２、または３時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は６３～８２％であった（図１０ａ）。次に、濾液を１．５、２、３、４、および９倍量の水で４または１０℃または室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、抽出に使用した溶媒の量（１２０、１６０、２００、または３００ｍＬ）と同じ量の水を使用する追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に３６～４５％のカルノシン酸が含まれており（ＨＰＬＣ定量）（図１０ｂ）、これは、例１０に記載の洗浄手順なしのプロセスと比較して、カルノシン酸含有量の重要な改善を表している。最終的な質量収率は、２．７～４．５％の範囲の値で付随して減少し（図１０ｃ）、これは工業標準に関して依然として十分に許容され得る。
例１２．ベタイン：乳酸ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、および遠心分離による粗製抽出物の回収
それぞれ１０％の水を含有する、１：２のベタイン：乳酸（ＢＬａ１／２＿１０％ｗ）混合物および１：１のベタイン：乳酸（ＢＬａ１／１＿１０％ｗ）混合物の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、これらの深共晶溶液２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）または３００ｍＬ（植物：溶媒、１：１５）と共に、室温で１時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は３２～８０％であった（図１１ａ）。次に、濾液を９倍量の水で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。沈殿物を遠心分離により回収し、一晩凍結乾燥した。最後に、乾燥ペレットを収集した。それらは２３～４０％のカルノシン酸を含有していた（ＨＰＬＣ定量化）（図１１ｂ）。最終的な質量収率は１．７～７．５％であった（図１１ｃ）。
例１３．ベタイン：乳酸ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
ここでは、例１２で実施したプロセスを、最後に追加の洗浄手順を用いて再現した。５％（ＢＬａ１／２＿５％ｗ）、１０％（ＢＬａ１／２＿１０％ｗ）、２０％（ＢＬａ１／２＿２０％ｗ）、および２５％（ＢＬａ１／２＿２５％）の水を含有する１：２のベタイン：乳酸混合物の均一溶液、および、１０％の水を含有する１：３のベタイン：乳酸混合物（ＢＬａ１／３＿１０％ｗ）の溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、１６０ｍＬ（植物：溶媒、１：８）、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）、または３００ｍＬ（植物：溶媒、１：１５）のこの深共晶溶液と共に、室温で１時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は４０～８０％であった（図１２ａ）。次に、濾液を４または９倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、水の抽出に使用した溶媒の量（１６０、２００、または３００ｍＬ）と同じ量の水を使用する追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に３３～４１％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図１２ｂ）。最終的な質量収率は０．８～４．６％の範囲であり（図１２ｃ）、これは工業標準に関して依然として十分に許容され得る。
例１４．ベタイン：グリセロールＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、および遠心分離による粗製抽出物の回収
２０％の水を含有する１：２のベタイン：グリセロール混合物（ＢＧｌｙ１／２＿２０％ｗ）の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、この深共晶溶液２００ｍＬ（１０Ｍ）と共に室温で１時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は４０％であった（図１３ａ、試料「BGly1/2_20%w_10M_RT_1h_9vol_crude」）。次に、濾液を９倍量の水で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。沈殿物を遠心分離により回収し、一晩凍結乾燥した。最後に、乾燥ペレットを収集した。それらには１７％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図１３ｂ）。最終的な質量収率は２．４％であった（図１３ｃ）。
例１５．ベタイン：グリセロールＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
ここでは、例１４で実施したプロセスを、最後に追加の洗浄手順を用いて再現した。２０％（ＢＧｌｙ１／２＿２０％ｗ）および２５％（ＢＧｌｙ１／２＿２５％ｗ）の水を含有する１：２のベタイン：グリセロール混合物の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬのこの深共晶溶液と共に室温で１時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は２２～４３％であった（図１３ａ）。次に、濾液を４または９倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に２９～４０％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図１３ｂ）。最終的な質量収率は０．２～０．８％の範囲であり（図１３ｃ）、これは工業標準に関して依然として十分に許容され得る。
例１６．ベタイン：ソルビトールＤＥＳを使用した室温でのローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
２０％（ＢＳ１／２＿２０％ｗ）、３０％（ＢＳ１／２＿３０％ｗ）、および５０％（ＢＳ１／２＿５０％ｗ）の水を含有する１：２のベタイン：ソルビトール混合物の均一溶液、ならびに、２０％（ＢＳ１／１＿２０％ｗ）、３０％（ＢＳ１／１＿３０％ｗ）および５０％（ＢＳ１／１＿５０％ｗ）を含有する１：１のベタイン：ソルビトール混合物の溶液、および３０％を含有する２：１のベタイン：ソルビトール混合物（ＢＳ２／１＿３０％ｗ）の溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、１６０ｍＬ（植物：溶媒、１：８）、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）、および３００ｍＬ（植物：溶媒、１：１５）のこの深共晶溶液と共に、室温で０．５、１、および２時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は３．９～１３．１％であった（図１４ａ）。次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、抽出に使用した溶媒の量（１６０、２００、または３００ｍＬ）と同じ量の水を使用する追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に１～１８％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図１４ｂ）。最終的な質量収率は０．１～１．７％の範囲であり（図１４ｃ）、これは工業標準に関して依然として十分に許容され得る。
例１７．ベタイン：ソルビトールＤＥＳを６０℃で使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
５０％の水を含有する１：２のベタイン：ソルビトール混合物（ＢＳ１／２＿５０％ｗ）の均一溶液、および、２０％（ＢＳ１／１＿２０％ｗ）、および５０％（ＢＳ１／１＿５０％ｗ）の水を含有する１：１のベタイン：ソルビトール混合物の溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、１６０ｍＬ（植物：溶媒、１：８）または２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に、６０℃で０．５、１、または２時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は３．９～１３．１％であった（図１５ａ）。次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、抽出に使用した溶媒の量（１６０または２００ｍＬ）と同じ量の水を使用する追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に１～１８％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図１５ｂ）。最終的な質量収率は０．１～１．７％の範囲であり（図１５ｃ）、これは工業標準に関して依然として十分に許容され得る。
例１８．ソルビトール：レブリン酸ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
２０％（ＳＬｅ１／１＿２０％ｗ）または３０％（ＳＬｅ１／１＿３０％ｗ）の水を含有する１：１のソルビトール：レブリン酸混合物の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に、室温で０．５時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率はそれぞれ５８％および２７％であった（図１６ａ）。次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的にＳＬｅ１／１＿２０％ｗについて３６％、ＳＬｅ１／１＿３０％ｗについて３１％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図１６ｂ）。最終的な質量収率は、それぞれ１．１と０．５であることが見出された（図１６ｃ）。これは工業標準に関して依然として十分に許容され得る。
例１９．ベタイン：プロリンＤＥＳを室温で使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
３０％の水を含有する１：２のベタイン：プロリン混合物の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に、室温で０．５、１、または２時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は１４～２４％であった（図１７ａ）。次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に１０～１６％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図１７ｂ）。最終的な質量収率は０．１～１．７％であることが見出され（図１７ｃ）、これは工業標準に関して依然として十分に許容され得る。
例２０．ベタイン：プロリンＤＥＳを６０℃で使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
３０％の水を含有する１：２のベタイン：プロリン混合物の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に、６０℃で０．５時間または２時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析し、２時間後に実施した抽出の回収率は３８％であった（図１８ａ）。残念ながら、０．５時間後に実施した抽出の回収率は評価されなかった。
次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に２１％（０．５時間）および２０％（２時間）のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図１８ｂ）。最終的な質量収率は、どちらの場合も２．９％であることが見出された（図１８ｃ）。
例２１．プロリン：グルコースＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
２０％（ＰＧｌｕ１／１＿２０％ｗ）または３０％（ＰＧｌｕ１／１＿３０％ｗ）の水を含有する１：１のプロリン：グルコース混合物、ならびに、それぞれが２０％の水を含有する１：２のプロリン：グルコース（ＰＧｌｕ１／２＿２０％ｗ）、２：１のプロリン：グルコース（ＰＧｌｕ２／１＿２０％ｗ）、および３：１のプロリン：グルコース（ＰＧｌｕ３／１＿２０％ｗ）の混合物の、均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に、室温、６０℃、または１００℃で、０．５、１、または２時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は６～２２％であった（図１９ａ）。次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に４～２３％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図１９ｂ）。最終的な質量収率は０．３～３％であることが見出され（図１９ｃ）、これは工業標準に関して依然として十分に許容され得る。
例２２．ベタイン：グルコースＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
３０％（ＢＧｌｕ１／２＿３０％ｗ）または５０％（ＢＧｌｕ１／２＿５０％ｗ）の水を含有する１：２のベタイン：グルコース混合物、ならびに、それぞれが２０％の水を含有する１：１のベタイン：グルコース（ＢＧｌｕ１／２＿２０％ｗ）、２：１のベタイン：グルコース（ＢＧｌｕ２／１＿２０％ｗ）、および３：１のベタイン：グルコース（ＢＧｌｕ３／１＿２０％ｗ）の混合物の、均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に、６０℃で０．５、１、または２時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は１～３５％であった（図２０ａ）。次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に１～２２％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図２０ｂ）。最終的な質量収率は１．１～１．７％であることが見出された（図２０ｃ）。
例２３．ベタイン：ピルビン酸ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
２５％の水を含有する１：２のベタイン：ピルビン酸混合物の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、１６０ｍＬ（植物：溶媒、１：８）、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）、または３００ｍＬ（植物：溶媒、１：１５）のこの深共晶溶液と共に、室温で０．５時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率はそれぞれ３４、４４、および５６％であった（図２１ａ）。
次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、抽出に使用した溶媒の量（１６０、２００、または３００ｍＬ）と同じ量の水を使用する追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に３９％（植物：溶媒、１：８）、４４％（植物：溶媒、１：１０）、および４２％（植物：溶媒、１：１５）のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図２１ｂ）。最終的な質量収率は、それぞれ１．６、２．１、および２．３％であることが見出された（図１８ｃ）。
例２４．尿素：塩化コリンＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、遠心分離とその後の濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、および遠心分離による粗製抽出物の回収
２：１の尿素：塩化コリンのニート混合物（ＵＣｈＣｌ２／１＿０％ｗ）の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に室温で１時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は１３％であった（図２２ａ、試料「UChCl2/1_0%w _10M_RT_1h_9vol_crude」）。次に、濾液を９倍量の水で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。沈殿物を遠心分離により回収し、一晩凍結乾燥した。最後に、乾燥ペレットを収集した。それらには６％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図２２ｂ）。最終的な質量収率は２．１％であった（図２２ｃ）。
例２５．グリセロール：乳酸ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
２０％の水を含有する１：１のグリセロール：乳酸混合物（ＧｌｙＬａ１／１＿２０％ｗ）の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に室温で０．５時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は２４％であった（図２２ａ）。次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に１９％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図２２ｂ）。最終的な質量収率は１．６％であることが見出された（図２２ｃ）。
例２６．グリセロール：レブリン酸ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキ除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
２０％の水を含有する１：１のグリセロール：レブリン酸混合物（ＧｌｙＬｅ１／１＿２０％ｗ）の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に室温で０．５時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は７９％であった（図２２ａ）。次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に３３％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図２２ｂ）。最終的な質量収率は０．２％であることが見出された（図２２ｃ）。
例２７．ソルビトール：乳酸ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
２０％の水を含有する１：１のソルビトール：乳酸混合物（ＳＬａ１／１＿２０％ｗ）の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に室温で０．５時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は７％であった（図２２ａ）。次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に８％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図２２ｂ）。最終的な質量収率は０．１％であることが見出された（図２２ｃ）。
例２８．キシリトール：レブリン酸ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキ除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
２０％の水を含有する１：１のキシリトール：レブリン酸混合物（ＸＬｅ１／１＿２０％ｗ）の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に室温で０．５時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は６７％であった（図２２ａ）。次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に３３％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図２２ｂ）。最終的な質量収率は０．４％であることが見出された（図２２ｃ）。
例２９．グルコース：レブリン酸ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
３０％の水を含有する１：２のグルコース：レブリン酸混合物（ＧｌｕＬｅ１／２＿３０％ｗ）の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に室温で０．５時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は７７％であった（図２２ａ）。次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に２８％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図２２ｂ）。最終的な質量収率は０．２％であることが見出された（図２２ｃ）。
例３０．プロリン：レブリン酸ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキ除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
２０％の水を含有する１：１のプロリン：レブリン酸混合物（ＰＬｅ１／１＿２０％ｗ）の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に室温で０．５時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は９５％であった（図２２ａ）。次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に３８％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図２２ｂ）。最終的な質量収率は４．１％であることが見出された（図２２ｃ）。
例３１．リシン：レブリン酸ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、濾過によるケーキの除去、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
２０％の水を含有する１：１のリシン：レブリン酸混合物（ＬＬｅ１／１＿２０％ｗ）の均一な溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に６０℃で０．５時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は５３％であった（図２２ａ）。次に、濾液を４倍量の水で室温で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置した。
次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。一晩凍結乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に３２％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）（図２２ｂ）。最終的な質量収率は２．９％であることが見出された（図２２ｃ）。
例３２．尿素：ベタインＨＣｌ ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、および遠心分離とその後の濾過によるケーキの除去
２：１の尿素：ベタインＨＣｌのニート混合物（ＵＢＨＣｌ２／１）の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に室温で１時間インキュベートし、濃縮溶液を、遠心分離とその後の濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は１０％であった（図２３）。
例３３．ベタイン：グリセロールＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、および濾過によるケーキの除去
１０％（ＢＧｌｙ１／２＿１０％ｗ）および３０％（ＢＧｌｙ１／２＿３０％ｗ）の水を含有する１：２のベタイン：グリセロール混合物、ならびに２０％の水を含有する１：１のベタイン：グリセロール混合物（ＢＧｌｙ１／１＿２０％ｗ）および３０％の水を含有する２：１のベタイン：グリセロール混合物（ＢＧｌｙ２／１＿３０％ｗ）の、均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に室温で１時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は１９～３３％であった（図２３）。
例３４．リンゴ酸：塩化コリンＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、および濾過によるケーキの除去
２０％（ＭＣｈＣｌ１／１＿２０％ｗ）および３０％（ＭＣｈＣｌ１／１＿３０％ｗ）の水を含有する１：１のリンゴ酸：塩化コリン混合物の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に室温で１時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は８～１８％であった（図２３）。
例３５．グリセロール：塩化コリンＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、および濾過によるケーキの除去
２：１のグリセロール：塩化コリンのニート混合物（ＧｌｙＣｈＣｌ２／１＿０％ｗ）、１０％の水を含有する１：１のグリセロール：塩化コリン混合物（ＧｌｙＣｈＣｌ１／１＿１０％ｗ）、および２０％の水を含有する１：２のグリセロール：塩化コリン混合物（ＧｌｙＣｈＣｌ１／２＿２０％ｗ）の、均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に室温で１時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は９～１３％であった（図２３）。
例３６．グリセロール：ソルビトールＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、および濾過によるケーキの除去
２０％の水を含有する１：１のグリセロール：ソルビトール混合物（ＧｌｙＳ１／１＿２０％ｗ）の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に室温で０．５時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は４％であった（図２３）。
例３７．リシン：レブリン酸ＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、および濾過によるケーキの除去
２０％の水を含有する１：２のリシン：レブリン酸混合物（ＬＬｅ１／２＿２０％ｗ）の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に室温で０．５時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は８７％であった（図２３）。
例３８．ベタイン：プロリンＤＥＳを使用したローズマリーの抽出、および濾過によるケーキの除去
３０％の水を含有する１：１のベタイン：プロリン混合物（ＢＰｒ１／１＿３０％ｗ）の均一溶液を調製した。２０グラムの粉砕したローズマリーの葉（２．７７％のカルノシン酸含有）を、２００ｍＬ（植物：溶媒、１：１０）のこの深共晶溶液と共に室温で０．５時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率は１４％であった（図２３）。
例３９．沈殿／凝集ステップに対するＤＥＳの組み合わせの重要性を示す陰性対照
本発明のプロセスが、例えばベタイン：レブリン酸などの２つの分子の組み合わせ（したがって、ＤＥＳの形成）を必要とすることをさらに検証するために、いくつかの陰性対照を沈殿ステップについて試験した。実際、１０％または２５％の水を含有する１：２のベタイン：レブリン酸の場合とまったく同じプロセスを、混合物中にレブリン酸のみ、ベタインの添加なしで再現した（表２）。粉砕したローズマリーの葉を、これらの混合物中、植物：溶媒の重量比１：１０で室温で１時間インキュベートした。抽出の最初のステップは、カルノシン酸回収率が８４～９３％の範囲で正常に実行されたが、水を追加した標準的な沈殿ステップを適用した後、濾過または遠心分離によって粗製抽出物を回収することはできなかった。
次に、純粋なレブリン酸（ベタインなし）を水の添加なしで直接使用し、ローズマリーの葉の抽出を、植物と溶媒の重量比１：１０で室温で１時間実施した。再度、現在ＤＥＳに適用されている手順と同じ手順で、形成された沈殿物（存在する場合）を収集することはできなかった。
最後の検証は、抽出期間が０．５時間であったこと以外は、レブリン酸のみの場合と同じ抽出および沈殿手順を使用し、４０％の水を含有するベタインのみ（水中の飽和レベルに近い）を使用して実施した。９．２％のカルノシン酸が抽出されたが、再度、沈殿物（存在する場合）の収集には失敗した。
表２．沈殿／凝集ステップに使用される陰性対照
Figure 2022537340000003
これらの陰性対照は、レブリン酸：ベタインＤＥＳの例において、粗製または精製ローズマリー抽出物を得るには２つの化合物の組み合わせが絶対に必要であることを示しており、何故ならば、対応するＤＥＳの代わりにレブリン酸のみまたはベタインのみを使用した場合には、抽出物が収集できないからである。
例４０．尿素：ベタイン深共晶で得てひまわり油に配合されたローズマリーの粗製および精製共晶抽出物の抗酸化活性（Rancimat法）
例７および８に記載の本発明のプロセスを使用し、尿素：ベタイン深共晶を用いて得た粗製（未洗浄）および精製（洗浄）ローズマリー抽出物を、それらの抗酸化活性についてRancimat法により評価した。抽出物を最終濃度１０００ｍｇ／ｋｇでひまわり油に可溶化し、Rancimat装置のガラス管に導入した。試料を１１０℃で加熱し、１０Ｌ／ｈのフラックスで空気を流して、酸化速度を加速した。収集したヘッドスペースの導電率により、酸化が大幅に増加するまでの誘導期（誘導時間）の正確な評価が可能となる。ローズマリー抽出物で処理した試料の誘導時間を、未処理のひまわり油対照の誘導時間で割ることにより、防護係数（ＰＦ）を決定できる。ＰＦが１の場合、抽出物は抗酸化作用がないことを示し、一方値が高いＰＦは抗酸化作用があることを示す。
ここでは、飽和レベル（それぞれ９５０および９５７ｇ／Ｌ）に近い２：１の尿素：ベタインまたは１：１の尿素：ベタイン混合物を使用して得られた３つの異なる粗製ローズマリー抽出物が、ＰＦが１．１～１．２の間での油配合物において顕著な抗酸化活性を示すことがわかる（図２４）。これらの粗製抽出物を洗浄して精製ローズマリー抽出物を得ると、ＰＦは劇的に増加して、１．８から２．０の範囲の値に達する。これは、本発明のプロセスに追加の洗浄手順を適用することにより、油性配合物（ここではひまわり油）の酸化安定性が２倍になったことを意味する。
例４１．ベタイン：レブリン酸ＤＥＳで得てひまわり油に配合されたローズマリーの粗製および精製された共晶抽出物の抗酸化活性（Rancimat法）
例４０で説明したものと同じRancimatプロトコルを使用して、１：２のベタイン：レブリン酸ＤＥＳを使用して得られた７つの異なる精製ローズマリー抽出物が、ＰＦが２．７～３の油配合物において顕著な抗酸化活性を示すことがわかる（図２５）。これは、本発明のプロセスに追加の洗浄手順を適用することにより、油性配合物（ここではひまわり油）の酸化安定性を３倍にすることができることを意味する。興味深いことに、我々は、アセトンによる従来の抽出とそれに続く複雑な精製プロセスを使用して得られた、標準的なローズマリー抽出物を示す。本発明の抽出物は、このローズマリー抽出物参照とほぼ同等であるか、またはさらに優れている。
例４２．Rancimatアッセイを使用して測定した防護係数と最終抽出物中のカルノシン酸含有量（％）の相関
ここでは、Rancimatアッセイを使用して測定した例４０および４１に例示の防護係数を、最終抽出物中のカルノシン酸含有量（％）の関数としてプロットした。ｙ＝０．０５２３ｘ＋０．５１７３として数学的に表すことができる線形の正の相関が、０．９６のＲ2で見出された（図２６）。これは、最終抽出物のカルノシン酸含有量が高いほど、対応する抗酸化活性が高いことを意味する。
例４３．水中の塩（ＮａＣｌ）含有量のカルノシン酸（ＣＡ）の水溶性に対する効果
最終抽出物中の高いカルノシン酸含有量と、それに伴う強力な抗酸化活性をもたらす洗浄手順をさらに改善するために、ここでは、塩化ナトリウムの添加の、ＣＡの水溶性に対する効果を調べた。図２７に示す結果は明確に、塩が洗浄手順中に失われるＣＡの量を減らすのに役立つことを示している。実際、ＣＡの水溶性は、蒸留水と酸性化蒸留水の両方に３ｇ／Ｌの塩を加えることによって大幅に低下する。したがって、洗浄手順後の遠心分離後に回収されるＣＡの量は、塩を添加することによって大幅に改善することができる。
洗浄ステップでのこの塩の添加は、２５％の水を含有する１：２のベタイン：レブリン酸混合物を使用した、室温で０．５時間、植物：溶媒の重量比１０での、粉砕したローズマリーの葉からのカルノシン酸抽出に対して実施した。濾過後のカルノシン酸の回収率は７９％であった。次に、９倍量の水を室温で１５分間磁気的に撹拌しつつ加え、さらに１５分間静置した。手順の最後に、塩化ナトリウムを添加した水（３．５％）を洗浄ステップに使用した。精製された抽出物の最終的なカルノシン酸含有量は３８％であることが見出されたが、最終的な質量収率は４．５％であった。この検証により、塩の添加が抽出物の取得に適合することを実証した。
洗浄手順に加えて、塩の添加は、貧溶媒として３ｇ／Ｌ以上の塩を添加した水を使用することにより、沈殿／凝集ステップ中にも役立つ。これにより、沈殿中に失われるＣＡの量を最小限にすることができる。
例４４．粉砕したセージの葉の抽出（１時間）、遠心分離とその後の濾過によるケーキの除去、、水を貧溶媒として用いた深共晶からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶の除去
２：１の尿素：ベタイン混合物の均一な水溶液を、飽和レベル（９５０ｇ／Ｌ）近くで調製した。２０グラムのセージ（Salvia officinalis）の葉（１．７５％のカルノシン酸含有）を２００ｍＬのこの深共晶溶液と共に周囲温度で１時間インキュベートし、濃縮溶液を遠心分離とその後の濾過によって植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、カルノシン酸の濃度は０．６７ｇ／Ｌであり、これは２８．６％の回収率に相当する。次に、濾液を水で１０倍に希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、抽出物からほとんどの深共晶を分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に攪拌し、さらに１５分間静置した。沈殿物を遠心分離により回収し、真空オーブン内で４５℃で一晩乾燥した。最後に、７．３０％のカルノシン酸を含有する５７３ｍｇの乾燥ペレット（質量収率：２．８６％）を収集し（ＨＰＬＣ定量）、これは、セージ出発物質と比較して１１．９２％の最終回収率に相当する。
その後、このプロセスを別の実験で再現した。３１．６％のカルノシン酸の回収率が、セージ残留物を除去した後の濾液において観察され、これは、以前に得られたものに匹敵する。次に、２００ｍＬの水を使用した追加の洗浄手順を適用して、残留深共晶を抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。真空オーブンで４５℃で一晩乾燥した無溶媒の共晶抽出物には、最終的に１４．３％のカルノシン酸が含まれていた（ＨＰＬＣ定量）。最終的な質量収率は１．２２％で、カルノシン酸の全体的回収率は９．９５％であった。抽出物は容易に回収可能であり、さらに粉砕可能な流動性粉末を形成する。
例４５．粉砕したウコンの根の抽出（１時間）、濾過によるケーキの除去、貧溶媒として水を使用した深共晶溶媒からの抽出物の分離、遠心分離による粗製抽出物の回収、および水での洗浄手順による残留深共晶溶媒の除去
２０％の水を含有する１：１のソルビトール：レブリン酸混合物（ＳＬｅ１／１＿２０％ｗ）、２０％の水を含有する１：１のプロリン：レブリン酸混合物（ＰＬｅ１／１＿２０％ｗ）、３０％の水を含有する１：２のベタイン：グリセロール混合物（ＢＧｌｙ１／２＿３０％ｗ）、２５％の水を含有する１：２のベタイン：レブリン酸混合物（ＢＬｅ１／２＿２５％ｗ）、および１０％の水を含有する１：２のベタイン：乳酸混合物（ＢＬａ１／２＿１０％ｗ）の、均一水溶液を調製した。２０グラムの粉砕したウコン（Curcuma longa）の葉（２．９３％のクルクミノイドと１．７４％のクルクミンを含有）を、２００ｍＬの各ＤＥＳ（植物：溶媒比：１：１０）と共に周囲温度または６０℃で１時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、回収率はクルクミノイドについて９～１１７％、クルクミンについて７～１１２％であった（図２７ａ）。次に、濾液を４倍量の水で希釈した。粗製抽出物をその後に構成する活性成分を、水を貧溶媒として用いて沈殿させるこのステップは、ＤＥＳの大部分を抽出物から分離するために不可欠である。得られた沈殿物を１５分間磁気的に撹拌し、さらに１５分間静置させた。沈殿物を遠心分離によって回収し、次に２００ｍＬの酸性水を使用して洗浄して、残留ＤＥＳを抽出物から除去し、カルノシン酸濃度をさらに増加させた。この場合も、遠心分離ステップにより、無溶媒の共晶抽出物を構成するペレットの回収が可能となる。これらの後者は一晩凍結乾燥されて、最終的にクルクミノイドを２１～４６％、クルクミンを１２～２６％含んでいた（ＨＰＬＣ定量）（図２７ｂ）。最終的な質量収率は０．２～３．９％であった（図２７ｃ）。
例４６．１：２のベタイン：乳酸ＤＥＳを使用して例４５で得られた精製（洗浄）ウコン抽出物の化学組成
表３は、１０％の水を含有する１：２のベタイン：乳酸を使用して得られ、例４５および図２７で説明されている共晶ウコン抽出物に見出される、同定された化合物の一部を示す（試料「BLa1/2_10%w_10M_1h_4vol_1washed」）。
表３．共晶ウコン精製抽出物中で同定された化合物
Figure 2022537340000004
例４７．粉砕したオレンジ（Citrus sinensis）の皮の抽出（１時間）および濾過によるケーキの除去
２０％の水を含有する１：１のソルビトール：レブリン酸混合物（ＳＬｅ１／１＿２０％ｗ）、２０％の水を含有する１：１のプロリン：レブリン酸混合物（ＰＬｅ１／１＿２０％ｗ）、３０％の水を含有する１：２のベタイン：グリセロール混合物（ＢＧｌｙ１／２＿３０％ｗ）、２５％の水を含有する１：２のベタイン：レブリン酸混合物（ＢＬｅ１／２＿２５％ｗ）、および１０％の水を含有する１：２のベタイン：乳酸混合物（ＢＬａ１／２＿１０％ｗ）の、均一水溶液を調製した。２０グラムの粉砕したオレンジの皮（２．６７％のヘスペリジン含有）を２００ｍＬの各ＤＥＳ（植物：溶媒比：１：１０）と共に周囲温度で１時間インキュベートし、濃縮溶液を濾過により植物から分離した。濾液をＨＰＬＣで分析したところ、ヘスペリジンの回収率は４９～９３％であった（図２９）。

Claims (31)

  1. 固体の生物学的抽出物を提供するための方法であって、以下：
    ｉ）生物学的材料を、水および深共晶溶媒（ＤＥＳ）を含む抽出溶液と混合すること；および
    ｉｉ）未溶解の生物学的材料を、（ｉ）で得られた溶液から除去すること；
    ｉｉｉ）凝集塊および／または沈殿物を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に水を加えることおよび／または冷却することにより、得ること；
    ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた固形物を、溶液から収集すること；および
    ｖ）任意に、ステップ（ｉｖ）で得られた固形物を乾燥すること、
    を含む、前記方法。
  2. 固体の生物学的抽出物を提供するための方法であって、以下：
    ｉ）生物学的材料を、深共晶溶媒（ＤＥＳ）を含む抽出溶液と混合すること；および
    ｉｉ）未溶解の生物学的材料を、（ｉ）で得られた溶液から除去すること；
    ｉｉｉ）凝集塊および／または沈殿物を、ステップ（ｉｉ）で得られた溶液に水を加えることおよび／または冷却することにより、得ること；
    ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた固形物を、溶液から収集すること；および
    ｖ）任意に、ステップ（ｉｖ）で得られた固形物を乾燥すること、
    を含み、ここで、ステップｉ）の溶液が水を含まない、前記方法。
  3. 生物学的抽出物が、少なくとも２重量％の親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物が、生物学的材料からの、以下を包含するフェノール化合物：フェノール酸（サリチル酸、ロスマリン酸またはカフェー酸など）、フェノール性エステル、フェノール性ジテルペン（カルノシン酸およびその誘導体など）、フラボノイド（ヘスペリジンまたはルテオリングルクロニドなど）、セコイリドイド、クルクミノイド（クルクミン、デメトキシクルクミンまたはビスデメトキシクルクミンおよびその誘導体など）、ビキシン、カプサイシノイド、カンナビノイド、ピラノアントシアニン、スチルベン、フェノールアルコール、フェノール脂質（ショウガオールまたはユビキノールなど）、シリマリン、アルカロイド、脂質、フェニルプロパノイド、クマリン（ジメトキシクマリンなど）、有機酸（リンゴ酸または酒石酸など）、以下を包含するテルペノイド：モノテルペノイド、セスキテルペノイド（ターメロン、クルクマジオン、プロクルクマジオールまたはデヒドロクルジオンなど）、ジテルペノイド（カルノシン酸またはヒドロキシクリプトタンシノンなど）、サポニン、リグナン、アントラキノン、グルコシノラート、スルフォラファンおよびイソチオシアナート、トリテルペノイド（ウルソール酸など）、サポゲニンまたはカロテノイド、およびそれらの混合物の１つ以上を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 生物学的抽出物が、生物学的材料に存在する少なくとも２重量％のカルノシン酸および／またはその誘導体および／または他の親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 生物学的抽出物が、生物学的材料に存在する少なくとも２重量％のクルクミンおよび／またはクルクミノイドおよび／またはその誘導体および／または他の親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 生物学的材料が、液体形態または固体形態である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  8. 生物学的材料が、植物の生物学的材料である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 植物の生物学的材料が、植物の根、植物の地上部、またはそれらの混合物から得られたかまたは得ることができる、請求項８に記載の方法。
  10. 植物の生物学的材料が、シソ科の種の少なくとも１つの植物から得られたかまたは得ることができる、請求項８または９に記載の方法。
  11. シソ科の種の少なくとも１つの植物が、バジル、ミント、ローズマリー、セージ、セイボリー、マジョラム、オレガノ、ヒソップ、タイム、ラベンダー、エゴマのうちの１つ以上およびそれらの混合物である、請求項１０に記載の方法。
  12. 少なくとも１つの植物が、ショウガ科の植物（ウコンなど）または柑橘類属の植物（C. sinensis、C. medica、C. reticulateなど）である、請求項８または９に記載の方法。
  13. ＤＥＳが、メチルアミン、有機酸、糖、ポリオール、アミノ酸、および尿素から選択される少なくとも２つの化合物を組み合わせることによって得られる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. ａ．メチルアミンが、Ｎ－トリメチルアミンオキシド（ＴＭＡＯ）、ベタイン、グリセロホスホコリン、カルニチン、ホマリン、塩化コリン、およびジメチルスルホノプロピオナート（ＤＭＳＰ）を含むメチルスルホニウム溶質、ならびにそれらの誘導体、例えば、ベタインハライド（ベタインＨＣｌ）などのそれらのハロゲン化物形態から選択され；
    ｂ．有機酸が、レブリン酸、乳酸、リンゴ酸、マレイン酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、クエン酸、シトラコン酸、グルタル酸、グリコール酸、酢酸、アコニチン酸、酒石酸、アスコルビン酸、マロン酸、シュウ酸、グルクロン酸、ノイラミン酸、シアル酸、シキミン酸、フィチン酸、ガラクツロン酸、イズロン酸、ヒアルロン酸、ヒドロキシクエン酸、ラクトン誘導体およびそれらの誘導体から選択され；
    ｃ．糖が、トレハロース、グルコース、スクロース、ラクトース、リボース、フルクトース、ガラクトースおよびそれらの誘導体から選択され；
    ｄ．ポリオールが、グリセロール、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、リビトール、アルドニトール、プロパンジオール、イノシトール、ペンチレングリコール、およびそれらの誘導体（ｏ－メチル－イノシトールなど）から選択され；
    ｅ．アミノ酸が、グリシン、プロリン、タウリン、リシン、およびそれらの誘導体（エクトイン、サルコシン、テアニン、ジメチルグリシンなど）から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. ＤＥＳが、尿素とベタイン、グリセロールとベタイン、ピルビン酸とベタイン、塩化コリンと尿素、グリセロールと塩化コリン、リンゴ酸と塩化コリン、レブリン酸とベタイン、乳酸とベタイン、ソルビトールとレブリン酸、ベタインとソルビトール、プロリンとレブリン酸、ベタインとプロリン、ベタインとグルコース、プロリンとグルコース、リシンとレブリン酸、グリセロールとソルビトール、グリセロールと乳酸、グルコースとレブリン酸、キシリトールとレブリン酸、ソルビトールと乳酸、尿素とベタインＨＣｌ、またはグリセロールとレブリン酸である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ステップ（ｉ）で使用される抽出溶液中のＤＥＳの濃度が、少なくともＤＥＳの最小ハイドロトロピック濃度（ＭＨＣ）である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ＤＥＳの濃度が、ＤＥＳの最小ハイドロトロピック濃度（ＭＨＣ）の約１～約２０倍、例えば約２～約１６倍または約４～約８倍である、請求項１４または１５に記載の方法。
  18. ＤＥＳが抽出溶媒中に、抽出溶媒の総重量に対して１重量％～約１００重量％の濃度で存在する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 生物学的材料が、水およびＤＥＳを含む抽出溶媒と混合され、ここでＤＥＳの濃度が、抽出溶媒の約１重量％～約９９重量％である、請求項１６に記載の方法。
  20. ｖｉ）ステップ（ｉｖ）または（ｖ）で得られた固体を水で約１～約１０回以上洗浄し、得られた固形物を回収し、および任意に固形物を乾燥すること；
    をさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 請求項１～２０のいずれか一項に規定の方法を使用して得られたかまたは得ることができる、生物学的抽出物。
  22. 抽出物が、少なくとも０．０５重量％の親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物の抽出物を含む、請求項２１に記載の生物学的抽出物。
  23. 抽出物が、約２重量％以上の親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物の抽出物、または約１０重量％以上の親油性、疎水性、油溶性および／または非水溶性化合物の抽出物を含む、請求項２２に記載の生物学的抽出物。
  24. 抽出物が、約２重量％以上のカルノシン酸および／またはヘスペリジンの抽出物を含む、請求項２２または２３に記載の生物学的抽出物。
  25. 抽出物が、約２重量％以上のクルクミンおよび／またはクルクミノイドの抽出物を含む、請求項２２または２３に記載の生物学的抽出物。
  26. 抽出物が、約２重量％以下のＤＥＳの抽出物または約０．０４重量％以下のＤＥＳの抽出物を含む、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の生物学的抽出物。
  27. 抽出物が、１つ以上の抗酸化化合物、抗微生物化合物、抗炎症化合物、着色料または色素、ビタミン、界面活性剤、フレーバー剤、フレグランスおよび／または味覚修飾化合物を含む、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の生物学的抽出物。
  28. 抗酸化剤、抗微生物剤、抗炎症剤として、着色料または色素として、ビタミンとして、界面活性剤として、フレーバー剤として、フレグランスとして、および／または味覚修飾剤として使用するための、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の生物学的抽出物。
  29. 請求項２１～２６のいずれか一項に記載の生物学的抽出物の、抗酸化剤、抗微生物剤、抗炎症剤としての、着色料または色素としての、ビタミンとしての、界面活性剤としての、フレーバー剤としての、フレグランスとしてのおよび／または味覚修飾剤としての、使用。
  30. 栄養補助食品組成物、ヒトまたは動物用の食品または食品製品、栄養サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬品、獣医学用組成物、またはワイン醸造もしくは化粧品配合物において使用するための請求項２１～２６のいずれか一項に記載の生物学的抽出物。
  31. 請求項２１～２６のいずれか一項に記載の生物学的抽出物、および任意に、薬学的／獣医学的に許容し得る成分、例えば賦形剤もしくは担体、または食品に許容し得る成分またはそれらの混合物を含む、栄養補助食品組成物、ヒトまたは動物用の食品または食品製品、栄養サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬品、獣医学用組成物、またはワイン醸造もしくは化粧品配合物。
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