JP2022536574A

JP2022536574A - 固体形態のｂｒｄ４阻害剤化合物およびその調製方法およびその使用

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Publication number: JP2022536574A
Application number: JP2021558494A
Authority: JP
Inventors: チュンリーシェン; ヨンリウ; ホアンユイピエン; チョントーウー; チアフーウー
Original assignee: シーエスピーシーチョンチーファーマシューティカルテクノロジー（シーチアチョアン）カンパニー，リミティド
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2020-03-23
Publication date: 2022-08-18
Also published as: EP3943498A4; AU2020248834A1; US20220185820A1; CA3134071A1; CN113646312B; EP3943498A1; KR20210151841A; WO2020192637A1; AU2020248834B2; CN113646312A

Abstract

ＢＲＤ４阻害剤として使用される式（Ｉ）の化合物の固体形態および結晶形、その調製方法、ならびにＢＲＤ４関連疾患を治療するための薬剤の調製におけるそれらの使用を開示する。TIFF2022536574000018.tif54137

Description

本開示は、小分子ＢＲＤ４阻害剤としての式（Ｉ）の化合物の固体形態および結晶形、ならびにその調製方法に関するものであり、ＢＲＤ４関連疾患を治療するための薬剤の製造におけるそれらの使用に関する。

ヒストンアセチル化は遺伝子の転写および染色体構造を制御し、エピジェネティクスにおいて重要な役割を果たす。ヒストンアセチル化認識遺伝子の「リーダー」として、ＢＥＴ（ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎａｎｄｅｘｔｒａ－ｔｅｒｍｉｎａｌｄｏｍａｉｎ）タンパク質はアセチル化されたリジン残基に特異的に結合し、他の転写因子を動員することができる。タンパク質間相互作用に関与することにより、メディエーター複合体が形成され、ＲＮＡポリメラーゼをリン酸化し、遺伝子転写を活性化し、ｃ－Ｍｙｃおよびその他の下流遺伝子を制御する。がん細胞の増殖は特定の遺伝子（たとえば、ｃ－Ｍｙｃ）に大きく依存しており、特定の遺伝子の発現の増強は、がん細胞の増殖において重要な役割を果たす。研究によると、腫瘍細胞は特定の遺伝子に過度に依存しているため、ＢＥＴ阻害剤に高い感受性がある。ＢＥＴ阻害剤の存在は、ＢＥＴタンパク質がヒストンアセチル化リジンに結合することを阻止し、それによって、転写因子によるＭｙｃの発現をブロックし、腫瘍の成長を阻害する。

ＢＥＴタンパク質ファミリーは、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴの４つのメンバーからなり、各メンバーは２つのＮ末端タンデム（ＢＤ１およびＢＤ２）、ｅｘｔｒａ－ｔｅｒｍｉｎａｌｄｏｍａｉｎ（ＥＴ）、いくつかの保存領域（Ａ、Ｂ、ＳＥＥＤ領域）、およびＣ末端モチーフ（ＣＴＭ）からなる。その中で、ＢＲＤ４は最も広く研究されているメンバーであり、リンパ腫（たとえば、急性骨髄リンパ腫）、白血病（たとえば、急性リンパ性白血病）を含む血液腫瘍、骨髄腫（たとえば、多発性骨髄腫）、および固形腫瘍、たとえば神経細胞腫、神経膠腫、乳がん（たとえば、トリプルネガティブ乳がん）、胃腸腫瘍（たとえば、結腸直腸がん）、および前立腺がん等の発生は、すべてＢＲＤ４の過剰発現に関連していることが見出されているが、ＢＲＤ４を標的とする薬剤はこれまで市場で承認されていない。

一つの態様では、本開示は、固体形態の式（Ｉ）：

を提供する。

本開示の一部の実施形態では、固体形態は、結晶形である。

本開示の一部の実施形態では、結晶形は、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａである：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、１４．００±０．２°。

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ａは、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、２０．０７±０．２°

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ａは、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する：７．０３±０．２°、１９．４８±０．２°、２０．０７±０．２°、２６．０５±０．２°。

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ａは、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、１７．３１±０．２°、１９．４８±０．２°、２０．０７±０．２°、２６．０５±０．２°

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ａは、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、１４．００±０．２°、１５．１１±０．２°、１７．３１±０．２°、１９．４８±０．２°、２０．０７±０．２°、２２．８６±０．２°。

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ａは、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、１４．００±０．２°、１５．１１±０．２°、１７．３１±０．２°、１９．４８±０．２°、２０．０７±０．２°、２６．０５±０．２°。

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ａは、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、１２．３９±０．２°、１４．００±０．２°、１５．１１±０．２°、１７．３１±０．２°、１９．４８±０．２°、２０．０７±０．２°、２２．８６±０．２°、２６．０５±０．２°。

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ａは、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、１２．３９±０．２°、１４．００±０．２°、１４．８７±０．２°、１５．１１±０．２°、１７．３１±０．２°、１９．４８±０．２°、２０．０７±０．２°、２２．８６±０．２°。

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ａは、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、１２．３９±０．２°、１４．００±０．２°、１４．８７±０．２°、１５．１１±０．２°、１７．３１±０．２°、１９．４８±０．２°、２０．０７±０．２°、２２．８６±０．２°、２６．０５±０．２°。

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ａは、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、１２．３９±０．２°、１４．００±０．２°、１４．８７±０．２°、１５．１１±０．２°、１７．３１±０．２°、１７．６８±０．２°、１９．４８±０．２°、２０．０７±０．２°、２２．８６±０．２°。

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ａは、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、１２．３９±０．２°、１４．００±０．２°、１４．８７±０．２°、１５．１１±０．２°、１７．３１±０．２°、１７．６８±０．２°、１９．４８±０．２°、２０．０７±０．２°、２２．８６±０．２°、２６．０５±０．２°。

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ａは、実質的に図１に示すＸＲＰＤ（粉末Ｘ線回折）パターンを有する。

本開示の一部の実施形態では、結晶形ＡのＸＲＰＤパターン分析データは、表１に示すとおりである：

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ａは、２８９．２２±３℃において吸熱ピークの開始を有する示差走査熱量測定曲線を有する

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ａは、実質的に図２に示すＤＳＣ（示差走査熱量測定）曲線を有する。

本開示の一部の実施形態では、熱重量分析パターンにおける結晶形Ａの重量減少は、３００．００±３℃で１．６２６％である。

本開示の一部の実施形態では、結晶形ＡのＴＧＡ（熱重量分析）パターンは、実質的に図３に示すとおりである。

本開示の一部の実施形態では、結晶形は、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂである：５．５０±０．２°、８．３６±０．２°、１１．８７±０．２°。

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ｂは、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する：５．５０±０．２°、８．３６±０．２°、１２．６６±０．２°

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ｂは、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する：５．５０±０．２°、８．３６±０．２°、１１．８７±０．２°、１２．３９±０．２°、１２．６６±０．２°、１５．１１±０．２°、１７．３５±０．２°、１８．７０±０．２°。

本開示の一部の実施形態では、結晶形Ｂは、実質的に図４に示すＸＲＰＤパターンを有する。

本開示の一部の実施形態では、結晶形ＢのＸＲＰＤパターン分析データは、表２に示すとおりである：

別の態様では、本開示はまた、固体形態の式（Ｉ）の化合物の製造方法を提供し、ここで、固体形態は結晶形Ａであり、以下の工程を含む：
（１）式（Ｉ）の化合物を溶媒に添加して、懸濁液または溶液を形成する工程；
（２）懸濁液または溶液を、恒温サーモミキサーで撹拌し、次に分離し、乾燥して、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａを得る工程。

本開示の一部の実施形態では、製造方法の工程（２）における分離は、遠心分離または濾過である。

本開示の一部の実施形態では、製造方法の工程（２）における分離は、遠心分離である。

本開示の一部の実施形態では、製造方法の溶媒は、Ｃ_1-4アルキル－Ｏ－Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルキルＣ（＝Ｏ）ＯＣ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルキル－ＣＮ、Ｃ_1-4アルキル－ＯＨ、またはＣ_1-4アルキルＣ（＝Ｏ）Ｃ_1-4アルキルからなる群から選択される単一溶媒である。

本開示の一部の実施形態では、製造方法の単一溶媒は、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、酢酸エチル、アセトニトリル、エタノール、アセトン、メタノール、またはメチルエチルケトンである。

本開示の一部の実施形態では、製造方法の溶媒は、Ｃ_1-4アルキルＣ（＝Ｏ）Ｃ_1-4アルキルおよび水の混合溶媒、またはＣ_1-4アルキル－ＯＨおよび水の混合溶媒である。

本開示の一部の実施形態では、製造方法のＣ_1-4アルキルＣ（＝Ｏ）Ｃ_1-4アルキルおよび水からなる混合溶媒について、Ｃ_1-4アルキルＣ（＝Ｏ）Ｃ_1-4アルキルと水の体積比は１～５：１、好ましくは２：１であり；またはＣ_1-4アルキル－ＯＨおよび水からなる混合溶媒について、Ｃ_1-4アルキル－ＯＨと水の体積比は１～５：１、好ましくは３：１である。

本開示の一部の実施形態では、製造方法の混合溶媒は、アセトンおよび水の混合溶媒、またはエタノールおよび水の混合溶媒である。

本開示の一部の実施形態では、製造方法の混合溶媒は、２：１の体積比のアセトン－水の混合溶媒、または３：１の体積比のエタノール－水の混合溶媒である。

用語「Ｃ_1-4アルキル」は、１～４個の炭素原子を含む任意の直鎖または分岐鎖基、たとえばメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル等を指す。

本開示の一部の実施形態では、製造方法の化合物と溶媒との重量対体積比は、１ｇ：５～１５ｍＬ、または１ｇ：５～１２ｍＬ、または１ｇ：５～１０ｍＬである。

本開示の一部の実施形態では、製造方法の撹拌温度は２５℃～４５℃である。

本開示の一部の実施形態では、製造方法の撹拌時間は１２時間～５０時間、または１２時間～４８時間、または１２時間～２４時間である。

別の態様では、本開示はまた、固体形態の式（Ｉ）の化合物の製造方法を提供し、ここで、固体形態は結晶形Ｂであり、以下の工程を含む：
（１）式（Ｉ）の化合物を溶媒に添加して、懸濁液または溶液を形成する工程；
（２）懸濁液または溶液を、恒温サーモミキサーで撹拌し、次に分離し、乾燥して、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂを得る工程。

本開示の一部の実施形態では、製造方法の溶媒はテトラヒドロフランである。

本開示の一部の実施形態では、製造方法の化合物と溶媒との重量対体積比は、１ｇ：５～１０ｍＬである。

別の態様では、本開示は、上記のように、固体形態の式（Ｉ）の化合物または任意の２つ以上の結晶形の結晶混合物を含む医薬組成物を提供する。

別の態様では、本開示はまた、ＢＲＤ４関連疾患を治療するための薬剤の製造のための、固体形態の式（Ｉ）の化合物または上記の医薬組成物の使用も提供する。

本開示の一部の実施形態では、ＢＲＤ４関連疾患は腫瘍を含む。

本開示の一部の実施形態では、上記使用は、腫瘍が血液腫瘍および進行性固形腫瘍を含み、ここで該血液腫瘍は白血病、リンパ腫、および骨髄腫を含み、該進行性固形腫瘍は神経細胞腫、神経膠腫、乳がん、胃腸腫瘍、および前立腺がんを含む；好ましくは、白血病は急性リンパ性白血病であるか、またはリンパ腫は急性骨髄性リンパ腫であるか、または乳がんはトリプルネガティブ乳がんであるか、または胃腸腫瘍は結腸直腸がんであることを特徴とする。

別の態様では、本開示はまた、ＢＲＤ４関連疾患の治療における使用のための固体形態の式（Ｉ）の化合物または上記の医薬組成物にも関する。

本開示の一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の固体形態または上記の医薬組成物、ここでＢＲＤ４関連疾患は腫瘍を含む。

本開示の一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の固体形態または上記の医薬組成物、ここで腫瘍は血液腫瘍および進行性固形腫瘍を含み、ここで該血液腫瘍は白血病、リンパ腫、および骨髄腫を含み、該進行性固形腫瘍は神経細胞腫、神経膠腫、乳がん、胃腸腫瘍、および前立腺がんを含む；好ましくは、白血病は急性リンパ性白血病であるか、またはリンパ腫は急性骨髄性リンパ腫であるか、または乳がんはトリプルネガティブ乳がんであるか、または胃腸腫瘍は結腸直腸がんである。

本開示の一部の実施形態では、対象の疾患を治療する方法、ここで疾患は腫瘍を含む。

本開示の一部の実施形態では、対象の疾患を治療する方法、ここで腫瘍は血液腫瘍および進行性固形腫瘍を含み、ここで該血液腫瘍は白血病、リンパ腫、および骨髄腫を含み、該進行性固形腫瘍は神経細胞腫、神経膠腫、乳がん、胃腸腫瘍、および前立腺がんを含む；好ましくは、白血病は急性リンパ性白血病であるか、またはリンパ腫は急性骨髄性リンパ腫であるか、または乳がんはトリプルネガティブ乳がんであるか、または胃腸腫瘍は結腸直腸がんである。

「対象」は、哺乳動物（たとえば、マウス、ラット、ネコ、サル、イヌ、ウマ、ブタ等）、およびヒトを含むがこれらに限定されない、動物のすべてのメンバーを含む。

用語「実質的に図〇に示す」は、粉末Ｘ線回折パターンまたはＤＳＣ曲線またはＴＧＡパターンにおけるピークの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、その図に示されていることを意味する。

定義および説明
本明細書で使用されている以下の用語およびフレーズは、特に明記されていない限り、以下の意味を持つことを意図している。特定のフレーズまたは用語は、具体的に定義されていない限り、不明確（ｉｎｄｅｆｉｎｉｔｅ）または不明確（ｕｎｃｌｅａｒ）であると見なされるべきではなく、一般的な意味に従って解釈されるべきである。ブランド名が本明細書で使用される場合、それは、その対応する市販製品またはその有効成分を指すことを意図している。

本開示の中間化合物は、以下に例示する特定の実施形態、それらと他の化学合成法との組み合わせによって形成される実施形態、および当業者に周知のそれらの同等物を含む、当業者に周知の多くの合成方法によって製造することができ、好ましい実施形態は、本開示の例が含むが、これらに限定されない。

本開示の特定の実施形態の化学反応は、本開示の化学変化およびそれに必要な試薬および材料に適合性する好適な溶媒中で行われる。本開示の化合物を得るために、当業者は、既存の実施形態に基づいて、合成工程または反応スキームを変更または選択する必要がある場合がある。

本開示は、本開示を決して限定することを意図するものではない例として、以下に具体的に説明される。

本開示で使用されるすべての溶媒は市販されており、さらに精製することなく使用することができる。

本開示で使用される溶媒は、商業的に入手することができる。本開示は、以下の略語を使用する：ＤＣＭはジクロロメタンを表す；ＤＭＦはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを表す；ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを表す；ＥｔＯＨはエタノールを表す；ＭｅＯＨはメタノールを表す；ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を表す；ＴｓＯＨはｐ－トルエンスルホン酸を表す；ｍｐは融点を表す；ＥｔＳＯ₃Ｈはエタンスルホン酸を表す；ＭｅＳＯ₃Ｈはメタンスルホン酸を表す；ＡＴＰはアデノシン三リン酸を表す；ＨＥＰＥＳは４－ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸を表す；ＥＧＴＡはエチレングリコールビス（２－アミノエチルエーテル）四酢酸を表す；ＭｇＣｌ₂は二塩化マグネシウムを表す；ＭｎＣｌ₂は二塩化マンガンを表す；ＤＴＴはジチオスレイトールを表す。

技術的効果
本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物は、良好な結晶形安定性を有し、薬剤の製造が容易である；本開示の結晶形は、ＢＲＤ４に対して優れた活性を示し、より良好な薬物動力学特性および経口吸収速度を有し、高活性、良好な代謝安定性、良好な溶解性、経口投与への適合性等の特徴を有し、ＢＲＤ４の異常発現によって引き起こされる疾患に対してより効果的な治療を提供することができる。

１．１粉末Ｘ線回折（Ｘ線粉末回折計、ＸＲＰＤ）
機器モデル：ＢｒｕｋｅｒＤ８ａｄｖａｎｃｅｄＸ－ｒａｙｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ
試験方法：ＸＲＰＤの検出には、約１０～２０ｍｇのサンプルを使用した。
詳細なＸＲＰＤパラメーターは次のとおりである：
Ｘ線発生装置：Ｃｕ、ｋα、（λ＝１．５４０５６Å）
管電圧：４０ｋＶ、管電流：４０ｍＡ
出射スリット：１度
高さ制限スリット（Ｈｅｉｇｈｔｌｉｍｉｔｉｎｇｓｌｉｔ）：１０ｍｍ
散乱スリット：１度
受光スリット：０．１５ｍｍ
モノクロメーター：固定されたモノクロメーター
走査範囲：結晶形Ａについて：４～３３度、および結晶形Ｂについて：４～３５度
走査速度：１０度／分

１．２示差走査熱量測定（示差走査熱量計、ＤＳＣ）
機器モデル：ＴＡＱ２０００ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｃａｎｎｉｎｇｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ
試験方法：サンプル（０．５～１ｍｇ）をＤＳＣアルミニウムポットに入れて試験し、サンプルを５０ｍＬ／分Ｎ₂の条件下で１０℃／分の加熱速度で３０℃から３００℃に加熱した。

１．３熱重量分析（熱重量分析機器、ＴＧＡ）
機器モデル：ＴＡＱ５０００ＩＲｔｈｅｒｍａｌｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃａｎａｌｙｚｅｒ
試験方法：サンプル（２～５ｍｇ）をＴＧＡプラチナパンに入れて試験し、サンプルを室温から２５ｍＬ／分Ｎ₂の条件下で１０℃／分の加熱速度で２０％の重量減少まで加熱した。

１．４本開示の動的水蒸気吸着（ＤｙｎａｍｉｃＶａｐｏｒＳｏｒｐｔｉｏｎ；ＤＶＳ）分析方法
機器モデル：ＳＭＳＤＶＳａｄｖａｎｔａｇｅｄｙｎａｍｉｃｖａｐｏｒｓｏｒｐｔｉｏｎａｎａｌｙｚｅｒ
試験条件：サンプル（１０～２０ｍｇ）は、試験のためにＤＶＳサンプルトレイに配置した。
詳細なＤＶＳパラメーター：
温度：２５℃
バランシング：ｄｍ／ｄｔ＝０．０１％／分（最短：１０分、最長：１８０分）
乾燥：１２０分間、０％ＲＨでの乾燥
ＲＨ（％）試験工程：１０％
ＲＨ（％）試験工程範囲：０％～９０％～０％

吸湿性の評価は次のように分類された。

式（Ｉ）の化合物の結晶形ＡのＣｕ－Ｋα放射線のＸＲＰＤパターンである。式（Ｉ）の化合物の結晶形ＡのＤＳＣ曲線である。式（Ｉ）の化合物の結晶形ＡのＴＧＡパターンである。式（Ｉ）の化合物の結晶形ＢのＣｕ－Ｋα放射線のＸＲＰＤパターンである。式（Ｉ）の化合物の結晶形ＡのＤＶＳ等温線（ＤＶＳｉｓｏｔｈｅｒｍ）である。

特定の実施形態
本開示をよりよく理解するために、特定の実施例を参照して以下の図を作成するが、本開示は特定の実施形態に限定されない。

実施例１：式（Ｉ）の化合物の調製

工程１：
化合物１－１（２５．００ｇ、１３９．２０ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ）、２－ブタノン（１１．０４ｇ、１５３．１２ｍｍｏｌ、１３．６３ｍＬ、１．１０ｅｑ）、およびモルホリン（１２．１３ｇ、１３９．２０ｍｍｏｌ、１２．２５ｍＬ、１．００ｅｑ）をエタノール（２００．００ｍＬ）に溶解し、続いて硫黄華（４．４６ｇ、１３９．２０ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）を添加した。懸濁液を７０℃に加熱し、窒素ガス保護下で１２時間撹拌した。反応物を最初に減圧下で蒸発させて黄色の油を得、これに水（５００ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（２００ｍＬ×４）で抽出した。合わせた有機相を集め、飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗製物をシリカゲルカラム（石油エーテル／酢酸エチル＝１０／１）で精製して、化合物１－２を得た。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm 7.47 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.38 (d, J=8.0 Hz, 2H), 6.43 (br s, 2H), 2.13 (s, 3H), 1.56 (s, 3H).

工程２：
化合物１－２（１０．００ｇ、３７．６３ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）をクロロホルム（１００．００ｍＬ）に溶解し、２－クロロアセチルクロリド（６．３７ｇ、５６．４５ｍｍｏｌ、４．４９ｍＬ、１．５０ｅｑ）を滴下した後、反応物を７０℃で１時間撹拌した。反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液（１００ｍＬ）および飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、続いて無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた粗化合物をメタノール（４０ｍＬ）から再結晶して化合物１－３を得た。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm 11.81 (br s, 1H), 7.58 (dd, J=2.0, 6.4Hz, 2H), 7.45 (dd, J=2.2, 8.6Hz, 2H), 4.25 (s, 2H), 2.29 (s, 3H), 1.72 (s, 3H).

工程３：
化合物１－３（１１．００ｇ、３２．１４ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびヨウ化ナトリウム（９．６３ｇ、６４．２８ｍｍｏｌ、２．００ｅｑ）をテトラヒドロフラン（５０．００ｍＬ）に添加し、混合物を６０℃で２時間撹拌した。反応物を減圧下で直接蒸発させて化合物１－４を得て、これを精製せずに次の反応に直接使用した。 LCMS (ESI) m/z: 433.9 (M+1).

工程４：
化合物１－４（１４．００ｇ、３２．２８ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）をテトラヒドロフラン（１００．００ｍＬ）に溶解し、－６０℃に冷却し、アンモニアガスを３０分間充填した。反応混合物をゆっくりと２０℃に加熱し、３時間撹拌した。反応物を減圧下で直接蒸発させた。得られた固体を酢酸エチル（１５０ｍＬ）に溶解し、水（５０ｍＬ×３）および飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた、濾過し、次に減圧下で蒸発させて化合物１－５を得て、これを次の反応で直接使用した。 LCMS (ESI) m/z: 322.9 (M+1), 344.9 (M+Na).

工程５：
化合物１－５（１０．００ｇ、３０．９８ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）をイソプロパノール（１５０．００ｍＬ）および氷酢酸（５０．００ｍＬ）に溶解し、９０℃で３時間撹拌した。溶媒を減圧下で反応溶液から除去した。残りの混合物をクロロホルム（２０ｍＬ）に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍＬ）および飽和食塩水（２０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、次に減圧下で蒸発させた。粗生成物を酢酸エチル（５０ｍＬ）から再結晶して、化合物１－６を得た。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm 8.98 (br s, 1H), 7.46 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.35 (d, J=8.4Hz, 2H), 4.80 (d, J=8.8Hz, 1H), 3.93 (d, J=8.6Hz, 1H), 2.28 (s, 3H), 1.59 (s, 3H).

工程６：
五硫化リン（１７．０７ｇ、７６．７９ｍｍｏｌ、８．１７ｍＬ、３．６０ｅｑ）を、１，２－ジクロロエタン（２００．００ｍＬ）中の炭酸ナトリウム（４．０７ｇ、３８．３９ｍｍｏｌ、１．８０ｅｑ）の連続撹拌懸濁液に添加し、２０℃で１時間撹拌し、次に化合物１－６（６．５０ｇ、２１．３３ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）を添加した。得られた懸濁液を６５℃で５時間反応させた。反応混合物を２０℃に冷却して濾過し、フィルターケーキを酢酸エチル（２Ｌ）に溶解し、飽和食塩水（５００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗化合物をシリカゲルカラム（石油エーテル／酢酸エチル＝５／１）で精製、化合物１－７を得た。

工程７：
メタノール（５．００ｍＬ）中の化合物１－７（３．５０ｇ、１０．９１ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）の懸濁液に、０℃でヒドラジン水和物（１．６７ｇ、３２．７２ｍｍｏｌ、１．６２ｍＬ、純度９８％、３．００ｅｑ）を添加し、反応物を０℃で１時間撹拌した。反応混合物を濾過し、フィルターケーキをオーブン乾燥して化合物１－８を得て、これを次の反応に直接使用した。 LCMS (ESI) m/z: 318.9 (M+1).

工程８：
トルエン（１００．００ｍＬ）中の化合物１－８（２．５０ｇ、７．８４ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）の混合物に、オルト酢酸トリエチル（３．８２ｇ、２３．５２ｍｍｏｌ、４．２９ｍＬ、３．００ｅｑ）を添加した。反応物を８０℃で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で直接蒸発させ、粗化合物を酢酸エチル（１０ｍＬ）から再結晶させて、化合物１－９を得た。 LCMS (ESI) m/z: 344.9 (M+1).

工程９：
テトラヒドロフラン（１８０ｍＬ）中の化合物１－９（１．５０ｇ、４．３８ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液に、ＬｉＨＭＤＳ（１Ｍ、８．７６ｍＬ、２．００ｅｑ）を－７０℃で滴下して添加した。反応物をこの温度で１時間撹拌し、次にテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中の２－ブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（１．２８ｇ、６．５７ｍｍｏｌ、９７０．８２．μＬ、１．５０ｅｑ）の溶液を滴下して添加した。添加が完了した後、反応物をゆっくりと２０℃に加熱して、５時間撹拌した。反応混合物を飽和ＮＨ₄Ｃｌ溶液（５０ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出し、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗化合物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、得られた化合物をＳＦＣで分離して化合物１－１０（塩基性ＥｔＯＨ、カラム：ＡＳ（２５０ｍｍ×３０ｍｍ，５μｍ）、移動相Ｂ：３０％、流量（ｍＬ／分）：５５） ([α]²⁵ _D +54 (C 0.6, CHCl₃)). LCMS (ESI) m/z: 457.0 (M+1).

工程１０：
化合物１－１０（１５０．００ｍｇ、３２８．２３μｍｏｌ、１．００ｅｑ）をジクロロメタン（５．００ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（１．００ｍＬ）に溶解し、反応物を２０℃で４時間撹拌した。反応混合物を減圧下で直接蒸発させ、化合物１を得て、それを次の反応で直接使用した。LCMS (ESI) m/z: 401.0 (M+1).

工程１１：
化合物２（０．７８ｇ、３．６６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（６４３．３９ｍｇ、５．４９ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（３３５．２９ｍｇ、３６６．１５μｍｏｌ、０．１ｅｑ）、炭酸セシウム（２．３９ｇ、７．３２ｍｍｏｌ、２ｅｑ）、および４，５－ビス（ジフェニルホスフィノ）－９，９－ジメチルキサンテン（２１１．８６ｍｇ、３６６．１５μｍｏｌ、０．１ｅｑ）を１，４－ジオキサン（１０ｍＬ）に添加して、１００℃で１２時間、窒素ガス保護下で反応させた。反応混合物に水（２０ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（２０ｍＬ）を添加し、不溶性物質を濾過により濾別し、水相を酢酸エチル（１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。フラッシュカラム装置を使用して精製を行い、化合物３を得た。 LCMS (ESI) m/z: 250.1 (M+1).

工程１２：
トリフルオロ酢酸（３．８５ｇ、３３．７７ｍｍｏｌ、２．５ｍＬ、１８．３０ｅｑ）を無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の化合物３（０．４６ｇ、１．８５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）に添加し、添加後２０℃で１２時間反応させた。反応物を水（２０ｍＬ）で洗浄し、水相のｐＨを飽和重炭酸ナトリウム溶液で７に調整し、水相をジクロロメタン（１０ｍＬ×２）で抽出し、合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。化合物４が得られ、さらに精製することなく次の反応に使用した。 LCMS (ESI) m/z:149.8 (M+1).

工程１３：
ＰＯＣｌ₃（７６．５０ｍｇ、４９８．９０μｍｏｌ、４６．３６μＬ、２ｅｑ）を、ピリジン（２ｍＬ）中の化合物１（１００ｍｇ、２４９．４５μｍｏｌ、１ｅｑ）および化合物４（４４．６５ｍｇ、２９９．３４μｍｏｌ、１．２ｅｑ）の溶液に０℃で添加した。添加後、温度を２０℃に１．５時間上昇させた。水（３ｍｌ）の添加により反応をクエンチし、２Ｎ塩酸で水相のｐＨを７に調整した。水相をジクロロメタン（５ｍＬ×３）で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝１０／１）による精製により、バイアル壁に付着するガラスペーストまたはフォームとしての式（Ｉ）の化合物を得た。 LCMS (ESI) m/z: 532.1 (M+1). ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ ppm 9.98 (br s, 1H), 7.94 (d, J=6.8Hz, 1H), 7.67 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.32-7.36 (m, 3H), 7.24-7.27 （m, 2H）, 5.08-5.16 (m, 2H), 4.57-4.61 (m, 1H), 3.78-3.84 (m, 1H), 3.45-3.50 (m, 1H), 2.63 (s, 3H), 2.36 (s, 3H), 1.63 (s, 3H).

実施例２：式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａの調製
式（Ｉ）の化合物約５０ｍｇをそれぞれ秤量し、１．５ｍＬのガラスバイアルに添加し、懸濁液が形成されるまで適切な量の溶媒（表３を参照）を添加し、これを密封フィルムで密封し、および恒温サーモミキサーで４０℃で４８時間撹拌した。次に、サンプルを遠心分離機で遠心分離し、遠心分離した固体を真空オーブンに添加して３０℃で一晩乾燥させて、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａを得た。

実施例３：式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂの調製
式（Ｉ）の化合物約５０ｍｇをそれぞれ秤量し、１．５ｍＬのガラスバイアルに添加し、懸濁液が形成されるまでテトラヒドロフラン（０．２ｍＬ）を添加し、これを密封フィルムで密封した。混合物をおよび恒温サーモミキサーで４０℃で４８時間撹拌した。次に、サンプルを遠心分離機で遠心分離し、遠心分離した固体を真空オーブンに添加して３０℃で一晩乾燥させて、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂを得た。

実験例１：式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａの固体安定性試験
ＡＰＩおよび製剤の安定性試験に関するガイドライン（ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ２０１５ｅｄｉｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅＩＶ９００１の一般ガイドライン）に従って、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａの安定性を加速下（４０℃／７５％ＲＨ、密閉）および長期（２５℃／６０％ＲＨ、密閉）条件で調べた。

式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａを１．５ｇ秤量し、サンプル用のガラス瓶の底に配置し、それをそれぞれ薄層に広げ、２５℃／６０％ＲＨおよび４０℃／７５％ＲＨの条件下で試験するサンプルを、２層ＬＤＰＥ（低密度ポリエチレン）バッグに充填した。ＬＤＰＥバッグの各層を別々に密封し、次にＬＤＰＥバッグをアルミホイルバッグに入れて熱融着させた。異なる条件で配置されたサンプルは、９０日目にサンプリングおよび検出され、検出結果は０日目の最初の検出結果と比較し、試験結果は次の表４に示す：

結論：式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａは安定性が高い。

実験例２：式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａの吸湿性試験
実験材料：
ＳＭＳＤＶＳａｄｖａｎｔａｇｅｄｙｎａｍｉｃｖａｐｏｒｓｏｒｐｔｉｏｎａｎａｌｙｚｅｒ
実験方法：
式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａの１０～１５ｍｇを、試験のためにＤＶＳサンプルトレイに配置した。
実験結果：
式（Ｉ）の化合物の結晶形ＡのＤＶＳパターンを図５に示す。 △W=1.789%.
実験の結論：
式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａは、２５℃および８０％ＲＨで１．７８９％の吸湿による重量の増加を有し、したがって、わずかに吸湿性である。

実施例３：ＢＲＤ４のための生化学活性アッセイ
実験の準備：
１）実験にはＢＰＳ社のＢＲＤ４－ＢＤ１タンパク質およびＢＲＤ４－ＢＤ２タンパク質；ならびにＡＮＡＳＰＥＣ社のポリペプチド；Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ社の検出試薬を使用する；
２）ＴＲ－ＦＲＥＴの実験原理を適用して化合物をスクリーニングする；
３）化合物を試験する。

実験工程は下記のとおりである：
１）化合物プレートの準備：
実験での化合物プレートの準備は、Ｅｃｈｏによって達成された：
化合物をＥｃｈｏで３倍減少させて１０個の濃度に希釈した：２００００、６６６６．６７、２２２２．２２、７４０．７４、２４６．９１、８２．３０５、２７．４３５、９．１４５、３．０４８、１．０１６ｎＭ。

２）反応試薬の準備：
関連する試薬は、実験当日に準備する必要がある：
ａ）１×アッセイバッファー（試験バッファー溶液）を準備する；
ｂ）３×実験成分溶液を準備する：
１．試薬を氷上に置き、後で使用するために自然に溶かした；
２．１×アッセイバッファー（試験バッファー溶液）を使用して、実験用に、「溶液Ａ」（タンパク質溶液）、「溶液Ｂ」（ポリペプチド溶液）、および「溶液Ｃ」（検出試薬溶液）を調製し、反応系の成分に３Ｘ溶液を形成できるようにし、溶液Ａ、Ｂ、Ｃの量を実験に求められる量に十分であった。

３）実験操作工程は以下のとおりである：
アッセイプレートは、ＥＣＨＯを使用して実験前に調製した化合物勾配濃度および対応するＤＭＳＯ溶液を含むプレートであった：
ａ）アッセイプレートを取り出し、５μＬ／ウェルの「溶液Ａ」（タンパク質溶液）をアッセイプレートのカラム２～２３に添加し、次に５μＬ／ウェルの１Ｘアッセイバッファーを実験系の最小対照としてのアッセイプレートのカラム１および２４に添加する；
ｂ）１０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離する；
ｃ）プレートを２３℃で２０分間インキュベートする；
ｄ）５μＬ／ウェルの「溶液Ｂ」（ポリペプチド溶液）をインキュベーションの２０分後にアッセイプレートのカラム１～２４に添加する；
ｅ）１０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離する；
ｆ）プレートを２３℃で２０分間インキュベートする；
ｇ）５μＬ／ウェルの「溶液Ｃ」（検出試薬溶液）をインキュベーションの２０分後にアッセイプレートのカラム１～２４に添加する；
ｈ）１０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離する；
ｉ）プレートを２３℃で４０分間インキュベートする；
ｊ）プレートをＥｎＶｉｓｉｏｎで読み取る。

４）データ解析：
ａ）各アッセイプレートの対応する最大対照（最大対照）［Ｍａｘｃｏｎｔｒｏｌ（ｍａｘｉｍｕｍｃｏｎｔｒｏｌ）］および最小対照（最小対照）［Ｍｉｎｃｏｎｔｒｏｌ（ｍｉｎｉｍｕｍｃｏｎｔｒｏｌ）］を使用して各アッセイプレートのＺ’値を計算し、各プレートのＺ’値が０．５より大きいことを確認する；
ｂ）ＸＬＦＩＴ５によって試験化合物のシグナルからＩＣ₅₀値を計算し、それが過去の平均データの３倍以内にあることを確認し、結果を表５に示す。

式（Ｉ）の化合物は、ＢＲＤ４－ＢＤ１およびＢＲＤ４－ＢＤ２に対して有意な阻害効果を有する。

実施例４：ヒト乳がんＭＤＡ－ＭＢ－２３１＿ｌｕｃ細胞皮下異種移植腫瘍モデルにおける式（Ｉ）の化合物のｉｎｖｉｖｏ薬力学研究
１．実験デザイン

２．実験材料
２．１実験動物
種：マウス
系統：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス
週齢および重量：６～８週齢、体重１８～２２グラム
性別：メス
供給元：ＳｈａｎｇｈａｉＳｉｐｐｒ－ＢＫｌａｂｏｒａｔｏｒｙａｎｉｍａｌＣｏ．Ｌｔｄ．

３．実験方法および工程
３．１細胞培養
ヒト乳がんＭＤＡ－ＭＢ－２３１＿ｌｕｃ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで単層培養し、培養条件は１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ－１６４０培地（供給元：Ｇｉｂｃｏ；商品番号：２２４００－０８９；製造バッチ番号：４８６８５４６）であった。培養は３７℃、５％ＣＯ₂で行った。継代のためのパンクレアチン－ＥＤＴＡによる従来法の消化処理は週に２回行った。細胞が指数増殖期にあるとき、細胞を収集し、計数し、接種した。

３．２腫瘍細胞接種
０．２ｍＬの１０×１０⁶ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１＿ｌｕｃ細胞を各ヌードマウスの右背部に皮下接種した（ＰＢＳ：マトリゲル＝１：１）。グループ化および投与は、平均腫瘍体積が１００～１５０ｍｍ³に達したときに開始した。

３．３腫瘍の測定および実験の指標
実験指標は、腫瘍の成長が阻害されたか、遅延したか、または治癒したかを調べることであった。腫瘍の直径は、ノギスで週に２回測定した。腫瘍体積を計算するための式は、Ｖ＝０．５ａ×ｂ²であった。ここで、ａおよびｂは、それぞれ腫瘍の長径および短径を表している。

化合物の腫瘍阻害効果は、ＴＧＩ（％）または相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）によって評価した。ＴＧＩ（％）は腫瘍増殖阻害率を反映していた。ＴＧＩ（％）の計算は次のとおりであった：ＴＧＩ（％）＝［（１－（治療群の投与終了時の平均腫瘍体積－この治療群の投与開始時の平均腫瘍体積））／（溶媒対照群における治療終了時の平均腫瘍体積－溶媒対照群における治療開始時の平均腫瘍体積）］×１００％。

相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）は、以下の式に従って計算した：Ｔ／Ｃ％＝Ｔ_RTV／Ｃ_RTV×１００％（Ｔ_RTV：治療群のＲＴＶ；Ｃ_RTV：陰性対照群のＲＴＶ）。相対腫瘍体積（ＲＴＶ）は、腫瘍測定の結果に従って計算した。計算式はＲＴＶ＝Ｖ_t／Ｖ₀であった。ここで、Ｖ₀はグループ化および投与時（すなわち、ｄ₀）に測定された平均腫瘍体積であり、Ｖ_tは特定の測定時の平均腫瘍体積であった。Ｔ_RTVおよびＣ_RTVは、同じ日のデータから取得した。

実験の最後に、腫瘍の重量を測定し、Ｔ／Ｃ_weightのパーセンテージを計算する。Ｔ_weightおよびＣ_weightは、それぞれ、投与群および溶媒対照群の腫瘍重量を表した。

３．４統計分析
統計分析は、各時点での各群の腫瘍体積の平均値および標準誤差（ＳＥＭ）を含んでいた。実験終了時の投与後２１日目に治療群が最も効果が高かったため、このデータをもとに統計分析を行い、群間の差異を評価した。２つの群間の比較はＴ検定によって分析し、３つ以上の群間の比較は一元配置分散分析によって分析した。Ｆ値が有意に異なる場合は、Ｇａｍｅｓ－Ｈｏｗｅｌｌ試験を適用した。Ｆ値に有意差がない場合は、Ｄｕｎｎｅｔ（両面）試験を分析に使用した。すべてのデータ分析は、ＳＰＳＳ１７．０を使用して実行した。ｐ＜０．０５は有意に異なると見なされた。

４．実験結論
投与後２１日目に、式（Ｉ）の化合物について、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ＝５４．８５％、Ｔ／Ｃ＝５２．９９％、ｐ＜０．０５；動物の体重に有意な変化はなく、それらは忍容性が高かった。

実施例５：ヒト前立腺がんＰＣ－３細胞皮下異種移植腫瘍モデルにおける式（Ｉ）の化合物のｉｎｖｉｖｏ薬力学研究
１．実験デザイン
試験物質の調製方法は表６と同じであり、動物群および投与レジメンは表７と同じであった。

２．実験材料
２．１実験動物
種：マウス
系統：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス
週齢および重量：６～８週齢、体重１８～２２グラム
性別：オス
供給元：ＳｈａｎｇｈａｉＳｉｐｐｒ－ＢＫｌａｂｏｒａｔｏｒｙａｎｉｍａｌＣｏ．Ｌｔｄ．

３．実験方法および工程
３．１細胞培養
ヒト前立腺がんＰＣ－３細胞をｉｎｖｉｔｒｏで単層培養し、培養条件は１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＦ－１２Ｋ培地（供給元：Ｇｉｂｃｏ；商品番号：２１１２７－０２２；製造バッチ番号：１８６８８７０）であった。培養は３７℃、５％ＣＯ₂で行った。継代のためのパンクレアチン－ＥＤＴＡによる従来法の消化処理は週に２回行った。細胞が指数増殖期にあるとき、細胞を収集し、計数し、接種した。

３．２腫瘍細胞接種
０．１ｍＬの１０×１０⁶ ＰＣ－３細胞を各ヌードマウスの右背部に皮下接種した。グループ化および投与は、平均腫瘍体積が１００～１５０ｍｍ³に達したときに開始した。

３．３腫瘍の測定、実験の指標および統計分析は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１モデルと同じであった。

４．実験結論
投与後２１日目に、溶媒対照群と比較して、式（Ｉ）の試験化合物は、有意な腫瘍抑制効果を有した（Ｔ／Ｃ＝４４．６３％、ＴＧＩ＝５８．４％、ｐ＝０．０３３）；動物は忍容性が高かった。

実施例６：ＭＣ３８マウス結腸がん細胞動物移植腫瘍モデルにおける式（Ｉ）の化合物のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍効果。
１．実験デザイン

２．実験材料
２．１実験動物
種：マウス
系統：Ｃ５７ＢＬ６マウス
週齢および重量：６～７週齢、体重１６～２０グラム
性別：メス
供給元：ＳｈａｎｇｈａｉＳＬＡＣＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＣｏ．Ｌｔｄ．

３．実験方法および工程
３．１細胞培養
マウス結腸がんＭＣ３８細胞（ＯＢｉＯＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏｒｐ．，Ｌｔｄ．）をｉｎｖｉｔｒｏで単層培養し、培養条件はインキュベーターで５％ＣＯ₂、３７℃、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ；商品番号：１２１００）であった。継代のための０．２５％パンクレアチン－ＥＤＴＡによる従来法の消化処理は週に２回行った。細胞が指数増殖期にあり、密度が８０％～９０％のときに、細胞を収集し、計数し、接種した。

３．２腫瘍細胞接種
０．１ｍＬの２×１０⁵ ＭＣ３８細胞を各マウスの右背部に皮下接種した。平均腫瘍体積が約７０ｍｍ³に達したときの腫瘍体積に応じてランダムグループ化および投与を行った。

３．３腫瘍の測定
腫瘍の直径は、ノギスで週に２回測定した。腫瘍体積を計算するための式は、Ｖ＝０．５ａ×ｂ²であった。ここで、ａおよびｂは、それぞれ腫瘍の長径および短径を表している。

化合物の腫瘍阻害効果は、ＴＧＩ（％）または相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）によって評価した。相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ％＝Ｔ_RTV／Ｃ_RTV×１００％（Ｔ_RTV：治療群のＲＴＶ；Ｃ_RTV：陰性対照群のＲＴＶ）。相対腫瘍体積（ＲＴＶ）は、腫瘍測定の結果に従って計算した。計算式はＲＴＶ＝Ｖ_t／Ｖ₀であった。ここで、Ｖ₀はグループ化および投与時（すなわち、ｄ₀）に測定された平均腫瘍体積であり、Ｖ_tは特定の測定時の平均腫瘍体積であった。Ｔ_RTVおよびＣ_RTVは、同じ日のデータから取得した。

ＴＧＩ（％）は腫瘍増殖阻害率を反映していた。ＴＧＩ（％）＝［（１－（治療群の投与終了時の平均腫瘍体積－この治療群の投与開始時の平均腫瘍体積））／（溶媒対照群における治療終了時の平均腫瘍体積－溶媒対照群における治療開始時の平均腫瘍体積）］×１００％。

実験の最後に、腫瘍の重量を測定し、Ｔ_weight／Ｃ_weightのパーセンテージを計算する。Ｔ_weightおよびＣ_weightは、それぞれ、投与群および溶媒対照群の腫瘍重量を表した。

３．４統計分析
統計分析は、実験終了時の腫瘍体積および腫瘍重量に基づいて、ＳＰＳＳソフトウェアを使用して行った。２つの群間の比較はＴ検定によって分析し、３つ以上の群間の比較は一元配置分散分析によって分析した。分散が均一である場合（Ｆ値に有意差がない場合）、ＬＳＤ法を分析に使用した。分散が均一でない場合（Ｆ値が有意に異なる場合）、Ｇａｍｅｓ－Ｈｏｗｅｌｌ法を試験に使用した。ｐ＜０．０５は有意に異なると見なされた。

４．実験結論
投与後２０日目に、式（Ｉ）の試験化合物について、１５ｍｇ／ｋｇ投与群の場合：相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ＝３３．６８％、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ＝６８．８１％、ｐ＜０．０００１；２５ｍｇ／ｋｇ投与群の場合：相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ＝２７．５９％、ＴＧＩ＝７５．２１％、ｐ＜０．０００１；５０ｍｇ／ｋｇ投与群の場合：Ｔ／Ｃ＝１０．０４％、ＴＧＩ＝９３．４６％、ｐ＜０．０００１。良好な忍容性を有する動物の各投与群において、有意な腫瘍抑制効果が示された。

実施例７：マウスにおける式（Ｉ）の化合物のｉｎｖｉｖｏ薬物動態試験
メスのＢａｌｂ／ｃマウスを試験動物として使用した。式（Ｉ）の化合物をマウスに静脈内および胃内に投与し、次に、異なる時点での血漿中の薬物濃度を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法によって決定した。マウスにおける式（Ｉ）の化合物のｉｎｖｉｖｏ薬力学的挙動を研究し、その薬力学的特性を評価した。

１．実験プロトコル
１．１実験薬：式（Ｉ）の化合物
１．２実験動物：１６匹の健康な成体メスＢａｌｂ／ｃマウスを、同様の体重の原則に従って４つのグループに分け、各グループに４匹のマウスを入れた。動物はＳｈａｎｇｈａｉＳＬＡＣＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．のＳｈａｎｇｈａｉＬｉｎｇｃｈａｎｇＢｉｏＴｅｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、動物生産ライセンス番号はＳＣＸＫ（上海）２０１３－００１８であった。

１．３薬物の製剤化
適切な量のサンプルを採取し、５％の最終容量のＤＭＳＯを添加し、次に９５％の最終容量の２０％ＨＰ－β－ＣＤを添加した。混合物を超音波で撹拌して、０．５ｍｇ／ｍＬの透明な溶液を得た。濾過後、静脈内投与に使用した。

適切な量のサンプルを採取し、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液に溶解した。混合物を超音波で撹拌して、胃内投与に使用される０．５ｍｇ／ｍＬの均一な懸濁液を得た。

１．４投与
８匹のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを２つのグループに分けた。一晩絶食させた後、第一の群は、２．５ｍＬ／ｋｇの投与量および１ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与された。第二の群は、５ｍＬ／ｋｇの投与量および３ｍｇ／ｋｇの投与量で胃内投与された。

２．操作
メスのＢａｌｂ／ｃマウスを静脈内投与した後、０．０８３３、０．２５、０．５、１、２、４、８、および２４時間の各時点で３０μＬの血液を採取し、２μＬのＥＤＴＡ－Ｋ₂を含む試験管に入れた；および、メスのＢａｌｂ／ｃマウスを胃内投与した後、０．０８３３、０．２５、０．５、１、２、４、８、および２４時間の各時点で３０μＬの血液を採取し、２μLのＥＤＴＡ－Ｋ₂含む試験管に入れた。管を３０００ｇで１５分間遠心分離して血漿を分離し、分離した血漿を－６０℃で保管した。動物は投与の２時間後に給餌することができた。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を使用して、マウスへの静脈内および胃内投与後の血漿中で試験される化合物の含有量を測定した。この方法の直線範囲は２．００～６０００ｎｍｏｌ／Ｌであった；血漿サンプルは、アセトニトリル処理によるタンパク質沈殿後に分析された。薬物動態パラメーターの結果を表８に示した。

実験の結論；式（Ｉ）の化合物は、経口投与による曝露が高く、薬物クリアランス率が低く、経口生体利用効率が高い。

実施例８：ラットにおける式（Ｉ）の化合物のｉｎｖｉｖｏ薬物動態試験
オスのＳＤラットを試験動物として使用した。式（Ｉ）の化合物をラットに静脈内および胃内に投与し、次に、異なる時点での血漿中の薬物濃度を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法によって決定した。ラットにおける式（Ｉ）の化合物のｉｎｖｉｖｏ薬力学的挙動を研究し、その薬力学的特性を評価した。

１．実験プロトコル
１．１実験薬：式（Ｉ）の化合物（結晶形Ａ）
１．２実験動物：４匹の健康な成体オスＳＤラットを、同様の体重の原則に従って２つのグループに分け、各グループに２匹のマウスを入れた。動物はＢｅｉｊｉｎｇＷｅｉｔｏｎｇｌｉｈｕａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓＬｔｄから購入し、動物生産ライセンス番号はＳＣＸＫ（北京）２０１６－０００６であった。

適切な量のサンプルを採取し、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液に溶解した。混合物を超音波で撹拌して、胃内投与に使用される１ｍｇ／ｍＬの均一な懸濁液を得た。

１．４投与
４匹のオスのＳＤラットを２つのグループに分けた。一晩絶食させた後、第一の群は、４ｍＬ／ｋｇの投与量および２ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与された。第二の群は、１０ｍＬ／ｋｇの投与量および１０ｍｇ／ｋｇの投与量で胃内投与された。

２．操作
オスのＳＤラットを静脈内投与した後、０．０８３３、０．２５、０．５、１、２、４、６、８、および２４時間の各時点で１００μLの血液を採取し、２μLのＥＤＴＡ－Ｋ₂を含む試験管に入れた；および、オスのＳＤラットを胃内投与した後、０．０８３３、０．２５、０．５、１、２、４、６、８、および２４時間の各時点で１００μLの血液を採取し、２μLのＥＤＴＡ－Ｋ₂含む試験管に入れた。管を３０００ｇで１５分間遠心分離して血漿を分離し、分離した血漿を－６０℃で保管した。動物は投与の２時間後に給餌することができた。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を使用して、ラットへの静脈内および胃内投与後の血漿中で試験される化合物の含有量を測定した。この方法の直線範囲は２．００～６０００ｎｍｏｌ／Ｌであった；血漿サンプルは、アセトニトリル処理によるタンパク質沈殿後に分析された。薬物動態パラメーターの結果を表９に示した。

実施例９：式（Ｉ）の化合物がｈＥＲＧカリウムイオンチャネルに及ぼす影響のアッセイ
式（Ｉ）の化合物がｈＥＲＧカリウムチャネル電流に及ぼす影響を、ｈＥＲＧカリウムイオンチャネルを安定して発現するＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を採用し、全自動パッチクランプＱＰａｔｃｈ技術を使用することによって調べた。

１．実験プロトコル
１．１実験薬：式（Ｉ）の化合物
１．２実験系：ＣＨＯ－ｈＥＲＧ細胞株
１．３細胞の調製
ＣＨＯ－ｈＥＲＧ細胞を１７５ｃｍ²の培養フラスコで培養した。細胞密度が６０～８０％に増加した後、培地を除去し、細胞を７ｍＬＰＢＳで１回洗浄し、次に３ｍＬデタチン（Ｄｅｔａｃｈｉｎ）を添加して消化した。

消化が完了した後、中和のために７ｍＬの培地を添加し、次に混合物を遠心分離した。上清を除去した後、５ｍＬの培地を添加して再懸濁し、細胞密度が２～５×１０⁶／ｍＬになるようにした。

１．４溶液の調製
溶液の調製方法を以下の表１０に示す。

２．操作
化合物の２０ｍＭ原液を細胞外液で希釈し、５μＬの２０ｍＭ原液を２４９５μＬの細胞外液に添加し、５００倍希釈で４０μＭに希釈した後、０．２％ＤＭＳＯを含む細胞外液で３倍段階希釈を続けて、試験に必要な最終濃度を得る。最高の試験濃度は４０μＭであり、これはそれぞれ４０、１３．３３、４．４４、１．４８、０．４９、０．１６μＭであり、合計６つの濃度であった。試験におけるＤＭＳＯの最終濃度は０．２％を超えず、ｈＥＲＧカリウムチャネルに影響を与えない。

単一細胞の高インピーダンスシーリングおよび全細胞モードの形成プロセスはすべて、Ｑｐａｔｃｈ機器によって自動的に完了した。全細胞記録モードが得られた後、細胞は－８０ミリボルトでクランプされた。細胞は、最初に－５０ミリボルトの前電圧を５０ミリ秒受け、次に＋４０ミリボルトで５秒間脱分極刺激を受け、次に－５０ミリボルトで５秒間再分極され、その後電圧は－８０ミリボルトに戻った。この電圧刺激は１５秒ごとに適用された。データは２分間記録され、次に細胞外液が与えられ、次にデータは５分間記録された。その後、薬剤の投与が開始した。試験化合物の濃度は最低濃度から開始し、各試験濃度を２．５分間試験した。すべての濃度を継続的に投与した後、３μＭのシサプリドを陽性対照化合物として投与した。少なくとも３つの細胞（ｎ≧3）が各濃度で試験された。実験データはＸＬＦｉｔソフトウェアによって分析された。

３．結論
結果は、式（Ｉ）の化合物がＩＣ₅₀＞４０μＭでｈＥＲＧカリウム電流を阻害することを示している。

Claims

固体形態の式（Ｉ）：

の化合物。
結晶形である、請求項１に記載の固体形態の式（Ｉ）の化合物。
以下を有する前記式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａである、請求項２に記載の固体形態の式（Ｉ）の化合物：
以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、１４．００±０．２°；
または、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、２０．０７±０．２°；
または、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン：７．０３±０．２°、１９．４８±０．２°、２０．０７±０．２°、２６．０５±０．２°；
または、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、１７．３１±０．２°、１９．４８±０．２°、２０．０７±０．２°、２６．０５±０．２°；
または、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、１４．００±０．２°、１５．１１±０．２°、１７．３１±０．２°、１９．４８±０．２°、２０．０７±０．２°、２６．０５±０．２°；
または、以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン：７．０３±０．２°、１１．２８±０．２°、１２．３９±０．２°、１４．００±０．２°、１５．１１±０．２°、１７．３１±０．２°、１９．４８±０．２°、２０．０７±０．２°、２２．８６±０．２°、２６．０５±０．２°；
または、実質的に図１に示すＸＲＰＤ（粉末Ｘ線回折）パターン。
２８９．２２±３℃において吸熱ピークの開始を有する示差走査熱量測定曲線を有する、請求項３に記載の固体形態の式（Ｉ）の化合物。
実質的に図２に示すＤＳＣ（示差走査熱量測定）曲線を有する、請求項４に記載の固体形態の式（Ｉ）の化合物。
熱重量分析パターンが、３００．００±３℃で１．６２６％の重量減少を有する、請求項３に記載の固体形態の式（Ｉ）の化合物。
実質的に図３に示すＴＧＡ（熱重量分析）パターンを有する、請求項６に記載の固体形態の式（Ｉ）の化合物。
以下を有する前記式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂである、請求項２に記載の固体形態の式（Ｉ）の化合物：
以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン：５．５０±０．２°、８．３６±０．２°、１１．８７±０．２°；
または以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン：５．５０±０．２°、８．３６±０．２°、１２．６６±０．２°；
または以下の２θの角度において特徴的な回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン：５．５０±０．２°、８．３６±０．２°、１１．８７±０．２°、１２．３９±０．２°、１２．６６±０．２°、１５．１１±０．２°、１７．３５±０．２°、１８．７０±０．２°；
または、実質的に図４に示すＸＲＰＤ（粉末Ｘ線回折）パターン。
以下を含む、請求項３に記載の固体形態の式（Ｉ）の化合物の製造方法：
（１）前記式（Ｉ）の化合物を溶媒に添加して、懸濁液または溶液を形成する工程；
好ましくは、前記溶媒は、Ｃ_1-4アルキル－Ｏ－Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルキルＣ（＝Ｏ）ＯＣ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルキル－ＣＮ、Ｃ_1-4アルキル－ＯＨ、またはＣ_1-4アルキルＣ（＝Ｏ）Ｃ_1-4アルキルからなる群から選択される単一溶媒である；さらに好ましくは、前記単一溶媒は、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、酢酸エチル、アセトニトリル、エタノール、アセトン、メタノール、またはメチルエチルケトンである；
または、好ましくは、前記溶媒は、Ｃ_1-4アルキルＣ（＝Ｏ）Ｃ_1-4アルキルおよび水の混合溶媒、またはＣ_1-4アルキル－ＯＨおよび水の混合溶媒である；さらに好ましくは、Ｃ_1-4アルキルＣ（＝Ｏ）Ｃ_1-4アルキルおよび水からなる前記混合溶媒について、Ｃ_1-4アルキルＣ（＝Ｏ）Ｃ_1-4アルキルと水の体積比は１～５：１、好ましくは２：１であり；Ｃ_1-4アルキル－ＯＨおよび水からなる前記混合溶媒について、Ｃ_1-4アルキル－ＯＨと水の体積比は１～５：１、好ましくは３：１である；さらに好ましくは、前記混合溶媒は、アセトンおよび水の混合溶媒、またはエタノールおよび水の混合溶媒である；さらに好ましくは、前記混合溶媒は、２：１の体積比のアセトン－水の混合溶媒、または３：１の体積比のエタノール－水の混合溶媒である；
または、好ましくは、前記化合物と前記溶媒との重量対体積比は、１ｇ：５～１５ｍＬ、好ましくは１ｇ：５～１２ｍＬである；
（２）前記懸濁液または前記溶液を、恒温サーモミキサーで撹拌し、次に分離し、乾燥して、前記式（Ｉ）の化合物の前記結晶形Ａを得る工程；
好ましくは、撹拌温度は２５～４５℃である；
または、好ましくは、撹拌時間は１２～５０時間、好ましくは１２～４８時間である；
または、好ましくは、工程（２）における前記分離は、遠心分離または濾過である；さらに好ましくは、工程（２）における前記分離は、遠心分離である。
以下を含む、請求項８に記載の固体形態の式（Ｉ）の化合物の製造方法：
（１）前記式（Ｉ）の化合物をテトラヒドロフランに添加して、懸濁液または溶液を形成する工程；好ましくは、前記化合物とテトラヒドロフランの重量対体積比は１ｇ：５～１０ｍＬである；
（２）前記懸濁液または前記溶液を恒温サーモミキサーで撹拌し、次に分離し、乾燥して、前記式（Ｉ）の化合物の前記結晶形Ｂを得る工程；好ましくは、撹拌温度は２５～４５℃である；
または、好ましくは、撹拌時間は１２～５０時間、好ましくは１２～４８時間である；
または、好ましくは、工程（２）における前記分離は、遠心分離または濾過である；
さらに好ましくは、工程（２）における前記分離は、遠心分離である。
請求項１～８のいずれか一項に記載の固体形態の式（Ｉ）の化合物または任意の２つ以上の結晶形の結晶混合物を含む医薬組成物。
ＢＲＤ４関連疾患を治療するための薬剤の製造のための、請求項１～８のいずれか一項に記載の固体形態の式（Ｉ）の化合物または請求項１１に記載の医薬組成物の使用であって、
好ましくは、ＢＲＤ４関連疾患は腫瘍を含む；
より好ましくは、前記腫瘍は血液腫瘍および進行性固形腫瘍を含み、ここで該血液腫瘍は白血病、リンパ腫、および骨髄腫を含み、該進行性固形腫瘍は神経細胞腫、神経膠腫、乳がん、胃腸腫瘍、および前立腺がんを含む；
さらに好ましくは、前記白血病は急性リンパ性白血病であるか、または前記リンパ腫は急性骨髄性リンパ腫である；
さらに好ましくは、前記乳がんはトリプルネガティブ乳がんであるか、前記胃腸腫瘍は結腸直腸がんである、
医薬組成物の使用。