CN115368355A - 一种吡唑并杂芳基类衍生物的结晶形式 - Google Patents

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CN115368355A CN202210558562.2A CN202210558562A CN115368355A CN 115368355 A CN115368355 A CN 115368355A CN 202210558562 A CN202210558562 A CN 202210558562A CN 115368355 A CN115368355 A CN 115368355A
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Abstract

本公开涉及一种吡唑并杂芳基类衍生物的结晶形式。具体而言，本公开涉及式(I)所示化合物的结晶形式。本公开的新晶型具备良好的理化性质。

Description

一种吡唑并杂芳基类衍生物的结晶形式
技术领域
本公开涉及一种吡唑并杂芳基类衍生物的结晶形式，具体地涉及式(I)所示化合物的结晶形式。
背景技术
无论是正常细胞还是肿瘤细胞中，每天都会出现成千上万次DNA的损伤。这使得DNA损伤修复在维持基因组的稳定性和细胞存活方面起到至关重要的作用。相比较于正常细胞，肿瘤细胞承受了更大的复制压力，携带更多的内源性DNA损伤，并且经常出现一个或多个DNA损伤修复通路的缺失。这使得肿瘤细胞的存活更加依赖于DNA损伤修复的顺利进行。
同源重组修复是DNA双链断裂的主要修复方式，以未受损的姐妹染色单体的同源序列作为其修复的模板复制受损处的DNA序列，精确修复DNA。这种修复方式主要发生在细胞的G2期和S期。ATR是同源重组修复通路中的关键酶，属于PIKK家族。当ATR/ATRIP复合物与覆盖了复制蛋白A(RPA)的受损DNA结合后，ATR被激活并通过磷酸化下游蛋白Chk1和SMARCAL等，调节细胞周期各个检查点，引起细胞周期阻滞；保证受损DNA的稳定性；提高dNTP浓度，促使DNA损伤得以修复。细胞周期S期中出现的DNA损伤修复主要由ATR通路完成，说明ATR对于保证细胞增殖非常重要。对于临床肿瘤样品的分析结果表明在多种肿瘤组织中，例如胃癌、肝癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌等，均观察到ATR表达水平升高。并且在卵巢癌、胰腺癌病人中，高水平的ATR往往伴随着较低的存活率。由此可见ATR是一个重要的肿瘤治疗的靶标。
WO2021098811A涉及一系列新的ATR抑制剂，其中式(I)所示化合物具有良好的ATR抑制活性，其结构如下所示：
Figure BDA0003653465610000021
药用的活性成分及其中间体的晶型结构往往影响到该他们的化学稳定性，结晶条件及储存条件的不同有可能导致化合物的晶型结构的变化，有时还会伴随着产生其他形态的晶型。一般来说，无定型的产品没有规则的晶型结构，往往具有其它缺陷，比如产物稳定性较差，析晶较细，过滤较难，易结块，流动性差等。因此，改善上述产物的各方面性质是很有必要的，我们需要深入研究找到晶型纯度较高并且具备良好化学稳定的新晶型。
发明内容
本公开提供了一种式(I)所示化合物新的晶型及其制备方法。
Figure BDA0003653465610000022
本公开还提供了一种式(I)所示化合物的的晶型，所述晶型为：
晶型A，其X-射线粉末衍射图谱在2θ角为6.4、7.5、9.1、9.9和21.7处有特征峰；
晶型B，其X-射线粉末衍射图谱在2θ角为5.3、5.5、8.7、16.0和21.5处有特征峰；
晶型C，其X-射线粉末衍射图谱在2θ角为5.2、6.5、20.7、21.3和22.8处有特征峰；或
晶型D，其X-射线粉末衍射图谱在2θ角为5.3、6.5、8.6、10.7和21.5处有特征峰。
在某些的实施方案中，所述晶型A的X-射线粉末衍射图谱在2θ角为5.3、6.4、7.5、9.1、9.9、10.7、12.1、16.0、16.6、17.5、18.4、19.9、21.7、22.2、23.6、25.0、27.0和28.4处有特征峰。
在某些的实施方案中，所述晶型A的X-射线粉末衍射图谱如图1所示。
在某些的实施方案中，所述晶型B的X-射线粉末衍射图谱在2θ角为5.3、5.5、8.7、9.8、10.6、11.2、12.0、12.9、14.5、16.0、17.2、18.1、19.7、21.5、23.8、25.2和26.8处有特征峰。
在某些的实施方案中，所述晶型B的X-射线粉末衍射图谱如图2所示。
在某些的实施方案中，所述晶型C的X-射线粉末衍射图谱在2θ角为5.2、6.5、10.3、10.7、11.3、13.4、14.7、16.7、17.4、18.0、18.1、19.8、20.3、20.7、21.3、22.8、23.9、24.6、25.3、26.0、27.5、28.0和31.3处有特征峰。
在某些的实施方案中，所述晶型C的X-射线粉末衍射图谱如图3所示。
在某些的实施方案中，所述晶型D的X-射线粉末衍射图谱在2θ角为5.3、6.5、8.6、9.2、9.8、10.4、10.7、11.3、12.1、13.0、14.3、16.0、17.2、18.2、19.2、19.8、21.5、25.2、26.7和29.4处有特征峰。
在某些的实施方案中，所述晶型D的X-射线粉末衍射图谱如图4所示。
本公开进一步提供一种制备式(I)所示化合物的晶型A的方法，所述方法包括：将包含式(I)所示化合物与溶剂混合，析晶，所述溶剂选自乙酸乙酯/正庚烷、四氢呋喃/正庚烷、二氯甲烷/正庚烷。
本公开进一步提供一种制备式(I)所示化合物的晶型B的方法，所述方法包括：将式(I)所示化合物与乙酸异丙酯/正庚烷混合，降温析晶。
本公开进一步提供一种制备式(I)所示化合物的晶型C的方法，所述方法包括：将式(I)所示化合物与乙酸乙酯/正庚烷混合，析晶。
本公开进一步提供一种制备式(I)所示化合物的晶型D的方法，所述方法包括：将式(I)所示化合物与乙酸乙酯/正庚烷混合，析晶。
通过X-射线粉末衍射图谱(XRPD)、差示扫描量热分析(DSC)对本公开所得到晶型进行结构测定、晶型研究。
本公开中晶型的析晶方法是常规的，例如挥发析晶、降温析晶或室温下析晶。
本公开晶型制备方法中所用的起始原料可以是任意形式的式(I)所示化合物，具体形式包括但不限于：无定形、任意晶型、水合物、溶剂合物等。
本公开进一步提供一种药物组合物，包含式(I)所示化合物的晶型，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
本公开进一步提供一种制备药物组合物的方法，包括将式(I)所示化合物的晶型与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合的步骤。
本公开进一步提供本公开所述的式(I)所示化合物的晶型或药物组合物在制备用于抑制ATR激酶的药物中的用途。
本公开进一步提供本公开所述的式(I)所示化合物的晶型或药物组合物在制备用于治疗过度增殖性疾病的药物中的用途。
本公开进一步提供本公开所述的式(I)所示化合物的晶型或药物组合物在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的用途。
本公开中所述的肿瘤选自黑色素瘤、脑瘤、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、骨癌、子宫癌、子宫内膜癌、头颈肿瘤、多发性骨髓瘤、B-细胞淋巴瘤、真性红细胞增多症、白血病、甲状腺肿瘤、膀胱癌和胆囊癌。
在本申请的说明书和权利要求书中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。然而，为了更好地理解本公开，下面提供了部分相关术语的定义和解释。另外，当本申请所提供的术语的定义和解释与本领域技术人员所通常理解的含义不一致时，以本申请所提供的术语的定义和解释为准。
本公开所述的“打浆”是指利用物质在溶剂中溶解性差，但杂质在溶剂中溶解性好的特性进行纯化的方法，打浆提纯可以去色、改变晶型或去除少量杂质。
本公开所述的“X-射线粉末衍射图谱或XRPD”是指根据布拉格公式2d sinθ＝nλ(式中，λ为X射线的波长，衍射的级数n为任何正整数，一般取一级衍射峰，n＝1)，当X射线以掠角θ(入射角的余角，又称为布拉格角)入射到晶体或部分晶体样品的某一具有d点阵平面间距的原子面上时，就能满足布拉格方程，从而测得了这组X射线粉末衍射图。
本公开所述的“X-射线粉末衍射图谱或XRPD”是通过在X-射线粉末衍射仪中使用Cu-Kα辐射得到的图谱。
本公开所述的“差示扫描量热分析或DSC”是指在样品升温或恒温过程中，测量样品与参考物之间的温度差、热流差，以表征所有与热效应有关的物理变化和化学变化，得到样品的相变信息。
本公开所述的“2θ或2θ角度”是指衍射角，θ为布拉格角，单位为°或度，2θ的误差范围为±0.3或±0.2或±0.1。
本公开所述的“晶面间距或晶面间距(d值)”是指空间点阵选择3个不相平行的连结相邻两个点阵点的单位矢量a，b，c，它们将点阵划分成并置的平行六面体单位，称为晶面间距。空间点阵按照确定的平行六面体单位连线划分，获得一套直线网格，称为空间格子或晶格。点阵和晶格是分别用几何的点和线反映晶体结构的周期性，不同的晶面，其面间距(即相邻的两个平行晶面之间的距离)各不相同；单位为
Figure BDA0003653465610000051
或埃。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“溶剂化物”或“溶剂化合物”指本公开的药物与一种或多种溶剂分子形成可药用的溶剂化物，溶剂分子的非限制性实例包括水、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸异丙酯、正庚烷、乙醇、乙腈、异丙醇、DMSO、乙酸乙酯。
术语“载体”用于本公开的药物，是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。药物载体释放和靶向系统能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度。如可作为载体的高分子表面活性剂由于其独特的两亲性结构，可以进行自组装，形成各种形式的聚集体，优选的实例如胶束、微乳液、凝胶、液晶、囊泡等。这些聚集体具有包载药物分子的能力，同时又对膜有良好的渗透性，可以作为优良的药物载体。
附图说明
图1为式(I)所示化合物的晶型A的XRPD图谱。
图2为式(I)所示化合物的晶型B的XRPD图谱。
图3为式(I)所示化合物的晶型C的XRPD图谱。
图4为式(I)所示化合物的晶型D的XRPD图谱。
图5为式(I)所示化合物的无定形的XRPD图谱。
图6为式(I)所示化合物的晶型A的DSC图谱。
图7为式(I)所示化合物的晶型B的DSC图谱。
图8为式(I)所示化合物的晶型D的DSC图谱。
具体实施方式
以下将结合实施例更详细地解释本公开，本公开的实施例仅用于说明本公开的技术方案，并非限定本公开的实质和范围。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以10-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。
MS的测定用Agilent 1200/1290 DAD-6110/6120 Quadrupole MS液质联用仪(生产商：Agilent，MS型号：6110/6120 Quadrupole MS)。waters ACQuity UPLC-QD/SQD(生产商：waters，MS型号：waters ACQuity Qda Detector/waters SQ Detector)THERMOUltimate 3000-Q Exactive(生产商：THERMO，MS型号：THERMO Q Exactive)
高效液相色谱法(HPLC)分析使用Agilent HPLC 1200DAD、Agilent HPLC 1200VWD和Waters HPLC e2695-2489高压液相色谱仪。
手性HPLC分析测定使用Agilent 1260 DAD高效液相色谱仪。
高效液相制备使用Thermo U3000、Agilent 1260 DAD、Shimadzu LC-20AP和Gilson GX-281制备型色谱仪。
手性制备使用Shimadzu LC-20AP制备型色谱仪。
CombiFlash快速制备仪使用Combiflash Rf200(TELEDYNE ISCO)。
薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
硅胶柱色谱法一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
激酶平均抑制率及IC50值的测定用NovoStar酶标仪(德国BMG公司)。
本公开的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co.KG，Acros Organics，Aldrich Chemical Company，韶远化学科技(AccelaChemBio Inc)、达瑞化学品等公司。
实施例中无特殊说明，反应能够均在氩气氛或氮气氛下进行。
氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。
氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。
加压氢化反应使用Parr 3916EKX型氢化仪和清蓝QL-500型氢气发生器或HC2-SS型氢化仪。
氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。
微波反应使用CEM Discover-S 908860型微波反应器。
实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂，纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：A：二氯甲烷/甲醇体系，B：正己烷/乙酸乙酯体系，C：石油醚/乙酸乙酯体系，，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。
THP为四氢吡喃基。
试验所用仪器的测试条件：
1、差示扫描量热仪(Differential Scanning Calorimeter,DSC)
仪器型号：Mettler Toledo DSC 3+
吹扫气：氮气
升温速率：10.0℃/min
温度范围：25-300℃
2、X-射线衍射谱(X-ray Powder Diffraction,XRPD)
仪器型号：BRUKER D8 DiscoverX-射线粉末衍射仪
射线：单色Cu-Kα射线
Figure BDA0003653465610000071
扫描方式：θ/2θ，扫描范围(2θ范围)：3～50°
电压：40kV，电流：40mA
实施例1
(R)-2-甲基-2-(1-甲基-5-(3-甲基吗啡啉)-3-(1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-7-基)丙腈I
Figure BDA0003653465610000081
第一步
(R,E)-1-甲基-4-((1-(3-甲基吗啡啉)乙亚基)氨基)-1H-吡唑-5-羧酸甲酯1c
将化合物(R)-1-(3-甲基吗啉)乙-1-酮1b(2.5g，17.7mmol，采用专利申请”WO2016020320A1中说明书第86页的实施例中间体-1”公开的方法制备而得)溶于1,2-二氯乙烷中，氩气保护，放入冰水中冷却，缓慢滴加三氯氧磷(7.4g，48.3mmol)，滴完后室温搅拌30分钟，加入化合物4-氨基-1-甲基-1H-吡唑-5-甲酸甲酯1a(2.5g，16.1mmol，江苏艾康生物)，加热至80℃搅拌反应2小时。冷却至室温，减压浓缩，所得残余物中加入二氯甲烷(200mL)稀释，放入冰水中冷却，滴加饱和碳酸氢钠溶液中和至pH＝8～9，有机相用饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液硅胶拌样，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系C纯化得到标题化合物1c(4.8g)，产率：94％。
MS m/z(ESI):281.2[M+1]
第二步
(R)-1-甲基-5-(3-甲基吗啡啉)-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-7-酚1d
将化合物1c(2.6g，9.3mmol)溶于四氢呋喃(20mL)，放入冰水中冷却，缓慢加入双三甲基硅基胺基锂(27.8mL，1M四氢呋喃溶液，27.8mmol)，0℃反应1小时。加入甲醇(10mL)淬灭反应，硅胶拌样，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化得到标题化合物1d(400mg)，产率：55.8％。
MS m/z(ESI):249.0[M+1]
第三步
(R)-4-(7-氯-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-5-基)-3-甲基吗啡啉1e
将化合物1d(400mg，1.6mmol)溶于3.0mL三氯氧磷中，加热至90℃搅拌2.0小时。反应液冷却至室温，减压浓缩，所得残余物中加入二氯甲烷(50mL)稀释，放入冰水中冷却，加入饱和碳酸氢钠溶液中和至pH＝8～9，搅拌反应0.5小时，静置分液，收集有机相，用饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液硅胶拌样，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系C纯化得到标题化合物1e(240mg)，产率：56％。
MS m/z(ESI):267.0[M+1]
第四步
(R)-2-甲基-2-(1-甲基-5-(3-甲基吗啡啉)-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-7-基)丙腈1g
将化合物1e(240mg，0.91mmol)和化合物异丁腈1f(620mg，8.9mmol，上海毕得)溶于30mL四氢呋喃中，氩气保护，干冰丙酮浴冷却，滴加双三甲基硅基胺基锂(8.9mL，1M四氢呋喃溶液，8.9mmol)，低温搅拌0.5小时，自然升至室温搅拌1小时，加水淬灭反应，有机相用饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系C纯化得到标题化合物1g(200mg)，产率：74％。
MS m/z(ESI):300.1[M+1]
第五步
(R)-2-(3-溴-1-甲基-5-(3-甲基吗啡啉)-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-7-基)-2-甲基丙腈1h
将1g(200mg，0.67mmol)溶于5mL的1,4-二氧六环中，加入氢氧化钠溶液(0.66mL，2M溶液，1.32mmol)，冰水冷却，加入液溴(427mg，2.67mmol)，低温搅拌10分钟，自然升至室温搅拌反应1小时。加入乙酸乙酯稀释，有机相用饱和硫代硫酸钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系C纯化得到标题化合物1h(140mg)，产率：55％。
MS m/z(ESI):377.9[M+1]
第六步
2-甲基-2-(1-甲基-5-((R)-3-甲基吗啡啉)-3-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-7-基)丙腈1i
将1h(20mg，0.05mmol)，四三苯基膦钯(18mg，0.015mmol)，碳酸钠(11mg，0.10mmol)和1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊-2-基)-1H-吡唑(29mg，0.10mmol，上海毕得)溶于4mL乙二醇二甲醚中，加入1mL水，氩气保护，微波加热至120℃反应1小时。反应液冷却至室温，加水20mL，乙酸乙酯萃取(20mL×3)，合并有机相，减压浓缩，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系C纯化得到标题化合物1i(20mg)，产率：84％。
MS m/z(ESI):450.1[M+1]
第七步
(R)-2-甲基-2-(1-甲基-5-(3-甲基吗啡啉)-3-(1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-7-基)丙腈I
将化合物1i(20mg，0.04mmol)溶于5mL二氯甲烷中，滴加5mL三氟乙酸，加毕，搅拌反应4小时。反应液减压浓缩，滴加7M氨甲醇溶液调节pH＝8～9，减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化得到标题化合物I(7.0mg)，产率：43％。经X-射线粉末衍射检测其为无定形。
MS m/z(ESI):366.0[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.58(s,1H),7.03(s,1H),6.86(s,1H),4.39(s,4H),4.04-3.82(m,2H),3.74(s,2H),3.58(td,1H),3.26(dd,1H),1.88(d,6H),1.19(d,3H).
实施例2
称取约2mg实施例1所得的式(I)所示化合物，加入0.05mL乙酸乙酯后溶清，加0.15mL正庚烷后，挥发析晶。经X-射线粉末衍射检测，将该产物定义为晶型A，XRPD谱图如图1所示，其特征峰位置如表1所示。
表1
Figure BDA0003653465610000111
实施例3
称取约20mg式(I)所示化合物，加入0.3mL乙酸异丙酯/正庚烷(1:3)，先升至60℃再降温，搅拌打浆析晶，离心分离固体，真空干燥。将该产物定义为晶型B，XRPD谱图如图2所示，其特征峰位置如表2所示。
表2
Figure BDA0003653465610000112
Figure BDA0003653465610000121
实施例4
称取约20mg式(I)所示化合物，加入0.5mL乙酸乙酯后溶清，加2mL正庚烷后，挥发析晶。将该产物定义为晶型C，XRPD谱图如图3所示，其特征峰位置如表3所示。
表3
Figure BDA0003653465610000122
Figure BDA0003653465610000131
实施例5
称取约100mg式(I)所示化合物，加入2.5mL乙酸乙酯后完全溶清，加入7.5mL正庚烷，挥发析晶，固体经真空干燥得到产物。经X-射线粉末衍射检测，将该产物定义为晶型D，XRPD谱图如图4所示，其特征峰位置如表4所示。
表4
Figure BDA0003653465610000132
实施例6
将式(I)所示化合物的晶型A和晶型B敞口平摊放置，分别考察在光照(4500Lux)、高温(40℃、60℃)、高湿(RH 75％、RH 92.5％)条件下样品的稳定性，取样考察期为30天。
表5
Figure BDA0003653465610000141
结论：影响因素实验表明：晶型A和B物理稳定性好，高温和高湿条件下化学稳定性好。
实施例7
将式(I)所示化合物晶型A和B用铝箔袋密封，分别放置25℃/60％RH和40℃/75％RH条件考察稳定性。
表6
Figure BDA0003653465610000151
长期/加速稳定性实验显示：晶型A和B的物理化学稳定性良好。
测试例：
生物学评价
测试例1、本公开化合物对ATR酶的抑制效应。
以下方法用来测定本公开化合物对ATR酶的抑制效应。实验方法简述如下：一、实验材料及仪器
1.ATR酶(Eurofins Pharma Discovery Services，14-953-M)
2.GST标签P53蛋白(Eurofins Pharma Discovery Services，14-952-M)
3. 384孔板(Thermo Scientific，267462)
4.U型底96孔板(Corning，3795)
5.标记铕穴状化合物抗磷酸化P53蛋白抗体(cisbio，61P08KAE)
6.链接d2的抗GST抗体(cisbio，61GSTDLF)
7.ATP溶液(Promega，V916B)
8.EDTA(Thermo Scientific，AM9260G)
9.HEPES(Gibco，15630-080)
10.酶标仪(BMG，PHERAsta)
二、实验步骤
ATR酶1nM，P53蛋白50nM，7.435μM的ATP以及不同浓度(首浓度1μM，3倍梯度稀释11个浓度)的小分子化合物混合室温孵育2小时，然后加入终止液(12.5mM HEPES，250mMEDTA)混匀，再加入0.42ng/孔的标记铕穴状化合物抗磷酸化P53蛋白抗体和25ng/孔的链接d2的抗GST抗体。室温孵育过夜后用PHERAstar检测620nm和665nm荧光信号。数据使用GraphPad软件处理。
三、实验数据
本公开化合物对ATR酶的抑制活性可通过以上的试验进行测定，测得的IC50值见表7。
表7本公开化合物对ATR酶抑制的IC50。
实施例编号 IC<sub>50</sub>/nM Max Inhibition(％)
1 3 100
结论：本公开化合物对ATR酶的抑制活性好。
测试例2、细胞增殖实验
以下方法通过检测细胞内ATP含量，根据IC50大小评价本公开化合物对LoVo细胞增殖的抑制效果。实验方法简述如下：
一、实验材料及仪器
1.LoVo，人结肠癌肿瘤细胞(南京科佰，CBP60032)
2.胎牛血清(GIBCO,10091-148)
3.F-12K培养基(Gibco，21127030)
4.CellTite-Glo试剂(Promega，G7573)
5. 96孔细胞培养板(corning，3903)
6.胰酶(invitrogen，25200-072)
7.酶标仪(BMG，PHERAsta)
8.细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司，IC1000)
二、实验步骤
LoVo细胞培养在含10％FBS的F-12K培养基中，一周传代2～3次，传代比列1:3或1:5。传代时，用胰酶消化细胞后转至离心管中，1200rpm离心3分钟，弃去上清培养基残液，加入新鲜培养基重悬细胞。在96孔细胞培养板中加入90μL的细胞悬液，密度为3.88×104细胞/ml，96孔板外围只加入100μL的完全培养基。将培养板在培养箱培养24小时(37℃，5％CO2)。
将待测样品用DMSO稀释成2mM，并以3倍依次稀释成10个浓度，并设置空白和对照孔。取配制成梯度浓度的待测化合物溶液5μL加入到95μL新鲜培养基中。再向培养板中加入10μL上述含药物的培养基溶液。将培养板在培养箱孵育3天(37℃，5％CO2)。在96孔细胞培养板中，每孔加入50μL CellTiter-Glo试剂，室温避光放置5-10min，在PHERAstar中读取化学发光信号值，数据使用GraphPad软件处理。
三、实验数据
本公开化合物对LoVo细胞增殖的抑制活性可通过以上的试验进行测定，测得的IC50值见表8。
表8本公开化合物对LoVo细胞增殖抑制的IC50。
实施例编号 IC<sub>50</sub>/nM Max Inhibition(％)
1 43 93
结论：本公开化合物对ATR酶的抑制活性好。
药代动力学评价
测试例3、本公开化合物的药代动力学测试
1、摘要
以大鼠为受试动物，应用LC/MS/MS法测定了大鼠灌胃给予实施例1化合物后不同时刻血浆中的药物浓度。研究本公开化合物在大鼠体内的药代动力学行为，评价其药动学特征。
2、试验方案
2.1试验药品
实施例1化合物。
2.2试验动物
健康成年SD大鼠12只，雌雄各半，平均分成3组，每组4只，购自维通利华实验动物有限公司。
2.3药物配制
称取一定量药物，加入5％DMSO、5％吐温80和90％生理盐水配置成无色澄明溶液。
2.4给药
SD大鼠禁食过夜后灌胃给药，给药剂量均为2mg/kg，给药体积均为10.0mL/kg。
3.操作
大鼠灌胃给药实施例1化合物，于给药前及给药后0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，11.0，24.0小时由眼眶采血0.2mL，置于EDTA-K2kk抗凝试管中，4℃、11000转/分钟离心5分钟分离血浆，于-20℃保存，给药后2小时进食。
测定不同浓度的药物灌胃给药后大鼠血浆中的待测化合物含量：取给药后各时刻的大鼠血浆25μL，加入内标溶液50μL，乙腈175μL，涡旋混合5分钟，离心10分钟(4000转/分钟)，血浆样品取上清液1μL进行LC/MS/MS分析。
4、药代动力学参数结果
表9本公开化合物的药代动力学参数如下：
Figure BDA0003653465610000181
结论：本公开化合物的药代吸收良好，具有明显的药代动力学优势。

Claims (15)

1.一种式(I)所示化合物的晶型，所述晶型为：
晶型A，其X-射线粉末衍射图谱在2θ角为6.4、7.5、9.1、9.9和21.7处有特征峰；
晶型B，其X-射线粉末衍射图谱在2θ角为5.3、5.5、8.7、16.0和21.5处有特征峰；
晶型C，其X-射线粉末衍射图谱在2θ角为5.2、6.5、20.7、21.3和22.8处有特征峰；或
晶型D，其X-射线粉末衍射图谱在2θ角为5.3、6.5、8.6、10.7和21.5处有特征峰，
Figure FDA0003653465600000011
2.根据权利要求1所述的晶型，其中所述晶型A的X-射线粉末衍射图谱在2θ角为5.3、6.4、7.5、9.1、9.9、10.7、12.1、16.0、16.6、17.5、18.4、19.9、21.7、22.2、23.6、25.0、27.0和28.4处有特征峰，优选所述晶型A的X-射线粉末衍射图谱如图1所示。
3.根据权利要求1所述的晶型，其中所述晶型B的X-射线粉末衍射图谱在2θ角为5.3、5.5、8.7、9.8、10.6、11.2、12.0、12.9、14.5、16.0、17.2、18.1、19.7、21.5、23.8、25.2和26.8处有特征峰，优选所述晶型B的X-射线粉末衍射图谱如图2所示。
4.根据权利要求1所述的晶型，其中所述晶型C的X-射线粉末衍射图谱在2θ角为5.2、6.5、10.3、10.7、11.3、13.4、14.7、16.7、17.4、18.0、18.1、19.8、20.3、20.7、21.3、22.8、23.9、24.6、25.3、26.0、27.5、28.0和31.3处有特征峰，优选所述晶型C的X-射线粉末衍射图谱如图3所示。
5.根据权利要求1所述的晶型，其中所述晶型D的X-射线粉末衍射图谱在2θ角为5.3、6.5、8.6、9.2、9.8、10.4、10.7、11.3、12.1、13.0、14.3、16.0、17.2、18.2、19.2、19.8、21.5、25.2、26.7和29.4处有特征峰，优选所述晶型D的X-射线粉末衍射图谱如图4所示。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的晶型，其中所述2θ角的误差范围为±0.2。
7.一种制备如权利要求1或2所述的式(I)所示化合物的晶型A的方法，所述方法包括：将包含式(I)所示化合物与溶剂混合，析晶，所述溶剂选自乙酸乙酯/正庚烷、四氢呋喃/正庚烷、二氯甲烷/正庚烷。
8.一种制备如权利要求1或3所述的式(I)所示化合物的晶型B的方法，所述方法包括：将式(I)所示化合物与乙酸异丙酯/正庚烷混合析晶。
9.一种制备如权利要求1或4所述的式(I)所示化合物的晶型C的方法，所述方法包括：将式(I)所示化合物与乙酸乙酯/正庚烷混合，析晶。
10.一种制备如权利要求1或5所述的式(I)所示化合物的晶型D的方法，所述方法包括：将式(I)所示化合物与乙酸乙酯/正庚烷混合，析晶。
11.一种药物组合物，包含权利要求1-6任意一项所述的式(I)所示化合物的晶型，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
12.一种制备药物组合物的方法，包括将权利要求1-6任意一项所述的式(I)所示化合物的晶型与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合的步骤。
13.权利要求1-6任意一项所述的式(I)所示化合物的晶型或权利要求11所述的药物组合物在制备用于抑制ATR激酶的药物中的用途。
14.权利要求1-6任意一项所述的式(I)所示化合物的晶型或权利要求11所述的药物组合物在制备用于治疗过度增殖性疾病的药物中的用途。
15.权利要求1-6任意一项所述的式(I)所示化合物的晶型或权利要求11所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的用途。
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WO2024109727A1 (zh) * 2022-11-21 2024-05-30 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种吡唑并杂芳基类衍生物的可药用盐的结晶形式

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