JP2022533237A

JP2022533237A - ピリミジンスルホンアミド系化合物の結晶形及びその製造方法

Info

Publication number: JP2022533237A
Application number: JP2021569179A
Authority: JP
Inventors: 俊苗栗; 茂▲義▼ 雷; 云富 ▲羅▼
Original assignee: シージャーヂュアン・サガシティー・ニュー・ドラッグ・デヴェロップメント・カンパニー・リミテッド
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2022-07-21
Also published as: US20220220098A1; EP3974421B1; CN113874364B; LT3974421T; CN113874364A; EP3974421A4; WO2020233694A1; AU2020277546A1; CA3139553A1; BR112021023328A2; IL288224A; FI3974421T3; EP3974421A1; CN118480033A; BR112021023328A8; DK3974421T3

Abstract

本発明は、ピリミジンスルホンアミド系化合物の結晶形及びその製造方法を公開し、ＥＴＡ受容体拮抗薬関連疾患を治療する薬物の製造における該結晶形の応用にさらに関する。TIFF2022533237000026.tif52169

Description

本願は、２０１９年５月２２日に出願した中国特許出願の第２０１９１０４２８７９５．９号の優先権を主張するものである。
本発明は、ピリミジンスルホンアミド系化合物の結晶形及びその製造方法に関し、ＥＴ_Ａ受容体拮抗薬関連疾患を治療する薬物の製造における該結晶形の応用にさらに関する。

エンドセリン（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ、ＥＴ）は、２１個のアミノ酸を含有するペプチド異性体ファミリーであり、いずれも６個の同じアミノ酸残基からなる疎水性Ｃ末端及び２個の鎖内ジスルフィド結合を有する。人体にＥＴ－１、ＥＴ－２及びＥＴ－３という、異なる遺伝子によってコードされる３種類の異性体があり、その中では、ＥＴ－１の血管収縮作用が最も強く、静脈に対する収縮強度が動脈の３～１０倍であり、疾患を引き起こす主な異性体である。ＥＴ－１は、エンドセリンファミリーのうち、含有量が最も多く、機能が最も重要な一つであり、主に血管内皮で発現されるが、心臓、腎臓、肺、副腎などの臓器の非血管組織にも分布している。

ＥＴの機能は血圧を調整する血管因子のみならず、多くの細胞プロセス（例えば増殖、アポトーシス及び遷移）に関与して組織肥大化、再構築、線維化及び炎症を引き起こすホルモンでもある。肺動脈高血圧、高血圧、敗血症、アテローム性動脈硬化、急性心筋梗塞、鬱血性心不全、偏頭痛及び喘息などの多くの疾患において、血漿及び組織では、ＥＴ－１レベルが上昇する。したがって、エンドセリン受容体拮抗薬は、非常に潜在力のある治療薬として広く研究されている。

エンドセリン受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体に属し、現在、主にＥＴ_Ａ、ＥＴ_Ｂ及びＥＴ_Ｃの３種があり、組織及び器官によって分布が異なり、３種のエンドセリンサブタイプに対する親和力も異なり、生理作用の違いも大きい。エンドセリンＥＴ_Ａ受容体は、主に平滑筋細胞に分布し、選択的にＥＴ－１と結合し、血管平滑筋の収縮を仲介する。エンドセリンＥＴ_Ｂ受容体は、ＥＴ_Ｂ１及びＥＴ_Ｂ２の２つのサブタイプに分けられ、前者は内皮細胞に分布し、内皮由来弛緩因子（ＥＤＲＦ）、プロスタサイクリン（ＰＧＩ_２）及び一酸化窒素（ＮＯ）の放出を仲介し、血管の拡張を引き起こし、後者は血管平滑筋に位置し、作用がＥＴ_Ａ受容体と同様に直接静脈血管の収縮を仲介し、ＥＴ－１、ＥＴ－２及びＥＴ－３に対するエンドセリンＥＴ_Ｂ受容体の親和力は同等である。ＥＴ_Ｃ受容体は、ＥＴ－３選択的受容体であり、主にニューロン細胞に分布し、神経伝達物質として役割を果たす。ＥＴ－１は、主にＥＴ_Ａ及びＥＴ_Ｂ受容体によって、役割を果たす。エンドセリン受容体拮抗薬は、ＥＴ_Ａ受容体拮抗薬、ＥＴ_Ｂ受容体拮抗薬、及びＥＴ_Ａ／ＥＴ_Ｂ二重拮抗薬の３種に分かれ、くも膜下出血、心不全、肺動脈高血圧、原発性高血圧、難治性高血圧、神経因性炎症、糖尿病性腎症、巣状分節性糸球体硬化症、腎不全、神経因性炎症、並びに腎不全及び心筋梗塞後の脳血管痙縮などの多くの疾患における臨床前及び／又は臨床の作用効果はすでに証明された。高選択性のＥＴ_Ａ受容体拮抗薬は、ＥＴ－１の強い血管収縮作用を抑制し、同時に非選択性のＥＴ_Ａ／ＥＴ_Ｂ受容体二重拮抗薬のいくつかの不良反応を回避することにより、臨床上の副作用を減少させる。

特許ＷＯ２００２０５３５５には、化合物マシテンタンが公開されており、該化合物は、エンドセリンの作用に関連する疾患の治療に用いることができる。

国際公開２００２０５３５５号

本発明に係る、式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形は、Ｘ線粉末回折パターンが、２θ角が１２．６２±０．２０°、１６．８６±０．２０°、１９．３３±０．２０°、２５．３８±０．２０°の位置に特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。

本発明のいくつかの態様では、上記Ａ結晶形は、Ｘ線粉末回折パターンが、２θ角が８．４２±０．２０°、１０．３１±０．２０°、１２．６２±０．２０°、１６．８６±０．２０°、１８．２８±０．２０°、１９．３３±０．２°、２１．８７±０．２０°、２５．３８±０．２０°、２７．１４±０．２０°の位置に特徴的な回折ピークを有する。

本発明のいくつかの態様では、上記Ａ結晶形は、Ｘ線粉末回折パターンが、２θ角が８．４２±０．２０°、１０．３１±０．２０°、１２．６２±０．２０°、１６．８６±０．２０°、１８．２８±０．２０°、１９．３３±０．２°、２１．８７±０．２０°、２２．９３±０．２０°、２５．３８±０．２０°、２６．６３±０．２０°、２７．１４±０．２０°の位置に特徴的な回折ピークを有する。

本発明のいくつかの態様では、上記Ａ結晶形は、Ｘ線粉末回折パターンが、２θ角が８．４２°、９．４１°、９．５８°、９．８２°、１０．３１°、１２．６２°、１５．７７°、１６．６２°、１６．８６°、１７．５１°、１７．９７°、１８．２８°、１８．８５°、１９．３３°、１９．５８°、２０．３３°、２１．８７°、２２．５８°、２２．９３°、２３．１５°、２３．３９°、２５．０５°、２５．３８°、２６．３１°、２６．６３°、２７．１４°、２７．７９°、２９．４０°、３１．０１°、３１．４８°、３５．４２°、３９．２１°の位置に特徴的な回折ピークを有する。

本発明のいくつかの態様では、上記Ａ結晶形は、ＸＲＰＤパターンが図１に示すとおりである。

本発明のいくつかの態様では、上記Ａ結晶形は、ＸＲＰＤパターンの解析データが表１に示すとおりである。

表１：式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形のＸＲＰＤパターンの解析データ

本発明のいくつかの態様では、上記Ａ結晶形は、示差走査熱量曲線が、１６１．３±３．０℃に吸熱ピークの開始点を有する。

本発明のいくつかの態様では、上記Ａ結晶形は、ＤＳＣパターンが図２に示すとおりである。

本発明のいくつかの態様では、上記Ａ結晶形は、熱重量分析曲線における１５２．３±３．０℃での減量が０．０１％に達する。

本発明のいくつかの態様では、上記Ａ結晶形は、ＴＧＡパターンが図３に示すとおりである。

本発明に係る、式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形は、Ｘ線粉末回折パターンが、２θ角が７．５１±０．２０°、９．６０±０．２０°、２２．５６±０．２０°の位置に特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。

本発明に係る、式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形は、Ｘ線粉末回折パターンが、２θ角が７．５１±０．２０°、２２．５６±０．２０°、２４．７９±０．２０°の位置に特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。

本発明に係る、式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形は、Ｘ線粉末回折パターンが、２θ角が７．５１±０．２０°、１５．０５±０．２０°、２２．５６±０．２０°、２４．７９±０．２０°の位置に特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。

本発明のいくつかの態様では、上記Ｂ結晶形は、Ｘ線粉末回折パターンが、２θ角が７．５１±０．２０°、９．６０±０．２０°、１５．０５±０．２０°、１９．０９±０．２０°、２２．５６±０．２０°、２４．１８±０．２０°、２４．７９±０．２０°、２７．９５±０．２０°の位置に特徴的な回折ピークを有する。

本発明のいくつかの態様では、上記Ｂ結晶形は、Ｘ線粉末回折パターンが、２θ角が７．５１±０．２０°、９．６０±０．２０°、１５．０５±０．２０°、１９．０９±０．２０°、２２．２０±０．２０°、２２．５６±０．２０°、２４．１８±０．２０°、２４．７９±０．２０°、２７．９５±０．２０°の位置に特徴的な回折ピークを有する。

本発明のいくつかの態様では、上記Ｂ結晶形は、Ｘ線粉末回折パターンが、２θ角が７．５１°、９．６０°、１１．０８°、１５．０５°、１５．５２°、１７．５３°、１８．３４°、１９．０９°、２０．４１°、２０．８５°、２２．２０°、２２．５６°、２３．１５°、２４．１８°、２４．７９°、２７．６９°、２７．９５°、２８．７５°、３３．５７°、３５．４２°の位置に特徴的な回折ピークを有する。

本発明のいくつかの態様では、上記Ｂ結晶形は、ＸＲＰＤパターンが図４に示すとおりである。

本発明のいくつかの態様では、上記Ｂ結晶形は、ＸＲＰＤパターンの解析データが表２に示すとおりである。

表２：式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形のＸＲＰＤパターンの解析データ

本発明のいくつかの態様では、上記Ｂ結晶形は、示差走査熱量曲線が、１５０．３±３．０℃に吸熱ピークの開始点を有する。

本発明のいくつかの態様では、上記Ｂ結晶形は、ＤＳＣパターンが図５に示すとおりである。

本発明のいくつかの態様では、上記Ｂ結晶形は、熱重量分析曲線における、９０．０±３．０℃での減量が０．５３％に達し、１４３．９±３．０℃での減量が０．６０％に達する。

本発明のいくつかの態様では、上記Ｂ結晶形は、ＴＧＡパターンが図６に示すとおりである。

本発明のいくつかの態様では、上記式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形の製造方法は、
（１）式（Ｉ）で表される化合物を溶媒に添加し加熱して溶解するステップと、
（２）上記溶液を固体が析出するまで降温し、撹拌し、濾過して、式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形を得るステップとを含む。

本発明のいくつかの態様では、上記製造方法において、上記溶媒は、テトラヒドロフラン及びアセトニトリルから選択される。

本発明のいくつかの態様では、上記製造方法において、撹拌温度は１０℃～６０℃である。

本発明のいくつかの態様では、上記製造方法において、撹拌時間は１２時間～２４時間である。

本発明のいくつかの態様では、上記製造方法において、化合物と溶媒との重量－体積比は、１ｇ：１～６ｍＬである。

本発明のいくつかの態様では、上記式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形の製造方法は、
（１）式（Ｉ）で表される化合物を溶媒に添加し完全に溶解するステップと、
（２）アミノ酸を添加し、４０℃で１２～２４時間撹拌し、濾過して、式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形を得るステップとを含み、
上記溶媒は、テトラヒドロフランから選択され、
上記アミノ酸は、Ｌ－アルギニンから選択される。

本発明は、ＥＴ_Ａ受容体拮抗薬関連疾患を治療する薬物の製造における上記結晶形の応用をさらに提供する。

本発明のいくつかの態様では、上記応用は、上記ＥＴ_Ａ受容体拮抗薬に関連する薬物は、肺動脈高血圧、原発性高血圧、難治性高血圧、糖尿病性腎症及び頭蓋内血管攣縮などの適応症に用いられる薬物であることを特徴とする。

定義及び説明

特に説明しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び連語は、以下の意味を有する。特定の連語や用語は、特別に定義されない場合、不確定又は不明瞭であるとみなされるべきではなく、一般的な意味で理解されるべきである。本明細書に商品名が現れる場合、その対応する商品又はその活性成分を指す。

本発明の中間体化合物は、以下に列挙される具体的な実施形態、他の化学合成方法と組み合わせた実施形態、及び当業者に周知の均等の置換形態を含む、当業者に周知の様々な合成方法で製造することができ、好ましい実施形態は、本発明の実施例を含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の具体的な実施形態における化学反応は、適切な溶媒中で完成され、上記溶媒は、本発明の化学変化及びそれに必要な試薬及び材料に適するべきである。本発明の化合物を得るために、当業者は既存の実施形態に基づいて合成ステップ又は反応フローを変更するか又は選択する必要がある場合がある。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明を何ら限定するものではない。

本発明に使用される全ての溶媒は市販されるものであり、さらに精製することなく使用することができる。

本発明に使用される溶媒は、市販品として入手可能である。本発明は以下の略語を採用する：ＡＣＮは、アセトニトリルを表し、ＤＣＭは、ジクロロメタンを表し、ＤＭＦは、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを表し、ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドを表し、ＥｔＯＨは、エタノールを表し、ＭｅＯＨは、メタノールを表し、ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸を表し、ＡＴＰは、アデノシン三リン酸を表し、ＨＥＰＥＳは、４－ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸を表す。

本発明の化合物の結晶形は、安定性が高く、製剤化されやすく、本発明の化合物は、いずれもヒトＥＴＡ受容体に対する、非常に高いインビトロ拮抗活性を示し、そしてＥＴＡ／ＥＴＢの選択性がいずれも１００００倍を超える。本発明の化合物は、ＰＸＲによるＣＹＰ３Ａ発現に対する誘導作用の特性評価実験において、対照のマシテンタンより優れており、ヒト肝ミクロソームセルリンＰ４５０の５種の主なアイソザイムに対する阻害作用の特性評価実験において、本発明の化合物はいずれもマシテンタンより優れている。本発明の化合物は、胆汁酸塩排出ポンプに対する阻害作用がマシテンタンよりはるかに弱いため、肝毒性が生じるリスクを顕著に低下させる。本発明の化合物は、ＳＤラット及びビーグル犬のいずれのインビボにおいて優れた薬物動態学的特徴を有する。

１．１Ｘ線粉末回折（Ｘ－ｒａｙｐｏｗｄｅｒｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、ＸＲＰＤ）
機器型番：ブルカーＤ８ａｄｖａｎｃｅＸ線回折計
試験方法：約１０～２０ｍｇのサンプルを、ＸＲＰＤ検出に用いる。
詳細なＸＲＰＤパラメータは、以下のとおりである：
Ｘ線管：Ｃｕ、ｋα、（λ＝１．５４０５６Å）
Ｘ線管電圧：４０ｋＶ、Ｘ線管電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
検出器スリット：１０．５０ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：４～４０ｄｅｇ
ステップ径：０．０２ｄｅｇ
ステップサイズ：０．１２秒
サンプルディスク回転数：１５ｒｐｍ

１．２示差熱分析（ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＳｃａｎｎｉｎｇＣａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＤＳＣ）
機器型番：ＴＡＱ２０００示差走査熱量計
試験方法：サンプル（～１ｍｇ）をアルミニウム製ＤＳＣパンに入れて試験を行い、５０ｍＬ／ｍｉｎのＮ_２の条件で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、サンプルを２５℃から３５０℃に加熱する。

１．３熱重量分析（ＴｈｅｒｍａｌＧｒａｖｉｍｅｔｒｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ、ＴＧＡ）

機器型番：ＴＡＱ５０００ＩＲ熱重量分析計

試験方法：サンプル（２～５ｍｇ）を白金製ＴＧＡパンに入れて試験を行い、２５ｍＬ／ｍｉｎのＮ_２の条件で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、サンプルを室温から３５０℃に加熱する。

１．４本発明の吸湿性試験

本発明は、『原薬と製剤の安定性試験の指導原則』（中国薬典２０１５版四部通則）に準じ、式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形に対して吸湿性試験を行った。

吸湿性の評価分類は以下のとおりである：

注：ΔＷ％は、２５℃で、下部に塩化アンモニウム飽和溶液が放置されている乾燥器内での供試品の吸湿による重量増加パーセントを示す

１．５高速液体クロマトグラフィー分析方法

固体安定性試験ＨＰＬＣ方法のクロマトグラフィー条件は以下の表３を参照する：

表３

式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形のＣｕ－Ｋα放射によるＸＲＰＤパターンである。式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形のＤＳＣパターンである。式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形のＴＧＡパターンである。式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形のＣｕ－Ｋα放射によるＸＲＰＤパターンである。式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形のＤＳＣパターンである。式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形のＴＧＡパターンである。

本発明の内容をよりよく理解するために、以下に具体的な実施例を参照してさらに説明するが、具体的な実施形態は本発明の内容を限定するものではない。

実施例１：式（Ｉ）の化合物の製造

ステップ１：化合物３の合成

５～１０℃で窒素ガスの保護下で、化合物２（１２７５ｇ、９．０１ｍｏｌ）をジクロロメタン（５．５Ｌ）に溶解し、温度を１５～２０℃に調整し、ゆっくりとｔ－ブチルアルコール（８０１．２３ｇ、１０．８１ｍｏｌ）を上記溶液に滴下し（滴下時間を約２時間とする）、反応混合物を室温で４時間撹拌し反応させる。目的化合物３（粗生成物）を反応溶媒のジクロロメタン（５．５Ｌ）に残し、そのまま次のステップの反応に用いる。

ステップ２：化合物４の合成

５～１０℃で窒素ガスの保護下で、化合物２－メトキシエチルアミン（６７６．７４ｇ、９．０１ｍｏｌ）をジクロロメタン（２．０Ｌ）に溶解し、その後にトリエチルアミン（１８２３．４４ｇ、１８．０２ｍｏｌ）を添加し、内温を１０～１５℃に保持し、ゆっくりと化合物３のジクロロメタン溶液（９．０１ｍｏｌ、５．５Ｌ）を上記反応液に滴下し（滴下時間を約２時間とする）、反応混合物を室温に昇温させ、１２時間撹拌し反応させる。反応が完了した後、反応液に２Ｍ希塩酸を添加してｐＨを３～４に調節し、分液し、水相を捨てる。有機相を水（２Ｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮して、目的化合物４を得る。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ：７．２４（ｂｒｓ、１Ｈ）、５．４５（ｔ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．５３（ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．３７（ｓ、３Ｈ）、３．２６（ｑ、Ｊ＝５．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．５１（ｓ、９Ｈ）。

ステップ３：化合物５の合成

５～１０℃で、化合物４（１９１２．５０ｇ、７．５２ｍｏｌ）を水（７．０Ｌ）に入れ、反応混合物を９０～９５℃に加熱し、４時間撹拌し反応させる。反応が完了した後、室温まで冷却し、酢酸エチル（２．０Ｌ×２）で抽出し、水相を収集し、有機相を合わせ、水（２．０Ｌ）で洗浄し、分液して得られた有機相を捨て、二回の水相を混合し、減圧濃縮して、目的化合物５を得る。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ：５．３８－５．３５（ｍ、３Ｈ）、３．５４（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．３６（ｓ、３Ｈ）、３．３０－３．２６（ｍ、２Ｈ）。

ステップ４：化合物６の合成

５～１０℃で窒素ガスの保護下で、化合物５（６０９．０５ｇ、３．９５ｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（５．０Ｌ）に溶解し、その後にカリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（１１０７．５１ｇ、９．８７ｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１５～２０℃下で１時間撹拌し反応させた後、５－ブロモ－４，６－ジクロロピリミジン（７５０．０３ｇ、３．２９ｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（２．０Ｌ）溶液を上記反応液にゆっくりと滴下し（滴下時間を約２時間とする）、反応混合物を室温で１２時間撹拌反応を継続する。該反応物を同じ量の二つのバッチに並行して投入し、合併して処理する。反応が完了した後、反応液に冷水（４２Ｌ）を添加し、２Ｍ希塩酸でｐＨを３～４に調節し、酢酸エチル（２０Ｌ×４）で抽出する。有機相を合わせ、飽和食塩水（１５Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧し溶媒を除去し、得られた粗生成物をメタノール（１．２Ｌ）で３０分間叩解し撹拌し、濾過し、濾過ケーキをメタノール（１００ｍＬ×２）で洗浄し、濾過ケーキを収集し減圧して溶媒を除去して、目的化合物６を得る。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ：８．５０（ｓ、１Ｈ）、７．８０（ｓ、１Ｈ）、５．８９（ｔ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．４１（ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．２１－３．１７（ｍ、５Ｈ）。

ステップ５：化合物７の合成

５～１０℃で窒素ガスの保護下で、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（１９５．２５ｇ、１．７４ｍｏｌ）をエチレングリコー（１．６Ｌ）に入れ、反応混合物を４０℃に加熱し、１時間撹拌し反応させた後、化合物６（２００．８０ｇ、０．５８ｍｏｌ）及びエチレングリコールジメチルエーテル（１００．００ｍＬ）を順に上記溶液に入れ、反応液を１１０℃に加熱し、１２時間撹拌反応を継続する。反応が完了した後、室温まで冷却し、反応液を氷水（６．５Ｌ）に注ぎ、２Ｍ希塩酸でｐＨを３～４に調節し、酢酸エチル（２．５Ｌ×４）で抽出する。有機相を合わせ、飽和食塩水（２．０Ｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧して溶媒を除去し、得られた残留物を室温で石油エーテル（２５０ｍＬ）と酢酸エチル（２００ｍＬ）との混合溶媒で２０分間叩解し撹拌し、濾過し、濾過ケーキを収集し、真空乾燥させて目的化合物７を得る。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ：８．３８（ｓ、１Ｈ）、７．６７（ｓ、１Ｈ）、６．００（ｔ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．５８（ｔ、Ｊ＝４．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．９８（ｔ、Ｊ＝４．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．４９（ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．２６（ｓ、３Ｈ）、３．２５－３．２１（ｍ、２Ｈ）、２．４５（ｂｒｓ、１Ｈ）

ステップ６：化合物８の合成

５～１０℃で窒素ガスの保護下で、化合物７（１０８．０２ｇ、０．２９ｍｏｌ）、３，４－ジメチレンジオキシフェニルボロン酸ピナコールエステル（９４．２７ｇ、０．３８ｍｏｌ）及び炭酸セシウム（２８３．４６ｇ、０．８７ｍｏｌ）をジオキサン（２．１０Ｌ）と水（２１０ｍＬ）との混合溶媒に溶解し、その後に、［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（３２．２０ｇ、０．０４４ｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８５℃に加熱し、１５時間撹拌反応させる。反応が完了した後、室温まで冷却し、減圧して溶媒を除去し、冷水（３．０Ｌ）を添加し、希塩酸でｐＨを３～４に調節し、酢酸エチル（１．２Ｌ×４）で抽出する。有機相を合わせ、飽和食塩水（１．５０Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧して溶媒を除去し、得られた残留物に対してカラムクロマトグラフィー分離（溶出剤：ジクロロメタン／メタノール＝１００／０－１００／１、体積比）を行って、目的化合物８を得る。ＭＳ－ＥＳＩｍ／ｚ：４１３．０［Ｍ＋Ｈ］^＋。

ステップ７：式（Ｉ）の化合物の合成

５～１０℃で窒素ガスの保護下で、水素化ナトリウム（２９．８９ｇ、０．７５ｍｏｌ、純度：６０％）をテトラヒドロフラン（１．４０Ｌ）にバッチで添加し、次に化合物８（６３．０５ｇ、０．１５ｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（５００ｍＬ）を上記反応液に添加し、反応混合物を５～１０℃下で１時間撹拌反応させ、次に５－ブロモ－２－クロロピリミジン（４４．４９ｇ、０．２３ｍｏｌ）及び無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（６３ｍＬ）を順に添加し、反応混合物を７０～７５℃まで加熱し、４時間撹拌反応を継続する。反応が完了した後、室温まで冷却し、冷飽和塩化アンモニウム溶液（６．０Ｌ）をゆっくりと注ぎ、２Ｍ希塩酸でｐＨを３～４に調節し、酢酸エチル（１．５Ｌ×４）で抽出する。有機相を合わせ、飽和食塩水（２．０Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧して溶媒を除去し、得られた粗生成物をジクロロメタン（７０ｍＬ）とメタノール（２４０ｍＬ）との混合溶媒に溶解し、１時間撹拌還流し、加熱を停止し、混合液を５～１０℃で１２時間撹拌し、濾過し、濾過ケーキを収集する。ジクロロメタン（２００ｍＬ）で濾過ケーキを溶解し、活性炭（２０ｇ）を添加し、混合物を室温で３時間撹拌し、濾過し、濾液を減圧して溶媒を除去し、得られた残留物をジクロロメタン（７０ｍＬ）とメタノール（２４０ｍＬ）との混合溶媒で１２時間叩解し、濾過し、濾過ケーキを収集し、メタノール（２０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥させて式（Ｉ）の化合物を得る。ＭＳ－ＥＳＩｍ／ｚ：５６８．９［Ｍ＋Ｈ］^＋、５７０．９［Ｍ＋Ｈ＋２］^＋。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：８．４９（ｓ、２Ｈ）、８．４５（ｓ、１Ｈ）、７．０１（ｓ、１Ｈ）、６．８７－６．８５（ｍ、１Ｈ）、６．７１－６．６９（ｍ、２Ｈ）、６．０５－６．０２（ｍ、３Ｈ）、４．７３－４．７１（ｍ、２Ｈ）、４．６５－４．６３（ｍ、２Ｈ）、３．４９（ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．２９（ｓ、３Ｈ）、３．１９－３．１５（ｍ、２Ｈ）。

実施例２：式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形の製造

１０～２０℃で、式（Ｉ）の化合物（１６８．００ｇ、０．３０ｍｏｌ）をアセトニトリル（１．８５Ｌ）に入れ、混合液を７５～８５℃に加熱し、溶液が清澄になるまで２時間撹拌する。活性炭（１００．０５ｇ）を上記混合液に入れ、混合液を７５～８５℃で３時間撹拌する。混合液を５０．０１ｇの珪藻土で熱いうちに濾過し、濾液を１５時間撹拌し室温１０～２０℃まで自然冷却する（大量の固体が析出する）。上記混合物を濾過し、濾過ケーキをアセトニトリル（１００ｍＬ×３）で洗浄する。濾過ケーキを収集し、真空乾燥箱で真空乾燥させて、式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形を得る。

約５０ｍｇの式（Ｉ）の化合物を１．５ｍＬの液相バイアルに入れ、４００μＬのテトラヒドロフランを添加し、超音波で均一に混合する。上記懸濁液サンプルをマグネチックスターラー（４０℃）に置いて遮光して４８時間撹拌し、遠心分離し、固体を収集した後、３０℃の真空乾燥箱に置いて一晩（１６～２４時間）乾燥させて、式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形を得る。

約５０ｍｇの式（Ｉ）の化合物を１．５ｍＬの液相バイアルに添加し、４００μＬのアセトニトリルを添加し、超音波で均一に混合する。上記懸濁液サンプルをマグネチックスターラー（４０℃）に置いて遮光して４８時間撹拌し、遠心分離し、固体を収集し、３０℃の真空乾燥箱に置いて一晩（１６～２４時間）乾燥させて、式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形を得る。

実施例３：式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形の固体安定性試験

『原薬と製剤の安定性試験の指導原則』（中国薬典２０１５版四部通則９００１）に準じ、式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形の高温（６０℃、開口）、高湿（室温／相対湿度９２．５％、開口）、加速条件（２５℃／６０％の相対湿度、４０℃／７５％の相対湿度、封口）及び強光（４５００±５００ｌｕｘ、９０μｗ／ｃｍ^２、封口）条件での安定性を考察する。

式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形１．５ｇを秤量し、開口した時計皿に入れ、薄く一層に敷く。高温及び高湿度条件で放置したサンプルをデシケータに入れて考察し、５日目、１０日目、３０日目にサンプリングして検出し、検出結果と０日目の初期検出結果とを比較し、強光条件で放置したサンプルに透明な蓋を被せ、シールフィルムで密封し、５日目、１０日目にサンプリングして検出し、検出結果と０日目の初期検出結果とを比較する。式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形を約２．０ｇずつに秤量する。各サンプルをそれぞれ二層ＬＤＰＥ袋に入れ、各層のＬＤＰＥ袋をそれぞれ封口し密封し、さらにＬＤＰＥ袋をアルミニウム箔袋に入れてヒートシールし、それぞれ２５℃／６０％の相対湿度の条件下で置き、３月目、６月目、９月目及び１２月目にサンプリングして検出し、及び４０℃／７５％の相対湿度の条件で考察し、１月目、２月目、３月目及び６月目にサンプリングして検出する。検出結果と０日目の初期検出結果とを比較する。試験結果を以下の表４に示す。

表４：式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形の高温、高湿及び強光条件での固体安定性試験結果

「－」：未測定。

結論：式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形は、高温、高湿又は強光の条件のいずれにおいても良好な安定性を有する。

実施例４：式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形の異なる溶媒中での安定性試験

式（Ｉ）の化合物の粗生成物を３８～４０℃でジクロロメタンに溶解し、熱いうちに濾過し、減圧濃縮しスピン乾燥させて式（Ｉ）の化合物の混合結晶を得る。５０℃で上記式（Ｉ）の化合物の混合結晶のＴＨＦとＡＣＮにおける飽和溶液をそれぞれ調製する。

約５ｍｇの式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形とＢ結晶形のサンプルをそれぞれ秤量し、以下の表に応じて異なる温度、異なる溶媒の飽和溶液に入れ、対応する温度のミキサーに入れた後に３日間撹拌する。

上記懸濁液を遠心分離し、沈殿を３０℃の真空乾燥箱で一晩乾燥させ、乾燥したサンプルにＸＲＰＤ検出を行い、結晶形の状態を検出する。結果を表５に示す。

表５：Ａ結晶形の異なる溶媒中での安定性実験

実験の結論：式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形は、アセトニトリル及びテトラヒドロフラン中で、２５℃及び５０℃の条件のいずれにおいても良好な安定性を有する。

実施例５：式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形の吸湿性に関する研究

実験方法：

１）２つの乾燥した栓付きガラス秤量瓶（外径が５０ｍｍで、高さが３０ｍｍである）を、下部に塩化アンモニウム飽和溶液が放置されている乾燥器内に置き、秤量瓶を開口して放置し、乾燥器の蓋を被せ、その後に乾燥器を２５℃の恒温室内に置き、一晩放置する。
２）秤量瓶を一晩放置した後に除去して重量を精密に秤量して、それぞれｍ_１１、ｍ_１２、ｍ_１３である。
３）適量の式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形サンプルを、重量を秤量した秤量に平らに敷き（サンプルの厚さが１ｍｍである）、その後に重量を精密に秤量し、それぞれｍ_２１、ｍ_２２、ｍ_２３である。
４）秤量瓶を開口して放置し、瓶蓋を下部に塩化アンモニウム飽和溶液が放置されている乾燥器内に共に置き、乾燥器の蓋を被せ、その後に乾燥器を２５℃の恒温箱に入れて、２４時間放置する。
５）２４時間放置した後、秤量瓶の蓋を被せ、その後に取り出して重量を精秤すると、それぞれｍ_３１、ｍ_３２、ｍ_３３である。
６）吸湿による重量増加を計算し、計算式は、重量増加パーセント＝１００％×（ｍ_３－ｍ_２）／（ｍ_２－ｍ_１）である。

結果を表６に示す。

表６

実験の結論：式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形は、吸湿による重量増加が０．０７５％であり、０．２％未満であり、吸湿性がないか又はほとんどない。

実施例６：式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形の製造

約１２０ｍｇの式（Ｉ）の化合物を秤量して８ｍＬのガラスバイアルに入れ、４ｍＬのテトラヒドロフランを添加し、超音波で完全に溶解し、サンプルをマグネチックスターラーで撹拌し（４０℃）、その後に当量のＬ－アルギニンを秤量し、１８時間撹拌した後、懸濁液を遠心分離し、固体を真空乾燥させて（１６～１８時間、３５℃）式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形を得る。

実験例１．ヒトＥＴ_Ａ受容体拮抗効果のインビトロ実験

実験目的：
蛍光検出方法によって化合物のヒトＥＴ_Ａ受容体アゴニストで誘導された細胞質Ｃａ^２＋イオンシグナルの変化に対する作用を測定することにより、化合物のＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞において内因性に発現されるヒトＥＴ_Ａ受容体における拮抗薬活性を評価する。ＥＴ_Ａ受容体拮抗効果の機能活性の試験はＥｕｒｏｆｉｎｓ－ＣｅｒｅｐＳＡで現行の標準操作手順に従って行われる。

実験プロトコル：
１．細胞を１％のＦＣＳｄで補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ培地溶液（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁させた後、５×１０^４個細胞／ウェルの密度で３８４ウェルプレート（１００μＬ／ウェル）に分配し、
２．２０ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ｐＨ７．４）で補充されたＨａｎｋ’ｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と蛍光プローブ（Ｆｌｕｏ４ＮＷ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を混合し、さらに各ウェルに入れた後、３７℃で細胞と６０分間平衡化し、さらに２２℃で細胞と１５分間平衡化し、
３．測定プレートをマイクロプレートリーダ（ＣｅｌｌＬｕｘ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に置き、被験化合物と陽性対照の適切な濃度のＤＭＳＯ溶液又はＨＢＳＳ緩衝液を添加し、５分間後に、さらに１ｎＭのエンドセリン－１又はＨＢＳＳ緩衝液（バックグラウンド対照）を添加した後、遊離細胞質基質のＣａ^２＋イオン濃度に比例する蛍光強度の変化値を測定し、
４．結果は、１ｎＭのエンドセリン－１の対照に相応するパーセントの抑制であり、
５．標準陽性対照はＢＱ－１２３であり、各実験においていくつかの濃度で測定し、Ｐｒｉｓｍでデータを分析し、濃度－応答の曲線を生成し、化合物のＩＣ_５０値を計算する。
６．実験結果を表７に示す。

実験例２．ヒトＥＴ_Ｂ受容体拮抗効果のインビトロ実験

実験目的：
蛍光検出方法によって化合物のヒトＥＴ_Ｂ受容体アゴニストで誘導された細胞質Ｃａ^２＋イオンシグナルの変化に対する作用を測定することにより、化合物のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞において発現されるヒトのＥＴ_Ｂ受容体における拮抗薬活性を評価する。ＥＴ_Ｂ受容体拮抗効果の機能活性の試験はＥｕｒｏｆｉｎｓ－ＣｅｒｅｐＳＡで現行の標準操作手順に基づいて行われる。

実験プロトコル：
１．細胞をＤＭＥＭ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁させた後、３×１０^４個細胞／ウェルの密度で３８４ウェルプレート（１００μＬ／ウェル）に分配し、
２．２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ｐＨ７．４）で補充されたＨＢＳＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と蛍光プローブ（Ｆｌｕｏ４Ｄｉｒｅｃｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を混合し、さらに各ウェルに入れた後、３７℃で細胞と６０分間平衡化し、さらに２２℃で細胞と１５分間平衡化し、
３．測定プレートをマイクロプレートリーダ（ＣｅｌｌＬｕｘ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に置き、被験化合物と陽性対照の適切な濃度のＤＭＳＯ溶液又はＨＢＳＳ緩衝液を添加し、５分間後に、さらに０．３ｎＭのエンドセリン－１又はＨＢＳＳ緩衝液（バックグラウンド対照）を添加した後、遊離細胞質基質のＣａ^２＋イオン濃度に比例する蛍光強度の変化値を測定し、
４．結果は、０．３ｎＭのエンドセリン－１の対照に相応するパーセントの抑制であり、
５．標準陽性対照はＢＱ－７８８であり、各実験においていくつかの濃度で測定し、Ｐｒｉｓｍでデータを分析し、濃度－応答の曲線を生成し、化合物のＩＣ_５０値を計算する。
注：ＢＱ－１２３は、選択性ＥＴＡエンドセリン受容体拮抗薬であり、エンドセリン受容体機能研究における生化学ツールとして用いられ、ＢＱ－７８８は、選択性ＥＴＢエンドセリン受容体拮抗薬であり、エンドセリン受容体機能研究における生化学ツールとして用いられる。

表７式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形の、ヒトＥＴ_Ａ及びＥＴ_Ｂ受容体に対するインビトロ拮抗活性並びにＥＴ_Ｂに対する選択性

注：「／」は、未測定を表す。

結論：式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形は、ヒトＥＴ_Ａ受容体に対する非常に高いインビトロ拮抗活性を示し、本発明の式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形は、ＥＴ_Ａ／ＥＴ_Ｂの選択性が２００００倍に達する。

実験例３：ヒトプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）試験

実験目的：
ＰＸＲによるＣＹＰ３Ａ発現に対する化合物の誘導作用を評価する。

実験材料と設備：

実験プロトコル：
１．無菌条件で、ＤＰＸ２細胞を解凍する。
２．ＤＰＸ２細胞液を９６ウェルプレート（１００マイクロリットル／ウェル）に分配し、プレートを５％のＣＯ_２／３７℃のインキュベータに一晩放置する。
３．３７℃の水浴で定量供給培地を解凍する。室温で陽性対照のリファンピシンを解凍する。定量供給培地において一連の被験化合物及び陽性対照の希釈液を調製する。吸引過程において細胞に影響しないように、慎重に各ウェルから培地を吸い出して捨てる。１００マイクロリットルの各濃度の被験化合物を標識しておいたウェルに転移する。陽性対照群及びブランク群の操作は同様である。プレートをインキュベータに戻して２４時間暴露させる。
４．酵素活性試験：
（１）７マイクロリットルのＬｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＩＰＡを７ミリリットルの定量供給培地に入れ、転倒混合し、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＩＰＡ試薬槽に注ぎ入れる。
（２）インキュベータから９６ウェルプレートを取り出し、慎重に培地を各ウェルから吸い出す。各ウェルに５０マイクロリットルの上記Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＩＰＡ試薬を添加し、細胞プレートをインキュベータに戻して６０分間培養する。
（３）インキュベーション期間に、Ｐ４５０－Ｇｌｏ緩衝液をＬｕｃｉｆｅｒｉｎ検出試薬に注ぎ入れ、転倒して均一に混合する。
（４）インキュベータから９６ウェルプレートを取り出し、かつ各ウェルの対応する位置が元の細胞プレートと一致するように、各ウェルから４０マイクロリットルの溶液を対応する白色の９６ウェルプレートに転移する。
（５）Ｐ４５０－Ｇｌｏ^ＴＭ溶液を複製プレートに転移した後、１０ミリリットルの細胞滴定緩衝液（ＣＴＦｂｕｆｆｅｒ）を１５ミリリットルの無菌円錐形管に転移し、さらに５マイクロリットルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｆｌｕｏｒ^ＴＭ試薬を添加し、転倒して均一に混合する。
（６）マルチチャネルピペットで、元の培養細胞の９６ウェルプレートに１００マイクロリットルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｆｌｕｏｒ^ＴＭ試薬を軽く入れ、さらに細胞プレートをインキュベータに戻して６０分間インキュベートする。
（７）複製プレートの各ウェルに４０マイクロリットルのＬｕｃｉｆｅｒｉｎ検出試薬／Ｐ４５０－Ｇｌｏ緩衝液を入れ、撹拌し、室温で２０分間インキュベートする。
（８）Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ検出試薬と２０分間インキュベートした後、光度計（読み取り時間を１～５秒にする。）で白色の９６ウェルプレートの各ウェルの発光を測定する。高いゲインの設定を使用するべきである。
（９）ＯＮＥ－Ｇｌｏ^ＴＭルシフェラーゼ検出緩衝液をＯＮＥ－Ｇｌｏ^ＴＭ検出試薬に入れ、転倒して均一に混合する。
（１０）３７度で６０分間インキュベートした後、インキュベータから元の９６ウェルプレートを取り出し、マイクロプレートリーダを蛍光モードに設定し、励起波長を３８０～４００ｎｍ、発光波長を５０５ｎｍに設定し、各ウェルの蛍光強度を測定する。
（１１）マイクロプレートリーダから細胞プレートを取り出し、各ウェルに１００マイクロリットルのＯＮＥ－Ｇｌｏ^ＴＭ検出試薬を入れる。プレートを振盪で均一に混合し、室温で５分間インキュベートする。
（１２）マイクロプレートリーダを５秒予備振盪及び５秒ウェル読み取りに設定し、各ウェルの蛍光強度を測定する。高い機器ゲイン（感度）の設定を使用すべきである。
５．ＰＸＲに対する薬物の活性化効果は、誘導倍率（ｆｏｌｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）で反映され、すなわち、各群の誘導倍率＝薬物処理群のルシフェラーゼ活性値／溶媒対照群のルシフェラーゼ活性値であり、それに基づいてそのＣＹＰ３Ａ４に対する誘導効果を予測する。
陽性対照は、リファンピシンであり、各実験において６つの濃度で測定し、Ｐｒｉｓｍをでデータを分析し、濃度－応答の曲線を生成し、化合物のＥＣ_５０値を計算する。

実験結果：
測定結果を表８に示す。
表８ＰＸＲによるＣＹＰ３Ａ発現に対する本発明の化合物の誘導作用の結果

^＊フィッティング曲線の計算誤差

結論：
本発明の式（Ｉ）の化合物はＰＸＲによるＣＹＰ３Ａ発現に対する誘導作用が弱く、化合物マシテンタンはＰＸＲによるＣＹＰ３Ａ発現に対する誘導作用が強い。したがって、ＰＸＲによるＣＹＰ３Ａ発現に対する誘導作用の特性評価実験において、式（Ｉ）の化合物はマシテンタンより優れている。

実験例４：ヒト肝ミクロソームシトクロムＰ４５０のアイソザイム阻害試験

実験目的：
研究項目の目的は、ＣＹＰアイソザイムの５イン１プローブ基質で被験品のヒト肝ミクロソームシトクロムＰ４５０アイソザイム（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ４）に対する阻害活性を評価することである。

実験プロトコル：
混合ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）はＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．（Ｓｔｅｕｂｅｎ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＵＳＡ）から購入され、使用前にいずれも－８０℃未満の条件で保存される。希釈された一連の濃度の供試品の作動液をヒト肝ミクロソーム、プローブ基質及び循環系の補助因子を含有するインキュベーション系に入れ、被験品を含有せずに溶媒を含有する対照を酵素活性対照（１００％）とする。プローブ基質で生成された代謝産物のサンプル中の濃度を液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）方法で測定する。ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（Ｖ．１１）を用いて供試品の平均パーセント活性を濃度に対して非線形回帰分析を行う。３パラメータ又は４パラメータ逆曲対数方程式によりＩＣ５０値を計算する。

実験結果：
測定結果を表９に示す。
表９ヒト肝ミクロソームシトクロムＰ４５０のアイソザイムに対する本発明の化合物の阻害の結果

結論：
本発明の式（Ｉ）の化合物は、ＣＹＰの５つの主なアイソザイムのいずれに対する阻害作用が非常に弱く、マシテンタンは、ＣＹＰの４つの主なアイソザイムに対する阻害作用が弱いが、アイソザイムＣＹＰ２Ｃ９に対する阻害作用が中等である。したがって、ヒト肝ミクロソームセルリンＰ４５０の５種の主なアイソザイムに対する阻害作用の特性評価実験において、式（Ｉ）の化合物はマシテンタンより優れている。

実験例５：胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）に対する化合物の阻害作用試験

実験目的：
本実験は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで胆汁酸トランスポーター（ＢＳＥＰ）の基質であるタウロコール酸ＴＣＡに対する吸収能力を検出する方法により、被験化合物の胆汁酸トランスポーターの輸送過程において阻害作用を有するか否かを評価する。

実験材料：

溶液の調製：
１．緩衝液Ａ：
５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１００ｍＭＫＮＯ_３、１０ｍＭＭｇ（ＮＯ３）_２、５０ｍＭショ糖。
２．緩衝液Ｂ：
１０ｍＭＴＲＩＳｐＨ７．４、１００ｍＭＫＮＯ３、１０ｍＭＭｇ（ＮＯ３）２、５０ｍＭショ糖。
３．ＡＴＰ緩衝液：
緩衝液Ａで調製し、１２ミリリットルの緩衝液Ａに８．１６ｍＭのＡＴＰ、４．０８μＭのタウロコール酸を含有させる。
４．ＡＭＰ緩衝液：
緩衝液Ａで調製し、１２ミリリットルの緩衝液Ａに８．１６ｍＭのＡＭＰ、４．０８μＭのタウロコール酸を含有させる。
５．ＢＳＥＰ－Ｈｉ５－ＶＴＶｅｓｉｃｌｅ溶液：
緩衝液ＡでＢＳＥＰ－Ｈｉ５－ＶＴを５μｇ／μＬ含有する溶液を調製する。

サンプルの準備：
１．化合物をＤＭＳＯで１００ｍＭに希釈し、その後に３倍連続希釈で１１つの濃度にし、最低濃度が０．１６９μＭである。
２．陽性参照は、Ｇｌｙｂｕｒｉｄｅ（グリベンクラミド）の２０ｍＭのＤＭＳＯ溶液で、その後に２倍連続希釈でで１１つの濃度にし、最低濃度が１９．５μＭである。

実験プロトコル：
１．ＥＣＨＯで、それぞれ０．３マイクロリットルの化合物のＤＭＳＯ溶液又は希釈されたＤＭＳＯを化合物プレートの対応するウェルに転移する。
２．それぞれ１４．７マイクロリットルのＡＴＰ緩衝液を化合物と０％効果（ＺＰＥ）に対応するウェルに入れる。
３．それぞれ１４．７マイクロリットルのＡＭＰ緩衝液を１００％効果（ＨＰＥ）に対応するウェルに入れる。
４．２５℃の条件で、プレートを１０分間振盪する。
５．それぞれ全てのウェルに１５マイクロリットルのＢＳＥＰ－Ｈｉ５－ＶＴＶｅｓｉｃｌｅ溶液を入れ、２５℃の条件でさらにプレートを４０分間振盪する。
６．直ちに全てのウェルに５マイクロリットルの０．５Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液を入れ、さらに６５マイクロリットルの緩衝液Ｂを入れ、全ての反応が終了する。
７．機器で反応終了後の化合物プレートから９５マイクロリットルの液体を濾過プレートに転移する。
８．濾過プレートの下に液体受け取りプレートを放置した後、遠心分離機で液体を除去し、受け取りプレートの液体を捨てる。
９．濾過プレートに９０マイクロリットルの緩衝液Ｂを添加し、濾過プレートの下に液体受け取りプレートを放置した後、遠心分離機え液体を除去し、受け取りプレートの液体を捨てて、濾過プレートを計３回洗浄する。
１０．濾過プレートを一晩自然乾燥する。
１１．翌日に、８０マイクロリットルのメタノール／水（８０／２０、体積比）溶液を濾過プレートに入れる。
１２．濾過プレートに膜を貼り付けた後にプレートを１５分間振盪する。
１３．濾過プレートの下に新しい液体受け取りプレートを放置し、５分間遠心分離し、濾過プレートにおける全ての液体を受け取りプレートに移す。
１４．液体受け取りプレートの各ウェルに１５マイクロリットルの内標準溶液を入れ、封止膜でプレートを封止する。
１５．ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで受け取りプレートにおけるタウロコール酸の含有量を検出する。

各実験においていくつかの濃度で測定し、Ｐｒｉｓｍでデータを分析し、濃度－応答の曲線を生成し、化合物のＩＣ_５０値を計算する。

実験結果：
試験結果を表１０に示す。
表１０胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）に対する本発明の化合物の阻害作用の結果

結論：
本発明の式（Ｉ）の化合物は、胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）に対する阻害作用が極めて弱いが、マシテンタンは、それに対する阻害作用が強い。したがって、胆汁酸塩排出ポンプに対する式（Ｉ）の化合物の阻害作用は、マシテンタンよりはるかに弱いため、肝毒性が生じるリスクを顕著に低下させる。
実験例６：化合物のラットにおける薬物動態学の評価

実験目的：
本研究は、被験動物としてＳＤ雄性ラットを選択し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法でラットに被験化合物を静脈注射又は経口胃内投与した異なる時点の血漿における薬物濃度を定量測定することにより、ラットインビボにおける被験化合物の薬物動態学的特徴を評価する。

実験材料：
ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（雄性、２００～３００ｇ、７～１０週齢、北京維通利華又は上海ＳＬＡＣ）。

実験操作：
被験化合物の清澄溶液を尾静脈からＳＤラットインビボ（一晩断食）に注射するか、又はＳＤラット（一晩断食）に経口胃内投与する。静脈注射による投与は、０時間（投与前）及び投与後０．０８３３、０．２５、０．５、１、２、４、６、８及び２４時間に頸静脈穿刺により２００μＬの血液を採取し、ＥＤＴＡ－Ｋ２を入れた抗凝血管（江蘇康健医療用品有限公司）に置き、４℃で、この抗凝血管中の混合物を十分にボルテックスで混合した後、１３０００回転／分で１０分間遠心分離して血漿を取る。経口胃内投与は、０時間（投与前）及び投与後０．５、１、２、４、６、８及び２４時間に頸静脈穿刺により２００μＬの血液を採取し、ＥＤＴＡ－Ｋ２を入れた抗凝血管（江蘇康健医療用品有限公司）に置き、この抗凝血管中の混合物を十分にボルテックスで混合した後、１３０００回転／分で１０分間遠心分離して血漿を取る。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法で血中薬濃度を測定し、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｖｅｒｓｉｏｎ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、ＣＡ）薬物動態学ソフトウェアを用いて、非コンパートメントモデルの対数線形台形法で関連薬物動態学的パラメータを計算する。

実験結果：
測定結果を表１１に示す。
表１１ラットにおける本発明の化合物の薬物動態学的パラメータ

結論：
本発明の式（Ｉ）の化合物は、ラットインビボにおける血漿クリアランスが低く（＜５ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇ）、経口胃内投与の生物学的利用能が高い（＞７０％）。

実験例７：化合物のビーグル犬における薬物動態学の評価

実験の目的：
本研究は、被験動物として雄性ビーグル犬を選択し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法でビーグル犬に被験化合物を静脈注射又は経口胃内投与した異なる時点の血漿における薬物濃度を定量測定することにより、ビーグル犬インビボにおける被験化合物の薬物動態学的特徴を評価する。

実験材料：
ビーグル犬（雄性、６～１５ｋｇ、６ヶ月以上、北京マーシャルバイオサイエンス有限会社）。

実験操作：
被験化合物の清澄溶液をビーグル犬インビボ（一晩断食）に静脈注射するか、又はビーグル犬（一晩断食）に経口胃内投与する。静脈注射による投与は、０時間（投与前）及び投与後の０．０８３３、０．２５、０．５、１、２、４、６、８及び２４時間に末梢血管から約５００μＬの血液を採取し、ＥＤＴＡ－Ｋ２を入れたた抗凝血管（江蘇康健医療用品有限公司）に置く。経口胃内投与は、０時間（投与前）及び投与後の０．２５、０．５、１、２、４、６、８及び２４時間に末梢血管から約５００μＬの血液を採取し、ＥＤＴＡ－Ｋ２を入れた抗凝血管に置く。４℃で、抗凝血管中の混合物を十分にボルテックスで混合した後、１３０００回転／分で１０分間遠心分離して血漿を取る。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法で血中薬濃度を測定し、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｖｅｒｓｉｏｎ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、ＣＡ）薬物動態学ソフトウェアを用いて、非コンパートメントモデルの対数線形台形法で関連薬物動態学的パラメータを計算する。

実験結果：
測定結果を表１２に示す。
表１２ビーグル犬における本発明の化合物の薬物動態学的パラメータ

結論：
本発明の式（Ｉ）の化合物は、ビーグル犬インビボにおける血漿クリアランスが低く（＜５ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇ）、経口胃内投与の生物学的利用能が高い（＞５０％）。

実験例８：化合物のインビボ薬力学評価

実験の目的
本試験は、モノクロタリン（ＭＣＴ）で誘導されたＳＤラットの肺動脈高血圧動物モデルを用いて、被験化合物のラットの肺動脈高血圧モデルに対する薬効作用を考察する。

実験材料：
実験動物
種属：ラット
品種：Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ
動物室に到着した時の週齢：５週間
性別：雄性
実験開始時の動物体重：２００～２６０ｇ
数：８８匹（８１匹を薬力学（ＰＤ）及び薬物動態学（ＰＫ）試験に用い、７匹をＰＫ－ブランク基質の収集に用いる）
サプライヤー：上海ＳＬＡＣ実験動物有限公司
動物の合格証番号：２０１７０００５００８６９５
他の試薬の情報
表１３．試薬情報テープル

重要な試薬及び化合物溶液の調製：
２０ｍｇ／ｍＬのＭＣＴ溶液：適量のＭＣＴを秤量して適切な体積の瓶に入れ、まず少量の１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌでＭＣＴを十分に溶解し、次に１０ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨでｐＨを７～７．５に調節し、最終に総体積になるまで生理食塩水を添加する。

溶媒：２０％ＰＥＧ４００＋０．５％トゥイーン８０を脱イオン水に溶解し、ｐＨ＝９±０．１に調節する。

３ｍｇ／ｍＬのマシテンタン、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬの式（Ｉ）の化合物の溶液：適量の化合物を秤量して適切な体積の瓶に入れ、総体積の２０％のＰＥＧ４００を添加し、４０℃で加熱撹拌し、総体積の０．５％のトゥイーン８０を添加し、４０℃で加熱撹拌し、脱イオン水の体積の７０～７５％を添加し、４０℃で加熱撹拌し、溶液が清澄になるまで５ＮのＮａＯＨでｐＨを調節し、その後に６ＮのＨＣＬ及び１ＮのＨＣＬでｐＨを９より小さくなるまで調節し、総体積になるまで脱イオン水で残りの体積補足し、最終的なｐＨ値（９±０．１）を測定する。

３０ｍｇ／ｍＬのペントバルビタールナトリウム溶液：適切な体積のペントバルビタールナトリウム原液を秤量して適切な体積の瓶に入れ、生理食塩水を添加して最終濃度に希釈する。

機器情報：
表１４．機器情報テープル

動物の群分け
動物を約１週間適応させた後、表１５に示すように、体重及び動物状態に基づいて動物を９組にランダムに分ける。

表１５．実験動物の群分け及び投与方式

注：Ｍａｃは、マシテンタンである。

モニタリング指標
ＰＤ試験モニタリング指標
１）毎日、動物の一般的な状態及び体重をモニタリングし、
２）右心室機能の検出：右心室駆出率（ＲＶＥＦ）、右心室壁厚（ＲＶＷＴ）、
３）血行動態モニタリング：右心室収縮圧（ＲＶＳＰ）、
４）右室肥大指数（ＲＶＨＩ）を測定する：ＲＶ／（ＬＶ＋ＳＥＰ）、
５）エンドポイント測定、４－ＨＥ染色によるＰＡＷＴの観察／ＩＨＣ染色によるＰＣＮＡの観察

ＰＫ試験モニタリング指標
１）毎日、動物の一般的な状態及び体重をモニタリングし、
２）血漿：化合物の血漿における薬物動態学的パラメータを検出する。

試験方法
ＲＶＥＦ、ＲＶＷＴをＢモード超音波で検出する
３０ｍｇ／ｍＬのペントバルビタールナトリウム（２ｍＬ／ｋｇ、ｉｐ）でラットを麻酔し、小型動物超音波機器（ＶＥＶＯ－１１００）でＲＶＥＦ、ＲＶＷＴを検出する。

ラットＲＶＳＰを右心カテーテル法で測定する
３０ｍｇ／ｍＬのペントバルビタールナトリウム（２ｍＬ／ｋｇ、ｉｐ）でラットを麻酔し、動物を仰臥位で手術台に固定し、頸部の皮毛を除去し、頸部の皮膚を切開し、皮下組織及び筋層を鈍的剥離し、左頸動脈及び右頸静脈を剥離する。圧力トランスデューサーに接続され、０．３％のヘパリンナトリウム溶液で満たされたラット専用右心カテーテル（外径が約１．５ｍｍで、先端が小円弧状であるＰＥカテーテル）を右頸外静脈に挿入する。操作中に、肺動脈カテーテルの弧を下方に保持し、かつ肺動脈カテーテルを右心房の方向に延伸し、圧力波形に基づいて心臓部位に到達するか否かを判定し、カニューレを左回転し、前に右心室に推進する。

ＲＶＨＩの測定
心臓を取り出し、心房及び大血管を除去し、濾紙で水分を吸収し、右心室を剥離し、秤量し、ＲＶＨＩ＝ＲＶ／（ＬＶ＋ＳＥＰ）に基づいて計算する。

エンドポイント測定、４－ＨＥ染色によるＰＡＷＴの観察／ＩＨＣ染色によるＰＣＮＡの観察
ラットを安楽死させた後、右肺中葉を生理食塩水で灌流した後に、病理学的検出のために４％のパラホルムアルデヒドに入れて固定する。

血液の採取及び血漿の製造
エンドポイントの当日投与前後に血液サンプルを採取し、採取時点を０、０．２５、０．５、１、２、４、６、８ｈとし、ラットを固定器に入れ、尾静脈から２５０μＬの血液を採取し、抗凝血剤（５～８μＬの１５％ＥＤＴＡ）を入れたＥＰカテーテルに転移し、転倒して均一に振盪した後に直ちに湿氷に入れて一時的に保存し、採取した血液サンプルを遠心分離機に入れ、遠心分離条件は４℃、３０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎであり、遠心分離が終了した後に血漿を収集して直ちにドライアイスに入れ、全てのサンプルの採取が終了した後に－８０℃に転移して凍結保存し、薬物動態学分析に備える。

統計分析：
全てのデータをＥｘｃｅｌドキュメントに入力し、平均値（Ｍｅａｎ）±標準誤差（ＳＥＭ）の方式で示す。実験データ統計は、一元配置分散分析方法（ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）とＤｕｎｎｅｔｔ’ｓｔｔｅｓｔを用いて各群のデータを分析し比較する。二つずつの比較は対応のない両側ｔ検定方法で差異性を比較する。統計分析の結果、Ｐ＜０．０５で、有意差は認められる。

試験結果：
表１６．肺動脈高血圧ラットに対する被験化合物の薬効（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝１２）

^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＶｅｈｉｃｌｅｖｓＳｈａｍ、ｔ－ｔｅｓｔ；^＃Ｐ＜０．０５、^＃＃Ｐ＜０．０１、^＃＃＃Ｐ＜０．００１各治療群ｖｓＶｅｈｉｃｌｅ、ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ。体重変化率（％）は、正値が体重増加のパーセント、負値が体重減少のパーセントである。Ｍａｃは、マシテンタンである。

式（Ｉ）の化合物及びマシテンタンの薬効に伴う薬物動態学的研究：
２１日目の投与前後に血液サンプルを採取し、採取時点を０、０．２５、０．５、１、２、４、６、８ｈとし、式（Ｉ）の化合物及びマシテンタン（Ｍａｃｉｔｅｎｔａｎ）の血漿における薬物濃度を分析する。結果によると、式（Ｉ）の化合物は、１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの投与量で胃内投与した後の血漿における薬物曲線下面積（ＡＵＣ_{０－ｉｎｆ}）がそれぞれ１４１０、５２３０ｎｇ／ｍＬ・ｈであり、良好な投与量関連性を示す。

表１７．式（Ｉ）の化合物及びマシテンタンのＭＣＴで誘導されたラットの肺動脈高血圧モデルにおける薬効に伴う薬物動態学的パラメータ（ｎ＝３）

結論：
研究結果によると、肺動脈高血圧モデルにおいて、式（Ｉ）の化合物は、肺動脈高血圧及び右心室機能の各指標のいずれに対して顕著な改善作用を有する。１、３、１０ｍｇ／ｋｇの３つの投与量で、いずれも右心室収縮圧を顕著に低下させ、右心室機能を改善し、肺動脈平滑筋の増殖を抑制することができる。式（Ｉ）の化合物は１ｍｇ／ｋｇで効果を果たすことができ、低投与量でマシテンタンの３０ｍｇ／ｋｇの投与量の薬効作用に相当する。

Claims

Ｘ線粉末回折パターンは、２θ角が１２．６２±０．２０°、１６．８６±０．２０°、１９．３３±０．２０°、２５．３８±０．２０°の位置に特徴的な回折ピークを有することを特徴とする、式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形。
Ｘ線粉末回折パターンは、２θ角が８．４２±０．２０°、１０．３１±０．２０°、１２．６２±０．２０°、１６．８６±０．２０°、１８．２８±０．２０°、１９．３３±０．２°、２１．８７±０．２０°、２５．３８±０．２０°、２７．１４±０．２０°の位置に特徴的な回折ピークを有する、請求項１に記載のＡ結晶形。
Ｘ線粉末回折パターンは、２θ角が８．４２°、９．４１°、９．５８°、９．８２°、１０．３１°、１２．６２°、１５．７７°、１６．６２°、１６．８６°、１７．５１°、１７．９７°、１８．２８°、１８．８５°、１９．３３°、１９．５８°、２０．３３°、２１．８７°、２２．５８°、２２．９３°、２３．１５°、２３．３９°、２５．０５°、２５．３８°、２６．３１°、２６．６３°、２７．１４°、２７．７９°、２９．４０°、３１．０１°、３１．４８°、３５．４２°、３９．２１°の位置に特徴的な回折ピークを有する、請求項２に記載のＡ結晶形。
ＸＲＰＤパターンは、図１に示すとおりである、請求項２に記載のＡ結晶形。
示差走査熱量曲線は、１６１．３±３．０℃に吸熱ピークの開始点を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のＡ結晶形。
ＤＳＣパターンは、図２に示すとおりである、請求項５に記載のＡ結晶形。
熱重量分析曲線における１５２．３±３．０℃での減量が０．０１％に達する、請求項１～４のいずれか１項に記載のＡ結晶形。
ＴＧＡパターンは、図３に示すとおりである、請求項７に記載のＡ結晶形。
Ｘ線粉末回折パターンは、２θ角が７．５１±０．２０°、９．６０±０．２０°、２２．５６±０．２０°の位置に特徴的な回折ピークを有することを特徴とする、式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形。
Ｘ線粉末回折パターンは、２θ角が７．５１±０．２０°、９．６０±０．２０°、１５．０５±０．２０°、１９．０９±０．２０°、２２．５６±０．２０°、２４．１８±０．２０°、２４．７９±０．２０°、２７．９５±０．２０°の位置に特徴的な回折ピークを有する、請求項９に記載のＢ結晶形。
Ｘ線粉末回折パターンは、２θ角が７．５１°、９．６０°、１１．０８°、１５．０５°、１５．５２°、１７．５３°、１８．３４°、１９．０９°、２０．４１°、２０．８５°、２２．２０°、２２．５６°、２３．１５°、２４．１８°、２４．７９°、２７．６９°、２７．９５°、２８．７５°、３３．５７°、３５．４２°の位置に特徴的な回折ピークを有する、請求項１０に記載のＢ結晶形。
ＸＲＰＤパターンは、図４に示すとおりである、請求項１１に記載のＢ結晶形。
示差走査熱量曲線は、１５０．３±３．０℃に吸熱ピークの開始点を有する、請求項９～１２のいずれか１項に記載のＢ結晶形。
ＤＳＣパターンは、図５に示すとおりである、請求項１３に記載のＢ結晶形。
熱重量分析曲線における、９０．０±３．０℃での減量が０．５３％に達し、１４３．９±３．０℃での減量が０．６０に達する、請求項９～１２のいずれか１項に記載のＢ結晶形。
ＴＧＡパターンは、図６に示すとおりである、請求項１５に記載のＢ結晶形。
（１）式（Ｉ）で表される化合物を溶媒に添加し加熱して溶解するステップと、
（２）上記溶液を固体が析出するまで降温し、撹拌し、濾過して、式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形を得るステップとを含む、式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形の製造方法。
前記溶媒は、テトラヒドロフラン及びアセトニトリルから選択される、請求項１７に記載の製造方法。
撹拌温度は、１０℃～６０℃である、請求項１７に記載の製造方法。
撹拌時間は、１２時間～２４時間である、請求項１７に記載の製造方法。
化合物と溶媒との重量－体積比は、１ｇ：１～６ｍＬである、請求項１７に記載の製造方法。
（１）式（Ｉ）で表される化合物を溶媒に添加し完全に溶解するステップと、
（２）アミノ酸を添加し、４０℃で１２～２４時間撹拌し、濾過して、式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形を得るステップとを含み、
前記溶媒は、テトラヒドロフランから選択され、
前記アミノ酸は、Ｌ－アルギニンから選択される、式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形の製造方法。
ＥＴ_Ａ受容体拮抗薬関連疾患を治療する薬物の製造における請求項１～１６のいずれか１項に記載の結晶形の応用。
前記ＥＴ_Ａ受容体拮抗薬に関連する薬物は、肺動脈高血圧、原発性高血圧、難治性高血圧、糖尿病性腎症及び頭蓋内血管攣縮などの適応症に用いられる薬物であることを特徴とする、請求項２３に記載の応用。