CN115947720B - β3肾上腺素能受体锚定型探针的设计及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了β3肾上腺素能受体锚定型探针的设计及其制备方法与应用，首先基于含喹啉基团的化合物制得中间产物S7，接着以9H‑咔唑‑4‑醇为原料制得中间产物S10，最后将中间产物S7与中间产物S10二者共价偶联得到目标产物β‑肾上腺素能受体β3‑ARP锚定型荧光探针，便于在活细胞水平实时追踪Β3‑AR受体状态，同时本锚定型荧光探针在转染β3‑AR受体蛋白的HEK293细胞中荧光显著下降，表明荧光探针β3‑ARP可实现对β3‑AR的特异性靶向，该探针将适用于在活细胞中成像β3‑AR，利用探针建立筛选平台，有望快速筛选β3‑AR受体相关化学调控剂。
Description
技术领域
本发明属于化学生物技术领域，具体涉及β3肾上腺素能受体锚定型探针的设计及其制备方法与应用。
背景技术
β-肾上腺素能受体(β-ARs)，包括三种亚型(β1、β2、β3)，是GPCR家族的重要成员，调节许多重要的生理功能。通过抑制内源性儿茶酚胺，β1-AR的拮抗作用可以降低心肌需求和工作量，这有利于治疗心力衰竭和心绞痛。β2-AR的激动作用可以减少平滑肌收缩，从而缓解阻塞性呼吸系统疾病(如哮喘和慢性阻塞性肺病)的症状。Β3-AR介导脂肪组织中的代谢效应，如脂肪分解和产热。
大多数探针是通过将β-AR配体连接到“常亮”荧光团而产生的，但由于探针分子的扩散效应，很难在活细胞中长时程追踪受体蛋白的状态。此外，由于缺少荧光开关，荧光团的信噪比不足，它们的激发和发射光谱与当前的生物发光系统不兼容，限制了它们在基于BRET的研究和药物筛选中的应用。
因此亟需一种能够在活细胞里长时间追踪受体蛋白的探针，为此本发明提出一种β3肾上腺素能受体锚定型化学探针及其制备方法与应用，本探针结构中的Linker与受体蛋白中邻近的亲和性氨基酸进行亲和共价连接，最终形成共价标记于受体蛋白上，从而实现对活细胞中受体蛋白的实时追踪。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了β3肾上腺素能受体锚定型探针的设计及其制备方法与应用，首先基于含喹啉基团的化合物制得中间产物S7，接着以9H-咔唑-4-醇为原料制得中间产物S10，最后将中间产物S7与中间产物S10二者共价偶联得到目标产物β-肾上腺素能受体β3-ARP锚定型荧光探针，便于在活细胞水平实时追踪Β3-AR受体状态，同时本锚定型荧光探针在转染β3-AR受体蛋白的HEK293细胞中荧光显著下降，表明荧光探针β3-ARP可实现对β3-AR的特异性靶向，该探针将适用于在活细胞中成像β3-AR，利用探针建立筛选平台，有望快速筛选β3-AR受体相关化学调控剂。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种β3肾上腺素能受体锚定型探针，β3肾上腺素能受体锚定型探针的结构式为：
上述β3肾上腺素能受体锚定型探针的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：首先基于含喹啉基团的化合物制得中间产物S7，接着以9H-咔唑-4-醇为原料制得中间产物S10，最后将中间产物S7与中间产物S10二者共价偶联得到目标产物；
其中：中间产物S7为2-(2-(6-(氮杂环丁烷-1-基)喹啉-2-甲酰胺基)乙氧基)乙基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯，中间产物S10为1-((2-(1H-咪唑-4-基)乙基)氨基)-3-((9H-咔唑-4-基)氧基)丙-2-醇。
作为本发明的一种改进，所述中间产物S7与中间产物S10的摩尔比为1:1。
作为本发明的一种改进，所述中间产物S7的具体制备步骤如下：
(1)将二氧化硒加入6-溴-2-甲基喹啉的吡啶溶液中，经高温加热反应过夜后，旋干溶剂，将所得混合物先用水洗除去，残留吡啶，再用甲醇洗，洗去杂质，烘干得到6-溴喹啉-2-羧酸；
(2)在冰浴条件下，将步骤(1)得到的6-溴喹啉-2-羧酸溶解于有机溶剂中，再往其中滴加氯化亚砜，混合物回流过夜，将反应后冷却至室温的悬浮液倒入饱和碳酸氢钠水溶液中，将所得混合物用有机溶剂萃取，萃取后的有机萃取液用无水硫酸钠干燥并过滤，然后真空蒸发除去溶剂，得到6-溴喹啉-2-羧酸甲酯；
(3)在氩气下，将步骤(2)得到的6-溴喹啉-2-羧酸甲酯与碳酸铯、醋酸钯和BINAP混合，将混合物在高温下搅拌过夜，反应后冷却至室温，用乙酸乙酯和水萃取反应混合物，合并有机萃取液，将有机萃取液用无水硫酸钠干燥并过滤，然后真空蒸发除去溶剂，得到6-(杂氮环丁烷)喹啉-2-羧酸甲酯；
(4)将步骤(3)得到的6-(杂氮环丁烷)喹啉-2-羧酸甲酯溶于甲醇中，加入NaOH溶液处理，与高温下搅拌24小时后蒸发挥发物，随后向水相中滴加盐酸，酸化调节pH，随后过滤出沉淀物，用水洗涤干燥后得到6-(氮杂环丁烷-1-基)喹啉-2-羧酸；
(5)将步骤(4)得到的6-(氮杂环丁烷-1-基)喹啉-2-羧酸溶于无水甲醇,加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇和4-(4,6-二甲氧基[1.3.5]三嗪-2-基)-4-加入氯化甲基吗啉水合物，并在室温下搅拌48小时，将所得混合物用有机溶剂萃取，萃取后的有机萃取液用无水硫酸钠干燥并过滤，然后经真空蒸发除去溶剂，所得残留物通过柱色谱纯化后得到6-(氮杂环丁烷-1-基)-N-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)喹啉-2-甲酰胺；
(6)将步骤(5)得到的6-(氮杂环丁烷-1-基)-N-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)喹啉-2-甲酰胺溶于无水乙腈和碳酸二琥珀酰亚胺酯中，然后滴加三乙胺3分钟后反应混合物变清澈，在室温下搅拌16小时后将粗反应物旋干，然后溶解在饱和NaHCO3中，将所得混合物用有机溶剂萃取，萃取后的有机萃取液用无水硫酸钠干燥并过滤，然后真空蒸发除去溶剂，所得残留物通过柱色谱纯化得到2-(2-(6-(氮杂环丁烷-1-基)喹啉-2-甲酰胺基)乙氧基)乙基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯。
优选地，所述步骤(1)中6-溴-2-甲基喹啉与二氧化硒的反应摩尔比为0.45：1，反应温度为100～105℃；所述步骤(2)中6-溴喹啉-2-羧酸与氯化亚砜的反应摩尔比为5：6；所述步骤(3)中每mmol 6-溴喹啉-2-羧酸甲酯，加入144mg Cs2CO3、8mg Pd(OAc)2和24mgBINAP与6-溴喹啉-2-羧酸甲酯进行反应；所述步骤(4)中6-(杂氮环丁烷)喹啉-2-羧酸甲酯与NaOH的反应摩尔比为1：10；所述步骤(5)中6-(氮杂环丁烷-1-基)喹啉-2-羧酸和2-(2-氨基乙氧基)乙醇和4-(4,6-二甲氧基[1.3.5]三嗪-2-基)-4-氯化甲基吗啉水合物的反应摩尔比为1：1：1；所述步骤(6)中6-(氮杂环丁烷-1-基)-N-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)喹啉-2-甲酰胺和碳酸二琥珀酰亚胺酯和三乙胺的反应摩尔比为1：1.5：3。
作为本发明的一种改进，所述中间产物S10的具体制备步骤如下：
(1)向9H-咔唑-4-醇和(2S)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯中加入丁-2-酮溶液和碳酸钾，将混合物在回流下搅拌18小时，然后在减压下除去溶剂，随后将残留物再溶于二氯甲烷中，并用氢氧化钠水溶液、水和饱和盐水洗涤溶液，有机层用无水硫酸钠干燥并蒸发旋干得到4-(环氧乙烷-2-基甲氧基)-9H-咔唑；
(2)将步骤(1)得到的4-(环氧乙烷-2-基甲氧基)-9H-咔唑溶于无水四氢呋喃中，组胺溶于无水甲醇中，将二者混合，随后将混合液在60℃下加热搅拌反应20小时，所得混合物用CH2Cl2萃取后合并有机萃取物，用无水Na2SO4干燥并过滤，然后真空蒸发除去溶剂，所得残留物通过柱色谱纯化，得到1-((2-(1H-咪唑-4-基)乙基)氨基)-3-((9H-咔唑-4-基)氧基)丙-2-醇。
优选地，所述步骤(1)中9H-咔唑-4-醇和(2S)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯和碳酸钾的反应摩尔比为1：1：1.1；所述步骤(2)中4-(环氧乙烷-2-基甲氧基)-9H-咔唑(1.00mmol)和组胺(1.00mmol)的反应摩尔比为1：1。
作为本发明的一种改进，所述目标产物的制备步骤如下：将中间产物S7与中间产物S10溶解在无水DMF中，加入一滴无水吡啶并在室温下反应4小时，随后合并有机提取物，用无水Na2SO4干燥并过滤，然后通过真空蒸发除去溶剂，所得残留物通过柱色谱纯化，得到最终产物。
β3肾上腺素能受体锚定型探针的制备方法总反应式如下所示：
本发明还提供了β3肾上腺素能受体锚定型探针在β3肾上腺素能受体(β3-AR)的锚定型化学标记中的应用，在稳定转染β1-AR、β2-AR和β3-AR的HEK293细胞中，当加入相应抑制剂后，在转染β3-AR受体蛋白的HEK293细胞中荧光显著下降，表明荧光探针β3-ARP可实现对β3-AR的特异性靶向，该探针将适用于在活细胞中成像β3-AR，利用探针建立筛选平台，有望快速筛选β3-AR受体相关化学调控剂。
本发明的有益效果为：
1.本发明β3-ARP选择性高，只对β3-AR响应，对其它β1-AR、β2-AR、金属离子、和相关氨基酸均无响应。
2.本发明β3-ARP对β3-AR具有高的敏感性。
3.在稳定转染β1-AR、β2-AR和β3-AR的HEK293细胞中有荧光，当加入相应抑制剂后，β3-AR的HEK293细胞发生荧光猝灭现象。可实现对β3-AR的特异性靶向。在转染β-ARs的活细胞中，还通过共焦显微镜研究了配体β3-ARP的共定位成像。荧光工具非常方便地在活细胞水平实时跟踪β3-AR。
附图说明
图1为β3-ARP的激发、发射光谱图。
图2为本发明β3-ARP对不同金属离子和不同氨基酸的稳定性示意图。
图3为本发明β3-ARP对pH在4-10之间的荧光强度变化示意图。
图4为本发明β3-ARP的HEK293细胞中的存活率示意图，表示β3-ARP的细胞毒性，从左到右分别为β3-ARP在分别转染肾上腺素受体β1、β2、β3的HEK293细胞中的存活率示意图。
图5为本发明β3-ARP在转染不同受体的HEK293细胞与不同浓度的受体拮抗剂反应后的流式细胞仪检测流式分析研究示意图。
图6为本发明荧光探针β3-ARP在稳定转染了三种β-AR亚型的HEK293细胞与不同受体拮抗剂反应后的不同荧光成像研究示意图。
图7为本发明β3-ARP在不同细胞器中的定位成像研究示意图。
图8为实施例1制得的S2的1HNMR谱图。
图9为实施例1制得的S2的13CNMR谱图。
图10为实施例1制得的S2的质谱图(HR-MS)。
图11为实施例1制得的S3的1H NMR谱图。
图12为实施例1制得的S3的13CNMR谱图。
图13为实施例1制得的S4的1H NMR谱图。
图14为实施例1制得的S4的1H NMR谱图。
图15为实施例1制得的S4的13CNMR谱图
图16为实施例1制得的S4的质谱图(HR-MS)。
图17为实施例1制得的S5的1H NMR谱图。
图18为实施例1制得的S5的13CNMR谱图。
图19为实施例1制得的S5的质谱图(HR-MS)。
图20为实施例1制得的S6的1H NMR谱图。
图21为实施例1制得的S6的13CNMR谱图。
图22为实施例1制得的S6的质谱图(HR-MS)。
图23为实施例1制得的S7的1H NMR谱图。
图24为实施例1制得的S7的13CNMR谱图。
图25为实施例1制得的S7的质谱图(HR-MS)。
图26为实施例1制得的S9的1H NMR谱图。
图27为实施例1制得的S9的13CNMR谱图。
图28为实施例1制得的S9的质谱图(HR-MS)。
图29为实施例1制得的S10的1H NMR谱图。
图30为实施例1制得的S10的13CNMR谱图。
图31为实施例1制得的S10的质谱图(HR-MS)。
图32为实施例1制得的β3-ARP的1H NMR谱图。
图33为实施例1制得的β3-ARP的13CNMR谱图。
图34为实施例1制得的β3-ARP的质谱图(HR-MS)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
β3肾上腺素能受体锚定型探针的制备：
(1)向6-溴-2-甲基喹啉(100mg，0.45mmol)的吡啶(5mL)溶液中加入二氧化硒(110mg，1.0mmol)，在100℃加热过夜后，浓缩滤液(旋干溶剂)；将所得混合物先用水洗，除去残留吡啶，再用甲醇洗，洗去杂质，烘干得到化合物S2：6-溴喹啉-2-羧酸。
(2)将6-溴喹啉-2-羧酸(10.0mmol)溶解在无水甲醇中并置于冰浴中，然后往其中滴加SOCl2(0.92mL，12.0mmol)，将得到的混合物回流过夜，直到TLC分析检测不到起始材料；将冷却至室温的悬浮液小心倒入饱和NaHCO3水溶液中，所得混合物用CH2Cl2萃取两次，合并有机萃取液，用无水Na2SO4干燥并过滤，然后通过真空蒸发除去溶剂，所得残渣经柱层析纯化得到相应的化合物S3：6-溴喹啉-2-羧酸甲酯。
(3)在氩气下，将6-溴喹啉-2-羧酸甲酯(1.0mmol)、Cs2CO3(144mg,1.50mmol)、Pd(OAc)2(8mg,3mol％)和BINAP(24mg,4mol％)混合置于Schlenk管中，反应过程中，Pd盐是催化剂，加快反应进行，BINAP用来活化Pd盐，碱也是催化剂，用于活化底物；将Schlenk管抽真空并用氩气冲洗，然后通过隔膜通过注射器往Schlenk管中加入无水甲苯(10mL)和氮杂环丁烷(114mg，2.0mmol)，用螺旋盖密封Schlenk管，并将混合物在100℃下搅拌过夜，直到在TLC分析中检测不到起始材料；反应后冷却至室温，用乙酸乙酯和水萃取反应混合物；合并有机萃取液，用无水Na2SO4干燥并过滤，然后通过真空蒸发除去溶剂；所得残留物通过柱色谱纯化得到化合物S4：6-(杂氮环丁烷)喹啉-2-羧酸甲酯。
(4)将6-(杂氮环丁烷)喹啉-2-羧酸甲酯(1.0mmol)溶解在10mL甲醇中，并用1.0mL10 eq NaOH溶液处理；搅拌24小时后，蒸发挥发物；向水相中滴加盐酸酸化至pH<1，过滤沉淀，用水洗涤，干燥，得到化合物S5：6-(杂氮环丁烷)喹啉-2-羧酸。
(5)将6-(氮杂环丁烷-1-基)喹啉-2-羧酸(60mg，0.3mmol)溶于3mL无水甲醇,加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇(30.4mg，0.3mmol)和4-(4,6-二甲氧基[1.3.5]三嗪-2-基)-4-加入氯化甲基吗啉水合物(72.8mg，0.3mmol)，并在室温下搅拌48小时。将所得混合物用有机溶剂萃取，萃取后的有机萃取液用无水硫酸钠干燥并过滤，然后真空蒸发除去溶剂，所得残留物通过柱色谱纯化，得到化合物S6：6-(氮杂环丁烷-1-基)-N-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)喹啉-2-甲酰胺。
(6)将化合物6-(氮杂环丁烷-1-基)-N-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)喹啉-2-甲酰胺(60mg，0.19mmol)溶于无水乙腈(2mL)和碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC，73mg，0.29mmol)中。然后滴加三乙胺(57.7mg，0.57mmol)3分钟后反应混合物变清澈。反应在室温下搅拌16小时，将粗反应物旋干，然后溶解在饱和NaHCO3中，将所得混合物用有机溶剂萃取，萃取后的有机萃取液用无水硫酸钠干燥并过滤，然后真空蒸发除去溶剂，所得残留物通过柱色谱纯化得到化合物S7：2-(2-(6-(氮杂环丁烷-1-基)喹啉-2-甲酰胺基)乙氧基)乙基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯。
(7)向9H-咔唑-4-醇(750mg，4.09mmol)和(2S)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯(1061mg，4.09mmol)中加入丁-2-酮(40mL)溶液和碳酸钾(622mg，4.50mmol)。混合物在回流下搅拌18小时，然后在减压下除去溶剂。将残留物再溶于二氯甲烷中，并用氢氧化钠水溶液、水和饱和盐水洗涤溶液。有机层用无水硫酸钠干燥并蒸发旋干。得到化合物S9：4-(环氧乙烷-2-基甲氧基)-9H-咔唑。
(8)将化合物4-(环氧乙烷-2-基甲氧基)-9H-咔唑(1.00mmol)溶于无水四氢呋喃(10mL)中，组胺(1.00mmol)溶于无水甲醇(10mL)中，将二者混合。在60℃下加热搅拌反应20小时。所得混合物用CH2Cl2萃取。合并有机萃取物，用无水Na2SO4干燥并过滤，然后真空蒸发除去溶剂。所得残留物通过柱色谱纯化，得到化合物S10：1-((2-(1H-咪唑-4-基)乙基)氨基)-3-((9H-咔唑-4-基)氧基)丙-2-醇。
(9)化合物2-(2-(6-(氮杂环丁烷-1-基)喹啉-2-甲酰胺基)乙氧基)乙基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(1mmol)，和化合物1-((2-(1H-咪唑-4-基)乙基)氨基)-3-((9H-咔唑-4-基)氧基)丙-2-醇(1mmol)溶解在无水DMF(10mL)中，加入一滴无水吡啶并在室温下反应4小时。合并有机提取物，用无水Na2SO4干燥并过滤，然后通过真空蒸发除去溶剂。所得残留物通过柱色谱纯化，得到最终产物β3-ARP。
结构通过1H NMR(图)和13C NMR(图)光谱以及质谱(HR-MS)(图)充分表征。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)11.26(s,1H),8.65(dt,J＝41.5,6.0Hz,1H),8.25(dd,J＝16.0,7.8Hz,1H),8.15(dd,J＝8.6,5.8Hz,1H),7.95(dd,J＝8.6,5.5Hz,1H),7.87(d,J＝9.1Hz,1H),7.54(s,1H),7.43(d,J＝8.1Hz,1H),7.29(m,2H),7.15-7.04(m,2H),6.70(s,1H),6.66-6.58(m,2H),5.43(s,1H),4.22(dd,J＝7.8,4.5Hz,1H),4.12-4.06(m,3H),3.96(t,J＝7.3Hz,3H),3.64-3.49(m,7H),3.43(d,J＝5.7Hz,2H),3.24(m,2H),2.73(q,J＝7.1Hz,2H),2.36(p,J＝7.3Hz,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)164.94,154.17,149.72,140.24,139.93,138.05,133.75,129.65,125.87,124.16,122.09,121.64,118.78,118.32,117.68,111.76,109.36,103.14,101.91,100.31,76.45,68.91,68.80,68.54,68.21,63.88,63.48,52.02,51.21,48.56,38.59,15.82；ESI:m/z cald.for C38H41N7O6,691.32[M+H]+,found 692.32.
对实施例1：
制得β3-ARP的的激发、发射光谱：首先通过荧光分光光度法分别测量β3-ARP的激发光谱和发射光谱，浓度为10mM的PBS缓冲液(pH 7.4，1％ DMSO)中表现出荧光。如图1所示。
β3-ARP对不同金属离子的稳定性：
测试β3-ARP(1％ DMSO 10uM)在不同种类金属离子(None、Na+、K+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Ba2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Cd2+、Pb2+、Ni2+、Sn2+、Ag+、)中表现出相对稳定性。在10mMPBS缓冲液中使用相同浓度的β3-ARP，在10mM的PBS缓冲液中分别加入不同的金属离子。其中Na+、K+、Mg2+浓度为1mM。Al3+、Zn2+、Ba2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Cd2+、Pb2+、Ni2+、Sn2 +、Ag+浓度为100μM。如图2a所示。
测试β3-ARP(1％ DMSO 10μM)在不同种类氨基酸(1.None；2.Gly；3.Ala；4.Val；5.Leu；6.Ile；7.Pro；8.Phe；9.Tyr；10.Trp；11.Ser；12.Thr；13.Asn；14.Asp；15.Glu；16.Lys；17.Arg；18.His；19.GSH；20.Hcy；21.Cys；)中表现出相对稳定性。在10mM PBS缓冲液中使用相同浓度的β3-ARP，在10mM的PBS缓冲液中分别加入不同的氨基酸。其中GSH浓度为1mM,Cys浓度为200μM，其他氨基酸Gly；Ala；Val；Leu；Ile；Pro；Phe；Tyr；Trp；Ser；Thr；Asn；Asp；Glu；Lys；Arg；His；Hcy；浓度为100μM。如图2b所示。
β3-ARP对pH在4-10之间的荧光强度变化：
在不同pH值的PBS缓冲液(10mM，1％ DMSO)中，β3-ARP对pH在4-10之间的荧光强度变化表现出相对稳定性。如图3所示。
β3-ARP的细胞毒性：
图4为本发明所列β3-ARP在分别转染肾上腺素受体β1、β2、β3的HEK293细胞中的存活率示意图。MTT细胞存活率测定法用于评估分子β3-ARP对稳定转染β1-和β2-和β3-ARPs的HEK293细胞的细胞毒性。将这些处于对数生长期的细胞(200μL，每孔8×103个)培养在96孔板中。在96孔板中孵育24小时；然后分别加入不同浓度的β3-ARP化合物(从100μM开始，逐级稀释至10μM、1μM、0.1μM、0.01μM，每组5个重复)并再孵育24小时。移除培养基，每孔加入5mg/ml MTT 10μl。孵化4小时后，吸掉孔板中培液后加入150ul DMSO,在M200 Pro多模微孔板酶标仪(Tecan，瑞士)中读取570nm和630nm处的吸光度。通过MTT进行分析，处理后HEK293细胞存活率很高，细胞毒性小。
流式细胞仪检测：
图5为本发明β3-ARP在转染不同受体的293细胞与不同浓度的受体拮抗剂反应后的流式分析研究示意图。稳定转染了三种β-AR亚型的HEK293细胞在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的DMEM中生长，温度为37℃和5％ CO2。收集处于增殖期的细胞，消化离心后收集细胞，播种在6孔板中(3×105)并培养过夜。去除旧的培养基后，将化合物母液稀释后以1μM的浓度加入到孔板中，在不加或加不同浓度(10μM、20μM、30μM、40μM)β-AR拮抗剂的条件下37℃孵育30分钟，之后消化离心收集细胞，用PBS缓冲液清洗两次，然后加入流式管中。在室温下孵化15分钟后，在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific)上收集细胞的荧光强度，并在Flowjo V10上通过计算相应通道中细胞的平均值进行分析。β3-AR可以靶向标记β3肾上腺素受体，对β1肾上腺素受体和β2肾上腺素受体无明显标记，可以实现对β3肾上腺素受体的特异性靶向。
荧光成像：
图6为本发明荧光探针β3-ARP
在稳定转染了三种β-AR亚型的HEK293细胞与不同受体拮抗剂反应后的不同荧光成像研究示意图。发现稳定转染了三种β-AR亚型的HEK293细胞在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的DMEM中生长，温度为37℃和5％ CO2。所有的化合物溶液都是从DMSO储备溶液(10mM)中制备的。将具有良好生长条件的细胞播种在共聚焦12孔板中(1×104)并培养过夜。去除旧的培养基后，将化合物(1μM)加入到孔板中，在不加或加β-AR拮抗剂(10μM)的条件下37℃孵育30分钟。随后，用莱卡SP8显微镜在405nm波长激发下收集510-560nm波长范围内的荧光信号。β3-ARP(1μM)在稳定转染β1-AR、β2-AR和β3-AR的HEK293细胞中，在没有和存在相应的拮抗剂(β1-AR、β2-AR和β3-AR的相应拮抗剂分别为10μM Mepotrolol、10μMICI118551、10μM SR59230A)时的荧光成像。成像激发波长为405nm，发射波长为535nm(500-560nm)，比例尺，20μM。发现荧光探针β3-ARP(1μM)在稳定转染β1-AR、β2-AR和β3-AR的HEK293细胞中有荧光，当加入相应抑制剂后，β3-AR的HEK293细胞发生荧光猝灭现象。可实现对β3-AR的特异性靶向。
共定位分析：
图7为本发明β3-ARP在不同细胞器中的定位成像研究示意图。稳定转染了三种β-AR亚型的HEK293细胞在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的DMEM中生长，温度为37℃和5％CO2。所有的化合物溶液都是从DMSO储备溶液(10mM)中制备的。收集处于增殖期的细胞，消化离心后收集细胞，播种在共聚焦小皿中(1×104)并培养过夜。将细胞与β3-ARP(10μM，30分钟)一起孵育，在荧光成像前加入细胞器荧光染料ER-Red(500nM，30分钟)、Golgi-Red(500μM，30分钟)、Lyso-Red(100nM，60分钟)和Mito Red(40nM，30分钟)荧光染料。探针β3-ARP通道在405nm波长的激发下收集480-550nm之间的荧光信号。内质网和高尔基体红色染料在561nm波长的激发下收集在550-650nm之间的荧光信号。溶酶体和线粒体红色通道在561nm波长的激发下收集585-620bnm之间的荧光信。皮尔逊的相关系数是用Image J计算的。发现对内质网、高尔基体、溶酶体、线粒体均没有很好的定位。
需要说明的是，上述仅仅是本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，在上述实施例的基础上还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种β3肾上腺素能受体锚定型探针，其特征在于：所述β3肾上腺素能受体锚定型探针的结构式为：
。
2.一种根据权利要求1所述的β3肾上腺素能受体锚定型探针的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：首先制备中间产物S7，接着以9H-咔唑-4-醇为原料制得中间产物S10，最后将中间产物S7与中间产物S10二者共价偶联得到目标产物；
其中：中间产物S7为2-（2-（6-（氮杂环丁烷-1-基）喹啉-2-甲酰胺基）乙氧基）乙基（2,5-二氧代吡咯烷-1-基）碳酸酯，中间产物S10为1-（（2-（1H-咪唑-4-基）乙基）氨基）-3-（（9H-咔唑-4-基）氧基）丙-2-醇；所述中间产物S7与中间产物S10的摩尔比为1:1。
3.根据权利要求2所述的一种β3肾上腺素能受体锚定型探针的制备方法，其特征在于：所述中间产物S7的制备具体步骤如下：
（1）将二氧化硒加入6-溴-2-甲基喹啉的吡啶溶液中，经高温加热反应过夜后，旋干溶剂，将所得混合物先用水洗除去，残留吡啶，再用甲醇洗，洗去杂质，烘干得到6-溴喹啉-2-羧酸；
（2）在冰浴条件下，将步骤（1）得到的6-溴喹啉-2-羧酸溶解于有机溶剂中，再往其中滴加氯化亚砜，混合物回流过夜，将反应后冷却至室温的悬浮液倒入饱和碳酸氢钠水溶液中，将所得混合物用有机溶剂萃取，萃取后的有机萃取液用无水硫酸钠干燥并过滤，然后真空蒸发除去溶剂，得到6-溴喹啉-2-羧酸甲酯；
（3）在氩气下，将步骤（2）得到的6-溴喹啉-2-羧酸甲酯与碳酸铯、醋酸钯和BINAP混合，将混合物在高温下搅拌过夜，反应后冷却至室温，用乙酸乙酯和水萃取反应混合物，合并有机萃取液，将有机萃取液用无水硫酸钠干燥并过滤，然后真空蒸发除去溶剂，得到6-（杂氮环丁烷）喹啉-2-羧酸甲酯；
（4）将步骤（3）得到的6-（杂氮环丁烷）喹啉-2-羧酸甲酯溶于甲醇中，加入NaOH溶液处理，与高温下搅拌24小时后蒸发挥发物，随后向水相中滴加盐酸，酸化调节pH，随后过滤出沉淀物，用水洗涤干燥后得到6-（氮杂环丁烷-1-基）喹啉-2-羧酸；
（5）将步骤（4）得到的6-（氮杂环丁烷-1-基）喹啉-2-羧酸溶于无水甲醇, 加入2-（2-氨基乙氧基）乙醇和4-（4,6-二甲氧基[1.3.5]三嗪-2-基）-4-加入氯化甲基吗啉水合物，并在室温下搅拌48小时，将所得混合物用有机溶剂萃取，萃取后的有机萃取液用无水硫酸钠干燥并过滤，然后经真空蒸发除去溶剂，所得残留物通过柱色谱纯化后得到6-（氮杂环丁烷-1-基）-N-（2-（2-羟基乙氧基）乙基）喹啉-2-甲酰胺；
（6）将步骤（5）得到的6-（氮杂环丁烷-1-基）-N-（2-（2-羟基乙氧基）乙基）喹啉-2-甲酰胺溶于无水乙腈和碳酸二琥珀酰亚胺酯中，然后滴加三乙胺3分钟后反应混合物变清澈，在室温下搅拌16小时后将粗反应物旋干，然后溶解在饱和NaHCO3中，将所得混合物用有机溶剂萃取，萃取后的有机萃取液用无水硫酸钠干燥并过滤，然后真空蒸发除去溶剂，所得残留物通过柱色谱纯化得到2-（2-（6-（氮杂环丁烷-1-基）喹啉-2-甲酰胺基）乙氧基）乙基（2,5-二氧代吡咯烷-1-基）碳酸酯。
4.根据权利要求3所述的一种β3肾上腺素能受体锚定型探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中6-溴-2-甲基喹啉与二氧化硒的反应摩尔比为0.45：1，反应温度为100~105℃；所述步骤（2）中6-溴喹啉-2-羧酸与氯化亚砜的反应摩尔比为5：6；所述步骤（3）中每mmol 6-溴喹啉-2-羧酸甲酯，加入144 mg Cs2CO3、8mg Pd(OAc)2和24 mg BINAP与6-溴喹啉-2-羧酸甲酯进行反应；所述步骤（4）中6-（杂氮环丁烷）喹啉-2-羧酸甲酯与NaOH的反应摩尔比为1：10；所述步骤（5）中6-（氮杂环丁烷-1-基）喹啉-2-羧酸和2-（2-氨基乙氧基）乙醇和4-（4,6-二甲氧基[1.3.5]三嗪-2-基）-4-氯化甲基吗啉水合物的反应摩尔比为1：1：1；所述步骤（6）中6-（氮杂环丁烷-1-基）-N-（2-（2-羟基乙氧基）乙基）喹啉-2-甲酰胺和碳酸二琥珀酰亚胺酯和三乙胺的反应摩尔比为1：1.5：3。
5.根据权利要求2所述的一种β3肾上腺素能受体锚定型探针的制备方法，其特征在于：所述中间产物S10的制备具体步骤如下：
（1）向9H-咔唑-4-醇和（2S）-间硝基苯磺酸缩水甘油酯中加入丁-2-酮溶液和碳酸钾，将混合物在回流下搅拌18小时，然后在减压下除去溶剂，随后将残留物再溶于二氯甲烷中，并用氢氧化钠水溶液、水和饱和盐水洗涤溶液，有机层用无水硫酸钠干燥并蒸发旋干得到4-（环氧乙烷-2-基甲氧基）-9H-咔唑；
（2）将步骤（1）得到的4-（环氧乙烷-2-基甲氧基）-9H-咔唑溶于无水四氢呋喃中，组胺溶于无水甲醇中，将二者混合，随后将混合液在60℃下加热搅拌反应20小时，所得混合物用CH2Cl2萃取后合并有机萃取物，用无水Na2SO4干燥并过滤，然后真空蒸发除去溶剂，所得残留物通过柱色谱纯化，得到1-（（2-（1H-咪唑-4-基）乙基）氨基）-3-（（9H-咔唑-4-基）氧基）丙-2-醇。
6.根据权利要求5所述的一种β3肾上腺素能受体锚定型探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中9H-咔唑-4-醇和（2S）-间硝基苯磺酸缩水甘油酯和碳酸钾的反应摩尔比为1：1：1.1；所述步骤（2）中4-（环氧乙烷-2-基甲氧基）-9H-咔唑（1.00 mmol）和组胺（1.00mmol）的反应摩尔比为1：1。
7.根据权利要求2所述的一种β3肾上腺素能受体锚定型探针的制备方法，其特征在于：所述目标产物的制备步骤如下：将中间产物S7与中间产物S10溶解在无水DMF中，加入一滴无水吡啶并在室温下反应4小时，随后合并有机提取物，用无水Na2SO4干燥并过滤，然后通过真空蒸发除去溶剂，所得残留物通过柱色谱纯化，得到最终产物。
8.根据权利要求1所述的β3肾上腺素能受体锚定型探针在β3肾上腺素能受体（β3-AR）的锚定型化学标记中的应用，其特征在于：在稳定转染β1-AR、β2-AR和β3-AR的HEK293细胞中，当加入相应抑制剂后，在转染β3-AR受体蛋白的HEK293细胞中荧光显著下降，表明荧光探针β3-ARP可实现对β3-AR的特异性靶向，该探针将适用于在活细胞中成像β3-AR，利用探针建立筛选平台，有望快速筛选β3-AR受体相关化学调控剂。
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