CN111808073B - 一种生长素荧光染料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种生长素荧光染料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生长素荧光染料及其制备方法与应用。所述生长素荧光探针具有如下式所示的结构式：
Figure DDA0002585441280000011
所述生长素荧光探针的制备方法包括以下步骤：以对羟基苯甲醛和2‑溴乙醇为原料，在碱存在的条件下进行亲核取代反应，生成化合物I；以生长素和化合物I为原料，在缩合剂和酯化反应催化剂存在的条件下进行酯化反应，生成化合物II；以所述化合物II和N‑甲基‑4‑甲基吡啶碘化物为原料，缩合反应催化剂存在的条件下进行缩合反应，生成所述生长素荧光染料。该荧光染料不仅在植物体内具有强的荧光活性，还具有生长素类似的生理活性，能够应用于原位示踪植物组织中生长素的分布与定位。

Description

一种生长素荧光染料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及荧光成像领域，具体涉及一种生长素荧光染料及其制备方法与应用。
背景技术
生长素(Auxin，IAA)是一种重要的植物激素，是具有高度生物活性的信号小分子，参与调控植物的生长和发育，并对外界刺激作出响应，在植物尤其是根系的生长发育过程中起着重要的调控作用。生长素的作用具有明显的时空特异性，其在细胞间的细微浓度差异足以引起发育方向的改变，生长素局部相对亏缺/聚集调控细胞的维持或分化等重要发育过程。为深入解析IAA调控植物生长发育的分子机制，细胞水平的生长素的原位实时分布备受关注。
通常，IAA检测方法均需要对植物部位的IAA进行提取分离后进行检测，无法实现活体植物中的细胞水平的生长素的原位实时分布检测，具有很大的局限性。
荧光染料是指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质。它们大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。荧光染料可以单独使用，也可以组合成复合荧光染料使用。荧光显微成像技术具有快速实时响应、分辨率高、灵敏度高、操作简便、非破坏性等优点，显示出独特的时间和空间上的优势，结合激光共聚焦显微镜，荧光成像技术成为分子水平上进行实时原位监测细胞内生物活性物质信号的重要手段。因此，设计合成具有新型的生物素荧光染料，用于研究活体植物中IAA运输和原位实时分布，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种生长素荧光染料(IAA-HMPI)，能够用于研究植物体内的IAA运输分布。
本发明还提出上述荧光染料的制备方法。
本发明还提出一种具有上述生长素荧光染料的细胞成像试剂。
本发明还提出上述荧光染料的应用。
根据本发明的第一方面实施例的生长素荧光染料(IAA-HMPI)，其结构式如下所示：
Figure GDA0003001725570000021
根据本发明实施例的生长素荧光染料，至少具有如下有益效果：本发明的荧光染料结构新颖，以IAA为基础进行结构修饰，具有与生长素类似的生理活性，能够参与植物体内IAA的代谢途径，进而用于IAA示踪显影；该荧光染料具有较强的荧光活性，其最大发光位置在488nm，这些性质使得该化合物尤为适合生物成像；同时，本发明实施例中的细胞成像也进一步证实，该荧光染料的生物成像效果明显且毒性低。
根据本发明的第二方面实施例的生长素荧光染料的制备方法，包括以下步骤：
化合物I的合成(亲核取代反应)：以对羟基苯甲醛和2-卤代乙醇为原料，在碱存在的条件下进行亲核取代反应，生成化合物I；
Figure GDA0003001725570000022
化合物II的合成(酯化反应)：以生长素和化合物I为原料，在缩合剂和酯化反应催化剂存在的条件下进行酯化反应，生成化合物II；
Figure GDA0003001725570000023
生长素荧光染料的合成(缩合反应)：以所述化合物II和N-甲基-4-甲基吡啶碘化物为原料，在缩合反应催化剂存在的条件下进行缩合反应，生成所述荧光染料(IAA-HMPI)；
Figure GDA0003001725570000031
根据本发明实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：该制备方法具有原料易得、工艺简单、反应条件容易控制和成本低廉等优点，在有机溶剂中具有较高的量子产率，制备得到的生长素荧光染料的质量好。
在本发明中，在上述生长素荧光染料的合成步骤中，所述缩合反应催化剂能够与所述化合物II上的醛基进行反应生成亚胺，进一步催化与N-甲基-4-甲基吡啶碘化物上4-甲基的缩合。
根据本发明的一些实施方式，在化合物I的合成步骤中，所述碱为弱碱，例如K2CO3、Na2CO3和NaHCO3中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，在化合物I的合成步骤中，反应的溶剂为非质子性溶剂；优选为DMF、DMSO、四氢呋喃和二氧六环中的至少一种；更优选地为四氢呋喃。
根据本发明的一些实施方式，在化合物II的合成步骤中，所述缩合剂为常用缩合剂，如二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，在化合物II的合成步骤中，所述酯化反应催化剂为4-二甲氨基吡啶。
根据本发明的一些实施方式，在化合物II的合成步骤中，所述生长素与化合物I的摩尔比为1:1.2。
根据本发明的一些实施方式，在化合物II的合成步骤中，反应的溶剂为四氢呋喃、甲苯、二氯乙烷、二氯甲烷、DMF、DMSO、烷烃溶剂中的至少一种；优选为石油醚：二氯甲烷的摩尔比为1:12的混合溶剂。在该溶剂体系下具有较高的酯化反应产率。
根据本发明的一些实施方式，在荧光染料的合成步骤中，所述缩合反应催化剂为有机碱，所述有机碱包括哌啶、吡啶、喹啉、伯胺和仲胺中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，在荧光染料的合成步骤中，反应的溶剂为乙腈、乙醇。
根据本发明的一些实施方式，具体包括以下步骤：
1)化合物I的合成：将1:1摩尔单量的羟基苯甲醛与2-溴乙醇混合，以乙腈为溶剂，加入3倍摩尔单量碳酸钾回流反应，低温亲核取代反应2h生成化合物I；
2)化合物II的合成：将1:1.2摩尔单量的生长素与化合物I混合，然后加入一倍摩尔单量的二环己基碳二亚胺，0.1倍摩尔单量的4-二甲氨基吡啶，在1:12摩尔单量的石油醚：无水二氯甲烷中，室温中氩气保护下反应12h，减压除去溶剂，得到化合物II；
3)化合物III的合成：将1:1摩尔单量的化合物I与N-甲基-4-甲基吡啶碘化物溶于无水乙醇中，加入0.5～1.0wt％哌啶于50℃催化反应5h，析出淡黄色固体，硅胶柱层析纯化后得到化合物III，即为生长素荧光染料IAA-HMPI。
根据本发明的第三方面实施例的植物细胞成像试剂，所述试剂包含上述生长素荧光染料。
根据本发明的第四方面实施例的生长素荧光染料的应用，上述生长素荧光染料应用于植物的细胞成像中。
根据本发明第四方面实施例的应用，至少具有如下有益效果：本发明的荧光染料可用来在植物活体内细胞进行成像分析，进而在活体内对于生长素的成像示踪，能够用于研究活体植物中IAA运输和原位实时分布。根据本发明的一些实施方式，包括以下步骤：使用浓度为0.5～10μmol/L的所述生长素荧光染料培养植物种子，对植物进行细胞成像。
进一步地，所述细胞成像是观察植物中生长素荧光染料在植物细胞中的荧光情况、形态变化和分布特征。
根据本发明的一些实施方式，还包括在培养前对种子进行春化处理的步骤。
根据本发明的一些实施方式，种子的培养条件为22℃恒温光照培养。
根据本发明的一些实施方式，具体包括以下步骤：
1)将IAA-HMPI粉末用DMSO溶解，配制成1mM的储存液，-20℃避光保存；
2)以模式植物拟南芥为实验材料，选择拟南芥yuc2yuc6突变体，先对拟南芥种子进行表面消毒，用浓度为75％酒精润洗种子10min，吸走酒精，用无菌双蒸水润洗种子3-5次，除去消毒液的残留，再用1mL枪头将种子点种于1/2MS固体平板上，封口。具体培养步骤为，先置于4℃春化2天，再置于22℃恒温光照培养箱，以16h/8h的光暗循环竖直培养；
3)挑取光照培养3天的拟南芥幼苗，浸泡于不同浓度的IAA-HMPI水溶液中，稀释为10μmol/L、1μmol/L的水溶液于96孔板，浸泡培养24h(光照)，再用1/2MS预留液中浸泡漂洗1min。同时选取野生型幼苗在纯水中进行对照培养。之后用100μL的1/2MS预留液在载玻片上压片，吸取多余的水分，防止采集图像中拟南芥幼苗发生位移，观察生长素荧光染料在拟南芥中的分布特征；
4)打开激光共聚焦显微镜扫描仪，预热15min，在40×目镜下，观察拟南芥根尖细胞的荧光分布。
根据本发明的第五方面实施例的生长素荧光染料的应用，上述生长素荧光染料应用于调节植物根系发育中。
根据本发明第五方面实施例的应用，至少具有如下有益效果：本发明的生长素荧光染料对植物幼苗毒性极小，在低浓度下(1μmol/L)促进植物侧根的发育，高浓度(10μmol/L)抑制主根的伸长，具有与生长素类似的生理活性。
根据本发明的一些实施方式，包括以下步骤：使用浓度为0.5～10μmol/L的所述生长素荧光染料培养种子。
根据本发明的一些实施方式，还包括在培养前对种子进行春化处理的步骤。
根据本发明的一些实施方式，种子的培养条件为22℃恒温光照培养。
根据本发明的一些实施方式，具体包括以下步骤：
1)将IAA-HMPI粉末用DMSO溶解，配制成1mmol/L的储存液，-20℃避光保存；
2)春化种子：以野生型拟南芥株系、拟南芥yuc2yuc6双突变体株系为实验材料，将拟南芥种子进行表面消毒，用浓度为75％酒精润洗种子10min，吸走酒精，在超净工作台使用无菌双蒸水润洗种子3-5次，除去消毒液的残留，置于4℃冰箱黑暗春化3天；
3)配置培养基：以MS为基本培养基，在培养基中分别加入的IAA-HMPI(浓度为1μmol/L和10μmol/L)；
4)点铺种子：用1mL枪头将春化后的拟南芥种子点种于上述培养基MS固体平板上，封口，置于22℃恒温光照培养箱，以16h(光)/8h(暗)的光暗循环竖直培养，22℃培养一周。
本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值，以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
如无特殊说明，本发明中的各原料均可通过市售购买获得，本发明中所用的设备可采用所属领域中的常规设备或参照所属领域的现有技术进行。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1的生长素荧光染料的一级质谱图(a)和二级质谱图(b)；
图2为本发明实施例2的生长素荧光染料的荧光光谱图；
图3为本发明实施例3的生长素荧光染料对拟南芥yuc2yuc6突变体幼苗的生理影响图；
图4为本发明实施例3的生长素荧光染料对拟南芥yuc2yuc6突变体幼苗的根形态的影响图；
图5为本发明实施例4的生长素荧光染料(10μmol/L浓度)在拟南芥yuc2yuc6突变体幼苗根尖中的生物成像图，同一视野下根尖细胞的荧光发光图(a)，明场图(b)，荧光明场叠加图(c)；
图6为本发明实施例4的生长素荧光染料(10μmol/L浓度)在拟南芥yuc2yuc6突变体幼苗根分生组织细胞的生物成像图；
图7为本发明实施例4的生长素荧光染料(10μmol/L浓度)在拟南芥yuc2yuc6突变体幼苗侧根的生物成像图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
实施例1一种新型生长素荧光染料的制备方法：
1)化合物I的合成
将1:1摩尔单量的羟基苯甲醛与2-溴乙醇混合，以乙腈为溶剂，加入3倍摩尔单量碳酸钾回流反应，低温亲核取代反应2h生成化合物Ⅰ，反应方程式如下：
Figure GDA0003001725570000071
2)化合物Ⅱ的合成
1:1.2摩尔单量的生长素与化合物Ⅰ混合，然后加入1倍摩尔单量的二环己基碳二亚胺(DCC)，0.1倍摩尔单量的4-二甲氨基吡啶，在1:12摩尔单量的石油醚：无水二氯甲烷中，室温中氩气保护下反应12h，减压除去溶剂，得到化合物Ⅱ，反应方程式如下：
Figure GDA0003001725570000072
3)化合物Ⅲ的合成
化合物II(100mg，0.31mmol)与N-甲基-4-甲基吡啶碘化物(73mg，0.31mmol)溶于3mL无水乙醇中，加入20μL哌啶于50℃催化反应5h，析出淡黄色固体。抽滤并用乙醇洗涤滤饼，过层析柱纯化，干燥后得116mg的化合物Ⅲ，即为生长素荧光染料IAA-HMPI，产率69％，反应方程式如下：
Figure GDA0003001725570000081
得到的生长素荧光染料IAA-HMPI的结构表征如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.97(s,1H),8.82(d,J＝6.4Hz,2H),8.17(d,J＝6.4Hz,2H),8.00(d,J＝16.3Hz,1H),7.73(d,J＝8.5Hz,2H),7.49(d,J＝7.8Hz,1H),7.37(d,J＝2.8Hz,1H),7.27(s,1H),7.08(d,J＝8.2Hz,3H),6.93(t,J＝7.4Hz,1H),4.41(s,2H),4.29(s,2H),4.24(s,3H),3.79(s,2H),2.51(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ171.9,160.5,153.3,145.3,140.9,136.5,130.4,128.5,127.5,124.6,123.55(s),121.4,121.3,118.9,115.9,111.8,107.1,66.2,62.9,47.1,30.9。
IAA-HMPI的高分辨质谱分析：运用Agilent 1290-6530UHPLC-QTOF MS四级杆飞行时间高分辨质谱仪，ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(150mm×2.1mm,5μm)；流动相：A为90％甲酸-水，B为10％乙腈，流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：1μL。质谱条件：ESI+模式；毛细管电压：4000V；干燥气温度：350℃；干燥气体积流量：12L/min；脱溶剂温度：35℃；扫描范围m/z：100-1200Da；碰撞电压：135V。图1为荧光染料的质谱图，其中，(a)为荧光染料的一级质谱图和(b)为二级质谱图；得到质量数413.1855与荧光染料裂解掉碘负离子的母离子[M-I+H]+吻合(图1中(a)所示)，以及精确的二级质谱的碎片离子的质量数212.1062(图1中(b)所示)。
IAA-HMPI的荧光光谱分析：称取适当的荧光染料IAA-HMPI粉末溶解于乙腈中，配制成1mM的储存液。荧光光谱分析参数：室温25℃，样品池为1cm×1cm×4cm石英比色皿，激发狭缝宽度2.5nm，发射狭缝宽度1nm，最大吸收波长为380nm，激发波长范围450-500nm。
实施例2生长素荧光染料IAA-HMPI的荧光吸收光谱图：
称取适当的荧光染料IAA-HMPI粉末溶解于乙腈中，配制成1mM的储存液。荧光光谱分析参数：室温25℃，样品池为1cm×1cm×4cm石英比色皿，激发狭缝宽度2.5nm，发射狭缝宽度1nm，最大吸收波长为380nm，激发波长范围450-500nm，荧光光谱图结果如图2所示。该荧光染料具有较强的荧光活性，其最大发光波长为488nm，这些性质使得该化合物尤为适合生物成像。
实施例3生长素荧光染料对植物的生理影响：
1)将IAA-HMPI粉末用DMSO溶解，配制成1mmol/L的储存液，-20℃避光保存；
2)春化种子：以拟南芥yuc2yuc6双突变体株系为实验材料，将拟南芥种子进行表面消毒，用浓度为75％酒精润洗种子10min，吸走酒精，在超净工作台使用无菌双蒸水润洗种子3-5次，除去消毒液的残留，置于4℃冰箱黑暗春化3天；
3)配置培养基：以MS为基本培养基，在培养基中分别加入不同浓度的HMPI(1μmol/L、10μmol/L)和IAA-HMPI(1μmol/L、10μmol/L)为实验组，设置空白对照组；
其中，HMPI是
Figure GDA0003001725570000091
合成方法为
Figure GDA0003001725570000092
4)点铺种子：用1mL枪头将春化后的拟南芥种子点种于不同浓度梯度的培养基MS固体平板上，封口，置于22℃恒温光照培养箱，以16h/8h的光暗循环竖直培养，22℃培养一周后观察。
5)合成的产物分子对拟南芥幼苗毒性极小，图3为荧光染料对拟南芥yuc2yuc6突变体幼苗的生理影响图，图4为荧光染料对拟南芥yuc2yuc6突变体幼苗的根形态的影响图，如图3和图4结果所示，在1μmol/L浓度下促进拟南芥侧根的发育，10μmol/L浓度下抑制主根的伸长，具有与生长素类似的生理活性。
本发明中使用拟南芥作为模式植物，拟南芥作为一种双子叶模式植物，在植物发育研究中发挥着不可替代的作用。
实施例4荧光染料在植物细胞中的成像试验：
1)将IAA-HMPI粉末用DMSO溶解，配制成1mM的储存液，-20℃避光保存。
2)以模式植物拟南芥为实验材料，选择拟南芥yuc2yuc6突变体，先对拟南芥种子进行表面消毒，用浓度为75％酒精润洗种子10min，吸走酒精，用无菌双蒸水润洗种子3～5次，除去消毒液的残留，再用1mL枪头将种子点种于1/2MS固体平板上，封口。具体培养步骤为，先置于4℃春化2天，再置于22℃恒温光照培养箱，以16h/8h的光暗循环竖直培养。
3)挑取光照培养3天的拟南芥幼苗，浸泡于不同浓度的IAA-HMPI水溶液中，稀释为10μmol/L，1μmol/L的水溶液于96孔板，浸泡培养24h(光照)，再用1/2MS预留液中浸泡漂洗1min。同时选取野生型幼苗在纯水中进行对照培养。之后用100μL的1/2MS预留液在载玻片上压片，吸取多余的水分，防止采集图像中拟南芥幼苗发生位移。观察生长素荧光染料在拟南芥中的分布特征。
4)运用Olympus FV1000激光扫描共聚焦显微镜，预热15min，在40×目镜下，使用488nm激光对拟南芥样品根尖部位进行扫描并录取图像，调整激光强度，保证数据分析结果的可靠性，观察生长素荧光染料在拟南芥根尖细胞的荧光情况、形态变化和分布特征等。
通过激光共聚焦成像结果表明，图5为荧光染料(10μmol/L)在拟南芥yuc2yuc6突变体幼苗根尖中的生物成像图，其中同一视野下根尖细胞的荧光发光图(a)，明场图(b),荧光明场叠加图(c)，从图5看出合成的荧光染料在根尖成熟区分布较少，在根冠和分生区分布密集，且在根尖伸长区前端中柱部分分布相对较少，周缘(皮层)细胞中分布较多，在根尖呈倒伞状分布。图6为荧光染料(10μmol/L)在拟南芥yuc2yuc6突变体幼苗根分生组织细胞的亚细胞生物成像图，图6看出其主要聚集在拟南芥根尖分生组织细胞的细胞核中。图7看出生长素荧光染料密集分布于侧根靠近内皮层突起的薄壁细胞中。说明该荧光染料的生物成像效果明显且毒性低，对深入研究活体细胞间IAA运输和原位实时分布具有重要的指示功能，有利于揭示生长素调控主根生长和侧根发育的功能。结果表明，合成的染料分子具有与生长素类似的生理活性，结合激光共聚焦技术，利用合成的生长素荧光染料建立原位示踪植物组织中生长素的分布与定位方法，该方法的优点为简便且直观可视化。
综上所述，本发提供的生长素荧光染料还具有以下优点：
(1)本发明的荧光染料具有所用原料易得，合成方法简单，反应条件容易控制等优点；
(2)本发明的荧光染料产物分子有较高的产率，该荧光染料不仅在植物体内具有强的荧光活性，还具有生长素类似的生理活性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (11)

1.一种生长素荧光染料，其特征在于，其结构式如下所示：
Figure FDA0003001725560000011
2.根据权利要求1所述的生长素荧光染料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
化合物I的合成：以对羟基苯甲醛和2-卤代乙醇为原料，在碱存在的条件下进行亲核取代反应，生成化合物I；
Figure FDA0003001725560000012
化合物II的合成：以生长素和化合物I为原料，在缩合剂和酯化反应催化剂存在的条件下进行酯化反应，生成化合物II；
Figure FDA0003001725560000013
生长素荧光染料的合成：以所述化合物II和N-甲基-4-甲基吡啶碘化物为原料，在缩合反应催化剂存在的条件下进行缩合反应，生成所述荧光染料；
Figure FDA0003001725560000021
3.根据权利要求2所述的生长素荧光染料的制备方法，其特征在于，在化合物I的合成步骤中，所述碱包括K2CO3、Na2CO3和NaHCO3中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的生长素荧光染料的制备方法，其特征在于，在化合物II的合成步骤中，所述缩合剂包括DCC、DIC和EDCI中的至少一种；所述酯化反应催化剂为4-二甲氨基吡啶。
5.根据权利要求2所述的生长素荧光染料的制备方法，其特征在于，在化合物II的合成步骤中，所述生长素与所述化合物I的摩尔比为1:1～1.5。
6.根据权利要求5所述的生长素荧光染料的制备方法，其特征在于，所述生长素与所述化合物I的摩尔比为1:1.2。
7.根据权利要求2所述的生长素荧光染料的制备方法，其特征在于，在生长素荧光染料的合成步骤中，所述缩合反应催化剂为哌啶。
8.一种植物细胞成像试剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的生长素荧光染料。
9.权利要求1所述的生长素荧光染料在植物的细胞成像中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：使用浓度为0.5～10μmol/L的所述生长素荧光染料培养植物种子，对植物细胞进行细胞成像。
11.权利要求1所述的生长素荧光染料在调节植物根系发育中的应用。
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