JP2022531141A - 遺伝子治療のコンディショニング方法 - Google Patents

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Abstract

開示は、移植された幹細胞の生着を改善し、遺伝子治療を提供するために、遺伝子改変幹細胞で移植する前に、対象から内因性造血幹細胞および/または免疫細胞の特定の集団を枯渇させるのに有用な組成物および方法を提供する。本開示は、なかでも、種々の血液病、代謝病、癌、および自己免疫疾患の治療のための組成物及び方法を提供する。ここに記載されているのは、例えば、ヒトのような患者においてCD117+またはCD45+細胞の集団を枯渇させることにより、これらの状態の治療に有効となるように適用することができる、抗体、抗原結合フラグメントおよびそれらのコンジュゲートである。

Description

関連出願
本出願は、2019年4月24日に出願された米国仮出願No.62/838,278及び2019年12月6日に出願された米国仮出願No.62/944,925を優先権を主張する。優先出願のそれぞれの内容は、援用として組み込まれている。
配列エンスリスト
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造血幹細胞(HSC)は、様々な疾患に対処するための重大な治療可能性を有する。さらに最近では、HSCに基づく治療法として、幹細胞の遺伝子改変を可能にする強力な遺伝子編集法の使用が挙げられている。遺伝子改変HSCは、とりわけ、欠陥遺伝子を修正するために、特定の血球の疾患(例えば、鎌状赤血球症)、代謝障害(例えば、ムコ多糖症)、癌、および自己免疫状態(例えば、慢性肉芽腫症)に罹患している患者に送達することができる。多くの患者にとって、HSCベースの治療法は依然として唯一の治癒的治療法である。
造血幹細胞移植(HSCT)は、生着前に被検者の組織(例えば骨髄組織)の調整を必要とする。照射(例えば、全身照射またはTBI)およびDNAアルキル化/変性剤を含む現在の非標的調整方法は、複数回臓器システム、造血細胞および非造血細胞および造血ミクロ環境に非常に有毒である。このような過酷な前処置は、ホスト被検者の免疫細胞やニッチ細胞を効果的に死滅させ、多重臓器系に悪影響を及ぼし、しばしば生命を脅かす合併症を引き起こす。例えば、近年の遺伝子編集法の進歩により鎌状赤血球症の遺伝子改変幹細胞の開発が可能になった一方で、過酷な前処置レジメンを含む現在の治療法は成功しないことが証明されており、患者は癌(二次性悪性腫瘍など)や不妊症などの寿命を脅かすまたは長期の合併症を発症している。このように、HSCは著しい治療の可能性を持っているが、そのような限界がクリニックでの使用を妨げている。
現在、移植後の患者において、HSCおよびその修正または改変された遺伝子の多能性および造血機能性が保存されるように、遺伝子改変HSC移植片の生着を促進する手法が必要とされている。
分野
本開示は、血病、代謝障害、ガン、自己感染症などの様々な病理に苦しむ患者の治療のための遺伝子改良幹細胞の使用に関するものであり、特に、ADCが血液細胞および/または自己細胞上で分子(例えばCD117またはCD45)を結合することができる、ADCを用いたコンディショニング法に関連するものである。
ここに記載されているのは、幹細胞遺伝子治療法であり、それを必要とする被検者に遺伝子改良幹細胞を行使する手法と、それを必要とする、抗薬物活用法(ADC)を含む調整手法とを併せて構成する。ここに記載されているADCの抗生物質は、遺伝子組み換え幹細胞を移植する前に、内生の血液細胞及び/又は被検者の細胞の特定集団を対象とし、枯渇させる。
いくつかの態様において、本開示は、それを必要とするヒト被検者に遺伝子改変幹細胞を投与する方法であって、a)造血幹細胞(HSC)および/または免疫細胞上に発現される細胞表面分子に結合する抗体-薬物結合体(ADC)をヒト被検者に投与し、それによってヒト被検者からHSCおよび/または免疫細胞を枯渇させる工程、およびb)遺伝子改変幹細胞の集団を含むヒト被検者に移植を投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施例において、ADCは、枯渇するために、HSCおよび/または/またはレムセルに表される細胞表面分子に結合する。
いくつかの態様において、本開示は、遺伝子改変された細胞でヒト被検者を治療する手法を提供し、該手法は、遺伝子改変された幹細胞の集団を含む移植を、それを必要とするヒト被検者に投与することを含み、ヒト被検者は、造血幹細胞(HSC)および/または免疫細胞上に発現される細胞表面分子に結合する抗体-薬物結合体(ADC)を含むコンディショニング処理を受けた。
いくつかの実施形態において、遺伝子組み換え血幹は、自称血幹である。いくつかの実施形態において、遺伝子組み換え血幹は異性血幹である。
いくつかの実施形態において、遺伝子組み換え血幹はHSCである。
いくつかの実施形態において、遺伝子組み換え血幹はCD34+ HSCである。
いくつかの実施形態において、被検者は、がん、異常ヘモグロビン症障害、骨髄異形成障害、免疫不全障害、または代謝障害のいずれか1つまたは複数を患っている。
いくつかの実施形態において、異常ヘモグロビン症障害は、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ファンコニ貧血、再生不良性貧血、またはヴィスコット-オールドリッチ症候群のいずれか1つ以上から選択される。
いくつかの実施形態において、免疫不全疾患は、先天性免疫不全症または後天性免疫不全症である。
いくつかの実施形態において、後天性免疫不全症は、ヒト免疫不全ウイルスまたは後天性免疫不全症候群(AIDS)である。
いくつかの実施形態において、代謝障害は、糖原病、ムコ多糖症、ゴーシェ病、ハーラーズ病、スフィンゴ脂質症、球様細胞白質萎縮症、または異染性白質ジストロフィーのいずれか1つ以上から選択される。
いくつかの態様において、癌は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、または神経芽細胞腫のいずれか1つ以上から選択される。
いくつかの実施形態において、がんは、例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、または多発性骨髄腫から選択される血液がんである。
いくつかの実施形態において、被検者は、アデノシンデアミナーゼ欠損症、重度複合免疫不全症、高免疫グロブリンM症候群、チェディアック-東病、遺伝性リンパ組織球症、大理石骨病、骨形成不全症、蓄積症、サラセミアメジャー、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、または若年性関節リウマチのいずれか1つ以上から選択される障害を患っている。
いくつかの実施態様において、被検者は自治性障害に苦しんでいる。いくつかの実施形態において、自己免疫障害は、多発性硬化症、ヒト全身性ループス、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬の治療、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、バロ病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、慢性疲労免疫不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、クローン病、瘢痕性類天疱瘡-疱疹状皮膚炎、寒冷凝集素症、Degos病のいずれか1つ以上から選択される 円板状ループス、自律神経障害、本態性混合性クリオグロブリン血症、線維筋痛・線維筋炎、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、化膿性汗腺炎、特発性および/または急性血小板減少性紫斑病、特発性肺線維症、IgAニューロパチー、若年性関節炎、川崎病、ライム病、 メニエール病、混合性結合組織病、重症筋無力症、神経筋強直症、眼筋クローヌス症候群、視神経炎、オード甲状腺炎、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性軟骨炎、多発性筋炎・皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発腺性動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性無ガンマグロブリン血症、レイター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、硬直者症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、外陰部痛、慢性肉芽腫症、またはヴェゲナー肉芽腫症。
いくつかの実施例において、幹細胞の集団は、ターゲット遺伝子を変更するために遺伝子組み換えされてきた。いくつかの実施形態において、ターゲット遺伝子は、ベータ-グロビン、γ-グロビン、アデノシンデアミナーゼ、アリールスルファターゼA、WASp遺伝子、食細胞NADPHオキシダーゼ、ガラトシルセラミダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、ベータ-ヘキソサミニダーゼ、アルファ-Lイズロニダーゼ、ATMセリン/トレオニンキナーゼ、リボソーム成熟化タンパク質SBDS、またはCCR5の1以上から選択される。
いくつかの実施形態において、遺伝子組み換え幹細胞の集団からなる移植は、遺伝子組み換えシステムを用いて変更された。いくつかの実施形態において、遺伝子編集システムは、CRISPR/Casシステムである。
いくつかの実施形態では、ADCは、CD2、CD5、CD7、CD15、CD13、CD19、CD22、CD29、CD34、CD36、CD38、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD43、CD45、CD45RC、CD45RO、CD48、CD49b、CD49d、CD49f、CD50、CD53、CD64a、CD71、CD72、CD81、CD82、CD85A、CD90、CD99、CD104、CD105、CD109、CD110、CD111、CD114、CD115、CD123、CD124、CD126、CD131、CD135、CD137、CD138から選択される1つまたは複数の細胞表面分子に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。CD151、CD162、CD164、CD173、CD175、CD176、CD183、CD191、CD200、CD201、CD205、CD217、CD220、CD221、CD223、CD224、CD225, CD226, CD227、CD228、CD229、CD230、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD240、CD242、CD243、CD277、CD292、CD293、CD295、CD298、CD309、CD318、CD324、CD325、CD338、CD344、CD349、またはCD350。
いくつかの実施例において、ADCは、CD117を結合する、それらの抗原結合フラグメントを構成する。
いくつかの実施形態において、ADCは、被検者内のCD117+電池の集団を減少させるのに十分な量で管理される。
いくつかの実施形態において、CD117は、GNNK+ CD117である。
いくつかの実施例では、抗CD117の、又は抗原結合断片は、(a)SEQ ID NO: 31に示されたアミノ酸配列からなるCDR1領域、SEQ ID NO:32に示されたアミノ酸配列からなるCDR2領域、及びSEQ ID NO: 33に示されたアミノ酸配列からなるCDR3領域、並びにSEQ ID NO: 34に示されたアミノ酸配列からなるCDR1領域、及びSEQ ID NO:35に示されたアミノ酸配列からなるCDR2領域及びSEQ ID NO: 36に示されたアミノ酸配列からなるCDR3領域からなる軽鎖可変領域からなる。幾つかの実施例において、抗CD117の、又は抗原結合断片は、SEQ ID NO: 21に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:22に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 23に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 24に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメインからなるライトチェーン可変領域、及びSEQ ID NO:25に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、並びにSEQ ID NO: 26に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインを含む。幾つかの実施例において、抗CD117の、又は抗原結合断片は、SEQ ID NO: 41に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:42に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 43に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 44に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメインからなるライトチェーン可変領域、及びSEQ ID NO:45に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、並びにSEQ ID NO: 46に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインを含む。幾つかの実施例において、抗CD117の、又は抗原結合断片は、SEQ ID NO: 51に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1領域、SEQ ID NO:52に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 53に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 54に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメインからなる軽鎖可変領域、及びSEQ ID NO:55に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、並びにSEQ ID NO: 56に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる重鎖可変領域を含んでいる。
幾つかの実施例において、抗CD117の、又は抗原結合断片は、SEQ ID NO: 61に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:62に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 63に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 64に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメインからなるライトチェーン可変領域、及びSEQ ID NO:65に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン及びSEQ ID NO: 66に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなるライトチェーン可変領域を含んでいる。幾つかの実施例において、抗CD117の、又は抗原結合断片は、SEQ ID NO: 71に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:72に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 73に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 74に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメインからなるライトチェーン可変領域、及びSEQ ID NO:75に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン及びSEQ ID NO: 76に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなるライトチェーン可変領域を含んでいる。幾つかの実施例において、抗CD117の、又は抗原結合断片は、SEQ ID NO: 81に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:82に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 83に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 84に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメインからなるライトチェーン可変領域、及びSEQ ID NO:85に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン及びSEQ ID NO: 86に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなるライトチェーン可変領域を含む。幾つかの実施例において、抗CD117の、又は抗原結合断片は、SEQ ID NO: 11に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1領域、SEQ ID NO:12に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2領域、及びSEQ ID NO: 13に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3領域、並びにSEQ ID NO: 14に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1領域、及びSEQ ID NO:15に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2領域及びSEQ ID NO: 16に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3領域からなるライトチェーン可変領域を含んでいる。幾つかの実施例において、抗CD117の、又は抗原結合断片は、SEQ ID NO: 91に記載されたアミノ酸配列を含むCDR1領域、SEQ ID NO:92に記載されたアミノ酸配列を含むCDR2領域、及びSEQ ID NO: 93に記載されたアミノ酸配列を含むCDR3領域、並びにSEQ ID NO: 94に記載されたアミノ酸配列を含むCDR1領域を含むライトチェーン可変領域、及びSEQ ID NO:95に記載されたアミノ酸配列を含むCDR2領域及びSEQ ID NO: 96に記載されたアミノ酸配列を含むCDR3領域からなるライトチェーン可変領域を含む。幾つかの実施例において、抗CD117の、又は抗原結合断片は、SEQ ID NO: 101に示されたアミノ酸配列からなるCDR1領域、SEQ ID NO:102に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 103に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 104に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメインからなるライトチェーン可変領域、及びSEQ ID NO:105に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン及びSEQ ID NO: 106に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなるライトチェーン可変領域を含んでいる。いくつかの実施例では、抗CD117の、又は抗原結合断片は、SEQ ID NO: 245に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1領域、SEQ ID NO:246に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2領域、及びSEQ ID NO: 247に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3領域、並びにSEQ ID NO: 248に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1領域、及びSEQ ID NO:249に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2領域及びSEQ ID NO: 250に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3領域からなるライトチェーン可変領域を含む。
幾つかの実施例において、抗CD117の、又は抗原結合断片は、SEQ ID NO: 127に示されたアミノ酸配列からなるCDR1領域、SEQ ID NO:128に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 129に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 130に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメインからなる軽鎖可変領域、及びSEQ ID NO:131に示されたアミノ酸配列からなるCDR2領域及びSEQ ID NO: 132に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる重鎖可変領域を含んでいる。
いくつかの実施例では、抗CD117の、又は抗原結合断片は、(a)SEQ ID NO: 133に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1領域、SEQ ID NO:134に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 135に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 136に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1領域及びSEQ ID NO:137に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン及びSEQ ID NO: 138に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる重鎖可変領域を含んでいる。幾つかの実施例において、抗CD117の、又は抗原結合断片は、SEQ ID NO: 139に示されるアミノ酸配列からなるCDR1領域、SEQ ID NO:140に示されるアミノ酸配列からなるCDR2領域、及びSEQ ID NO: 141に示されるアミノ酸配列からなるCDR3領域、並びにSEQ ID NO: 142に示されるアミノ酸配列からなるCDR1領域及びSEQ ID NO:143に示されるアミノ酸配列からなるCDR2領域及びSEQ ID NO: 144に示されるアミノ酸配列からなるCDR3領域からなる軽鎖可変領域を含んでいる。
いくつかの実施形態において、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号29に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号30に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態において、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号19に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号20に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施例では、抗CD117の、又はその抗原結合断片は、第39章に記載されているアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、第40章に記載されているアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含んでいる。いくつかの実施形態において、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号49に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号50に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態において、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号59に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号60に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態において、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号69に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号70に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態において、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号79に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号80に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態において、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号10に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施例では、抗CD117の、又はその抗原結合断片は、SEQ ID NO: 89に記載されているアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 90に記載されているアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域からなる。いくつかの実施例では、抗CD117の、又はその抗原結合断片は、SEQ ID NO: 99に記載されているアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 100に記載されているアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域からなる。いくつかの実施形態において、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号243に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号244に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントは、1×10-2～1×10-3、1×10-3～1×10-4、1×10-5～1×10-6、1×10-6～1×10-7 または1×10～1×10-8 の解離速度(KOFF)を有する。
いくつかの実施例において、約100 nM以下、約90 nM以下、約80 nM以下、約70 nM以下、約60 nM以下、約50 nM以下、約40 nM以下、約30 nM以下、約20 nM以下、約10 nM以下、約8 nM以下、約6 nM以下、約4 nM以下、約2 nM以下、約1 nM以下、Bio-Layer Interferometry (BLI)アッセイにより判定された約1 nM以下のCD117を結合する。
幾つかの実施例において、それらの抗原結合フラグメントは、人間である。幾つかの実施例において、それらの抗原結合フラグメントは、無傷の抗原である。いくつかの実施例において、それの抗原結合フラグメントはIgGである。いくつかの実施例では、それらの抗原結合フラグメントはIgG1またはIgG4である。幾つかの実施例において、それらの抗原結合フラグメントは、モノクローン・ビーズである。
いくつかの実施例では、それらの抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO: 122及び/又はSEQ ID NO: 121に記載されているアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を有する重鎖不変領域を含む。
いくつかの実施例では、それらの抗原結合フラグメントは、D265C、H435A、L234AおよびL235Aからなる群から選択された少なくとも1つのアミノ酸置換からなるFc領域を構成する(EU指数による番号付け)。いくつかの実施形態において、Fc領域は、アミノ酸の置換D265C、L234AおよびL235A(EU指数による番号付け)からなる。
幾つかの実施例において、抗CD117の反抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO: 109に記載されたアミノ酸配列からなる軽い鎖と、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113及びSEQ ID NO: 114からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる重い鎖からなる。
幾つかの実施例において、抗CD117の、又は抗原結合断片は、SEQ ID NO: 115に記載されたアミノ酸配列からなるライトチェーンと、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119及びSEQ ID NO: 120からなるグループから選択されたアミノ酸配列からなる重鎖からなる。
幾つかの実施例において、抗CD117の反抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO: 284に記載されたアミノ酸配列からなる軽い鎖と、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 276、SEQ ID NO: 277及びSEQ ID NO: 278からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる重い鎖からなる。
いくつかの実施形態では、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントは、HC-CDR1、HC-CDR2、およびAb55、Ab54、Ab56、Ab57、Ab58、Ab61、Ab66、Ab67、Ab68、Ab69、Ab85、Ab86、Ab87、Ab88、Ab89、Ab77、Ab79、Ab81、Ab85、またはAb249の重鎖可変領域、ならびにLC--CDR1、LC-CDR2、ならびにAb55、Ab54、Ab56、Ab57、Ab58、Ab61、Ab66、Ab67、Ab68、Ab69、Ab85、Ab86、Ab87、Ab88、Ab87、Ab89、Ab77、Ab79、Ab81、Ab85、Ab81、Ab85、またはAb249の軽鎖可変領域からのLC-CDR3または可変領域配列を含む重鎖を含む。実施形態では、HC-CDR1、HC-CDR2、及びHC-CDR3からなる重鎖可変領域、又はSEQ ID NO: 147、164、160、172、176、178、180、185、189、191、195、197、201、202、206、202、214、216、220、224、226、238、又は243の可変領域、並びにLC-CDR3又はSEQ ID NO: 148、149、150、151、153、154の軽鎖可変領域からなる 162、169、167、167、161、177、169、182、189、182、198、198、200、203、207、211、215、219、221、225、228、229、231、233、234、236、239、241、244。
いくつかの実施形態において、ADCは、式Ab-(Z-L-Cy)nで表され、式中、Abは、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、Lは、L上に存在する反応性置換基Z'と、その抗体または抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基との間のカップリング反応によって形成される化学部分であり、Cyは、アマトキシン、シュードモナス外毒素A、ジフテリア毒素、サポリン、メイタンシノイド、ピロロロベンゾジアゼピン二量体、インドリノベンゾジアゼピン二量体、インドリノベンゾジアゼピン偽ジマー、カリケアマイシン、アウリスタチン、およびアントラサイクリンからなる群から選択される細胞毒であり、nは、約1～約20の整数である これは、抗体あたりの細胞毒の平均数を表します。いくつかの実施形態において、nは、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、または約20の整数である。いくつかの実施形態において、nは2である。
いくつかの実施形態において、細胞毒素はアマトキシンである。
いくつかの実施形態において、ADCは式(I)で表される。
[化１]
記
Q は-S-, -S(O)-, または-SO2 -;
R1はH、OH、ORA、またはORD;
R2はH、OH、ORB、またはORD;
RA とRBは、もし存在するなら、それらが結合している酸素と結合して、任意に置換された5-族のヘテロシクロアルキル基を形成する。
R3はH、RC、またはRD;
R4はH、OH、ORC, ORD, RC、またはRD;
R5はH、OH、ORC, ORD, RC、またはRD;
R6はH、OH、ORC, ORD, RC、またはRD;
R7はH、OH、ORC, ORD, RC、またはRD;
R8はOH、NH2, ORC, ORD, NHRD、またはNRC RD;
R9はH、OH、ORC、またはORD;
R Cは、C 1 -C 6のアーキテクル、C 1-C 6のアルキネル、C 2 -C 6のアルキニール、ヘテロアルキニール、シクロアルキニール、C 1 -C 6のアルキニール、C 2-C 6のアルキニール、ヘテロアルキニール、C 2 -C 6のアルキニール、シクロアルキニール、C 2 -C 6、またはヘテロアルキニールの各々が、1～5個の代替物で任意に置換されてもよい。
これらの代替物は、アルキニール、アルキニール、シクロアルキ、アルキアリール、ヘテロアルキニール、アルキアリール、アノニュ、アンモニア、アシル、アサイロアルカミノ、アルカノニル、アルカノニル、アルカミノ、アルカム、C 2 -C 6、アルカム、スルホニール、アルカニール、アルカニール、アルファジー、トリハローム、シアノ、キャプト、である。
RDは-L-Z-Abであり、式(I)のADCは正確に1つのRD代数を含む。
Lは、1～6の整数であるヒドラジン、ジスルフィド、チオエーテル、アミノ酸、10個までのアミノ酸からなるペプチド、p-アミノベンジル(PAB)基、複素環式自己不溶性基、C 1 -C 6 アルキル、C 1 -C 6ヘテロアルキル、C 2-C 6アルケニル、C 2 -C 6 ヘテロアルケニル、C 2 -C 6 アルキニル、C 2-C 6 ヘテロアルキニル、C 3 -C 6 シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、-(C=O)基、-C(O)NH基、-OC(O)NH基、または-(CH 2 CH 2 O)-基のうちの1つまたは複数を含む。
ここで、各々のC1-C6 アルキル、C1 -C6ヘテロアルキル、C2 -C6アルケニル、C2-C6 ヘテロシクロアルキル、ヘテロアルキニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルカリ、アミノ、アンモニウム、アシルオキシ、アシルアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルホニル、ヒドロキシル、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプトからなる群から独立して選択される1～5個(例えば、1、2、3、4、または5個)の置換基で置換されていてもよい およびニトロ;ならびに、O、SおよびNから選択される1つまたは複数のヘテロ原子によって、それぞれのC1 -C6 アルキル、C1-C6ヘテロアルキル、C2 -C6 ヘテロアルケニル、C2 -C6 アルキニル、C2-C6 ヘテロアルキニル、C2 -C6 シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基を遮断してもよい。
いくつかの実施形態では、式(I)のADCは式(Ia)で表される。
[化２]
ここで、Q、R1 -R9, RA, RB, RC, RD、L、およびZのそれぞれは、公式(I)に対して先に定義されたとおりである。
いくつかの実施形態において、R1は、ORA ; R2は、ORBであり、RA およびRBは、それらが結合されている原子と共に、形成するために結合される。
[化３]
記
OBC=S)-, -(C=NH)-, -(CH)2、およびCRE RE’-(CH)RE’は、それぞれ独立に、H、C1-C6アルキレン、シクロアルキレン、-RD、アルキレン、-RD、およびヘテロアルキレンから選択され、ここで、前記-RD, C2 -C6アルキレン、ヘテロアルキレン、-RD, C2 -C6アルキレン、-RDアルキニレン、ヘテロアルキレン、REシクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、またはヘテロアルキレンは、それぞれ、1～5(例えば、1、2、3、4、または5)の代替案が、アルキニール、アルキニール、シクロアルキニール、アルキニール、アルキニール、アルキニール、ヘテロアルキニール、アルキニール、アルキニールからなる群から選択されてもよい。
ある実施態様において、Yは、次の公式で表されるC=Oである。
[化４]
いくつかの態様において、リンカーは、ペプチド、オリゴ糖, -(CH2)p -, -(CH2 CH2O)p -, -(C=O)-, -(C=O)(CH2)p-、PAB、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、またはAla-PABのうちの1つまたは複数を含み、ここでpは1～6(例えば、1、2、3、4、5、または6幾つかの実施例において、リンカーは、次の公式で表されるPAB-Ala-Val-プロピオニールを含む。
[化５]
いくつかの実施形態において、リンカーは、次の公式で表されるPAB-Cit-Val-プロオニールを含む。
[化６]
いくつかの実施形態において、L-Z-Abとしてまとめられたリンカー-Abnygateは、以下の構造を有する。
[化７]
ここで、Sは、その抗原結合フラグメントの中に存在する反応性代替物を表す硫黄原子である。
いくつかの実施形態において、L-Z-Abは、以下の構造を有する。
[化８]
ここで、Sは、その抗原結合フラグメントの中に存在する反応性代替物を表す硫黄原子である。
いくつかの実施形態において、公式(Ia)のADCは、以下から構成される群から選択される。
[化９]
図1Aと図1Bは、Celltiter Gloによる発光(RLU)で測定されるかすみ‐1細胞生存性を示す防CD117 ADCまたは制御濃度の機能として、体内細胞殺菌アッセイの判定をグラフィックに描写したものである。Ab54(図1A)、Ab55(図1A)、Ab56(図1A)、Ab57(図1A)、Ab58(図1A)、Ab61(図1A)、Ab66(図1B)、Ab67(図1B)、Ab68(図1B)、Ab69(図1B)の結果を示す。 図2は、イチジクに描かれた体内電池殺処分法における殺処分曲線下の面積の定量化を図に描いたものである。 CD117-ADCが一次ヒトおよび非ヒト霊長類(NHP) CD34+細胞に対して強力であり、HSCに対して選択的であることを示す。図3は、ヒトおよび非ヒト霊長類(NHP) HSCsを用いたin vitro cell killingアッセイの結果を図示している。これは、CD117 ADCがヒト同質型およびNHP同質型制御と比較して、HSCsおよび前駆細胞を効率的に枯渇させることを示している。 図4は、フローサイトメトリーを用いて分析されたアカゲザルに投与されたCD117-ADCの単回投与の結果を記述し、リンパ球が維持されている間に有意なHSC枯渇を示す。CD117-ADCが一次ヒトおよび非ヒト霊長類(NHP) CD34+細胞に対して強力であり、HSCに対して選択的であることを示す。 データは、CD117-ADCの単回投与が、投与の7日後に骨髄において有意なコロニー形成細胞枯渇をもたらすことを実証した(図5)。CD117-ADCが一次ヒトおよび非ヒト霊長類(NHP) CD34+細胞に対して強力であり、HSCに対して選択的であることを示す。 図6は、投与後数日以内のグラフト注入を可能にするCD117-ADCの迅速なクリアランスを図示する。CD117-ADCが一次ヒトおよび非ヒト霊長類(NHP) CD34+細胞に対して強力であり、HSCに対して選択的であることを示す。 は、CD117-ADCが、Rh霊長類における自己遺伝子改変移植療法を可能にするのに十分であることを示す。図7Aは、(sinlge-dose)投与CD117 ADC条件付け霊長類における遺伝子標識自家移植の治療スキームを示す。図7Bは、ブスルファンの多層線量管理のための治療計画を示している。 図8は、移植後の日数の関数として、CD117 ADC がニュートロフィル・カウント(103/マイクロル)を1回の線量で投与した結果を図示している。CD117-ADCが、Rh霊長類における自己遺伝子改変移植療法を可能にするのに十分であることを示す。 図9は、移植後の日数の関数として、CD117 ADCを1回使用した場合の血小板数(105/mmull)の結果を図表化したものである。CD117-ADCが、Rh霊長類における自己遺伝子改変移植療法を可能にするのに十分であることを示す。 図10は、移植後の日数の関数として、CD117 ADCを1回投与して細胞数(103/mmul)を計算した結果を図示したものである。CD117-ADCが、Rh霊長類における自己遺伝子改変移植療法を可能にするのに十分であることを示す。 図11は、移植後の日数の関数としての周顆粒球β-グロビンベクターコピー数(VCN)を示すアッセイの結果をグラフで示す。データは、周辺グラニュロサイトベクトルコピー数が時間とともに安定であり、ブスルファン条件付けの歴史的データに匹敵することを示した。シェードボックスは、バスルファンのコンディショニングを使用したVCN レンジを表す。CD117-ADCが、Rh霊長類における自己遺伝子改変移植療法を可能にするのに十分であることを示す。 図12は、移植後の機能日数としてアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)レベル(U/L)を示すアッセイの結果をグラフに示す。
ここに記載されているのは、遺伝子組み換え幹細胞(例えば、数学的幹細胞)の集団から成る移植を、それを必要としている被検者に実施する方法を含む、幹細胞遺伝子治療を提供する方法である。遺伝子組み換え幹細胞は、調整処理を受けた被検者に管理される。調整処理は、被検者から特定の集団の内生の血液細胞および/または/または自己の細胞をターゲットとし、枯渇させる、抗たん薬の活用法である。本稿に述べるように、遺伝子組み換え血幹は、治療を必要とする被検者に欠陥遺伝子(例えば、遺伝子障害を引き起こす遺伝子のミュータント)を補正するために使用することができる。本開示は、幹細胞遺伝子治療と、接木を強化し、それによって遺伝子補正を可能にする条件付け法を組み合わせる手法を提供する。
一例として、鎌状赤血球貧血患者由来の自己幹細胞を、エクスビボで欠陥遺伝子(例えば、βグロビン遺伝子の突然変異-HBB遺伝子)を修正するために遺伝子改変し、患者に投与することができる。遺伝子組み換え細胞の種々の方法(例えば、遺伝子編集)が知られており、当技術において入手可能であり、例えば、亜鉛の指核(例えば、米国9,834,787)、エフェクター核のような書き換え活性化剤(TALEN)、ウイルスを媒介とした遺伝子編集、又はCRISPR/Casシステム(例えば、US 2019/0010495 A1)を含む。さらに、種々の遺伝子組み換え血幹が本技術に知られており(例えば、Yongら「遺伝子組み換え細胞治療における最近の課題と進歩」J. Pharm. Investig. 48(2):199-208、2018、および本技術に含まれる引用文献を参照のこと)これらのどれも本技術に使用することができる。
本開示で使用するADCは、造血幹細胞および/または免疫細胞上の特定の分子、例えば、CD2、CD5、CD13、CD22、CD30、CD34、CD36、CD42a、CD42c、CD43、CD45RA、CD45RC、CD45RO、CD47、CD49b、CD49e、CD49f、CD50、CD55、CD68、CD72、CD81、CD85A、CD90、CD104、CD105、CD109、CD111、CD114、CD117、CD123、CD126、CD127を標的とすることができる CD131、CD133、CD135、CD138、CD151、CD157、CD162、CD168、CD172a、CD173、CD174、CD175、CD176、CD183、CD200、CD201、CD205、CD221, CD222, CD223, CD224, CD225, CD226, CD227, CD228, CD229, CD230, CD235a, CD235b, CD236, CD236R, CD238, CD240, CD242, CD243, CD252, CD277, CD292, CDw293, CD295, CD298, CD309, CD318, CD324, CD325, CD338, CD344, CD349、またはCD350。例えば、ここに記載されているADCは、ヒトCD117に結合する、分離された抗CD117ヒト抗。また、ヒトCD45に結合する、分離された抗CD45ヒト・抗CD45からなるADCがここに記載されている。ここに提供された抗生物質は、遺伝子組み換え幹細胞移植のためのヒト患者のコンディショニング方法を含む、それらを治療に有利なものにする多くの特性を有している。例えば、ここに開示された抗生物質は、rhesus CD117と相互作用し、内部化することができる。これらの特徴はまた、細胞毒素をCD117表現電池に送るための活用にも有益である。
ここに記載されている抗生物質には、敵対的な抗生物質と中性の両方が含まれる。具体的には、ヒトCD117の外部ドメインに特異的に結合する各ヒト抗CD117抗体である抗CD117抗体54(Ab54)、抗体55(Ab55)、抗体56(Ab56)、抗体57(Ab57)、抗体58(Ab58)、抗体61(Ab61)、抗体66(Ab66)、抗体67(Ab67)、抗体68(Ab68)、および抗体69(Ab69)が本明細書に提供される。Ab54、Ab55、Ab56、Ab57、Ab58、Ab61、Ab66、Ab67、Ab68、およびAb69の結合領域を、表9を含めて以下に記載する。ここに開示される抗CD117抗生物質は、抗CD117(ADCs;ここでは、活用物としても言及される)抗CD117(抗CD117)薬物活用体に含まれることができる。
ここに記載されるADCを含む調整方法(例えば、抗CD117又は抗CD45の薬物活用者(ADCs))と組み合わせた遺伝子改良血幹は、血液系の細胞型の病気、ガン、自己防御病、代謝障害、血幹障害など、様々な障害を治療する方法で使用することができる。ここに記載されたADC組成及び方法は、移植した細胞が住むことができるニッチを提供することによって移植した遺伝子改良型の血液細胞の接木を促進するために、内生の血液細胞の集団を減少させる。前記の活動は、血液細胞によって表現される抗原(例えば、CD117またはCD45)に結合することができるADC、抗原、またはそれらの抗原結合フラグメントの投与によって達成することができる。この投与は、内因性造血幹細胞の集団の選択的枯渇を引き起こすことができ、それにより、移植された、遺伝子的に改変された造血幹細胞によって引き続いて充填され得る、骨髄のような造血組織における空洞を作り出すことができる。この選択的消耗は「条件づけ」とも呼ばれる。本方法は、一部、ADC、抗物質又はその抗原結合フラグメント、例えばCD117(GNK+ CD117のような)、又はCD45が、患者に条件剤として施されることができるという観察に基づいている。例えばCD117またはCD45を結合するADC、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、癌性細胞または自己免疫細胞の集団を直接枯渇させるために、白血病、または自己免疫疾患などの癌に罹患している患者に投与することができ、また、移植された上記改変造血幹細胞の生存および生着能を促進するために、造血幹細胞上記治療を必要とする患者に投与することができ、それにより、移植後の患者において、修正された上記または改変された上記が確実に保存されるようにすることができる。
例えば、防CD117または防CD45 ADCの投与による遺伝子改変造血幹細胞移植の生着は、様々な経験的測定において顕在化し得る。例えば、移植された遺伝子的に改変された造血幹細胞の生着は、本明細書に記載されているADCの投与およびその後の遺伝子的に改変された造血幹細胞移植の投与に続く患者の骨髄内に存在する競合的再増殖単位(CRU)の量を評価することによって評価することができる。さらに、蛍光、発光、または発光産物を産出する化学反応を触媒する遺伝子のようなレポーター遺伝子を、遺伝子改良された数学的幹細胞を含む生着が生着されたベクトルに組み入れ、その後、生着された数学的幹細胞が骨髄のように戻された組織における対応する信号を監視することによって、遺伝子改良された数学的幹細胞生着の接木を観察することができる。また、例えば、当業者に知られている蛍光活性細胞分類(FACS)分析法によって決定されるように、血液細胞および前駆細胞の量および生存率の評価によって、血液細胞生着を観察することもできる。生着はまた、移植後期間中の末梢血中の白血球数を測定すること、および/または骨髄吸引試料中のドナー細胞による骨髄細胞の回収を測定することによって決定することができる。移植はまた、訂正されたあるいは変化された遺伝子配列の存在を検出することによっても決定される。例えば、鎌状赤血球症の治療において、修正されたHBB遺伝子配列の存在を検出することによって生着を決定することができる。
以下のセクションは、ADC、抗体、またはその抗原結合フラグメント、および癌もしくは自己免疫疾患に罹患している患者、または遺伝子改変造血幹細胞移植片の生着を促進するために造血幹細胞移植療法を必要とする患者などの患者に投与することができる遺伝子改変幹細胞、ならびに患者にそのような治療薬を投与する方法(例えば、遺伝子改変HSCの調整および投与)の説明を提供する。
定義
本明細書で使用される「約」という用語は、記載される値よりも10%上または下の値を指し、例えば、「約5 nM」という用語は、4.5nM～5.5 nMの範囲を示す。
ここで用いられるように、「抗菌」という用語は、特定の抗原に特別に結合するか、あるいは、特定の抗原に対して反応性である、イムグロブリン分子を意味する。抗体は、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、多特異的抗体(例えば、二重特異性抗体)、遺伝子操作された、および他に修飾された形態の抗体を含み、これらに限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体(例えば、ビトリおよびクアッド特異的抗体、ジアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ)、および抗体フラグメント(すなわち、抗体の抗原結合フラグメント)(例えば、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rlgG、およびscFvフラグメントを含む)は、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、含む。
「モノクローナル・アブ」という用語は、無傷の分子と、目的タンパク質に特別に結合することが可能な(たとえば、FabやF(ab')2の断片などを含む)2の断片の両方を含むことを意図したものである。モノクローン(monoclonal)とは、単一のクローンに由来し、当該技術で入手可能または知られている何らかの方法で、ハイブリドマテクノロジーによって生成される抗物質に限定されないものをいう。本開示で有用なモノクロナル抗生物質は、ハイブリドマ、組み換え、ファージディスプレイ技術の使用、またはそれらの組合せを含む、本技術に知られている広範な技術を用いて調製することができる。本項で使用するように、Fab及びF(ab')2断片は、無傷の抗菌のFc断片を欠いている抗菌断片を指す。これらの断片の実施例は本稿に記載されている。
本開示の抗生物質は、通常、分離されているか、組換えされている。ここでいう「分離された」とは、一般的に、ポリペプチド、例えば、それが表現された細胞又は細胞培養特定され、分離され、又は回収された、又は/又は回収された、ポリペプティドのことを指す。通常、分離された反対者は少なくとも1つの精製工程によって準備される。従って、「分離された反対者」とは、実質的に異なる抗原性を有する他の反対者を含まない反対者を指す。たとえば、CD117に特別に結合する単離された抗生物質には、CD117以外の抗原を特別に結合する抗物質は実質的に含まれていない。
ここで用いられている「抗原結合断片」という用語は、標的抗原に特殊に結合する能力を指し、抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実行できる。たとえば、Fab, F(ab')2、scFv, diabody,Affibody,ナノボディ、aptamer、あるいは抗体である。抗体の「抗原結合断片」という用語に含まれる例としては、(i)VL, VH, CLとCH 1ドメインから成る単価断片、(ii)ヒンジ領域でディスフル化橋によって結ばれる2価なFab断片、(iii)VHとCH 1ドメインから成るFv断片、(iv)単一アームから成るFv断片(vi)VH領域からなるdAb断片(例えば、VHとVL領域からなるdAb)、(v)CH領域からなるdAb断片(例えば、Ward et al., Nature 341:544-546, 1989を参照)、(vii)VHまたは2 領域からなるdAb、(viii)孤立補完決定領域(CDR)、(ix)2つ以上の結合(例えば、2、3、4、5、6)合成リンカーによって任意に結合される可能性のある2つ以上の単独CDRの組合せ。さらに、Fvフラグメントの2つの領域、VLとVHは別個の遺伝子によってコード化されているが、それらは再結合法を用いて結合することができる。それはリンカーであり、VLとVH領域が一価分子(scFvとして知られている)を形成するための単一のタンパク質チェーンとして作られることを可能にする。たとえば、Bird et al., Science 242:423-426, 1988, and Huston et al., Procを参照。Natl.アカド。科学アメリカ85:5879-5883, 1988).これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を使用して得ることができ、断片は、無傷の抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングすることができる。アンチゲン抗原結合フラグメントは、組換えDNA技術、無傷のイムノ免疫グロブリンのエンザイマティックまたは化学的な割断、または、ある場合には、当業者に知られている化学ペプチド合成手順によって作り出すことができる。
ここで用いられるように、「抗CD117」又は「CD117に結合する抗菌」という用語は、CD117を標的とする際に診断及び/又は治療剤として有用であるような十分な親和性をもってCD117に結合することができる抗菌を意味する。ヒトCD117の2つの主要な同位体のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 145(同質体1)とSEQ ID NO: 146(同質体2)に示されている。
ここで用いられるように、「抗CD45」又は「CD45に結合する」という用語は、CD45を標的とする際に診断及び/又は治療剤として有用であるような十分な親和性をもってCD45に結合することができる。
ここで用いられるように、「抗CD2 bid」又は「CD2に結合する抗CD2 ADC」又は「CD2に結合するADC」という用語は、CD2がT細胞のような細胞表面上に発見されるように、ヒトCD2に特定的に結合するADCを意味する。
ここで用いられるように、「CD5と結合する抗CD5」又は「CD5と結合する抗CD5」又は「CD5と結合するADC」という用語は、CD5がT細胞のような細胞表面上で発見されるように、ヒトCD5と具体的に結合するADCを意味する。
ここで用いられるように、「抗CD137」又は「CD137に結合する」という用語は、CD137を標的とする際に診断及び/又は治療剤として有用であるような十分な親和性をもってCD137に結合することができる。
本明細書で使用される用語「二重特異性抗体」は、同一または種々の抗原上にあり得る少なくとも2つの種々の抗原または2つの異なるエピトープに結合することができる抗体、例えばモノクローナル抗体、しばしばヒトまたはヒト化抗体を指す。たとえば、結合特異性の1つは、CD117(例えばCD117、GNK+ CD117のようなCD117)またはCD45のような血液細胞表面抗原上のエピトープに向けられることができ、もう1つは、細胞成長を強力にするシグナル伝達経路に関与するレセプターまたはレセプターサブユニットのような、異なる血液細胞表面抗原または他の細胞表面タンパク質上でエピトープを特別に結合することができる。いくつかの実施形態において、結合特殊性は、同じ標的抗原上のユニークで重複していないエピトープ(すなわち、バイパラトピック・ビーズ・ビー・アフィンチ)に向けることができる。
ここで用いられるように、「相補性決定領域」(CDR)とは、液体の軽鎖および重鎖の両方に見いだされる超可変領域を指す。様々なドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域(FRs)と呼ばれます。超可変領域を描写するアミノ酸位置は、当該技術における既知の文脈及び種々の定義に応じて変化し得る。可変ドメイン内のいくつかの位置は、異なる一連の基準の下では超可変ドメイン外であるとみなされる一方で、これらの位置は1組の基準の下で超可変ドメイン内であるとみなすことができる、というハイブリッド超可変位置とみなすことができる。これらの位置のうちの1つ以上は、拡大超可変領域にも見いだすことができる。ここに記載されている抗生物質は、これらのハイブリッド・ハイパーバリアブル・ポジションの変化を含んでいる可能性がある。固有の重鎖とL鎖の可変ドメインは、それぞれ4つの骨格領域を含んでおり、主に3つのCDRで結ばれたベータシート構造を採用しており、一部のは接続ループを形成し、場合によってはベータシート構造の一部を形成している。各チェーンのCDRは、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の骨格領域によって密接に結びついており、また、他の抗生物質チェーンからのCDRと共に、抗物質の標的結合サイトの形成に寄与する(Kabatら、参照、国立健康研究所、Bethesda、MD、1987)。特定の実施形態では、別途記載のない限り、カバトらの(IMGT及びチョチアに限定されないが、いずれかの抗菌番号付けづけスキームを使用することができるが)、イムグロブリンアミノ酸残基物の番号付けづけが、イムグロブリンアミノ酸残基物番号付けづけシステムに従って行われる。
ここで用いられるように、「条件」及び「条件付け」という用語は、患者が移植を受け入れるために準備される処理又は処理、例えば、遺伝子改良された数学的幹細胞(HSCs)を含む移植を意味する。そのような手順は、造血幹細胞移植の生着を促進する(例えば、コンディショニング手順およびその後の造血幹細胞移植に続いて患者から単離された血液サンプル内の生存可能な造血幹細胞の量の持続的増加から推測される)。ここに記載される方法によれば、患者は、CD117(例:GNK+ CD117)やCD45のような、数学的幹細胞または/または防除細胞によって表現される抗原に結合することができるADCの患者に投与することにより、遺伝子改良型HSC移植治療のための条件づけを受けることができる。本明細書に記載されるように、抗体は、薬物-抗体結合体(抗体薬物結合体(ADC)とも呼ばれる)を形成するように、細胞毒素に共有結合的に結合され得る。血液細胞移植(HSCT)治療を必要とする患者に本書で開示されたHSC表明抗原の1つ以上を結合することができるADC、抗原、又は抗原結合断片の投与は、例えば内生HSCを選択的に減少させることにより、HSC接木を促進し、それによって遺伝子改良HSC移植によって埋め尽くされる空きを作り出すことができる。
ここで用いられるように、「接合体」、「啓発剤」又は「薬物抗原体」又は「ADC」という用語は、細胞毒素と結びついている、自己又はそのフラグメントを意味する。ADCは、抗原結合フラグメントの反応性機能群と、ここに述べた細胞毒素のような別の分子の適切に反応性のある機能群との間の化学的結合によって形成される。共役には、例えば、抗菌と細胞毒素の間のように、互いに結合した2つの分子間のリンカーが含まれることがある。接合体の形成に使用できるリンカーの実施例には、ペプチドを含むリンカー、実施例えば、天然に起きている、あるいはD-アミノ酸のような非自然に起きているアミノ酸を含むリンカーが含まれる。リンカーは、本技術に記載され、かつ本技術に知られている様々な戦略を用いて調製することができる。その中の反応性成分に応じて、リンカーは、例えば、加水分解、加水分解、酸性条件下の加水分解、基礎条件下の加水分解、酸化、ジスルフィド還元、核友性切断、または有機メタリック切断(例えば、Leriche et al., Bioorg. Med. Chem., 20:571-582, 2012を参照)によって切断することができる。上述したように、「コンジュゲート」(複合物を参照する場合)という用語は、ここでは、「ドラッグコンジゲート」、「ドラッグ・コンジゲート」、「抗ドラッグ・コンジゲート」、「ADC」とも同義に言及する。
ここで用いられるように、「カップリング反応」という用語は、それぞれの置換体に結合した分子断片を(例えば、同価に)結合する化学的水を形成するように、互いに反応するのに適した2つ以上の置換体が反応する化学反応を意味する。カップリング反応とは、当該技術に知られている、又は、ここに記載されている細胞毒素のような、細胞毒素である断片に結合した反応性代替物、又はその断片である抗原結合フラグメント、又は当該技術に知られている又はここに記載されているCD117(GNK+ CD117のような)を結合する特定の抗CD117(抗原結合フラグメント)に結合した抗反応性代替物を反応させる反応性代替物、又はその断片である抗原結合フラグメントを含む反応性代替物を含む。適当に反応性の代替物の例としては、求核剤/電友対(例えば、チオール/ハロアルキンペア、アミン/カルボニールペア、またはチオール/α、特に、非飽和カルボニールペア)、ジエン/ジエンフィルペア(例えば、アジド/アルキンペア、その他)などが含まれる。カップリング反応は、限定されるものではないが、チオールアルキル化、ヒドロキシルアルキル化、アミンアルキル化、アミン縮合、アミド化、エステル化、ジスルフィド形成、環状付加(例えば、[4+2] Diels-Alder環状付加、[3+2] Huisgen環状付加、とりわけ)、求核芳香族置換、求電子芳香族置換、および本明細書に記載される他の反応様式を含む。
ここで用いられる「CRU(競合的再パリング単位)」とは、in-vivo移植後に検出される長期接木細胞の測定単位を指す。
本明細書中で使用される「ダイアボディ」という語は、2つのポリペプチド鎖を含む二価抗体を意味し、ここで、各々のポリペプチド鎖は、同じペプチド鎖上のVHおよびVL領域の分子内会合を可能にするには短すぎるリンカー(例えば、5つのアミノ酸からなるリンカー)によって連結されたVHおよびVL領域を含む。この構成によって、各ドメインは別のポリペプチド鎖上の相補的なドメインと対になり、ホモジメリックな構造を形成することになる。従って、「トリアボディ」という用語は、ペプチド・チェーン3つを含む三価の抗性物質を意味し、それぞれは、同じペプチド・チェーン内でVHおよびVL・ドメインの分子内結合を可能にする非常に短いリンカー(例えば、1-2アミノ酸からなるリンカー)に結合した1つのVH領域および1つのVL領域を含む。その固有の構造に折り畳むために、このように構成されたペプチドは、通常、隣接するペプチド鎖のVHおよびVL領域を空間的に互いに近接するように位置付けるように三重化される(例えば、Holligerら、Proc. Natal. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993を参照)。
本明細書で使用される場合、「薬物対抗体比」または「DAR」は、結合体の抗体に結合した薬物、例えば、アマトキシンの数を指す。ADCのDARは1から8までの範囲があるが、それよりも高い負荷をかけることは、抗原上のリンク部位の数によっても可能である。ある実施例において、活用形は、1、2、3、4、5、6、7、または8のDARを有する。
本明細書で使用される場合、「内因性」という語は、ヒトのような特定の生物に自然に見出される、分子、細胞、組織、または臓器(例えば、造血幹細胞、または造血系列の細胞、例えば、巨核球、血小板、血小板、赤血球、マスト細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、ミクログリア細胞、顆粒球、単球、破骨細胞、抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Tリンパ球、またはBリンパ球)のような物質を記載する。
ここで使用されるように、「生着ポテンシャル」という用語は、そのような細胞が自然に循環しているか、移植によって提供されているかを問わず、組織を再現するための、血液細胞および前駆細胞の能力を指すために使用される。この用語は、細胞の組織への帰巣や、興味のある組織内での細胞の定着といった、接木を取り巻く、またはそれに至るすべての有害事象を包含する。生着効率または生着率は、当業者に知られているような、医学的に受け入れられるパラメータを用いて評価または定量化することができ、また、例えば、競合的な再パルピング単位(CRU)の評価を含むことができ、幹細胞が帰宅し、植え付けられ、生着された組織にマーカーを取り込みまたは表現することができ、あるいは病気の進行、血液系および前駆細胞の生存、または受領者の生存を通した被検者の進展を評価することができる。生着は、移植後の時期に末梢血中の白血球血球数を測定することによっても判定できる。生着はまた、骨髄吸引試料中のドナー細胞による骨髄細胞の回収を測定することによって評価することができる。
本明細書中で使用される「外因性」という用語は、ヒト患者のような特定の生物に自然には見出されない分子、細胞、組織、または臓器(例えば、巨核球、血小板、血小板、赤血球、マスト細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、ミクログリア細胞、顆粒球、単球、破骨細胞、抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Tリンパ球、またはBリンパ球のような、遺伝子改変造血幹細胞または造血系列の細胞)のような物質を記述する。ある実施態様において、被援助国の有機体、例えば被援助国の生体に外生的である物質は、その物質が由来する供与国の被検者のような供与国の有機体に自然に存在することができる。たとえば、同種異系細胞移植には、受け手には外生的であるが、受け手には固有の細胞が含まれている。いくつかの実施例において、自己ロゴ細胞移植は、受領者にとって外生的である遺伝子配列(例えば、受領者に存在した突然変異の補正によって)を含み、したがって、そのような自己ロゴ細胞移植は受領者にとって「外生的」である。外生物質とは、外部から生命体に、あるいはそこから抽出された培養物質に供給される物質をいう。
ここで使用する「Fc」、「Fc領域」および「Fc領域」という用語は、IgG分子のパペン消化により得られる結晶性フラグメントと相関するIgG抗菌分子の一部を指す。Fc領域は、ジスルフィド結合によって結合されたIgG分子の2つの重鎖のC-端子半分を構成する。それは抗原結合作用はないが、炭水化物潤沢を含み、FcRnレセプター(以下参照)を含む補完的およびFcレセプターの結合サイトを含む。例えば、Fc領域には、第二の定常ドメインCH2(例、IgG1のEU位置231-340の残余)と第三の定常ドメインCH3(例、ヒトIgG1のEU位置341-447の残余)が含まれる。ここで用いられるように、Fc領域または領域は「下ヒンジ領域」(例えば、IgG1のEU位置233-239の残渣)を含む。
Fcは、この領域、すなわち、この領域を、抗菌、抗菌断片、あるいはFc融合性たんぱく質という文脈において、単独で言及することができる。ポリモルフィスは、EUの位置270、272、312、315、356、358を含むが、限定されないFcドメインのいくつかの位置で観察されており、したがって、本技術で知られているインスタント適用に提示される配列と既知の配列とのわずかな差が存在することができる。したがって、「ワイルドタイプIgG Fc ドメイン」または「WT IgG Fc ドメイン」とは、自然に発生するすべてのIgG Fc 領域(つまりどんなアレル)を指します。ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4 の重鎖の配列は、いくつかの順序データベース(www.uniprot.org)で、加入数P01857 (IGHG1_HUMAN)、P01859 (IGHG2_HUMAN)、P01860 (IGHG3_HUMAN)、P01861 (IGHG1_HUMAN) で見つけることができます。「WT」領域の例は、SEQ ID NO: 122 (Fc 領域を含む鎖定常領域提供する) で提供される。
ここで用いられる用語「改良Fc領域」又は「改良Fc領域」は、1以上のアミノ酸の置換、削除、挿入又は改良を含むIgG Fc領域を指す。特定の態様において、変形IgG Fcドメインは、1以上のアミノ酸代替物を含まない野生型Fcドメインと比較して、FcガンマRおよび/またはC1qに対する1つ以上のアミノ酸代替物またはアブレーション結合親和性の減少またはアブレーション結合親和性をもたらす1つ以上のアミノ酸代替物を含む。さらに、Fc結合相互作用は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)および補体依存性細胞傷害(CDC)を含むが、これらに限定されない、様々なエフェクター機能および下流シグナル伝達イベントに必須である。従って、特定の態様において、変形したFcドメイン(例えば、接合性たんぱく質又は共役)を含む抗菌は、別の側面では同じアミノ酸配列を有するが、1以上のアミノ酸置換、削除、挿入又は変形、例えば、Fc領域内の対応する位置に天然に起こるアミノ酸残基を含む不変のFc領域を含まないようなものではない、少なくとも1つ以上のFc配位子(例えば、FcガンマRs)に対して変化した結合親和性を示すことができる。
様々なFc領域は、それらを構成するアミノ酸の改変によって定義される。Fc領域に関してここで議論したすべてのアミノ酸置換物について、数え方は常にカバトのようにEU指数に従う。したがって、例えば、D265Cは、EU位置265におけるアスパルチン酸(D)のFc変形例であり、親Fc領域に対してシスタイン(C)で置き換えられる。置換が提供される順序は、任意であることに注意されたい。
同様に、例えば、D265C/L234A/L235Aは、EU位置265(D～C)、234(L～A)、および、親のFcドメインに対する235(L～A)で代用した変形例Fcを定義する。変種は、EUアミノ酸の変位位置における最終アミノ酸組成によっても指定することができる。たとえば、L234A/L235Aミュータントは「LA」と呼ばれることができる。
さらに別の例として、E233P.L234V.L235A.delG236(236の削除)ミュータントは「EPLVLAdelG」と呼ばれることができる。また別の例として、I253A.H310A.H435Aミュータントは「IHH」と呼ばれることができる。置換が提供される順序は、任意であることに注意されたい。
ここで用いられる用語「Fcガンマレセプター」または「FcガンマR」は、IgGの抗タンパク質領域を結合し、FcガンマR遺伝子によってエンコードされる、種族のどれかを指す。ヒトにおいて、この家庭は、アイソフォームFcγRI(CD64)、Fcγリブ、およびFcγRIcを含むFcγRII(CD32)、アイソフォームFcγRIIa(アロタイプH131およびR131を含む)、FcγRIIb(FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む)、およびFcγRIII(アイソフォームFcγRIIIa (アロタイプV158およびF158を含む)およびFcγRIIIb (アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む)を含むFcγRII(CD64)、ならびにあらゆる未発見のヒトFcγRまたはFcγRアイソフォームまたはアロタイプを含む。FcガンマRは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含む、しかしそれに限らないあらゆる生き物から得られる。マウスFcガンマRには、FcガンマRI (CD64)、FcガンマRII (CD32)、FcガンマRII (CD16)、FcガンマRII-2(CD16-2)に限らず、未発見のマウスFcガンマRsまたはFcガンマR同型または同類型が含まれる。
ここで使用される「エフェクター関数」という用語は、FcレセプターとFcドメインの相互作用から結果生化学的事象を意味する。エフェクター関数には、ADCC、ADCP、CDCが含まれるが、これらに限定されない。ここで使用される「エフェクターセル」とは、1つ以上のFcレセプターを表現し、1つ以上のエフェクター関数を仲介する、イフェクターセルを意味する。エフェクター細胞は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、B細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、およびガンマデルタT細胞を含むが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むがこれらに限定されない任意の生物由来であり得る。
「サイレント」、「サイレンシング」、または「サイレンシング」という用語は、本明細書中で使用される場合、未修飾Fc領域を含む同一抗体のFcγRへの結合(例えば、BLIにより測定される、未修飾Fc領域を含む同一抗体のFcγRへの結合と比較して、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のFcγRへの結合の減少)に対して、Fcγ受容体(FcγR)への結合が減少した、本明細書中に記載される修飾Fc領域を有する抗体を指す。いくつかの態様において、Fcサイレンシング抗体は、FcγRへの検出可能な結合を有さない。改良されたFc領域を有する抗菌のFcimrRへの結合は、例えば、平衡法(例えば、ELISA;KinExA, Rathanaswamiら)に限定されないが周知の様々な技術を用いて決定することができる。分析生化学Vol.373:52-60, 2008; 2008年;または、ラジオエムアッセイ(RIA)、または、表面プラズモン共鳴アッセイまたはその他のキネティクスに基づくアッセイ(例えば、BIACORETM分析またはOctetTM分析(forteBIO))、および間接結合アッセイ、競争結合アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、ゲル電気泳動法およびクロマトグラフィー(例えば、ジェルフィルトレーション)などの他の方法による。これらおよび他の方法は、検討中の成分の一つまたはそれ以上のラベルを利用することができ、また/または、発色性、蛍光、発光、または同位体標識を含むが、それに限らない多様な検出方法を使用することができる。結合する親和性と運動学についての詳細な記述は、Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見られる。競合結合アッセイの一例は、増大する量の非標識抗原の存在下での標識抗原と目的の抗体とのインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含むラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する興味のある標本の親和性と結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によりデータから決定することができる。また、ラジオイムノアッセイを用いて、第二の抗菌剤との競合を判断することもできる。この場合、この抗原は、標識されていない第2のビーンズの増加量の存在の中で、標識化された複合物に接合された興味のあるビーンズと共にインキュベートされる。
ここで用いられるように、「非改良Fc領域を含む同一抗菌」という用語は、復唱されたアミノ酸の置換(例えば、D265C、H435A、L234Aおよび/またはL235A)が欠けているが、それ以外の場合には、それが比較されているFc改良抗菌と同じアミノ酸配列を有する。
「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」または「ADCC」という用語は、特定の細胞毒性細胞(例えば、主にNK細胞、好中球、およびマクロファージ)上に存在するFcレセプター(FcR)上に結合したFcドメイン、例えば抗体を含むポリペプチドを指し、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原ベアリング「ターゲット細胞」に特異的に結合し、続いてターゲット細胞を細胞毒素で殺すことを可能にする細胞毒性の形態を指す。
(Hogarth et al., Nature review Drug Discovery 2012, 11:313) 抗物質とそのフラグメントに加えて、Fc領域を含む他のポリペプチド、例えば、Fc融合タンパク質とFc結合たんぱく質であり、抗原ベアリングターゲット細胞に特別に結合する能力を有する他のポリペプチドが、細胞媒介の細胞毒性を作用させることができると考えられている。
単純化のために、Fc領域を含むポリペプチドの活性から生じる細胞媒介の細胞毒を、ここではADCC活性と呼ぶ。ADCCによって標的細胞の溶解を媒介する本開示の特定のポリペプチドの能力は、アッセイすることができる。ADCC活動を評価するために、興味のあるポリペプチド(例えば、抗菌剤)が、ターゲット細胞に、ターゲット細胞の細胞分解をもたらす、防除エフェクター細胞と組み合わせて、加えられる。細胞分解は通常、標識(たとえば放射性基質、蛍光染料、天然細胞内タンパク質)を分解した細胞から放出することによって検出される。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、周辺血液単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。in vitro ADCCアッセイの具体例は、Bruggemann et al., J. Expに記載されている。中央値。166:1351 (1987); (1987); Wilkinsonら、J. Immunol方法258:183 (2001); Patel et al., J. Immunol.方法184:29(1995)。別に、または、追加に、関心のADCC活性は、例えばClynesら、Procに開示されているような動物モデルにおいて、生体内で評価することができる。Natl.アカド。科学アメリカ95:652 (1998).
用語「全長抗体」および「インタクト抗体」は、本明細書中で、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すために交換可能に使用され、本明細書中で定義される抗体フラグメントではない。このように、IgG bidについては、無傷のAdfは可変領域、一定領域、Fc領域からなるそれぞれ2つの重鎖と、可変領域と一定領域からなるそれぞれ2つのL鎖からなる。より具体的には、無傷のIgGは、それぞれ軽鎖可変領域(VL)と軽鎖不変領域(CL)からなる2つの軽鎖からなり、それぞれ重鎖可変領域(VH)と3つの重鎖不変領域(CH1, CH2, CH3)からなる2つの重鎖からなる。CH2とCH3は重鎖のFc領域を表す。特定の実施形態では、幹細胞の表面に表される抗原と結合する無傷の抗原からなる本記載方法で使用されるADC、例えば、ヒトCD117(hCD117)またはヒトCD45(hCD45)。
ここで用いられるように、「骨格領域」又は「FW領域」は、抗原結合フラグメントのCDRに隣接するアミノ酸残留物を含む。FW領域残渣は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、Fab断片、一本鎖抗体断片、scFv断片、抗体ドメイン、および二重特異性抗体中に存在し得る。
また、ここに記載されたSEQ ID NOに記載された配列の「保守的な配列変更」、すなわち、核酸配列によってエンコードされた、あるいはアミノ酸配列を含む、抗原との結合を損なわないヌクレオチドおよびアミノ酸の配列変更も提供される。このような控えめな配列変化には、控えめなヌクレオチドとアミノ酸の置換、並びにヌクレオチドとアミノ酸の添加と削除が含まれる。例えば、現場指向の変調剤やPCRを媒介とした変調剤のような、本技術で知られる標準的な技術によって、ここに記載されるSEQ ID NOに変調を導入することができる。控えめな配列変化としては、控えめなアミノ酸の置換がある。この置換では、アミノ酸残基は、似たような側鎖をもつアミノ酸残基に置き換えられる。側鎖が類似しているアミノ酸残基のファミリーが本技術において定義されている。これらの家庭には、基礎的な側面鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側面鎖(例えば、アスパルチン酸、グルタミン酸)、非充電極性側面鎖(例えば、グリシン、アスパラジン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側面鎖(例えば、アラニン、バリン、レウシン、イソレウシン、プロリン、フェニーラニン、メチオニン)、ベータ枝状の側面鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソレウシン)、及び芳香族側面鎖(例えば、チロシン、フェニーラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。したがって、抗CD117抗体中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖家庭由来の別のアミノ酸残基で置き換えられる。抗原結合を除去しないヌクレオチドとアミノ酸の保守的な置換を同定する方法は、本技術でよく知られている(例えば、Brummellら、Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashiらを参照)。たんぱく園12(10):879-884 (1999); (1999)、Burksら進める。Natl.アカド。科学アメリカ94:41] (1997)).
ここで用いられるように、「半減期」とは、身体中の薬物のプラズマ濃度が、被検者、例えば、人間の被検者において1/2ないし50%減少するのに要する時間をいう。この50%の血清濃度低下は、薬物循環量を反映している。
ここで使用されるように、「幹細胞」という用語は、多能な幹細胞(例えば、数学的幹細胞)を意味する。この用語は、全能性または多能性幹細胞を指すこともできる。
本明細書中で使用される、用語「造血幹細胞」(「HSC」)は、自己複製し、顆粒球(例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球)、赤血球(例えば、網状赤血球、赤血球)、血小板(例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板)、単球(例えば、単球、マクロファージ)、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、およびリンパ球(例えば、NK細胞、B細胞およびT細胞)を含むがこれらに限定されない多様な系統を含む成熟血球に分化する能力を有する未成熟血球を指す。このような電池はCD34+電池を含むことができる。CD34+細胞は、CD34セル表面マーカーを表す未成熟細胞です。ヒトでは、CD34+電池は、上述の幹電池特性を有する電池の亜集団を含むと考えられているが、マウスでは、HSCはCD34-である。さらに、HSCは、長期再増殖HSC(LT‐HSC)および短期再増殖HSC(ST‐HSC)も指す。LT‐HSCsとST‐HSCsは、機能電位と細胞表面マーカー式に基づいて区別される。例えば、ヒトHSC は、CD34+、CD38-、CD45RA-、CD90+、CD49F+、lin(CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11B、CD19、CD20、CD56、CD235A を含む成熟した直線マーカーについては負の値です)。マウスにおいて、骨髄LT-HSCは、CD34-、SCA-1+、C-kit+、CD135-、Slamfl/CD150+、CD48-、およびlin(Ter119、CD11b、Gr1、CD3、CD4、CD8、B220、IL7raを含む成熟系統マーカーに対して陰性)であるのに対し、ST-HSCは、CD34+、SCA-1+、C-kit+、CD135-、Slamfl/CD150+、およびlin(Ter119、CD11b、Gr1、CD3、CD4、CD8、B220、IL7raを含む成熟系統加えて、ST‐HSCはホメオスタシス条件下でLT‐HSCよりも静止期が少なく、より増殖性である。しかしながら、LT-HSCはより大きな自己複製能を有する(すなわち、それらは成人期を通して生存し、連続した受取人を通して連続的に移植時間)のに対し、ST-HSCは限定された自己複製を有する(すなわち、それらは限られた期間のみ生存し、連続した移植能を有しない)。これらのHSCのどれも、ここに記載された方法で使用することができる。ST-HSCは、非常に拡散性があり、したがって、より迅速に差別化された子孫を生み出すことができるので、特に有用である。
本明細書中で使用される、用語「遺伝子改変血幹」または「遺伝子改変HSC」は、細胞のゲノム中のターゲット遺伝子を改変するように遺伝子編集を受けた、または外因性遺伝子または外因性遺伝子配列が細胞中で発現されるように改変された細胞または細胞を意味する。
ここで用いられるように、「ターゲット遺伝子」という用語は、遺伝子配列または血幹ゲノムの遺伝子配列の一部を意味する。いくつかの実施形態において、標的遺伝子配列はコーディング配列である。いくつかの実施例において、標的遺伝子配列は非コーディング配列である(例えば、規制配列)。いくつかの実施例において、標的遺伝子配列は、障害または病気を引き起こす非野生型遺伝子配列(例えば、突然変異)である。いくつかの実施形態において、ターゲット遺伝子を変更することは、例えば、1)ターゲット遺伝子配列の1つ以上の突然変化を訂正するための遺伝子編集システムの使用(例えば、コドン固有の編集、あるいは遺伝子の全体または一部の置換)、それによって遺伝子の機能を回復すること(例えば、機能性タンパク質または機能的規制配列を生成する)、2)機能的遺伝子配列(例えば、野生型または遺伝子の機能的変形例配列)を血幹ゲノムに挿入すること、3)機能的遺伝子(例えば、野生型または遺伝子の機能的変形例配列)の挿入および破壊(例えば、沈黙させること)を含む。遺伝子配列を補正し、又は/又は挿入するための種々の遺伝子編集システムが本技術で知られている。例として、鎌状赤血球症を引き起こすHBB遺伝子の1つまたは複数の突然変異は、突然変異の部位特異的編集、または遺伝子の全体または一部の置換によって修正することができる。一例として、突然変異体HBB遺伝子を遺伝子編集方法によってサイレンシングすることができ、機能的HBB遺伝子を血幹ゲノムに挿入することができる。いくつかの実施例では、標的遺伝子はワイルド型遺伝子(例、CCR5)であり、それは変形配列に置き換えることができ、あるいは変形配列をエンコードするように編集され、治療上の便益(例、HIV治療のためのCCR5(デルタ)32)を与える。
本明細書中で使用される「造血幹細胞機能電位」という用語は、1)顆粒球(例えば、前骨髄球、好酸球、好塩基球)、赤血球(例えば、網状赤血球)、血小板(例えば、巨核球、血小板)、単球(例えば、単球、マクロファージ)、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、およびリンパ球(例えば、NK細胞、B細胞およびT細胞)を含むが、これらに限定されない複数の異なる血液系統に分化する能力を指す、2)自己複製(母細胞として同等の電位を有する造血幹細胞の能力を指す、さらに、この能力は、枯渇することなく個々の寿命にわたって繰り返し生じ得ること、および3)移植レシピエントに再導入される造血幹細胞またはその後代の能力 それらは造血幹細胞ニッチに入り、生産的で持続的な造血を再確立する。
ここで用いられる「人間の抗菌」という用語は、ヒトジェルムラインのイグロブリン配列に由来する可変で一定の領域を有する抗性質を含むことを意図している。ヒトの抗菌は、ヒトジェルムラインのイグロブリン配列によってエンコードされていないアミノ酸残基(例えば、無作為またはサイト特有の遺伝子組換え中に導入されたか、あるいは生体内での遺伝子組換え中または体交代中に導入された)を含み得る。しかしながら、ここで用いられる「人間の抗菌」という用語は、マウスのような他の哺乳動物のゲルムラインに由来するCDR配列をヒトのフレームワーク配列に接ぎ木したものを含むことを意図していない。ヒトの抗菌は、ヒトの細胞(たとえば組み換え式)の中で、あるいは、機能的に再配置されたヒトの遺伝子(たとえば重鎖やL鎖)を表すことができる、ヒト以外の動物や原核あるいは真核細胞によって作り出すことができる。ヒトの抗たんぱく質が単一の鎖である場合、それは天然のヒトの抗たんぱく質には見られないリンカーペプチドを含むことができる。例えば、Fvは、重鎖の可変領域とL鎖の可変領域とを結びつける2～8のグリシンまたは他のアミノ酸残基のようなリンカーペプチドを含むことができる。このようなリンカーペプチドは、人間の起源であると考えられている。ヒト抗毒素は、ヒトのイムグロブリン配列から派生した抗菌ライブラリーを用いたファージディスプレイ法を含む、当業者に知られている種々の方法によって作ることができる。ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して作製され得る(例えば、PCT公開番号WO 1998/24893; WO 1992/01047; WO 1996/34096; WO 1996/33735;米国特許第5,413,923号;第5,625,126号;第5,633,425号;第5,569,825号;第5,661,016号;第5,545,806号;第5,814,318号;第5,885,793号;第5,916,771号;および第5,939,598号を参照のこと)。
「人間化された」とは、ヒト以外のイムノグロブリンに由来する最小限配列を含む「最小限・配列」をいうので、ヒト以外の(例えば、ムリン)の「人間化された」形態のアボディーは、ヒト以外のアーボンから派生した最小限配列を含むキメリック・アボディーである。FW領域のすべて、あるいはほぼすべてが、ヒト・ウィグロブリン配列のものである。一般的に、ヒト化された抗原は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変領域の実質的な全てを含み、CDR領域の全部または実質的に全てが非ヒトゲルウリンの領域に対応し、FR領域の全部または実質的に全てがヒトゲルウリン配列の領域である。ヒト化された抗原はまた、少なくとも、通常、ヒト・イムグロブリンのコンセンサス配列の、イムグロブリン定常領域(Fc)を構成することができる。
抗体のヒト化の方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Riechmannら、性質 332:323-7,1988;Queenらに対する米国特許第5,530,101号;第5,585,089号;第5,693,761号;第5,693,762号;および第6,180,370号; EP239400号; PCT公開第WO 91/09967号;米国特許に記載されている。No. 5,225,539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol.Immunol., 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot.エング7:805-814; Roguskaら、1994年、ProcNatl.アカド。科学91:969-973; 米国特許No.5,565,332。
本分野で使用されるように、遺伝子組み換え血液細胞移植を「必要としている」患者には、幹細胞障害、自己感染症、ガン、またはここに記載されている他の病理を有する患者と同様に、例えば、1種類以上の血球型に欠陥または欠陥を示す患者が含まれる。いくつかの実施形態において、遺伝子改変HSC移植を必要とする患者は、障害を引き起こす欠陥遺伝子(例えば、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ヴィスコット-オールドリッチ症候群、アデノシンデアミナーゼ欠損症)を有する患者を含む。造血幹細胞は、一般に、1)多分化能を示し、従って、次のように複数の異なる血液系統に分化することができる:顆粒球(例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球)、赤血球(例えば、網状赤血球、赤血球)、血小板(例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板)、単球(例えば、単球、マクロファージ)、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、およびリンパ球(例えば、NK細胞、B細胞およびT細胞)、2)自己複製能を有し、したがって、母細胞として同等の可能性を有する娘細胞を生じ得る、3)移植レシピエントに再導入され、その際、それらが造血幹細胞ニッチに帰着し、再生産的かつ持続的な造血を確立する能力。このようにして、造血幹細胞は、例えば標的遺伝子(例えば、突然変異遺伝子)を改変することによって、インビボでの細胞の欠損または欠損集団を再構成するために、造血系列の1つ以上の細胞型(例えば、突然変異遺伝子による)を欠損または欠損した患者に投与することができる。さらに、またはその代替として、患者は、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ファンコニ貧血、再生不良性貧血、およびヴィスコット-オールドリッチ症候群などの異常ヘモグロビン症(例えば、非悪性異常ヘモグロビン症)を患っていることができる。この被検者は、アデノシンデアミナーゼ重度複合免疫不全症(ADA SCID)、HIV/AIDS、異染性白質ジストロフィー、ダイアモンド-ブラックファン貧血、およびシュワックスマン-ダイアモンド症候群に罹患しているものであり得る。
被検者は、遺伝性の血液疾患(鎌状赤血球貧血など)または自己免疫疾患を有するか、またはその影響を受けている可能性がある。さらに、またはその代替として、被検者は、悪性腫瘍、例えば、神経芽細胞腫または血液癌を有するか、またはその影響を上記。例えば、被検者は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫を有することがある。いくつかの実施形態において、被検者は、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、または非ホジキンリンパ腫を有する。いくつかの実施形態において、被検者は骨髄異形症候群を有する。幾つかの実施例において、被検者は、硬皮症、多発性硬化症、陶器性大腸炎、クローン病、1型糖尿病、またはここに記載されている他の自己感染病理のような自己感染性の病気を有する。いくつかの実施形態において、被検者はキメラ抗原レセプターT細胞(CART)療法を必要としている。いくつかの実施形態において、被検者は代謝貯蔵障害を有するか、あるいはそうでなければ影響を受ける。被検者は、糖原病、ムコ多糖症、ハーラー病、スフィンゴ脂質症、異染性白質ジストロフィー、または本明細書に開示される治療および治療から有益であり得る任意の他の疾患または障害(限定されるわけではないが、重度複合免疫不全症、ウィスコット-オールドリッチ症候群、高免疫グロブリンM (IgM)症候群、チェディアック-東病、遺伝性リンパ組織球症、骨形成不全症、貯蔵疾患、サラセミア・メジャー、鎌状赤血球症、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、若年性関節リウマチ、またはそれらの疾患、または灰教育書籍、1:319-338(2000)、その開示は、造血幹細胞移植療法の投与によって治療され得る病態に関するものであるため、ここではその全体を引用して組み込む。
ここで使用される「中性の」とは、リガンドへのレセプターの結合または基質とのエンザイムの相互作用を含む、特定の、または特定の標的(例えばCD117またはCD45)の活動を著しく中和、遮断、抑制、阻害、破壊、縮小または妨害することができない、抗原結合フラグメントを指す。1つの実施形態において、中性の抗CD117検出法、又はそのフラグメントは、SCF依存性細胞の拡散を実質的に抑制せず、また、CD117に結合するSCFをクロスブロックしない反CD117検出法である。中性のAb67(またはAb67の結合領域を持つ)の実施例である。対照的に、「アンタゴニスト」抗CD117抗体は、SCF依存性増殖を阻害し、SCFのCD117への結合を遮断することができる。Ab55(またはAb55の結合領域を有する)は、アンタゴニストのAb55の実施例である。
ここで用いられる「受領者」という用語は、移植を受けた患者、例えば、遺伝子改良された数学的幹細胞の集団を含む移植を意味する。受領者に投与される移植細胞は、例えば、自家細胞、同系細胞、または同種異系細胞であり得る。ここで用いられるように、「供与者」という用語は、受取人に電池またはその子孫を投与する前に、1つ以上の電池から分離される人または動物を意味する。1つ以上の細胞は、例えば、数学的幹細胞の集団である。
ここで用いられるように、「オートロゴス」という用語は、同じ被検者から派生した被検者に移植される電池を意味する。ある場合には、自己細胞または細胞は、被検者に戻される移植の前に遺伝的に改変される。
ここでいう「同種」とは、細胞と遺伝子的に異なる同種の細胞、すなわち、異なった人間の被検者の細胞を指す。たとえば、ある人の被検者の細胞を、別の人の被検者に移植することができる。同種異系は、レシピエントに対する細胞の供給源を参照することを意図しており、遺伝子改変に関する細胞の状態を参照することを意図していない。
本明細書で使用される場合、「試料」という語は、被検者から採取された試料(例えば、血液、血液成分(例えば、血清または血漿)、尿、唾液、羊水、脳脊髄液、組織(例えば、胎盤または皮膚)、膵液、絨毛サンプル、および細胞)を指す。
ここで用いられるように、「scFv」という用語は、重鎖の可変ドメインと抗原からのL鎖が一本の鎖を形成するために結合された単一の連鎖Fv(fv)を意味する。scFv断片は、VL(例:CDR-L1、CDR-L2、および/またはCDR-L3)の可変領域と、リンカーによって分離されたVH(例:CDR-H1、CDR-H2および/またはCDR-H3)の可変領域を含む単一のポリペプチドチェーンを含む。scFv断片のVLとVH領域に結合するリンカーは、プロテイン生成アミノ酸からなるペプチドリンカーである。代替リンカーは、scFvフラグメント(たとえば、D-アミノ酸を含むリンカー)の溶解性を高めるために、scFvフラグメント(例えば、ポリエチレングリコールを含むリンカーまたは繰り返しのグリシンとセリン残留物を含むポリペプチドのような親水性リンカー)の溶解性を高めるために、分子(たとえば、分子内または分子間ジスルフィド結合を形成するシステイン残留物を含むリンカー)の生物物理学的安定性を改善するために、またはscFvフラグメント(たとえば、グリコシル化部位を含むリンカー)のウィンジェニック性を弱めるために、プロテオリトリック劣化に対するscFvフラグメントの耐を高めるために、またはscFvフラグメント(たとえば、グリコシル化部位を含むリンカー)を弱めるために使用することができる。本明細書中に記載されるscFv分子の可変領域は、それらが由来した抗体分子からのアミノ酸配列が変化するように修飾され得ることも、当業者によって理解される。たとえば、保守的な置換や、アミノ酸残基の変化につながるヌクレオチドやアミノ酸の置換(たとえばCDRやフレームワーク残基)を作り、scFvが対応する抗原に結合する能力を維持または強化することができる。
ここでいう「比バインディング」又は「特別バインディング」とは、一般に、タンパク質に対してではなく、比のタンパク質構造(エピトープ)を認識し、結合することを示す「ADC」の用語である。エピトープA(又は非ラベル化されたA)を含む分子の存在は、ラベル化された「A」及びその「A」を含む反応において、それらに結合されたラベル化されたAの量を減少させる。例として、もし、ラベル化された場合に、当該非ラベル化されたビールによって、当該のターゲットから離れて競争することができるならば、「比」をターゲットに結合する。1つの実施形態では、抗体がターゲットに具体的に拘束されるものとしては、例えば、CD117が、少なくとも約10M -4以下、10M -5以下、10M -6以下、10M -7 以下、10-8 M 以下、10-9 M 以下、10-10 M 以下、10M 以下、10M -11 以下、10MKD 以下(例えば、10-13 より少ない数字を意味する)である場合。前述のKDを含む範囲、例えば、-810M～-1210M、例えば、-910M～-1210M、または-1010M～-1210Mも本明細書に含まれる。一実施形態では、本明細書で使用される場合、「CD117に特異的に結合する」または「CD117に特異的に結合する」という語は、CD117に結合し、表面プラズモン共鳴により決定される酸解離定数(KD)が1.0×10-7 M以下である抗体(またはADC)を指す。一実施形態では、KD(M)は、標準バイオ層干渉法に従って決定される。一実施の形態では、Koff(1/s)は、標準のバイオ層干渉法(BLI)に従って決定される。しかしながら、この抗原は、連続して関連する2つ以上の抗原に特別に結合することができるかもしれないことを理解しなければならない。例えば、ある実施の形態では、CD117またはCD45のヒトと非ヒト(例えば、マウスまたは非ヒト霊長類)の両方のオーソログに、特定的に結合することができる。
ここで使用される「被検者」および「患者」という用語は、ここに記載されているように特定の病気または状態の治療を受けている人間のような有機体を指す。例えば、ヒト患者のような患者は、自家または同種であり得る遺伝子改変造血幹細胞の生着を促進するために、造血幹細胞移植療法に先立って治療を受けることができる。
ここで用いられるように、「実質的に血液から除去される」という句は、患者から分離された血液サンプル中の治療薬の濃度が従来の方法では検出できないような場合(例えば、治療薬が治療薬を検出するために使用された装置のノイズスレッショルドを越えて検出できない、又はアッセイを越えて検出できないような場合)、治療薬(例えば、抗CD117のような)を患者に投与した後の時点を指す。当技術分野で公知の種々の技術を使用して、抗体、または抗体断片(例えば、当技術分野で公知の、または本明細書に記載されるELISAベースの検出アッセイ)を検出することができる。本技術分野で知られているものの中で、アッセイを用いて、抗毒剤、又は抗菌断片を検出することができる追加のアッセイには、予防接種技術及びイムブロットアッセイが含まれる。
ここで用いられるように、「幹細胞障害」という語は、広く、被検者の標的組織を整理し、また/又は標的組織内の内生の幹細胞集団を治癒することによって(例えば、被検者の骨髄組織から内生の血液細胞または祖母細胞集団を治癒すること)、及び、被検者の標的組織に遺伝子改良した幹細胞を接木または移植することによって、治療または治癒される可能性のある病気、障害または状態を指す。本書に記載された組成物及び方法を用いて治療することができる追加の障害には、限定されないが、鎌細胞貧血、サラセミア、ファンコニ貧血、無弾性貧血、ウィスコット・アルドリッチシンドローム、ADA SCID、HIV/エイズ、メタクロドロピストロフィー、ダイアモンド・ブラックファン貧血およびシュワックマン・ダイアモンドシンドロームが含まれる。患者の調整および本明細書に記載されている遺伝子組換え造血幹細胞移植方法を用いて治療され上記さらなる疾患は、遺伝性血液障害(例えば、鎌状赤血球貧血)および強皮症、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、およびクローン病などの自己免疫障害を含む。本明細書に記載される調整および移植方法を用いて治療され上記さらなる疾患には、神経芽細胞腫または白血病、リンパ腫および骨髄腫などの血液癌などの悪性腫瘍が含まれる。
例えば、癌は、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、または非ホジキンリンパ腫であり得る。ここに記載されている調整および/または移植方法を用いて治療可能な追加の病気には、骨髄細胞障害症候群が含まれる。いくつかの実施形態において、被検者は代謝貯蔵障害を有するか、あるいはそうでなければ影響を受ける。例えば、被検者は、糖原病、ムコ多糖症、ハーラー病、スフィンゴ脂質症、異染性白質ジストロフィー、または本明細書に開示される任意の治療および治療から利益を得ることができる他の疾患または障害(限定されるわけではないが、重度複合免疫不全症、ウィスコット-オールドリッチ症候群、高免疫グロブリンM (IgM)症候群、チェディアック-東病、遺伝性リンパ組織球症、骨形成不全症、蓄積症、サラセミアメジャー、鎌状赤血球症、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、若年性関節リウマチ、またはそれらの疾患、またはASH教育書籍)1:319-338(2000)、その開示は、造血幹細胞移植療法の投与によって治療され得る病態に関するものであるため、ここではその全体を引用して組み込む。
ここで用いられるように、「トランスフェクション」という用語は、原核または真核の宿主細胞への外生DNAの導入に一般的に使用される、エレクトロポレーション、リッポフェクト、カルシウムリン酸析出、DEAEdextranトランスフェクションなどの広範囲にわたる技術の総称である。
ここで用いられる「治療」という用語は、病気の症状の重度および/または周波数を低減し、病気の症状および/または当該症状の根本的な原因を除去し、病気の症状および/またはその根本的な原因の周波数または可能性を減少させ、病気によって直接または間接に引き起こされる損害を向上または上記すること、あるいは、長生き、病気のような病気の結果の向上、あるいは、他の治療様式の副産物である副作用の軽減/またはその/または軽減を意味する;この技術で容易に理解されるように、病気の完全な根絶は好ましいが、治療法の必要性ではないにしても好まれる。有益な、または望ましい臨床結果としては、以下に記載するようなADC調整治療後の患者における血液細胞の移植の促進が含まれるが、これに限定されるものではない。また、それに限定されない。これは、本稿およびその後の遺伝子組み換え血液細胞移植治療後に行われる。さらなる有益な結果には、コンディショニング療法およびその後の患者への造血幹細胞移植片の投与に続いて、造血幹細胞移植を必要とする患者における造血幹細胞の細胞数または相対濃度の増加が含まれる。本明細書に記載される治療の有益な結果はまた、コンディショニング療法およびその後の造血幹細胞移植療法に続いて、巨核球、血小板、血小板、赤血球、マスト細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、ミクログリア細胞、顆粒球、単球、破骨細胞、抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Tリンパ球、またはBリンパ球などの造血系列の1つ以上の細胞の細胞数または相対濃度の増加を含み得る。さらなる有益な結果には、癌細胞の集団(例えば、CD117+白血病細胞)または自己免疫細胞(例えば、自己抗原と交差反応するT細胞レセプターを発現するCD117+ T細胞などのCD117+自己免疫リンパ球)のような疾患を引き起こす細胞集団の量の低下が含まれ得る。追加の有益な結果としては、本書に記載されているように、病気を引き起こすターゲット遺伝子を矯正する結果として、患者において表現される機能性タンパク質の存在または検出が含まれる。本開示の方法が障害の予防に向けられているかぎり、「予防」という用語は、病気状態を完全に妨害することを必要としないことが理解される。むしろ、ここで用いられるように、予防という用語は、当業者が障害に影響されやすい集団を特定する能力を意味し、したがって、本開示の化合物の投与は、病気の発生前に起こり得る。この用語は、病態が完全に回避されていることを意味するものではない。
ここで用いられるように、「バリアント」および「派生物」という用語は、互換的に使用され、また、ここに記載されている複合物、ペプチド、タンパク質、またはその他の物質の自然発生的、合成的および半合成アナログを指す。ここに記載されている複合物、ペプチド、タンパク質、またはその他の物質の変形または派生物は、元の物質の生物学的活動を維持または改善することができる。
ここで用いられるように、「ベクター」という用語は、プラスミド、DNAベクトル、プラスミド、RNベクトル、ウイルス、または他の適切なレプリコンのような核酸ベクトルを含む。ここに記載される表現ベクトルは、ポリヌクレオチド配列並びに、例えば、タンパク質の表現及び/又はこれらポリヌクレオチド配列を哺乳類細胞のゲノムに積分のに用いられる追加の配列要素を含むことができる。本開示の抗生物質及び抗生物質断片の表現に用いることができる特定のベクターには、遺伝子転写を直接する促進剤及び向上剤のような規制配列を含むプラスミドが含まれる。他にも、抗生物質および抗生物質断片の表現に有用なベクターには、ポリヌクレオチド配列が含まれており、これはこれらの遺伝子の翻訳速度を高めるか、遺伝子転写から結果mrnaの安定性または核輸出を改善する。これらの配列要素は、例えば、発現ベクター上に担持された遺伝子の効率的な転写を指示するために、5'および3'非翻訳領域、ならびにポリアデニル化シグナル部位を含み得る。本明細書中に記載される発現ベクターはまた、そのようなベクターを含有する細胞の選択のためのマーカーを符号化するポリヌクレオチドを含有し得る。適切なマーカーの実施例には、アンピシリン、クロランフェニコール、カナマイシン、ノルソトリシンなどの抗生物質に抵抗性を示す遺伝子が含まれる。
本明細書で使用される「アシル」という語は、-C(=O)Rを指し、ここで、Rは、本明細書で定義されるように、H(「アルデヒド」)、C 1 -C 12アルケニール、C 2 -C 12アルキニール、C 2-C 12アルキニール、C 3 -C 7カルボサイクリル、C 6 -C 20アリール、5-10メンバーヘテロアリール、または5-10メンバーヘテロサイクリルである。無制限の実施例としては、フォルミル、アセチル、プロパノイル、ベンゾイル、およびアクリロイルが挙げられる。
ここで使用する「C1-C12アルキル」という用語は、1から12の炭素原子を持つ、直鎖または枝分かれした、飽和炭化水素を意味する。代表的なC1 -C12のアルキル群には、-methyl、-ethyl、-n-propyl、-n-butyl、-n-pentyl、および-n-hexylが含まれるが、これらに限定されない分岐C1 -C12のアルキルには、-isopyl、-sec-butyl、-isobutyl、-tert-butyl、-isopentyl、および2-methylbutylが含まれるが、これらに限定されない。C1-C12のアルキル基は、置換されないか、または置換されることができる。
ここで使用する「アルケニール」という用語は、非飽和性の少なくとも1つの部位、すなわち、炭素-炭素、スパ2二重結合を持つ、通常、二次、または三次炭素を含むC2-C12炭化水素を指す。例としては、エチレン又はビニル、-アリル、-1-ブテニル、-2-ブテニル、-イソブチレニル、-1-ペンテニル、-2-ペンテニル、-3-メチル-1-ブテニル、-2-メチル-2-ブテニル、-2,3-ジメチル-2-ブテニル等が挙げられるが、これらに限定されない。アルケニール基は置換されないか、あるいは置換されることができる。
ここで使用する「アルキニール」は、非飽和性の少なくとも1つの部位、すなわち、炭素-炭素、spトリプル結合を持つ、通常、二次、または三次炭素原子を含むC2 -C12炭化水素を指す。例としては、アセチレン及びプロパルギルが含まれるが、これらに限定されない。アルキニル基は、非置換または置換されていてもよい。
「アリール」は、本明細書中で使用される場合、C 6 -C 20炭素環芳香族基を指す。アリール基の例には、フェニル基、ナフチル及びアントラセニールが含まれるが、これらに限定されない。アリール基は代替することも、代替することもできる。
ここで使用する「アリラルキル」は、炭素原子に結合した水素原子の1つ、典型的には端子またはsp 3炭素アトムが、アリールの急進的なものに置き換えられる、非環状アルキル基を意味する。代表的なアリールアルキル基としては、ベンジル、2-フェニルエタン-1-イル、2-フェニルエテン-1-イル、ナフチルメチル、2-ナフチルエタン-1-イル、2-ナフチルエテン-1-イル、ナフトベンジル、2-ナフトフェニルエタン-1-イルなどが挙げられるが、これらに限定はされない。アリールアルキル基は6～20個の炭素原子を含み、例えばアリールアルキル基のアルカニル、アルケニルまたはアルキニル基を含むアルキル部分は1～6個の炭素原子であり、アリール部分は5～14個の炭素原子である。アルカリ基は置換されないか、あるいは置換されることができる。
本稿で使用する「シクロアルキル」とは、1つまたは自転車であるかもしれない、飽和した炭素環状ラジカルを指す。シクロアルキル基には、自転車として3～7個の炭素原子を持つ環、または7～12個の炭素原子を持つ環が含まれる。単環式シクロアルキル基の実施例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが含まれる。Cycloalkyl基は代替することもできない。
「シクロアルケニル」とは、本明細書中で使用される場合、不飽和炭素環ラジカルをいい、これは、単環または二環であってもよい。シクロアルケニール基には、自転車として3～6個の炭素原子を持つ環、または7～12個の炭素原子を含む。単環式シクロアルケニル基の実施例には、1-シクロペント-1-エニル、1-シクロペント-2-エニル、1-シクロペント-3-エニル、1-シクロヘキサ-1-エニル、1-シクロヘキサ-2-エニル、および1-シクロヘキサ-3-エニルが含まれる。シクロアルケニル基は代替または代替することができる。
ここで使用する「ヘテロアラルキール」とは、炭素原子に結合した水素原子の1つ、典型的には端子またはsp 3炭素原子がヘテロアリールラジカルに置き換えられる非環状アルキル基を指す。典型的なヘテロアリールアルキル基は、限定されるものではないが、2-ベンズイミダゾリルメチル、2-フリルエチル等を含む。ヘテロアリールアルキル基は、6～20個の炭素原子、例えば、ヘテロアリールアルキル基のアルカニル、アルケニルまたはアルキニル基を含むアルキル部分が1～6個の炭素原子であり、ヘテロアリール部分が5～14個の炭素原子およびN、O、P、およびSから選択される1～3個のヘテロ原子を含み、ヘテロアリールアルキル基のヘテロアリール部分は、3～7個のリング部材(2～6個の炭素原子、または7～10個のリング部材(4～9個の炭素原子およびN、O、P、およびSから選択される1～3個のヘテロ原子)を有する単環、例えば、ビシクロ[4,5]、[5,5]、[5,6]、または[6,6]システムであり得る。
ここで使用する「ヘテロアリル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それぞれ、1つ以上の環原子がヘテロ原子、例えば、窒素、酸素および硫黄である芳香性または非芳香性の環系を指す。ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルラジカルは、N、O、P、Sから選ばれた2～20の炭素原子と1～3のヘテロ原子からなる。ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルは、3～7のリング部材(N、O、P、Sから選ばれた2～6の炭素原子と1～3のヘテロ原子)を持つ単環であってもよいし、7～10のリング部材(N、O、P、Sから選ばれた4～9の炭素原子と、N、O、P、Sから選ばれた1～3のヘテロ原子)を持つ自転車であってもよい。例えば、自転車[4,5]、[5,5]、[5,ヘテロアリルとヘテロシクロアルキルは、置換することができないか、または置換することができる。
ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキル基は、Paquette, Leo A.;「現代のヘテロ環状化学の原理」(W. A. Benjamin, New York, 1968)、特に第1章、3章、4章、6章、7および9;「複素環化合物の化学、A一連のモノグラフ」(John Wiley & Sons, New York, 1950年から現在まで)、特に巻13, 14, 16, 19および28;およびJ. Amに記載されている。化学協会(1960) 82:5566.
ヘテロアリール基の実施例としては、ピリジル、チアゾリル基、ピリミジル、ピリミジル、イミダリル、ピリゾリル、インドリル、イソリジニール、イソリジニール、ピリダジニール、3H-インドリル、1H-インドリジル、プリニル、4H-キノリジル、フタジニール、ナフチリジニール、キノザリニール、キノリニル、シニジニール、4aH-カルバリジニール、アクリジニール、ピリミジニール、フェナントロリニール、フェノチアジニール、フラザニール、イソクロマニール、イミダゾリジニール、ピラゾリジニール、ベンゾトリアゾリル、イザチノイルヘテロシクロアルキルの実施例としては、実施例として、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル(ピペリジル)、テトラヒドロチオフェニル、ピペリジニル、4-ピペリドニル、ピロリジニル、2-ピロリドニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ビス-テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、ピペラジニル、キヌクリジニル及びモルホリニルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
例として、限定ではなく、炭素結合ヘテロアリールとヘテロシクロアルキルはピリジンの2、3、4、5、6番目、ピリジンの2番目、4番目、5番目、6番目、ピリミジンの2番目、5番目、5番目、6番目、ピラジンの3番目、5番目、または6番目、ピラジンの2番目、3番目、5番目、4番目、または4番目、または4番目、または4番目のアゼチジンの4番目、3番目、4番目、5番目、または4番目のアゼチジンの4番目、5番目、5番目、または5番目のアゼチジンの4番目、または8杯のイソキノリン。更に典型的には、炭素結合ヘテロシクリルは2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、5-ピリジル、6-ピリジル、3-ピリダジニル、4-ピリダジニル、5-ピリダジニル、6-ピリダジニル、2-ピリミジニル、4-ピリミジニル、5-ピリミジニル、6-ピリミジニル、2-ピラジニル、3-ピラジニル、5-ピラジニル、6-ピラジニル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、又は5-チアゾリルを包含する。
限定ではなく例として、窒素結合ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキルは、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、2-ピロリン、3-ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、2-イミダゾリン、3-イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、2-ピラゾリン、3-ピラゾリン、ピペリジン、ピペリジン、インドール、インドール、1H-インダゾール、イソインドールの位置2、モルホリンの位置4、およびカルバゾール、またはベータ-カルボリンの位置9で結合される。更に典型的には、窒素結合ヘテロシクリルは1-アジリジル、1-アゼチジル、1-ピロリル、1-イミダゾリル、1-ピラゾリル、及び1-ピペリジニルを包含する。
本項で使用し、また上記のアルキル、アルキン、アリール、アルキニール、ハルキン、ヘテロシクリル、その他に適用した「置換」とは、1つ以上の水素原子が、それぞれ別個に置き換えられることを意味する。上述の「アルキル」、「アルキレン」、「アルキレン」、「アルキン」、「アルキンキン」、「アルキンキン」、「シクロアルキレン」、「ヘテロシクロアルキレン」、「ヘテロシクロアルキレン」、「アリール」、「アリレン」、「ヘテロアリール」、「ヘテロアリーレン」グループは、任意に置き換えることができる。典型的な置換剤は、-XOBR)3, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -OOaH, -NC(=O)R, -C(=O)H, -C(=O)R, -C(=O)2, -SO3 -, -SO3H, -S(=O)2 R, -OS(=OFR)2, -S(=O)R, -OP(=O)(OH)2, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)OONN(R)2, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NH2, -C(=O)OJS), -R, -OH, -OR, -SH, -SR, NH2, -NHR, -N(R)2, -N+ ()2、-C(=NH)NH2, -C(=O)N(および-C(=NR)N(R)2を含むが、これらに限定されない。ここで、各々のXは、F、Cl、Br、およびIからのそれぞれのオカレンスに対して独立して選択され、各々のRは、2 OR, -S(=O)2 NH2, -S(=O)2 N(のアルキル、C6 -C20のアリール、, -C(=S)R, -CO2 H, -CO2 R, -CO2 -, -C(=S)OR, -C(=のヘテロシクロアルクまたはヘテロアリールからのオカレンス、保護群およびプロダクトモティーからのそれぞれのオカレンスに対して独立して選択される。群が「任意に置換」と記述されるところでは、どこであれ、その群は、個々の場合とは独立に、上記置換体のうちの1つ以上で置換することができる。
特定のラジカル命名規則には、状況に応じて、モノラル・ラディカルまたはディ・ラディカルのどちらかが含まれることがあることを理解する必要があります。たとえば、置換基が分子の残りの部分に2つの付着点を必要とする場合、その置換基はジラジカルであることがわかる。例えば、2結合点を必要とする「アルキ」として識別される代替物は、-CH2 -, -CH2 CH2 -, -CH2CH(CH3)CH2 -,等のような「ジラジカル」を含む。他の根本的な命名規則は、この急進的なものが、「アルキレン」、「アルケニレン」、「アリーレン」、「ヘテロシクロアルキレン」などのディ・ラジカルであることを明確に示している。
代替体がディラジカル(すなわち、分子の他の部分に2つの付着点を持つ)として描写される場合、他に示されない限り、代替体はどんな方向にも付着することができることを理解する必要がある。
「イソメリズム」とは、同一の分子式をもっているが、その原子の結合の順序や空間における原子の配列が異なっている化合物をいう。空間における原子の配置が異なっているイソマーを「立体異性体」と呼び、互いに鏡映しない立体異性体を「ジアステレオ異性体」と呼び、重ね合わせることができない鏡像同士を「エナンチウム」、あるいは「光学異性体」と呼ぶこともある。
4つの非同一の置換基に結合した炭素原子は「キラル中心」と呼ばれ、「キラルイソマー」は少なくとも1つのキラル中心を持つ複合体を意味し、複数のキラル中心を持つ複合体は、個々のジアステレオマーとして存在するか、「ジアステレオマー混合物」と呼ばれるジアステレオマーの混合物として存在することがある。一つのキラル中心が存在するとき、立体体体はそのキラル中心の絶対的な配置(RまたはS)によって特徴づけられる。絶対配置とは、キラル中心に付着した置換基の空間における配置をいう。検討中のキラル中心に付着した置換基は、Cahn, Ingold,Prelogの配列規則に従ってランク付けされた。(Cahn et al., Angew. Chem. Inter. Edit. 1966, 5, 385; errata 511; Cahn et al., Angew. Chem. 1966, 78, 413; Cahn and Ingold, J. Chem. Soc. 1951 (London), 612; Cahn et al., Experientia 1956, 12, 81; Cahn, J. Chem. Educ.1964, 41, 116).正反対のキラリティの個々のエナンチメリック形成を等量含む混合物を「ラセミク混合物」と呼ぶ。
この説明及びクレームにおいて開示される化合物は、1つ以上の非対称中心を含み、また、各化合物の異なるジアステレオマー及び/又は鏡像異性体が存在することがある。この明細書及びクレームのどれかの化合物の記述は、特に記載のない限り、すべての鏡像異性体、ジアステレオマー、及びそれらの混合物を含むことを意図している。加えて、この説明及びクレームのどれかの化合物の記述は、別に記載されていない限り、鏡像異性体の、個々の鏡像異性体、並びに、ラセミク、その他の混合物の両方を含むことを意図したものである。複合物の構造が、特定のエンベンチマーとして描写される場合、本出願の現在の開示は、その特定のエンベンチマーに限定されないことを理解する必要がある。したがって、本開示の構造式の各々の鏡像異性体、光学異性体、およびジアステレオマーが、本明細書中で企図される。本明細書では、複合物の構造式は、便宜上、ある種の異性体を表しているが、本明細書には、幾何学的異性体、非対称炭素に基づく光学異性体、立体異性体、トートマー等の全ての異性体が含まれており、全ての異性体が同じ活動レベルを持つとは限らないことが理解されている。化合物は、異なる互変異性体形態で生じ得る。本開示による化合物は、特に記載のない限り、すべての同性体形態を含むことを意図している。複合物の構造が特定のトートマーとして描写される場合、本出願の本開示は、特定のトートマーに限定されないことを理解する必要がある。
本明細書に記載される任意の式の化合物は、化合物自体、ならびにそれらの塩、および該当する場合にはそれらの溶媒和物を含む。例えば、塩は、開示の複合体上のアニオンと正電荷を帯びた群(例えば、アミノ)の間で形成することができる。適切なアニオンとしては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、重硫酸塩、スルファミン、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸塩、グルタメート、グルクロネート、グルクロネート、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、トシレート、サリチル酸エステル、乳酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、および酢酸塩(例えば、トリフルオロ酢酸塩)が挙げられる。「薬学的に許容されるアニオン」という用語は、薬学的に許容される塩を形成するのに適したアニオンを意味する。同様に、開示の複合体上で、カチオンと負電荷を帯びたグループ(例えばカルボキシレート)の間で塩を形成することもできる。適当なイオンには、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびテトラエチランモニウムイオンのようなアンモニウムイオンが含まれる。いくつかの適切な置換アンモニウムイオンの例は、エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミン、ならびにアミノ酸、例えばリジンおよびアルギニンから誘導されるものである。開示される化合物にはまた、第四紀窒素原子を含むそれらの塩も含まれる。
適当な無機アニオンの実施例としては、以下の無機酸から誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない:塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、およびリン。適切な有機アニオンの実施例としては、以下の有機酸が含まれるが、これらに限定されないが、以下の有機アニオンの実施例には以下が含まれる: 2-アセチ安息香、コルビック、安息香、安息香、スルフォニック、ケティック、クエン酸、エタニスルフォニック、エタネスルフォニック、エタネスルフォニック、フマリック、グルプトニック、グルトニック、グルタミン、グルティック、グリコリック、ハイキシマレイク、ハイドロキシマレインカルボキシリック、チオン酸、乳酸、乳酸、ラクトビック、ラウリック、マレイク、マリック、メタネルフォニック、ムカリック、オキサリック、パルミチック、パモアチック、パトセニック、パ適当なポリマー有機アニオンの例には、以下のポリマー酸から得られたものが含まれるが、これらに限定されない:タンニン酸、カルボキシミルセルロース。
加えて、本開示の化合物の化合物、例えば、は、水分補給または水分補給されていない(無水)形態で存在することもあれば、他の溶媒分子と共にソルベートとして存在することもある。ハイドレートの無限の実施例には、単非、ジハイドレートなどがある。溶媒和物の非限定的な例としては、エタノール溶媒和物、アセトン溶媒和物などが挙げられ、「溶媒和物」とは、化学量論的または非化学量論的な量の溶媒を含有する溶媒付加形態を意味する。いくつかの化合物は、結晶性固体状態において溶媒分子の固定されたモル比を捕捉し、したがって溶媒和物を形成する傾向を有する。溶媒が水の場合、生成する溶媒和物は水和物であり、溶媒がアルコールの場合、生成する溶媒和物はアルコラートである。水化物は、水がH2 O.A.ハイドレートと同様に、水がその分子を保持している物質の1分子と、1つ以上の水分子との組合せによって形成される。水化物とは、例えば、一水位体、二水位体、三水位体などを指す。
加えて、本明細書に開示される公式により表される化合物またはそれらの塩に対して結晶多型が存在することができる。本開示の範囲には、水晶形成、結晶形成、混合物、無水物化物またはそのハイドレートが含まれることに注意されたい。
ここで用いられるように、「アマトキシン」という用語は、Amanita phalloides mushroomsによって生成されるペプチドのアマトキシンファミリーの部材、またはそれらの派生物、すなわち、RNポリメラーゼII活動を抑制することができるその派生物または派生物を指す。以下に、適当なアマゾン及びその派生物をさらに詳述する。ここに記載されるように、アマトキシンは、例えばリンカー潤沢(L)を経由して、自己結合体(すなわち、ADC)を形成することによって、抗原結合断片、又はその抗原結合断片に結合することができる。このようなプロセスに有用なアマトキシン結合およびリンカーの例示的な方法は、以下に記載され、当技術分野で公知である。
幹細胞遺伝子治療の方法
本開示の方法には、欠陥遺伝子(例えば、突然変容)に起因する状態に苦しむ患者に遺伝子改良血幹の集団を管理することが含まれる。一般的に、本方法は、生きた細胞のゲノム(例えば、幹細胞)が治療目的のために修正される、幹細胞遺伝子治療に関連する。特に、本稿に記載されているように、欠陥遺伝子を是正することにより、治療効果を達成することができる。たとえば、血液細胞(HSC)は、欠陥遺伝子(たとえばHBB遺伝子に欠陥がある例の患者)に起因する障害に苦しむ患者から抽出され、CD34を表現する細胞(CD34+)を選択することによって純化される。分離した電池は、公知方法を用いてex vivoで処理することができ、そのゲノムは、例えば、欠陥のあるターゲット遺伝子を機能的遺伝子に修正するように編集するなどして、望むように修正することができる。その後、このような改良血幹を患者に戻す。移植された幹細胞は、患者の骨髄に根を取り、複製し、正常に機能するタンパク質を成熟させて作り出す細胞を作り出し、それによって問題を解決する。
源から幹細胞を分離し、ex vivo (例、拡大およびゲノム改良)のさらなる処理をする方法は周知であり、当技術において利用可能である。いくつかの実施形態において、幹細胞は、それらが管理される哺乳動物に対して異性である。いくつかの実施形態において、幹細胞は、それらが管理される哺乳動物に自称である。
いくつかの実施形態において、幹細胞は骨髄から分離される。いくつかの実施例において、幹細胞は、例えば、動員された末梢血から分離される。いくつかの実施例において、動員された末梢血は、G-CSFを実施した被検者から分離される。いくつかの実施例において、動員された末梢血は、例えば、プレリクサフォー(R) (AMD3100)のような、G-CSF以外の動員剤を管理された被検者から分離される。いくつかの実施例において、茎細胞は、へその臍帯血から分離される。
いくつかの実施形態において、分離した茎細胞はCD34+細胞を構成するか、または構成する。いくつかの実施形態において、電池は実質的にCD34-電池を含まない。いくつかの実施形態では、細胞はCD34+/CD90+の幹細胞を構成するか、構成する。いくつかの実施形態において、電池はCD34+/CD90-電池を構成するか、またはからなる。幾つかの実施形態において、細胞は、上述または明細書された1つ以上の細胞タイプからなる集団である。
いくつかの実施例において、遺伝子組み換え幹細胞の何れか1つ以上が、本方法で使用できる。例えば、StrimvelisTM (ヒトのADA cDNA配列をエンコードするレトロウィルスベクターで変換されたCD34+細胞を含むオートロガスCD34+濃縮細胞分裂である。)
本書に記載されている遺伝子改良HSCは、遺伝子組み換え幹細胞治療、又は、患者に伝達する前に遺伝子組み換え細胞を形成するためのin vitro遺伝子編集(例えば、CRISPR/Casシステムまたはウイルス変換)において使用されることができる。そのため、本書に記載されている遺伝子組み換え血幹は、それらが改変あるいは訂正された遺伝子を含んでおり、また/または外生遺伝子を含んでいるため、遺伝子治療の方法において使用される。特に、ここに記載されている遺伝子組み換え血幹は、改変された、または訂正された遺伝子をすべての、または、改変された血幹からのほとんどの後代が含むので、遺伝子治療の方法において有用である。したがって、改変された造血細胞は、限定されるわけではないが、遺伝性障害、がん、およびある種のウイルス感染を含む条件を患う、哺乳動物被検者、例えばヒト被検者の治療に使用することができる。
本稿に述べるように、遺伝子組み換え血幹は、接ぎ木を確実にするか、改善するために本稿に述べるADCおよび方法を用いて条件付けされた患者に管理される(すなわち移植される)。
血幹ゲノム改質方法
細胞のゲノム(例えば、幹細胞)を編集するための種々の方法が、本技術に知られている。例えば、本技術に記載されているように。操作する幹細胞には、分離された幹細胞から確立された個々の独立した幹細胞または幹細胞が含まれる。これらは、1つ以上の核酸の枝変わりを含む。本技術及び本技術に記載されているいずれかの適当な遺伝子操作法も、幹細胞のゲノムを編集または変更するために使用され得る。特に、実施例において、幹細胞のゲノムの遺伝子組み換えは、幹細胞の核酸突然異変を訂正することができる。いくつかの実施形態において、幹細胞のゲノムの遺伝子改変は、幹細胞に外生遺伝子を導入することができる。ある実施例では、核酸操作試薬(例えば遺伝子編集システムの成分)が幹細胞に導入される。ある種の実施形態では、遺伝物質(例えば、表現される外生遺伝子)及び/又は核酸操作試薬(例えば、遺伝子編集システムの成分)の送達は、ウイルスベクター(例えば、レトロウィルス、アデノウィルス、AV、ヘルパー依存アデノウィルスシステム、ハイブリッドアデノウィルスシステム、ヘルペス・シンプレックス、ポックス・ウィルス、レンティウィルス、エプスタイン・バー・ウィルス)及び非ウイルスシステム(物理システム(ネイキッド・DNA爆撃、エレクトロポレーション、流体力学、超音波、磁気作動)、及び化学システム(カチオニック脂質、異なったカチオニックポリマー及び脂質ポリマー)を介して達成することができる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクトルはレンチウィルスである。核酸操作試薬は、その後、血幹内の核酸の突然変わりを修正し、操作された血幹を作ります。このような試薬は、標的細胞(例、幹細胞)内の1つ以上の標的ポリヌクレオチド配列(標的配列)の効率的かつ精密な修正を可能にすることで作用し、通常、標的細胞内の核酸配列を認識する核酸誘導エンドニュークレーズ(例、Cas9のような核酸誘導エンドニュークレーズ、またはDNA誘導エンドニュークレーズ)のような、部位指向の修正ポリペプチドを含む。
現在開示されている組成物及び方法で使用されている部位指向の修飾ポリペプチドは、ポリペプチド自体又は関連する分子が認識し、特定の核酸配列又は一連の類似した配列(すなわち目標配列)を標的とする部位特有のものである。いくつかの実施形態において、部位指向の修飾ポリペプチド(またはその関連する分子)は、1つ以上の位置で退化することができる保存された塩基またはモチーフからなる、連続的に類似した配列を認識する。
特に、部位指向の修飾ポリペプチドは、その標的配列の外の特定位置(すなわち、修飾部位)でポリヌクレオチドを修飾する。特定の部位指向の修正ポリペプチドによって修正された部位(s)も、一般的には、特定のシークエンスまたは類似したシークエンスのセットに固有のものである。これらの実施形態のいくつかでは、部位指向の修飾ポリペプチドは、保存された塩基または1つ以上の位置で退化することができるモチーフから成る、連続的に類似した配列を修飾する。他の実施形態では、部位指向の修正ポリペプチドは、ターゲット配列に対して特定位置にある配列を修正する。たとえば、部位指向の修飾ポリペプチドは、標的配列から上流または下流にある特定の数の核酸内の配列を修飾することができる。
本稿において、サイト指向のポリペプチドの改変に関して用いられるように、「改変」又は「改変」という用語は、改変サイトの少なくとも1つのヌクレオチドのどれかの挿入、削除、置換、又は化学的な改変、或いは標的部位に隣接する遺伝子の表現の変化を意味する。修飾部位内の少なくとも1つのヌクレオチドの置換は、シチジンデミナーゼまたはアデニンデミナーゼドメイン(例えば、Eidら(2018) Biochem J 475(11):1955-1964、これは本稿に全体として組み込まれている)のようなベース編集ドメインのリクルートメントの結果であることができる。
標的部位に隣接する遺伝子の発現の変化は、遺伝子のプロモーター領域への転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインの動員、またはDNA配列を変化させることなくヒストン構造および/または染色体構造を変化させるためにDNAまたはヒストンタンパク質を共有結合的に修飾するエピジェネティック修飾ドメインの動員に起因し得、隣接する遺伝子の遺伝子発現の変化をもたらす。「変形」または「変形」という用語はまた、特定の核酸配列(例えば、疾病に関連した配列)の検出を可能にする、サイト指向の変形ポリペプチドまたは関連分子(例えば、gR)に結合することができる検出可能な標識の標的部位への募集を含んでいる。
いくつかの実施形態において、部位特異的修飾ポリペプチドは、ヌクレアーゼまたはその変異体、およびヌクレアーゼまたはその変異体を含む薬剤である。本明細書中で使用される場合、「ヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド鎖の背骨においてホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。現在開示されている組成物および方法に適したヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活性を有することができる。エキソヌクレースはポリヌクレオチド鎖の端部から1つずつヌクレオチドを分裂させる。エンドニュークレーズは、ポリヌクレオチド鎖の両端のものとは別に、ポリヌクレオチド鎖内のリンジエステル結合を切断して、ポリヌクレオチド鎖を分裂させる。ヌクレアーゼは、RNAポリヌクレオチド鎖(すなわち、リボヌクレアーゼ)および/またはDNAポリヌクレオチド鎖(すなわち、デオキシリボヌクレアーゼ)を切断することができる。
ヌクレアーゼはポリヌクレオチド鎖を切断し、切断部位を生じる。ここで用いられるように、「割れ」という用語は、ポリヌクレオチド鎖の背骨内のホスイジエステル結合の加水分解を意味する。現在開示されている核基による解放は、単独で取り残されたり、二重で取り残されたりすることがある。いくつかの態様において、DNAの二本鎖切断は、2つのヌクレアーゼでの切断を介して達成され、ここで、各ヌクレアーゼは、DNAの一本鎖を切断する。ヌクレアーゼによる切断は、平滑末端または千鳥状末端をもたらすことがある。
現在開示されている組成物および方法に適したヌクレアーゼの非限定的な例には、ホーミングエンドヌクレアーゼなどのメガヌクレアーゼ;IIS型エンドヌクレアーゼ(例えばFokI)などの制限エンドヌクレアーゼ;ジンクフィンガーヌクレアーゼ;転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)および核酸誘導ヌクレアーゼ(例えば、RNA誘導エンドヌクレアーゼ、DNA誘導エンドヌクレアーゼ、またはDNA/RNA誘導エンドヌクレアーゼ)が含まれる。
本明細書で使用される「メガヌクレアーゼ」とは、12塩基対を超える長さの標的配列でDNAに結合するエンドヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼはヘテロダイマーとして二本鎖DNAに結合する。現在開示されている組成及び方法のための適当なメガヌクレースには、このアミノ酸モチーフまたはそれらの変形物を含むラグリダグ(SEQ ID NO: 321)家庭のそれらのようなホームミングエンドニュークレーズが含まれる。
本明細書で使用される場合、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ZFN」は、制限エンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインに融合されたジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むキメラタンパク質を指す。ジンクフィンガーDNA結合領域は、特異な構造を安定化する役割を果たす亜鉛イオンによって結合される。
本明細書で使用される場合、「転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ」または「TALEN」は、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ、例えば制限エンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメインに融合された複数のTALドメイン繰り返しを含むDNA結合ドメインを含むキメラタンパク質を指す。TALドメイン繰り返しは、ProteobacteriaのXanthomonas属由来のタンパク質のTALE家庭に由来することができる。TAL領域の繰り返しは、超可変12thと13thのアミノ酸を含む33-34のアミノ酸配列であり、これはリピート可変ジ残基(RVD)と呼ばれている。このRVDは、目標配列バインディングの具体性を与える。TALドメインの繰り返しは、特定の標的配列特殊性を持つ改良型TALENを生成するための合理的または実験的手段を通して設計することができる(例えば、Bochら(2009) Science 326(5959):1509-1512およびMoscou and Bogdanove (2009) Science 326(5959):1501を参照)。TALENによるDNA切断には、非特定スペーサー領域に囲まれた2つのDNA標的配列が必要であり、それぞれのDNA標的配列はTALEN一量体によって結合される。いくつかの実施形態において、TALENは、1つ以上のTALドメインを有するDNA結合ドメインを含むエンドニュークレーンを意味するコンパクトTALENを含んでおり、それは、ホミングエンドニュークレースの任意の部分(例えば、I-TevI、MmeI、EndA、End1、I-BasiI、I-TevIII、I-TevIII、I-TwoI、MspI、MvaI、NucA、NucM)と融合している。小型のTALENは、DNA処理活動のために二元化を必要としないので、単一のターゲットサイトを必要とするだけであるという点で利点がある。
ここで用いられる「核酸誘導核酸」とは、誘導核酸(つまり、誘導核酸、gR、誘導DNA、gDNA、または誘導DNA、あるいは誘導DNA/rnaハイブリッド)と標的配列との間の補完性(完全または部分的)に基づいて、特定の標的配列に向けられた核酸のことである。
ガイド・RNと標的配列との間の結合は、核を標的配列の近傍に集めるのに役立つ。現在開示されている組成及び方法に適した核酸誘導核酸の非限定的な例には、自然に発生するクラスター状の規則的な間隔を置いた短いペリンドロミックリピート(CRISPR)に関連した(Cas)ポリペプチドが、原核生物(例えば、バクテリア、アルカイア)またはそれらの変形例からのものである。原核生物内に見られるCRISPR配列とは、侵入するウイルスからのポリヌクレオチドの断片に由来する配列であり、その後の感染の際に同様のウイルスを認識し、ウイルスポリヌクレオチドを、ウイルスポリヌクレオチド(Cas)ポリペプチドを介してクリーブするのに用いられる。このポリヌクレオチドは、ウイルスによるポリヌクレオチドをクリーブするために、PRISPRに関連した(Cas)ポリペプチドとして機能する。ここで用いられるように、「CRISPR関連ポリペプテッド」又は「カスポリペプテッド」は、自然に発生するCRISPRシステムの中で、CRISPR配列に近接して発見される自然に発生するポリペプテッドを意味する。ある種のCasポリペプチドはRNA誘導ヌクレアーゼとして機能する。
自然発生型のCRISPRシステムには、Class 1とClass 2の2種類以上があります。一般に、現在開示されている組成物の核酸誘導核基は、Class 2 Cas ポリペプチド又はその変形物であり、これは、Class 2 CRISPR装置が核酸誘導核酸活動を有する単一のポリペプチドを含んでいるのに対し、Class 1 CRISPR装置は核酸活動のために複雑なタンパク質を必要とすることを考慮したものである。クラス2のCRISPRシステムには、少なくとも3種類の既知のタイプがある。タイプII、タイプV、タイプV、およびタイプVIであり、これらの中には複数のサブタイプ(定義されていないまたは推定されるサブタイプの中で、いくつかのサブタイプII-A、II-B、II-B、C-V、A-V、B-V、C、VI-A、およびVI-C)がある。一般に、II型とV-B型のシステムでは、活性にはcrRNAに加えてtracrRNAが必要である。対照的に、型V-Aと型VIは、活動のためにcr-R-NAだけを必要とする。既知のII型およびV型RNA誘導ヌクレアーゼはすべて二本鎖DNAを標的としているが、既知のVI型RNA誘導ヌクレアーゼはすべて一本鎖RNAを標的としている。型IIのCRISPRシステムの、R‐誘導核基は、ここではCas9と呼ばれ、文献では文献にも言及されている。いくつかの実施形態において、現在開示されている組成及び方法の核酸誘導核酸は、タイプII Cas9タンパク質又はその変形物である。RNA誘導ヌクレアーゼとして機能するV型Casポリペプチドは、標的配列のターゲティングおよび切断にtracrRNAを必要としない。VA型CRISPRシステムのRNA誘導ヌクレアーゼはCpf1と呼ばれ、VB型CRISPRシステムはC2C1と呼ばれ、VC型CRISPRシステムはCas12CまたはC2C3と呼ばれ、VIA型CRISPRシステムはC2C2またはCas13A1と呼ばれ、VIB型CRISPRシステムはCas13Bと呼ばれ、VIC型CRISPRシステムは本明細書および文献ではCas13A2と呼ばれる。特定の実施例では、現在開示されている組成及び方法の核酸誘導核基はタイプVA Cpf1タンパク質又はその変形物である。自然に発生するカスポリペプチド及びそのバリエーションは、核酸誘導核酸として機能する本技術に知られており、これらに限定されないが、Streptococcus pyogenes Cas9, Staphylococcus aureus Cas9, Streptococcus thermophilus Casphilus novicida Cpf1、又はShmakov et al. (2017) Nat Rev Microbiol 15(3):169-182; Makarova et al. (2015) Nat Rev Microbiol 13(11):722-736;及び米国特許。No. 9790490は、それぞれ本書中に含まれている。教室2 V CRISPRヌクレアーゼには、Cas12、およびCas12の任意のサブタイプ、例えばCas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、およびCas12iが含まれる。Class 2 Type VI CRISPR Nucleases(Cas13を含む)は、RN標的配列を切断するために使用することができる。
現在開示されている組成及び方法の核酸誘導核基は、自然に発生する核酸誘導核基(例えば、S. pyogenes Cas9)又はその変形物であることができる。変種核酸誘導核基は、変更特性(例えば、転写活性化領域、上遺伝子改変領域、検出可能な標識)を付与するヘテロロジー領域に核酸誘導核基を融合するか、例えば、1つ以上の核酸領域の活動を変化させるアミノ酸の置換、削除、または付加を含む自然に発生する改変形を行うことができるか、あるいは、核酸の安定性を改変するか、あるいは核酸の特殊性を改変することができる。
いくつかの実施形態において、核酸誘導核酸は、細胞内微小環境における標的部位及び/又は安定性を改善するための1つ以上の突然異変を含む。たとえば、たんぱく質がCas9(例:SpCas9)である場合や修正Cas9である場合には、Rec2ドメインのN175からR307(包括的)までの残渣のいずれかまたはすべてを削除することが有益である。核酸のより小さい、あるいはより低い分子質量の方がより効果的であることがわかるかもしれない。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、天然型のヌクレアーゼと比較して少なくとも1つの置換を含む。例えば、たんぱく質がCas9または改良Cas9である場合、C80またはC574(あるいはそれらの同質体、インデルと改良されたたんぱく質の中で)を改変することが有益である。Cas9 では、望ましい置換は、C80A、C80L、C80I、C80V、C80K、C574E、C574D、C574N、およびC574Q のいずれかを含みます(任意の組み合わせ)。核酸の細胞内タンパク質結合を減少させ、および/または標的部位の特異性を増加させるために、代替物を含めることができる。さらに、または代わりに、組成物のオフターゲット毒性を低減するために、置換が含まれてもよい。
核酸誘導核酸は、誘導核酸(例、guided Rance、guide DNA (gDNA))との関連を通して、特定の標的配列に向けられる。核酸誘導ヌクレアーゼは、非共有結合相互作用を介してガイド核酸に結合し、従って錯体を形成する。ポリヌクレオチドターゲティング核酸は、標的配列の配列を補完するヌクレオチド配列を構成することによって、複合体に標的の特異性を提供する。複合体、ドメイン、ラベルの核酸誘導核基は、融合されているか、あるいはそうでなければ、サイト固有の活動を提供する。言い換えれば、核酸誘導核酸は、ポリヌクレオチド配列(たとえば、遺伝子組換え核酸の標的配列、外交核酸の標的配列、たとえば、エピソーム核酸、ミトコンドリル核酸の標的配列、クロロプラント核酸の標的配列、プラスミドの標的配列)に導かれる。これは、ポリヌクレオチドを標的とする誘導核酸のタンパク質結合セグメントとの関連性によるものである。
このように、ガイド核酸は「ポリヌクレオチドターゲティングセグメント」と「ポリペプチド結合セグメント」の2つのセグメントからなり、「セグメント」とは、分子のセグメント/部/領域(例えば、一連の連続した延伸である)を意味する。セグメントはまた、複数の分子の領域を含むことができるような錯体の領域/セクションを参照することもできる。例えば、ポリヌクレオチドを標的とする核酸のポリペプチド結合セグメント(後述)は、1つの核酸分子のみを含み、したがって、ポリペプチド結合セグメントは、その核酸分子の領域を構成する。他の場合、DNAターゲティング核酸のポリペプチド結合セグメント(後述)は、相補性の領域に沿ってハイブリッド化された2つの独立した分子からなる。
ポリヌクレオチドターゲティングセグメント(または「ポリヌクレオチドターゲティングシークエンス」または「ガイドシークエンス」)は、標的シークエンス内の特定のシークエンス(例えば、標的DNAシークエンスの補足的ストランド)に補完的(完全または部分的)であるヌクレオチドシークエンスを含み、ポリペプチド結合セグメント(または「ポリペプチド結合シークエンス」)は核酸誘導核酸と相互作用する。一般的には、核酸誘導核酸による標的DNAのサイト固有の切断または変化は、核酸のポリヌクレオチドターゲティングシークエンスと標的DNAの間の塩基対の相補性、および(ii)標的DNAの短いモチーフ(プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と呼ばれる)の両方によって決定される場所で起こる。
プロトスペーサーの隣接モチーフは、異なる長さのものであり、ターゲット配列からの可変距離であることができる。しかし、PAMは、目標配列からの約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、または約10のヌクレオチドを含む、目標配列からの約1から約10のヌクレオチドの範囲内である。PAM は、ターゲットシークエンスの5' または3' とすることができます。一般的に、PAMは約3-4ヌクレオチドのコンセンサス配列であるが、特定の実施は、長さにおいて2、3、4、5、6、7、8、9以上のヌクレオチドである。当技術には、特定のRa-guided nucleaseのための好ましいPAMコンセンサス配列シークエンスを識別する方法が知られており、Karvelisら(2015) Genome Biol 16:253またはPattanayakら(2013) Nat Biotechnol 31(9):839-43に開示されているアッセイに限定されないが、これらはそれぞれ、その全体として参考文献に組み込まれている。
ポリヌクレオチドターゲティングシークエンス(つまりガイドシークエンス)は、直接的に関心の対象シークエンスとハイブリッド化するヌクレオチドシークエンスである。ガイド配列は、関心の対象配列と完全または部分的に補完的であるように設計されます。様々な実施形態において、ガイド配列は約8のヌクレオチドから約30のヌクレオチドまたはそれ以上を含むことができる。例えば、ガイド配列は、長さが約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、ガイド配列は長さ約10から約26のヌクレオチド、または長さ約12から約30のヌクレオチドである。特に、ガイド配列は長さ約30のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、適切なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントされる場合、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはそれ以上である。特に、ガイド配列は二次構造ではなく、mFold (例えば、Zuker and Stiegler (1981) Nucleic Acids Resを参照)を含むが、それに限らない、本技術で知られている任意の適当なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムを用いて予測することができる。9:133-148) そしてRNAfold (例: Gruber et al. (2008) Cell 106(1): 23-24 を参照)。
また、いくつかの実施例では、ガイド核酸は、2つの別個の核酸(以下、「アクティバター核酸」及び「ターゲター核酸」)からなり、ここでは、「二分子ガイド核酸」又は「二分子ガイド核酸」と称する。また、他の実施例では、被検者ガイド核酸は1つの核酸(一分子核酸)であり、ここでは、「単一分子ガイド核酸」、「単一分子ガイド核酸」、又は「sgNA」と称する。「ガイド核酸」又は「gNA」とは、二分子ガイド核酸及び単一分子ガイド核酸の双方を意味する。ガイド核酸がRNAであるこれらの実施形態において、gRNAは、二重分子ガイドRNAまたは単一ガイドRNAであり得る。同様に、ガイド核酸がDNAであるこれらの実施態様においては、gDNAは二分子ガイドDNA又は単一ガイドDNAであり得る。
例示的な2分子ガイド核酸は、crRNA様(「CRISPR RNA」または「ターゲッター-RNA」または「crRNA」または「crRNA繰り返し」)分子と、対応するtracrRNA様(「trans-activator-RNA」または「tracrRNA」)分子とを含み、crRNA様分子(ターゲッター-RNA)は、ガイドRNAのポリヌクレオチドターゲットセグメント(一本鎖)と、本明細書でCRISPR繰り返し配列とも称される、ガイドRNAのポリペプチド結合セグメントのdsRNA二重鎖の半分を形成するヌクレオチドの伸長(「二本鎖形成セグメント」)との両方を含む。
「活性化剤核酸」または「活性化剤-NA」という用語は、本書では、二重分子ガイド核酸のtracrR-NAのような分子を意味する。「ターゲター核酸」または「ターゲター-NA」という用語は、本書では、二重分子ガイド核酸のcr-NAのような分子を意味するために使用される。「二重分子形成セグメント」という用語は、本書では、アクティベーター-NAまたはターゲター-NAのヌクレオチドの伸長を意味し、対応するアクティベーター-NAまたはターゲター-NAのヌクレオチドの伸長にハイブリッドすることによりdsPREXの形成に寄与するターゲター-NAを意味する。言い換えれば、アクティベーター‐NAは、対応するターゲター‐NAのデュプレックス形成セグメントを補完するデュプレックス形成セグメントを構成する。このように、アクティベータ‐NAは二重形成セグメントを、ターゲタ‐NAはガイド核酸の二重形成セグメントとDNAターゲティングセグメントの両方を含む。従って、被検者の二分子ガイド核酸は、一対応する活性化剤-NAとターゲター-NAの一対からなることができる。
アクティベーター‐NAは、アクティベーター‐NA(ガイド核酸のポリペプチド結合セグメントの他の部分)とハイブリッドするのに十分な相補性を持つ領域を構成するヌクレオチド配列を含むCRISPR繰り返し配列を含む。様々な実施形態において、CRISPRリピートシークエンスは約8のヌクレオチドから約30のヌクレオチドまたはそれ以上を含むことができる。例えば、CRISPR反復配列は、長さが約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、適切なアライメントアルゴリズムを用いて最適にアライメントされた場合、CRISPR反復配列とその対応するトラッカー配列の反反反復領域との間の相補性の程度は、約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはそれ以上である。
それに対応するtracr-R-NAのような分子(すなわちアクティベーター-NA)は、ガイド核酸のポリペプチド結合セグメントの二重複部分の他の部分を形成するヌクレオチド(二重形成セグメント)の延伸を構成する。言い換えると、crRNA様分子のヌクレオチドの伸長(すなわち、CRISPR反復配列)は、tracrRNA様分子のヌクレオチドの伸長(すなわち、抗反復配列)と相補的であり、ハイブリダイズして、ガイド核酸のポリペプチド結合ドメインの二本鎖二重鎖を形成する。crRNA様分子は、さらに一本鎖DNAターゲティングセグメントを提供する。したがって、crRNA様分子とtracrRNA様分子(一対応する一対として)がハイブリダイズして、ガイド核酸を形成する。所定のcrRNAまたはtracrRNA分子の正確な配列は、そのRNA分子が見出されるCRISPRシステムおよび種の特徴である。被検者二分子ガイドRNA、任意の一対応するcrRNAおよびtracrRNA一対を含むことができる。
トランス活性化のようなCRISPR RNまたはtracrR-NAのような分子(本稿では「活性化剤-NA」とも呼ばれる)は、本稿では反リピート領域と呼ばれる、CRISPRのリピートシークエンスとハイブリッド化するのに十分な補完性を有する領域からなるヌクレオチドシークエンスを含む。いくつかの実施形態において、tracrR-like分子は、更に、その対応するcrR-R-Rとハイブリッド化することにより、二次構造(例えば、茎-ループ)を有する領域または二次構造を形成する。特に、CRISPRリピートシークエンスに完全または部分的に補完的であるtracrR-RNのような分子の領域は、分子の5'端にあり、tracr-R-RNのような分子の3'端は二次構造を構成する。二次構造のこの領域は、一般に、ネクサスヘアピンを含むいくつかのヘアピン構造から成り、これは防繰り返し配列に隣接して見られる。nexusヘアピンはヘアピンステムの塩基に保存されたヌクレオチド配列をもつことが多く、tracrRNAのnexusヘアピンの多くにみられるモチーフUNANNCがある。tracrRNAの3'末端にはしばしば端子のヘアピンがあり、その構造と数はさまざまであるが、しばしばGCに富む停止剤非依存性の転写ターミネーターヘアピンと、それに続く3'末端にU'の文字列がある。例えば、Briner et al. (2014) Molecular Cell 56:333-339, Briner and Barrangou (2016) Cold Spring Harb Protoc; doi: 10.1101/pdb.top0902, and U.S. Publication No. 2017/0275648を参照してください。
様々な実施形態において、CRISPRリピートシークエンスの完全または部分的に補完的であるtracrR-RNのような分子の反リピート領域は、約8ヌクレオチドから約30ヌクレオチドまたはそれ以上を含む。例えば、tracrRNA様抗反復配列とCRISPR反復配列との間の塩基対形成領域は、長さが約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、CRISPR反復配列とその対応するtracrRNA様抗反復配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントされた場合、約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはそれ以上である。
様々な実施形態において、全体のtracrR-Rのような分子は約60のヌクレオチドから約140以上のヌクレオチドを含むことができる。例えば、tracrR-Rのような分子は、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、約105、約110、約115、約120、約125、約130、約135、約140、またはそれ以上の長さのヌクレオチドである。特定の実施形態では、tracrRNA様分子は、約80、約81、約82、約83、約84、約85、約86、約87、約88、約89、約90、約91、約92、約93、約94、約95、約96、約97、約98、約99、および約100ヌクレオチド長を含む約80～約100ヌクレオチド長である。
被検者な一分子ガイド核酸(すなわちsgNA)は、相互補完的な2つのヌクレオチド(ターゲターNAとアクチベーターNA)が、介入するヌクレオチド(「リンカー」または「リンカーヌクレオチド」)によって延伸結びついていて、融合して、タンパク質結合セグメントの二重ストライド核酸二重構造を形成し、それゆえ、茎-ループ構造を生み出す。ターゲッター-NAとアクチベーター-NAは、ターゲッター-NAの3'末端とアクチベーター-NAの5'末端を介して共有結合することができる。あるいは、ターゲッター-NAおよびアクチベーター-NAは、ターゲッター-NAの5'端部およびアクチベーター-NAの3'端部を介して共有結合することができる。
単一分子DNAターゲティング核酸のリンカーは、約3ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまでの長さを持つことができる。例えば、リンカーは、約3ヌクレオチド(nt)～約90 nt、約3nt～約80 nt、約3nt～約70 nt、約3nt～約60 nt、約3nt～約50 nt、約3nt～約40 nt、約3nt～約30 nt、約3nt～約20 ntまたは約3nt～約10 ntの長さを有することができ、これに限定されないが、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、単一分子DNAターゲティング核酸のリンカーは4 ntである。
一分子DNAターゲティング核酸の一例は、二重二重複体を形成するためにハイブリッド化する2つのヌクレオチドの補完的な延伸と、特定の標的配列とハイブリッド化するガイドシークエンスを含んでいる。
適宜自然発生の同種の一対のcrRNA(および、いくつかの実施形態では、tracrRNA)は、核酸誘導核酸として機能するほとんどのCasタンパク質で知られており、それらは、既知の反復コーディング配列またはそれらの変形例を探すことによって、tracrR-coding配列を確認するためのCas核酸誘導核酸性タンパク質の側面配列を配列決定し分析することにより、核酸導き核酸活性を有する特定の自然発生のCasタンパク質のために発見されたか、または決定されることができる。tracrRNAの反復領域は、dsタンパク質結合二重鎖の半分を構成する。タンパク質結合二重の1/2を構成する相補的繰り返しシークエンスをCRISPR繰り返しと呼ぶ。既知のCRISPR核酸誘導核酸によって利用されるCRISPR繰り返しおよび反繰り返し配列は、この当業者に知られており、例えば、crispr.i2bc.paris-saclay.fr/crispr/のインターネット上のCRISPRデータベースで見つけることができる。
単一のガイド核酸または二重ガイド核酸は、化学的にまたはin vitro転写によって合成することができる。核酸誘導ヌクレアーゼとガイド核酸との間の配列特異的結合を決定するためのアッセイは、当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、発現核酸誘導ヌクレアーゼとガイド核酸との間のインビトロ結合アッセイを含み、これは、検出可能な標識(例えば、ビオチン)でタグ付けされ得、核タンパク質複合体が検出可能な標識(例えば、ストレプトアビジンビーズで)を介して捕捉されるプルダウン検出アッセイにおいて使用される。ガイド核酸とは無関係の配列又は構造を有する制御ガイド核酸は、核酸に対する非特異的な結合の否定的制御として使用することができる。
特定の実施形態において、現在開示されている組成及び方法の部位指向の修飾ポリペプテッドは、ニカーゼとして機能するニュークレーズバリアントを含み、その中で、ニュークレーズは、野生型のニュークレーズと比較して、2本のストランドの核酸分子の1本のストランドのみを開くことができ、又は全く核酸活性を欠いている(すなわち、ニュークレーズデッド)ということになる、突然性を含んでいる。
ニッカーゼとして機能する核酸誘導ヌクレアーゼのようなヌクレアーゼは、単一の機能性ヌクレアーゼドメインのみを含む。これらの実施形態のいくつかでは、特定の領域の核酸活動が減少または除去されるように、追加の核酸ドメインが改変されている。
他の実施形態では、核酸(例えば、rna誘導核酸)は完全に核酸活性を欠いており、本稿では、核酸死体と呼ぶ。これらの実施形態のいくつかでは、ヌクレアーゼ内のすべてのヌクレアーゼドメインは、ポリペプチドのすべてのヌクレアーゼ活性が除去されるように変異されている。本技術で知られたどんな方法でも、米国Publに記載されているものを含め、部位指向核酸の1つ以上の核領域に突然異変を導入するために使用することができる。No.2014/0068797及び米国特許No.9,790,490は、いずれも引用によりその全体を組み込んでいる。
ヌクレアーゼ活性を減少または除去するヌクレアーゼドメイン内の任意の突然変異を使用して、ニッカーゼ活性を有する核酸ガイドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼデッド核酸ガイドヌクレアーゼを生成することができる。このようなミューテーションは、当業者において知られており、RuvC領域内のD10Aミューテーション又はS. pyogenes Cas9のHNH領域内のH840Aミューテーション、又はS. pyogenes Cas9と最大の均質性を有する場合には他のヌクレアーゼ誘導ヌクレアーゼエース内の類似の位置(s)を含むが、これらに限定されない。S. pyogenes Cas9のヌクレアーゼドメイン内の他の位置で、ニッカーゼまたはヌクレアーゼ死タンパク質を生成するように突然変異され得るものは、G12、G17、E762、N854、N863、H982、H983、およびD986を含む。ニカーゼまたは核酸によるデッド・タンパク質の核酸の領域内でニカーゼまたはヌセイド・ドゥード・タンパク質に導くことができる核酸導き核酸の領域内の他の枝変わりには、D917A、E1006A、E1028A、D1227A、D1227A、N1257A、D917A、E1006A、E1028A、D1227AおよびN1257Aが含まれる。これらは、F. novicida Cpf1タンパク質(米国特許番号9,790,490)と最大の同質性のためにアラインメントされた場合、他の核酸導き核の中の同位置にある。
核酸のデッド・ドメインを含む部位指向の修飾ポリペプチドは、さらにポリヌクレオチドを修飾することができる領域を構成することができる。限定されていない、核酸のデッドドメインに融合されうるドメインを修飾することの例としては、転写活性化または抑圧ドメイン、ベース編集ドメイン、および遺伝子組み換えドメインが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、核酸のデッド・ドメインを含む部位指向の修飾ポリペプチドは、さらに、標的配列の存在を検出する助剤となる検出可能な標識ヌクレアーゼ死ドメインに融合させることができるエピジェネティック修飾ドメインは、DNA配列自体を変化させることなくヒストン構造および/または染色体構造を変化させるためにDNAまたはヒストンタンパク質を共有結合的に修飾する働きをし、遺伝子発現の変化(アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション)をもたらす。部位特異的修飾ポリペプチドによって誘導され得るエピジェネティック修飾の非限定的な例には、ヒストン残基およびその逆反応における以下の変更が含まれる。
スモイル化、アルギニンまたはリジン残基のメチル化、リジン残基のアセチル化またはユビキチン化、セリンおよび/またはトレオニン残基のリン酸化;ならびにDNAの次の変更およびその逆反応:シストシン残基のメチル化またはヒドロキシメチル化。エピジェネティック修飾ドメインの非限定的な例としては、このように、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストン脱アセチル化ドメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストン脱メチル化酵素ドメイン、DNAメチルトランスフェラーゼドメイン、およびDNA脱メチル化酵素ドメインが挙げられる。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、転写制御要素および/または転写調節タンパク質、例えば転写因子またはRNAポリメラーゼとの相互作用を介して少なくとも1つの隣接する遺伝子の転写を活性化する転写活性化ドメインを含む。適切なトランスクリプショナル活性化ドメインは、VP16活性化ドメインを含むが、これに限定されない。
他の実施形態では、部位指向ポリペプチドは、少なくとも1つの隣接する遺伝子の転写を減少または終了させるために、転写制御要素および/または転写規制タンパク質、たとえば転写因子またはリボンポリメラーゼと相互作用することができる転写上記領域を含む。適切な転写抑制ドメインは当技術分野で公知であり、IκBおよびKRABドメインを含むが、これらに限定されない。
まだ他の実施形態においては、核のデッド・ドメインを含む部位指向の修飾ポリペプチドは、さらに、病気に関連したシークエンスであるかもしれない標的シークエンスの存在を検出するのに助剤検出可能な標識を含む。検出可能な標識とは、可視化またはその他の方法で観察できる分子のことである。検出可能な標識は、核酸誘導核酸を核融合性たんぱく質(例えば、蛍光性たんぱく質)として融合され得るか、あるいは、目視または他の手段で検出可能な核ポリペプチドに結合された低分子であり得る。融合性たんぱく質として現在開示されている核酸誘導核酸と融合可能な検出可能な標識には、検出可能なプロテイン領域、すなわち、蛍光たんぱく質または特定の抗たんぱく質で検出可能な領域を含むが、これに限定されない。蛍光タンパク質の限定されない例としては、緑色蛍光タンパク質(例:GFP、EGFP、ZsGreen1)および黄色蛍光タンパク質(例:YFP、EYFP、ZsYellow1)が挙げられるが、低分子検出ラベルの限定されない例としては、3 Hや35 Sのような放射性ラベルが含まれる。
核酸ガイド核酸は、運搬システムの一部として、核酸ガイド核酸に結合した核酸ガイド核酸を含む核タンパク複合体として細胞に運搬することができる。また、核酸ガイド核酸とガイド核酸は別個に用意されている。ある種の実施形態では、誘導RNは、目標セルに入ることができ、それは、RN分子である。ガイドは、in vitroまたは化学的に合成することができる。他の実施形態では、ガイド・トランスをエンコードするヌクレオチド配列が細胞に導入される。これらの実施形態の幾つかにおいて、ガイドrnをエンコードするヌクレオチド配列は、促進剤(例えば、rnaポリメレースIII促進剤)と動作的にリンクされており、これは、天然促進剤であったり、ガイドrnaエンコードするヌクレオチド配列へのヘテログザスであったりする。
特定の実施形態において、部位指向ポリペプチドは、少なくとも一つの核局在配列(NLS)のような追加のアミノ酸配列を含むことができる。核局在配列は、部位特異的ポリペプチドの細胞核への輸送を増強する。核に輸入されるたんぱく質は、通常リジンとアルギニン残基に最もよく結合するインポートインポート/カリフェリンプロテインのように、核孔複合体内の1つ以上のたんぱく質と結合する。核局在化の最もよく調べられている経路には、インポーチン-αタンパク質に結合する短いペプチド配列がある。これらの核局在化配列は、しばしば基本的なアミノ酸の延長線上にあり、また、輸入α上に2つの結合サイトがあることを考えると、少なくとも10のアミノ酸によって分離された2つの基本配列が、二分の1のNLSを構成することができる。二番目に特徴的な核輸入の経路は、輸入者-ベータ1タンパク質、たとえばHIV-TATとHIV-REVタンパク質に結合するタンパク質であり、これはRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 322)とRQARRNRRRRWR (SEQ ID NO: 323)の配列を用いて、それぞれインポートインパクト-ベータ1に結合する。他の核局在化配列は本技術に知られている(例えば、Lange et al., J. Biol. Chem. (2007) 282:5101-5105を参照)。NLSは、部位指向ポリペプチドまたはヘテロロゴのNLSの自然発生NLSであることができる。ここでいう「異種」とは、配列を指す「異種」とは、外来種に由来する配列のことであり、または、同一種に由来する場合には、意図的な人間の介入により、その本来の形態から組成物および/またはゲノムの位置づけにおいて実質的に修正される配列のことである。部位指向ポリペプチドの核局在化を強化するために使用できるNLS配列の限定されていない例には、SV40のLarge T-angineとc-MycのNLSが含まれる。特定の実施例において、NLSは、アミノ酸配列PKKKRKV (SEQ ID NO: 324)を含む。
部位指向のポリペプチドは、2、3、4、5、6、またはそれ以上のNLS配列のように、1つ以上のNLSを構成することができる。複数のNLSの各々が連続してユニークであるか、または使用される同じNLS配列の1つ以上であることができる。NLSは、部位指向ポリペプチドのアミノ-端子(N-端子)端、カルボキシー-端子(C-端子)端、またはポリペプチドのN-端子とC-端子端の両方に存在することができる。特定の実施形態において、部位指向ポリペプチドはそのN-端子端の4つのNLS配列を含む。他の実施形態では、部位指向ポリペプチドは、部位指向ポリペプチドのC-端子端の2つのNLS配列を含む。その他の実施形態において、部位指向ポリペプチドは、そのN-端子端の4つのNLS配列とそのC-端子端の2つのNLS配列からなる。
特定の実施形態において、部位指向ポリペプチドは、電池を貫通するペプチド(CPP)を含み、それは、電池のプラズマ膜を通して、結合したタンパク質またはペプチドを吸収することを誘発する。CPPは一般的に細胞の中に入るのを誘発する。なぜなら、その一般的な形状と、自己集合が膜を覆う穴に入る傾向があるからである。あるいは、いくつかの正電荷残留物があるからである。これらの残留物は、負電荷を帯びたリン脂質外膜と相互作用し、膜の曲率を誘発し、それが内在化を活性化する。例示的な透過性ペプチドとしては、以下に限定されるものではないが、トランスポータン、PEP1、MPG、p-VEC、MAP、CADY、ポリR、HIV-TAT、HIV-REV、ペネトラチン、R6W3、P22N、DPV3、DPV6、K-FGF、およびC105Yが挙げられ、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、van den BergおよびDowdy (2011)バイオテクノロジー22:888-893およびFarkhaniら(2014)ペプチド57:78-94における現行の意見でレビューされている。
NLSに加えて、または、それに代わるものとして、部位指向のポリペプチドは、融合性たんぱく質を形成するために、ここに記載されている検出ラベル(例えば、蛍光性たんぱく質)または精製タグのような、さらなるヘテロのアミノ酸配列を含むことができる。精製タグは、たんぱく質を分離したり、混合物(例えば、生物サンプル、培養媒体)から融合したたんぱく質を分離するのに利用できるあらゆる分子である。精製タグの限定されない例としては、ビオチン、myc、マルトース結合タンパク質(MBP)、およびグルタチオン‐S‐トランスフェラーゼ(GST)がある。
現在開示されている組成及び方法は、修復される(例えば、誤りがちな非同質的エンド結合(NHEJ)、微小ホモロジー媒介のエンド結合(MMEJ)、又は特定のゲノム位置での突然変異を導入するための代替的エンド結合(alt-EJ)経路を通して、配列特有の、二本鎖の切断を導入することを通してゲノムを編集するために使用することができる。修理工程の誤差が多いため、二本鎖の切断の修理は、目標の配列を変更することがあります。別の方法として、ドナーテンプレートポリヌクレオチドは、導入された二本鎖の切断の修復過程の間に、標的配列に組み込まれ、または交換され、結果的に外生ドナー配列を導入することができる。従って、組成物及び方法は、側面の同質体端部を含むことができるドナーテンプレートポリヌクレオチドを更に構成することができる。これらの実施例のいくつかにおいて、ドナーテンプレートポリヌクレオチドは、別の所で説明されるリンカーを介して部位指向ポリペプチドに結合される(例えば、ドナーテンプレートポリヌクレオチドは、クレーバブルリンカーを介して部位指向ポリペプチドに結合される)。
いくつかの実施形態において、ドナー配列は、新たに統合されたドナー配列が核酸誘導核酸によって認識され、切り離されないように、元の標的配列を変える。ドナー配列は、相同指向修理によるドナー配列の統合を強化するために、ターゲット配列に側面を置く配列と実質的な配列同一性有するフランキング配列を構成することができる。特に、核酸誘導核酸が二重ストランドよじれたよじれの破断を発生する実施例では、ドナーポリヌクレオチドは互換性のオーバーハングによって側面に囲まれ、二重ストランドの破れの修復中に非ホモロゴス修理工程を経てドナー配列を組み込むことを可能にする。
本開示の核酸操作試薬は、適当な送達方法を用いて、幹細胞に導入することができる。デリバリーはin vitro、ex vivo、またはin vivo administrationで行うことができます。核酸操作試薬を導入するための例示的な方法は、トランスフェクション、エレクトロラルメソッド及びバイラルベースの方法を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施例では、遺伝子編集成分の導入前に、幹細胞は被検者から分離される。幹細胞を生体外で遺伝的に改変し、被検者に戻す(例えば、移植する)ことができる。一実施の形態では、被検者は電池が分離されるのと同じ被検者である。別の実施形態では、被検者は電池が分離される被検者とは異なる。特定の実施において、自色の茎/前駆細胞は、生体外で改変され、被検者に戻される。別の実施形態では、異性の茎/前駆細胞は、生体外で改変され、被検者に戻される。
幹細胞の遺伝的変形には、ここに記載されている幹細胞へのgR分子、カス9分子、および任意に、ドナーテンプレート核酸の送達が含まれることができる。一実施形態では、gRNA分子、Cas9分子、またはその両方、および任意に鋳型核酸は、ウイルスベクター、例えば、AAVベクターまたはレンチウイルスベクター、例えば、積分欠損レンチウイルス(IDLV)によって送達される。別の実施形態では、gRNA分子/カス9分子のリボヌクレオプロテイン複合体として、gRNA分子とCas9分子を送付する。別の実施形態において、gRNAmoleculeおよびCas9分子は、RNAとして送達される。テンプレート核酸は、遺伝子置換療法のためのターゲット遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含むことができる。特定の実施形態において、テンプレート核酸は、病気または病気のリスクに関連する突然異変を含まない。テンプレート核酸は、標的幹細胞内にプロモーター配列を含むことができる。特に、テンプレート核酸はスプライスドナーまたはアクセプターを含む。別の実施形態では、テンプレート核酸はポリアデニール化シグナルを含む。
いくつかの実施形態において、1つ以上の細胞吸収試薬はトランスフェクション試薬である。トランスフェクション試薬としては、例えば、ポリマーベースの(例えば、DEAEデキストラン)トランスフェクション試薬およびカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション試薬が挙げられる。また、原子核酸操作試薬の吸収を容易にするために、電気処理法が用いられることもある。分野を適用することにより、細胞内に変形した透過膜ポテンシャルを引き起こし、透過膜ポテンシャルの純値(適用と休止ポテンシャルの差の合計)が閾値より大きくなると、膜内に一過渡的な浸透構造が生み出され、電磁化が達成される。例えば、Gehlら、Acta Physiolを参照。スキャンド。177:437-447 (2003).
また、核酸操作剤は、幹細胞へのウイルスの伝達を通して運ばれることもある。適切なバイラル・送達システムには、アデノ関連ウイルス(AAV)レトロウィルスおよびレンチウィルス送達システムが含まれるが、これらに限定されない。このようなウイルス送達システムは、幹細胞がトランスフェクションに抵抗する場合に特に有用である。ウイルスを媒介とした搬送システムを使用する手法には、さらに、核酸操作試薬をエンコードするウイルスベクターを準備し、ベクターをウイルス粒子にパッケージングする工程が含まれ得る。
核酸試薬の送達の他の方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、裸のDNA、人造ビリオン、ナノ粒子、および核酸の薬剤増強取り込みが挙げられるが、他に限定されない。Neiwoehner et al., Nucleic Acids Res.も参照のこと。42:1341-1353 (2014), (2014)は、ここに引用により、すべての目的、特に試薬送達システムに関連するすべての教示に組み込まれている。いくつかの実施例では、非ウイルスベクトル送達システムは、DNAプラスミド、rna(例えば、ここに記載されたベクトルの転写物)、裸の核酸、及びリポソームのような運搬車両と複合した核酸を含む。
遺伝子的に変化する幹細胞は、関心のある遺伝子の目標位置(例、標的の交雑位置)を変化させることができる。標的の位置を変えることは、例えば、遺伝子の1つ以上の突然変異を修復する(例えば、修正または変更する)ことによって達成される。特定の実施では、人工変異はホモロジーによって修復され、修復を指示する。相同指向性修理を用いて、突然変異対立遺伝子を修正し、野生型状態に回復させる。1つの実施形態において、遺伝子における突然変異の修正は、野生型遺伝子活性を復元させる。血幹、ポリヌクレオチドを標的遺伝子にノックすることによっても改変することができる。ある実施形態では、ポリヌクレオチドをノックすることにより、野生型遺伝子活動が復元する。
特に、幹細胞は、ターゲット遺伝子の活性をノックアウトまたはノックダウンするように修正することができる。標的位置を変更することは、(1)遺伝子の: (a)遺伝子の初期コーディング領域に近接またはその内部に1つ以上のヌクレオチドの挿入または欠失(例えば、NHEJ媒介挿入または欠失)、または(b)遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列の欠失(例えば、NHEJ媒介欠失)、または(2)遺伝子のプロモーター領域を標的とすることにより、酵素的に不活性なCas9(eiCas9)分子またはeiCas9-融合タンパク質(例えば、転写リプレッサーに融合)によって媒介される遺伝子をノックダウンすることによって達成することができる。
治療の適応
本稿で述べるように、遺伝子組み換えHSC移植治療は、治療を必要とする被検者に施すことができ、1種類以上の血球を対象遺伝子の変更で移植することができる。造血幹細胞は一般的に多分化能を示し、したがって、顆粒球(例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球)、赤血球(例えば、網状赤血球、赤血球)、血小板(例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板)、単球(例えば、単球、マクロファージ)、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、およびリンパ球(例えば、NK細胞、B細胞およびT細胞)を含むが、これらに限定されない複数の異なる血液系統に分化することができる。さらに、造血幹細胞は、自己複製能力を有し、したがって、母細胞と同等の能力を有する娘細胞を生じさせることができ、また、移植レシピエントに再導入される能力を特徴とし、その際、それらが造血幹細胞ニッチに帰着し、再増殖的かつ持続的な造血を確立することができる。
したがって、本明細書に記載の組成物および方法は、非悪性異常ヘモグロビン症(例えば、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ファンコニ貧血、再生不良性貧血、およびウィスコットアルドリッチ症候群からなる群から選択される異常ヘモグロビン症)を治療するために使用することができる。加えて、または、代替的に、ここに記載される組成物及び方法は、例えば先天性のウイルスのような、ウイルスを治療するために使用することができる。加えて、または、別の方法として、ここに記載される組成物及び方法は、後天的なウイルス(例えば、HIVおよび助剤から成るグループから選ばれた後天的なウイルス)を治療するために使用することができる。本明細書に記載の組成物および方法は、代謝障害(例えば、グリコーゲン蓄積症、ムコ多糖症、ゴーシェ病、ハーラーズ病、スフィンゴ脂質症、および異染性白質ジストロフィーからなる群から選択される代謝障害)を治療するために使用することができる。
いくつかの実施例において、本方法は、ヘモグロビンに影響を発明一群の障害である鎌状赤血球症を治療するために使用することができる。この病気の被検者は異型ヘモグロビン(ヘモグロビンS)をもっていて、赤い血球が鎌状に変形したり、三日月状に変形することがあります。この病気の特性は、赤い血球が少ないこと(貧血)、感染症を繰り返すこと、痛みが周期的に起こることなどです。HBB遺伝子の突然変異は鎌状赤血球症を引き起こす。HBB遺伝子は、ベータ-グロビンをつくるための命令を提供する。HBB遺伝子の異なる突然変異によって、さまざまな種類のβグロビンが生じる。ある特定のHBB遺伝子突然変異は、ヘモグロビンS (HbS)として知られる異常型のβグロビンを産生する。HBB遺伝子の他の突然変異は、ヘモグロビンC (HbC)やヘモグロビンE (HbE)のようなβグロビンの追加の異常型をもたらす。HBB遺伝子突然変異はまた、異常に低いレベルのベータグロビン、すなわちベータサラセミアをもたらしうる。鎌状赤血球症の人では、ヘモグロビン中のβグロビンサブユニットの少なくとも1つがヘモグロビンSに置き換わっています。鎌状赤血球症の一般的な型である鎌状赤血球貧血では、ヘモグロビンのβグロビンサブユニットの両方がヘモグロビンSに置き換わっています。他のタイプの鎌状赤血球症では、ヘモグロビン中のたった1つのベータ‐グロビンサブユニットがヘモグロビンSに置き換わり、もう1つのベータ‐グロビンサブユニットがヘモグロビンCなどの異なる異常な変形例に置き換わります。たとえば、鎌状赤血球ヘモグロビンC (HbSC)病の人は、ヘモグロビンSとヘモグロビンCをもつヘモグロビン分子をベータ‐グロビンの代わりにもっています。ヘモグロビンSとβサラセミアを引き起こす突然変異が同時に起こると、ヘモグロビンSβサラセミア(HbSBetaThal)病になります。既知の遺伝子編集方法を用いて、鎌状赤血球症を引き起こす突然変異のうちのいずれか1つ以上を、本方法に使用するために血幹中で変更することができる。さらに、またはその代替として、機能的HBB遺伝子を移植のために幹細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態において、本手法は、ヘモグロビンの作製を減少させる血液障害であるベータ・サラセミア(ベータ・タルとも呼ばれる)の治療に使用することができる。ベータサラセミアの被検者では、ヘモグロビン値が低くなると、体内の多くの部位で酸素が不足します。また、患者は赤い血球が不足し(貧血)、皮膚が青白くなる、脱力、倦怠感、より重篤な合併症を起こすことがあります。ベータサラセミアの人は、異常な血栓ができるリスクが高くなります。ベータサラセミアは、症状の重症度によって、サラセミアメジャークーリー貧血としても知られる)と中間型サラセミアの2種類に分類されます。2つのタイプのうち、サラセミアメジャーの方が厳しいです。HBB遺伝子の突然変異はβサラセミアを引き起こす。HBB遺伝子は、ベータ-グロビンをつくるための命令を提供する。HBB遺伝子の突然変異の中には、βグロビンの産生を妨げるものもある。βグロビンがないことをβゼロ(Bo)サラセミアと呼ぶ。他のHBB遺伝子の突然変性により、ベータ・グロビンのいくつかは生成されるが、減少した量、すなわちベータ・プラス(B+)・サラセミアを作ることができる。どちらのタイプの人も、大サラセミアと中間サラセミアと診断されています。いくつかの実施例において、ベータ・サラセミアのある希少な形成は、デルタ-又はガンマ-グロビン(HBG1及びHBG2、UniProt P69891及びP69892、それぞれ)の欠陥製造によって引き起こされる。既知の遺伝子編集方法を用いて、βサラセミアを引き起こす突然変異のいずれか1つまたは複数を、本方法で使用するために血幹中で変更することができる。さらに、またはその代替として、任意の1つまたは複数の機能性遺伝子(例えば、HBB、HBG1、HBG2)を、移植のために幹細胞に導入することができる。http://dx.doi.org/10.5772/61441;等参照Pondarre and Badens, Ann.生涯。Clin (Paris) 72(6): 639-668, 2014.
いくつかの実施例では、本方法は、アデノシンデミナーゼ欠乏(ADA欠乏またはADA-SCID (重度複合免疫不全症型感染症)とも呼ばれる)を治療するために使用されることができる。これは、アデノシンデミナーゼ(ADA)の欠如による血液障害を引き起こす代謝障害である。重度複合免疫不全症の人は、細菌、ウイルス、真菌から事実上すべての免疫防御能を欠いています。非常に重篤または寿命を脅かす可能性のある感染症を繰り返し、持続する傾向がある。これらの感染症は、免疫システムが正常な人には普通は病気を起こさない「日和見」微生物が原因であることがよくあります。ADA欠損症の人のほとんどは、生後6カ月以内に重度複合免疫不全症と診断される。治療を受けなければ、通常、この赤ちゃんは2歳を過ぎても生き残れません。約10～15%の症例では、免疫不全の発症が生後6～24カ月の間(遅発型)または成人になるまで(遅発型)遅れる。これらの後期発症例の免疫不全は重症度が低い傾向があり、主に再発性上気道および耳の感染症を引き起こす。やがて罹患者は、慢性的な肺の損傷、栄養不良、その他の健康上の問題を起こすことがある。既知の遺伝子編集方法を用いて、ADAを引き起こすアデノシンデアミナーゼ遺伝子における突然変異のうちのいずれか1つでも、本方法に使用するために幹細胞において改変することができる。さらに、またはその代替として、機能的アデノシンデアミナーゼ遺伝子を移植用の幹細胞に導入することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子組み換え血幹はStrimvelisTM (ヒトのADA cDNA配列をエンコードするレトロウィルスベクターで変換されたCD34+電池を含むオートロガスCD34+濃縮電池分率)である。
いくつかの実施形態において、本手法は、酵素アリールスルファターゼA (ARSA)の欠損によって引き起こされるリソソーム蓄積症である異染性白質ジストロフィー(MLDまたはArylsulfatase A欠損とも呼ばれる)を治療するために使用することができ、細胞中のスルファチドと呼ばれる脂肪の蓄積によって特徴づけられる。この蓄積は、特に神経を絶縁して保護する物質であるミエリンを産生する神経系の細胞に影響を及ぼします。ミエリンで覆われた神経細胞は、白質と呼ばれる組織を構成しています。ミエリン産生細胞に硫酸塩が蓄積すると、脳や脊髄(中枢神経系)、脳と脊髄を筋肉につなぐ神経や、触覚、疼痛、熱覚、音覚(末梢神経系)などの感覚を検出する感覚上記、神経系全体に白質の進行性の破壊(白質ジストロフィー)が起こります。変色性白色血球症の人では、白色物質のダメージにより、知的機能や歩行能力などの運動能力の劣化が進行する。また、四肢の感覚消失(末梢神経障害)、失禁、けいれん発作、麻痺、発語不能、失明、難聴も起こります。最終的に周囲の意識を失い、反応しなくなります。既知の遺伝子編集方法を用いて、MLDを引き起こすARSA遺伝子の突然変異のうちのいずれか1つ以上を血幹中で変化させて、本方法に使用することができる。さらに、または代わりに、移植のために、官能基ARSA遺伝子を幹細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態において、本方法は、ヴィスコット-オールドリッチ症候群(WASまたは湿疹-血小板減少症-免疫不全症候群とも呼ばれる)、WASp遺伝子の突然変異によって引き起こされるX連鎖劣性疾患、および異常な免疫系機能(免疫不全)および血餅を形成する能力の低下を特徴とする疾患を治療するために使用することができる。ウィスコットアルドリッチ症候群の患者は、凝固に関与する血球フラグメント(血小板)の数と大きさの減少である微小血小板減少症を呈する。この血小板異常は、典型的には出生時から存在し、軽度の外傷後に易傷性、血性下痢、または遷延性出血のエピソードを引き起こす可能性がある。微小血小板減少症では、表皮の表面のすぐ下に小さな出血領域が生じ、紫斑と呼ばれる紫がかった斑点や、点状出血と呼ばれる小さな赤い斑点の発疹が生じます。場合によっては、出血が命にかかわることもあります。ウィスコット‐アルドリッチシンドロームはまた、異常または非機能的な、例えば、シテ血球によって特徴づけられる。白色血球の変化は、ヴィスコット‐オールドリッチ症候群の患者では、いくつかの免疫疾患や炎症性疾患のリスク増大につながります。これらの免疫障害の重症度は様々で、易感染性や湿疹(赤く刺激された表皮の異常な斑点を特徴とする炎症性表皮疾患)が多くみられる。
ヴィスコット‐オールドリッチ症候群の患者は、関節リウマチや溶血性貧血などの自己免疫疾患を発症する危険性が高くなります。このような疾患は、免疫系が故障しなくなり、自分自身の組織や臓器を攻撃することによって起こります。ヴィスコット‐オールドリッチ症候群の患者さんでは、免疫系細胞のがん(リンパ腫)など特定タイプのがんが発生する可能性も高くなります。既知の遺伝子編集法を用いて、ウィスコット‐アルドリッヒシンドロームの原因となるWASP遺伝子のどれかの突然変異のうちの1つは、本方法で使用するために血幹内で改変することができる。さらに、または代わりに、移植のために幹細胞に機能的なWASP遺伝子を導入することができる。
いくつかの実施形態において、本方法は、酵素食細胞NADPHオキシダーゼの欠損をもたらし、免疫不全を引き起こす、5つの異なる遺伝子のうちのいずれか1つの変異によって引き起こされる、慢性肉芽腫性疾患(CGDとも呼ばれる)を治療するために使用することができる。慢性肉芽腫性疾患の患者は、細菌および真菌感染を繰り返すことがある。この病態の人は、さまざまな組織に炎症部位(肉芽腫)ができて、その組織に損傷が生じることもあります。これらの患者では、肺が最も頻度の高い感染領域である;肺炎がこの病態の一般的な特徴である。慢性肉芽腫性疾患の患者は、マルチ肺臓炎と呼ばれる真菌性肺臓炎の一種を発症することがあり、マルチ、干し草、死んだ葉などの腐敗した有機物質にさらされた後に発熱や息切れを起こします。これらの有機物質やその分解にかかわる多数の真菌にさらされると、慢性肉芽腫症の人は肺に真菌感染症を起こします。慢性肉芽腫性疾患の患者によくみられる感染部位にはこのほか、表皮、肝臓、リンパ節などがあります。さらに、炎症は、CGD患者において身体の多くの異なる領域で起こり得る。最も一般的には、肉芽腫は消化管および泌尿生殖器に生じる。既知の遺伝子編集方法を用いて、CGDを引き起こす食細胞NADPHオキシダーゼ遺伝子の突然変異のうちのいずれか1つ以上を血幹中で変化させて、本方法に使用することができる。さらに、またはその代替として、官能基食細胞NADPHオキシダーゼ遺伝子を、移植のために幹細胞に導入することができる。
特定の実施形態では、本方法は、GALC遺伝子の突然変異によって引き起こされる球様細胞白質萎縮症(GCL、ガラクトシルセラミドリピドーシスまたはクラブベ病とも呼ばれる)を治療するために使用することができる。GALC遺伝子は、ガラクトシルセラミダーゼを作るための命令を提供し、ガラクトシルセラミダーゼは、特定の運命(例、ガラクトリピド)を破壊する。ガラクトシルセラミドと呼ばれるガラクトリピドをガラクトシルセラミドによって分解したものはミエリンの重要な成分である。ガラクトシルセラミドの分解は、生涯にわたって起こるミエリンの正常な代謝回転の一部である。別のガラクト脂質は、ミエリンの製造過程で形成されるサイコシンと呼ばれ、ガラクトシルセラミダーゼで分解されないと有毒である。一般に、GCLは神経の保護的髄鞘被覆の成長に影響を与え、運動能力の重度の変性を引き起こす。また、GCLは脳内の球様細胞と呼ばれる異常な細胞を特徴とします。球様細胞は大型の細胞で、通常は複数の核をもっています。既知の遺伝子編集方法を用いて、GCLを引き起こすGALC遺伝子の突然変異のいずれか1つ以上を血幹中で変化させて、本方法に使用することができる。さらに、またはその代替として、機能的GALC遺伝子を移植のために幹細胞に導入することができる。
いくつかの実施例において、本方法は、イドゥロニダーゼアルファ-L遺伝子(IDUA遺伝子)の突然異変により引き起こされたMPSの形態である粘膜性1型(MPSタイプIとも呼ばれる)(すなわち、アルファ-L-mucopolysaccharidesとして知られる複雑な炭水化物をより単純な分子に代謝することができない)の治療に使用することができるが、これは、アルファ-L-iduronidaseの欠陥につながる。IDUA酵素活性が欠損すると、細胞内、特にリソソーム内部にグリコサミノグリカン(GAG)が蓄積する。MPS1の患者では、頭が大きく(巨頭症)、脳内に流体がたまり(水頭症)、心臓弁の異常、肝臓と脾臓の肥大(肝脾腫)、大きな舌(巨舌症)がみられます。声帯が大きくなり、声が深くなり、声がしゃがれる。MPS Iの人によっては気道が狭くなり、頻繁な上気道感染症を起こし、睡眠中の呼吸が短く休止する(睡眠時無呼吸)ことがある。MPS Iを使用している人は、角の曇りを起こすことが多く、視力を大きく失うことがあります。罹患者はまた、難聴および反復性の耳感染症を有することがある。MPS Iの人の中には、低身長と継手の変形(拘縮)があり、可動性に影響を及ぼしている人もいる。この病気の重症型の人の大半は、多発性骨異形成症(複数の骨格異常を指します)も併発してる。脊柱管が狭くなる(脊柱管狭窄症)と、首が圧迫されて脊髄が損傷を受けることがある。既知の遺伝子編集方法を用いて、MPS I型を引き起こすIDUA遺伝子の突然変異のうちのいずれか1つ以上を血幹中で変化させて、本方法に使用することができる。
さらに、またはその代替として、機能的IDUA遺伝子を移植のために幹細胞に導入することができる。加えて、または、代替的に、ここに記載される組成物及び方法は、悪性または拡散障害、例えば、数学的ガン、ミロロリフェラティブ病、特にここに記載される活用を扱うために使用することができる。癌治療の場合には、移植細胞が内生細胞枯渇工程によって作られたニッチに帰着し、生産的な血液細胞を確立することができる、血液細胞移植治療の前に内生血液細胞の集団を減少させるために、ここに記載された組成及び方法を患者に施すことができる。これは、次に、全身化学療法の間のような、癌細胞根絶の間に枯渇した細胞の集団を再構成することができる。本明細書に記載される組成物および方法を用いて治療することができる例示的な血液がんには、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、ならびに神経芽細胞腫を含む他の癌性状態が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本明細書に記載される組成物および方法で治療することができるさらなる疾患は、限定されるものではないが、アデノシンデアミナーゼ欠損症および重度複合免疫不全症、高免疫グロブリンM症候群、チェディアック-東病、遺伝性リンパ組織球症、大理石骨病、骨形成不全症、蓄積症、主要サラセミア、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、および若年性関節リウマチを含む。
本明細書に記載の組成物および方法は、造血幹細胞移植療法の前に内因性造血幹細胞の集団を枯渇させることによって自己免疫疾患を治療するために使用することができ、その場合、移植された細胞は、内因性細胞枯渇段階によって作り出されたニッチに帰宅し、生産的造血を確立することができる。これは、次に、自己免疫細胞根絶の間に枯渇した細胞の集団を再構成することができる。
本明細書に記載される組成物および方法を用いて治療することができる自己免疫疾患には、限定されるものではないが、乾癬、1型糖尿病(RA)、関節リウマチ(SLE)、ヒト全身性ループス(MS)、炎症性腸疾患(IBD)、リンパ球性大腸炎、急性散在性脳脊髄炎(ADEM)、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群(APS)、再生不良性貧血、自己免疫性内耳疾患(AIED)、自己免疫性リンパ増殖性症候群(ALPS)、自己免疫性卵巣炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、慢性疲労性免疫不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーが含まれる クローン病、瘢痕性類天疱瘡、コエリアックスプルー皮膚炎、寒冷凝集素症、デゴス病、円板状エリテマトーデス、自律神経異常症、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛症-線維筋炎、グッドパスチャー症候群、Guillain-Barre症候群(GBS)), 橋本甲状腺炎、化膿性汗腺炎、特発性及び/又は急性血小板減少性紫斑病、IgAニューロパチー、若年性関節炎、川崎病、ライム病、メニエール病、混合性結合組織病(MCTD)、重症筋無力症、神経筋強直症、視神経炎、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性軟骨炎及び皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、原発性無ガンマグロブリン血症、レイター症候群、リウマチ熱、強皮症 シェーグレン症候群、こわばり人症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎(「巨細胞性動脈炎」としても知られる)、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、外陰部痛(「外陰前庭炎」)、ヴェーゲナー肉芽腫症。
抗体薬物コンジュゲート(ADC)
アンティボディーズ
本明細書に記載するように、本発明の方法は、造血幹細胞および/または免疫細胞上の特定の分子、例えば、CD2、CD5、CD13、CD22、CD30、CD34、CD36、CD42a、CD42c、CD43、CD45RA、CD45RC、CD45RO、CD47、CD49d、CD49f、CD50、CD53、CD68、CD72、CD81、CD85A、CD90、CD104、CD105、CD109、CD111、CD114、CD117、CD123、CD126を標的とするADCの使用を含む CD127、CD133、CD135、CD137、CD138、CD151、CD157、CD162、CD168、CD172a、CD173、CD175、CD176、CD183、CD191、CD200、CD205、CD217, CD220, CD221, CD222, CD223, CD224, CD225, CD226, CD227, CD228, CD229, CD230, CD235a, CD235b, CD236, CD236R, CD238, CD240, CD242, CD243, CD252, CD277, CD292, CDw293, CD295, CD298, CD309, CD318, CD324, CD325, CD338, CD344, CD349、またはCD350。幾つかの実施例において、ADCは、HSCs及び/又はレムセル上の特定分子の1つ以上に特別に結合する、それらの抗原結合フラグメントを含む。本方法で使用するのに適した抗剤を生成する方法は、当業者に容易に利用可能である。
抗CD117抗体
GNK+ CD117のようなCD117を結合することができる反体または抗原結合フラグメントは、例えば、(i)CD117+細胞によって特徴づけられるがんおよび自己感染症の治療に、(ii)移植治療を必要とする患者における移植遺伝子改良型の遺伝子造血幹細胞の移植を促進するために、単独または共役(ADC)として使用することができる。これらの治療活性は、例えば、癌細胞、自己免疫細胞、または造血幹細胞のような細胞の表面上に発現されるCD117(例えば、GNNK+ CD117)に結合し、続いて細胞死を誘導する、単離された抗CD117抗体、その抗原結合フラグメントの結合によって引き起こされ得る。内因性造血幹細胞の枯渇は、移植された造血幹細胞が帰宅できるニッチを提供し、続いて、生産的造血を確立することができる。このように、移植された血液細胞は、ここに記載された幹細胞障害に苦しむ人間のような患者において、接ぎ木に成功する可能性がある。
ヒトCD117(c-Kit、mRNA NCBI参照配列: NM_000222.2、タンパク質BINC参照配列: NP_000213.1とも呼ばれる)に結合することができる抗体および抗原結合フラグメント(GNNK+ CD117に結合することができるものを含む)は、造血幹細胞移植治療のために患者をコンディショニングするために、本明細書に記載の組成物および方法と併せて使用することができる。集団のかなりの割合でCD117のコーディング領域または細胞外ドメインに影響を及ぼす多型は、現在、非腫瘍学的表示ではよく知られていない。CD117には少なくとも4つのアイソフォームが同定されており、腫瘍細胞に発現するさらなるアイソフォームの可能性がある。CD117アイソフォームのうち2つは蛋白質の細胞内ドメインに位置し、2つは外部傍膜領域に存在する。2つの細胞外アイソフォーム、GNNK+とGNNK-は、4アミノ酸配列の存在(GNNK+)または非存在(GNNK-)が異なる。これらの同質体はリガンド(SCF)と同じ親和性を持つと報告されているが、GNNKisoformに結合するリガンドは内部化と劣化を増加させると報告されている。GNNK+アイソフォームは、このアイソフォームに対して生成された抗体がGNNK+およびGNNKタンパク質を包含するので、CD117に結合することができる抗体を生成するための免疫原として使用することができる。ヒトCD117アイソフォーム1と2のアミノ酸配列は、SEQ ID No:145と146に記載されている。特定の実施例において、本明細書に開示されている抗ヒトCD117(hCD117)抗生物質は、ヒトCD117の同質1と同質2の両方に結合することができる。
以下に述べるように、診断および治療用途の新規な抗CD117抗生物質およびそれらの断片を同定するために、ヒト抗生物質の酵母ライブラリー画面を実施した。抗体54(Ab54)、抗体55(Ab55)、抗体56(Ab56)、抗体57(Ab57)、抗体58(Ab58)、抗体61(Ab61)、抗体66(Ab66)、抗体67(Ab67)、抗体68(Ab68)、および抗体69(Ab69)は、このスクリーニングで同定されたヒト抗体であった。これらの抗体は、ヒトCD117およびアカゲザルCD117と交差反応する。さらに、本明細書に開示されているこれらの抗生物質は、ヒトCD117の同質体、すなわち、イソフォーム1(SEQ ID NO: 145)とイソフォーム2(SEQ ID NO: 146)の両方に結合することができる。
抗CD117抗体Ab54、Ab55、Ab56、Ab57、Ab58、Ab61、Ab66、Ab67、Ab68、およびAb69の種々の結合領域のアミノ酸配列を表9に記載する。本開示には、表9に示されるCDRを含むヒト抗CD117、並びに表9に示される様々な領域を含むヒト抗CD117が含まれる。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ55のものに対応する結合領域、例えばCDR、可変領域からなる抗CD117の、又はその抗原結合断片を提供する。Antibody 55(すなわちAb55)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:19(表9参照)に示されている。抗体55のVH CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号21(VH CDR1);配列番号22(VH CDR2)、および配列番号23(VH CDR3)に記載される。アンティボディ55の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 20(表9参照)に記載されている。抗体55のVL CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号24(VL CDR1);配列番号25(VL CDR2)、および配列番号26(VL CDR3)に記載される。アンティボディ55の重鎖定常領域は、SEQ ID No:122に示されている。アンティボディ55の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:121に示されている。したがって、特定の実施例においては、抗CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:21、22及び23に記載されている可変重鎖CDR設定(CDR1、CDR2及びCDR3)と、SEQ ID No:24、25及び26に記載されている軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 20に記載されたアミノ酸残基を含む可変軽鎖と、SEQ ID NO: 19に記載された重鎖可変領域を含む。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ54のものに対応する結合領域、例えばCDR、可変領域からなるアンチCD117の、又はその抗原結合フラグメントを提供する。Antibody 54(すなわちAb54)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:29(表9参照)に示されている。アンチボディ54のVH CDRドメインアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 31(VH CDR1)、SEQ ID NO: 32(VH CDR2)、SEQ ID NO: 33(VH CDR3)に記載されている。アンティボディ54の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 30(表9参照)に記載されている。抗体54のVL CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号34(VL CDR1);配列番号35(VL CDR2)、および配列番号36(VL CDR3)に記載される。Antibody 54の鎖定常領域は、SEQ ID No:122に記載されている。アンティボディ54の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:121に示されている。したがって、特定の実施例においては、抗CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:31、32及び33に規定される可変重鎖CDRセット(CDR1、CDR2及びCDR3)と、SEQ ID No:34、35及び36に規定される軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、問番号: 30に記載されたアミノ酸残基を含む可変軽鎖と、問番号: 29に記載された重鎖可変領域を含む。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ56のものに対応する結合領域、例えばCDR、可変領域からなる抗CD117の、又はその抗原結合断片を提供する。Antibody 56(すなわちAb56)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:39(表9参照)に示されている。抗体56のVH CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号41(VH CDR1);配列番号42(VH CDR2)、および配列番号43(VH CDR3)に記載される。アンティボディ56の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 40(表9参照)に記載されている。抗体56のVL CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号44(VL CDR1);配列番号45(VL CDR2)、および配列番号46(VL CDR3)に記載される。Antibody 56の鎖定常領域は、SEQ ID No:122に示されている。アンティボディ56の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:121に示されている。したがって、特定の実施例においては、抗CD117型、すなわちその抗原結合部は、SEQ ID No:41、42、43に規定される可変重鎖CDRセット(CDR1、CDR2、CDR3)と、SEQ ID No:44、45及び46に規定される軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施例では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、問番号: 40に記載されたアミノ酸残基を含む可変軽鎖と、問番号: 39に記載された重鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ57のものに対応する、結合領域、例えばCDR、可変領域からなる抗CD117(抗原結合断片)を提供する。Antibody 57(すなわちAb57)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:49(表9参照)に示されている。抗体57のVH CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号51(VH CDR1);配列番号52(VH CDR2)、および配列番号53(VH CDR3)に記載される。アンティボディ57の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 50(表9参照)に記載されている。抗体57のVL CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号54(VL CDR1);配列番号55(VL CDR2)、および配列番号56(VL CDR3)に記載される。アンティボディ57の鎖定常領域は、SEQ ID No:122に示されている。アンティボディ57の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:121に示されている。したがって、特定の実施例では、抗CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:51、52、53に記載されている可変重鎖CDRセット(CDR1、CDR2、CDR3)と、SEQ ID No:54、55、56に記載されている軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 50に記載されたアミノ酸残基を含む可変軽鎖と、SEQ ID NO: 49に記載された重鎖可変領域を含む。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ58のものに対応する、結合領域、例えばCDR、様々な領域から成る抗CD117の、又はその抗原結合断片を提供する。アンティボディ58(すなわちAb58)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 59(表9参照)に示されている。抗体58のVH CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号61(VH CDR1);配列番号62(VH CDR2)、および配列番号63(VH CDR3)に記載される。アンティボディ58の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 60(表9参照)に記載されている。抗体58のVL CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号64(VL CDR1);配列番号65(VL CDR2)、および配列番号66(VL CDR3)に記載される。アンティボディ58の鎖定常領域は、SEQ ID No:122に示されている。アンティボディ58の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:121に示されている。したがって、特定の実施例においては、抗CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:61、62及び63に記載されている可変重鎖CDR組(CDR1、CDR2及びCDR3)と、SEQ ID No:64、65及び66に記載されている軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 60に記載されたアミノ酸残基からなる可変軽鎖と、SEQ ID NO: 59に記載された重鎖可変領域からなる。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ61のものに対応する、結合領域、例えばCDR、可変領域からなる抗CD117の、又はその抗原結合断片を提供する。Antibody 61(すなわちAb61)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:69(表9参照)に示されている。アンチボディ61のVH CDRドメインアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 71(VH CDR1)、SEQ ID NO: 72(VH CDR2)、SEQ ID NO: 73(VH CDR3)に記載されている。Antibody 61の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列はSEQ ID NO: 70(表9参照)に記載されている。抗体61のVL CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号74(VL CDR1);配列番号75(VL CDR2)、および配列番号76(VL CDR3)に記載される。Antibody 61の鎖定常領域は、SEQ ID No:122に記載されている。アンティボディ61の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:121に示されている。したがって、特定の実施例においては、抗CD117型、すなわちその抗原結合部は、SEQ ID No:71、72、73に規定される可変重鎖CDRセット(CDR1、CDR2、およびCDR3)と、SEQ ID No:74、75および76に規定される軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、問番号: 70に記載されたアミノ酸残基からなる可変軽鎖と、問番号: 69に記載された重鎖可変領域を含む。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ66のものに対応する結合領域、例えばCDR、可変領域からなる抗CD117の、又はその抗原結合断片を提供する。Antibody 66(すなわちAb66)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:79(表9参照)に示されている。アンチボディ66のVH CDRドメインアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 81(VH CDR1)、SEQ ID NO: 82(VH CDR2)、SEQ ID NO: 83(VH CDR3)に記載されている。Antibody 66の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID No:80(表9参照)に記載されている。アンチボディ66のVL CDRドメインアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 84(VL CDR1)、SEQ ID NO: 85(VL CDR2)、SEQ ID NO: 86(VL CDR3)に記載されている。アンティボディ66の鎖定常領域は、SEQ ID No:122に示されている。アンティボディ66の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:121に示されている。したがって、特定の実施例では、抗CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:81、82、83に記載されている可変重鎖CDR設定(CDR1、CDR2及びCDR3)と、SEQ ID No:84、85及び86に記載されている軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施例では、抗CD117(又はその抗原結合部)は、SEQ ID NO: 80に記載されたアミノ酸残基からなる可変軽鎖と、SEQ ID NO: 79に記載された重鎖可変領域からなる。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ67のものに対応する、結合領域、例えばCDR、可変領域からなる抗CD117(抗原結合断片)を提供する。Antibody 67の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:9(表9参照)に示されている。抗体67のVH CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号11(VH CDR1);配列番号12(VH CDR2)、および配列番号13(VH CDR3)に記載される。Antibody 67の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列はSEQ ID NO: 10(表9参照)に記載されている。抗体67のVL CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号14(VL CDR1);配列番号15(VL CDR2)、および配列番号16(VL CDR3)に記載される。
アンティボディ67の全長ヘビーチェーン(HC)はSEQ ID NO: 110に、アンティボディ67の全長鎖定常領域SEQ ID NO: 122に記載されている。アンティボディ67のL鎖(LC)はSEQ ID No:109に記載されている。アンティボディ67の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:121に示されている。したがって、特定の実施例においては、抗CD117(又はその抗原結合部)は、SEQ ID No:11,12,13に記載されている可変重鎖CDRセット(CDR1, CDR2, CDR3)と、SEQ ID No:14,15,16に記載されている軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、問番号:9に記載されたアミノ酸残基を含む可変重鎖と、問番号: 10に記載された重鎖可変領域を含む。更なる実施の形態では、抗CD117抗菌株は、SEQ ID NO: 110からなる重鎖と、SEQ ID NO: 109からなるL鎖からなる。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ68のものに対応する結合領域、例えばCDR、可変領域からなる抗CD117の、又はその抗原結合断片を提供する。Antibody 68(すなわちAb68)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:89(表9参照)に示されている。抗体68のVH CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号91(VH CDR1);配列番号92(VH CDR2)、および配列番号93(VH CDR3)に記載される。アンティボディ68の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 90(表9参照)に記載されている。抗体68のVL CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号94(VL CDR1);配列番号95(VL CDR2)、および配列番号96(VL CDR3)に記載される。アンティボディ68の鎖定常領域は、SEQ ID No:122に示されている。アンティボディ68の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:121に示されている。したがって、特定の実施例において、抗CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:91,92,93に記載されている可変重鎖CDRセット(CDR1, CDR2, CDR3)と、SEQ ID No:94,95,96に記載されている軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 90に記載されたアミノ酸残基を含む可変軽鎖と、SEQ ID NO: 89に記載された重鎖可変領域を含む。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ69のものに対応する、結合領域、例えばCDR、様々な領域からなる抗CD117の、又はその抗原結合断片を提供する。Antibody 69(すなわちAb69)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:99(表9参照)に示されている。抗体69のVH CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号101(VH CDR1);配列番号102(VH CDR2)、および配列番号103(VH CDR3)に記載される。アンティボディ69の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 100(表9参照)に記載されている。
抗体69のVL CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号104(VL CDR1);配列番号105(VL CDR2)、および配列番号106(VL CDR3)に記載される。Antibody 69の鎖定常領域は、SEQ ID No:122に記載されている。アンティボディ69の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:121に示されている。したがって、特定の実施例において、抗CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:101,102,103に記載されている可変重鎖CDRセット(CDR1, CDR2, CDR3)と、SEQ ID No:104,105,106に記載されている軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 100に記載されたアミノ酸残基を含む可変軽鎖と、SEQ ID NO: 99に記載された重鎖可変領域を含む。
さらに、抗CD117抗体Ab77、Ab79、Ab81、Ab85、Ab86、Ab87、Ab88、およびAb89の種々の結合領域のアミノ酸配列を表9に記載する。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ77のものに対応する、結合領域、例えばCDR、可変領域からなる抗CD117(抗原結合断片)を提供する。Antibody 77(すなわちAb77)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:147(表9参照)に示されている。抗体77のVH CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号263(VH CDR1);配列番号2(VH CDR2)、および配列番号3(VH CDR3)に記載される。アンティボディ77の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 231(表9参照)に記載されている。アンチボディ77のVL CDRドメインアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 264(VL CDR1)、SEQ ID NO: 265(VL CDR2)、SEQ ID NO: 266(VL CDR3)に記載されています。アンティボディ77の鎖定常領域は、SEQ ID No:269に示されている。アンティボディ77の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:283に示されている。したがって、特定の実施例において、抗CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:263、2及び3に記載されている可変重鎖CDR設定(CDR1、CDR2及びCDR3)と、SEQ ID No:264、265及び266に記載されている軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 231に記載されたアミノ酸残基を含む可変軽鎖と、SEQ ID NO: 147に記載された重鎖可変領域を含む。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ79のものに対応する、結合領域、例えばCDR、様々な領域からなる反CD117の、又はその抗原結合フラグメントを提供する。
アンティボディ79(すなわちAb79)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:147(表9参照)に示されている。アンチボディ79のVH CDRドメインアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 263(VH CDR1)、SEQ ID NO: 2(VH CDR2)、SEQ ID NO: 3(VH CDR3)に記載されている。
アンティボディ79の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 233(表9参照)に記載されている。アンチボディ79のVL CDRドメインアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 267(VL CDR1)、SEQ ID NO: 265(VL CDR2)、SEQ ID NO: 266(VL CDR3)に記載されています。アンティボディ79の鎖定常領域は、SEQ ID No:269に示されている。アンティボディ79の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:283に示されている。したがって、特定の実施例において、抗CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:263、2及び3に記載されている可変重鎖CDRセット(CDR1、CDR2及びCDR3)と、SEQ ID No:267、265及び266に記載されている軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 233に記載されたアミノ酸残基からなる可変軽鎖と、SEQ ID NO: 147に記載された重鎖可変領域からなる。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ81のものに対応する、結合領域、例えばCDR、可変領域から成る抗CD117の、又はその抗原結合断片を提供する。Antibody 81(すなわちAb81)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:147(表9参照)に示されている。アンチボディ81のVH CDRドメインアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 263(VH CDR1)、SEQ ID NO: 2(VH CDR2)、SEQ ID NO: 3(VH CDR3)に記載されている。アンティボディ81の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 235(表9参照)に記載されている。アンチボディ81のVL CDRドメインアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 264(VL CDR1)、SEQ ID NO: 268(VL CDR2)、SEQ ID NO: 266(VL CDR3)に記載されている。アンティボディ81の鎖定常領域は、SEQ ID No:269に示されている。アンティボディ81の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:283に示されている。したがって、特定の実施例において、抗CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:263、2及び3に記載されている可変重鎖CDRセット(CDR1、CDR2及びCDR3)と、SEQ ID No:264、268及び266に記載されている軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 235に記載されたアミノ酸残基からなる可変軽鎖と、SEQ ID NO: 147に記載された重鎖可変領域からなる。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ85のものに対応する、結合領域、例えばCDR、可変領域からなる抗CD117の、又はその抗原結合断片を提供する。Antibody 85(すなわちAb86)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:243(表9参照)に示されている。抗体85のVH CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号245(VH CDR1);配列番号246(VH CDR2)、および配列番号247(VH CDR3)に記載される。アンティボディ85の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 242(表9参照)に記載されている。抗体85のVL CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号248(VL CDR1);配列番号249(VL CDR2)、および配列番号250(VL CDR3)に記載される。アンティボディ85の鎖定常領域は、SEQ ID No:269に示されている。アンティボディ85の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:283に示されている。したがって、特定の実施例において、反CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:245、246及び247に記載されている可変重鎖CDRセット(CDR1、CDR2及びCDR3)と、SEQ ID No:248、249及び250に記載されている軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 244に記載されたアミノ酸残基を含む可変軽鎖と、SEQ ID NO: 243に記載された重鎖可変領域を含む。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ86のものに対応する結合領域、例えばCDR、可変領域からなる抗CD117の、又はその抗原結合断片を提供する。Antibody 86(すなわちAb86)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 251(表9参照)に示されている。抗体86のVH CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号245(VH CDR1);配列番号253(VH CDR2)、および配列番号3(VH CDR3)に記載される。アンティボディ86の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 252(表9参照)に記載されている。アンチボディ86のVL CDRドメインアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 254(VL CDR1)、SEQ ID NO: 249(VL CDR2)、SEQ ID NO: 255(VL CDR3)に記載されています。アンティボディ86の鎖定常領域は、SEQ ID No:269に示されている。アンティボディ86の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:283に示されている。したがって、特定の実施例では、抗CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:245、253及び3に規定される可変重鎖CDRセット(CDR1、CDR2及びCDR3)と、SEQ ID No:254、249及び255に規定される軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 252に記載されたアミノ酸残基を含む可変軽鎖と、SEQ ID NO: 251に記載された重鎖可変領域を含む。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ87のものに対応する、結合領域、例えばCDR、可変領域からなる抗CD117(抗原結合断片)を提供する。Antibody 87(すなわちAb87)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:243(表9参照)に示されている。抗体87のVH CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号245(VH CDR1);配列番号246(VH CDR2)、および配列番号247(VH CDR3)に記載される。アンティボディ87の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 256(表9参照)に記載されている。アンチボディ87のVL CDRドメインアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 257(VL CDR1)、SEQ ID NO: 5(VL CDR2)、SEQ ID NO: 255(VL CDR3)に記載されている。アンティボディ87の鎖定常領域は、SEQ ID No:269に示されている。アンティボディ87の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:283に示されている。したがって、特定の実施例において、抗CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:245、246及び247に記載されている可変重鎖CDRセット(CDR1、CDR2及びCDR3)と、SEQ ID No:257、5及び255に記載されている軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 256に記載されたアミノ酸残基からなる可変軽鎖と、SEQ ID NO: 243に記載された重鎖可変領域からなる。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ88のものに対応する、結合領域、例えばCDR、可変領域からなる抗CD117の、又はその抗原結合断片を提供する。Antibody 88(すなわちAb88)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 258(表9参照)に示されている。抗体88のVH CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号245(VH CDR1);配列番号259(VH CDR2)、および配列番号3(VH CDR3)に記載される。アンティボディ88の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 256(表9参照)に記載されている。アンチボディ88のVL CDRドメインアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 257(VL CDR1)、SEQ ID NO: 5(VL CDR2)、SEQ ID NO: 255(VL CDR3)に記載されています。アンティボディ88の鎖定常領域は、SEQ ID No:269に示されている。アンティボディ88の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:283に示されている。したがって、特定の実施形態において、抗CD117抗体またはその抗原結合部分は、配列ID番号: 245、259、および3に記載の可変重鎖CDRセット(CDR1、CDR2、およびCDR3)、ならびに配列ID番号: 257、5、および255に記載の軽鎖可変領域CDRを含む。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 256に記載されたアミノ酸残基からなる可変軽鎖と、SEQ ID NO: 258に記載された重鎖可変領域からなる。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ89のものに対応する、結合領域、例えばCDR、様々な領域からなる抗CD117の、又はその抗原結合断片を提供する。Antibody 89(すなわちAb89)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 260(表9参照)に示されている。抗体89のVH CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号245(VH CDR1);配列番号2(VH CDR2)、および配列番号3(VH CDR3)に記載される。アンティボディ89の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 252(表9参照)に記載されている。アンチボディ89のVL CDRドメインアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 254(VL CDR1)、SEQ ID NO: 249(VL CDR2)、SEQ ID NO: 255(VL CDR3)に記載されています。アンティボディ89の鎖定常領域は、SEQ ID No:269に示されている。アンティボディ89の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:283に示されている。
したがって、特定の実施例において、抗CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:245,2,3に規定される可変重鎖CDRセット(CDR1, CDR2, CDR3)と、SEQ ID No:254,249,255に規定される軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 252に記載されたアミノ酸残基を含む可変軽鎖と、SEQ ID NO: 260に記載された重鎖可変領域を含む。
一実施の形態では、本開示は、アンチボディ249のものに対応する、結合領域、例えばCDR、様々な領域からなる抗CD117の、又はその抗原結合断片を提供する。Antibody 249(すなわちAb249)の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID No:238(表9参照)に示されている。抗体249のVH CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号286(VH CDR1);配列番号2(VH CDR2)、および配列番号287(VH CDR3)に記載される。抗体249の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、配列番号242(表9参照)に記載される。抗体249のVL CDRドメインアミノ酸配列は、配列番号288(VL CDR1);配列番号249(VL CDR2)、および配列番号289(VL CDR3)に記載される。アンティボディ249の鎖定常領域は、SEQ ID No:269に示されている。アンティボディ249の軽鎖定常領域は、SEQ ID No:283に示されている。したがって、特定の実施例では、抗CD117の、又はその抗原結合部は、SEQ ID No:286、2、287に記載されている可変重鎖CDRセット(CDR1、CDR2及びCDR3)と、SEQ ID No:288、249及び289に記載されている軽鎖可変領域CDRからなる。他の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 242に記載されたアミノ酸残基を含む可変軽鎖と、SEQ ID NO: 238に記載された重鎖可変領域を含む。
さらに、本開示には、SEQ ID No:147～168に規定される結合領域(重および軽鎖CDRまたは可変領域)からなる抗CD117薬物コンジゲートが含まれる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 148のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 149のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 150のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 151のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 152のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 153のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 154のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 155のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 156のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 157のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 158のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 159のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 160のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 161のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 162のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 163のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 164のアミノ酸配列に示されるような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 165のアミノ酸配列に示されるような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 166のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 167のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 168のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 169のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 170のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 171のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 172のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 173のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 174のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 175のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原結合部は、SEQ ID NO: 176のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 177のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 178のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 179のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 180のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 181のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 172のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 182のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 183のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 184のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 185のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 186のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 187のアミノ酸配列に示されるような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 188のアミノ酸配列に示されるような軽鎖可変領域を含む。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 189のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 190のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 191のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 192のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 193のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 194のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 195のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 196のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 197のアミノ酸配列に示されるような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 198のアミノ酸配列に示されるような軽鎖可変領域を含む。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 199のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 200のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 201のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 190のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 202のアミノ酸配列に示されるような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 203のアミノ酸配列に示されるような軽鎖可変領域を含む。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 204のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 205のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 206のアミノ酸配列に示されるような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 207のアミノ酸配列に示されるような軽鎖可変領域を含む。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 208のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 209のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 210のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 211のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 212のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 213のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 214のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 215のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 216のアミノ酸配列に示されるような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 217のアミノ酸配列に示されるような軽鎖可変領域を含む。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 218のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 219のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 220のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 221のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 222のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 223のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 224のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 225のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 226のアミノ酸配列に示されるような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 227のアミノ酸配列に示されるような軽鎖可変領域を含む。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 228のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 229のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 230のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 231のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 232のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 233のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 234のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 235のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 236のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されるような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 237のアミノ酸配列に示されるような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 243のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 244のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 251のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 252のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 243のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 256のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 258のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 256のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 260のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 252のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 238のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 239のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 239のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 147のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 240のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 238のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 241のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。一実施の形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合部は、SEQ ID NO: 238のアミノ酸配列に示されているような重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 242のアミノ酸配列に示されているような軽鎖可変領域を含んでいる。
ここに記載されている抗CD117の中には、CD117を表現する細胞上のCD117活性を実質的に抑制しない中性抗物質がある。たとえば、in vitro幹細胞因子(SCF)依存細胞拡散アッセイ(例えば、ここに記載された例11を参照)を用いて中性抗生物質を同定することができる。SCF依存性細胞増殖アッセイにおいて、中性CD117抗体は、SCFに依存して分裂するCD34+細胞を殺さないであろう。中性抗体は、SCFがCD117活性を阻害するようなCD117に結合するのを阻止しないであろうからである。
中性抗生物質は、ヒトCD117に特に結合する能力を考えると、診断目的に使用することができるが、また、本書に記載されているように、細胞毒素に接合した場合、CD117を表現する細胞を殺すのにも効果的である。典型的には、コンジュゲートに使用される抗物質は、その抗たん性に特有の敵対的または敵対的な活動を有する。しかしながら、明細書、活用に対するユニークなアプローチであり、特に、活用が幹細胞移植に先立って調整剤として使用されている状況において、そうである。細胞毒素だけでなく、細胞毒素としての細胞毒素と組み合わせることによって、反抗的な抗毒素は効果的であるが、細胞毒素の効果に対して、中性のアンチCD117の共役を条件として、抗細胞毒素の活性が副次的であるが、細胞毒素の効果を効果的に伝達するためには、抗毒素の内部化および親和性の特性、例えば解離速度が重要であるという代替戦略を提示している。
中性抗CD117型の実施例としては、Ab58、Ab61、Ab66、Ab67、Ab68、Ab69が挙げられる。中性、反CD117のCDRのアミノ酸配列を比較したところ、同定された2つの中性抗物質群の間のコンセンサス配列が明らかになった。Ab58とAb61の重量および軽鎖可変領域の比較はPCT/US2018/057172に記載されており、それらは全体として参考文献に含まれている。Ab58とAb61は、HC CDR1とHC CDR2のわずかなバリエーションで、同じL鎖CDRとHC CDR3を共有している。HC CDR1とCDR2のコンセンサス配列はSEQ ID No:133と134に記載されている。Ab66、Ab67、Ab68、およびAb69も中性抗物質である。これらの抗生物質の重鎖および軽鎖可変領域は、その全体として参考文献として組み入れられたPCT/US2018/057172に記載されている。Ab66、Ab67、Ab68、およびAb69は同じL鎖CDRと同じHC CDR3を共有しているが、これらの薬物はHC CDR1およびHC CDR2領域内で変動がある。HC CDR1およびHC CDR2地域におけるこれらの抗毒素に対するコンセンサス配列、それぞれSEQ ID No:139および140で提供される。
Antagonist abidesは、Ab54、Ab55、Ab56、およびAb57を含む、ここに提供される。これらの抗生物質の可変重鎖および軽鎖アミノ酸配列の比較はPCT/US2018057172に記載されており、それらの全文を参考にしている。Ab54、Ab55、Ab56、およびAb57は同じL鎖CDRと同じHC CDR3を共有しているが、これらはHC CDR1およびHC CDR2領域内で変動がある。HC CDR1およびHC CDR2地域におけるこれらの抗毒素に対するコンセンサス配列、それぞれSEQ ID No:127および128で提供される。
本明細書に記載の抗CD117全長抗体、二重特異性抗体、二重可変ドメイン抗体、多重鎖または一本鎖抗体、および/またはヒトCD117に特異的に結合する結合フラグメントの形成であり得、これらには、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv)、scFv (一本鎖Fv)、サロボディー(サロゲート軽鎖構築物を含む)、単一ドメイン抗体、カメリー化抗体などが含まれるが、これらに限定されない。また、それらは、IgA (例:IgA1またはIgA2)、IgD、IgE、IgG (例:IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4)、またはIgMを含む、任意のアイソタイプの、またはそれらに由来することができる。いくつかの実施形態において、抗CD117の抗たんぱくはIgGである(例えば、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4)。
ここに記載された方法と関連して使用されるアンチボディには、上記に記載された抗毒物の変形例、例えば、Fc領域を含むか欠如している抗毒物、並びにここに記載された非人類抗毒物の人類化変形例およびCDRまたはその同等領域の1つ以上または全部、又は本稿に記載されている抗毒物(例えば、10Fn3ドメイン)を含んでいる人類化変形例が含まれる。前記の抗原結合フラグメントの例としては、デュアルバリアブル・イムグロブリン・ドメイン、シングル・チェーンFv分子(scFv)、ダイアボディ、トライアボディ、ナノボディ、Andi-like protein scaffold、Fv断片、Fb断片、F(ab')2分子、およびタンデム・ディ-scFvが含まれる。
1つの実施形態では、1つ以上の放射性ラベル表示されたアミノ酸からなる反CD117物質が提供される。放射性標識された抗CD117抗体は、診断目的および治療目的の両方に使用され得る(放射性標識された分子への結合は、別の可能な特徴である)。ポリペプチドのラベルの非限定的な例としては、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tcおよび125I、131Iおよび186Reが含まれるが、これらに限定されない。放射性ラベル表示されたアミノ酸及び関連ペプチドの派生物を調製する方法は、当技術分野で知られている(例えば、Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (第2版、Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)))及び米国特許を参照されたい。第4,681,581号、米国特許第4,735,210号、米国特許第5,101,827号米国特許No.5,102,990(米国RE35,500)、米国特許。No.5,648,471及び米国特許5,697,902号。たとえば、放射性同位体はクロラミンT法によって結合することができる。
ここに記載された抗CD117抗生物質又は結合フラグメントは、また、本技術で知られるように、半減期を増加させるもの、ADCCを増加または減少させるもの等の、抗生物質及び/又は断片の特性を変化させる改変及び/又は突然性を含んでいることがある。
一実施の形態では、当該変形例Fc領域は、野生型Fc領域に比較して少なくとも1つのアミノ酸変質を含み、当該分子はFcgammaRに対する変質親和性を有する変形例Fc領域を含んでいる、反CD117の、又はそれらの結合フラグメントは、変形例Fc領域を含んでいる。Fc領域内のいくつかのアミノ酸位置は、Fcに対して直接接触するための結晶学研究を通して知られている。具体的には、アミノ酸234-239(ヒンジ領域)、アミノ酸265-269(B/Cループ)、アミノ酸297-299(C'/Eループ)、アミノ酸327-332(F/G)ループである。(Sondermann et al., 2000 Nature, 406: 267-273 を参照)。幾つかの実施例において、ここに記載される防CD117抗体は、構造的及び結晶学的分析に基づき、FcimRと直接的に接触する少なくとも1つの残渣の改造から成る変形型Fc領域を含んでいることができる。一実施形態では、抗CD117のFc領域(又はそのフラグメント)は、KabatらによるEU指数によれば、EU指数におけるアミノ酸265におけるアミノ酸置換を含んでいる。これは、参照によって明示的にここに含まれている、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)による。「KabatにおけるようなEUインデックス」とは、ヒトIgG1 EU抗体の番号付けを指す。カバトまたはEU番号付けスキームにおけるEUインデックスまたはEUインデックスは、EU(Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85、以下、完全に参考文献に含める)の番号付けを参照する。1つの実施形態では、Fc領域はD265A突然異変を含む。1つの実施形態において、Fc領域はD265C突然異変を含む。いくつかの実施形態において、反CD117のFc領域(又はそのフラグメント)は、カバトにおけるように、EU指数によれば、アミノ酸234におけるアミノ酸置換を含む。1つの実施形態において、Fc領域はL234A突然異変を含む。いくつかの実施形態において、反CD117のFc領域(又はそのフラグメント)は、カバトにおけるように、EU指数によれば、アミノ酸235におけるアミノ酸置換を含む。1つの実施形態において、Fc領域はL235A突然異変を含む。さらに別の実施形態では、Fc領域はL234AとL235Aの突然変異を含む。更なる実施の形態では、Fc領域はD265C、L234AおよびL235Aの突然変異を含む。
特定の態様において、変形IgG Fcドメインは、1つ以上のアミノ酸置換を含まない野生型Fcドメインと比較して、FcimRおよび/またはC1qに対する1つ以上のアミノ酸置換又はアブレーション結合親和性の減少又はアブレーション結合親和性をもたらす1つ以上のアミノ酸置換を含んでいる。Fc結合相互作用は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)および補体依存性細胞傷害(CDC)を含むが、これらに限定されない、様々なエフェクター機能および下流シグナル伝達イベントに必須である。従って、特定の態様において、改良されたFc領域(例えば、L234A、L235A、およびD265C突然異変からなる)を含む抗菌は、エフェクター機能を実質的に減少または廃止した。
Fc領域への親和性は、例えば、平衡法(例えば、ELISA;KinExA, Rathanaswami et al.)に限定されないが周知の様々な技術を用いて決定することができる。分析生化学Vol.373:52-60, 2008; 2008年、または、ラジオイムノアッセイ(RIA)、または、表面プラズモン共鳴アッセイまたは他のキネティクスベースのアッセイのメカニズム(例:BIACORETM分析またはOctetTM分析(forteBIO))、および間接結合アッセイ、競合結合蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、ゲル電気泳動法およびクロマトグラフィー(例:ゲルろ過)などの他の方法。これらおよび他の方法は、検討中の成分の一つまたはそれ以上のラベルを利用することができ、また/または、発色性、蛍光、発光、または同位体標識を含むが、それに限らない多様な検出方法を使用することができる。
結合する親和性と運動学についての詳細な記述は、Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見られる。競合結合アッセイの一例は、増大する量の非標識抗原の存在下での標識抗原と目的の抗体とのインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含むラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する興味のある標本の親和性と結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によりデータから決定することができる。また、ラジオイムノアッセイを用いて、第二の抗菌剤との競合を判断することもできる。この場合、この抗原は、標識されていない第2のビーンズの増加量の存在の中で、標識化された複合物に接合された興味のあるビーンズと共にインキュベートされる。
本開示の抗体は、例えば(Dall'Acqua et al. (2006)J Biol Chem 281: 23514-24)、(Zalevsky et al. (2010) Nat Biotechnol 28: 157-9)、(Hinton et al. (2004)J Biol Chem 279: 6213-6)、(Hinton et al. (2006)J Immunol 176: 346-56)、(Shields et al. (2001)J Biol Chem 276: 6591-604)、(Petkova et al. (2006) Int Immunol 18: 1759-69)、(Drag Metab Dispos 35: 86-94)、(Vaccaro et al. (2005) Nat Biotechnol 23: 1283-8)、(Yeung et.2010) Cancer Res 70: 3269-77 et al. (1999) Eur J Immunol 29: 2819-25)、および250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434および435の位置を含む。特異的に、または組み合わせて行われ得る例示的な変異は、T250Q、M252Y、1253A、S254T、T256E、P2571、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435AおよびH435R変異である。
このように、一実施の形態では、Fc領域は、半減期をもたらす突然変異を含んでいる。短い半減期を有する抗菌剤は、短期間の治療として機能することが期待される場合には、ある場合には有利であろう。例えば、本書に記載されている条件付工程において、抗菌剤がHSCsによって管理されることが有利であろう。理想的には、HSCs(一般にはCD117も表現するが、内生の幹細胞とは異なり、反CD117の標的ではない)の送達前に、この抗HSCsは実質的にクリアされるであろう。1つの実施形態において、Fc領域は、位置435(カバトによるEUインデックス)の突然異変を含む。1つの実施形態において、この突然変異はH435Aの突然変異である。
1つの実施形態において、本明細書に記載の抗CD117抗体は、約24時間以下の半減期、約22時間以下の半減期、約21時間以下の半減期、約20時間以下の半減期、約19時間以下の半減期、約18時間以下の半減期、約17時間以下の半減期、約16時間以下の半減期、約15時間以下の半減期、約14時間以下の半減期、約13時間以下の半減期、約12時間以下の半減期、約11時間以下の半減期、または約10時間以下の半減期を有する。1つの実施形態では、抗菌剤の半減期は約11時間から約24時間、約12時間から約22時間、約10時間から約20時間、約8時間から約18時間、又は約14時間から約24時間である。別の実施の形態では、ここに記載される抗CD117(抗CD117)の半減期(例えば、人間)は、約1～5時間、約5～10時間、約10～15時間、約15～20時間、又は約20～25時間である。
いくつかの側面では、Fc領域は、半減期をもたらし、また、大幅に、および、抗菌の効果的な機能を減少または完全に廃止する2つ以上の突然変わりで構成される。いくつかの実施形態では、Fc領域は、半減期の減少とFcirと直接接触できる少なくとも1つの残渣の突然変異をもたらすような(例えば、構造的及び結晶学的分析に基づく)突然変異を含む。1つの実施形態では、Fc領域はH435A突然異変、L234A突然異変、およびL235A突然異変を含む。1つの実施形態において、Fc領域はH435A突然異変とD265C突然異変を含む。1つの実施形態において、Fc領域は、H435A突然異変、L234A突然異変、L235A突然異変、およびD265C突然異変を含む。
幾つかの実施例では、抗CD117-binding fragment又はその抗原結合フラグメントは、サイトトキシン(例:アマトキシン)に、抗原結合フラグメント又はその抗原結合フラグメントのFc領域のシステイン残留物を経由して接合される。いくつかの実施例では、システイン残留物は、抗原結合フラグメントのFc領域における突然変異によって導入される。たとえば、システイン残基は、Cys118、Cys239、およびCys265からなる群から選ぶことができる。一実施の形態では、抗CD117のFc領域(又はそのフラグメント)は、カバトにおけるように、EU指数によれば、アミノ酸265におけるアミノ酸置換を含む。1つの実施形態において、Fc領域はD265C突然異変を含む。1つの実施形態では、Fc領域はD265CとH435Aの突然変わりを含む。1つの実施形態では、Fc領域はD265C、L234AおよびL235Aの突然変異を含む。1つの実施形態では、Fc領域はD265C、L234A、L235AおよびH435Aの突然変異を含む。一実施の形態では、カバトにおけるように、EU指数によると、抗CD117抗原結合断片のFc領域は、アミノ酸239におけるアミノ酸置換を含む。1つの実施形態では、Fc領域はS239C突然異変を含む。1つの実施形態では、Fc領域はL234A突然異変、L235A突然異変、S239C突然異変およびD265A突然異変を含む。別の実施形態では、Fc領域はS239CとH435Aの突然変わりを含む。別の実施形態では、Fc領域はL234A突然異変、L235A突然異変、およびS239C突然異変を含む。さらに別の実施形態では、Fc領域は、H435A突然異変、L234A突然異変、L235A突然異変およびS239C突然異変を含む。さらに別の実施形態では、Fc領域は、H435A突然異変、L234A突然異変、L235A突然異変、S239C突然異変およびD265A突然異変を含む。
特に、Fcアミノ酸の位置は、特に示されていない限り、EU番号指数を参考にしている。
これらのアスペクトのいくつかの実施例において、システイン残留物は、アンチCD117のFc領域またはそれらの抗原結合フラグメントにおいて自然に生じている。例えば、Fcドメインは、ヒトIgG1 FcドメインのようなIgG Fcドメインであり、システイン残基は、Cys261、Csy321、Cys367およびCys425からなるグループから選択され得る。
例えば、一実施の形態では、Antibody 67のFc領域がD265C突然異変を構成するように変更される(例えば、SEQ ID NO: 111)。別の実施形態では、アンチボディ67のFc領域は、D265C、L234AおよびL235Aの突然変異(例えば、SEQ ID NO: 112)を含むように変更される。さらに別の実施形態では、Antibody 67のFc領域は、D265CとH435Aの突然異変(例えば、SEQ ID NO: 113)を含むように変更される。更なる実施の形態では、Antibody 67のFc領域は、D265C、L234A、L235AおよびH435Aの変わり目(例えば、SEQ ID NO: 114)を含むように変更される。
Antibody 55については、一実施の形態では、Antibody 55のFc領域がD265C突然異変を含むように改変されている(例えば、SEQ ID NO: 117)。別の実施形態では、アンチボディ55のFc領域は、D265C、L234AおよびL235Aの突然変異(例えば、SEQ ID NO: 118)を含むように変更される。さらに別の実施形態では、Antibody 55のFc領域は、D265CとH435Aの変わり目(例えば、SEQ ID NO: 119)を構成するように変更される。更なる実施の形態では、アンチボディ55のFc領域は、D265C、L234A、L235AおよびH435Aの突然異変(例えば、SEQ ID NO: 120)を含むように変更される。
アンチボディ54、アンチボディ55、アンチボディ56、アンチボディ57、アンチボディ58、アンチボディ61、アンチボディ66、アンチボディ67、アンチボディ68、またはアンチボディ69のいずれかのFc領域は、D265C変異(例えば、SEQ ID NO: 123のように);D265C、L234A、およびL235A変異(例えば、SEQ ID NO: 124のように);D265CおよびH435A変異(例えば、SEQ ID NO: 125のように);またはD265C、L234A、L235A、およびH435A変異(例えば、SEQ ID NO: 126のように)を含むように修正され得る。
ここに記載されている改良型Fc領域はそれらを構成するアミノ酸の改良に従って定義されている。Fc領域に関してここで議論したすべてのアミノ酸置換物について、番号は常にEU指数に従う。したがって、例えば、D265Cは、EU位置265におけるアスパルチン酸(D)のFc変形例であり、親Fc領域に対してシスタイン(C)で置き換えられる。同様に、例えば、D265C/L234A/L235Aは、EU位置265(D～C)、234(L～A)、および、親のFcドメインに対する235(L～A)で代用した変形例Fcを定義する。変種は、EUアミノ酸の変位位置における最終アミノ酸組成によっても指定することができる。たとえば、L234A/L235AミュータントはLAと呼ぶことができる。置換が提供される順序は、任意であることに注意されたい。
一実施形態では、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書に開示される配列番号と少なくとも約90%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%同一であるアミノ酸配列を有する可変領域を含む。あるいは、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書に開示される配列番号と少なくとも約90%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%同一であるアミノ酸配列を有する本明細書に記載される可変領域のフレームワーク領域を有する本明細書に開示される配列番号を含むCDRを含む。
特定の実施例においては、抗CD117の、又はその抗原結合断片は、ある種の分離速度を有しており、これは共役体の一部として使用されるときに特に有利である。例えば、抗CD117抗体は、特定の実施形態では、生物層干渉法(BLI)によって測定されるように、1×10-2～1×10-3、1×10-3～1×10-4、1×10-5～1×10-6、1×10-6～1×10-7 または1×10-7～1×10OOJのヒトCD117および/またはアカゲザルCD117のオフレート速度(Koff)を有する。幾つかの実施形態において、約100 nM以下、約90nM以下、約80 nM以下、約70 nM以下、約60 nM以下、約50 nM以下、約40 nM以下、約30 nM以下、約20 nM以下、約10 nM以下、約8 nM以下、約6 nM以下、約4 nM以下、約2 nM以下、Bio-Layer Interferometry (BLI)アッセイにより判定された約1 nM以下のKDのCD117(例えば、ヒトCD117及び/又はrhesus CD117)を結合する。
ここに開示されている抗生物質及びそれらの結合フラグメントは、より詳細に以下に説明されるように、活用具として使用することができる。
アンチボディーは、例えば米国特許に記載されているように、組み換え方法及び組成を用いて製造され得る。4,816,567号。一実施の形態では、ここに記載されている反CD117抗をエンコードしている孤立した核酸が提供される。このような核酸は、VL及び/又は/又は、VHを含むアミノ酸配列(例えば、上記の軽鎖及び/又は重鎖)を含んでいるアミノ酸配列をコード化することができる。更なる実施の形態では、上記核酸を含む1つ以上のベクトル(例えば、表現ベクトル)が提供される。更なる実施の形態では、上記核酸を含む宿主細胞が提供される。上記実施形態の一例では、宿主細胞は、(1) VLを含むアミノ酸の配列を含むアミノ酸配列と、VHを含むアミノ酸の配列を示すアミノ酸の配列を示すベクトル、(2) および(2) VLを含むアミノ酸の配列を示すアミノ酸を含む第1ベクトルと、および、(VHを含むアミノ酸の配列を示すアミノ酸の配列を示す第2ベクトルを含む、(1)宿主細胞を構成するベクトルから成る。1つの実施例において、宿主細胞は真核生物である。例えば、中国のハムスターオヴァリー(CHO)細胞又はリンゴ細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20セル)。一実施の形態では、抗CLL-1抗菌を作る方法が提供される。この方法は、上記のように、当該抗菌の表現に適した条件下で、また任意にホスト細胞(又はホスト細胞培地)からの抗菌を回収することにより、核酸からなるホスト細胞を作る。
抗CD117の遺伝子組み換え生産のために、例えば、上述のように、抗CD117をエンコードする核酸は、単離されて、ホスト細胞内でさらなるクローン化および/または式のために、1つ以上のベクトルに挿入される。このような核酸は、従来の方法(例えば、上記の重鎖および軽鎖をコード化する遺伝子に特定的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用すること)を用いて、容易に分離および配列決定される。
抗菌ベクトルのクローンまたは表現に適した宿主細胞には、ここに記載されている原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、特にグリコシル化とFcエフェクター機能が不要な場合、抗生物質がバクテリアで生産されることがある。バクテリア中の抗菌断片及びポリペプチドの表現については、例えば、米国特許を参照されたい。
No.5,648,237, 5,789,199, 5,789,199、および5,840,523。(Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254、E. coliの中の抗菌断片の表現を参照のこと) 表現後、この抗菌は溶解分に含まれる細胞ペーストから分離され、さらに浄化される可能性がある。
垂直電池は宿主としても使用される。例えば、懸濁状態で成長するように適応した哺乳類細胞系が有用である。有用な哺乳類宿主細胞系の他の例としては、SV40(COS-7)によって変換されたサルのキドニー細胞(Grahamら、J. Gen Virol. 36:59(1977))、マウスセルトリ細胞(Mather, Biol. Reprodなどに記載されたTM4細胞)がある。
23:243-251 (1980); サルのキドニー細胞(VERO-76); ヒトの内臓細胞(HELA); イヌのキドニー細胞(MDCK; バッファローの肝臓細胞(BRL 3A); ヒトの肺細胞(Hep G2); マウスのママリー細胞(MMT 060562); TRI細胞(Mather et al. N.Y.)アカド。科学383:44-68 (1982); (1982); MRC 5細胞;およびFS4細胞。その他の有用な哺乳類宿主細胞系には、DHFRCHO細胞(Urlaubら、Proc. Natal. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含む中国ハムスター卵巣(CHO)細胞、およびY0、NS0およびSp2/0のような骨髄細胞系が含まれる。抗菌製造に適した哺乳動物のホスト細胞系のレビューについては、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003)を参照。
一実施形態では、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書に開示される配列番号と少なくとも約90%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%同一であるアミノ酸配列を有する可変領域を含む。あるいは、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書に開示される配列番号と少なくとも約90%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%同一であるアミノ酸配列を有する本明細書に記載される可変領域のフレームワーク領域を有する本明細書に開示される配列番号を含むCDRを含む。
一実施の形態では、抗CD117の、又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域と、本明細書で開示されるアミノ酸配列を有する重鎖不変領域を含む。別の実施の形態では、抗CD117の、又はその抗原結合断片は、本分野に開示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とライトチェーン不変領域を含む。更に別の実施形態では、抗CD117抗原、又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、鎖定常領域分野に開示されるアミノ酸配列を有する軽鎖不変領域からなる。
抗CD45抗体
本方法はまた、CD45ポリペプチド、例えばヒトのCD45ポリペプチドに特に結合する抗原結合フラグメント、及びそれらの使用を含む。例示的な実施例において、CD45ポリペプチドに特別に結合する、抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を構成する。本書に記載されているADCでは、CD45抗性物質を使用することができる。
CD45は、T細胞およびB細胞抗原レセプターを介するシグナル伝達に必須の造血細胞特異的膜貫通タンパク質チロシンホスファターゼである。CD45には大きな細胞外ドメインと細胞質ドメインを含むアルカリホスファターゼがある。CD45は、刺激の性質および関与する細胞型に依存して、正および負の両方の調節因子として作用する可能性がある。CD45遺伝子には多数の並べ順列が可能であるが、伝統的にヒトで同定されているアイソフォームはわずか6種類である。アイソフォームは、RA、RO、RB、RAB、RBCおよびRABCである(Hermistonら2003 "CD45: a critical regulator of signaling thresholds in immune." Annu Rev Immunol. 2: 107-137.)。CD45RAはナイーブT細胞に発現し、CD45ROは活性化および記憶部T細胞、一部のB細胞サブセット、活性化単球/マクロファージ、顆粒球に発現している。CD45RBは末梢B細胞、ナイーブT細胞、胸腺細胞、マクロファージ、樹状細胞に弱く発現している。ヒトCD45(mRNCBIリファレンスシリーズ: NM_080921.3, Protein NCBIリファレンスシリーズ: NP_563578.2)を結合することができる、抗原結合断片および抗原結合断片は、等形CD45ROを結合することができるものを含む、本明細書に開示される組成物及び方法と併せて使用することができ、例えば、血液細胞移植治療を必要とする患者における血液細胞グラフトを促進することができる。CD45の複数のアイソフォームは、一次転写産物中の34個のエキソンの選択的スプライシングから生じる。エクソン4、5、6、および潜在的に7のスプライシングは、複数のCD45変異を生じる。選択的エキソン式は、以下の表1に記載のCD45アイソフォームで観察される。
[表１]
選択的スプライシングは、CD45タンパク質の様々なアイソフォーム(例えば、CD45RA、CD45RAB、CD45RABC)で発現される個々のエキソンまたはエキソンの組合せをもたらしうる。対照的に、CD45ROはエクソン4～6の発現を欠き、エクソン1～3および7～34の組合せから生成される。エクソン7もタンパク質から排除でき、その結果、エクソン1-3と8-34が一緒にスプライシングされるという証拠がある。E3-8と命名されたこのタンパク質はmRNAレベルで検出されているが、現在のところフローサイトメトリーでは同定されていない。
CD45ROは現在、造血幹細胞に発現する唯一の既知のCD45アイソフォームである。CD45RAおよびCD45RABCは検出されていないか、または造血幹細胞の表現型から除外されている。CD45RBが胎児の造血幹細胞に発現しているが、成人の骨髄造血幹細胞には存在しないという証拠が、マウスを用いて行われた研究から得られている。特に、CD45RCはアジア人集団内で認められるエクソン6の多型の割合が高い(CD45RCのエクソン6の多型は日本人集団の約25%に認められる)。この多型は、CD45ROの高発現およびCD45RA、CD45RB、およびCD45RCのレベルの低下をもたらす。さらに、CD45RA変形例(CD45RABおよびCD45RACなど)は、自己免疫疾患と関連しているエクソン4の多型を示す。
造血幹細胞上のCD45ROの存在および他の免疫細胞上のその比較的限定された式(TおよびBリンパ球サブセットおよび種々の骨髄細胞のような)は、CD45ROを、造血幹細胞移植を必要とする患者のためのコンディショニング療法のための特に十分に適した標的にする。CD45ROはエクソン4、5、6のみの表現が不足しているため、パンCD45 AbsとCD45RO特有の抗生物質のスクリーニングを可能にする。
ここに記載された患者の調整方法と併用可能な抗CD45 bidodyは、例えば、BIOLEGEND(R) (カリフォルニア州サンディエゴ)から市販されている抗CD45 clone HI30およびそれらのヒト化された改良型を含む。抗生物質の人為化は、骨格残渣物及び非人的抗菌の一定領域残渣物を、当業者に知られている手順に従い、ゲルムラインヒト抗菌の残渣物に置き換えることによって行うことができる。本明細書に記載の方法と併せて使用できる追加の抗CD45抗体には、ABCAM(R) (ケンブリッジ、MA)から市販されている抗CD45抗体ab10558、EP322Y、MEM-28、ab10559、0.N.125、F10-89-4、HIe-1、2B11、YTH24.5、PD7/26/16、F10-89-4、1B7、ab154885、B-A11、蛍光体S1007、ab170444、EP350、Y321、GA90、D3/9、X1 6/99、およびLT45、ならびにそれらのヒト化変異体が含まれる。
ここに記載されている患者のコンディショニング手順と併用されることができるさらなるCD45反抗物質には、SIGMA-ALDRICH(R) (セントルイス、ミズーリ州)から市販されている反CD45のHPA000440およびそれらの人間化されたバリエーションが含まれる。ここに記載されている患者の条件付け方法と併用できる追加の抗CD45抗生物質は、例えば、Matthewsら、Blood 78:1864-1874、1991において記載されている、ムリンモノクローン抗BC8を含み、これは、抗CD45抗生物質と同様に、それらの人間化改良物に関連する、ここに含まれる。本明細書中に記載される方法と組み合わせて使用され得るさらなる抗CD45抗体は、モノクローナル抗体YAML568を含み、これは、例えば、Glatting et al., J. Nuclに記載される。中央値。8:1335-1341, 2006, 2006, この特許は、それが抗CD45抗並びにそれらの人間化された改良物に関するものとして、ここに参考文献に組み込まれている。ここに記載されている患者の調整手順と併用できる追加の抗CD45薬物は、例えばBrenner et al., Annに記載されているモノクローナル抗TH54.12およびYTH25.4を含む。ニューヨークアカド。科学996:80-88, 2003, 2003, この特許は、それが抗CD45抗並びにそれらの人間化された改良物に関するものとして、ここに参考文献に組み込まれている。ここに記載されている患者のコンディショニング法に使用するための追加の抗CD45抗薬は、例えば、褐色ら、Immunology 64:331-336,1998に記載されている、UCHL1、2H4、SN130、MD4.3、MBI、およびMT2を含んでおり、これらはアンチCD45抗薬およびそれらの人間化バリエーションに関連するものとしてここに含まれる。
本明細書中に記載される方法と組み合わせて使用され追加のさらなる抗CD45抗体は、American Type Culture Collection (ATCC)アクセッション番号から産生され、放出されるものを含む。RA3-6132、RA3-2C2、およびTIB122、ならびにJohnsonら、J. Exp.に記載されているモノクローン抗生物質C363.16Aおよび13/2。中央値。169:1179-1184, 1989, 1989, この特許は、それが抗CD45抗並びにそれらの人間化された改良物に関するものとして、ここに参考文献に組み込まれている。本明細書に記載される患者の調整方法と併せて使用することができるさらなる抗CD45抗体には、例えばHarvathら、J. Immunolに記載されているモノクローナル抗体AHN-12.1、AHN-12、AHN-12.2、AHN-12.3、AHN-12.4、HLe-1、およびKC56(T200)が含まれる。146:949-957, 1991, 1991, この特許は、それが抗CD45抗並びにそれらの人間化された改良物に関するものとして、ここに参考文献に組み込まれている。
ここに記載されている患者のコンディショニング法と併用できる追加の抗CD45物質には、例えば米国特許番号に記載されているものが含まれる。7,265,212 (例えば、他のクローンの中でも、抗CD45抗体39E11、16C9、および1G10を記載する)7,160,987(例えば、モノクローナル抗体6G3などのATCC受託番号HB-11873によって産生および放出される抗CD45抗体を記載する)、および6,099,838(例えば、抗CD45抗体MT3、ならびにATCC受託番号HB220(MB23G2とも記載する)およびHB223によって産生および放出される抗体を記載する)、ならびにUS 2004/0096901およびUS 2008/0003224(例えば、ATCC受託番号PTA-7339によって産生および放出される抗CD45抗体、例えば、モノクローナル抗体17.1)を記載する。
ここに記載された患者のコンディショニング法と併用抗体更なるCD45反抗物質には、ATCCアクセションNosから生産され、放出される抗CD45が含まれる。MB4B4, MB23G2, 14.8, GAP 8.3, 74-9-3, I/24.D6, 9.4, 4B2, M1/9.3.4.HL.2、およびそれらの人間化および/または親和性成熟型バリエーション。親和性熟成は、例えば、ここに記載された、又は本技術で知られている、ファージディスプレイのようなin vitroディスプレイ技術を用いて行うことができる。
ここに記載されている患者のコンディショニング法と併用できる追加の抗CD45 bidodyは、例えば、Morikawa et al., Int.に記載されている反CD45 bide T29/33を含んでいる。J. ヘマトール。54:495-504, 1991, 1991, 当該特許の開示は、抗CD45抗薬に関するものとしてここに引用している。
ある種の実施例において、抗CD45抗菌液は、アパミスタマブ(別名90Y-BC8、Iomab-B、BC8;例えば、US20170326259、WO2017155937、およびOrozco et al. Blood. 127.3 (2016): 352-359.)またはBC8-B10(説明されるように、例えばLi et al.)から選択される。PloS one 13.10 (2018): e0205135. は、各参考として組み込まれています。他の反CD45抗性物質は、例えば、WO2003048327、WO2016016442、US20170226209、US20160152733、US9701756、US20110076270またはUS7825222に記載されており、これらは、それぞれ、反CD45抗性物質に関する参考文献に組み込まれている。
一実施の形態では、当該抗CD45モノは、本稿に記載した抗CD45モノの重鎖と、本稿に記載した抗CD45モノの軽鎖可変領域からなる。一実施の形態では、当該抗CD45のうちのCDR1、CDR2及びCDR3からなる重鎖と、本項に記載した抗CD45のCDR1、CDR2及びCDR3からなる軽鎖可変領域とを含んでいる。
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書中の抗CD45抗体と少なくとも約90%のアイデンティティ、例えば、本明細書中の抗CD45抗体と少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアイデンティティを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一定の実施形態では、1種のAnti-CD45のHC変数領域(HC)を含む変形例重鎖(HC)領域、又はその変形例体(i)が、1,2,3,4又は5のアミノ酸の置換、補足又は削除においてAnti-CD45と異なる。(ii)最大でも5,4,3,2又は1のアミノ酸置換、補足又は削除においてAnti-CD45と異なる。 (iii)1-5、1-3、2-2、2-5又は3-5のアミノ酸置換、補足又は削除並びに/又は(iv)においてAnti-CD45とは異なる。 (iii)Anti-CD45の1-5 Abidとは少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約95%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%以上がAnti-CD45 (i)-(iv)のいずれにおいても、アミノ酸の代替は控えめなアミノ酸の代替または非控えめなアミノ酸の代替となりうる;そして、変形例重鎖可変領域は、抗CD45の結合特異性を保持しながら、反CD45の重鎖可変領域に比べて、より高い生物配列活動を持つことができる。
上記載の各々の開示は、抗CD45抗生物質に関するものとして、ここに参考文献として組み込まれている。上述の組成および方法と併用されることができる反体および抗原結合フラグメントには、上述の抗生物質および抗原結合フラグメント、並びに上述の非ヒト抗生物質および抗原結合フラグメントのヒト化改良版および抗原結合フラグメントが含まれ、これらは上述のものと同じエピトープを結合する、たとえば、競合するCD45結合アッセイによって評価される。
抗CD2抗体
ヒトCD2は、T細胞表面抗原T11/Leu-5、T11、CD2抗原(p50)、およびヒツジ赤色血球受容体(SRBC)とも呼ばれる。CD2はT細胞上に発現している。ヒトCD2の2つのアイソフォームが同定されている。イソホルム1は、351個のアミノ酸を含有することがSeed, B. et al. (1987) Proc.に記載されている。Nat.アカド。科学84: 3365-69 (Sewellら(1986) Procも参照)。Nat.アカド。科学83: 8718-22) 以下 (NCBI リファレンス配列: NP_001758.2):
msfpckfvas fllifnvssk gavskeitna letwgalgqd inldipsfqm sddiddikwe
ktsdkkkiaq frkeketfke kdtyklfkng tlkikhlktd dqdiykvsiy dtkgknvlek
ifdlkiqerv skpkiswtci nttltcevmn gtdpelnlyq dgkhlklsqr vithkwttsl
sakfkctagn kvskessvep vscpekgldi yliigicggg sllmvfvall vfyitkrkkq
rsrrndeele trahrvatee rgrkphqipa stpqnpatsq hpppppghrs qapshrpppp
ghrvqhqpqk rppapsgtqv hqqkgpplpr prvqpkpphg aaenslspss n (SEQ ID NO: 293)
CD2の2番目の同位体は377アミノ酸であり、ここではNCBIリファレンス配列: NP_001315538.1として確認される。
一実施の形態では、ここに記載される組成物及び方法と併用されうる抗CD2抗たんぽは、以下のCDRのうちの1つ以上または全部を有するものを含む。
アミノ酸配列EYMY(SEQ ID NO: 294)を有するCDR-H1;
アミノ酸配列RIDPEDGSIDYVEKFKK (SEQ ID NO: 295)を有する1つのCDR-H2
アミノ酸配列GKFNYRFAY (SEQ ID NO: 296)を有するCDR-H3;
アミノ酸配列RSSQSLLHSSGNTYLN (配列番号297)を有するCDR-L1;
アミノ酸配列LVSKLES (SEQ ID NO: 298)を持つCDR-L2;
アミノ酸配列MQFTHYPYT (SEQ ID NO: 299)を有するCDR-L3。
1つの実施例では、抗CD2抗CDシークエンス、又はその抗抗CD2、又は抗原結合部を有するアミノ酸配列可変領域が、1つの実施例では、レイノンチェーン可変領域を含み、それらは、アミノ酸シークエンスを有するDVVMQVSQEQVSQEQVSQEVGスペルギルギルギルバースバースヴルギルバースヴトヴトヴトヴスSS (SEQ NO: 300)と、アミノ酸シークエンスを有する軽鎖可変領域、若干のチェーン可変領域を有する。
一実施の形態では、ここに記載される組成物及び方法と併用されうる抗CD2抗たんぽは、以下のCDRのうちの1つ以上または全部を有するものを含む。
アミノ酸配列GFTFSSY (SEQ ID NO: 302)を有するCDR-H1;
アミノ酸配列SGGGF (SEQ ID NO: 303)を有するCDR-H2;
アミノ酸配列SSYGEIMDY (SEQ ID NO: 304)を有するCDR-H3;
アミノ酸配列RASQRIGTSIH (配列番号305)を有するCDR-L1;
アミノ酸配列YASESIS(配列番号306)を有するCDR-L2;および
アミノ酸配列QQSHGWPFTF (SEQ ID NO: 307)を有するCDR-L3。
1つの実施形態では、抗CD2、又はその抗CD2、又は抗原結合部を有するアミノ酸配列可変領域が、1つの実施形態では、アミノ酸配列のE-CDGSGFTVGSGFTVGLGSGFTVGLGSGFTVGLGSGFTLGFTVGRLGFTGFTLGFTLGFTVGRILNILNIRDSMYCARSSYRSGSGSSGSSGSFTGFTDFTVSSIGSPRVSPAIVSPAIQWSHQWFTGKLEIE (SEQ ID No:309)と、アミノ酸配列のDILGGSGFTVGSGFTGLGFTGFTGFTGLEIE (SEQ No:309)を有する軽鎖可変領域を含んでいる。
別の実施形態では、本記載の組成物及び方法と関連して使用されうる抗CD2の技術には、以下のCDRのうちの1つ以上または全部を有するものが含まれる。
アミノ酸配列GFTFSSY (SEQ ID NO: 302)を有するCDR-H1;
アミノ酸配列SGGGF (SEQ ID NO: 303)を有するCDR-H2;
アミノ酸配列SSYGELMDY (SEQ ID NO: 310)を持つCDR-H3;
アミノ酸配列RASQRIGTSIH (配列番号305)を有するCDR-L1;
アミノ酸配列YASESIS(配列番号306)を有するCDR-L2;および
アミノ酸配列QQSHGWPFTF (SEQ ID NO: 307)を有するCDR-L3。
1つの実施形態では、抗CD2、又はその抗CD2、又は抗原結合部を有するアミノ酸配列可変領域が、1つの実施形態では、アミノ酸配列E-CDGSGFTVGSGFTVGLGGSGFTVLGSGFTVGLGFTVGLGFTVGLGFTLGFTVGRLGFTLGFTVGRYLDSLNILYCARSSYRSGSSGSGSGSFTGFTVSSIQFSPRVSPAIVSQGSQGFTWFTGLEIE (SEQ No:311)と、アミノ酸配列DILQSPAIQFSQGSQFTQFTGFTGGTKLEIE (SEQ No:309)を有する軽鎖可変領域を含む、レインチェーン可変領域を含んでいる(SEQ No:311)。
また、レイン酸配列DILGGSGGSGGSGFTVGLGFTVGSFTGLGFTGFTGLEIE (SEQ No:309)。
先に述べたCDR配列を含むアンチボディ及びそれらの抗原結合フラグメントが記載されている。例えば、米国特許第6,849,258であり、その開示は、反CD2抗原及びそれらの抗原結合フラグメントに関するものとして、ここに参考文献に含まれる。
抗CD5抗体
ヒトCD5はリンパ球抗原T1、T1、Leu-1、LEU1とも呼ばれる。CD5はヒトT細胞上に発現する。ヒトCD5の2つのアイソフォームが同定されている。Isoform 1は495アミノ酸を含み、Gladkikhら(2017) Cancer Med.6(12):2984およびJonesら(1986) Nature 323(6086):346に記載されている。CD5(同位体1)のアミノ酸配列は以下のとおりである(NCBI Reference Sequence: NP_055022.2):
mpmgslqpla tlyllgmlva sclgrlswyd pdfqarltrs nskcqgqlev ylkdgwhmvc
sqswgrsskq wedpsqaskv cqrlncgvpl slgpflvtyt pqssiicygq lgsfsncshs
rndmchslgl tclepqkttp pttrpppttt peptapprlq lvaqsggqhc agvvefysgs
lggtisyeaq dktqdlenfl cnnlqcgsfl khlpeteagr aqdpgepreh qplpiqwkiq
nssctslehc frkikpqksg rvlallcsgf qpkvqsrlvg gssicegtve vrqgaqwaal
cdsssarssl rweevcreqq cgsvnsyrvl dagdptsrgl fcphqklsqc helwernsyc
kkvfvtcqdp npaglaagtv asiilalvll vvllvvcgpl aykklvkkfr qkkqrqwigp
tgmnqnmsfh rnhtatvrsh aenptashvd neysqpprns hlsaypaleg alhrssmqpd nssdsdydlh gaqrl (SEQ ID NO: 312)
ヒトCD5の第2の同位体は438アミノ酸(上の下線部分参照)であり、NCBI参照配列: NP_001333385.1と同定される。イソフォーム1とは異なり、CD5アイソフォーム2は細胞内タンパク質である。Isoform 2 は別個5' UTR を含み、等形1 と比較して5' コーディング領域の内枠部分を欠いている。得られたアイソフォーム2は、アイソフォーム1と比較してN末端が短い。CD5アイソフォーム2は、アイソフォーム1と比較してリーダーペプチドを欠き、Bリンパ球のサブセットに見られる細胞内アイソフォームである。ここに記載されているADCは、ヒトCD5の細胞外版を表すヒトCD5アイソフォーム1に特有のものである。
1つの実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において使用され得る抗CD5抗体は、抗体5D7(Ab5D7)である。Ab5D7の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列は、SEQ ID NO: 313として提供される。
VLTGPTVGPTVLTVGPTVGFSFCTFSVLTVGPTVGFSVLTGPTVGFSLTVGPTVGFSLTVG VADVTAVCYVRRATGGTVSS (SEQ ID NO: 313)
Ab5D7のVH CDRアミノ酸配列は、上に下線が付され、FSLSTSGMG (VH CDR1;配列番号315); WWDDD (VH CDR2;配列番号316);およびRRATGTGFDY (VH CDR3;配列番号317)である。
Ab5D7の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列は、SEQ ID No.314として提供される。
第314号(SEQ ID NO: 314) は、次のように述べています。安楽器、安楽器、安楽器
Ab5D7のVL CDRアミノ酸配列は上に下線を引いてあり、QDVGTA (VL CDR1; SEQ ID NO: 318); WTSTRHT (VL CDR2; SEQ ID NO: 319);YNSYNT (VL CDR3; SEQ ID NO: 320)である。
一実施形態において、抗CD5 ADCは、SEQ ID NO: 315に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO: 316に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 317に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 318に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメインからなる軽鎖、及びSEQ ID NO: 319に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、並びにSEQ ID NO: 320に記載され、リンカーを介してサイトトキシンに接合されるアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる反CD5 ADCを含む。
1つの実施形態において、抗CD5 ADCは、配列番号313に示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖、および配列番号314に示されるアミノ酸配列を含む可変領域を含むL鎖を含む抗CD5抗体を含み、抗体はリンカーを介して細胞毒素に結合体化される。
別の実施形態では、本明細書に記載されるADCにおいて使用される抗CD5抗体は、5D7抗体である(例えば、US 20080254027参照、その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。別の実施の形態では、ここに記載される方法及び組成(ADCを含む)において使用されうる抗CD5抗たんぽは、5D7抗たんぱくの変形例である(例えば、US 20080254027を参照のこと。この開示はここに参考文献として組み込まれている)。
ここに記載されている、WO 2019/108863に記載されている配列を含む、反CD5、又は結合フラグメントの追加の配列が、本分野に知られている。その含有量は、ここに組み込まれている。
本明細書中に記載されるADCにおいて使用され追加のさらなる抗CD5抗体は、ハイブリドーマ産生などの当技術分野で公知の技術を使用して同定され追加の。ハイブリドーマは、ムリンシステムを用いて調製することができる。予防接種及びその後の融合のためのスプレノサイトの分離のためのプロトコルは、本技術で知られている。融合パートナーとハイブリドマ発電の手順も知られている。または、HuMAb-Mouse(R)またはXenoMouseTMを使用して抗CD5抗物質を生成することもできます。追加の抗CD5抗薬を作る際、CD5抗原は分離され、または/または浄化される。CD5抗原は、CD5の細胞外ドメインからのCD5の断片であってもよい。動物への接種は、本技術に知られているどんな方法でも行うことができる。例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990を参照。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、豚、牛および馬のような動物の予防接種方法は、当技術においてよく知られている。Harlow and Lane, supra, and U.S. Patを参照。No.5,994,619。CD5抗原は、免疫反応を刺激するためにアジュバントと共に投与することができる。当該技術分野で公知のアジュバントには、完全または不完全フロイントアジュバント、RIBI (ムラミルジペプチド)またはISCOM (免疫刺激複合体)が含まれる。CD5抗原で動物を免疫化した後、免疫化された動物から単離された細胞から抗体産生不死化細胞株を調製する。免疫後、動物を屠殺し、リンパ節および/または脾臓B細胞を、当技術分野で公知の方法(例えば、発癌遺伝子導入、発癌性ウイルス形質導入、発癌性または変異性化合物への暴露、不死化細胞、例えば骨髄腫細胞との融合、および腫瘍抑制遺伝子の不活性化)により不死化する。Harlow and Lane, supraを参照。ハイブリドーマは、頑丈な成長、高い抗菌製造、および望ましい抗菌特性を含む望ましい特性のために、選択し、クローンし、さらにスクリーニングすることができる。
本書に記載されている反CD5 ADCにおいて使用される反CD5 は、また、CD5に結合することができる分子のための、高いスループットスクリーニングを用いて、抗CD5 ライブラリを特定することができる。このような方法には、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳類細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイ、mrnaディスプレイ、およびcDNAディスプレイなどのような、当業者に知られている体外ディスプレイ技術が含まれる。たとえば、Feliciら、Biotechnolでは、生物学的に関連性のある分子を結合する抗物質、抗原結合フラグメント、あるいは配位子を分離するためのファージディスプレイの使用が検討されている。Annual Rev. 1:149-183, 1995; Katz, Annual Rev.生態学。バイオモル。構造。26:27-45, 1997; 1997年;およびHoogenboom et al., Immunotechnology 4:1-20, 1998年。これらの開示は、それぞれがインビトロディスプレイ技術に関連するものとして本明細書に参考として援用される。ランダム化されたコンビナトリアル・ペプチド・ライブラリは、Kay, Perspectに記載されているように、細胞表面抗原を結合するポリペプチドを選ぶために構築されている。ドラッグディスカバリー・デス2:251-268, 1995年およびKayら、Mol.多様。1:139-140, 1996, 1996, 各開示は、抗原結合分子の発見に関するものであるので、ここに引用して参考文献に組み込まれている。多マー性タンパク質などのタンパク質は、機能分子としてファージ表示に成功している(たとえば、EP 0349578、EP 4527839、EP 0589877、それにChiswell とMcCafferty, Trends Biotechnolを参照)。10:80-84 1992, 1992, 各開示は、抗原結合分子の発見のためのin vitroディスプレイ技術の使用に関する引用としてここに組み込まれている。加えて、FabやscFvのような機能的な上記断片は、in vitroディスプレイ形式で表現されている(例えば、McCaffertyら、Nature 348:552554、1990; Barbasら、Procを参照)。Natl.アカド。科学米国88:7978-7982, 1991; and Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991、各開示は、抗原結合分子の発見のためのin vitroディスプレイプラットフォームに関連するものとしてここに含まれる。
インビトロディスプレイ技術に加えて、計算モデリング技術を用いて、例えば、米国特許第2013/0288373号明細書に記載されている手順を用いて、抗CD5抗体または抗体断片をインシリコでデザインおよび同定することができ、その開示は、抗CD5抗体を同定するための分子モデル手順に関連するので、本明細書に組み込まれる。例えば、計算モデル技法を用いて、当業者は、CD5上に特定のエピトープを結合することができる分子、例えばCD5の細胞外エピトープのために、シリコ内の上記毒物又は上記菌断片のライブラリーをスクリーニングすることができる。
一実施の形態では、ここに記載されるADCにおいて使用されるアンチ・CD5・バイオレンスは、セルに内部化することができる。抗CD5(又はその断片)を識別する際には、追加の技法を用いて、細胞の表面(例えばTセル)にCD5を結合する抗物質又は抗原結合フラグメントを識別し、さらに、例えば、レセプター媒介の内細胞により細胞に内在化することができる。例えば、上述のin vitroディスプレイ技術は、血液幹細胞の表面にCD5を結合し、その後内部化される抗物質または抗原結合フラグメントをスクリーニングするのに適応することができる。フェイジ・ディスプレイは、この選別のパラダイムと併用できるそのような手法の一つである。CD5を結合し、その後CD5+セルに内部化される抗CD5抗生物質又はそのフラグメントを特定するために、当業者の1人は、ウィリアムズら、Leukemia 19:1432-1438、2005に記載されているファージディスプレイ技術を使用することができる。このような技法は、他の上記原を標的とする上記毒物にも適用できる。
例えば、当該技術分野で知られている放射性核種内部化アッセイを用いて、抗CD5の内在化能力またはそのフラグメントを評価することができる。例えば、18 F、75 Br、 77 Br、122 I、99 I、 125 I、124 I、ディスプレイI、211、At 67 Ga、111 In、 90Tc、 123 Yb、186 Re、64 Cu、129Cu、131 Lu、77 As、72 As、86 Y、86 Y、169 Zr、212Bi、213 Bi、67 Ac、225 Acのような放射性同位体を組み込むことにより、機能化することができる。例えば、18 F、75 Br、 77Br、122 I、124 I、125 I、129 I、131 I、211 Aなどの放射性ハロジェンは、電気的ハロジェン試薬(例えば、イオディネーションビード、サーモフィッシャーサイエンティフィック、ケンブリッジ、マサ)を含む、ポリスチレンビードなどのビードを使用して、アンド、上記のフラグメント、または配位子に組み込むことができる。放射性化された抗生物質またはそのフラグメントは、内在化を可能にするのに十分な時間の間、血液細胞と共に育てることができる。内部化された抗体またはそのフラグメントは、回収された洗浄バッファーの放出された照射(例えば、γ照射)と比較して、得られた造血幹細胞の放出された照射(例えば、γ照射)を検出することによって同定することができる。上記の内部化アッセイはまた、CD5以外のHSC抗原を標的とするADCと同様に、ADCの特徴を明らかにするために使用することができる。
抗体の同定及び製造方法
細書には、遺伝子組み換えHSC移植前の調整方法のように、特定の抗CD117および反CD45抗性物質が提供されている。本分野における開示を考慮すると、他の反CD117の防、例えば中性の防、又は他の反CD45の防、を同定することができる。
HSCsおよび/または抗菌細胞によって表現されるCD117(例、GNK+CD117)またはCD45を結合することが可能な分子のための高スループットスクリーニングの方法、または、自己感染症を治療し、幹細胞遺伝子治療を必要とする患者(例、ヒト患者)を調整するのに有用な成熟した抗生物質を同定および親和性を確認するために使用することができる。このような方法は、ここに記載されている抗生物質の同等の又は更に改良されたバージョンを識別するために使用することができる。このような方法には、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳類細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイ、mrnaディスプレイ、およびcDNAディスプレイなどのような、当業者に知られている体外ディスプレイ技術が含まれる。
リガンドや抗生物質、あるいは生物学的に関連性のある分子を結合する断片(例:scFv)を分離するためのファージディスプレイの使用について、例えば、Feliciら、Biotechnolで検討されている。Annual Rev. 1:149-183, 1995; Katz, Annual Rev.生態学。バイオモル。構造。26:27-45, 1997; 1997年;およびHoogenboom et al., Immunotechnology 4:1-20, 1998年。これらの開示は、それぞれがインビトロディスプレイ技術に関連するものとして本明細書に参考として援用される。ランダム化されたコンビナトリアル・ペプチド・ライブラリは、Kay, Perspectに記載されているように、細胞表面抗原を結合するポリペプチドを選ぶために構築されている。ドラッグディスカバリー・デス2:251-268, 1995年およびKayら、Mol.多様。1:139-140, 1996, 1996, 各開示は、抗原結合分子の発見に関するものであるので、ここに引用して参考文献に組み込まれている。多マー性たんぱく質のようなタンパク質は、機能分子としてファージ表示に成功した(例えば、EP 0349578、EP 4527839、およびEP 0589877、ならびにChiswellとMcCafferty, Trends Biotechnol. 10:80-84 1992、これらの各開示は、抗原結合分子の発見のためのin vitroディスプレイ技術の使用に参照して、ここに含まれている)。さらに、FabやscFvのような機能的な抗菌断片は、in vitroディスプレイ形式で表現されている(例えば、McCaffertyら、Nature 348:552554, 1990; Barbasら、Proc. Natal. Acad. Sci. USA 88:7978-7982, 1991;Clacksonら、Nature 352:624-628, 1991を参照)。これらの各々の開示は、抗原結合分子の発見のためのin vitroディスプレイプラットフォームに関連するものとして、ここに含まれる。HuMAb-Mouse(R)やXenoMouseTMなどで、人間の抗生物質を生成することもできる。
これらの技術は、特に、CD117(例:GNK+CD117)を結合する抗物質の親和性を特定し、改善するために使用することができ、これらは、逆に、血液細胞移植治療を必要とする患者(例:ヒト患者)の内生血液細胞を枯渇させるために使用することができる。
体外ディスプレイ技術に加えて、計算モデル技術を用いて、CD117(例:GNK+ CD117)やCD45のような抗原に結合することが可能な、抗物質や抗原の断片を設計し、識別することができる。例えば、当業者は、計算モデル技法を用いて、この抗原の細胞外エピトープのような特定のエピトープを結合することができる分子のために、シリコの中で、抗物質および抗物質断片の図書館をスクリーニングすることができる。これらの計算技法によって確認された抗生物質およびそれらの抗原結合フラグメントは、ここに記載されたガンおよび自己感染症の治療法およびここに記載された患者調整手順のような、ここに記載された治療法と併用することができる。
追加の技法は、細胞の表面(例、ガン細胞、自己感染細胞、あるいは血液細胞)で、例えば、レセプターを媒介とした内細胞によって内在化されているCD117(例、GNK+ CD117)またはCD45に結合することができる抗原結合断片、ならびに抗原結合断片を識別するために使用することができる。例えば、上述のin vitroディスプレイ技術は、CD117(例えば、GNK+ CD117)またはCD45を結合し、後に内部化される抗物質およびそれらの抗原結合フラグメントのスクリーニングに適応することができる。フェイジ・ディスプレイは、この選別のパラダイムと併用できるそのような手法の一つである。例えば、CD117(例:GNNK+ CD117)又はCD45を結合し、その後、血液細胞によって内在化される抗毒素及びそのフラグメントを識別するために、例えば、Williamsら、Leukemia 19:1432-1438、2005に記載されているファージディスプレイ技術を、当業者は適応することができるが、その開示は、その全体としてここに参考文献に含まれている。例えば、当技術分野で知られているミュージネーション・ファージ・ライブラリーは、特に、scFvフラグメント、Fabフラグメント、ダイアボディ、トリアボディ、10のFn3ドメインのような抗生物質、あるいはランダム化されたアミノ酸カセットを含むリガンド(例えば、CDRまたは同等の領域の1つ以上または全部、またはそれに相当する領域、あるいはそれに相当する領域、または、抗生物質または断片)をエンコードする再結合ファージ・ライブラリーを作ることができる。フレームワーク領域、ヒンジ、Fcドメイン、および抗生他断片の他の領域は、例えば、ヒトのゲルムライン抗生他と比較してわずかな変化を示すヒトゲルムラインの配列を有することにより、それらがヒトにおいて非遺伝子性であるように設計されることができる。
本技術に記載されている、又は本技術に知られているファージディスプレイ技術を用いて、ファージ粒子に同価結合している無作為化された抗物質、又は、ファージ粒子に同価結合している、CD117(例:GNK+ CD117)又はCD45抗原を含むファージライブラリーを、例えば、最初にファージライブラリーをブロッキング剤(例えば、乳たんぱく質、牛たんぱく質アルバミン及び/又はIgG)と共にインキュベートし、ファージエンコード化されている抗物質、又はその断片を除去することにより、Fcドメインを結合している非固有のたんぱく結合及びそれらの断片を示すファージライブラリーをインキュベートし、その後、ファージライブラリーを数多くの血液細胞とインキュベートすることにより、インキュベートすることができる。ファージライブラリーは、CD45-又はCD117-specific abides、又はそれらの抗原結合フラグメント(例:GNK+ CD117-specific abides、又はその抗原結合フラグメント)が細胞表面のCD117(例:sell-surface GNK+ CD117)又はCD45抗原を結合し、その後、血液細胞によって(例:4°Cで1時間から6時間)内在化するのに十分な時間、抗原またはその断片を含んでいる。
たとえば、これらの抗原のうちの1つ以上に十分な親和性を示さないPhageは、細胞を洗浄することによって、取り除くことができる。寒さ(4°)0.1Mで pH 2.8のグリシン緩衝剤たとえば、細胞を分解し、細胞媒体から内部化されたファージを取り戻すことによって、癌細胞、自己感染細胞、あるいは血液細胞によって内在化されたファージに結合されたファージ、あるいはそのフラグメントを同定することができる。次に、ファージは、例えば、当業者に知られている方法を用いて、回収されたファージと一緒に2xYT媒体で菌細胞をインキュベートすることによって、細菌細胞内で増幅することができる。この媒体から回収されたファージは、例えば、ファージゲノム内に挿入された、抗物質をエンコードする遺伝子またはそのフラグメントの核酸配列を決定することによって特徴づけることができる。コード化された抗生物質またはその断片は、その後、化学合成(例えば、scFvの断片のような抗菌断片のような)または組換え式(例えば、全長の抗上記の)によって新しく調製することができる。
本書に記載された組成物及び方法で使用するための防CD117(例:防GNK+CD117)または防CD45の体外進化のための例示的な方法は、ファージディスプレイである。ファージディスプレイライブラリーは、抗体のCDRまたは抗体様スキャフォールドの類似領域(例えば、10 Fn3ドメインのBC、CD、およびDEループ)のコード配列内の設計された一連の変異または変異を作製することによって作製することができる。これらの突然変わりが導入されるテンプレート・エコノミー・コード化のシークエンスは、例えば、純粋なヒトの生殖ラインシークエンスである。これらの突然変異は、当技術分野で公知の標準的突然変異誘発技術を用いて行うことができる。このようにして、各ミュータント配列は、1つ以上のアミノ酸の変形のための保存に対応するテンプレートに対応する1つの抗菌をコード化する。レトロバイラル及びファージディスプレイベクトルは、本技術で知られる通常のベクトル建設技術を用いてエンジニアリングすることができる。P3ファージディスプレイベクトルは、相性のあるタンパク質表現ベクトルとともに、ファージディスプレイベクトルを生成し、多様化させることができる。
突然変異したDNAは配列の多様性を提供し、各形質転換ファージはDNAによってコードされる最初のテンプレートアミノ酸配列の1つの変形例を示し、膨大な数の異なるが構造的に関連したアミノ酸配列を示すファージ集団(ライブラリー)を生じる。このように、各領域の特徴が明確になっているため、ファージディスプレイスクリーンに導入されたアミノ酸のバリエーションは、結合ペプチドや領域の結合特性を変化させるものであり、その全体的な分子構造を著しく変化させるものではないと考えられている。
典型的なスクリーンでは、ファージライブラリーは上記の抗原の1つまたはそのエピトープと接触し、結合することができる。バインダと非バインダの分離を容易にするために、固い保持体で標的を固定することが便利である。ファージベアリングのCD117結合部またはCD45結合部は、固体保持体上の標的と錯体を形成することができるが、非結合部ファージは、液体中に残り、余剰緩衝剤で洗い流すことができる。次に、緩衝液を極限のpH (pH 2またはpH 10)に変えたり、緩衝液のイオン強度を変えたり、デナチュランを加えたり、他の既知の手段を加えたりすることによって、境界ファージを標的から放出することができる。
その後、回収されたファージは細菌細胞の感染によって増幅することができ、スクリーニング過程を繰り返すことができる。そして、新しいプールは、結合していない抗生物質で消耗し、結合する抗生物質、たとえばCD117(例:GNNK+ CD117)やCD45を豊富にする。少数の結合したファージでさえ回復することは、その後のスクリーニングを繰り返すためにファージを増幅するのに十分である。何回かの選択の後、結合プールの中で選択されたファージクローンから派生した、抗物質又は抗原結合フラグメントをエンコードする遺伝子配列は、通常の方法により決定される。それゆえ、ファージの標的への結合親和性を付与するペプチド配列を明らかにする。パンニング処理の間、集団の配列の多様性は、望ましいペプチド結合抗薬が残るまで、選択ラウンドごとに減少する。シークエンスは、少数の関連する抗生物質またはそれらの抗原結合フラグメントに収束することがある。選択の各ラウンドで回収されるファージの数の増加は、図書館の収束が画面に起こったことを示している。
例えば、抗CD117または抗CD45の識別のための別の方法には、CD117(例えば、GNK+CD117)またはCD45を結合する非人間性抗毒素を使用することが含まれる。これは、例えば、以下の手順に従ったものである。コンセンサスのあるヒトの重鎖および軽鎖配列が本技術で知られている(例えば、「VBASE」のヒトゲルムライン配列データベース; Kabatらを参照)。Immunological Interest のタンパク質 Sequences, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91 -3242, 1991; Tomlinson et al., J生涯。227:776-798, 1992; 1992年、Coxらユール。J. イミュノール。24:827836, 1994, 1994, これらの各々の開示は、本文中で引用することにより、それらが、コンセンサスである人間の検出重鎖および軽鎖配列に関するものであることを示している。確立された手順を用いて、当業者の1人は、コンセンサス・ニーズ・配列(例、配列・アラインメント)の可変ドメインフレームワーク残基およびCDRを識別することができる。本書に記載されているように、CD117(例:GNK+ CD117)またはCD45を結合する非人的抗たる1つ以上の対応するCDRと、コンセンサス人的なヒトの抗たるコンセンサスの重鎖および/または軽鎖可変領域の1つ以上のCDRの代替となることができる。このCDR交換は、ここに記載された、又は本技術に知られている遺伝子編集技術を用いて行うことができる。
SEQ No: 7.に記載されているヒトのコンセンサス・ヒューマン・ドメインを含む。SEQ No: 7.に記載されている重鎖・ドメインと、SEQMTQSPLGSRVGESLG VESLG GSFTGSLGFTGFTDLTQPEDFATYQYCQYLPGTQVTVSSQSSQGSSLASQLASYQLASQLASQLASQLYASQKAPLYASQLASQLYASQLASQLYASQQKEQEQRT (SEQ ID No: 8)は、米国特許番号を確認した。6,054,297(ジェネンテック)であり、これは、ヒトのコンセンサス配列に関するものである。上の配列のCDRは太字で表されてる。
人間化抗毒物を生成するために、1つ以上の可変領域CDRが、例えばCD117(例、GNK+ CD117)またはCD45を結合する非ヒトのCDRの可変領域CDR配列に置き換えられた、上記コンセンサス配列をエンコードするポリヌクレオチドを再結合して表現することができる。血液細胞抗原への抗原の親和性は、主としてCDR配列によって決定されるので、その結果生まれたヒト化された抗原は、ヒト化された抗原の由来となった非ヒト化された抗原とほぼ同じ数の血液細胞抗原との親和性を示すことが期待される。標的抗原に対する抗菌の親和性を決定する方法は、特に、本技術で記載され周知のELISAに基づく技術、並びに表面プラズモン共鳴、蛍光アニソトロピー、同位体チテーションカロリメトリーを含む。
例えば、当該技術に知られている放射性核種内部化アッセイを用いて、調製された抗生物質、或いは抗生物質断片の内部化能力を評価することができる。例えば、本明細書に記載される、または当技術分野で公知のインビトロディスプレイ技術を用いて同定される抗体またはその断片は、18 F、75 Br、 77 I、 123 I、124 I、 125 I、129 I、211 I、67 At、72 Ga、111 In、122Tc、169 Yb、186 Re、64 Cu、67 Cu、225 Lu、77 As、86 Y、99 Y、89 Zr、212Bi、213 Bi、または67 Acなどの放射性同位元素の取り込みにより官能化することができる。例えば、18 F、75 Br、 77Br、122 I、124 I、125 I、129 I、131 I、211 Aなどの放射性ハロジェンは、電気的ハロジェン試薬(例えば、イオディネーションビード、サーモフィッシャーサイエンティフィック、ケンブリッジ、マサ)を含むポリスチレンビードなどのビードを使用して、上記のビーズ、またはフラグメントに組み込むことができる。
放射性標識された抗体、またはそのフラグメントは、癌細胞、自己免疫細胞、または造血幹細胞と、内部移行を可能にするのに十分な時間(例えば、4℃で30分間～6時間、例えば、4℃で1時間)、インキュベートされ得る。その後、電池を洗浄して、内蔵されていない抗非、またはそれらの断片を除去することができる(例えば、pH 2.8の冷(4° C)0.1Mのグリシン緩衝液を使用する)。内部化された抗体またはそのフラグメントは、回収された洗浄バッファーの放出された照射(例えば、γ照射)と比較して、得られた癌細胞、自己免疫細胞、または造血幹細胞の放出された照射(例えば、γ照射)を検出することによって同定することができる。前述の内部化アッセイは、ADCの特徴を明らかにするのにも利用できる。
アンチボディーは、例えば米国特許に記載されているように、組み換え方法及び組成を用いて製造され得る。4,816,567号。一実施の形態では、本記載の防CD117または防CD45抗をエンコードする孤立核酸が提供される。このような核酸は、VL及び/又は/又は、VHを含むアミノ酸配列(例えば、上記の軽鎖及び/又は重鎖)を含んでいるアミノ酸配列をコード化することができる。更なる実施の形態では、上記核酸を含む1つ以上のベクトル(例えば、表現ベクトル)が提供される。更なる実施の形態では、上記核酸を含む宿主細胞が提供される。上記実施形態の一例では、宿主細胞は、(1) VLを含むアミノ酸の配列を含むアミノ酸配列と、VHを含むアミノ酸の配列を示すアミノ酸の配列を示すベクトル、(2) および(2) VLを含むアミノ酸の配列を示すアミノ酸を含む第1ベクトルと、および、(VHを含むアミノ酸の配列を示すアミノ酸の配列を示す第2ベクトルを含む、(1)宿主細胞を構成するベクトルから成る。1つの実施例において、宿主細胞は真核生物である。例えば、中国のハムスターオヴァリー(CHO)細胞又はリンゴ細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20セル)。一実施の形態では、抗CLL-1抗菌を作る方法が提供される。この方法は、上記のように、当該抗菌の表現に適した条件下で、また任意にホスト細胞(又はホスト細胞培地)からの抗菌を回収することにより、核酸からなるホスト細胞を作る。
防CD117又は防CD45の遺伝子組み換え生産のために、例えば、上述のように、防CD45をエンコードしている核酸が、1つ以上のベクトルに分離され、ホスト細胞内でさらなるクローン化及び/又は表現のために挿入される。このような核酸は、従来の方法(例えば、上記の重鎖および軽鎖をコード化する遺伝子に特定的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用すること)を用いて、容易に分離および配列決定される。
抗菌ベクトルのクローンまたは表現に適した宿主細胞には、ここに記載されている原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、特にグリコシル化とFcエフェクター機能が不要な場合、抗生物質がバクテリアで生産されることがある。バクテリア中の抗菌断片及びポリペプチドの表現については、例えば、米国特許を参照されたい。No.5,648,237, 5,789,199, 5,789,199、および5,840,523。(Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254、E. coliの中の抗菌断片の表現を参照のこと) 表現後、この抗菌は溶解分に含まれる細胞ペーストから分離され、さらに浄化される可能性がある。
垂直電池は宿主としても使用される。例えば、懸濁状態で成長するように適応した哺乳類細胞系が有用である。有用な哺乳類宿主細胞系の他の例としては、SV40(COS-7)によって変換されたサルのキドニー細胞(Grahamら、J. Gen Virol. 36:59(1977))、マウスセルトリ細胞(Mather, Biol. Reprodなどに記載されたTM4細胞)がある。23:243-251 (1980); サルのキドニー細胞(VERO-76); ヒトの内臓細胞(HELA); イヌのキドニー細胞(MDCK; バッファローの肝臓細胞(BRL 3A); ヒトの肺細胞(Hep G2); マウスのママリー細胞(MMT 060562); TRI細胞(Mather et al. N.Y.)アカド。科学383:44-68 (1982); (1982); MRC 5細胞;およびFS4細胞。その他の有用な哺乳類宿主細胞系には、DHFRCHO細胞(Urlaubら、Proc. Natal. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含む中国ハムスター卵巣(CHO)細胞、およびY0、NS0およびSp2/0のような骨髄細胞系が含まれる。抗菌製造に適した哺乳動物のホスト細胞系のレビューについては、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003)を参照。1つの実施例において、宿主細胞は真核生物である。例えば、中国のハムスターオヴァリー(CHO)細胞又はリンゴ細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20セル)。
Fc-Modified Antibodies
幾つかの実施例において、本明細書に開示された抗物質又は抗原結合フラグメントは、Fcサイレンシングを許容するFc改変を含んでいる。このようなFc-modified abidesは、CD45やCD117のような血液細胞によって表現される抗原に結合することができ、本書に記載されているように、移植された遺伝子改良された血液幹細胞の接着を促進するために、薬物に結合することができる。これらの治療活動は、例えば、血液細胞(例えば、血球計数幹細胞または成熟免疫細胞(例えば、T細胞))によって表現される、抗体、例えば、抗CD45抗体、またはその抗原結合フラグメント、または抗原結合フラグメント)のCD45またはCD117への結合により、引き起こされうる。これは、癌細胞、自己免疫細胞、または造血幹細胞などであり、その後、死亡を誘発する。内因性造血幹細胞の枯渇は、移植された遺伝子改変HSCが帰宅できるニッチを提供することができ、続いて、生産的造血を確立することができる。このようにして、移植された遺伝子改良HSCは、ここに記載された幹細胞障害に苦しむ人間のような患者での移植に成功するであろう。本書では、Fc-modified abidesおよびADCは、内生の血液細胞の選択的枯渇を可能にするだけでなく、移植された遺伝子組み換えHSCに対するサイトトキシック効果を低減し、それによってHSCグラフトのさらなる移植を促進している。
ここに記載されている抗生物質又は抗原結合フラグメントは、また、半減期を増加させたり、ADCCを増加または減少させたりするような、抗生物質及び/又は断片の特性を変化させる。
1つの実施形態において、1つ以上の放射性ラベル表示されたアミノ酸からなる抗物質が提供される。放射性標識された抗体は、診断目的と治療目的の両方に使用することができる(放射性標識された分子への結合は、別の可能な特徴である)。ポリペットのためのラベルの非限定的な例としては、3 H, 14 C, 15 N, 35 S, 90 Y、99 Tc、および125 I、131 I、および186 Reが挙げられるが、これらに限定されるものではない。放射性標識されたアルファベットおよび関連するポリペット派生体を準備する方法は、当技術分野で公知である(例えば、Cancer ChemotherapyおよびBiotherapy 655-686(第2版、ChafnerおよびLongo、eds.、Lippincot Raven (1996)を参照)。第4,681,581号、米国特許第4,735,210号、米国特許第5,101,827号米国特許No.5,102,990(米国RE35,500)、米国特許。No.5,648,471及び米国特許5,697,902号。たとえば、放射性同位体はクロラミンT法によって結合することができる。
一実施の形態では、当該抗CD45(又はその抗原結合断片)、又はその抗CD117(又はその抗原結合断片)は、改良されたFc領域を含み、この改良されたFc領域は、当該分子がFcgammaR(FcimR)に対する改良された親和性又は結合性を有するような、野生型Fc領域に関連する少なくとも1つのアミノ酸改良を含む。Fc領域内のいくつかのアミノ酸位置は、Fcに対して直接接触するための結晶学研究を通して知られている。具体的には、アミノ酸234-239(ヒンジ領域)、アミノ酸265-269(B/Cループ)、アミノ酸297-299(C'/Eループ)、アミノ酸327-332(F/G)ループである。(例:Sondermann et al., 2000 Nature, 406: 267-273 参照)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、構造的および結晶学的分析に基づいて、FcγRと直接接触する少なくとも1つの残渣の修飾を含む変形例Fc領域を含み得る。一実施の形態では、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)が明示的にここに参考として含んでいるように、EU指数によれば、Anti-CD45 binding のFc領域、又はその断片、又はその抗CD117 binding の断片は、アミノ酸265におけるアミノ酸置換を含む。「KabatにおけるようなEUインデックス」とは、ヒトIgG1 EU抗体の番号付けを指す。1つの実施形態では、Fc領域はD265A突然異変を含む。1つの実施形態において、Fc領域はD265C突然異変を含む。いくつかの実施形態では、カバトにおけるように、EU指数によれば、抗菌(又はそのフラグメント)のFc領域は、アミノ酸234におけるアミノ酸置換を含む。
一実施の形態では、Fc領域は、D265、V205、H435、I253、および/またはH310のアミノ酸位置における突然異変を含む。例えば、これらの位置における特定の突然変わりには、D265C、V205C、H435A、I253A、および/またはH310Aが含まれる。
1つの実施形態において、Fc領域はL234A突然異変を含む。いくつかの実施例では、抗CD45抗原結合フラグメント、又はその抗CD117抗原結合フラグメントのFc領域は、カバトにおけるように、EU指数によれば、アミノ酸235におけるアミノ酸置換を含む。1つの実施形態において、Fc領域はL235A突然異変を含む。さらに別の実施形態では、Fc領域はL234AとL235Aの突然変異を含む。更なる実施の形態では、Fc領域はD265C、L234AおよびL235Aの突然変異を含む。さらに別の実施形態では、Fc領域はD265C、L234A、L235AおよびH435Aの突然変異を含む。更なる実施形態では、Fc領域はD265CとH435Aの突然変わりを含む。更なる実施の形態では、Fc領域はS239Cを構成する。
さらに別の実施形態では、Fc領域はL234AとL235Aの突然変異(ここでは「L234A.L235A」または「LA」とも呼ばれる)を含む。別の実施形態では、Fc領域は、Fc領域がP329G突然異変を含まないL234A及びL235A突然異変を含む。更なる実施の形態では、Fc領域は、D265C、L234AおよびL235Aの枝変わり(ここでは「D265C.L234A.L235A」とも呼ばれる)を構成する。別の実施形態では、Fc領域はD265C、L234AおよびL235Aの突然変異を含み、Fc領域はP329Gの突然変異を含まない。さらに別の実施形態では、Fc領域は、D265C、L234A、L235A、およびH435A変異(本明細書では、「D265C.L234A.L235A.H435A」とも呼ばれる)を含む。別の実施形態では、Fc領域はD265C、L234A、L235AおよびH435Aの突然変異を含み、Fc領域はP329G突然変異を含まない。更なる実施の形態では、Fc領域はD265CとH435Aの突然変わり(ここでは「D265C.H435A」とも呼ばれる)を含む。さらに別の実施形態では、Fc領域は、D265A、S239C、L234AおよびL235Aの枝変わり(また、ここでは、「D265A.S239C.L234A.L235A」とも呼ばれる)を構成する。
さらに別の実施形態では、Fc領域はD265A、S239C、L234AおよびL235Aの突然変異を含み、Fc領域はP329Gの突然変異を含まない。別の実施形態では、Fc領域は、D265C、N297GおよびH435Aの突然変異(本稿では「D265C.N297G.H435A」とも呼ばれる)を含む。別の実施形態では、Fc領域は、D265C、N297QおよびH435Aの突然変わり(ここでは「D265C.N297Q.H435A」とも呼ばれる)を含む。別の実施形態では、Fc領域は、E233P、L234V、L235AおよびdelG236(236の削除)(ここでは「E233P.L234V.L235A.delG236」または「EPLVLAdelG」としても参照される)からなる。別の実施形態では、Fc領域は、E233P、L234V、L235AおよびdelG236(236の削除)突然異変を含み、Fc領域はP329G突然異変を含まない。別の実施形態では、Fc領域は、E233P、L234V、L235A、delG236(236の削除)およびH435Aの突然異変(ここでは「E233P.L234V.L235A.delG236.H435A」または「EPLVLAdelG.H435A」としても参照される)からなる。別の実施形態では、Fc領域はE233P、L234V、L235A、delG236(236の削除)およびH435Aの突然変異を含み、Fc領域はP329G突然異変を含まない。別の実施形態では、Fc領域はL234A、L235A、S239CおよびD265Aの突然変異を含む。別の実施形態では、Fc領域はL234A、L235A、S239CおよびD265Aの突然変異を含み、Fc領域はP329Gの突然変異を含まない。別の実施形態では、Fc領域は、H435A、L234A、L235AおよびD265C突然異変を含む。別の実施形態では、Fc領域はH435A、L234A、L235AおよびD265C突然異変を含み、Fc領域はP329G突然異変を含まない。
いくつかの実施形態において、抗体は、未修飾Fc領域を含む同一の抗体のFc Rへの結合と比較して、Fcレセプター(Fc R)への結合の減少を伴う、インビトロエフェクター機能アッセイにおいてエフェクター機能を低下させるように、修飾されたFc領域を有する。いくつかの実施形態では、このような、非改良Fc領域を含む同一のFc領域をFcirRに結合することに関連して、Fcガンマレセプター(FcirR)への結合を減少させるとともに、in vitroエフェクター関数アッセイにおいて、上記抗菌はエフェクター機能を減少させるという、改良Fcc領域を有する。いくつかの実施形態において、FcγRは、FcγR1である。いくつかの実施形態において、FcγRは、FcγR2Aである。いくつかの実施形態において、FcγRは、FcγR2Bである。他の実施形態において、FcγRは、FcγR2Cである。いくつかの実施形態において、FcγRは、FcγR3Aである。いくつかの実施形態において、FcγRは、FcγR3Bである。他の実施形態において、結合の減少は、FcγRに対する未修飾Fc領域を含む同一抗体の結合と比較して、FcγRに対する抗体結合の少なくとも約70%の減少、少なくとも約80%の減少、少なくとも約90%の減少、少なくとも約95%の減少、少なくとも約98%の減少、少なくとも約99%の減少、または100%の減少である。他の実施形態において、結合の減少は、FcγRに対する未修飾Fc領域を含む同一抗体の結合と比較して、FcγRに対する抗体結合の少なくとも約70%～100%の減少、少なくとも約80%～100%の減少、少なくとも約90%～100%の減少、少なくとも約95%～100%の減少、または少なくとも約98%～100%の減少である。
いくつかの実施形態では、本発明は、上記修正Fc領域を含む同一のサイトキンの放出に対し、少なくとも約50%のサイトキン放出を減少させるとともに、ビトロサイトキン放出アッセイにおけるサイトキンの放出を減少させるような修正Fc領域を有する。いくつかの実施形態において、サイトカイン放出の減少は、未修飾Fc領域を含む同一抗体のサイトカイン放出と比較して、少なくとも約70%の減少、少なくとも約80%の減少、少なくとも約90%の減少、少なくとも約95%の減少、少なくとも約98%の減少、少なくとも約99%の減少、または100%のサイトカイン放出の減少である。いくつかの実施形態において、サイトカイン放出の減少は、未修飾Fc領域を含む同一抗体のサイトカイン放出と比較して、サイトカイン放出の少なくとも約70%～100%の減少、少なくとも約80%～100%の減少、少なくとも約90%～100%の減少、少なくとも約95%～100%のサイトカイン放出の減少である。特定の実施形態では、サイトカイン放出は、免疫細胞による。
いくつかの実施形態において、抗体は、未修飾Fc領域を含む同一抗体のマスト細胞脱顆粒と比較して少なくとも約50%のマスト細胞脱顆粒の減少を上記in vitroマスト細胞脱顆粒アッセイにおいてマスト細胞脱顆粒を減少させるように、修飾Fc領域を有する。幾つかの実施例において、マスト細胞の減少は、非修正Fc領域を含む同一種のマスト細胞の減少に対して、少なくとも約70%減少、少なくとも約80%減少、少なくとも約90%減少、少なくとも約95%減少、少なくとも約98%減少、少なくとも約99%減少、又はマスト細胞の減少を100%減少させる。いくつかの実施例において、マスト細胞の減少は、非修正Fc領域を含む同種のマスト細胞の減少に対して、マスト細胞の減少率が少なくとも約70%から100%減少、少なくとも約80%から100%減少、少なくとも約90%から100%減少、少なくとも約95%から100%減少する。
いくつかの実施形態において、抗体は、未修飾Fc領域を含む同一抗体のADCPと比較して少なくとも約50%のADCPの減少を伴う、インビトロ抗体依存性電池食作用アッセイにおいて抗体依存性電池食作用(ADCP)を減少または防止するように、修飾Fc領域を有する。いくつかの実施形態において、ADCPの減少は、未修飾Fc領域を含む同一抗体の抗体依存性電池食作用に対する抗体依存性電池食作用の少なくとも約70%の減少、少なくとも約80%の減少、少なくとも約90%の減少、少なくとも約95%の減少、少なくとも約98%の減少、少なくとも約99%の減少、または100%の減少である。
いくつかの実施例では、当該抗CD45、又はその抗CD117抗原結合フラグメントは、D265A、D265C / H435A、DLA / LA / H435A / L235A / H435A、D265A / L239C / L235A / L235A、D265C / N297G、D265C (EPLVLAdelG)、D265A / D265C / N297Q / N297Q、EPLVLAdelG / H435A、EPLVLAdelG / D265C、EPLVLAdelG / D265A、N297A、N297Q。いくつかの実施例では、当該抗CD45の、又は抗CD117抗原結合フラグメント、又はそれらの抗CD結合フラグメントは、ここに記載される、D265A、D265C、265C / H435A、D265C / LA、D265C / LA / H435A、D265C / N297G、D265C / N297G / H435A、D265C (IgG2*)、D265C (IgG2) / H435A、D265C / N297Q / H435A、D265C / N297Q / D265C / N295C / N297Q、EPLVLAdelG / H435A、N297A、N297改良Fc領域とFcガンマレセプターとの結合または親和性は、例えば、平衡法(例えば、ELISA; KinExA, Rathanaswami et al.)に限定されないが周知の様々な技術を用いて決定することができる。
分析生化学Vol.373:52-60, 2008; 2008年;または、ラジオイムノアッセイ(RIA)、または、表面プラズモン共鳴アッセイまたは他のキネティクスベースのアッセイのメカニズム(例えば、BIACORE.RTM.分析またはOctetTM分析(forteBIO))、および他の方法、ならびに間接結合アッセイ、競争結合アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、ゲル電気泳動法およびクロマトグラフィー(例えば、ジェルフィルトレーション)。これらおよび他の方法は、検討中の成分の一つまたはそれ以上のラベルを利用することができ、また/または、発色性、蛍光、発光、または同位体標識を含むが、それに限らない多様な検出方法を使用することができる。結合する親和性と運動学についての詳細な記述は、Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見られる。競合結合アッセイの一例は、増大する量の非標識抗原の存在下での標識抗原と目的の抗体とのインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含むラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する興味のある標本の親和性と結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によりデータから決定することができる。また、ラジオイムノアッセイを用いて、第二の抗菌剤との競合を判断することもできる。この場合、この抗原は、標識されていない第2のビーンズの増加量の存在の中で、標識化された複合物に接合された興味のあるビーンズと共にインキュベートされる。
一実施形態では、本明細書に記載されるFc修飾(例えば、D265C、L234A、L235A、および/またはH435A)を有する抗体は、Fcγレセプター体への未修飾Fc領域を含む同一の抗体の結合と比較して、Fcγレセプター体への結合において、少なくとも約70%の減少、少なくとも約75%の減少、少なくとも約80%の減少、少なくとも約85%の減少、少なくとも約90%の減少、少なくとも約95%の減少、少なくとも約98%の減少、少なくとも約99%の減少、または100%の減少を有する(例えば、生体層干渉法(BLI)によって評価される)。
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、Fcガンマ受容体とのFc領域結合相互作用は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)および補体依存性細胞傷害(CDC)を含むが、これらに限定されない、様々なエフェクター機能および下流シグナル伝達事象に必須であると考えられる。従って、特定の態様において、改良されたFc領域(例えば、L234A、L235A、および/またはD265C突然異変からなる)を含む抗菌は、エフェクター機能を実質的に減少または廃止した。効果機能は、関心応答に応じて細胞反応(例えば、マスト細胞の退化またはサイトキンの放出)を測定することによって、当該技術に知られている様々な方法を用いて評価することができる。例えば、本技術分野における標準的な方法を用いて、Fc改良抗生物質は、それらのビトロでマスト細胞退化を引き起こす能力またはサイトキン放出を引き起こす能力、例えば、ヒトの周辺血液単核細胞によって、アッセイすることができる。
従って、一実施の形態では、Fc領域は、半減期(例えば、非改良Fc領域を有するアフリカン・アフリカン・アフリカン)の減少をもたらす。短い半減期を有する抗菌剤は、短寿命の治療として機能することが期待される場合には、ある場合には有利であろう。例えば、遺伝子組み換えHSCを移植した後に、ここに記載された条件づけ工程である。理想的には、遺伝子組み換えHSCsが送達される前に、このHSCsは実質的にクリアされるだろう。このHSCsは、一般的には標的抗原(例えば、CD45又はCD117)を表現しているが、内生幹細胞とは異なり、抗CD45又は抗CD117の標的ではない。1つの実施形態において、Fc領域は、位置435(カバトによるEUインデックス)の突然異変を含む。1つの実施形態において、この突然変異はH435Aの突然変異である。
一実施の形態では、ここに記載された抗CD45又は抗CD117の半減期は、約24時間以下、約23時間以下、約22時間以下、約21時間以下、約20時間以下、約19時間以下、約18時間以下、約17時間以下、約16時間以下、約15時間以下、約14時間以下、約13時間以下、約12時間以下、約11時間以下である。
一実施の形態では、ここに記載された抗CD45又は抗CD117のバーチは、半減期(例えば、人間)が約1～5時間、約5～10時間、約10～15時間、約15～20時間、又は約20～25時間である。別の実施形態では、ここに記載される抗CD45又は抗CD117の半減期は、約5～7時間、約5～9時間、約5～11時間、約5～13時間、約5～15時間、約5～20時間、約5～24時間、約7～24時間、約9～24時間、約11～24時間、約12～22時間、約10～20時間、約8～18時間、又は約14～24時間である。
いくつかの側面では、Fc領域は、半減期を与え、また、抗菌の効果的な機能を減少させる2つ以上の突然変わりから成る。いくつかの実施形態では、Fc領域は、半減期の減少とFcirと直接接触できる少なくとも1つの残渣の突然変異をもたらすような(例えば、構造的及び結晶学的分析に基づく)突然変異を含む。1つの実施形態では、Fc領域はH435A突然異変、L234A突然異変、およびL235A突然異変を含む。1つの実施形態において、Fc領域はH435A突然異変とD265C突然異変を含む。1つの実施形態において、Fc領域は、H435A突然異変、L234A突然異変、L235A突然異変、およびD265C突然異変を含む。
いくつかの実施例では、本説明のような、その抗原結合フラグメントは、抗原結合フラグメントのFc領域内のシステイン残留物またはその抗原結合フラグメントを経由して、サイトトキシン(例、アマトキシン)に結合する。いくつかの実施例では、システイン残留物は、抗原結合フラグメントのFc領域における突然変異によって導入される。たとえば、システイン残基は、Cys118、Cys239、およびCys265からなる群から選ぶことができる。一実施の形態では、ここに記載された抗CD117抗原結合フラグメントの、または抗CD45抗原結合フラグメントのFc領域は、カバトに記載されているように、EU指数によると、アミノ酸265におけるアミノ酸置換を含んでいる。1つの実施形態において、Fc領域はD265C突然異変を含む。1つの実施形態では、Fc領域はD265CとH435Aの突然変わりを含む。1つの実施形態では、Fc領域はD265C、L234AおよびL235Aの突然変異を含む。1つの実施形態では、Fc領域はD265C、L234A、L235AおよびH435Aの突然変異を含む。一実施の形態では、抗CD117のFc領域又はその抗原結合フラグメント、又はそれらの抗CD45の断片(又は、抗CD2の断片、抗CD5の断片、抗CD5の断片、抗CD137の断片、又は抗CD252の断片)は、カバトにおけるように、EU指数によれば、アミノ酸239におけるアミノ酸置換を含む。1つの実施形態では、Fc領域はS239C突然異変を含む。1つの実施形態では、Fc領域はL234A突然異変、L235A突然異変、S239C突然異変およびD265A突然異変を含む。別の実施形態では、Fc領域はS239CとH435Aの突然変わりを含む。別の実施形態では、Fc領域はL234A突然異変、L235A突然異変、およびS239C突然異変を含む。さらに別の実施形態では、Fc領域は、H435A突然異変、L234A突然異変、L235A突然異変およびS239C突然異変を含む。さらに別の実施形態では、Fc領域は、H435A突然異変、L234A突然異変、L235A突然異変、S239C突然異変およびD265A突然異変を含む。
特に、Fcアミノ酸の位置は、特に示されていない限り、EU番号指数を参考にしている。
前記の刊行物の各々の開示は、抗CD45抗体または抗CD117抗体に関連するように、参照により本明細書に組み込まれる。上述の組成および方法と併用されることができる反体および抗原結合フラグメントには、上述の抗生物質および抗原結合フラグメント、並びに上述の非ヒト抗生物質および抗原結合フラグメントのヒト化改良版ならびに、例えば、競合的抗原結合アッセイによって評価されるように、上述のものと同じエピトープを結合する抗生物質または抗原結合フラグメントが含まれる。
本開示の抗性は、例えば、(Dall'Acqua他(2006)J Biol Chem 281: 23514-24)、(Zalevsky他(2010) Nat Biotechol 28: 157-9)、(Hinton他(2004)J Biol Chem 279: 6213-6)、(Shields他(2001)J Biol Chem 276: 6591-604)、(Petkova他(2006) Int Immunol 18: 1759-69)、(Darug Metab Dispos 35: 86-94)、(Vaccaro他(2005) Nat Biotechnol 23: 1283-8)、(Yeung他(2010年Cancer Res 70: 3269-77 と (Kim et al. (1999) Eur J Immunol 29: 2819-25) ポジションには、250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434、435が含まれます。特異的に、または組み合わせて行われ得る例示的な変異は、T250Q、M252Y、1253A、S254T、T256E、P2571、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435AおよびH435R変異である。
本分野におけるFc改良のいずれかを含める工学的アボディーの手法は周知である。これらの方法には、部位特異的(またはオリゴヌクレオチド媒介)突然変異誘発による調製、PCR突然変異誘発、および抗体または抗体の少なくとも定常領域をコードする調製されたDNA分子のカセット突然変異誘発が含まれるが、これらに限定されない。部位指向型ミュージエージェントは、この当業者でよく知られている(例えば、Carterら、Nucleic Acids Res、13:4431-4443(1985)およびKunkelら、Procを参照)。Natl.アカド。科学アメリカ, 82:488 (1987)).PCRのミューテージエージェントは、開始ポリペプチドのアミノ酸配列変形例を作るのにも適している。PCR Protocols, pp. 177-183(Academic Press, 1990)、およびVallette et al., Nucを参照。酸性研究所17:723-733 (1989).配列変形例であるカセットミューテージエージェントを準備する別の方法は、Wellsら、Gene, 34:315-323 (1985) によって記載された技術に基づいている。
g. 他の抗原結合タンパク質
特定の実施例では、リガンド又はそれの機能的に活性化した断片のような抗原結合たんぱく質(上記を標的とする抗原)が、ここに記載されている共役又は融合タンパク質において使用される。たとえば、幹細胞因子(SCF)はCD117のリガンドであり、ここで開示された調整手法を達成するために、SCFを活用または毒素に融合することができる。
特定の実施形態では、抗体模倣物は、本明細書に開示される組成物および方法において抗原ターゲティング部分として使用される。たとえば、アトネクチン、アフィボディ、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチアリン、アプタマー、アルマジロリピートプロテインベースのスカフォールド、アトリマー、アトリマー、鳥マー、DARpin、ファイノマー、ノッティン、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ナノフィチンなどがあるが、これらに限定されない。
細胞毒素
ここに記載されているアンチボディおよび抗原結合フラグメントは、リンカーを介してサイトトキシンと結合(結合)することができる。いくつかの実施形態において、細胞傷害性分子は、抗体またはその断片の細胞取り込みに続いて、細胞毒素がその細胞内標的にアクセスし、造血細胞死を媒介することができるように、本明細書に開示されるような細胞内移行抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートされる。たとえば、1、2、3、4、5、6、7、または8のいずれの細胞毒素でも、防CD117または防CD45といったように、この防毒素を接合することができる。
幾つかの実施例において、ここに記載されるADCは、サイトトキシック(またはサイトトキシン)に結合した(すなわち、リンカーと同価に結合した)抗原結合フラグメントを含んでいる。様々な実施形態において、細胞毒性部分は、共役中で結合された場合、減少したまたは全く細胞毒性を示さないが、リンカーからの切断後に細胞毒性を再開する。種々の態様において、細胞毒性部分は、リンカーからの切断なしに細胞毒性を維持する。幾つかの実施例において、サイトトキシクル分子は、本明細書に開示されているように、細胞を内部化する抗原結合フラグメントに接合され、このようにして、細胞内集積、又はその断片に続いて、細胞毒素は細胞内ターゲットにアクセスし、例えば、T細胞死を媒介することができる。
ここに記載されているアンチボディおよびそれらの抗原結合フラグメント(例えば、CD117またはCD45を認識および結合する抗原結合フラグメント)は、細胞毒素と結合する(または結合する)ことができる。
したがって、本開示のADCは、抗体またはその抗原結合フラグメント(Ab)が、化学部分(Z)を介してリンカー(L)に結合(共有結合)され、細胞傷害性部分(「薬物」、D)に結合している、一般式Ab-(Z-L-D)nであり得、「n」は、抗体に結合している薬物の数を表し、一般に1～8の範囲である。
従って、ここに記載されている、抗原結合フラグメントは、例えば約1から約20の範囲の、1個当たりの細胞毒素の平均数を表す整合nによって示されるように、多くの薬物モイートと結合することができる。いくつかの実施形態において、nは1から4である。いくつかの実施形態において、nは1である。いくつかの実施形態において、nは2である。いくつかの実施形態において、nは3である。いくつかの実施形態において、nは4である。共役反応からのADCの調製における、1個当たりの薬物モイティーの平均数は、質量分析、ELISAアッセイ、およびHPLCのような従来の方法によって特徴づけられる。nでのADCの定量的分布も決定できる。場合によっては、nが他の薬物ロードを有するADCからある一定の価値である場合には、逆相HPLCまたは電気泳動によって分離、精製および均質ADCの特性化を達成することができる。
ここに記載した、一部のCD117 ADCsまたは防CD45 ADCsについては、一人あたりの細胞毒素の平均数は、当該の付着部位の数によって制限される可能性がある。例えば、接着剤がシステインチオールである場合、1つか複数のシステインチオールグループを持つことができるか、またはリンカーと化学的な部分が付着することができる十分に反応するチオール基つか数つしか持たないことがある。一般的に、抗生物質には、薬物母性と結びついている可能性のある、多くの自由で反応性のあるシステインチオール基が含まれていない;主に、システインチオール残渣は、ジスルフィドブリッジ部として存在する。ある種の実施形態では、部分的又は全面的な減少条件下で、ジチオスレイトール(DTT)又はトリカルボンチルフォスフィン(TCEP)のような減少剤により、反応性システインチオールグループを生成するために、抗菌を減少させることができる。
ある種の実施形態では、共役反応の間に、薬物モイテイの理論的な最大値よりも少ない数が、抗菌に接合される。たとえば、以下で論じるように、抗菌剤は、薬物-リンカー中間体またはリンカー試薬と反応しないリジン残渣を含むことができる。最も反応性のリジン基のみが、アミン反応性リンカー試薬と反応し得る。ある種の実施形態では、リジンまたはシステインのような反応性の核好性グループを明らかにするために、抗菌は劣化状態にさらされる。
ADCの負荷(ドラッグ/ビーチ比)は、例えば、(i)抗たんぱく質リンカー中間体又はリンカー試薬のモル余剰を、たとえば、(ii)共役反応時間または温度を制限すること、(iii)システインチオール修飾の部分的または制限的な条件、(iv)再結合技術により、システイン残留物の数と位置を、リンカー薬物接合の数および/または位置を制御するために変えるような、その抗たんのアミノ酸配列を工学的に調整することによって、異なる方法で制御することができる。
ここに記載されるADCにおいて使用される細胞毒素には、DNA-インターカレート剤(例えば、アントラサイクリン)、ミトティックスピンドル装置(例えば、ビンカアルカロイド、メイタンシン、メイタンシノイドおよびそれらの派生物)を破壊することが可能な剤、および、DNAポリメラーゼ阻害剤(例えば、アマトキシン、α-アマニチンなどのアマトキシン、およびそれらの派生物)、並びにタンパク質生合成を破壊することが可能な剤(例えば、サポリンおよびリシンA鎖のようなrR-N-グリコシダーゼ活性を示す剤)が含まれ、他にも知られている。
本明細書に記載される組成物および方法での使用に適したサイトキシンは、限定されるものではないが、5-エチニルウラシル、アビラテロン、アドゼレシン、アルデスレタミン、アムスチン、アミドックス、アミフォスチン、アムサクリン、アナストロゾール、アンドログラホリド、血管新生阻害剤、アンタレリクス、抗背側形成タンパク質-1、抗アンドロゲン、前立腺癌、アンチネオプラストン、アンチネオプラストン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アフィジコリングリシネート、アポトーシス調節剤、アプリン酸、アスウラクリン、アタメスタン、アキシナスタチン1、アキシナスタチン2、アザセトロン、アザチロシン、バカチンIII誘導体を含む バラノール、BCR/ABL拮抗薬、ベンゾクロリン、βラクタム誘導体、ベタクラミンB、ベツリン酸、ビカルタミド、ビサントレミン、ビスナフィド、ビゼレシンA、ブレオマイシンA2、ブレオマイシンB2、ブロピリミン、ブチオニンスルホキシミン、カルシポトリオール、カルホスチンC、カンプトテシン誘導体(例えば、10-ヒドロキシ-カンプトテシン)、カペシタビン、カルボキサミド-アミノ-トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール, カルゼレシン、セクロピン、カセインキナーゼ阻害剤、クロロリクス、シカプロリン、シスポルフィリン、クラドリビンA、クロトリマゾールおよびその類似体、コムブレタスタチンA4、コナゲニン、クランベシジン816、クリプトフィシンA誘導体、クリプトフィシンA、シクロペンタントラキノン、シペマイシン、シタラビンオクスファート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒドロジデムニンB、2'デオキシコホルマイシン(DCF)、デスロレリン、デクスファミド、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、ジアジコン ジデムニンB、ジヒドロノルスペルミン、ジヒドロキサシチジン、ジヒドロキサシチジン、ドロキソサノール、ドロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンSA、エブセレン、エコムスチン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフル、エピチロン、エプリステリド、エトポシド、エトポシド4'-リン酸(エトポフオスともいう)、エキセメスタン、ファザラビン、フェンレチニド、フィラステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルダラビン、フルオロダウノルニシン、フォルフェニメクス, フォルメスタン、ホテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、ガロシタビン、ガロシタビン、ゲムシタビン、グルタチオン阻害薬、ヘプタン、ヒペリシン、イバンドロニン酸、イロマンソン酸、イリモスタット、イミダゾクリドン、免疫刺激ペプチド、イオベングアノ、イリノテカン、イリノグラジン、イソベンガゾール、ジャスファリドF、ラメラリン-Nトリアセテート、レナマイシン、レノグラスチム、レプトルスタチン、レトロゾール、脂溶性白金化合物、リスソクリンアミド7、ロバプラチン、ロメトレキソール ロニダミン、ロキサントロン、ロキソリビン、ロキソトリビン、マソプロテイナーゼ阻害剤、マソプロテイナーゼ、メロガリン、メテロシナーゼ、メチオニナーゼ、MIF阻害剤、イフェプリストン、ミルテホシン、ミリモスチム、ミトガゾン、ミトラクトール、ミトキサントロン、モファロテン、ミリアポロンB、N-アセチルジナリン、ナフェルスティプ、ナフテルピン、ナルグラスチム、ネモルビシン、ニルタミド、ニトルリン、オクエノン、 オナプリストン、オキサリプラチン、オキサロマイシン、パルミトキシン、パミドロン酸、パルミトリオール、パゼリン、ペグアスパラガーゼ、パゼリプチン、ポリ硫酸ナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルフルブロン、フェナジノマイシン、ピシバニール、ピラルビシン、ポドフィロトキシン、ポルフィロマイシン、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、ラルチトレキセド、リゾキシン、ロヒツカイン、ルビギノンB1、ルフィン、サルコフィトールA、サルガモスチム、ソブゾキサン、スパルフォシンD、スピロムスチン ピスチアミド、スルフィノシン、テモゾロミド、テニポシド、タリブラスチン、チオコラザミン、トポテカン、トプセンチン、トリシリビン、トリメトレキサート、ビノレルビン、ビンキサルチン、ボロゾール、ゼニプラチン、およびジラスコルブ。
いくつかの実施形態において、細胞毒素は、微小管結合剤(例えば、メイタンシンまたはメイタンシノイド)、アマトキシン、シュードモナス外毒素A、デボウガニン、ジフテリア毒素、サポリン、オーリスタチン、アントラサイクリン、カリケアマイシン、イリノテカン、SN-38、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、インドリノベンゾジアゼピン二量体、インドリノベンゾジアゼピン二量体、インドリノベンゾジアゼピン偽二量体、またはその変種、または当技術分野で本明細書に記載もしくは公知の別の細胞毒性化合物である。
いくつかの実施形態において、細胞毒素は、DM1及びDM4からなる群から選抜されたメイタンシノイドである。いくつかの態様において、細胞毒素は、モノメチルアウリスタチンEおよびモノメチルアウリスタチンFからなる群から選択されるオーリスタチンである。
いくつかの実施形態において、細胞毒素は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、およびイダルビシンからなる群より選択されるアントラサイクリンである。
幾つかの実施例において、抗たん薬活用物の細胞毒素は、リボンポリメラーゼ阻害剤である。いくつかの態様において、RNAポリメラーゼ阻害剤は、アマトキシンまたはその誘導体である。アマトキシンは、RNAポリメラーゼIIの強力かつ選択的な阻害剤であり、それによって、影響を受けた細胞の転写およびタンパク質生合成も阻害する。ここで用いられるように、「アマトキシン」という用語は、Amanita phalloides mushroomsによって生成されるペプチドのアマトキシンファミリーの部材、またはそれらの派生物、すなわち、RNポリメラーゼII活性を抑制することができるその派生物または派生物を指す。アマトキシンは、基本配列Ile-Trp-Gly-Ile-Gly-Cys-Asn (またはAsp)-Pro (SEQ ID NO: 325)を持つ硬い位置タペプティドで、Cys硫黄とTrp indole環の2番目の間の結合により交差し、トリプタチオニンを形成する。
いくつかの実施例では、抗原断片、又は他の抗原結合剤、例えば、幹細胞因子のようなリガンドが付着するサイトトキシンは、タンパク質ベースの毒素である。タンパク質ベースの毒素の実施例は、志賀毒素である。したがって、いくつかの実施例において、たとえば滋賀のような毒素Aサブユニット、およびその断片、ならびに他の派生物である滋賀の毒素、あるいはその断片、あるいは派生物、たとえば、抗原結合剤、たとえば、幹細胞因子のようなリガンドが付着するサイトトキシンである。いくつかの実施形態において、アニトボディ、抗原結合剤または他の抗原結合剤が結合される細胞毒素は、SLT I、SLT II、SLT IIV、LT毒素またはC3毒素のような滋賀のような毒素である。
特定の実施形態において、細胞毒素は、たんぱく質ベースの毒素と抗原結合性たんぱく質からなる融合たんぱく質の一部である。例えば、特定の実施形態における融合タンパク質は、scFvなどの抗体フラグメントと、タンパク質ベースの毒素、例えば、タンパク質合成阻害剤、例えば、リボソーム不活性化タンパク質、例えば、志賀毒素、志賀様毒素Aサブユニット、サポリン、リシン、および上記の突然変異体、フラグメント、および誘導体などを含む、操作された毒素本体である。
メイタンシノイド
幾つかの実施例において、ここに記載されている抗毒物及び抗原結合フラグメントは、微小管結合剤である細胞毒素と結合することができる。いくつかの態様において、微小管結合剤は、メイタンシン、メイタンシノイドまたはメイタンシノイドアナログである。メイタンシノイドは、微小管と結合し、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、東アフリカの低木Maytenus serrata(米国特許番号3,896,111)から最初に分離された。その後、ある種の微生物はメイタンシノールやC-3メイタンシノールエステル(米国特許第4,151,042号)のようなメイタンシノールをも生成することが発見された。合成メイタンシノール及びその誘導体並びにそれらの類似物は、例えば米国特許に開示される。No.4,137,230; 4,248,870; 4,248,870; 4,248,746; 4,260,608; 4,265,14,294,57; 4,307,57; 4,307,16; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428,428,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,4メイタンシノイド医薬品モイティーは、(i)発酵または化学修飾によって調製することが比較的容易である、(ii)非ジスルフィドリンカーを介して抗物質に接合するのに適した官能基をもって導出されることが可能である、(iii)プラズマ中で安定である、(iv)種々のがん細胞系に対して有効である、という理由から、抗薬物活用における麻薬モイティーが魅力的である。
適当なメイタンシノイドの実施例には、メイタンシノールのエステル、合成メイタンシノール、及びメイタンシノールアナログ及び誘導体が含まれる。ここに含まれる細胞毒素は、メイタンシノイド、メイタンシノール、メイタンシノール類似物、およびメイタンシノール類似物、および派生物のように、微小管形成を抑制し、哺乳類細胞に極めて有毒である。
適当なメイタンジノールエステルの実施例には、改良された芳香性のリングを有するもの及び他の位置で改変を有するものが含まれる。このような適当なメイタンシノイドは、米国特許に開示される。No.4,137,230; 4,151,042; 4,151,042; 4,266,67; 4,266,408,57; 4,308,268; 4,309,4,313,94,29; 4,317,821; 4,322,348,064; 5,4,4,363; 5,416,064; 5,485,492; 5,846,410; 7,276,497および7,473,796であり、これらはメイタンシノイドおよびそれらの派生物に関するものである。
幾つかの実施例では、本開示の抗薬物結合体(ADCs)は、細胞傷害性剤としてチオールを含むメイタンシノイド(DM1)を使用している。これは、正式に「N2'-deacetyl-N2'-(3-mercapto-1-oxopropyl)-maytansine」と呼ばれている。DM1は構造式(IV)で表される。
[化１０]
別の実施例では、本開示の活用者は、チオールを含むメイタンシノイドN2'-deacetyl-N2'(4-mel-4-mercapto-1-oxopentyl)-メイタンジン(例、DM4)を細胞傷害性剤として利用する。DM4は構造式(V)で表される。
[化１１]
立体的に邪魔されたチオール結合を含む側鎖からなるもう一つのメイタンシノイドは、N2'-deacetyl-N-2'(4-mercapto-1-oxopentyl)-maytansine(DM3と呼ばれる)であり、構造式(VI)で表される。
[化１２]
メイタンシノイドの各々は、米国特許で教えられた。No.5,208,020 また、7,276,497は、本開示の活用においても使用できる。これに関連して、5,208,020及び7,276,697のすべての開示がここに参考文献として組み込まれている。
メイタンシノイド上の多くの位置は、結合部を化学的に結びつける位置として役立つことができる。例えば、水酸塩基を有するC-3の位置、水酸エチルで改良されたC-14の位置、水酸塩で改良されたC-15の位置、水酸基を有するC-20の位置は、いずれも有用であると期待される。いくつかの実施形態では、C-3の位置は、連結部を化学的に結ぶ位置であり、いくつかの特定の実施例では、メイタンジノールのC-3の位置は、結合部を化学的に結ぶ位置である。当該技術分野では、例えば米国特許で開示されたものを含む、Adbid-maytansinoid結合体を作ることで知られている多くの結合したグループが存在する。No.5,208,020, 6,441,163, 6,441,163, and EP Patent No. 0425235 B1, Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992), and U.S. 2005/0169933 A1、これらの開示はここに引用により明確に組み込まれている。追加の結合基をここに説明し、例示した。
本開示はまた、様々な異性体およびメイタンシノイドと共役体の混合物を含んでいる。本開示の幾つかの化合物及び共役は、種々の立体異性体、エナンチオメリック及びジアステレオメリックの形成で存在することができる。このようなメイタンシノイド共役を作るためのいくつかの記述が米国特許に提供されている。No.5,208,020, 5,416,064 5,416,064、6,333,410、6,441,163、6,716,821、および7,368,565は、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる。
抗体分子当たりに結合したメイタンシノイド分子の治療的に有効な数は、252nmおよび280nmにおける吸光度の比を分光光度法で測定することによって決定することができる。特定の実施形態において、抗体分子当たりコンジュゲートされた平均3～4個のメイタンシノイド分子は、抗体の機能または溶解性に負の影響を与えることなく標的細胞の細胞毒性を増強し得るが、毒素/抗体の1分子は、抗体単独よりも細胞毒性を増強し得る。メイタンシノイド分子/抗原結合フラグメントの平均数は、例えば、1-10または2-5であることができる。
アントラサイクリン
他の実施形態では、ここに記載されている抗物質及び抗原結合フラグメントは、アントラサイクリン分子である細胞毒素に結合することができる。アントラサイクリンは、細胞毒活性を示す抗生物質化合物です。研究は、アントラサイクリンが、以下を含む多くの異なるメカニズムによって電池を殺すように作動する可能性があることを示している:1)電池のDNAへの薬物分子のインターカレーション、それによってDNA依存性核酸合成を阻害する;2)次いで電池への損傷を引き起こすフリーラジカルの薬物による製造、または3)薬物分子と電池膜との相互作用[例えば、C. Petersonら、Anthracycline In Experimental Systems and Human Leukemia」のAnthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R. Bachur、"Free Radical Damage" id. at pp.97-102.細胞毒性の可能性があるため、アントラサイクリン系薬物は、白血病、乳癌、肺癌、卵巣腺癌および肉腫などの多数の癌の治療に使用されている[例えば、アントラサイクリンのP.HWiernik、現在の状態と新たな展開p 11参照]。一般的に使用されるアントラサイクリンには、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびダウノマイシンがある。
いくつかの実施形態において、細胞毒素は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、およびイダルビシンからなる群より選択されるアントラサイクリンである。アントラサイクリンの代表的な例としては、ダウノルビシン(セルビジン;ベッドフォード研究所)、ドキソルビシン(アドリアマイシン;ベッドフォード研究所;ドキソルビシン塩化水素塩化物、水酸-ダウノルビシンおよびルベックスとも呼ばれる)、エピルビシン(エレンス;ファイザー)、イダルビシン(イダマイシン;ファイザー)があるが、これらに限らない。
アントラサイクリンアナログ、ドキソルビシン(ADRIAMYCINO)は、転写のためにDNAを巻き戻す酵素トポイソメラーゼIIのインターカレーションおよび進行の抑制によりDNAと相互作用すると考えられている。ドキソルビシンは、複製のためのDNA鎖を切断した後、トポイソメラーゼII錯体を安定化し、DNA二重らせんが再結合するのを妨げ、それによって複製過程を停止させる。ドキソルビシンおよびダウノルビシン(DAUNOMYCIN)は、プロトタイプの細胞傷害性天然物アントラサイクリン化学療法薬(Sessaら、(2007) Cardiovasc)である。トキシコール。7:75-79).
本書で使用する適当なアントラサイクリンの制限のない例は、PNU-159682("PNU")である。PNUは親nemorubicinと比較して3000倍以上の細胞毒を示す(Quintieri et al., Clinical Cancer Research 2005, 11, 1608-1617)。PNUは構造式で表される。
[化１３]
PNUのようなアントラサイクリン上の複数の位置は、結合分子を共有結合する位置として役立つことができ、それゆえ、本書に記載されているそれらの抗生物質及び抗原結合フラグメントである。例えば、リンカーは、水酸エチルケトン側鎖に変形を通して導入することができる。
いくつかの実施形態において、細胞毒素は構造式によって表されるPNU誘導体である。
[化１４]
ウェーブラインとは、以下に述べるように、ADCのリンカーへの等価な付着点を示す。
いくつかの実施形態において、細胞毒素は構造式によって表されるPNU誘導体である。
[化１５]
ウェーブラインとは、以下に述べるように、ADCのリンカーへの等価な付着点を示す。
ピロロベンゾジアゼピン(PBD)
他の実施形態では、ここに記載されたこれらの抗毒物及び抗原結合フラグメントは、ピロロロンボンゾディアゼピン(PBD)又はPBDを含む細胞毒素に結合することができる。PBDsは配列選択的DNAアルキル化化合物であることが知られている。PBD細胞毒素は、アントラマイシン、ジメリックPBDおよび、例えばHartley, J.A. (2011)に開示されるものを含むが、これらに限定されない。「抗腫瘍剤としてのピロロベンゾジアゼピンの開発」専門家Opin。Inv.Drug, 20(6), 733-744; and Antonow, D., E. (2011) "DNA対話型ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン(PBDs)." Chem. Rev. 111: 2815-2864.
いくつかの実施形態において、細胞毒素は、以下の公式に表されるピロロロンボゾジアゼピンダイマーであることができる。
[化１６]
ウェーブラインはリンカーの付着点を示す。
[化１７]
幾つかの実施形態において、細胞毒素は、マレイミドカプロイルリンカーを経由して、抗原結合フラグメント、すなわちそれに対する接合体である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチド、オリゴ糖OBC=O)(CH2 CH2O)t -, -(NHCH2 CH2)u -, -PAB、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、またはAla-PABのうちの1つ以上を含み、p、q、r、t、およびuのそれぞれは、発生ごとに独立して選択される1～12の整数である。
いくつかの実施形態において、リンカーは公式の構造を持つ。
[化１８]
ここで、R1 はCH3 (Ala) または(CH2)3NH(CO)NH2 (Cit) である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、抗菌への接合前に、L-Z'として一緒に取られた反応性代用Z'を含む、構造を有する。
[化１９]
ウェーブラインは細胞毒素(例えばPBD)への付着点を示す。特定の実施形態では、R1はCH3である。
いくつかの実施形態において、細胞毒素リンカー活用物は、接合前に、反応性代替物Z'を含む、Cy-L-Z'としてまとめられた、公式の構造を有する。
[化２０]
この特定の細胞毒素リンク剤はテシリン(SG3249)として知られており、例えば、Howardら、ACS Medに記載されている。Chem. Lett.2016, 7(11), 7(11)、983-987、その開示は、ここにその全体として参考文献に含まれる。
いくつかの実施形態において、細胞毒素は、式に代表されるピロロロンボゾジアゼピンダイマーであることができる。
[化２１]
ウェーブラインはリンカーの付着点を示す。
いくつかの実施形態において、細胞毒素リンカー活用物は、接合前に、反応性代替物Z'を含む、Cy-L-Z'としてまとめられた、公式の構造を有する。
[化２２]
この特定の細胞毒素リンク剤はタリリンとして知られ、例えば、ADCバダスツキシマブタリリン(SGN-CD33A)、Mantaj他、Angewandte Chemie International Edition English 2017,56,462-488に関連して記述されている。この開示は、本文中でその全体に含まれている。
いくつかの実施形態において、細胞毒素は、公式の構造を有するインドリノベンゾジアゼピンの擬似物であることがある。
[化２３]
ウェーブラインはリンカーの付着点を示す。
いくつかの実施形態において、細胞毒素リンカー活用物は、接合前に、反応性代替物Z'を含む、Cy-L-Z'としてまとめられた、公式の構造を有する。
[化２４]
これは、例えば、参考文献に含まれる国際特許出願No. WO2017004026に開示されているADC IMGN632を構成する。
カリケアマイシン
他の実施例では、ここに記載されているこれらの抗生物質及び抗原結合フラグメントは、エネジイン抗がん抗生物質であるサイトトキシン(例えば、カリケアミシン、オゾガミシン)に結合することができる。抗生物質のカリケミシンファミリーは、ピコモラル以下の濃度で、二鎖DNAされたDNAの破れを作ることができる。カリケミシンファミリーの活用の準備については、米国特許を参照のこと。No.5,712,374; 5,714,586; 5,714,586; 5,739,116; 5,767,285; 5,770,701; 5,770,710; 5,773,001; 5,877,296 (すべて米国シアナミド会社)。使用されうるカリケミカルの構造的類似物は、例えば、Hinmanら、Cancer Research 53:3336-3342(1993)、Lodeら、Cancer Research 58:2925-2928(1998)、および前述の米国シアナミド特許を含むが、これに限定されない。
ここでは単にガンマとして参照され、構造式を有する、例示的な1は、ガンマとして指定されるカリケアマイシンである。
[化２５]
幾つかの実施例において、カリケアミシンは、ガンマ‐カリケアミシン派生体またはN‐アセチルガムマ‐カリケアミシン派生体であることができる。使用されうるカリケミカルの構造的類似物は、例えば、Hinmanら、Cancer Research 53:3336-3342(1993)、Lodeら、Cancer Research 58:2925-2928(1998)、および前述の米国特許を含んでいるが、これに限定されない。カリケアミシンは、ジスルフィドを形成するために適当なチオールと反応することができる三硫化塩基を含み、同時に、リンカーを経由して、本項に記載されているような反CD117の抗原結合フラグメントにカリケアミシン誘導体を付着させるのに有用な官能基を導入する。カリケミシンファミリーの活用の準備については、米国特許を参照のこと。No.5,712,374; 5,714,586; 5,714,586; 5,739,116; 5,767,285; 5,770,701; 5,770,710; 5,773,001; 5,877,296 (すべて米国シアナミド会社)。使用されうるカリケミカルの構造的類似物は、例えば、Hinmanら、Cancer Research 53:3336-3342(1993)、Lodeら、Cancer Research 58:2925-2928(1998)、および前述の米国シアナミド特許を含むが、これに限定されない。
一実施形態では、本明細書で開示されるようなADCの細胞毒素は、式で表されるカリケアマイシンジスルフィド誘導体であってもよい。
[化２６]
ウェーブラインはリンカーの付着点を示す。
リボソーム不活性化タンパク質(RIP)
幾つかの実施例において、本項に記載されている、抗生物質及び抗原結合フラグメントに接合した細胞毒素は、リボソーム不活性化プロテイン(RIP)である。リボソーム不活性化タンパク質はタンパク質合成インヒビターであり、通常は不可逆的にリボソームに作用する。RIPはバクテリアだけでなく植物にも見られる。RIPの実施例としては、サポリン、リシン、アブリン、ゲロニン、シュードモナス外毒素(または外毒素A)、トリコサンチン、ルフィン、凝集素およびジフテリア毒素が挙げられるが、これらに限定されない。
ここに開示されるADCおよび方法で使用され得るRIPの別の実施例は、滋賀毒素(Stx)または滋賀のような毒素(SLT)である。志賀毒素(Stx)は、Shigella dysenteriae 1および一部の血清群(血清型O157:H7、O104:H4を含む)のEscherichia coli (大腸菌ではStx1と呼ばれる)にみられる細菌毒素である。Stx1に加えて、一部の大腸菌株はStx/Stx1と同じ作用様式をもつが抗原的に異なる第2の型のStx (Stx2)を産生する。この毒素は志賀清志にちなんで命名されている。志賀清志は、赤痢菌による赤痢の細菌起源を最初に記述した。SLTはEscherichia coliが産生する毒素の類似または同一の歴史的用語である。各毒素のサブタイプが同定されているため、現在では各グループの原型毒素をStx1aまたはStx2aと命名している。Stx1aおよびStx2aは、様々な細胞型に対する細胞毒性の差を示し、受容体類似体または模倣体に異なって結合し、異なるケモカイン応答を誘導し、いくつかの特徴的な構造特性を有する。
滋賀毒素の一員は、構造的および機能的に関連する自然起源のタンパク質毒素の家庭の一員であり、特にS. dysenteriaeおよびE. coliから分離された毒素を指す(Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)))。例えば、志賀毒素は、S. dysenteriae血清型1から単離された真の志賀毒素(Stx)、腸管出血性E. coliの血清型から単離された志賀毒素1変異体(SLT1またはStx1またはSLT-1またはSlt-I)、および腸管出血性E. coliの血清型から単離された志賀毒素2変異体(SLT2またはStx2またはSLT-2)を包含する。SLT1 はStx とは1 つの残渣だけで異なり、どちらもVerotoxins またはVerotoxins (VTs) (O'Brien A et al., Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)) と呼ばれています。SLT1とSLT2変形例は、アミノ酸配列レベルではお互いにほぼ53-60%しか似ていないが、それらは滋賀毒素家庭のメンバーと共通している(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)))。
志賀毒素のメンバーは、AサブユニットとBサブユニットの2つのサブユニットをもつ。毒素のBサブユニットは、糖脂質グロボトリアオシルセラミド(Gb3)として知られる細胞膜の成分に結合する。サブユニットBがGb3に結合すると、狭い管状の膜陥入が誘導され、バクテリアが細胞内に取り込まれるために内向きの膜細管が形成される。志賀毒素(非細孔形成毒素)は、ゴルジ網および小胞体を介して細胞質ゾルに移行する。ゴルジ体毒素から小胞体に輸送される。滋賀毒素は、リコソーム(Sandvig and van Deurs)(2000) EMBO J 19(220:5943)と同様のメカニズムにより、標的細胞内のタンパク質合成を抑制する働きをする。細胞に入った後、毒素のAサブユニットはリボソームの60Sサブユニットの28S Ranから特定のアデニンヌクレオジン塩基を分裂させ、それによってタンパク質合成を停止させる(Donohue-Rolfe et al. (2010)感染症13供給のレビュー)。4(7): S293-297).
本項で使用する滋賀毒素とは、自然発生性たんぱく質毒素(例、S. dysenteriaeおよびE. coliから分離された毒素)の滋賀毒素の一員のうち、構造的および機能的に関連するものをいう。例えば、志賀毒素は、S. dysenteriae血清型1から単離された真の志賀毒素(Stx)、腸管出血性E. coliの血清型から単離された志賀毒素1変異体(SLT1またはStx1またはSLT-1またはSlt-I)、および腸管出血性E. coliの血清型から単離された志賀毒素2変異体(SLT2またはStx2またはSLT-2)を包含する。本項でいう「滋賀毒素A」又は「滋賀毒素A」とは、滋賀毒素又は滋賀毒素を含む滋賀家のいずれかの構成員の構成サブユニットAをいう。
一実施の形態において、ADCは、本書に記載されている、滋賀毒素サブユニットA、或いはサイトトキシック活動、すなわちリボソーム抑制活動を有する滋賀毒素サブユニットAの一部と結合した、抗原結合フラグメントのいずれかを含む。滋賀毒素サブユニットAのサイトトキシック活性には、例えば、リボソーム不活化、たんぱく質合成抑制、N-グリコシダーゼ活性、ポリヌクレオチド:アデノシングリコシダーゼ活性、RNAase活性、およびDNAase活性が含まれる。志賀毒素エフェクター活性のアッセイの非限定的例は、タンパク質合成阻害活性、脱プリン活性、細胞増殖の阻害、細胞毒性、超らせんDNA緩和活性、およびヌクレアーゼ活性を測定する。
特定の実施例では、本項に記載されている抗毒物及び抗原結合フラグメントは、リボソーム抑制活性を有する志賀毒素Aサブユニット又はその断片と結合する。志賀毒素サブユニットAの実施例は、志賀毒素1サブユニットA (SLT-1A)であり、そのアミノ酸配列を以下に示す。
(SEQ ID NO: 290)。
志賀毒素サブユニットAのもう一つの実施例は、志賀毒素サブユニットA (StxA)であり、そのアミノ酸配列を以下に示す
(SEQ ID NO: 291)。
志賀毒素サブユニットAの別の実施例は、志賀毒素2サブユニットA (SLT-2A)であり、そのアミノ酸配列を以下に示す
(SEQ ID NO: 292)。
ある状況下では、自然に発生する滋賀毒素サブユニットAは、それらのアミノ端子における約22のアミノ酸のシグナル配列を含む前駆体または形態を含んでおり、それらは、成熟した滋賀毒素Aサブユニットを作るために除去され、熟練した作業者に認識されることができる。滋賀毒素サブユニットAのサイトトキシック・フラグメントまたは切り詰めたものもまた、ここに開示されるADCおよび方法において使用され得る。
特定の実施形態では、志賀毒素サブユニットAは、天然に存在する志賀毒素Aサブユニットとは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40個以上のアミノ酸残基(ただし、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を保持するもの以下)まで異なる。いくつかの実施形態において、志賀毒素サブユニットAは、天然に存在する志賀毒素Aサブユニットとは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40個以上のアミノ酸残基(ただし、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を保持するもの以下)まで異なる。したがって、滋賀毒素家庭の部材Aから得られるポリペプチド領域は、自然に発生する滋賀家庭毒素部材ユニットAに少なくとも約85%、少なくとも約90%、約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性が維持されている限り、元の配列からの添加、削除、切り詰めまたはその他の変更を含むことができる。
したがって、特定の実施形態では、志賀家庭毒素サブユニットAは、SLT-1A(配列番号290)、StxA (配列番号291)、および/またはSLT-2A(配列番号292)などの天然に存在する志賀家庭毒素サブユニットAと少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、少なくとも約99.5%、少なくとも約99.6%、少なくとも約99.7%、少なくとも約99.8%、少なくとも約99.9%以上の全配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または本質的にからなる。
細胞毒素として好適なShiga毒素およびRIPは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているUS20180057544に開示されている。
オーリスト教徒
本明細書中に記載される抗体およびその抗原結合フラグメントは、オーリスタチンである細胞毒素に結合され得る(米国特許第5,635,483号;第5,780,588号)。オーリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解、および核と細胞分裂を妨害する抗有糸分裂剤である(Woykeら(2001) Antimicrob)。剤とChemother。45(12):3580-3584) 抗癌剤(米国特許第5,663,149号)および抗真菌活性(Pettit et al (1998) Antimicrob)を有する。剤・チェマ。42:2961-2965).(米国特許番号5,635,483; 5,780,588)。アウリスタチンの薬物基質は、ペプティックドラッグモイアのN(アミノ)ターミナルまたはC(カルボキシル)ターミナル(WO 02/088172)を通して、抗菌に付着することができる。
例証的なアウリスタチンの実施形態としては、Nターミス結合モノミロリスタチンドラッグモアティーズDEおよびDFが含まれる。これは、Senterら、米国がん研究協会会会の会報、第45巻、要約数623、2004年3月28日に提出され、その開示は、その全体として明示的に参考文献に組み込まれている。
例示的なオーリスタチン実施形態は、MMAEである。
[化２７]
ここでいう「波線」とは、リンカー結合体(-L-Z-Ab、以下のように)のリンカーへの等価な付着点を示す。
もう一つの典型的なレストランの実施形態はMMAFである。
[化２８]
ここで、ウェーブラインとは、US 2005/0238649に開示されているように、リンカー結合体(-L-Z-Ab、以下に記載)のリンカーへの同価な付着点を示す。
オーリスタチンは、米国特許の方法に従って調製することができる。No.5,635,483;米国特許。No. 5,780,588; Pettit et al (1989) J. Am.化学協会111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G. R., et al.統合、1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem Soc.パーキントランス15:859-863; and Doronina (2003) Nat.バイオテクノル。21(7):778-784.
アマトキシン
いくつかの実施形態では、ADCの細胞毒素は、アマトキシンまたはその誘導体である。幾つかの実施例において、細胞毒素は、アマトキシンまたはその派生物であり、例えば、α-アマニチン、ベータ-アマニチン、ゲーマニチン、イプタマニチン、アマニナイン、アマニナミド、アマナリン、アマヌリン、アマヌリン酸およびプロアマヌリンである。種々のアマトキシンの構造は、式(II)および付属の表2に示され、例えば、Zanotti et al., Int.で開示される。J. Peptide Protein Res. 30, 1987, 450-459は、ここにその全体を含んでいる。
[化２９]

[表２]
アマトキシンおよびその派生物は、本書に記載されている組成および方法に関連して有用であるが、これらに限定されないが、α-アマニティン、ベータ-アマニティン、ゲータ-アマニティン、クリーム-アマニティン、イナマニティン、アマニナミデス、アマヌリン、アマヌリン酸、プロアマヌリンおよびそれらの派生物を含む。一実施形態において、細胞毒素は、アマニチンまたはその派生物である。一実施形態において、細胞毒素は、α-アマニチンまたはその派生物である。例えば、例えば、米国特許番号に記載されているように、ヒト幹細胞の細胞表面上で表現された抗原を認識し、それに結合する、抗原結合フラグメント、又はその抗原結合フラグメントは、アマトキシン、例えば、α-アマニチンまたはその派生物に結合することができる。9,233,173 そして、9,399,681及び米国特許公開番号である。2016/0089450, 2016/0002298, 2016/0002298, 2015/0218220, 2014/0294865, その各々の開示は、例えば、α-アマニチンのようなアマトキシンや、同価活用に使用できるコバレントリンカーに関連する、引用によりここに組み込まれている。このような過程に有用なアマトキシン活用及びリンカーの例示的な方法をここに述べる。本書には、組成及び方法に従った、抗原結合フラグメントへの接合に有用なリンカーを含む例示的なアマトキシンも記載されている。
ここで用いられるように、「アマトキシン誘導体」または「アマニチン誘導体」という用語は、上記のアマトキシン(たとえば、α-アマニチン、ベータ-アマニチン、α-アマニチン、△アマニチン、アマニ、アマニナミド、アマニナミド、アマヌリン、アマヌリン酸またはプロアマヌリン)に対して、1つ以上の位置で化学的に改変されたアマトキシンを意味する。それぞれの場合、誘導体は、上記に発生する複合体(「半合成」)の化学修飾、完全に合成された源から得られることがある。各種アマトキシン誘導体への合成経路は、例えば、米国特許番号9,676,702及びペリン他、J. Amに開示されている。化学協会2018, 140, 140, p. 6513-6517。これらはそれぞれ、驚異的な毒素を調製し、導出するための総合的な方法に関して、ここに引用文献全体に組み込まれている。
いくつかの実施形態において、アマトキシンまたはその派生物は、式(III)で表される。
[化３０]
又はそれらの鏡像異性体又はジアステレオマーである。
Q は-S-, -S(O)-, または-SO2 -;
R1はH、OH、またはORA;
R2はH、OH、またはORB;
RA とRBは、もし存在するなら、それらが結合している酸素原子と結合して、5族のヘテロシクロアルキル基を形成する;
R3がHまたはRC;
R4, R5, R6、およびR7 はそれぞれ個別にH、OH、またはRC;
R8はOH、NH2, ORC、またはNHRC;
R9はH またはOH またはORC; であり、
R Cは、C 1 -C 6的なアーキテクル、C 1-C 6的なアルケニール、C 2 -C 6的なアルキニール、ヘテロアルキニール、C 1 -C 6的なアルキニール、ヘテロアルキニール、C 2 -C 6的なアルキニール、ヘテロアルキニール、C 2 -C 6的なアルキニール、ヘテロアルキニール、C 2 -C 6、またはヘテロアルキニールを、アルキニール、アルキニール、シクロアルキ、アルキニール、アルキアリール、ヘテロアルキニール、アルキニール、アルキニール、ミノアリール、アサイロ、アサイロアルカミノ、アルカノシル、アルカノニル、アルカムネート、C 2 -C 6、アルファベイル、スルホニル、アルカニール、アルカニール、アルカニール、アルファジー、カノミノ、シアノ、キャプトからなる群から独立して1～5個の代替物で代替することができる。
いくつかの実施例において、RA とRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と共に、5個のヘテロシクロアルキル基を形成する。
[化３１]
[化３２]
ここで、Y は-(C=O)-, -(C=S)-, -(C=NH)-, または-(CH)2- である。
いくつかの実施形態において、アマトキシンまたはその誘導体は、式(IIIa)で表される。
[化３３]
ここで、Q、R1 -R9, RA, RB、およびRCの各々は、公式(III)に対して先に定義されたとおりである。
いくつかの実施形態において、式(III)のアマトキシンまたはその派生物は、式(IIIb)で表される。
[化３４]
ここで、Q、R1 -R9, RA, RB、およびRCの各々は、公式(III)に対して先に定義されたとおりである。
いくつかの実施形態では、式(III)のアマトキシンまたはその派生物は、式(IIC)で表される。
[化３５]
ここで、R4, R5、X、およびR8は、それぞれ上記で定義されたものである。
本明細書に記載される組成物および方法に従って、抗体またはその抗原結合フラグメントへの共役のために使用され得る追加のアマトキシンは、例えば、国際公開第2016/142049号、国際公開第2016/071856号、国際公開第2017/149077号、国際公開第2018/115466号、および国際公開第2017/046658号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
リンカー
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、抗体またはそのフラグメント(Ab)を細胞毒素(例えば、アマトキシン)に共有結合して抗体-薬物結合体(ADC)を形成する共有結合または原子の鎖を含む2価の化学部分を意味する。
上記抗体および薬物部分の共有取付部材は、リンカーが2つの反応性官能基(すなわち、反応の意味において二価)を有することを要する。ペプチド、核酸、薬方法、毒素、抗毒素、ハプテン、およびレポーターグループのような、2つ以上の機能的または生方法学的に活発なモイテイを付着させるのに有用な二価リンカー試薬が知られており、その結果として生じた結合方法(Hermanson, G. T. (1996) バイオコンジュゲートテクニック アカデミックプレス ニューヨーク、234-242ページ)が記載されている。
従って、現在のリンカーは、2つの反応性ターミニを持っている。1つは、抗菌に対する共役であり、もう1つは、細胞毒素に対する共役である。リンカーの共役反応性ターミナル(ここではZ'として定義する反応性物質)は、典型的には、例えば、抗菌に対するシステインチオールまたはリジンアミングループを通して共役できる化学物質であり、したがって、典型的には、マイケルアクセプター(マレイミドのような)、クロロ、ブロモ、イオドまたはR-スファニールグループのような脱離基、またはカーボキシルグループのようなアミン反応性グループである。リンカーと抗菌剤の結合については、ここでより詳しく説明する。
リンカーの細胞毒素(例、アマトキシン)共役反応性ターミナルは、細胞毒素分子内の反応性代替物との結合を形成することによって細胞毒素に共役することができる一般的な化学物質である。限定されていない例としては、例えば、リンカー上のカルボキシル又は塩基性アミン基を介して、サイトトキシル基上にアミド結合またはカルボキシル基と結合したもの、または、それぞれ細胞毒素基のOH又はNH基のアルキル化を介して、細胞毒素上にエーテル、アミドまたは同類の形成が含まれる。
「リンカー」という用語が活用形でリンカーを説明する際に使用されるとき、反応性ターミニの一方又は両者は、リンカー及び/又は細胞毒素の間の結合の形成、並びにリンカー及び/又はそれらのリンカー又はそれらの抗原結合フラグメントの間の結合のために、不完全(例えば、以下に述べるように、反応性モアチュアZに変換されたZ'のような)又は不完全(例えば、カルボキシル酸のカルボニールのみである)でなくなるだろう。このような上記反応については、ここでさらに詳しく説明する。
種々のリンカーを使用して、細胞傷害性分子に記載された抗体、抗原結合フラグメント、および配位子を結合させることができる。一般的には、本開示に適したリンカーは、循環において実質的に安定しているが、標的細胞内又は近接において細胞毒素の放出を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、本開示に適した特定のリンカーは、切り離すことができるか、または、切り離すことができないかに分類されることがある。一般に、切り離すことができるリンカーは、生理学的環境に応じて切り離される1つ以上の官能基を含んでいる。例えば、クレーバブルリンカーには、細胞内エンザイム(例えば、カテプシンB)の存在で分解するエンザイマティック基材(例えば、バリン・アラニーン)、細胞区画の酸性環境で分解する酸性クリーバブル基(例えば、ハイドロゾーン)、または細胞内還元環境で分解する還元性基(例えば、ジスルフィド)を含むことができる。コンテストにより、一般に、非切断性リンカーは、標的細胞内のADCの抗体部分の劣化(例えば、リソソーム劣化)中にADCから放出される。
切断不能なリンカー
本明細書での使用に適した, -(C=O)-, C1 -C6アルキレン、C1 -C6ヘテロアルキレン、C2-C6アルケニレン、C2 -C6ヘテロアルケニレン、C2 -C6 アルキニレン、C2-C6 ヘテロアルキニレン、C3 -C6 シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリン、およびそれらの組合せから選択される1つまたは複数のグループをさらに含み、それらの各々は任意に置換されてもよく、および/または1つまたは複数のヘテロアトム(例えば、S、N、またはO)を1つまたは複数の原子の代わりに含んでもよい。このようなグループの非限定的な例としては、アルキレン(CH2)p, (C=O)(CH2)p,および(PEG; (CH2 CH2 O)p)単位が挙げられ、ここでpは、各場面に対して独立に選択される1～6の整数である。
いくつかの実施形態において、リンカLは、結合、-(C=O)-、a -C(O)NHgroup、-OC(O)NHgroup、C1-C6アルキレン、C1 -C6ヘテロアルキレン、C2 -C6アルキレン、C2-C6ヘテロアルケニレン、C2 -C6 アルキニレン、C2 -C6 ヘテロアルキニレン、C3-C6 シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、-(CH2CH2 O)p - groupのうちの1つ以上を含む。ここで、pは、1-6からの整数であるか、または、液性向上群である。
それぞれのC 1 -C 6アルキレン、C 1 -C 6ヘテロアルキレン、C 2-C 6アルケニレン、C 2 -C 6 ヘテロアルキニレン、C 2 -C 6 ヘテロアルキニレン、C 3-C 6 シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルカリ、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルフィニル、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、およびニトロからなる群からそれぞれ独立に選択される1～5個の置換基で置換されていてもよい。
いくつかの実施形態において、それぞれのC1-C6アルキレン、C1 -C6ヘテロアルキレン、C2 -C6アルケニレン、C2-C6ヘテロアルケニレン、C2 -C6 アルキニレン、C2 -C6 ヘテロアルキニレン、C3-C6 シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンは、任意にO、SおよびNから選択される1つ以上のヘテロアトによって中断されてもよい。
いくつかの実施形態において、C 1-C 6アルキレン、C 2 -C 6アルケニレン、C 2 -C 6アルケニレン、ヘテロアルケニレン、C 2 -C 6 アルキニレン、ヘテロアルキニレン、C 3 -C 6 シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンは、O、Sから選択される1つ以上のヘテロ原子によって任意に中断され、アルキル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アミノ、アシル、アシルオキシ、アシルアミノカルボニル、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルホニル、ヒドロキシル、スルホニル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、およびニトロからなる群より独立して選択される1～5の置換基で任意に置換され得る。
いくつかの実施形態において、リンカーは、-(CH2)n-ユニットを含み、ここでnは、2-12からの整数、例えば2-6である。いくつかの実施形態において、リンカーは、-(CH2)nを含む。ここで、nは6である。
いくつかの実施形態において、リンカーは、-(CH2)n-ここで、nは、公式によって表される1、2、3、4、5、または6である。
[化３６]
切断可能なリンカー
いくつかの実施例では、細胞毒素にそれらの抗原結合断片または抗原結合断片を活用するリンカーは、細胞内環境においてリンカーの分裂により、細胞内環境において、薬物ユニットを放出するような、細胞内条件下では分裂可能である。クリーン可能なリンカーは、例えば、標的細胞内で細胞毒素の放出を引き起こすために、局所環境、例えば、細胞外および細胞内環境の違いを利用するように設計されている。一般に、分割可能なリンカーは、循環において比較的安定であるが、1つ以上の機構(例えば、プロテアーゼ、ペプティダーゼ、グルクロニダーゼの活性を含むが、それに限定されない)を通して、細胞内環境において特に分裂しやすい。本分野で使用される可解リンカーは、ターゲット細胞の循環プラズマおよび/または外で実質的に安定であり、ターゲット細胞の内部またはターゲット細胞に近接したところで、何らかの効果的な速度で切り離されることができる。
適切な切断可能なリンカーは、例えば、酵素的加水分解、光分解、酸性条件下での加水分解、基本条件加水分解、酸化、ジスルフィド還元、求核切断、または有機金属切断によって切断され得るものを含む(例えば、Leriche et al., Bioorg. Med. Chem., 20:571-582, 2012を参照のこと、その開示は、共有共役共役に適したリンカーに関連するとして、参照により本明細書に組み込まれる)。適切な切断可能なリンカーは、例えば、ヒドラジン、ジスルフィド、チオエーテルまたはジペプチドなどの化学的部分を含み得る。
酸性条件下で加水分解可能なリンカーには、例えば、ヒドラゾン化合物、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、cis-アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなどが含まれる。(例えば米国特許を参照。No.5,122,368; 5,824,805; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm.Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol.Chem. 264:14653-14661、各開示は、同価活用に適したリンカーに関連するので、ここにその全体として参考文献に含まれる。このようなリンカーは血液中のような中性のpH状態では比較的安定であるが、pH 5.5または5.0(リソソームの上記pH)以下では不安定である。
還元条件下で掃除可能なリンカーには、例えばジスルフィドが含まれる。例えば、アドバンストテクノロジアタッチメント (N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート)、SPDP (N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート)、SPDB (N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)酪酸)及びSMPT (N-スクシンイミジル-オキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジル-ジチオ)トルエン)、SPDB及びSMPTを用いて形成することができるものを含む、種々のジスルフィドリンカーが当該技術分野において公知である(例えば、Thorpe et al., 1987, Cancer Res)。47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987.米国特許も参照のこと。No. 4,880,935は、各々の開示が、共有結合共役に適したリンカーに関連するので、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
酵素的加水分解に感受性のリンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素(リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むが、これらに限定されない)によって切断されるペプチド含有リンカーであり得る。治療薬剤の細胞内プロテオリズム解放を使用することの1つの利点は、その薬品が接合されたときに典型的に減衰され、接合体の美容安定性が一般的に高いことである。いくつかの実施形態において、ペプティルリンカーは少なくとも2つのアミノ酸が長いか少なくとも3つのアミノ酸が長い。典型的なアミノ酸リンカーには、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプティドが含まれる。適切なペプチドの例には、バリン、アラニン、シトルリン、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、およびグリシンのようなアミノ酸を含有するものが含まれる。アミノ酸リンカー成分を構成するアミノ酸残留物には、天然のものに加え、マイナーなアミノ酸や、シトルリン等の非天然のアミノ酸類似物が含まれます。典型的なジペプチドには、フェニルアラニン-シトルリン(vcまたはval-cit)およびアラニーン-フェニーラニン(afまたはala-phe)が含まれる。例示的なトリプペプチドには、グリシン-フェニルアラニン-シトルリン(gly-val-cit)とグリシン-glycine-glycine (gly-gly-gly)が含まれる。いくつかの実施形態において、リンカーは、Val-Cit、Ala-Val、又はPhe-Lys、Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Arg又はTrp-Citのようなジペプチドを含む。Val-CitやPhe-Lysのようなジペプチドを含むリンカーは、例えば米国特許に開示される。No.6,214,345。この開示は、本引用文献全体として、同価活用に適したリンカーに関するものであるから、ここに組み込まれている。いくつかの実施形態において、リンカーは、Val-AlaおよびVal-Citから選ばれたジペプチドを含む。
本明細書中に記載される抗体、抗原結合フラグメント、および配位子を細胞傷害性分子に結合させるのに適したリンカーには、1,6-脱離処理によって細胞毒素を放出することができるものが含まれる。この脱離処理が可能な化学部分は、p-アミノベンジル(PAB)基、6-マレイミドヘキサン酸、pH感受性炭酸塩、およびJainら、Pharmに記載されるような他の試薬を含む。研究32:3526-3540, 2015, 2015, それらの開示は、それが同価活用に適したリンカーに関連するので、ここにその全体として参考文献に組み込まれている。
いくつかの態様において、リンカーは、例えば、Carlら、J. Medに開示されている、前述のPABまたはPABC (パラ-アミノベンジルオキシカルボニル)などの「自己不溶性」基を含む。Chem. (1981) 24:479-480; Chakravarty et al (1983) J. Med.Chem. 26:638-644; US 6214345; US20030130189; US20030096743; US6759509; US20040052793; US6218519; US6835807; US6268488; US20040018194; W098/13059; US20040052793; US6677435; US5621002; US20040121940; W02004/032828).このプロセスが可能な他のそのような化学部分(「自己非揮発性リンカー」)には、メチレンカルバメートおよびアミノチアゾール、アミノイミダゾール、アミノピリミジンなどのヘテロアリール基が含まれる。このようなヘテロ循環的な自己グループを含むリンカーは、例えば、米国特許公開番号に開示される。20160303254および20150079114、ならびに米国特許第7,754,681号; Hayら(1999) Bioorg。中央値。Chem. Lett.9:2237; 米国2005/0256030; de Groot et al. (2001) J. Org.Chem. 66:8815-8830; およびUS 7223837。いくつかの実施形態において、ジペプチドは、自己不滅リンカーと組み合わせて使用される。
適切なリンカー、溶解性を高める特性を有するグループを含むことができる。例えば、(CH2 CH2 O)p単位(ポリエチレングリコール、PEG)を含むリンカーは、アミノ、硫酸、リン酸またはリン酸残渣で置換されたアルキル鎖のように、溶解性を高めることができる。このようなモイテイを含むリンカーは、例えば、米国特許番号に開示される。8,236,319 そして、9,504,756であり、それらの各開示は、同価活用に適したリンカーに関連するので、ここにその全体として参考文献に含まれる。さらなる溶解性強化基は、例えば、アシルおよびカルバモイルスルファミド基を含み、その構造を有する。
[化３７]
aが0または1であること。
R 10は、水素、C 1 -C 24アルキル基、C 3-C 24シクロアルキル基、C 1 -C 24(ヘテロ)アリール基、C 1 -C 24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC 1-C 24(ヘテロ)アリールアルキル基、C 3 -C 24シクロアルキル基、C 2 -C 24(ヘテロ)アリール基、C 3-C 24アルキル(ヘテロ)アリール基及びC 3 -C 24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から選択され、これらの各々は、O、S及びNR 11R 12から選択される1つ以上のヘテロ原子によって置換され及び/又は場合により中断されてもよく、ここで、R 11及びC 1 -C 24は、水素及びC 1-C 4アルキル基からなる群から独立して選択され;又はR 10はサイトトキシンであり、サイトトキシンは、スペーサ部分を介してNに任意に連結されている。このようなグループを含むリンカーについては、例えば、米国特許第9,636,421号及び特許出願公開第2017/0298145号において記載されているが、これらの開示は、細胞毒素及び抗原結合フラグメントへの同価な活用に適したリンカーに関するものとして、ここにその全体として参考文献に含まれている。
いくつかの実施例において、リンカLは、1つ以上のハイドラジン、ジスルフィド、チオエーテル、アミノ酸、最大10のアミノ酸からなるペプチド、p-aminobenzyl (PAB)グループ、ヘテロ周期的な自己運動性グループ、C 1-C 6 ヘテロアルキル、C 1 -C 6ヘテロアルキル、C 2 -C 6 ヘテロアルキンイル、C 2-C 6 ヘテロアルキンイル、C 2 -C 6 ヘテロアルキンイル、C 3 -C 6 シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、a -(C=O)グループ、a -(C)NHグループ、an -OC(O)NHグループ、an -(O)NHグループ、a -(CH 2 CH 2 O)pグループ、又はa -(OOJ O)グループであり、pが1-6の整数である。
ここで、各々のC 1-C 6 アルキル、C 1 -C 6ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2-C 6 ヘテロアルケニル、C 2 -C 6 ヘテロアルキニル、C 2 -C 6 ヘテロシクロアルキル、C 3-C 6 ヘテロアルキニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルフィニル、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、およびニトロからなる群から各々独立して選択される1～5個の置換基で置換される。
いくつかの実施形態において、それぞれのC 1-C 6 アルキル、C 1 -C 6ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2-C 6 ヘテロアルケニル、C 2 -C 6 アルキニル、C 2 -C 6 ヘテロアルキニル、C 3-C 6 シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、場合により、O、SおよびNから選択される1つ以上のヘテロ原子によって中断され得る。
いくつかの実施形態において、C 1-C 6 アルキル、C 1 -C 6アルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2-C 6 アルケニル、ヘテロアルケニル、C 2 -C 6 アルキニル、ヘテロアルキル、C 3 -C 6 シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、O、Sから選択される1つ以上のヘテロ原子によって任意に中断され、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルカリアルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アミノ、アシル、アシルオキシ、アシルアミノカルボニル、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルホニル、ヒドロキシル、スルホニル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、およびニトロからなる群より独立して選択される1つまたは5つの置換基で任意に置換され得る。
当業者は、リストされたグループのうちの1つ以上が、二価(ジラディカル)種、例えばC1-C6アルキレン等の形で存在することを認識するであろう。
いくつかの実施形態において、リンカーLは、部分*-L1 L2 -**を含む。
L1がないか-(CH2)m NR13C(=O)-, -(CH2)m NR13 -, -(CH2)mX3 (CH2)mである。
[化３８]
L2が存在しないか、-(CH2)m -、-(CH2)R13 C(=O)Nm -、-(CH2)13 C(=O)Nm -、-(CH2)C(=O)X4、-((CH2)CH2)m -((CH2)m -(CH2)m n -(CH2)m -、-(NR13)(CH2)X3 (CH2)m -、-NR13(CH2)m X3 (CH2)m -、-X1 X2 C(=O)m -、-(CH2)m -(CH2)m -、-(CH2)m (CH2)n、-(CH2)m NR13(m)m -、-(CH2)m NR13 C(=O)(CH2)m X3 (CH2)m -(CH2)m C(=O)NR13(CH2)m NR13 C(=O)(CH2)m-, -(CH2)m C(=O)-, - (m)m NR13(CH2)m C(=O)X2 X1 C(=O)-, -(CH2)m)X2X1 C(=O)-, - (CH2)mm -, -(CH2)mC(=O)NR13 (CH2)m X3 (CH2)mCH2)m NR13 C(=O)(CH2)m-, -(CH2)m X3 (CH2)mC(=O)NR13 (CH2)m -, - (CH2)mO)n (CH2)m NR13 C(=O)m X3(CH2)m C(=Om X3 (O(CH2)m)nm(O(CH2)m)n -, - (CH2)m(O(CH2)m C(=O)NR13 (CH2))nC(=O)-, -(-, -(CH2)m X3 (CH2)mNR13 (CH2)m C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR13 (CH2)m NR13 C(=O)-, -(CH2)m(O(CH2)CH2)n X3 (CH2)m-, - (CH2)(CH2)m -, -(CH2) X3((m C(=O)NR13 (CH2))m O)CH2)mX3 (CH2)m C(=O)-, - (CH2)mC(=O)NR13 (CH2)m O)n (CH2)mX3 (CH2)m -, - (CH2)m X3(CH2)m (O(CH2)m)n NR13C(=O)(CH2)m -, -(CH2)m X3(CH2)m (O(CH2)m)n CmCH2)m)n-, -(CH2)m C(=O)n (CH2)m-, -(CH2-, -(CH2)m C(=O)NR13 (CH2)m(O(CH2)m)n C(=O)-, -((m)mO)n (CH2)m NR13 C(=O)(=O)-, -(CH2)mX3 (CH2)m (O(CH2mm -, -(CH2)mNR13 C(=O)(CH2)m NR13 C(=O)(CH2) -(CH2)NR13 (CH2)m C(=O))NR13-, -(CH2)m C(=O)NR13 -, -(CH2)mX3 -, -C(R13)2 (CH2)m -, -(CH2)m C(R13)2 NR13 -, -(CH2)m (CH2)m -, -(CH2) m C(=O)NR13 (CH2)=O)m C(=O)NR13(CH2))m X3 (CH2)mC(=O=O)X2 X1 C(=O)-, - C(R13)2 (CH2)mNR13 C(=O)(CH2)m -, -(CH2)CH2mC(R13)2 NR13 -, - C(R13)2(CH2)C(=O)NR13 (CH2)mNR13-, - (CH2)m C()NR13 (CH2)mNR13 C(=O NR13 -, -(CH2)m C(NR13(CH2)m -, -(CH2)m NR13C(=O)O(CH2)m C(R13)2 NR13-, -(CH2)m m C(=O)NR13 (CH2)CH2)mX3 (CH2)m -, -()CH2) m X3(CH2)m C(R13)2 NR13 -, -C(R13)2 (CH2)m OC(=O)O)NR13(CH2)m (O(CH2)m)X3 (CH2)mNR13 -, -()m S(=O)2 -, - (CH2)mC(=O)NR13 n NR13 -, -(CH2)m(CH2)m X3 (CH2)m (O(CH2mn NR13 -, -(CH2)m NR13-, -(CH2)m C(=)(CH2)m S(=O)2O(m))O(CH2)m-, -(CH2))-, -(CH2)m X3 (CH2)nC(=O)X2 X1 C(=O(m S(=O)2 -, -)))m)nX2 X1 C(=O)-, - -, -(CH2)m (O(CH2m n X2 X1 C(=O)-, -)n NR13-, -(CH2 CH2 O)n (CH2)m-, -(CH2))(CH2)m X3 (CH2)mCO)-)(CH2)m X2 X1C(=O) -, -(CH2)m (O(C(=O)(m (OCH2CH2)n; -(CH2)m)(mO)(=O)-, -(CH2)C(=O)-, -(CH2O)m X3(CH2)m C(=O ((CH2)m X3(CH2)m X2 X1)C(=O)-, -(CH2- またはCH2 m (O(CH2)m)nC C(=O)-;
(式中、X1は
[化３９]
X2は
[化４０]
X3は
[化４１]
及び、
X4は
[化４２]
(式中、R13は、HおよびC1-C6のアルキルからそれぞれ独立に選択される;
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10の各機会ごとに選択される。
n は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 からそれぞれの機会に独立して選択される。
単一の星印(*)は細胞毒素(例:アマトキシン)への付着点を示し、二重の星印(**)は反応性代替物質Z'または化学物質Zへの付着点を示し、L1とL2の両方が欠けていないことを条件とする。
いくつかの実施形態において、リンカーは、p-aminobenzyl基(PAB)を含む。ある実施形態では、p-アミノベンジル基は、リンカー内の部位トキシック薬物とプロテアーゼ切断部位の間に処分される。1つの実施形態において、p-アミノベンジル基はp-アミノベンジルオキシカルボニル単位の一部である。一実施の形態では、p-aminobenzyl基は、p-aminobenzylamido単位の一部である。
いくつかの実施形態において、リンカーは、Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Ala、Phe-Cit、Val-Ala、Val-Cit、およびVal-Argからなるグループから選ばれたペプチドからなる。
いくつかの実施形態において、リンカーは、PAB、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、又はAlいくつかの実施形態において、リンカーは、ペプチド、オリゴ糖化, -(CH2)p-, -(CH2 CH2 O)p -, -(C=O)(CH2)p-,PAB、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、又はAla-PABの1つ以上を含み、Pは1-6の整数である。
幾つかの実施例において、リンカーは、次の公式で表されるPAB-Ala-Val-プロピオニールを含む。
[化４３]
いくつかの実施形態において、リンカーは、次の公式で表されるPAB-Cit-Val-プロピオニールを含む。
[化４４]
このようなPAB-ジペプチド-プロピオニールリンカーは、例えば、国際特許出願第WO2017/149077に開示されているが、これは、その全体において、引用により組み込まれている。
ある態様において、ADCのリンカーは、マレイミドカプロイル-Val-Ala-パラ-アミノベンジル(mc-Val-Ala-PAB)である。
ある態様において、ADCのリンカーは、マレイミドカプロイル-Val-Cit-パラ-アミノベンジル(mc-vc-PAB)である。
いくつかの実施形態において、リンカーは、を構成する。
[化４５]
いくつかの実施形態において、リンカーはMCC (4-[N-maleimidomethyl]シクロヘキサン-1-カルボキシレート)を含む。
本分野の当業者は、本分野で開示されるどれかの化学グループ、モイティーおよび特徴のいずれかが、本分野で開示されるように、抗毒素および細胞毒素の活用に有用なリンカーを形成するために、複数の方法で結合することができることを認識するであろう。ここに記載された組成物及び方法と関連して有用な更なるリンカーが、例えば、米国特許出願公報第2015/0218220号に記載されており、これは、その全体としてここに参考文献に含まれている。
リンカー-サイトトキシンおよびリンカー-抗体結合
ある種の実施例において、リンカー-細胞毒素共役を形成するための適切な条件下で、リンカーは細胞毒素と反応する。ある種の実施例では、反応性グループが細胞毒素またはリンカー上で、同価な付着を形成するために使用される。幾つかの実施例において、細胞毒素は、式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)のいずれかによれば、アマトキシンまたはその派生物である。その後、細胞毒素リンク剤は、ADCを形成するための適切な条件の下で、適切な条件下で、抗原結合型、あるいはそれらの抗原結合断片と反応する。
別の方法として、リンカーはまず、リンカー・抗体レンジを形成するために、まず、抗原結合フラグメント、あるいはそれらを導出させて反応し、その後、ADCを形成するために細胞毒素と反応することができる。このような活用反応については、もう少し詳しく説明しよう。
リンカーまたは細胞毒素-リンカー複合体の抗体またはその抗原結合フラグメントへの共有結合のために、多数の異なる反応が利用可能である。また、この抗菌分子に対する適切な付着点としては、リジンのアミン群、グルタミン酸・アスパルチン酸の遊離カルボキシル酸群、システインのスルフィドリル群、および芳香族アミノ酸の様々なモイテイが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、非特異的共有結合は、カルボジイミド反応を用いて、リンカー上のカルボキシ(またはアミノ)基を抗体部分上のアミノ(またはカルボキシ)基に結合させることにより行うことができる。加えて、ジアルデハイドまたはイミドエステルのような二機能性物質もまた、リンカー上のアミノ基を、抗菌上のアミノ基と結びつけるために使用することができる。また、細胞毒素をモイテイに付着させることも可能であるが、これはSchiffベースの反応である。この方法は、解凍剤またはリンカーのいずれかにグリコールまたは水酸基の周期性酸化を含み、それによってアルデハイドを形成し、その後、それぞれリンカーまたは反応される。共有結合の形成は、アルデハイドとアミノ塩基の間のSchiff塩基の形成を介して起こる。イソチオシアネートはまた、細胞毒素または抗体部分をリンカーに共有結合するためのカップリング剤として使用され得る。他の技術は、当業者に知られており、本開示の範囲内である。
本明細書中に記載される抗体または抗原結合フラグメントへの結合に有用なリンカーは、以下の表3に示されるように、抗体とリンカー上の反応性化学部分(本明細書中で反応性置換基、Z'と呼ばれる)との間のカップリング反応によって形成される化学部分Zを含有するリンカーを含むが、これらに限定されない。波線は、それぞれ抗体または抗原結合フラグメントおよび細胞傷害性分子への結合点を示す。
表3.例示的な化学物質Zは、カップリング反応させて、抗菌薬の結合体を形成することによって形成される。
[表３]
当業者の1人は、リンカーに付着した反応性代替物Z'と、それに付着した反応性代替物またはそれらの抗原結合フラグメントが、化学物質Zを生成するための同価カップリング反応に従事しており、反応性代替物Z'を認識することを認識するであろう。したがって、本明細書中に記載される手法と組み合わせて有用な抗体-薬物結合体は、本明細書中に記載されるように、リンカーまたは細胞毒素-リンカー結合体と、抗体上の反応性置換基、またはその抗原結合フラグメントとの反応に適した、反応性置換基Z'を含むリンカーまたは細胞毒素-リンカー結合体、またはその抗原結合フラグメントとの反応によって形成されて、化学部分Zを形成し得る。
いくつかの実施形態において、Z'は、-NR13 C(=O)CH=CH2, -N3, -SH, -S(=O)2(CH=CH2), -(CH2)2 S(=O)2 (CH=CH2), -NR13 S(=O)2 (CH=CH2), -NR13C(=O)CH2 R14, -NR13 C(=O)CH2 Br、-NR13 C(=O)CH2 I、-NHC(=O)CH2Br、-NHC(=O)CH2 I、-ONH、-C(O)NHNH2、-CO2 H、-NH2、-NH(C=O)、-NC(=S)、
[化４６]
(式中、R13は、HおよびC1-C6のアルキルからそれぞれ独立に選択される。
R14が-S(CH2)n CHR15NHC(=O)R13;
R15がR13または-C(=O)OR13;
R16は、H、C1 -C6 Alk、F、Cl、および-OH からそれぞれ個別に選択される。
R17は、H, C1 -C6 alkyl, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2 CH3, -N(CH3)2, -CN, -NO2, -OHからそれぞれ独立に選択される。
R18は、H、-C(=O)OHで置換されたC1-C6 Olk、F、ベンジロキシ、-C(=O)OHで置換されたベンジル、-C(=O)OHで置換されたC1 -C4 アルコキシ基、-C(=O)OHで置換されたC1 -C4 アルコキシ基から、それぞれ個別に選択される。
表3に示すように、リンカー上の適切に反応性の代替物質Z'およびその抗原結合フラグメントの例には、核酸/エレクトロフィルペア(例えば、チオール/ハロアルキルペア、アミン/カルボニールペア、またはチオール/非飽和型カルボニールペアなど)、ジエン/ジエンフィルペア(例えば、アジド/アルキンペア、あるいはジエン/非飽和型カルボニールペアなど)などが含まれる。化学部分Zを形成するための反応性置換基間のカップリング反応としては、チオールアルキル化、ヒドロキシルアルキル化、アミンアルキル化、アミンまたはヒドロキシルアミン縮合、ヒドラジン形成、アミド化、エステル化、ジスルフィド形成、環状付加(例えば、とりわけ、[4+2] Diels-Alder環状付加、[3+2] Huisgen環状付加)、芳香族求核置換、芳香族求電子置換、および本明細書に記載される他の反応様式が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施例では、反応性代替物Z'は、反射性官能基を有する抗原結合フラグメントとの反応に適した電気親水性官能基である。
本明細書に開示されているように、抗原結合フラグメント、すなわち、抗原結合フラグメントに存在しうる反応性代替物には、(i)N-端子アミン基、(ii)側鎖アミン基、例えばリジン、(iii)側鎖チオール基、例えばシステイン、(iv)糖水酸基又はその抗原がグリコシル化されるアミノ基を含むが、これに限定されない。本明細書に開示されるように、抗体またはその抗原結合フラグメント内に存在し得る反応性置換基は、限定されるものではないが、セリン、トレオニン、およびチロシン残基のヒドロキシル部分;リジン残基のアミノ部分;アスパラギン酸およびグルタミン酸残基のカルボキシル部分;ならびにシステイン残基のチオール部分;ならびにプロパルギル、アジド、ハロアリール、ハロヘテロアリール(例えば、フルオロヘテロアリール)、ハロアルキル、および非天然アミノ酸のハロヘテロアルキル部分を含む。いくつかの態様において、抗体内に存在する反応性置換基、または本明細書に開示されるその抗原結合フラグメントは、アミンまたはチオール部分を含む。ある種の抗体は還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわちシステインブリッジ部を有する。抗体は、DTT (ジチオトレイトール)などの還元剤で処理することによって、リンカー試薬との結合のために反応性にされ得る。このように、システインのブリッジ部はそれぞれ、理論的には二つの反応性のあるチオールヌクレオフィルを形成する。さらに、2-イミノチオラン(Trautの試薬)によるリジンの反応を通して、アミンをチオールに変換させることによって、抗物質に加えた核基を導入することができる。反応性チオール基は、1、2、3、4、またはそれ以上のシステイン残留物(例えば、1つ以上の非ネイティブシステインアミノ酸残留物からなる交配抗物質を調製すること)を導入することによって、その(またはそれらの断片)に導入され得る。米国特許No.7,521,541は反応性システインアミノ酸の導入による工学的な抗生物質を教えている。
いくつかの態様において、リンカーに結合した反応性置換基Z'は、抗体上に存在する求電子性と反応性である求核基である。抗体上の有用な親電子性基は、限定されるものではないが、アルデヒドおよびケトンカルボニル基を含む。求核基(例えば、a)ヘテロ原子は、抗体上の求電子性と反応し、抗体と共有結合を形成することができる。有用な求核基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、水酸基、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、カルボン酸ヒドラジン、およびアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。
幾つかの実施例において、化学物質Zは、アミン及びチオールモイテイのような、抗原結合フラグメント、並びにリンカーに付着した反応性の好電性上記発明Z'との間の反応の産物である。例えば、Z'はマイケル受け入れ子(例えばマレイミド)、活性化エステル、電子欠乏カルボニール複合体、あるいはアルデハイドなどである。
反応性代替物質とその結果生じる化学物質の代表的で限定されないいくつかの実施例を表4に示す。
表4.相補的な反応性置換基や化学部分
[表４]
例えば、リンカー‐抗菌共役とADCの合成に適したリンカーには、マレイミドまたはハロアルキル基のような、リンカーに付着した反応性代替物Z'が限定なく含まれる。これらは、例えば、他Liuら、18:690-697、1979に記載されている、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-L-カルボキシレート(SMCC)、Nスクシンイミジルヨードアセテート(SIA)、スルホ-SMCC、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(MBS)、スルホ-MBS、およびスクシンイミジルヨードアセテートなどの試薬によってリンカーに結合されてもよく、これらの開示は、化学的結合のためのリンカーに関連するので、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施例では、リンカーLに付着する反応性代替物Z'はマレイミド、アジドまたはアルキンである。マレイミドを含むリンカーの実施例は、非開けられないマレイミドカプロイルベースリンカーであり、これは、アウリスタチンのような微小管破壊剤の活用に特に有用である。上記リンカーは、Doroninaら、Bioconjugate Chem. 17:14-24, 2006により記載されており、その開示は、化学的結合のためのリンカーに関連するものとして、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施例において、反応性代替物Z'は、-(C=O)又は-NH(C=O)-であり、このようなことから、リンカーは、それぞれ、アミドまたは尿素不安によって、上記リンカーを、抗原結合フラグメントに結合することができる。これは、それらの-(C=O)又は-NH(C=O)グループが、それらの抗原結合フラグメントのアミノ基を有する反応の結果である(C=O)又は-NH(C=O)グループである。
いくつかの実施形態において、反応性置換基Z'は、N-マレイミジル基、ハロゲン化N-アルキルアミド基、スルホニルオキシN-アルキルアミド基、カーボネート基、スルホニルハライド基、チオール基またはその誘導体、内部炭素-炭素三重結合を含むアルキニル基、(ヘテロ)シクロアルキニル基、(ヘテロ)シクロアルキニル基、(6.1.0]非-4-イン-9-イル基、内部炭素-炭素二重結合を含むアルケニル基、シクロアルケニル基、テトラジニル基、アジド基、ホスフィン基、ニトロンオキシド基、ニトロンイミン基、ニトリルイミン基、ジアゾ基、ケトン基、(O-アルキル)ヒドロキシルアミノ基、ヒドラジン基、ハロゲン化N-マレイミジル基、1,1-ビス(スルホニルメチル)メチルカルボニル基またはその脱離誘導体、ハロゲン化カルボニル基、またはアレナミド基であり、いくつかの態様において、反応性副成分は、シクロアルケン基、シクロアルキン基、または置換されていてもよい(ヘテロ)シクロアルキニル基を含む。
いくつかの実施形態において、化学物質Zは表3または表4から選択される。いくつかの実施形態において、化学物質Zは、以下のとおりである。
[化４７]
ここで、Sは、ヒトの幹細胞またはT細胞の細胞表面上で表現される抗原(例えば、システイン残基の-SHグループからの)に特別に結合する、抗原結合フラグメント、すなわち、抗原内に存在する反応性代替物を表す硫黄原子である。
いくつかの実施例では、L-Z'としてまとめられたリンカー反応性代替基体群は、それらの抗原結合フラグメントと接合する前に、構造を有する。
[化４８]
ここで、波線は細胞毒素(例えば、アマトキシンまたはその誘導体)への結合点を示す。このリンカー反応性代替体群L-Z'は、別に、N-beta-maleimidopropyl-Val-Ala-para-aminobenzyl (BMP-Val-Ala-PAB)と呼ばれることができる。
いくつかの実施形態では、L-Z-Abと同様に、リンカーLと化学物質Zは、その接合後、構造を有する。
[化４９]
ここで、Sは、ヒトの幹細胞またはT細胞の細胞表面上で表現される抗原(例えば、システイン残基の-SHグループからの)に特別に結合する、抗原結合フラグメント、すなわち、抗原内に存在する反応性代替物を表す硫黄原子である。リンカー末端の波線は、細胞毒素への結合点、例えば、アマトキシンまたはその派生物を示す。
いくつかの実施例では、L-Z'としてまとめられたリンカー反応性代替基体群は、それらの抗原結合フラグメントと接合する前に、構造を有する。
[化５０]
ここで、波線は細胞毒素(例えば、アマトキシンまたはその誘導体)への結合点を示す。
いくつかの実施形態では、L-Z-Abと同様に、リンカーLと化学物質Zは、その接合後、構造を有する。
[化５１]
ここで、Sは、ヒトの幹細胞またはT細胞の細胞表面上で表現される抗原(例えば、システイン残基の-SHグループからの)に特別に結合する、抗原結合フラグメント、すなわち、抗原内に存在する反応性代替物を表す硫黄原子である。リンカー末端の波線は、細胞毒素への結合点、例えば、アマトキシンまたはその派生物を示す。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるようなアマトキシンは、以下の式を有するリンカー反応性部分-L-Z'にコンジュゲートされる。
[化５２]
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるようなアマトキシンは、以下の式を有するリンカー反応性部分-L-Z'にコンジュゲートされる。
[化５３]
上述のリンカモイテイ及びアマトキシンリンク剤は、特にここに記載された組成物及び方法と関連して有用であるが、例えば、米国特許出願公報第2015/0218220号及び特許出願第WO2017/149077号に記載されている。これらは、ここにその全体として参考文献に含まれている。
1つの側面において、アマトキシンまたはその派生物としてここに開示されるADCの細胞毒素。いくつかの実施形態において、アマトキシンは、式(III)、(IIIa)、(IIIb)、又は(IIIc)のいずれかで表される。当業者であれば、このようなアマトキシンは、リンカーへの付着点のための多数の可能性を提示することを認識するであろう(例えば、R9を通して可変R1によって示される位置のいずれかで)。
例えば、ここに記載されている抗原結合フラグメント、又は抗原結合フラグメントは、Abが自己、又はその抗原結合フラグメントであるAb-Z-L-Amに代表される接合体を形成するために、アマトキシンに結合してもよい。Lはリンカーであり、Zは化学潤滑剤であり、Amはアマトキシンである。いくつかの実施形態において、Ab-Z-L-Amは構造式(I)で表される。
[化５４]
記
Q は-S-, -S(O)-, または-SO2 -;
R1はH、OH、ORA、またはORD;
R2はH、OH、ORB、またはORD;
RA とRBは、もし存在するなら、それらが結合している酸素と結合して、任意に置換された5-族のヘテロシクロアルキル基を形成する。
R3はH、RC、またはRD;
R4はH、OH、ORC, ORD, RC、またはRD;
R5はH、OH、ORC, ORD, RC、またはRD;
R6はH、OH、ORC, ORD, RC、またはRD;
R7はH、OH、ORC, ORD, RC、またはRD;
R8はOH、NH2, ORC, ORD, NHRD、またはNRC RD;
R9はH、OH、ORC、またはORD;
R Cは、C 1 -C 6的なアーキテクル、C 1-C 6的なアルケニール、C 2 -C 6的なアルキニール、ヘテロアルキニール、C 1 -C 6的なアルキニール、ヘテロアルキニール、C 2 -C 6的なアルキニール、ヘテロアルキニール、C 2 -C 6的なアルキニール、ヘテロアルキニール、C 2 -C 6、またはヘテロアルキニールを、アルキニール、アルキニール、シクロアルキ、アルキニール、アルキアリール、ヘテロアルキニール、アルキニール、アルキニール、ミノアリール、アサイロ、アサイロアルカミノ、アルカノシル、アルカノニル、アルカムネート、C 2 -C 6、アルファベイル、スルホニル、アルカニール、アルカニール、アルカニール、アルファジー、カノミノ、シアノ、キャプトからなる群から独立して1～5個の代替物で代替することができる。およびアリールは、-L-Z-Abであり、ここで、L、Z、およびAbは、本明細書に開示されるとおりである。
いくつかの実施形態において、式IのADCは正確に1つのRDな置換体を含む。
いくつかの実施形態では、式(I)のADCは式(Ia)で表される。
[化５５]
ここで、Q、R1 -R9, RA, RB, RC、およびRDの各々は、公式(I)に対して先に定義されたとおりである。
いくつかの実施形態において、式(Ia)のADCは、正確に1つのRDな置換体を含む。
いくつかの実施形態では、式(I)のADCは式(Ib)で表される。
[化５６]
ここで、Q、R1 -R9, RA, RB, RC、およびRDの各々は、公式(I)に対して先に定義されたとおりである。
いくつかの実施形態において、式(Ib)のADCは、正確に1つのRD置換体を含む。
いくつかの実施形態において、ADCは、(I)、(Ia)、又は(Ib)によって表される。
RA とRBが存在する場合、それらがバインドされているアトムと一緒に結合して形成される。
[化５７]
記
Yは-(C=O)-, -(C=S)-, -(C=NRE)-,またはCRERE’;およびREおよびRE’は、それぞれ独立にH、C1 -C6アルキレン-RD, C1 -C6アルキレンから選択され、ヘテロアルキレン-RD, C2 -C6アルキニーレン-RD, C2-C6ヘテロアルキニレン-RD、シクロアルキレン-RD、ヘテロシクロアルキレン-RD、アリレン-RD、ヘテロアルレン-RDである。
前記C 1 -C 6アルキレン、C 1 -C 6ヘテロアルキレン、C 2-C 6アルケニレン、C 2 -C 6ヘテロアルキニレン、ヘテロアルキニレン、C 2 -C 6ヘテロアルキニレン、シクロアルキニレン、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンの各々は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルカリ、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルフィニル、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、およびニトロからなる群からそれぞれ独立に選択される1～5個の置換基で任意に置換される。
いくつかの実施形態において、ADCは、(I)、(Ia)、又は(Ib)によって表される。
R1はH、OH、ORA、またはORD;
R2はH、OH、ORB、またはORD;
RA とRBが存在する場合、それらがバインドされているアトムと一緒に結合して形成される。
[化５８]
R3はH、RC、またはRD;
R4はH、OH、ORC, ORD, RC、またはRD;
R5はH、OH、ORC, ORD, RC、またはRD;
R6はH、OH、ORC, ORD, RC、またはRD;
R7はH、OH、ORC, ORD, RC、またはRD;
R8 はOH、NH2, ORD、またはNHRD で、R9 はH またはOH である。
いくつかの実施形態において、ADCは、(I)、(Ia)、又は(Ib)によって表される。
R1はH、OH、ORA、またはORD;
R2はH、OH、ORB、またはORD;
RA とRBが存在する場合、それらがバインドされているアトムと一緒に結合して形成される。
[化５９]
R3がHまたはRD;
R4とR5はそれぞれ個別にH、OH、ORC, RD、またはORD;
R6とR7はそれぞれH;
R8 はOH、NH2, ORD、またはNHRD で、R9 はH またはOH である。
いくつかの実施形態において、ADCは、(I)、(Ia)、又は(Ib)によって表される。
R1はH、OH、またはORA;
R2はH、OH、またはORB;
RA とRBが存在する場合、それらがバインドされているアトムと一緒に結合して形成される。
[化６０]
R3, R4, R6、およびR7はそれぞれH;
R5がORD;
R8 はOH またはNH2 で、R9 はH またはOH である。
このようなアマトキシン活用上記は、例えば、特許出願公開第2016/0002298号に記載されているが、この開示は、その全体としてここに参考文献に含まれる。
いくつかの実施形態において、ADCは、(I)、(Ia)、又は(Ib)によって表される。
R1とR2 はそれぞれ独立してHまたはOHである。R3がRD;
R4, R6、およびR7はそれぞれH;
R5は、H、OH、またはOC1-C6のバイトである。
R8 はOH またはNH2 で、R9 はH またはOH である。
上記アマトキシン共役は、例えば、米国特許出願公開第2014/0294865号に記載されており、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、ADCは、(I)、(Ia)、又は(Ib)によって表される。
R1とR2はそれぞれ独立してHまたはOHである。
R3, R6、およびR7はそれぞれH;
R4とR5はそれぞれ個別にH、OH、ORD、またはRD;
R8 はOH またはNH2 で、R9 はH またはOH である。
上記アマトキシン共役は、例えば、米国特許出願公開第2015/0218220号に記載されており、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、ADCは、(I)、(Ia)、又は(Ib)によって表される。
R1とR2はそれぞれ独立してHまたはOHである。
R3, R6、およびR7はそれぞれH;
R4とR5はそれぞれ独立してHまたはOHである;
R8 はOH、NH2, ORD、またはNHRD で、R9 はH またはOH である。
上記アマトキシン共役は、例えば、米国特許番号に記載されている。9,233,173 そして9,399,681、および米国2016/0089450では、各開示が参考文献全体としてここに組み込まれている。
いくつかの実施形態において、ADCは、(I)、(Ia)、又は(Ib)によって表される。
R1とR2はそれぞれOH;
R3, R4,R6、およびR7はそれぞれH;R5がORD;
R8 はNH2 で、R9 はOH である。
いくつかの実施形態において、ADCは、(I)、(Ia)、又は(Ib)によって表される。
R1とR2はそれぞれ独立してHまたはOHである。
R3, R6、およびR7はそれぞれH;R4とR5はそれぞれ独立してHまたはOHである;
R8 はORD、またはNHRD ; で、R9 はH またはOH である。
いくつかの実施形態において、リンカーLは、ヒドラジン、ジスルフィド、チオエーテル、アミノ酸、最大10個のアミノ酸からなるペプチド、p-アミノベンジル(PAB)基、複素環式自己不溶性基、C 1 -C 6 アルキル、C 1 -C 6ヘテロアルキル、C 2-C 6アルケニル、C 2 -C 6 ヘテロアルケニル、C 2 -C 6 アルキニル、C 2-C 6 ヘテロアルキニル、C 3 -C 6 シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、-(C=O)基、-C(O)NH基、-OC(O)NH基、-(CH 2 CH 2 O)pが1-6の整数である-基、または溶解性増強基のうちの1つまたは複数を含む。
ここで、各々のC 1-C 6 アルキル、C 1 -C 6ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2-C 6 ヘテロアルケニル、C 2 -C 6 ヘテロアルキニル、C 2 -C 6 ヘテロアルキニル、C 3-C 6 シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアルキニル、C 3-C 6 シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルカリ、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルフィニル、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、およびニトロからなる群から各々独立に選択される、1～5個の置換いくつかの実施形態において、それぞれのC 1 -C 6 アルキル、C 1-C 6ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6 ヘテロアルケニル、C 2-C 6 アルキニル、C 2 -C 6 ヘテロアルキニル、C 3 -C 6 シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、場合により、O、SおよびNから選択される1つ以上のヘテロ原子によって中断され得る。
いくつかの実施形態において、C 1-C 6 アルキル、C 1 -C 6アルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2-C 6 アルケニル、ヘテロアルケニル、C 2 -C 6 アルキニル、ヘテロアルキル、C 3 -C 6 シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、O、Sから選択される1つ以上のヘテロ原子によって任意に中断され、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルカリアルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アミノ、アシル、アシルオキシ、アシルアミノカルボニル、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルホニル、ヒドロキシル、スルホニル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、およびニトロからなる群より独立して選択される1つまたは5つの置換基で任意に置換され得る。
いくつかの実施形態において、リンカーは、p-aminobenzyl基(PAB)を含む。ある実施形態では、p-アミノベンジル基は、リンカー内の部位トキシック薬物とプロテアーゼ切断部位の間に処分される。1つの実施形態において、p-アミノベンジル基はp-アミノベンジルオキシカルボニル単位の一部である。一実施の形態では、p-aminobenzyl基は、p-aminobenzylamido単位の一部である。
いくつかの実施形態において、リンカーは、Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Ala、Phe-Cit、Val-Ala、Val-Cit、およびVal-Argからなるグループから選ばれたペプチドからなる。
いくつかの実施形態において、リンカーは、PAB、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、又はAl
いくつかの実施形態において、リンカーは、ペプチド、オリゴ糖化, -(CH2)p-, -(CH2 CH2 O)p -, -(C=O)(CH2)p-,PAB、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、又はAla-PABの1つ以上を含み、Pは1-6の整数である。
幾つかの実施例において、リンカーは、次の公式で表されるPAB-Ala-Val-プロピオニールを含む。
[化６１]
いくつかの実施形態において、リンカーは、次の公式で表されるPAB-Cit-Val-プロピオニールを含む。
[化６２]
いくつかの実施形態において、化学物質Zは表3または表4から選択される。いくつかの実施形態において、化学物質Zは、以下のとおりである。
[化６３]
ここで、Sは、ヒトの幹細胞またはT細胞の細胞表面上で表現される抗原(例えば、システイン残基の-SHグループからの)に特別に結合する、抗原結合フラグメント、すなわち、抗原内に存在する反応性代替物を表す硫黄原子である。いくつかの実施例では、L-Z'としてまとめられたリンカー反応性代替基体群は、それらの抗原結合フラグメントと接合する前に、構造を有する。
[化６４]
いくつかの実施形態では、L-Z-Abと同様に、リンカーLと化学物質Zは、その接合後、構造を有する。
[化６５]
ここで、Sは、ヒトの幹細胞またはT細胞の細胞表面上で表現される抗原(例えば、システイン残基の-SHグループからの)に特別に結合する、抗原結合フラグメント、すなわち、抗原内に存在する反応性代替物を表す硫黄原子である。
いくつかの実施形態において、リンカーは、-(CH2)n-ユニットを含む。ここで、nは、2-6からの整数である。いくつかの実施形態において、リンカーは、-(CH2)nを含む。ここで、nは6である。いくつかの実施形態において、リンカーは、-(CH2)n-ここで、nは、公式によって表される6である。
[化６６]
いくつかの実施例では、L-Z'としてまとめられたリンカー反応性代替基体群は、それらの抗原結合フラグメントと接合する前に、構造を有する。
[化６７]
いくつかの実施形態では、L-Z-Abと同様に、リンカーLと化学物質Zは、その接合
後、構造を有する。
[化６８]
ここで、Sは、ヒトの幹細胞またはT細胞の細胞表面上で表現される抗原(例えば、システイン残基の-SHグループからの)に特別に結合する、抗原結合フラグメント、すなわち、抗原内に存在する反応性代替物を表す硫黄原子である。
特に、式(I)のADCは、以下の構造の1つを有する。
[化６９]
特に、公式(Ia)のADCは、以下の構造の1つを有する。
[化７０]
特に、式(Ib)のADCは、以下の構造の1つを有する。
[化７１]
抗体-薬物結合体の調製
式(I)、(Ia)または(Ib)のいずれかのADCのような、本明細書に開示される式Ab-(Z-L-Cy)nのADCにおいて、抗体またはその抗原結合フラグメント(Ab)は、本明細書に開示されるようなリンカーLおよび化学部分Zを介して、1つ以上の細胞毒性薬物部分(Cy;例えば、アマトキシン)、例えば、抗体あたり約1～約20の細胞毒性部分にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、nは1である。
本開示のADCは、本技術者に知られている有機化学反応、条件、及び試薬を用いて、いくつかの経路によって作成され得る。例えば、(1)上記に記載されているように、Ab-Z-Lを形成するための二価リンカー試薬を用いて、Ab-Z-Lを形成するための反応性の代替物又はその抗原結合フラグメントを反応させ、それに続いて、(2)Cy-L-Z'を形成するための二価リンカー試薬を用いて、サイトトキシックな代替物を反応させ、続いて、本項に記載されているように、Ab-(Z-L-Cy n)のADCを形成するための反応性の代替物又は抗原結合フラグメントを反応させる。ADCを準備するための追加の方法をここに述べる。
一実施の形態では、それらの抗原結合フラグメントは、1つ以上のスルフハイドリル基を有するように化学的に改変することができる1つ以上の炭水化物グループを有することができる。次いで、ADCは、本明細書中上記のように、スルフヒドリル基の硫黄原子を通る共役によって形成される。
別の実施形態では、本抗体は、アルデハイド(-CHO)グループを提供するために酸化することができる1つ以上の炭水化物グループを有することができる(例えば、Laguzza, et al., J. Med. Chem. 1989, 32(3), 548-55を参照)。次いで、ADCは、本明細書中上記のように、対応するアルデヒドを通る共役によって形成される。細胞毒素の付着または結合のためのタンパク質の改変のための他のプロトコールはColiganら、現在のタンパク質サイエンスのプロトコール、volに記載されている。2, John Wiley & Sons (2002)は、ここに参考文献として含んでいる。
例えば、米国特許には、電池を標的としたタンパク質(例えば、抗物質、イムグロブリン、又はそのフラグメント)へのリンカードラッグ・モイテイの活用法が発見されている。No.5,208,020;米国特許。No. 6,441,163; WO2005037992; WO2005081711; およびWO2006/034488は、これらすべてを引用文献全体に明示的に組み入れたものである。
別の方法として、例えば、組換え技術またはペプチド合成により、抗菌剤とサイトトキシク剤からなる融合タンパク質を作ることができる。DNAの長さは、結合体の2つの部分をコードするそれぞれの領域を、互いに隣接するか、または結合体の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離されてもよい。
医薬組成物
ここに記載されるADCは、様々な量の形態で、患者(例えば、感染症またはガンに苦しむ人)に管理することができる。例えば、ここに記載されるADCは、1種以上の薬事的に受け入れられる補助剤を含む水性液体のような水性液体の形成で、病気またはガンに苦しむ患者に与えられる。本明細書中に記載される組成物および方法と共に使用するための適切な薬学的に許容される賦形剤は、粘度改変剤を含む。水溶液は、既知の技術を用いて殺菌することができる。
本明細書に記載されるようなADCを含む医薬製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、このようなADCを1つ以上の任意の薬学的に許容可能な担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))と混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液;酸化防止(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライドなど;塩化ベンザルコニウム;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール; 3-ペンタノール;およびm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン);親水性ポリマー(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、またはリジン);単糖、二糖類を含むが、これらに限定されない およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖;ナトリウムのような塩を形成する対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質複合体);および/または非イオン性界面活性剤 ポリエチレングリコール(PEG)など。
投与経路および投与法
抗体薬物結合体(ADC)投与
本書に記載されているアンチボディまたは抗原結合フラグメントは、様々な量の形態で患者(例えば、ガンに苦しむ人、自己感染症に苦しむ人、あるいは血液細胞移植治療を必要とする人)に施術することができる。例えば、ここに記載されている抗毒物又は抗原結合フラグメントは、ガンに苦しむ患者、自治病に苦しむ患者、又は血液細胞移植治療を必要とする患者に、1種以上の薬事的に許容可能な補助剤を含む水性液体のような水性液体の形成で施すことができる。本明細書中に記載される組成物および方法と共に使用するための薬学的に許容される賦形剤は、粘度-変性剤を含む。水溶液は、既知の技術を用いて殺菌することができる。
ここに記載されるように、防CD117または防CD45防物質およびADCからなる製剤は、上記防CDCまたはADCを、1つ以上の任意の薬事的に薬学的に許容可能な担体(レミントンの薬事科学第16版、Osol, A. Ed. (1980)))と、凍結剤または水性ソリューションの形で混合して調製する。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液;酸化防止(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライドなど;塩化ベンザルコニウム;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール; 3-ペンタノール;およびm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン);親水性ポリマー(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、またはリジン);単糖、二糖類を含むが、これらに限定されない およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖;ナトリウムのような塩を形成する対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質複合体);および/または非イオン性界面活性剤 ポリエチレングリコール(PEG)など。
本書に記載されている抗生物質及び抗原結合フラグメントは、口頭、経皮下、皮下、鼻内、静脈、筋肉中、眼内、親戚のような様々な経路によって管理され得る。任意の所与の場合における投与のための最も適切な経路は、投与される特定の抗体、または抗原結合フラグメント、患者、医薬製剤方法、投与方法(例えば、投与時間および投与経路)、患者の年齢、体重、性別、治療される疾患の重症度、患者の食事、および患者の排泄速度に依存する。
ここに記載されている抗CD117又は抗CD45結合物、すなわち抗抗抗抗原結合フラグメントの有効量は、例えば、シングル(ボーラス)の行政、複数の行政、又は継続的な行政において約0.001から約100kg/kgの体重、又は、又は、最適な血清濃度(例えば、0.0001-5000mm/mlの血清濃度)、又はそれらの原結合フラグメントを達成することができる。1日に1回以上(例:2～10回)、週に1回、月に1回以上、ガン、自己感染症、血液細胞移植の準備のためのコンディショニングセラピーなどに苦しむ被検者(例:ヒト)に治療を行う。
血液細胞移植前の調整手順の場合には、血液細胞移植前の調整手順の場合、例えば、1時間から約1時間、約1時間、約2時間、約3時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約15時間、約15時間、約16時間、約18時間、約19時間、約20時間、約22時間、約24時間、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日 移植する。
ここに開示される方法を用いれば、当業者は、遺伝子改良型の血液細胞移植治療を必要とする人の患者に、例えばCD117(例えば、GNK+ CD117を結合する抗原結合フラグメント)またはCD45(例えば、GNK+ CD117を結合する抗原結合フラグメント)を結合するように、数学的幹細胞によって表現される抗原を結合することができる、抗CD117または抗原結合フラグメント、ADCまたは抗CD45を管理することができる。この様式において、内因性造血幹細胞の集団は、造血幹細胞移植片の生着を促進するように、遺伝子的に改変された造血幹細胞移植片の投与前に枯渇させることができる。
上記のように、抗体は、本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の細胞傷害性分子などの毒素に共有結合的に結合され得る。例えば、抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメント(抗GNK+ CD117抗体またはその抗原結合フラグメントなど)または抗CD45抗体またはその抗原結合フラグメントは、シュードモナス外毒素A、デボウガニン、ジフテリア毒素、アマトキシン、例えばγ-アマニチン、α-アマニチン、サポリン、メイタンシン、メイタンシノイド、アウリスタチン、アントラサイクリン、カリケアマイシン、イリノテカン、SN-38、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ピロロロベンゾジアゼピン二量体、インドリノベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、またはそれらの変異体などの細胞毒素に共有結合的に結合させることができる。この共役は、本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の共有結合形成技術を使用して行うことができる。その後、患者に遺伝子改良された数学的幹細胞(例えば、自生細胞、シナジェニック、あるいは異性数学的幹細胞)を移植する前に、例えば、静脈内投与によって、当該患者に、抗原結合フラグメント、又は薬物-抗菌共役を用いることができる。
抗CD117(例:Anti-GNK+ CD117)又は抗CD45(例:Anti-CD45)又はその抗原結合フラグメント、又はそれらの反抗性血液細胞の量を、例えば、血液細胞移植治療の前に、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%以上減少させるのに十分な量で管理することができる。血液細胞数の低下は、例えば、コンディショニング・セラピーの間、様々な間隔で患者から引き出された血液試料中に特徴的な血液細胞表面抗原を表現する細胞のFACS分析によって、この技術に知られている通常の技法を用いてモニターすることができる。
例えば、当業者は、コンディショニング・療法の間の様々な時点で患者から血液試料を引き出すことができ、また、FACS分析を実施することにより、血液細胞マーカー抗原に結合する抗薬を用いて、試料中の血液幹細胞の相対濃度を解明することにより、内生の血液細胞減少の程度を決定することができる。幾つかの実施例によれば、抗CD117(例:Anti-GNK+ CD117)又は抗CD45(例:Anti-CD45)によるコンディショニングセラピー、又はその抗原結合断片、又はそれらの抗原結合剤に対するコンディショニングセラピーに対して、血液細胞細胞の濃度が最低値に達した場合、医師はコンディショニングセラピーを結論付け、患者の血液細胞移植セラピーの準備を開始することができる。
抗CD117(例えば、抗GNK+ CD117)又は抗CD45(抗抗CD45)の抗原結合フラグメント剤は、粘度改良剤のような1つ以上の薬事的に受け入れられる補助剤を含む水性液中で、患者に使用することができる。水溶液は、本技術に記載された、又は本技術に知られている技術を用いて殺菌することができる。患者に血液細胞投与を行う前に、例えば、0.001ag/kgから100mm/kgまでの量で、患者に、抗原結合フラグメント、又はそれらの抗原共役を管理することができる。抗体、その抗原結合フラグメントまたは薬物-抗体結合体は、遺伝子組み換え造血幹細胞の生着を最適に促進する時点で、例えば、遺伝子組み換え造血幹細胞の投与前に、約1時間～約1週間(例えば、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、約24時間、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、または約7日)以上、患者に投与することができる。
遺伝子組換え幹細胞投与
前処置療法の終了後、患者は、次に、前処置療法を実施した同一の医師または異なる医師からのような、遺伝子組換え造血幹細胞の注入(例えば、静脈内注入)を受けることができる。医師は、例えば、1×103から1×109の造血幹細胞/kgまでの量で、自己、シナジェニック、あるいは異種遺伝子に改良された遺伝子造血幹細胞を患者に注入することができる。いくつかの実施形態において、医師は、遺伝子組み換えHSCsを約1 x 103、3 約2 x 103、3 約4 x 103、3 約5 x 106、3 約107、3 x 107、4 約108、3 約109、3 約109、4 約109、4 約109、5 約106、3 約103、4 約4 x 103、4約4 x 103、4 約4 x 105、4 約10、5 約5 x 106、5 約107、3 約107、4 約108、5 約109、6 約1 x 101、6 約2 x 103、5 7 x 103、約1、8 x 103、約4、6 x 103、約4、7 x 103、5 x 107、6x 107、約108、4 x 109、7109、約1 9 x 102、5 x 103、約103、8 x 103、約4 9、6 x 104、7 x 105、約5、6 x 106、7x 107、5 x 107、6 x 108、5 約109、8 約1 x 109、8 約2 x 10、6 約2 x 103、6 約4 x 10、8 約5 x 10、7 約6、8 約7 x 107、約8いくつかの実施形態において、医師は、約1×103 ～約1×108 HSCs/kgの量で遺伝子改良HSCsを患者に注入することができる。いくつかの実施形態において、医師は、約1×103 ～約1×107 HSCs/kgの量で遺伝子改良HSCsを患者に注入することができる。いくつかの実施形態において、医師は、約1×103 ～約1×106 HSCs/kgの量で遺伝子改良HSCsを患者に注入することができる。いくつかの実施形態において、医師は、約1×103 ～約1×105 HSCs/kgの量で遺伝子改良HSCsを患者に注入することができる。
いくつかの実施形態において、医師は、約1×104 ～約1×108 HSCs/kgの量で遺伝子改良HSCsを患者に注入することができる。いくつかの実施形態において、医師は、約1×105 ～約1×108 HSCs/kgの量で遺伝子改良HSCsを患者に注入することができる。いくつかの実施形態において、医師は、約1×106 ～約1×108 HSCs/kgの量で遺伝子改良HSCsを患者に注入することができる。
医師は、例えば、患者から血液サンプルを採取し、移植の投与後に造血幹細胞または造血系列の細胞(巨核球、血小板、血小板、赤血球、マスト細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、ミクログリア、顆粒球、単球、破骨細胞、抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Tリンパ球、およびBリンパ球など)の濃度の増加を測定することによって、遺伝子組換え造血幹細胞移植の生着を監視することができる。この分析は、例えば、1時間から6時間以上、あるいはそれ以上の方法で行うことができる。
たとえば、遺伝子組み換え血液細胞移植治療(例、1時間から6時間、3時間、約3時間、約5時間、約6時間、約9時間、約8時間、約12時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約20時間、約21時間、約22時間、約24時間、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約2週間、約3週間、約3週間、約4週間、約4週間、約5週間、約5週間、約6週間、約7週間、約8週間、約9週間、約10週間、約11週間、約12週間、約13週間 1週間～24週間、1日間～1週間、1日間～2週間、1日間～6ヶ月、1週間～1週間、約15週間、約18週間、約22週間、約22週間、約24週～それ以上、1週間～1週間、約24週間、約1日～約24週間、約1日～約24週間、約1日～約6ヶ月、約1日～約5ヶ月、約1日～3ヶ月、約1日～約2ヶ月、約1日～約1ヶ月、約1ヶ月～上述の時間を包含する範囲、例えば約4週間もここに考慮される。造血幹細胞または造血系列の細胞の濃度が、移植療法前の対応する細胞型の濃度と比較して、移植療法後に増加したという知見(例えば、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約20%、約30%、約40%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約200%、約500%、またはそれ以上;約1%～約500%、約5%～約250%、約10%～約100%、約15%～約200%、約20%～約200%、約30%～約300%、約1%～約100%)は、抗CD117(例えば、 抗GNNK+ CD117)または抗CD45抗体、その抗原結合フラグメント、または薬物-抗体結合体(ADC)は、移植された遺伝子組み換え造血幹細胞移植片の生着を成功裏に促進した。上述の割合を含む範囲、例えば約10%もここに考慮される。いくつかの実施形態において、接ぎ木を成功させるには、変化した遺伝子配列の存在を検出することができる。例えば、鎌状赤血球症の治療において、修正されたHBB遺伝子配列の存在を検出することによって生着を決定することができる。
実施例
以下の実施例は、ここに記載された組成物及び方法がどのように使用され、作られ、評価され、本開示の純粋に模範的なものであることを意図し、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図したものではないことを、当業者に提供するために、提示されている。
実施例1.in vitro細胞死滅アッセイを用いた抗CD117抗体結合体の分析
明細書されている種々の抗生物質は、さらに、PCT/US2018/057172、US 2019/0144558、US 2019/0153114、およびPCT/US2018/057185に記載されているように特徴づけられており、それらのエントリーに含まれる。
10個の抗CD117ヒトIgG1抗体の全IgGを毒素(サポリン)にコンジュゲートした抗ヒトFabと共にプレインキュベートし、各種抗体がin vitroでKasumi‐1細胞(ATCC No.CRL‐2724)を殺す能力を試験した。セルキリングアッセイの後、細胞毒のレベルが定量化された。
霞‐1細胞を用いた体内殺菌法では、ATCCガイドラインに従って霞‐1細胞を育成した。より具体的には、Kasumi‐1細胞をCD117‐ADCまたは陽性対照抗体(CK6;アンタゴニスト抗体)の存在下で3日間培養した。細胞生存性はCelltiter Gloによって測定された。
図で説明した結果。1Aと1Bは、種々のIgG:Fab‐saporin複合体の各々が、in vitroでCD117を表現する細胞(すなわち霞‐1細胞)を殺すのに効果があり、複合体が内部化されたことを示している。図2は、霞-1電池殺害アッセイの定量化を示している。以下の表5は、霞-1電池殺菌法のこの定量化に関する追加データである。霞‐1細胞はSCF依存ではないので、SCF不在時にKasumi‐1細胞殺害アッセイを行った。したがって、試験された抗生物質のアンタゴニスト/中性特性は、SCF依存電池殺害アッセイ(PCT/US2018/057172に記載されており、その全体に参考文献として組み込まれている)のように明らかではなかった。特に、SCF依存電池殺害アッセイでアンタゴニストとして同定された抗物質は、Kasumi-1アッセイでより高い殺人レベルを示し、例えば、Ab55(アンタゴニスト)のAUC値とAb67(中性)を比較した。
[表５]
例2:抗CD117 ADCの単回投与は、初代ヒトおよびNHP CD34+細胞に対して強力であり、HSCに対して選択的である。
ヒトおよび非ヒト霊長類(NHP) HSC(すなわち、分離された一次ヒトおよびNHP CD34+選択骨髄細胞(BMC))を用いて、体内殺菌法を行った。ヒトCD34+ BMCおよびNHP CD34+ BMCを、抗CD117-ADCまたは制御(すなわち、ヒトアイソタイプまたはNHPアイソタイプ)で6日間培養した。可動CD34+電池をフローサイトメトリーで評価した(データは示されていない)。
抗CD117 ADCは、ヒトおよびNHP CD34+細胞のいずれにも、ビトロでそれぞれ0.2pMと0.1 pMのEC50で有効である(図3)。このことは、CD117を標的としたデータでは示されていないが、遺伝子治療を可能にするには、ブスフラン調整後に観察されたHSPCの減少に匹敵する血液細胞および前駆細胞の減少が十分であることを示している(6ag/kg/day x 4)。
抗CD117 ADCの有効性と忍容性を、アカゲザル霊長類で評価した。アカゲザルに1回のCD117-ADCの注射を行い、フロー・サイトメトリーを用いて分析した結果を示した(図4)。データは、CD117-ADCの単回投与が、投与の7日後に、骨髄において有意なCD34+細胞およびコロニー形成細胞枯渇をもたらすことを実証した(図5)。また、リンパ球コンパートメントは維持されており(図4)、抗CD117 ADCの特異性が示された。
HSCTでの使用を容易にするために、アンチCD117 ADCは迅速なクリアランス(t1/2=約10時間)を持つように設計された。図6に示すように、ADCレベルは投与後48時間後にELISA検出限界値の下限値を下回って減少し、モデル化された薬理学では、投与後5日後にADCが後トキシック濃度以下であることが示された(図6)。
まとめると、これらのデータは、抗CD117 ADCが完全に骨髄破壊的であり、in vivoでRhesus HSCを強固に枯渇させることを示した。リンパ球に対する抗CD117 ADCの実質的な効果は観察されなかった。これらの結果は、防CD117 ADCが良好な安全性プロフィールを持ち、耐性システムを予備し、接木の最適なタイミングを可能にするために迅速にクリアされることを示した。
例3:抗CD117 ADC単回用量により非ヒト霊長類における自家遺伝子改変造血幹細胞移植(遺伝子治療)が可能になる
防CD117 ADCが(化学療法または放射線の必要なしに)自家HSCに基づく遺伝子治療を可能にするのに十分であるかどうかを決定するために、ベータ-グロビン形質導入CD34+細胞の生着を、防CD117 ADCの単回投与後に2匹のアカゲザル動物で評価した。この例のADCで使用されている抗CD117型は、Ab85LA/S239C/H435Aの速い半減期変形例であり、S239C突然異を介してPBDに結合される。
アフェレーシス前に2頭のアカゲザルに顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF, 20mcg/kg/day x 5)とプレリキサフォー(G-CSF 5日目に1mg/kg)を動員した(図7)。単離したCD34+細胞にβ-グロビン遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを導入し、凍結保存した(図7)。防CD117 ADCは、第-6日(0.2ag/kg IV)に供試され、クライオプレザーブ遺伝子改良電池は、0日に解凍し、注入された(3.3 x 6 CD34 + セル/kg)(すなわち、電池は、反CD117 ADCを1回服用した後、6日後に同じ動物に再び移植された。図7A参照)。抗CD117 ADC条件動物は、ADC投与から10日後に好中球減少症となった(図8)。8日目と10日目に好中球(図8)、10日目と11日目に血小板(図9)が回復したが、リンパ球は移植を通して維持された(図10)。これらのデータは、8日目および10日目に好中球を、10日目および15日目に血小板を回収したブスルファン条件付け動物と同等である。ブスルファンも同様に非リンパアブレーションである。結果は表6にも記載されている。
[表６]
抗CD117-ADC調整動物に用いた形質導入CD34+細胞の周顆粒球ベクターコピー数(VCN)を測定したところ、ブスルファン調整動物に用いた細胞のVCNと比較して低いことがわかった(表7)。
[表７]
しかし、抗CD117-ADC調整動物に用いた形質導入CD34+細胞の末梢顆粒球VCNは、経時的に安定しており、ブスルファン調整動物で観察されたものと同じ範囲であった(図11の遮光領域参照)。これらの結果は、CD117‐ADCによるコンディショニングが、完全骨髄破壊的ブスルファンと同レベルで遺伝子改変HSCの生着を可能にするのに十分であったことを示す。
これらの検討の利点は、CD117-ADCが十分に許容されたことである。動物は正常に食事を摂ることが観察され、胃腸スチナール(GI)の副作用は観察されなかった(表8)。これは、食欲不振(粘膜炎による)、体重減少、および下痢が認められたブスルファンで治療された動物とは対照的である。肝臓の血清化学的変化は観察されなかった(例えば、図12参照。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)アラニンアミノトランスフェラーゼについては、正常範囲外のADC関連変化は観察されなかった)。また、ALT (データ示さず)、乳酸脱水素酵素(LDH;データ示さず)、Albumin(データ示さず)、Creatinine (Cr;データ示さず)、血中尿素窒素(BUN;データ示さず)、総ビリルビン(TBIL;データ示さず)、アルカリホスファターゼ(ALP;データ示さず)及びGlucose(データ示さず)について、正常範囲外のADC関連変化は認められず、観察可能な行動異常が全く認められなかったことと一致している。
[表８]
ここに示したデータは、NHP CD34+細胞に強力な活性を有する反CD117 ADCを実証した。この抗CD117-ADCは、NHPにおいて単回投与で完全に骨髄破壊的であり、良好な安全性プロファイルを有し、免疫系を免れ、適切なグラフト注入のタイミングを可能にするために迅速に除去される。自家遺伝子改変HSCTのアカゲザルモデルにおいて、抗CD117 ADCの単回投与は、遺伝子改変HSCの生着を可能にする。これらの研究は、移植前のターゲット血幹除去のための抗CD117 ADCの使用を検証し、自己遺伝子改変HSCTのための新しいコンディショニング剤としての使用を支持している。より安全な前処置のためのこのような標的アプローチは、幹細胞移植を受ける患者のリスクベネフィットプロファイルを改善し、より多くの患者が遺伝子治療を含むこれらの治癒可能な治療から利益を得ることを可能にするかもしれない。
[表９]
* Fc残渣はKabatらのEU指数に従って番号付けされている。
その他の実施形態
本明細書で言及されている全ての出版物、特許、特許出願は、各独立出版物又は特許出願が、引用により具体的かつ個別に組み込まれることを指摘されたかのように、ここに同程度の引用文献として組み込まれている。
本開示は、その特定の実施形態に関連して発明されてきたが、それはさらなる修正が可能であり、本出願は、本開示の原則に従い、また、本開示に関する既知の又は慣習的な実施からの逸脱を含む、本開示のあらゆるバリエーション、使用、又は、本開示の適応をカバーすることを意図していると理解される。本開示は、先にここに記載された本来の特徴に関連しており、上記、本請求の範囲に従うであろう本技術における本開示からの逸脱を含む。他の実施形態は、請求項の範囲内である。

Claims (43)

  1. 遺伝子組み換え血幹を、それを必要としている人間の被検者に行使する方法、すなわち、以下の方法で構成される。
    a)ヒト被検者には、血液性幹細胞(HSC)および/または/または、または/または自己細胞に表される細胞表面に結合し、それによってヒト被検者からHSCおよび/または/または自己細胞を消耗させる、および/または、b)遺伝子組み換え幹細胞の集団から成る移植をヒト被検者に施す、という(ADC)接合体(ADC)を与えている。
  2. 遺伝子改変された細胞でヒト被検者を処置する方法であって、遺伝子改変された幹細胞の集団を含む移植を、それを必要とするヒト被検者に投与することを含み、ヒト被検者が、造血幹細胞(HSC)および/または免疫細胞上に発現される細胞表面分子に結合する抗体-薬物結合体(ADC)を含む調整処置を受けた、方法。
  3. 遺伝子組み換え血幹が自発的血幹であるクレーム1又は2の方法。
  4. 遺伝子組み換え血幹が異性血幹であるクレーム1又は2の方法。
  5. 遺伝子組み換え血幹がHSCであるクレーム1又は2の方法。
  6. 被検者が、がん、異常ヘモグロビン症障害、骨髄異形成障害、免疫不全障害、または代謝障害を患っている、請求項1～5のいずれか一項記載の手法。
  7. 異常ヘモグロビン症障害が、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ファンコニ貧血、再生不良性貧血、またはヴィスコット-オールドリッチ症候群のいずれか1つ以上から選択される、請求項6記載の方法。
  8. 免疫不全障害が、先天性免疫不全症または後天性免疫不全症である、請求項6記載の方法。
  9. 後天性免疫不全症が、ヒト免疫不全ウイルスまたは後天性免疫不全症候群(AIDS)である、請求項6記載の方法。
  10. 代謝障害が、糖原病、ムコ多糖症、ゴーシェ病、ハーラーズ病、スフィンゴ脂質症、球様細胞白質萎縮症、または異染性白質ジストロフィーのいずれか1つまたは複数から選択される、請求項6記載の方法。
  11. 前記癌が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、または神経芽腫のいずれか1つ以上から選択される、請求項6に記載の方法。
  12. ガンが血学的ガンであることを示す請求項6の方法。
  13. 前記血液がんが、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、または多発性骨髄腫である、請求項12記載の方法。
  14. 被検者が、アデノシンデアミナーゼ欠損症、重度複合免疫不全症、高免疫グロブリンM症候群、チェディアック-東病、遺伝性リンパ組織球症、大理石骨病、骨形成不全症、蓄積症、サラセミアメジャー、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、または若年性関節リウマチのいずれか1つまたは複数から選択される障害を患っている、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
  15. 請求項1-5のうち、被検者が自己感染症に苦しんでいるもののいずれかの手法。
  16. 多発性硬化症、ヒト全身性ループス、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬の治療、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性卵巣炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、慢性疲労免疫不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、クローン病、瘢痕性類天疱瘡、疱疹状皮疹、寒冷凝集素症、デゴス病のいずれか1つ以上から自己免疫障害が選択される、請求項15記載の方法 円板状ループス、自律神経障害、本態性混合性クリオグロブリン血症、線維筋痛・線維筋炎、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、化膿性汗腺炎、特発性および/または急性血小板減少性紫斑病、特発性肺線維症、IgAニューロパチー、若年性関節炎、川崎病、扁平苔癬、 ライム病、メニエール病、混合性結合組織病、重症筋無力症、神経筋強直症、眼筋クローヌス症候群、視神経炎、オード甲状腺炎、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性軟骨炎、多発性筋炎・皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発腺性動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性無ガンマグロブリン血症、レイター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、硬直者症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、外陰部痛、慢性肉芽腫症、またはヴェゲナー肉芽腫症。
  17. 幹細胞の集団がターゲット遺伝子を変更するために遺伝子組み換えされている請求項1-16のいずれかの方法。
  18. ターゲット遺伝子が、ベータ-グロビン、γ-グロビン、アデノシンデアミナーゼ、アリールスルファターゼA、WASp遺伝子、食細胞NADPHオキシダーゼ、ガラトシルセラミダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、ベータ-ヘキソサミニダーゼ、アルファ-Lイズロニダーゼ、ATMセリン/トレオニンキナーゼ、リボソーム成熟タンパク質SBDS、またはCCR5の1つまたは複数から選択される、請求項17記載の方法。
  19. 遺伝子改良血幹の集団からなる移植が遺伝子編集システムを用いて改良された、請求項1-18のいずれかの手法。
  20. 遺伝子編集システムがCRISPR/Casシステムである記載の方法。
  21. CD2、CD7、CD15、CD22、CD30、CD34、CD36、CD42a、CD42c、CD43、CD45RA、CD45RC、CD45RO、CD49b、CD49e、CD49f、CD50、CD55、CD68、CD72、CD81、CD85A、CD90、CD104、CD105、CD109、CD111、CD114、CD117、CD123、CD126、CD130から選択される1つ以上の細胞表面分子をADCが結合する抗体または抗原結合フラグメントを含む、請求項1～20のいずれか一項記載の方法 CD131、CD135、CD138、CD151、CD157、CD164、CD168、CD172a、CD173、CD174、CD175、CD176、CD183、CD200、CD201、CD205、CD221, CD222, CD223, CD224, CD225, CD226, CD227, CD228, CD229, CD230, CD235a, CD235b, CD236, CD236R, CD238, CD240, CD242, CD243, CD277, CD292, CDw293, CD295, CD298, CD309, CD318, CD324, CD325, CD338, CD344, CD349、またはCD350。
  22. 請求項1-20のいずれかの手法で、ADCがCD117を結合する、それらの抗原結合フラグメントを含むもの。
  23. 請求項1-20のいずれかの手法。当該クレームは、ADCが被検者内のCD117+細胞の個体数を減少させるのに十分な量で管理される。
  24. 前記CD117がGNNK+ CD117である、請求項22に記載の方法。
  25. 請求項22の方法であって、当該反CD117の抗原結合フラグメントが構成されるもの、
    (a) SEQ ID NO: 31に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:32に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 33に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 34に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメインからなる軽鎖可変領域、及びSEQ ID NO:35に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、並びにSEQ ID NO: 36に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる重鎖可変領域
    (b) SEQ ID NO: 21に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:22に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 23に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 24に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメインからなる軽鎖可変領域、及びSEQ ID NO:25に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、並びにSEQ ID NO: 26に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる重鎖可変領域
    (c) SEQ ID NO: 41に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:42に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 43に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 44に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、及びSEQ ID NO:45に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、並びにSEQ ID NO: 46に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる重鎖可変領域
    (d) SEQ ID NO: 51に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:52に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 53に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 54に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、及びSEQ ID NO:55に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、並びにSEQ ID NO: 56に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる重鎖可変領域
    (e) SEQ ID NO: 61に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:62に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 63に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 64に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、及びSEQ ID NO:65に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、並びにSEQ ID NO: 66に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる重鎖可変領域
    (f) SEQ ID NO: 71に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:72に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 73に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 74に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメインからなる軽鎖可変領域、及びSEQ ID NO:75に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、並びにSEQ ID NO: 76に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる重鎖可変領域;
    (g) SEQ ID NO: 81に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:82に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、およびSEQ ID NO: 83に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 84に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:85に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、およびSEQ ID NO: 86に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる軽鎖可変領域
    (h) SEQ ID NO: 11に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:12に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、及びSEQ ID NO: 13に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 14に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメインからなる軽鎖可変領域、及びSEQ ID NO:15に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、並びにSEQ ID NO: 16に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる重鎖可変領域
    (i) SEQ ID NO: 91に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:92に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、およびSEQ ID NO: 93に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 94に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:95に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、およびSEQ ID NO: 96に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる軽鎖可変領域
    (j) SEQ ID NO: 101に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:102に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、およびSEQ ID NO: 103に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、並びにSEQ ID NO: 104に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:105に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、およびSEQ ID NO: 106に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる軽鎖可変領域
    (k) SEQ ID NO: 245に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメイン、SEQ ID NO:246に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、およびSEQ ID NO: 247に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメイン、ならびにSEQ ID NO: 248に示されたアミノ酸配列からなるCDR1ドメインからなる軽鎖可変領域、およびSEQ ID NO:249に示されたアミノ酸配列からなるCDR2ドメイン、ならびにSEQ ID NO: 250に示されたアミノ酸配列からなるCDR3ドメインからなる重鎖可変領域である。
  26. 請求項22の方法、つまり、抗CD117の、又は抗原結合断片は、SEQ ID NO: 127に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1領域、SEQ ID NO:128に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2領域、及びSEQ ID NO: 129に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3領域、並びにSEQ ID NO: 130に記載されたアミノ酸配列からなるCDR1領域、及びSEQ ID NO:131に記載されたアミノ酸配列からなるCDR2領域、並びにSEQ ID NO: 132に記載されたアミノ酸配列からなるCDR3領域を含んでいる。
  27. 請求項22の方法であって、当該反CD117の抗原結合フラグメントが構成されるもの：
    (a) 配列番号133に示されるアミノ酸配列を含むCDR1ドメイン、配列番号134に示されるアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン、および配列番号135に示されるアミノ酸配列を含むCDR3ドメインを含む重鎖可変領域ならびに配列番号136に示されるアミノ酸配列を含むCDR1ドメイン、配列番号137に示されるアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン、および配列番号138に示されるアミノ酸配列を含むCDR3ドメインを含む軽鎖可変領域または
    （b)配列番号139に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインと、配列番号140に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメインと、配列番号141に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメインとを含み、配列番号142に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインと、配列番号143に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメインと、配列番号144に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメインとを含む重鎖可変領域。
  28. 請求項22の方法であって、当該反CD117の抗原結合フラグメントが構成されるもの：
    (a) 問番号29に示されたアミノ酸配列と、問番号30に示されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む重鎖可変領域;
    (b) SEQ ID NO: 19に示されたアミノ酸配列と、SEQ ID NO: 20に示されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む重鎖可変領域;
    (c) 問番号39に示されたアミノ酸配列と、問番号40に示されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む重鎖可変領域;
    (d) SEQ ID NO: 49に記載されているアミノ酸配列と、SEQ ID NO: 50に記載されているアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む重鎖可変領域;
    (e) 問番号59に示されたアミノ酸配列と、問番号60に示されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む重鎖可変領域;
    (f) 問番号: 69に示されたアミノ酸配列と、問番号: 70に示されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む重鎖可変領域;
    (g) 問番号79に示されたアミノ酸配列と、問番号80に示されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む重鎖可変領域;
    (h) SEQ ID NO: 9に示されたアミノ酸配列と、SEQ ID NO: 10に示されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む重鎖可変領域;
    (i) SEQ ID NO: 89に示されたアミノ酸配列と、SEQ ID NO: 90に示されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む重鎖可変領域;
    (j) SEQ ID NO: 99に記載されているアミノ酸配列と、SEQ ID NO: 100に記載されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む重鎖可変領域、または
    (k) 配列番号243に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号244に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
  29. 抗CD117抗体またはその抗原結合フラグメントが、バイオ層干渉法(BLI)により測定して、1×10-2～1×10-3、1×10-3～1×10-4、1×10-5～1×10-6、1×10-6～1×10-7 または1×10～1×10-8の解離速度(KOFF)を有する、請求項22～28のいずれか一項記載の方法。
  30. 請求項22-28のいずれかの方法、当該請求項又は抗原結合フラグメントが、CD117と約100 nM以下、約90nM以下、約80 nM以下、約70 nM以下、約60 nM以下、約50 nM以下、約40 nM以下、約30 nM以下、約20 nM以下、約10 nM以下、約8 nM以下、約6 nM以下、約4 nM以下、約2 nM以下、約1 nM以下、Bio-Layer Interferometry (BLI)アッセイにより判定される約1 nM以下と結合するもの。
  31. 当該抗菌又は抗原結合フラグメントがヒトである請求項21-28のいずれかの方法。
  32. 請求項21-28のいずれかの方法であって、その抗原結合フラグメント又はその抗原結合フラグメントが無傷の抗原であること。
  33. 請求項21-28のいずれかの方法で、それらの抗原結合フラグメント又はそれの抗原結合フラグメントがIgGであること。
  34. 請求項21-28のいずれかの方法であって、その抗原結合フラグメント又はそれがIgG1又はIgG4であること。
  35. 請求項21-28のいずれかの方法であって、その抗原結合フラグメント又はそれの抗原結合フラグメントがモノクローン・ビーズであること。
  36. 請求項21-28のいずれかの方法であって、その抗原結合フラグメントが、SEQ ID NO: 122及び/又はSEQ ID NO: 121に記載されているアミノ酸配列を含む軽鎖不変領域を有する重鎖不変領域を含むもの。
  37. 請求項21-28のいずれかの方法であって、その抗原結合フラグメントがD265C、H435A、L234AおよびL235Aからなる群から選択された少なくとも1つのアミノ酸置換からなるFc領域を含むもの(EU指数による番号付け)
  38. 請求項37記載の方法で、Fc領域がアミノ酸置換D265C、L234AおよびL235Aからなる(EU指数による番号付け)。
  39. 請求項22の方法、つまり、抗CD117抗きょう体又は抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO: 109に記載されたアミノ酸配列からなる軽い鎖と、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113及びSEQ ID NO: 114からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる重い鎖からなる。
  40. クレーム22の方法であって、当該抗CD117抗きょう体又は抗原結合フラグメントが、SEQ ID NO: 115に記載されたアミノ酸配列からなるL鎖と、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119及びSEQ ID NO: 120からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる重鎖からなるものを含む。
  41. 請求項22の方法、つまり、抗CD117抗菌又は抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO: 284に記載されたアミノ酸配列からなるL鎖と、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 276、SEQ ID NO: 277及びSEQ ID NO: 278からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる重鎖からなる。
  42. 請求項22の方法、当該抗CD117の断片は、HC-CDR1、Ab55、Ab56、Ab56、Ab67、Ab69、Ab86、Ab87、Ab89、Ab79、Ab85、Ab85、Ab85、Ab249、及びLC-CDR2からなるライトチェーン、又はAb55、Ab55、Ab56、Ab58、Ab66、Ab67、Ab68、Ab85、Ab86、Ab85、Ab87、Ab88、Ab88、Ab89, Ab79, Ab81, Ab85, Ab249、またはHC-CDR2、およびSEQ IDの重鎖可変領域からの可変領域 NO: 147,164,180,184,176,187,176,187,198,197,182,202,206,210,216,222,226,238,243 およびLC-CDR1またはSEQ ID NO: 148,149,151,152,154,156,158,162,165,169,173,177,177,181,188,190 192, 194, 206, 207, 209, 201, 217, 219, 223, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 234, 236, 239, 241, 244.
  43. 請求項1-42のうち、ADCが式Ab-(Z-L-Cy)nによって表されるもののいずれかの方法:
    Abは、それらの抗原結合フラグメントである。
    Lはリンカである。
    Zは、L上に存在する反応性置換基と、抗体またはその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基とのカップリング反応により形成される化学部分であり、Cyは、アマトキシン、シュードモナス外毒素A、デボウガニン、ジフテリア毒素、サポリン、メイタンシノイド、ピロロロベンゾジアゼピン、ピロロロベンゾジアゼピン二量体、インドリノベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、カリケアマイシン、アウリスタチン、およびアントラサイクリンからなる群から選択される細胞毒素であり、nは、抗体あたりの細胞毒素の平均数を表す約1～約20の整数である。
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