JP2022530033A - 乳汁産生の促進に有用な組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
哺乳動物における乳汁産生を促進するための方法、薬剤、および組成物が提供される。乳汁産生を促進するのに有用な薬剤には、NOTCH4活性を阻害する薬剤が含まれ得る。薬剤は、ROBO2に結合することによっておよび/またはNOTCH4に結合することによってNOTCH4活性を阻害し得る。薬剤は、ROBO2への結合についてROBO1と競合することにより、NOTCH4活性を阻害するためのROBO1を利用可能にすることによってNOTCH4を阻害し得る。薬剤は、可溶性ROBO1細胞外ドメインまたはNOTCH4活性を阻害する抗NOTCH4抗体であり得る。薬剤は、NOTCH4の発現を阻害するRNAi構築物またはROBO2の発現を阻害するRNAi構築物であり得る。可溶性ROBO1細胞外ドメインの発現、ROBO2の発現の阻害、および/またはNOTCH4の発現の阻害のために遺伝子改変されたトランスジェニック哺乳動物も、本明細書で提供される。本明細書で開示される1つ以上の薬剤を投与することにより、そのようなトランスジェニック哺乳動物における乳汁産生を促進するための方法も提供される。【選択図】図1-1
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2019年4月23日に出願された米国仮特許出願第62/837,590号の利益を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2019年4月23日に出願された米国仮特許出願第62/837,590号の利益を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
2019年2月15日に作成され、130KBのサイズを有するテキストファイルUCSC-383PRV2 seq list_ST25.txtとして、配列表が本明細書とともに提供される。このテキストファイルは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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乳腺、または乳房は、哺乳動物の乳汁産生に関与する動的な上皮器官である1。乳頭に位置する原基(anlage)として始まり、乳腺は思春期に生成されたホルモンのキューに応答して出生後に発達し、基礎にある間質脂肪パッド中に分岐する腺管構造を形成する。各管は二層であり、基底/筋上皮細胞(basal/myoepithelial cells)の外層(本明細書ではBCと呼ばれる)および管腔細胞(luminal cells)の内層(本明細書ではLCと呼ばれる)を含む。管腔細胞は、2つの亜集団にさらに細分され得、管腔を囲む管亜集団、および妊娠中に乳汁産生腺房(alveoli)が生成される腺房亜集団である(図1A)。子が母乳から離乳すると、乳腺は退縮と呼ばれるプロセスで妊娠前の状態にリモデリングされる。腺房細胞亜集団内には、腺房前駆細胞(AVP:alveolar progenitor cells)がある。現在、妊娠中の腺房の生成は、腺房前駆細胞の乳汁産生腺房細胞(AV:alveolar cells)への分化から生じると考えられている。
ノッチ(Notch)は、幹細胞/前駆細胞の維持および発生運命(fate)決定を調節する主要なシグナル伝達経路である。4つのNOTCH受容体がある:NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、およびNOTCH4-これらのすべてが乳腺で発現される2。乳腺の発達中、ノッチシグナル伝達は、基底細胞の発生運命を犠牲にして管腔細胞の発生運命を促進する3~6。さらに、構成的に活性なNOTCH4細胞内ドメイン(ICD)の過剰発現が腺房の発達を大幅に減少させることを示す研究結果により、NOTCH4活性の阻害が腺房の拡大および分化に必要であるようである7~9。これは、腺房前駆細胞においてそれらが腺房細胞に分化するためにNOTCH4を介したシグナル伝達が阻害されなければならないことを示している。
ラウンドアバウト(ROBO)受容体は、多くの発達過程に関与する保存された免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーのメンバーである。それらは、SLIT(例えば、乳腺におけるSLIT2およびSLIT3)と呼ばれる保存された分泌型糖タンパク質細胞外マトリックスリガンドのファミリーに結合し、これは乳腺上皮全体に発現する(図1B)10、11。このシグナル伝達システムは、マウスの神経系およびショウジョウバエの腸における細胞の発生運命決定を調節することが示されている12、13。
妊娠のたびに乳汁の供給を構築するには、細胞増殖および分化を大幅に加速する必要がある。本明細書に開示されるのは、脱抑制性シグナル伝達回路に影響を与える薬剤で処置することによってその加速された細胞増殖および分化を促進する方法であり、それにより、ROBO2はROBO1を阻害し、次にNOTCH4活性化を阻害する。ROBO1は、処女乳腺のBCおよびLCの両方で発現するが、妊娠中のLCではアップレギュレートされる。ROBO2の発現は、管腔細胞のサブセットに制限されている。本明細書で初めて開示されるのは、以下の発見である:Robo1遺伝子の喪失(または欠失)は、乳腺腺房分化の阻害をもたらす。これは、HC11細胞授乳モデルと乳腺のインビボの両方で実証されている。Robo2の喪失(または欠失)は、両方のモデルで反対の表現型をもたらす、つまり、乳腺腺房の分化がより大きくなる。ROBO1は、NOTCH4に特異的に結合して、そのシグナル伝達を阻害することが示されている。ROBO2は、ROBO1に特異的に結合し、ROBO1がNOTCH4を阻害するのを防止することが示されている。ROBO1とROBO2の間の相互作用は、SLIT2によって強化される。本明細書に開示されるのは、NOTCH4シグナル伝達を阻害するROBO1細胞外ドメインの部分を含むROBO1受容体フラグメントである。本明細書に開示される実験は、SLIT/ROBOシグナル伝達が、NOTCH4活性化を支配し、乳汁産生腺房細胞に分化する腺房前駆細胞の数を制御することにより、乳腺腺房形成を調節することを示している。
哺乳動物における乳汁産生を促進するための方法、薬剤、および組成物が提供される。乳汁産生を促進するのに有用な薬剤には、NOTCH4活性を阻害する薬剤が含まれ得る。薬剤は、可溶性ROBO1細胞外ドメインであり得るか、または薬剤は、ROBO2に結合することによっておよび/またはNOTCH4に結合することによってNOTCH4活性を阻害し得る。薬剤は、ROBO1と競合してROBO2への結合から離し、それによってNOTCH4活性を阻害するためのROBO1を利用可能にすることにより、NOTCH4を阻害し得る。薬剤は、NOTCH4活性を阻害する抗NOTCH4抗体であり得る。薬剤は、NOTCH4の発現を阻害するRNAi構築物であり得る。薬剤は、ROBO2の発現を阻害するRNAi構築物であり得る。本明細書では、可溶性ROBO1細胞外ドメインの発現、ROBO2の発現の阻害、および/またはNOTCH4の発現の阻害のために遺伝子改変されたトランスジェニック哺乳動物も提供される。本明細書に開示される薬剤の1つ以上を投与することによってそのようなトランスジェニック哺乳動物における乳汁産生を促進するための方法も提供される。
配列表
配列番号1-ウシROBO1-Ecto
配列番号2-ウシROBO1-Ig5
配列番号3-ウシROBO1-Ig2
配列番号4-ホモサピエンスROBO1-Ecto
配列番号5-ホモサピエンスROBO1-Ig5
配列番号6-ホモサピエンスROBO1-Ig2
配列番号7-アメリカバイソンROBO1-Ecto
配列番号8-アメリカバイソンROBO1-Ig5
配列番号9-アメリカバイソンROBO1-Ig2
配列番号10-フタコブラクダROBO1-Ecto
配列番号11-フタコブラクダROBO1-Ig5
配列番号12-フタコブラクダROBO1-Ig2
配列番号13-ヤギROBO1-Ecto
配列番号14-ヤギROBO1-Ig5
配列番号15-ヤギROBO1-Ig2
配列番号16-ヒツジROBO1-Ecto
配列番号17-ヒツジROBO1-Ig5
配列番号18-ヒツジROBO1-Ig2
配列番号19-ヤクROBO1-Ecto
配列番号20-ヤクROBO1-Ig5
配列番号21-ヤクROBO1-Ig2
配列番号22-ハツカネズミROBO1-Ecto
配列番号23-ハツカネズミROBO1-Ig5
配列番号24-ハツカネズミROBO1-Ig2
配列番号25-ドブネズミROBO1-Ecto
配列番号26-ドブネズミROBO1-Ig5
配列番号27-ドブネズミROBO1-Ig2
配列番号28-ドブネズミDCC Ig2
配列番号29-ドブネズミDCC Ig4
配列番号30-Robo1 shRNAフォワードストランド
配列番号31-Robo1 shRNAリバースストランド
配列番号32-Notch4 shRNAフォワードストランド
配列番号33-Notch4 shRNAリバースストランド
配列番号34-Robo2 shRNAフォワードストランド
配列番号35-Robo2 shRNAリバースストランド
配列番号1-ウシROBO1-Ecto
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配列番号5-ホモサピエンスROBO1-Ig5
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配列番号7-アメリカバイソンROBO1-Ecto
配列番号8-アメリカバイソンROBO1-Ig5
配列番号9-アメリカバイソンROBO1-Ig2
配列番号10-フタコブラクダROBO1-Ecto
配列番号11-フタコブラクダROBO1-Ig5
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配列番号32-Notch4 shRNAフォワードストランド
配列番号33-Notch4 shRNAリバースストランド
配列番号34-Robo2 shRNAフォワードストランド
配列番号35-Robo2 shRNAリバースストランド
哺乳動物における乳汁産生を促進するための方法、薬剤、および組成物が提供される。乳汁産生を促進するのに有用な薬剤には、NOTCH4活性を阻害する薬剤が含まれ得る。薬剤は、可溶性ROBO1細胞外ドメインであり得、薬剤は、ROBO2に結合することによっておよび/またはNOTCH4に結合することによってNOTCH4活性を阻害し得る。薬剤は、ROBO1と競合してROBO2への結合から離し、それによってNOTCH4活性を阻害するためのROBO1を利用可能にすることにより、NOTCH4活性を阻害し得る。薬剤は、NOTCH4活性を阻害する抗NOTCH4抗体であり得る。薬剤は、NOTCH4の発現を阻害するRNAi構築物であり得る。薬剤は、ROBO2の発現を阻害するRNAi構築物であり得る。本明細書では、可溶性ROBO1細胞外ドメインの発現、ROBO2の発現の阻害、および/またはNOTCH4の発現の阻害のために遺伝子改変されたトランスジェニック哺乳動物も提供される。本明細書に開示される薬剤の1つ以上を投与することによってそのようなトランスジェニック哺乳動物における乳汁産生を促進するための方法も提供される。
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されるところに関連する方法および/または材料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示についてのものであり、提供される刊行日は、独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる可能性があるため、本方法、組成物、およびトランスジェニック動物が、このような刊行物に先行する権利がないと認めるものと解釈されるべきではない。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示物を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は任意選択的な要素を排除するように起草されてもよいことにさらに留意されたい。このように、この記述は、クレーム要素の記載に関連して、「もっぱら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用、または「負の」限定の使用のための根拠としての役割を果たすことを意図している。
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証される個々の実施形態の各々は、本方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの態様のいずれかの特徴と容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の構成要素および特徴を有する。記載された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な他の順序で実施することができる。
定義
本明細書で使用される「抗体」という用語は、少なくとも1つの抗原結合部位を介して標的を認識して結合する免疫グロブリン分子を指す。「抗体」は、本明細書で最も広い意味で使用され、ポリクローナル抗体、組換え抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体(ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダなどの2つ以上の異なる種からの抗体配列のキメラ)、ヒト化抗体、ヒト抗体、ウシ化抗体、ヒツジ化抗体、ヤギ抗体、ラクダ化抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、単鎖Fv(scFv)抗体、シングルドメイン抗体(例えば、ラクダ/ラマ抗体)、および抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、少なくとも1つの抗原結合部位を介して標的を認識して結合する免疫グロブリン分子を指す。「抗体」は、本明細書で最も広い意味で使用され、ポリクローナル抗体、組換え抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体(ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダなどの2つ以上の異なる種からの抗体配列のキメラ)、ヒト化抗体、ヒト抗体、ウシ化抗体、ヒツジ化抗体、ヤギ抗体、ラクダ化抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、単鎖Fv(scFv)抗体、シングルドメイン抗体(例えば、ラクダ/ラマ抗体)、および抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
「インタクト抗体」または「全長抗体」という用語は、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指す。これは、各々が可変領域および軽鎖定常領域(CL)を含む2つの軽鎖と、各々が可変領域および少なくとも重鎖定常領域CH1、CH2、およびCH3とを含む2つの重鎖を含む抗体を含む。
本明細書で使用される「抗体フラグメント」という用語は、抗体の一部分および一般に抗原結合部位を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、Fd、線状抗体、単鎖抗体分子(例えば、scFv)、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、ミニボディ、デュアル可変ドメイン抗体(DVD)、シングル可変ドメイン抗体、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「可変領域」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体軽鎖の領域または抗体重鎖の領域を指す。抗体重鎖および抗体軽鎖の可変領域は、類似の構造を有し、一般に、4つのフレームワーク領域および3つの相補性決定領域(CDR)(超可変領域としても知られる)を含む。
「フレームワーク領域」という用語は、可変領域内のCDR残基以外のアミノ酸残基を指す。可変領域は通常、FR1、FR2、FR3、およびFR4の4つのフレームワーク領域を含む。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一の抗原決定基またはエピトープの非常に特異的な認識および結合に関与する実質的に均質な抗体集団を指す。集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る、自然に発生する可能性のある突然変異を除いて、同一である。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトおよび完全長モノクローナル抗体、ならびに抗体フラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、単鎖(scFv)抗体、抗体フラグメント、および抗原結合部位を含む他の修飾免疫グロブリン分子を含む融合タンパク質を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ産生、ファージライブラリーディスプレイ、組換え発現、およびトランスジェニック動物を含むがこれらに限定されない、任意の数の技術によって作製されたそのような抗体を指す。
本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来し、一方、重鎖および/または軽鎖の残りが異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、一般にヒト免疫グロブリン(例えば、レシピエント抗体)を含むキメラ抗体を指し、天然のCDR残基は、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種からの対応するCDRからの残基によって置き換えられ、ここでドナー抗体は、所望の特異性、親和性、および/または活性を有する。場合によっては、ヒト免疫グロブリンの1つ以上のフレームワーク領域内の1つ以上の残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の特徴をさらに洗練および/または最適化するために行われ得る。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのものに対応するCDRのすべてまたは実質的にすべて、およびヒト免疫グロブリンのものに対応するフレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてを含む可変領域を含み得る。いくつかの態様では、ヒト化抗体は、免疫グロブリンFc領域(例えば、ヒンジ領域、CH1、CH2、および/またはCH3)の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。同様の定義が、ウシ化、ヒツジ化、ヤギ化、およびラクダ化抗体に適用される。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生された抗体および/またはヒト抗体を作製するための当業者に知られた技術のいずれかを使用して作製された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。これらの技術には、ファージディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、トランスジェニック動物、およびB細胞ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で定義されるヒト抗体は、非ヒト供給源からの残基を含むヒト化抗体を除外する。
「エピトープ」および「抗原決定基」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、特定の結合剤または結合剤(例えば抗体)によって認識および結合され得る抗原または標的のその部分を指す。抗原または標的がポリペプチドである場合、エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置された隣接アミノ酸および非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープ(線状エピトープとも呼ばれる)は、通常、タンパク質変性時に保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープ(立体構造エピトープとも呼ばれる)は、通常、タンパク質変性時に失われる。エピトープは、通常、独特の空間的立体構造で少なくとも3つ、より一般的には少なくとも5、6、7、または8~10個のアミノ酸を含む。エピトープは、インターネット上で利用可能な多数のソフトウェアバイオインフォマティクスツールのいずれか1つを使用して予測され得る。X線結晶学が、抗原/抗体複合体のアミノ酸残基相互作用を分析することにより、標的タンパク質上のエピトープを特徴づけるために使用され得る。
本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、代替物質よりも特定の抗原、エピトープ、タンパク質、または標的分子に対して、より頻繁に、より迅速に、より長い継続期間で、より高い親和性で、または上記のいくつかの組み合わせで相互作用する結合剤(例えば、抗体)を指す。抗原に特異的に結合する抗体は、例えば、イムノアッセイ、ELISA、表面プラズモン共鳴(SPR)技術(例えば、Biacore)、FACS、または当業者に知られている他の技術によって同定され得る。
「ポリペプチド」および「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。「ペプチド」という用語は、50アミノ酸未満、例えば、5~50アミノ酸のポリマーを指すように使用され得る。ポリマーは、線状または分枝状であり得、それは、修飾されたアミノ酸を含み得、それは、非アミノ酸によって中断され得る。これらの用語はまた、自然に、または介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他の操作または修飾によって、修飾されたアミノ酸ポリマーを包含し得る。定義には、例えば、非天然アミノ酸を含むがこれらに限定されないアミノ酸の1つ以上の類似体、ならびに当技術分野で知られている他の修飾を含むポリペプチドも含まれる。本開示のポリペプチドのいくつかは抗体に基づき得るため、「ポリペプチド」という用語は、一本鎖としてのポリペプチドおよび2つ以上の随伴する鎖のポリペプチドを包含することが理解される。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および/またはそれらの類似体、あるいはDNAまたはRNAポリメラーゼによってポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。
2つ以上の核酸またはポリペプチドの文脈における「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、その配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大の対応が得られるように比較されアラインメントされた(必要に応じてギャップを導入して)場合、同一であるか、または特定されたパーセンテージで同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する2つ以上の配列またはサブ配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定され得る。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用され得る様々なアルゴリズムおよびソフトウェアは、当該技術分野でよく知られている。これらには、BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCGウィスコンシンパッケージ、およびそれらの変形が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、本開示の2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定された、最大の対応となるように比較されアラインメントされた場合、実質的に同一であり、これは、それらが少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、およびいくつかの態様では少なくとも95%、96%、97%、98%、99%のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有することを意味する。いくつかの態様では、同一性は、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約40~60ヌクレオチドまたはアミノ酸残基、少なくとも約60~80ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の長さ、またはそれらの間の任意の整数値である配列の領域にわたって存在する。いくつかの態様では、同一性は、60~80のヌクレオチドまたはアミノ酸残基よりも長い領域、例えば少なくとも約80~100のヌクレオチドまたはアミノ酸残基にわたって存在し、いくつかの態様では、配列は、例えば(i)ヌクレオチド配列のコード領域または(ii)アミノ酸配列のような比較される配列の全長にわたって実質的に同一である。
本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」という句は、あるアミノ酸残基が同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられる置換を指す。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で一般的に定義されており、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含み、。例えば、チロシンからフェニルアラニンへの置換は、保存的置換であるとみなされる。一般に、ポリペプチドおよび/または抗体の配列における保存的置換は、標的の結合部位へのポリペプチドまたは抗体の結合を損なわせない。結合を損なわせないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該技術分野でよく知られている。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞において目的の1つ以上の遺伝子または配列を送達することができ、通常は発現することができる、構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のDNAもしくはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミド、またはファージベクター、カチオン性縮合剤に付随するDNAもしくはRNA発現ベクター、およびリポソームにカプセル化されたDNAもしくはRNA発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「単離された」という用語は、自然界には見られない形態のポリペプチド、ペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物を指す。「単離された」抗体は、それが由来する細胞源からの物質を実質的に含まない。いくつかの態様では、単離されたポリペプチド、ペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、それらがもはや自然界に見出される形態ではない程度に精製されたものである。いくつかの態様では、単離されるポリペプチド、ペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、実質的に純粋である。ポリペプチド、ペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然の供給源から、または操作された細胞株などの供給源から単離され得る。
本明細書で使用される「実質的に純粋な」という用語は、少なくとも50%純粋である(すなわち、汚染物質を含まない)、少なくとも90%純粋である、少なくとも95%純粋である、少なくとも98%純粋である、または少なくとも99%純粋である物質を指す。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの文脈における「由来する」という用語は、特定の供給源からのタンパク質の配列に基づく配列を有するポリペプチドを指す。特定の供給源からのタンパク質に由来するポリペプチドは、特定の供給源からのタンパク質の変異体であり得る。例えば、特定の供給源からのタンパク質に由来するポリペプチドは、それが由来するタンパク質の配列に関して改変された配列を有し得る。特定の供給源からのタンパク質に由来するポリペプチドは、それが由来するタンパク質との少なくとも50%の配列同一性、少なくとも60%の配列同一性、少なくとも70%の配列同一性、少なくとも80%の配列同一性、または少なくとも90%の配列同一性を共有する。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、哺乳動物などの、対象において意図された効果を生み出すのに十分な薬剤(例えば、抗体、ポリペプチド、核酸など)の量を指す。
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータに向けられた態様を含む(かつ記載する)。例えば、「約X」に言及する記載は、「X」の記載を含む。
本開示および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の形態を含む。
本明細書の「Aおよび/またはB」などの句で使用される「および/または」という用語は、AおよびBの両方、AまたはB、A(単独)、ならびにB(単独)を含むことが意図されている。同様に、「A、B、および/またはC」などの句で使用される「および/または」という用語は、以下の態様の各々を包含することが意図されている:A、B、およびC;A、B、またはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A(単独);B(単独);およびC(単独)。
本明細書で使用される場合、RNAi構築物という用語は、それが細胞内に存在することによりRNA干渉(RNAi)がもたらされ、そのRNAi構築物が標的とする転写物の発現の低減につながるRNA分子およびベクターを包含する。この用語には、siRNA、shRNA、およびRNAi誘導ベクターが含まれる。
本明細書で使用される場合、RNAi誘導ベクターは、それが細胞内に存在することにより、自己ハイブリダイズまたは互いにハイブリダイズしてshRNAまたはsiRNAを形成する1つ以上のRNAの転写をもたらすベクターである。この用語は、プラスミド、例えば、DNAベクターまたはウイルスベクターを包含する。該ベクターは、そのベクターが細胞内に存在する場合にハイブリダイズまたは自己ハイブリダイズしてsiRNAまたはshRNAを形成する1つ以上のRNA分子が転写されるように、発現シグナルに作動可能に連結された核酸を含み得る。したがって、ベクターは、1つもしくは複数のRNAまたはその前駆体の細胞内合成のためのテンプレートを提供する。
短い干渉RNA(siRNA)は、約19塩基対の長さのRNA二重鎖を含み、任意で1つまたは2つの一本鎖オーバーハングをさらに含む。siRNAは、一緒にハイブリダイズする2つのRNA分子から形成され得るか、あるいは、自己ハイブリダイズする部分を含む単一のRNA分子から生成され得る。siRNAの二本鎖部分は、1つ以上の対になっていないヌクレオチドを含み得る。siRNAの1本の鎖には、完全な相補性または1つもしくは2つのミスマッチを有する標的転写物とハイブリダイズする部分が含まれる。完全な相補性が達成されない態様では、ミスマッチはsiRNA終端またはその近くに位置し得る。
ショートヘアピンRNAという用語は、RNAiを媒介するのに十分な長さ(通常は、少なくとも19塩基対の長さ)の二本鎖(デュプレックス)構造を形成するためにハイブリダイズしたまたはハイブリダイズすることができる少なくとも2つの相補的部分と、少なくとも1つの一本鎖部分であって、通常はループを形成する約1~10ヌクレオチドの長さのものとを含むRNA分子を指す。二本鎖部分は、1つ以上の対になっていないヌクレオチドからなる1つ以上のバルジを含み得るが、通常は含まない。
本明細書に開示されているのは、乳腺腺房形成の際のROBO受容体の役割の調査である。特に、Robo1の喪失は腺房形成を阻害し、Robo2の喪失は腺房形成を促進する。ROBO1がNOTCH4に特異的に結合してNOTCH4活性化を阻害することを明らかにする、細胞株における生化学的研究が開示されている。ROBO1は乳腺上皮コンパートメント全体で広く発現していることが示されているが、ROBO2の発現は腺房前駆細胞および基底/筋上皮細胞(BC)に限定されている。また、NOTCH4シグナル伝達を阻害し腺房形成を促進するROBO1細胞外ドメイン(ECD)の部分を含むROBO1受容体フラグメントも開示されている。ROBO2がROBO1に結合することを阻害する抗体で細胞および哺乳動物を処理することによって腺房形成が増強されることも開示されている。理論に拘束されることなく、本明細書に開示される発見は、NOTCH4シグナル伝達を調節し、その結果、妊娠ごとに乳汁産生腺房に分化する腺房前駆細胞の数を調節する、阻害回路メカニズム(ROBO2―|ROBO1―|NOTCH4)を示す。
哺乳動物における乳汁産生を増強させる方法
本開示は、哺乳動物における乳汁産生を促進する方法を提供する。特定の態様では、この方法は、NOTCH4活性を阻害する第1の薬剤を哺乳動物に投与することを含み得、第1の薬剤は、NOTCH4活性を阻害するのに十分な量で投与され、それにより乳汁産生を促進する。第1の薬剤は、NOTCH4タンパク質に直接結合することにより、ROBO2のROBO1への結合を阻害することにより、ROBO1のNOTCH4への結合を促進することにより、NOTCH4の発現を阻害することにより、またはROBO2の発現を阻害することにより、NOTCH4活性を阻害し得る。
本開示は、哺乳動物における乳汁産生を促進する方法を提供する。特定の態様では、この方法は、NOTCH4活性を阻害する第1の薬剤を哺乳動物に投与することを含み得、第1の薬剤は、NOTCH4活性を阻害するのに十分な量で投与され、それにより乳汁産生を促進する。第1の薬剤は、NOTCH4タンパク質に直接結合することにより、ROBO2のROBO1への結合を阻害することにより、ROBO1のNOTCH4への結合を促進することにより、NOTCH4の発現を阻害することにより、またはROBO2の発現を阻害することにより、NOTCH4活性を阻害し得る。
特定の態様では、第1の薬剤は、可溶性ROBO1細胞外ドメイン(ECD)を含み得る。特定の態様では、可溶性ROBO1 ECDは、ROBO1の細胞外ドメイン全体またはそのROBO2結合フラグメントを含み得る。特定の態様では、可溶性ROBO1 ECDは、ROBO1の少なくとも2つの免疫グロブリン(Ig)ドメイン、例えば、ROBO1の最初の2つのIgドメインを含み得る。特定の態様では、可溶性ROBO1 ECDは、ROBO1の少なくとも5つの免疫グロブリンドメインを含み得る。特定の態様では、可溶性ROBO1 ECDは、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヒトROBO1の細胞外ドメインに由来し得る。特定の態様では、可溶性ROBO1 ECDは、配列番号1~27のいずれか1つに記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性であるアミノ酸配列を含み得る。特定の態様では、可溶性ROBO1 ECDは、それに対する1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または最大20)の保存的アミノ酸置換を有する配列番号1~27のいずれか1つの配列を含み得る。特定の態様では、哺乳動物に投与される可溶性ROBO1 ECDは、可溶性ROBO1 ECDに対する免疫応答を低減させるために、その哺乳動物によって発現されるROBO1タンパク質の配列に由来し得る。
ROBO1の細胞外領域全体またはそのROBO2結合フラグメントを含み得る可溶性ROBO1 ECDは、任意の手段によって同定され得る。例えば、NOTCH4活性を阻害するのに有効な可溶性ROBO1 ECDは、ROBO2への可溶性ROBO1 ECDの結合を測定するためのアッセイを実施することによって同定され得る。アッセイは、可溶性ROBO1 ECDが、完全長ROBO1または配列番号1~27のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を有する可溶性ROBO1 ECDなどの競合の存在下でROBO2に結合するかどうかを決定することを含み得る。特定の態様では、NOTCH4活性を阻害するのに有効な可溶性ROBO1 ECDは、NOTCH4への可溶性ROBO1 ECDの結合を測定するためのアッセイを実施することによって同定され得る。可溶性ROBO1 ECDのROBO2および/またはNOTCH4への結合は、ROBO1 ECD::ROBO2複合体および/またはROBO1 ECD::NOTCH4複合体の形成を検出することによって測定され得る。可溶性ROBO1 ECDのROBO2および/またはNOTCH4への結合を同定するための他の方法もまた使用され得る。
いくつかの態様では、可溶性ROBO1は、異種ポリペプチドに融合または連結されている。いくつかの態様では、異種ポリペプチドは、可溶性ROBO1 ECDのアミノ終端、カルボキシル終端、または両方の終端に連結している。本明細書で使用される場合、ROBO1 ECDの文脈で使用される可溶性という用語は、細胞表面局在化に必要な膜貫通領域を欠いているため、ROBO1 ECDが細胞表面に局在化されていないか、局在化することができないことを意味する。可溶性ROBO1 ECDは、ROBO1の細胞内領域の配列も欠いている。特定の態様では、可溶性ROBO1 ECDポリペプチドは、免疫グロブリンFcポリペプチド(例えば、IgG1 FcなどのヒトIgG1 Fc)、血清アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミンもしくはウシ血清アルブミン)、またはマルトース結合タンパク質に融合され得る。特定の態様では、可溶性ROBO1 ECDは、ポリペプチドの精製または追跡を容易にするタンパク質タグに融合され得る。このようなタンパク質タグには、Hisタグ、血球凝集素タグ、Fc領域(ヒト、ウシ、ヒツジ、またはヤギ抗体、例えば、IgG、IgM、IgA、IgE、またはIgDに由来するIgに由来する)、またはMycタグが含まれる。
いくつかの態様では、第1の薬剤は、NOTCH4活性を阻害する抗NOTCH4抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントであり得る。本明細書で使用される場合、抗体という用語は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、その抗原結合フラグメントを包含する。いくつかの態様では、抗体は、抗原上の異なるエピトープに結合する複数のポリクローナル抗体を含む。いくつかの態様では、抗体は組換え抗体である。いくつかの態様では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様では、抗体はキメラ抗体である。特定の態様では、抗体は、その抗体を受け入れる哺乳動物における免疫原性の減少を提供するように改変されている。いくつかの態様では、抗体はヒト化抗体である。いくつかの態様では、抗体はヒト抗体である。いくつかの態様では、抗体はウシ化抗体である。いくつかの態様では、抗体はウシ抗体である。いくつかの態様では、抗体はヒツジ化抗体である。いくつかの態様では、抗体はヒツジ抗体である。いくつかの態様では、抗体はヤギ化抗体である。いくつかの態様では、抗体はヤギ抗体である。いくつかの態様では、抗体はラクダ化抗体である。いくつかの態様では、抗体はラクダ抗体である。いくつかの態様では、抗体は、IgA、IgD、IgE、IgG、またはIgM抗体である。いくつかの態様では、抗体は、IgG抗体である。いくつかの態様では、抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体である。いくつかの態様では、抗体は、少なくとも1つの抗原結合部位を含む抗体フラグメントである。いくつかの態様では、抗体は、scFvである。いくつかの態様では、抗体は、ジスルフィド結合scFvである。いくつかの態様では、抗体は、Fabである。いくつかの態様では、抗体は、二重特異性抗体または多重特異性抗体である。
いくつかの態様では、第1の薬剤は、NOTCH4に結合するポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、当業者に知られている任意の方法によって調製され得る。いくつかの態様では、ポリクローナル抗体は、複数の皮下または腹腔内注射を使用して、動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ラクダ、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ロバ)を目的の抗原(例えば、精製ペプチドフラグメント、組換えタンパク質、または融合タンパク質)で免疫化することによって産生される。いくつかの態様では、抗原は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤などの担体にコンジュゲートされている。抗原(担体タンパク質の有無にかかわらず)は、滅菌生理食塩水で希釈され、通常はアジュバント(例えば、完全または不完全フロイントアジュバント)と組み合わされて安定なエマルジョンを形成する。一定期間後、免疫化された動物から(例えば、血液または腹水から)ポリクローナル抗体が回収される。いくつかの態様では、ポリクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および/または透析を含むがこれらに限定されない、当該技術分野における標準的な方法に従って血清または腹水から精製される。
いくつかの態様では、第1の薬剤は、NOTCH4に結合するモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に知られている任意の方法によって調製され得る。いくつかの態様では、モノクローナル抗体は、当業者に知られているハイブリドーマ法を使用して調製される。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、または他の適切な宿主動物が、上記のように免疫化される。いくつかの態様では、リンパ球が、インビトロで免疫化される。いくつかの態様では、免疫化抗原は、ヒトタンパク質またはそのフラグメントである。免疫化に続いて、リンパ球が単離され、例えば、ポリエチレングリコールを使用して適切な骨髄腫細胞株と融合される。当該技術分野で知られている特殊な培地を使用してハイブリドーマ細胞が選択され、融合していないリンパ球および骨髄腫細胞はこの選択プロセスで生き延びない。選択した抗原に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、免疫沈降、イムノブロッティング、およびインビトロ結合アッセイ(例えば、フローサイトメトリー、FACS、ELISA、SPR(例えば、Biacore)およびラジオイムノアッセイ)を含むがこれらに限定されない様々な方法によって同定され得る。所望の特異性、親和性、および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されると、クローンは、限界希釈または他の技術によってサブクローン化され得る。ハイブリドーマは、標準的な方法を使用したインビトロ培養で、または動物の腹水腫瘍としてインビボのいずれかで増殖され得る。モノクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および透析を含むがこれらに限定されない当該技術分野の標準的な方法に従って、培養培地または腹水から精製され得る。
いくつかの態様では、モノクローナル抗体は、当業者に知られている組換えDNA技術を使用して作製される。例えば、抗体をコードするポリヌクレオチドが、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するRT-PCRなどによって成熟B細胞またはハイブリドーマ細胞から単離され、それらの配列は標準的な技術を使用して決定される。次に、重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドは、通常なら免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞(例えば大腸菌、シミアンCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または骨髄腫細胞など)にトランスフェクトされたときにモノクローナル抗体を産生する、適切な発現ベクターにクローン化される。
いくつかの態様では、組換えモノクローナル抗体は、所望の種(例えば、ウシまたはヒト)の可変ドメインまたはCDRを発現するファージディスプレイライブラリーから単離される。ファージライブラリーのスクリーニングは、当該技術分野で知られている様々な技術によって達成され得る。
いくつかの態様では、モノクローナル抗体は、組換えDNA技術を使用して代替抗体を生成することによって改変される。いくつかの態様では、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインが、キメラ抗体を生成するために、ヒト抗体、ヒツジ抗体、ウシ抗体、ヤギ抗体、またはラクダ抗体の定常領域で置き換えられる。いくつかの態様では、定常領域は、モノクローナル抗体の所望の抗体フラグメントを生成するために切断されるかまたは除去される。いくつかの態様では、モノクローナル抗体の特異性および/または親和性を最適化するために可変領域の部位特異的または高密度突然変異誘発が使用される。
いくつかの態様では、抗NOTCH4抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体を生成するための様々な方法が当該技術分野で知られている。いくつかの態様では、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその配列に導入された1つ以上のアミノ酸残基を含む。いくつかの態様では、ヒト化は、ヒト抗体のCDR配列の1つ以上のアミノ酸を非ヒト抗体(例えば、マウス抗体)からの対応するアミノ酸に置換することによって行われる。いくつかの態様では、ヒト化抗体は、ヒト抗体の6つのCDRすべてを、非ヒト抗体(例えば、マウス抗体)のCDRからの対応するアミノ酸で置換することによって構築される。
ヒト化抗体を生成するために使用されるヒト重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域の選択は、様々な要因に基づいて、かつ当該技術分野で知られている様々な方法によって行われ得る。いくつかの態様では、「ベストフィット」法が使用され、非ヒト(例えば、げっ歯類)抗体の可変領域の配列が、既知のヒト可変領域配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。非ヒト(例えば、げっ歯類)配列の配列に最も類似しているヒト配列が、ヒト化抗体のヒト可変領域フレームワークとして選択される。いくつかの態様では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定の可変領域フレームワークが、可変領域フレームワークとして選択される。いくつかの態様では、可変領域フレームワーク配列は、最も豊富なヒトサブクラスのコンセンサス配列に由来する。いくつかの態様では、ヒト生殖系列遺伝子が可変領域フレームワーク配列の供給源として使用される。
いくつかの態様では、抗NOTCH4抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で知られている様々な技術を使用して調製され得る。いくつかの態様では、ヒト抗体は、インビトロで免疫化された不死化ヒトBリンパ球から生成される。いくつかの態様では、ヒト抗体は、免疫化された個体から単離されたリンパ球から生成される。いずれにしても、標的抗原に対する抗体を産生する細胞が生成および単離され得る。いくつかの態様では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、そのファージライブラリーはヒト抗体を発現する。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、免疫化されていないドナーからの免疫グロブリン可変領域遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体フラグメントを産生することができる。抗体ファージライブラリーの生成および使用のための技術は、当該技術分野でよく知られている。抗体が同定されると、鎖シャッフリングおよび部位特異的突然変異誘発を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている親和性成熟戦略を使用して、より親和性の高いヒト抗体を生成し得る。いくつかの態様では、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックマウスにおいて産生される。免疫化の際に、これらのマウスは、内因性免疫グロブリン産生がなくても、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができる。
特定の態様では、抗体は、ウシ化抗体または完全ウシ抗体であり得る。非ウシ抗体からウシ化抗体を産生するための方法は、非ウシ抗体からのCDRを保持するキメラ抗体を形成することを含み得、一方、抗体の他の領域は、ウシ抗体から1つ以上のアミノ酸残基を導入して、ウシ抗体からの対応する配列で置き換えられ得る。特定の態様では、非ウシ抗体は、定常領域をウシ抗体からの定常領域で置き換えることによってウシ化され得る。特定の態様では、非ウシ抗体は、定常領域をウシ抗体からの定常領域で置き換え、かつフレームワーク領域をウシ抗体からのフレームワーク領域で置き換えることによって、ウシ化され得る。特定の態様では、ウシ化抗体は、ウシ抗体のCDRを非ウシ抗体からのCDRで置き換えることによって生成され得る。場合によっては、抗体は、ウシ抗体をコードする遺伝子配列を使用して産生される完全ウシ抗体であり得る。完全ウシ抗体は、ウシ、ウシ細胞株、ウシ抗体を発現するように遺伝子改変された非ウシ細胞株、またはウシ抗体を発現するように遺伝子改変されたトランスジェニック非ウシ動物において産生され得る。同様の方法を使用して、種に投与されたときに抗体に対する免疫応答が低減する種特異的抗体を生成することができる。例えば、ヒツジ、ヤギ、およびラクダにそれぞれ抗体を投与する目的で、ヒツジ抗体、ヤギ化抗体、ラクダ化抗体を産生することができる。
抗体のCDRは、様々な方法/システムを使用して当業者によって定義される。これらのシステムおよび/または定義は、何年にわたって開発および改良されており、それらにはKabat、Chothia、IMGT、AbM、およびContactが含まれる。Kabatの定義は、シーケンスの変動性に基づいており、一般的に使用されている。Chothiaの定義は、構造的ループ領域の位置に基づいている。IMGTシステムは、可変ドメインの構造内の配列変動性および位置に基づいている。AbMの定義は、KabatとChothiaの間の妥協点である。Contactの定義は、利用可能な抗体の結晶構造の分析に基づいている。Exemplaryシステムは、KabatとChothiaの組み合わせである。抗体配列の分析およびCDRの決定のためにソフトウェアプログラム(例えばabYsis)が利用可能であり、当業者に知られている。
本明細書で定義される特定のCDR配列は、一般に、KabatおよびChothiaの定義の組み合わせ(Exemplaryシステム)に基づいている。しかしながら、特定の抗体の1つもしくは複数の重鎖CDRおよび/または1つもしくは複数の軽鎖CDRへの言及は、当業者に知られているすべてのCDR定義を包含することが理解されるであろう。
いくつかの態様では、抗NOTCH4抗体は、少なくとも1つ以上の定常領域が改変または欠失されている抗体を含む。いくつかの態様では、抗体は、3つの重鎖定常領域(CH1、CH2もしくはCH3)のうちの1つ以上および/または軽鎖定常領域(CL)の改変を含み得る。いくつかの態様では、改変された抗体の重鎖定常領域は、少なくとも1つのヒト定常領域を含む。いくつかの態様では、改変された抗体の重鎖定常領域は、複数のヒト定常領域を含む。いくつかの態様では、定常領域の改変は、1つ以上の領域における1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含む。いくつかの態様では、1つ以上の領域が、改変された抗体の定常領域から部分的にまたは完全に欠失される。いくつかの態様では、CH2ドメイン全体が、抗体から除去されている(ΔCH2構築物)。いくつかの態様では、削除された定常領域は、通常ならその不在となった定常領域によって与えられる分子柔軟性のいくらかを提供する、短いアミノ酸スペーサーによって置き換えられる。いくつかの態様では、改変された抗体は、抗体のヒンジ領域に直接融合されたCH3ドメインを含む。いくつかの態様では、改変された抗体は、ヒンジ領域と改変されたCH2および/またはCH3ドメインとの間に挿入されたペプチドスペーサーを含む。
抗体の定常領域がいくつかのエフェクター機能を媒介し、これらのエフェクター機能が抗体のアイソタイプに応じて変化し得ることが当該技術分野で知られている。例えば、補体のC1成分がIgGまたはIgM抗体(抗原に結合)のFc領域に結合すると、補体系が活性化される。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン作用および溶解において重要である。補体の活性化はまた、炎症反応を刺激し、自己免疫性過敏症に関与する可能性がある。さらに、抗体のFc領域は、Fc受容体(FcR)を発現する細胞に結合し得る。IgG(ガンマ受容体)、IgE(イプシロン受容体)、IgA(アルファ受容体)およびIgM(ミュー受容体)を含む様々なクラスの抗体に特異的な多くのFc受容体が存在する。抗体が細胞表面上のFc受容体に結合すると、抗体被覆粒子の貪食と破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解(抗体依存性細胞傷害性またはADCCと呼ばれる)、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過、および免疫グロブリン産生の制御を含む多くの重要で多様な生物学的反応が引き起こされる。
いくつかの態様では、抗NOTCH4抗体は、変異体Fc領域を含む。ヒトIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4のFc領域のアミノ酸配列は、当業者に知られている。いくつかの態様では、変異型Fc領域は、変更されたエフェクター機能を提供し、それは次に、抗体の生物学的プロファイルに影響を与える。例えば、いくつかの態様では、定常領域の欠失または不活性化(点突然変異または他の手段による)が、抗体が循環するときに、改変された抗体のFc受容体結合を低減または排除する。いくつかの態様では、定常領域改変は、抗体の血清半減期を増加させる。いくつかの態様では、定常領域改変は、抗体の血清半減期を減少させる。いくつかの態様では、定常領域改変は、抗体のADCCおよび/または補体依存性細胞傷害性(CDC)を減少、低減、または除去する。いくつかの態様では、対応するIgG2またはIgG4残基を有するヒトIgG1 Fc領域における特定のアミノ酸置換が、改変された抗体におけるエフェクター機能(例えば、ADCCおよびCDC)を低減させ得る。いくつかの態様では、抗体は、1つ以上のエフェクター機能を有しない。いくつかの態様では、抗体は、ADCC活性および/またはCDC活性を有しない。いくつかの態様では、抗体は、Fc受容体および/または補体因子に結合しない。いくつかの態様では、抗体は、エフェクター機能を有しない(例えば、「エフェクターレス」抗体)。いくつかの態様では、定常領域改変は、抗体のエフェクター機能を増加または増強させる。いくつかの態様では、定常領域改変は、抗体のADCCおよび/またはCDCを増加または増強させる。いくつかの態様では、定常領域は、ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を排除するように改変される。いくつかの態様では、定常領域は、1つまたは複数のアミノ酸を付加/置換して、1つまたは複数の細胞毒素、オリゴ糖、または炭水化物付着部位を提供するように改変される。
本明細書に記載の抗体の定常領域への改変は、周知の生化学的または分子工学的技術を使用して行うことができる。いくつかの態様では、抗体変異体は、適切なヌクレオチド変化をコードDNAに導入することによって、および/または所望の抗体またはポリペプチドの合成によって調製される。この技術を使用して、改変抗体の構造、結合活性、および他の所望の特性を実質的に維持しながら、特定の配列または領域によって提供される活性またはエフェクター機能を破壊することが可能となり得る。
本開示は、本明細書に記載の組換え、モノクローナル、キメラ、ヒト化、およびヒト抗体、またはそれらの抗体フラグメントに実質的に相同である追加の変異体および等価物をさらに包含する。いくつかの態様では、抗体の結合親和性を改善することが望まれる。いくつかの態様では、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、免疫原性、および/または溶解性を含むがこれらに限定されない、抗体の生物学的特性を調節することが望まれる。当業者は、アミノ酸の変化が、グリコシル化部位の数もしくは位置の変化または膜固定特性の変化などの、抗体の翻訳後プロセスを変化させ得ることを理解するであろう。変異は、天然の抗体またはポリペプチド配列と比較してアミノ酸配列の変化をもたらす、抗体またはポリペプチドをコードする1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入であり得る。いくつかの態様では、アミノ酸置換は、ロイシンをセリンで置換することのような、あるアミノ酸を類似の構造的および/または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換すること、例えば保存的アミノ酸置換の結果である。本明細書に記載の変異体抗体またはポリペプチドは、部位特異的変異誘発、アラニンスキャニング変異誘発、およびPCR変異誘発を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている方法を使用して生成され得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるようなNOTCH4活性を阻害する薬剤は、化学的に修飾される。いくつかの態様では、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、および/または細胞リガンドもしくは他のタンパク質への連結によって化学的に修飾された可溶性ROBO1 ECDおよび/または抗NOTCH4抗体。多数の化学的修飾のいずれも既知の技術によって行われ得る。
いくつかの態様では、方法は、哺乳動物種における乳汁産生を増加させることを含み得、哺乳動物種は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヤギを含み、この方法は、哺乳動物種に、それぞれヒトROBO1、ウシROBO1、ヒツジROBO1、ヤギROBO1、またはヤギROBO1に由来する可溶性ROBO1 ECDを投与することを含み得る。特定の態様では、哺乳動物は、乳汁産生に適した発育段階の雌である。例えば、哺乳動物は、乳腺を発育させた女性であり得る。特定の態様では、哺乳動物は、ヒト女性、乳牛、雌牛、雌羊、または雌ラクダである。特定の態様では、NOTCH4活性を阻害する薬剤が哺乳動物に投与されるときに、哺乳動物は妊娠中であり得る。特定の態様では、哺乳動物は、NOTCH4活性を阻害する薬剤の投与前に出産した動物であり得る。例えば、哺乳動物は、投与から1~2年以内に、例えば、3ヶ月、6ヶ月、1年、または18ヶ月以内に出産した動物であり得る。他の態様では、哺乳動物は妊娠していない。いくつかの態様では、哺乳動物は、NOTCH4活性を阻害する薬剤の投与前に出産していない。例えば、哺乳動物は、投与後1~2年以内、例えば、3ヶ月、6ヶ月、1年、または18ヶ月以内に出産していない。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるようなNOTCH4活性を阻害する薬剤は、NOTCH4 mRNAに結合しNOTCH4の発現を減少させる、RNAi構築物であり得る。いくつかの態様では、本明細書に記載されるようなROBO2活性を阻害する薬剤は、ROBO2 mRNAに結合しROBO2の発現を減少させる、RNAi構築物であり得る。RNAi構築物は、短い干渉RNA(siRNA)であり得る。siRNAは、短いトヘアピンRNA(shRNA)であり得る。RNAi構築物は、マイクロRNA(miRNA)であり得る。既知遺伝子配列の発現を阻害するためのRNAi構築物を作製するための方法は、当業者に知られている。特定の態様では、NOTCH4の発現を減少させるためのsiRNAは、配列番号32または33に示される核酸配列を含み得る。特定の態様では、ROBO2の発現を減少させるためのsiRNAは、配列番号34または35に示される核酸配列を含み得る。特定の態様では、RNAi構築物は、哺乳動物に投与され得る。他の態様において、核酸
特定の態様では、哺乳動物における乳汁産生を促進するための方法は、NOTCH4活性を阻害する1つ以上の薬剤を投与することを含み得る。特定の態様では、この方法は、第1の薬剤および第2の薬剤のうちの少なくとも1つを投与することを含み得、第1の薬剤および第2の薬剤は、可溶性ROBO1 ECD、抗NOTCH4抗体、NOTCH4の発現を阻害するRNAi構築物、またはROBO2の発現を阻害するRNAi構築物から独立して選択される。特定の態様では、この方法は、第1の薬剤、第2の薬剤、および第3の薬剤のうちの少なくとも1つを投与することを含み得、第1の薬剤、第2の薬剤、および第3の薬剤は、可溶性ROBO1 ECD、抗NOTCH4抗体、NOTCH4の発現を阻害するRNAi構築物、またはROBO2の発現を阻害するRNAi構築物から独立して選択される。特定の態様では、この方法は、第1の薬剤、第2の薬剤、第3の薬剤、および第4の薬剤を投与することを含み得、第1の薬剤、第2の薬剤、第3の薬剤、および第4の薬剤は、可溶性ROBO1 ECD、抗NOTCH4抗体、NOTCH4の発現を阻害するRNAi構築物、またはROBO2の発現を阻害するRNAi構築物から独立して選択される。
NOTCH4活性を阻害するための1つ以上の薬剤は、非経口(例えば、筋肉内、静脈内、皮下(例えば、注射またはインプラント)、腹腔内、大槽内、関節内、腹腔内、脳内(例えば、実質内)および脳室内)、経口、経鼻、腟内、舌下、眼内、直腸内、局所(例えば、皮下)、舌下および吸入を含む、任意の適切な経路を介して、乳汁産生を促進するために哺乳動物に投与され得る。特定の態様では、1つ以上の薬剤は、直接注射、例えば、乳腺組織への注射、例えば、管内注射により投与され得る。
NOTCH4活性を阻害するための薬剤およびその組成物
本明細書に提供されるのはまた、本明細書に開示された方法を実施するために使用され得る薬剤およびその組成物である。
本明細書に提供されるのはまた、本明細書に開示された方法を実施するために使用され得る薬剤およびその組成物である。
特定の態様では、本明細書に開示されるような可溶性ROBO1 ECDポリペプチドを含むポリペプチドが提供される。可溶性ROBO1 ECDポリペプチドは、本明細書に開示されるように異種ポリペプチドに融合され得る。特定の態様では、本明細書に開示されるような可溶性ROBO1 ECDポリペプチドをコードする核酸が提供される。可溶性ROBO1 ECDポリペプチドの説明は、前のセクションおよび本明細書の他の場所で提供されており、簡潔にするためにここでは繰り返さない。可溶性ROBO1 ECDは、当該技術分野で知られている方法を使用して産生され得る。ポリペプチドは、標準的な組換えDNA技術を使用して、または化学的方法を使用して、全体的または部分的に生成され得る。ポリペプチドを合成するための化学的方法は、自動化された合成器(例えば、Biotage機器)を使用して実行され得る様々な固相技術を使用することを含み得る。ポリペプチドを合成するための化学的方法は、コンビナトリアル方法論を使用することを含み得る。さらに、ポリペプチドは、当業者に知られている多種多様な化学的方法によって修飾され得る。ポリペプチド配列の変異、置換、および/または改変は、部位特異的変異誘発、アラニンスキャニング、および/またはPCRベースの変異誘発などの方法を使用して行われ得る。部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、制限選択変異誘発、および他の技術をクローン化DNAに対して実行して、可溶性ROBO1 ECD、変異体、融合物、キメラ、およびそれらの他の誘導体を産生することができる。「産生された」または「合成された」ポリペプチド配列は、人の手による操作が関わる任意の方法によって作製されたポリペプチドである。そのような方法には、化学合成、組換えDNA技術、より大きな分子の生化学的または酵素的断片化、および前述のものの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
ポリペプチド、例えば、可溶性ROBO1 ECDポリペプチドが組換え技術を使用して生成される場合、該ポリペプチドは、任意の適切な構築物、および原核細胞または真核細胞(それぞれ、細菌(例えば大腸菌)または酵母宿主細胞など)であり得る任意の適切な宿主細胞を使用して、細胞内タンパク質または分泌タンパク質として産生され得る。特定の態様では、ポリペプチドの生成のための宿主細胞として使用される真核細胞には、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および/または植物細胞が含まれる。特定の態様では、哺乳動物宿主細胞が使用され、ヒト細胞(例えば、HeLa、293、H9およびJurkat細胞)、マウス細胞(例えば、NIH3T3、L細胞、およびC127細胞);霊長類細胞(例えば、Cos1、Cos7、およびCV1)ならびにハムスター細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞)を含み得る。特定の態様では、本明細書に開示されるポリペプチドは、CHO細胞またはHEK細胞において産生される。特定の態様では、本開示のポリペプチド、例えば、可溶性ROBO1 ECDは、ヘパリンの存在下で培養された細胞において産生される。例えば、約300ng/mlのヘパリンが培養培地に含まれ得る。他の態様では、本開示のポリペプチド、例えば、可溶性ROBO1 ECDは、有意な量のヘパリンを含まない培養培地で培養された細胞において産生され、例えば、培養培地は、300ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、または1ng/ml未満のヘパリンを含み得、またはヘパリンなしであり得る。
ポリペプチドの発現に適した様々な宿主-ベクターシステムを、当該技術分野で知られている標準的な手順に従って使用することができる。例えば、Sambrook et al.,1989 Current Protocols in Molecular Biology Cold Spring Harbor Press,New York、およびAusubel et al.1995 Current Protocols in Molecular Biology,Eds.Wiley and Sonsを参照されたい。遺伝物質を宿主細胞に導入するための方法には、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、リン酸カルシウム法などが含まれる。導入されたポリペプチドをコードする核酸の安定した発現を提供するように、移入のための方法を選択することができる。ポリペプチドをコードする核酸は、遺伝性エピソーム要素(例えば、プラスミド)として提供され得、またはゲノムに組み込まれ得る。関心対象のポリペプチドの産生に使用するための様々な適切なベクターが市販されている。
ベクターは、宿主細胞における染色体外維持を提供することができ、または宿主細胞ゲノムへの統合を提供することができる。発現ベクターは、転写調節および翻訳調節配列を提供し、誘導性または構成的発現を提供し得、コード領域が、転写開始領域の転写制御下、ならびに転写および翻訳終端領域下で機能的に連結されている。概して、転写調節配列および翻訳調節配列は、これらに限定されないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサーまたは活性化配列を含み得る。プロモーターは、構成的または誘導的のいずれかであり得、かつ強力な構成的プロモーター(例えば、T7)であり得る。
本明細書に提供されるのはまた、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする核酸である。特定の態様では、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドの発現を与えるプロモーター配列に機能的に連結されている。特定の態様では、核酸の配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のためにコドン最適化されている。特定の態様では、核酸は、デオキシリボ核酸(DNA)である。特定の態様では、核酸は、リボ核酸(RNA)である。本明細書に提供されるのはまた、本明細書に記載されるような、乳汁産生を促進するためのポリペプチドをコードする核酸を含むベクターである。特定の態様では、ベクターは、ウイルスベクターである。
特定の態様では、本明細書に開示されるような抗NOTCH4抗体が提供される。抗NOTCH4抗体の説明は、前のセクションおよび本明細書の他の場所で提供されており、簡潔にするためにここでは繰り返さない。NOTCH4活性を阻害するための抗NOTCH4抗体は、本明細書に開示されるアッセイおよび/または細胞および動物モデルなどの任意の適切な手段を使用することによって同定され得る。
特定の態様では、本明細書に開示されるような、NOTCH4の発現を阻害するRNAi構築物またはROBO2の発現を阻害するRNAi構築物が提供される。そのようなRNAi構築物の説明は、前のセクションおよび本明細書の他の場所で提供されており、簡潔にするためにここでは繰り返さない。NOTCH4活性を阻害するためのRNAi構築物は、本明細書に開示されるアッセイおよび/または細胞および動物モデルなどの任意の適切な手段を使用することによって同定され得る。
本明細書に開示されるのはまた、本明細書に開示されるようなNOTCH4活性の1つ以上の阻害剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。本明細書で使用されるような「薬学的に許容される」という用語は、規制当局によって承認されまたは承認可能であるか、または米国薬局方、欧州薬局方、またはヒトを含む動物で使用するための他の一般的に認められている薬局方に記載されている物質を指す。
本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤、担体、またはアジュバント」または「許容される医薬担体」という用語は、少なくとも1つの薬剤とともに対象に投与され得、薬剤の薬理学的活性への影響を有しない、賦形剤、担体、またはアジュバントを指す。一般に、当業者およびU.S.FDAは、薬学的に許容される賦形剤、担体、またはアジュバントが、製剤の不活性成分であるとみなしている。
本明細書で使用されるような「医薬製剤」または「医薬組成物」という用語は、薬剤(例えば、抗体)の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態にある調製物を指す。医薬製剤または組成物は、一般に、薬学的に許容される賦形剤、担体、アジュバント、緩衝液などの追加の成分を含む。
特定の態様において、ポリペプチドおよび核酸(例えば、ポリペプチドまたはRNAiをコードする)は、医薬組成物中に治療有効量で存在する。治療有効量は、組成物の観察された有効性に基づいて決定され得る。治療有効量は、細胞における、例えば、本開示のポリペプチドに応答してレポーターの発現が調節されるレポーター細胞株における、所望の効果を測定するアッセイを使用して決定され得る。医薬組成物は、本明細書に記載の方法および使用を実施するために、エクスビボまたはインビボで哺乳類に投与され得る。
本開示の医薬組成物は、意図された投与方法または投与経路と適合性があるように製剤化され得、例示的な投与経路が本明細書に記載されている。適切な薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤には、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、生理食塩水またはクエン酸緩衝食塩水などの適切なビヒクルが含まれるが、これらに限定されない。
非経口、皮内、または皮下投与に使用される溶液または懸濁液には、以下の成分が含まれ得る:注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤;ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤。pHは、塩酸および水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整され得る。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の複数回投与用バイアルに封入され得る。
注射可能な使用に適した医薬組成物は、典型的には、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL(商標)(BASF、Parsippany,N.J.)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が含まれる。
滅菌注射液は、必要に応じて、上記に列挙された成分の1つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に必要な量で活性化合物を組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒および上記に列挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、予め滅菌濾過されたその溶液からの活性成分プラス任意の所望する追加成分の粉末を生じる。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与の目的で、活性化合物は、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態で賦形剤とともに組み込まれて使用され得る。うがい薬として使用するための流体担体を使用して、経口組成物を調製することもできる。医薬的に適合性のある結合剤、および/またはアジュバント材料を、組成物の一部として含められ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物を含み得る:微結晶性セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなどの結合剤;デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤;アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテスなどの潤滑剤;コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤;ショ糖もしくはサッカリンなどの甘味剤;またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくオレンジフレーバーなどの香味剤。経口送達用の製剤は、胃腸管内の安定性を改善するため、および/または吸収を増強するための薬剤を有利に組み込むことができる。
吸入による投与のために、組成物は、適切な噴霧剤(例えば二酸化炭素などのガス)を含有する加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態での送達のための送達剤とともに製剤化される。
全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与の場合、浸透するバリアに適した浸透剤が、製剤中に使用される。そのような浸透剤は、一般に、当該技術分野で知られており、例えば、経粘膜投与用に、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、スプレー式点鼻剤または坐剤を使用することにより行われ得る。経皮投与の場合、活性化合物および送達剤は、当該技術分野で一般に知られているように、軟膏(ointment)、軟膏(salve)、ゲル、またはクリームに製剤化される。組成物はまた、坐剤(例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いる)または直腸投与のための停留浣腸の形態でも調製され得る。
一態様では、組成物は、例えばインプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、身体からの急速な排除に対して化合物を保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための方法は、当業者には明らかであろう。これらの材料は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Inc.から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体と共に感染細胞に標的指向化されるリポソームを含む)も、薬学的に許容される担体として使用され得る。
経口または非経口組成物は、投与の容易さおよび投与量の一様性のために、投与量単位形態で製剤化され得る。本明細書で使用される投与量単位形態は、意図された対象の単一投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体に付随して所望の効果を生み出すように計算された所定量の活性化合物を含む。
上記のように、siRNAまたはshRNAの転写のためのテンプレートとして機能する核酸分子は、遺伝子治療ベクターとして使用され得るベクターに挿入され得る。可溶性ROBO1 ECDをコードする核酸分子もまた、遺伝子治療ベクターとして使用され得るベクターに挿入され得る。一般に、遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与、または定位注射によって対象に送達され得る。特定の態様では、遺伝子治療ベクターおよび送達剤を含む組成物は、経口でまたは吸入により送達され得、それらを分解などから保護するためにカプセル化され得、または他の方法で操作され得る。遺伝子治療ベクターを含む医薬組成物は、許容可能な希釈剤を含み得、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞からインタクトで産生され得る場合(例えばレトロウイルスまたはレンチウイルスベクター)、医薬調製物は、その遺伝子送達システムを産生する1つ以上の細胞を含み得る。
医薬組成物は、投与の指示書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含められ得る。
トランスジェニック哺乳動物
特定の態様では、以下の表現型:可溶性ROBO1細胞外ドメインの発現;ROBO2の発現の阻害;およびNOTCH4の発現の阻害のうちの1つ以上をもたらす遺伝子改変を含む、トランスジェニック哺乳動物が提供される。特定の態様では、トランスジェニック哺乳動物は、ネズミ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはラクダであり得る。
特定の態様では、以下の表現型:可溶性ROBO1細胞外ドメインの発現;ROBO2の発現の阻害;およびNOTCH4の発現の阻害のうちの1つ以上をもたらす遺伝子改変を含む、トランスジェニック哺乳動物が提供される。特定の態様では、トランスジェニック哺乳動物は、ネズミ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはラクダであり得る。
特定の態様では、表現型は、乳腺組織に限定される。特定の態様では、表現型の発現を誘導するために乳腺組織特異的プロモーターを使用することによって、表現型は乳腺組織に限定される。
特定の態様では、トランスジェニック哺乳動物は、記載された表現型のうちの2つをもたらす2つの遺伝子改変を含み得る。特定の態様では、トランスジェニック哺乳動物は、記載された表現型の3つすべてをもたらす3つの遺伝子改変を含み得る。
特定の態様では、本明細書に開示されるような、乳汁産生を促進するための方法は、本明細書に開示されるように、NOTCH4活性を阻害する医薬組成物の少なくとも1つをトランスジェニック哺乳動物に投与することを含み得る。
特定の態様では、トランスジェニック動物は、可溶性ROBO1細胞外ドメインの発現をもたらす遺伝子改変を含み得、この方法は、抗ROBO1抗体、および抗NOTCH4抗体、またはROBO2および/またはNOTCH4の発現を阻害するRNAi構築物を含む医薬組成物をトランスジェニック動物に投与することをさらに含み得る。
特定の態様では、トランスジェニック動物は、ROBO2および/またはNOTCH4の発現の阻害をもたらす遺伝子改変を含み得、この方法は、本明細書に開示されるような可溶性ROBO1 ECDを含む医薬組成物をトランスジェニック動物に投与することをさらに含み得る。
トランスジェニック哺乳動物は、当該技術分野で知られている方法を使用して生産され得る。トランスジェニック哺乳動物を生産するための例示的な方法は、以下のステップを含み得る:1)プロモーターの制御下で、可溶性ROBO1 ECDをコードする核酸、またはNOTCH4もしくはROBO2を標的とするsiRNAもしくはshRNAに転写される核酸配列を含む遺伝子構築物を産生するステップ。プロモーターは、乳腺特異的プロモーターまたは遍在的に活性なプロモーターであり得る。2)遺伝子構築物を哺乳動物からの細胞、例えばウシ細胞にトランスフェクトし、遺伝子構築物を組み込んだトランスジェニック細胞を選択するステップ。3)トランスジェニック細胞を、そのトランスジェニック細胞と同じ種(例えばウシ)からの除核卵母細胞と融合させ(例えば、電気パルスを印加することにより)、卵母細胞を胚に発達させるステップ。4)胚と同じ種のレシピエント哺乳動物(例えば、ウシ)に胚を移植するステップ。5)胚がトランスジェニック哺乳動物に発達したことを確認するステップ。
実験
ROBO1は、内腔コンパートメントと基底コンパートメントの両方で発現し、妊娠中にアップレギュレートされる。
以前に発表された研究は、処女動物における分岐形態形成の期間中のSLIT/ROBO1シグナル伝達の役割に焦点を合わせている11、15、16。妊娠中のROBO1の役割を調査するために、乳腺から分離された細胞のRobo1 mRNAレベルをRT qPCRを使用して測定した(図1C)。細胞を成体の処女および妊娠18日目(PD18)の野生型(WT)マウスから採取し(図1Cに示すように)、3つの亜集団に蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって精製した:管腔前駆細胞(LP、Lin-CD24loCD29+CD61+)、成熟管腔(ML、Lin-CD24loCD29+CD61-)、および基底(BC、Lin-CD24+CD29hi)17、18。結果は、管腔前駆細胞および成熟管腔の両方でRobo1のアップレギュレーションを示すが、基底の亜集団では示さない(図1C)。
ROBO1は、内腔コンパートメントと基底コンパートメントの両方で発現し、妊娠中にアップレギュレートされる。
以前に発表された研究は、処女動物における分岐形態形成の期間中のSLIT/ROBO1シグナル伝達の役割に焦点を合わせている11、15、16。妊娠中のROBO1の役割を調査するために、乳腺から分離された細胞のRobo1 mRNAレベルをRT qPCRを使用して測定した(図1C)。細胞を成体の処女および妊娠18日目(PD18)の野生型(WT)マウスから採取し(図1Cに示すように)、3つの亜集団に蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって精製した:管腔前駆細胞(LP、Lin-CD24loCD29+CD61+)、成熟管腔(ML、Lin-CD24loCD29+CD61-)、および基底(BC、Lin-CD24+CD29hi)17、18。結果は、管腔前駆細胞および成熟管腔の両方でRobo1のアップレギュレーションを示すが、基底の亜集団では示さない(図1C)。
組織におけるROBO1およびROBO2タンパク質の発現を評価するために、免疫組織化学(図1D)およびβ-ガラクトシダーゼ(lacZ)染色(図1E)を、マウスのWTおよびRobo1lacZ/+成熟処女乳腺の組織切片で実施した。免疫組織化学およびβ-gal染色を、妊娠16日目(PD16)(図1F)および授乳3日目(LD3)(図1G)の乳腺切片でも実施した。ROBO1タンパク質は、成熟した処女および妊婦の乳腺の管腔細胞の亜集団で発現される(図1D-Fの矢頭)。基礎的な筋上皮ROBO1の発現は、妊娠中の妊婦および授乳中の乳腺でも観察される(図1F、G矢印)。
ROBO1は腺房形成を促進する:
腺房形成中のROBO1機能を調査するために、Robo1遺伝子発現がHC11細胞において阻害された(Robo1 KD)。HC11細胞は、授乳の確立されたプロラクチン応答モデルである19、20。Robo1遺伝子発現が阻害されなかった細胞は、ここではWTまたはRobo1+/+と呼ばれる。乳汁産生を測定するために、細胞をコンフルエンスになるまで増殖させた後、上皮増殖因子(EGF、10ng/ml)で処理することによりプライミングした。EGFは、チャコールストリッピング化ウシ胎児血清と組み合わせて3日間投与され、その後、EGFの非存在下で1日チャコールストリッピング化ウシ胎児血清が投与される。次に、これらのプライミングされた細胞は、デキサメタゾン(1μg/ml)、インスリン(5μg/ml)およびプロラクチン(Prl、5μg/ml)培地(DIP培地)で3~5日間処理することにより分化する(図2A)。分化(Dif)により、乳汁で満たされたドームの発達がもたらされる(図2B)。DIP培地での処理に応答して、統計的に有意に少ない乳汁ドーム形成および統計的に有意に少ないホエイ酸性タンパク質(WAP)遺伝子発現が観察された(図2B)。細胞を未分化(Undif)のままにした場合、WT細胞またはRobo1-/-細胞のいずれにもドーム形成はほとんどなかった(図2B)。次に、Robo1ノックアウトマウス(Robo1-/-)および野生型マウス(WTまたはRobo1+/+)マウスの組織を分析した。乳腺を妊娠18日目のWTおよびRobo1-/-動物から採取し、腺房形成を、連続切片、カーマイン染色、および組織の上部分、中部分、下部分に位置する切片において腺房が占める面積を定量化することによって分析した。この分析により、WT乳腺と比較して、Robo1-/-における腺房面積が大幅に低減していることが明らかになった(図2C)。
腺房形成中のROBO1機能を調査するために、Robo1遺伝子発現がHC11細胞において阻害された(Robo1 KD)。HC11細胞は、授乳の確立されたプロラクチン応答モデルである19、20。Robo1遺伝子発現が阻害されなかった細胞は、ここではWTまたはRobo1+/+と呼ばれる。乳汁産生を測定するために、細胞をコンフルエンスになるまで増殖させた後、上皮増殖因子(EGF、10ng/ml)で処理することによりプライミングした。EGFは、チャコールストリッピング化ウシ胎児血清と組み合わせて3日間投与され、その後、EGFの非存在下で1日チャコールストリッピング化ウシ胎児血清が投与される。次に、これらのプライミングされた細胞は、デキサメタゾン(1μg/ml)、インスリン(5μg/ml)およびプロラクチン(Prl、5μg/ml)培地(DIP培地)で3~5日間処理することにより分化する(図2A)。分化(Dif)により、乳汁で満たされたドームの発達がもたらされる(図2B)。DIP培地での処理に応答して、統計的に有意に少ない乳汁ドーム形成および統計的に有意に少ないホエイ酸性タンパク質(WAP)遺伝子発現が観察された(図2B)。細胞を未分化(Undif)のままにした場合、WT細胞またはRobo1-/-細胞のいずれにもドーム形成はほとんどなかった(図2B)。次に、Robo1ノックアウトマウス(Robo1-/-)および野生型マウス(WTまたはRobo1+/+)マウスの組織を分析した。乳腺を妊娠18日目のWTおよびRobo1-/-動物から採取し、腺房形成を、連続切片、カーマイン染色、および組織の上部分、中部分、下部分に位置する切片において腺房が占める面積を定量化することによって分析した。この分析により、WT乳腺と比較して、Robo1-/-における腺房面積が大幅に低減していることが明らかになった(図2C)。
この欠陥が乳腺上皮のRobo1阻害によるものであり、ホルモン産生に影響を与える可能性のあるその全身的な欠失に起因するものではないことを確認するために21、Robo1-/-および同腹仔Robo1+/+マウスの組織を、標準プロトコル22に従って内因性乳腺上皮が事前に除去された宿主に対側的に移植した。10週間後、動物を交配させ、妊娠18日目に組織を検査した。移植されたRobo1-/-KO乳腺では腺房面積が大幅に減少し(図2D)、インタクトなRobo1-/-動物の乳腺で観察された結果と同様の結果が得られた(図2C)。妊娠によって調節される特定のマーカーの発現を評価するために、Robo1-/-およびRobo1+/+組織を授乳1日目に採取し、RNAを抽出し、乳汁産生に関与することが知られている遺伝子についてRT-qPCRを実行した。Robo1-/-組織では、WAP、ラクトアルブミンアルファ(Lalba)、キサンチンデヒドロゲナーゼ(XDH)、ブチロフィリン(Btn1)の有意に低い発現が観察された(図2E)。
選択されたマーカーを、免疫組織化学を使用してさらに評価した。Robo1-/-およびWTの妊娠18日目の乳腺でのWAP発現は、Robo1-/-組織でのWAP免疫染色が少ないことを示した(図2F)。移植された妊娠16日目の組織を、脂質結合タンパク質ペリリピン2(PLIN2)に特異的な抗体で免疫染色した。Robo1-/-乳腺組織では、PLIN2免疫染色があまり観察されなかった(図2G)。
さらに、全臓器組織のクリアリングを使用して、組織の光学的透明度と形態学的保存を最適化した。これに続いて、腺房形成6に必要な転写因子ELF5に特異的な抗体を使用し、細胞間接着タンパク質E-カドヘリン(CDH1)に特異的な抗体を使用した二重免疫組織化学が行われた(図2H)。Robo1+/+組織と比較して、Robo1-/-では有意に少ないELF5染色が観察された(図2H)。
Robo1の喪失はインビボでの乳汁産生を妨害する:
乳汁産生に対するRobo1発現の影響を評価するために、ヘテロ接合の子が生まれるように交配を行って、その子らはRobo1-/-雌親またはWT雌親のいずれかによって授乳された。ヘテロ接合の子は、WTオスとRobo1-/-メスを交配すること、およびRobo1-/-オスとWTメスを交配することによって生まれた。同腹仔の数は5匹に制限され、これらの子の体重は毎日測定された(図2I)。WT雌親によって飼育されたヘテロ接合の子は直線的に体重が増加したが、Robo1-/-雌親によって飼育されたヘテロ接合の子の体重増加はより少なかった(図2J)。
乳汁産生に対するRobo1発現の影響を評価するために、ヘテロ接合の子が生まれるように交配を行って、その子らはRobo1-/-雌親またはWT雌親のいずれかによって授乳された。ヘテロ接合の子は、WTオスとRobo1-/-メスを交配すること、およびRobo1-/-オスとWTメスを交配することによって生まれた。同腹仔の数は5匹に制限され、これらの子の体重は毎日測定された(図2I)。WT雌親によって飼育されたヘテロ接合の子は直線的に体重が増加したが、Robo1-/-雌親によって飼育されたヘテロ接合の子の体重増加はより少なかった(図2J)。
ROBO1はNOTCH4シグナル伝達と相互作用し、それを阻害する:
Notchシグナル伝達は用量に非常に敏感であり、その帰結は受容体活性のレベルに依存する23。リガンド結合後、Notch受容体は切断によって活性化される。最初に細胞外切断があり、続いてγ-セクレターゼを介した細胞内切断があり、Notch細胞内ドメイン(ICD)が放出され、ICDは核に入り、転写を調節する。処女乳腺から単離されたFACS精製亜集団のRNAシーケンシング解析は、Robo1+/+と比較して、Robo1-/-管腔前駆細胞(LP)亜集団におけるNotchシグナル伝達エフェクターHey1のより高い発現を明らかにしている(図3A)。
Notchシグナル伝達は用量に非常に敏感であり、その帰結は受容体活性のレベルに依存する23。リガンド結合後、Notch受容体は切断によって活性化される。最初に細胞外切断があり、続いてγ-セクレターゼを介した細胞内切断があり、Notch細胞内ドメイン(ICD)が放出され、ICDは核に入り、転写を調節する。処女乳腺から単離されたFACS精製亜集団のRNAシーケンシング解析は、Robo1+/+と比較して、Robo1-/-管腔前駆細胞(LP)亜集団におけるNotchシグナル伝達エフェクターHey1のより高い発現を明らかにしている(図3A)。
Sca/CD54マーカーを使用して、FACSで精製した管腔前駆細胞のプールから腺房前駆細胞(AVP)を濃縮した。バルク管腔前駆細胞からのデータ(図3A)と同様に、腺房前駆細胞(AVP)のRT-qPCR解析により、Robo1+/+と比較して、Robo1-/-で3つの下流Notchエフェクター(Hey1、Hes1およびHey2)の有意に高い発現が明らかになった(図3B)。同様に、HC11細胞では、WT細胞と比較して、Hey1、Hes1、およびHey2の有意に高い発現が、Robo1発現の阻害後に観察された(図3C)。HC11細胞におけるRobo1発現の阻害はまた、WTと比較して、分化促進マーカーElf5の有意に低い発現をもたらした(図3C)。これらのデータは、初代細胞および組織培養細胞の両方でのRobo1発現の阻害が、Notchエフェクター遺伝子のアップレギュレーションおよび分化促進Elf5遺伝子のダウンレギュレーションをもたらすことを示し、ROBO1が存在しない場合のNotchシグナル伝達の活性化をさらに示唆している。
以前の研究は、腺房形成が、Notchシグナル伝達6、特に、NOTCH47~9のダウンレギュレーションを要することを示している。腺房前駆細胞(AVP)が処女(Virg)および妊娠18日目(PD18)の動物からFACS精製され、Notch4標的遺伝子Hes1およびHey1の発現がRT-qPCRによって調べられた(図3D)。両方のNotch標的遺伝子が、処女動物の腺から単離された腺房前駆細胞と比較して、妊娠動物の腺から単離された腺房前駆細胞において有意にダウンレギュレーションされたことが観察された。
HC11細胞分化アッセイにおけるNotchの効果も評価された。Robo1発現の阻害(KD)により、コントロール(Scr)と比較して、HC11乳汁ドームの形成の大幅な減少がもたらされた(図3E)。Robo1発現が阻害されたHC11細胞(siR1)は、コントロール(Scr)と比較して、WAPおよびLalbaの発現も少ないことが示された(図3F)。これらの効果は両方とも、γ-セクレターゼ阻害剤(GSI、RO4929097)で細胞を処理することによって救済された(siR1+GSI)(図3E、F)。このγ-セクレターゼ阻害剤はNotchシグナル伝達を防止するように作用するものであり、Robo1の喪失がNotch4シグナル伝達を増強して、γ-セクレターゼ処理によって救済され得る効果をもたらすという概念をさらに支持する。
追加の実験では、Notch4の発現が、HC11細胞で阻害された(siN4)。これらの細胞は、コントロール細胞(Scr)と比較して、より大きなWAPおよびLalba発現を示した。さらに他の実験では、Robo1およびNotch4の両方の発現がHC11細胞で阻害され(dKD)、Robo1阻害プラスGSI処理(siR1+GSI)で観察されたWAPとLalbaの発現レベルと同様に、コントロール細胞(Scr)と比較してWAPおよびLalbaの発現が増加した(図3F)。Notch4ノックダウンは、コントロール細胞(Scr)と比較して、有意に高いドーム数をもたらし(図3G)、これは、乳汁遺伝子でのより大きな発現と一致した結果である(図3F)。これらのデータは、NOTCH4が腺房形成を阻害するモデルを支持する。Robo1の発現を阻害すると(siR1)、コントロール細胞(Scr)と比較して、形成される乳汁ドームが大幅に少なくなった(図3G)が、Robo1およびNotch4の両方の発現を同時に阻害すると(dKD)、より多くの乳汁ドームが形成され、これはNotch4発現の阻害のみ(siN4)で観察されたのと同じ効果であった(図3G)。総合すると、これらのデータは、ROBO1およびNOTCH4が同じ経路で機能して、ROBO1がNOTCH4を阻害し、NOTCH4が腺房形成を阻害することで腺房形成を調節することを示唆している。
ノッチ受容体の活性化は、結合パートナーとの直接的な相互作用を通じて調節され得る24。その結果、ROBO1がNOTCH4に結合し、NOTCH4の切断および活性化を直接阻害する可能性がある。この可能性を調べるために、4つのNotch受容体(NOTCH1-4)すべての検出可能なレベルを発現するMBA-MD-231細胞溶解物を使用して、共免疫沈降実験を実施した。内因性ROBO1はNOTCH4と共免疫沈降したが、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3とは共免疫沈降しなかった(図3H、データは示していない)。次に、NOTCH4細胞内ドメイン(N4-ICD)およびHES1の発現と細胞内局在を、コントロール(Scr)およびRobo1(siR1)ノックダウンHC11細胞で調べた。HC11細胞でRobo1の発現が阻害され、それからHC11細胞は上記のように分化のためにプライミングされた。Robo1ノックダウン細胞は、コントロール細胞(Scr)と比較して、核NOTCH4細胞内ドメイン(N4-ICD)およびHES1の有意に高い発現を示した。この効果は、Robo1を過剰発現するように操作されたコントロールRobo1ノックダウン細胞(siR1+o/e)またはγ-セクレターゼ阻害剤GSIで処理された細胞(siR1+GSI)では観察されなかった(図3I~3K)。
追加の研究は、ROBO1/NOTCH4複合体の形成がHC11分化の時間経過にわたってどのように調節されるかを扱った。発現解析は、HC11分化の段階(コンフルエンス、プライミング、乳汁ドーム形成)中に実行された19、20。この時間経過にわたるウエスタンブロットによるROBO1、pSTAT5、およびNOTCH4の細胞内ドメインの解析は、他の段階と比較して、乳汁ドーム形成段階中のROBO1(R1)およびpSTAT5のレベルが高いことを明らかにした。対照的に、NOTCH4細胞内ドメイン(N4-ICD)は、乳汁ドーム形成段階中に低レベルで発現していた(図3L)。この発見は、NOTCH4シグナル伝達が腺房形成中に減衰することを示した以前の研究と一致している7~9。抗ROBO1との共免疫沈降を使用して、SLIT2およびSLIT3の非存在下および存在下の両方で、初期(+EGF)および後期(-EGF)の段階のプライミング化細胞および分化(Dif)HC11細胞でNOTCH4をプルダウンした(図3M)。ROBO1/NOTCH4複合体形成は、分化した(Dif)HC11細胞においてSLIT2/SLIT3処理によって影響を受けないようである。しかしながら、未処理の細胞と比較して、後期プライミング細胞(-EGF)ではSLIT2およびSLIT3の存在下でROBO1/NOTCH4複合体形成はより少なく観察された。ROBO1/NOTCH4複合体は、初期プライミング細胞(+EGF)では検出されず、コントロールIgG免疫沈降物でも検出されなかった。まとめると、これらのデータは、ROBO1が直接結合し、腺房形成中にNOTCH4の切断およびシグナル伝達を阻害し、乳腺上皮細胞の乳汁産生細胞への分化を妨害することを示唆している。
ROBO1は、一次細胞および哺乳動物におけるノッチシグナル伝達を阻害する:
Robo1の欠失は、NOTCH4シグナル伝達を増強し、HC11細胞の分化を阻害するため、このプロセスを一次細胞および動物においてさらに評価した。腺房前駆細胞をFACS精製し、マトリゲルに単一細胞密度で播種した後、ニューレグリン(100ng/ml)およびR-スポンジン(42.5ng/ml)を添加した培地で5日間増殖させた。次に、細胞をDIP培地に切り替え、さらに5日間分化させた25。Robo1-/-腺房前駆細胞から増殖したコロニーは、WT腺房前駆細胞から増殖したコロニーよりも小さいことが観察され、Robo1-/-コロニーはWAPを生成しなかった(図4A)。免疫染色が、培養されたWTおよびRobo1-/-初代管腔細胞で実施された。WT細胞と比較して、Robo1-/-一次細胞の核で有意に高いレベルのNOTCH4細胞内ドメイン(N4-ICD)が検出された(図4B)。これらの研究は、Robo1-/-の腺房前駆細胞(AVP)が核内に高レベルのNOTCH4細胞内ドメインを含み、WTの対応物のような乳汁産生オルガノイドを生成しないことを示している。この発見は、Robo1-/-乳腺で観察された腺房形成障害と一致している(図2)。
Robo1の欠失は、NOTCH4シグナル伝達を増強し、HC11細胞の分化を阻害するため、このプロセスを一次細胞および動物においてさらに評価した。腺房前駆細胞をFACS精製し、マトリゲルに単一細胞密度で播種した後、ニューレグリン(100ng/ml)およびR-スポンジン(42.5ng/ml)を添加した培地で5日間増殖させた。次に、細胞をDIP培地に切り替え、さらに5日間分化させた25。Robo1-/-腺房前駆細胞から増殖したコロニーは、WT腺房前駆細胞から増殖したコロニーよりも小さいことが観察され、Robo1-/-コロニーはWAPを生成しなかった(図4A)。免疫染色が、培養されたWTおよびRobo1-/-初代管腔細胞で実施された。WT細胞と比較して、Robo1-/-一次細胞の核で有意に高いレベルのNOTCH4細胞内ドメイン(N4-ICD)が検出された(図4B)。これらの研究は、Robo1-/-の腺房前駆細胞(AVP)が核内に高レベルのNOTCH4細胞内ドメインを含み、WTの対応物のような乳汁産生オルガノイドを生成しないことを示している。この発見は、Robo1-/-乳腺で観察された腺房形成障害と一致している(図2)。
さらなる研究では、Robo1-/-表現型を逆転させることを試みてNotchシグナル伝達が阻害された。乳腺29を含むいくつかの異なる器官26~28においてNotchを阻害するためにインビボで首尾よく以前に使用されてきたγ阻害剤が選択された。成熟した処女動物を10mg/kgのGSIまたはビヒクルコントロール29で7日間処置した(図4C)。処置後、乳腺を採取し、FACSおよびqPCRで解析した。Robo1-/-乳腺には、WTコントロールと比較して、より多くの腺房前駆細胞が含まれていることが観察された(図4D)。Robo1-/-動物をガンマセクレターゼ阻害剤で処置すると、これらの動物はWT動物と同じ数の腺房前駆細胞を有していた(図4D)。GSI処置は、WT動物における腺房前駆細胞の数に影響を与えなかった(図4D)。
Notchエフェクター遺伝子(Hey1およびHes1)の発現の調査によって、ビヒクルで処置した動物と比較して、GSIで処置した動物ではNotchエフェクターの発現が少ないことが明らかになった(図4E)。GSI阻害剤はNotch受容体を特異的に標的としていないが、この結果は、薬剤が乳腺で作用してNotchシグナル伝達を低下させることを示している。Robo1-/-腺房前駆細胞(AVP)は、ビヒクルで処置したWT動物のAVPと比較して、ビヒクルで処置した場合に高レベルのHey1およびHes1を発現した(図4E)。この結果は、初代腺房前駆細胞およびHC11細胞で見られる結果と類似している(図3B、C)。ビヒクルで処置したRobo1-/-腺房前駆細胞(AVP)は、ビヒクルで処置したWT動物のAVPよりも低レベルのElf5を発現した(図4E)。これは、Robo1+/+乳腺と比較して、Robo1-/-で低レベルのELF5発現が観察され(図2H)、コントロール(Scr)HC11細胞と比較して、Robo1ノックダウンで低レベルのElf5が観察されたことと一致している(図3C)。さらなる観察により、GSIでRobo1-/-動物を処置すると、ビヒクルで処置されたRobo1-/-動物と比較して、変化したAVP遺伝子発現が逆転し、Hey1およびHes1の発現は、ビヒクルで処置されたRobo1-/-動物と比較して、GSIで処置したRobo1-/-動物からのAVPで低く、一方、Elf5発現は、ビヒクルで処置されたRobo1-/-動物と比較して、GSIで処置されたRobo1-/-動物からのAVPで高いことが示された(図4E)。まとめると、この研究は、ROBO1がNOTCH4シグナル伝達を制限していることを示している。Robo1が存在しない場合、NOTCH4が活性化され、この効果は、Notchシグナル伝達の薬理学的阻害(図4E、3E、3F、3I~K)またはNotch4遺伝子発現のノックダウン(図3F、G)のいずれかによって逆転される。
ROBO2は腺房形成を阻害する:
動物および細胞におけるRobo2の阻害は、Robo1発現の阻害からもたらされる表現型とは反対の表現型をもたらした。HC11細胞において、Robo2発現の阻害(Robo2 KD)により、コントロール細胞(Scr)と比較して分化が速くなり、WAP発現が高くなり、乳汁ドーム数が多くなった。同じ細胞におけるRobo1およびRobo2の阻害により、乳汁ドームの数がネガティブコントロールと区別がつかなくなった(図5A)。
動物および細胞におけるRobo2の阻害は、Robo1発現の阻害からもたらされる表現型とは反対の表現型をもたらした。HC11細胞において、Robo2発現の阻害(Robo2 KD)により、コントロール細胞(Scr)と比較して分化が速くなり、WAP発現が高くなり、乳汁ドーム数が多くなった。同じ細胞におけるRobo1およびRobo2の阻害により、乳汁ドームの数がネガティブコントロールと区別がつかなくなった(図5A)。
インタクトなRobo2-/-乳腺および対側的に移植されたRobo2-/-派生物の両方で腺房形成が評価された。腺房面積で測定した場合、Robo2+/+コントロールの乳腺と比較して、無傷のRobo2-/-乳腺とRobo2-/-移植片の両方で、有意に速い腺房形成が観察された(図5B)。インタクトな処女Robo2-/-乳腺(MG)での乳汁遺伝子の発現は、Robo2+/+コントロールよりも高く、一方、Robo2-/-インタクト乳腺からのFACS精製腺房前駆細胞(AVP)でのNotchエフェクター遺伝子(Hey1、Hes1、およびHey2)の発現は、Robo2+/+コントロールよりも低かった(図5C)。
処女乳腺上皮細胞からのFACS精製亜集団においてRT-qPCRによってRobo2の発現が評価された。すべての亜集団で発現するRobo1とは異なり、Robo2の発現は、より制限されており、腺房前駆細胞(AVP)で高レベルで発現し、基底細胞(BC)でより低いレベルで発現する(図5D)。管前駆細胞(DP)での発現は、成熟管腔細胞(ML)での発現と区別できなかった;MLでの発現は正規化に使用された。組織におけるRobo2の発現を、Robo2lacZ/+腺の乳腺切片でのβ-ガラクトシダーゼ(lacZ)染色によって調べた。Robo2の発現は、妊娠18日目の腺房の管腔細胞の亜集団(図5E、上)、および引退したブリーダー動物の管に沿って基底に位置する細胞の亜集団(図5E、下)で観察された。
これらの表現型および発現データについての1つの解釈は、ROBO2が腺房前駆細胞のROBO1を阻害するというものである。分化中、ROBO2はダウンレギュレーションされ、ROBO1を解放し、それがNOTCH4を阻害して、脱抑制回路(ROBO2―|ROBO1―|NOTCH4)を生成する(図5F左)。言い換えれば、Robo2の発現を阻害することで、ROBO1は腺房の分化を促進することができる。Robo1の発現を阻害すると、NOTCH4は腺房の分化を阻害できる。
ROBO1とROBO2の間の相互作用は、SLITによって強化される。
SLITタンパク質とROBOタンパク質の相互作用は、ヒトSLIT2が哺乳類受容体と同様の親和性でショウジョウバエRobo1に結合し、逆に、ショウジョウバエSlitがラットROBO1およびROBO2に結合することを示す研究によって証明されるように、進化的に保存されている30。生化学的研究により、この受容体/リガンド対間の相互作用にはSlitの高度に保存された第2のLRRドメインおよびRoboの保存されたIg1ドメインが関わることが示され、一方、ROBO1のIg2~Ig5ドメインおよびすべてのFN3ドメインは結合に必須ではないと見られる31~34。さらに、研究によれば、ROBO1およびROBO2は、シス32、35、36およびトランス37の両方で、互いに結合し得ることが示されている。この相互作用もIgドメインに依存する。最近の結晶学の実験は、リガンド未結合ROBOが、SLITに応答して開くコンパクトな同型二量体を形成し、ROBO間の「二量体の二量体」の形成を可能にすることを示している38。
SLITタンパク質とROBOタンパク質の相互作用は、ヒトSLIT2が哺乳類受容体と同様の親和性でショウジョウバエRobo1に結合し、逆に、ショウジョウバエSlitがラットROBO1およびROBO2に結合することを示す研究によって証明されるように、進化的に保存されている30。生化学的研究により、この受容体/リガンド対間の相互作用にはSlitの高度に保存された第2のLRRドメインおよびRoboの保存されたIg1ドメインが関わることが示され、一方、ROBO1のIg2~Ig5ドメインおよびすべてのFN3ドメインは結合に必須ではないと見られる31~34。さらに、研究によれば、ROBO1およびROBO2は、シス32、35、36およびトランス37の両方で、互いに結合し得ることが示されている。この相互作用もIgドメインに依存する。最近の結晶学の実験は、リガンド未結合ROBOが、SLITに応答して開くコンパクトな同型二量体を形成し、ROBO間の「二量体の二量体」の形成を可能にすることを示している38。
開示されたモデルは、ROBO2がROBO1を阻害することを示している。この阻害が直接相互作用によるものかどうかを調べるために、ROBO1抗体を使用してHEK細胞の内因性タンパク質に対して共免疫沈降実験を行った。ROBO2抗体により結合されるバンド(グリコシル化形態と見られる)が、ROBO1と共免疫沈降。Robo1の発現が阻害されている細胞を使用して免疫沈降を行うと、このバンドの強度は低くなる(図5G)。ライセート調製および抗ROBO1抗体を使用する免疫共沈降の前に、細胞をSLIT2およびSLIT3(各々1μg)で4時間処理すると、ROBO2について2つの強く染色するバンドが観察される。これは、SLIT2およびSLIT3がROBO1とROBO2との間のより効率的な相互作用を促進することを示唆している(図5G)。
ROBO1受容体細胞外ドメインフラグメントはROBO2に結合する:
本明細書に開示された実験は、ROBO1およびNOTCH4がNOTCH4の活性化を阻害する複合体を形成することを示唆しており、2つのタンパク質間の直接的な相互作用を示唆している。以前の研究により、多くの膜貫通受容体の可溶性細胞外ドメインフラグメントが、膜貫通受容体間の同種親和性およびヘテロ親和性相互作用の両方、ならびに膜貫通受容体とそれらのリガンドとの間の相互作用を遮断するように作用することが示された39。可溶性ROBO1細胞外ドメイン(ECD)も同様にROBO1とROBO2との相互作用に干渉し得ることが仮定され得る。ROBO1 ECDを含む構築物は、ROBO2との結合に関して内因性ROBO1と競合し、それによって、内因性ROBO1がNOTCH4に結合してNOTCH4の活性化を阻害することを可能にし、それによって、腺房の分化を促進して乳汁産生を促進し得る(図5F右)。可溶性ROBO1 ECDはまた、相互に排他的でない態様で、NOTCH4に直接結合してNOTCH4活性化を阻害し得、これもまた、腺房の分化を促進する結果になる(図5F右)。したがって、ROBO1 ECDは、NOTCH4の活性化を直接的および間接的に阻害し得る。
本明細書に開示された実験は、ROBO1およびNOTCH4がNOTCH4の活性化を阻害する複合体を形成することを示唆しており、2つのタンパク質間の直接的な相互作用を示唆している。以前の研究により、多くの膜貫通受容体の可溶性細胞外ドメインフラグメントが、膜貫通受容体間の同種親和性およびヘテロ親和性相互作用の両方、ならびに膜貫通受容体とそれらのリガンドとの間の相互作用を遮断するように作用することが示された39。可溶性ROBO1細胞外ドメイン(ECD)も同様にROBO1とROBO2との相互作用に干渉し得ることが仮定され得る。ROBO1 ECDを含む構築物は、ROBO2との結合に関して内因性ROBO1と競合し、それによって、内因性ROBO1がNOTCH4に結合してNOTCH4の活性化を阻害することを可能にし、それによって、腺房の分化を促進して乳汁産生を促進し得る(図5F右)。可溶性ROBO1 ECDはまた、相互に排他的でない態様で、NOTCH4に直接結合してNOTCH4活性化を阻害し得、これもまた、腺房の分化を促進する結果になる(図5F右)。したがって、ROBO1 ECDは、NOTCH4の活性化を直接的および間接的に阻害し得る。
3つの組換えROBO1 ECDコンストラクトが構築された:1つは2つの免疫グロブリン(Ig)ドメインを含み(ROBO1-Ig2)、もう1つは5つすべてのIgドメインを含み(ROBO1-Ig5)、もう1つは細胞外ドメイン全体を含む(ROBO1-Ecto)(図6A)。他の構築物では、HA(血球凝集素)、Myc、およびヒトとマウスの免疫グロブリンFcがRobo1 ECDに融合された(図6A、5F右)。2つのIg(DCC-Ig2)または4つのIg(DCC-Ig4)ドメインのいずれかを含みHAタグ化された、ROBO1と構造的に類似したIgスーパーファミリーメンバーであるDeleted in Colorectal Cancer(DCC)の細胞外ドメインが、ネガティブコントロールとして使用するために構築された(図6A、5F右)。構築物の発現分泌は、HEK293細胞で構築物を過剰発現させ、細胞溶解物および培地でウエスタンブロットを行うことで確認された(図6B)。以前の研究によって、細胞を、ヘパラン硫酸の高度に硫酸化されたバリアントであるヘパリンとインキュベートすると、いくつかの細胞外タンパク質の分泌が促進されることが示された40。本明細書で使用されるRobo1-Ig5を、ヘパリン(300ng/ml)の非存在下および存在下でHEK-293細胞で発現させた。プラスミドトランスフェクション後2、4、6日目にこれらのROBO1-Ig5過剰発現細胞から培地を回収した。この可溶性ROBO1 ECDの相対的な分泌を評価するために、収集した培地のドットブロット希釈アッセイを実施した(図6C)。可溶性ROBO1-Ig5分泌はこの時間経過にわたって増加し、ヘパリン処理はより多くの分泌の傾向をもたらした(図6C)。これらのROBO1-Ig5トランスフェクト細胞からの培地試料はTCA沈殿されてウエスタンブロットによっても解析され、それは、ヘパリンの非存在下および存在下の両方で培地中での6日後にインタクトなROBO1-Ig5タンパク質を示した(図6D)。
ヘパリンの存在下で生成された可溶性ROBO1 ECDフラグメントROBO1-Ig2およびROBO1-Ig5をドームアッセイで使用した。結果は、ヘパリンの存在下で生成された可溶性ROBO1 ECDフラグメントが、ヘパリンの非存在下で生成された同じフラグメントよりも少ないドームを形成したことを示した(図6E)。ヘパリンによる処理は、ROBO1 ECD産生に対して控えめなプラスの効果を有するのみで、しかもそれらの機能に対して有害な効果を有していたため(図6C、E)、可溶性ROBO1 ECDフラグメントを生成するためのヘパリンの使用は追求されなかった。ROBO1 ECDフラグメントがROBO2受容体に結合する能力は、Cos7細胞でRobo2を過剰発現させ、細胞をアジ化ナトリウムで処理してタンパク質の内在化を防止し、固定化および免疫染色の前に細胞をROBO1-Ecto-HA 1Hとインキュベートすることによって試験した。ROBO1-Ecto-HAはROBO2に結合するが、DCC-Ig2-HAはROBO2に結合しないという結果が示された(図6G)。
ROBO1細胞外ドメインフラグメントは、HC11細胞の分化を促進する:
ROBO1 ECDフラグメントがNOTCH4シグナル伝達に影響を与えるかどうかを判断するために、HC11アッセイを実行して、位相差顕微鏡(図7A、B、上)と、中性脂質に結合する疎水性Bodipy493/503を使用した蛍光顕微鏡(図7A、B、下)の両方を使用してドーム形成をモニターした。未分化(Undif)細胞は、位相差で視認できる相互接続プロセスおよびほとんど/まったくないBodipy染色により区別される(図7A)。分化およびプロラクチン処理の際に、位相差で暗い縁の円として(図7B、上)、およびBodipy染色によって点状の緑色の円として現れる(図7B、下)、小さな脂肪滴が蓄積する。ROBO1-Ectoでの処理によって、脂肪滴で完全に囲まれた細胞の数が増えることが、Bodipy493/503染色により明らかになった(図7B)。
ROBO1 ECDフラグメントがNOTCH4シグナル伝達に影響を与えるかどうかを判断するために、HC11アッセイを実行して、位相差顕微鏡(図7A、B、上)と、中性脂質に結合する疎水性Bodipy493/503を使用した蛍光顕微鏡(図7A、B、下)の両方を使用してドーム形成をモニターした。未分化(Undif)細胞は、位相差で視認できる相互接続プロセスおよびほとんど/まったくないBodipy染色により区別される(図7A)。分化およびプロラクチン処理の際に、位相差で暗い縁の円として(図7B、上)、およびBodipy染色によって点状の緑色の円として現れる(図7B、下)、小さな脂肪滴が蓄積する。ROBO1-Ectoでの処理によって、脂肪滴で完全に囲まれた細胞の数が増えることが、Bodipy493/503染色により明らかになった(図7B)。
ROBO1 ECDフラグメントのタイトレーションに応答したドーム数の形成を定量した。ROBO1-Ig2、ROBO1-Ig5、およびROBO-1-Ectoの濃度が高いほど、ドーム形成率が高くなる。この結果は、DCC-Ig2またはDCC-Ig4コントロールECDフラグメントのいずれかによる処理に応答しては観察されなかった(図7C~G)。ウシROBO1-Ig5コンストラクトもこのアッセイで試験され、ラットコンストラクトと同様に、高濃度のROBO1-Ecto ECDでの処理に応答してより多くのドームが形成された(図7H)。まとめると、これらの研究により、ROBO1-ECDがHC11細胞のドーム形成を促進することが示されている。
ドーム形成の促進がより高い乳汁産生ももたらすかどうかを決定するために、HC11細胞を、DIP培地と同時に細胞に添加されたROBO1-ECDフラグメントの存在下または非存在下で分化させた。細胞を採取し、WAPおよびLalbaの発現をRT-qPCRで評価した。異なるROBO1-ECDでの処理は、無処理のコントラストと比較して、6~9倍高い発現をもたらした(図7I、J)。DCC-Ig4で処理した細胞では、WAP発現レベルは増加しなかった(図7K)。次に、ROBO1-Ig5およびROBO1-Ectoで処理した細胞に対してWAPおよびPLIN2のウエスタンブロット解析を行った。ROBO-1 ECDで処理した細胞では、WAPおよびPLIN2タンパク質の発現が約2倍に増加することが観察された(図7L~O)。
ROBO1細胞外ドメインフラグメントは、Notchシグナル伝達を阻害する:
Notchシグナル伝達に対するROBO1-ECDフラグメントの影響を調べるために、HC11細胞をROBO1-ECDフラグメントで処理し、Notchエフェクターの発現を評価した。ROBO1-Ig5およびROBO1-Ecto処理では、Hey1およびHes1発現の低下がもたらされた(図8A)が、ROBO1-Ig2で処理した細胞では、この効果は観察されなかった(図8A)。さらに、HC11細胞は、分化中にROBO-Ig5で処理された。次に、これらの細胞を分画し、ウエスタンブロットを行ってHES1およびNOTCH4-ICDを検出した(図8B)。ROBO1-Ig5による処理は、コントロール処理と比較して、核画分においてHES1およびNOTCH4-ICD(N4-ICD)タンパク質の両方のレベルが低くなり、NOTCH4-ICDは、ROBO1-Ig5処理による細胞質画分でも低かった。まとめると、これらの結果は、ROBO1-ECDがNotchシグナル伝達を阻害することを示唆している。
Notchシグナル伝達に対するROBO1-ECDフラグメントの影響を調べるために、HC11細胞をROBO1-ECDフラグメントで処理し、Notchエフェクターの発現を評価した。ROBO1-Ig5およびROBO1-Ecto処理では、Hey1およびHes1発現の低下がもたらされた(図8A)が、ROBO1-Ig2で処理した細胞では、この効果は観察されなかった(図8A)。さらに、HC11細胞は、分化中にROBO-Ig5で処理された。次に、これらの細胞を分画し、ウエスタンブロットを行ってHES1およびNOTCH4-ICDを検出した(図8B)。ROBO1-Ig5による処理は、コントロール処理と比較して、核画分においてHES1およびNOTCH4-ICD(N4-ICD)タンパク質の両方のレベルが低くなり、NOTCH4-ICDは、ROBO1-Ig5処理による細胞質画分でも低かった。まとめると、これらの結果は、ROBO1-ECDがNotchシグナル伝達を阻害することを示唆している。
本明細書に開示されるのは、可溶性ROBO1 ECDフラグメントがROBO2に結合して、ROBO2が内因性膜貫通ROBO1に結合するのを防止し、それによって、Notchシグナル伝達を妨害するROBO1/NOTCH複合体の形成を促進するモデルである(図5F右)。ただし、ROBO1-ECDフラグメントがNOTCH4に直接結合して、NOTCH4を阻害する可能性もある。したがって、ROBO1-ECDフラグメントがROBO1の非存在下でNotchを阻害するかどうかを試験するために、Robo1の発現をHC11細胞で阻害した。次に、Robo1発現を欠いた細胞をROBO1-ECDフラグメントで処理し、それらのドームを形成する能力を評価した。上記で観察されたように(図7C~E、H)、ROBO1-ECDフラグメントで処理すると、コントロール細胞(Scr)のドーム形成が増加した(図8C)。Robo1発現の阻害(shRobo1)も、上記で観察されたように(図1B、3E)、コントロール細胞におけるドーム形成を阻害した(図8C)。ただし、Robo1発現が阻害された(shRobo1)細胞をROBO1-Ig5で処理すると、ROBO1-ECDフラグメントで処理したコントロール細胞(Scr)と同じレベルでのドーム形成がもたらされた(図8C)。ROBO1-Ig5フラグメントの非存在下でNotch4の発現を阻害すると(shNotch4)、上記で観察されたように(図3G)、コントロール細胞(Scr)と比較して、より大きなドーム形成がもたらされた(図8C)。これらの細胞(shNotch4)をROBO1-Ig5で処理すると、未処理のNotch4ノックダウン細胞(shNotch4)と同じレベルのドーム形成につながった(図8C)。これは、ROBO1-Ig5処理がNOTCH4の非存在下でHC11ドーム形成をさらに増加させないことを示唆している。まとめると、これらの結果は、NOTCH4がROBO1-Ig5の直接の標的であることを示唆している。
ROBO1細胞外ドメインフラグメントは、オルガノイド形成および乳腺分岐を強化する:
初代腺房前駆細胞増殖に対するインビトロでのおよび分岐形態形成に対するインビボでのROBO1 ECDフラグメントの影響について試験した。FACS精製されたマウスおよびウシの腺房前駆細胞(AVP)をマトリゲル中で単一細胞としてプレーティングし、ROBO1-ECDフラグメントの非存在下および存在下で10日間増殖させた(図9A、B)。ROBO1-ECDでの処理は、未処理のコントロールと比較して、より多くのマウスオルガノイドをもたらした(図9A)。ROBO1-Ig5での処理は、未処理のコントロールと比較して、より大きなウシオルガノイドをもたらした(図9B)。ROBO1-Ig5フラグメントは、Nutella中の以下のホルモンを経口投与された卵巣切除動物に皮下注射(7.5乳腺/kg/日)することによってインビボでも試験された:エストロゲン(E、1μg/日)、プロゲステロン(P、1mg/日 乳腺/日)およびプロラクチン(Prl、0.2mg/日 乳腺/日)(図9C)。ROBO1-Ig5フラグメント処理の14日後に乳腺を採取し、カーマインを染色して評価した。ROBO1-Ig5処理は、未処理のコントロールと比較して、有意に大きな面積および多数の一次(1°)分岐をもたらした(図1D)。腺のより多くの二次(2°)および三次(3°)分岐も観察された。ただし、腺領域のサイズは、分岐が大きい腺の方が大きかったため、処理された腺の全体的な分岐密度は、コントロールのそれと異ならなかった(図1E)。まとめると、この研究は、インビボでのROBO1-Ig5処理が有意に多くの枝を有する乳腺をもたらしたことを示している。他の態様では、マウス-Fc配列でタグ化されたROBO1-ECDコンストラクトが含まれ得る。このタグは、組織中への輸送を促進する内因性受容体によって認識される41。
初代腺房前駆細胞増殖に対するインビトロでのおよび分岐形態形成に対するインビボでのROBO1 ECDフラグメントの影響について試験した。FACS精製されたマウスおよびウシの腺房前駆細胞(AVP)をマトリゲル中で単一細胞としてプレーティングし、ROBO1-ECDフラグメントの非存在下および存在下で10日間増殖させた(図9A、B)。ROBO1-ECDでの処理は、未処理のコントロールと比較して、より多くのマウスオルガノイドをもたらした(図9A)。ROBO1-Ig5での処理は、未処理のコントロールと比較して、より大きなウシオルガノイドをもたらした(図9B)。ROBO1-Ig5フラグメントは、Nutella中の以下のホルモンを経口投与された卵巣切除動物に皮下注射(7.5乳腺/kg/日)することによってインビボでも試験された:エストロゲン(E、1μg/日)、プロゲステロン(P、1mg/日 乳腺/日)およびプロラクチン(Prl、0.2mg/日 乳腺/日)(図9C)。ROBO1-Ig5フラグメント処理の14日後に乳腺を採取し、カーマインを染色して評価した。ROBO1-Ig5処理は、未処理のコントロールと比較して、有意に大きな面積および多数の一次(1°)分岐をもたらした(図1D)。腺のより多くの二次(2°)および三次(3°)分岐も観察された。ただし、腺領域のサイズは、分岐が大きい腺の方が大きかったため、処理された腺の全体的な分岐密度は、コントロールのそれと異ならなかった(図1E)。まとめると、この研究は、インビボでのROBO1-Ig5処理が有意に多くの枝を有する乳腺をもたらしたことを示している。他の態様では、マウス-Fc配列でタグ化されたROBO1-ECDコンストラクトが含まれ得る。このタグは、組織中への輸送を促進する内因性受容体によって認識される41。
ROBO1細胞外ドメインフラグメントは、小葉腺房乳腺の発達と乳汁産生を増加させる。
妊娠中の小葉腺房の発達に対するインビボでのROBO1 ECD-Fcフラグメントの影響を調査した。ROBO1 ECDフラグメント(7.5mg/kg)および模擬注射されたコントロールは、妊娠中に3回(妊娠日から(PD)8.5日目、PD11.5日目およびPD14.5日目)皮下注射された(図10A)。乳腺はPD17.5日目に採取され、腺房形成は連続切片、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色によって分析され、次いで、組織の上部、中央部、下部にある切片で腺房が占める面積が定量化された。上記で観察されたように、WT、模擬注射された乳腺と比較して、Robo1-/-における腺房面積が大幅に低減され、Robo1-/-腺房サイズが低減された(図10B、C、F、矢印、アスタリスク)。ROBO1 ECD-FcフラグメントをWT動物およびRobo1-/-動物の両方に注射することで、模擬注射したコントロールと比較して、腺房面積と、乳汁滴で満たされた腺房数とにおいて有意な増加が見られた。
妊娠中の小葉腺房の発達に対するインビボでのROBO1 ECD-Fcフラグメントの影響を調査した。ROBO1 ECDフラグメント(7.5mg/kg)および模擬注射されたコントロールは、妊娠中に3回(妊娠日から(PD)8.5日目、PD11.5日目およびPD14.5日目)皮下注射された(図10A)。乳腺はPD17.5日目に採取され、腺房形成は連続切片、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色によって分析され、次いで、組織の上部、中央部、下部にある切片で腺房が占める面積が定量化された。上記で観察されたように、WT、模擬注射された乳腺と比較して、Robo1-/-における腺房面積が大幅に低減され、Robo1-/-腺房サイズが低減された(図10B、C、F、矢印、アスタリスク)。ROBO1 ECD-FcフラグメントをWT動物およびRobo1-/-動物の両方に注射することで、模擬注射したコントロールと比較して、腺房面積と、乳汁滴で満たされた腺房数とにおいて有意な増加が見られた。
乳汁産生をさらに評価するために、乳汁タンパク質遺伝子のホエイ酸性タンパク質(WAP)、キサンチンデヒドロゲナーゼ(XDH)、およびベータカゼイン(CSN2)のRT-qPCRを実行した。コントロール処理と比較して、ROBO1 ECD-Fc処理では乳汁タンパク質遺伝子発現が有意に増加している(図11A~C)。乳汁発現について、乳汁に対する抗体(#YNRMTM、Accurate Chemical and Scientific Corp)を使用して、切片組織の免疫組織化学によってタンパク質レベルでも評価された。この場合も、WT動物またはRobo1-/-動物のいずれかにROBO1 ECDを注射すると、乳汁の有意な増加が観察された(図11D~H)。まとめると、これらのデータは、ROBO1 ECDフラグメントを妊娠動物に皮下注射すると、小葉腺房の発達、乳汁タンパク質遺伝子および乳汁産生が増加することを示している。
ROBO1は、乳腺の基底細胞で腺房分化および乳汁産生に必要である:
乳腺は、外側の基底細胞(基底コンパートメント)と内側の管腔細胞(管腔コンパートメント)で構成される二層組織である(図1A)。ROBO1発現は、乳腺の管腔細胞および基底細胞の両方で検出された(図1D~G)。どの細胞型においてROBO1が腺房前駆細胞から乳汁産生腺房細胞への分化を可能にするように機能するかを決定するために、基底コンパートメントまたは管腔コンパートメントを含む細胞のいずれかがRobo1-/-細胞で構成されるように、ROBO1の発現においてモザイク状であるオルガノイドが生成された(図12C、D)。コントロールとして、WTおよびKO細胞が基底コンパートメントおよび管腔コンパートメントの両方をなすWTオルガノイドおよびRobo1-/-オルガノイドが生成された(WT/WTおよびKO/KO)(図12A、B)。WT細胞とKO細胞を区別できるように、WT組織(GFP+/+)のためにはACTb-EGFPマウスをが使用した。オルガノイドは、2つの集団を分離するための分別的トリプシン処理と、それに続いて、分離された基底および管腔亜集団を混合することによって生成し(WT/WT、KO/KO、WT/KO、KO/WT)、それからそれらをマトリゲル中で培養した後に5日間分化させた。GFP+/+基底細胞およびGFP+/+管腔細胞の両方を含むWT/WTオルガノイドは大きな二層オルガノイドを形成し、これは分化させると、管腔を満たす乳汁を産生した(図12A)。対照的に、Robo1-/-基底細胞およびRobo1-/-管腔細胞の両方を含むKO/KOオルガノイドはより小さな二層構造を生成し、これは分化させてもほとんどまたはまったく乳汁を産生しなかった(図12B)。Robo1-/-基底細胞をWT管腔細胞と混合すると(KO/WT)、得られたモザイクオルガノイドは分化時にほとんど/まったくミルクを生成しなかった(図12C)。しかしながら、WT基底細胞をRobo1-/-管腔細胞(WT/KO)と混合すると、得られたオルガノイドは、WT/WTオルガノイドでの乳汁産生(図12A)と同様に乳汁を産生した(図12D)。これらのデータは、ホルモン刺激に際して管腔細胞が乳汁を産生するためには、ROBO1の発現が乳腺の管腔コンパートメントではなく基底コンパートメントで必要であることを示している。
乳腺は、外側の基底細胞(基底コンパートメント)と内側の管腔細胞(管腔コンパートメント)で構成される二層組織である(図1A)。ROBO1発現は、乳腺の管腔細胞および基底細胞の両方で検出された(図1D~G)。どの細胞型においてROBO1が腺房前駆細胞から乳汁産生腺房細胞への分化を可能にするように機能するかを決定するために、基底コンパートメントまたは管腔コンパートメントを含む細胞のいずれかがRobo1-/-細胞で構成されるように、ROBO1の発現においてモザイク状であるオルガノイドが生成された(図12C、D)。コントロールとして、WTおよびKO細胞が基底コンパートメントおよび管腔コンパートメントの両方をなすWTオルガノイドおよびRobo1-/-オルガノイドが生成された(WT/WTおよびKO/KO)(図12A、B)。WT細胞とKO細胞を区別できるように、WT組織(GFP+/+)のためにはACTb-EGFPマウスをが使用した。オルガノイドは、2つの集団を分離するための分別的トリプシン処理と、それに続いて、分離された基底および管腔亜集団を混合することによって生成し(WT/WT、KO/KO、WT/KO、KO/WT)、それからそれらをマトリゲル中で培養した後に5日間分化させた。GFP+/+基底細胞およびGFP+/+管腔細胞の両方を含むWT/WTオルガノイドは大きな二層オルガノイドを形成し、これは分化させると、管腔を満たす乳汁を産生した(図12A)。対照的に、Robo1-/-基底細胞およびRobo1-/-管腔細胞の両方を含むKO/KOオルガノイドはより小さな二層構造を生成し、これは分化させてもほとんどまたはまったく乳汁を産生しなかった(図12B)。Robo1-/-基底細胞をWT管腔細胞と混合すると(KO/WT)、得られたモザイクオルガノイドは分化時にほとんど/まったくミルクを生成しなかった(図12C)。しかしながら、WT基底細胞をRobo1-/-管腔細胞(WT/KO)と混合すると、得られたオルガノイドは、WT/WTオルガノイドでの乳汁産生(図12A)と同様に乳汁を産生した(図12D)。これらのデータは、ホルモン刺激に際して管腔細胞が乳汁を産生するためには、ROBO1の発現が乳腺の管腔コンパートメントではなく基底コンパートメントで必要であることを示している。
ROBO1は、基底細胞でJagged1の発現を阻害する:
Notch発現を調節する1つの方法は、NotchリガンドJagged1、Jagged2、またはDeltaの発現レベルを制御することである。ROBO1がNotchリガンド発現を調節するかどうかを調べるために、Robo1を発現するプラスミドの量を増加させながら細胞をトランスフェクトさせた。48時間後、細胞を採取し、ROBO1、JAGGED1(JAG1)、GAPDH(ローディングコントロール)に対する抗体を用いて、イムノブロッティングを行った(図13A)。データは、ROBO1発現の増加がJAGGED1発現の減少をもたらしたことを示している。次に、siRNAを使用して、Robo1の発現をノックダウンさせた。48時間後の細胞において、JAGGED1およびJAGGED発現をイムノブロットで評価した。JAGGED1の発現が増加したことと、JAGGED2の発現の変化がないことが観察された(図13B、C)。JAGGED1のこの調節がインビボで起こるかどうかを調べるために、初代WTおよびRobo1-/-乳腺上皮細胞の亜集団を、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用して基底、管腔、および間質の亜集団に精製し、次いで、JAGGED1およびCytokeratin14(CK14)(ローディングコントロール)に対するイムノブロットによって解析した(図13D)。Robo1+/+の基底細胞と比較して、Robo1-/-ではより多くのJAGGED1が観察された。管腔細胞では検出可能な発現は存在せず、間質細胞では中程度の発現のみが存在し、これらのデータは、細胞株でRobo1発現をノックダウンすることによって得られた結果と類似している(図13B)。また、Robo1+/+およびRobo1-/-オルガノイドを免疫染色することにより、JAGGED1発現を評価した(図13E、F)。Robo1+/+オルガノイドと比較して、Robo1-/-の基底細胞ではより多くのJAGGED1発現が観察された。まとめると、これらのデータは、ROBO1が乳腺基底細胞におけるJAGGED1の発現を阻害し、Robo1が失われるとJAGGED1が増加することを示している。JAGGED1発現が増加すると、隣接する腺房前駆細胞におけるNOTCHシグナル伝達が増強され、それらの乳汁産生腺房細胞への分化が阻害される。したがって、ROBO1が乳汁産生を調節する1つのメカニズムは、乳腺の基底コンパートメント内のNotchリガンドJAGGED1のレベルを支配することによるものである。
Notch発現を調節する1つの方法は、NotchリガンドJagged1、Jagged2、またはDeltaの発現レベルを制御することである。ROBO1がNotchリガンド発現を調節するかどうかを調べるために、Robo1を発現するプラスミドの量を増加させながら細胞をトランスフェクトさせた。48時間後、細胞を採取し、ROBO1、JAGGED1(JAG1)、GAPDH(ローディングコントロール)に対する抗体を用いて、イムノブロッティングを行った(図13A)。データは、ROBO1発現の増加がJAGGED1発現の減少をもたらしたことを示している。次に、siRNAを使用して、Robo1の発現をノックダウンさせた。48時間後の細胞において、JAGGED1およびJAGGED発現をイムノブロットで評価した。JAGGED1の発現が増加したことと、JAGGED2の発現の変化がないことが観察された(図13B、C)。JAGGED1のこの調節がインビボで起こるかどうかを調べるために、初代WTおよびRobo1-/-乳腺上皮細胞の亜集団を、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用して基底、管腔、および間質の亜集団に精製し、次いで、JAGGED1およびCytokeratin14(CK14)(ローディングコントロール)に対するイムノブロットによって解析した(図13D)。Robo1+/+の基底細胞と比較して、Robo1-/-ではより多くのJAGGED1が観察された。管腔細胞では検出可能な発現は存在せず、間質細胞では中程度の発現のみが存在し、これらのデータは、細胞株でRobo1発現をノックダウンすることによって得られた結果と類似している(図13B)。また、Robo1+/+およびRobo1-/-オルガノイドを免疫染色することにより、JAGGED1発現を評価した(図13E、F)。Robo1+/+オルガノイドと比較して、Robo1-/-の基底細胞ではより多くのJAGGED1発現が観察された。まとめると、これらのデータは、ROBO1が乳腺基底細胞におけるJAGGED1の発現を阻害し、Robo1が失われるとJAGGED1が増加することを示している。JAGGED1発現が増加すると、隣接する腺房前駆細胞におけるNOTCHシグナル伝達が増強され、それらの乳汁産生腺房細胞への分化が阻害される。したがって、ROBO1が乳汁産生を調節する1つのメカニズムは、乳腺の基底コンパートメント内のNotchリガンドJAGGED1のレベルを支配することによるものである。
材料および方法
動物:
すべての動物の手順は、カリフォルニア大学サンタクルーズ校(UCSC)のInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)に従って実施された。すべてのRobo1マウスは、上記に記載されるように産生され、遺伝子型決定された11。
動物:
すべての動物の手順は、カリフォルニア大学サンタクルーズ校(UCSC)のInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)に従って実施された。すべてのRobo1マウスは、上記に記載されるように産生され、遺伝子型決定された11。
乳腺脂肪パッドのクリアリングおよび移植:
8週齢のWTおよびROBO1 KOマウスからの小さな乳腺組織断片を、予めクリアリングされたFoxn1nuの脂肪パッドに対側的に移植された。対側派生物は妊娠18.5日目に採取され、カーマイン染色が施された。
8週齢のWTおよびROBO1 KOマウスからの小さな乳腺組織断片を、予めクリアリングされたFoxn1nuの脂肪パッドに対側的に移植された。対側派生物は妊娠18.5日目に採取され、カーマイン染色が施された。
乳腺ホールマウントカルミン-アルミニウムアッセイ:
マウス乳腺を外科的に解剖し、スライドガラス上に広げ、カルノア液(25%氷酢酸および75%エタノール)中に固定した。短時間脱水した後、腺を0.2%カルミンと0.5%硫酸アルミニウムカリウムで一晩染色し、エタノールの段階的溶液(70%、95%、100%)で脱水し、トルエンでクリアリングし、パーマウントでマウントした。
マウス乳腺を外科的に解剖し、スライドガラス上に広げ、カルノア液(25%氷酢酸および75%エタノール)中に固定した。短時間脱水した後、腺を0.2%カルミンと0.5%硫酸アルミニウムカリウムで一晩染色し、エタノールの段階的溶液(70%、95%、100%)で脱水し、トルエンでクリアリングし、パーマウントでマウントした。
脂肪パッド充填解析:
パラフィン包埋されたRobo1 KOまたはWTの同腹仔組織または対側派生物を切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色が施された。ImageJを使用して画像を分析し、腺房が占める面積を測定することにより、脂肪パッドの充填率を計算した。
パラフィン包埋されたRobo1 KOまたはWTの同腹仔組織または対側派生物を切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色が施された。ImageJを使用して画像を分析し、腺房が占める面積を測定することにより、脂肪パッドの充填率を計算した。
免疫組織化学およびベータガラクトシダーゼ染色:
組織を、4%パラホルムアルデヒドで固定した。パラフィン包埋組織を6μmで切片化し、連続的にマウントした。免疫組織化学については、標準的なプロトコルに従った。ベータガラクトシダーゼ染色では、40mg/mlの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドを1MのMgCl2および10mMのシアン化第一鉄カリウムを含む1Mのリン酸緩衝液中で調製した。組織の凍結切片を、37℃のアテイン溶液で1.5~24時間処理し、PBSで洗浄し、エタノールで脱水し、キシレンで固定し、カバーガラスで覆った42。
組織を、4%パラホルムアルデヒドで固定した。パラフィン包埋組織を6μmで切片化し、連続的にマウントした。免疫組織化学については、標準的なプロトコルに従った。ベータガラクトシダーゼ染色では、40mg/mlの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドを1MのMgCl2および10mMのシアン化第一鉄カリウムを含む1Mのリン酸緩衝液中で調製した。組織の凍結切片を、37℃のアテイン溶液で1.5~24時間処理し、PBSで洗浄し、エタノールで脱水し、キシレンで固定し、カバーガラスで覆った42。
顕微鏡観察:
明視野イメージングをBiorevo BZ-9000デジタル顕微鏡(Keyence)で行い、共焦点顕微鏡観察をNikon C2 Confocal、Leica SP5 confocalで行った。収集したデータを、ImageJを使用して解析した。
明視野イメージングをBiorevo BZ-9000デジタル顕微鏡(Keyence)で行い、共焦点顕微鏡観察をNikon C2 Confocal、Leica SP5 confocalで行った。収集したデータを、ImageJを使用して解析した。
共免疫沈降:
付着細胞を、1%Igepal NP40(Sigma)、1mMフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)、1mMロイペプチン、1mMアプロチニン、およびホスファターゼ阻害剤(Roche Complete)を添加した1mLの1X lysis buffer(137nM NaCl、10mM Tris-HCl(pH8)、2nM EDTA、1mM オルトバナジン酸ナトリウム)に溶解させた。細胞溶解物を穏やかに揺り動かしながら4℃で15分間インキュベートした後、12,000rpmで10分間遠心分離した。可溶性相を、企業プロトコルに従って、1μgの抗体と結合したDynabeadsプロテインA(Thermo-fisher)とともに、室温で1時間、または4℃で4時間インキュベートした。試料を、プロトコルに従って洗浄し、溶出した。溶出したタンパク質複合体を2X Lysis bufferと混合し、70℃で10分間および100℃で5分間インキュベートした。
付着細胞を、1%Igepal NP40(Sigma)、1mMフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)、1mMロイペプチン、1mMアプロチニン、およびホスファターゼ阻害剤(Roche Complete)を添加した1mLの1X lysis buffer(137nM NaCl、10mM Tris-HCl(pH8)、2nM EDTA、1mM オルトバナジン酸ナトリウム)に溶解させた。細胞溶解物を穏やかに揺り動かしながら4℃で15分間インキュベートした後、12,000rpmで10分間遠心分離した。可溶性相を、企業プロトコルに従って、1μgの抗体と結合したDynabeadsプロテインA(Thermo-fisher)とともに、室温で1時間、または4℃で4時間インキュベートした。試料を、プロトコルに従って洗浄し、溶出した。溶出したタンパク質複合体を2X Lysis bufferと混合し、70℃で10分間および100℃で5分間インキュベートした。
ウエスタンブロッティング:
付着細胞を、5%ベータメルカプトエタノールを添加した1Xサンプルバッファーで直接溶解し、5分間煮沸してタンパク質溶解液を調製した。タンパク質溶解液をSDS-PAGEで分離し、PVDFに400mAで90分間、または30mAで一晩転写した。一次抗体を表1に示す濃度で使用し、4℃で一晩インキュベートした。HRP標識二次抗体(Jackson Labs)を1:3000で使用し、室温で45分間インキュベートした。すべてのタンパク質は、BioRad Chemi-Doc MP Imagerを使用してClarity ECL(BioRad)を用いて検出し、上記に記載されるようにImageLabソフトウェアを使用して定量した43。
付着細胞を、5%ベータメルカプトエタノールを添加した1Xサンプルバッファーで直接溶解し、5分間煮沸してタンパク質溶解液を調製した。タンパク質溶解液をSDS-PAGEで分離し、PVDFに400mAで90分間、または30mAで一晩転写した。一次抗体を表1に示す濃度で使用し、4℃で一晩インキュベートした。HRP標識二次抗体(Jackson Labs)を1:3000で使用し、室温で45分間インキュベートした。すべてのタンパク質は、BioRad Chemi-Doc MP Imagerを使用してClarity ECL(BioRad)を用いて検出し、上記に記載されるようにImageLabソフトウェアを使用して定量した43。
2D細胞培養:
すべての細胞株はAmerican Type Culture Collectionから入手した。MDA-MB-231細胞は、10%熱不活化FBS(Seradigm)および1X抗生物質-抗真菌剤(Gibco)を添加したDMEM増殖培地(Gibco)で培養した。未分化HC11細胞をRPMI-1640増殖培地(Gibco)で培養し、10μg/mLウシインスリン(Sigma-Aldrich)および10ng/mLヒトEGF(Peprotech)を添加した。一次LECを、前に記述されたように8週齢のRobo1 KOまたはWT同腹仔から採取した15。
すべての細胞株はAmerican Type Culture Collectionから入手した。MDA-MB-231細胞は、10%熱不活化FBS(Seradigm)および1X抗生物質-抗真菌剤(Gibco)を添加したDMEM増殖培地(Gibco)で培養した。未分化HC11細胞をRPMI-1640増殖培地(Gibco)で培養し、10μg/mLウシインスリン(Sigma-Aldrich)および10ng/mLヒトEGF(Peprotech)を添加した。一次LECを、前に記述されたように8週齢のRobo1 KOまたはWT同腹仔から採取した15。
3D細胞培養:
FACS精製AVPをマトリゲル(BD Bioscience)中で5000細胞/100uLの密度で培養し、基本培地DMEM:100ng/mLニューレグリン(R&D)、42.5ng/mL R-Spondin1(Peprotech)を添加したF12フェノール不含、10mM HEPES、N2(Gibco)、B27(Gibco)で5日間培養した。培養されたAVPを分化させるために、10-6Mデキサメタゾン(Sigma)、10μg/mLウシインスリン(Sigma)、および5μg/mLプロラクチン(National Hormone and Peptideプログラム)を添加した基本培地でさらに5日間増殖させた。腺房を、前に記載されたように固定および処理した44。
FACS精製AVPをマトリゲル(BD Bioscience)中で5000細胞/100uLの密度で培養し、基本培地DMEM:100ng/mLニューレグリン(R&D)、42.5ng/mL R-Spondin1(Peprotech)を添加したF12フェノール不含、10mM HEPES、N2(Gibco)、B27(Gibco)で5日間培養した。培養されたAVPを分化させるために、10-6Mデキサメタゾン(Sigma)、10μg/mLウシインスリン(Sigma)、および5μg/mLプロラクチン(National Hormone and Peptideプログラム)を添加した基本培地でさらに5日間増殖させた。腺房を、前に記載されたように固定および処理した44。
HC11ドームアッセイ:
HC11細胞を、10%ウシ胎児血清(BioFluid Technologies)、5μg/mLインスリン(Sigma)、および10ng/ml上皮成長因子(EGF;Sigma)を添加したRPMI 1640培地(Gibco)で増殖させた。HC11細胞における分化を誘導するために、コンフルエントなプレートに、新鮮な培地(5%チャコールストリッピング化ウシ胎児血清(BioFluid Technologies)、5μg/mLインスリン、および10ng/ml上皮成長因子(EGF;Sigma)を添加したRPMI1640培地)が3日間与えられ、続いてプライミング培地(5%チャコールストリッピング化ウシ胎児血清(BioFluid Technologies)および5μg/mLインスリンを添加したRPMI1640培地)で24時間プライミングされる。プライミング後、DIP培地(5%チャコールストリッピング化ウシ胎児血清(BioFluid Technologies)、10-6Mデキサメタゾン(Sigma)、5μg/mLインスリン、および5μg/mLプロラクチン(National Hormone and Peptide program)を添加したRPMI1640培地)を24時間ごとに新鮮な培地で追加した。
HC11細胞を、10%ウシ胎児血清(BioFluid Technologies)、5μg/mLインスリン(Sigma)、および10ng/ml上皮成長因子(EGF;Sigma)を添加したRPMI 1640培地(Gibco)で増殖させた。HC11細胞における分化を誘導するために、コンフルエントなプレートに、新鮮な培地(5%チャコールストリッピング化ウシ胎児血清(BioFluid Technologies)、5μg/mLインスリン、および10ng/ml上皮成長因子(EGF;Sigma)を添加したRPMI1640培地)が3日間与えられ、続いてプライミング培地(5%チャコールストリッピング化ウシ胎児血清(BioFluid Technologies)および5μg/mLインスリンを添加したRPMI1640培地)で24時間プライミングされる。プライミング後、DIP培地(5%チャコールストリッピング化ウシ胎児血清(BioFluid Technologies)、10-6Mデキサメタゾン(Sigma)、5μg/mLインスリン、および5μg/mLプロラクチン(National Hormone and Peptide program)を添加したRPMI1640培地)を24時間ごとに新鮮な培地で追加した。
レンチウイルス産生:
スクランブル、Robo1、Robo2、およびNotch4のノックダウン実験のためのレンチウイルス粒子産生には、psPAX2、pMD2.G、およびpLVTHM-スクランブル-GFP(SCR)またはpLVTHM-sh-target GFPのHEK293T細胞への組み合わせトランスフェクションが含まれた。次に、濾過した(0.45um)ウイルス粒子を培地で希釈して、標的の乳腺株(MDA-MB-231およびHC11細胞)に感染させた。
スクランブル、Robo1、Robo2、およびNotch4のノックダウン実験のためのレンチウイルス粒子産生には、psPAX2、pMD2.G、およびpLVTHM-スクランブル-GFP(SCR)またはpLVTHM-sh-target GFPのHEK293T細胞への組み合わせトランスフェクションが含まれた。次に、濾過した(0.45um)ウイルス粒子を培地で希釈して、標的の乳腺株(MDA-MB-231およびHC11細胞)に感染させた。
乳腺上皮細胞の単離およびフローサイトメトリー:
機械的に解離された鼠径部および胸部乳腺の脂肪パッドが、記載されているようにFACS用の細胞懸濁液中に調製された17。AVPを、記載されているように、FITC-CD14(クローンSa14-2;BioLegend)およびACP-Cy7-CD117(クローン2B8;BioLegend)を使用して単離した14。
機械的に解離された鼠径部および胸部乳腺の脂肪パッドが、記載されているようにFACS用の細胞懸濁液中に調製された17。AVPを、記載されているように、FITC-CD14(クローンSa14-2;BioLegend)およびACP-Cy7-CD117(クローン2B8;BioLegend)を使用して単離した14。
インビボガンマセクレターゼ阻害剤(GSI):
GSI阻害剤(RO4929097;MedchemExpress)は、記載されるように、10mg/kgで5日間経口投与された29。乳腺は、GSIまたはビヒクル処理の5日後に採取され、単一細胞解析のために調製された。精製された集団を収集し、RNA用に処理した。FlowJoを使用して、精製された集団数を解析した。
GSI阻害剤(RO4929097;MedchemExpress)は、記載されるように、10mg/kgで5日間経口投与された29。乳腺は、GSIまたはビヒクル処理の5日後に採取され、単一細胞解析のために調製された。精製された集団を収集し、RNA用に処理した。FlowJoを使用して、精製された集団数を解析した。
RNA抽出およびRT-qPCR:
全RNAを、TRIzol試薬(Invitrogen)で溶解した細胞から回収し、エタノール中に一晩のRNA沈殿を追加して、メーカーのプロトコルに従って相を分離した(Macias et al.,2011)。RNAを、TURBO DNase(Ambion)処理でさらに精製した。全RNAの品質をアガロースゲル電気泳動で解析し、ND-1000分光光度計(NanoDrop)で定量した。iScript cDNA合成キット(BioRad)を使用して、1μgの全RNAからcDNAライブラリーを調製した。定量的RT-PCRは、ライトサイクラー480 SYBR Green Iマスター(Roche)を使用して3回実行し、BioRad CFX’Connect Real-Time SystemおよびCFX Managerソフトウェア(BioRad)を使用して定量化した。結果はGAPDHに対して正規化された。
全RNAを、TRIzol試薬(Invitrogen)で溶解した細胞から回収し、エタノール中に一晩のRNA沈殿を追加して、メーカーのプロトコルに従って相を分離した(Macias et al.,2011)。RNAを、TURBO DNase(Ambion)処理でさらに精製した。全RNAの品質をアガロースゲル電気泳動で解析し、ND-1000分光光度計(NanoDrop)で定量した。iScript cDNA合成キット(BioRad)を使用して、1μgの全RNAからcDNAライブラリーを調製した。定量的RT-PCRは、ライトサイクラー480 SYBR Green Iマスター(Roche)を使用して3回実行し、BioRad CFX’Connect Real-Time SystemおよびCFX Managerソフトウェア(BioRad)を使用して定量化した。結果はGAPDHに対して正規化された。
ROBO1細胞外ドメイン生成:
タンパク質フラグメントを生成するために、関心対象のフラグメントに対応するプラスミドでHEK細胞をトランスフェクトした。Cytographicaプロトコルに従ってPEIトランスフェクションを行った。トランスフェクションの24時間後、培地をOptiMEMに交換した。トランスフェクションの8日後、培地を回収し、3000xgで10分間遠心分離した。次に、上清を0.45μm PVDFフィルターで濾過した。
タンパク質フラグメントを生成するために、関心対象のフラグメントに対応するプラスミドでHEK細胞をトランスフェクトした。Cytographicaプロトコルに従ってPEIトランスフェクションを行った。トランスフェクションの24時間後、培地をOptiMEMに交換した。トランスフェクションの8日後、培地を回収し、3000xgで10分間遠心分離した。次に、上清を0.45μm PVDFフィルターで濾過した。
TCA沈殿:
1容量のTCAストックを4容量のタンパク質サンプルに追加する。4℃で10分間インキュベートする。14Krpmで5分間マイクロ遠心機でチューブを回転させる。タンパク質ペレットをインタクトのまま残して、上清を除去し、200μlの冷アセトンでペレットを洗浄する。マイクロフュージで、14Krpmで5分間回転させる。合計2回のアセトン洗浄のために、ステップ4~6を繰り返す。サンプルバッファーに懸濁する前にペレットを乾燥させる。
1容量のTCAストックを4容量のタンパク質サンプルに追加する。4℃で10分間インキュベートする。14Krpmで5分間マイクロ遠心機でチューブを回転させる。タンパク質ペレットをインタクトのまま残して、上清を除去し、200μlの冷アセトンでペレットを洗浄する。マイクロフュージで、14Krpmで5分間回転させる。合計2回のアセトン洗浄のために、ステップ4~6を繰り返す。サンプルバッファーに懸濁する前にペレットを乾燥させる。
Bodipy 493/503染色:
細胞を半分の体積のバッファーまたは培地に入れる。Invitrogen(商標)BODIPY(商標)493/503色素の2X溶液(2μg/ml=7.6μM)を、0.5mLの加温した同じバッファーまたは培地(細胞なし、BSAも血清もなし)中に作製し、勢いよく混合してこの溶液を機械的に乳化させる。すぐに細胞の溶液に加え、混合し、最大30分間インキュベートする。
細胞を半分の体積のバッファーまたは培地に入れる。Invitrogen(商標)BODIPY(商標)493/503色素の2X溶液(2μg/ml=7.6μM)を、0.5mLの加温した同じバッファーまたは培地(細胞なし、BSAも血清もなし)中に作製し、勢いよく混合してこの溶液を機械的に乳化させる。すぐに細胞の溶液に加え、混合し、最大30分間インキュベートする。
CUBIC免疫蛍光法:
腺を採取し、10%中性緩衝ホルマリン(Sigma)で4℃で一晩固定した。固定を、0.2%グリシン(Fisher Scientific)を含むPBST(0.1%Triton X-100;Sigma)で2X10分間クエンチした。次に、腺をCUBIC試薬1A中37℃で48時間インキュベートし、続いて、記載されているように、PBSTで3×10分間洗浄した45。腺をPBST/10%ロバ血清(Sigma)で4℃で一晩ブロックし、次にPBST/5%ロバ血清中の一次抗体とともに4℃で48時間インキュベートした。次に、腺をPBSTで3X1時間洗浄し、PBST/5%ロバ血清で希釈した二次抗体とともに4℃で24時間インキュベートした。DNAを対比染色するために、腺をPBSTで希釈したHoechstと共に1時間インキュベートし、次にPBSTで2X1時間洗浄した。最後に、腺を、それらが透明になるまで、通常は24時間、CUBIC試薬2とともに4℃でインキュベートした。
腺を採取し、10%中性緩衝ホルマリン(Sigma)で4℃で一晩固定した。固定を、0.2%グリシン(Fisher Scientific)を含むPBST(0.1%Triton X-100;Sigma)で2X10分間クエンチした。次に、腺をCUBIC試薬1A中37℃で48時間インキュベートし、続いて、記載されているように、PBSTで3×10分間洗浄した45。腺をPBST/10%ロバ血清(Sigma)で4℃で一晩ブロックし、次にPBST/5%ロバ血清中の一次抗体とともに4℃で48時間インキュベートした。次に、腺をPBSTで3X1時間洗浄し、PBST/5%ロバ血清で希釈した二次抗体とともに4℃で24時間インキュベートした。DNAを対比染色するために、腺をPBSTで希釈したHoechstと共に1時間インキュベートし、次にPBSTで2X1時間洗浄した。最後に、腺を、それらが透明になるまで、通常は24時間、CUBIC試薬2とともに4℃でインキュベートした。
管内注射:
注射の準備:イソフルランチャンバーを使用してマウスを麻酔し、眼の潤滑剤を適用した。マウスは、ノーズコーンを介して酸素中の2~4%イソフルランで継続的に麻酔された。Nairケミカルヘアリムーバーで乳頭領域から毛を除去する。注射:妊娠7日目に、PBSまたはROBO2 mAbを、50μlの注射器に取り付けられた33ゲージの斜角針(Hamilton)を使用して、腺#3、#4、#5の乳首に両側から注射する。注射は非常にゆっくりと(約40μl/分)行い、管腔内で急速に移動する流体によって引き起こされる可能性のある損傷を最小限に抑えた。注射後:動物をノーズコーンから取り出し、回復のために別のケージに移す46。
注射の準備:イソフルランチャンバーを使用してマウスを麻酔し、眼の潤滑剤を適用した。マウスは、ノーズコーンを介して酸素中の2~4%イソフルランで継続的に麻酔された。Nairケミカルヘアリムーバーで乳頭領域から毛を除去する。注射:妊娠7日目に、PBSまたはROBO2 mAbを、50μlの注射器に取り付けられた33ゲージの斜角針(Hamilton)を使用して、腺#3、#4、#5の乳首に両側から注射する。注射は非常にゆっくりと(約40μl/分)行い、管腔内で急速に移動する流体によって引き起こされる可能性のある損傷を最小限に抑えた。注射後:動物をノーズコーンから取り出し、回復のために別のケージに移す46。
卵巣摘出、ホルモン処理および皮下注射:
C57BLマウス(8~10週齢)を両側卵巣切除し、1週間回復させた47。回復中、マウスはNuttellaの経口投与で訓練された。マウスに、17ベータ-エストラジオール(E、1μg、Sigma)+プロゲステロン(P、1mg、Sigma)を混合したNutellaを3週間(毎日)与えた。ROBO1-Ig5 ECDの場合、プロラクチン(Prl、200μg、NHPP)が、1週間のE+Pの後に開始して、1週間にわたって(毎日)Nutellaの経口投与によって投与された。ROBO2 mAbの場合、プロラクチン(Prl、50μg)を、1週間のE+Pの後に開始して、2.5週間にわたって(毎日)腹腔内注射によって注射した。ROBO1-Ig5 ECDは、E+Pの1週間後に開始して、2週間にわたって皮下注射した(7.5mg/kg、ROBO1-Ig5 ECDまたはPBS;毎日)。ROBO2 mAbまたはIgGアイソタイプコントロールmAb(250μg/マウス)は、1週間のE+P後に開始して、17日間にわたって週2回皮下注射した48。
C57BLマウス(8~10週齢)を両側卵巣切除し、1週間回復させた47。回復中、マウスはNuttellaの経口投与で訓練された。マウスに、17ベータ-エストラジオール(E、1μg、Sigma)+プロゲステロン(P、1mg、Sigma)を混合したNutellaを3週間(毎日)与えた。ROBO1-Ig5 ECDの場合、プロラクチン(Prl、200μg、NHPP)が、1週間のE+Pの後に開始して、1週間にわたって(毎日)Nutellaの経口投与によって投与された。ROBO2 mAbの場合、プロラクチン(Prl、50μg)を、1週間のE+Pの後に開始して、2.5週間にわたって(毎日)腹腔内注射によって注射した。ROBO1-Ig5 ECDは、E+Pの1週間後に開始して、2週間にわたって皮下注射した(7.5mg/kg、ROBO1-Ig5 ECDまたはPBS;毎日)。ROBO2 mAbまたはIgGアイソタイプコントロールmAb(250μg/マウス)は、1週間のE+P後に開始して、17日間にわたって週2回皮下注射した48。
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本発明の好ましい態様を本明細書に図示して説明してきたが、そのような態様が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。当業者は、本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、および置換を思いつくであろう。本明細書に記載されている本発明の態様の様々な代替態様が、本発明を実施する際に用いられ得ることを理解されたい。下記の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによって網羅されることが意図されている。
完全性の理由から、本開示のポリペプチド、組成物、および方法の特定の態様は、以下の番号が付けられた条項に記載されている。
1.哺乳動物の乳生産を促進する方法であって、
哺乳動物に、NOTCH4活性を阻害する第1の薬剤を、NOTCH4活性を阻害するのに十分な量で投与し、それにより乳汁産生を促進することを含む、方法。
2.第1の薬剤が、NOTCH4タンパク質に直接結合することにより、ROBO2のROBO1への結合を阻害することにより、ROBO1のNOTCH4への結合を促進することにより、NOTCH4の発現を阻害することにより、またはROBO2の発現を阻害することにより、NOTCH4活性を阻害する、条項1に記載の方法。
3.第1の薬剤が可溶性ROBO1細胞外ドメイン(ECD)を含む、条項1に記載の方法。
4.可溶性ROBO1 ECDが、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、またはヒトROBO1 ECDである、条項3に記載の方法。
5.ROBO1 ECDが、異種ポリペプチドを含む、条項3または4に記載の方法。
6.異種ポリペプチドが、Hisタグ、血球凝集素タグ、免疫グロブリン(Ig)Fc領域、またはMycタグを含む、条項5に記載の方法。
7.第1の薬剤が、NOTCH4またはROBO2の発現を阻害するRNAi構築物を含む、条項1に記載の方法。
8.RNAi構築物が、短い干渉RNAである、条項7に記載の方法。
9.第1の薬剤が、抗NOTCH4抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントを含む、条項1に記載の方法。
10.第1の薬剤が、複数のポリクローナル抗NOTCH4抗体を含む、条項9に記載の方法。
11.抗NOTCH4抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントが、モノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントである、条項9に記載の方法。
12.ポリクローナル抗NOTCH4抗体が、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、またはヒトポリクローナル抗体であり、ポリクローナル抗体が生成される種が、第1の薬剤が投与される哺乳動物の種と一致する、条項10に記載の方法。
13.モノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、もしくはヒトモノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントであり、モノクローナル抗体が由来する種が、第1の薬剤が投与される哺乳動物の種と一致する、条項11に記載の方法。
14.抗NOTCH4モノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントが、ウシ化、ヒツジ化、ヤギ化、ラクダ化、またはヒト化されている、条項13に記載の方法。
15.第1の薬剤が、可溶性ROBO1細胞外ドメインを含み、方法が、NOTCH4活性を阻害する第2の薬剤を、NOTCH4活性を阻害するのに十分な量で哺乳動物に投与することをさらに含む、条項1に記載の方法。
16.第2の薬剤が、NOTCH4またはROBO2の発現を阻害するRNAi構築物を含む、条項15に記載の方法。
17.NOTCH4またはROBO2の発現を阻害するRNAi構築物を含む第3の薬剤をさらに含む、条項16に記載の方法。
18.方法が、NOTCH4活性を阻害する第1の薬剤、第2の薬剤、第3の薬剤、および第4の薬剤のうちの少なくとも1つを投与することを含み、第1の薬剤、第2の薬剤、第3の薬剤、および第4の薬剤の各々が独立して、可溶性ROBO1 ECD、抗NOTCH4抗体、NOTCH4の発現を阻害するRNAi構築物、およびROBO2の発現を阻害するRNAi構築物から選択される、条項1に記載の方法。
19.ポリペプチドであって、
異種ポリペプチドに融合した可溶性ROBO1細胞外ドメインを含む、ポリペプチド。
20.可溶性ROBO1 ECDがマウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヒトROBO1 ECDである、条項19に記載のポリペプチド。
21.異種ポリペプチドが、Hisタグ、血球凝集素タグ、ヒトもしくはマウスFc領域、Mycタグ、または蛍光タンパク質を含む、条項20に記載のポリペプチド。
22.医薬組成物であって、
条項19~21のいずれか一条項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
23.哺乳動物における乳汁産生を促進するのに使用するための、条項22に記載の医薬組成物。
24.NOTCH4活性を阻害する抗NOTCH4抗体またはそのNOTCH4結合フラグメント。
25.抗体が、複数のポリクローナル抗体を含む、条項24に記載の抗体。
26.抗体が、モノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントである、条項24に記載の抗体。
27.抗体が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、またはヒトポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含み、モノクローナル抗体の少なくとも一部が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヒト抗体からの抗体配列を含む、条項24~26のいずれか一条項に記載の抗体。
28.ウシ化、ヒツジ化、ヤギ化、ラクダ化、またはヒト化抗体またはその任意の抗原結合フラグメントを含む、条項26に記載の抗体。
29.条項24~28のいずれか一条項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
30.哺乳動物における乳汁産生を促進するのに使用するための、条項29に記載の医薬組成物。
31.ROBO2またはNOTCH4の発現を阻害するRNAi構築物を含む、ポリヌクレオチド。
32.少なくとも1つの天然に存在しないヌクレオチドを含む、条項31に記載のポリヌクレオチド。
33.配列番号32~配列番号35のうちの1つ以上を含む、条項31または32に記載のポリヌクレオチド。
34.条項31~33のいずれか一条項に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
35.哺乳動物における乳汁産生を促進するのに使用するための、条項34に記載の医薬組成物。
36.以下の表現型:可溶性ROBO1細胞外ドメインの発現;ROBO2の発現の阻害;およびNOTCH4の発現の阻害のうちの1つ以上をもたらす遺伝子改変を含む、トランスジェニック哺乳動物。
37.表現型が、乳腺組織に限定される、条項36に記載のトランスジェニック動物。
38.トランスジェニック動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはラクダである、条項36または37に記載のトランスジェニック哺乳動物。
39.記載された表現型のうちの2つをもたらす2つの遺伝子改変を含む、条項36~38のいずれか一条項に記載のトランスジェニック哺乳動物。
40.記載された表現型の3つすべてをもたらす3つの遺伝子改変を含む、条項36~38のいずれか一条項に記載のトランスジェニック哺乳動物。
41.乳汁産生を促進する方法であって、
条項36~40のいずれか一条項に記載のトランスジェニック哺乳動物に、NOTCH4活性を阻害する医薬組成物を投与することを含む、方法。
42.医薬組成物が、条項22、23、29、30、34および35のいずれか一条項に記載の組成物である、条項41に記載の方法。
43.トランスジェニック動物が、可溶性ROBO1細胞外ドメインの発現をもたらす遺伝子改変を含み、方法が、トランスジェニック動物に条項22、23、29、30、34および35のいずれか一条項に記載の医薬組成物を投与することをさらに含む、条項41に記載の方法。
44.トランスジェニック哺乳動物が、ROBO2および/またはNOTCH4の発現の阻害をもたらす遺伝子改変を含み、方法が、トランスジェニック動物に条項34または35に記載の医薬組成物を投与することをさらに含む、条項41に記載の方法。
1.哺乳動物の乳生産を促進する方法であって、
哺乳動物に、NOTCH4活性を阻害する第1の薬剤を、NOTCH4活性を阻害するのに十分な量で投与し、それにより乳汁産生を促進することを含む、方法。
2.第1の薬剤が、NOTCH4タンパク質に直接結合することにより、ROBO2のROBO1への結合を阻害することにより、ROBO1のNOTCH4への結合を促進することにより、NOTCH4の発現を阻害することにより、またはROBO2の発現を阻害することにより、NOTCH4活性を阻害する、条項1に記載の方法。
3.第1の薬剤が可溶性ROBO1細胞外ドメイン(ECD)を含む、条項1に記載の方法。
4.可溶性ROBO1 ECDが、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、またはヒトROBO1 ECDである、条項3に記載の方法。
5.ROBO1 ECDが、異種ポリペプチドを含む、条項3または4に記載の方法。
6.異種ポリペプチドが、Hisタグ、血球凝集素タグ、免疫グロブリン(Ig)Fc領域、またはMycタグを含む、条項5に記載の方法。
7.第1の薬剤が、NOTCH4またはROBO2の発現を阻害するRNAi構築物を含む、条項1に記載の方法。
8.RNAi構築物が、短い干渉RNAである、条項7に記載の方法。
9.第1の薬剤が、抗NOTCH4抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントを含む、条項1に記載の方法。
10.第1の薬剤が、複数のポリクローナル抗NOTCH4抗体を含む、条項9に記載の方法。
11.抗NOTCH4抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントが、モノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントである、条項9に記載の方法。
12.ポリクローナル抗NOTCH4抗体が、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、またはヒトポリクローナル抗体であり、ポリクローナル抗体が生成される種が、第1の薬剤が投与される哺乳動物の種と一致する、条項10に記載の方法。
13.モノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、もしくはヒトモノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントであり、モノクローナル抗体が由来する種が、第1の薬剤が投与される哺乳動物の種と一致する、条項11に記載の方法。
14.抗NOTCH4モノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントが、ウシ化、ヒツジ化、ヤギ化、ラクダ化、またはヒト化されている、条項13に記載の方法。
15.第1の薬剤が、可溶性ROBO1細胞外ドメインを含み、方法が、NOTCH4活性を阻害する第2の薬剤を、NOTCH4活性を阻害するのに十分な量で哺乳動物に投与することをさらに含む、条項1に記載の方法。
16.第2の薬剤が、NOTCH4またはROBO2の発現を阻害するRNAi構築物を含む、条項15に記載の方法。
17.NOTCH4またはROBO2の発現を阻害するRNAi構築物を含む第3の薬剤をさらに含む、条項16に記載の方法。
18.方法が、NOTCH4活性を阻害する第1の薬剤、第2の薬剤、第3の薬剤、および第4の薬剤のうちの少なくとも1つを投与することを含み、第1の薬剤、第2の薬剤、第3の薬剤、および第4の薬剤の各々が独立して、可溶性ROBO1 ECD、抗NOTCH4抗体、NOTCH4の発現を阻害するRNAi構築物、およびROBO2の発現を阻害するRNAi構築物から選択される、条項1に記載の方法。
19.ポリペプチドであって、
異種ポリペプチドに融合した可溶性ROBO1細胞外ドメインを含む、ポリペプチド。
20.可溶性ROBO1 ECDがマウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヒトROBO1 ECDである、条項19に記載のポリペプチド。
21.異種ポリペプチドが、Hisタグ、血球凝集素タグ、ヒトもしくはマウスFc領域、Mycタグ、または蛍光タンパク質を含む、条項20に記載のポリペプチド。
22.医薬組成物であって、
条項19~21のいずれか一条項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
23.哺乳動物における乳汁産生を促進するのに使用するための、条項22に記載の医薬組成物。
24.NOTCH4活性を阻害する抗NOTCH4抗体またはそのNOTCH4結合フラグメント。
25.抗体が、複数のポリクローナル抗体を含む、条項24に記載の抗体。
26.抗体が、モノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントである、条項24に記載の抗体。
27.抗体が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、またはヒトポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含み、モノクローナル抗体の少なくとも一部が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヒト抗体からの抗体配列を含む、条項24~26のいずれか一条項に記載の抗体。
28.ウシ化、ヒツジ化、ヤギ化、ラクダ化、またはヒト化抗体またはその任意の抗原結合フラグメントを含む、条項26に記載の抗体。
29.条項24~28のいずれか一条項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
30.哺乳動物における乳汁産生を促進するのに使用するための、条項29に記載の医薬組成物。
31.ROBO2またはNOTCH4の発現を阻害するRNAi構築物を含む、ポリヌクレオチド。
32.少なくとも1つの天然に存在しないヌクレオチドを含む、条項31に記載のポリヌクレオチド。
33.配列番号32~配列番号35のうちの1つ以上を含む、条項31または32に記載のポリヌクレオチド。
34.条項31~33のいずれか一条項に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
35.哺乳動物における乳汁産生を促進するのに使用するための、条項34に記載の医薬組成物。
36.以下の表現型:可溶性ROBO1細胞外ドメインの発現;ROBO2の発現の阻害;およびNOTCH4の発現の阻害のうちの1つ以上をもたらす遺伝子改変を含む、トランスジェニック哺乳動物。
37.表現型が、乳腺組織に限定される、条項36に記載のトランスジェニック動物。
38.トランスジェニック動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはラクダである、条項36または37に記載のトランスジェニック哺乳動物。
39.記載された表現型のうちの2つをもたらす2つの遺伝子改変を含む、条項36~38のいずれか一条項に記載のトランスジェニック哺乳動物。
40.記載された表現型の3つすべてをもたらす3つの遺伝子改変を含む、条項36~38のいずれか一条項に記載のトランスジェニック哺乳動物。
41.乳汁産生を促進する方法であって、
条項36~40のいずれか一条項に記載のトランスジェニック哺乳動物に、NOTCH4活性を阻害する医薬組成物を投与することを含む、方法。
42.医薬組成物が、条項22、23、29、30、34および35のいずれか一条項に記載の組成物である、条項41に記載の方法。
43.トランスジェニック動物が、可溶性ROBO1細胞外ドメインの発現をもたらす遺伝子改変を含み、方法が、トランスジェニック動物に条項22、23、29、30、34および35のいずれか一条項に記載の医薬組成物を投与することをさらに含む、条項41に記載の方法。
44.トランスジェニック哺乳動物が、ROBO2および/またはNOTCH4の発現の阻害をもたらす遺伝子改変を含み、方法が、トランスジェニック動物に条項34または35に記載の医薬組成物を投与することをさらに含む、条項41に記載の方法。
Claims (44)
- 哺乳動物の乳汁産生を促進する方法であって、
前記哺乳動物に、NOTCH4活性を阻害する第1の薬剤を、NOTCH4活性を阻害するのに十分な量で投与し、それにより乳汁産生を促進すること、を含む、方法。 - 前記第1の薬剤が、NOTCH4タンパク質に直接結合することにより、ROBO2がROBO1に結合することを阻害することにより、ROBO1がNOTCH4に結合することを促進することにより、NOTCH4の発現を阻害することにより、またはROBO2の発現を阻害することにより、NOTCH4活性を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の薬剤が可溶性ROBO1細胞外ドメイン(ECD)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記可溶性ROBO1 ECDが、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、またはヒトROBO1 ECDである、請求項3に記載の方法。
- 前記ROBO1 ECDが、異種ポリペプチドを含む、請求項3または4に記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが、Hisタグ、血球凝集素タグ、免疫グロブリン(Ig)Fc領域、またはMycタグを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記第1の薬剤が、NOTCH4またはROBO2の発現を阻害するRNAi構築物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記RNAi構築物が、短い干渉RNAである、請求項7に記載の方法。
- 前記第1の薬剤が、抗NOTCH4抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の薬剤が、複数のポリクローナル抗NOTCH4抗体を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記抗NOTCH4抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントが、モノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントである、請求項9に記載の方法。
- 前記ポリクローナル抗NOTCH4抗体が、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、またはヒトポリクローナル抗体であり、前記ポリクローナル抗体が生成される種が、前記第1の薬剤が投与される前記哺乳動物の種と一致する、請求項10に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、もしくはヒトモノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントであり、前記モノクローナル抗体が由来する種が、前記第1の薬剤が投与される前記哺乳動物の種と一致する、請求項11に記載の方法。
- 抗NOTCH4モノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントが、ウシ化、ヒツジ化、ヤギ化、ラクダ化、またはヒト化されている、請求項13に記載の方法。
- 前記第1の薬剤が、可溶性ROBO1細胞外ドメインを含み、前記方法が、NOTCH4活性を阻害する第2の薬剤を、NOTCH4活性を阻害するのに十分な量で前記哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の薬剤が、NOTCH4またはROBO2の発現を阻害するRNAi構築物を含む、請求項15に記載の方法。
- NOTCH4またはROBO2の発現を阻害するRNAi構築物を含む第3の薬剤をさらに含む、請求項16に記載の方法。
- 前記方法が、NOTCH4活性を阻害する第1の薬剤、第2の薬剤、第3の薬剤、および第4の薬剤のうちの少なくとも1つを投与することを含み、前記第1の薬剤、前記第2の薬剤、前記第3の薬剤、および前記第4の薬剤の各々が独立して、可溶性ROBO1 ECD、抗NOTCH4抗体、NOTCH4の発現を阻害するRNAi構築物、およびROBO2の発現を阻害するRNAi構築物から選択される、請求項1に記載の方法。
- ポリペプチドであって、
異種ポリペプチドに融合した可溶性ROBO1細胞外ドメインを含む、ポリペプチド。 - 可溶性ROBO1 ECDがマウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヒトROBO1 ECDである、請求項19に記載のポリペプチド。
- 前記異種ポリペプチドが、Hisタグ、血球凝集素タグ、ヒトもしくはマウスFc領域、Mycタグ、または蛍光タンパク質を含む、請求項20に記載のポリペプチド。
- 医薬組成物であって、
請求項19~21のいずれか一項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。 - 哺乳動物における乳汁産生を促進することにおける使用のための、請求項22に記載の医薬組成物。
- NOTCH4活性を阻害する抗NOTCH4抗体またはそのNOTCH4結合フラグメント。
- 前記抗体が、複数のポリクローナル抗体を含む、請求項24に記載の抗体。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体またはそのNOTCH4結合フラグメントである、請求項24に記載の抗体。
- 前記抗体が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、またはヒトのポリクローナル抗体、または、少なくとも一部がウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヒト抗体からの抗体配列を含むモノクローナル抗体を含む、請求項24~26のいずれか一項に記載の抗体。
- ウシ化、ヒツジ化、ヤギ化、ラクダ化、もしくはヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項26に記載の抗体。
- 請求項24~28のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
- 哺乳動物における乳汁産生を促進することにおける使用のための、請求項29に記載の医薬組成物。
- ROBO2またはNOTCH4の発現を阻害するRNAi構築物を含む、ポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つの天然に存在しないヌクレオチドを含む、請求項31に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号32~配列番号35のうちの1つ以上を含む、請求項31または32に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項31~33のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
- 哺乳動物における乳汁産生を促進することにおける使用のための、請求項34に記載の医薬組成物。
- 以下の表現型:可溶性ROBO1細胞外ドメインの発現;ROBO2の発現の阻害;およびNOTCH4の発現の阻害のうちの1つ以上をもたらす遺伝子改変を含む、トランスジェニック哺乳動物。
- 前記表現型が、乳腺組織に限定される、請求項36に記載のトランスジェニック動物。
- 前記トランスジェニック動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはラクダである、請求項36または37に記載のトランスジェニック哺乳動物。
- 前記表現型のうちの2つをもたらす2つの遺伝子改変を含む、請求項36~38のいずれか一項に記載のトランスジェニック哺乳動物。
- 前記表現型の3つすべてをもたらす3つの遺伝子改変を含む、請求項36~38のいずれか一項に記載のトランスジェニック哺乳動物。
- 乳汁産生を促進する方法であって、
請求項36~40のいずれか一項に記載のトランスジェニック哺乳動物に、NOTCH4活性を阻害する医薬組成物を投与することを含む、方法。 - 前記医薬組成物が、請求項22、23、29、30、34および35のいずれか一項に記載の組成物である、請求項41に記載の方法。
- 前記トランスジェニック動物が、可溶性ROBO1細胞外ドメインの発現をもたらす遺伝子改変を含み、前記方法が、前記トランスジェニック動物に請求項22、23、29、30、34および35のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することをさらに含む、請求項41に記載の方法。
- 前記トランスジェニック哺乳動物が、ROBO2および/またはNOTCH4の発現の阻害をもたらす遺伝子改変を含み、前記方法が、前記トランスジェニック動物に請求項34または35に記載の医薬組成物を投与することをさらに含む、請求項41に記載の方法。
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