JP2022524304A - 肝細胞がん早期スクリーニング用キット、その製造方法、及びその使用 - Google Patents
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Abstract
遺伝子マーカー検出剤及びタンパク質マーカー検出剤を含む肝細胞がん早期スクリーニング用キット、その製造方法及びその使用。特定の遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを含むキットは、コミュニティ集団において肝細胞がん早期スクリーニングを効果的に実施できることが確認され、前向き研究において検証されている。【選択図】図４
Description
本発明は、医療分野に属し、肝細胞がん早期スクリーニング用キットに関し、より具体的には、ＡＦＰ陰性被検者の肝細胞がん早期スクリーニング用キット、その製造方法、及び使用に関する。
肝がんには、肝細胞がん（ＨＣＣ）と肝内胆管細胞がん（ｉＣＣＡ）の２つの主要な病理組織学的タイプがあり、そのうち、ＨＣＣが約８５～９０％を占め、現在進行したＨＣＣに有効な治療法がないことから、ＨＣＣのリスクが高い肝硬変患者にはスクリーニングが薦められる（Omata M, et al. (2017) Asia-Pacific clinical practice guidelines on the management of hepatocellular carcinoma: a 2017 update. Hepatol Int11(4):317-370；Marrero JA, et al. (2018) Diagnosis, Staging and Management of Hepatocellular Carcinoma: 2018 Practice Guidance by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology.）。中国では、アジア太平洋肝臓学会のガイドラインによれば、すでに複数のコホートでＨＣＣ早期スクリーニングを行っており、肝硬変個体とＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）陽性個体が６ヶ月ごとに超音波検査（ＵＳ）と血清αフェトプロテイン（ＡＦＰ）検査を含むＨＣＣモニタリングを行う（Omata M, et al. (2017)、同上）ことが薦められている。従来の研究では、このような早期発見と早期治療は肝がんの総生存率を著しく高めた（Singal AG, Pillai A, & Tiro J (2014) Early detection, curative treatment, and survival rates for hepatocellular carcinoma surveillance in patients with cirrhosis: a meta-analysis. PLoS medicine 11(4):e1001624.）が、ＨＣＣの正確な検査は経験のある専門家を必要とし、それにより全てのＨＢｓＡｇ陽性個体における広範な応用が制限される。さらに、年２回のスクリーニングは、フォローアップ予約や不安の発生にも繋がる。現在、中国のＨＣＣ症例の大部分は、ＨＣＣスクリーニングではなく、臨床症状に基づいて発見されており、病院で診断されたときにはすでに進行期にある。
最近の研究では、細胞の遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の遺伝子改変に基づく液体生検が、がんの早期検査で良好な効果を示している（Bettegowda C, et al.(2014) Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science translational medicine 6(224):224ra224；Chaudhuri AA, et al. (2017) Early Detection of Molecular Residual Disease in Localized Lung Cancer by Circulating Tumor DNA Profiling. Cancer discovery7(12):1394-1403.）。遺伝子とタンパク質マーカーを組み合わせることにより、検出の感度と特異性がさらに向上し、１つのテストで複数の腫瘍タイプをスクリーニングする可能性がある（Springer S, et al. (2015) A Combination of Molecular Markers and Clinical Features Improve the Classification of Pancreatic Cysts. Gastroenterology；Cohen JD, et al. (2018) Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science359(6378):926-930；Cohen JD, et al. (2017) Combined circulating tumor DNA and protein biomarker-based liquid biopsy for the earlier detection of pancreatic cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 114(38):10202-10207.）。しかし、これらの研究は主にＨＣＣ入院患者とＨＢＶ感染のない健常者を対象としている（Cohen JD, et al. (2018)、同上）。慢性ＨＢＶ感染のハイリスク集団では、肝硬変などの前がん障害もＨＣＣに普遍的に存在するドライバー変異を持っている可能性があるため、液体生検の性能が影響を受ける恐れがある。肝炎、肝硬変や非がん性肝結節の分析は、ベースラインを作成してイメージング又は組織学的臨床検証によってＨＣＣを正確に同定するのに必要である。
肝機能障害を引き起こすよくある原因は感染（例えばＢ型肝炎ウイルス感染）、肥満、アルコール依存症、アフラトキシン暴露、血中脂質異常などであり、しかも肝疾患患者は肝がんにかかるリスクが更に高い。αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、プロトロンビン（ＤＣＰ）及び扁平上皮細胞がん抗原（ＳＣＣＡ）は全て肝がんのタンパク質マーカーである。研究により、ＡＦＰとＤＣＰの両方を測定すると、肝がんの予測感度を高め、早期肝がんと非代償性肝硬変を効果的に区別できることが明らかになった。しかしながら、多くの早期肝がんの場合、ＡＦＰ、ＤＣＰ、及びＳＣＣＡの検査結果は全て陰性である。
腫瘍やその他の細胞はＤＮＡ分子を血液中に放出し、ＤＮＡ分子が分解されて遊離するＤＮＡ断片（Ｃｅｌｌｆｒｅｅ ＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ）となる。ｃｆＤＮＡの検出は腫瘍の標的投薬の指導、治療効果の監視及びがんの早期スクリーニングなどにおいて極めて大きな潜在力を示している。中国の肝がん患者のうち、約９０％はＢ型肝炎ウイルス感染があり、しかもＢ型肝炎ウイルス関連性肝がんにはＫＲＡＳ、ＢＲＡＦなどのホットスポット変異がほとんどない。
前述したように、従来、ＡＦＰなどの単独のタンパク質マーカーをＨＣＣ早期スクリーニング指標として使用してきた。Ｃｈｕｎらは２０１５（Chun S, Rhie SY, Ki CS, Kim JE, & Park HD (2015) Evaluation of alpha-fetoprotein as a screening marker for hepatocellular carcinoma in hepatitis prevalent areas. Annals of hepatology 14(6):882-888.）に、単独のαフェトプロテインをスクリーニングマーカーとして用いたことを報告しているが、効果が低く、陽性予測値が約１～２％であった。
最近、遺伝子変化とタンパクマーカーの組み合わせを用いたＨＣＣ早期スクリーニングも試みられている。Ｊｏｓｈｕａ Ｄ．Ｃｏｈｅｎらは２０１８（Cohen J D,Li L,Wang Y,et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test[J].Science,2018,359(6378)：eaar3247.）に、ＨＣＣを含む汎がん種の早期スクリーニングを遺伝子変異とタンパク質マーカーの組み合わせにより行うことを報告したが、ＨＣＣに関わる場合、例えばＴＥＲＴ及びその多様な形及び／又はＨＢＶ融合の遺伝子変化を用いていない。しかも、この研究は、ＨＣＣと診断された入院患者と健常集団に対する後ろ向き研究だけであり、ＨＣＣ病状のない集団に対して前向き研究を行って、ＨＣＣの発生に対して予測を行い、陽性予測値を提供していない。
発明の概要
従来、遺伝子変化又はタンパク質マーカーは、それぞれ単独でがん早期スクリーニングに用いられてきた。遺伝子変化とタンパク質マーカーの組み合わせによるがん早期スクリーニングも試みられたことがある。遊離した細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）とタンパク質を組み合わせた液体生検は、多くの組織型のがんの早期検査に潜在力を示してきた。しかしながら、これらの研究の多くは、以前にがんと診断された個体を症例とし、健常個体を対照とした後ろ向きのものである。一方、ごく少数の前向き研究であっても、肝細胞がんについては、従来技術で採用されているマーカーの予測効果は低い。そこで、本発明は、肝細胞がんスクリーニング（ＨＣＣスクリーニング）と呼ばれる液体生検測定法を開発し、特定の遺伝子マーカーとタンパク質マーカーを組み合わせ、多拠点コミュニティ集団において慢性ＨＢＶ感染の早期ＨＣＣ検査への応用価値を確認した。検証の結果、この方法はＨＣＣ個体と非ＨＣＣ個体を確実に区別し、８５％の感度と９３％の特異性を有することを示している。発明者らはさらに、この測定法を肝臓超音波検査と血清ＡＦＰレベルが正常な３３１名の個体に適用し、前向き研究を行った。２４例の陽性症例を識別し、６～８ヶ月の臨床フォローアップにより、４例がＨＣＣに進展したことを確認した。同じ時期のフォローアップでは、３０７人のテスト陰性個体はＨＣＣ症例を診断できなかった。この測定法は検証セットで１００％の感度、９４％の特異性、１７％の陽性予測値を示した。その陽性予測値（ＰＰＶ）である１７％は、従来のＡＦＰレベルのみによるスクリーニング結果（Chun S, Rhie SY, Ki CS, Kim JE, & Park HD (2015) Evaluation of alpha-fetoprotein as a screening marker for hepatocellular carcinoma in hepatitis prevalent areas. Annals of hepatology 14(6):882-888.）よりも著しく高く、本発明の特定の遺伝子マーカー及び特定のタンパク質マーカーをそれぞれ用いて単独で得られた結果よりも高い。
従来、遺伝子変化又はタンパク質マーカーは、それぞれ単独でがん早期スクリーニングに用いられてきた。遺伝子変化とタンパク質マーカーの組み合わせによるがん早期スクリーニングも試みられたことがある。遊離した細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）とタンパク質を組み合わせた液体生検は、多くの組織型のがんの早期検査に潜在力を示してきた。しかしながら、これらの研究の多くは、以前にがんと診断された個体を症例とし、健常個体を対照とした後ろ向きのものである。一方、ごく少数の前向き研究であっても、肝細胞がんについては、従来技術で採用されているマーカーの予測効果は低い。そこで、本発明は、肝細胞がんスクリーニング（ＨＣＣスクリーニング）と呼ばれる液体生検測定法を開発し、特定の遺伝子マーカーとタンパク質マーカーを組み合わせ、多拠点コミュニティ集団において慢性ＨＢＶ感染の早期ＨＣＣ検査への応用価値を確認した。検証の結果、この方法はＨＣＣ個体と非ＨＣＣ個体を確実に区別し、８５％の感度と９３％の特異性を有することを示している。発明者らはさらに、この測定法を肝臓超音波検査と血清ＡＦＰレベルが正常な３３１名の個体に適用し、前向き研究を行った。２４例の陽性症例を識別し、６～８ヶ月の臨床フォローアップにより、４例がＨＣＣに進展したことを確認した。同じ時期のフォローアップでは、３０７人のテスト陰性個体はＨＣＣ症例を診断できなかった。この測定法は検証セットで１００％の感度、９４％の特異性、１７％の陽性予測値を示した。その陽性予測値（ＰＰＶ）である１７％は、従来のＡＦＰレベルのみによるスクリーニング結果（Chun S, Rhie SY, Ki CS, Kim JE, & Park HD (2015) Evaluation of alpha-fetoprotein as a screening marker for hepatocellular carcinoma in hepatitis prevalent areas. Annals of hepatology 14(6):882-888.）よりも著しく高く、本発明の特定の遺伝子マーカー及び特定のタンパク質マーカーをそれぞれ用いて単独で得られた結果よりも高い。
特定の遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを含む本発明のキットは、不特定集団においてＨＣＣ早期スクリーニングに有効であることを確認されているため、不特定集団のＨＣＣ早期スクリーニング、より好ましくはＡＦＰ陰性被検者のＨＣＣ早期スクリーニングに適用できる。
なお、本発明のキットは、４例のＨＣＣがそれぞれ診断時に早期（＜３ｃｍ）であり、その後の治療に良好な基礎を提供する前向きな早期ＨＣＣ予測のためのものである。本発明者の研究の証拠は、ｃｆＤＮＡ改変とタンパク質マーカーを併用した検出が、無症状でＨＣＣ状態が未知のコミュニティ集団から早期ＨＣＣを識別するための実行可能な方法であることを示している。
したがって、一態様において、本発明は、遺伝子マーカー検出剤及びタンパク質マーカー検出剤を含む肝細胞がん早期スクリーニング用キットを提供する。
前記キットは、遺伝子マーカー及び／又はタンパク質マーカーの情報を前記被験者の肝細胞がんスクリーニングスコアに変換し、前記被験者の肝細胞がんスクリーニングスコアから被験者が肝がん患者であるか否かを予測するデータ処理システムをさらに含んでもよい。
別の態様において、本発明は、
（１）遺伝子マーカー検出剤及びタンパク質マーカー検出剤を用いて被検者の遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを検出するステップと、（２）前記遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーの検出結果を用いて肝細胞がんスクリーニングスコアを算出し、閾値と比較するステップとを含む、肝細胞がん早期スクリーニング方法を提供する。
（１）遺伝子マーカー検出剤及びタンパク質マーカー検出剤を用いて被検者の遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを検出するステップと、（２）前記遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーの検出結果を用いて肝細胞がんスクリーニングスコアを算出し、閾値と比較するステップとを含む、肝細胞がん早期スクリーニング方法を提供する。
前記方法において、前記肝細胞がんスクリーニングスコア及び閾値は、肝がん予測モデルにより得られ、前記肝がん予測モデルの構築方法は、
複数の肝がん患者及び複数の肝がんハイリスク者からなる訓練セットを構築するステップと、
訓練セットの遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを特徴とし、検出結果を特徴スコア値に変換し、罰則付きロジスティック回帰アルゴリズムを用いて、肝がん予測モデルを構築し、肝細胞がんスクリーニングスコアを算出するステップと、
肝細胞がんスクリーニングスコアとサンプルグループ情報とに従って、罰則付きロジスティック回帰モデルの感度と特異性のＲＯＣ曲線を取得し、ＲＯＣ曲線に従って、肝がん患者と肝がんハイリスク者とを区別するための閾値となるカットオフ値を決定するステップとを含む。
複数の肝がん患者及び複数の肝がんハイリスク者からなる訓練セットを構築するステップと、
訓練セットの遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを特徴とし、検出結果を特徴スコア値に変換し、罰則付きロジスティック回帰アルゴリズムを用いて、肝がん予測モデルを構築し、肝細胞がんスクリーニングスコアを算出するステップと、
肝細胞がんスクリーニングスコアとサンプルグループ情報とに従って、罰則付きロジスティック回帰モデルの感度と特異性のＲＯＣ曲線を取得し、ＲＯＣ曲線に従って、肝がん患者と肝がんハイリスク者とを区別するための閾値となるカットオフ値を決定するステップとを含む。
さらに別の態様において、本発明は、遺伝子マーカー検出剤及びタンパク質マーカー検出剤の肝細胞がん早期スクリーニングにおける使用を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、肝細胞がん早期スクリーニング用キットの製造における遺伝子マーカー検出剤及びタンパク質マーカー検出剤の使用を提供する。
本発明の目的は、肝がんの早期スクリーニングを行うことである。
本発明は、まず、肝がん突然変異遺伝子の検出試薬、ＤＣＰ検出試薬、ＡＦＰ検出試薬を含んでもよい肝がん早期スクリーニング用キットを保護する。
前記「肝がん突然変異遺伝子の検出試薬」は、ｃｆＤＮＡ中の肝がん突然変異遺伝子の突然変異タイプ及び／又は突然変異ｒｅａｄｓ及び／又は遺伝子コピー数変異を検出するのに用いられてもよい。
前記「肝がん突然変異遺伝子」は、ＴＰ５３遺伝子及び／又はＴＥＲＴ遺伝子及び／又はＡＸＩＮ１遺伝子及び／又はＣＴＮＮＢ１遺伝子であってもよい。
前記ＤＣＰ検出試薬は、血漿中のＤＣＰ含有量を検出するのに用いられてもよい。
前記ＡＦＰ検出試薬は、血漿中のＡＦＰ含有量を検出するのに用いられてもよい。
前記キットは、ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否かの検出試薬及び／又はｃｆＤＮＡ検出試薬をさらに含んでもよい。
前記「ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否かの検出試薬」は、ｃｆＤＮＡにおけるＨＢＶ配列のヒトゲノムへの組込み部位の有無を検出するのに用いられてもよい。
前記「ｃｆＤＮＡ検出試薬」は、ｃｆＤＮＡ濃度及び／又はｃｆＤＮＡ中の異なる挿入断片長のｃｆＤＮＡ含有量が占めるパーセンテージを検出するのに用いられてもよい。
上記のいずれかのキットは、被験者の肝がん遺伝子変異情報（即ち、１１個の遺伝子突然変異特徴の情報）、ＤＣＰ含有量（血漿中のＤＣＰ含有量）、ＡＦＰ含有量（血漿中のＡＦＰ含有量）、ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否か、ｃｆＤＮＡ情報及び臨床情報を前記被験者の肝細胞がんスクリーニングスコア（即ち、ＨＣＣｓｃｒｅｅｎスコア値）に変換し、前記被験者の肝細胞がんスクリーニングスコアから被験者が肝がん患者であるか否かを予測するデータ処理システムをさらに含んでもよい。
本発明はまた、上記のいずれかの肝がん突然変異遺伝子の検出試薬、ＤＣＰ検出試薬、ＡＦＰ検出試薬、ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否かの検出試薬、及びｃｆＤＮＡ検出試薬のＡ１）～Ａ４）の少なくとも１つであってもよい使用を保護している：
Ａ１）被験者が肝がん患者であるか否かを予測すること、
Ａ２）被験者が肝がん患者であるか否かを予測するためのキットを製造すること、
Ａ３）肝がんを予測すること、
Ａ４）肝がんを予測するためのキットを製造すること。
Ａ１）被験者が肝がん患者であるか否かを予測すること、
Ａ２）被験者が肝がん患者であるか否かを予測するためのキットを製造すること、
Ａ３）肝がんを予測すること、
Ａ４）肝がんを予測するためのキットを製造すること。
本発明はまた、上記のいずれかの肝がん突然変異遺伝子の検出試薬、ＤＣＰ検出試薬、ＡＦＰ検出試薬、ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否かの検出試薬、ｃｆＤＮＡ検出試薬、及びデータ処理システムのＡ１）～Ａ４）の少なくとも１つであってもよい使用を保護している：
Ａ１）被験者が肝がん患者であるか否かを予測すること、
Ａ２）被験者が肝がん患者であるか否かを予測するためのキットを製造すること、
Ａ３）肝がんを予測すること、
Ａ４）肝がんを予測するためのキットを製造すること。
Ａ１）被験者が肝がん患者であるか否かを予測すること、
Ａ２）被験者が肝がん患者であるか否かを予測するためのキットを製造すること、
Ａ３）肝がんを予測すること、
Ａ４）肝がんを予測するためのキットを製造すること。
本発明はまた、被験者の年齢、被験者の性別、被験者の血漿中のＤＣＰ含有量、被験者の血漿中のＡＦＰ含有量、及び「被験者のｃｆＤＮＡ中の肝がん突然変異遺伝子の突然変異タイプ、突然変異ｒｅａｄｓ、遺伝子コピー数変異、ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否か、ｃｆＤＮＡ濃度、異なる挿入断片長のｃｆＤＮＡ含有量が占めるパーセンテージ」の、マーカーとしてのＡ１）～Ａ４）のうちの少なくとも１つであってもよい使用を保護している：
Ａ１）被験者が肝がん患者であるか否かを予測すること、
Ａ２）被験者が肝がん患者であるか否かを予測するためのキットを製造すること、
Ａ３）肝がんを予測すること、
Ａ４）肝がんを予測するためのキットを製造すること。
Ａ１）被験者が肝がん患者であるか否かを予測すること、
Ａ２）被験者が肝がん患者であるか否かを予測するためのキットを製造すること、
Ａ３）肝がんを予測すること、
Ａ４）肝がんを予測するためのキットを製造すること。
本発明はまた、被験者の血漿中のＤＣＰ含有量及びＡＦＰ含有量を検出するステップと、被験者のｃｆＤＮＡ中の肝がん突然変異遺伝子の突然変異タイプ、突然変異ｒｅａｄｓ、遺伝子コピー数変異、ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否か、ｃｆＤＮＡ濃度、及び異なる挿入断片長のｃｆＤＮＡ含有量が占めるパーセンテージを検出するステップと、被験者の年齢と性別を記録するステップと、上記被験者の情報を肝細胞がんスクリーニングスコア（即ち、ＨＣＣｓｃｒｅｅｎスコア値）に変換し、肝細胞がんスクリーニングスコアから被験者が肝がん患者であるか否かを予測するステップとを含んでもよい肝がん予測方法を保護している。
前記「肝細胞がんスクリーニングスコアから被験者が肝がん患者であるか否かを予測する」ステップは、動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）により診断閾値を決定し、被験者の肝細胞がんスクリーニングスコアと前記診断閾値の大きさを比較することにより、被験者の肝がん予測を行うことを含む。
被験者のＨＣＣｓｃｒｅｅｎスコア値は、肝がん予測モデルにより算出されてもよい。前記肝がん予測モデルは、訓練セット中の個々の患者の特徴スコア値とグループ化情報に従って開発された罰則付きロジスティック回帰モデルである。訓練セットは、複数の肝がん患者（肝がん群を構成）と複数の肝がんハイリスク患者（肝がんハイリスク群を構成）からなる。本発明の一実施例では、訓練セットは６５人の肝がん患者と７０人の肝がんハイリスク者からなる。
上記のいずれかのＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否かは、ＨＢＶが遺伝子に組み込まれている程度、ＨＢＶがＴＥＲＴ遺伝子に組み込まれているか否か、及び／又はＨＢＶが非ＴＥＲＴ遺伝子（例えばＡＰＯＢＥＣ４、ＦＢＸ０１０、ＦＵＴ８、ＷＤＲ７、ＳＬＣ７Ａ１０、ＧＵＳＢＰ４）に組み込まれているか否かであってもよい。
上記のいずれかの肝がん突然変異遺伝子の情報は、肝がん突然変異遺伝子の突然変異タイプ及び／又は突然変異ｒｅａｄｓ及び／又は遺伝子コピー数変異の情報を含む。
上記のいずれかのｃｆＤＮＡ情報は、ｃｆＤＮＡ濃度及び／又はｃｆＤＮＡ中の異なる挿入断片長のｃｆＤＮＡ含有量を含んでもよい。前記ｃｆＤＮＡ中の異なる挿入断片長のｃｆＤＮＡ含有量が占めるパーセンテージは、具体的には、遊離ＤＮＡ断片長が９０ｂｐ未満の区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が９０～１４０ｂｐの区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が１４１～２００ｂｐの区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が２００ｂｐより大きい区間のパーセンテージであってもよい。区間のパーセンテージは全てのｃｆＤＮＡ含有量に占めるパーセンテージを指す。
上記のいずれかの臨床情報は、年齢及び／又は性別を含んでもよい。
上記のいずれかの肝がん突然変異遺伝子の検出試薬は、ｃｆＤＮＡを抽出する試薬（例えば、ＭａｇＭＡＸTMＣｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）、ｃｆＤＮＡライブラリーを構築する試薬（例えば、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐキット）、及び目的領域のハイブリダイゼーションキャプチャを行う試薬（例えば、ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ＸＴ標的キャプチャキット）を含む。
前記ＤＣＰ検出試薬は、血漿中のＤＣＰ含有量を検出する試薬であってもよい。具体的には、血漿を分離し、米国アボット社のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ｉ２０００ＳＲ化学発光免疫分析装置を用いてＤＣＰの含有量を検出する。
前記ＡＦＰ検出試薬は、血漿中のＡＦＰ含有量を検出する試薬であってもよい。具体的には、血漿を分離し、米国アボット社のＩＭｘ分析装置を用いてＡＦＰの含有量を検出する。
上記のいずれかのＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否かの検出試薬は、ｃｆＤＮＡを抽出する試薬（例えば、ＭａｇＭＡＸTMＣｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を含んでもよい。
前記ｃｆＤＮＡ検出試薬は、ｃｆＤＮＡを抽出する試薬（例えば、ＭａｇＭＡＸTMＣｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡＩ ｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を含む。
以上では、検出（キット検出）の特徴は、具体的には、以下のような実施例における２０個の特徴であってもよい。
一、前記「肝がん突然変異遺伝子の検出試薬」の検出用の特徴は、具体的には、実施例の１１個の特徴であってもよく、それぞれ、ＴＰ５３遺伝子非Ｒ２４９Ｓ突然変異、ＴＥＲＴ遺伝子突然変異、ＡＸＩＮ１遺伝子突然変異、ＣＴＮＮＢ１遺伝子突然変異、ＴＰ５３ Ｒ２４９Ｓホットスポット突然変異、ＣＮＶ次元削減特徴１、ＣＮＶ次元削減特徴２、ＣＮＶ次元削減特徴３、ＣＮＶ次元削減特徴４、ＣＮＶ次元削減特徴５、ＣＮＶ次元削減特徴６（即ち、１１個の遺伝子突然変異特徴）である。具体的なステップは以下のとおりである。
１、被験血液サンプルｃｆＤＮＡを抽出する。
２、前記被験血液サンプルｃｆＤＮＡを取り、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐキットを用いてライブラリーを構築し、被験血液サンプルのｃｆＤＮＡライブラリーを得る。
３、前記被験血液サンプルのｃｆＤＮＡライブラリーを取り、ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ＸＴ標的キャプチャキットを用いて目的領域のハイブリダイゼーションキャプチャを行い、その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでシークエンシングを行う。被験血液サンプルｃｆＤＮＡ中の肝がん突然変異遺伝子の検出結果（突然変異遺伝子及び突然変異頻度を含む）を得る。
４、遺伝子突然変異結果の注釈及び採点
ｃｆＤＮＡ中の肝がん突然変異遺伝子の検出結果を、突然変異ｒｅａｄｓサポート頻度の注釈スコアで注釈する。
５、被験血液サンプルのｃｆＤＮＡライブラリーを取り、低深度全ゲノムシークエンシングを行い、その後、シークエンシングデータをＣＮＶ検出とｃｆＤＮＡ断片長検出を行う。
６、遺伝子コピー数変異の検出結果の特徴抽出
ＣＮＶ検出結果について次の処理を行う。各染色体腕レベルのＣＮＶシグナル（性染色体は性別がＣＮＶシグナルに与える影響を排除するために削除された）に対して主成分分析（ＰＣＡ）次元削減処理を行い、累積割合（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）≧９５％を閾値として、前の６つの主成分（即ち、ＣＮＶ次元削減特徴１、ＣＮＶ次元削減特徴２、ＣＮＶ次元削減特徴３、ＣＮＶ次元削減特徴４、ＣＮＶ次元削減特徴５、ＣＮＶ次元削減特徴６）をＣＮＶ関連の特徴として選択し、ＣＮＶ次元削減特徴１、ＣＮＶ次元削減特徴２、ＣＮＶ次元削減特徴３、ＣＮＶ次元削減特徴４、ＣＮＶ次元削減特徴５、ＣＮＶ次元削減特徴６）をＣＮＶ特徴とし後続の計算を行い、各ＣＮＶ特徴に対応する主成分のスコア値は当該特徴の特徴スコア値となる。
７、ｃｆＤＮＡ断片長の検出
低深度全ゲノムシークエンシングデータは、それぞれ、遊離ＤＮＡ断片長が９０ｂｐ未満の区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が９０～１４０ｂｐの区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が１４１～２００ｂｐの区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が２００ｂｐより大きい区間のパーセンテージという実施例の４つの特徴の分析に用いることができる。
１、被験血液サンプルｃｆＤＮＡを抽出する。
２、前記被験血液サンプルｃｆＤＮＡを取り、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐキットを用いてライブラリーを構築し、被験血液サンプルのｃｆＤＮＡライブラリーを得る。
３、前記被験血液サンプルのｃｆＤＮＡライブラリーを取り、ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ＸＴ標的キャプチャキットを用いて目的領域のハイブリダイゼーションキャプチャを行い、その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでシークエンシングを行う。被験血液サンプルｃｆＤＮＡ中の肝がん突然変異遺伝子の検出結果（突然変異遺伝子及び突然変異頻度を含む）を得る。
４、遺伝子突然変異結果の注釈及び採点
ｃｆＤＮＡ中の肝がん突然変異遺伝子の検出結果を、突然変異ｒｅａｄｓサポート頻度の注釈スコアで注釈する。
５、被験血液サンプルのｃｆＤＮＡライブラリーを取り、低深度全ゲノムシークエンシングを行い、その後、シークエンシングデータをＣＮＶ検出とｃｆＤＮＡ断片長検出を行う。
６、遺伝子コピー数変異の検出結果の特徴抽出
ＣＮＶ検出結果について次の処理を行う。各染色体腕レベルのＣＮＶシグナル（性染色体は性別がＣＮＶシグナルに与える影響を排除するために削除された）に対して主成分分析（ＰＣＡ）次元削減処理を行い、累積割合（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）≧９５％を閾値として、前の６つの主成分（即ち、ＣＮＶ次元削減特徴１、ＣＮＶ次元削減特徴２、ＣＮＶ次元削減特徴３、ＣＮＶ次元削減特徴４、ＣＮＶ次元削減特徴５、ＣＮＶ次元削減特徴６）をＣＮＶ関連の特徴として選択し、ＣＮＶ次元削減特徴１、ＣＮＶ次元削減特徴２、ＣＮＶ次元削減特徴３、ＣＮＶ次元削減特徴４、ＣＮＶ次元削減特徴５、ＣＮＶ次元削減特徴６）をＣＮＶ特徴とし後続の計算を行い、各ＣＮＶ特徴に対応する主成分のスコア値は当該特徴の特徴スコア値となる。
７、ｃｆＤＮＡ断片長の検出
低深度全ゲノムシークエンシングデータは、それぞれ、遊離ＤＮＡ断片長が９０ｂｐ未満の区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が９０～１４０ｂｐの区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が１４１～２００ｂｐの区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が２００ｂｐより大きい区間のパーセンテージという実施例の４つの特徴の分析に用いることができる。
二、前記「ｃｆＤＮＡ検出試薬」の検出用の特徴は、具体的には、ｃｆＤＮＡ濃度であってもよい。ｃｆＤＮＡ濃度値はｌｏｇ２変換後の値を特徴スコア値とする。
三、前記「ＤＣＰ検出試薬」の検出用の特徴は、具体的には、実施例の１つの特徴、即ち血漿中のＤＣＰ含有量であってもよい。
四、前記「ＡＦＰ検出試薬」の検出用の特徴は、具体的には、実施例の１つの特徴、即ち血漿中のＡＦＰ含有量であってもよい。
五、前記「ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否かの検出試薬」の検出用の特徴は、具体的には、それぞれＨＢＶが変異に組み込まれている状況と、ＨＢＶとＴＥＲＴが変異に組み込まれているか否か（即ち２つの遺伝子突然変異特徴）との実施例の２つの特徴である。
以上では、突然変異部位の組み込み及び採点：遺伝子突然変異ごとに、突然変異ｒｅａｄｓサポート頻度に従って注釈点数を与え、その後、突然変異部位のスコア値を異なるＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ Ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）区間に累積する（即ち、特徴スコア値が得られる）。この区間は、４つの遺伝子（ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＴＥＲＴ及びＡＸＩＮ１）と１つのＴＰ５３ Ｒ２４９Ｓホットスポット突然変異位置領域を含む。計算式は以下のとおりである。
以上では、構造的変異結果の特徴抽出ステップは以下の通りである。
（１）各標本のＨＢＶ組み込み変異の特徴スコア値を検出し、検出した各組み込み変異に対して、ｒｅａｄｓサポート信頼度によってＡ、Ｂ、及びＣの３つの等級（組み込みｒｅａｄｓ数≧１０：Ａ等級、１０＞組み込みｒｅａｄｓ数＞６：Ｂ等級、残りはＣ等級、表７中の第３列を参照）に分け、対応するスコアはそれぞれ１、０．８、及び０．３点であり、その後合計すると、ＨＢＶ組み込み変異の特徴スコア値が得られる。
（２）各標本ＨＢＶとＴＥＲＴ組み込み変異の特徴のスコア値を検出し、ＴＥＲＴ組み込みが発生した場合、ＴＥＲＴ組み込み変異の特徴スコア値は１であり（ｒｅａｄｓサポート信頼度の格付けを考慮する必要はない）、ＴＥＲＴ組み込みが発生していない場合、ＴＥＲＴ組み込み変異の特徴スコア値は０である。
（１）各標本のＨＢＶ組み込み変異の特徴スコア値を検出し、検出した各組み込み変異に対して、ｒｅａｄｓサポート信頼度によってＡ、Ｂ、及びＣの３つの等級（組み込みｒｅａｄｓ数≧１０：Ａ等級、１０＞組み込みｒｅａｄｓ数＞６：Ｂ等級、残りはＣ等級、表７中の第３列を参照）に分け、対応するスコアはそれぞれ１、０．８、及び０．３点であり、その後合計すると、ＨＢＶ組み込み変異の特徴スコア値が得られる。
（２）各標本ＨＢＶとＴＥＲＴ組み込み変異の特徴のスコア値を検出し、ＴＥＲＴ組み込みが発生した場合、ＴＥＲＴ組み込み変異の特徴スコア値は１であり（ｒｅａｄｓサポート信頼度の格付けを考慮する必要はない）、ＴＥＲＴ組み込みが発生していない場合、ＴＥＲＴ組み込み変異の特徴スコア値は０である。
以上では、遊離ＤＮＡ長の関連特徴抽出のステップは以下の通りである。４つの区間（＜９０ｂｐ、９０～１４０ｂｐ、１４１～２００ｂｐ、及び＞２００ｂｐ）に占めるｃｆＤＮＡ断片長のパーセンテージを算出し、これらの特徴を予測変数とし、４つの区間に占めるｃｆＤＮＡ断片長のパーセンテージを特徴スコア値とする。
以上では、タンパク質マーカーの関連特徴抽出のステップは以下の通りである。
ＡＦＰの実測値を閾値（１３、２０、２００、４００）の昇順で５つの値の等級：０、５、８、２０、３０に分け、ＤＣＰの実測値を閾値（４０、６０）の昇順で３つの値の等級：０、２、５に分け、２つのタンパク質マーカーの特徴スコア値とする。
ＡＦＰの実測値を閾値（１３、２０、２００、４００）の昇順で５つの値の等級：０、５、８、２０、３０に分け、ＤＣＰの実測値を閾値（４０、６０）の昇順で３つの値の等級：０、２、５に分け、２つのタンパク質マーカーの特徴スコア値とする。
また、臨床及び実験の関連特徴によって２つの特徴を抽出してもよく、臨床的特徴は、患者の年齢、性別を含み、病例の表現型とも一定の相関性を持つ。このうち、年齢の特徴スコア値はサンプルの実年齢の数値であり、、性別が男性である場合、特徴スコア値は１、性別が女性である場合、特徴スコア値は０である。
特徴は、１３個の遺伝子突然変異特徴、２個のタンパク質マーカー、５個のｃｆＤＮＡ物理特徴、及び２個の血液サンプルの基本情報からなる２２個の特徴を含んでもよい。１３個の遺伝子突然変異特徴は、それぞれ、ＴＰ５３遺伝子非Ｒ２４９Ｓ突然変異、ＴＥＲＴ遺伝子突然変異、ＡＸＩＮ１遺伝子突然変異、ＣＴＮＮＢ１遺伝子突然変異、ＴＰ５３ Ｒ２４９Ｓホットスポット突然変異、ＣＮＶ次元削減特徴１、ＣＮＶ次元削減特徴２、ＣＮＶ次元削減特徴３、ＣＮＶ次元削減特徴４、ＣＮＶ次元削減特徴５、ＣＮＶ次元削減特徴６、ＨＢＶ組み込み変異、ＨＢＶとＴＥＲＴの変異組み込みの有無である。２個のタンパク質マーカーは、それぞれＡＦＰとＤＣＰである。５個のｃｆＤＮＡ物理特徴は、それぞれ、遊離ＤＮＡ断片長が９０ｂｐより小さい区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が９０～１４０ｂｐの区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が１４１～２００ｂｐの区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が２００ｂｐより大きい区間のパーセンテージ、及びｃｆＤＮＡ濃度である。２個の血液サンプルの基本情報はそれぞれ性別と年齢である。
がんの早期検査は、がんによる死亡を減少させる最も効果的な方法である。最近の研究では、ｃｆＤＮＡやタンパク質に基づく液体生検は、様々な組織型のがんの早期検査に有望であるが（Cohen JD, et al. (2018),同上）、ＨＣＣに対する良好な予測結果や、早期肝がんとハイリスク群を同定する際の効果は証明されていない。本研究において、発明者は液体生検測定法を開発して試験した。バイオマーカーの選択には、ＴＥＲＴプロモーター突然変異など、頻繁に変化し発がん機序が明確な遺伝子バイオマーカーや、ＤＣＰ（Lok AS, et al. (2010) Des-gamma-carboxy prothrombin and alpha-fetoprotein as biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Gastroenterology138(2):493-502.）など、診断価値が明確なタンパク質マーカーに焦点を当てる。本発明は、ＨＣＣと明確に関連する限られた数の候補バイオマーカーを含み、限られた数の腫瘍／正常症例において多数の候補バイオマーカーを検討した場合の過剰適合効果を回避するために、ＨＣＣと明確に関連する少数の候補バイオマーカーを組み入れる。後向き及び／又は前向き研究に用いる研究ツールを用いて、本発明で選択された遺伝子マーカーとタンパク質マーカーの特定の組み合わせを検証することにより、この特定の組み合わせが後向き及び前向き検証の両方において優れた効果を得ることを見出した。
したがって、一態様において、本発明は、遺伝子マーカー検出剤及びＤＣＰ検出剤を含むＡＦＰ陰性被検者の肝細胞がん早期スクリーニング用キットを提供する。
前記キットは、遺伝子マーカー及び／又はタンパク質マーカーの情報を前記被験者の肝細胞がんスクリーニングスコアに変換し、前記被検者の肝細胞がんスクリーニングスコアから前記被験者が肝がん患者であるか否かを予測するデータ処理システムをさらに含んでもよい。
上記のいずれかの遺伝子マーカー検出剤は、ＴＰ５３検出剤、ＣＴＮＮＢ１検出剤、ＡＸＩＮ１検出剤、ＴＥＲＴ検出剤から選ばれる１種又は複数種、好ましくは３種又は４種であってもよい。
上記のいずれかの遺伝子マーカー検出剤は、ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否かの検出試薬をさらに含んでもよい。
上記のいずれかのタンパク質マーカー検出剤は、ＡＦＰ検出剤及びＤＣＰ検出剤から選ばれる１種又は複数種を含んでもよい。
本発明のキットは、不特定の集団のＨＣＣ早期スクリーニング、又はＡＦＰ陰性被検者のような特定の集団のＨＣＣ早期スクリーニングに使用することができる。ＡＦＰは血液検査などの日常的な健康診断における一般的な検査指標であるため、被検者のＡＦＰの状態（陰性又は陽性）が既知である可能性が高い。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のキットは、ＡＦＰ陰性被検者のような特定の集団のＨＣＣ早期スクリーニングに用いられ、ここで、前記キットはＡＦＰ検出剤を含まない。同様に、いくつかの実施形態では、本発明のキットは、ＤＣＰ陰性被検者のような特定の集団のＨＣＣ早期スクリーニングに用いられ、ここで、前記キットはＤＣＰ検出剤を含まない。同様に、いくつかの実施形態では、本発明のキットは、ＡＦＰ及びＤＣＰ陰性被検者のような特定の集団のＨＣＣ早期スクリーニングに用いられ、ここで、前記キットはＡＦＰ検出剤及びＤＣＰ検出剤を含まない。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子マーカー検出剤及びタンパク質マーカー検出剤を含み、好ましくは、前記タンパク質マーカー検出剤がＤＣＰ検出剤を含む、ＡＦＰ陰性被検者の肝細胞がん早期スクリーニング用キットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子マーカー検出剤及びタンパク質マーカー検出剤を含み、好ましくは、前記タンパク質マーカー検出剤がＡＦＰ検出剤を含む、ＤＣＰ陰性被検者の肝細胞がん早期スクリーニング用キットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子マーカー検出剤を含む、ＡＦＰ及びＤＣＰ陰性被検者の肝細胞がん早期スクリーニング用キットを提供する。本発明に係る遺伝子マーカー検出剤は、突然変異タイプ及び突然変異ｒｅａｄｓを含む遺伝子マーカーの存在及び／又はタイプを検出することができる。
いくつかの実施形態では、本発明に係る遺伝子マーカー検出剤はＣＮＶ検出剤をさらに含む。ＣＮＶ検出剤は、通常、全ゲノムレベルのＣＮＶを検出するために使用されるが、いくつかの実施形態では、局所レベル、例えば遺伝子のＣＮＶを検出するためにも使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、グローバルＣＮＶレベルを検出するためのＣＮＶ検出剤を含む。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、局所ＣＮＶレベルを検出するためのＣＮＶ検出剤を含む。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、ＴＥＲＴ遺伝子のＣＮＶレベルを検出するためのＣＮＶ検出剤を含む。ＣＮＶ検出剤の使用は、ＨＣＣスクリーニングの感度及び特異性をさらに向上させることができる。いくつかの実施形態では、ＣＮＶ検出結果は、ＣＮＶ次元削減特徴１、ＣＮＶ次元削減特徴２、ＣＮＶ次元削減特徴３、ＣＮＶ次元削減特徴４、ＣＮＶ次元削減特徴５、及び／又はＣＮＶ次元削減特徴６に変換されてもよい。
本明細書で使用される場合、「遺伝子マーカー検出剤」という用語は、遺伝子マーカーを検出するための検出剤であり、当業者に周知されたものと本明細書に記載のものとを含む。このような場合、「ＴＰ５３検出剤」、「ＣＴＮＮＢ１検出剤」、「ＡＸＩＮ１検出剤」及び「ＴＥＲＴ検出剤」という用語は、それぞれにより示される遺伝子マーカーを検出するための検出剤であり、当業者に周知のものと本明細書に記載のものとを含む。ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＡＸＩＮ１及びＴＥＲＴは、ＴＥＲＴプロモーター突然変異のような、当業者に周知の遺伝子マーカーである。いくつかの実施形態では、ＴＰ５３の全長が検出される。いくつかの実施形態では、ＴＰ５３の１つ又は複数のエクソンが検出される。本発明のいくつかの態様は、ＴＰ５３の１種又は複数種のエクソンだけを検出するのではなく、ＴＰ５３の全長を検出することを特徴とする。
当業者にとって自明なように、本発明に記載の遺伝子は、遺伝子マーカーとして機能する場合、必ずしも特定の部位に限定されるのではなく、シーケンシングにより得られた配列の全部又は一部とそれに対応する野生型配列との間の少なくとも１つ又は複数のヌクレオチドの相違を利用するものである。ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＡＸＩＮ１及びＴＥＲＴ遺伝子は、遺伝子マーカーとして機能する場合、それに対応する野生型配列との間に、全長にわたって少なくとも１つ又は複数のヌクレオチドの相違が存在していてもよい。ＴＰ５３遺伝子は、遺伝子マーカーとした場合、その特定のホットスポット領域（例えばＲ２４９Ｓ）とそれに対応する野生型配列との間に少なくとも１つ又は複数のヌクレオチドの相違が存在してもよい。ＴＥＲＴ遺伝子は、遺伝子マーカーとした場合、その特定のホットスポット領域（例えば、ｃｈｒ５：１２９５２２８Ｃ＞Ｔ又はｃｈｒ５：１２９５２５０Ｃ＞Ｔ）とそれに対応する野生型配列との間に少なくとも１つ又は複数のヌクレオチドの相違が存在していてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明に係る遺伝子マーカー検出剤はＨＢＶ組み込み検出剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、「ＨＢＶ組み込み検出剤」という用語は、ＨＢＶがゲノムに組み込まれているか否かの検出試薬である。いくつかの実施形態では、ＨＢＶのゲノムへの組み込みは、例えばＴＥＲＴの上流１．５ｋｂ内のような、ゲノム中のＴＥＲＴ近傍へのＨＢＶの組み込み、及びゲノム中の他の場所へのＨＢＶの組み込みを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、被検者の遺伝子マーカーは、被検者のｃｆＤＮＡから検出されるものである。一般には、本明細書に記載の遺伝子マーカー検出剤を用いて遺伝子マーカーを検出する際には、使用過程又は検出過程は、ｃｆＤＮＡの抽出及び検出を含むことから、例えばｃｆＤＮＡ濃度及び／又はｃｆＤＮＡ中の異なる挿入断片長のｃｆＤＮＡ含有量に占めるパーセンテージ及び／又はｃｆＤＮＡ長検出剤など、ｃｆＤＮＡに関する情報を把握する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の「遺伝子マーカー検出剤」及びその下位概念は、同様にｃｆＤＮＡ検出剤として機能してもよく、このため、「ｃｆＤＮＡ検出剤」と交換的に使用することができる。別の実施形態では、本発明のキットはｃｆＤＮＡ検出剤をさらに含む。
本明細書で使用される場合、「タンパク質マーカー検出剤」という用語は、タンパク質マーカーを検出するための検出剤であり、当業者に周知のものと本明細書に記載のものとを含む。このような場合、「ＡＦＰ検出剤」及び「ＤＣＰ検出剤」という用語は、それぞれにより示されるタンパク質マーカーを検出するための検出剤であり、当業者に周知のものと本明細書に記載のものとを含む。ＡＦＰ及びＤＣＰは、当業者に周知のタンパク質マーカーである。
いくつかの実施形態では、被検者のタンパク質マーカーは、被検者の血液、又は血清又は血漿のような血液成分から検出されるものである。いくつかの実施形態では、キットは採血器具をさらに含む。
本発明のキットは、データ処理システムを含むか、又はデータ処理システムと共に使用してもよく、例えば、データ処理システムはコンピュータに含まれてもよい。前記データ処理システムは、本発明に係る遺伝子マーカー検出剤及び／又はタンパク質マーカー検出剤の検出結果を処理するためのものである。いくつかの実施形態では、データ処理システムは、前記遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーの検出結果を用いて肝細胞がんスクリーニングスコアを算出する。いくつかの実施形態では、データ処理システムは、肝細胞がんスクリーニングスコアを閾値と比較する。いくつかの実施形態では、データ処理システムは、好ましくは肝細胞がんスクリーニングスコアを閾値と比較することによって、ＨＣＣを推定及び／又は検証及び／又は予測する。
本発明は、このＨＣＣスクリーニングを用いて、早期ＨＣＣ個体を識別し、肝硬変を含む慢性肝疾患に罹患している非ＨＣＣ個体と区別することが可能であることを見出した。この測定法は、肝結節及び／又は血清ＡＦＰ上昇の個体を超音波で検出するＨＣＣ診断において、８５％の感度と９３％の特異性を示している。さらに重要なことに、ＡＦＰ／ＵＳ陰性検証セット中でも性能は維持されており、感度及び特異性はそれぞれ、１００％及び９４％である。現在の感度は、限られた数のＨＣＣ症例に基づくものである。追加のＨＣＣ症例が識別された場合、これは全ての個体の長期フォローアップ又は動的ＣＴ／ＭＲＩ検査によって変化する可能性がある。このような場合、フォローアップ時間に応じて感度と特異性を決定するには、前向きでかつ大規模な臨床試験が必要とされる。しかしながら、検証セットの現在の陽性予測値（ＰＰＶ）である１７％は、従来ＡＦＰレベル単独でのスクリーニングで得られたものよりも著しく高い（Chun S, Rhie SY, Ki CS, Kim JE, & Park HD (2015) Evaluation of alpha-fetoprotein as a screening marker for hepatocellular carcinoma in hepatitis prevalent areas. Annals of hepatology 14(6):882-888.）。
したがって、別の態様において、本発明は、
（１）被検者の遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを検出するステップと、
（２）前記遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーの検出結果を用いて肝細胞がんスクリーニングスコアを算出し、閾値と比較するステップとを含む、肝細胞がん早期スクリーニング方法を提供する。
（１）被検者の遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを検出するステップと、
（２）前記遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーの検出結果を用いて肝細胞がんスクリーニングスコアを算出し、閾値と比較するステップとを含む、肝細胞がん早期スクリーニング方法を提供する。
１回目の試験で陽性となった症例に対して、２回目のＨＣＣスクリーニングを行えば、ＰＰＶはさらに改善する。高ＰＰＶは、非ＨＣＣ個体の不必要な不安やフォローアップ検査を減らすことができることから、通常の臨床応用に非常に役立つ。
したがって、別の態様において、本発明は、
（１）被検者の遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを検出するステップと、
（２）前記遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーの検出結果を用いて肝細胞がんスクリーニングスコアを算出し、閾値と比較するステップと、
（３）肝細胞がんスクリーニングスコアが閾値よりも高い場合、一定期間後に前記被検者に対して（１）及び（２）ステップを１回又は複数回繰り返すステップとを含む、肝細胞がん早期スクリーニング方法を提供する。
（１）被検者の遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを検出するステップと、
（２）前記遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーの検出結果を用いて肝細胞がんスクリーニングスコアを算出し、閾値と比較するステップと、
（３）肝細胞がんスクリーニングスコアが閾値よりも高い場合、一定期間後に前記被検者に対して（１）及び（２）ステップを１回又は複数回繰り返すステップとを含む、肝細胞がん早期スクリーニング方法を提供する。
１つの実施形態では、被検者の遺伝子マーカーは、被検者のｃｆＤＮＡから検出されるものである。即ち、本発明の方法は、被検者のｃｆＤＮＡを抽出することを含む。
１つの実施形態では、被検者のタンパク質マーカーは、被検者の血液から検出されるものである。即ち、本方法は、被検者の血液、好ましくは血清又は血漿を採取することを含む。
本明細書で使用される場合、「一定期間」という用語は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年とすることができ、これに限定されない。
いくつかの実施形態では、算出された肝細胞がんスクリーニングスコアと比較する閾値は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１．０である。好ましい実施形態では、閾値は０．４である。好ましい実施形態では、閾値は０．５である。
さらに別の態様において、本発明は、肝細胞がん早期スクリーニングにおける遺伝子マーカー検出剤及びタンパク質マーカー検出剤の使用を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、肝細胞がん早期スクリーニング用キットの製造における遺伝子マーカー検出剤及びタンパク質マーカー検出剤の使用を提供する。
当業者が理解できるように、本明細書でキットを説明する際に説明される特徴、パラメータ、及び効果などの全ての限定が、本発明の方法又は使用に関する他の任意の態様と適切に組み合わされ得る。
腫瘍の大きさは診断時に重要な臨床パラメーターであり、ＨＣＣ患者の生存に影響する。タンパク質やＲＮＡに基づくバイオマーカーとは異なり、腫瘍細胞は、たいていの場合、突然変異体ＤＮＡのコピーを１コピーしか含んでいない。ｃｆＤＮＡに基づく早期検査スクリーニングの基本的な問題は、早期腫瘍が循環的に検出するのに十分な突然変異ＤＮＡのコピーを放出するか否かである。本研究では、ＨＣＣスクリーニングにより識別された全てのＨＣＣのうち、８５％と６８％の症例は、それぞれ＜５ｃｍと＜３ｃｍである。＜５ｃｍのＨＣＣ腫瘍は早期段階であり、治療効果のある手術に適している。腫瘍＜３ｃｍ未満の患者は更に良い結果が得られ、それによって、ＨＣＣの発病率と死亡率の低下におけるＨＣＣスクリーニングの価値が反映される。検証セットでは、本発明はＡＦＰ／ＵＳ陰性集団から２～３ｃｍの大きさの４例のＨＣＣを識別した。これらの結果から明らかに、ＨＣＣスクリーニングの感度は早期ＨＣＣ検査において非常に将来性が期待できる。
理想的な腫瘍スクリーニング方法は、高感度と高特異性が要求され、また臨床実践において実施しやすいものでなければならない。このＨＣＣスクリーニング測定法は、コード領域中の突然変異と未知のブレークポイントを有する転座／ＨＢＶ組み込みを検出するものであり、コストが１５０ドル未満である。さらに、この液体生検測定法は、処理の集中化と標準化が可能であり、地域の病院／診療所の専門知識や設備への要求が最小限に抑えられている。一般的には、この方法は、ハイリスク集団のＨＣＣスクリーニング用の常の試験として非常に好適である。
本発明の研究により提供される証拠から明らかなように、ＨＣＣ患者を同定する上で、ハイリスク集団において、ｃｆＤＮＡ突然変異及びタンパク質マーカーに基づくスクリーニングが有効である。このスクリーニングは、非侵襲的であり、早期及び進行期の腫瘍を検出することができる。さらに重要なことに、ドライバー遺伝子における体細胞の突然変異がほとんどのがんの発展において一般的であるため、単一チューブの血液から他の腫瘍タイプ又は複数の腫瘍タイプを早期にスクリーニングするために、このストラテジーを修正することができる。
本発明のキットは、追加の治療剤をさらに含んでもよい。本発明の方法は、追加の治療剤を投与するステップをさらに含んでもよい。１つの実施形態では、前記追加の治療剤は、本分野で知られているがん（例えば肝細胞がん）の治療剤である。
本出願において一連の挙げられた数値が現れる全ての箇所において、挙げられた数値のいずれかが、数値範囲の上限又は下限であってもよい。また、本発明は、そのような全ての数値範囲、即ち、数値の上限値と下限値との組み合わせを有する範囲を包含し、上限値と下限値のそれぞれの数値は、本発明に記載の任意の数値としてもよい。本発明による範囲は、その範囲内の全ての値を含むものと理解すべきである。例えば、１～１０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の全ての値を含み、場合によっては分数の値を含むものと理解する。「最大（ｕｐ ｔｏ）」と表現される値（例えば、最大５）の範囲は、０、１、２、３、４、５などの範囲の上限を含む全ての値と理解し、場合によっては分数値を含むものとする。最大１週間又は１週間内は、０．５日、１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日を含むものと理解すべきである。同様に、「少なくとも」で限定された範囲は、提供された低い値と高い値を全て含むものと理解すべきである。
特に明記されていない限り、全てのパーセンテージの形式は重量／重量である。
本発明で使用される場合、「約」は、平均値の３つの標準偏差又は特定範囲内の標準公差の範囲に含まれるものと理解すべきである。いくつかの実施形態では、「約」は０．５を超えない変動として理解すべきである。「約」は、その後に挙げられた全ての値を修飾する。例えば、「約１、２、３」は「約１」「約２」「約３」を意味する。
冠詞「一（ａ）」及び「１個（ａｎ）」は、本発明では、この冠詞の１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）の文法的客体を指す。一例として、「１つの要素」とは、１つ又は複数の要素を指す。
「含む」という用語は、本発明では、「含むが、限定されない」という語句を意味し、この語句と交換的に使用されてもよい。
文脈によって特に明示的に示されない限り、「又は」という用語は、本発明では、「及び／又は」という用語を包含的に意味し、「及び／又は」という用語と交換的に使用されてもよい。
「例えば」という用語は、本発明では、「例えば、限定されないが」という語句を指し、それと交換的に使用されてもよい。
当業者が理解できるように、以上の様々な実施形態に記載の技術的特徴は、単独で又は組み合わせて、本発明の様々な態様の技術案と組み合わせて使用されてもよい。
本発明のいくつかの実施形態は、以下の非限定的な実施例にて説明される。
早期肝がんスクリーニングマーカーの多くはタンパク質類や遺伝子メチル化情報である。本発明は、血清タンパク質マーカーとｃｆＤＮＡ改変の両方の検出に基づく、新しい肝細胞がんスクリーニング（ＨＣＣスクリーニング）方法を報告し、慢性ＨＢＶ感染を有する多拠点コミュニティ集団の早期ＨＣＣ検査に応用する場合の有用性を確認した。本発明者らは、血漿中のｃｆＤＮＡの遺伝子変異情報が早期ＨＣＣ予測に有用であることを、大量の実験により初めて確認した。本発明者らは、肝がん予測モデルを用いて被験者をスコアリングし、そのスコア値により被験者が肝がん患者であるか否かを予測することにより、本発明の遺伝子マーカーとタンパク質マーカーの組み合わせによりＨＣＣ早期スクリーニングを効果的に行えることを検証した。このことから、ｃｆＤＮＡ検出による肝がんの早期スクリーニング、病状追跡、治療効果評価、予後予測などは重要な臨床意義を持つことが分かった。
以下の実施例は、本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明を限定するものではない。
以下の実施例における実験方法は、特に断らない限り、従来の方法である。
以下の実施例に用いる試験材料は、特に断らない限り、通常の生化学試薬販売店から購入したものである。
以下の実施例における定量試験は、いずれも３回の反復実験を設定し、結果として平均値と取る。
下記の実施例では、各肝がん患者、各肝がんハイリスク者、及び健常ボランティア全員が本研究の内容についてインフォームドコンセントをしている。
ＭａｇＭＡＸTMＣｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＫｉｔはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社の製品である。ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ ＰｒｅｐキットはＫＡＰＡ社の製品である。ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ＸＴ標的キャプチャキットはＡｇｉｌｅｎｔ社の製品である。
以下の実施例に用いる試験材料は、特に断らない限り、通常の生化学試薬販売店から購入したものである。
以下の実施例における定量試験は、いずれも３回の反復実験を設定し、結果として平均値と取る。
下記の実施例では、各肝がん患者、各肝がんハイリスク者、及び健常ボランティア全員が本研究の内容についてインフォームドコンセントをしている。
ＭａｇＭＡＸTMＣｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＫｉｔはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社の製品である。ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ ＰｒｅｐキットはＫＡＰＡ社の製品である。ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ＸＴ標的キャプチャキットはＡｇｉｌｅｎｔ社の製品である。
下記の実施例では、一部の肝がん患者、肝がんハイリスク者、及び健常ボランティアの基本情報の詳細は表１に示される。
倫理声明
コミュニティ集団が行った早期ＨＣＣスクリーニングプロジェクトに基づき、発明者は２０１７年に肝がんのハイリスク集団に対してコミュニティに基づくコホート研究（ＣＣＯＰ－ＬＣコホート；中国臨床登録、ＣｈｉＣＴＲ－ＥＯＣ－１７０１２８３５）を立ち上げた。この研究案（ＮＣＣ２０１７０９０１１）は、国家がんセンター／国家腫瘍臨床医学研究センター／中国医学科学院腫瘍病院の機構審査委員会によって承認された。
コミュニティ集団が行った早期ＨＣＣスクリーニングプロジェクトに基づき、発明者は２０１７年に肝がんのハイリスク集団に対してコミュニティに基づくコホート研究（ＣＣＯＰ－ＬＣコホート；中国臨床登録、ＣｈｉＣＴＲ－ＥＯＣ－１７０１２８３５）を立ち上げた。この研究案（ＮＣＣ２０１７０９０１１）は、国家がんセンター／国家腫瘍臨床医学研究センター／中国医学科学院腫瘍病院の機構審査委員会によって承認された。
コミュニティグループにおける早期ＨＣＣスクリーニングプロジェクトの概要
早期ＨＣＣスクリーニングは、衛生部疾病予防制御センターの中国がん早期検査・早期治療専門家委員会が発表した「がん早期診断・早期治療技術案」に基づいて行われる（Shia YC, Beever JE,Lewin HA,& Schook LB (1991) Restriction fragment length polymorphisms at the porcine t complex polypeptide 1 (TCP1) locus. Anim Genet 22(2):194.）。全てのスクリーニングセンターに、集団に基づくがん登録所と人口動態統計部門が設置されている（Chen W, et al. (2018) Cancer incidence and mortality in China, 2014. Chinese journal of cancer research = Chung-kuo yen cheng yen chiu30(1):1-12.）。簡単に言えば、ＨＢｓＡｇ陽性の３５～６９歳の「健常」個体は、早期ＨＣＣスクリーニングに参加してもらう。全ての参加者は、血清ＡＦＰ濃度測定と超音波検査（ＵＳ；Ａｌｏｋａ ＰｒｏＳｏｕｎｄ ＳＳＤ－４０００；中国上海）、及びその他の標準的な生化学検査（表２）を受けた。血清ＡＦＰレベルと肝結節検査に基づいて、個体をＡＦＰ／ＵＳ陽性、擬似又は陰性とした。「ＡＦＰ／ＵＳ陽性」個体は以下のいずれかを有する。１）超音波で測定した結節を考慮せず、血清ＡＦＰレベル＞４００ｎｇ／ｍＬである。２）血清ＡＦＰ濃度を考慮せず、超音波で測定した結節は≧２ｃｍである。３）超音波で測定した結節は≧１ｃｍであり、血清ＡＦＰは≧２００ｎｇ／ｍｌである。「ＡＦＰ／ＵＳ擬似」個体は、以下のいずれかを有する。１）超音波で測定した肝結節を考慮せず、血清ＡＦＰレベル≧２０ｎｇ／ｍｌである。２）超音波で測定した結節は≧１ｃｍである。「ＡＦＰ／ＵＳ陰性」個体は、血清ＡＦＰレベルが＜２０ｎｇ／ｍＬであり、超音波検査で肝臓結節が検出されていないものと定義される。ＡＦＰ／ＵＳ陽性の個体は、上級病院（中国三級病院）に紹介され、動的ＣＴや動的ＭＲＩで肝がん患者と確診された場合、臨床実践指針に基づく関連治療を受ける（図１）（Omata M,et al. (2017) Asia-Pacific clinical practice guidelines on the management of hepatocellular carcinoma：a 2017 update.Hepatol Int 11(4):317-370.）。確診されなかった個体は、２ヶ月以内に戻って動的ＣＴ／ＭＲＩ検査を受けるようになる。ＡＦＰ／ＵＳ擬似個体は、２～３ヶ月以内に２回目の血清ＡＦＰ定量検査と超音波検査を受けることが推奨されている。
早期ＨＣＣスクリーニングは、衛生部疾病予防制御センターの中国がん早期検査・早期治療専門家委員会が発表した「がん早期診断・早期治療技術案」に基づいて行われる（Shia YC, Beever JE,Lewin HA,& Schook LB (1991) Restriction fragment length polymorphisms at the porcine t complex polypeptide 1 (TCP1) locus. Anim Genet 22(2):194.）。全てのスクリーニングセンターに、集団に基づくがん登録所と人口動態統計部門が設置されている（Chen W, et al. (2018) Cancer incidence and mortality in China, 2014. Chinese journal of cancer research = Chung-kuo yen cheng yen chiu30(1):1-12.）。簡単に言えば、ＨＢｓＡｇ陽性の３５～６９歳の「健常」個体は、早期ＨＣＣスクリーニングに参加してもらう。全ての参加者は、血清ＡＦＰ濃度測定と超音波検査（ＵＳ；Ａｌｏｋａ ＰｒｏＳｏｕｎｄ ＳＳＤ－４０００；中国上海）、及びその他の標準的な生化学検査（表２）を受けた。血清ＡＦＰレベルと肝結節検査に基づいて、個体をＡＦＰ／ＵＳ陽性、擬似又は陰性とした。「ＡＦＰ／ＵＳ陽性」個体は以下のいずれかを有する。１）超音波で測定した結節を考慮せず、血清ＡＦＰレベル＞４００ｎｇ／ｍＬである。２）血清ＡＦＰ濃度を考慮せず、超音波で測定した結節は≧２ｃｍである。３）超音波で測定した結節は≧１ｃｍであり、血清ＡＦＰは≧２００ｎｇ／ｍｌである。「ＡＦＰ／ＵＳ擬似」個体は、以下のいずれかを有する。１）超音波で測定した肝結節を考慮せず、血清ＡＦＰレベル≧２０ｎｇ／ｍｌである。２）超音波で測定した結節は≧１ｃｍである。「ＡＦＰ／ＵＳ陰性」個体は、血清ＡＦＰレベルが＜２０ｎｇ／ｍＬであり、超音波検査で肝臓結節が検出されていないものと定義される。ＡＦＰ／ＵＳ陽性の個体は、上級病院（中国三級病院）に紹介され、動的ＣＴや動的ＭＲＩで肝がん患者と確診された場合、臨床実践指針に基づく関連治療を受ける（図１）（Omata M,et al. (2017) Asia-Pacific clinical practice guidelines on the management of hepatocellular carcinoma：a 2017 update.Hepatol Int 11(4):317-370.）。確診されなかった個体は、２ヶ月以内に戻って動的ＣＴ／ＭＲＩ検査を受けるようになる。ＡＦＰ／ＵＳ擬似個体は、２～３ヶ月以内に２回目の血清ＡＦＰ定量検査と超音波検査を受けることが推奨されている。
参加者及び研究設計
現在の研究の参加者は、中国の江蘇省と安徽省の４つのスクリーニングセンターで個体を評価するＣＣＯＰ－ＬＣコホートから得られた（図１）。ＡＦＰ／ＵＳスクリーニング期間中（ベースラインを考慮して、２０１７年１０月７日～２０１８年１月３１日の間に実施）に、発明者は末梢血（ＥＤＴＡを塗布したチューブ内、５ｍＬ）を採取し、採取後２時間内に４０００ｇを１０分間遠心分離して、血漿・血球を分離した。全ての標本は－８０℃で保管した。ほとんどの場合、タンパク質マーカーの測定には０．５ｍＬの血漿が使用され、ｃｆＤＮＡ抽出には２ｍＬの血漿が使用される。
現在の研究の参加者は、中国の江蘇省と安徽省の４つのスクリーニングセンターで個体を評価するＣＣＯＰ－ＬＣコホートから得られた（図１）。ＡＦＰ／ＵＳスクリーニング期間中（ベースラインを考慮して、２０１７年１０月７日～２０１８年１月３１日の間に実施）に、発明者は末梢血（ＥＤＴＡを塗布したチューブ内、５ｍＬ）を採取し、採取後２時間内に４０００ｇを１０分間遠心分離して、血漿・血球を分離した。全ての標本は－８０℃で保管した。ほとんどの場合、タンパク質マーカーの測定には０．５ｍＬの血漿が使用され、ｃｆＤＮＡ抽出には２ｍＬの血漿が使用される。
ＨＣＣスクリーニング測定法において、さらに１７６個のＡＦＰ／ＵＳ陽性／擬似症例を分析した。本研究では、フォローアップ検査での診断結果に従って、信頼度の高い診断を受けた参加者を訓練セットとして選択した。本発明者の発見を検証するために、本発明は、ＨＣＣスクリーニング測定法においてＡＦＰ／ＵＳ陽性／擬似者と年齢が類似しているＡＦＰ／ＵＳ陰性個体から３３１人の参加者をサンプリングした。２０１８年５月２０日～７月１７日（ベースライン採血から６～８ヶ月後）まで、動的ＣＴ／ＭＲＩ、ＡＦＰ／超音波検査又は電話インタビューにより３３１人の個体をフォローアップした。ＣＴ／ＭＲＩ画像は北京中国医学科学院国家がんセンターの２名の放射線科医師が独立して評価した。この間、本発明は、ベースラインがＡＦＰ／ＵＳ陰性であり、ＨＣＣスクリーニング試験が実施されていない個体に対して、追加のＡＦＰ／ＵＳ試験を提供した。彼らの中には追加のＡＦＰ／ＵＳ検査を選択していないものもあり、２０１８年６月３０日までの肝がんの結果（ＩＣＤ－１０コードＣ２２）は、スクリーニングセンターの集団に基づくがん登録所から得られた（図１）。３６１７人のＡＦＰ／ＵＳ陰性個体のうち、１６１２人（４４．６％）の参加者は２０１８年５月２０日～７月１７日までの期間、即ちベースラインスクリーニングの６～８ヶ月後にフォローアップできた。このうち、８７人の参加者は動的ＣＴ／ＭＲＩ検査を受け、１１２０人はＡＦＰ／ＵＳを受け、６８人は電話インタビューを受けた。３３７人の参加者の肝がんの結果は、現地の集団に基づくがん登録所から得られた（図２）。他の２００５人の参加者のＨＣＣ状態は、２０１８年６月３０日まで得られなかった（図２）。
年間健康診断を行い、いかなるＨＢＶ感染も報告されていない集団の中から７０人の健常対照者を得た。献血したところ、全員ＨＢｓＡｇ陰性が確認された。
血清ＤＣＰ濃度の測定
製造者の取扱書（Abbott Laboratories；Chicago,IL,USA）によると、市販キットを使用してＡｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ｉ２０００ＳＲ化学発光免疫分析装置（ＣＬＩＡ）で血清ＤＣＰレベルを測定した。
製造者の取扱書（Abbott Laboratories；Chicago,IL,USA）によると、市販キットを使用してＡｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ｉ２０００ＳＲ化学発光免疫分析装置（ＣＬＩＡ）で血清ＤＣＰレベルを測定した。
ｃｆＤＮＡ改変のスペクトル解析
本発明者は試験を設計してｃｆＤＮＡのシーケンシングを行い、１）ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＡＸＩＮ１のコード領域とＴＥＲＴのプロモーター領域（表３）；２）ＨＢＶ組み込みに対して、スペクトル解析を行った。簡単に言えば、まず、ｃｆＤＮＡ断片をランダムなＤＮＡバーコードを有するアダプタ（ａｄａｐｔｏｒ）に接続する（図３）。接続された構築物を１０回の反応サイクルで増幅して、各元のｃｆＤＮＡ断片を識別する固有のＤＮＡバーコードを有する数百の冗長構築物を含む全ゲノムライブラリーを生成する。増幅されたライブラリーは、５～１０回の独立したシークエンシング解析を行うのに十分である。標的領域は、標的特異的プライマー（ＴＳプライマー１）と接合体配列を一致させるプライマー（Perera BP & Kim J (2016) Next-generation sequencing-based 5' rapid amplification of cDNA ends for alternative promoters. Analytical biochemistry 494:82-84；Zheng Z, et al. (2014) Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature medicine 20(12):1479-1484.）（図３）を用いたＰＣＲの９サイクル中にＤＮＡバーコードとともに増幅される。アダプタと標的領域を一致させる一対のネストプライマー（ＴＳプライマー２）を用いて、１５サイクルのＰＣＲを再度行い、標的領域をさらに濃縮し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプタを追加する（図３）。ＰＣＲに基づくこの測定法では、有効な濃縮が観察され、＞８０％のｒｅａｄｓが＜１０Ｋｂの小標的領域にマッピングされた。該測定法により、本発明は１００,０００回を超える標的領域、３Ｇｂシークエンシングデータをカバーすることができ、元のｃｆＤＮＡ ５,０００コピーの２０×冗長シークエンシングが可能となる。ＤＮＡバーコードが元のｃｆＤＮＡ分子に接続されている場合、元のｃｆＤＮＡ分子からの冗長ｒｅａｄｓを追跡して、ＰＣＲ増幅及び並列変異シーケンシングに固有の呼び出しエラー（ｃａｌｌｉｎｇ ｅｒｒｏｒ）を最小化することができる（Kinde I, Wu J, Papadopoulos N, Kinzler KW, & Vogelstein B (2011) Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108(23):9530-9535；Chaudhuri AA, et al.(2017) Early Detection of Molecular Residual Disease in Localized Lung Cancer by Circulating Tumor DNA Profiling. Cancer discovery 7(12):1394-1403.）。本発明は、今回の測定法で検出された１１個の突然変異をデジタルＰＣＲで調べて、全ての突然変異を０．０３～０．１６％の突然変異スコアで検証した。
本発明者は試験を設計してｃｆＤＮＡのシーケンシングを行い、１）ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＡＸＩＮ１のコード領域とＴＥＲＴのプロモーター領域（表３）；２）ＨＢＶ組み込みに対して、スペクトル解析を行った。簡単に言えば、まず、ｃｆＤＮＡ断片をランダムなＤＮＡバーコードを有するアダプタ（ａｄａｐｔｏｒ）に接続する（図３）。接続された構築物を１０回の反応サイクルで増幅して、各元のｃｆＤＮＡ断片を識別する固有のＤＮＡバーコードを有する数百の冗長構築物を含む全ゲノムライブラリーを生成する。増幅されたライブラリーは、５～１０回の独立したシークエンシング解析を行うのに十分である。標的領域は、標的特異的プライマー（ＴＳプライマー１）と接合体配列を一致させるプライマー（Perera BP & Kim J (2016) Next-generation sequencing-based 5' rapid amplification of cDNA ends for alternative promoters. Analytical biochemistry 494:82-84；Zheng Z, et al. (2014) Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature medicine 20(12):1479-1484.）（図３）を用いたＰＣＲの９サイクル中にＤＮＡバーコードとともに増幅される。アダプタと標的領域を一致させる一対のネストプライマー（ＴＳプライマー２）を用いて、１５サイクルのＰＣＲを再度行い、標的領域をさらに濃縮し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプタを追加する（図３）。ＰＣＲに基づくこの測定法では、有効な濃縮が観察され、＞８０％のｒｅａｄｓが＜１０Ｋｂの小標的領域にマッピングされた。該測定法により、本発明は１００,０００回を超える標的領域、３Ｇｂシークエンシングデータをカバーすることができ、元のｃｆＤＮＡ ５,０００コピーの２０×冗長シークエンシングが可能となる。ＤＮＡバーコードが元のｃｆＤＮＡ分子に接続されている場合、元のｃｆＤＮＡ分子からの冗長ｒｅａｄｓを追跡して、ＰＣＲ増幅及び並列変異シーケンシングに固有の呼び出しエラー（ｃａｌｌｉｎｇ ｅｒｒｏｒ）を最小化することができる（Kinde I, Wu J, Papadopoulos N, Kinzler KW, & Vogelstein B (2011) Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108(23):9530-9535；Chaudhuri AA, et al.(2017) Early Detection of Molecular Residual Disease in Localized Lung Cancer by Circulating Tumor DNA Profiling. Cancer discovery 7(12):1394-1403.）。本発明は、今回の測定法で検出された１１個の突然変異をデジタルＰＣＲで調べて、全ての突然変異を０．０３～０．１６％の突然変異スコアで検証した。
データ処理及び変異検出
シーケンシングｒｅａｄｓは、処理によってタグを抽出し、シーケンスアダプタを除去する。次に、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（ｖ０．３６）を使用して、残ったアダプタと低質量領域を除去する。デフォルトパラメータを有する‘bwa（v0.7.10）mem’（Li H & Durbin R (2010) Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics26(5):589-595.）を使用して、清浄なｒｅａｄｓをｈｇ１９及びＨＢＶゲノムにマッピングする。samtools mpileup（Li H, et al. (2009) The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 25(16):2078-2079.）を用いて、関心のある標的領域においてＳＮＰとＩＮＤＥＬからなる候補体突然変異を同定する。正確性を確保するために、同じタグ及び開始座標と終了座標を持つｒｅａｄｓは、一意識別子（Ｕｎｉｑｕｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ファミリー（ＵＩＤファミリー）にグループ化される。少なくとも２つのｒｅａｄｓを含有し、その少なくとも８０％のｒｅａｄｓが同じタイプであるＵＩＤファミリーは、有効一意識別子（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｕｎｉｑｕｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ファミリー（ＥＵＩＤファミリー）として定義される。各突然変異の頻度は、代替ＥＵＩＤファミリーの数を代替と参照の合計で除算することによって算出される。ＩＧＶにおいてさらに手動で突然変異を検査する。Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｖａｒｉａｎｔ Ｅｆｆｅｃｔ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（ＶＥＰ）で候補バリアントを注釈し（Wang J, et al. (2011) CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat Methods 8(8):652-654）。Ｃｒｅｓｔを用いてＨＢＶ組み合わせを同定し（McLaren W, et al. (2016) The Ensembl Variant Effect Predictor. Genome biology 17(1):122.）、また、少なくとも４つのソフトトランケーションシーケンスのサポート（ｓｏｆｔ－ｃｌｉｐ ｒｅａｄｓ ｓｕｐｐｏｒｔｓ）を必要とする。
シーケンシングｒｅａｄｓは、処理によってタグを抽出し、シーケンスアダプタを除去する。次に、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（ｖ０．３６）を使用して、残ったアダプタと低質量領域を除去する。デフォルトパラメータを有する‘bwa（v0.7.10）mem’（Li H & Durbin R (2010) Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics26(5):589-595.）を使用して、清浄なｒｅａｄｓをｈｇ１９及びＨＢＶゲノムにマッピングする。samtools mpileup（Li H, et al. (2009) The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 25(16):2078-2079.）を用いて、関心のある標的領域においてＳＮＰとＩＮＤＥＬからなる候補体突然変異を同定する。正確性を確保するために、同じタグ及び開始座標と終了座標を持つｒｅａｄｓは、一意識別子（Ｕｎｉｑｕｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ファミリー（ＵＩＤファミリー）にグループ化される。少なくとも２つのｒｅａｄｓを含有し、その少なくとも８０％のｒｅａｄｓが同じタイプであるＵＩＤファミリーは、有効一意識別子（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｕｎｉｑｕｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ファミリー（ＥＵＩＤファミリー）として定義される。各突然変異の頻度は、代替ＥＵＩＤファミリーの数を代替と参照の合計で除算することによって算出される。ＩＧＶにおいてさらに手動で突然変異を検査する。Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｖａｒｉａｎｔ Ｅｆｆｅｃｔ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（ＶＥＰ）で候補バリアントを注釈し（Wang J, et al. (2011) CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat Methods 8(8):652-654）。Ｃｒｅｓｔを用いてＨＢＶ組み合わせを同定し（McLaren W, et al. (2016) The Ensembl Variant Effect Predictor. Genome biology 17(1):122.）、また、少なくとも４つのソフトトランケーションシーケンスのサポート（ｓｏｆｔ－ｃｌｉｐ ｒｅａｄｓ ｓｕｐｐｏｒｔｓ）を必要とする。
モデル構築
１．特徴マッピング及びデータ前処理
１）突然変異注釈及びスコア：
突然変異の頻度（候補突然変異をサポートするｒｅａｄｓのスコア）は、血液中に循環する腫瘍ＤＮＡの総量及び腫瘍の大きさに高度に比例する。したがって、本発明は、入力突然変異の全てを、そのｒｅａｄｓサポート頻度で注釈を付ける。
２）突然変異の分解
突然変異を遺伝子レベル又は焦点領域に分解することにより、複数の遺伝子特徴を抽出する。ＲＯＩスコアは、関心のある領域（ＲＯＩ）ごとに算出される。
ここで、ｎはＲＯＩと重複する突然変異の数であり、ａｄｊ＿ｓｃｏｒｅは突然変異のｒｅａｄｓサポート頻度である。
３）タンパク質及び実験マーカー
ＤＣＰとＡＦＰの２つのタンパク質マーカーは、これまでの研究でＨＣＣ診断の非常に強力な指標であることが確認された（Chen H, et al. (2018) Direct comparison of five serum biomarkers in early diagnosis of hepatocellular carcinoma. Cancer management and research10:1947-1958.）ため、本発明のモデルに使用されている。これらの値は、複数の数値分類にランク付けされる。ｃｆＤＮＡ濃度も本発明のモデルの特徴リストに含まれる。
４）特徴としての臨床情報
ＨＣＣ診断の可能性が個体の年齢及び性別にある程度関連していることが証明されているので、患者の年齢及び性別も本発明の予測器の一部を構成する。
１．特徴マッピング及びデータ前処理
１）突然変異注釈及びスコア：
突然変異の頻度（候補突然変異をサポートするｒｅａｄｓのスコア）は、血液中に循環する腫瘍ＤＮＡの総量及び腫瘍の大きさに高度に比例する。したがって、本発明は、入力突然変異の全てを、そのｒｅａｄｓサポート頻度で注釈を付ける。
２）突然変異の分解
突然変異を遺伝子レベル又は焦点領域に分解することにより、複数の遺伝子特徴を抽出する。ＲＯＩスコアは、関心のある領域（ＲＯＩ）ごとに算出される。
３）タンパク質及び実験マーカー
ＤＣＰとＡＦＰの２つのタンパク質マーカーは、これまでの研究でＨＣＣ診断の非常に強力な指標であることが確認された（Chen H, et al. (2018) Direct comparison of five serum biomarkers in early diagnosis of hepatocellular carcinoma. Cancer management and research10:1947-1958.）ため、本発明のモデルに使用されている。これらの値は、複数の数値分類にランク付けされる。ｃｆＤＮＡ濃度も本発明のモデルの特徴リストに含まれる。
４）特徴としての臨床情報
ＨＣＣ診断の可能性が個体の年齢及び性別にある程度関連していることが証明されているので、患者の年齢及び性別も本発明の予測器の一部を構成する。
２．特徴選択
ＲａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔは、候補特徴から有用な変数をスクリーニングすることに使用される。発明者は、バイアスのないアウトオブバッグ誤差推定（ｕｎｂｉａｓｅｄｏｕｔ－ｏｆ－ｂａｇ ｅｒｒｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ）を最小化することにより、逆変数減算（ｂａｃｋｗａｒｄ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）を適用し、実行するごとに１つの特徴を削除する。その後、タンパク質、遺伝子マーカー及び臨床情報を最適化して、二元分類器の最終的な特徴を構築する。ＨＣＣを健常個体と比較する訓練では、ｃｔＤＮＡ ＳＮＰ／ｉｎｄｅｌ突然変異とタンパク質マーカーのみを使用する。健常群ではＨＢＶ感染がないため、ＨＢＶ－ＴＥＲＴ融合又は他のＨＢＶ組み込みは含まれない。
ＲａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔは、候補特徴から有用な変数をスクリーニングすることに使用される。発明者は、バイアスのないアウトオブバッグ誤差推定（ｕｎｂｉａｓｅｄｏｕｔ－ｏｆ－ｂａｇ ｅｒｒｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ）を最小化することにより、逆変数減算（ｂａｃｋｗａｒｄ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）を適用し、実行するごとに１つの特徴を削除する。その後、タンパク質、遺伝子マーカー及び臨床情報を最適化して、二元分類器の最終的な特徴を構築する。ＨＣＣを健常個体と比較する訓練では、ｃｔＤＮＡ ＳＮＰ／ｉｎｄｅｌ突然変異とタンパク質マーカーのみを使用する。健常群ではＨＢＶ感染がないため、ＨＢＶ－ＴＥＲＴ融合又は他のＨＢＶ組み込みは含まれない。
３．モデル及びパラメータの最適化
罰則付きロジスティック回帰モデルは、６５個のＨＣＣと７０個の非ＨＣＣを含む１３５個の標本の訓練セットから構築される。モデルの性能は、曲線下面積（ＡＵＣ）統計によって、訓練データセットと検証データセットの両方について評価される。モデルの感度と特異性は、最適化されたカットオフ値０．４を用いても決定される。このカットオフ値の最適化にはＹｏｕｄｅｎインデックスが使用される。遺伝子、タンパク質、ＣＮＶレベルをそれぞれクラスタリング分析するために、罰則付きロジスティック回帰を用いた特徴ごとの交差検証係数も与える。このモデルはＲパッケージ‘ｇｌｍｎｅｔ’（Ｒバージョン３．５．１）で起動され、ペナルティパラメータαは訓練データセット内で１０倍交差検証により最適化され、最適化された値は０である。
罰則付きロジスティック回帰モデルは、６５個のＨＣＣと７０個の非ＨＣＣを含む１３５個の標本の訓練セットから構築される。モデルの性能は、曲線下面積（ＡＵＣ）統計によって、訓練データセットと検証データセットの両方について評価される。モデルの感度と特異性は、最適化されたカットオフ値０．４を用いても決定される。このカットオフ値の最適化にはＹｏｕｄｅｎインデックスが使用される。遺伝子、タンパク質、ＣＮＶレベルをそれぞれクラスタリング分析するために、罰則付きロジスティック回帰を用いた特徴ごとの交差検証係数も与える。このモデルはＲパッケージ‘ｇｌｍｎｅｔ’（Ｒバージョン３．５．１）で起動され、ペナルティパラメータαは訓練データセット内で１０倍交差検証により最適化され、最適化された値は０である。
統計分析
本発明は、ｃｔＤＮＡ突然変異、タンパク質バイオマーカーレベル、及び臨床的特徴を変数とする罰則付きロジスティック回帰モデルを使用する。発明者は、ＡＦＰ／ＵＳ陽性及びＡＦＰ／ＵＳ擬似個体において、動的ＣＴ／ＭＲＩ及び／又は組織学的ＨＣＣ症例及び非ＨＣＣ症例を定義した（図１）。ＨＣＣスクリーニング測定法の感度と特異性は、６５例のＨＣＣと７０例の非ＨＣＣの訓練データセットに対して１００回の反復のＬＯＯＣＶ（Ｌｅａｖｅ－Ｏｎｅ－Ｏｕｔ Ｃｒｏｓｓ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ、一個抜き交差検証）を行って算出した。
本発明は、ｃｔＤＮＡ突然変異、タンパク質バイオマーカーレベル、及び臨床的特徴を変数とする罰則付きロジスティック回帰モデルを使用する。発明者は、ＡＦＰ／ＵＳ陽性及びＡＦＰ／ＵＳ擬似個体において、動的ＣＴ／ＭＲＩ及び／又は組織学的ＨＣＣ症例及び非ＨＣＣ症例を定義した（図１）。ＨＣＣスクリーニング測定法の感度と特異性は、６５例のＨＣＣと７０例の非ＨＣＣの訓練データセットに対して１００回の反復のＬＯＯＣＶ（Ｌｅａｖｅ－Ｏｎｅ－Ｏｕｔ Ｃｒｏｓｓ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ、一個抜き交差検証）を行って算出した。
実施例１、４つのスクリーニングセンターによるベースライン参加者の臨床パラメータ及び肝細胞がん（ＨＣＣ）結果のフォローアップ
４つのスクリーニングセンターにおいて、血液Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）試験によりコミュニティ個体（ｎ＝７２７２０）をスクリーニングし、その後アンケート調査を行った。ＨＢｓＡｇ陽性個体（ｎ＝３７９３）にＡＦＰ／ＵＳスクリーニングに参加してもらった。これらのＨＢｓＡｇ陽性個体のうち、１７６位に関連するＡＦＰ／ＵＳ結果（ＡＦＰ／ＵＳ陽性／擬似群と命名）があり、残りのＨＢｓＡｇ陽性患者はＡＦＰ／ＵＳ陰性群（ｎ＝３６１７）を構成した（図１と表３）。彼らのＨＣＣ状態を決定するために、全てのＡＦＰ／ＵＳ陽性／擬似個体は、最初のスクリーニングから２ヶ月以内に動的ＣＴ／ＭＲＩ検査を行うことが推奨された。ＨＣＣ状態が確実に診断された患者を本研究の訓練セットに入れて、これらの個体から得られたベースラインＡＦＰ／ＵＳ血液サンプルに対してＨＣＣスクリーニング試験を行った（図１）。
４つのスクリーニングセンターにおいて、血液Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）試験によりコミュニティ個体（ｎ＝７２７２０）をスクリーニングし、その後アンケート調査を行った。ＨＢｓＡｇ陽性個体（ｎ＝３７９３）にＡＦＰ／ＵＳスクリーニングに参加してもらった。これらのＨＢｓＡｇ陽性個体のうち、１７６位に関連するＡＦＰ／ＵＳ結果（ＡＦＰ／ＵＳ陽性／擬似群と命名）があり、残りのＨＢｓＡｇ陽性患者はＡＦＰ／ＵＳ陰性群（ｎ＝３６１７）を構成した（図１と表３）。彼らのＨＣＣ状態を決定するために、全てのＡＦＰ／ＵＳ陽性／擬似個体は、最初のスクリーニングから２ヶ月以内に動的ＣＴ／ＭＲＩ検査を行うことが推奨された。ＨＣＣ状態が確実に診断された患者を本研究の訓練セットに入れて、これらの個体から得られたベースラインＡＦＰ／ＵＳ血液サンプルに対してＨＣＣスクリーニング試験を行った（図１）。
この３６１７人のＡＦＰ／ＵＳ陰性個体のうち、約６０％は、本研究のベースラインスクリーニングの前にＡＦＰ／ＵＳスクリーニングを行ったことがある（図２及び表３）。フォローアップにおける不安や非コンプライアンスを軽減するために、本発明は、主に、過去１～３年間にＡＦＰ／ＵＳスクリーニングを行った個体を検証セット（ｎ＝３３１）として選択する。性別、ＵＳで検出された肝硬変の割合及び血清アルブミンレベルに基づいて、サンプリングしたＡＦＰ／ＵＳ陰性参加者の分布は全てのＨＢｓＡｇ陽性参加者と類似している（図２及び表３）。本発明は、ベースラインＡＦＰ／ＵＳスクリーニングにおいて検証セットから採取された血液サンプルに対してＨＣＣ液体生検試験（ＨＣＣスクリーニング）を行い、ベースラインスクリーニングの６～８ヶ月後にＨＣＣ状態をフォローアップした。本発明はまた、ＨＢＶ感染のない７０人の健常個体に対してＨＣＣスクリーニングを行った。
実施例２、ＨＣＣスクリーニングを用いたＨＣＣマーカーの選択及び検出
本発明は、１）ＨＣＣにおいて非常に一般的であり、ｃｆＤＮＡで検出可能な遺伝子改変；及び２）血清タンパク質マーカーであるαフェトプロテイン（ＡＦＰ）及び脱－γ－カルボキシプロトロンビン（ＤＣＰ）という２種類のバイオマーカーを用いてＨＣＣスクリーニング測定法を開発した。以前のがんゲノム研究では、ＨＢＶ関連ＨＣＣの多くは、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＡＸＩＮ１又はＴＥＲＴプロモータの遺伝子／位置の突然変異を少なくとも有する（Totoki Y, et al. (2014) Trans-ancestry mutational landscape of hepatocellular carcinoma genomes. Nature genetics 46(12):1267-1273；Zhang W, et al. (2017) Genetic Features of Aflatoxin-associated Hepatocellular Carcinomas. Gastroenterology.）。本発明はまた、ＨＣＣの潜在的なバイオマーカーとしてＨＢＶ組み込みブレークポイントを考慮する。ＨＢＶ組み込み部位は各体細胞において一意であるべきであるため、血漿（２～３ｍｌ）から複数のコピー（＞２）が検出された特定の組み込み部位は、ＨＢＶ組み込みを有する個々の細胞のクローン増幅を示すことができる。この場合にのみ、そこからできた腫瘍が同じゲノムＤＮＡの複数のコピーを血液中に放出する。本発明は、並列スペクトル解析（ｐｒｏｆｉｌｅ）可能な遺伝子変化の測定法を設計した。抽出されたｃｆＤＮＡは、ＤＮＡバーコードを有するカスタマイズされたアダプタに接続され、その後、増幅されて全ゲノムライブラリーが生成される。発明者は、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１及びＡＸＩＮ１のコード領域、ＴＥＲＴのプロモーター領域、及びＨＢＶ配列をカバーする複数のプライマーを用いて、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）と同様の方法で、点突然変異及びＨＢＶ組み込みを有する標的を濃縮させる（図３）（Chaudhuri AA, et al.(2017) Early Detection of Molecular Residual Disease in Localized Lung Cancer by Circulating Tumor DNA Profiling. Cancer discovery 7(12):1394-1403；Waltari E, et al. (2018) 5' Rapid Amplification of cDNA Ends and Illumina MiSeq Reveals B Cell Receptor Features in Healthy Adults, Adults With Chronic HIV-1 Infection, Cord Blood, and Humanized Mice. Frontiers in immunology 9:628.）。第二世代シークエンシングのｒｅａｄｓは、ＤＮＡバーコードによって元のｃｆＤＮＡ分子を追跡することができるため、シークエンシング／増幅エラーから偽陽性一塩基変異（ＳＮＶ）をフィルタリングすることができる（Kinde I, Wu J, Papadopoulos N, Kinzler KW, & Vogelstein B (2011) Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108(23):9530-9535.）。
本発明は、１）ＨＣＣにおいて非常に一般的であり、ｃｆＤＮＡで検出可能な遺伝子改変；及び２）血清タンパク質マーカーであるαフェトプロテイン（ＡＦＰ）及び脱－γ－カルボキシプロトロンビン（ＤＣＰ）という２種類のバイオマーカーを用いてＨＣＣスクリーニング測定法を開発した。以前のがんゲノム研究では、ＨＢＶ関連ＨＣＣの多くは、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＡＸＩＮ１又はＴＥＲＴプロモータの遺伝子／位置の突然変異を少なくとも有する（Totoki Y, et al. (2014) Trans-ancestry mutational landscape of hepatocellular carcinoma genomes. Nature genetics 46(12):1267-1273；Zhang W, et al. (2017) Genetic Features of Aflatoxin-associated Hepatocellular Carcinomas. Gastroenterology.）。本発明はまた、ＨＣＣの潜在的なバイオマーカーとしてＨＢＶ組み込みブレークポイントを考慮する。ＨＢＶ組み込み部位は各体細胞において一意であるべきであるため、血漿（２～３ｍｌ）から複数のコピー（＞２）が検出された特定の組み込み部位は、ＨＢＶ組み込みを有する個々の細胞のクローン増幅を示すことができる。この場合にのみ、そこからできた腫瘍が同じゲノムＤＮＡの複数のコピーを血液中に放出する。本発明は、並列スペクトル解析（ｐｒｏｆｉｌｅ）可能な遺伝子変化の測定法を設計した。抽出されたｃｆＤＮＡは、ＤＮＡバーコードを有するカスタマイズされたアダプタに接続され、その後、増幅されて全ゲノムライブラリーが生成される。発明者は、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１及びＡＸＩＮ１のコード領域、ＴＥＲＴのプロモーター領域、及びＨＢＶ配列をカバーする複数のプライマーを用いて、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）と同様の方法で、点突然変異及びＨＢＶ組み込みを有する標的を濃縮させる（図３）（Chaudhuri AA, et al.(2017) Early Detection of Molecular Residual Disease in Localized Lung Cancer by Circulating Tumor DNA Profiling. Cancer discovery 7(12):1394-1403；Waltari E, et al. (2018) 5' Rapid Amplification of cDNA Ends and Illumina MiSeq Reveals B Cell Receptor Features in Healthy Adults, Adults With Chronic HIV-1 Infection, Cord Blood, and Humanized Mice. Frontiers in immunology 9:628.）。第二世代シークエンシングのｒｅａｄｓは、ＤＮＡバーコードによって元のｃｆＤＮＡ分子を追跡することができるため、シークエンシング／増幅エラーから偽陽性一塩基変異（ＳＮＶ）をフィルタリングすることができる（Kinde I, Wu J, Papadopoulos N, Kinzler KW, & Vogelstein B (2011) Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108(23):9530-9535.）。
本発明者のこれまでの発見及びＨＣＣ、肝硬変及び慢性肝炎の影響を受けた他の入院患者の報告に基づくと、ＡＦＰとＤＣＰの血清タンパク質レベルの組み合わせは、早期ＨＣＣと非代償性肝硬変との区別において顕著な感度及び特異性を示す（Chen H, et al. (2018) Direct comparison of five serum biomarkers in early diagnosis of hepatocellular carcinoma. Cancer management and research10:1947-1958.）。したがって、本発明は、このような液体生検に基づく測定法（ＡＦＰ、ＤＣＰ及びｃｆＤＮＡを含む）が早期ＨＣＣを効果的にスクリーニングできるか否かを検討するために、ｃｆＤＮＡ改変とこれら２つの血清タンパク質マーカーを組み合わせる。
実施例３、ＨＣＣスクリーニング測定法による臨床診断の一致性
ＨＣＣ検査におけるその有用性を決定するために、本発明は、ＨＣＣと診断されたか、又は排除された（非ＨＣＣ）個体においてＨＣＣスクリーニングを行った。ＡＦＰ／ＵＳ陽性／擬似個体から６５例のＨＣＣと７０例の非ＨＣＣを得た。このＨＣＣ陽性又はＨＣＣ陰性の状態は、動的ＣＴ／ＭＲＩ画像及び組織学に基づいて確認された。この１３５例の症例を訓練セットとして使用し、ＨＣＣスクリーニング結果を臨床診断と比較した。測定法において、異なるタイプのバイオマーカーを組み込んだ分類器を確立するために、本発明は、まず、異なるタイプのｃｆＤＮＡ突然変異を、各遺伝子又は遺伝子座について関心領域（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＲＯＩ）スコアに分解（ｃｏｌｌａｐｓｅ）する。ＲＯＩスコアは、ＲＯＩ内の各点突然変異の破壊効果及び頻度の加重和である。本発明は、遺伝子におけるＳＮＶ／ｉｎｄｅｌ突然変異のＲＯＩスコアに加えて、ＨＣＣ状態を予測するための診断分類器を構築するための最終的な特徴として、２つの構造的バリアント特徴（ＴＥＲＴプロモーター領域におけるＨＢＶ組み込み及び他のＨＢＶ組み込み）、１つの実験的特徴（ｃｆＤＮＡ濃度）、２つのタンパク質マーカー（ＡＦＰ及びＤＣＰ）、及び２つの臨床的特徴（年齢及び性別）を追加する（表２）。これらのマーカーを用いて罰則付きロジスティック回帰アルゴリズムを用いると、ＨＣＣスクリーニングモデルはＨＣＣ症例と非ＨＣＣ症例をよく区別する（図４のＡ）。６５例のＨＣＣと７０例の非ＨＣＣの訓練データセットに対して１００回の繰り返した一個抜き交差検証（ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ ｃｒｏｓｓ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を行ったところ、該測定法は、ＨＣＣ診断において８５％の感度と９３％の特異性（曲線下面積＝０．９２８）を有することがわかった（図４のＢ及び図４のＣ）。ＨＣＣスクリーニングスコアのカットオフ値は最高Ｙｏｕｄｅｎインデックスのスコアに対して０．４であった（図５のＢ及び表４）。ｃｆＤＮＡとタンパク質マーカーの両方はＨＣＣの識別に顕著な貢献をした（図４のＣ及び表５）。
ＨＣＣ検査におけるその有用性を決定するために、本発明は、ＨＣＣと診断されたか、又は排除された（非ＨＣＣ）個体においてＨＣＣスクリーニングを行った。ＡＦＰ／ＵＳ陽性／擬似個体から６５例のＨＣＣと７０例の非ＨＣＣを得た。このＨＣＣ陽性又はＨＣＣ陰性の状態は、動的ＣＴ／ＭＲＩ画像及び組織学に基づいて確認された。この１３５例の症例を訓練セットとして使用し、ＨＣＣスクリーニング結果を臨床診断と比較した。測定法において、異なるタイプのバイオマーカーを組み込んだ分類器を確立するために、本発明は、まず、異なるタイプのｃｆＤＮＡ突然変異を、各遺伝子又は遺伝子座について関心領域（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＲＯＩ）スコアに分解（ｃｏｌｌａｐｓｅ）する。ＲＯＩスコアは、ＲＯＩ内の各点突然変異の破壊効果及び頻度の加重和である。本発明は、遺伝子におけるＳＮＶ／ｉｎｄｅｌ突然変異のＲＯＩスコアに加えて、ＨＣＣ状態を予測するための診断分類器を構築するための最終的な特徴として、２つの構造的バリアント特徴（ＴＥＲＴプロモーター領域におけるＨＢＶ組み込み及び他のＨＢＶ組み込み）、１つの実験的特徴（ｃｆＤＮＡ濃度）、２つのタンパク質マーカー（ＡＦＰ及びＤＣＰ）、及び２つの臨床的特徴（年齢及び性別）を追加する（表２）。これらのマーカーを用いて罰則付きロジスティック回帰アルゴリズムを用いると、ＨＣＣスクリーニングモデルはＨＣＣ症例と非ＨＣＣ症例をよく区別する（図４のＡ）。６５例のＨＣＣと７０例の非ＨＣＣの訓練データセットに対して１００回の繰り返した一個抜き交差検証（ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ ｃｒｏｓｓ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を行ったところ、該測定法は、ＨＣＣ診断において８５％の感度と９３％の特異性（曲線下面積＝０．９２８）を有することがわかった（図４のＢ及び図４のＣ）。ＨＣＣスクリーニングスコアのカットオフ値は最高Ｙｏｕｄｅｎインデックスのスコアに対して０．４であった（図５のＢ及び表４）。ｃｆＤＮＡとタンパク質マーカーの両方はＨＣＣの識別に顕著な貢献をした（図４のＣ及び表５）。
実施例４、ＨＣＣスクリーニング測定法によるＡＦＰ／ＵＳ陰性個体の早期ＨＣＣの予測値
本発明はさらに、ＡＦＰ／ＵＳ陰性で臨床症状を示さないＨＢｓＡｇ陽性個体からＨＣＣスクリーニングがＨＣＣを検出できるか否かを試験した。３３１人のＡＦＰ／ＵＳ陰性個体をＨＣＣスクリーニングで試験し、訓練セットから得られたアルゴリズムに基づいて２４例の陽性症例（ＨＣＣスクリーニング陽性と呼ばれる）を識別した（図４のＤ）。
本発明はさらに、ＡＦＰ／ＵＳ陰性で臨床症状を示さないＨＢｓＡｇ陽性個体からＨＣＣスクリーニングがＨＣＣを検出できるか否かを試験した。３３１人のＡＦＰ／ＵＳ陰性個体をＨＣＣスクリーニングで試験し、訓練セットから得られたアルゴリズムに基づいて２４例の陽性症例（ＨＣＣスクリーニング陽性と呼ばれる）を識別した（図４のＤ）。
２４名のＨＣＣスクリーニング陽性個体に対して６～８ヶ月のフォローアップを行い、ＨＣＣの臨床結果を得た。これらの個体のうち、１７名に動的ＣＴ検査、４名にＡＦＰ／ＵＳ検査、３名に電話インタビューによるフォローアップを行った。２４名のＨＣＣスクリーニング陽性個体のうち４名は最終的にＨＣＣと診断され、ＨＣＣ検査の陽性予測値は１７％であった（図４のＥ）。また、１群のＨＣＣスクリーニング陰性参加者（ｎ＝７０）は、６～８ヶ月に動的ＣＴ検査を行うことに同意し、誰もＨＣＣと診断されなかった。本発明はまた、ベースラインＡＦＰ／ＵＳスクリーニングの６～８ヶ月後に、１７２人のＨＣＣスクリーニング陰性参加者をＡＦＰ／ＵＳで追跡したが、ＨＣＣ症例を診断しなかった。電話インタビューによるフォローアップを行った６５人の参加者のうち、ＨＣＣ患者は認められなかった（図２）。一般的には、これらのＨＣＣスクリーニング陰性症例のうち、ＨＣＣ症例は認められなかった。これらを総合すると、ＨＣＣスクリーニング測定法はＡＦＰ／ＵＳ陰性個体では１７％の陽性予測値、１００％（４／４）の感度、９４％の特異性（３０７／３２７）を示した（図４のＦ）。動的ＣＴで診断した時、識別した全ての４つのＨＣＣ患者の腫瘍の大きさは全て＜３ｃｍ（図４のＧ）であり、しかもベースライン時のＵＳ結果によると、この４人の患者は肝硬変がなかった。
本発明は、ベースライン検出時にＡＦＰ／ＵＳ－陰性であり、ＨＣＣスクリーニング試験を行っていない９４４人の参加者に対して、ベースライン検出後６～８ヶ月の間にＡＦＰ／ＵＳ検査を行った。ＨＣＣが４例検出され、さらに確認された（０．４％、４／９４４）。がん登録記録によると、ベースラインスクリーニングでＡＦＰ／ＵＳ陰性であり、ＨＣＣスクリーニング又はそれ以上のＡＦＰ／ＵＳスクリーニングを行っていない３３７人の参加者のうち、２０１８年６月３０日までに肝がんの結果（ＩＣＤ－１０コードＣ２２）が確認されなかった（図２）。
ベースラインの１回目の採血から６～８ヶ月後に、２４人のＨＣＣスクリーニング陽性症例のうち１３人に対して２回目の採血を行い、ＨＣＣスクリーニング測定法を繰り返した。このうち、ＨＣＣ症例の１つは引き続き陽性で、６ヶ月前よりもスコアが高かった。もう１つのＨＣＣ症例は、２回目の採血の前に手術で腫瘍を切除しており、ＨＣＣスクリーニングでは陰性であり、この状態と一致していた。ＨＣＣスクリーニングで陽性となった１１例の非ＨＣＣ症例のうち、７例（６４％）は、２つのスクリーニング結果が閾値（０．４０）に近かったものの、２回目のＨＣＣスクリーニングで陰性であった。残りの４例の非ＨＣＣ症例は、２回目のＨＣＣスクリーニングで陽性であるままであった（図４のＥ）。これらの結果は、第２の時点で試験を繰り返すことにより、陽性予測値をさらに改善できることを示している。現在、これらの症例に対してフォローアップを行い、さらにこの測定法を検証した。
実施例５、健常個体訓練による液体生検測定法
ＨＣＣスクリーニング測定法はハイリスク集団で強いＨＣＣ識別能力を示した。以前の研究によれば、そのようなハイリスク集団では、ＨＢＶ感染又は他のリスク因子を持たない健常者とのがん患者の比較よりも感度と特異性が低くなると予測されていた。この仮説をテストするために、本発明は、ＨＢＶ感染のない７０人の健常個体（ＨＢｓＡｇ陰性）にＨＣＣスクリーニングを行い、訓練セットのＨＢｓＡｇ陽性の非ＨＣＣ症例７０例の代わりにこれらのデータを使用した。ＨＣＣスクリーニング測定法は、ｃｆＤＮＡとタンパク質マーカーの解析により、健常個体からＨＣＣ症例を効率的に識別し、感度が９８％、特異性が１００％であった（図５のＡ）。しかし、この訓練セット（ＨＣＣ及び健常個体）から得られたアルゴリズムは、ＨＢｓＡｇ陽性の非ＨＣＣ症例ではパフォーマンスが良くなかった。このアルゴリズムによれば、非ＨＣＣ症例のほとんどが陽性に分類される一方、ＨＣＣと非ＨＣＣの症例は高く重複している（図５のＢ）。さらに、検証セットに対してパフォーマンスが良くなかった。試験では、４つのＨＣＣ症例が全て陽性であったが、ＨＢｓＡｇ（＋）個体の多くは陽性と分類され、生成した特異性と陽性予測値はそれぞれ５８％と２．８％にとどまった（図５のＢ）。一方、ＨＢｓＡｇ陽性の検証セットにおけるそのパフォーマンスを除いて、ＨＣＣと非ＨＣＣ症例から得られたアルゴリズムは、全ての健常個体（１００％）を正しく陰性に分類した（図５のＢ）。
ＨＣＣスクリーニング測定法はハイリスク集団で強いＨＣＣ識別能力を示した。以前の研究によれば、そのようなハイリスク集団では、ＨＢＶ感染又は他のリスク因子を持たない健常者とのがん患者の比較よりも感度と特異性が低くなると予測されていた。この仮説をテストするために、本発明は、ＨＢＶ感染のない７０人の健常個体（ＨＢｓＡｇ陰性）にＨＣＣスクリーニングを行い、訓練セットのＨＢｓＡｇ陽性の非ＨＣＣ症例７０例の代わりにこれらのデータを使用した。ＨＣＣスクリーニング測定法は、ｃｆＤＮＡとタンパク質マーカーの解析により、健常個体からＨＣＣ症例を効率的に識別し、感度が９８％、特異性が１００％であった（図５のＡ）。しかし、この訓練セット（ＨＣＣ及び健常個体）から得られたアルゴリズムは、ＨＢｓＡｇ陽性の非ＨＣＣ症例ではパフォーマンスが良くなかった。このアルゴリズムによれば、非ＨＣＣ症例のほとんどが陽性に分類される一方、ＨＣＣと非ＨＣＣの症例は高く重複している（図５のＢ）。さらに、検証セットに対してパフォーマンスが良くなかった。試験では、４つのＨＣＣ症例が全て陽性であったが、ＨＢｓＡｇ（＋）個体の多くは陽性と分類され、生成した特異性と陽性予測値はそれぞれ５８％と２．８％にとどまった（図５のＢ）。一方、ＨＢｓＡｇ陽性の検証セットにおけるそのパフォーマンスを除いて、ＨＣＣと非ＨＣＣ症例から得られたアルゴリズムは、全ての健常個体（１００％）を正しく陰性に分類した（図５のＢ）。
実施例６、ＣＮＶをさらに含む液体生検測定法
一、血液サンプルの取得
肝がん患者の血液サンプルは、臨床的に肝がんと同定された６５人の肝がん患者から提供された。
肝がんハイリスク者の血液サンプルは、文献（Omata,M.,et al.,Asia-Pacific clinical practice guidelines on the management of hepatocellular carcinoma:a 2017 update.Hepatol Int,2017.11(4):p.317-370.）に記載されている方法を用いて、肝がんハイリスクと同定された７０人の肝がんハイリスク者から提供された。
健常者の血液サンプルは１００人の健常ボランティアから提供された。
一、血液サンプルの取得
肝がん患者の血液サンプルは、臨床的に肝がんと同定された６５人の肝がん患者から提供された。
肝がんハイリスク者の血液サンプルは、文献（Omata,M.,et al.,Asia-Pacific clinical practice guidelines on the management of hepatocellular carcinoma:a 2017 update.Hepatol Int,2017.11(4):p.317-370.）に記載されている方法を用いて、肝がんハイリスクと同定された７０人の肝がんハイリスク者から提供された。
健常者の血液サンプルは１００人の健常ボランティアから提供された。
二、被験血液サンプルのｃｆＤＮＡ中の肝がん突然変異遺伝子の検出及びＣＮＶ検出
被験血液サンプルは、６５人の肝がん患者の血液サンプル、７０人の肝がんハイリスク者の血液サンプル、及び１００名の健常者の血液サンプルである。
被験血液サンプルは、６５人の肝がん患者の血液サンプル、７０人の肝がんハイリスク者の血液サンプル、及び１００名の健常者の血液サンプルである。
１、ＭａｇＭＡＸTMＣｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、被験血液サンプルｃｆＤＮＡをそれぞれ抽出した。
２、ステップ１を完了した後、液相ハイブリダイゼーションキャプチャ技術を用いて、被験血液サンプルのｃｆＤＮＡ中の肝がん突然変異遺伝子情報、例えばＴＰ５３遺伝子、ＡＸＩＮ１遺伝子、ＣＴＮＮＢ１遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子のプロモーター、Ｂ型ＨＢＶとＣ型ＨＢＶの突然変異情報を測定した。ステップは、具体的には、以下のとおりである。
（１）前記被験血液サンプルのｃｆＤＮＡを採取し、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐキットを用いてライブラリーを構築し、被験血液サンプルのｃｆＤＮＡライブラリーを得た。
（２）ステップ（１）を完了した後、前記被験血液サンプルのｃｆＤＮＡライブラリーによって、ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ＸＴ標的キャプチャキットを用いて標的領域のハイブリダイゼーションキャプチャを行い、その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームで２００００×の深さでシークエンシングを行った。検出された遺伝子又はウイルスのバージョン、染色体、開始位置、終了位置及びカバー領域の詳細は表６に示される。
（１）前記被験血液サンプルのｃｆＤＮＡを採取し、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐキットを用いてライブラリーを構築し、被験血液サンプルのｃｆＤＮＡライブラリーを得た。
（２）ステップ（１）を完了した後、前記被験血液サンプルのｃｆＤＮＡライブラリーによって、ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ＸＴ標的キャプチャキットを用いて標的領域のハイブリダイゼーションキャプチャを行い、その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームで２００００×の深さでシークエンシングを行った。検出された遺伝子又はウイルスのバージョン、染色体、開始位置、終了位置及びカバー領域の詳細は表６に示される。
３．ステップ２の（１）で製造した血液サンプルのｃｆＤＮＡライブラリーを取り、低深度全ゲノムシーケンシングを行い、次に、シーケンシングデータ（約３Ｇ）をＣＮＶ検出を行った。
三、血漿中のＡＦＰ含有量の検出
被験血液サンプルは、６５人の肝がん患者の血液サンプル、７０人の肝がんハイリスク者の血液サンプル、１００名の健常者の血液サンプルである。
被験血液サンプルは、６５人の肝がん患者の血液サンプル、７０人の肝がんハイリスク者の血液サンプル、１００名の健常者の血液サンプルである。
１、被験血液サンプルを採取し、採血管の上下を逆にして１０回混ぜ、４℃、２０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離した後、上層血漿を遠心分離管（規格は１．５ｍＬ）に移し、４℃、１６０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清（血漿）を収集した。
２、ステップ１を完了した後、前記血漿を採取し、米国アボット社のＩＭｘ分析装置を用いてＡＦＰの含有量を検出した。
一部の血液サンプル血漿中のＡＦＰ含有量の検出結果は表８の第２列に示される。
２、ステップ１を完了した後、前記血漿を採取し、米国アボット社のＩＭｘ分析装置を用いてＡＦＰの含有量を検出した。
一部の血液サンプル血漿中のＡＦＰ含有量の検出結果は表８の第２列に示される。
四、血漿中のＤＣＰ含有量の検出
被験血液サンプルは６５人の肝がん患者の血液サンプル、７０人の肝がんハイリスク者の血液サンプル、及び１００名の健常者の血液サンプルである。
１、被験血液サンプルを採取し、採血管の上下を逆にして１０回混ぜ、４℃、２０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離した後、上層血漿を遠心分離管（規格１．５ｍＬ）に移し、４℃、１６０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清（即ち血漿）を収集した。
２、ステップ１を完了した後、前記血漿を取り、米国アボット社のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ｉ２０００ＳＲ化学発光免疫分析装置を用いてＤＣＰの含有量を検出した。
一部の被験血液サンプルの血漿中のＤＣＰ含有量の検出結果は表８の第３列に示される。
被験血液サンプルは６５人の肝がん患者の血液サンプル、７０人の肝がんハイリスク者の血液サンプル、及び１００名の健常者の血液サンプルである。
１、被験血液サンプルを採取し、採血管の上下を逆にして１０回混ぜ、４℃、２０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離した後、上層血漿を遠心分離管（規格１．５ｍＬ）に移し、４℃、１６０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清（即ち血漿）を収集した。
２、ステップ１を完了した後、前記血漿を取り、米国アボット社のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ｉ２０００ＳＲ化学発光免疫分析装置を用いてＤＣＰの含有量を検出した。
一部の被験血液サンプルの血漿中のＤＣＰ含有量の検出結果は表８の第３列に示される。
五、データ処理及び２２個の特徴スコア値の取得
１、遺伝子突然変異結果の注釈及び採点
ステップ二のｃｆＤＮＡ中の肝がん突然変異遺伝子の検出結果に対して、突然変異ｒｅａｄｓサポート頻度の注釈スコアで注釈を行った。突然変異ｒｅａｄｓサポートは、組織内の変異細胞の割合を大きく反映しているため、表現型に関連する重要な因子である。
１、遺伝子突然変異結果の注釈及び採点
ステップ二のｃｆＤＮＡ中の肝がん突然変異遺伝子の検出結果に対して、突然変異ｒｅａｄｓサポート頻度の注釈スコアで注釈を行った。突然変異ｒｅａｄｓサポートは、組織内の変異細胞の割合を大きく反映しているため、表現型に関連する重要な因子である。
２．突然変異部位の組み込み及び採点
各遺伝子突然変異について、突然変異ｒｅａｄｓサポート頻度に従って注釈スコアを与え、その後、突然変異部位スコア値を異なるＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ Ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）区間に累積した（即ち、特徴スコア値が得られる）。この区間は４つの遺伝子（ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＴＥＲＴ及びＡＸＩＮ１）と１つのＴＰ５３ Ｒ２４９Ｓホットスポット突然変異位置領域を含む。計算式は以下のとおりである。
各遺伝子突然変異について、突然変異ｒｅａｄｓサポート頻度に従って注釈スコアを与え、その後、突然変異部位スコア値を異なるＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ Ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）区間に累積した（即ち、特徴スコア値が得られる）。この区間は４つの遺伝子（ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＴＥＲＴ及びＡＸＩＮ１）と１つのＴＰ５３ Ｒ２４９Ｓホットスポット突然変異位置領域を含む。計算式は以下のとおりである。
３．構造的変異結果の特徴抽出
（１）各標本のＨＢＶとＴＥＲＴ組み込み変異特徴のスコアを検出し、ＴＥＲＴ組み込みが発生した場合、ＴＥＲＴ組み込み変異の特徴スコア値は１であり、ＴＥＲＴ組み込みが発生しない場合、ＴＥＲＴ組み込み変異の特徴スコア値は０である。
（２）各標本のＨＢＶ組み込み変異の特徴スコア値を検出し、検出した各組み込み変異に対して、ｒｅａｄｓサポート信頼度によってＡ、Ｂ、及びＣの３つの等級（組み込みｒｅａｄｓ数≧１０：Ａ等級；１０＞組み込みｒｅａｄｓ数＞６：Ｂ等級；残りはＣ等級、表７中の第３列を参照）に分け、対応するスコアはそれぞれ１、０．８、及び０．３点であり、その後合計すると、ＨＢＶ組み込み変異の特徴スコア値を得た。
（１）各標本のＨＢＶとＴＥＲＴ組み込み変異特徴のスコアを検出し、ＴＥＲＴ組み込みが発生した場合、ＴＥＲＴ組み込み変異の特徴スコア値は１であり、ＴＥＲＴ組み込みが発生しない場合、ＴＥＲＴ組み込み変異の特徴スコア値は０である。
（２）各標本のＨＢＶ組み込み変異の特徴スコア値を検出し、検出した各組み込み変異に対して、ｒｅａｄｓサポート信頼度によってＡ、Ｂ、及びＣの３つの等級（組み込みｒｅａｄｓ数≧１０：Ａ等級；１０＞組み込みｒｅａｄｓ数＞６：Ｂ等級；残りはＣ等級、表７中の第３列を参照）に分け、対応するスコアはそれぞれ１、０．８、及び０．３点であり、その後合計すると、ＨＢＶ組み込み変異の特徴スコア値を得た。
４、遺伝子コピー数変異検出結果の特徴抽出
ステップ二のＣＮＶ検出結果を以下のように処理した。各腕レベルでの計４４個のＣＮＶシグナル（性染色体は性別がＣＮＶシグナルに与える影響を排除するために削除された）のスコアに対してＰＣＡ次元削減処理を行い、Ｒ２値により前の６つの主成分（即ち、ＣＮＶ次元削減特徴１、ＣＮＶ次元削減特徴２、ＣＮＶ次元削減特徴３、ＣＮＶ次元削減特徴４、ＣＮＶ次元削減特徴５、ＣＮＶ次元削減特徴６）をＣＮＶ関連の特徴として選択し、ＣＮＶ次元削減特徴１、ＣＮＶ次元削減特徴２、ＣＮＶ次元削減特徴３、ＣＮＶ次元削減特徴４、ＣＮＶ次元削減特徴５、ＣＮＶ次元削減特徴６のＲ２値は特性スコアとなる。
ステップ二のＣＮＶ検出結果を以下のように処理した。各腕レベルでの計４４個のＣＮＶシグナル（性染色体は性別がＣＮＶシグナルに与える影響を排除するために削除された）のスコアに対してＰＣＡ次元削減処理を行い、Ｒ２値により前の６つの主成分（即ち、ＣＮＶ次元削減特徴１、ＣＮＶ次元削減特徴２、ＣＮＶ次元削減特徴３、ＣＮＶ次元削減特徴４、ＣＮＶ次元削減特徴５、ＣＮＶ次元削減特徴６）をＣＮＶ関連の特徴として選択し、ＣＮＶ次元削減特徴１、ＣＮＶ次元削減特徴２、ＣＮＶ次元削減特徴３、ＣＮＶ次元削減特徴４、ＣＮＶ次元削減特徴５、ＣＮＶ次元削減特徴６のＲ２値は特性スコアとなる。
５．遊離ＤＮＡの長さに関する特徴抽出
本発明の発明者は、ｃｆＤＮＡ断片長が４つの区間（＜９０ｂｐ、９０～１４０ｂｐ、１４１～２００ｂｐ、及び＞２００ｂｐ）に占めるパーセンテージを算出し、これらの特徴を予測変数とし、４つの区間に占めるｃｆＤＮＡ断片長のパーセンテージを特徴スコア値とした。
本発明の発明者は、ｃｆＤＮＡ断片長が４つの区間（＜９０ｂｐ、９０～１４０ｂｐ、１４１～２００ｂｐ、及び＞２００ｂｐ）に占めるパーセンテージを算出し、これらの特徴を予測変数とし、４つの区間に占めるｃｆＤＮＡ断片長のパーセンテージを特徴スコア値とした。
６、タンパク質マーカーに関する特徴抽出
ＡＦＰの実測値を閾値（１３、２０、２００、４００）の昇順で５つの数値ランク：０、５、８、２０、３０に、ＤＣＰの実測値を閾値（４０、６０）の昇順で３つの数値ランク：０、２、５に分け、２つのタンパク質マーカーの特徴スコア値とした。
ＡＦＰの実測値を閾値（１３、２０、２００、４００）の昇順で５つの数値ランク：０、５、８、２０、３０に、ＤＣＰの実測値を閾値（４０、６０）の昇順で３つの数値ランク：０、２、５に分け、２つのタンパク質マーカーの特徴スコア値とした。
７．臨床及び実験に関する特徴抽出
臨床的特徴は患者の年齢、性別を含み、ｃｆＤＮＡ濃度（ｃｆＤＮＡ含有量／血漿体積）も病例の表現型と一定の相関性を呈し、モデルに組み入れられた。そのうち、ｃｆＤＮＡ濃度値はｌｏｇ２変換後の数値を特徴スコア値とした。年齢の特徴スコア値はサンプルの実際の年齢数値であり、性別が男の場合、特徴スコア値は１、性別が女の場合、特徴スコア値は０であった。
臨床的特徴は患者の年齢、性別を含み、ｃｆＤＮＡ濃度（ｃｆＤＮＡ含有量／血漿体積）も病例の表現型と一定の相関性を呈し、モデルに組み入れられた。そのうち、ｃｆＤＮＡ濃度値はｌｏｇ２変換後の数値を特徴スコア値とした。年齢の特徴スコア値はサンプルの実際の年齢数値であり、性別が男の場合、特徴スコア値は１、性別が女の場合、特徴スコア値は０であった。
以上のように、２２個の特徴は１３個の遺伝子突然変異特徴、２個のタンパク質マーカー、５個のｃｆＤＮＡ物理特徴、及び２個の血液サンプルの基本情報からなる。１３個の遺伝子突然変異特徴は、それぞれ、ＴＰ５３遺伝子突然変異、ＴＥＲＴ遺伝子突然変異、ＡＸＩＮ１遺伝子突然変異、ＣＴＮＮＢ１遺伝子突然変異、ＴＰ５３ Ｒ２４９Ｓホットスポット位置領域、ＣＮＶ次元削減特徴１、ＣＮＶ次元削減特徴２、ＣＮＶ次元削減特徴３、ＣＮＶ次元削減特徴４、ＣＮＶ次元削減特徴５、ＣＮＶ次元削減特徴６、ＨＢＶとＴＥＲＴ組み込み変異、ＨＢＶと非ＴＥＲＴ組み込み変異である。２個のタンパク質マーカーは、それぞれＡＦＰとＤＣＰである。５個のｃｆＤＮＡ物理特徴は、それぞれ遊離ＤＮＡ断片長が９０ｂｐより小さい区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が９０～１４０ｂｐの区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が１４１～２００ｂｐの区間のパーセンテージ、遊離ＤＮＡ断片が２００ｂｐより大きい区間のパーセンテージ、及びｃｆＤＮＡ濃度である。２個の血液サンプルの基本情報は、それぞれ性別と年齢であった。
六、肝がん予測
１、ステップ一～五の方法に従って、被験者の２２個の特徴の特徴スコア値を得た。
２、ステップ１で得られた特徴スコア値をパラメータとして、罰則付きロジスティック回帰アルゴリズムを用いて６５個のＨＣＣと７０個の肝がんハイリスク者を含む１３５個の標本からなる訓練セットデータに対してモデル構築を行い、ＨＣＣｓｃｒｅｅｎスコア値を算出した。遺伝子、タンパク質、及びＣＮＶレベルをそれぞれクラスタリング分析するために、罰則付きロジスティック回帰を用いた特徴ごとの交差検証係数も与えられた。このモデルはＲパッケージ‘ｇｌｍｎｅｔ’（Ｒバージョン３．５．１）で起動され、ペナルティパラメータαは訓練データセット内で１０倍の交差検証により最適化され、最適化された値は０である。その後、ＨＣＣＳｃｒｅｅｎスコア値及びサンプルグループ（がん又は非がん）情報によりＲＯＣ曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）をプロットした。ヨーデン指数（Ｙｏｕｄｅｎ’ｓ ｉｎｄｅｘ）が最大のときに対応するＨＣＣＳｃｒｅｅｎスコアの値を閾値とした。このモデルでは、モデルの最適なｃｕｔ－ｏｆｆ値として０．４を選択した。
ＨＣＣＳｃｒｅｅｎ＞０．４の場合は肝がんと判定し、そうでない場合は非肝がんと判定した。
１、ステップ一～五の方法に従って、被験者の２２個の特徴の特徴スコア値を得た。
２、ステップ１で得られた特徴スコア値をパラメータとして、罰則付きロジスティック回帰アルゴリズムを用いて６５個のＨＣＣと７０個の肝がんハイリスク者を含む１３５個の標本からなる訓練セットデータに対してモデル構築を行い、ＨＣＣｓｃｒｅｅｎスコア値を算出した。遺伝子、タンパク質、及びＣＮＶレベルをそれぞれクラスタリング分析するために、罰則付きロジスティック回帰を用いた特徴ごとの交差検証係数も与えられた。このモデルはＲパッケージ‘ｇｌｍｎｅｔ’（Ｒバージョン３．５．１）で起動され、ペナルティパラメータαは訓練データセット内で１０倍の交差検証により最適化され、最適化された値は０である。その後、ＨＣＣＳｃｒｅｅｎスコア値及びサンプルグループ（がん又は非がん）情報によりＲＯＣ曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）をプロットした。ヨーデン指数（Ｙｏｕｄｅｎ’ｓ ｉｎｄｅｘ）が最大のときに対応するＨＣＣＳｃｒｅｅｎスコアの値を閾値とした。このモデルでは、モデルの最適なｃｕｔ－ｏｆｆ値として０．４を選択した。
ＨＣＣＳｃｒｅｅｎ＞０．４の場合は肝がんと判定し、そうでない場合は非肝がんと判定した。
七、肝がん予測モデルの有効性の検証
それぞれ肝がん群（６５人の肝がん患者からなる）、肝がんハイリスク群（７０人の肝がんハイリスク者からなる）、及び健常群（１００名の健常ボランティアからなる）をサンプルとして、ステップ七の肝がん予測モデルの予後方法の有効性を検証した。
結果を図７に示す。その結果、肝がん予測モデルは、被験者が肝がん患者であるか否かを予測できることが明らかになった。
それぞれ肝がん群（６５人の肝がん患者からなる）、肝がんハイリスク群（７０人の肝がんハイリスク者からなる）、及び健常群（１００名の健常ボランティアからなる）をサンプルとして、ステップ七の肝がん予測モデルの予後方法の有効性を検証した。
結果を図７に示す。その結果、肝がん予測モデルは、被験者が肝がん患者であるか否かを予測できることが明らかになった。
本発明の本発明者らは、血漿中のｃｆＤＮＡの遺伝子変異情報が早期ＨＣＣ予測に有用であることを、多くの実験により初めて確認した。本発明者らは、肝がん予測モデルを用いて被験者をスコアリングし、そのスコア値から被験者が肝がん患者であるか否かを予測することにより、本発明の遺伝子マーカーとタンパク質マーカーとの組み合わせによる有効なＨＣＣ早期スクリーニング効果を検証した。このことから、ｃｆＤＮＡ検出による肝がんに対する早期スクリーニング、病状追跡、治療効果評価、予後予測などは、重要な臨床意義がある。
Claims (19)
- 遺伝子マーカー検出剤及び／又はタンパク質マーカー検出剤を含む肝細胞がん早期スクリーニング用キット。
- 遺伝子マーカー検出剤及びＤＣＰ検出剤を含むＡＦＰ陰性被検者の肝細胞がん早期スクリーニング用キット。
- 遺伝子マーカー及び／又はタンパク質マーカーの情報を前記被験者の肝細胞がんスクリーニングスコアに変換し、前記被験者の肝細胞がんスクリーニングスコアから被験者が肝がん患者であるか否かを予測するデータ処理システムをさらに含む、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のキット。
- 肝細胞がん早期スクリーニング方法であって、
（１）遺伝子マーカー検出剤及びタンパク質マーカー検出剤を用いて被検者の遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを検出するステップと、
（２）前記遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーの検出結果を用いて肝細胞がんスクリーニングスコアを算出し、閾値と比較するステップとを含む、方法。 - 前記肝細胞がんスクリーニングスコア及び閾値は、肝がん予測モデルにより得られ、
前記肝がん予測モデルの構築方法は、
複数の肝がん患者及び複数の肝がんハイリスク者からなる訓練セットを構築するステップと、
訓練セットの遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを特徴とし、検出結果を特徴スコア値に変換し、罰則付きロジスティック回帰アルゴリズムを用いて、肝がん予測モデルを構築し、肝細胞がんスクリーニングスコアを算出するステップと、
肝細胞がんスクリーニングスコアとサンプルグループ情報とに従って、罰則付きロジスティック回帰モデルの感度と特異性のＲＯＣ曲線を取得し、ＲＯＣ曲線に従って、肝がん患者と肝がんハイリスク者とを区別するための閾値となるカットオフ値を決定するステップとを含む、ことを特徴とする請求項４に記載の方法。 - 遺伝子マーカー検出剤及びタンパク質マーカー検出剤の、肝細胞がん早期スクリーニングにおける使用。
- 肝細胞がん早期スクリーニング用キットの製造における、遺伝子マーカー検出剤及びタンパク質マーカー検出剤の使用。
- 前記遺伝子マーカー検出剤は、ＴＰ５３検出剤、ＣＴＮＮＢ１検出剤、ＡＸＩＮ１検出剤及びＴＥＲＴ検出剤から選ばれる１種又は複数種、好ましくは３種又は４種を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のキット、方法又は使用。
- 前記タンパク質マーカー検出剤は、ＡＦＰ検出剤及びＤＣＰ検出剤から選ばれる１種又は複数種を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のキット、方法又は使用。
- 前記遺伝子マーカー検出剤は、ＨＢＶ組み込み検出剤をさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のキット、方法又は使用。
- 前記遺伝子マーカー検出剤は、ＣＮＶ検出剤をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のキット、方法又は使用。
- 前記遺伝子マーカー検出剤は、ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否かの検出試薬をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のキット、方法又は使用。
- 前記遺伝子マーカー検出剤は、ｃｆＤＮＡ濃度及び／又はｃｆＤＮＡ長さ検出剤をさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のキット、方法又は使用。
- 肝がん突然変異遺伝子の検出試薬、ＤＣＰ検出試薬、及びＡＦＰ検出試薬を含む、肝がん早期スクリーニング用キット。
- ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否かの検出試薬及び／又はｃｆＤＮＡ検出試薬をさらに含む、ことを特徴とする請求項１４に記載のキット。
- 被験者の肝がん遺伝子変異情報、ＤＣＰ含有量、ＡＦＰ含有量、ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否か、ｃｆＤＮＡ情報及び臨床情報を前記被験者の肝細胞がんスクリーニングスコアに変換し、前記被験者の肝細胞がんスクリーニングスコアから被験者が肝がん患者であるか否かを予測するデータ処理システムをさらに含む、ことを特徴とする請求項１、２、３、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５に記載のキット。
- 肝がん突然変異遺伝子の検出試薬、ＤＣＰ検出試薬、ＡＦＰ検出試薬、ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否かの検出試薬及びｃｆＤＮＡ検出試薬の使用であって、
Ａ１）被験者が肝がん患者であるか否かを予測すること、
Ａ２）被験者が肝がん患者であるか否かを予測するためのキットを製造すること、
Ａ３）肝がんを予測すること、
Ａ４）肝がんを予測するためのキットを製造すること、の少なくとも１つである、使用。 - 被験者の年齢、被験者の性別、被験者の血漿中のＤＣＰ含有量、被験者の血漿中のＡＦＰ含有量及び「被験者のｃｆＤＮＡ中の肝がん突然変異遺伝子の突然変異タイプ、突然変異ｒｅａｄｓ、遺伝子コピー数変異、ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否か、ｃｆＤＮＡ濃度、異なる挿入断片長のｃｆＤＮＡ含有量が占めるパーセンテージ」の、マーカーとしての使用であって、
Ａ１）被験者が肝がん患者であるか否かを予測すること、
Ａ２）被験者が肝がん患者であるか否かを予測するためのキットを製造こと、
Ａ３）肝がんを予測すること、
Ａ４）肝がんを予測するためのキットを製造すること、の少なくとも１つである、使用。 - 肝がん予測方法であって、
被験者の血漿中のＤＣＰ含有量とＡＦＰ含有量を検出するステップと、
被験者のｃｆＤＮＡ中の肝がん突然変異遺伝子の突然変異タイプ、突然変異ｒｅａｄｓ、遺伝子コピー数変異、ＨＢＶが遺伝子に組み込まれているか否か、ｃｆＤＮＡ濃度、及び異なる挿入断片長のｃｆＤＮＡ含有量が占めるパーセンテージを検出するステップと、
被験者の年齢と性別を記録するステップと、
前記被験者の情報を肝細胞がんスクリーニングスコアに変換し、肝細胞がんスクリーニングスコアから被験者が肝がん患者であるか否かを予測するステップとを含む、肝がん予測方法。
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