KR20210133232A - 간세포암 조기 선별용 키트 및 그 제조 방법과 용도 - Google Patents

간세포암 조기 선별용 키트 및 그 제조 방법과 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간세포암 조기 선별용 키트 및 그 제조 방법과 용도를 제공한다. 상기 키트는 유전자 마커 검출제와 단백질 마커 검출제를 포함한다. 특정 유전자 마커와 단백질 마커를 포함하는 키트는 커뮤니티 집단에서 간세포암 조기 선별에 효과적인 것으로 입증되었으며 전향적 연구에서 검증되었다.

Description

간세포암 조기 선별용 키트 및 그 제조 방법과 용도
본 발명은 의학 분야에 속하며 간세포암 조기 선별 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 AFP 음성 피험자의 간세포암 조기 선별용 키트 및 그 제조 방법과 용도에 관한 것이다.
간암은 간세포암(HCC)과 간내담도암(iCCA)의 두 가지 주요 조직병리학적 유형이 있다. 그 중 HCC가 약 85% 내지 90%를 차지하며, 현재 말기 HCC는 효과적인 치료법이 없다. 따라서 HCC 고위험 간경화 환자는 선별 검사 진행을 권고한다(Omata M, et al. (2017) Asia-Pacific clinical practice guidelines on the management of hepatocellular carcinoma: a 2017 update. Hepatol Int 11(4): 317-370; Marrero JA, et al. (2018) Diagnosis, Staging and Management of Hepatocellular Carcinoma: 2018 Practice Guidance by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology.). 중국에서는 아시아태평양간학회(APASL)의 가이드라인에 따라 여러 코호트에서 HCC 조기 선별 검사를 진행하며, 간경화 개체와 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 양성 개체는 6개월마다 1회 HCC 모니터링을 권장한다. 여기에는 초음파 검사(US)와 혈청 알파태아단백질(AFP) 검출이 포함된다(Omata M, et al. (2017), 상동). 이전 연구에서 이러한 모델을 사용한 조기 발견 및 조기 치료는 간암의 전체 생존율을 현저하게 향상시켰다(Singal AG, Pillai A, & Tiro J (2014) Early detection, curative treatment, and survival rates for hepatocellular carcinoma surveillance in patients with cirrhosis: a meta-analysis. PLoS medicine 11(4):e1001624.). 그러나 HCC의 정확한 검출에는 경험 있는 전문가가 필요하며, 이는 전체 HBsAg 양성 개체에서의 광범위한 응용을 제한하였다. 또한 연 2회의 선별 검사는 정기 방문 예약 및 불안과도 관계가 있다. 현재 중국의 대다수 HCC 사례는 임상 증상을 기반으로 한 것이지 HCC 선별 검사를 통해 발견된 것이 아니며, 병원 진단 시 이미 말기에 있다.
최근 연구에서 세포 유리 DNA(cfDNA)의 유전적 변화를 기반으로 한 액체 생검은 암의 조기 발견에 우수한 효과를 보여주었다(Bettegowda C, et al. (2014) Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science translational medicine 6(224):224ra224; Chaudhuri AA, et al. (2017) Early Detection of Molecular Residual Disease in Localized Lung Cancer by Circulating Tumor DNA Profiling. Cancer discovery 7(12):1394-1403.). 유전자와 단백질 마커를 결합하면 검출의 민감도와 특이성을 더욱 향상시킬 수 있으며 한 번의 테스트로 여러 종양 유형을 선별 검사할 수 있다(Springer S, et al. (2015) A Combination of Molecular Markers and Clinical Features Improve the Classification of Pancreatic Cysts. Gastroenterology; Cohen JD, et al. (2018) Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science 359(6378):926-930; Cohen JD, et al. (2017) Combined circulating tumor DNA and protein biomarker-based liquid biopsy for the earlier detection of pancreatic cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 114(38):10202-10207.). 그러나 이러한 연구는 주로 HCC 입원 환자와 HBV 감염이 없는 건강한 사람을 대상으로 한 것이다(Cohen JD, et al. (2018), 상동). 만성 HBV 감염이 있는 고위험군에서는 액체 생검 검출의 성능이 영향을 받을 수 있다. 간경화와 같은 일부 전암병터는 HCC에서 흔히 볼 수 있는 드라이버 돌연변이가 있을 수 있기 때문이다. 간염, 간경화 및 비암성 간 결절에 대한 분석은 기준선을 설정하여 영상 또는 조직학적 임상 검증을 통해 HCC를 정확하게 식별하는 것이 필요할 수 있다.
간 기능 손상의 일반적인 원인에는 감염(B형 간염 바이러스 감염 등), 비만, 알코올 중독, 아플라톡신(aflatoxin) 노출, 이상지질혈증 등이 있으며, 간 질환이 있는 환자는 간암 위험이 더 높다. 알파태아단백질(AFP), DCP(Des-gamma carboxyprothrombin), 편평 세포 암종 항원(SCCA)은 모두 간암의 단백질 마커이다. 연구에 따르면 AFP와 DCP의 연합 측정은 간암 예측의 민감도를 향상시키고 조기 간암을 비대상성 간경화와 효과적으로 구별할 수 있음을 보여주었다. 그러나 많은 조기 간암에서 AFP, DCP 및 SCCA 검출 결과는 모두 음성이다.
종양이나 다른 세포는 DNA 분자를 혈액으로 방출하며, 분해되어 유리 DNA 단편(Cellfree DNA, cfDNA)을 형성한다. cfDNA의 검출은 종양 표적 약물 치료, 치료 효과 모니터링 및 조기 암 선별 검사 등 측면에서 큰 잠재력을 보여준다. 중국 간암 환자의 약 90%는 B형 간염 바이러스 감염 배경이 있으며, B형 간염 바이러스 관련 간암은 KRAS, BRAF 등과 같은 핫스팟 돌연변이가 거의 없다.
전술한 바와 같이, 종래에는 AFP와 같은 독립된 단백질 마커가 HCC 조기 선별 지표로 사용되었다. Chun 등은 2015년(Chun S, Rhie SY, Ki CS, Kim JE, & Park HD (2015) Evaluation of alpha-fetoprotein as a screening marker for hepatocellular carcinoma in hepatitis prevalent areas. Annals of hepatology 14(6):882-888)에 독립된 알파태아단백질을 선별 검사 마커로 사용하였다고 보고하였으나, 효과가 좋지 않고 양성 예측값이 약 1% 내지 2%이다.
최근에는 HCC 조기 선별을 위해 단백질 마커와 함께 유전자 변화를 사용하려는 시도도 있다. Joshua D. Cohen 등은 2018년(Cohen J D, Li L, Wang Y, et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test[J].Science, 2018, 359(6378): eaar3247.) 유전자 돌연변이와 단백질 마커를 결합하는 방식을 채택하여 HCC를 포함한 범암종의 조기 선별을 수행한다고 보고하였으나, 이는 HCC와 관련된 경우 TERT 및 그 다양한 형태 및/또는 HBV 융합과 같은 유전자 변화를 사용하지 않는다. 또한 본 연구는 이미 HCC로 진단된 입원환자와 건강한 사람군을 대상으로 한 후향적 연구일 뿐이며, HCC 발생을 예측하고 양성 예측값을 제공하기 위해 HCC 증상이 없는 사람을 대상으로 전향적 연구는 하지 않았다.
종래에 있어서 유전자 변화 또는 단백질 마커는 각각 암 조기 선별에 개별적으로 사용되었다. 일부 사람들은 유전적 변화와 단백질 마커의 조합을 사용해 조기 암을 검진하려는 시도도 있었다. 유리 세포 DNA(cfDNA)와 단백질을 결합한 액체 생검은 다양한 조직 유형에서 조기 암 검출에 대한 가능성을 보여주었다. 그러나 이러한 연구의 대부분은 후향적이며, 이전에 암 진단을 받은 개인을 사례로 건강한 개인을 대조군으로 사용한다. 매우 적은 수의 전향적 연구에 대해서도 간세포암의 경우 종래 기술에서 사용된 마커의 예측 효과는 매우 떨어진다. 여기에서 본 발명은 간세포암 선별 검사(HCC 선별 검사)라는 이름의 액체 생검 측정법을 개발하여 특정 유전자 마커와 단백질 마커를 결합하였으며, 다기관 커뮤니티 인구 집단에서 만성 HBV 감염의 조기 HCC 검출에 대한 응용 가치가 입증되었다. 검증 결과는 상기 방법이 HCC 개체와 비HCC 개체를 안정적으로 구별하며 85%의 민감도와 93%의 특이성을 갖는 것을 보여준다. 발명인은 추가로 전향적 연구를 수행하였으며, 이러한 측정법을 간 초음파 검사와 혈청 AFP 수준이 정상적인 331명의 개체에 적용하였다. 24건의 양성 사례가 확인되었고, 6 내지 8개월의 임상 추적 관찰 후 4건의 사례가 HCC로 진행되었다. 같은 기간의 추적 조사에서 307명의 검사 음성 개체에서 HCC가 진단된 사례는 없었다. 상기 측정법은 검증 세트에서 100% 민감도, 94% 특이성 및 17% 양성 예측 값을 보여주었다. 17%의 양성 예측 값(PPV)은 이전에 AFP 수준 선별 검사를 단독으로 사용하여 얻은 결과보다 현저하게 높다(Chun S, Rhie SY, Ki CS, Kim JE, & Park HD (2015) Evaluation of alpha-fetoprotein as a screening marker for hepatocellular carcinoma in hepatitis prevalent areas. Annals of hepatology 14(6):882-888.). 또한 본 발명에서 특정 유전자 마커와 특정 단백질 마커를 따로 사용하여 얻은 결과보다 높다.
본 발명의 특정 유전자 마커 및 단백질 마커를 포함하는 키트는 비특정 집단에서 HCC 조기 선별에 효과적인 것으로 입증되어, 비특정 집단의 HCC 조기 선별에 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 AFP 음성 피험자의 HCC 조기 선별에 사용될 수 있다.
본 발명의 키트는 전향적 조기 HCC 예측에 사용되며, 4건의 HCC 각각 진단 당시 모두 조기(<3cm)로 후속 치료를 위한 좋은 기반을 제공한다는 점은 주목할 만하다. 발명자의 연구 증거는 cfDNA 변화와 단백질 마커의 결합 검출이 무증상이고 HCC 증상이 알려지지 않은 커뮤니티 집단에서 조기 HCC를 식별하는 실행 가능한 방법임을 보여준다.
따라서 일 양상에 있어서, 본 발명은 간세포암 조기 선별용 키트를 제공하며, 여기에는 유전자 마커 검출제와 단백질 마커 검출제가 포함된다.
상기 키트는 데이터 처리 시스템을 더 포함한다. 상기 데이터 처리 시스템은 유전자 마커 및/또는 단백질 마커의 정보를 상기 시험 대상자의 간세포암 선별 검사 점수로 변환하는 데 사용되며, 상기 시험 대상자의 간세포암 선별 검사 점수에 따라 시험 대상자가 간암 환자인지 여부를 예측한다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 간세포암 조기 선별 방법을 제공한다.
여기에는 (1) 유전자 마커 검출제와 단백질 마커 검출제를 이용하여 피험자의 유전자 마커와 단백질 마커를 검출하는 단계; 및 (2) 상기 유전자 마커와 단백질 마커의 검출 결과를 채택하여 간세포암 선별 검사 점수를 계산하고 임계값과 비교하는 단계가 포함된다.
상기 방법에서 상기 간세포암 선별 검사 점수와 임계값은 간암 예측 모델을 통해 획득한다. 상기 간암 예측 모델의 구축 방법에는 하기 단계가 포함된다.
훈련 세트를 구축하고, 상기 훈련 세트는 복수의 간암 환자와 복수의 간암 고위험 환자로 구성된다.
훈련 세트의 유전자 마커와 단백질 마커를 특징으로 삼아, 검출 결과를 특징 점수로 변환하고, 패널티 로지스틱 회귀 알고리즘을 사용하여 간암 예측 모델을 구축하여 간세포암 선별 검사 점수를 계산한다.
간세포암 선별 검사 점수와 샘플 분류 정보에 따라, 패널티 로지스틱 회귀 모델의 민감도 및 특이성의 ROC 곡선을 획득하며, ROC 곡선에 따라 컷오프 값을 확정한다. 이 컷오프 값을 간암 환자와 간암 고위험 환자를 구분하는 임계값으로 사용한다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 유전자 마커 검출제와 단백질 마커 검출제를 간세포암 조기 선별에 사용하는 용도를 제공한다.
또 다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 유전자 마커 검출제와 단백질 마커 검출제를 간세포암 조기 선별용 키트 제조에 사용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 목적은 간암 조기 선별 검사에 있다.
본 발명은 간암 조기 선별 검사 키트를 제공한다. 여기에는 간암 돌연변이 유전자의 검출 시약, DCP 검출 시약 및 AFP 검출 시약이 포함된다.
상기 "간암 돌연변이 유전자의 검출 시약"은 cfDNA 중 간암 돌연변이 유전자의 돌연변이 유형 및/또는 돌연변이 reads 및/또는 유전자 복제수 변이를 검출하는 데 사용될 수 있다.
상기 "간암 돌연변이 유전자"는 TP53 유전자 및/또는 TERT 유전자 및/또는 AXIN1 유전자 및/또는 CTNNB1 유전자일 수 있다.
상기 DCP 검출 시약은 혈장 중의 DCP 함량을 검출하는 데 사용될 수 있다.
상기 AFP 검출 시약은 혈장 중의 AFP 함량을 검출하는 데 사용될 수 있다.
상기 키트는 HBV가 유전자와 통합되는지 여부에 대한 검출 시약 및/또는 cfDNA 검출 시약을 더 포함할 수 있다.
상기 "HBV가 유전자와 통합되는지 여부에 대한 검출 시약"은 cfDNA에서 HBV 서열과 인간 게놈 사이에 통합 부위가 있는지 여부를 검출하는 데 사용될 수 있다.
상기 "cfDNA 검출 시약"은 cfDNA 농도 및/또는 cfDNA 중 다양한 삽입 단편 길이의 cfDNA 함량 백분율을 검출하는 데 사용될 수 있다.
전술한 어느 하나의 상기 키트에는 데이터 처리 시스템이 더 포함될 수 있다. 상기 데이터 처리 시스템은 시험 대상자의 간암 유전자 변이 정보(즉, 11개 유전자 돌연변이 특성의 정보), DCP 함량(혈장 중의 DCP 함량), AFP 함량(혈장 중의 AFP 함량), HBV가 유전자와 통합되는지 여부, cfDNA 정보 및 임상 정보를 상기 시험 대상자의 간세포암 선별 검사 점수(즉, HCCscreen 점수)로 변환하여 상기 시험 대상자의 간세포암 선별 검사 점수에 따라 시험 대상자가 간암 환자인지 여부를 예측한다.
본 발명은 전술한 어느 하나의 상기 간암 돌연변이 유전자의 검출 시약, DCP 검출 시약, AFP 검출 시약, HBV가 유전자와 통합되는지 여부에 대한 검출 시약 및 cfDNA 검출 시약의 응용을 더 제공한다.
이는 A1) 시험 대상자가 간암 환자인지 여부의 예측;
A2) 시험 대상자가 간암 환자인지 여부 예측용 키트의 제조;
A3) 간암의 예측; 및
A4) 간암 예측용 키트의 제조 중 적어도 하나일 수 있다.
본 발명은 전술한 어느 하나의 상기 간암 돌연변이 유전자의 검출 시약, DCP 검출 시약, AFP 검출 시약, HBV가 유전자와 통합되는지 여부에 대한 검출 시약, cfDNA 검출 시약 및 데이터 처리 시스템의 응용을 더 제공한다.
이는 A1) 시험 대상자가 간암 환자인지 여부의 예측;
A2) 시험 대상자가 간암 환자인지 여부 예측용 키트의 제조;
A3) 간암의 예측; 및
A4) 간암 예측용 키트의 제조 중 적어도 하나일 수 있다.
본 발명은 시험 대상자의 연령, 시험 대상자의 성별, 시험 대상자 혈장 중 DCP 함량, 시험 대상자 혈장 중 AFP 함량 및 "시험 대상자 cfDNA 중 간암 돌연변이 유전자의 돌연변이 유형, 돌연변이 reads, 유전자 복제수 변이, HBV가 유전자와 통합되는지 여부, cfDNA 농도, 상이한 삽입 단편 길이의 cfDNA 함량이 차지하는 백분율"을 마커로 사용하는 응용을 더 제공하다.
이는 A1) 시험 대상자가 간암 환자인지 여부의 예측;
A2) 시험 대상자가 간암 환자인지 여부 예측용 키트의 제조;
A3) 간암의 예측; 및
A4) 간암 예측용 키트의 제조 중 적어도 하나일 수 있다.
본 발명은 간암의 예측 방법을 더 제공한다. 여기에는 시험 대상자 혈장 중 DCP 함량과 AFP 함량을 검출하는 단계; 시험 대상자 cfDNA 중 간암 돌연변이 유전자의 돌연변이 유형, 돌연변이 reads, 유전자 복제수 변이, HBV가 유전자에 통합되는지 여부, cfDNA 농도 및 상이한 삽입 단편 길이의 cfDNA 함량이 차지하는 백분율을 검출하는 단계; 시험 대상자의 연령과 성별을 기록하는 단계; 및 상기 시험 대상자의 정보를 간세포암 선별 검사 점수(즉, HCC screen 점수)로 변환하고, 간세포암 선별 검사 점수에 따라 시험 대상자가 간암 환자인지 여부를 예측하는 단계가 포함될 수 있다.
상기 "간세포암 선별 검사 점수를 기반으로 시험 대상자가 간암 환자인지 예측하는 단계"는 작업 특성 곡선(ROC 곡선)을 통해 진단 임계값을 확정하고, 시험 대상자의 간세포암 선별 검사 점수와 상기 진단 임계값의 크기를 비교하여 시험 대상자의 간암 예측을 완료하는 단계를 포함한다.
시험 대상자의 HCC screen 점수는 간암 예측 모델을 통해 계산하여 획득할 수 있다. 상기 간암 예측 모델은 훈련 세트 중 각 환자의 특징 점수와 분류 정보에 따라 개발한 패널티 로지스틱 회귀 모델이다. 훈련 세트는 복수의 간암 환자(간암군 구성)와 복수의 간암 고위험 환자(간암 고위험군 구성)로 구성된다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 훈련 세트는 65명의 간암 환자와 70명의 간암 고위험 환자로 구성된다.
전술한 어느 하나의 상기 HBV가 유전자와 통합되는지 여부는 HBV와 유전자 통합의 정도, HBV가 TERT 유전자와 통합되는지 여부 및/또는 HBV가 비TERT 유전자(예를 들어 APOBEC4, FBX010, FUT8, WDR7, SLC7A10, GUSBP4)와 통합되는지 여부일 수 있다.
전술한 어느 하나의 상기 간암 돌연변이 유전자의 정보는 간암 돌연변이 유전자의 돌연변이 유형 및/또는 돌연변이 reads 및/또는 유전자 복제수 변이의 정보를 포함한다.
전술한 어느 하나의 상기 cfDNA 정보는 cfDNA 농도 및/또는 cfDNA 중 다양한 삽입 단편 길이의 cfDNA 함량 백분율을 포함할 수 있다. 상기 cfDNA 중 상이한 삽입 단편 길이의 cfDNA 함량이 차지하는 백분율은 구체적으로 유리 DNA 단편 길이 90bp 미만 구간 백분율, 유리 DNA 단편 90 내지 140bp 구간 백분율, 유리 DNA 단편 141 내지 200bp 구간 백분율 및 유리 DNA 단편 200bp 초과 구간 백분율일 수 있다. 구간 백분율은 모든 cfDNA 함량이 차지하는 백분율을 의미한다.
전술한 어느 하나의 상기 임상 정보는 연령 및/또는 성별을 포함할 수 있다.
전술한 어느 하나의 상기 간암 돌연변이 유전자의 검출 시약은 cfDNA를 추출하는 시약(예를 들어 MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit), cfDNA 라이브러리를 구축하는 시약(예를 들어 KAPA Hyper Prep 키트) 및 표적 영역 하이브리드 캡쳐(hybrid capture)를 수행하는 시약(예를 들어 sureselect XT 표적 캡쳐 키트)을 포함한다.
상기 DCP 검출 시약은 혈장 중 DCP 함량을 검출하는 시약일 수 있다. 구체적으로 혈장을 분리하고 미국 애보트(Abbott) ARCHITECT i2000SR 화학 발광 면역 분석기를 이용해 DCP의 함량을 검출한다.
상기 AFP 검출 시약은 혈장 중 AFP 함량을 검출하는 시약일 수 있다. 구체적으로 혈장을 분리하고 미국 애보트 IMx 분석기를 이용해 AFP의 함량을 검출한다.
전술한 어느 하나의 상기 HBV가 유전자와 통합되는지 여부에 대한 검출 시약은 cfDNA를 추출하는 시약(예를 들어 MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit)을 포함할 수 있다.
상기 cfDNA 검출 시약은 cfDNA를 추출하는 시약(예를 들어 MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit)을 포함한다.
상기 내용에서 검출(키트 검출)의 특징은 구체적으로 실시예 중 20개 특징일 수 있으며, 구체적으로 하기와 같다.
가. 상기 "간암 돌연변이 유전자의 검출 시약"에서 검출에 사용되는 특징은 구체적으로 실시예 중의 11개 특징일 수 있다. 각각 TP53 유전자 비-R249S 돌연변이, TERT 유전자 돌연변이, AXIN1 유전자 돌연변이, CTNNB1 유전자 돌연변이, TP53 R249S 핫스팟 돌연변이, CNV 차원 축소 특징 1, CNV 차원 축소 특징 2, CNV 차원 축소 특징 3, CNV 차원 축소 특징 4, CNV 차원 축소 특징 5, CNV 차원 축소 특징 6(즉, 11개의 유전자 돌연변이 특징)이다. 구체적인 단계는 하기와 같다.
1. 검사 대상 혈액 샘플 cfDNA를 추출한다.
2. 상기 검사 대상 혈액 샘플 cfDNA를 취하고, KAPA Hyper Prep 키트를 사용하여 라이브러리를 구축하여, 검사 대상 혈액 샘플의 cfDNA 라이브러리를 획득한다.
3. 상기 검사 대상 혈액 샘플의 cfDNA 라이브러리를 취하고, Sureselect XT 표적 캡쳐 키트를 사용하여 표적 영역 하이브리드 캡쳐를 수행한 후 Illumina 플랫폼에서 시퀀싱을 수행한다. 검사 대상 혈액 샘플 cfDNA 중 간암 돌연변이 유전자의 검출 결과를 획득한다(돌연변이 유전자 및 돌연변이 빈도 포함).
4. 유전자 돌연변이 결과에 주석을 달고 점수를 매긴다.
cfDNA 중 간암 돌연변이 유전자의 검출 결과에 대해 주석을 수행한다. 돌연변이 reads 지지 빈도의 주석 점수이다.
5. 검사 대상 혈액 샘플의 cfDNA 라이브러리를 취하여, 저심도 전장 유전체 시퀀싱을 수행한 후, 시퀀싱 데이터에 대해 CNV 검출과 cfDNA 단편 길이 검출을 수행한다.
6. 유전자 복제수 변이 검출 결과 특징 추출
CNV 검출 결과에 대해 다음 처리를 수행한다. 각 염색체 아암(chromosome arm)의 수준에서 CNV 신호(성염색체가 삭제되어 CNV 신호에 대한 성별의 영향을 제거함)에 대해 주성분 분석(PCA) 차원 축소 처리를 수행하며, 임계값으로 누적 비율(cumulative proportion) ≥95%를 사용한다. 앞 6개 주성분(즉, CNV 차원 축소 특징 1, CNV 차원 축소 특징 2, CNV 차원 축소 특징 3, CNV 차원 축소 특징 4, CNV 차원 축소 특징 5, CNV 차원 축소 특징 6)을 CNV 관련 특징으로 사용하고, CNV 차원 축소 특징 1, CNV 차원 축소 특징 2, CNV 차원 축소 특징 3, CNV 차원 축소 특징 4, CNV 차원 축소 특징 5, CNV 차원 축소 특징 6을 CNV 특징으로 사용하여 후속 계산을 수행하고, 각 CNV 특징에 대응하는 주성분 점수가 바로 상기 특징의 특징 점수이다.
7. cfDNA 단편 길이 검출
저심도 전장 유전체 시퀀싱 데이터는 실시예 중 4개 특징을 분석하는 데 사용될 수 있다. 이는 각각 유리 DNA 단편 길이 90bp 미만 구간 백분율, 유리 DNA 단편 90 내지 140bp 구간 백분율, 유리 DNA 단편 141 내지 200bp 구간 백분율 및 유리 DNA 단편 200bp 초과 구간 백분율이다.
나. 상기 "cfDNA 검출 시약"의 검출에 사용되는 특징은 구체적으로 cfDNA 농도일 수 있다. cfDNA 농도값은 log2를 취하여 변환한 후의 수치를 특징 점수로 사용한다.
다. 상기 "DCP 검출 시약"의 검출에 사용되는 특징은 구체적으로 실시예 중 1개 특징, 즉 혈장 중 DCP 함량일 수 있다.
라. 상기 "AFP 검출 시약"의 검출에 사용되는 특징은 구체적으로 실시예 중 1개 특징, 즉 혈장 중 AFP 함량일 수 있다.
마. 상기 "HBV가 유전자에 통합되는지 여부의 검출 시약"에서 검출에 사용되는 특징은 구체적으로 실시예 중 2개 특징일 수 있으며, 이는 각각 HBV 통합 변이의 상황, 및 HBV와 TERT가 통합 변이되는지 여부(즉, 2개 유전자 돌연변이 특징)이다.
상기 내용에서 돌연변이 부위 통합 및 점수: 각 유전자 돌연변이에 대해, 돌연변이 reads 지원 빈도에 따라 주석 점수를 부여한 후, 돌연변이 부위 점수가 상이한 ROI(Region Of Interest) 구간에 누적된다(즉, 특징 점수를 획득함). 상기 구간은 4개 유전자(TP53, CTNNB1, TERT 및 AXIN1) 및 1개 TP53 R249S 핫스팟 돌연변이 위치 영역을 포함한다. 계산 공식은 하기와 같다.
Figure pct00001
여기에서 n은 ROI 중첩의 돌연변이 수량이고, adj_score는 돌연변이의 reads 지지 빈도이다.
상기 내용에서 구조적 변이 결과 특징 추출 단계는 하기와 같다.
(1) 각 샘플에서 HBV 통합 변이의 특징 점수 검출: 검출된 각 통합 돌연변이에 대해, reads 지원 신뢰성에 따라 A, B, C의 세 가지 레벨로 나눈다(통합 reads 수≥10, A레벨; 10>통합 reads 수>6, B레벨; 나머지는 C레벨, 표 7의 제3열 참고). 각각 대응하는 점수는 1, 0.8 및 0.3이며 합산하여 HBV 통합 변이의 특징 점수를 획득한다.
(2) 각 샘플 HBV와 TERT 통합 변이 특징의 점수 검출: TERT 통합이 발생하면 TERT 통합 변이의 특징 점수는 1이고(reads 지원 신뢰성 레벨을 고려할 필요 없음), TERT 통합이 발생하지 않으면 TERT 통합 변이의 특징 점수는 0이다.
상기 내용에서 유리 DNA 길이 관련 특징 추출 단계는 다음과 같다. 즉, 4개 구간(<90bp, 90 내지 140bp, 141 내지 200bp 및 >200bp)에서 cfDNA 단편 길이가 차지하는 백분율을 계산하고, 이러한 특징을 예측 변수로 사용한다. 4개 구간에서 cfDNA 단편 길이가 차지하는 백분율이 특징 점수이다.
상기 내용에서 단백질 마커 관련 특징 추출의 단계는 하기와 같다.
AFP의 실제 측정값을 임계값(13, 20, 200, 400)에 따라 낮은 것에서 높은 것으로 0, 5, 8, 20, 30의 5가지 수치 레벨로 나눈다. DCP의 실제 측정값을 임계값(40, 60)에 따라 낮은 것에서 높은 것으로 0, 2, 5의 3개 수치 레벨로 나눈다. 이를 2개 단백질 마커의 특징 점수로 사용한다.
또한 임상 및 실험 관련 특징을 기반으로 2개 특징을 추출할 수도 있는데, 임상 특징에는 환자의 연령, 성별이 포함되며 병례 표현형과도 일정한 관련성을 나타낸다. 여기에서 연령의 특징 점수는 샘플의 실제 연령 수치이다. 성별은 남자의 특징 점수가 1이고 여자의 특징 점수가 0이다.
특징은 13개 유전자 돌연변이 특징, 2개 단백질 마커, 5개 cfDNA 물리 특징 및 2개 혈액 샘플의 기본 정보로 구성되는 22개 특징을 포함할 수 있다. 13개 유전자 돌연변이 특징은 각각 TP53 유전자 비R249S 돌연변이, TERT 유전자 돌연변이, AXIN1 유전자 돌연변이, CTNNB1 유전자 돌연변이, TP53 R249S 핫스팟 돌연변이, CNV 차원 축소 특징 1, CNV 차원 축소 특징 2, CNV 차원 축소 특징 3, CNV 차원 축소 특징 4, CNV 차원 축소 특징 5, CNV 차원 축소 특징 6, HBV 통합 변이, HBV와 TERT가 통합 변이되는지 여부이다. 2개 단백질 마커는 각각 AFP와 DCP이다. 5개 cfDNA 물리 특징은 각각 유리 DNA 단편 길이 90bp 미만 구간 백분율, 유리 DNA 단편 90 내지 140bp 구간 백분율, 유리 DNA 단편 141 내지 200bp 구간 백분율, 유리 DNA 단편 200bp 초과 구간 백분율 및 cfDNA 농도이다. 2개 혈액 샘플의 기본 정보는 각각 성별과 연령이다.
암 조기 검출은 암으로 인한 사망을 줄이는 가장 효과적인 방법이다. 최근 연구에서 cfDNA 및/또는 단백질 기반의 액체 생검은 여러 조직 유형에서 암의 조기 검출에 가능성을 보여주었지만(Cohen JD, et al.(2018), 상동), HCC에 대한 우수한 예측 결과가 입증되지는 않았으며, 초기 간암과 고위험군을 구별하는 효과도 입증되지 않았다. 본 연구에서 발명인은 액체 생검 측정법을 개발 및 시험하였다. 바이오마커 선정에 있어서, 빈번하게 변경되고 명확한 발암기전이 있는 TERT 프로모터 변이와 같은 유전 바이오마커, 및 DCP와 같이 진단적 가치가 명확한 단백질 마커에 초점을 맞춰졌다(Lok AS, et al. (2010) Des-gamma-carboxy prothrombin and alpha-fetoprotein as biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Gastroenterology 138(2):493-502.). 본 발명은 HCC와 명백히 관련이 있는 제한된 수의 후보 바이오마커를 한정적으로 포함한다. 제한된 수의 종양/정상 사례에서 대량의 후보 바이오마커를 연구할 때 과적합 효과를 피하기 위해, HCC와 명백히 관련이 있는 소수의 후보 바이오마커를 편입시켰다. 본 발명에서 선정된 유전자 마커와 단백질 마커의 특정 조합을 검증하기 위해 후향적 및/또는 전향적 연구를 위한 연구 도구를 사용함으로써, 상기 특정 조합이 후향적 검증 및 전향적 검증 모두에서 우수한 효과를 획득함을 발견하였다.
따라서 일 양상에 있어서, 본 발명은 AFP 음성 피험자의 간세포암 조기 선별용 키트를 제공하며, 여기에는 유전자 마커 검출제와 DCP 검출제가 포함된다.
상기 키트는 데이터 처리 시스템을 더 포함한다. 상기 데이터 처리 시스템은 유전자 마커 및/또는 단백질 마커의 정보를 상기 시험 대상자의 간세포암 선별 검사 점수로 변환하는 데 사용되며, 상기 시험 대상자의 간세포암 선별 검사 점수에 따라 시험 대상자가 간암 환자인지 여부를 예측한다.
전술한 어느 하나의 상기 유전자 마커 검출제는 TP53 검출제, CTNNB1 검출제, AXIN1 검출제 및 TERT 검출제 중에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 3종 또는 4종을 포함할 수 있다.
전술한 어느 하나의 상기 유전자 마커 검출제는 HBV가 유전자와 통합되는지 여부에 대한 검출 시약을 더 포함할 수 있다.
전술한 어느 하나의 상기 단백질 마커 검출제는 AFP 검출제 및 DCP 검출제 중에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 비특정인 군집의 HCC 조기 선별에 사용될 수 있으며, AFP 음성 피험자와 같은 특정인 군집의 HCC 조기 선별에 사용될 수도 있다. AFP는 혈액 검사와 같은 일상적인 신체 검사에서 일반적인 검사 지표이기 때문에, 피험자의 AFP 상태(음성 또는 양성)가 알려질 가능성이 높다. 따라서 일부 실시방식에 있어서, 본 발명의 키트는 AFP 음성 피험자와 같은 특정인 군집의 HCC 조기 선별에 사용되며, 여기에서 상기 키트에는 AFP 검출제가 포함되지 않는다. 이와 유사하게, 일부 실시방식에 있어서, 본 발명의 키트는 DCP 음성 피험자와 같은 특정인 군집의 HCC 조기 선별에 사용되며, 여기에서 상기 키트에는 DCP 검출제가 포함되지 않는다. 이와 유사하게, 일부 실시방식에 있어서, 본 발명의 키트는 AFP와 DCP 음성 피험자와 같은 특정인 군집의 HCC 조기 선별에 사용되며, 여기에서 상기 키트에는 AFP 검출제와 DCP 검출제가 포함되지 않는다. 따라서 일부 실시방식에 있어서, 본 발명은 AFP 음성 피험자의 간세포암 조기 선별용 키트를 제공한다. 여기에는 유전자 마커 검출제와 단백질 마커 검출제가 포함된다. 바람직하게는 상기 단백질 마커 검출제는 DCP 검출제를 포함한다. 일부 실시방식에 있어서, 본 발명은 DCP 음성 피험자의 간세포암 조기 선별용 키트를 제공한다. 여기에는 유전자 마커 검출제와 단백질 마커 검출제가 포함된다. 바람직하게는 상기 단백질 마커 검출제는 AFP 검출제를 포함한다. 일부 실시방식에 있어서, 본 발명은 AFP와 DCP 음성 피험자의 간세포암 조기 선별용 키트를 포함한다. 여기에는 유전자 마커 검출제가 포함된다. 본 발명에 따른 유전자 마커 검출제는 유전자 마커의 존재 및/또는 유형을 검출할 수 있으며, 여기에는 돌연변이 유형과 돌연변이 reads가 포함된다.
본 발명에 따른 유전자 마커 검출제는 일부 실시방식에서 CNV 검출제를 더 포함한다. CNV 검출제는 통상적으로 전장 유전체 레벨의 CNV를 검출하는 데 사용되지만, 일부 실시방식에 있어서 유전자의 CNV와 같이 국소 레벨을 검출하는 데 사용될 수도 있다. 일부 실시방식에 있어서, 본 발명의 키트는 전장 CNV 레벨을 검출하는 데 사용되는 CNV 검출제를 포함한다. 일부 실시방식에 있어서, 본 발명의 키트는 국소 CNV 레벨을 검출하는 데 사용되는 CNV 검출제를 포함한다. 일부 실시방식에 있어서, 본 발명의 키트는 TERT 유전자의 CNV 레벨을 검출하는 데 사용되는 CNV 검출제를 포함한다. CNV 검출제의 사용은 HCC 선별 검사의 민감도와 특이성을 더 향상시킬 수 있다. 일부 실시방식에 있어서, CNV 검출 결과는 CNV 차원 축소 특징 1, CNV 차원 축소 특징 2, CNV 차원 축소 특징 3, CNV 차원 축소 특징 4, CNV 차원 축소 특징 5 및/또는 CNV 차원 축소 특징 6으로 변환될 수 있다.
전술한 바와 같이, 용어 "유전자 마커 검출제"는 유전자 마커를 검출하는 데 사용되는 검출제이며, 당업자가 익히 알고 있는 바와 본원에서 기술한 바가 포함된다. 이에 상응하도록 용어 "TP53 검출제", "CTNNB1 검출제", "AXIN1 검출제" 및 "TERT 검출제"는 각각이 가리키는 유전자 마커를 검출하는 데 사용되는 검출제이며, 당업자가 익히 알고 있는 바와 본원에서 기술한 바가 포함된다. TP53, CTNNB1, AXIN1 및 TERT는 TERT 프로모터 돌연변이와 같이 당업계의 일반적인 유전자 마커로서 당업자에게 잘 알려져 있다. 일부 실시방식에 있어서, TP53은 전체 길이가 검출된다. 일부 실시방식에 있어서, TP53의 하나 또는 복수의 엑손이 검출된다. 본 발명의 일부 양상은 TP53의 하나 이상의 엑손을 검출할 뿐만 아니라 TP53의 전체 길이를 검출하는 것을 특징으로 한다.
당업자는 본 발명에서 언급하는 유전자가 유전자 마커로 사용될 때 시퀀싱에 의해 수득된 서열의 전부 또는 일부와 이에 상응하는 야생형 서열 사이에 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드 차이를 사용하며, 특정 부위에 국한되지 않는다는 것을 용이하게 인식할 수 있다. TP53, CTNNB1, AXIN1 및 TERT 유전자가 유전자 마커로 사용되는 경우, 전장 상에서 상응하는 야생형 서열 사이에 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드 차이가 있을 수 있다. TP53 유전자가 유전자 마커로 사용되는 경우 특정 핫스팟(예를 들어 R249S)과 해당 야생형 서열 사이에 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드 차이가 있을 수 있다. TERT 유전자가 유전자 마커로 사용되는 경우 특정 핫스팟(예를 들어 chr5:1295228C>T 또는 chr5:1295250C>T)과 그 상응하는 야생형 서열 간에 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드 차이가 더 있을 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 마커 검출제는 일부 실시방식에서 HBV 통합 검출제를 더 포함한다. 전술한 바와 같이, "HBV 통합 검출제"라는 용어는 HBV가 게놈에 통합되는지 여부를 검출하기 위한 시약이다. 일부 실시방식에 있어서, 게놈에서 HBV의 통합은 게놈에서 TERT 근처, 예를 들어 TERT의 업스트림 1.5kb 내에서 HBV의 통합, 및 게놈의 다른 위치에서 HBV의 통합을 포함할 수 있다.
일부 실시방식에 있어서, 피험자의 유전자 마커는 피험자의 cfDNA로부터 검출된 것이다. 일반적으로 본 명세서에 기재된 유전자 마커 검출제를 사용하여 유전자 마커를 검출하는 경우, 사용 과정 또는 검출 과정은 cfDNA 추출 및 검출을 포함하며, 이를 통해 cfDNA 관련 정보를 획득한다. 예를 들어 cfDNA 농도 및/또는 cfDNA 중 상이한 삽입 단편 길이가 cfDNA 함량을 차지하는 백분율 및/또는 cfDNA 길이 검출제를 포함한다. 따라서 일부 실시방식에 있어서, 본원에 기재된 "유전자 마커 검출제" 및 그 하위 개념은 마찬가지로 cfDNA 검출제의 작용을 나타낼 수 있으므로, "cfDNA 검출제"와 호환 사용될 수 있다. 다른 일부 실시방식에 있어서, 본 발명의 키트는 cfDNA 검출제를 더 포함한다.
전술한 바와 같이, 용어 "단백질 마커 검출제"는 단백질 마커를 검출하는 데 사용되는 검출제이며, 당업자가 익히 알고 있는 바와 본원에서 기술한 바가 포함된다. 이에 상응하여 용어 "AFP 검출제" 및 "DCP 검출제"는 각각 가리키는 단백질 마커를 검출하는 데 사용되는 검출제이며, 당업자가 익히 알고 있는 바와 본원에서 기술한 바가 포함된다. AFP와 DCP는 당업계에서 일반적인 단백질 마커로서 당업자가 익히 알고 있는 것이다.
일부 실시방식에 있어서, 피험자의 단백질 마커는 피험자의 혈액 또는 혈청 또는 혈장과 같은 성분으로부터 검출된 것이다. 일부 실시방식에 있어서, 키트는 혈액 추출 용구를 더 포함한다.
본 발명의 키트는 데이터 처리 시스템을 더 포함하거나, 데이터 처리 시스템과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어 데이터 처리 시스템은 컴퓨터에 포함될 수 있다. 상기 데이터 처리 시스템은 본 발명에 따른 유전자 마커 검출제 및/또는 단백질 마커 검출제의 검출 결과를 처리하는 데 사용된다. 일부 실시방식에 있어서, 데이터 처리 시스템은 상기 유전자 마커와 단백질 마커의 검출 결과를 채택하여 간세포암 선별 검사 점수를 계산한다. 일부 실시방식에 있어서, 데이터 처리 시스템은 간세포암 선별 검사 점수와 임계값을 비교한다. 일부 실시방식에 있어서, 데이터 처리 시스템은 HCC 추정 및/또는 검증 및/또는 예측하는 데 사용된다. 바람직하게는 간세포암 선별 검사 점수를 임계값과 비교한다.
상기 HCC 선별 검사를 채택하여, 본 발명은 조기 HCC를 가진 개체를 식별하고 간경화를 포함한 만성 간 질환을 가진 비HCC 개체와 이를 구별하는 것이 가능하다는 것을 발견했다. 상기 측정법은 초음파로 간 결절 및/또는 혈청 AFP가 상승한 개인의 HCC 진단에서 85%의 민감도와 93%의 특이성을 검출하였다. 더 중요한 것은 성능도 AFP/US 음성 검증 세트에서도 유지되어 민감도와 특이성이 각각 100%와 94%라는 점이다. 현재 민감도는 제한된 수량의 HCC 사례를 기반으로 한다. 추가 HCC 사례가 확인되면, 이는 모든 개체의 장기 추적 관찰 또는 동적 CT/MRI 검출에 따라 변경될 수 있다. 이 경우, 추적 관찰 시간을 기반으로 민감도와 특이성을 결정하려면 전향적인 대규모 임상 시험이 필요하다. 그러나 검증 세트에서 현재 17%의 양성 예측 값(PPV)은 이전에 AFP 수준 선별 검사를 단독으로 사용하여 얻은 것보다 현저하게 높다(Chun S, Rhie SY, Ki CS, Kim JE, & Park HD (2015) Evaluation of alpha-fetoprotein as a screening marker for hepatocellular carcinoma in hepatitis prevalent areas. Annals of hepatology 14(6):882-888.).
따라서 다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 다음을 포함하는 간세포암 조기 선별 방법을 제공한다.
(1) 피험자의 유전자 마커와 단백질 마커를 검출한다.
(2) 상기 유전자 마커와 단백질 마커의 검출 결과를 사용하여 간세포암 선별 검사 점수를 계산하고 임계값과 비교한다.
1차 테스트에서 양성인 경우에 2차 HCC 선별 검사를 실시하면 PPV가 더욱 개선될 수 있다. 높은 PPV는 비 HCC 개체의 불필요한 불안과 후속 검사를 줄여주기 때문에 일상적인 임상 적용에 매우 유용하다.
따라서 다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 다음을 포함하는 간세포암 조기 선별 방법을 제공한다.
(1) 피험자의 유전자 마커와 단백질 마커를 검출한다.
(2) 상기 유전자 마커와 단백질 마커의 검출 결과를 사용하여 간세포암 선별 검사 점수를 계산하고 임계값과 비교한다.
(3) 간세포암 선별 검사 점수가 임계값보다 높으면, 일정 시간 후 상기 피험자에 대해 단계 (1) 및 (2)를 1회 이상 반복 수행한다.
일 실시방식에 있어서, 피험자의 유전자 마커는 피험자의 cfDNA로부터 검출된 것이다. 즉, 방법에는 피험자의 cfDNA 추출 단계가 포함된다.
일 실시방식에 있어서, 피험자의 단백질 마커는 피험자의 혈액으로부터 검출된 것이다. 즉, 방법에는 피험자의 혈액, 바람직하게는 혈청 또는 혈장을 채취하는 단계가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "일정 시간"은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시방식에 있어서, 계산된 간세포암 선별 검사 점수와 비교하는 데 사용되는 임계값은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0이다. 일 바람직한 실시방식에 있어서, 임계값은 0.4이다. 일 바람직한 실시방식에 있어서 임계값은 0.5이다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 유전자 마커 검출제와 단백질 마커 검출제를 간세포암 조기 선별에 사용하는 용도를 제공한다.
또 다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 유전자 마커 검출제와 단백질 마커 검출제를 간세포암 조기 선별용 키트 제조에 사용하는 용도를 제공한다.
당업자는 본원에 기재된 키트를 설명할 때의 특징, 파라미터 및 효과 등이 모두 본 발명의 방법 또는 용도의 임의의 다른 측면과 적절하게 조합될 수 있음을 이해한다.
종양 크기는 진단 시 중요한 임상 파라미터로, HCC 환자의 생존에 영향을 미친다. 단백질 또는 RNA 기반의 바이오마커와 달리, 종양 세포는 대부분의 경우 통상적으로 하나의 복제된 돌연변이 DNA만 포함한다. cfDNA 기반의 조기 검출 선별 검사의 기본적인 문제는, 초기 종양이 순환계에서 검출될 정도로 복제된 돌연변이 DNA를 충분히 방출하는지 여부이다. 본 연구에서 HCC 선별 검사를 통해 확인된 모든 HCC 중 85%와 68%는 각각 5cm 미만 및 3cm 미만이다. 5cm 미만의 HCC 종양은 초기 단계로, 근치적 수술에 적합하다. 3cm 미만의 종양이 있는 환자는 더 나은 결과를 얻을 수 있으므로, HCC 발병률 및 사망률을 줄이는 HCC 선별 검사의 가치를 강조하였다. 검증 세트에서, 본 발명은 AFP/US 음성 군집으로부터 4개의 HCC를 식별하였으며, 이는 2 내지 3cm 크기였다. 이러한 결과에서 알 수 있듯이, HCC 선별 검사의 민감도는 조기 HCC 검출에 우수한 전망을 갖고 있다.
이상적인 종양 선별 검사 방법은 민감도와 특이성이 높아야 하며 임상에서 쉽게 시행할 수 있어야 한다. 본 HCC 선별 검사 측정법은 코딩 영역의 돌연변이와 미지의 중단점을 가진 전좌/HBV 통합을 검출하며, 비용은 150달러 미만이다. 또한 상기 액체 생검 측정법은 집중화되고 표준화된 처리일 수 있으며, 지역 병원/클리닉에서 최소한의 전문 지식과 장비가 필요하다. 일반적으로 상기 방법은 고위험군에서 HCC 선별 검사를 위한 일반적인 검사로 매우 적합하다.
본 발명의 연구에 의해 제공된 증거는 고위험 집단에서 cfDNA 돌연변이 및 단백질 마커에 기초한 선별 검사가 HCC 환자를 식별하는 데 효과적임을 보여준다. 이는 비침습적이며 조기 및 말기 종양을 검출할 수 있다. 더 중요한 것은 드라이버 유전자의 체세포 돌연변이가 대부분의 암 진행에서 흔하기 때문에, 상기 전략은 단일 혈액 튜브에서 다른 종양 유형 또는 여러 종양 유형의 조기 선별 검사를 위해 수정될 수 있다는 것이다.
본 발명의 키트는 다른 치료제를 더 포함할 수 있다. 본 발명은 방법은 다른 치료제를 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 실시방식에 있어서, 상기 다른 치료제는 당업계에서 공지된 암(예를 들어 간세포암) 치료제이다.
본 출원에서 일련의 나열된 값의 모든 부분이 나타나는 경우, 임의 나열된 값은 수치 범위의 상한 또는 하한이 될 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명은 이러한 모든 수치 범위, 즉 상한 수치 및 하한 수치가 조합된 하나의 범위를 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 여기에서 상한 및 하한 각각의 수치는 본 발명에 나열된 임의의 수치일 수 있다. 본 발명에서 제공하는 범위는 상기 범위 내의 모든 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어 1 내지 10은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 중 전부를 포함하며 상황에 따라 분수값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. "많아야(up to)" 특정 값(예를 들어 많아야 5)으로 표현된 범위는 모든 값(상기 범위의 상한 포함), 예를 들어 0, 1, 2, 3, 4 및 5이며, 상황에 따라 분수값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 많아야 1주 또는 1주 이내는 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이와 유사하게, "적어도"에서 한정하는 범위는 제공되는 비교적 낮은 값과 모든 더 높은 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
달리 명시되지 않는 한 모든 백분율 형태는 중량/중량이다.
본 발명에서 "약"은 평균값의 3개 표준편차 이내 또는 특정 영역에서의 표준허용범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 특정 실시방식에 있어서, 약은 0.5를 초과하지 않는 돌연변이로 이해되어야 한다. "약"은 이후 모든 나열된 값을 수정한다. 예를 들어 "약 1, 2, 3"은 "약 1", "약 2", "약 3"을 나타낸다.
관사 "하나(a)" 및 "1개(an)"는 본 발명에서 하나 이상(즉, 적어도 하나)의 상기 관사의 어법 대상을 나타내는 데 사용된다. 예를 들어 "하나의 요소"는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본 발명에서 "포함"이라는 용어는 "포함하지만 이에 한정되지 않는"이라는 문구를 지칭하기 위해 사용되며, 이와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 "또는"이라는 용어는 문맥상 명백하게 달리 명시되지 않는 한, "및/또는"이라는 용어를 지칭하기 위해 포괄적으로 사용되며, 이와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 "예를 들어"라는 용어는 "예를 들지만 이에 한정되지 않는"이라는 문구를 지칭하기 위해 사용되며, 이와 혼용될 수 있다.
당업자는 상기 각 실시예에서 설명된 기술적 특징이 단독으로 또는 본 발명의 다양한 측면의 기술적 해결책과 조합되어 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 일부 실시방식은 하기 비제한적 실시예에 의해 설명된다.
조기 간암 선별 검사 마커는 다수가 단백질 또는 유전자 메틸화 정보이다. 본 발명은 신규한 간세포암 선별 검사(HCC 선별 검사) 방법을 보고하였다. 상기 방법은 혈청 단백질 마커와 cfDNA 변화 모두의 검출을 기반으로 하며, 만성 HBV 감염이 있는 다기관 커뮤니티 집단의 조기 HCC 검출 시 유용함을 검증하였다. 본 발명의 발명인은 대량의 실험을 통해 처음으로 혈장 중 cfDNA의 유전자 돌연변이 정보를 검증하여 조기 HCC 예측에 사용할 수 있다. 발명인은 간암 예측 모델을 이용하여 시험 대상자를 채점하고, 점수값을 통해 시험 대상자가 간암 환자인지 여부를 예측함으로써, 본 발명의 유전자 마커와 단백질 마커의 조합으로 HCC 조기 선별을 효과적으로 수행할 수 있음을 검증하였다. 여기에서 알 수 있듯이, cfDNA 검출을 통한 간암에 대한 조기 검진, 질병 추적, 치료효능 평가 및 예후 예측 등은 중요한 임상적 의의가 있다.
도 1은 연구 설계 방안이다. 사람 모집, HCC 선별 검사 모델의 훈련 및 샘플링의 AFP/US 음성 개체 중의 검증이 포함된다.
도 2는 상세한 연구 설계 방안이다.
도 3은 HCC 선별 검사 측정법 중 cfDNA의 유전자 스펙트럼 분석의 설계이다.
도 4는 훈련 세트와 검증 세트에서 HCC 선별 검사의 표현이다. 여기에서 A는 훈련 세트에서, 진단 모델에서, HCC 선별 검사 점수 및 cfDNA와 단백질 바이오마커의 기여도이다. B는 훈련 세트의 진단 모델의 이원 결과이다. C는 훈련 세트에서 HCC 선별 검사의 진단 모델의 ROC 곡선이다. D는 검증 세트에서 진단 모델의 HCC 선별 검사 표현이다. E는 검증 세트 중 HCC 선별 검사 양성 사례의 추적 검사와 진단이다. F는 검증 세트 중 진단 모델의 2원 결과이다. G는 AFP/US 음성 개체에서 HCC 선별 검사로 검출한 4개 HCC 사례의 동적 CT 영상이다.
도 5는 상이한 훈련 세트의 표현이다. 여기에서 A는 HBV 감염이 없는 건강한 개체를 대조군으로 한 훈련 세트에서 HCC 선별 검사 진단 모델의 ROC 곡선이다. B는 HCC와 비HCC 개체로 수행한 훈련(왼쪽)과 HCC와 건강한 개체로 수행한 훈련(오른쪽)이다.
도 6은 간암 예측 모델의 ROC 곡선이다.
도 7은 상이한 그룹 모델 점수 비교도이다.
이하의 실시예는 본 발명의 더 나은 이해를 돕기 위한 것으로 본 발명을 제한하지 않는다.
이하의 실시예에 사용된 실험 방법은 달리 명시되지 않는 한 모두 일반적인 방법이다.
이하의 실시예에 사용된 시험 재료는 달리 명시되지 않는 한 모두 일반적인 생화학 시약 판매점에서 구입한 것이다.
이하의 실시예에 사용된 정량 시험은 모두 3회 반복 실험으로 설정되었으며 결과는 평균값을 취하였다.
하기 실시예에 있어서, 각 간암 환자, 각 간암 고위험 환자 및 건강한 지원자는 모두 본 연구의 내용에 대해 사전 동의하였다.
MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit는 Thermo Fisher사의 제품이다. KAPA Hyper Prep 키트는 KAPA사의 제품이다. Sureselect XT 표적 캡쳐 키트는 Agilent사의 제품이다.
하기 실시예에서 일부 간암 환자, 간암 고위험 환자 및 건강한 지원자의 기본 정보는 표 1과 같다.
표 1
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
각주: "-"는 기록이 없거나 종양이 검출되지 않았음을 의미하며, 종양 크기는 종양 부피, 종양 최대 직경 또는 종양 최대 횡단면적이다.
윤리 선언
커뮤니티 집단으로 수행한 조기 HCC 선별 검사 프로젝트를 기반으로 본 발명인은 2017년에 간암 고위험군에 대한 커뮤니티 기반 코호트 연구(CCOP-LC 코호트, 중국 임상등록, ChiCTR-EOC-17012835)를 구축하였다. 상기 연구방안(NCC201709011)은 중국암센터/국가종양임상의학연구센터/중국의학과학원 종양병원 기관심사위원회의 승인을 받았다.
커뮤니티 집단의 조기 HCC 선별 검사 프로젝트의 개요
조기 HCC 선별 검사는 위생부질병예방통제센터의 중국암 조기검출 및 조기치료 전문가위원회에서 발표한 "암 조기진단 및 조기치료 기술방안"을 기반으로 한다(Shia YC, Beever JE, Lewin HA, & Schook LB (1991) Restriction fragment length polymorphisms at the porcine t complex polypeptide 1 (TCP1) locus. Anim Genet 22(2):194.). 모든 선별 검사 센터에 군집 기반의 암 등록처 및 인구동적통계부문을 설치하였다(Chen W, et al. (2018) Cancer incidence and mortality in China, 2014. Chinese journal of cancer research = Chung-kuo yen cheng yen chiu 30(1):1-12.). 요컨대, 35 내지 69세 HBsAg 양성의 "건강한" 개체가 조기 HCC 선별 검사에 참여하도록 초대되었다. 모든 참가자는 혈청 AFP 농도 측정 및 초음파 검사(미국, Aloka ProSound SSD-4000, 중국 상하이) 및 기타 표준 생화학 검사를 받았다(표 2). 혈청 AFP 수치 및 간 결절 검출을 기반으로, 개체를 AFP/US 양성, 의심 또는 음성으로 지정한다. "AFP/US 양성" 개체는 1) 초음파에 의해 검출된 결절이 고려되지 않고 혈청 AFP 수준이 >400ng/mL인 경우, 2) 혈청 AFP 농도가 고려되지 않고 초음파로 검출된 결절이 2cm 이상인 경우, 3) 초음파로 검출된 결절이 1cm 이상이고 혈청 AFP가 200ng/ml 이상인 경우 중 어느 하나를 갖는다. "AFP/US 의심" 개체는 1) 초음파로 검출된 간 결절을 고려하지 않고, 혈청 AFP 수치가 20ng/ml 이상인 경우, 2) 초음파로 검출된 결절이 1cm 이상인 경우 중 어느 하나를 갖는다. "AFP/US 음성" 개체는 혈청 AFP 수준이 <20ng/mL이고 초음파에 의해 검출된 간 결절이 없는 것으로 정의된다. AFP/US 양성 개체는 고급 병원(중국 3차 병원)에 진단이 의뢰된다. 예를 들어 동적 CT 또는 동적 MRI로 간암이 확인된 환자는 임상 진료 지침에 따라 관련 치료를 받게 된다(도 1)(Omata M, et al. (2017) Asia-Pacific clinical practice guidelines on the management of hepatocellular carcinoma: a 2017 update.Hepatol Int 11(4):317-370.). 진단되지 않은 개체는 2개월 이내에 동적 CT/MRI 검사를 위해 다시 방문하도록 초대된다. AFP/US 의심 개체는 2 내지 3개월 이내에 2차 혈청 AFP 정량 검사 및 초음파 검사를 받는 것이 권장된다.
표 2 AFP/US 선별 검사와 액체 생검 분석 참가자의 일반 정보
Figure pct00005
* 총 3255명 참가자가 HBV-DNA 농도 평가에 참여하였다.
† 모든 HCC 선별 검사 참가자에 대해 ‡로 표시된 P 값 외에 Chi-square tests를 사용하였다.
‡ Fisher's exact tests를 수행하고 모든 HCC 선별 검사 참가자와 비교한다.
참가자와 연구 설계
현재 연구의 참가자는 중국 장쑤성과 안후이성의 4개 선별 검사 센터에서 평가한 개체의 CCOP-LC 코호트에서 얻었다(도 1). AFP/US 선별 검사 기간(기준선 고려, 2017년 10월 7일 ~ 2018년 1월 31일 진행) 동안, 본 발명인은 말초혈액(EDTA 코팅 튜브에 5mL)을 채혈하였다. 이는 수집 후 2시간 이내에 4000g로 10분간 원심분리하여 혈장과 혈액 세포를 분리한다. 모든 샘플은 -80℃에서 보관된다. 대부분의 경우 0.5mL의 혈장이 단백질 마커 측정에 사용되며, 2mL 혈장이 cfDNA 추출에 사용된다.
HCC 선별 검사 측정법에서 176개의 AFP/US 양성/의심 사례가 추가로 분석되었다. 추적 검사에서 진단한 결과에 따라 진단이 확실한 참가자를 본 연구의 훈련 세트로 선정하였다. 본 발명인의 발견을 검증하기 위해, 본 발명은 AFP/US 음성 개체로부터 331명의 참가자를 샘플링하며, 이 참가자의 연령은 HCC 선별 검사 측정법 중 AFP/US 양성/의심 개체와 유사하다. 2018년 5월 20일부터 7월 17일까지(기준선 채혈 후 6 내지 8개월), 동적 CT/MRI, AFP/초음파 검사 또는 전화 인터뷰를 통해 331명의 개체를 추적했다. CT/MRI 이미지는 베이징 중국의학과학원 국가암센터의 두 명의 방사선 전문의가 독립적으로 평가했다. 이 기간 동안, 본 발명은 기준선에서 AFP/US 음성이고 HCC 선별 검사를 받지 않은 개체에 대한 추가 AFP/US 테스트를 제공하였다. 이들 중 일부는 추가 AFP/US 검사를 선택하지 않았고, 그들의 2018년 6월 30일 이전의 간암 결과(ICD-10 코드 C22)는 선별 검사 센터의 그룹 기반 암등록처에서 얻었다(도 1). AFP/US 음성인 3,617명 중 1,612명(44.6%)이 2018년 5월 20일부터 7월 17일까지, 즉 기준선 선별 검사 6 내지 8개월 후 추적하였다. 이 중 87명이 동적 CT/MRI, 1120명이 AFP/US, 68명이 전화 인터뷰를 받았다. 337명의 참가자의 간암 결과는 현지 그룹 기반 암 등록처에서 얻었다(도 2). 다른 2005명 참가자의 HCC 상태는 2018년 6월 30일 이전에 확인할 수 없었다(도 2).
연간 신체 검사를 받았고 HBV 감염이 없다고 보고된 사람들로부터 70명의 건강한 대조군을 얻었다. 헌혈 당시 모두 HBsAg 음성으로 확인됐다.
혈청 DCP 농도의 측정
제조업체의 지침(Abbott Laboratories; Chicago, IL, USA)에 따라 Abbott ARCHITECT i2000SR 화학 발광 면역 분석기(CLIA)에서 상업용 키트를 사용하여 혈청 DCP 수준을 측정하였다.
cfDNA 변경의 스펙트럼 분석
발명인은 스펙트럼 분석을 위해 cfDNA를 서열화하는 실험을 설계했다. 즉, 1) TP53, CTNNB1, AXIN1 코딩 영역 및 TERT 프로모터 영역(표 3), 2) HBV 통합이다. 간단히 말해 먼저 cfDNA 단편을 랜덤 DNA 바코드가 있는 어댑터에 연결한다(도 3). 연결된 구조체는 10개 반응 순환을 통해 증폭되어 전체 게놈 라이브러리를 생성하며, 수백 개의 리던던시 구조체가 포함되며, 각각 원시 cfDNA 단편을 인식하는 고유한 DNA 바코드가 있다. 증폭된 라이브러리는 5 내지 10개의 독립적인 시퀀싱 분석을 수행하기에 충분하다. 표적 영역은 표적 특이성 프라이머(TS 프라이머 1)와 어댑터 서열에 매칭되는 프라이머(Perera BP & Kim J (2016) Next-generation sequencing-based 5' rapid amplification of cDNA ends for alternative promoters. Analytical biochemistry 494:82-84; Zheng Z, et al. (2014) Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature medicine 20(12):1479-1484.)(도 3)를 사용하는 PCR의 9개 순환 중 DNA 바코드와 함께 증폭되는 것이다. 어댑터 및 표적 영역과 매칭되는 한 쌍의 네스티드 프라이머(TS 프라이머 2)를 사용하여 제2차 15개 순환의 PCR을 수행하여, 표적 영역을 더욱 풍부하게 하고 Illumina 시퀀싱 어댑터를 추가한다(도 3). 상기 PCR 기반 측정법에서 효과적인 농축이 관찰되었으며, reads의 >80%가 <10Kb의 작은 표적 영역에 맵핑되었다. 상기 측정법을 사용하여 본 발명은 3Gb 시퀀싱 데이터로 100,000회가 넘는 표적 영역을 커버할 수 있어, 5,000개 복제의 원시 cfDNA의 20x 리던던시 시퀀싱이 가능하다. DNA 바코드가 원시 cfDNA 분자에 연결된 경우, 원시 cfDNA 분자로부터의 리던던시 reads를 추적하여 PCR 증폭 및 병렬 돌연변이 시퀀싱 고유의 호출 오류(calling error)를 최소화할 수 있다(Kinde I, Wu J, Papadopoulos N, Kinzler KW, & Vogelstein B (2011) Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108(23):9530-9535; Chaudhuri AA, et al. (2017) Early Detection of Molecular Residual Disease in Localized Lung Cancer by Circulating Tumor DNA Profiling. Cancer discovery 7(12):1394-1403.). 본 발명은 디지털 PCR을 이용하여 이번 측정법에서 검출된 11개의 돌연변이를 확인하였으며, 0.03 내지 0.16%의 돌연변이 점수를 이용해 이러한 돌연변이를 모두 검증하였다.
표 3 HCC 선별 검사 특징 및 그 계수의 특성
Figure pct00006
패널티 로지스틱 회귀: λ=0.14, α=0.
데이터 처리와 돌연변이 검출
시퀀싱 reads는 처리를 통해 태그를 추출하고 시퀀스 어댑터를 제거한다. 그런 다음 Trimmomatic(v0.36)을 사용하여 잔여 어댑터와 품질이 낮은 영역을 제거한다. 기본 파라미터를 갖는 'bwa(v0.7.10) mem'을 사용하여(Li H & Durbin R (2010) Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 26(5):589-595.) 청결한 reads를 hg19와 HBV 게놈에 맵핑한다. samtools mpileup(Li H, et al. (2009) The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 25(16):2078-2079.)을 사용하여 관심 대상 영역에서 SNP 및 INDEL로 구성된 후보 돌연변이를 감정한다. 정확성을 보장하기 위해 동일한 태그와 시작 및 끝 좌표를 가진 reads는 고유 식별자(Unique Identifier) 패밀리(UID 패밀리)로 분류한다. 적어도 2개의 reads를 함유하고 적어도 80%의 reads 유형이 동일한 UID 패밀리는 유효한 고유 식별자(Effective Unique Identifier) 패밀리(EUID 패밀리)로 정의한다. 대체성 EUID 패밀리의 수를 대체성과 참가자의 총합으로 나누어 각 돌연변이의 빈도를 계산한다. IGV에서 수동으로 돌연변이를 추가로 검사한다. Ensembl Variant Effect Predictor(VEP)를 이용해 후보 변이체에 주석을 단다(Wang J, et al. (2011) CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat Methods 8(8):652-654). Crest를 사용하여 HBV 통합을 감정하고(McLaren W, et al. (2016) The Ensembl Variant Effect Predictor. Genome biology 17(1):122.), 적어도 4개의 소프트클립 서열 지지(soft-clip reads supports)가 필요하다.
모델 구축
1. 특징 맵핑과 데이터 전처리
1) 돌연변이 주석과 점수:
돌연변이 빈도(후보 돌연변이를 지지하는 reads의 점수)는 혈액 내 순환하는 종양 DNA의 총량 및 종양 크기에 매우 비례한다. 따라서 본 발명은 그 reads 지지 빈도를 이용하여 모든 입력 돌연변이에 대한 주석을 단다.
2) 돌연변이의 분해
돌연변이를 유전자 수준 또는 응집 영역으로 분해하여 다양한 유전적 특징을 추출한다. 각 관심 영역(ROI)에 대해 ROI 점수가 계산된다.
Figure pct00007
여기에서 n은 ROI 중첩의 돌연변이 수량이고, adj_score는 돌연변이의 reads 지지 빈도이다.
3) 단백질과 실험 마커
이전 연구에서 HCC 진단을 위한 매우 강한 지표로 나타났기 때문에 본 발명의 모델에서 두 개의 단백질 마커인 DCP와 AFP를 사용한다(Chen H, et al. (2018) Direct comparison of five serum biomarkers in early diagnosis of hepatocellular carcinoma. Cancer management and research 10:1947-1958.). 이러한 값은 여러 숫자 분류로 레벨이 나뉜다. cfDNA 농도도 본 발명의 모델 특징 목록에 포함된다.
4) 특징으로서의 임상 정보
HCC 진단의 가능성이 개체의 연령 및 성별과 어느 정도 관련이 있는 것으로 나타났기 때문에, 환자의 연령 및 성별도 본 발명의 예측자의 일부를 구성한다.
2. 특징 선택
RandomForest는 후보 특징에서 유용한 변수를 선별하는 데 사용된다. 발명인은 편향되지 않은 out-of-bag 오류 추정(unbiased out-of-bag error estimation)을 최소화하여 역방향 변수 감산법(backward variables subtraction)을 응용해 매회 운행에서 하나의 특징을 제거한다. 그 후 단백질, 유전자 마커 및 임상 정보를 최적화하여 이원 분류기의 최종 특징을 구축한다. 건강한 개체와 비교한 HCC의 훈련에서는 ctDNA SNP/indel 돌연변이 및 단백질 마커만 사용한다. 건강군은 HBV 감염이 없었기 때문에 HBV-TERT 융합 또는 기타 HBV 통합은 포함하지 않는다.
3. 모델과 파라미터 최적화
패널티 로지스틱 회귀 모델은 65개의 HCC와 70개의 비HCC의 135개 샘플을 포함하는 훈련 세트로 구성된다. AUC(area under the curve) 통계를 통해 모델 성능은 훈련 및 검증 데이터 세트 모두에서 평가된다. 모델의 민감도와 특이성은 최적화된 컷오프 값 0.4를 더 사용하여 확정한다. 컷오프 값의 최적화를 위해 Youden 지수를 사용한다. 유전자, 단백질 및 CNV 수준에 대한 클러스터 분석을 각각 수행하기 위해, 패널티 로지스틱 회귀를 사용한 각 특징의 교차 검증 계수를 더 제공한다. 상기 모델은 R 패키지 'glmnet'(R 버전 3.5.1)에서 가동되며, 패널티 파라미터 α는 훈련 데이터 세트 내에서 10배 교차 검증을 통해 최적화되고, 최적화된 값은 0이다.
통계 분석
본 발명은 ctDNA 돌연변이, 단백질 바이오마커 수준 및 임상 특성을 변수로 하는 패널티 로지스틱 회귀 모델을 사용한다. 본 발명인은 AFP/US 양성 및 AFP/US 의심 개체에서 동적 CT/MRI 및/또는 조직학이 있는 HCC 사례 및 비HCC 사례를 정의하였다(도 1). HCC 65건과 비HCC 70건의 훈련 데이터 세트에 대해 LOOCV(Leave-One-Out Cross Validation)를 100회 번갈아 수행하여 HCC 선별 검사 측정법의 민감도와 특이성을 계산하였다.
실시예 1: 4개 선별 검사 센터에서 기준선에서 참가자의 임상 파라미터 및 간세포암(HCC) 결과의 추적
4곳의 선별 검사 센터에서 커뮤니티 개체(n=72720)를 대상으로 혈액 B형 간염 바이러스 표면항원(HBsAg) 테스트를 실시한 후 설문조사를 실시하였다. HBsAg 양성 개체(n=3793)를 AFP/US 선별 검사에 참여하도록 초대하였다. 이러한 HBsAg 양성 개체 중 176명이 관련 AFP/US 결과를 보였으며(AFP/US 양성/의심군으로 명명), 나머지 HBsAg 양성 환자는 AFP/US 음성군(n=3617)을 구성했다(도 1 및 표 3). 이들의 HCC 상태를 확정하기 위해, 모든 AFP/US 양성/의심 개체는 첫 선별 검사 후 2개월 이내에 동적 CT/MRI 검사를 받도록 권장한다. HCC 상태에 대한 신뢰할 수 있는 진단을 받은 환자를 본 연구의 훈련 세트에 포함하고, 이러한 개체로부터 얻은 기준선 AFP/US 혈액 샘플에 대해 HCC 선별 검사 테스트를 수행했다(도 1).
이 3,617명의 AFP/US 음성 개체 중 약 60%가 이 연구에서 기준선 선별 검사 전에 AFP/US 선별 검사를 받았다(도 2 및 표 3). 후속 추적 절차에서 불안과 불순응을 줄이기 위해, 본 발명에서는 주로 최근 1 내지 3년 동안 AFP/US 선별 검사를 받은 개체를 검증 세트(n=331)로 선정하였다. 성별, US에 의해 검출된 간경화의 비율 및 혈청 알부민 수준을 기준으로, 샘플링된 AFP/US 음성 참가자의 분포는 모든 HBsAg 양성 참가자와 유사했다(도 2 및 표 3). 본 발명은 기준선 AFP/US 선별 검사에서 검증 세트로부터 수집한 혈액 샘플에 대해 HCC 액체 생검 테스트(HCC 선별 검사)를 수행하고, 기준선 선별 검사 6 내지 8개월 후 HCC 상태에 대한 추적을 수행하였다. 본 발명은 HBV 감염이 없는 70명의 건강한 개체에 대해서도 HCC 선별 검사를 수행하였다.
실시예 2: HCC 선별 검사를 채택한 HCC 마커의 선택과 검출
본 발명은 두 가지 유형의 바이오마커를 사용하여 HCC 선별 검사 측정법을 개발하였다. 1) HCC에서 매우 보편적이고 cfDNA에서 검출될 수 있는 유전적 변화, 및 2) 혈청 단백질 마커-알파태아단백질(AFP) 및 탈-γ-카르복시 프로트롬빈(DCP)이다. 이전 암 게놈 연구에서 대부분의 HBV 관련 HCC는 다음 유전자/위치에서 TP53, CTNNB1, AXIN1 및 TERT 프로모터 중 적어도 하나의 돌연변이를 가졌다(Totoki Y, et al. (2014) Trans-ancestry mutational landscape of hepatocellular carcinoma genomes. Nature genetics 46(12):1267-1273;Zhang W, et al. (2017) Genetic Features of Aflatoxin-associated Hepatocellular Carcinomas. Gastroenterology.). 본 발명은 HCC의 잠재적인 바이오마커로서 HBV 통합 중단점을 더 고려한다. HBV 통합 부위는 각 개체 세포에서 고유해야 하므로, 혈장(2 내지 3ml)에서 검출된 복수 복제(>2)의 특정 통합 부위는 HBV 통합을 휴대하는 단일 세포의 클론 증폭을 나타낼 수 있다. 이 경우에만 여기에서 생성된 종양이 동일한 게놈 DNA의 여러 복제를 혈액으로 방출할 수 있다. 본 발명은 유전적 변화를 병렬로 프로파일링할 수 있는 측정법을 설계하였다. 추출된 cfDNA는 DNA 바코드가 있는 맞춤형 어댑터에 연결된 후 증폭되어 게놈 전체 라이브러리를 생성한다. 발명인은 cDNA 말단 급속 증폭점(RACE)과 유사한 방법을 사용하여, TP53, CTNNB1 및 AXIN1의 코딩 영역, TERT의 프로모터 영역 및 HBV 서열을 덮는 복수의 프라이머를 사용하고, 돌연변이 및 HBV 통합으로 표적을 풍부하게 하였다(도 3)(Chaudhuri AA, et al. (2017) Early Detection of Molecular Residual Disease in Localized Lung Cancer by Circulating Tumor DNA Profiling. Cancer discovery 7(12):1394-1403; Waltari E, et al. (2018) 5' Rapid Amplification of cDNA Ends and Illumina MiSeq Reveals B Cell Receptor Features in Healthy Adults, Adults With Chronic HIV-1 Infection, Cord Blood, and Humanized Mice. Frontiers in immunology 9:628.). 2세대 시퀀싱 reads는 DNA 바코드를 통해 원시 cfDNA 분자를 추적할 수 있으므로, 시퀀싱/증폭 오류에서 위양성 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)를 필터링할 수 있다(Kinde I, Wu J, Papadopoulos N, Kinzler KW, & Vogelstein B (2011) Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108(23):9530-9535.).
발명인의 이전 발견 및 기타 HCC, 간경화 및 만성 간염에 의해 영향을 받는 입원 환자에 대한 보고서를 기반으로, AFP 및 DCP의 혈청 단백질 수준의 조합은 조기 HCC 및 비대상성 간경화 구분 측면에서 현저한 민감도와 특이성을 나타낸다(Chen H, et al. (2018) Direct comparison of five serum biomarkers in early diagnosis of hepatocellular carcinoma. Cancer management and research 10:1947-1958.). 따라서 본 발명은 이 두 가지 혈청 단백질 마커를 cfDNA의 변화를 조합하여, 이 액체 생검 기반의 측정법(AFP, DCP 및 cfDNA 포함)이 조기 HCC를 효과적으로 선별 검사하는 데 유효한지 여부를 연구하였다.
실시예 3: HCC 선별 검사 측정법을 이용하여 수행한 임상 진단의 일치성
HCC 검출에서의 유용성을 확정하기 위해, 본 발명은 HCC로 진단된 것으로 알려져 있거나 배제된 개체(비HCC)에서 HCC 선별 검사를 수행하였다. HCC 65건과 비HCC 70건은 AFP/US 양성/의심 개체에게서 얻었다. 상기 HCC 양성 또는 HCC 음성 상태는 동적 CT/MRI 영상 및 조직학적 확인을 기반으로 한다. 이 135개의 사례를 훈련 세트로 사용하였고, HCC 선별 검사 결과를 임상 진단과 비교하였다. 측정법에서 상이한 유형의 바이오마커를 통합하는 분류기를 구축하기 위해, 본 발명은 각 유전자 또는 유전자좌에 대해 먼저 상이한 유형의 cfDNA 돌연변이를 관심 영역(ROI) 점수로 분해한다(collapse). ROI 점수는 ROI에서 각 점 돌연변이의 파괴 효과와 빈도의 가중치 합이다. 유전자에서 SNV/indel 돌연변이의 ROI 점수 이외에, 본 발명은 2개의 구조적 변이체 특징(TERT 프로모터 영역에서 HBV 통합 및 기타 HBV 통합), 1개의 실험적 특징(cfDNA 농도), 2개의 단백질 마커(AFP 및 DCP) 및 2개의 임상 특징(연령 및 성별)을 더 추가하여 진단 분류기를 구축함으로써 HCC 상태의 최종 특징을 예측하였다(표 2). 이러한 마커를 이용해 패널티 로지스틱 회귀 알고리즘을 사용하며, HCC 선별 검사 모델은 HCC 사례와 비HCC 사례를 더 잘 구별한다(도 4에서 A). HCC 65건과 비HCC 70건의 훈련 데이터 세트에 대해 100회 반복된 LOOCV(leave-one-out cross validation)를 수행하여, 상기 측정법이 HCC 진단에서 민감도가 85%이고 특이성이 93%인 것을 발견하였다(곡선 하부 면적=0.928)(도 4에서 B 및 C). HCC 선별 검사 점수 컷오프 값은 가장 높은 Youden 지수 점수에 대해 0.4이다(도 5에서 B 및 표 4). cfDNA와 단백질 마커 모두 HCC 인식에 크게 기여한다(도 4에서 C 및 표 5).
표 4 특징과 HCC 선별 검사 점수
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표 5 돌연변이 정보
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*: T는 진정한 돌연변이를 나타내고, S는 의심되는 돌연변이를 나타낸다.
실시예 4: HCC 선별 검사 측정법의 AFP/US 음성 개체 조기 HCC에 대한 예측값
본 발명은 HCC 선별 검사가 AFP/US 음성이고 임상 증상이 없는 HBsAg 양성 개체로부터 HCC를 검출할 수 있는지 여부를 추가로 시험하였다. HCC 선별 검사를 이용해 331명의 AFP/US 음성 개체를 시험하였으며, 훈련 세트에서 얻은 알고리즘을 기반으로 24개의 양성 사례(HCC 선별 검사 양성이라고 함)가 식별되었다(도 4에서 D).
24명의 HCC 선별 검사 양성 개체에 대해 6 내지 8개월 동안 추적하여 HCC 임상 결과를 얻었다. 이들 개체에서 17명은 동적 CT로, 4명은 AFP/US로, 3명은 전화 인터뷰로 추적 관찰하였다. 24명의 HCC 선별 검사 양성 중 4명은 최종적으로 HCC로 진단되었고, HCC 검출의 양성 예측 값은 17%였다(도 4에서 E). 또한 1개 군의 HCC 선별 검사 음성 참가자(n=70)는 6 내지 8개월 이내에 동적 CT 검사를 받기로 동의했으며 HCC 진단을 받은 사람은 없었다. 본 발명은 기준선 AFP/US 선별 검사 6 내지 8개월 후 AFP/US를 통해 172명의 HCC 선별 검사 음성 참가자를 추적하였으나 HCC 사례는 진단되지 않았다. 전화 인터뷰를 통해 추적된 65명의 참가자 중 HCC 환자는 발견되지 않았다(도 2). 결론적으로 이러한 HCC 선별 검사의 음성 사례에서는 HCC 사례가 발견되지 않았다. 요약하면, HCC 선별 검사 측정법은 AFP/US-음성 개체에서 17%의 양성 예측 값, 100%(4/4) 민감도 및 94%의 특이성(307/327)을 생성했다(도 4에서 F). 동적 CT로 진단할 때 식별된 모든 4명의 HCC 환자는 종양 크기가 3cm 미만이었고(도 4에서 G), 기준선에서의 US 결과에 따르면 이 4명의 환자는 간경화가 없었다.
본 발명은 기준선에서 검출한 후 6 내지 8개월 이내에 기준선 검출 시 AFP/US 음성이었고 HCC 선별 검사를 받지 않은 944명의 참가자에게 AFP/US 검사를 제공한다. 4건의 HCC 사례(0.4%, 4/944)가 발견되어 추가로 확인하였다. 암 등록 기록에 따르면 2018년 6월 30일 이전에 이 337명의 참가자에서 간암 결과(ICD-10 코드 C22)가 확인되지 않았다. 이 참가자는 기준선 선별 검사에서 AFP/US 음성이었고 HCC 선별 검사 또는 임의 추가적 AFP/US 선별 검사를 진행하지 않았다(도 2).
기준선에서 제1차 채혈 6 내지 8개월 후, 24명 HCC 선별 검사 양성 사례 중 13명에 대해 제2차 채혈을 수행하여 HCC 선별 검사 측정법을 반복한다. 여기에서 하나의 HCC 사례는 계속해서 양성이었고 점수는 6개월 전보다 높았다. 또 다른 HCC 사례는 제2차 채혈 전에 종양이 외과적으로 제거되었고 HCC 선별 검사는 음성으로 상기 상태와 일치하였다. 11건의 HCC 선별 검사 양성의 비HCC 사례 중 7건(64%)은 제2차 HCC 선별 검사 테스트에서 음성이었으며, 그중 2건의 선별 검사 결과는 임계값(0.40)에 가까웠다. 나머지 4건의 비HCC 사례는 제2차 HCC 선별 검사에서 여전히 양성이었다(도 4에서 E). 이러한 결과는 양성 예측 값이 제2 시점에서 중복 테스트를 통해 더욱 개선될 수 있음을 나타낸다. 현재 이러한 사례는 추적을 통해 상기 측정법을 추가로 검증한다.
실시예 5: 건강한 개체를 이용해 액체 생검 측정법 훈련
HCC 선별 검사 측정법은 고위험군에서 강력한 HCC 식별 능력을 보여주었다. 이전 연구에서는 이러한 고위험군에서 민감도와 특이성이 암 환자와 HBV 감염 또는 기타 위험 요인이 없는 건강한 개체의 비교보다 낮을 것이라고 예측했다. 이 가설을 테스트하기 위해, 본 발명은 HBV 감염이 없는 70명의 건강한 개체(HBsAg 음성)에 대해 HCC 선별 검사를 수행하고, 이러한 데이터를 사용하여 훈련 세트 중 70명의 HBsAg 양성 비HCC 사례를 대체했다. cfDNA 및 단백질 마커의 분석을 통해, HCC 선별 검사 측정법은 건강한 개체로부터 HCC 사례를 효과적으로 식별하였으며, 그 민감도와 특이성은 각각 98%, 100%였다(도 5에서 A). 그러나 이 훈련 세트(HCC 및 건강한 개체)에서 획득한 알고리즘은 HBsAg 양성 비HCC 사례에서 제대로 수행되지 않았다. 상기 알고리즘에 따르면, 대부분의 비HCC 사례는 양성으로 분류되는 반면, HCC 및 비HCC 사례는 고도로 중첩된다(도 5에서 B). 또한 검증 세트의 성능도 좋지 않았다. 테스트 중 모든 4건의 HCC 사례가 양성이었지만, 많은 HBsAg(+) 개체가 양성으로 분류되어, 생성된 특이성과 양성 예측 값이 각각 58%와 2.8%에 불과했다(도 5에서 B). 반면, HBsAg 양성 검증 세트에서의 그 표현 외에도, HCC 및 비HCC 사례에서 획득한 알고리즘은 정확하게 모든 건강한 개체(100%)를 음성으로 분류했다(도 5에서 B).
실시예 6: CNV를 더 포함하는 액체 생검 측정법
가. 혈액 샘플의 획득
간암 환자의 혈액 샘플은 임상을 통해 간암으로 식별된 65명의 간암 환자에 의해 제공되었다.
간암 고위험 환자 혈액 샘플은 문헌(Omata, M.,et al.,Asia-Pacific clinical practice guidelines on the management of hepatocellular carcinoma:a 2017 update. Hepatol Int,2017.11(4): p.317-370.)에 제공된 방법을 사용하여 간암 고위험군으로 확인된 70명의 간암 고위험 환자가 제공하였다.
건강한 사람들의 혈액 샘플은 100명의 건강한 지원자에 의해 제공되었다.
나. 검사 대상 혈액 샘플 cfDNA 중 간암 돌연변이 유전자 검출 및 CNV 검출
검사 대상 혈액 샘플은 간암 환자 65명, 간암 고위험 환자 70명, 건강한 사람 100명의 혈액 샘플이다.
1. MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit를 사용하여 검사 대상 혈액 샘플에서 cfDNA를 각각 추출한다.
2. 1단계를 완료한 후, 액체상 하이브리드 캡쳐 기술을 사용하여 검사 대상 혈액 샘플 cfDNA 중의 간암 돌연변이 유전자 정보를 입력한다. 예를 들어 TP53 유전자, AXIN1 유전자, CTNNB1 유전자, TERT 유전자 프로모터, B형 및 C형 HBV와 같은 돌연변이 정보이다. 구체적인 단계는 하기와 같다.
(1) 상기 검사 대상 혈액 샘플 cfDNA를 취하고, KAPA Hyper Prep 키트를 사용하여 라이브러리를 구축하여, 검사 대상 혈액 샘플의 cfDNA 라이브러리를 획득한다.
(2) 단계 (1)을 완료한 후, 상기 검사 대상 혈액 샘플의 cfDNA 라이브러리를 취한다. Sureselect XT 표적 캡쳐 키트를 사용하여 표적 영역 하이브리드 캡쳐를 수행한 후, Illumina 플랫폼에서 시퀀싱을 수행한다. 시퀀싱 깊이는 20000×이다. 검출된 유전자 또는 바이러스의 버전, 염색체, 시작 위치, 종료 위치 및 커버 영역은 표 6과 같다.
표 6
Figure pct00037
일부 검사 대상 혈액 샘플 cfDNA 중의 간암 돌연변이 유전자의 검출 결과는 표 7에서 제2열과 제4열을 참고한다.
표 7
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
각주: "-"는 돌연변이가 검출되지 않았음을 의미하고, "--"는 통합이 검출되지 않았음을 의미한다.
3. 단계 2(1)에서 제조한 검사 대상 혈액 샘플의 cfDNA 라이브러리를 취하고, 저심도 전장 유전체 시퀀싱을 수행한 후 시퀀싱 데이터(약 3G)에 대해 CNV 검출을 수행한다.
다. 혈장 중 AFP 함량 검출
검사 대상 혈액 샘플은 간암 환자 65명, 간암 고위험 환자 70명, 건강한 사람 100명의 혈액 샘플이다.
1. 검사 대상 혈액 샘플을 취하여 채혈관에 거꾸로 10회 혼합한 후 4℃, 2000g에서 10분간 원심분리한 다음, 상층 혈장을 원심분리관(규격 1.5mL)으로 옮긴다. 4℃, 16000g에서 10분 동안 원심분리하고 상층액(즉, 혈장)을 수집한다.
2. 단계 1을 완료한 후 상기 혈장을 취하고 미국 애보트 IMx 분석기를 사용하여 AFP의 함량을 검출한다.
일부 검사 대상 혈액 샘플 혈장 중 AFP 함량에 대한 검출 결과는 표 8의 제2열을 참고한다.
표 8
Figure pct00041
Figure pct00042
라. 혈장 중 DCP 함량 검출
검사 대상 혈액 샘플은 간암 환자 65명, 간암 고위험 환자 70명, 건강한 사람 100명의 혈액 샘플이다.
1. 검사 대상 혈액 샘플을 취하여 채혈관에 거꾸로 10회 혼합한 후 4℃, 2000g에서 10분간 원심분리한 다음, 상층 혈장을 원심분리관(규격 1.5mL)으로 옮긴다. 4℃, 16000g에서 10분 동안 원심분리하고 상층액(즉, 혈장)을 수집한다.
2. 단계 1을 완료한 후 상기 혈장을 취하고 미국 애보트 ARCHITECT i2000SR 화학 발광 면역 분석기를 이용해 DCP의 함량을 검출한다.
일부 검사 대상 혈액 샘플 혈장 중 DCP 함량에 대한 검출 결과는 표 8의 제3열을 참고한다.
마. 데이터 처리 및 22개 특징 점수의 획득
1. 유전자 돌연변이 결과 주석 및 점수
단계 2의 cfDNA 중 간암 돌연변이 유전자의 검출 결과에 대해 주석을 수행한다. 돌연변이 reads 지지 빈도의 주석 점수이다. 돌연변이 reads 지지는 조직 내 변이세포의 백분율을 크게 반영하므로, 하나의 중요한 표현형 관련 요소이다.
2. 돌연변이 부위 통합 및 점수
각 유전자 돌연변이에 대해, 돌연변이 reads 지원 빈도에 따라 주석 점수를 부여한 후, 돌연변이 부위 점수가 상이한 ROI(Region Of Interest) 구간에 누적된다(즉, 특징 점수를 획득함). 상기 구간은 4개 유전자(TP53, CTNNB1, TERT 및 AXIN1) 및 1개 TP53 R249S 핫스팟 돌연변이 위치 영역을 포함한다. 계산 공식은 하기와 같다.
Figure pct00043
여기에서 n은 ROI 중첩의 돌연변이 수량이고, adj_score는 돌연변이의 reads 지지 빈도이다.
3. 구조적 변이 결과 특징 추출
(1) 각 샘플 HBV와 TERT 통합 변이 특징의 점수 검출: TERT 통합이 발생하면 TERT 통합 변이의 특징 점수는 1이고, TERT 통합이 발생하지 않으면 TERT 통합 변이의 특징 점수는 0이다.
(2) 각 샘플에서 HBV 통합 변이의 특징 점수 검출: 검출된 각 통합 돌연변이에 대해, reads 지원 신뢰성에 따라 A, B, C의 세 가지 레벨로 나눈다(통합 reads 수≥10, A레벨; 10>reads 수>6, B레벨; 나머지는 C레벨, 표 7의 제3열 참고). 각각 대응하는 점수는 1, 0.8 및 0.3이며 합산하여 HBV 통합 변이의 특징 점수를 획득한다.
4. 유전자 복제수 변이 검출 결과 특징 추출
단계 2 중 CNV 검출 결과는 다음과 같이 처리된다. 즉, 각 아암 수준에서 총 44개의 CNV 신호(성염색체가 제거되어 CNV 신호에 대한 성별의 영향을 배제함) 점수에 대해 PCA 차원 축소 처리를 수행한다. R2 값으로 앞 6개 주성분(즉, CNV 차원 감소 특징 1, CNV 차원 감소 특징 2, CNV 차원 감소 특징 3, CNV 차원 감소 특징 4, CNV 차원 감소 특징 5, CNV 차원 감소 특징 6)을 CNV 관련 특징으로 선택하며, CNV 감소 차원 특징 1, CNV 차원 감소 특징 2, CNV 차원 감소 특징 3, CNV 차원 감소 특징 4, CNV 차원 감소 특징 5 및 CNV 차원 감소 특징 6의 R2 값이 바로 특징 점수이다.
5. 유리 DNA 길이 관련 특징 추출
본 발명의 발명인은 4개 구간(<90bp, 90 내지 140bp, 141 내지 200bp 및 >200bp)에서 cfDNA 단편 길이가 차지하는 백분율을 계산하고, 이러한 특징을 예측 변수로 사용한다. 4개 구간에서 cfDNA 단편 길이가 차지하는 백분율이 특징 점수이다.
6. 단백질 마커 관련 특징 추출
AFP의 실제 측정값을 임계값(13, 20, 200, 400)에 따라 낮은 것에서 높은 것으로 0, 5, 8, 20, 30의 5가지 수치 레벨로 나눈다. DCP의 실제 측정값을 임계값(40, 60)에 따라 낮은 것에서 높은 것으로 0, 2, 5의 3개 수치 레벨로 나눈다. 이를 2개 단백질 마커의 특징 점수로 사용한다.
7. 임상 및 실험 관련 특징 추출
환자의 연령, 성별 및 cfDNA 농도(cfDNA 함량/혈장 부피)를 포함한 임상 특징도 병례 표현형과 상관 관계가 있으므로 모델에 포함한다. 여기에서 cfDNA 농도값은 log2 변환 후의 값을 특징 점수로 사용한다. 연령의 특징 점수는 샘플의 실제 연령값이고, 남성의 특징 점수는 1, 여성의 특징 점수는 0이다.
요약하면 22개 특징은 13개 유전자 돌연변이 특징, 2개 단백질 마커, 5개 cfDNA 물리 특징 및 2개 혈액 샘플의 기본 정보로 구성된다. 13개 유전자 돌연변이 특징은 각각 TP53 유전자, TERT 유전자 돌연변이, AXIN1 유전자 돌연변이, CTNNB1 유전자 돌연변이, TP53 R249S 핫스팟 구역, CNV 차원 축소 특징 1, CNV 차원 축소 특징 2, CNV 차원 축소 특징 3, CNV 차원 축소 특징 4, CNV 차원 축소 특징 5, CNV 차원 축소 특징 6, HBV와 TERT 통합 변이, HBV와 비TERT 통합 변이이다. 2개 단백질 마커는 각각 AFP와 DCP이다. 5개 cfDNA 물리 특징은 각각 유리 DNA 단편 길이 90bp 미만 구간 백분율, 유리 DNA 단편 90 내지 140bp 구간 백분율, 유리 DNA 단편 141 내지 200bp 구간 백분율, 유리 DNA 단편 200bp 초과 구간 백분율 및 cfDNA 농도이다. 2개 혈액 샘플의 기본 정보는 각각 성별과 연령이다.
바. 간암 예측
1. 단계 1 내지 5의 방법에 따라, 시험 대상자의 22가지 특징에 대한 특징 점수를 얻는다.
2. 단계 1에서 얻은 특징 점수를 파라미터로 사용하고, 패널티 로지스틱 회귀 알고리즘을 사용하여 65개의 HCC 및 70개의 간암 고위험 환자를 포함하는 135개 샘플로 구성된 훈련 세트 데이터를 모델링하고 HCCscreen 점수를 계산한다. 유전자, 단백질 및 CNV 수준에 대한 클러스터 분석을 각각 수행하기 위해, 패널티 로지스틱 회귀를 사용한 각 특징의 교차 검증 계수를 더 제공한다. 상기 모델은 R 패키지 'glmnet'(R 버전 3.5.1)에서 가동되며, 페널티 파라미터 α는 훈련 데이터 세트 내에서 10배 교차 검증을 통해 최적화되고, 최적화된 값은 0이다. 이어서 HCCScreen 점수 및 샘플 그룹화(암 또는 비암) 정보를 기반으로 ROC 곡선(receiver operating characteristic curve)을 그린다. 최대 Youden 지수에 해당하는 HCCScreen 점수를 임계값으로 사용한다. 상기 모델에서는 0.4가 모델의 가장 좋은 컷오프 값으로 선택된다.
HCCScreen>0.4이면 간암으로, 그렇지 않으면 비간암으로 판독한다.
사. 간암 예측 모델 유효성 검증
각각 간암군(간암환자 65명으로 구성), 간암 고위험군(간암 고위험 환자 70명으로 구성), 건강군(건강한 지원자 100명으로 구성)을 샘플로 사용하며, 단계 7에서 간암 예측 모델 예후 방법에 대해 유효성 검증을 수행한다.
결과는 도 7과 같다. 결과에 따르면 간암 예측 모델은 시험 대상자가 간암 환자인지 여부를 예측할 수 있다.
본 발명의 발명인은 대량의 실험을 통해 처음으로 혈장 중 cfDNA의 유전자 돌연변이 정보를 검증하여 조기 HCC 예측에 사용할 수 있다. 발명인은 간암 예측 모델을 이용하여 시험 대상자를 채점하고, 점수값을 통해 시험 대상자가 간암 환자인지 여부를 예측함으로써, 본 발명의 유전자 마커와 단백질 마커의 조합으로 HCC 조기 선별 효과를 효과적으로 수행할 수 있음을 검증하였다. 여기에서 알 수 있듯이, cfDNA 검출을 통한 간암에 대한 조기 검진, 질병 추적, 치료효능 평가 및 예후 예측 등은 중요한 임상적 의의가 있다.

Claims (19)

  1. 간세포암 조기 선별용 키트에 있어서,
    유전자 마커 검출제 및/또는 단백질 마커 검출제를 포함하는 키트.
  2. AFP 음성 피험자의 간세포암 조기 선별용 키트에 있어서,
    유전자 마커 검출제 및 DCP 검출제를 포함하는 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 키트는 데이터 처리 시스템을 더 포함하고, 상기 데이터 처리 시스템은 유전자 마커 및/또는 단백질 마커의 정보를 상기 시험 대상자의 간세포암 선별 점수로 변환하는 데 사용되며, 상기 시험 대상자의 간세포암 선별 검사 점수에 따라 시험 대상자가 간암 환자인지 여부를 예측하는 것을 특징으로 하는 키트.
  4. 간세포암 조기 선별 방법에 있어서,
    (1) 유전자 마커 검출제와 단백질 마커 검출제를 이용하여 피험자의 유전자 마커와 단백질 마커를 검출하는 단계; 및
    (2) 상기 유전자 마커와 단백질 마커의 검출 결과를 채택하여 간세포암 선별 검사 점수를 계산하고 임계값과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 간세포암 선별 검사 점수와 임계값은 간암 예측 모델을 통해 획득하고;
    상기 간암 예측 모델의 구축 방법에는,
    훈련 세트를 구축하고, 상기 훈련 세트는 복수의 간암 환자와 복수의 간암 고위험 환자로 구성되고;
    훈련 세트의 유전자 마커와 단백질 마커를 특징으로 삼아, 검출 결과를 특징 점수로 변환하고, 패널티 로지스틱 회귀 알고리즘을 사용하여 간암 예측 모델을 구축하여 간세포암 선별 검사 점수를 계산하고;
    간세포암 선별 검사 점수와 샘플 분류 정보에 따라, 패널티 로지스틱 회귀 모델의 민감도 및 특이성의 ROC 곡선을 획득하며, ROC 곡선에 따라 컷오프 값을 확정하고, 이 컷오프 값을 간암 환자와 간암 고위험 환자를 구분하는 임계값으로 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 간세포암 조기 선별에 사용하는 유전자 마커 검출제와 단백질 마커 검출제의 용도.
  7. 간세포암 조기 선별용 키트 제조에 사용하는 유전자 마커 검출제와 단백질 마커 검출제의 용도.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전자 마커 검출제는 TP53 검출제, CTNNB1 검출제, AXIN1 검출제 및 TERT 검출제 중에서 선택된 하나 이상을 포함하고, 바람직하게는 3종 또는 4종을 포함할 수 있는 키트, 방법 또는 용도.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 마커 검출제는 AFP 검출제 및 DCP 검출제 중에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있는 키트, 방법 또는 용도.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전자 마커 검출제는 HBV 통합 검출제를 더 포함하는 키트, 방법 또는 용도.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전자 마커 검출제는 CNV 검출제를 더 포함하는 키트, 방법 또는 용도.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전자 마커 검출제는 HBV가 유전자와 통합되었는지 여부에 대한 검출 시약을 더 포함하는 키트, 방법 또는 용도.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전자 마커 검출제는 cfDNA 농도 및/또는 cfDNA 길이 검출제를 더 포함하는 키트, 방법 또는 용도.
  14. 간암 조기 선별 검사 키트에 있어서,
    간암 돌연변이 유전자의 검출 시약, DCP 검출 시약 및 AFP 검출 시약을 포함하는 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 키트는 HBV가 유전자와 통합되었는지 여부에 대한 검출 시약 및/또는 cfDNA 검출 시약을 더 포함하는 키트.
  16. 제1항, 제2항, 제3항, 제8항, 제9항, 제10항, 제11항, 제12항, 제13항, 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 키트는 데이터 처리 시스템을 더 포함하고, 상기 데이터 처리 시스템은 시험 대상자의 간암 유전자 변이 정보, DCP 함량, AFP 함량, HBV가 유전자와 통합되는지 여부, cfDNA 정보 및 임상 정보를 상기 시험 대상자의 간세포암 선별 검사 점수로 변환하는 데 사용되며, 상기 시험 대상자의 간세포암 선별 검사 점수에 따라 시험 대상자가 간암 환자인지 여부를 예측하는 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 간암 돌연변이 유전자의 검출 시약, DCP 검출 시약, AFP 검출 시약, HBV가 유전자와 통합되는지 여부에 대한 검출 시약 및 cfDNA 검출 시약의 응용에 있어서,
    A1) 시험 대상자가 간암 환자인지 여부의 예측;
    A2) 시험 대상자가 간암 환자인지 여부 예측용 키트의 제조;
    A3) 간암의 예측; 및
    A4) 간암 예측용 키트의 제조 중 적어도 하나인 응용.
  18. 시험 대상자의 연령, 시험 대상자의 성별, 시험 대상자 혈장 중 DCP 함량, 시험 대상자 혈장 중 AFP 함량 및 "시험 대상자 cfDNA 중 간암 돌연변이 유전자의 돌연변이 유형, 돌연변이 reads, 유전자 복제수 변이, HBV가 유전자와 통합되는지 여부, cfDNA 농도, 상이한 삽입 단편 길이의 cfDNA 함량이 차지하는 백분율"을 마커로 사용하는 응용에 있어서,
    A1) 시험 대상자가 간암 환자인지 여부의 예측;
    A2) 시험 대상자가 간암 환자인지 여부 예측용 키트의 제조;
    A3) 간암의 예측; 및
    A4) 간암 예측용 키트의 제조 중 적어도 하나인 응용.
  19. 간암의 예측 방법에 있어서,
    시험 대상자 혈장 중 DCP 함량과 AFP 함량을 검출하는 단계; 시험 대상자 cfDNA 중 간암 돌연변이 유전자의 돌연변이 유형, 돌연변이 reads, 유전자 복제수 변이, HBV가 유전자에 통합되는지 여부, cfDNA 농도 및 상이한 삽입 단편 길이의 cfDNA 함량이 차지하는 백분율을 검출하는 단계; 시험 대상자의 연령과 성별을 기록하는 단계; 및 상기 시험 대상자의 정보를 간세포암 선별 검사 점수로 변환하고, 간세포암 선별 검사 점수에 따라 시험 대상자가 간암 환자인지 여부를 예측하는 단계;를 포함하는 방법.
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