JP2022523825A - トロパンアルカロイド（ｔａ）産生非植物宿主細胞、ならびにその製造方法および使用方法 - Google Patents

トロパンアルカロイド（ｔａ）産生非植物宿主細胞、ならびにその製造方法および使用方法 Download PDF

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プラシャーント スリニバサン
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Abstract

とりわけ、トロパンアルカロイド産物、トロパンアルカロイド産物の前駆体、またはトロパンアルカロイド産物の誘導体を産生する操作された非植物細胞が本明細書で提供される。この細胞を利用するトロパンアルカロイド、トロパンアルカロイド産物の前駆体、またはトロパンアルカロイド産物の誘導体を産生するための方法もまた記載されている。【選択図】図１

Description

相互参照
本出願は、２０１９年３月８日に出願された米国仮出願第６２／８１５，７０９号、２０１９年５月１５日に出願された第６２／８４８，４１９号、および２０１９年８月２６日に出願された第６２／８９１，７７１号の利益を主張し、これらの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約ＧＭ１１０６９９およびＡＴ００７８８６下で政府支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
序文
トロパンアルカロイド（ＴＡ）は、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）の植物によって産生される抗コリン作用性の二次代謝産物の一種である。アトロピン、ヒヨスチアミン、スコポラミンを含むいくつかのＴＡは、有機リン酸エステルおよび神経ガス中毒などの多様な神経障害、胃腸管れん縮、および心不整脈の治療に、ならびにパーキンソン病の症状を抑えるのに不可欠な医薬品として世界保健機関によって分類されている。そのため、これらのＴＡ分子を適切かつ一貫して供給し、研究者および医師が利用できるようにすることが重要である。薬用ＴＡの現在のサプライチェーンは、持続不可能で地理的に制限された植物の単作からの抽出に依存しており、ＴＡは、乾燥重量の０．２～４％までしか蓄積せず、害虫、土地利用の変化、気候の影響を受けやすくなっている。単純な原料からのＴＡの完全な化学合成は、ＴＡの立体化学から生じる困難のために、工業的使用に対し十分に経済的であることがまだ証明されていない。さらに、規模の経済性に乏しく、生成時間が長いため、これまでのところ、ＴＡ生産が改善されたトランスジェニック植物または植物培養の工学は、これらの化合物を調達するための実行不可能な戦略となっている。そのため、ＴＡを調製する方法は重要である。
概要
本発明は、前駆体および糖からの多様なトロパンアルカロイド（ＴＡ）の産生のために操作された非植物生物を含む。例えば、本発明に含まれるのは、ヒヨスチアミン、アトロピン、アニソダミン、およびスコポラミン、ならびにそれらの前駆体および誘導体を含む、現在の医療行為において確立された用途を有する天然に存在するＴＡとして本明細書に定義される、薬用ＴＡの産生のための操作された微生物株である。また、本発明に含まれるのは、カリステギン、コカイン、ならびにそれらの前駆体および誘導体を含む、現在の医療行為において確立された用途を有しない天然に存在するＴＡとして本明細書に定義されるが、医療的に関心のある生物活性を有し得る、非薬用ＴＡの産生のための操作された微生物株である。本発明はさらに、薬用ＴＡの誘導体および非薬用ＴＡの誘導体を含む、天然に存在する生物においてエステル化されないアシル供与体およびアシル受容体化合物のエステル化を介して産生されるＴＡなど、未改変生物によって産生されないＴＡとして本明細書に定義される、非天然ＴＡの産生のための操作された微生物株を含む。本発明に含まれるスキームの例は、図１～３に詳述されている。
本発明は、微生物触媒として少なくとも１つの異種酵素を発現するように操作された微生物を使用して、プソイドトロピンおよびプソイドトロピンから誘導されるアルカロイド、例えば、カリステギンを産生する方法を包含する。本発明はさらに、微生物触媒として少なくとも１つの異種酵素を発現するように操作された微生物を使用して、ＴＡ足場の生合成のためのアシル供与体として使用できる多様な化合物を産生する方法を含む。本発明はまた、微生物触媒として少なくとも１つの異種酵素を発現するように操作された微生物を使用して、ＴＡ足場を産生するためのアシル供与体および受容体をエステル化する方法を含む。本発明はさらに、ヒヨスチアミンおよびスコポラミンなどの薬用ＴＡ、カリステギンなどの非薬用ＴＡ、および３－フェニル乳酸（ＰＬＡ）以外のアシル供与体化合物によるトロピンのエステル化から誘導されるものなどの非天然ＴＡの産生のための、操作された微生物株を改変および培養する方法を含む。
ヒヨスチアミンおよびスコポラミンなど、目的のトロパンアルカロイド（ＴＡ）を産生するように操作された宿主細胞が提供される。目的のＴＡには、ＴＡ前駆体、ＴＡ、およびＴＡの誘導体を含むＴＡの改変が含まれ得る。宿主細胞は、以下の、酵素遺伝子における変異を軽減するフィードバック阻害、生合成酵素遺伝子の転写調節改変、酵素における不活性化変異、および異種コード配列、から選択される１つ以上の改変を有し得る。本発明の方法で使用が見出される、宿主細胞および組成物、例えば、キット、システムなどを使用して、目的のＴＡを産生する方法も提供される。
本発明の一態様は、トロパンアルカロイド（ＴＡ）産物を有する産物ストリームを形成するための方法を提供する。この方法は、操作された非植物細胞ならびに栄養素および水を含む原料をバッチ反応器に提供することを含み、操作された非植物細胞は、以下の、細胞生来の生合成酵素遺伝子における変異を軽減するフィードバック阻害、細胞生来の生合成酵素遺伝子の転写調節改変、および細胞生来の酵素における不活性化変異、からなる群から選択される少なくとも１つの改変を有する：さらに、この方法は、バッチ反応器において、操作された非植物細胞を少なくとも約５分間インキュベートすることによって、操作された非植物細胞を発酵に供し、ＴＡ産物および細胞物質を含む溶液を産生することを含む。この方法はまた、少なくとも１つの分離ユニットを使用して、ＴＡ産物を細胞物質から分離して、ＴＡ産物を含む当該産物ストリームを提供することを含む。
別の態様では、本発明は、ＴＡ産物を有する産物ストリームを形成するための方法を提供する。この方法は、操作された非植物細胞ならびに栄養素および水を含む原料を反応器に提供することを含む。この方法はまた、反応器において、操作された酵母細胞を少なくとも約５分間（例えば、５分以上）インキュベートすることによって、操作された非植物細胞を発酵に供し、細胞物質およびＴＡ産物を含む溶液を産生することを含む。さらに、この方法は、少なくとも１つの分離ユニットを使用して、ＴＡ産物を細胞物質から分離して、ＴＡ産物を含む産物ストリームを提供することを含む。
本発明の別の態様は、トロパンアルカロイド（ＴＡ）産物を産生する操作された非植物細胞を提供することであって、操作された非植物細胞は、細胞生来の生合成酵素遺伝子における変異を軽減するフィードバック阻害、細胞生来の生合成酵素遺伝子の転写調節改変、細胞生来の酵素における不活性化変異、からなる群から選択される少なくとも１つの改変を有する。操作された非植物細胞は、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチンウレオヒドロラーゼ、アグマチナーゼ、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼ、ピロリジンケチドシンターゼ、トロピノンシンターゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、トロピノンレダクターゼ、フェニルピルビン酸レダクターゼ、３－フェニル乳酸ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ８４Ａ２７、リットリンシンターゼ、リットリンムターゼ、ヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ、ヒヨスチアミン６β－ヒドロキシラーゼ／ジオキシゲナーゼ、およびコカインシンターゼの群から選択される少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの異種コード配列を含む。いくつかの例では、操作された非植物細胞は、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチンウレオヒドロラーゼ、アグマチナーゼ、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼ、ピロリジンケチドシンターゼ、トロピノンシンターゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、トロピノンレダクターゼ、フェニルピルビン酸レダクターゼ、３－フェニル乳酸ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ８４Ａ２７、リットリンシンターゼ、リットリンムターゼ、ヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ、ヒヨスチアミン６β－ヒドロキシラーゼ／ジオキシゲナーゼ、およびコカインシンターゼの群から選択される酵素をコードする複数の異種コード配列を含む。いくつかの例では、異種コード配列は、作動可能に接続され得る。作動可能に接続されている異種コード配列は、特定のトロパンアルカロイド産物を産生するのと同じ経路内にある可能性がある。いくつかの例では、操作された非植物細胞は、酵素の改変された細胞内輸送、酵素の改変された細胞内局在化、および代謝産物の改変された細胞内輸送を含むがこれらに限定されない群から選択される、細胞内コンパートメント化への１つ以上の改変を含む。
本発明の別の態様では、治療薬が提供される。治療薬は、トロパンアルカロイド産物を含む。
本発明は、添付の図面と併せて読むと、後続の発明を実施するための形態から最良に理解される。一般的な慣例に従って、図面の種々の特徴は縮尺通りではないことを強調する。むしろ、種々の特徴の寸法は、明確性のために任意に拡大または縮小される。図面には次の図が含まれる。
Ｌ－アルギニンを非薬用ＴＡに変換するための例示的な生合成スキームを図示する。ＡＤＣ、アルギニンデカルボキシラーゼ；ＡＲＧ、アルギナーゼ；ＡＵＨ、アグマチンウレオヒドロラーゼ；ＯＤＣ、オルニチンデカルボキシラーゼ；ＰＡＯ、ポリアミンオキシダーゼ；ＰＭＴ、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ；ＭＰＯ、Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼ；自発的、自発的（非酵素的）ステップ；ＰＹＫＳ、ピロリジンケチドシンターゼ；ＣＹＰ８２Ｍ３、トロピノンシンターゼ；ＣＰＲ、シトクロムＰ４５０－ＮＡＤＰ＋レダクターゼ；ＴＲ２、トロピノンレダクターゼ２；Ｐ４５０、シトクロムＰ４５０。アルギニン、オルニチン、スペルミン、スペルミジン、プトレシンは酵母で自然に合成される。示されている他のすべての代謝物は、酵母で自然に生成されるわけではない。ボックス内に示されている最終産物は、非薬用ＴＡの例である。 アミノ酸を目的の薬用ＴＡ分子およびその前駆体分子に変換することができる例示的な生合成経路を図示する。この例は、Ｌ－アルギニンとＬ－フェニルアラニンの薬用ＴＡへの変換を示している。ＡＤＣ、アルギニンデカルボキシラーゼ；ＡＲＧ、アルギナーゼ；ＡＵＨ、アグマチンウレオヒドロラーゼ；ＯＤＣ、オルニチンデカルボキシラーゼ；ＰＡＯ、ポリアミンオキシダーゼ；ＰＭＴ、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ；ＭＰＯ、Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼ；自発的、自発的（非酵素的）ステップ；ＰＹＫＳ、ピロリジンケチドシンターゼ；ＣＹＰ８２Ｍ３、トロピノンシンターゼ；ＣＰＲ、シトクロムＰ４５０－ＮＡＤＰ＋レダクターゼ；ＴＲ１、トロピノンレダクターゼ１；ＡｒＡＴ、芳香族アミノトランスフェラーゼ；ＰＰＲ、フェニルピルビン酸レダクターゼ；ＵＧＴ８４Ａ２７、３－フェニル乳酸ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ；ＬＳ、リットリンシンターゼ；ＣＹＰ８０Ｆ１、リットリンムターゼ；ＨＤＨ、（Ｓ）－ヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ；Ｈ６Ｈ、（Ｓ）－ヒヨスチアミン６β－ヒドロキシラーゼ／ジオキシゲナーゼ。アルギニン、オルニチン、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、フェニルアラニン、３－フェニルピルビン酸、および微量の３－フェニル乳酸は、酵母で自然に合成される。示されている他のすべての代謝物は、酵母で自然に生成されるわけではない。ボックス内に示されている最終産物は、薬用ＴＡの例である。 アミノ酸を非天然のＴＡおよびその前駆体分子に変換することができる例示的な生合成経路を図示する。この例では、Ｌ－アルギニンとＬ－フェニルアラニンが非天然ＴＡに変換される。ＡＤＣ、アルギニンデカルボキシラーゼ；ＡＲＧ、アルギナーゼ；ＡＵＨ、アグマチンウレオヒドロラーゼ；ＯＤＣ、オルニチンデカルボキシラーゼ；ＰＡＯ、ポリアミンオキシダーゼ；ＰＭＴ、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ；ＭＰＯ、Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼ；自発的、自発的（非酵素的）ステップ；ＰＹＫＳ、ピロリジンケチドシンターゼ；ＣＹＰ８２Ｍ３、トロピノンシンターゼ；ＣＰＲ、シトクロムＰ４５０－ＮＡＤＰ＋レダクターゼ；ＴＲ１、トロピノンレダクターゼ１；ＰＡＬ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ；４ＣＬ、４－クマル酸－ＣｏＡリガーゼ；ＣＳ、コカインシンターゼ。アルギニン、オルニチン、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、およびフェニルアラニンは、酵母で自然に合成される。示されている他のすべての代謝物は、酵母で自然に生成されるわけではない。ボックス内に示されている最終産物は、非天然ＴＡの例である。 アミノ酸および他のポリアミン分子からのプトレシンの産生のための生合成経路の例を図示する。この図は、内因性酵母と異種生合成経路を使用して、中心的な代謝物からプトレシンを産生する方法を示す。 アルギニンとポリアミンの代謝に関与する内因性生合成酵素の過剰発現のために操作された酵母株が、液体培養でプトレシンを産生できることを示す。天然の遺伝子の追加コピーは、野生型酵母（ＣＥＮ．ＰＫ２）の低コピープラスミドから発現された。形質転換株は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、２％デキストロースを含む選択培地で３０℃で４８時間培養した。すべてのデータは、少なくとも３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。特に明記しない限り、統計的有意性は、対応する対照（すなわち、ＣＥＮ．ＰＫ２）と比較して示される。 アルギニンとポリアミンの代謝に関与する酵母以外の生物由来の生合成酵素の異種発現のために操作された酵母株が、液体培養でプトレシンを産生できることを示す。この例では、酵母株は、植物および細菌由来の異種生合成経路を発現するように操作されている。異種酵素は、野生型酵母の低コピープラスミドから発現された。形質転換株は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、２％デキストロースを含む選択培地で３０℃で４８時間培養した。すべてのデータは、少なくとも３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。特に明記しない限り、統計的有意性は、対応する対照（すなわち、ＣＥＮ．ＰＫ２）と比較して示される。 酵母以外の生物由来のアルギニンおよびポリアミン代謝に関与する生合成酵素の異種発現のために操作された酵母株が、液体培養で、ＴＡ前駆体および中間体アグマチン、Ｎ－カルバモイルプトレシン、およびプトレシンを産生できることを示す。この図は、酵母におけるアグマチン／プトレシン生合成経路遺伝子の機能検証を示す。野生型酵母株ＣＥＮ．ＰＫ２は、３つの低コピープラスミドで形質転換され、ゼロ（陰性対照）～３つの示された生合成遺伝子を同時発現した。青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を発現するプラスミドを、３つの栄養要求性選択マーカーＵＲＡ３、ＴＲＰ１、およびＬＥＵ２のそれぞれの陰性対照として使用した。形質転換株は、代謝産物産生のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、２％デキストロースを含む選択培地で３０℃で４８時間培養した。すべてのデータは、陰性対照（ＣＥＮ．ＰＫ２）と比較した、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳピーク面積で測定された力価を示す。データは３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。 通常の酵母の増殖中に細胞内プトレシンレベルを厳密に制御する内因性調節経路を図示する。 内因性ポリアミン生合成調節機構を破壊した酵母株におけるプトレシン産生のヒートマップを示す。ネイティブまたは異種プトレシン経路の過剰発現のために、示された遺伝子が野生型酵母（ＷＴ）または各単一破壊株の低コピープラスミドから発現された。菌株は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、２％デキストロースを含む選択培地（ＹＮＢ－ＤＯ）で３０℃で７２時間培養した。すべてのデータは、少なくとも３回の生物学的反復の平均を表す。この図は、ポリアミン代謝遺伝子の単一破壊を有し、内因性または異種のプトレシン生合成経路が過剰発現している酵母株が、液体培養でプトレシンを産生できることを示す。 酵母のプトレシン産生を増やすための工学的取り組みの概要を示す。「＋」記号は、経路からの少なくとも１つの遺伝子の発現を示し、「－」は、経路からの遺伝子の発現がないことを示す。菌株は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、２％デキストロースを含む選択培地で３０℃で４８時間培養した。すべてのデータは、少なくとも３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。特に明記しない限り、統計的有意性は、対応する対照（すなわち、ＣＥＮ．ＰＫ２）と比較して示される。 本発明の実施形態による、操作された酵母における、プトレシンの、中間体ＮＭＰおよび４ＭＡＢを介したＴＡ中間体ＮＭＰｙおよび副産物４ＭＡＢ酸への段階的変換を説明するＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示す。内因性酵母酵素（ＡＬＤ）の活性を介した４ＭＡＢ酸副産物の形成について提案された機構が示される。抽出されたイオンクロマトグラムＭＲＭトレースは、経路に沿った各代謝物と、各代謝物の最も高い前駆体イオン／産物イオン遷移を使用する基準となる標準物質とについて示される。対照は、低コピープラスミドに載ったＳＰＥ１、ＡｓＡＤＣ、およびｓｐｅＢを発現する株ＣＳＹ１２３５（実施例１．５を参照）を表す。クロマトグラムトレースは、３回の生物学的反復を代表するものである。酵素記号：ＰＭＴ、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ；ＭＰＯ、Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼ；ＡＬＤ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ。 本発明の実施形態による、ＡｂＰＭＴ１およびＭＰＯ酵素を発現する操作された酵母の液体培養におけるＴＡ前駆体（Ａ）プトレシン、（Ｂ）ＮＭＰ、（Ｃ、Ｅ）４ＭＡＢ、および（Ｄ、Ｆ）ＮＭＰｙの相対的産生を説明する、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示す。（Ａ）プトレシン過剰産生のためのｐＣＳ４２３９を保有するＣＳＹ１２３５についてのプトレシン（ｍ／ｚ＋８９→７２）のＭＲＭクロマトグラム。（Ｂ）ｐＣＳ４２３９を保有し、低コピープラスミドからＡｂＰＭＴ１を発現するＣＳＹ１２３５についてのＮＭＰ（ｍ／ｚ＋１０３→７２）のＭＲＭクロマトグラム。（Ｃ、Ｄ）ｐＣＳ４２３９を保有し、低コピープラスミドからＡｂＰＭＴ１およびＮｔＭＰＯ１を発現するＣＳＹ１２３５についての、それぞれ４ＭＡＢ（ｍ／ｚ＋１０２→７１）およびＮＭＰｙ（ｍ／ｚ＋８４→５７）のＭＲＭクロマトグラム。（Ｅ、Ｆ）ｐＣＳ４２３９を保有し、低コピープラスミドからＡｂＰＭＴ１およびＤｍＭＰＯ１ΔＣ－ＰＴＳ１を発現するＣＳＹ１２３５についての、それぞれ４ＭＡＢ（ｍ／ｚ＋１０２→７１）およびＮＭＰｙ（ｍ／ｚ＋８４→５７）のＭＲＭクロマトグラム。トレースのＹ軸は、生のＭＲＭイオンカウントである。すべてのクロマトグラムは、２％デキストロースを含む選択培地で３０℃で４８時間増殖させた後、細胞外培地のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって生成された。トレースは、少なくとも３回の生物学的反復を代表するものである。 ＡｂＰＭＴ１によるＳＡＭ依存性プトレシンＮ－メチル化に対するＭＥＵ１破壊の影響を示す。野生型株ＣＥＮ．ＰＫ２またはｍｅｕ１破壊株ＣＳＹ１２２９を、ＳＰＥ１、ＡｓＡＤＣ、およびｓｐｅＢ、ならびにＡｂＰＭＴ１を発現する低コピープラスミドで同時形質転換した。データは、２％デキストロースを含む選択培地で３０℃で４８時間増殖させた後、３回の生物学的反復のＬＣ－ＭＳ／ＭＳピーク面積によって定量化されたＣＥＮ．ＰＫ２対照と比較した平均ＮＭＰ力価を示す。エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＳｈｅｒＬｏｃ２ Ｗｅｂサーバーを使用する、植物および酵母／真菌細胞におけるＮＭＰｙ生合成遺伝子の細胞内局在性のインシリコの予測を示す。値と色は、各コンパートメントへの局在性の確率スコア（０～１）を示す：ＣＹＴ、サイトゾル；ＮＵＣ、核；ＶＡＣ、液胞；ＣＨＬ、葉緑体；ＭＩＴ、ミトコンドリア；ＰＯＸ、ペルオキシソーム。 （Ａ）Ｎ末端およびＣ末端にＧＦＰタグ付けされたＮｔＭＰＯ１とＰＥＸ３ペルオキシソームマーカーの共局在化、ならびに（Ｂ）本発明の実施形態による、操作された酵母の液体培養物におけるＴＡ前駆体４ＭＡＢおよびＮＭＰｙの産生に対する、ＮｔＭＰＯ１のＮ末端およびＣ末端へのＧＦＰタグ付けの効果を図示する。この図は、ＮｔＭＰＯ１の細胞内局在性の実験的検証を示す。（Ａ）野生型酵母（ＣＥＮ．ＰＫ２）でペルオキシソームマーカーｍＣｈｅｒｒｙ－ＰＥＸ３と同時発現したＮｔＭＰＯ１のＮ末端ＧＦＰ融合体およびＣ末端ＧＦＰ融合体の蛍光顕微鏡観察。白い矢印は、ＧＦＰタグ付きＮｔＭＰＯ１とペルオキシソームの共局在を示す。スケールバー、１０μｍ。（Ｂ）４ＭＡＢまたはＮＭＰｙ産生に対するＮｔＭＰＯ１のサイトゾル局在化の強制の効果。野生型酵母（ＣＥＮ．ＰＫ２）は、野生型ＮｔＭＰＯ１、またはＮ末端ＧＦＰ融合体またはＣ末端ＧＦＰ融合体を発現する低コピープラスミドと、ＳＰＥ１、ＡｓＡＤＣ、およびｓｐｅＢ、ならびにＡｂＰＭＴ１を発現する低コピープラスミドとで、同時形質転換された。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、２％デキストロースを含む選択培地で３０℃で４８時間増殖させた後に実施した。データは、３回の生物学的反復の平均を表す。エラーバーは標準偏差を示す。最も可能性の高い細胞内コンパートメントは、（ａ）の顕微鏡データに基づいて示される。 酵母で異種発現させた場合のＡｂＰＭＴ１とＮｔＭＰＯ１の細胞内局在性を示す蛍光顕微鏡データを提供する。低コピープラスミドから、Ｎ末端またはＣ末端にＧＦＰタグ付けされたＡｂＰＭＴ１またはＮｔＭＰＯ１を発現する野生型酵母で、顕微鏡観察を実施した。スケールバー、１０μｍ。 （Ａ）植物トランスクリプトームデータから同定されたＮｔＭＰＯ１と推定ＭＰＯ酵素ＡｂＭＰＯ１およびＤｍＭＰＯ１との配列アラインメント（上から下へ：配列番号２７～２９）、（Ｂ）ＮｔＭＰＯ１、ＡｂＭＰＯ１、またはＤｍＭＰＯ１を発現する操作された酵母株の液体培養における、ＴＡ前駆体４ＭＡＢおよびＮＭＰｙの産生の比較、および（Ｃ）本発明の実施形態による、ホモロジーモデリングから決定されたＮｔＭＰＯ１、ＡｂＭＰＯ１、およびＤｍＭＰＯ１の予測される三次元構造の比較、を図示する。（Ａ）１０００ Ｐｌａｎｔｓ ＰｒｏｊｅｃｔデータベースからのＡｂＭＰＯ１およびＤｍＭＰＯ１候補に対するクエリＮｔＭＰＯ１シーケンスのアラインメント。青はアミノ酸構造の保存を示し、赤はミスマッチを示す。（Ｂ）ＭＰＯオルソログの相対的な活性の比較。プトレシン過剰産生株ＣＳＹ１２３５（実施例１．５を参照）を、ＳＰＥ１、ＡｓＡＤＣ、およびｓｐｅＢ、ＡｂＰＭＴ１、および３つのＭＰＯバリアントのうちの１つを発現する低コピープラスミドで同時形質転換した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、選択培地で３０℃で４８時間増殖させた後に実行した。データは、３回の生物学的反復の平均を表す。エラーバーは標準偏差を示す。（Ｃ）ＲａｐｔｏｒＸ Ｗｅｂサーバーを使用してエンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）銅含有アミノオキシダーゼ（ＰＤＢ：１ＫＳＩ、青）の結晶構造に基づいて構築されたＭＰＯ酵素（ピンク）の相同性モデル。上：ＮｔＭＰＯ１；中央：ＡｂＭＰＯ１；下：ＤｍＭＰＯ１。 プトレシンを過剰産生し、ＡｂＰＭＴ１と、ＮｔＭＰＯ１およびＤｍＭＰＯ１のＮ末端およびＣ末端のトランケーション型とを発現する操作された酵母株の液体培養における、４ＭＡＢ産生を図示する。この図は、操作された酵母の４ＭＡＢ産生に対する、メチルプトレシンオキシダーゼのＮ末端およびＣ末端のトランケーションの影響を示す。野生型（ＷＴ）酵素および示されたトランケーション型は、プトレシン過剰産生株ＣＳＹ１２３５の低コピープラスミドから発現された（実施例１．５を参照）。菌株は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、２％デキストロースを含む選択培地で３０℃で４８時間培養した。すべてのデータは、少なくとも３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ４つの天然アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１つについて単一の破壊を保有する操作された酵母株の液体培養における、ＴＡ前駆体４ＭＡＢおよびＮＭＰｙならびに副産物４ＭＡＢ酸の産生を示す。この図は、４ＭＡＢ酸の蓄積に対する個々のアルデヒドデヒドロゲナーゼの破壊の影響を示す。プトレシン過剰産生株ＣＳＹ１２３５（対照）またはｈｆｄ１、ａｌｄ４、ａｌｄ５、またはａｌｄ６のナンセンス変異破壊を有する娘株を、ＳＰＥ１、ＡｓＡＤＣ、およびｓｐｅＢ、ＡｂＰＭＴ１、およびＤｍＭＰＯ１ΔＣ－ＰＴＳ１を発現する低コピープラスミドで形質転換した。バーは、選択培地で３０℃で４８時間増殖させた後、ＣＳＹ１２３５（ＡＬＤ破壊なし）に対し正規化されたＬＣ－ＭＳ／ＭＳピーク面積で測定した４ＭＡＢ酸相対力価を示す。データは３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 天然アルデヒドデヒドロゲナーゼへの１つ以上の破壊を保有する操作された酵母株の液体培養における、（Ａ）４ＭＡＢ酸副産物、ならびに（Ｂ）ＴＡ前駆体４ＭＡＢおよびＮＭＰｙの産生を示す。この図は、操作された酵母における（Ａ）４ＭＡＢ酸副産物および（Ｂ）４ＭＡＢおよびＮＭＰｙの産生に対する、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊の影響を示す。「＋」および「－」記号は、それぞれ機能的酵素の有無を示す。菌株は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、２％デキストロースを含む選択培地（ＹＮＢ－ＤＯ）で３０℃で４８時間培養した。すべてのデータは、少なくとも３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。特に明記しない限り、統計的有意性は、対応する対照（ＣＳＹ１２３５）と比較して示される。 本発明の実施形態による、プトレシン過剰産生遺伝子、ＡｂＰＭＴ１、およびＤｍＭＰＯ１トランケーション型の、低コピープラスミドベースまたはゲノム発現のいずれかでの、操作された酵母株の液体培養におけるＴＡ前駆体ＮＭＰｙの産生の比較を図示する。この図は、４ＭＡＢおよびＮＭＰｙの産生と、ＮＭＰｙ生合成遺伝子のプラスミドベース（ＣＳＹ１２４１）発現およびゲノム（ＣＳＹ１２４３）発現との比較を示している。ＣＳＹ１２４１株は、プトレシン過剰産生遺伝子（ＳＰＥ１、ＡｓＡＤＣ、ｓｐｅＢ）、ＡｂＰＭＴ１、およびＤｍＭＰＯ１ΔＣ－ＰＴＳ１を発現する低コピープラスミドで形質転換した。ＣＳＹ１２４３株は、ゲノムに組み込まれたコピーから前述の遺伝子をすべて発現した。ＮＭＰｙレベルは、選択的（ＣＳＹ１２４１）または非選択的（ＣＳＹ１２４３）培地で３０℃で４８時間増殖させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで定量した。データは少なくとも２回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。 本発明の実施形態による、ＮＭＰｙおよびＭＰＯＢからの副産物ヒグリンの産生の生合成経路を示す。酵母の推定される主要な副反応およびマイナーな副反応を、それぞれ太い矢印および点線の矢印で示す。 低コピープラスミドベースのＡｂＰＹＫＳ、ＡｂＣＹＰ８２Ｍ３、ＤｓＴＲ１、および４つの異なるＣＰＲのうちの１つを発現する操作された酵母株の液体培養における、ＴＡ前駆体トロピノンおよびトロピンと副産物ヒグリンの産生の比較を図示する。この図は、操作された酵母におけるＡｂＰＹＫＳ、ＡｂＣＹＰ８２Ｍ３、およびＤｓＴＲ１の発現を伴うトロピンおよび関連する中間体の産生を示す。示された遺伝子は、ＣＳＹ１２４６の低コピープラスミドから発現され、「＋」および「－」記号は、酵素の有無を示す。菌株は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、２％デキストロースを含む選択培地で３０℃で４８時間培養した。データは３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 （Ａ）操作された酵母株の液体培養で産生されたＴＡ前駆体ＭＰＯＢの特徴的なトリプルピークを示すＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラム、および（Ｂ）プラスミドからＡｂＰＹＫＳ、ＡｂＣＹＰ８２Ｍ３、および４つのＣＰＲのうちの１つを発現するように操作された酵母株の液体培養でのＴＡ前駆体ＮＭＰｙおよびＭＰＯＢの産生を図示する。この図は、ＡｂＰＹＫＳを発現する操作された菌株の培地におけるＮＭＰｙおよびＭＰＯＢの蓄積を示す。（Ａ）低コピープラスミドのみからＡｂＰＹＫＳを発現するＣＳＹ１２４６の細胞外培地中のＭＰＯＢを検出するための代表的なＬＣ－ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリング（ＭＲＭ）クロマトグラム。３つの特徴的なＭＰＯＢアイソフォームピークは、（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）でラベル付けされている。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、選択培地で３０℃で４８時間増殖させた後に実行した。（Ｂ）選択培地で３０℃で４８時間増殖させた後の、低コピープラスミドからＡｂＰＹＫＳ、ＡｂＣＹＰ８２Ｍ３、および４つのＣＰＲのうちの１つを発現するＣＳＹ１２４６の細胞外培地におけるＮＭＰｙおよびＭＰＯＢの相対存在量（３つのピークすべて）。「＋」および「－」記号は、遺伝子の有無を示す。データは、３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。 操作された酵母の液体培養における、ＴＡ前駆体トロピンと副産物ヒグリンの産生に対する増殖温度の影響を図示する。この図は、トロピン産生酵母株（ＣＳＹ１２４８）の自発的ヒグリン産生に対する増殖温度の影響を示す。相対的選択性は、ヒグリン相対力価に対するトロピン相対力価の比を表す。菌株は、ＬＣ－ＭＳ／Ｍｓ分析の前に、２％デキストロースを含む非選択培地で３０℃または２５℃で４８時間培養した。データは３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 （Ａ）酢酸補充の有りまたは無し培地での、トロピンを産生する操作された酵母株の増殖に対するＡＬＤ４およびＡＬＤ６再構成の影響、および（Ｂ）本発明の実施形態による、トロピンを産生する操作された酵母株の液体培養物中の副産物４ＭＡＢ酸およびヒグリンの産生に対する酢酸要求性の除去の影響を図示する。この図は、操作されたトロピン産生酵母株における酢酸要求性の除去の影響を示す。（Ａ）酢酸補充の有りまたは無しでの、ＮＭＰｙ産生酵母株（ＣＳＹ１２４６）の増殖に対する機能的ＡＬＤ４またはＡＬＤ６遺伝子の再構成の影響。ＡＬＤ４およびＡＬＤ６は低コピープラスミドから発現された。「ＷＴ」は、対照（ＢＦＰ）プラスミドを含むＣＳＹ１２４６を示す。隣接する欄は１０倍希釈を示す。（Ｂ）操作された酵母における再構成された酢酸代謝を伴う４ＭＡＢ酸およびヒグリン副産物の産生。「＋」および「－」記号は、供給された代謝物（酢酸）または低コピープラスミドから発現されたＡＬＤ４およびＡＬＤ６遺伝子の有無を示す。菌株は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、２％デキストロースを含む選択培地（ＹＮＢ－ＤＯ）で３０℃で４８時間培養した。データは３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 （Ａ）トロピンを産生するように操作された酵母株の液体培養物における、ＮＭＰｙとトロピノンの間のＴＡ前駆体の蓄積に対する酢酸要求性の影響、および（Ｂ）本発明の実施形態による、酢酸要求性ありおよびなしの、トロピンを産生するように操作された酵母株の液体培養物において産生された、ＴＡ前駆体ＭＰＯＢの代表的なＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを図示する。この図は、操作された酵母のトロピンに向かうＮＭＰｙを介した代謝物フラックスに対するＡＬＤ６活性の再構成の影響を示す。（Ａ）機能的なＡｌｄ６ｐがある場合とない場合の、操作された菌株におけるＮＭＰｙとトロピノンの間の中間体の産生。中間体存在量は、２５℃で４８時間培養した、０．１％ｗ／ｖ酢酸カリウムを補充した非選択培地で増殖させた統合トロピン産生株（ＣＳＹ１２４８）（灰色）、または酢酸の補充なしで非選択培地で増殖させた、再構成されたＡＬＤ６を有するトロピン産生株（ＣＳＹ１２４９）（ピンク）の細胞外培地で、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭによって測定した。データは、３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｂ）（ａ）に記載されたように培養されたＣＳＹ１２４８（灰色）およびＣＳＹ１２４９（赤色）からのＭＰＯＢ産生の代表的なＭＲＭクロマトグラム。 操作された酵母菌株の液体培養における、ＴＡ前駆体トロピンおよび副産物ヒグリンの産生の改善の進行を図示する。この図は、酵母でのトロピン産生を増加させるように操作された菌株の概要を提示する。「－」記号は遺伝子がないことを示し、「ｐ」および「ｉ」は、それぞれ低コピープラスミドまたはゲノム組み込みからの遺伝子発現を示す。菌株は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、２％デキストロースを含む選択培地または非選択培地で３０℃または２５℃で４８時間培養した。データは３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 本発明の実施形態による、操作された酵母の液体培養におけるプトレシンとトロピンとの間の各ＴＡ前駆体の産生に対する、異種生合成酵素ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＰＹＫＳ、およびＣＹＰ８２Ｍ３の追加のコピーの発現の影響を図示する。この図は、最適化されたトロピン産生株（ＣＳＹ１２４９）の代謝ボトルネックを特定する。株ＣＳＹ１２４９は、ＢＦＰを発現する対照プラスミド（「過剰発現なし」）、またはＡｂＰＭＴ１、ＤｍＭＰＯ１ΔＣ－ＰＴＳ１、ＡｂＰＹＫＳ、またはＡｂＣＹＰ８２Ｍ３の追加コピーを発現する低コピープラスミドで、形質転換された。細胞外培地の中間体レベルは、選択培地で２５℃で４８時間増殖させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで定量した。データは３回の生物学的反復の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。 ボトルネック酵素ＰＭＴおよびＰＹＫＳの追加コピーの、操作された酵母のトロピン産生に及ぼす影響を示す。この図は、ＰＭＴおよびＰＹＫＳ酵素の追加コピーのゲノム組み込みによる代謝ボトルネックの軽減を示す。トロピン産生株ＣＳＹ１２４９およびＣＳＹ１２５１は、増殖培地のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、非選択培地で２５℃で４８時間培養された。データは３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 異種乳酸デヒドロゲナーゼおよびフェニルピルビン酸レダクターゼ酵素を発現する操作された酵母株の液体培養における、ＴＡ前駆体アシル供与体化合物ＰＬＡの産生を示す。この図は、Ｌ－フェニルアラニンを３－フェニル乳酸に変換するように設計された酵母株のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を示す。酵母株は、ＬＥＵ２選択マーカー、ＴＤＨ３プロモーター、および陰性対照としてのＢＦＰのコード配列、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）（ＢｃＬＬＤＨ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）（ＬｃＬＬＤＨ）、Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＬｐＬＬＤＨ）由来のＬＤＨバリアント、または、ベラドンナ（Ａ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）（ＡｂＰＰＲ）、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ＬｐＰＰＲ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ｈｃｘＢ）、またはＷ．フルオレッセンス（Ｗ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ＷｆＰＰＲ）由来のＰＰＲバリアントを保有する低コピーＣＥＮ／ＡＲＳプラスミドを含むように操作されている。酵母は、９６ウェルディープウェルマイクロタイタープレート内の３００μＬ選択培地（－Ｌｅｕ）中で、新たに形質転換されたコロニーから増殖した。２５℃、４６０ｒｐｍの振とうインキュベーターで７２時間増殖させた後、酵母をペレット化し、培地の上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。データは、抽出されたイオンクロマトグラム（アンモニウム付加物、ＥＩＣ ｍ／ｚ＋＝１８４）に基づいて、陰性対照に存在する微量レベルに対して正規化した３－フェニル乳酸相対力価を示す。データは３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 フェニルアラニンアンモニアリアーゼを発現する操作された酵母株の液体培養におけるＴＡ前駆体アシル供与体化合物である桂皮酸の産生を示す、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示す。この図は、Ｌ－フェニルアラニンを桂皮酸に変換するように操作された酵母株のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を示す。酵母株は、ＴＲＰ１選択マーカー、ＴＥＦ１プロモーター、および（ｉ）ＢＦＰまたは（ｉｉ）Ａ．ｔｈａｌｉａｎａフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＡｔＰＡＬ１）のコード配列を保有する低コピーＣＥＮ／ＡＲＳプラスミドを有するように設計されている。酵母は、９６ウェルディープウェルマイクロタイタープレート内の３００μＬ選択培地（－Ｔｒｐ）中で、新たに形質転換されたコロニーから増殖させた。３０℃、４６０ｒｐｍの振とうインキュベーターで４８時間増殖させた後、酵母をペレット化し、培地の上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。クロマトグラムのトレースは、桂皮酸の最も豊富な多重反応モニタリング（ＭＲＭ）遷移に基づいて、これらの菌株によって生成された桂皮酸を示す（ｍ／ｚ＋１４９→１３１）。各トレースは、３つの試料を表す。 操作された酵母で発現されたＴＡ産生Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ由来のＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ８４Ａ２７（ＵＧＴ８４Ａ２７）オルソログの基質特異性を図示する。この図は、操作された酵母で発現された３つの異なるフェニルプロパノイド化合物に対するＵＧＴ８４Ａ２７オルソログの活性の比較を示す。（Ａ）操作された酵母においてＵＧＴ８４Ａ２７のグルコース（Ｇｌｕ）受容体として試験されたフェニルプロパノイド。上、（Ｄ）－３－フェニル乳酸（ＰＬＡ）；中、トランス－桂皮酸（ＣＡ）；下、トランス－フェルラ酸（ＦＡ）。（Ｂ）ＵＧＴ８４Ａ２７発現のため操作された酵母による、供給されたフェニルプロパノイドのグルコシドへの変換率のヒートマップ。ＵＧＴ８４Ａ２７オルソログまたはＢＦＰ陰性対照を、ＣＳＹ１２５１の低コピープラスミドから発現した。形質転換細胞は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、５００μＭのＰＬＡ、ＣＡ、またはＦＡを添加した選択培地で７２時間培養した。データは、ｎ＝３の生物学的に独立した試料の平均±標準偏差を表す。 ＵＧＴ８４Ａ２７活性のクロマトグラフィーおよび質量分析の例を図示する。この図は、より完全なグルコシル化を可能にするために、図３３Ｂのように１２０時間培養したＣＳＹ１２５１でＡｂＵＧＴによるＰＬＡ、ＣＡ、およびＦＡの同族グルコシドへの変換を示す代表的なＬＣ－ＭＳ／ＭＳトレースを示す。ＰＬＡの場合、酸（各パネルの上部のトレース）およびグルコシド（各パネルの下のトレース）は、異なるＮＨ４ ＋付加親質量ならびに異なる保持時間によって区別した。ＣＡおよびＦＡの場合、迅速なフラグメンテーションでは、フェニルプロパノイドの断片によって生成される保持力の低いピークに基づいてグルコシドを検出する必要があった。 基質特異性を変化させるためのＡｂＵＧＴの構造情報に基づく活性部位工学技術を示す。この図は、ＰＬＡの活性を高める潜在的な変異を特定するためのＡｂＵＧＴ３Ｄ構造の構造解析を示す。（Ａ）ＵＤＰが結合したシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）サリチル酸ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼＵＧＴ７４Ｆ２（ＰＤＢ：５Ｖ２Ｋ）の結晶構造に基づいて構築された、ＡｂＵＧＴ８４Ａ２７のホモロジーモデル。ＰＬＡ（オレンジ）は、ドッキングシミュレーションに基づいて、ＵＤＰ－グルコース（ピンク）との好ましい結合ポーズで示される。（Ｂ）ドッキングしたＤ－ＰＬＡおよびＵＤＰ－グルコースを含むＡｂＵＧＴ活性部位の拡大図。ＰＬＡ選択性を改善するために同定された潜在的な変異（Ｆ１３０Ｙ、Ｌ２０５Ｆ、Ｉ２９２Ｑ）が示され、破線は、推定上の極性／水素結合の相互作用を示す。 ＡｂＵＧＴ８４Ａ２７活性部位変異体の基質特異性を示す。この図は、ＡｂＵＧＴ変異体の発現のために操作された酵母による、供給されたフェニルプロパノイドのグルコシドへの変換率のヒートマップを示す。ＡｂＵＧＴ野生型、活性部位変異体、またはＢＦＰ陰性対照は、ＣＳＹ１２５１の低コピープラスミドから発現した。形質転換細胞は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、５００μＭのＰＬＡ、ＣＡ、またはＦＡを添加した選択培地で７２時間培養した。データは、ｎ＝３の生物学的に独立した試料の平均±標準偏差を表す。 トロピン産生のために操作された酵母におけるＰＬＡグルコシドの段階的生合成を検証するＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示す。この図は、ＰＬＡグルコシドの段階的再構成のために操作された酵母株の培養培地からの多重反応モニタリング（ＭＲＭ）および抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）トレースを示す。培養物上清のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、株を非選択培地で７２時間増殖させた。クロマトグラムトレースは、３回の生物学的反復を代表するものである。 酵母におけるグルコースの２つの代謝運命について生合成経路の概略図を示す。この図は、解糖の阻害を介した、グルコシド産生に対するクエン酸の効果を示す。略語：ＨＸＫ、ヘキソキナーゼ；ＧＰＩ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ；ＰＦＫ、ホスホフルクトキナーゼ；ＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ；ＵＧＰ、ＵＤＰ－グルコースピロホスホリラーゼ。 操作された酵母の異種グルコシド産生に対するクエン酸補充の影響を示す。この図は、ＡｂＵＧＴ発現のために操作された酵母によるフェニルプロパノイド酸のグルコシドへの変換に対する２％クエン酸補充の影響を示す。菌株ＣＳＹ１２８８は、内因的に産生されたＰＬＡのグルコシル化を評価するために追加の補充なしで、または５００μＭのトランス桂皮酸（ＣＡ）またはトランスフェルラ酸（ＦＡ）の補充を伴う、２％クエン酸の有りまたは無しでの非選択培地で培養された。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、培養物を７２時間培養した。データはｎ＝３の生物学的に独立した試料（白丸）の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＵＤＰ－グルコース生合成酵素の過剰発現のために操作された酵母株における、相対的なＰＬＡグルコシド産生を示す。この図は、操作された酵母でのＰＬＡグルコシドの産生に対する、グルコシド前駆体ＵＤＰ－グルコースの生合成に関与する天然酵素の過剰発現の影響を示す。酵素または陰性対照（ＢＦＰ）は、ＣＳＹ１２８８株の低コピープラスミドから発現した。培養物上清中の代謝物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、菌株を選択培地で７２時間培養した。データはｎ＝３の生物学的に独立した試料（白丸）の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。対応する対象と比較して統計的有意性が示される。 内因性グルコシダーゼの破壊を有するＣＳＹ１２８８での相対的なＰＬＡグルコシド産生を示す。この図は、操作された酵母におけるＰＬＡグルコシドの蓄積に対する、３つの天然グリコシダーゼ遺伝子のそれぞれを破壊する影響を示す。菌株は、培養物上清のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、非選択培地で７２時間培養された。データはｎ＝３の生物学的に独立した試料（白丸）の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。対応する対象と比較して統計的有意性が示される。 ＡｂＣＹＰ８０Ｆ１を発現する操作された酵母細胞の液体培養におけるリットリンからの薬用ＴＡ前駆体ヒヨスチアミンアルデヒドの産生を示す、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示す。この図は、（Ｒ）－リットリンをヒヨスチアミンアルデヒドに変換するように操作された酵母株のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を示す。酵母株は、ＬＥＵ２選択マーカー、ＴＤＨ３プロモーター、およびＡ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ由来のリットリンムターゼＣＹＰ８０Ｆ１（ＡｂＣＹＰ８０Ｆ１）のコード配列を保有する低コピーＣＥＮ／ＡＲＳプラスミドを有するように操作されている。菌株はさらに、ＴＲＰ１選択マーカー、ＴＤＨ３プロモーター、および（ｉ）陰性対照としてのＢＦＰ、（ｉｉ）Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＣＰＲ（ＮＣＰ１）、または（ｉｉｉ）シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ） ＣＰＲ（ＡｔＡＴＲ１）のコード配列を保有する第２の低コピープラスミドを有する。酵母は、９６ウェルディープウェルマイクロタイタープレート内の、１ｍＭリットリンを補充した３００μＬの選択培地（－Ｌｅｕ－－Ｔｒｐ）中で、新たに形質転換したコロニーから増殖させた。３０℃、４６０ｒｐｍの振とうインキュベーターで４８時間増殖させた後、酵母をペレット化し、培地の上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。クロマトグラムのトレースは、最も豊富なＭＲＭ遷移（ｍ／ｚ＋２８８→１２４）に基づいてこれらの菌株によって産生されたヒヨスチアミンアルデヒドを示す。矢印は、推定のヒヨスチアミンアルデヒドのピークを示す。各トレースは、３つの試料を表す。 ヒヨスチアミン６β－ヒドロキシラーゼ／ジオキシゲナーゼ（Ｈ６Ｈ）のオルソログを発現する操作された酵母細胞の液体培養における、薬用ＴＡヒヨスチアミンからの薬用ＴＡスコポラミンの産生を示す。この図は、Ｈ６Ｈオルソログを発現する操作された酵母株による、（Ｓ）－ヒヨスチアミンから（Ｓ）－スコポラミンへの変換を示す。酵母株は、ＬＥＵ２選択マーカー、ＴＤＨ３プロモーター、および陰性対照としてのＢＦＰのコード配列、またはシロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）（ＤｓＨ６Ｈ）、Ａ．アクタングルス（Ａ．ａｃｕｔａｎｇｕｌｕｓ）（ＡａＨ６Ｈ）、Ｂ．アルボレア（Ｂ．ａｒｂｏｒｅａ）（ＢａＨ６Ｈ）、もしくはチョウセンアサガオ（Ｄ．ｍｅｔｅｌ）（ＤｍＨ６Ｈ）由来のＨ６Ｈバリアントを保有する低コピーＣＥＮ／ＡＲＳプラスミドを有するように操作されている。酵母は、９６ウェルディープウェルマイクロタイタープレート内の、１ｍＭヒヨスチアミンを補充した３００μＬの選択培地（－Ｌｅｕ）中で、新たに形質転換したコロニーから増殖させた。３０℃、４６０ｒｐｍの振とうインキュベーターで４８時間増殖させた後、酵母をペレット化し、培地の上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。データは、３回の生物学的反復の平均を表し、供給されたヒヨスチアミン中のスコポラミン混入物質の量に対して正規化されている。エラーバーは標準偏差を表す。スコポラミン相対力価は、ｍ／ｚ＋３０４→１３８ＭＲＭ遷移のピーク面積に基づいて定量化された。 ＤｓＨ６Ｈを発現する操作された酵母細胞の液体培養における、ヒヨスチアミンのスコポラミンへの変換に対する補因子の利用可能性と培地への補充の影響を図示する。この図は、操作された酵母における（Ｓ）－ヒヨスチアミンの（Ｓ）－スコポラミンへの変換に対する補因子補充の影響を示す。酵母株は、ＬＥＵ２選択マーカー、ＴＤＨ３プロモーター、および（ｉ）陰性対照としてのＢＦＰまたは（ｉｉｉ）Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ（ＤｓＨ６Ｈ）由来のヒヨスチアミン６β－ヒドロキシラーゼ／ジオキシゲナーゼのコード配列を保有する低コピーＣＥＮ／ＡＲＳプラスミドを有するように操作されている。酵母は、９６ウェルディープウェルマイクロタイタープレート内の、示された基質および／または補因子を補充した３００μＬの選択培地（－Ｌｅｕ）中で、新たに形質転換されたコロニーから増殖させた。３０℃、４６０ｒｐｍの振とうインキュベーターで４８時間増殖させた後、酵母をペレット化し、培地の上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。（Ｓ）－スコポラミン相対力価は、ｍ／ｚ＋３０４→１３８ＭＲＭ遷移の積分ピーク面積に基づいて定量化され、ＤｓＨ６Ｈを発現しすべての補因子と基質が補充された菌株に対して正規化された。データは３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。Ｈｙｏ、（Ｓ）－ヒヨスチアミン；２－ＯＧ、２－オキソグルタル酸；Ｌ－ＡＡ、Ｌ－アスコルビン酸。 組織同時発現データの分析により、Ａ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａトランスクリプトームから同定されたヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ遺伝子候補の階層的クラスタリングヒートマップを示す。この図は、ヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする可能性のあるＡ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａトランスクリプトームの転写産物の組織特異的発現プロファイルのクラスタリングを示す。各候補の転写産物の発現は、正規分布を使用して行ごとにスケーリングされる。樹状図は、組織特異的な発現プロファイルによる候補の階層的クラスタリングを示す。既知のＴＡ経路遺伝子は名称で識別され、推定ＨＤＨ候補は遺伝子座ＩＤで示される。黒い三角形は、活性についてスクリーニングされた候補を示し、二重の黒い三角形は、実験的に検証されたＨＤＨ活性を有する候補を示す。 ヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）候補を発現する操作された酵母細胞の液体培養における、リットリンからの薬用ＴＡスコポラミンの産生を図示する。この図は、操作された酵母における、Ａ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａのトランスクリプトームから同定されたＨＤＨ候補の活性の、実験的スクリーニングを示す。酵母株は、ゲノムに組み込まれた発現カセット内の構成的プロモーターからの、Ａ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａリットリンムターゼ（ＡｂＣＹＰ８０Ｆ１）およびＤ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍヒヨスチアミン６β－ヒドロキシラーゼ／ジオキシゲナーゼ（ＤｓＨ６Ｈ）を、ならびにＴＲＰ１選択マーカーとＴＤＨ３プロモーターを保有する低コピーＣＥＮ／ＡＲＳプラスミドからの１３のＨＤＨ候補のそれぞれのうちの１つを、発現するように操作されている。酵母は、９６ウェルディープウェルマイクロタイタープレート内の１ｍＭリットリンを補充した３００μＬの選択培地（－Ｔｒｐ）中で、新たに形質転換したコロニーから増殖させた。３０℃、４６０ｒｐｍの振とうインキュベーターで７２時間増殖させた後、酵母をペレット化し、培地の上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。ヒヨスチアミンアルデヒド相対力価は、ｍ／ｚ＋２８８→１２４ＭＲＭ遷移の積分ピーク面積に基づいて定量化され、ＨＤＨ候補の代わりにＢＦＰを発現する操作された菌株のピーク面積に正規化された。（Ｓ）－スコポラミン力価は、ｍ／ｚ＋３０４→１３８ＭＲＭ遷移の積分ピーク面積と純正のスコポラミン標準の検量線に基づいて定量化された。データは３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。 Ａ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ由来のヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼの三次元構造を図示する。この図は、テンプレートとしてのアメリカヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＰｔＳＡＤ；ＰＤＢ：１ＹＱＤ）の結晶構造に基づいて構築されたホモロジーモデルとしてのＡｂＨＤＨの構造の画像図（ｃａｒｔｏｏｎ）表示を示す。ＮＡＤＰＨとＺｎ２＋が活性部位に示される。挿入ボックスは、ＮＡＤＰＨとドッキングされたヒヨスチアミンアルデヒドを含むＡｂＨＤＨ活性部位の拡大図を示す。破線は、触媒作用にとって重要な相互作用を示す。 は、ＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースで最も近いタンパク質ヒットとともに、３つの同定されたＨＤＨオルソログ（ＡｂＨＤＨ、ＤｉＨＤＨ、ＤｓＨＤＨ）との系統樹を示す。この図は、ＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースのＢＬＡＳＴ検索に基づいて、密接に関連するタンパク質配列を有する３つの同定されたＨＤＨ酵素オルソログのクラスタリングを示す。示されている配列には、Ｅ値に基づく上位５０のＢＬＡＳＴｐヒットと、次の１００ランクから選択された１０の追加ヒットが含まれている。系統発生関係は、ＣｌｕｓｔａｌＸ２でｎ＝１０００回の試行でのブートストラップ近隣結合法を介して導出され、結果のツリーはＦｉｇＴｒｅｅソフトウェアで視覚化された。略語：ＡＤＨ、アルコールデヒドロゲナーゼ；ＣＡＤＨ、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ；ＭＴＤＨ、マンニトールデヒドロゲナーゼ；ＤＰＡＳ、デヒドロプレコンジロカルピン（Ｄｅｈｙｄｒｏｐｒｅｃｏｎｄｙｌｏｃａｒｐｉｎｅ）アセテートシンターゼ；８ＨＧＤＨ、８－ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ；ＧＤＨ、ゲラニオールデヒドロゲナーゼ；ＧＳ、ガイソシジン（ｇｅｉｓｓｏｓｃｈｉｚｉｎｅ）シンターゼ；ＲＥＤＸ、不特定のレドックスタンパク質。 ヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼオルソログを発現する操作された酵母細胞の液体培養における、リットリンからの薬用ＴＡスコポラミンの産生を図示する。この図は、操作された酵母で発現された、同定されたＨＤＨ酵素オルソログ間の活性の比較を示す。酵母株は、ゲノムに組み込まれた発現カセット内の構成的プロモーターからの、Ａ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａリットリンムターゼ（ＡｂＣＹＰ８０Ｆ１）およびＤ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍヒヨスチアミン６β－ヒドロキシラーゼ／ジオキシゲナーゼ（ＤｓＨ６Ｈ）を発現するように、かつ、ＴＲＰ１選択マーカーおよびＴＤＨ３プロモーターを保有する低コピーＣＥＮ／ＡＲＳプラスミドからの、３つのＨＤＨオルソログ（ＡｂＨＤＨ、ＤｉＨＤＨ、ＤｓＨＤＨ）のうちのいずれか１つを発現するように、かつ、ＬＥＵ２選択マーカーおよびＴＤＨ３プロモーターを保有する低コピーＣＥＮ／ＡＲＳプラスミドからの、ＤｓＨ６Ｈの追加のコピーを発現するように、操作されている。酵母は、９６ウェルディープウェルマイクロタイタープレート内の、１ｍＭリットリンを補充した３００μＬの選択培地（－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ）中で、新たに形質転換したコロニーから増殖させた。３０℃、４６０ｒｐｍの振とうインキュベーターで７２時間増殖させた後、酵母をペレット化し、培地の上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。ヒヨスチアミンアルデヒド相対力価は、ｍ／ｚ＋２８８→１２４ＭＲＭ遷移の積分ピーク面積に基づいて定量化され、ＤｓＨ６Ｈの代わりにＡｂＨＤＨおよびＢＦＰを発現する操作された菌株のピーク面積に正規化された。（Ｓ）－スコポラミン力価は、ｍ／ｚ＋３０４→１３８ＭＲＭ遷移の積分ピーク面積と純正のスコポラミン標準の検量線に基づいて定量化された。データは３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。 ＣＹＰ８０Ｆ１、ＨＤＨ、Ｈ６Ｈの発現のために操作された酵母による、供給されたリットリンのスコポラミンへの変換の実験的検証を図示する。この図は、リットリンのスコポラミンへの変換のために操作された酵母株の培養培地からの多重反応モニタリング（ＭＲＭ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳトレースを示す。菌株は、培養物上清中の代謝物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、１ｍＭリットリンを補充した非選択培地で７２時間培養した。右下のパネル（ＣＳＹ１２９４、スコポラミン）の濃色のトレースは、１２５ｎＭ（３８μｇ／Ｌ）のスコポラミン標準を表す。クロマトグラムトレースは、３回の生物学的反復の代表である。 ＳＣＰＬアシルトランスフェラーゼ（ＳＣＰＬ－ＡＴ）の、標準的な植物のＥＲから液胞への輸送および成熟経路を示す。この図は、典型的なＥＲから液胞へのタンパク質輸送経路とそれに続く植物のＳＣＰＬ－ＡＴの概略図を示しており、例としてＡ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａリットリンシンターゼ（ＡｂＬＳ）が示されている。丸で囲んだ数字は、（１）ＥＲ内腔と（２）ゴルジ体の成熟、（３）液胞への輸送、液胞（４）基質の移入、（５）産物の排出など、ＳＣＰＬ－ＡＴの発現と活性の主要なステップを示す。 操作された酵母で発現された、Ａ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａからの野生型リットリンシンターゼの共局在を示す。この図は、Ｎ末端ＧＦＰタグ付きＡｂＬＳ（ＧＦＰ－ＡｂＬＳ）の発現のために操作され、液胞膜染料剤ＦＭ４－６４で染色された酵母の、落射蛍光顕微鏡観察を示す。顕微鏡観察は、低コピープラスミドからＧＦＰ－ＡｂＬＳを発現するＣＳＹ１２９４で実行された。スケールバー、５μｍ。 シグナル配列の置換を介して、リットリンシンターゼを異なる酵母の細胞内コンパートメントに強制的に局在化させるための戦略を図示する。この図は、ＡｂＬＳの細胞内局在を改変して、異なるコンパートメントでの基質の利用可能性に対する潜在的な制限に対処するためのタンパク質工学的アプローチを図示する。（Ａ）シグナル配列スワッピングを介したＡｂＬＳの局在化を標的とした酵母細胞内コンパートメントの概略図。シグナル配列源タンパク質が、各コンパートメントに示される。（Ｂ）ＡｂＬＳシグナル配列置換のために選択された末端および残基。各シグナル配列ドメインを構成する残基は、ＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースの構造アノテーションに基づいて選択された。 タバコで発現し、デグリコシラーゼで処理された、野生型ＡｂＬＳのウエスタンブロットを示す。この図は、植物で発現するＡｂＬＳのグリコシル化改変タイプの同定を示す。Ｃ末端にＨＡタグ付けされたＡｂＬＳは、ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉で、アグロインフィルトレーション（ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を介して一時的に発現した。葉の粗抽出物は、未処理（レーン１：’－’）、あるいはペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ；レーン２：’Ｎ’）またはＯ－グリコシダーゼ（レーン３：’Ｏ’）で処理して、それぞれＮ－またはＯ－結合型グリコシル化を除去したものであった。粗抽出物をＮｕＰＡＧＥ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルでの電気泳動により分離し、次にキメラウサギＩｇＧκ抗ＨＡ ＨＲＰコンジュゲート抗体を使用する免疫検出のためにニトロセルロース膜に移した。すべての電気泳動およびブロッティングステップは、ジスルフィド還元条件下で実行された（オンライン方法を参照されたい）。レーン「Ｌ」、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＤｕａｌＣｏｌｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｄｄｅｒ。 酵母とタバコで発現したＡｂＬＳグリコシル化部位変異体のウエスタンブロットを示す。この図は、酵母とタバコで発現したＡｂＬＳに存在するＮ－グリコシル化パターンの比較を示す。Ｃ末端ＨＡタグ付き野生型ＡｂＬＳ、単一グリコシル化部位点変異体（Ｎ→Ｑ）、または４重（ｑｕａｄｒｕｐｌｅ）変異体は、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（’Ｎｂ’）のアグロインフィルトレーションを介して（Ａ）、またはＣＳＹ１２９４（「酵母」）の低コピープラスミドから（Ｂ）、一時的に発現させた。タバコおよび酵母の粗抽出物の調製は、変性、ジスルフィド還元条件下で実行された（オンライン方法を参照されたい）。粗抽出物をＮｕＰＡＧＥ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルでの電気泳動により分離し、次にキメラウサギＩｇＧκ抗ＨＡ ＨＲＰコンジュゲート抗体を使用する免疫検出のためにニトロセルロース膜に移した。すべての電気泳動およびブロッティングステップは、ジスルフィド還元条件下で実行された（オンライン方法を参照されたい）。（Ａ）および（Ｂ）については、比較のために対応する酵母およびタバコで発現された対照が含まれる。レーン「Ｌ」、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＤｕａｌＣｏｌｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｄｄｅｒ。 リットリンシンターゼにおける推定エンドプロテオリシスの（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）プロペプチド除去の系統発生的同定を示す。この図は、ＡｂＬＳと、タンパク質分解的に除去される内部プロペプチドリンカー（太字、灰色）を有する（ＡｔＳＣＴ、ＡｓＳＣＰＬ１、ＴａＣＢＰ２）または欠く（ＡｔＳＭＴ、ｙＰＲＣ１）ことが知られている、特徴づけられたセリンカルボキシペプチダーゼおよびＳＣＰＬアシルトランスフェラーゼとの、配列アラインメントを示す。推定上のＮ末端シグナルペプチドは太字（黒）で示され、ジスルフィド結合は接続線として示される。ＡｔＳＣＴ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのシナポイルグルコース：コリンシナポイルトランスフェラーゼ；ＡｔＳＭＴ、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａシナポイルグルコース：リンゴ酸シナポイルトランスフェラーゼ；ＡｂＬＳ、ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）リットリンシンターゼ；ＡｓＳＣＰＬ１、セイヨウチャヒキ（Ａｖｅｎａ ｓｔｒｉｇｏｓａ）アベナシンシンターゼ；ＴａＣＢＰ２、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）カルボキシペプチダーゼ２；ｙＰＲＣ１、酵母カルボキシペプチダーゼＹ。上から下へ：配列番号３０～３５。 リットリンシンターゼにおける推定エンドプロテオリシスのプロペプチド除去の構造的同定を示す。この図は、２つのＳＣＰＬ－ＡＴの三次元構造の比較を示し、そのうちの１つは、タンパク質分解によって除去される内部プロペプチド配列を含むことが知られている。左：（上）画像図でのおよび（下）表面表現での、ＴａＣＢＰ２（ＰＤＢ：１ＷＨＴ）の結晶構造であり、ジスルフィド結合と内部プロペプチド除去部位を示す。右：（上）画像図でのおよび（下）表面表現での、ＴａＣＢＰ２の結晶構造に基づくＡｂＬＳのホモロジーモデルであり、Ｎ末端シグナルペプチド、ジスルフィド結合、および活性部位へのアクセスをブロックするように見える推定内部プロペプチドを示す。 酵母におけるＡｂＬＳスプリット対照および推定プロペプチド交換バリアントの、タンパク質分解的切断パターンの分析を示す。この図は、操作された酵母で発現されたＡｂＬＳスプリット対照およびプロペプチドバリアントによって生成されたタンパク質フラグメントサイズのウエスタンブロット分析を示す。Ｃ末端にＨＡタグ付けされたＡｂＬＳバリアントは、ＣＳＹ１２９４の低コピープラスミドから発現し（レーン１～６）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）（Ｎｂ）で発現したＨＡタグ付き野生型ＡｂＬＳは、追加の対照として示される（レーン７）。ゲル電気泳動とブロッティングはジスルフィド還元条件下で行い、検出は抗ＨＡ抗体を使用して実行した（オンライン方法を参照されたい）。レーン記号：Ｌ、タンパク質分子量ラダー；ＷＴ、野生型ＡｂＬＳ；ＳＰＬ、両方の断片にシグナルペプチドを有する、推定プロペプチドで分割されたＡｂＬＳ；ＳＰＬ－Ｔ、どちらの断片にもシグナルペプチドを含まない、推定プロペプチドで分割されたＡｂＬＳ；ＧＳ、野生型プロペプチドが可動性Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーに交換されたＡｂＬＳバリアント；ＳＣＴ、野生型プロペプチドがＡｔＳＣＴプロペプチド配列と交換されたＡｂＬＳバリアント；ＣＵＴ、Ｋｅｘ２ｐプロテアーゼによって認識および切断される合成ポリアルギニン部位と交換された野生型プロペプチドを有するＡｂＬＳバリアント。 ＡｂＬＳのＮ末端融合体の発現のために操作された酵母株における、ヒヨスチアミンおよびスコポラミンのデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）産生を図示する。この図は、Ｎ末端に融合した異なる可溶性タンパク質ドメインを持つＡｂＬＳを発現する酵母株における、ヒヨスチアミンおよびスコポラミンのデノボ産生の比較を示す。野生型（対照）またはＡｂＬＳ融合体は、ＣＳＹ１２９４の低コピープラスミドから発現された。形質転換株は、培養物上清中の代謝物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、選択培地で９６時間培養された。データはｎ＝３の生物学的に独立した試料（白丸）の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 液胞のＴＡ輸送制限を軽減するために、ＣＳＹ１２９６で発現したタバコアルカロイドトランスポーターの蛍光顕微鏡観察を示す。この図は、細胞内局在の確認を可能にするために、Ｃ末端でＧＦＰに融合したタバコアルカロイドトランスポーターを発現する操作された酵母の蛍光顕微鏡画像を示す。（Ａ）ＮｔＪＡＴ１および（Ｂ）ＮｔＭＡＴＥ２の、Ｃ末端ＧＦＰ融合体は、ＣＳＹ１２９６の低コピープラスミドから発現された。スケールバー、５μｍ。 異種アルカロイドトランスポーターの発現のために操作されたＣＳＹ１２９６における、トロピン、ヒヨスチアミン、およびスコポラミンの産生を示す。この図は、ＴＡ産生のために操作された酵母の細胞内基質輸送制限を軽減する上でのさまざまな植物アルカロイドトランスポーターの有用性を示す。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ） ジャスモン酸誘導性アルカロイドトランスポーター１（ＮｔＪＡＴ１）、多剤および毒素排出（ＭＡＴＥ）トランスポーター１もしくは２、または陰性対照（ＢＦＰ）は、ＣＳＹ１２９６の低コピープラスミドから発現させた。形質転換株は、培養物上清中の代謝物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、選択培地で９６時間培養された。データはｎ＝３の生物学的に独立した試料（白丸）の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 （Ａ）産物イオンモードおよび（Ｂ）多重反応モニタリングモードでのＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示し、操作された酵母での非天然ＴＡシンナモイルトロピンのデノボ産生を示す。この図は、非天然ＴＡシンナモイルトロピンを産生する操作された酵母株のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を示す。（Ａ）（ｉ）トロピン産生株ＣＳＹ１２５１、（ｉｉ）フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＡｔＰＡＬ１）、４－クマル酸－ＣｏＡリガーゼ５（Ａｔ４ＣＬ５）、およびコカインシンターゼ（ＥｃＣＳ）を発現するＣＳＹ１２５１（ＣＳＹ１２８２と表記）、または（ｉｉｉ）ｍ／ｚ＋＝２７２の親質量に対する純正のシンナモイルトロピン標準の、細胞外培地のタンデムＭＳ／ＭＳスペクトル。青いひし形は、親化合物のピークを示す。（Ｂ）基質供給を介した桂皮酸およびα－トロピンに対するＥｃＣＳアシルトランスフェラーゼ活性の検証。菌株は、ＡｔＰＡＬ１（低コピープラスミドｐＣＳ４２５２）および／またはＡｔ４ＣＬ５とＥｃＣＳ（高コピープラスミドｐＣＳ４２０７）を発現するプラスミドの組み合わせで形質転換され、以下のような異なる基質を補充した培地で培養した：（ｉ）ＣＥＮ．ＰＫ２＋Ａｔ４ＣＬ５＋ＥｃＣＳ＋０．１ｍＭトランス－桂皮酸、（ｉｉ）ＣＥＮ．ＰＫ２＋Ａｔ４ＣＬ５＋ＥｃＣＳ＋０．５ｍＭのα－トロピン、（ｉｉｉ）ＣＥＮ．ＰＫ２＋ＡｔＰＡＬ１＋Ａｔ４ＣＬ５＋ＥｃＣＳ；（ｉｖ）ＣＥＮ．ＰＫ２＋ＡｔＰＡＬ１＋Ａｔ４ＣＬ５＋ＥｃＣＳ＋０．５ｍＭのα－トロピン、（ｖ）ＣＳＹ１２５１＋Ａｔ４ＣＬ５＋ＥｃＣＳ、（ｖｉ）ＣＳＹ１２５１＋Ａｔ４ＣＬ５＋ＥｃＣＳ＋０．２ｍＭのトランス－桂皮酸、（ｖｉｉ）ＣＳＹ１２５１＋ＡｔＰＡＬ１＋Ａｔ４ＣＬ５＋ＥｃＣＳ、（ｖｉｉｉ）２５ｎＭシンナモイルトロピン標準。（Ａ）および（Ｂ）の場合、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、酵母株を選択培地（ＹＮＢ－ＤＯ＋２％デキストロース＋５％グリセロール）で２５℃で７２時間培養した。 操作された酵母の液体培養におけるトロピンおよび関連するＴＡ前駆体の産生に対する、（Ａ）単独で供給された、または（Ｂ）デキストロースと一緒に供給された、さまざまな炭素源の影響を図示する。この図は、操作された酵母のトロピン産生を改善するための炭素源の最適化を示す。トロピン産生株ＣＳＹ１２４９（実施例３．３．４を参照）の一晩培養物を非選択的富栄養培地（ＹＰＤ）で増殖させた。一晩培養物をペレット化し、すべてのアミノ酸および（Ａ）２％の各炭素源または（Ｂ）２％デキストロース、およびデキストロースを含む追加の２％の各炭素源を含む非選択的定義培地（ＹＮＢ－ＳＣ）に再懸濁した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる増殖培地の分析の前に、培養物を２５℃で４８時間増殖させた。データは、（Ａ）２％デキストロースまたは（Ｂ）２％＋２％デキストロースに対して正規化された、各代謝物の相対力価を示す。データは３回の生物学的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。 スコポラミン産生株ＣＳＹ１２９６の代謝ボトルネック分析を図示する。この図は、操作された酵母におけるＴＡおよびＴＡ前駆体の産生に対するフラックス制限酵素の追加コピーの発現の影響を示す。トロピンとスコポラミンの間の各生合成酵素の追加コピーは、ＣＳＹ１２９６株の以下の低コピープラスミドから発現された：（Ａ）ＷｆＰＰＲ、ｐＣＳ４４３６；（Ｂ）ＡｂＵＧＴ、ｐＣＳ４４４０；（Ｃ）ＤｓＲｅｄ－ＡｂＬＳ、ｐＣＳ４５２６；（Ｄ）ＡｂＣＹＰ８０Ｆ１、ｐＣＳ４４３８；（Ｅ）ＤｓＨＤＨ、ｐＣＳ４４７８；（Ｆ）ＤｓＨ６Ｈ、ｐＣＳ４４３９；または、各生合成遺伝子プラスミドと同じ栄養要求性マーカーに対応するＢＦＰ対照（ｐＣＳ４２０８、ｐＣＳ４２１２、またはｐＣＳ４２１３）。形質転換株を適切な選択培地で２５℃で９６時間培養した後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで増殖培地中の代謝物を定量した。データは、ｎ＝３の生物学的に独立した試料（白丸）の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 操作された酵母におけるヒヨスチアミンとスコポラミンの産生に対する、フラックスと輸送の制限を軽減する影響を示す。この図は、酵母菌株ＣＳＹ１２９６およびＣＳＹ１２９７における、ヒヨスチアミンおよびスコポラミンのデノボ産生の比較を示し、後者はフラックス制限酵素（ＷｆＰＰＲおよびＤｓＨ６Ｈ）の追加のゲノムコピーと、タバコ液胞アルカロイドインポーター（ＮｔＪＡＴ１）を有する。菌株は、培養物上清中の代謝物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、非選択培地で９６時間培養された。データはｎ＝３の生物学的に独立した試料（白丸）の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
定義
さらに詳細に例示的な実施形態を記載する前に、以下の定義を記載して、本説明で使用される用語の意味および範囲を説明しおよび定義する。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、２Ｄ ＥＤ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｋｈａｍ、ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、本明細書で使用される用語の多数の一般的な意味を当業者に提供する。さらに、参照を明確かつ容易にするために、特定の用語が以下で定義される。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。例えば、「プライマー」という用語は、１つ以上のプライマー、すなわち単一のプライマーおよび複数のプライマーを指す。特許請求の範囲はいかなる任意選択的な要素を除外するように起草されていることをさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「唯一の」などのような排他的な用語の使用または「否定的な」制限の使用のための先行基準としての役割を果たすことを意図している。
本明細書で使用される場合、「決定すること」、「測定すること」および「評価すること」、ならびに「アッセイすること」という用語は、交換可能に使用され、定量的および定性的決定の両方を含む。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、長さが２～５０アミノ酸の範囲のペプチドおよび長さが５０アミノ酸を超えるポリペプチドを含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。「ポリペプチド」という用語は、コード化および非コード化アミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸のポリマー、および従来のバックボーンが非天然または合成バックボーンで置き換えられた改変ペプチドバックボーンを有するポリペプチドを含む。ポリペプチドは、任意の都合のよい長さ、例えば、２個以上のアミノ酸、例えば４個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、５０個以上のアミノ酸、１００個以上のアミノ酸、３００個以上のアミノ酸、例えば５００個または１０００個以上のアミノ酸であり得る。「ペプチド」は、２個以上のアミノ酸、例えば４個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、例えば最大５０個のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、長さが５個～３０個のアミノ酸である。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、精製前にその部分が関連する他の成分を少なくとも６０％含まず、少なくとも７５％含まず、少なくとも９０％含まず、少なくとも９５％含まず、少なくとも９８％含まず、さらには少なくとも９９％含まない、目的の部分を指す。
本明細書で使用される場合、「によってコードされる」という用語は、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、ポリペプチド配列またはその一部は、核酸配列によってコードされるポリペプチドからの３個以上のアミノ酸、例えば５個以上、８個以上、１０個以上、１５個以上、または２０個以上のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。この用語には、その配列によってコードされるポリペプチドと免疫学的に同定可能なポリペプチド配列も含まれる。
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。本明細書で使用される場合、典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」という用語は、目的の遺伝子の発現を指示することができ、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を意味するために交換可能に使用され、これはベクターの全部もしくは一部のゲノム組み込み、または染色体外要素としてのベクターの一過性もしくは遺伝的維持によって達成される。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターを含む。
「発現カセット」は、発現カセットのプロモーターに作動可能に連結されている目的の遺伝子／コード配列の発現を指示することができる任意の核酸構築物を含む。そのようなカセットは、発現カセットを標的細胞に導入するために、「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、または「遺伝子導入ベクター」に構築することができる。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
「複数」には、少なくとも２つのメンバーが含まれる。特定の場合において、複数は、１０以上、例えば、１００以上、１０００以上、１０，０００以上、１００，０００以上、１０６以上、１０７以上、１０８以上、または１０９以上のメンバーを有し得る。任意の実施形態では、複数は、２～２０のメンバーを有することができる。
「トロパンアルカロイド産物」という用語は、骨格が、シクロヘプタン環と炭素原子１および５を接続する窒素架橋を含む８－アザビシクロ［３．２．１］オクタンコア基とを含有する任意の分子を指すことを意図し、８－アザビシクロ［３．２．１］オクタニル基は、３位のエステル結合によってアシル基に共有結合し、ならびに／または８－アザビシクロ［３．２．１］オクタニル基が３位のヒドロキシル基で、および２、４、５、６、および／または７位で１つ以上のヒドロキシル基で、官能化されている。トロパンアルカロイド産物には、リットリン、ヒヨスチアミン、アトロピン、アニソダミン、スコポラミン、コカイン、および他の同様のトロピン／プソイドトロピン＋アシル基の天然または非天然のトロパンアルカロイド（例えば、カリステギン）が含まれるが、これらに限定されない。
「トロパンアルカロイド産物の前駆体」という用語は、炭素源および窒素源から生物によって生合成され得、そして１つ以上（例えば、１つまたは２つ）の生合成ステップでトロパンアルカロイド産物に変換され得る任意の分子を指すことを意図し、ここで、炭素源は、炭水化物、非炭水化物糖、糖アルコール、脂質、脂肪酸、または代謝経路を介して上記の炭素源の１つ以上に変換される基質であり、窒素源は、アンモニア、尿素、硝酸、亜硝酸、グルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびシトルリンを除く任意のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、または代謝経路を介して上記の窒素源の１つ以上に変換される任意の基質である。
「トロパンアルカロイド産物の誘導体」という用語は、分子の骨格がトロパンアルカロイド産物を含み、骨格自体を変更することなく官能基の付着によって当該トロパンアルカロイド産物とは異なる、未改変生物によって天然には産生されない任意の分子を指すことを意図している。本明細書で使用される場合、官能基の付着には、ヒドロキシル化、アルキル化およびＮ－アルキル化、アセチル化およびＮ－アセチル化、アシル化およびＮ－アシル化、ならびにハロゲン化が含まれるが、これらに限定されない。
数値範囲は範囲を定義する数を含む。
本明細書に記載の方法は、複数のステップを含む。各ステップは、必要に応じて、ステップ間で所定の時間が経過した後に実行することができる。したがって、各ステップを実行する間の時間は、１秒以上、１０秒以上、３０秒以上、６０秒以上、５分以上、１０分以上、６０分以上、および５時間以上であってもよい。特定の実施形態では、後続の各ステップは、前のステップの完了直後に実行される。他の実施形態では、ステップは、前のステップの完了後のインキュベーションまたは待機時間の後に、例えば、数分から一晩の待機時間の後に、実行され得る。
本明細書を通して用語の他の定義が現れてもよい。
詳細な説明
ヒヨスチアミンおよびスコポラミンなど、目的のトロパンアルカロイド（ＴＡ）を産生するように操作された宿主細胞が提供される。宿主細胞は、以下から選択される１つ以上の操作された改変を有し得る：酵素遺伝子の変異を軽減するフィードバック阻害、生合成酵素遺伝子の転写調節改変、酵素の不活性化変異、および異種コード配列。本発明の方法で使用が見出される、宿主細胞および組成物、例えば、キット、システムなどを使用して、目的のＴＡを産生する方法も提供される。
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、したがって、それ自体が変更され得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されることになるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定することを意図していないこともまた理解されるべきである。
値の範囲が提供される場合、文脈上明確に指示されていない限り、下限の単位の１０分の１までのそれぞれの介在値は、その範囲の上限および下限と、その記載された範囲内の記載された他の値または介在値との間で、本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さい範囲に含めてもよく、また本発明に包含され、記載された範囲内で特に除外された任意の制限も受ける。記載された範囲が限界の片方または両方を含む場合、限界を含んだ範囲のいずれかまたは両方を除外することもまた、本発明に含まれる。
ある特定の範囲は、数値の前に「約」という用語が付された状態で本明細書に提示される。「約」という用語は、それが先行する正確な数字、およびその用語が先行する数字に近接または近似する数字に逐語的支持を提供するために本明細書において使用される。数が特定の列挙された数に近接または近似するかどうかを決定するにあたり、近接または近似の列挙されていない数は、それが提示されている文脈において具体的に列挙された数と実質的に等価な数であり得る。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料はまた、本発明の実施または試験においても使用することができるが、代表的で例示的な方法および材料をここで説明する。
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、それぞれ個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用される関連する方法および／または材料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に関するものであり、本発明が先行発明のためにその刊行物に先行する権限を有しないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供されている公表日は、実際の公表日とは異なることがあり、別途確認する必要がある可能性がある。
本開示を読む際に当業者に明らかであるように、本明細書に説明および例証される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離することができるか、または該特徴と組み合わせることができる個別の要素および特徴を有する。何らかの列挙された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能であるその他の順序で実施することができる。
本発明をさらに説明する際に、目的のＴＡ前駆体、ＴＡ、およびＴＡの誘導体を含むＴＡの改変が、最初により詳細に記載され、続いて、それを産生するための宿主細胞が記載される。次に、宿主細胞の使用が見出される目的の方法が概説される。本発明の方法を実施する際に使用することができるキットも記載されている。
トロパンアルカロイド（ＴＡ）前駆体
上に要約したように、トロパンアルカロイド前駆体（ＴＡ前駆体）を産生する宿主細胞が提供される。ＴＡ前駆体は、（例えば、本明細書に記載されるような）目的のＴＡの産生をもたらす合成経路（例えば、本明細書に記載されるような）における任意の中間体または前駆体化合物であり得る。場合によっては、ＴＡ前駆体は、ＴＡまたはその誘導体として特徴付けられ得る構造を有する。場合によっては、ＴＡ前駆体は、ＴＡの断片として特徴付けられ得る構造を有する。場合によっては、ＴＡ前駆体は初期ＴＡである。本明細書で使用される場合、「初期ＴＡ」とは、細胞における目的のＴＡの合成における初期中間体を意味し、初期ＴＡは、宿主細胞原料または単純な出発化合物から宿主細胞によって産生される。場合によっては、初期ＴＡは、細胞に出発化合物を添加する必要なしに、宿主細胞原料（例えば、炭素および栄養源）からのみ対象宿主細胞によって産生されるＴＡ中間体である。初期ＴＡという用語は、初期ＴＡ自体がトロパンアルカロイドとして特徴付けられ得るかどうかにかかわらず、目的のＴＡ最終産物の前駆体を指すことができる。
場合によっては、ＴＡ前駆体は、プレトロピントロパンアルカロイドまたはプレリットリントロパンアルカロイドなどの初期ＴＡである。このように、プレトロピントロパンアルカロイド（プレトロピンＴＡ）およびプレリットリントロパンアルカロイド（プレリットリンＴＡ）を産生する宿主細胞が提供される。トロピンは、リットリンから誘導される薬用ＴＡ製品などの最終産物を産生するための細胞工学的取り組みによる下流のＴＡの合成における重要な主要分岐点中間体である（図２）。対象の宿主細胞は、トロピン、リットリン、および下流のＴＡ最終産物の産生に使用が見出され得る単純で安価な出発物質からＴＡ前駆体を産生することができる。
本明細書で使用される場合、「エステル化前トロパンアルカロイド」、「エステル化前ＴＡ」、および「エステル化前ＴＡ前駆体」という用語は交換可能に使用され、リットリン、シンナモイルトロピン、またはエステル化前駆体自体の構造がトロパンアルカロイドとして特徴付けられるかどうかに係わりなく、アシル供与体およびアシル受容体エステル化の他の産物の、生合成前駆体を指す。エステル化前ＴＡという用語は、リットリンなどのエステル化生成物をもたらす可能性のある宿主細胞生合成経路の任意の便利なメンバーの生合成前駆体、中間体、およびそれらの代謝物を含むことを意味する。場合によっては、プレエステル化ＴＡは、トロピン断片、フェニルプロパノイド断片、またはそれらの前駆体もしくは誘導体などのトロパンアルカロイド断片を含む。特定の例では、プレエステル化ＴＡは、トロパンアルカロイドまたはその誘導体として特徴付けられ得る構造を有する。
目的のＴＡ前駆体には、トロピンおよびフェニル乳酸（ＰＬＡ）、ならびにアルギニン、オルニチン、アグマチン、Ｎ－カルバモイルプトレシン（ＮＣＰ）、プトレシン、Ｎ－メチルプトレシン（ＮＭＰ）、４－メチルアミノブタナール、Ｎ－メチルピロリニウム（ＮＭＰｙ）、４－（１－メチル－２－ピロジニル）－３－オキソブタン酸（ＭＰＯＢ）、トロピノン、フェニルアラニン、プレフェン酸、およびフェニルピルビン酸（ＰＰＡ）などのトロピンおよびＰＬＡ前駆体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＡ前駆体は、トロピンおよびＰＬＡである。特定の例では、１つ以上のＴＡ前駆体は、トロピンおよび桂皮酸などのＰＬＡ以外のフェニルプロパノイドカルボン酸である。図１、２、および３は、さまざまなＴＡおよび非ＴＡ前駆体分子からの非薬用、薬用、および非天然ＴＡの生合成をそれぞれ図示する。
ＴＡ前駆体への合成経路は、宿主細胞で起こり得、そして任意の便利な出発化合物（複数可）または材料で開始され得る。図１～４は、アミノ酸から開始するＴＡ前駆体への目的の合成経路を示している。出発物質は、天然に存在しない場合もあれば、出発物質が宿主細胞に天然に存在する場合もある。宿主細胞に存在する合成経路に基づいて、任意の便利な化合物および材料を出発物質として使用することができる。出発物質の供給源は、宿主細胞自体、例えば、アルギニンまたはフェニルアラニンから誘導され得るか、または出発物質は、外部供給源から宿主細胞に添加または補充され得る。したがって、場合によっては、出発化合物は、増殖原料または細胞増殖培地の一部ではない外部供給源から宿主細胞に添加される、細胞の合成経路中の化合物を指す。対象となる出発化合物には、Ｎ－メチルプトレシン、４－メチルアミノブタナール、トロピノン、トロピン、ＰＬＡ、桂皮酸、および図１～４に示す任意の化合物が含まれるが、これらに限定されない。例えば、宿主細胞が液体培養で増殖している場合、細胞培地は、細胞に輸送され、細胞によって所望の産物に変換される出発物質で補充され得る。関心のある出発物質には、安価な原料および単純な前駆体分子が含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、宿主細胞は、出発物質として単純な炭素源を含む原料を利用し、これを宿主細胞は、細胞の合成経路の化合物を産生するために利用する。宿主細胞増殖原料は、セルロース、デンプン、遊離糖などの炭素源、およびアンモニウム塩または安価なアミノ酸などの窒素源などの１つ以上の成分を含み得る。場合によっては、出発原料として使用される増殖原料は、スイッチグラスおよび藻類などの耕作限界地で成長したバイオマス、または他の産業活動または農業活動からのバイオマス廃棄物などの持続可能な供給源から得られる場合がある。
トロパンアルカロイド（ＴＡ）
上に概要を述べたように、目的のトロパンアルカロイド（ＴＡ）を産生する宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本発明の操作された株は、トロピンおよびＰＬＡから誘導されるものなどの薬用ＴＡ；トロピノン、プソイドトロピン、またはノルプソイドトロピンから誘導されるものなどの非薬用ＴＡ；あるいはトロピンおよびＰＬＡ以外のＴＡ前駆体（例えば、アシル供与体およびアシル受容体化合物）のエステル化から誘導されるものなどの非天然ＴＡを含むがこれらに限定されないいくつかのクラスにわたって、目的のトロパンアルカロイドおよびその改変物を産生するためのプラットフォームを提供する。これらのクラスのそれぞれは、クラスのメンバーにつながる可能性のある宿主細胞生合成経路の任意の便利なメンバーの生合成前駆体、中間体、およびそれらの代謝産物を含むことを意図している。これらのクラスのそれぞれについて、化合物の非限定的な例を以下に示す。いくつかの実施形態では、所与の実施例の構造は、それ自体をトロパンアルカロイドとして特徴付けることができる場合とできない場合がある。本化学物質は、単一のエナンチオマー、ラセミ混合物、光学的に純粋な形態、ジアステレオマーの混合物および中間混合物を含む、すべての可能な異性体を含むことを意図している。
薬用ＴＡには、植物によって自然に産生されるリットリン、ヒヨスチアミン、アトロピン、アニソダミン、スコポラミン、およびそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
非薬用ＴＡには、植物によって自然に産生されるカリステギン、コカイン、およびそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
非天然ＴＡには、シンナモイルトロピン、シンナモイル－３β－トロピン、クマロイルトロピン、クマロイル－３β－トロピン、ベンゾイルトロピン、ベンゾイル－３β－トロピン、カフェオイルトロピン、カフェオイル－３β－トロピン、フェルロイルトロピン、およびフェルロイル－３β－トロピンが含まれ得るが、これらに限定されない。
誘導体を含むＴＡの改変
上に概要を述べたように、目的のトロパンアルカロイド（ＴＡ）の改変誘導体を産生する宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本発明の操作された株は、操作された宿主細胞によって産生される、または増殖培地中の操作された宿主細胞に供給されるＴＡ前駆体、薬用ＴＡ、非薬用ＴＡ、および非天然ＴＡを誘導することを含む、目的のＴＡを誘導するためのプラットフォームを提供する。
本明細書で使用される場合、「誘導体化」、「官能化」、「誘導体化による改変」、および「官能化による改変」という用語は、ＴＡ骨格自体を改変することなく、官能基の付着を介したＴＡまたはＴＡ前駆体の改変を指す。本明細書で使用される場合、官能基の付着には、ヒドロキシル化、アルキル化およびＮ－アルキル化、アセチル化およびＮ－アセチル化、アシル化およびＮ－アシル化、ならびにハロゲン化が含まれるが、これらに限定されない。
本発明のいくつかの実施形態では、目的のＴＡの誘導体化は、事前に官能化されたＴＡ前駆体、例えば、ハロゲン化またはアルキル化アミノ酸を、供給されたＴＡ前駆体を取り込んで次に目的のＴＡに変換するように操作された宿主細胞に供給することによって酵素的に達成され得る。本発明の他の実施形態では、目的のＴＡの誘導体化は、未改変のＴＡを産生するのに必要な酵素および細胞改変に加えて、標的ＴＡに官能基を付着させるのに所望の活性を有する酵素を発現するように、宿主細胞を操作することによって酵素的に達成され得る。本発明の他の実施形態では、目的のＴＡの誘導体化は、操作された宿主細胞によって産生された未改変ＴＡを、所望の官能基を付着することができる精製酵素で、または所望の誘導体化活性を有する酵素を発現するように操作された宿主細胞の粗溶解物で処理することによって酵素的に達成され得る。本発明の他の実施形態では、目的のＴＡの誘導体化は、操作された宿主細胞によって産生された未改変ＴＡを、所望の官能基を付着した化学薬品で処理することによって非酵素的に達成され得る。
ＴＡの改変誘導体には、ｐ－ヒドロキシアトロピン、ｐ－ヒドロキシヒヨスチアミン、ｐ－フルオロヒヨスチアミン、ｐ－クロロヒヨスチアミン、ｐ－ブロモヒヨスチアミン、ｐ－フルオロスコポラミン、ｐ－クロロプスコポラミン、ｐ－ブロモスコポラミン、Ｎ－メチルヒヨスチアミン、Ｎ－ブチルヒヨスチアミン、Ｎ－メチルスコポラミン、Ｎ－ブチルスコポラミン、Ｎ－アセチルヒヨスチアミン、およびＮ－アセチルスコポラミンが含まれるが、これらに限定されない。
宿主細胞
上に概要を述べたように、本発明の一態様は、１つ以上の目的のＴＡを産生する宿主細胞である。任意の便利な細胞を対象の宿主細胞および方法で利用することができる。場合によっては、宿主細胞は非植物細胞である。場合によっては、宿主細胞は微生物細胞として特徴付けられ得る。ある場合では、宿主細胞は、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、または真菌細胞である。任意の便利なタイプの宿主細胞を、対象のＴＡ産生細胞の産生に利用することができ、例えば、米国特許第８，９７５，０６３号、ＵＳ２０１４／０２７３１０９およびＷＯ２０１４／１４３７４４として現在公開されているＵＳ２００８／０１７６７５４を参照されたい）、その開示は、その全体が参照により組み込まれている。関心のある宿主細胞には、これらに限定されないが、細菌細胞、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アセトバクテリウム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラキバクテリウム（Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）、ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｎｓｔｏｃ）、マクロコッカス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロセラ（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロシスティス（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、ムーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、プロクロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サイクロバクター（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、テトラゲノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、およびサルモネラ ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｉｕｍ）細胞、昆虫細胞、例えばキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ） Ｓ２およびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ） Ｓｆ９細胞、ならびに酵母細胞、例えばサッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス ポンべ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ヤロウィア リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス属の種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、リゾプス属の種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．）、ペニシリウム属の種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、およびトリコデルマ リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞、が含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。場合によっては、宿主細胞は、酵母細胞である。場合によっては、宿主細胞は、目的のＴＡを産生するように操作された酵母株に由来する。米国特許第８，９７５，０６３号、ＵＳ２０１４／０２７３１０９およびＷＯ２０１４／１４３７４４として現在公開されているＵＳ２００８／０１７６７５４に記載されている宿主細胞のいずれも、対象の細胞および方法での使用に適合させることができる。特定の実施形態では、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種のものであり得る。特定の実施形態では、酵母細胞は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ種のものであり得る。特定の実施形態では、酵母細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ種のものであり得る。目的のいくつかの生合成経路に関与するシトクロムＰ４５０タンパク質は、小胞体膜に適切に折りたたまれてその活性が維持されるため、酵母は宿主細胞として重要である。
本発明で使用が見出される目的の酵母株には、ＣＥＮ．ＰＫ（遺伝子型：ＭＡＴａ／αｕｒａ３－５２／ｕｒａ３－５２ ｔｒｐ１－２８９／ｔｒｐ１－２８９ ｌｅｕ２－３＿１１２／ｌｅｕ２－３＿１１２ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１ＭＡＬ２－８Ｃ／ＭＡＬ２－８Ｃ ＳＵＣ２／ＳＵＣ２）、Ｓ２８８Ｃ、Ｗ３０３、Ｄ２７３－１０Ｂ、Ｘ２１８０、Ａ３６４Ａ、Σ１２７８Ｂ、ＡＢ９７２、ＳＫ１、およびＦＬ１００が含まれるが、これらに限定されない。特定の場合では、酵母株は、Ｓ２８８Ｃ（ＭＡＴα；ＳＵＣ２ ｍａｌ ｍｅｌ ｇａｌ２ ＣＵＰ１ ｆｌｏ１ ｆｌｏ８－１ ｈａｐ１）、ＢＹ４７４１（ＭＡＴα；ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０；ｍｅｔ１５Δ０；ｕｒａ３Δ０）、ＢＹ４７４２（ＭＡＴα；ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０；ｌｙｓ２Δ０；ｕｒａ３Δ０）、ＢＹ４７４３（ＭＡＴａ／ＭＡＴα；ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０／ｌｅｕ２Δ０；ｍｅｔ１５Δ０／ＭＥＴ１５；ＬＹＳ２／ｌｙｓ２Δ０；ｕｒａ３Δ０／ｕｒａ３Δ０）、およびＷＡＴ１１またはＷ（Ｒ）である、Ｗ３０３－Ｂ株の誘導体（ＭＡＴａ；ａｄｅ２－１；ｈｉｓ３－１１、－１５；ｌｅｕ２－３、－１１２；ｕｒａ３－１；ｃａｎＲ；ｃｙｒ＋）（それぞれＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａＮＡＤＰＨ－Ｐ４５０レダクターゼＡＴＲ１および酵母ＮＡＤＰＨ－Ｐ４５０レダクターゼＣＰＲ１を発現する）のいずれかである。別の実施形態では、酵母細胞は、Ｗ３０３ａｌｐｈａ（ＭＡＴα；ｈｉｓ３－１１，１５ ｔｒｐ１－１ ｌｅｕ２－３ ｕｒａ３－１ ａｄｅ２－１）である。関心のあるさらなる酵母菌株の同一性と遺伝子型は、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ（ｗｅｂ．ｕｎｉ－ｆｒａｎｋｆｕｒｔ．ｄｅ／ｆｂ１５／ｍｉｋｒｏ／ｅｕｒｏｓｃａｒｆ／ｃｏｌ＿ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に見出すことができる。
場合によっては、宿主細胞は、真菌細胞である。特定の実施形態では、真菌細胞はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種のものであり得、菌株には、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（ＡＴＣＣ １０１５、ＡＴＣＣ ９０２９、ＣＢＳ ５１３．８８）、アスペルギルス オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（ＡＴＣＣ ５６７４７、ＲＩＢ４０）、アスペルギルス テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）（ＮＩＨ ２６２４、ＡＴＣＣ ２０５４２）およびアスペルギルス ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）（ＦＧＳＣ Ａ４）が含まれる。
特定の実施形態では、異種コード配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種における発現のためにコドン最適化され得、適切なプロモーターから発現され得る。特定の実施形態では、プロモーターは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、ＭｂｆＡプロモーター、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットプロモーター（ＣｏｘＡ）、ＳｒｐＢプロモーター、ＴｖｄＡプロモーター、リンゴ酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＭｄｈＡ）、ベータマンノシダーゼプロモーター（ＭａｎＢ）から選択され得る。特定の実施形態では、ターミネーターは、グルコアミラーゼターミネーター（ＧｌａＡ）またはＴｒｐＣターミネーターから選択され得る。特定の実施形態では、プロモーター、異種コード配列、およびターミネーターからなる発現カセットは、プラスミドから発現され得るか、または宿主のゲノムに組み込まれ得る。特定の実施形態では、プラスミドまたは組み込みカセットを維持する細胞の選択は、ハイグロマイシンなどの抗生物質選択、または唯一の窒素源としてアセトアミドを使用するなどの窒素源の利用によって実行することができる。特定の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、プロトプラスト形質転換、酢酸リチウム、またはエレクトロポレーションなどの確立された形質転換方法を使用して、宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、細胞は、選択の有無にかかわらず、液体ＭＥまたは固体ＭＥＡ（３％麦芽抽出物、０．５％ペプトン、および±１．５％寒天）でまたはフォーゲルの最少培地で培養され得る。
場合によっては、宿主細胞は、細菌細胞である。細菌細胞は、任意の細菌属から選択することができる。細菌細胞が由来する属の例には、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｆｎｉａ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｎｓｔｏｃ、Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓが含まれる。本開示の方法で使用可能な細菌種の例には、アルスロバクター ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、アセトバクター アセティ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ）、アルスロバクター アリライテンシス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｒｉｌａｉｔｅｎｓｉｓ）、バチルス セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ビフィドバクテリウム アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ブラキバクテリウム チロファーメンタンス（Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｙｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ブラビバクテリウム リネンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎｓ）、カルノバクテリウム ディバーゲンス（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム フラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、エンテロコッカス フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、グルコンアセトバクター ヨーロペウス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）、グルコンアセトバクター ヨハンナ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｊｏｈａｎｎａｅ）、グルコノバクター オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）、ハフニア アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）、ハロモナス エロンガタ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｎｇａｔａ）、コクリア リゾフィラ（Ｋｏｃｕｒｉａ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ）、ラクトバチルス アシディファリネ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｉｆａｒｉｎａｅ）、ラクトバチルス イェンセニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス ヤマナシエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ロイコノストック シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ）、マクロコッカス カセオリティクス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ミクロバクテリウム フォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｌｉｏｒｕｍ）、ミクロコッカス リラエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｌａｅ）、オエノコッカス オエニ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ）、ペディオコッカス アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、プロピオニバクテリウム アシディプロピオニシ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、プロテウス ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、シュードモナス フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、サイクロバクター セレー（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｌｅｒ）、スタフィロコッカス コンディメンティ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｄｉｍｅｎｔｉ）、ストレプトコッカス サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトマイセス グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、テトラゲノコッカス ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ワイセリア シバリア（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｉｂａｒｉａ）、ワイセリア コリエンシス（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、ザイモモナス モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）、コリネバクテリウム グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム ビフィダム／ブレベ／ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ／ｂｒｅｖｅ／ｌｏｎｇｕｍ）、ストレプトマイセス リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ラクトバチルス プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）、ラクトバチルス カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、シュードアルテロモナス シトレア（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｅａ）、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、クロストリジウム リュングダリイ／アセチカム／アセトブチリカム／ベイジェリンキイ／ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ／ａｃｅｔｉｃｕｍ／ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ／ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ／ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、およびムーレラ サーモセラム／サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｍｏｃｅｌｌｕｍ／ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）が含まれる。
特定の実施形態では、細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのものであり得る。特定の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉの株は、ＢＬ２１、ＤＨ５α、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、およびＫ１２から選択され得る。特定の実施形態では、異種コード配列は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化され得、適切なプロモーターから発現され得る。特定の実施形態では、プロモーターは、Ｔ７プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター（ｔｅｔ）、ｌａｃオペロンプロモーター（ｌａｃ）、ｌａｃＯ１プロモーターから選択され得る。特定の実施形態では、プロモーター、異種コード配列、およびターミネーターからなる発現カセットは、プラスミドから発現され得るか、またはゲノムに組み込まれ得る。特定の実施形態では、プラスミドは、ｐＵＣ１９またはｐＢＡＤから選択される。特定の実施形態では、プラスミドまたは組み込みカセットを維持する細胞の選択は、カナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシンまたはアンピシリンなどの抗生物質の選択を用いて実行され得る。特定の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、コンジュゲーション、熱ショック化学形質転換、またはエレクトロポレーションなどの確立された形質転換方法を使用して、宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、細胞は、抗生物質の有無にかかわらず、約３７℃で液体ルリア－ベルターニ（ＬＢ）培地で培養され得る。
特定の実施形態では、細菌細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの菌株であり得る。特定の実施形態では、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌株は、１７７９、ＧＰ２５、ＲＯ－ＮＮ－１、１６８、ＢＳｎ５、ＢＥＳＴ１９５、１Ａ３８２、および６２１７８から選択され得る。特定の実施形態では、異種コード配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種における発現のためにコドン最適化され得、適切なプロモーターから発現され得る。特定の実施形態では、プロモーターは、ｇｒａｃプロモーター、ｐ４３プロモーター、またはｔｒｎＱプロモーターから選択され得る。特定の実施形態では、プロモーター、異種コード配列、およびターミネーターからなる発現カセットは、プラスミドから発現され得るか、またはゲノムに組み込まれ得る。特定の実施形態では、プラスミドは、ｐＨＰ１３ ｐＥ１９４、ｐＣ１９４、ｐＨＴ０１、またはｐＨＴ４３から選択される。特定の実施形態では、ｐＤＧ３６４またはｐＤＧ１７３０などの組み込みベクターを使用して、発現カセットをゲノムに組み込み得る。特定の実施形態では、プラスミドまたは組み込みカセットを維持する細胞の選択は、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、およびスペクチノマイシンなどの抗生物質選択を用いて実行され得る。特定の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、自然の能力、熱ショック、または化学的形質転換などの確立された形質転換方法を使用して、宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、細胞は、３７℃の液体ルリア－ベルターニ（ＬＢ）培地、またはグルコースおよびトリプトファンを加えたＭ９培地で培養され得る。
宿主細胞の遺伝子改変
宿主細胞は、目的のＴＡの産生を提供する１つ以上の改変（２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはさらに多くの改変など）を含むように操作され得る。場合によっては、改変とは、遺伝子またはその断片の突然変異、付加、または欠失、あるいは遺伝子またはその断片の転写調節などの遺伝子改変を意味する。場合によっては、１つ以上（２つ以上、３つ以上、または４つ以上など）の改変が、以下から選択される：細胞生来の生合成酵素遺伝子の変異を軽減するフィードバック阻害、細胞生来の生合成酵素遺伝子の転写調節改変、細胞生来の酵素の不活性化変異、酵素をコードする異種コード配列、酵素または代謝産物の細胞内輸送および／または局在化を改変するタンパク質をコードする異種コード配列。１つ以上の改変を含む細胞は、改変された細胞と呼ばれ得る。
改変された細胞は、１つ以上の前駆体ＴＡ、ＴＡ、または改変されたＴＡ分子を過剰産生し得る。過剰産生とは、細胞が、対照細胞（例えば、未改変の細胞）と比較して、目的のＴＡ分子の産生が改善または増加していることを意味する。産生の改善または増加とは、対照がＴＡ前駆体の産生を有さない場合の目的ＴＡのある量の産生、ならびに対照にいくらかの目的のＴＡが産生される状況では、約１０％以上の、例えば約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上の、例えば２倍以上の、例えば５倍以上の、１０倍以上を含む、増加の両方を意味する。
場合によっては、宿主細胞は、（例えば、本明細書に記載されるように）１つ以上の改変を欠く対照宿主細胞と比較して、増加した量のプトレシンを産生することができる。特定の例では、プトレシンの増加量は、対照宿主細胞と比較して約１０％以上であり、例えば、対照宿主細胞と比較して、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、２倍以上、５倍以上、さらには１０倍以上である。
場合によっては、宿主細胞は、（例えば、本明細書に記載されるように）１つ以上の改変を欠く対照宿主細胞と比較して、増加した量のＮ－メチルピロリニウムを産生することができる。特定の例では、Ｎ－メチルピロリニウムの増加量は、対照宿主細胞と比較して約１０％以上であり、例えば、対照宿主細胞と比較して、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、２倍以上、５倍以上、さらには１０倍以上である。
場合によっては、宿主細胞は、（例えば、本明細書に記載されるように）１つ以上の改変を欠く対照宿主細胞と比較して、増加した量のトロピンを産生することができる。特定の例では、トロピンの増加量は、対照宿主細胞と比較して約１０％以上であり、例えば、対照宿主細胞と比較して、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、２倍以上、５倍以上、さらには１０倍以上である。
場合によっては、宿主細胞は、（例えば、本明細書に記載されるように）１つ以上の改変を欠く対照宿主細胞と比較して、増加した量のフェニルピルビン酸を産生することができる。特定の例では、フェニルピルビン酸の増加量は、対照宿主細胞と比較して約１０％以上であり、例えば、対照宿主細胞と比較して、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、２倍以上、５倍以上、さらには１０倍以上である。
場合によっては、宿主細胞は、（例えば、本明細書に記載されるように）１つ以上の改変を欠く対照宿主細胞と比較して、増加した量のフェニル乳酸を産生することができる。特定の例では、フェニル乳酸の増加量は、対照宿主細胞と比較して約１０％以上、例えば、対照宿主細胞と比較して、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、２倍以上、５倍以上、さらには１０倍以上である。
場合によっては、宿主細胞は、（例えば、本明細書に記載されるように）１つ以上の改変を欠く対照宿主細胞と比較して、増加した量のリットリンを産生することができる。特定の例では、リットリンの増加量は、対照宿主細胞と比較して約１０％以上であり、例えば、対照宿主細胞と比較して約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、２倍以上、５倍以上、さらには１０倍以上である。
場合によっては、宿主細胞は、（例えば、本明細書に記載されるように）１つ以上の改変を欠く対照宿主細胞と比較して、増加した量のヒヨスチアミンを産生することができる。特定の例では、ヒヨスチアミンの増加量は、対照宿主細胞と比較して約１０％以上であり、例えば、対照宿主細胞と比較して約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、２倍以上、５倍以上、さらには１０倍以上である。
場合によっては、宿主細胞は、（例えば、本明細書に記載されるように）１つ以上の改変を欠く対照宿主細胞と比較して、増加した量のスコポラミンを産生することができる。特定の例では、スコポラミンの増加量は、対照宿主細胞と比較して約１０％以上であり、例えば、対照宿主細胞と比較して約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、２倍以上、５倍以上、さらには１０倍以上である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、アルギニンなどの出発化合物から１０％以上の収率のトロピンを産生することができ、例えば、出発化合物から２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上の収率のトロピンを産生することができる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フェニルアラニンなどの出発化合物から１０％以上の収率のフェニル乳酸を産生することができ、例えば、出発化合物から２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、さらには９０％以上の収率のフェニル乳酸を産生することができる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、アルギニンまたはフェニルアラニンなどの出発化合物から１０％以上の収率のヒヨスチアミンを産生することができ、例えば、出発化合物から２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、さらには９０％以上の収率のヒヨスチアミンを産生することができる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、アルギニンまたはフェニルアラニンなどの出発化合物から１０％以上の収率のスコポラミンを産生することができ、例えば、出発化合物から２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、さらには９０％以上の収率のスコポラミンを産生することができる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、アルギニン、オルニチン、アグマチン、プトレシン、Ｎ－メチルプトレシン、４－メチルアミノブタナール、Ｎ－メチルピロリニウム、４－（１－メチル－２－ピロジニル）－３－オキソブタン酸、トロピノン、トロピン、フェニルアラニン、プレフェン酸、フェニルピルビン酸、フェニル乳酸、グルコース－１－Ｏ－フェニルラクテート、リットリン、ヒヨスチアミンアルデヒド、ヒヨスチアミン、アニソダミン、およびスコポラミンからなる群から選択される１つ以上の目的のＴＡ分子を過剰産生する。
１つ以上の改変の任意の便利な組み合わせが、対象の宿主細胞に含まれ得る。場合によっては、２つ以上（２つ以上、３つ以上、または４つ以上など）の異なるタイプの改変が含まれる。特定の例では、同じタイプの改変の２つ以上（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはそれ以上）の別個の改変が、対象細胞に含まれる。
宿主細胞のいくつかの実施形態では、細胞が１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種コード配列を含む場合、それは、以下からなる群から選択される少なくとも１つの追加の改変を含む：細胞生来の生合成酵素遺伝子における変異を軽減するフィードバック阻害、細胞生来の生合成酵素遺伝子の転写調節改変、および細胞生来の酵素の不活性化変異。宿主細胞の特定の実施形態では、細胞が、細胞生来の１つ以上の生合成酵素遺伝子における変異を軽減する１つ以上のフィードバック阻害を含む場合、それは、以下からなる群から選択される少なくとも１つの追加の改変を含む：細胞生来の生合成酵素遺伝子の転写調節改変、細胞生来の酵素の不活性化変異、および酵素をコードする異種コード配列。宿主細胞のいくつかの実施形態では、細胞が、細胞生来の１つ以上の生合成酵素遺伝子の１つ以上の転写調節改変を含む場合、それは、以下からなる群から選択される少なくとも１つの追加の改変を含む：細胞生来の生合成酵素遺伝子における変異を軽減するフィードバック阻害、細胞生来の酵素の不活性化変異、酵素をコードする異種コード配列、および酵素または代謝産物の細胞内輸送および／または局在化を改変するタンパク質をコードする異種コード配列。宿主細胞の特定の例では、細胞が、細胞生来の１つ以上の酵素における１つ以上の不活性化変異を含む場合、それは、以下からなる群から選択される少なくとも１つの追加の改変を含む：細胞生来の生合成酵素における変異を軽減するフィードバック阻害、細胞生来の生合成酵素遺伝子の転写調節改変、酵素をコードする異種コード配列、および酵素または代謝産物の細胞内輸送および／または局在化を改変するタンパク質をコードする異種コード配列。
宿主細胞の特定の実施形態では、細胞は、細胞生来の１つ以上の生合成酵素遺伝子における変異を軽減する１つ以上のフィードバック阻害、および細胞生来の１つ以上の生合成酵素遺伝子の１つ以上の転写調節改変を含む。宿主細胞の特定の実施形態では、細胞は、細胞生来の１つ以上の生合成酵素遺伝子における変異を軽減する１つ以上のフィードバック阻害、および細胞生来のある酵素における１つ以上の不活性化変異を含む。宿主細胞の特定の実施形態では、細胞は、細胞生来の１つ以上の生合成酵素遺伝子における変異を軽減する１つ以上のフィードバック阻害、および１つ以上の異種コード配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、表１に記載されている１つ以上の目的の遺伝子を含む１つ以上の改変（例えば、本明細書に記載されている）を含む。
変異を軽減するフィードバック阻害
場合によっては、宿主細胞は、細胞の１つ以上の生合成酵素遺伝子における変異を軽減する１つ以上のフィードバック阻害（２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはそれ以上など）を含む細胞である。場合によっては、１つ以上の生合成酵素遺伝子は細胞生来のものである（例えば、未改変の細胞に存在する）。本明細書で使用される場合、「フィードバック阻害軽減変異」という用語は、宿主細胞のフィードバック阻害制御機構を軽減する変異を指す。フィードバック阻害は、調節された化合物の合成経路の酵素が、その化合物が特定のレベルに蓄積したときに阻害され、それによって細胞内の化合物の量のバランスをとる細胞の制御機構である。場合によっては、変異を軽減する１つ以上のフィードバック阻害は、図１～４の生合成経路または図８の概略図に記載されている酵素にある。フィードバック阻害を軽減する変異は、対照細胞と比較して、目的の細胞における調節酵素の阻害を減少させ、調節化合物またはその下流の生合成産物のレベルの増加を提供する。場合によっては、調節酵素の阻害を軽減することは、阻害のＩＣ５０が２倍以上、例えば３倍以上、５倍以上、１０倍以上、３０倍以上、１００倍以上、３００倍以上、１０００倍以上、またはそれ以上増加することを意味する。増加したレベルとは、対照細胞またはその下流産物中の調節化合物のレベルの１１０％以上、例えば１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上、または２００％以上のレベルを意味し、例えば、少なくとも３倍以上、少なくとも５倍以上、少なくとも１０倍以上またはそれ以上の宿主細胞またはその下流産物中の調節された化合物のレベルを意味する。
ＴＡ前駆体のレベルの調節に向けられた、宿主細胞生来の様々なフィードバック阻害制御機構および生合成酵素が、宿主細胞における軽減の標的とされ得る。宿主細胞は、細胞生来の１つ以上の生合成酵素遺伝子の変異を軽減する１つ以上のフィードバック阻害を含み得る。変異は、生合成酵素が調節制御の対象となる、宿主細胞生来の任意の便利な生合成酵素遺伝子に位置し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の生合成酵素遺伝子は、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、オルニチンデカルボキシラーゼアンチザイム、およびプトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼから選択される１つ以上の酵素をコードする。いくつかの実施形態では、１つ以上の生合成酵素遺伝子は、オルニチンデカルボキシラーゼをコードする。場合によっては、１つ以上の生合成酵素遺伝子は、オルニチンデカルボキシラーゼアンチザイムをコードする。いくつかの実施形態では、１つ以上の生合成酵素遺伝子は、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼをコードする。特定の例では、変異を軽減する１つ以上のフィードバック阻害は、ＳＰＥ１、ＯＡＺ１、およびＰＭＴから選択される生合成酵素遺伝子に存在する。特定の例では、変異を軽減する１つ以上のフィードバック阻害は、ＳＰＥ１である生合成酵素遺伝子に存在する。特定の例では、変異を軽減する１つ以上のフィードバック阻害は、ＯＡＺ１である生合成酵素遺伝子に存在する。特定の例では、変異を軽減する１つ以上のフィードバック阻害は、ＰＭＴである生合成酵素遺伝子に存在する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、表１に記載されるそれらの遺伝子のうちの１つなどの１つ以上の生合成酵素遺伝子における変異を軽減する１つ以上のフィードバック阻害を含む。
任意の便利な数およびタイプの突然変異を利用して、フィードバック阻害制御機構を軽減することができる。本明細書で使用される場合、「変異」という用語は、参照配列またはモチーフに対するアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換を指す。変異は、元の遺伝子座のネイティブ遺伝子への有向突然変異として組み込まれる場合がある。場合によっては、突然変異は、別の遺伝子座での遺伝子統合として導入された遺伝子の追加コピーとして、または２μまたはセントロメアプラスミドなどのエピソームベクター上の追加コピーとして組み込まれることがある。特定の例では、酵素のフィードバック阻害コピーは、ネイティブ細胞の転写調節下にある。場合によっては、酵素のフィードバック阻害コピーは、合成プロモーターの制御下に置くことにより、タンパク質発現の操作された構成的または動的な調節によって導入される。
特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３以個上、１４以個上、または１５個以上の変異を軽減するフィードバック阻害を含むことができ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のフィードバック阻害が、宿主細胞生来の１つ以上の生合成酵素遺伝子の変異を軽減する。
転写調節の改変
宿主細胞は、細胞の１つ以上の生合成酵素遺伝子の１つ以上の転写調節改変（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはさらに多くの改変）を含み得る。場合によっては、１つ以上の生合成酵素遺伝子が細胞生来のものである。細胞の任意の便利な生合成酵素遺伝子は、転写調節の標的とされ得る。転写調節とは、改変された細胞における目的の遺伝子の発現が、対照細胞（例えば、改変されていない細胞）と比較して、調節されること、例えば、増加または減少、増強または抑制されることを意味する。場合によっては、目的の遺伝子の転写調節には、発現の増加または増強が含まれる。発現を増加または増強することは、目的の遺伝子の発現レベルが、対照、すなわち、改変されていない同じ細胞での発現と比較して、２倍以上、例えば５倍以上、時には２５倍、５０倍、または１００倍以上、特定の実施形態では、３００倍以上増加することを意味する（例えば、任意の便利な遺伝子発現アッセイを使用することによる）。あるいは、細胞内での目的の遺伝子の発現が非常に低く、検出できない場合、発現が容易に検出可能なレベルまで増加すれば、目的の遺伝子の発現レベルが増加したと見なされる。特定の例において、目的の遺伝子の転写調節には、発現の減少または抑制が含まれる。発現を減少または抑制することは、目的の遺伝子の発現レベルが、対照と比較して、２倍以上、例えば５倍以上、時には２５倍、５０倍、または１００倍以上、特定の実施形態では、３００倍以上またはそれ以上、減少することを意味する。場合によっては、発現が検出できないレベルまで減少する。対象の宿主細胞での使用に適合させることができる目的の宿主細胞プロセスの改変は、Ｓｍｏｌｋｅ ｅｔ ａｌ．による米国特許出願公開第２０１４／０２７３１０９（１４／２１１，６１１）に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
任意の便利な生合成酵素遺伝子は、転写調節することができ、ＡＲＧ２、ＣＡＲ１、ＳＰＥ１、ＦＭＳ１、ＰＨＡ２、ＡＲＯ８、ＡＲＯ９、およびＵＧＰ１などの図１～３に記載の生合成酵素が含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、１つ以上の生合成酵素遺伝子が、ＡＲＧ２、ＣＡＲ１、ＳＰＥ１、およびＦＭＳ１から選択される。場合によっては、１つ以上の生合成酵素遺伝子は、ＡＲＧ２である。特定の例では、１つ以上の生合成酵素遺伝子は、ＣＡＲ１である。いくつかの実施形態では、１つ以上の生合成酵素遺伝子は、ＳＰＥ１である。いくつかの実施形態では、１つ以上の生合成酵素遺伝子は、ＦＭＳ１である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、表１に記載されるこれらの遺伝子のうちの１つなどの１つ以上の遺伝子に対する１つ以上の転写調節改変を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、図１～４のうちの１つの生合成経路または図８の概略図に記載される遺伝子の１つなどの１つ以上の遺伝子に対する１つ以上の転写調節改変を含む。
いくつかの実施形態では、転写調節改変は、１つ以上の生合成酵素遺伝子の天然プロモーターを強力なプロモーターへ置換、または強力なプロモーターの制御下にある１つ以上の遺伝子の追加のコピーの発現が含まれる。目的の遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、プロモーターが宿主細胞において活性であり得るという条件で、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。目的の遺伝子は、それらの天然プロモーターから発現され得るか、または非天然プロモーターが使用され得る。必須ではないが、そのようなプロモーターは、それらが使用される宿主において中程度から高強度である必要がある。プロモーターが制御的または、構成的であり得るいくつかの実施形態では、グルコースで抑制されない、または培養培地中のグルコースの存在によって穏やかにのみ抑制されるプロモーターが使用される。多数の好適なプロモーターがあり、その例には、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｔｓｒ遺伝子（フルクトース二リン酸アルドラーゼをコードする）のプロモーターまたは酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－リン酸デヒドロゲナーゼをコードする）のプロモーターなどの解糖系遺伝子のプロモーターが含まれる（Ｂｉｔｔｅｒ Ｇ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：６７３ ６８４（１９８７））。関心のある他の強力なプロモーターには、パン酵母のＡＤＨＩプロモーター（Ｒｕｏｈｏｎｅｎ Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：１９３ ２０３（１９９５））、酵母のＰＨＯ５プロモーターなどのリン酸飢餓誘導プロモーター（Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ，ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂａｒｒ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ（１９８９）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のアルカリホスファターゼプロモーター（Ｌｅｅ．Ｊ．Ｗ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３７：１１２７ １１３３（１９９１））、ＧＰＤ１およびＴＥＦ１が含まれるが、これらに限定されない。関心のある酵母プロモーターには、Ｇａｌ１－１０、Ｇａｌ１、ＧａｌＬ、ＧａｌＳなどの誘導性プロモーター、抑制性プロモーターＭｅｔ２５、ｔｅｔＯ、および構成的プロモーター例えばグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＧＰＤ）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ）、翻訳伸長因子－１－アルファプロモーター（ＴＥＦ）、シトクロムｃ－オキシダーゼプロモーター（ＣＹＣ１）、ＭＲＰ７プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）などが含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、強力なプロモーターはＧＰＤ１である。特定の例では、強力なプロモーターはＴＥＦ１である。グルココルチコイド、ステロイド、および甲状腺ホルモンなどのホルモンによって誘導され得るプロモーターを含有する自律複製酵母発現ベクターも知られており、これらに限定されないが、グルコルチコイド応答配列（ＧＲＥ）および甲状腺ホルモン応答配列（ＴＲＥ）が含まれ、例えば米国特許第７，０４５，２９０号に記載されているプロモーターを参照されたい。アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、ＰＧＨなどの構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを使用することができる。さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢによる）を使用して、目的の遺伝子の発現を促進することもできる。宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに特異的な任意の便利なプロモーターを選択できることが理解される。場合によっては、プロモーターの選択を使用して転写を最適化し、ひいては酵素レベルを最適化して、エネルギー資源を最小限に抑えながら産生を最大化することができる。
不活性化変異
宿主細胞は、細胞の酵素に対する１つ以上の不活性化変異（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはそれ以上）を含み得る。１つ以上の不活性化変異を含めることにより、宿主細胞の合成経路の流れを改変して、目的のＴＡまたはそれをもたらす望ましい酵素または前駆体のレベルを増加させることができる。場合によっては、１つ以上の不活性化変異は細胞生来の酵素に対するものである。図８は、ポリアミン産生経路に作用する酵母の天然の調節機構を示し、図９は、プトレシンの産生に対するこれらの天然の調節システムの破壊の影響を示す。本明細書で使用される場合、「不活性化変異」とは、遺伝子または細胞の調節ＤＮＡ配列に対する１つ以上の変異を意味し、ここで、変異（複数可）は、目的の遺伝子によって発現されるタンパク質の生物学的活性を不活性化する。場合によっては、遺伝子は細胞生来のものである。場合によっては、遺伝子は、不活性化され、かつ宿主細胞によって産生される目的のＴＡの合成経路の一部であるか、またはそれに接続されている酵素をコードする。場合によっては、不活性化変異は、目的の遺伝子を制御する調節ＤＮＡ配列に位置している。場合によっては、不活性化変異は遺伝子のプロモーターに対するものである。任意の便利な変異（例えば、本明細書に記載されるような）を利用して、目的の遺伝子または調節ＤＮＡ配列を不活性化することができる。「不活化された」または「不活化」とは、変異遺伝子によって発現されるタンパク質の生物活性が、非変異対照遺伝子によって発現される対照タンパク質と比較して、１０％以上、例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または９９％以上低下することを意味する。場合によっては、タンパク質は酵素であり、不活性化変異は酵素の活性を低下させる。
いくつかの実施形態では、細胞は、細胞生来の酵素における不活性化変異を含む。任意の便利な酵素が不活化の標的となり得る。対象となる酵素には、限定するものではないが、図１～４、８、１１、２２、および４１に記載されている酵素が含まれ、宿主細胞の生合成経路でのそれらの作用は、対象のＴＡのレベルを低下させる傾向がある。場合によっては、酵素はメチルチオアデノシンホスホリラーゼ活性を有する。特定の実施形態では、不活性化変異を含む酵素は、ＭＥＵ１である（例えば、図８、９、および１３を参照されたい）。場合によっては、酵素はオルニチンデカルボキシラーゼアンチザイム活性を有する。特定の実施形態では、不活性化変異を含む酵素は、ＯＡＺ１である。場合によっては、酵素はスペルミジンシンターゼ活性を有する。特定の実施形態では、不活性化変異を含む酵素は、ＳＰＥ３である。場合によっては、酵素はスペルミンシンターゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、不活性化変異を含む酵素は、ＳＰＥ４である。場合によっては、酵素はポリアミン排出活性を有する膜トランスポーターである。特定の実施形態では、不活性化変異を含む酵素またはタンパク質は、ＴＰＯ５である。場合によっては、酵素はフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ活性を有する。特定の実施形態では、不活性化変異を含む酵素は、ＰＡＤ１である。場合によっては、酵素はアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、不活性化変異を含む酵素は、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４、ＡＤＨ５、ＡＤＨ６、ＡＤＨ７、およびＳＦＡ１から選択される。特定の実施形態では、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＡＤＨ２である。特定の実施形態では、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＡＤＨ３である。特定の実施形態では、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＡＤＨ４である。特定の実施形態では、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＡＤＨ５である。特定の実施形態では、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＡＤＨ６である。特定の実施形態では、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＡＤＨ７である。場合によっては、酵素はアルデヒドオキシドレダクターゼ活性を有する。特定の実施形態では、不活性化変異を含む酵素は、ＨＦＤ１、ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、およびＡＬＤ６から選択される。特定の実施形態では、変異（複数可）を含み、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＨＦＤ１である。特定の実施形態では、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＡＬＤ２である。特定の実施形態では、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＡＬＤ３である。特定の実施形態では、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＡＬＤ４である。特定の実施形態では、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＡＬＤ５である。特定の実施形態では、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＡＬＤ６である。場合によっては、酵素はグルコシダーゼ活性を有する。特定の実施形態では、不活性化変異を含む酵素は、ＥＸＧ１、ＳＰＲ１、およびＥＧＨ１から選択される。特定の実施形態では、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＥＸＧ１である。特定の実施形態では、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＳＰＲ１である。特定の実施形態では、不活性化変異（複数可）を含む酵素は、ＥＧＨ１である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、表１に記載される１つ以上の遺伝子に対する１つ以上の不活性化変異を含む。
非植物宿主におけるアシルトランスフェラーゼの機能的発現を使用してＴＡアシル転移反応を実行するための方法
本明細書で提供されるいくつかの方法、プロセス、およびシステムは、非植物細胞内で１つ以上のＴＡを産生するための、アシル供与体基を含む１つ以上のＴＡ前駆体とアシル受容体基を含む１つ以上のＴＡ前駆体との協奏反応（以下、ＴＡアシル転移反応と呼ぶ）を説明している。これらの方法、プロセス、およびシステムのいくつかは、操作された宿主細胞を含み得る。いくつかの例では、ＴＡアシル転移反応は、基質を多様な範囲のアルカロイドに変換する際の重要なステップである。いくつかの例では、ＴＡアシル転移反応は、縮合反応を含む。
いくつかの例では、ＴＡアシル転移は、少なくとも１つの縮合反応を含み得る。場合によっては、縮合反応のうちの少なくとも１つが酵素の存在下で行われる。場合によっては、縮合反応のうちの少なくとも１つが酵素によって触媒される。場合によっては、少なくとも１つの酵素が縮合反応を触媒するのに有用である。
本明細書に記載のいくつかの方法、プロセス、およびシステムでは、酵素の存在下で縮合反応を実行することができる。いくつかの例では、酵素はアシルトランスフェラーゼであり得る。アシルトランスフェラーゼは、基質としてアルコールまたはカルボキシレート官能基を有するＴＡを使用することができる。アシルトランスフェラーゼは、基質として、糖（以下、グリコシドと呼ぶ）への１－Ｏ－βグリコシド結合を介して活性化されるカルボキシレート基を含むＴＡを使用することができる。アシルトランスフェラーゼは、ＴＡアルコールおよびカルボキシレート／グリコシド官能基を、対応するエステル誘導体に変換し得る。本開示におけるＴＡ前駆体の縮合に好適な酵素の非限定的な例には、セリンカルボキシペプチダーゼ様アシルトランスフェラーゼ（ＳＣＰＬ－ＡＴ）が含まれる。例えば、リットリンシンターゼ（ＥＣ ２．３．１．－）は、アルコール官能基を含むトロピンおよび他のＴＡ前駆体と、１－Ｏ－β－フェニルラクトイル－グルコースおよび他のＴＡグリコシド前駆体とを縮合して、リットリンおよび他の対応するエステル産物にすることができる。いくつかの例では、前述の例のいずれか１つのＳＣＰＬ－ＡＴドメインを含むタンパク質が、縮合を実行し得る。いくつかの例において、ＳＣＰＬ－ＡＴは、本明細書に記載されるように、操作された宿主細胞などの宿主細胞内の縮合反応を触媒し得る。さらに他の例では、ＳＣＰＬ－ＡＴは、本明細書に記載されるように、操作された宿主細胞などの宿主細胞内の細胞内コンパートメント内の縮合反応を触媒し得る。
本発明のいくつかの実施形態では、ＴＡアシル転移反応を実行するために使用されるアシルトランスフェラーゼ酵素、例えばＳＣＰＬ－ＡＴ酵素、のアミノ酸配列は、翻訳後プロセシング、輸送、折り畳み、オリゴマー化、および／または酵素の細胞内局在を変更する１つ以上の改変を受ける。ＳＣＰＬ－ＡＴ酵素を含むいくつかのアシルトランスフェラーゼ酵素は、生きている非植物細胞で触媒活性を示すことが実証されていないため、そのような改変は、非植物宿主細胞での活性に有用であるか、必要である可能性がある。このような改変の例には、Ｎ末端シグナルペプチド配列の付加、除去、または置換；内部プロペプチド配列の追加、除去、または置換；アスパラギン結合型Ｎ－グリコシル化部位の追加または除去；セリン結合型Ｏ－グリコシル化部位の追加または除去；アシルトランスフェラーゼドメインのＮ末端および／またはＣ末端へのタンパク質ドメインの融合が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の一実施形態では、ＳＣＰＬ－ＡＴ酵素ドメインは、可溶性タンパク質ドメインの融合によってそのＮ末端で改変されている。この可溶性ドメインは、アシルトランスフェラーゼドメインの内部シグナル配列をマスクし、それによって、融合したＳＣＰＬ－ＡＴドメインの輸送および／または細胞内局在を改変する。いくつかの例では、Ｎ末端融合ドメインは、ＥＲ膜、ＥＲ内腔、シスゴルジ、トランスゴルジ、リソソーム、液胞膜、液胞内腔を含むがこれらに限定されない細胞内コンパートメントへの、ＳＣＰＬ－ＡＴドメインの輸送を誘導する。Ｎ末端融合可溶性ドメインはまた、ＳＣＰＬ－ＡＴドメインのオリゴマー化状態を、その天然状態（モノマー）から、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモトリマー、ヘテロトリマー、ホモテトラマー、ヘテロテトラマー、ホモヘキサマー、ヘテロヘキサマー、ホモオクタマー、ヘテロオクタマー、またはより高度なオリゴマー化を含むがこれらに限定されない任意の状態に改変することができる。
一例では、Ｎ末端融合可溶性タンパク質ドメインは、オワンクラゲ属の種（Ａｅｑｕｏｒｉａ ｓｐ．）に由来する蛍光タンパク質、およびイソギンチャクモドキ属の種（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）に由来する蛍光タンパク質を含むが、これらに限定されない群から選択される、蛍光タンパク質である。一例では、Ｎ末端融合可溶性タンパク質ドメインは、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．由来の赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）である。他の例では、Ｎ末端融合可溶性タンパク質ドメインは、オルニチンデカルボキシラーゼ、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ、ピロリジンケチドシンターゼ、トロピノンレダクターゼ、フェニルピルビン酸レダクターゼ、フェニル乳酸ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ８４Ａ２７、およびヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼを含むがこれらに限定されない、ＴＡ生合成経路の別の酵素である。
非植物細胞内でＴＡアシル転移反応を実行するために使用できるＳＣＰＬ－ＡＴドメインのＮ末端に融合できる可溶性タンパク質ドメインのアミノ酸配列の例を表３に提示する。融合したＮ末端ドメインを含み、非植物細胞におけるＴＡアシル転移反応で利用されるＳＣＰＬ－ＡＴ酵素のアミノ酸配列は、表３に記載されている所与のアミノ酸配列と５０％以上同一であり得る。例えば、そのようなアシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、本明細書で提供されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、特定の実施形態では、「同一の」アミノ酸配列は、特定のアミノ酸配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも８０％～９９％の同一性を含有する。場合によっては、「同一の」アミノ酸配列は、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、および特定の場合にはさらに、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を、アミノ酸レベルで含有する。場合によっては、アミノ酸配列は同一であってもよいが、例えば宿主生物のコドン利用を最適化するために、ＤＮＡ配列が変更されている。
ＴＡアシル転移反応を触媒するアシルトランスフェラーゼを産生する操作された非植物宿主細胞が提供され得、アシルトランスフェラーゼは、そのＮ末端が、表３のそれらの配列からなる群から選択される可溶性タンパク質ドメインのアミノ酸配列に融合されるアミノ酸配列を含む。操作された宿主細胞内で産生されるアシルトランスフェラーゼは、生体触媒を形成するように回収および精製され得る。アシルトランスフェラーゼを産生する操作された宿主細胞から回収される１つ以上の酵素は、ＴＡアシル転移反応を実施するためのプロセスで使用され得る。このプロセスは、アルコールおよび／またはカルボキシレート／グリコシド官能基を有するＴＡ前駆体を、アルコールおよび／またはカルボキシレート／グリコシド基を、対応するエステル基に変換するのに十分な量のアシルトランスフェラーゼと接触させることを含み得る。例において、アルコールおよび／またはカルボキシレート／グリコシド官能基を有するＴＡ前駆体を、当該ＴＡ前駆体のうちの少なくとも５％が対応するエステルに変換されるように、十分な量の１つ以上の酵素と接触させることができる。さらなる例において、アルコールおよび／またはカルボキシレート／グリコシド官能基を有するＴＡを、当該ＴＡ前駆体のうちの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または１００％が、対応するエステル変換されるように、十分な量の１つ以上の酵素と接触させることができる。
ＴＡアシル転移反応を実施するために使用され得る１つ以上の酵素は、インビトロでＴＡ前駆体と接触し得る。さらに、またはあるいは、ＴＡアシル転移反応を実施するために使用され得る１つ以上の酵素は、インビボでＴＡ前駆体と接触し得る。さらに、ＴＡアシル転移反応を実施するために使用され得る１つ以上の酵素は、ＴＡ前駆体を内部に有する細胞に提供され得るか、または操作された非植物宿主細胞内で産生され得る。
いくつかの例では、方法は、アルカロイド産物を産生する操作された非植物宿主細胞を提供し、ここで、ＴＡアシル転移反応は、アルカロイド産物の産生における重要なステップを含み得る。いくつかの例では、産生されるアルカロイドは薬用ＴＡである。さらに他の実施形態では、産生されるアルカロイドは、例えば、非天然ＴＡを含む薬用ＴＡに由来するものである。さらに他の実施形態では、アルカロイド産物は、薬用ＴＡ、非薬用ＴＡ、および非天然ＴＡからなる群から選択される。
いくつかの例では、基質は、記載された化合物のトロピン、プソイドトロピン、エクゴニン、メチルエクゴニン、フェニル乳酸、桂皮酸、フェルラ酸、クマル酸、およびグリコシドからなる群から選択されるＴＡ前駆体である。
いくつかの例では、この方法は、トロピンおよび１－Ｏ－β－フェニルラクトイルグルコースからアルカロイド産物を産生する、操作された非植物宿主細胞を提供する。トロピンと１－Ｏ－β－フェニルラクトイルグルコースとのリットリンへの縮合は、前駆体からの多様なアルカロイド産物の産生における重要なステップを構成し得る。いくつかの例では、前駆体は、Ｌ－アミノ酸または糖（例えば、グルコース）である。多様なアルカロイド産物には、薬用ＴＡ、非薬用ＴＡ、および非天然ＴＡが含まれ得る、これらに限定されない。
任意の好適な炭素源を、ＴＡアシル転移反応の前駆体として使用することができる。好適な前駆体には、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース）、オリゴ糖（例えば、ラクトース、スクロース、ラフィノース）、多糖（例えば、デンプン、セルロース）、またはこれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの例では、再生可能な原料からの未精製の混合物を使用することができる（例えば、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦麦芽、バイオマス加水分解物）。さらに他の実施形態では、炭素前駆体は、１炭素化合物（例えば、メタノール、二酸化炭素）または２炭素化合物（例えば、エタノール）であり得る。さらに他の実施形態では、他の炭素含有化合物、例えば、メチルアミン、グルコサミン、およびアミノ酸（例えば、Ｌ－アルギニンおよびＬ－フェニルアラニン）を利用することができる。いくつかの例において、アルコールおよび／またはカルボキシレート／グリコシド官能基を有するＴＡまたはＴＡの前駆体は本発明の操作された宿主細胞に直接添加され得、例えば、トロピン、プソイドトロピン、エクゴニン、メチルエクゴニン、フェニル乳酸、桂皮酸、フェルラ酸、クマル酸、および記載されている化合物のグリコシドを含む。
いくつかの実施形態では、液胞ＴＡアシル転移反応を実施するために使用される基質は、１つ以上のアルコールおよび／またはカルボキシレート／グリコシド官能基を含み得、前記官能基のうちの１つのみが対応するエステルに縮合する。
ＴＡアルコール－アルデヒド相互変換
本明細書で提供されるいくつかの方法、プロセス、およびシステムは、アルデヒド官能基を有するＴＡの、アルコール（ヒドロキシル）官能基を有するＴＡへの変換、およびアルコール官能基を有するＴＡの、アルデヒド官能基を有するＴＡへの変換（以下、ＴＡアルコール－アルデヒド相互変換と呼ぶ）について説明する。これらの方法、プロセス、およびシステムのいくつかは、操作された宿主細胞を含み得る。いくつかの例では、ＴＡアルコール－アルデヒド相互変換は、基質を多様な範囲のアルカロイドに変換する際の重要なステップである。いくつかの例において、ＴＡアルデヒド基のＴＡアルコール基への変換は、還元反応を含む。場合によっては、基質ＴＡアルデヒドのアルコールへの還元は、図２に提示し、スキーム１に一般的に示すように、アルデヒド基質を、対応する四面体オキシアニオン中間体に還元し、次にこの中間体をヒドロキシルにプロトン化することによって実行できる。スキーム１に提供されるように、Ｒ１は、Ｈ、ＣＨ３、またはより高次のアルキル基であってよく、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ＯＨ、またはＯＣＨ３であってよく、Ｒ４は、Ｈであってもよく、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１－Ｃ４アルキル、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ、Ｃ１－Ｃ４アシル、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒであってよい。
Figure 2022523825000002
いくつかの例では、ＴＡアルコール－アルデヒド相互変換は、少なくとも１つの酸化反応または少なくとも１つの還元反応を含み得る。場合によっては、酸化または還元反応のうちの少なくとも１つが酵素の存在下で行われる。場合によっては、酸化または還元反応のうちの少なくとも１つが酵素によって触媒される。場合によっては、酸化反応と還元反応の両方が、少なくとも１つの酵素の存在下で実行される。場合によっては、少なくとも１つの酵素が酸化および還元反応を触媒するのに有用である。酸化および還元反応は、同じ酵素によって触媒され得る。
本明細書に記載のいくつかの方法、プロセスおよびシステムにおいて、酸化または還元反応は、酵素の存在下で実行され得る。いくつかの例では、酵素はデヒドロゲナーゼであり得る。デヒドロゲナーゼは、基質としてアルコールまたはアルデヒド官能基を有するＴＡを使用することができる。デヒドロゲナーゼは、ＴＡアルコールまたはアルデヒド官能基を、対応するアルデヒドまたはアルコール誘導体に変換することができる。デヒドロゲナーゼは、ヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）と呼ばれることがある。本開示におけるＴＡの酸化および／または還元に好適な酵素の非限定的な例には、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ、２－オキソグルタル酸依存性オキシダーゼ、フラボタンパク質オキシダーゼ、短鎖デヒドロゲナーゼ－レダクターゼ（ＳＤＲ）、中鎖デヒドロゲナーゼ－レダクターゼ（ＭＤＲ）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、およびアルドケトレダクターゼ（ＡＫＲ）が挙げられる。例えば、トロピノンレダクターゼ１（ＥＣ １．１．１．２０６）は、ケトン官能基を持つトロピノンおよびその他のＴＡ前駆体を、トロピン（３α－トロパノール）およびその他の対応するアルコール産生物に酸化できる。いくつかの例では、前述の例のうちのいずれかの１つのデヒドロゲナーゼドメインを含むタンパク質が、酸化または還元を実行し得る。いくつかの例において、デヒドロゲナーゼは、本明細書に記載されるように、操作された宿主細胞などの宿主細胞内の酸化および／または還元反応を触媒し得る。
ＴＡアルコール－アルデヒド相互変換を実行するために使用できるデヒドロゲナーゼ酵素のアミノ酸配列の例を表２に提示する。ＴＡアルコール－アルデヒド相互変換で利用されるデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、表２に記載されている所与のアミノ酸配列と５０％以上同一であり得る。例えば、そのようなデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、本明細書で提供されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、特定の実施形態では、「同一の」アミノ酸配列は、特定のアミノ酸配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも８０％～９９％の同一性を含有する。場合によっては、「同一の」アミノ酸配列は、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、および特定の場合にはさらに、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を、アミノ酸レベルで含有する。場合によっては、アミノ酸配列は同一であってもよいが、例えば宿主生物のコドン利用を最適化するために、ＤＮＡ配列が変更されている。
ＴＡアルコール－アルデヒド相互変換を触媒するデヒドロゲナーゼを産生する操作された宿主細胞が提供され得、デヒドロゲナーゼは、表２のそれらの配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。操作された宿主細胞内で産生されたデヒドロゲナーゼは、生体触媒を形成するように回収および精製され得る。デヒドロゲナーゼを産生する操作された宿主細胞から回収される１つ以上の酵素は、ＴＡアルコール－アルデヒド相互変換を実施するためのプロセスで使用され得る。このプロセスは、アルコールおよび／またはアルデヒド官能基を有するＴＡを、ＴＡのアルコールおよび／またはアルデヒド基を、対応するアルデヒドおよび／またはアルコール基に変換するのに十分な量のデヒドロゲナーゼと接触させることを含み得る。例において、アルコールおよび／またはアルデヒド官能基を有するＴＡは、前記ＴＡのうちの少なくとも５％がその対応するアルデヒドおよび／またはアルコール基に変換されるように、十分な量の１つ以上の酵素と接触させることができる。さらなる例において、アルコールおよび／またはアルデヒド官能基を有するＴＡは、当該ＴＡの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または１００％が、その対応するアルデヒドおよび／またはアルコール基に変換されるように、十分な量の１つ以上の酵素と接触させることができる。
ＴＡアルコール－アルデヒド相互変換を実施するために使用され得る１つ以上の酵素は、インビトロでＴＡに接触し得る。さらに、またはあるいは、ＴＡアルコール－アルデヒド相互変換を実施するために使用され得る１つ以上の酵素は、インビボでＴＡに接触し得る。さらに、ＴＡアルコール－アルデヒド相互変換を実施するために使用され得る１つ以上の酵素は、ＴＡを内部に有する細胞に提供され得るか、または操作された宿主細胞内で産生され得る。
いくつかの例では、方法は、アルカロイド産物を産生する操作された宿主細胞を提供し、ここで、ＴＡアルコール－アルデヒド相互変換は、アルカロイド産物の産生における重要なステップを含み得る。いくつかの例では、産生されるアルカロイドは薬用ＴＡである。さらに他の実施形態では、産生されるアルカロイドは、例えば、非天然ＴＡを含む薬用ＴＡに由来するものである。別の実施形態では、アルコールおよび／またはアルデヒド官能基を有するＴＡは、操作された宿主細胞の産物に対する中間体である。さらに他の実施形態では、アルカロイド産物は、薬用ＴＡ、非薬用ＴＡ、および非天然ＴＡからなる群から選択される。
いくつかの例では、基質は、リットリン、ヒヨスチアミンアルデヒド、ヒヨスチアミン、アニソダミン、およびスコポラミンからなる群から選択されるＴＡまたはＴＡの前駆体である。
いくつかの例では、この方法は、ヒヨスチアミンアルデヒドからアルカロイド産物を産生する操作された宿主細胞を提供する。ヒヨスチアミンアルデヒドのヒヨスチアミンへの還元は、前駆体からの多様なアルカロイド産物の産生における重要なステップを含み得る。いくつかの例では、前駆体は、Ｌ－アミノ酸または糖（例えば、グルコース）である。多様なアルカロイド産物には、薬用ＴＡ、非薬用ＴＡ、および非天然ＴＡが含まれ得る、これらに限定されない。
任意の好適な炭素源を、ＴＡアルコール－アルデヒド相互変換の前駆体として使用することができる。好適な前駆体には、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース）、オリゴ糖（例えば、ラクトース、スクロース、ラフィノース）、多糖（例えば、デンプン、セルロース）、またはこれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの例では、再生可能な原料からの未精製の混合物を使用することができる（例えば、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦麦芽、バイオマス加水分解物）。さらに他の実施形態では、炭素前駆体は、１炭素化合物（例えば、メタノール、二酸化炭素）または２炭素化合物（例えば、エタノール）であり得る。さらに他の実施形態では、他の炭素含有化合物、例えば、メチルアミン、グルコサミン、およびアミノ酸（例えば、Ｌ－アルギニンおよびＬ－フェニルアラニン）を利用することができる。いくつかの例において、アルコールおよび／またはアルデヒド官能基を有するＴＡまたはＴＡの前駆体は、本発明の操作された宿主細胞に直接添加され得、例えば、トロピン、プソイドトロピン、エクゴニン、メチルエクゴニン、リットリン、ヒヨスチアミンアルデヒド、ヒヨスチアミン、アニソダミン、およびスコポラミンを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＡアルコール－アルデヒド相互変換を実施するために使用される基質は、１つ以上のアルコールおよび／またはアルデヒド官能基を含み得、当該官能基の１つのみが、対応するアルデヒドまたはアルコール基に酸化または還元される。
細胞内および細胞外代謝物輸送を増加させる方法
本明細書で提供されるいくつかの方法、プロセス、およびシステムは、脂質膜を横切って代謝産物を移動させる（以下「膜貫通輸送」と呼ぶ）ためのタンパク質（以下「トランスポーター」と呼ぶ）の使用を説明する。これらの方法、プロセス、およびシステムのいくつかは、操作された宿主細胞を含み得る。いくつかの例では、膜貫通輸送は、基質を多様な範囲のアルカロイドに変換する際の重要なステップである。
特定の実施形態では、宿主細胞は、脂質膜に局在しかつ同じ脂質膜を横切ってＴＡまたはＴＡ前駆体を移動させる１つ以上のトランスポーターまたはその活性断片の１つ以上の異種コード配列を含む。いくつかの例では、脂質膜は液胞膜である。他の例では、脂質膜は小胞体膜である。いくつかの例では、脂質膜はペルオキシソーム膜である。他の例では、脂質膜は細胞原形質膜である。
いくつかの例では、この方法で輸送されるＴＡおよびＴＡ前駆体には、プトレシン、Ｎ－メチルプトレシン、４－メチルアミノブタナール、Ｎ－メチルピロリニウム、トロピノン、トロピン、フェニル乳酸、１－Ｏ－β－フェニルラクトイルグルコース、リットリン、ヒヨスチアミン、アニソダミン、およびスコポラミンが含まれるが、これらに限定されない。特定の細胞内コンパートメントでのそのようなＴＡまたはＴＡ前駆体の蓄積は、異なるコンパートメントにおける、作動可能に連結されている生合成酵素によるアクセスを妨げる可能性があり、したがって、ＴＡまたはＴＡ前駆体をあるコンパートメントから別のコンパートメントに移動させるトランスポーターを使用すると、このような輸送の制限を緩和することができる。特定の場合では、宿主細胞内の１つ以上のトランスポーターの異種コード配列の発現により、ＴＡまたはＴＡ前駆体の産生を増加させ得る。
いくつかの実施形態では、トランスポーターまたはその活性断片は、多剤および毒素排出（ｔｏｘｉｎ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）（ＭＡＴＥ）トランスポーターである。前述のＴＡまたはＴＡ前駆体のうちの１つ以上を輸送する任意の便利なＭＡＴＥトランスポーターは、対象の宿主細胞で使用が見出される。対象となるトランスポータータンパク質には、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ジャスモン酸誘導性アルカロイドトランスポーター１（ＮｔＪＡＴ１）、タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ） ＭＡＴＥ１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＭＡＴＥ２、または表１および表４に記載されているその他の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、トランスポーターまたはその活性断片は、硝酸／ペプチドファミリー（ＮＰＦ）トランスポーターである。前述のＴＡまたはＴＡ前駆体のうちの１つ以上を輸送する任意の便利なＮＰＦトランスポーターは、対象の宿主細胞で使用が見出される。他の実施形態では、トランスポーターまたはその活性断片は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターである。前述のＴＡまたはＴＡ前駆体のうちの１つ以上を輸送する任意の便利なＮＰＦトランスポーターは、対象の宿主細胞で使用が見出される。いくつかの実施形態では、トランスポーターまたはその活性断片は、多面発現性薬剤耐性（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）（ＰＤＲ）トランスポーターである。前述のＴＡまたはＴＡ前駆体のうちの１つ以上を輸送する任意の便利なＰＤＲトランスポーターは、対象の宿主細胞で使用が見出される。
特定の実施形態では、宿主細胞は、トランスポーターまたはその活性断片のための異種コード配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、トランスポーターのアミノ酸配列は、細胞内局在、基質移動の方向、および／または酵素のトポロジー的配向を変更する１つ以上の改変を受ける。そのような改変の例には：Ｎ末端、Ｃ末端、または内部シグナル配列の追加、除去、または置換；膜貫通ヘリックスの追加、除去、交換、または再配置；およびトランスポーターのＮ末端および／またはＣ末端へのタンパク質ドメインの融合が含まれるが、これらに限定されない。
基質輸送の制限を緩和するため、および／または特定の細胞コンパートメントにおけるＴＡまたはＴＡ前駆体の蓄積を増加させるために使用することができるトランスポーターのアミノ酸配列の例を表４に提供する。非植物細胞でこのように利用されるトランスポーターのアミノ酸配列は、表４に記載されている所与のアミノ酸配列と５０％以上同一であり得る。例えば、そのようなトランスポーターのアミノ酸配列は、本明細書で提供されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、特定の実施形態では、「同一の」アミノ酸配列は、特定のアミノ酸配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも８０％～９９％の同一性を含有する。場合によっては、「同一の」アミノ酸配列は、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、および特定の場合にはさらに、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を、アミノ酸レベルで含有する。場合によっては、アミノ酸配列は同一であってもよいが、例えば宿主生物のコドン利用を最適化するために、ＤＮＡ配列が変更されている。
１つ以上のＴＡまたはＴＡ前駆体を１つの細胞コンパートメントから別の細胞コンパートメントに移動させるトランスポーターを産生する、操作された非植物宿主細胞を提供することができ、トランスポーターは、表４のそれらの配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、この方法は、アルカロイド産物を産生する操作された非植物宿主細胞を提供し、ここで、ＴＡ膜貫通輸送は、アルカロイド産物の産生における重要なステップを含み得る。いくつかの例では、産生されるアルカロイドは薬用ＴＡである。さらに他の実施形態では、産生されるアルカロイドは、例えば、非天然ＴＡを含む薬用ＴＡに由来するものである。さらに他の実施形態では、アルカロイド産物は、薬用ＴＡ、非薬用ＴＡ、および非天然ＴＡからなる群から選択される。
異種コード配列
場合によっては、宿主細胞は、例えば本明細書に記載されるように、宿主細胞が目的の所望のＴＡを産生することを可能にする活性（複数可）をコードする１つ以上の異種コード配列（例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはそれ以上）を保有する細胞である。本明細書で使用される場合、「異種コード配列」という用語は、通常は宿主生物に存在しない、適切な条件下で宿主細胞で発現し得る、ペプチドまたはタンパク質またはその同等のアミノ酸配列、例えば酵素をコードする、または最終的にコードする任意のポリヌクレオチドを示すために使用される。したがって、「異種コード配列」には、宿主細胞に通常存在するコード配列の複数のコピーが含まれ、それにより細胞が、通常は細胞に存在しないコード配列の追加のコピーを発現する。異種コード配列は、ＲＮＡまたはその任意のタイプ、例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはその任意のタイプ、例えば、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドであり得る。関心のあるコード配列には、コード配列、イントロン、プロモーター領域、３’－ＵＴＲ、およびエンハンサー領域などの特徴を含む全長の転写ユニットが含まれるが、これらに限定されない。
例において、操作された宿主細胞は、それぞれが酵素をコードする複数の異種コード配列を含む。いくつかの例では、複数の異種コード配列によってコードされる複数の酵素は、互いに異なっていてもよい。いくつかの例では、複数の異種コード配列によってコードされる複数の酵素のいくつかは、互いに異なり得、複数の異種コード配列によってコードされる複数の酵素のいくつかは、複製コピーであり得る。
いくつかの例において、異種コード配列は、作動可能に接続され得る。作動可能に接続されている異種コード配列は、特定のトロパンアルカロイド産物を産生するのと同じ経路内にある可能性がある。いくつかの例では、作動可能に接続された異種コード配列は、特定のトロパンアルカロイド産物を産生する経路に沿って直接連続していてもよい。いくつかの例では、作動可能に接続された異種コード配列は、複数の異種コード配列によってコードされる１つ以上の酵素の間に１つ以上の天然酵素を有し得る。いくつかの例では、異種コード配列は、複数の異種コード配列によってコードされる１つ以上の酵素の間に１つ以上の異種酵素を有し得る。いくつかの例では、異種コード配列は、複数の異種コード配列によってコードされる１つ以上の酵素の間に１つ以上の非天然酵素を有し得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）活性を含む。便利なＰＭＴ酵素は、対象の宿主細胞で使用が見出される。対象となるＰＭＴ酵素には、表１に記載されているように、ＥＣ ２．１．１．５３などの酵素が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＰＭＴまたはその活性断片の異種コード配列を含む。
場合によっては、宿主細胞は、ＮＭＰを４ＭＡＢに変換する１つ以上の酵素またはその活性断片の１つ以上の異種コード配列を含む。特定の場合では、１つ以上の酵素が植物のメチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）および真核生物のＭＰＯ（例えばＥＣ １．４．３．２２）から選択される。
特定の実施形態では、細胞は、ＮＭＰｙをＭＰＯＢに変換する１つ以上の酵素またはその活性断片の１つ以上の異種コード配列を含む。特定の場合では、１つ以上の酵素はＩＩＩ型ポリケチドシンターゼである（例えば、ＥＣ ２．３．１．－）。１つ以上の異種コード配列は、任意の便利な種に由来し得る（例えば、本明細書に記載されるもの）。場合によっては、１つ以上の異種コード配列は、表１に記載されている種に由来し得る。場合によっては、１つ以上の異種コード配列は、表１に記載されているものから選択された遺伝子または酵素に存在する。
特定の実施形態では、宿主細胞は、トロピノンシンターゼ活性を含む。任意の便利なトロピノンシンターゼ酵素（例えば、ＣＹＰ８２Ｍ３）は、対象の宿主細胞で使用が見出される。対象となるトロピノンシンターゼ酵素には、表１に記載されているような、ＥＣ １．１４．１４．－などの酵素が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、宿主細胞は、トロピノンシンターゼまたはその活性断片の異種コード配列を含む。
特定の実施形態では、宿主細胞は、トロピノンレダクターゼ活性を含む。便利なトロピノンレダクターゼ酵素は、対象の宿主細胞で使用が見出される。対象となるトロピノンレダクターゼ酵素には、表１に記載されているような、ＥＣ １．１．１．２０６などの酵素が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、宿主細胞は、トロピノンレダクターゼまたはその活性断片の異種コード配列を含む。
場合によっては、宿主細胞はフェニルピルビン酸レダクターゼ（ＰＰＲ）活性を含む。便利なＰＰＲ酵素は、対象の宿主細胞で使用が見出される。対象となるいくつかのＰＰＲ酵素には、表１に記載されているような、ＥＣ １．１．１．２３７などの酵素が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＰＰＲまたはその活性断片の異種コード配列を含む。
特定の実施形態では、宿主細胞は、フェニル乳酸グリコシルトランスフェラーゼ活性を含む。便利なフェニル乳酸グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、対象の宿主細胞で使用が見出される。グリコシルトランスフェラーゼ酵素には、表１に記載されているような、グリコシドエステル結合によってグルコース部分をＵＤＰ－グルコースからフェニル乳酸に転移させる２．４．１．－などの酵素が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、宿主細胞は、フェニル乳酸グリコシルトランスフェラーゼまたはその活性断片の異種コード配列を含む。
特定の実施形態では、細胞は、トロピンおよび１－Ｏ－β－フェニルラクトイルグルコースをリットリンに変換する１つ以上の酵素またはその活性断片の１つ以上の異種コード配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、リットリンシンターゼ活性を含む。任意の便利なリットリンシンターゼ酵素またはリットリンシンターゼ活性断片を含む酵素は、対象の宿主細胞での使用が見出される。対象となるリットリンシンターゼ酵素には、表１に記載されているようなＥＣ ２．３．１．－などの酵素、および表３に記載されているようなＮ末端が可溶性タンパク質ドメインに融合しているリットリンシンターゼ酵素を含む酵素が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、宿主細胞は、リットリンシンターゼまたはその活性断片の異種コード配列を含む。
特定の例において、宿主細胞はリットリンムターゼ活性を含む。便利なリットリンムターゼ酵素は、対象の宿主細胞で使用が見出される。対象となるリットリンムターゼ酵素には、表１に記載されているような、ＥＣ １．１４．１９．－などの酵素が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、宿主細胞は、リットリンムターゼまたはその活性断片の異種コード配列を含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）活性を含む。便利なＨＤＨ酵素は、対象の宿主細胞で使用が見出される。対象となるいくつかのＨＤＨ酵素には、表２に記載されている配列が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＨＤＨまたはその活性断片の異種コード配列を含む。
特定の実施形態では、宿主細胞は、ヒヨスチアミン６β－ヒドロキシラーゼ／ジオキシゲナーゼ（Ｈ６Ｈ）活性を含む。便利なＨ６Ｈ酵素は、対象の宿主細胞で使用が見出される。対象となるいくつかのＨ６Ｈ酵素には、表１に記載されているような、ＥＣ １．１４．１１．１１などの酵素が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｈ６Ｈまたはその活性断片の異種コード配列を含む。
特定の例では、操作された宿主細胞は、それぞれが膜貫通代謝産物トランスポーターをコードする複数の異種コード配列を含む。いくつかの例では、複数の異種コード配列によってコードされる複数のトランスポーターは、互いに異なっていてもよい。いくつかの例では、複数の異種コード配列によってコードされる複数のトランスポーターのいくつかは、互いに異なり得、複数の異種コード配列によってコードされる複数のトランスポーターのいくつかは、複製コピーであり得る。
本明細書で使用される場合、「異種コード配列」という用語はまた、ペプチドまたは酵素のコード部分、すなわち、ペプチドまたは酵素のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列、ならびに全長転写単位のコード部分、すなわち、イントロンおよびエキソン、ならびに「コドン最適化」配列、トランケーションされた配列、または酵素をコードするもしくはその同等のアミノ酸配列をコードするが、但しその同等のアミノ酸配列が機能性タンパク質を産生する改変された配列の他の形態を含む遺伝子を含む。そのような同等のアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸の欠失を有し得、その欠失は、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部にある。それらが本明細書に示される触媒能力を有する限り、トランケーション型が想定される。触媒活性が維持されている条件で、経路内の代謝物の転移を促進するために、２つ以上の酵素の融合も想定されている。非触媒タンパク質ドメインが融合触媒ドメインの可溶化、折り畳み、成熟、および／または活性を促進するような方法での１つ以上の酵素または触媒タンパク質ドメインと１つ以上の非触媒タンパク質ドメインとの融合も含まれる。
動作可能な断片、変異体、またはトランケーション型は、モデリングおよび／またはスクリーニングによって特定することができる。これは、例えば、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部領域を段階的に追加または欠失させ、続いて、元の配列と比較して所望の反応に対するその活性に関して得られた誘導体を分析することによって可能になる。問題の誘導体がこの能力で機能する場合、それは適切な酵素の同等の誘導体を構成すると見なされる。
本発明の態様はまた、様々な酵素の天然アミノ酸配列と同等であるアミノ酸配列をコードする異種コード配列に関する。「同等」のアミノ酸配列は、特定のアミノ酸配列と同一ではなく、所望の目的で使用される場合、特定のアミノ酸配列の同様の活性と比較して、タンパク質の生物学的活性に本質的に影響を与えない、少なくともいくつかのアミノ酸変化（欠失、置換、反転、挿入など）を含むアミノ酸配列として定義される。生物学的活性は、デカルボキシラーゼの例では、その触媒活性を指す。同等の配列はまた、元のアミノ酸配列とは異なる特性を有するように操作されたおよび／または進化させたものを含むことを意味する。関心のある易変特性には、触媒活性、基質特異性、選択性、安定性、溶解性、局在化などが含まれる。特定の実施形態では、「同等の」アミノ酸配列は、特定のアミノ酸に対してアミノ酸レベルで少なくとも８０％～９９％の同一性を含み、場合によってはアミノ酸レベルで、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％の、さらに場合によっては少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を含む。場合によっては、アミノ酸配列は同一であってもよいが、例えば宿主生物のコドン利用を最適化するために、ＤＮＡ配列が変更されている。
宿主細胞はまた、異種コード配列に対応するために１つ以上の遺伝的変化を有するように改変され得る。天然宿主ゲノムの変化には、ゲノムを改変して、所望の経路を妨害し得る特定のタンパク質の発現を低減または除去することが含まれるが、これに限定されない。そのような天然タンパク質の存在は、経路の中間体または最終産物の１つを、所望の経路で使用できない代謝物または他の化合物に迅速に変換することができる。したがって、天然酵素の活性が低下したか、またはまったく存在しない場合、産生された中間体は、所望の生成物への取り込みに対してより容易に利用可能であろう。
タンパク質の発現の除去が重要であり得るいくつかの例では、変化は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーター、多剤耐性（ＭＤＲ）ポンプ、および関連する転写因子を含むがこれらに限定されない、多面発現性薬剤応答に関与するタンパク質にある。これらのタンパク質は、ＴＡ分子およびＴＡ前駆体の培地への排出に関与しているため、欠失により化合物の培地への排出を制御し、目的の産物への取り込みに利用できるようになる。いくつかの実施形態では、目的の宿主細胞遺伝子欠失は、折り畳まれていないタンパク質応答および小胞体（ＥＲ）増殖に関連する遺伝子を含む。このような遺伝子の欠失は、ＴＡ産生の改善につながる可能性がある。シトクロムＰ４５０の発現は、折り畳まれていないタンパク質応答を誘発し、ＥＲを増殖させる可能性がある。これらのストレス応答に関連する遺伝子の欠失は、宿主細胞への全体的な負担を制御または軽減し、経路の性能を向上させることができる。遺伝的変化はまた、発現を増加させるために内因性遺伝子のプロモーターを改変すること、および／または内因性遺伝子の追加のコピーを導入することを含み得る。この例には、内因性酵母ＮＡＤＰＨ－Ｐ４５０レダクターゼＮｃｐ１ｐを過剰発現させて異種Ｐ４５０酵素の活性を高める菌株の構築／使用が含まれる。さらに、中間代謝物の合成に直接関与するＳｐｅ１ｐ、Ｆｍｓ１ｐ、Ｃａｒ１ｐ、Ａｒｇ２ｐ、Ａｒｏ８ｐ、Ａｒｏ９ｐ、Ｐｈａ２ｐ、Ｕｇｐ１ｐ、およびＬｅｕ２ｐなどの内因性酵素も過剰発現させてもよい。
対象となる異種コード配列には、野生型または同等の配列のいずれかの、通常、植物におけるＴＡおよび前駆体の産生に関与する酵素をコードする配列が含まれる。場合によっては、異種配列がコードする酵素は、ＴＡ経路内の酵素のいずれかであり得、任意の便利な供給源由来のものであり得る。特定の合成経路の異種コード配列によってコードされる酵素の選択および数は、所望の産物に基づいて選択され得る。特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、またはさらに１５以上の異種コード配列、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の異種コード配列を含み得る。
場合によっては、異種コード配列によってコードされるポリペプチド配列は、ＧＥＮＢＡＮＫで報告されている通りである。対象となる酵素には、本明細書に記載されている酵素および表１に示されている酵素が含まれるが、これらに限定されない。宿主細胞は、任意の供給源からの、記載された酵素の任意の組み合わせを含み得る。特に明記しない限り、表１のアクセッション番号はＧｅｎＢａｎｋを参照している。一部のアクセッション番号は、ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇのワールドワイドウェブで入手できるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓゲノムデータベース（ＳＧＤ）を参照している。
いくつかの実施形態では、宿主細胞（例えば、酵母株）は、１つ以上の酵素を細胞内のコンパートメントに局在化させることによって、目的のＴＡを選択的に産生させるために操作される。場合によっては、酵素は、この酵素によって産生された化合物が、化合物を望ましくない代謝物に変換し得る局在化酵素に到達する前に自発的に再配列するように、または別の酵素によって望ましい代謝物に変換されるように、宿主細胞において配置され得る。２つの酵素間の空間距離は、酵素の１つが化合物に直接作用して望ましくない代謝物を産生するのを防ぎ、望ましくない最終産物（例えば、望ましくないオピオイド副産物）の産生を制限するように選択できる。他のいくつかの場合において、酵素は、それが位置する細胞内コンパートメントが、酵素が天然に見出されるコンパートメントよりも、その活性についてより最適なｐＨ、補因子濃度、酸化還元電位、基質濃度、および／または他の生化学的パラメータを提供するように、宿主細胞に局在化され得る。特定の場合において、酵素が当該コンパートメントに輸送される細胞内輸送経路が、酵素が活性を示すために必要な翻訳後改変を提供するように、酵素は、宿主細胞内の特定のコンパートメントに局在化され得る。このような翻訳後改変には、アセチル化、アセチルグリコシル化、アミド化、カルボキシル化、メチル化、グルタチオン化、ヒドロキシル化、グリコシル化、リン酸化、スルホン化、ジスルフィド結合形成、シグナル配列の切断、および多酵素複合体形成が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書に記載の酵素のいずれかは、単独でまたは第２の酵素と一緒に、細胞小器官、小胞体、ゴルジ、液胞、核、原形質膜、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、周辺質、前述の細胞小器官のいずれかの内腔、または前述の細胞小器官のいずれかを取り囲むかまたは関連する膜を含むがこれらに限定されない、宿主細胞の任意の便利なコンパートメントに局在化され得る。１つ以上の酵素が前述の細胞小器官のいずれかに関連する膜に局在する場合、酵素は、酵素の触媒ドメインがサイトゾル、細胞小器官の内腔、および／または他の任意の細胞内空間に面するように配向され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、局在化タグを含む１つ以上の酵素を含む。任意の便利なタグを利用できる。場合によっては、局在化タグは、酵素のＮ末端および／またはＣ末端に付着しているペプチド配列である。
タグを酵素に付着させるために、任意の便利な方法を利用することができる。場合によっては、局在化タグは内因性酵母タンパク質に由来する。このようなタグは、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体（ＧＡ）、ミトコンドリア（ＭＴ）、原形質膜（ＰＭ）、ペルオキシソーム（ＰＯＸ）、液胞（Ｖ）などを含むがこれらに限定されない、さまざまな酵母細胞小器官への経路を提供し得る。特定の実施形態では、タグは、ＥＲルーティングタグ（例えば、ＥＲ１）である。特定の実施形態では、タグは液胞タグ（例えば、Ｖ１）である。特定の実施形態では、タグは原形質膜タグ（例えば、Ｐ１）である。特定の実施形態では、タグは、ペルオキシソーム標的化配列（例えば、ＰＴＳ１）である。特定の例において、タグは、テイルアンカークラス（ｔａｉｌ－ａｎｃｈｏｒｅｄ ｃｌａｓｓ）のタンパク質内からの膜貫通ドメインを含むか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、局在化タグは、細胞小器官の外側に酵素を配置する。特定の実施形態では、局在化タグは、細胞小器官の内側に酵素を配置する。いくつかの実施形態では、局在化タグは、酵素の１つ以上の部分が細胞小器官の内側および外側の両方に見出されるように酵素を配置する。
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、上記の局在化タグを含む１つ以上の酵素をコードする１つ以上のコード配列の発現によって改変される。特定の実施形態では、宿主細胞は、１つ以上の酵素がサイトゾルで発現されるように、１つ以上の異種コード配列の発現によって改変される。このような酵素の例には、アルギニンデカルボキシラーゼ、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ、ピロリジンケチドシンターゼ、トロピノンレダクターゼ、フェニルピルビン酸レダクターゼ、ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ、およびヒヨスチアミン６β－ヒドロキシラーゼ／ジオキシゲナーゼなどの２－オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、宿主細胞は、１つ以上の酵素がＥＲ膜で発現されるように、１つ以上の異種コード配列の発現によって改変される。このような酵素の例には、トロピノンシンターゼ（ＣＹＰ８２Ｍ３）およびリットリンムターゼ（ＣＹＰ８０Ｆ１）などのシトクロムＰ４５０、およびＮＡＤＰ＋－シトクロムＰ４５０レダクターゼが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、宿主細胞は、１つ以上の酵素がミトコンドリアで発現されるように、１つ以上の異種コード配列の発現によって改変される。そのような酵素の例には、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、宿主細胞は、１つ以上の酵素がペルオキシソームで発現されるように、１つ以上の異種コード配列の発現によって改変される。そのような酵素の例には、Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼなどのアミンオキシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、宿主細胞は、１つ以上の酵素が液胞内腔で発現されるように、１つ以上の異種コード配列の発現によって改変される。そのような酵素の例には、リットリンシンターゼなどのセリンカルボキシペプチダーゼ様アシルトランスフェラーゼ、およびそれらの操作されたバリアントが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、宿主細胞は、１つ以上の酵素またはタンパク質が液胞膜において発現されるように、１つ以上の異種コード配列の発現によって改変される。そのようなタンパク質の例には、多剤および毒素排出トランスポーター、硝酸／ペプチドファミリートランスポーター、およびＡＴＰ結合カセットトランスポーターが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、宿主細胞は、１つ以上の酵素またはタンパク質が原形質膜において発現されるように、１つ以上の異種コード配列の発現によって改変される。そのようなタンパク質の例には、ＡＴＰ結合カセットトランスポーター、多面発現性薬剤耐性トランスポーター、および多剤耐性トランスポーターが含まれるが、これらに限定されない。
場合によっては、各タイプの酵素の発現は、追加の遺伝子コピー（すなわち、複数のコピー）によって増加し、これにより、中間体蓄積および／または目的のＴＡ産生が増加する。本発明の実施形態は、単一または複数の酵素の複数の種のバリアントの同時発現を介した、宿主細胞における目的のＴＡ産生の増加を含む。場合によっては、単一または複数の酵素の追加の遺伝子コピーが宿主細胞に含まれる。宿主細胞内の酵素の異種コード配列の複数のコピーを含む、任意の便利な方法を利用することができる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、酵素の異種コード配列の複数のコピー、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または１０以上のコピーを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、２つ以上、３つ以上、４つ以上などの複数のコピーなど、１つ以上の酵素の異種コード配列の複数のコピーを含む。場合によっては、酵素の異種コード配列の複数のコピーは、宿主細胞と比較して、２つ以上の異なるソース生物（ｓｏｕｒｃｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ）に由来する。例えば、宿主細胞は、１つの異種コード配列の複数のコピーを含み得、コピーのそれぞれは、異なるソース生物に由来する。したがって、各コピーは、異種コード配列によってコードされる目的の酵素の種間差異に基づく明示的配列のいくつかのバリエーションを含み得る。
宿主細胞のいくつかの実施形態では、異種コード配列は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ、ウィッケルハミア フルオレセンス（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、Ａｅｑｕｏｒｉａ ｓｐｐ、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐｐ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、マカラスムギ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ａｔｒｏｐａ ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ、ヒヨスシアムス ニガー（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ヒヨスシアムス ムティカス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ ｍｕｔｉｃｕｓ）、シロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）、チョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｍｅｔｅｌ）、アメリカチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｉｎｎｏｘｉａ）、ズボイジア ミオポロイデス（Ｄｕｂｏｉｓｉａ ｍｙｏｐｏｒｏｉｄｅｓ）、アニソダス ルリドゥス（Ａｎｉｓｏｄｕｓ ｌｕｒｉｄｕｓ）、アニソダス タングティカス（Ａｎｉｓｏｄｕｓ ｔａｎｇｕｔｉｃｕｓ）、アニソダス アクタングルス（Ａｎｉｓｏｄｕｓ ａｃｕｔａｎｇｕｌｕｓ）、ブルグマンシア アルボレア（Ｂｒｕｇｍａｎｓｉａ ａｒｂｏｒｅａ）、ブルグマンシア カンジダ（Ｂｒｕｇｍａｎｓｉａ×ｃａｎｄｉｄａ）、ブルグマンシア サンギネア（Ｂｒｕｇｍａｎｓｉａ ｓａｎｇｕｉｎｅａ）、コカノキ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ ｃｏｃａ）、トモシリソウ（Ｃｏｃｈｌｅａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ソラナム属の種（Ｓｏｌａｎｕｍ ｓｐｐ）、ニコチアナ属の種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐｐ）、アトロパ属の種（Ａｔｒｏｐａ ｓｐｐ）、ヒヨスシアムス属の種（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ ｓｐｐ）、ダチュラ属の種（Ｄａｔｕｒａ ｓｐｐ）、ズボイジア属の種（Ｄｕｂｏｉｓｉａ ｓｐｐ）、アニソダス属の種（Ａｎｉｓｏｄｕｓ ｓｐｐ）、ブルグマンシア属の種（Ｂｒｕｇｍａｎｓｉａ ｓｐｐ）、エリスロキシラム属の種（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ ｓｐｐ）、またはコクレアリア属の種（Ｃｏｃｈｌｅａｒｉａ ｓｐｐ）からなる群から選択されるソース生物に由来する。特定の例において、異種コード配列は、Ａ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ、Ｈ．ニガー（Ｈ．ｎｉｇｅｒ）、およびＤ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍから選択されたソース生物に由来する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、表１に記載される１つ以上のソース生物由来の異種コード配列を含む。
操作された宿主細胞培地を、目的のＴＡの産生についてサンプリングしかつ監視することができる。目的のＴＡは、任意の便利な方法を使用して観察および測定できる。関心のある方法には、対象の試料が既知量の標準化合物との比較によって分析されるＬＣ－ＭＳ法（例えば、本明細書に記載されるような）が含まれるが、これらに限定されない。同一性は、例えばｍ／ｚおよびＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンによって確認でき、化合物の定量または測定は、既知の保持時間のＬＣトレースピークおよび／または対応する既知量の標準の化合物のＬＣ－ＭＳ分析を参照するＥＩＣ ＭＳピーク分析によって達成できる。
方法
プロセスステップ
上に要約したように、本発明の態様は、目的のトロパンアルカロイド（ＴＡ）を調製する方法を含む。したがって、本発明の態様は、宿主細胞を、細胞が目的の出発化合物を目的の産物ＴＡまたはその前駆体（例えば、エステル化前のＴＡ）に変換するように、１つ以上の宿主細胞改変（例えば、本明細書に記載）が機能的に発現される条件下で、培養することを含む。１つ以上の異種コード配列が機能的に発現され、目的の出発化合物を目的の生成物ＴＡに変換するように、タンパク質産生に好適な条件下で宿主細胞を培養することを含む方法も提供される。場合によっては、この方法は、トロパンアルカロイド（ＴＡ）を調製する方法であり、宿主細胞を培養する（例えば、本明細書に記載されるように）ことと、細胞培養物に出発化合物を加えることと、細胞培養物からＴＡを回収することと、を含む。この方法のいくつかの実施形態では、出発化合物、ＴＡ産物、および宿主細胞は、表１の記入のうちの１つによって記載されている。
発酵培地は、好適な炭素基質を含み得る。本開示の方法を実行するのに好適な炭素源は、多種多様な炭素含有基質を含み得る。好適な基質には、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース）、オリゴ糖（例えば、ラクトース、スクロース、ラフィノース）、多糖（例えば、デンプン、セルロース）、またはこれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。場合によっては、再生可能な原料からの未精製の混合物を使用することができる（例えば、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦麦芽）。場合によっては、炭素基質は、１炭素基質（例えば、メタノール、二酸化炭素）または２炭素基質（例えば、エタノール）であり得る。他の場合には、他の炭素含有化合物、例えば、メチルアミン、グルコサミン、およびアミノ酸を利用することができる。
宿主細胞を培養する任意の便利な方法を、目的のＴＡ前駆体および下流のＴＡを生成するために使用することができる。使用される特定のプロトコルは、例えば、宿主細胞、異種コード配列、所望のＴＡ前駆体および目的の下流ＴＡなどに応じて変化し得る。細胞は、１つ以上の機能的な異種酵素を細胞が発現することができる環境などの任意の便利な環境に存在し得る。インビトロは、本明細書で使用される場合、細胞の位置に関係なく、単に生細胞の外側を意味する。本明細書で使用される場合、インビボという用語は、細胞の位置に関係なく、生細胞の内部を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、酵素発現を助長する条件下で、インビボで目的のＴＡ前駆体および下流のＴＡの産生を可能にするために利用可能な適切な基質を用いて培養される。いくつかの実施形態では、機能的酵素は、インビトロ条件下でのＴＡの産生のために宿主から抽出される。場合によっては、宿主細胞は多細胞宿主生物に戻される。宿主細胞は、定常期および対数増殖期などを含むがこれらに限定されない増殖の任意の期にある。さらに、培養物自体は、連続培養物であり得るか、またはそれらはバッチ培養物であり得る。
細胞は適切な発酵培地で２０～４０℃の温度で増殖させることができる。細胞は、任意の都合のよい速度（例えば、２００ｒｐｍ）で振とうしながら増殖させることができる。細胞は好適なｐＨで増殖させることができる。発酵に好適なｐＨ範囲は、ｐＨ５～９の間であり得る。発酵は、好気性、嫌気性、または微好気性の条件下で実施することができる。任意の好適な増殖培地を使用することができる。好適な増殖培地には、合成規定（ＳＤ）最少培地または酵母エキスペプトンデキストロース（ＹＥＰＤ）リッチ培地などの、一般的な商業的に調製された培地が含まれ得るが、これらに限定されない。微生物に適した他のリッチな、規定の、または合成の増殖培地を使用することができる。
細胞は、本質的に任意のサイズおよび形状の容器内で培養することができる。本開示の方法を実行するのに好適な容器の例には、マルチウェル振とうプレート、試験管、フラスコ（バッフル付きおよびバッフルなし）、およびバイオリアクターが含まれ得るが、これらに限定されない。培養物の容量は、１０マイクロリットル～１０，０００リットルを超える範囲であってよい。
アルカロイドの産生に望ましい方法で代謝を調節することが知られている薬剤の増殖培地への添加が含まれ得る。非限定的な例では、環状アデノシン２’３’－一リン酸を増殖培地に添加して、カタボライト抑制を調節することができる。
特定の細胞型のための任意の便利な細胞培養条件を利用することができる。特定の実施形態では、１つ以上の改変を含む宿主細胞は、標準的なまたは容易に最適化された条件下で、標準的な細胞培養培地およびサプリメントと共に培養される。一例として、プラスミド維持のための選択圧が必要とされない場合の標準的な増殖培地は、２０ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／Ｌのペプトン、および２０ｇ／Ｌのデキストロース（ＹＰＤ）を含み得る。プラスミドを含む宿主細胞は、１．７ｇ／Ｌの酵母窒素ベース基礎培地、５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、および増殖と選択に必要な適切なアミノ酸を補充した、２０ｇ／Ｌのデキストロースを含む合成完全（ＳＣ）培地で増殖させる。誘導性酵素発現に有用であり得る代替炭素源には、スクロース、ラフィノース、およびガラクトースが含まれるが、これらに限定されない。細胞は、実験室で、容器内、例えば、試験管またはフラスコ内で、１～１０００ｍＬ以上の範囲の容量で、任意の都合のよい速度（例えば、２００ｒｐｍ）で振とうしながら、任意の便利な温度（例えば、３０℃）で増殖させる。
培養量は、例えば、工業プロセスの一部として、より大きな発酵容器での増殖のためにスケールアップすることができる。工業的発酵プロセスは、クローズドバッチ、流加（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ）、または連続ケモスタット条件下、あるいは任意の好適な発酵モードで実施することができる。場合によっては、細胞を全細胞触媒として基質に固定化し、アルカロイド産生のための発酵条件に供してもよい。
バッチ発酵は閉鎖系であり、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵プロセス中に変更されない。発酵の開始時に、所望の生物（複数可）を培地に接種する。場合によっては、バッチ発酵は、ｐＨおよび酸素濃度（炭素ではない）などの要因を制御するためにシステムに変更を加えて実行される。このタイプの発酵システムでは、システムのバイオマスと代謝産物の組成は、発酵の過程で連続的に変化する。細胞は通常、誘導期、対数期（高増殖速度）、定常期（増殖速度の低下または停止）、そして最終的には死滅期（未処理のままの場合）に進む。
流加発酵は、発酵プロセスの過程で、間隔を置いて基質がシステムに追加されることを除いて、バッチ発酵に似ている。流加システムは、カタボライト抑制が宿主細胞の代謝に与える影響を軽減するために使用され、また、増殖培地に基質の量を制限することが望まれるその他の状況下でも使用される。
連続発酵は開放系であり、規定の発酵培地がバイオリアクターに連続的に追加され、等量の発酵培地を処理のために容器から連続的に除去するものである。連続発酵システムは、一般に、定常状態の増殖条件を維持するために操作され、その結果、除去される培地による細胞損失は、発酵における増殖速度によってバランスをとる必要がある。連続発酵は、一般に、細胞が一定の高い細胞密度にある条件で操作される。連続発酵は、標的産物の濃度および／または細胞増殖に影響を与える１つまたは複数の要因の調節することができる。
液体培地は、限定されないが、上記の添加剤成分を有する、リッチまたは合成の規定された培地を含み得る。培地成分は、水に溶解し、熱、圧力、ろ過、放射線、化学薬品、またはそれらの任意の組み合わせによって滅菌することができる。いくつかの培地成分を別々に調製して滅菌し、次に発酵容器内で組み合わせることができる。培養培地は、発酵を通して一定のｐＨを維持するのを助けるために緩衝され得る。
温度、溶存酸素、ｐＨ、撹拌、通気速度、細胞密度などのプロセスパラメータは、発酵の過程で監視または制御できる。例えば、発酵プロセスの温度は、培養培地に浸漬された温度プローブによって監視され得る。培養温度は、ジャケット温度を調節することにより設定点で制御することができる。水は外部冷却装置で冷却された後、バイオリアクター制御塔に流れ込み、容器内の設定温度を維持するために必要な温度でジャケットに循環される。
さらに、ガスフローパラメータは、発酵プロセスで監視することができる。例えば、ガスはスパージャーを介して培地に流入され得る。本開示の方法に好適なガスには、圧縮空気、酸素、および窒素が含まれ得る。ガスフローは、固定速度であるか、溶存酸素の設定値を維持するように調整されていてもよい。
培養培地のｐＨも監視することができる。一例では、ｐＨは、容器内の培養培地に浸漬されたｐＨプローブによって監視され得る。ｐＨ制御が有効な場合、ｐＨは、必要な速度で各溶液を培地に添加する酸および塩基ポンプによって調整できる。ｐＨを制御するために使用される酸性溶液は、硫酸または塩酸であり得る。ｐＨを制御するために使用される塩基性溶液は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、または水酸化アンモニウムであり得る。
さらに、溶存酸素は、培養培地に浸漬された溶存酸素プローブによって培養培地中で監視され得る。溶存酸素調整が有効な場合は、撹拌速度を増減することで酸素レベルを調整できる。溶存酸素レベルは、ガス流量を増減することによって調整することもできる。ガスは、圧縮空気、酸素、または窒素であり得る。
撹拌速度は、発酵プロセスでも監視できる。例では、撹拌機モーターがアジテータを駆動することができる。撹拌機の速度は、発酵全体を通して一定のｒｐｍに設定することができ、または設定された溶存酸素レベルを維持するために動的に調整することができる。
さらに、濁度を発酵プロセスで監視することができる。例では、細胞密度は、濁度プローブを使用して測定することができる。あるいは、細胞密度は、バイオリアクターから試料を採取し、それらを分光光度計で分析することによって測定することができる。さらに、試料は、滅菌サンプリング装置を介して時間間隔でバイオリアクターから取り出され得る。試料は、宿主細胞によって産生されたアルカロイドについて分析され得る。試料はまた、他の代謝物および糖、培養培地成分の枯渇、または細胞の密度についても分析できる。
別の例では、発酵プロセス中に供給原料パラメータを監視することができる。特に、糖および他の炭素源、栄養素、および補因子を含む供給原料を、外部ポンプを使用して発酵に加えることができる。消泡剤、塩、キレート剤、界面活性剤、および有機液体を含むがこれらに限定されない他の成分も発酵中に添加され得る。
宿主細胞における異種ポリヌクレオチドの発現を最適化するための任意の便利なコドン最適化技術は、対象の宿主細胞および方法での使用に適合させることができ、例えば、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２，３４６－３５３を参照されたく、これは、参照によりその全体が組み込まれる。
対象となる方法はまた、細胞培養物に出発化合物を加えることも含み得る。任意の便利な添加方法を、対象となる方法での使用に適合させることができる。細胞培養物は、十分な量の目的の出発物質（例えば、本明細書に記載されるような）、例えば、約１～５ｍＭの出発化合物など、ｍＭ～μＭの量で補充され得る。添加される出発物質の量、添加のタイミングおよび速度、添加される物質の形態などは、様々な要因によって変化し得ることが理解される。出発物質は、ニートで、または好適な溶媒（例えば、細胞培養培地、水、または有機溶媒）に事前に溶解して添加することができる。出発物質は、添加時の細胞培養培地の希釈を最小限にするために、濃縮された形態（例えば、所望の濃度の１０倍）で添加され得る。出発物質は、１つ以上のバッチで、または長期間（例えば、数時間または数日）にわたって連続的に添加することによって添加することができる。
発酵培地から産物を分離する方法
対象となる方法はまた、細胞培養物から目的のＴＡを回収することを含み得る。分離および単離の任意の便利な方法（例えば、クロマトグラフィー法または沈殿法）を、細胞培養物から目的のＴＡを回収するための対象となる方法での使用に適合させることができる。濾過法を使用して、細胞培養物の可溶性画分と不溶性画分を分離することができる。場合によっては、液体クロマトグラフィー法（例えば、逆相ＨＰＬＣ、サイズ排除、順相クロマトグラフィー）を使用して、目的のＴＡを細胞培養の他の可溶性成分から分離することができる。場合によっては、抽出方法（例えば、液体抽出、ｐＨベースの精製など）を使用して、目的のＴＡを細胞培養物の他の成分から分離することができる。
産生されたアルカロイドは、当技術分野で知られている方法を使用して発酵培地から単離することができる。所望の生成物の最初の回収のために、発酵の直後（または場合によっては発酵中に）にいくつかの回収ステップを実施することができる。これらのステップを通じて、アルカロイド（例えば、ＴＡ）は、細胞、細胞の破片および廃棄物から分離され得、他の栄養素、糖、および有機分子は使用済み培養培地に残り得る。このプロセスは、ＴＡ富化産物を産生するために使用できる。
一例では、トロパンアルカロイド（ＴＡ）産物を有する産物ストリームは、操作された酵母細胞ならびに栄養素および水を含む原料をバッチ反応器に提供することによって形成される。操作された酵母細胞は、細胞生来の生合成酵素遺伝子の変異を軽減するフィードバック阻害、細胞生来の生合成酵素遺伝子の転写調節改変、および細胞生来の酵素における不活性化変異、からなる群から選択される少なくとも１つの改変を有し得る。操作された酵母細胞がバッチ反応器内にある場合、操作された酵母細胞は発酵に供され得る。特に、操作された酵母細胞は、操作された酵母細胞を少なくとも約５分間インキュベートすることによって発酵に供されて、ＴＡ産物および細胞材料を含む溶液を産生し得る。操作された酵母細胞が発酵に供されると、少なくとも１つの分離ユニットを使用して、ＴＡ産物を細胞材料から分離して、ＴＡ産物を含む産物ストリームを提供することができる。特に、産物ストリームは、ＴＡ産物、ならびに清澄化酵母培地などの追加の成分を含み得る。さらに、ＴＡ産物は、１つ以上のＴＡ化合物などの目的の１つ以上のＴＡを含み得る。
目的のＴＡを含むバイオリアクター培地から細胞を除去するために、さまざまな方法を使用することができる。例では、細胞は、経時的な沈降によって除去され得る。この沈降プロセスは、冷却またはシリカなどの清澄剤の添加によって加速され得る。次に、使用済み培養培地を反応器の上部からサイフォンで吸い上げるか、細胞を反応器の底部からデカントすることができる。あるいは、細胞は、フィルター、膜、または他の多孔質材料を通して濾過することによって除去され得る。細胞はまた、遠心分離によって、例えば、連続フロー遠心分離によって、または連続抽出器を使用することによって除去され得る。
関心のあるいくつかの貴重なＴＡが細胞内に存在する場合、細胞を透過処理または溶解し、細胞破片を上記の方法のいずれかによって除去することができる。細胞を透過処理するために使用される薬剤には、有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）または塩（例えば、酢酸リチウム）が含まれ得るが、これらに限定されない。細胞を溶解する方法には、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤の添加、またはビーズミリングまたは超音波処理による機械的破壊が含まれ得る。
目的のＴＡは、水性培養培地と非混和性の有機液体を添加することにより、液液抽出によって清澄化された使用済み培養培地から抽出することができる。好適な有機液体の例には、ミリスチン酸イソプロピル、酢酸エチル、クロロホルム、酢酸ブチル、メチルイソブチルケトン、オレイン酸メチル、トルエン、オレイルアルコール、酪酸エチルが含まれるが、これらに限定されない。有機液体は、水性培地の体積の最小１０％または最大１００％まで添加することができる。
場合によっては、有機液体は、発酵の開始時または発酵中の任意の時点で添加され得る。抽出発酵のこのプロセスは、ＴＡ前駆体またはＴＡを有機相に連続的に取り出すことにより、宿主細胞からの目的のＴＡの収量を増加させることができる。
撹拌により、有機相が水性培地とエマルジョンを形成する可能性がある。２つの相の別個の層への分離を促進する方法は、限定されないが、解乳化剤または核剤の添加、またはｐＨの調整を含み得る。エマルジョンはまた、例えば、連続コニカルプレート遠心分離によって、２つの相を分離するために遠心分離され得る。
あるいは、有機相を水性培養培地から単離して、抽出後に物理的に取り出すことができる。例えば、溶媒は膜に封入され得る。
一例では、目的のＴＡは、吸着法を使用して発酵培地から抽出され得る。特に、目的のＴＡは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ４などの樹脂または吸着によってＴＡを取り出す別の薬剤を添加することにより、清澄化された使用済み培養培地から抽出できる。次に、目的のＴＡは、有機溶媒を使用して樹脂から放出され得る。好適な有機溶媒の例には、これらに限定されないが、メタノール、エタノール、酢酸エチル、またはアセトンが含まれる。
目的のＴＡは、ろ過を使用して発酵培地から抽出することもできる。高ｐＨでは、目的のＴＡがバイオリアクター内で結晶のような沈殿物を形成できる。この沈殿物は、フィルター、膜、またはその他の多孔質材料でろ過することにより直接取り出すことができる。沈殿物はまた、遠心分離および／またはデカンテーションによって収集され得る。
上記の抽出方法は、インサイチュ（バイオリアクター内）またはエクスサイチュ（例えば、培地がバイオリアクターから流出して抽出剤に接触し、その後容器に再循環される外部ループ内）のいずれかで実施することができる。あるいは、抽出方法は、バイオリアクター容器から取り出された清澄化された培地を使用して発酵が終了した後に実行され得る。
アルカロイド富化溶液から産物を精製する方法
その後の精製ステップは、発酵後のＴＡ前駆体またはＴＡ富化産物を、当技術分野で知られている方法を使用して処理して、目的の個々の産物種を高純度に回収することを含み得る。
一例では、有機相で抽出されたＴＡ前駆体またはＴＡは、水溶液に移され得る。場合によっては、有機溶媒を熱および／または真空によって蒸発させることができ、得られた粉末を好適なｐＨの水溶液に溶解することができる。さらなる例において、ＴＡ前駆体またはＴＡは、ＴＡ前駆体またはＴＡの水相への抽出を促進する好適なｐＨの水溶液を添加することによって、有機相から抽出され得る。次に、水相は、デカンテーション、遠心分離、または別の方法によって取り出すことができる。
ＴＡ前駆体またはＴＡ含有溶液は、例えば、好適なキレート剤で処理することによって、金属を除去するためにさらに処理され得る。ＴＡ前駆体またはＴＡ含有溶液は、沈殿によってタンパク質およびＤＮＡなどの他の不純物を除去するためにさらに処理され得る。一例では、ＴＡ前駆体またはＴＡ含有溶液は、エタノール、メタノール、アセトン、またはイソプロパノールなどの適切な沈殿剤で処理される。別の例では、ＤＮＡおよびタンパク質は、透析によって、またはより小さなアルカロイドを混入した生体高分子から分離するサイズ排除の他の方法によって除去され得る。
さらなる例において、ＴＡ前駆体、ＴＡ、または改変ＴＡ含有溶液は、当技術分野で知られている方法を使用する連続クロスフロー濾過によって高純度に抽出され得る。
溶液がＴＡ前駆体またはＴＡの混合物を含む場合、それは、当技術分野で知られている方法を使用して、目的の種の個々のＴＡを生成するために酸塩基処理に供され得る。このプロセスでは、水溶液のｐＨを調整して、個々のＴＡ前駆体またはＴＡをそれぞれのｐＫａで沈殿させる。
高純度の小規模な調製物の場合、ＴＡ前駆体またはＴＡは液体クロマトグラフィーによって単一のステップで精製することができる。
酵母由来のアルカロイドＡＰＩ対植物由来のＡＰＩ
清澄化酵母培地（ＣＹＣＭ）は、複数の不純物を含み得る。清澄化された酵母培養培地は、真空および／または熱によって脱水されて、アルカロイド富化粉末を産生し得る。この産物は、さらなる化学処理および精製に供されるトロパンアルカロイドの抽出のために医薬品有効成分（ＡＰＩ）メーカーによって使用されるナス科植物（ｎｉｇｈｔｓｈａｄｅ）の葉の濃縮物（ＣＮＬ）に類似する。本発明の目的のために、ＣＮＬは、所望のアルカロイド産物（複数可）が最終的にさらに精製され得る任意のタイプの精製された植物抽出物の代表的な例である。表５は、ＣＹＣＭもしくはＣＮＬのいずれかに固有であり得るか、または両方に存在し得るこれら２つの産物の不純物を強調する。これらの不純物のサブセットについて未知の起源の産物を分析することにより、当業者は、その産物が酵母または植物の産生宿主に由来するかどうかを決定することができる。
ＡＰＩグレードの医薬品成分は高度に精製された分子である。そのため、ＡＰＩの植物由来または酵母由来を示す可能性のある不純物（表２および３にリストされているものなど）は、産物のそのＡＰＩ段階では存在しない可能性がある。実際、本発明の酵母株に由来するＡＰＩ産物の多くは、従来の植物由来のＡＰＩとほとんど区別がつかない可能性がある。しかしながら、場合によっては、従来のアルカロイド化合物は、化学合成アプローチを使用して化学改変を受ける可能性があり、そのような化学改変を必要とする植物ベースの産物において化学不純物として現れる可能性がある。例えば、化学的誘導体化は、化学合成プロセスに関連する一連の不純物をもたらすことがよくある。特定の状況において、これらの改変は、酵母産生プラットフォームにおいて生物学的に実施され得、それにより、化学的誘導に関連する不純物のいくつかが酵母由来産物に存在することを回避することができる。特に、化学的誘導産物からのこれらの不純物は、化学合成プロセスを使用して産生されるＡＰＩ産物に存在する可能性があるが、酵母由来産物を使用して産生されるＡＰＩ産物には存在しない可能性がある。あるいは、酵母由来産物が化学的に誘導された産物と混合される場合、結果として生じる不純物が存在する可能性があるが、化学的に誘導された産物のみまたはそれが主に含まれるＡＰＩで予想されるよりも少ない量である。この例では、これらの不純物のサブセットについてＡＰＩ産物を分析することにより、当業者は、産物が酵母産生宿主に由来するのか、または従来の化学的誘導体化経路に由来するのかを決定することができる。
化学的に誘導されたトロパンアルカロイドＡＰＩには存在する可能性があるが、生合成されたＡＰＩには存在しない可能性のある不純物の非限定的な例には、ヒヨスチアミンとスコポラミンの、Ｎ－メチル化およびＮ－ブチル化などの化学的Ｎ－アルキル化によって形成される、塩化水素、ヨウ化水素および臭化水素などのハロゲン化水素が含まれる。
しかし、酵母由来の化合物と植物由来の化合物の両方が化学合成アプローチによる化学改変を受ける場合、化学合成プロセスに関連する同じ不純物が産物に予想される可能性がある。そのような状況では、出発物質（例えば、ＣＹＣＭまたはＣＮＬ）を、上記のように分析することができる。
宿主細胞を操作する方法
目的のＴＡまたはその前駆体を産生する目的で宿主細胞を操作する方法も含まれる。ＤＮＡを宿主細胞に挿入することは、任意の便利な方法を使用して達成することができる。この方法は、宿主細胞が酵素を機能的に発現し、目的の出発化合物を目的の産物ＴＡに変換するように、異種コード配列を宿主細胞に挿入するために使用される。
任意の便利なプロモーターを対象の宿主細胞および方法で利用することができる。異種コード配列の発現を駆動するプロモーターは、プロモーターが宿主細胞において活性であるという条件で、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。異種コード配列は、それらの天然プロモーターから発現され得るか、または非天然プロモーターが使用され得る。そのようなプロモーターは、それらが使用される宿主において低強度から高強度であり得る。プロモーターは制御的または、構成的であり得る。特定の実施形態では、グルコース抑制されない、または培養培地中のグルコースの存在によって穏やかにのみ抑制されるプロモーターが使用される。対象となるプロモーターには、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｔｓｒ遺伝子（フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーター領域をコードする）のプロモーターまたはグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ、ＧＡＰＤＨ、またはＴＤＨ３）をコードする酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子由来のプロモーターなどの、解糖系遺伝子のプロモーター、パン酵母のＡＤＨ１プロモーター、酵母のＰＨＯ５プロモーターなどの、リン酸飢餓誘導プロモーター、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリホスファターゼプロモーター、Ｇａｌ１－１０、Ｇａｌ１、ＧａｌＬ、ＧａｌＳなどの酵母誘導性プロモーター、抑制性プロモーターＭｅｔ２５、ｔｅｔＯ、および構成的プロモーター、例えばグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＧＰＤ）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ）、翻訳伸長因子－１－αプロモーター（ＴＥＦ）、シトクロムｃ－オキシダーゼプロモーター（ＣＹＣ１）、ＭＲＰ７プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）などが含まれるが、これらに限定されない。グルココルチコイド、ステロイド、および甲状腺ホルモンなどのホルモンによって誘導されるプロモーターを含有する自律複製酵母発現ベクターも使用することができ、これらに限定されないが、グルコルチコイド応答配列（ＧＲＥ）および甲状腺ホルモン応答配列（ＴＲＥ）が含まれる。これらおよび他の例は、そこに引用されている参考文献を含めて、参照により組み込まれる、米国特許第７，０４５，２９０号に記載されている。α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなどの、追加の構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを使用することができる。さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢによる）を使用して、遺伝子の発現を促進することもできる。任意の便利な適切なプロモーターを、宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのために選択することができる。プロモーター選択を使用して転写産物を最適化し、ひいては酵素レベルを最適化して、エネルギー資源を最小化しながら生産を最大化することもできる。
任意の便利なベクターを対象の宿主細胞および方法で利用することができる。目的のベクターには、酵母および他の細胞で使用するためのベクターが含まれる。酵母ベクターの種類は、組み込みベクター（ＹＩｐ）、自律複製高コピー数ベクター（ＹＥｐまたは２μプラスミド）、自律複製低コピー数ベクター（ＹＣｐまたはセントロメアプラスミド）、および大断片クローニング用ベクター（ＹＡＣ）の４つの一般的なカテゴリーに分類できる。ベクターＤＮＡは、便利な形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞に導入される。
有用性
本発明の宿主細胞および方法は、例えば、上記のように、様々な用途での使用が見出される。関心のある用途には、限定されないが、研究用途および治療用途が含まれる。本発明の方法では、ＴＡの産生が関心のある任意の便利な用途を含む様々な異なる用途での使用が見出される。
対象の宿主細胞および方法は、様々な治療用途で使用が見出される。対象となる治療用途には、ＴＡを含む医薬品の調製が対象となる用途が含まれる。本明細書に記載の宿主細胞は、トロパンアルカロイド前駆体（ＴＡ前駆体）および目的のＴＡを産生する。トロピノンとトロピンは、薬用ＴＡ製品などの最終製品を製造するための工学的取り組みを含む、ＴＡの合成において重要な主要な分岐点中間体である。対象の宿主細胞を利用して、トロピノン、トロピン、およびＴＡ最終産物を含む目的のＴＡの産生に使用が見出され得る、単純で安価な出発物質からＴＡ前駆体を産生することができる。したがって、対象の宿主細胞は、治療的に活性なＴＡまたはその前駆体の供給において使用が見出される。
場合によっては、宿主細胞および方法は、これらの化合物の化学合成が低収率であって大規模生産のための実行可能な手段ではない、商業規模の量のＴＡまたはその前駆体の生産に使用が見出される。特定の場合において、宿主細胞および方法は、例えば、５，０００～２００，０００リットルの容量のバイオリアクター（発酵槽）を含む発酵施設で利用され、治療産物のための目的のＴＡまたはその前駆体の迅速な生産を可能にする。このような用途には、セルロース、デンプン、遊離糖などの発酵性炭素源からの目的のＴＡの工業規模の生産が含まれ得る。
対象の宿主細胞および方法は、さまざまな研究用途での使用が見出されている。対象の宿主細胞および方法を使用して、様々な目的のＴＡまたはその前駆体の生合成経路に対する様々な酵素の効果を分析することができる。さらに、宿主細胞は、まだ証明されていない治療機能における関心のある生物活性の試験に使用が見出されるＴＡまたはその前駆体を産生するように操作することができる。場合によっては、さまざまな酵素をコードするさまざまな異種コード配列を含むように宿主細胞を操作することで、目的のＴＡまたはその前駆体に向かう高収量の生合成経路が解明される。場合によっては、研究用途には、目的の治療用分子の前駆体の産生が含まれ、その後、所望の産物にさらに化学的に改変または誘導体化するか、目的の治療活性の増加をスクリーニングすることができる。場合によっては、宿主細胞株は、そのような経路での関心のある酵素活性をスクリーニングするために使用され、これらの株で産生されたＴＡ代謝物の変換を介した酵素の発見につながる可能性がある。
対象の宿主細胞および方法は、植物に特化した代謝産物の生産プラットフォームとして使用することができる。対象の宿主細胞および方法は、薬物ライブラリ開発ならびに植物酵素発見のためのプラットフォームとして使用され得る。例えば、対象の宿主細胞および方法は、ヒヨスチアミンおよびスコポラミンなどの興味深い足場分子を産生する酵母株を採取し、コンビナトリアル生合成を介してまたは化学的手段によって化合物構造をさらに機能化することにより、天然物ベースの薬物ライブラリの開発に使用が見出され得る。この方法で薬物ライブラリを作成することにより、潜在的な薬物ヒットは、大規模な培養と産生に適した産生宿主にすでに関連付けられている。別の例として、これらの対象の宿主細胞および方法は、植物酵素の発見に使用が見出され得る。対象の宿主細胞は、定義された代謝物のクリーンなバックグラウンドを提供して、植物発現配列タグ（ＥＳＴ）ライブラリを発現させ、新しい酵素活性を特定する。対象の宿主細胞および方法は、酵母における植物酵素の機能的発現および増加した活性のための発現方法および培養条件を提供する。
キットおよびシステム
本発明の態様は、キットおよびシステムをさらに含み、キットおよびシステムは、本明細書に記載されるような、本発明の方法で使用される１つ以上の構成要素、例えば、宿主細胞、出発化合物、異種コード配列、ベクター、培地などを含み得る。いくつかの実施形態では、対象キットは、宿主細胞（例えば、本明細書に記載される）、および以下から選択される１つ以上の成分を含む：出発化合物、異種コード配列および／またはそれを含むベクター、ベクター、増殖原料、発現システムでの使用に好適な構成要素（例えば、細胞、クローニングベクター、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、双方向プロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）など）、ならびに培養培地。
本明細書に記載の構成要素のいずれか、例えば、１つ以上の改変を含む宿主細胞、出発化合物、培養培地などをキットで提供することができる。異種コード配列、クローニングベクターおよび発現システムの作成および使用に使用するのに好適な様々な構成要素が、対象のキットでの使用に見出され得る。キットには、チューブ、緩衝液など、および使用説明書も含まれる場合がある。キットの様々な試薬成分は、別々の容器に存在し得るか、またはそれらのいくつかまたはすべては、必要に応じて、単一の容器内の試薬混合物に事前に組み合わされ得る。
目的のＴＡを産生するためのシステムも提供され、システムは、１つ以上の改変（例えば、本明細書に記載される）を含む操作された宿主細胞、出発化合物、培養培地、発酵槽および発酵装置、例えば、宿主細胞の増殖条件を維持するのに好適な器械、サンプリングおよび監視機器および構成要素などを含み得る。酵母細胞の大規模発酵での使用に好適な様々な構成要素が、対象のシステムでの使用に見出され得る。
場合によっては、システムには、操作された宿主細胞の大規模発酵、および発酵した宿主細胞によって産生されたＴＡ化合物の監視と精製のための構成要素が含まれている。特定の実施形態では、１つ以上の出発化合物（例えば、本明細書に記載される）は、発酵槽内の操作された宿主細胞が１つ以上の所望のＴＡ産物またはその前駆体を産生する条件下で、システムに添加される。場合によっては、宿主細胞は、目的のＴＡ（例えば、本明細書に記載されるような）を産生する。場合によっては、目的のＴＡ産物は、ヒヨスチアミン、Ｎ－メチルヒヨスチアミン、アニソダミン、スコポラミン、Ｎ－メチルスコポラミン、およびＮ－ブチルスコポラミンなどの薬用ＴＡ産物である。
場合によっては、システムは、対象の宿主細胞によって産生される１つ以上のＴＡ化合物またはその前駆体を監視および／または分析するための手段を含む。例えば、本明細書に記載のＬＣ－ＭＳ分析システム、クロマトグラフィーシステム、または試料を分析し、例えば本明細書に記載の標準と比較することができる任意の便利なシステム。発酵培地は、サンプリングおよび分析により、発酵前および発酵中の任意の都合のよい時間に監視することができる。出発化合物の、目的のＴＡ産物または前駆体への変換が完了すると、発酵を停止し、ＴＡ産物の精製を行うことができる。したがって、場合によっては、対象システムは、それが産生される宿主細胞培地から目的のＴＡ産物または前駆体を精製するのに好適な精製構成要素を含む。精製構成要素は、シリカクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、液体抽出およびｐＨ抽出法を含むがこれらに限定されない、ＴＡ産物または発酵の前駆体を精製するために使用できる任意の便利な手段を含み得る。場合によっては、対象システムは、システムへの１つ以上の出発化合物の入力に続いて、目的のＴＡ発酵産物の産生および単離を提供する。
以下の実施例は、当業者に、本発明をどのように製造および使用するのかに関する完全な開示および説明を提供するように提案されており、本発明者らが自分らの発明としてみなすものの範囲を制限するよう意図されておらず、該実施例は、以下の実験が、すべてであるかまたは実施された唯一の実験であることを表すよう意図しているのでもない。使用される数値（例えば量、温度等）に関して精度を確保するための努力がなされたが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部分は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧かまたはほぼ大気圧である。
実施例の方法
次のセクションでは、ＴＡ前駆体およびＴＡの産生のために、酵母菌株などの微生物株を構築、培養、および試験するため、ならびにＴＡ前駆体およびＴＡを産生するためにそのような菌株の発酵を行うために使用できる方法および手順の例を提供する。また、微生物宿主の改変に必要なＤＮＡ配列を生成して、微生物宿主に所望のＤＮＡ配列を導入するために使用することができる方法、手順、および材料の例も含まれる。
化合物および標準。 操作された宿主細胞によって産生された代謝産物の同一性を検証および定量化するためのＴＡ前駆体およびＴＡの化学的標準は、商業的ベンダーから購入することができる。例えば、プトレシン二塩酸塩、Ｎ－メチルプトレシン、ヒグリン、トロピノン、およびトロピンは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）から購入できる。４－（メチルアミノ）酪酸塩酸塩はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入できる。γ－メチルアミノブチルアルデヒド（４ＭＡＢ）ジエチルアセタールおよびリットリンは、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）から購入できる。ＮＭＰｙの化学的標準は、前述のように１容量のジエチルアセタールを５容量の２Ｍ ＨＣｌで６０℃で３０分間脱保護することと（Ｆｅｔｈ，Ｆ．，Ｗｒａｙ，Ｖ．＆Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．Ｇ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｂｙ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４，１６５３－１６５５（１９８５）を参照されたい）、室温で一晩インキュベートすることと、次に得られた濃縮物を３倍量のジエチルエーテルで２回洗浄して、残留有機不純物を除去することとによって、合成できる。
プラスミドの構築。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による新規ＤＮＡ配列の生成およびＤＮＡ配列決定に使用されるオリゴヌクレオチドは、ＩＤＴ ＤＮＡ、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、またはｔｈｅ Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡ）などのＤＮＡ合成会社から入手できる。天然酵母遺伝子は、コロニーＰＣＲを介してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡから増幅できる（Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｔ．Ｊ．，Ｚｏｇｈｂｉ，Ｈ．Ｙ．，Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｋ．Ａ．＆Ｃｈｉｎａｕｌｔ，Ａ．Ｃ．Ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｌｏｎｅｓ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ ｐｏｏｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｒｕｄｅ ｉｙｓａｔｅ ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，７１９１（１９９０）を参照されたい）。異種酵素の遺伝子配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの好適なコドン最適化ソフトウェアを使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの発現を改善するためにコドン最適化することができる。次に、異種遺伝子配列は、商業的ＤＮＡ合成会社によって線状の二本鎖ＤＮＡ断片として合成され得る。酵母での遺伝子発現には、２種類のプラスミドを使用でき、目的の生合成遺伝子を試験するための直接発現（ＤＥ）プラスミドと、選択したプロモーター－遺伝子－ターミネーターカセットのゲノム組み込みのテンプレートを提供する酵母組み込み（ＹＩ）保持プラスミドである。
ＤＥプラスミドは、構成的プロモーターおよびターミネーターに挟まれた目的の遺伝子、低コピーＣＥＮ６／ＡＲＳ４酵母複製起点、および栄養要求性選択マーカーを含む。ＤＥプラスミドは、目的の遺伝子をＰＣＲ増幅し、プライマーオーバーハングを使用して５’および３’制限部位を付加し、ＰＣＲ産物または合成した遺伝子断片を、制限酵素（例えば、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、またはＸｈｏＩ）の適切な対で消化し、次に遺伝子断片を、プラスミドｐＡＧ４１４ＧＰＤ－ｃｃｄＢ、ｐＡＧ４１５ＧＰＤ－ｃｃｄＢ、またはｐＡＧ４１６ＧＰＤ－ｃｃｄＢなどの好適な酵母プロモーター、ターミネーター、および複製配列を用いて同様に消化されたベクターにＴ４ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションすることにより構築できる（Ａｌｂｅｒｔｉ，Ｓ．，Ｇｉｔｌｅｒ，Ａ．Ｄ．＆Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ｓ．Ａ ｓｕｉｔｅ ｏｆ Ｇａｔｅｗａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｙｅａｓｔ ２４，９１３－９（２００７）を参照されたい）。
ＹＩプラスミドは、構成的プロモーターとターミネーターに挟まれた目的の遺伝子を含むが、酵母の複製起点または栄養要求性選択マーカーを欠いている。ＹＩプラスミドは、プロモーターとターミネーターの３’末端と５’末端にそれぞれ結合するように設計されたプライマーを使用した「アラウンドザホーン（ａｒｏｕｎｄ－ｔｈｅ－ｈｏｒｎ）」ＰＣＲを使用して、好適なプロモーターとターミネーターを有する空の保持ベクターを直線化することによって構築できる。目的の遺伝子をＰＣＲ増幅して、直線化されたベクターバックボーンの末端に３５～４０ｂｐの相同性を持つ５’および３’オーバーハングを付加することもできる。次に、遺伝子のＹＩベクターへのアセンブリは、ギブソンアセンブリを使用して実行できる。生合成酵素のＧＦＰ融合体を発現するＤＥプラスミドは、最初にＧＦＰ、標的酵素、およびＹＩベクターバックボーンを別々にコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントをギブソンアセンブリを使用して組み立てて、続いて制限酵素を使用してＹＩプラスミドからＤＥベクターに融合コンストラクトをサブクローニングし、記載されているようにライゲーションクローニングすることによって調製できる。
ＰＣＲ増幅は、商業的供給業者から入手可能な任意の忠実度の高い組換えＤＮＡポリメラーゼを使用して実施することができ、線状ＤＮＡは、好適なＤＮＡカラム精製キットを使用して精製することができる。組み立てられたプラスミドは、熱ショック形質転換、およびカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス中またはＬＢ寒天プレートでの選択、または別の抗生物質の選択を使用して、任意の化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株で増殖させることができる。プラスミドＤＮＡは、製造元のプロトコルに従ってプラスミド精製カラムを使用して、選択的ＬＢ培地で３７℃および２５０ｒｐｍで増殖させたＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物からアルカリ溶解によって単離できる。プラスミド配列は、サンガーシーケンシングによって確認する必要がある。
酵母株の構築。 酵母の任意の好適な実験室株を宿主生物として使用することができる。実験セクションの例で説明されている酵母株は、ＣＥＮ．ＰＫ２と呼ばれる親株ＣＥＮ．ＰＫ２－１Ｄに由来する（Ｅｎｔｉａｎ，Ｋ．Ｄ．＆Ｋｏｔｔｅｒ，Ｐ．２５ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６，６２９－６６６（２００７）を参照されたい）。菌株は、２％ｗ／ｖデキストロースを補充した酵母ペプトン培地（ＹＰＤ培地）、合成完全アミノ酸混合物および２％ｗ／ｖデキストロースを補充した酵母窒素ベース基礎培地（ＹＮＢ）規定培地（ＹＮＢ－ＳＣ）、または前述の培地の寒天プレートで非選択的に増殖させることができる。栄養要求性選択マーカー（ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、および／またはＬＥＵ２）を持つプラスミドで形質転換された株は、２％ｗ／ｖデキストロースと適切なドロップアウト溶液を補充したＹＮＢ培地（ＹＮＢ－ＤＯ）またはＹＮＢ－ＤＯ寒天プレートで選択的に増殖させることができる。酢酸代謝が不足している酵母株は、０．１％ｗ／ｖ酢酸カリウムを補充した前述の培地（すなわち、ＹＰＡＤまたはＹＮＢＡ）で増殖させることができる。
酵母のゲノム改変は、ＣＲＩＳＰＲｍ法を使用して実行できる（Ｒｙａｎ，Ｏ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ．Ｅｌｉｆｅ ３，１－１５（２０１４）を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲｍプラスミドはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と酵母ゲノムの目的の遺伝子座を標的とするシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を発現し、ＳｐＣａｓ９、ｔＲＮＡプロモーターおよびＨＤＶリボザイム、２０－ｎｔガイドＲＮＡ配列、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびターミネーターをコードするＤＮＡ断片のアセンブリＰＣＲおよびギブソンアセンブリによって構築できる。遺伝子挿入の場合、固有のプロモーターおよびターミネーターで挟まれた１つ以上の目的の遺伝子を含む組み込みフラグメントを、ＰＣＲ増幅を使用して構築し、ギブソンアセンブリによって保持ベクターにクローニングすることができる。組み込み断片は、好適な高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲ増幅され、隣接する断片、および／または組み込み部位の酵母ゲノムに隣接する４０ｂｐのマイクロホモロジー領域を持つことになる。遺伝子破壊の場合、組み込み断片は、オープンリーディングフレームの前半内に位置する破壊部位への４０ｂｐのマイクロホモロジーに隣接する３つのリーディングフレームすべてにおいて６～８個の終止コドンを含む。完全な遺伝子欠失の場合、組み込み断片は、欠失部位への４０ｂｐのマイクロホモロジーに隣接する栄養要求性マーカー遺伝子を含む。各組み込み断片は、所望のゲノム部位を標的とするＣＲＩＳＰＲｍプラスミドで同時形質転換される。陽性の組み込み体は、酵母コロニーＰＣＲ、サンガーシーケンシング、および／または液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による機能的スクリーニングによって特定できる。
酵母の形質転換。 酵母株は、熱ショック、エレクトロポレーション、および化学的形質転換を含む任意の好適な方法を使用して形質転換することができる。例えば、実験セクションの例で説明されている酵母株は、Ｆｒｏｚｅｎ－ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して化学的に形質転換された。個々の酵母コロニーをＹＰ（Ａ）Ｄ培地に接種し、３０℃および２５０ｒｐｍで一晩増殖させる。飽和培養物をＹＰ（Ａ）Ｄ培地で１：１０～１：５０に逆希釈し、さらに５～７時間増殖させて、指数期に到達させる。培養物を５００×ｇで４分間の遠心分離によりペレット化し、次にペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５に再懸濁することにより２回洗浄する。洗浄したペレットを、形質転換ごとに２０μＬのＥＺ２溶液に再懸濁し、１００～６００ｎｇの全ＤＮＡおよび２００μＬのＥＺ３溶液と混合する。酵母懸濁液を３０℃で穏やかに回転させながら１時間インキュベートする。プラスミド形質転換の場合、形質転換された酵母を、ＹＮＢ（Ａ）－ＤＯ寒天プレートに直接プレーティングする。Ｃａｓ９を介した染色体改変の場合、酵母懸濁液を１ｍＬのＹＰ（Ａ）Ｄ培地と混合し、５００×ｇで４分間遠心分離してペレット化し、２５０μＬの新鮮なＹＰ（Ａ）Ｄ培地に再懸濁する。次に、懸濁液を３０℃で穏やかに回転させながらさらに２時間インキュベートして、Ｇ４１８耐性タンパク質の産生を可能にし、４００ｍｇ／ＬのＧ４１８（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）硫酸塩を含むＹＰ（Ａ）Ｄプレートに広げる。次にプレートを３０℃で４８～６０時間インキュベートして、コロニーを形成させる。
スポット希釈アッセイ。 菌株をＹＮＢ（Ａ）－ＤＯ培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩増殖させる。飽和一晩培養物を４分間５００×ｇでの遠心分離によってペレット化し、ＯＤ６００に基づいて、１０７細胞／ｍＬの濃度になるように、滅菌したＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中に再懸濁する。次に、各菌株の１０倍段階希釈液をＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で調製し、各希釈液の１０μＬを、予め温めたＹＮＢ（Ａ）－ＤＯプレートにスポット（ｓｐｏｔ）する。プレートを３０℃でインキュベートし、４８時間後に画像化する。
代謝物アッセイの増殖条件。 小規模代謝物産生試験は、ＹＮＢ（Ａ）－ＳＣまたはＹＮＢ（Ａ）－ＤＯ培地で実施できる。酵母コロニーを３００～５００μＬの培地に接種し、ガス透過性フィルムで覆われた２ｍＬのディープウェル９６ウェルプレートで、３０℃、４６０ｒｐｍ、相対湿度８０％で４８～７２時間、振とう機内で増殖させ得る。
代謝物産生の分析。 代謝物のプロファイルと力価は、液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して分析できる。分析のために培地から細胞を分離するために、発酵培養物を１２℃で５分間３，５００×ｇで遠心分離することによりペレット化し、その後、直接分析のために上清の１００～２００μＬのアリコートを取り出すことができる。代謝物産生は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣおよびＡｇｉｌｅｎｔ６４２０ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ質量分析計などのトリプル四重極質量分析計と組み合わせた好適なＨＰＬＣデバイスを使用してＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析できる。クロマトグラフィーは、Ｚｏｒｂａｘ ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓ Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、１．８μｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などのＣ１８逆相カラムを使用し、移動相溶媒Ａとして水中の０．１％ｖ／ｖギ酸および溶媒Ｂとしてのアセトニトリル中の０．１％ｖ／ｖギ酸を使用して実行できる。カラムは、４０℃で０．４ｍＬ／分の一定流量、５μＬの試料注入量で操作される。化合物の分離は、次のグラジエントを使用して実行できる：０．００～０．７５分、１％Ｂ；０．７５～１．３３分、１～２５％Ｂ；１．３３～２．７０分、２５～４０％Ｂ；２．７０～３．７０分、４０～６０％Ｂ；３．７０～３．７１分、６０～９５％Ｂ；３．７１～４．３３分、９５％Ｂ；４．３３～４．３４分、９５～１％Ｂ；４．３４～５．００分、１％Ｂで平衡化。ＬＣ溶離液は、ポジティブモードのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、ソースガス温度３５０℃、ガス流量１１Ｌ／分およびネブライザー圧力４０ｐｓｉで動作する０．０１～５分でＭＳに送られる。代謝物は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）パラメータと標準曲線に基づく統合ピーク面積によって定量化できる。
蛍光顕微鏡検査法。 蛍光タンパク質レポーターに融合した生合成酵素をコードするプラスミドで形質転換された酵母株の個々のコロニーを１ｍＬのＹＮＢ－ＤＯ培地に接種し、３０℃および２５０ｒｐｍで一晩増殖させる。一晩培養物を５００×ｇで４分間遠心分離してペレット化し、２％ｗ／ｖデキストロースを含む２ｍＬ ＹＮＢ－ＤＯ培地に再懸濁し、３０℃および２５０ｒｐｍでさらに４～６時間増殖させて、指数期に到達させ、発現した蛍光タンパク質を完全に折り畳ませる。次に、約５～１０μＬの培養物をガラス製の顕微鏡スライドにスポットし、ガラス製のカバーガラスで覆い、６０倍の油浸対物レンズを備えた好適な倒立型蛍光顕微鏡を使用して画像化する。蛍光励起は、キセノンアークランプと次のフィルター設定を使用して実行できる：ＧＦＰ、ＥＴ４７０／４０Ｘ励起フィルターおよびＥＴ５２５／５０発光フィルター；ｍＣｈｅｒｒｙ、ＥＴ５７２／３５Ｘ励起フィルターおよびＥＴ６３２／６０発光フィルター。放出された光はＣＣＤカメラでキャプチャされ、その後の画像分析は、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）などの任意の好適な科学的画像分析ソフトウェアで実行できる。
トランスクリプトームデータベースからの新規遺伝子バリアントの同定。 新規遺伝子およびそのバリアントは、トランスクリプトームおよびゲノムデータベースの配列アラインメントベースの検索を使用して同定することができる。例えば、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼ（ＮｔＭＰＯ１）のオルソログは、１０００ Ｐｌａｎｔｓ ＰｒｏｊｅｃｔデータベースのＤ．ｍｅｔｅｌおよびＡ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａのトランスクリプトームのｔＢＬＡＳＴｎ検索を使用して同定された（Ｍａｔａｓｃｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｄａｔａ ａｃｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ １，０００ Ｐｌａｎｔｓ（１ＫＰ）ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｇｉｇａｓｃｉｅｎｃｅ ３，１７（２０１４）を参照されたい）。次に、これらの検索戦略を使用して同定された推定遺伝子のコード配列を酵母発現用に最適化し、前述のように発現ベクターにクローニングすることができる。
酵素構造解析。 異種酵素は、ＲａｐｔｏｒＸまたはＲｏｓｅｔｔａなどの好適なホモロジーモデリングまたはデノボ構造予測ソフトウェアを使用して構築されたホモロジーモデルを調べることにより、大きな非構造化領域などの、酵母での発現中に問題となる可能性のある構造的特徴を分析できる。結果として得られるタンパク質モデルは、ＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）またはＵＣＳＦＣｈｉｍｅｒａなどの三次元分子表示ソフトウェアを使用して視覚化できる。特定の基質に対する酵素親和性は、ＡｕｔｏＤｏｃｋ、ＳｗｉｓｓＤｏｃｋ、ＧＯＬＤ、またはＧｌｉｄｅなどの好適なリガンドドッキングシミュレーションソフトウェアを使用して分析できる。
ウエスタンブロットによる酵母のタンパク質発現の分析。 酵母で発現したタンパク質のイムノブロット分析では、好適な株を、目的のエピトープタグ付きタンパク質を保有する発現ベクターで形質転換する。形質転換の３日後、形質転換されたコロニーを２ｍＬ ＹＮＢ－ＤＯ培地に接種し、３０℃および４６０ｒｐｍで定常期まで一晩（約１６～２０時間）増殖させる。細胞を３，０００×ｇで５分間遠心分離してペレット化し、２００μＬのＨ２Ｏに再懸濁し、２００μＬの０．２Ｍ ＮａＯＨと混合し、室温で５分間インキュベートして、細胞壁糖タンパク質を加水分解する。細胞を３，０００×ｇで５分間再ペレット化し、７５μＬのＨ２Ｏに再懸濁し、２５μＬの４Ｘ ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と混合し、９５℃で３分間煮沸して細胞を溶解する。懸濁液を１６，０００×ｇで５分間遠心分離してペレット化し、不溶性の破片を除去し、上清を事前に冷却したチューブに移す。還元条件下での分析では、タンパク質溶解物をβ－メルカプトエタノール（最終濃度１０％）と混合し、７０℃で１０分間インキュベートする。約２０～４０μｇの総タンパク質を、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒタンパク質分子量マーカー（ＢｉｏＲａｄ）を備えたＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ４～１２％アクリルアミドゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にロードする。電気泳動は、１Ｘ ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ ＳＤＳランニング緩衝液で、１５０Ｖで９０分間行う。タンパク質のニトロセルロース膜への転写は、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｓｅｍｉ－Ｄｒｙ装置（ＢｉｏＲａｄ）およびＮｕＰＡＧＥ転写緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を製造元の指示に従って使用して、１５Ｖで１５分間行う。還元条件のために、ＮｕＰＡＧＥ抗酸化剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、ランニング緩衝液と転写緩衝液の両方に最終濃度が１倍になるように添加する。転写されたタンパク質を含む膜を、Ｔｗｅｅｎを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ－Ｔ；１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１９ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ ７．４）で５分間洗浄し、ＴＢＳ－Ｔ中の５％スキムミルクで室温で１時間ブロックする。膜を、５％ミルクを含むＴＢＳ－Ｔ中で適切に希釈したＨＲＰ結合抗体と４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔで５分間ずつ３回洗浄した後、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ ＨＲＰ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と好適なイメージャを使用して視覚化する。
実験
一連の特定の遺伝子改変は、単純で安価な原料または前駆体分子からＴＡを産生するためのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの生合成プロセスを提供する。非ＴＡ前駆体または単純な原料から、初期のＴＡ分子であるプトレシン、Ｎ－メチルプトレシン、４－メチルアミノブタナール、Ｎ－メチルピロリニウム（ＮＭＰｙ）、トロピノン、トロピン、フェニル乳酸（ＰＬＡ）、および１－Ｏ－β－フェニルラクトイルグルコース（ＰＬＡグルコシド）を産生できる新規株を構築する方法について記載する。ＮＭＰｙは、すべての既知のＴＡ分子の天然の前駆体である。酵母生合成経路の調節を操作するための方法、およびアミノ酸由来のＴＡ前駆体の産生を最適化するための方法も記載する。単純な原料からプソイドトロピンアルカロイドおよびカリステギンなどの非薬用ＴＡを産生できる新規菌株を構築する方法について記載する。さらに、非ＴＡ前駆体または単純な原料からヒヨスチアミン、アニソダミン、スコポラミンなどの薬用ＴＡを産生できる新規菌株を構築する方法についても記載する。さらに、非ＴＡ前駆体または単純な原料からシンナモイルトロピンなどの非天然ＴＡを産生することができる新規株を構築するための方法を記載する。
実施例１．高レベルのプトレシン産生のためのプラットフォーム酵母株の操作
ＴＡのトロピン部分は、アミノ酸アルギニンからポリアミン分子プトレシンを介して誘導される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株は、プトレシン、ＮＭＰ、４ＭＡＢ、およびＮＭＰｙを含むＴＡ前駆体分子の細胞内濃度を増加させる目的で、アルギニンおよびポリアミン生合成経路を通る改良されたフラックスを伴って開発される。これらの菌株は、一般に中心的な代謝からアルギニンおよびポリアミン生合成への炭素および窒素フラックスを増加させる目的で遺伝子改変を組み合わせ、ＴＡ前駆体プトレシンの追加産生のための重要な異種酵素の導入を含む。天然生合成酵素および調節タンパク質をコードする遺伝子への変異を軽減するフィードバック阻害の導入、天然生合成酵素の転写調節の調整、前駆体分子を意図された経路からそらす酵素をコードする遺伝子の欠失または破壊、および内因性分子をＴＡ前駆体分子に変換するための異種酵素の導入、を含む遺伝子改変が採用される。
１．１）操作された菌株の生合成経路には、アルギニン代謝とポリアミン生合成に関与する天然酵母遺伝子の過剰発現が組み込まれる（図４）。
１．１．１）酵母で過剰発現する天然遺伝子の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：グルタミン酸からのアルギニン生合成の最初のステップを触媒するグルタミン酸Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（Ａｒｇ２ｐ）；ミトコンドリアマトリックスで、アルギニンのグアニジニウム基を除去して、オルニチンを産生するアルギナーゼ（Ｃａｒ１ｐ）；ミトコンドリアマトリックスからサイトゾルにオルニチンを排出するミトコンドリア膜トランスポーター（Ｏｒｔ１ｐ）；サイトゾルのオルニチンをプトレシンに脱炭酸するオルニチンデカルボキシラーゼ（Ｓｐｅ１ｐ）；およびスペルミンとスペルミジンをプトレシンに脱アルキル化するポリアミンオキシダーゼ（Ｆｍｓ１ｐ）。
１．１．２）プトレシン産生に対するこれらの天然酵素の過剰発現の影響を、それぞれがＳＰＥ１、ＯＲＴ１、ＣＡＲ１、ＡＲＧ２、ＦＭＳ１、または陰性対照としての青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）うちの１つを発現する３つの低コピープラスミドの異なる組み合わせで酵母株を同時形質転換することによって調べた。選択培地で４８時間増殖させた後、同時形質転換細胞の細胞外培地に蓄積したプトレシンの力価をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで定量した（図５）。ＳＰＥ１のみの過剰発現により、プトレシン力価が１３．４倍に増加して２３ｍｇ／Ｌになった。ＣＡＲ１またはＡＲＧ２とＳＰＥ１との同時過剰発現は、ＳＰＥ１単独と比較してプトレシン産生の２７％および１２％の増加をもたらしたが、ＯＲＴ１とＳＰＥ１の過剰発現は、ＳＰＥ１と比較してプトレシン力価の３５％の減少を引き起こした。ＳＰＥ１、ＣＡＲ１、ＡＲＧ２、およびＦＭＳ１のうちのいずれか３つを過剰発現させると、細胞外プトレシン力価が全体として３４～３５ｍｇ／Ｌに増加した。
１．２）操作された菌株の生合成経路は、酵母以外の生物に見られるポリアミン産生経路からの異種酵素の発現を組み込んで、プトレシン産生をさらに増加させる（図４）。
１．２．１）ほとんどの植物、動物、菌類に見られるオルニチン依存性経路に加えて、アルギニンの脱グアニジン化とそれに続くオルニチンの脱炭酸によってプトレシンが合成されるほか、多くの細菌および植物はまた、アルギニンが最初にアルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）によって脱炭酸され、アグマチンを産生することによる代替経路も発現する。植物では、アグマチンのグアニジン基がイミノヒドロラーゼ（ＡＩＨ）によって尿素に変換されてＮ－カルバモイルプトレシン（ＮＣＰ）が産生され、次いでそこからアミド基がアミダーゼ（ＣＰＡ）によって除去されてプトレシンが産生される（Ｐａｔｅｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｎｔ ａｒｇｉｎａｓｅｓ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｔｈｉｒｄ ｒｏｕｔｅ ｆｏｒ ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．２６２，６２－７３（２０１７）を参照されたい）。いくつかの細菌は、アグマチンからグアニジン基を直接除去して、Ｎ－カルバモイル化中間体なしでプトレシンを産生することを可能にするアグマチンウレオヒドロラーゼ（ＡＵＨ）酵素を進化させた（Ｋｌｅｉｎ，Ｒ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ／ｐｌａｎｔ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４５（Ｐｔ ２，３０１－７（１９９９）を参照されたい）。
１．２．２）酵母の異種プトレシン生合成経路を再構築するために、次の酵素を使用することができる：ＡＤＣ、ＡＩＨ、ＣＰＡ、およびＡＵＨ。これらの酵素活性を有する操作された菌株の例として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで以前に活性が示されたオーツ麦（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ；ＡｓＡＤＣ）からのＡＤＣ（Ｋｌｅｉｎ，Ｒ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ／ｐｌａｎｔ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４５（Ｐｔ ２，３０１－７（１９９９）を参照されたい）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡｔＡＩＨ）由来のＡＩＨ、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ；ＳｌＣＰＡ）およびＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（ＡｔＣＰＡ）由来の２つのＣＰＡオルソログ、およびＥ．ｃｏｌｉ （ｓｐｅＢ）およびＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（ＡｔＡＲＧＡＨ２）由来の２つのＡＵＨが、酵母での発現のために選択された。
１．２．３）酵母における各異種酵素の機能を確立するために、３段階（アルギニン→アグマチン→ＮＣＰ→プトレシン）または２段階（アルギニン→アグマチン→プトレシン）のプトレシン経路を、ＡｓＡＤＣ、ＡｔＡＩＨ、およびＳｌＣＰＡもしくはＡｔＣＰＡのいずれか；またはＡｓＡＤＣおよびｓｐｅＢもしくはＡｔＡＲＧＡＨ２のいずれかを発現する低コピープラスミドで野生型酵母株を同時形質転換する段階的な方法で再構成した。異なるレベルの栄養要求性から生じる細胞増殖および代謝産物産生に対する影響を排除するために、すべての形質転換は、ブランクまたはプラスミドなしの代わりに陰性対照としてＢＦＰを使用して、異なる栄養要求性マーカーを保有する３つの低コピープラスミドで実行された。選択培地で４８時間増殖させた後の形質転換細胞の細胞外培地におけるアグマチン、ＮＣＰ、およびプトレシンの相対的蓄積をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析したところ、ＳｌＣＰＡおよびＡｔＡＲＧＡＨ２を除くすべての酵素が酵母で活性を保持していることが示された（図６、７）。ＡｓＡＤＣ、ＡｔＡＩＨ、およびＡｔＣＰＡを含む植物特異的経路の再構成により、２３ｍｇ／Ｌの力価でプトレシンの生産が可能になり、野生型の力価と比較して２２倍の改善が見られた。トマト由来のオルソロガスＣＰＡ（ＳｌＣＰＡ）は、ＡｓＡＤＣおよびＡｔＡＩＨを発現する細胞のプトレシンレベルと同様に、ＡｓＡＤＣおよびＡｔＡＩＨと組み合わせた場合に４．５ｍｇ／Ｌの力価でプトレシン産生を可能にした。ＡｓＡＤＣおよびＥ．ｃｏｌｉウレオヒドロラーゼ（ｓｐｅＢ）を介した細菌のショートカット経路の再構成により、野生型より３２倍高い３４ｍｇ／Ｌの力価でプトレシンの産生が可能になった。
１．３）操作された菌株の生合成経路には、アルギニンとポリアミンの生合成に関与する天然酵母遺伝子の過剰発現と、酵母以外の生物に見られるポリアミン産生経路からの異種生合成酵素の発現が組み込まれており、プトレシン産生をさらに増加させる。
１．３．１）プトレシン生合成のための過剰発現された天然遺伝子の最高性能の三つ組（ＳＰＥ１、ＡＲＧ２、ＣＡＲ１；１．１．２）は、野生型酵母株をＳＰＥ１、ＡｓＡＤＣ、およびｓｐｅＢをコードする低コピープラスミドとＡＲＧ２およびＣＡＲ１をコードする低コピープラスミドとで同時形質転換することによって、最高性能の異種プトレシン経路（ＡｓＡＤＣ、ｓｐｅＢ；１．２．３）と組み合わされた。形質転換細胞の培養培地中のプトレシン力価は、４８時間後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって測定された。得られた菌株は、４７ｍｇ／Ｌの力価でプトレシンを産生した（図１０）。
１．４）酵母のポリアミン生合成はいくつかの機構によって調節されている（図８）。操作された菌株の生合成経路は、プトレシン産生のフィードバック阻害を低減するために、これらの調節機構の１つ以上の破壊を組み込んでいる。
１．４．１）ポリアミン生合成の調節に関与し、したがって細胞内プトレシン蓄積を改善するために破壊される可能性のある天然酵母遺伝子には、以下の例が含まれるが、これらに限定されない（図８）。メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（Ｍｅｕ１ｐ）は、スペルミジンシンターゼ（Ｓｐｅ３ｐ）およびスペルミンシンターゼ（Ｓｐｅ４ｐ）によって触媒される、プトレシンをスペルミジンおよびスペルミンに変換するためのアルキル基供与体を構成する脱炭酸Ｓ－アデノシルメチオニン（ｄｃＳＡＭ）のリサイクル経路の駆動ステップを触媒する（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ，Ｍ．Ｋ．，Ｔａｂｏｒ，Ｃ．Ｗ．＆Ｔａｂｏｒ，Ｈ．Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｎｄ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ａ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍｅｕ１Δ ｍｕｔａｎｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４３，２０３－２０７（２００６）を参照されたい）。メチルチオアデノシンはスペルミジンシンターゼの活性を阻害することが知られている（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ，Ｍ．Ｋ．，Ｔａｂｏｒ，Ｃ．Ｗ．＆Ｔａｂｏｒ，Ｈ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｉｎ ｙｅａｓｔ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＭＥＵ１ ｇｅｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０２，１６１５８－１６１６３（２００５）を参照されたい）。ポリアミン生合成は、真菌と後生動物の間で保存されているアンチザイムを介した負のフィードバックループによって調節されている（Ｐｅｇｇ，Ａ．Ｅ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１，１４５２９－１４５３２（２００６）を参照されたい）。酵母では、ＯＡＺ１遺伝子は、オルニチンデカルボキシラーゼ（Ｓｐｅ１ｐ）の競合阻害剤であるアンチザイム－１を集合的にコードする単一ヌクレオチドによって隔てられた２つのエクソンを含む。ポリアミン誘導リボソームフレームシフト機構は、高ポリアミンレベルでのみ全長アンチザイムの翻訳を可能にし、それによってそれらの生合成のフィードバック阻害を課す。最後に、細胞外環境からのポリアミンの取り込みは、カルニチン、スペルミジン、スペルミンに親和性のある原形質膜のパーミアーゼであるＡｇｐ２ｐと、Ａｇｐ２ｐと相互作用すると考えられるプロテインキナーゼであるＳｋｙ１ｐが関与するシグナル伝達経路によって媒介される。
１．４．２）ＭＥＵ１、ＯＡＺ１、ＳＰＥ４、ＳＫＹ１、およびＡＧＰ２のそれぞれの酵母単一遺伝子破壊株は、野生型酵母の各オープンリーディングフレームの最初の３分の１内に一連のタンデムナンセンス変異を挿入することによって構築された。天然のおよび異種プトレシン生産経路に関連する各調節的な破壊の影響を特徴づけるために、酵母ＯＤＣ（ＳＰＥ１）を過剰発現させるか、ＡｓＡＤＣとｓｐｅＢを、単一遺伝子破壊株のそれぞれで低コピープラスミドから同時発現させた。細胞外培地中のプトレシン力価は、７２時間の増殖後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳを介して測定された（図９）。ＭＥＵ１の破壊により、ＳＰＥ１を介したネイティブのプトレシン産生経路が過剰発現した場合、プトレシン力価が６８％改善した。同様に、ＯＡＺ１の破壊は、ＳＰＥ１の過剰発現と組み合わせると、プトレシン産生を１７４％まで、著しく改善した。ＯＡＺ１の破壊により、非形質転換細胞のプトレシン力価が２１倍に増加し、天然のものもまた異種でもプトレシン経路は過剰発現しなかった。ＳＰＥ１で過剰発現させた場合、ＳＫＹ１およびＡＧＰ２の破壊により、プトレシン力価がそれぞれ２９％および１４％増加した。ＳＫＹ１の破壊により、ＡｓＡＤＣとｓｐｅＢの異種発現と組み合わせると、プトレシン力価が４１％低下した。
１．５）操作された株の生合成経路は、ＭＥＵ１およびＯＡＺ１調節遺伝子ノックアウトと、天然および異種プトレシン生合成遺伝子の過剰発現を組み合わせて、操作された株のプトレシン産生をさらに増加させる。天然アルギニンおよびポリアミン生合成遺伝子ＡＲＧ２、ＣＡＲ１、およびＦＭＳ１の追加コピーは、ｍｅｕ１／ｏａｚ１二重破壊株のゲノムに組み込まれた。この株は、ＳＰＥ１、ＡｓＡＤＣ、およびｓｐｅＢを発現する低コピープラスミドで形質転換された。この形質転換株の細胞外培地のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、プトレシン力価が、選択培地での４８時間の増殖後に８６ｍｇ／Ｌに達したことを示した（図１０）。
実施例２．ＮＭＰｙの産生のための酵母株の操作
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株は、ＴＡ前駆体ＮＭＰｙの産生のために実施例１で開発されたプトレシン過剰産生株を改変することによって開発される。これらの菌株は、プトレシンからＮＭＰｙ生合成に向けて炭素と窒素のフラックスを増加させる目的で遺伝子改変を組み合わせており、ＴＡ前駆体ＮＭＰ、４ＭＡＢ、およびＮＭＰｙの産生のための重要な異種酵素の導入が含まれる。異種宿主における活性を改善するための目的の酵素のＮ末端および／またはＣ末端ドメインの改変、および前駆体分子を意図された経路からそらす酵素をコードする遺伝子の欠失または破壊を含む遺伝子改変が採用される。
２．１）操作された株の生合成経路は、内因性プトレシンからのＮＭＰｙの産性を可能にする。プトレシンは、最初にＳＡＭ依存性Ｎ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）によってＮ－メチルプトレシン（ＮＭＰ）に変換され、その後、銅依存性ジアミンオキシダーゼ（ＭＰＯ）によって４－メチルアミノブタナール（４ＭＡＢ）に酸化される。４ＭＡＢは、多くのアルデヒド化合物と同様に、水溶液中で不安定であり、塩基触媒による求核攻撃によって自発的に環化してＮＭＰｙを形成する（図１１）。
２．１．１）プトレシン過剰産生のためのＳＰＥ１、ＡｓＡＤＣ、およびｓｐｅＢを発現する低コピープラスミドを保有する実施例１．５のプトレシン過剰産生株を、Ａ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａからのＰＭＴ（ＡｂＰＭＴ１）を発現する追加の低コピープラスミドおよびそれに続きＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍからのＭＰＯ酵素（ＮｔＭＰＯ１）を発現する追加の低コピープラスミドで同時形質転換した。プトレシンとＮＭＰｙの間で連続する各酵素を発現する形質転換細胞の細胞外培地における中間体の蓄積を、４８時間の増殖後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を介して比較した。ＮｔＭＰＯ１の直接生成物（４ＭＡＢ）とその自発的環化生成物（ＮＭＰｙ）は、ＡｂＰＭＴ１とＮｔＭＰＯ１（図１１）、およびそれらの前駆体であるＮＭＰとプトレシン（図１２）の発現によって産生された。
２．１．２）ＮＭＰの蓄積は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により、ＭＥＵ１遺伝子（実施例１．４．２に記載）の破壊がある場合とない場合のプトレシン過剰産生酵母株の増殖培地で測定された。この分析は、プトレシン過剰産生株におけるＭＥＵ１の以前の破壊と、それに伴うＳＡＭリサイクルへの影響が、ＡｂＰＭＴ１によるプトレシンＮ－メチル化を阻害しなかったことを示した（図１３）。
２．２）酵素は、元の宿主生物とは異種で発現した場合、異なる細胞内コンパートメントに局在する可能性があり、その結果、機能が低下する。操作された株の生合成経路は、天然および異種酵素のポリペプチド配列への改変を組み込んで、これらの改変酵素の、それらが自然に局在化する細胞内コンパートメント以外の細胞内コンパートメントへの局在化を誘導し得る。例えば、以前の研究では、ＮｔＰＭＴはタバコ細胞のサイトゾルで発現しているが、ＮｔＭＰＯ１はペルオキシソーム内腔に局在していることが示されている（Ｎａｃｏｎｓｉｅ，Ｍ．，Ｋａｔｏ，Ｋ．，Ｓｈｏｊｉ，Ｔ．＆Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎ Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５，４３６－４４４（２０１４）を参照されたい）。
２．２．１）ＮｔＭＰＯ１の細胞内局在化は、シグナルペプチド検出用のＳｈｅｒＬｏｃ２ユーティリティを使用して酵素細胞内局在化のインシリコ予測を実行することによって調べられた（Ｂｒｉｅｓｅｍｅｉｓｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＳｈｅｒＬｏｃ２：Ａ ｈｉｇｈ－ａｃｃｕｒａｃｙ ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．８，５３６３－５３６６（２００９）を参照されたい）．この分析は、ＮｔＭＰＯ１がそのＣ末端（Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ、ＰＴＳ１と表記）に強力な酵母コンセンサスペルオキシソームターゲティング配列（ＰＴＳ）を保有していることを示し、酵母で異種発現した場合にＮｔＭＰＯ１がペルオキシソームに局在する可能性があることを示唆している（図１４）。
２．２．２）低コピープラスミドからＮ末端またはＣ末端にＧＦＰタグ付けされたＡｂＰＭＴ１およびＮｔＭＰＯ１を発現する野生型酵母細胞の蛍光顕微鏡検査では、ＡｂＰＭＴ１は主にサイトゾルに見られるが、ＮｔＭＰＯ１のペルオキシソームへの局在化は露出したＣ末端ＰＴＳに依存する（図１５ａ、１６）。
２．２．３）ＧＦＰ融合でＣ末端ＰＴＳをマスキングすることによって達成されたＮｔＭＰＯ１のサイトゾル発現は、細胞外４ＭＡＢまたはＮＭＰｙレベルに有意な影響を与えなかった（図１５ｂ）。
２．３）操作された菌株の生合成経路には、表１に記載されているもの以外の生合成酵素のオルソログが組み込まれることがある。酵素の異なるオルソログは、異種宿主で発現された場合、活性に有意差を示す可能性がある。したがって、本明細書に例として提供され、表１にリストされている生合成酵素のオルソログは、同じ生化学的変換を実行するために、操作された非植物細胞でも使用され得る。
２．３．１）１０００ Ｐｌａｎｔｓ ＰｒｏｊｅｃｔデータベースでのＡ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａとＤａｔｕｒａ ｍｅｔｅｌのトランスクリプトームのｔＢＬＡＳＴｎ検索（Ｍａｔａｓｃｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｄａｔａ ａｃｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ １，０００ Ｐｌａｎｔｓ（１ＫＰ）ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｇｉｇａｓｃｉｅｎｃｅ ３，１７（２０１４）を参照）は、クエリとしてＮｔＭＰＯ１のアミノ酸配列を使用し、Ｅ値の閾値を１０－１５０として使用して実行された。ＡｂＭＰＯ１およびＤｍＭＰＯ１で示される２つの全長オルソログ配列が同定され、それぞれがＮｔＭＰＯ１と９１％の配列同一性を共有していた（図１７ａ）。
２．３．２）ＡｂＭＰＯ１およびＤｍＭＰＯ１の酵母コドン最適化配列を取得し、低コピー発現プラスミドにクローニングした。それらの活性を評価するために、３つのＭＰＯバリアントのそれぞれを、実施例１．５のプトレシン過剰産生株における低コピープラスミドからのＡｂＰＭＴ１と同時発現させ、４ＭＡＢおよびＮＭＰｙ蓄積を、選択培地での４８時間増殖後に、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって細胞外培地で測定した。ＤｍＭＰＯ１は、元のＮｔＭＰＯ１バリアントと同等のレベルの４ＭＡＢおよびＮＭＰｙの生成を示した（図１７ｂ）。
２．３．３）オルソロガス酵素間の活性の違いは、多くの場合、少なくとも部分的にはそれらの活性部位の構造の違いに起因する可能性がある。ＮｔＭＰＯ１、ＡｂＭＰＯ１、およびＤｍＭＰＯ１のテンプレートベースのホモロジーモデルは、ＲａｐｔｏｒＸ Ｗｅｂサーバーを使用してＰｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ銅含有アミノオキシダーゼ（ＰＤＢ：１ＫＳＩ）の結晶構造に基づいて構築された（Ｋａｌｌｂｅｒｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＲａｐｔｏｒＸ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．７，１５１１－２２（２０１２）を参照されたい）。ホモロジーモデルは、オルソログが長く、構造化されていないＮ末端およびＣ末端のテール領域を持っていることを示した（図１７ｃ）。
２．３．４）２つの活性オルソログである、ＮｔＭＰＯ１およびＤｍＭＰＯ１のトランケーション型を、操作された酵母での活性について試験した。Ｎ末端のトランケーションにより、２つのオルソログの最初の８４残基および８１残基がそれぞれ除去された。Ｃ末端のトランケーションにより、最後の２１残基が除去された。非構造化テールは除去されたが、ＰＴＳは保持されているＣ末端トランケーション型も構築された（ΔＣ－ＰＴＳ１と表示）。実施例１．５のプトレシン過剰産生株において、各ＭＰＯトランケーション型を低コピープラスミドからのＡｂＰＭＴ１と同時発現させ、４８時間の増殖後の培地における４ＭＡＢおよびＮＭＰｙの蓄積をＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって定量化した。ＮｔＭＰＯ１トランケーション間で活性に有意差は観察されなかった（図１８）。Ｃ末端ＰＴＳトリペプチドを保持しながらＤｍＭＰＯ１からＣ末端非構造化領域を除去すると、野生型ＤｍＭＰＯ１酵素と比較して細胞外４ＭＡＢレベルが３１％増加した。
２．４）操作された菌株の生合成経路は、望ましくない副反応の代謝フラックスを低減または排除するために、１つ以上の遺伝子改変を組み込んでいる。異種宿主で発現される生合成酵素は、代謝物フラックスを所望の化合物の生合成から引き離す望ましくない副反応に関与する可能性がある。例えば、酵母アルデヒドデヒドロゲナーゼは、４ＭＡＢなどの異種アルデヒド分子をそれらの同族のカルボン酸に酸化する可能性がある。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に基づいて、ＡｂＰＭＴ１およびＤｍＭＰＯ１ΔＣ－ＰＴＳ１を低コピープラスミドから同時発現させた場合、実施例１．５のプトレシン過剰産生株の増殖培地において４ＭＡＢ酸の蓄積が観察されたが、ＭＰＯ酵素の非存在下では観察されなかった（図１１）。
２．４．１）６つの酵母遺伝子（ＡＬＤ２～ＡＬＤ６およびＨＦＤ１）は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードすることが文献で実証されている（Ｄａｔｔａ，Ｓ．，Ａｎｎａｐｕｒｅ，Ｕ．Ｓ．＆Ｔｉｍｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｖａｒ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３７，ＢＳＲ２０１６０５２９（２０１７）、およびまた、Ｎａｋａｈａｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｓｊｏｇｒｅｎ－Ｌａｒｓｓｏｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｇｅｎｅ Ｅｎｃｏｄｅｓ ａ Ｈｅｘａｄｅｃｅｎａｌ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ １－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ４６，４６１－４７１（２０１２）を参照されたい）。ＡＬＤ２およびＡＬＤ３遺伝子は、パントテン酸の生合成において３－アミノプロパナールのβ－アラニンへの酸化を触媒するほぼ同一のサイトゾルデヒドロゲナーゼのペアをコードする（Ｗｈｉｔｅ，Ｗ．Ｈ．，Ｓｋａｔｒｕｄ，Ｐ．Ｌ．，Ｘｕｅ，Ｚ．＆Ｔｏｙｎ，Ｊ．Ｈ．Ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｍｏｎｇ Ａｌｄｅｈｙｄｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６３，６９－７７（２００３）を参照されたい）。ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、およびＡＬＤ６遺伝子は、それぞれ２つのミトコンドリアアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼと１つのサイトゾルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードし、これらは、グルコースとエタノールでの発酵増殖中にアセトアルデヒドを酢酸に酸化することに加えて（Ｓａｉｎｔ－Ｐｒｉｘ，Ｆ．，Ｂｏｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．＆Ｄｅｑｕｉｎ，Ｓ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＬＤ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｄｕｒｉｎｇ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｏｎ ｇｌｕｃｏｓｅ：Ｔｈｅ ＮＡＤＰ＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｌｄ６ｐ ａｎｄ Ａｌｄ５ｐ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｐｌａｙ ａ ｍａｊｏｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ａｃｅｔａｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５０，２２０９－２２２０（２００４）を参照されたい）、一連の多様な脂肪族および芳香族アルデヒドをカルボン酸に酸化することが示されている（Ｄａｔｔａ，Ｓ．，Ａｎｎａｐｕｒｅ，Ｕ．Ｓ．＆Ｔｉｍｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｖａｒ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３７，ＢＳＲ２０１６０５２９（２０１７）を参照されたい）。これらの４つの標的遺伝子の個々のノックアウト株は、実施例１．５のプトレシン過剰産生株のオープンリーディングフレームの最初の３分の１内に一連のタンデムナンセンス変異を挿入することによって構築された。４ＭＡＢ酸化に対する４つのデヒドロゲナーゼのそれぞれの寄与は、各単一破壊株の低コピープラスミドからＡｂＰＭＴ１とＤｍＭＰＯ１ΔＣ－ＰＴＳ１を同時発現させ、４８時間の増殖後のＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって、培地中の４ＭＡＢ酸蓄積を測定することによって評価した。４ＭＡＢ酸レベルのわずかな減少が、個々のＨＦＤ１およびＡＬＤ４～６の破壊で観察された（図１９）。
２．４．２）ＡＬＤ４－６は、酢酸およびアセチルＣｏＡ産生における役割のために必須遺伝子と見なされているが、以前の研究では、３つの遺伝子が少なくとも部分的に冗長であり、ダブルノックアウトおよびトリプルノックアウトの致命的な表現型を、培地に酢酸を補充することによって救済できることが示されている（Ｓａｉｎｔ－Ｐｒｉｘ，Ｆ．，Ｂｏｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．＆Ｄｅｑｕｉｎ，Ｓ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＬＤ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｄｕｒｉｎｇ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｏｎ ｇｌｕｃｏｓｅ：Ｔｈｅ ＮＡＤＰ＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｌｄ６ｐ ａｎｄ Ａｌｄ５ｐ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｐｌａｙ ａ ｍａｊｏｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ａｃｅｔａｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５０，２２０９－２２２０（２００４）；ａｎｄ ａｌｓｏ Ｌｕｏ，Ｚ．，Ｗａｌｋｅｙ，Ｃ．Ｊ．，Ｍａｄｉｌａｏ，Ｌ．Ｌ．，Ｍｅａｓｄａｙ，Ｖ．＆Ｖａｎ Ｖｕｕｒｅｎ，Ｈ．Ｊ．Ｊ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｖｏｌａｔｉｌｅ ａｃｉｄｉｔｙ ｉｎ ｗｉｎｅ．ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．１３，４８５－４９４（２０１３）を参照されたい）。四重ノックアウト酵母株は、ＨＦＤ１およびＡＬＤ４－６のオープンリーディングフレームを破壊して構築され、低コピープラスミドからＡｂＰＭＴ１およびＤｍＭＰＯ１ΔＣ－ＰＴＳ１の両方を発現した。この菌株は、破壊のない菌株と比較して、４ＭＡＢ酸レベルの４５％の低下（図２０ａ）とそれに伴うＮＭＰｙ産生の４６％の増加を示した（図２０ｂ）。
２．４．３）実施例２．４．２の四重ノックアウト株のゲノムからタンデムＡＬＤ２－ＡＬＤ３遺伝子を欠失させ、低コピープラスミドからＡｂＰＭＴ１とＤｍＭＰＯ１ΔＣ－ＰＴＳ１を同時発現させることによってＡＬＤヌル株を構築した。４８時間の増殖後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により、ＡＬＤ２とＡＬＤ３を欠失させると４ＭＡＢ酸副産物が完全に排除され、６つのＡＬＤ遺伝子すべてを含む無傷菌株と比較して、４ＭＡＢとＮＭＰｙの産生がそれぞれ８３％と７５％増加したことが示された。（図２０ａ、ｂ）。
２．４．４）ＮＭＰｙ産生酵母株は、以前のプラスミド由来のプトレシン過剰産生遺伝子カセット（ＳＰＥ１、ＡｓＡＤＣ、ｓｐｅＢ）を実施例２．４．３のＡＬＤヌル株のゲノムに組み込み、さらにＡｂＰＭＴ１およびＤｍＭＰＯ１ΔＣ－ＰＴＳ１を組み込むことによって構築された。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により、非選択培地で４８時間増殖させた後のこの株でのＮＭＰｙ産生は、低コピープラスミドからの必要なプトレシン産生遺伝子であるＡｂＰＭＴ１およびＤｍＭＰＯ１ΔＣ－ＰＴＳ１を発現し選択培地で培養した実施例２．４．３のＡＬＤヌル株と同等であることが確認された（図２１）。
実施例３．単糖と栄養素からトロピンを生産するために操作された酵母菌株
タイプＩＩＩポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）とシトクロムＰ４５０は、ＴＡ前駆体ＭＰＯＢを介してＮＭＰｙからトロピノンへの変換を可能にする。トロピノンは、トロピノンレダクターゼ１（ＴＲ１）と呼ばれる立体特異的レダクターゼによって還元され、トロピンを産生する（Ｋｉｍ，Ｎ．，Ｅｓｔｒａｄａ，Ｏ．，Ｃｈａｖｅｚ，Ｂ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｃ．＆Ｄ’Ａｕｒｉａ，Ｊ．Ｃ．Ｔｒｏｐａｎｅ ａｎｄ Ｇｒａｎａｔａｎｅ Ａｌｋａｌｏｉｄ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２１，（２０１６）を参照されたい）（図２２）。
３．１）操作された菌株の生合成経路には、ピロリジンケチドシンターゼ、トロピノンシンターゼＣＹＰ８２Ｍ３、１つ以上のシトクロムＰ４５０レダクターゼ、およびＮＭＰｙをトロピンに変換するトロピノンレダクターゼ１が組み込まれている。
３．１．１）Ａ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａピロリジンケチドシンターゼ（ＡｂＰＹＫＳ）、トロピノンシンターゼ（ＡｂＣＹＰ８２Ｍ３）、およびＤａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍトロピノンレダクターゼ１（ＤｓＴＲ１）をコードする酵母コドン最適化ＤＮＡ配列が得られた。Ｐ４５０酵素は継続的な電子交換のためにＮＡＤＰ＋－シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）パートナーを必要とするため、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ、Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｚｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ（カリフォルニアポピー）、およびＰａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ（ケシ）からの３つの植物ＣＰＲ、および天然酵母ＣＰＲ（ＮＣＰ１）を含む、４つの異なるＣＰＲのパネルの酵母コドン最適化配列も酵母での発現のため得られた。酵母株は、ＤｓＴＲ１を実施例２．４．４のＮＭＰｙ産生株のゲノムに組み込み、低コピープラスミドからＡｂＰＹＫＳ、ＡｂＣＹＰ８２Ｍ３、および４つのＣＰＲのそれぞれを発現させることによって構築された。酵素活性を検証し、潜在的なボトルネックを特定するために、ＮＭＰｙ、ＭＰＯＢ、トロピノン、およびトロピンの蓄積を、４８時間の増殖後に形質転換株の培地でＬＣ－ＭＳ／ＭＳによってモニターした（図２３）。アッセイ条件下で、４つのＣＰＲパートナーすべてで同等レベルのデノボトロピン産生（１７５～２１０μｇ／Ｌ）が観察された。
３．２）生合成酵素またはその低い活性が生合成経路の一部を通るフラックスを制限する自発的ステップとして定義される代謝ボトルネックの存在は、所望のＴＡおよび前駆体の次善の産生をもたらす可能性がある。
３．２．１）例えば、実施例３．１．１の操作された菌株の培地におけるＴＡ中間体の蓄積の分析は、ＡｂＣＹＰ８２Ｍ３の産物であるトロピノンの蓄積は最小限であったが、ＡｂＰＹＫＳによって産生されたＭＰＯＢのかなりの部分がＡｂＣＹＰ８２Ｍ３によって消費されないまま残っていることを示した（図２４）。
３．２．２）トロピン生合成遺伝子の酵母ゲノムへの組み込みは、より安定したＡｂＣＹＰ８２Ｍ３発現を可能にすることにより、トロピン産生を改善することができる。ＡｔＡＴＲ１をＡｂＰＹＫＳおよびＡｂＣＹＰ８２Ｍ３と共に、実施例３．１．１のＮＭＰｙ産生株のゲノムに組み込むことにより、トロピン産生プラットフォーム株を構築した。組み込まれた株のトロピンとヒグリンの蓄積を、４８時間後のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を介して同じ遺伝子のプラスミドベースの発現と比較した（図２８）。ＡｂＰＹＫＳ、ＡｂＣＹＰ８２Ｍ３、およびＡｔＡＴＲ１のゲノム発現は、プラスミドベースの発現（１８９μｇ／Ｌ）と比較してトロピン力価をほぼ３倍（５６５μｇ／Ｌ）増加させた。遺伝子操作された菌株はまた、ヒグリン蓄積の２．６倍の増加を示した。
３．３）操作された菌株の生合成経路における副産物の蓄積は、所望のＴＡおよび前駆体の次善の産生をもたらす可能性がある。
３．３．１）例えば、実施例３．１．１の操作された株の培地におけるＴＡ中間体の蓄積の分析は、トロピン（７７５－９００μｇ／Ｌ）よりほぼ４倍大きい力価でＮＭＰｙの誘導体であるヒグリンの実質的な蓄積を示した。関連文献では、ヒグリンはＭＰＯＢの自発的脱炭酸を介して蓄積することが観察されている（Ｂｅｄｅｗｉｔｚ，Ｍ．Ａ．，Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ｄ．，Ｄ’Ａｕｒｉａ，．Ｃ．＆Ｂａｒｒｙ，Ｃ．Ｓ．Ｔｒｏｐｉｎｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｖｉａ ａｎ ａｔｙｐｉｃａｌ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｎｄ Ｐ４５０－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９，５２８１（２０１８）を参照されたい）（図２２）。別の例として、実施例３．１．１の操作された株の増殖培地のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、ヒグリンが、ＮＭＰｙとの脱炭酸縮合のために、ＡｂＰＹＫＳおよびＡｂＣＹＰ８２Ｍ３を欠く陰性対照株にも蓄積することを示した（図２２）。
３．３．２）増殖温度の調節を使用して、操作された菌株の生合成経路における副産物の蓄積を減らし、所望のＴＡおよび前駆体へのフラックスを増加させることができる。一例では、自発的ヒグリン産生に対する温度の影響は、酵素的および自発的反応の速度がより低い温度で減少するという速度論的原理を利用することによって評価された。Ａ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａおよび他のＴＡ産生Ｓｏｌａｎａｃｅａｅは、より涼しい気候での最適な増殖に適応しているため、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ遺伝子を発現する酵母株の２５℃での増殖は、酵素の折り畳みおよび／または活性を改善し、３０℃での増殖での酵素的に産生されたトロピンと同等の産生を可能にすると同時に自発的ヒグリン産生の速度を低下させる。実施例３．２．２のトロピン産生株の培養物を３０℃および２５℃で非選択規定培地中で増殖させ、トロピンとヒグリンの蓄積を、４８時間後の増殖培地のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって比較した。トロピン力価は、温度の低下による影響を最小限に抑えた。ヒグリン蓄積は、３０℃と比較して２５℃で４２％減少し、産生されたトロピン対ヒグリンの比が６０％増加した（図２５）。
３．３．３）望ましくない副反応の低減または排除を使用して、操作された菌株の生合成経路における望ましいＴＡおよびＴＡ前駆体への代謝産物フラックスを改善することができる。一例では、ＴＡ前駆体トロピンへのフラックスは、酢酸との自発的な脱炭酸縮合から生じるヒグリン産生を減少させることによって改善され得る。実施例２．４．４のＮＭＰｙ産生株の培地から供給された酢酸を除去することの、ヒグリンおよびトロピン産生に対する影響を評価した。実施例２．４．４の操作された株における酢酸要求性を無くさせる効果は、低コピープラスミドに載せられたＡＬＤ４およびＡＬＤ６の機能的コピーを発現させ、４８時間の増殖後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を介してヒグリンおよび４ＭＡＢ酸の蓄積を監視することによって評価された。ＡＬＤ４またはＡＬＤ６の再構成により、酢酸を供給しない場合の選択培地での増殖が可能となったが（図２６ａ）、ＡＬＤ４の添加により４ＭＡＢ酸の蓄積が５倍に増加し、一方ＡＬＤ６では有意な増加は見られなかった（図２６ｂ）。さらに、ＡＬＤ４またはＡＬＤ６のいずれかで酢酸の供給を排除すると、ヒグリンの蓄積がそれぞれ３８％および５９％減少した（図２６ｂ）。
３．３．４）ＡＬＤ６遺伝子の機能的コピーは、以前に破壊されたａｌｄ６遺伝子座で実施例３．２．２のトロピン産生株に再組み込み（ｒｅ－ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）された。ＮＭＰｙとトロピン間のすべての代謝物の蓄積に対するこの組み込みの影響は、非選択培地で４８時間増殖させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって測定された。Ａｌｄ６ｐを介した酢酸代謝の回復により、トロピン力価が２．７倍に増加し、ヒグリン蓄積が１．６倍に増加した（図２８）。さらに、ＡＬＤ６の組み込みにより、ＮＭＰｙとトロピノンの産生が大幅に増加し、ＭＰＯＢの消費量も増加した（図２７）。
３．３．５）プトレシンとトロピンの間の各生合成酵素遺伝子の追加コピー（すなわち、ＡｂＰＭＴ１、ＤｍＭＰＯ１ΔＣ－ＰＴＳ１、ＡｂＰＹＫＳ、およびＡｂＣＹＰ８２Ｍ３）を、実施例３．３．４の操作された株おいて低コピープラスミドから発現させ、ＴＡ中間体の産生を、選択培地で４８時間増殖させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによってＢＦＰを発現する同じ株のそれと比較した。ＡｂＰＹＫＳの追加コピーの発現は、ＮＭＰ蓄積の４．３倍の増加と、トロピン産生の１．３倍の増加をもたらした（図２９）。ＡｂＰＭＴ１の追加コピーの発現により、ＮＭＰとトロピノンの間のすべてのＴＡ前駆体の産生が大幅に改善され、トロピン産生が２．４倍に増加した（図２９）。したがって、ＰＭＴ（ＡｂＰＭＴ１およびＤｓＰＭＴ１）およびＰＹＫＳ（ＡｂＰＹＫＳ）の追加のコピーが、ＰＡＤ１遺伝子座で実施例３．３．４（ＣＳＹ１２４９）のトロピン産生株のゲノムに組み込まれた。得られた操作された株（ＣＳＹ１２５１）を非選択培地で２５℃で４８時間増殖させた結果、力価３．４ｍｇ／Ｌでトロピン産生が得られ、実施例３．３．４のトロピン産生株（ＣＳＹ１２４９）の２．２倍であった（図３０）。
実施例４：Ｌ－アルギニンからプソイドトロピンアルカロイドを生産するために操作された酵母
酵母菌株は、Ｌ－アルギニンなどの初期アミノ酸前駆体から非薬用ＴＡを生産するように操作することができる。一例として、実施例３に記載のプラットフォーム酵母株は、Ｌ－アルギニンからプソイドトロピンアルカロイドを産生するようにさらに操作することができる（図１）。
Ｌ－アルギニンからトロピノンを産生するプラットフォーム酵母株（実施例３の説明を参照）は、立体特異的レダクターゼ、例えばトロピノンレダクターゼ２（ＴＲ２；ＥＣ １．１．１．２３６）を組み込んで、生合成されたトロピノンをプソイドトロピンに変換するようにさらに操作することができる。ＴＤＨ３などの強力な構成的プロモーターとＴＲ２バリアント、例えばＤａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ由来のＴＲ２（ＤｓＴＲ２）のコード配列を保有する発現カセットは、トロピノン産生プラットフォーム酵母株のゲノムに組み込むことができる。得られた株は、ＰＧＫ１などの強力な構成的プロモーターとプソイドトロピン足場に作用するシトクロムＰ４５０などのヒドロキシル化酵素を保有する１つ以上の発現カセットを組み込むことにより、プソイドトロピンのヒドロキシル化誘導体、例えばカリステギンを産生するようにさらに操作することができる。それぞれがプソイドトロピン骨格の異なる位置に作用する複数のＰ４５０酵素を組み込むことにより、さまざまなカリステギンおよびその誘導体を生合成することができる。次に、操作された菌株を非選択的合成完全培地で３０℃または２５℃で４８～９６時間培養し、その後、培養培地中のプソイドトロピンアルカロイドの蓄積をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析できる。
実施例５：フェニルピルビン酸および関連するＴＡ前駆体の過剰産生のために操作された酵母
酵母菌株は、中心的な代謝から所望のＴＡおよびＴＡ前駆体への炭素および窒素フラックスを増加させる目的で、薬用ＴＡの産生に必要なアシル供与体分子の前駆体であるフェニルピルビン酸の過剰産生のために操作することができる（図２）。酵母株は、天然の生合成酵素の転写調節の調整、前駆体分子を意図された経路からそらす酵素をコードする遺伝子の欠失または破壊、および内因性分子をＴＡ前駆体分子に変換するための異種酵素の導入を含むがこれらに限定されない遺伝子改変を組み込むことによって、フェニルピルビン酸の過剰産生のために操作することができる。
一例では、酵母株は、アミノ酸または他の中心的な代謝産物からフェニルピルビン酸を産生する生合成酵素をコードする天然遺伝子の追加のコピーを組み込むことによって、フェニルピルビン酸産生を増加させるように操作することができる。これらの追加のコピーは、ＧＰＤ、ＴＥＦ１、ＰＧＫ１などの強力な構成的プロモーターによって制御できる。天然の遺伝子標的の例には、芳香族酸アミノトランスフェラーゼＡＲＯ８およびＡＲＯ９、ならびにデヒドラターゼＰＨＡ２が含まれるが、これらに限定されない。一例では、強力な構成的プロモーターの制御下で、ＡＲＯ８の１つ以上の追加のコピーを操作された株に組み込むことができる。一例では、強力な構成的プロモーターの制御下で、ＡＲＯ９の１つ以上の追加のコピーを操作された株に組み込むことができる。別の例では、強力な構成的プロモーターの制御下で、ＰＨＡ２の１つ以上の追加のコピーを操作された株に組み込むことができる。本発明の一実施形態では、ＡＲＯ８、ＡＲＯ９、およびＰＨＡ２を含む群から選択される１つ以上の遺伝子うちの１つ以上の追加のコピーを、独特の強力な構成的プロモーターの制御下で操作株に組み込むことができる。
実施例６：ＴＡ足場の生合成のための、Ｌ－フェニルアラニンまたはＬ－チロシンからのアシル供与体の産生のために操作された酵母
酵母株は、ＰＬＡ、桂皮酸、クマル酸、フェルラ酸、安息香酸、およびこれらの化合物の補酵素Ａチオエステルおよびグリコシド誘導体を含む、Ｌ－フェニルアラニンおよびＬ－チロシンからの多様なフェニルプロパノイドアシル供与体化合物の産生のために操作することができ、これらはトロピン、プソイドトロピン、またはそれらの誘導体とエステル化して、薬用ＴＡ、非薬用ＴＡ、および非天然ＴＡを生合成することができる（図１－３）。
６．１）野生型酵母は微量のＰＬＡしか産生しないため、下流のＴＡを十分に蓄積するには、このＴＡ前駆体の産生を増やす必要がある。ＰＬＡ産生を改善するために、異種フェニルピルビン酸レダクターゼ（ＰＰＲ）を、操作された宿主細胞で発現させることができる。３－フェニルピルビン酸に対する活性が報告されているＥ．ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ、およびＷｉｃｋｅｒｈａｍｉａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のＰＰＲオルソログ、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（表１）は、ＣＳＹ１２５１の低コピープラスミドから各酵素を発現させ、選択培地で７２時間増殖させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるＰＬＡ産生を測定することにより、酵母での活性についてスクリーニングした。すべてのＬＤＨ候補とＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびＡ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａからのＰＰＲは、対照と比較してＰＬＡ産生に中程度（１．３～３．５倍）の改善をもたらしたが、Ｗ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのＰＰＲの発現はＰＬＡ産生が約８０倍に増加して約２５０ｍｇ／Ｌとなった（図３１）。そのため、ＣＳＹ１２５１に組み込んでＣＳＹ１２８７株を作成するためにＷｆＰＰＲが選択された。
６．２）別の例として、酵母株は、それぞれ、Ｌ－フェニルアラニンおよびＬ－チロシンからの、トロピンまたはプソイドトロピンとエステル化して非天然ＴＡを形成するためのアシル供与体化合物として使用できるフェニルプロパノイドである、桂皮酸およびクマル酸の産生のために操作することができる。酵母は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ；ＥＣ ４．３．１．２４）などのアンモニアリアーゼを組み込むことにより、Ｌ－フェニルアラニンから桂皮酸を産生するように操作することができる。同様に、酵母は、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ；ＥＣ ４．３．１．２３）などのアンモニアリアーゼを組み込むことにより、Ｌ－チロシンからクマル酸を産生するように設計することができる。酵母株は、ＴＲＰ１選択マーカー、ＴＥＦ１プロモーター、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＰＡＬバリアント（ＡｔＰＡＬ１）のコード配列を含む低コピーＣＥＮ／ＡＲＳプラスミドで形質転換することにより、Ｌ－フェニルアラニンから桂皮酸を生成するように操作された。低コピープラスミドを保有する得られた株は、３０℃で、適切なアミノ酸ドロップアウト溶液（－Ｕｒａ）含む合成完全培地で増殖させた。４８時間の増殖後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって培地の桂皮酸含有量を分析した（図３２）。
６．３）Ａ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａでは、ＰＬＡは、ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ８４Ａ２７（ＡｂＵＧＴ）によるグルコシル化を介してトロピンへのアシル転移のために活性化される（Ｑｉｕ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｌｉｔｔｏｒｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌ．，ｎｐｈ．１６３１７（２０１９）を参照されたい）。植物のＵＧＴは多様なフェニルプロパノイドの生合成に関与し、多くの場合、広い基質範囲を示すので（Ｒｏｓｓ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｌｉｍ，Ｅ．－Ｋ．，Ｄ．Ｊ．Ｂｏｗｌｅｓ，Ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２，３００４．１－３００４．６（２００１）を参照されたい）、所望のアシル供与体に対して十分に高い活性を有するＵＧＴを選択する必要がある。
６．３．１）例として、標準基質ＰＬＡを含むさまざまなフェニルプロパノイドアシル供与体に対するＡｂＵＧＴの活性について、ＣＳＹ１２５１の低コピープラスミドからＡｂＵＧＴを発現させ、３つのフェニルプロパノイドアシル供与体（ＰＬＡ、桂皮酸、フェルラ酸）それぞれのグルコシドへの変換を測定することによって評価した。ＡｂＵＧＴは桂皮酸およびフェルラ酸をそれぞれ約６０％および９０％グルコシル化したが、ＰＬＡのグルコシル化は、＜３％の変換であり、試験した基質の中で最低であった（図３３）。
６．３．２）他のＴＡ産生ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）からのＡｂＵＧＴのオルソログを、ＰＬＡおよび他のフェニルプロパノイドに対する活性について評価することができる。この例では、ｔＢＬＡＳＴｎ検索を使用して、１０００ＰｌａｎｔｓデータベースのＢｒｕｇｍａｎｓｉａ ｓａｎｇｕｉｎｅａ（ＢｓＵＧＴ）およびＤ．ｍｅｔｅｌ（ＤｍＵＧＴ）のトランスクリプトームからのＵＧＴ８４Ａ２７をコードする転写産物。これらのオルソロガスＵＧＴをコードする酵母コドン最適化配列は、ＣＳＹ１２５１の低コピープラスミドからのＡｂＵＧＴ、ＢｓＵＧＴ、ＤｍＵＧＴ、またはＢＦＰ陰性対照を発現させることにより、活性についてスクリーニングされた。グルコース受容体として５００μＭのＰＬＡ、桂皮酸（ＣＡ）、またはフェルラ酸（ＦＡ）を添加した選択培地で７２時間増殖させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを介して形質転換株の培養物中のグルコシド産生を測定した。３つのＵＧＴオルソログはすべて、ＣＡ（３４～６５％変換）およびＦＡ（８５～９０％変換）の実質的なグルコシル化を示し、ＰＬＡに対しては微量活性（＜３％変換）のみを示し、ＡｂＵＧＴはＰＬＡの最大変換（２．７％）を示した（図３３、３４）。
６．３．３）構造的に類似した基質である桂皮酸、フェルラ酸、およびＰＬＡに対するＡｂＵＧＴの活性の不均衡な変動を考えると、ＰＬＡに対する活性を改善するために、構造に基づく合理的な変異誘発アプローチを実行してＡｂＵＧＴの活性部位を操作することができる。この例では、ＵＤＰ－グルコースに結合したＡｂＵＧＴのホモロジーモデルが、ＲａｐｔｏｒＸ Ｗｅｂサーバーを使用してＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａサリチル酸ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼＵＧＴ７４Ｆ２（ＰＤＢ：５Ｖ２Ｋ）の結晶構造に基づいて最初に構築された（図３５）。次に、Ｍａｅｓｔｒｏ／ＧｌｉｄｅＸＰソフトウェアスイートを使用して、活性部位でのＤ－ＰＬＡのドッキングをシミュレートした。エネルギー最小化結合モードに基づいて、Ｄ－ＰＬＡのアリール環はＦ１３０とのパイスタッキング相互作用によって安定化される可能性が高く、そのα－ヒドロキシル基およびカルボキシレート基はそれぞれＱ１５１およびＨ２４との水素結合によって安定化されるため、求核性カルボキシレート酸素は、ＵＤＰ－グルコースの求電子性Ｃ１炭素の４Å以内にある（図３５）。Ｄ－ＰＬＡはさらに残基Ｌ２０５およびＩ２９２に隣接しており、どちらも、どちらの基質とも相互作用していないようである。これは、（ｉ）Ｆ１３０のチロシンへの変異が、Ｄ－ＰＬＡのアリール環とのパイスタッキングを維持する一方で、桂皮酸およびフェルラ酸には存在しないＤ－ＰＬＡのα－ヒドロキシル酸素を安定化する追加の水素結合を提供する可能性があることを示唆し、（ｉｉ）Ｌ２０５のフェニルアラニンへの変異が、Ｆ１３０ＹによるＤ－ＰＬＡのパイスタッキング安定化を増加させる可能性があることを示唆し、（ｉｉｉ）Ｉ２９２のグルタミンへの変異が、Ｄ－ＰＬＡおよびＵＤＰ－グルコースとの２つの追加の安定化水素結合を生成することを示唆している（図３５）。ＡｂＵＧＴのＦ１３０Ｙ、Ｌ２０５Ｆ、およびＩ２９２Ｑ点変異体は、ＣＳＹ１２５１の低コピープラスミドから各変異体、野生型ＡｂＵＧＴ、またはＢＦＰ対照を発現させることにより活性をスクリーニングし、５００μｍのＰＬＡ、ＣＡ、またはＦＡを補充した選択培地での７２時間増殖させた後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳによってグルコシド産生を測定した。Ｆ１３０ＹおよびＩ２９２Ｑ変異はＣＡでのＵＧＴ活性を有意に減少させたが、３つの変異体はすべて野生型ＡｂＵＧＴと比較してＰＬＡで比較的低い（そして統計的に区別できない）活性を示した（＜３％変換）（図３６）。
６．３．４）セクション６．１および６．３に記載されている結果に基づいて、酵母コドン最適化ＷｆＰＰＲおよびＡｂＵＧＴをＣＳＹ１２５１のゲノムに組み込むことにより、ＣＳＹ１２８８株を構築し、ＰＬＡ産生（６６ｍｇ／Ｌ）および最小ＰＬＡグルコシド蓄積の確認によって検証した（図３７）。
６．４）ＰＬＡに対するＡｂＵＧＴの活性が低いと、下流のＴＡへのＴＡ前駆体のフラックスが制限される可能性があるため、ＵＤＰ－グルコースの蓄積を促進し、グリコシドの分解を減少させる遺伝子改変を組み込むことにより、フェニルアラニンのＰＬＡグルコシドへのフラックスを増やすことができる。
６．４．１）ＵＤＰ－グルコースは、貯蔵多糖類、細胞壁グルカン、および糖タンパク質の形成に重要であり、したがってその生合成は厳密に調節されている（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｍ．，Ｔａｎａｂｅ，Ｍ．，Ｙａｂｕｋｉ，Ｎ．，Ｋｉｔａｄａ，Ｋ．，Ｔｏｈ－ｅ，Ａ．Ｐｈｏ８５ ｋｉｎａｓｅ，ａ ｙｅａｓｔ ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ，ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＵＧＰ１ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ．Ｙｅａｓｔ．１８，２３９－２４９（２００１）を参照されたい）。グルコースでの増殖中、酵母は、解糖とデンプン生合成という２つの主要な代謝経路に沿ってグルコース－６－リン酸を誘導する。クエン酸は解糖系の律速酵素ホスホフルクトキナーゼのアロステリック阻害剤であるため（Ｌｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ａ ｆｒｏｍ Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ Ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７８，１５８６－１５９８（２０１６）を参照されたい）、クエン酸の補給による解糖の部分的抑制は、ＵＤＰ－グルコースの利用可能性とグルコシド産生を増加させる可能性がある（図３８）。内因性ＰＬＡグルコシド産生のためのゲノムＷｆＰＰＲおよびＡｂＵＧＴをコードする株ＣＳＹ１２８８を、２％クエン酸および５００μＭのＣＡまたはＦＡを添加した培地で培養し、７２時間の増殖後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳによってグルコシド産生を比較した。クエン酸の補充により、ＰＬＡ、ＣＡ、およびＦＡのグルコシル化がそれぞれ８３％、５６％、および７８％減少した（図３９）。
６．４．２）それぞれその遺伝子産物がグルコース－６－リン酸のグルコース－１－リン酸への異性化およびグルコース－１－リン酸のＵＤＰ－グルコースへの変換を触媒するＰＧＭ２およびＵＧＰ１の過剰発現は、それらを使用してＵＤＰ－グルコース供給を増加させることができる。
６．４．２．１）ＰＧＭ２およびＵＧＰ１の余分なコピーは、ＣＳＹ１２８８の低コピープラスミドから発現され、ＰＬＡグルコシド産生は選択培地で７２時間増殖させた後に測定された。ＰＧＭ２の過剰発現は対照と比較して改善をもたらさなかったが、ＵＧＰ１の過剰発現はＰＬＡグルコシド産生について約１．８倍の増加をもたらし（図４０）、ＵＤＰ－グルコースプールの増加がＡｂＵＧＴによるＰＬＡ利用を改善することを支持している。
６．４．２．２）他の異種グルコシドが酵母でこのように加水分解されることが示されているため、天然グルコシドはＰＬＡおよび他のＴＡ前駆体グルコシドに作用して蓄積を減らす可能性がある（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｓ．，Ｒａｉｎｉｅｒｉ，Ｓ．，Ｗｉｔｔｅ，Ｓ．，Ｍａｔｅｒｎ，Ｕ．，Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｓ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｔｈａｔ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｓ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７，１７５１－１７５７（２０１１）を参照されたい、また Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．１５，１－１２（２０１６）も参照されたい）。この例では、３つの天然グルコシダーゼ遺伝子（ＥＸＧ１、ＳＰＲ１、およびＥＧＨ１）がＣＳＹ１２８８で破壊され、非選択培地での破壊変異体の７２時間の増殖後にＰＬＡグルコシド産生が測定された。ＥＧＨ１の破壊はＰＬＡグルコシド産生を２倍以上にし（図４１）、Ｅｇｈ１ｐによる加水分解がＴＡ前駆体フラックスの実質的な損失を構成することを示している。
実施例７：リットリンをヒヨスチアミンアルデヒドに変換するために操作された酵母
リットリンをヒヨスチアミンアルデヒドに変換するために酵母菌株を操作することができる（図２）。例えば、実施例６に記載のトロピンおよびＰＬＡグルコシド産生酵母株は、リットリンのヒヨスチアミンアルデヒドへの転位を触媒するシトクロムＰ４５０ ＣＹＰ８０Ｆ１（ＥＣ１．１４．１９．－）、およびＰ４５０酵素の活性をサポートするシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ、ＥＣ １．６．２．４）を発現するようにさらに操作することができる。酵母株は、ＬＥＵ２選択マーカー、ＴＤＨ３プロモーター、およびＡ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ由来のＣＹＰ８０Ｆ１バリアント（ＡｂＣＹＰ８０Ｆ１）のコード配列を含む低コピーＣＥＮ／ＡＲＳプラスミドで形質転換することによって、ならびにＴＲＰ１選択マーカー、ＴＥＦ１プロモーター、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＮＣＰ１）由来もしくはＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（ＡｔＡＴＲ１）由来のシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）のコード配列を含む低コピーＣＥＮ／ＡＲＳプラスミドで形質転換することによって、供給されたリットリンをヒヨスチアミンアルデヒドに変換するように操作された。低コピープラスミドを保有する得られた株は、適切なアミノ酸ドロップアウト溶液（－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ）を伴いかつ１ｍＭのリットリンが補充された合成完全培地中で、３０℃で増殖させた。４８時間の増殖後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により培地をヒヨスチアミンアルデヒド含有量について分析した（図４２）。
実施例８：ヒヨスチアミンをスコポラミンに変換するために設計された酵母
ヒヨスチアミンをスコポラミンに変換するために酵母菌株を操作することができる（図２）。例えば、実施例７に記載の酵母株は、さらに操作して、ヒヨスチアミンの６β位においてヒドロキシラーゼ活性を有しアニソダミンを形成する酵素、およびアニソダミンの６β－ヒドロキシル位においてジオキシゲナーゼ活性を有しスコポラミンを形成する酵素、またはこれらの活性の両方を持っている酵素を組み込むことができる（ＥＣ １．１４．１１．１１）。酵母菌株は、ＬＥＵ２選択マーカー、ＴＤＨ３プロモーター、およびＤ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ由来（ＤｓＨ６Ｈ）の、Ａｎｉｓｏｄｕｓ ａｃｕｔａｎｇｕｌｕｓ由来（ＡａＨ６Ｈ）の、Ｂｒｕｇｍａｎｓｉａ ａｒｂｏｒｅａ由来（ＢａＨ６Ｈ）の、またはＤａｔｕｒａ ｍｅｔｅｌ由来（ＤｍＨ６Ｈ）のヒヨスチアミン６β－ヒドロキシラーゼ／ジオキシゲナーゼ（Ｈ６Ｈ）のコード配列を含む低コピーＣＥＮ／ＡＲＳプラスミドで形質転換することにより、供給されたヒヨスチアミンをスコポラミンに変換するように操作された。低コピープラスミドを保有する得られた株は、適切なアミノ酸ドロップアウト溶液（－Ｌｅｕ）を伴いかつ１ｍＭのヒヨスチアミンが補充された合成完全培地中で、３０℃で増殖させた。７２時間の増殖後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により培地をスコポラミン含有量について分析した（図４３）。試験されたすべてのバリアントはインビボでＨ６Ｈ活性を示したが、Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ由来のＨ６Ｈバリアントを発現する菌株は、供給されたヒヨスチアミンからスコポラミンへの最大の変換を示した。補因子要件のさらなる最適化は、この操作された酵母株の培養培地に異なる補因子を補充し、７２時間の増殖後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって培地を分析することによって実行された。この分析により、第一鉄の補充がヒヨスチアミンからスコポラミンへの変換を増加させることが確認された（図４４）。
実施例９．操作された非植物細胞におけるヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ酵素候補の同定およびヒヨスチアミンアルデヒドのヒヨスチアミンへの還元
本明細書に開示される方法のＴＡアルコール－アルデヒド相互変換を実施するのに好適なデヒドロゲナーゼ酵素を同定するために、そして特にヒヨスチアミンアルデヒドをヒヨスチアミンに還元するために、ヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）オープンリーディングフレームを公的に入手可能な植物ＲＮＡ配列決定データから同定した。
９．１）Ａ．ｂｅｌｌａｄｏｎｎａトランスクリプトームから同定された４３，８６１の固有の転写産物のそれぞれについて、組織特異的な存在量（１００万のマップされた読み取りあたりの、コンティグの1キロベースあたりの断片、ＦＰＫＭ）および推定タンパク質の構造的および機能的注釈をミシガン州立大学薬用植物ゲノミクスリソースから取得した。ヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ候補をコードする転写産物は、以下の計算フィルタリングアルゴリズムを使用して、ＴＡ生合成経路のデヒドロゲナーゼステップの前後にそれぞれあるベイト（ｂａｉｔ）遺伝子ＣＹＰ８０Ｆ１（リットリンムターゼ）およびＨ６Ｈ（ヒヨスチアミン６β－ヒドロキシラーゼ／ジオキシゲナーゼ）の組織特異的発現プロファイルのクラスタリングに基づいて同定された。
まず、４３，８６１の転写産物の完全なリストを、次のタンパク質ファミリー（ＰＦＡＭ）ＩＤのいずれか：ＰＦ００１０６、ＰＦ１３５６１、ＰＦ０８６５９、ＰＦ０８２４０、ＰＦ００１０７、ＰＦ００２４８、ＰＦ００４６５、ＰＦ１３６８５、ＰＦ１３８２３、ＰＦ１３６０２、ＰＦ１６８８４、ＰＦ００２４８、または次の機能アノテーションキーワードのいずれか：アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドレダクターゼ、短鎖、アルド／ケト、で注釈が付けられたものについてフィルタリングした。さらに、キーワードの、プトレシン、トロピノン、およびトロピンを含む機能アノテーションが付いた転写産物のいずれかは、ベイト遺伝子とのクラスタリングを検証するための陽性対照ＴＡ関連遺伝子としてフィルターに含まれていた。次に、ＣＹＰ８０Ｆ１およびＨ６Ｈベイト遺伝子の平均組織特異的発現プロファイルが生成された。２つのベイト遺伝子のそれぞれについて、線形回帰モデルを構築して、ベイト遺伝子発現プロファイル（ＦＰＫＭ）を各候補遺伝子プロファイルの線形関数として表現し、各候補の相関ｐ値を計算した。２つのベイト遺伝子のそれぞれを使用して同定された候補をプールし、重複を除去した。各候補の結合されたｐ値は、２つのベイト遺伝子のそれぞれとの相関のｌｏｇ１０ｐ値の合計として計算された。ＴＡ生合成経路の既知のデヒドロゲナーゼ（すなわち、トロピノンレダクターゼＩおよびＩＩ）に一致する転写産物を除去し、残りの候補を、組み合わせたｐ値および組織特異的発現プロファイルの階層的クラスタリングによるベイト遺伝子からの距離によってランク付けした（図４５）。
９．２）実施例９．１で同定されたほぼすべての候補は、既知のＴＡ生合成遺伝子で観察されたのと同じ二次根特異的発現パターンを示した。結果として得られた約３０の候補をＵｎｉＰＲＯＴ／ＳｗｉｓｓＰＲＯＴデータベースに対してＢＬＡＳＴｐ検索すると、多くの転写産物に末端または内部配列領域が欠落していることが明らかになった。これに対処するために、Ｔｒｉｎｉｔｙソフトウェアパッケージを使用して、寄託された生のＲＮＡｓｅｑ読み取りからデノボトランスクリプトームアセンブリを繰り返し（Ｈａａｓ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅ ｎｏｖｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｔｒｉｎｉｔｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８，１４９４－５１２（２０１３）を参照されたい）、１２のＨＤＨ候補の、欠落しているすべての配列フラグメントを、新しく組み立てられたトランスクリプトームに対して不完全な配列領域のＢＬＡＳＴアラインメントを実行することによって、再構成した（表２）。
９．３）酵母において実施例９．１および９．２で生成された候補をスクリーニングすることにより、欠落しているＨＤＨ活性を特定した。
９．３．１）ヒヨスチアミンアルデヒドの本格的な商業標準の欠如と化学合成からの不十分な収率は、供給されたリットリンを介したインビボでの活性スクリーニングのために、上流の生合成酵素であるシトクロムＰ４５０リットリンムターゼ（ＣＹＰ８０Ｆ１）とのＨＤＨ候補の同時発現を必要とした（実施例７を参照）。リットリンは、ＨＤＨ製品であるヒヨスチアミンと同様のクロマトグラフィーおよび質量分析特性を示すため、酵母コドン最適化ＡｂＣＹＰ８０Ｆ１およびＤｓＨ６Ｈ（実施例８を参照）をＣＳＹ１２５１のゲノムに組み込むことにより、ＨＤＨスクリーニング株（ＣＳＹ１２９２）を構築し、３段階の生合成経路（図２）を介して供給されたリットリン（ｍ／ｚ＋２９０）から産生されたスコポラミン（ｍ／ｚ＋３０４）の検出を介してＨＤＨ候補のスクリーニングを可能にした。
９．３．２）１２個のＨＤＨ候補のそれぞれをコードする酵母コドン最適化配列を、ＣＳＹ１２９２株の低コピープラスミドから発現させ、１ｍＭのリットリンを補充した培地で７２時間増殖させた後にスコポラミン産生を測定した。１２個の候補の１つであるＨＤＨ２（ＡｂＨＤＨと呼ばれる）は、ヒヨスチアミンアルデヒドレベルの３５％の減少と、スコポラミンの測定可能な蓄積（７．２μｇ／Ｌ）を示し、欠落しているＨＤＨ活性をコードしていることを示している（図４６）。
９．４）構造および系統発生分析は、ＨＤＨの触媒機構および進化の歴史へのさらなる洞察を提供した。
９．４．１）ＡｂＨＤＨのホモロジーモデルは、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓシナピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＰｔＳＡＤ；ＰＤＢ：１ＹＱＤ）の結晶構造に基づいて構築された（図４７）。ＡｂＨＤＨは、中鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＭＤＲ）スーパーファミリー内の亜鉛依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（ＺＡＤＨ）ファミリーのメンバーである。このファミリーの典型であるＡｂＨＤＨは、よく保存されたヌクレオチド結合ドメインと、より可変的な基質結合ドメインとを持つ、二小葉構造を示す。ＡｂＨＤＨヌクレオチド結合ドメイン内の残基Ｓ２１６、Ｔ２１７、Ｓ２１８、およびＫ２２１とＰｔＳＡＤのリン酸安定化残基Ｓ２１４、Ｔ２１５、Ｓ２１６、およびＫ２１９とのアラインメントは、ＡｂＨＤＨがＮＡＤＰＨ依存性オキシドレダクターゼであることを示唆している。また、ＺＡＤＨの典型であるＡｂＨＤＨは、タンパク質の表面近くのシステイン残基の４分子（Ｃ１０５、Ｃ１０８、Ｃ１１１、およびＣ１１９）と、活性部位内での触媒的Ｚｎ２＋とを用いて、構造的Ｚｎ２＋に結合するようである。
９．４．２）ＡｂＨＤＨの触媒機構は、Ｍａｅｓｔｒｏ／Ｇｌｉｄｅソフトウェアパッケージを使用して、基質であるヒヨスチアミンアルデヒドを活性部位に分子ドッキングすることで解明された（図４７）。最も好ましい結合モードは、基質のアルデヒド基を、触媒的Ｚｎ２＋およびＮＡＤＰＨ水素化物供与体の両方の約５Å以内に配置する。ドッキングの結果とＺＡＤＨの一般的な機構（Ｂｏｍａｔｉ，Ｅ．Ｋ．，Ｎｏｅｌ，Ｊ．Ｐ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ ｓｉｎａｐｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．１７，１５９８－１６１１（２００５）を参照されたい）は、ＡｂＨＤＨの次の触媒機構を示唆している。基質がない場合、活性部位内の触媒的Ｚｎ２＋は、Ｃ５２、Ｈ７４、Ｃ１６８、およびＳ５４との極性相互作用を介して配置され、ヒヨスチアミンアルデヒドの結合時に置換される水分子によって安定化される。水素化ジヒドロニコチンアミドによるアルデヒドカルボニルの求核攻撃は、触媒作用のＺｎ２＋との相互作用によって安定化されたオキシアニオン中間体を形成し、ＮＡＤＰ＋のリボース基とＳ５４の間のプロトンシャトルを介してプロトン化される可能性がある。
９．５）オルソロガスオキシドレダクターゼが他のＴＡ産生Ｓｏｌａｎａｃｅａｅのヒヨスチアミン生合成を触媒するかどうかを確認するために、ｔＢＬＡＳＴｘ検索を使用してＤａｔｕｒａ ｉｎｎｏｘｉａとＤａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍのトランスクリプトームからＡｂＨＤＨコード配列のバリアントを同定した（図４８）。２つの同定されたオルソログ（ＤｉＨＤＨ、ＤｓＨＤＨ）のＨＤＨ活性は、ＣＳＹ１２９２の低コピープラスミドからのフラックス制限ＤｓＨ６Ｈの追加コピーを伴って酵母コドン最適化配列と同時発現させ、１ｍＭのリットリンを補充した培地でスコポラミン産生を測定することによって検証された。ＤｓＨＤＨは、試験したバリアントの中で最も高い基質枯渇と産物の蓄積を示した（図４９）。
９．６）最適な酵素バリアントとフラックス制限酵素の過剰発現を含む薬用ＴＡ生合成ブランチが、プラットフォーム酵母株に組み込まれた。菌株ＣＳＹ１２９４は、酵母のコドン最適化ＷｆＰＰＲとＡｂＵＧＴ、ＤｓＨＤＨ、およびＤｓＨ６Ｈの第２のコピーをＣＳＹ１２９２に組み込むことによって構築された。供給されたリットリンからのスコポラミン産生は、ＣＳＹ１２９４で確認された（図５０）。
実施例１０：ＴＡ足場の生成のためのアシル供与体および受容体のエステル化のために操作された酵母
酵母菌株は、活性化されたアシル供与体化合物とアシル受容体化合物のエステル化を触媒して多様なＴＡ足場を生成する酵素を発現するように操作することができる（図２、３）。アシル供与体基の活性化は、実施例６に記載されるように、アシル供与体産生酵母株を操作して、補酵素Ａ（ＣｏＡ）またはグルコース（グルコシド）などの高い官能基移動ポテンシャルを有する化学部分をアシル供与体のカルボキシル基に付加する酵素を組み込むことによって達成することができる。この能力で利用できるアシル供与体活性化酵素の例には、ＣｏＡリガーゼおよびＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼが含まれる。活性化アシル供与体化合物およびトロピンおよびプソイドトロピンなどのアシル受容体のエステル化を触媒するために使用できるエステル化酵素の例は、セリンカルボキシペプチダーゼ様アシルトランスフェラーゼ（ＳＣＰＬ－ＡＴ）およびＢＡＨＤ型アシルトランスフェラーゼを含むアシルトランスフェラーゼである。そのようなアシルトランスフェラーゼのコード配列は、酵母などの異種宿主で発現された場合にそれらの活性を改善するように改変され得る。
１０．１）ＳＣＰＬ－ＡＴが通常自然に発生することが見出される植物では、ＳＣＰＬ－ＡＴのコード配列には、新生ポリペプチドを小胞体（ＥＲ）に向けるＮ末端シグナルペプチドが含まれる。ＥＲに局在化すると、ＳＣＰＬ－ＡＴポリペプチドは、分泌輸送経路によってゴルジを介して液胞内腔に輸送され、そこで活性を示すことがわかる。このＥＲから液胞への輸送プロセス中に、それらはシグナルペプチド切断、Ｎ－グリコシル化、内部プロペプチド配列の除去、およびジスルフィド結合形成を含むがこれらに限定されない、いくつかの翻訳後改変（図５１）を受ける（Ｓｔｅｈｌｅ，Ｆ．，Ｓｔｕｂｂｓ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｔｒａｃｋ，Ｄ．，＆Ｍｉｌｋｏｗｓｋｉ，Ｃ．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ－ｌｉｋｅ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，２７５，（２００８）を参照されたい）。ただし、細胞内輸送経路と翻訳後改変のパターンは生物間で異なるため、異種宿主でのＳＣＰＬ－ＡＴの発現は、細胞内局在の誤りおよび／または活性に関して翻訳後改変の誤りをもたらす可能性がある。一例として、リットリンシンターゼ（ＬＳ）（表１）などのＳＣＰＬ－ＡＴのコード配列を改変して、酵母で発現させた場合の活性を改善することができる。
１０．１．１）シグナルペプチド配列は、酵母におけるＳＣＰＬ－ＡＴのプロセシングと局在化に影響を与える可能性がある。
１０．１．１．１）ＡｂＬＳに推定上のＮ末端シグナルペプチドが存在することは、それが植物の予想されるＳＣＰＬ ＥＲから液胞への輸送経路に従っていることを示唆している。酵母におけるＡｂＬＳの局在は、ＣＳＹ１２９４の低コピープラスミドから、ＡｂＬＳのＮ末端およびＣ末端ＧＦＰ融合体を発現させることによって調べられた。蛍光顕微鏡は、Ｎ末端融合体（ＧＦＰ－ＡｂＬＳ）が液胞膜染色剤ＦＭ４－６４と共局在していることを明らかにした（図５２）。Ｃ末端融合体（ＡｂＬＳ－ＧＦＰ）の蛍光は検出されなかったが、これは、天然Ｃ末端がＳＣＰＬアシルトランスフェラーゼの安定性に重要であるという報告と一致する（Ｓｔｅｈｌｅ，Ｆ．，Ｓｔｕｂｂｓ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｔｒａｃｋ，Ｄ．，＆Ｍｉｌｋｏｗｓｋｉ，Ｃ．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ－ｌｉｋｅ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，２７５，（２００８）を参照されたい）。
１０．１．１．２）酵母は、サイトゾルとの二次代謝産物の交換に必要な、植物に存在する液胞トランスポーターを欠いている可能性が高いため、酵母におけるＳＣＰＬ－ＡＴの液胞隔離はサイトゾル基質プールへのアクセスを妨げる可能性がある。他の酵母コンパートメントへのＡｂＬＳの強制局在化（おそらくサイトゾル代謝物へのアクセスの改善を伴う）が活性を可能にするかどうかを判断するために、野生型Ｎ末端ＳＰ配列を、液胞内腔（Ｐｒｃ１ｐおよびＰｅｐ４ｐ）、内腔に面する液胞膜（Ｄａｐ２ｐ）、トランスゴルジネットワーク（Ｏｃｈ１ｐ）、内腔に面するＥＲ膜（Ｍｎｓ１ｐ）、およびミトコンドリアマトリックス（Ｃｉｔ１ｐ）を標的とする、酵母タンパク質から採取したＮ末端シグナル配列のパネルに置き換えた（図５３）。野生型ＳＰも完全に除去され、別のバリアントでは、標準的なペルオキシソームターゲティング配列（ＰＴＳ１）がＣ末端に付加された。これらのキメラＡｂＬＳバリアントは、ＣＳＹ１２９４の高コピープラスミドから発現され、形質転換体は、選択培地で９６時間増殖させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって活性についてスクリーニングされた。リットリンまたは下流の中間体の産生は、どのバリアントでも観察されなかった（図５３）。
１０．１．２）酵母におけるＳＣＰＬ－ＡＴの誤った翻訳後プロセシングは、活性酵素の発現を妨げる可能性がある。
１０．１．２．１）タンパク質のＮ－グリコシル化パターンは酵母と植物で異なり、以前の報告では、多様な植物酵素の正しいＮ－グリコシル化が、それらの折り畳み、安定性、および／または活性にとって重要であることが示唆されている（Ｋａｒ，Ｂ．，Ｖｅｒｍａ，Ｐ．，ｄｅｎ Ｈａａｎ，Ｒ．，Ｓｈａｒｍａ，Ａ．Ｋ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｕｔｒａｎｊｉｖａ ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１１２，４９０－４９８（２０１８）を参照されたい、またＰｏｄｚｉｍｅｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ｎｕｃｌｅａｓｅ ＴＢＮ１ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．２７６，１５２－１６１（２０１８）も参照されたい、さらにＳｔｒａｓｓｅｒ，Ｒ．，Ｐｌａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２６，９２６－９３９（２０１６）も参照されたい）。ＡｂＬＳポリペプチドのインシリコ分析では、４つのＮ－グリコシル化部位（Ｎ１５２、Ｎ３２０、Ｎ３７６、Ｎ４１６）が予測され、このタンパク質のＯ－グリコシル化はＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａでは検出されなかった（図５４）。Ｃ末端にＨＡタグが付いた野生型ＡｂＬＳ、４つのＮ→Ｑ変異体（この場合、ＮからＱへの変異がＮ－グリコシル化を無効にする（２３））のそれぞれ、または４重のＮ→Ｑ変異体をＣＳＹ１２９４およびＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａで発現させ、グリコシル化プロファイルをウエスタンブロットによって比較した。野生型ＡｂＬＳ、Ｎ→Ｑ単一変異体、および４重変異体はすべて、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａでは単一バンドとして現れ、単一のグリコシル化状態を示しているが、酵母では４重Ｎ→Ｑ変異体のみが単一バンドを生成し、他のすべてのバリアントでは、二重または三重のバンドとして現れ、複数のグリコシル化状態の組み合わせを示していた（図５５）。ただし、酵母の２つの野生型ＡｂＬＳバンドの密度が高いほど、タバコの野生型ＡｂＬＳのバンドと部分的に重複しているため、酵母で発現したＡｂＬＳの少なくとも一部は正しいグリコシル化状態にあるにちがいなく、誤ったグリコシル化が、酵母におけるＡｂＬＳ活性の完全な欠如を説明する可能性は低い。（図５４～５５）。
１０．１．２．２）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のシナポイルグルコース：コリンシナポイルトランスフェラーゼ（ＡｔＳＣＴ）およびＡｖｅｎａ ｓｔｒｉｇｏｓａ由来のアベナシンシンターゼ（ＡｓＳＣＰＬ１）を含むＳＣＰＬアシルトランスフェラーゼのサブセットは、タンパク質分解的に除去されてジスルフィド結合によって結合された活性ヘテロダイマーを生成する内部プロペプチドリンカーを含むことが示されている（Ｓｈｉｒｌｅｙ，Ａ．Ｍ．，Ｃｈａｐｐｌｅ，Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎａｐｏｙｌｇｌｕｃｏｓｅ：ｃｈｏｌｉｎｅ ｓｉｎａｐｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ａ ｓｅｒｉｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａｎ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，１９８７０－１９８７７（２００３）を参照されたい、またＭｕｇｆｏｒｄ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａ ｓｅｒｉｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ－ｌｉｋｅ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｏａｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．２１，２４７３－２４８４（２００９）を参照されたい）。ＡｂＬＳアミノ酸配列を、以前に特徴付けられた植物セリンカルボキシペプチダーゼおよびＳＣＰＬアシルトランスフェラーゼのものと比較すると、ＡｔＳＣＴ、ＡｓＳＣＰＬ１、および小麦カルボキシペプチダーゼ２（ＴａＣＢＰ２）の非常に可変的なプロペプチドと整列する内部２５～３０残基配列の存在が明らかになり、ＡｂＬＳも、エンドプロテオリシス（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）切断を受けてヘテロダイマーを形成することを示唆している（図５６）。さらに、ＡｂＬＳのホモロジーモデルは、予測された内部プロペプチドが活性部位をブロックし、したがって活性のためにはこれを除去する必要があることを示唆した（図５７）。しかし、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａで発現した野生型ＡｂＬＳは、ジスルフィド還元条件下でウエスタンブロットによって予想される約２０～２５ｋＤａのＣ末端フラグメントが検出されなかったため、タンパク質分解的切断を受けていないようである（図５４、５５）。推定上のプロペプチドは植物で切断または除去されていないように見えるため、ＡｂＬＳは、植物では天然のコンフォメーションが採用され、プロペプチドを活性部位から遠ざける可能性があるが、酵母の分泌経路および／または液胞の生化学的環境の違いによってこの移動が妨げられ、活性をブロックする。
この障害モードに対処するために、推定プロペプチドリンカーに隣接するＮ末端ドメインとＣ末端ドメインが別々のシグナルペプチドの有無にかかわらず独立して発現される、スプリットＡｂＬＳ対照が構築された。さらに、ＡｂＬＳバリアントであって、その推定プロペプチドが、フレキシブルな（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２６）リンカー（ＡｔＳＣＴからの内部プロペプチドは酵母で切断されることが以前に示されていた）、（Ｓｈｉｒｌｅｙ，Ａ．Ｍ．，Ｃｈａｐｐｌｅ，Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎａｐｏｙｌｇｌｕｃｏｓｅ：ｃｈｏｌｉｎｅ ｓｉｎａｐｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ａ ｓｅｒｉｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａｎ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，１９８７０－１９８７７（２００３）を参照されたい）で、またはトランスゴルジプロテアーゼＫｅｘ２ｐによって切断されたポリアルギニン部位を含む合成リンカー（Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｚａｒｏ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｈｅｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６５，１３５７－１３６９ （２０１３）を参照されたい、またＲｅｄｄｉｎｇ，Ｋ．，Ｓｅｅｇｅｒ，Ｍ．，Ｐａｙｎｅ，Ｇ．Ｓ．，Ｆｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｓ．，Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｌａｔｈｒｉｎ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｎ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｅｘ２ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｒｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＴＧＮ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｔａｉｌ ｏｆ Ｋｅｘ２ｐ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．７，１６６７－１６７７（１９９６）も参照されたい）で置き換えられた、ＡｂＬＳバリアントが構築された（図５８）。スプリットＡｂＬＳ対照およびプロペプチド／リンカーバリアントのそれぞれは、ＣＳＹ１２９４の低コピープラスミドから発現され、形質転換体は、選択培地で９６時間増殖させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによってＬＳ活性についてスクリーニングされた。これらのバリアントのいずれにおいても、リットリンまたは下流のＴＡの産生は観察されなかった。
タンパク質発現のトラブルシューティングを行うために、上記のＣ末端ＨＡタグ付きＡｂＬＳバリアントのそれぞれを、ＣＳＹ１２９４の低コピープラスミドから発現させ、見かけのタンパク質サイズをウエスタンブロットによってスプリットＡｂＬＳ対照と比較した（図５８）。ＡｔＳＣＴもポリアルギニンリンカーも、タンパク質分解的切断から予想される２０～２５ｋＤａのＣ末端フラグメントを生成しなかった。後者の場合、ポリアルギニンＡｂＬＳバリアントが切断されないことは、タンパク質がトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ；酵母では後期ゴルジ（ｌａｔｅ Ｇｏｌｇｉ）とも呼ばれる）の上流の分泌経路で止まることを示唆し、これは野生型またはゴルジ標的（Ｏｃｈ１ｐ ＳＰ融合）ＡｂＬＳを発現するＣＳＹ１２９４で観察された、重度の増殖障害を説明し得る。
１０．１．３）酵母におけるＳＣＰＬ－ＡＴの機能的発現は、ＴＧＮからの選別を変更するＮ末端融合体を操作することによって達成できる。ＴＧＮから液胞への可溶性酵母タンパク質の輸送には、液胞タンパク質選別（Ｖｐｓ）カーゴ輸送タンパク質による典型的なＮ末端シグナル配列の認識を必要とするが、酵母ＴＧＮに到達する内在性膜タンパク質はデフォルトで液胞に選別されるようである（Ｓｔａｃｋ，Ｊ．Ｈ．，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｖａｃｕｏｌｅ ｉｎ Ｙｅａｓｔ：Ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ，Ｌｉｐｉｄ Ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ＧＴＰ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１，１－３３（１９９５）を参照されたい、またＲｏｂｅｒｔｓ，Ｃ．Ｊ．，Ｎｏｔｈｗｅｈｒ，Ｓ．Ｆ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｔ．Ｈ．，Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｒｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｖａｃｕｏｌｅ ｍａｙ ｂｅ ｔｈｅ ｄｅｆａｕｌｔ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１９，６９－８３（１９９２）も参照されたい）。したがって、ＳＰを、Ｎ末端に融合した可溶性ドメインでマスキングすることによる、ＳＣＰＬ－ＡＴの膜貫通タンパク質への変換は、ＴＧＮソーティングの障害を解決することができる。
１０．１．３．１）一例では、ＡｂＬＳバリアントは、Ａｅｑｕｏｒｉａ（ＧＦＰ、ＢＦＰ、ｍＶｅｎｕｓ）およびＤｉｓｃｏｓｏｍａ（ｍＣｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ）ファミリーの蛍光タンパク質、変異したプロテアーゼ切断部位（ＳＵＭＯ＊）を持つ小分子ユビキチン関連改変因子（Ｓｍｔ３ｐ）、およびＴＡ経路の上流酵素であるＡｂＵＧＴを含むＮ末端融合可溶性ドメインのパネルで構築された。これらのバリアントと野生型ＡｂＬＳは、ＣＳＹ１２９４の低コピープラスミドから発現され、選択培地で９６時間増殖させた後のリットリンシンターゼ活性についてスクリーニングされた。すべてのＮ末端融合ＡｂＬＳバリアントは、ヒヨスチアミンとスコポラミンの測定可能な蓄積を示した。Ａｅｑｕｏｒｉａ ＧＦＰ由来の蛍光タンパク質をＡｂＬＳに融合すると、ヒヨスチアミンおよびスコポラミンがそれぞれ約１μｇ／Ｌおよび約０．１μｇ／Ｌ産生され、一方、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ由来の蛍光タンパク質の融合は、かなり高いＴＡ産生をもたらし、ＤｓＲｅｄ融合（１０．３μｇ／Ｌヒヨスチアミン、０．８７μｇ／Ｌスコポラミン）を介して最大の力価が達成された（図５９）。ＡｂＬＳ活性の増強は、Ｎ末端ドメインのオリゴマー化状態と相関しているようであり、スコポラミン産生は、単量体（ＧＦＰ、ＢＦＰ、ｍＶｅｎｕｓ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＳＵＭＯ＊）、ホモ二量体（ＡｂＵＧＴ）、ホモ四量体（ＤｓＲｅｄ）の順に増加していた。
１０．２）完全なＴＡ生合成が可能な菌株を生成するために、酵母コドン最適化ＤｓＲｅｄ－ＡｂＬＳと、ＵＧＰ１の第２のコピーとを、破壊されたＥＧＨ１部位でＣＳＹ１２９４のゲノムに組み込み、ＣＳＹ１２９６を生成した。ＣＳＹ１２９６は、それぞれ１０．２μｇ／Ｌおよび１．０μｇ／Ｌの力価で、ヒヨスチアミンおよびスコポラミンのデノボ産生を示した。
実施例１１．異種トランスポーターを使用した細胞内基質輸送制限の軽減
ＴＡ生合成を実行する酵素は複数の細胞内コンパートメント（サイトゾル、ＥＲ膜、ペルオキシソーム、液胞、ミトコンドリア）に分布しており、酵母は、異なるコンパートメント間でＴＡ生合成中間体の動員を可能にする、植物で見られるトランスポーターを持っている可能性が低いため、細胞内代謝物輸送はＴＡ産生を制限する可能性がある。
１１．１）コンパートメント間輸送の制限は、非植物宿主細胞における植物トランスポーターの機能的発現によって対処され得る。ＤｓＲｅｄ－ＡｂＬＳの液胞コンパートメント化（図６０）では、サイトゾルトロピンとＰＬＡグルコシドを液胞内腔に移入させ、液胞リットリンをサイトゾルに排出させる必要がある。Ｓｏｌａｎａｃｅａｅでは、液胞アルカロイドおよびグリコシドの隔離に関与するいくつかの多剤および毒素排出（ＭＡＴＥ）トランスポーターが同定されており、ＴＡに対する活性が観察または予測された３つが含まれる（Ｍｏｒｉｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｕｏｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ａｎｄ ｔｏｘｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ（ＭＡＴＥ）ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｉｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６，２４４７－２４５２（２００９）を参照されたい、またＳｈｏｊｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ａｎｄ ｔｏｘｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ－ｔｙｐｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｖａｃｕｏｌａｒ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｒｏｏｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４９，７０８－７１８（２００９）を参照されたい）。一例では、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍジャスモン酸誘導性アルカロイドトランスポーター１（ＮｔＪＡＴ１）および２つのＭＡＴＥ（ＮｔＭＡＴＥ１、ＮｔＭＡＴＥ２）がＣＳＹ１２９６の低コピープラスミドから発現され、選択培地での９６時間の増殖後にＴＡの蓄積が測定された。ＮｔＪＡＴ１とＮｔＭＡＴＥ２の発現はＴＡ産生を改善し、前者はヒヨスチアミンおよびスコポラミンの力価をそれぞれ７４％および１８％増加させた（図６１）。
１１．２）これらのトランスポーターの細胞内局在化を評価し、可能性のある作用機序を決定するために、低コピープラスミドからＮｔＪＡＴ１またはＮｔＭＡＴＥ２のＣ末端ＧＦＰ融合体を発現するＣＳＹ１２９６の蛍光顕微鏡検査を実行した。分析は、ＮｔＪＡＴ１がほぼ液胞膜に局在する（ＤｓＲｅｄ－ＡｂＬＳと共局在する）のに対し、ＮｔＭＡＴＥ２は液胞膜と原形質膜の間で分かれることを裏付けており（図６０）、両方のトランスポーターが液胞基質輸送制限を解消するように機能する可能性があり、後者は細胞のＴＡ排出も改善する可能性があることを示唆している。
実施例１２：Ｌ－フェニルアラニンまたはＬ－チロシンおよびＬ－アルギニンから非天然ＴＡを生産するために操作された酵母
酵母は、生物に自然に発生する薬用および非薬用ＴＡの生産用に操作されているだけでなく、非天然ＴＡの生産用に操作することもできる（図３）。例えば、酵母は、植物によるＴＡに自然には組み込まれないアシル供与体化合物を産生するための生合成経路を発現するように操作することができる。
１２．１）一例では、実施例３に記載のプラットフォームトロピン産生酵母株をさらに操作して、アシル供与体化合物桂皮酸（実施例６に記載）を産生し、桂皮酸活性化酵素およびエステル化酵素を発現させてシンナモイルトロピンなどの非天然ＴＡを産生することができる。
１２．１．１）桂皮酸は、フェニルアラニンから、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、例えばＡ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＰＡＬ１（ＡｔＰＡＬ１）を介して産生することができる。ＥｃＣＳには補酵素Ａ（ＣｏＡ）で活性化されたアシル供与体が必要なため、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来の４ＣＬ５（Ａｔ４ＣＬ５）などの桂皮酸に対して確立された活性を持つ４－クマル酸ＣｏＡリガーゼ（Ｅｕｄｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＢＡＨＤ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｔｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍａｔｅ ａｎｄ ｂｅｎｚｏａｔｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，１５，（２０１６）を参照されたい）は、酵母でのシンナモイルＣｏＡ生合成を可能にするために発現させることができる。実施例３に記載のプラットフォームトロピン産生酵母株を、実施例６に記載のように桂皮酸の産生を可能にする低コピープラスミドで形質転換した。
１２．１．２）実施例１２．１．１の操作された株は、ＵＲＡ３選択マーカー、ＨＸＴ７およびＰＭＡ１プロモーター、およびＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ４ＣＬ５）由来の４－クマル酸－ＣｏＡリガーゼバリアント、およびＥｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ ｃｏｃａ由来のコカインシンターゼ（ＥｃＣＳ）のコード配列を有する高コピー２μプラスミドで形質転換することにより、シンナモイルトロピンを産生するようにさらに改変された。低および高コピープラスミドを保有する得られた株を、２５℃で適切なアミノ酸ドロップアウト溶液（－Ｕｒａ－Ｔｒｐ）を含む合成完全培地で増殖させた。７２時間の増殖後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により培地のシンナモイルトロピンを分析した（図６２）。タンデムＭＳ／ＭＳとフラグメンテーション分析を使用して、シンナモイルトロピンの同一性を検出および検証した。シンナモイルトロピンの親質量（ｍ／ｚ＋＝２７２）に対応するＭＳ／ＭＳスペクトルを比較すると、保持時間３．６８４分の新しいピークが明らかになり、その質量が純正シンナモイルトロピン標準の遷移と一致するように見える断片が生成された（図６２ａ）。最も大きい質量遷移、ｍ／ｚ＋２７２→１２４は、ヒヨスチアミンの断片化中に生成される主要なｍ／ｚ＋＝１２４トロピン断片と一致する（Ｂｅｄｅｗｉｔｚ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ａ Ｒｏｏｔ－Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｌ－Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ：４－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｔｒｏｐａｎｅ Ａｌｋａｌｏｉｄ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ａｔｒｏｐａ ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２６，（２０１４）を参照されたい）。
１２．１．３）実施例１２．１．２に記載されているシンナモイルトロピンの２７２→１２４ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ遷移に基づいて、デノボでシンナモイルトロピン産生を測定するために多重反応モニタリング（ＭＲＭ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法が開発された。シンナモイルトロピンは、実施例１２．１．２の操作された株の細胞外培地にかなりのレベルまで蓄積したが、ＡｔＰＡＬ１、Ａｔ４ＣＬ５、およびＥｃＣＳの非存在下では蓄積しなかった（図６２ｂ）。デノボで生成されたシンナモイルトロピンの力価は、検量線に基づいて６．０μｇ／Ｌと推定された。
実施例１３：ＴＡおよびＴＡ前駆体の産生を改善するための増殖培地の改変
ＴＡ前駆体およびＴＡの産生力価は、培養培地組成を変更することによって改善することができる。例えば、培地の種類は、培地ベース（例えば、酵母ペプトン、酵母窒素ベース基礎培地）、炭素源（例えば、グルコース、マルトデキストリン）、および窒素源（例えば、アミノ酸、硫酸アンモニウム、尿素）において異なり得る。培地の種類は、炭素源の濃度と窒素源の濃度、または個々のアミノ酸の濃度など、各成分の相対的な比率も異なり得る。
１３．１）トロピン産生酵母株（実施例３に記載）は、最初に規定培地（すなわち、硫酸アンモニウムとすべてのアミノ酸を含むＹＮＢ）で増殖させ、２５℃で４８時間増殖させた後にトロピン産生をアッセイした。トロピンの最高の産生は、２％のガラクトースで観察された（図６３ａ）。ただし、一部の操作された菌株は、おそらくこれらの炭素源を中心的な代謝に同化できないために、グリセロール、アラビノース、ソルビトールなどの特定の炭素源で成長に失敗するか、増殖が大幅に低下した。
１３．２）トロピン産生酵母株（実施例３に記載）の増殖のために、２％デキストロースを含み、追加の２％の炭素源を補充した規定培地中で培養し、２５℃で４８時間増殖させた後にトロピン生産をアッセイした。トロピンの最高の産生は、２％デキストロースと２％グリセロールで観察された（図６３ｂ）。グリセロールは非糖炭素源であり、細胞脂質膜の安定化、異種タンパク質の折り畳みと安定性の改善、シトクロムＰ４５０の活性に必要なＮＡＤＰＨ補因子の再生およびいくつかの短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ酵素など、いくつかの機構を通じてＴＡ前駆体とＴＡのより高い産生に寄与する可能性がある（Ｌｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎｏｓｃａｐｉｎｅ ａｎｄ ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２０１８，１１５（１７）Ｅ３９２２－Ｅ３９３１を参照されたい）。
１３．３）操作された酵母における薬用ＴＡのデノボ生合成の改善は、フラックスのボトルネックと輸送の制限を軽減することで達成できる。
１３．３．１）ＴＡ生産の改善は、ボトルネック酵素の過剰発現と培地の最適化によって達成された。ＣＳＹ１２９６でのトロピンの産生（およそｍｇ／Ｌ）が、スコポラミン（およそμｇ／Ｌ）へのフラックスを制限する可能性は低いため、スコポラミン産生を制限する代謝ボトルネックは、ＣＳＹ１２９６の低コピープラスミドからフェニルピルビン酸とスコポラミンの間の各異種酵素（図２）の追加コピーを発現し、ＴＡおよび中間体の産生を測定することによって特定された。ＷｆＰＰＲとＤｓＨ６Ｈの追加コピーにより、ヒヨスチアミンおよびスコポラミンの力価がそれぞれ６４％および８９％増加し、これらの酵素が経路フラックスの主要なリミッターであったことを示す（図６４）。
１３．３．２）改良されたスコポラミン産生株は、ＮｔＪＡＴ１と、ＷｆＰＰＲおよびＤｓＨ６Ｈの第２のコピーとをＣＳＹ１２９６に組み込むことによって構築された。得られた菌株ＣＳＹ１２９７は、ＣＳＹ１２９６と比較してヒヨスチアミンおよびスコポラミンの蓄積がそれぞれ２．４倍および７．１倍増加したことを示した（図６５）。
（表１）操作された代謝経路の構成要素としての目的の遺伝子
Figure 2022523825000003
Figure 2022523825000004
Figure 2022523825000005
Figure 2022523825000006
（表２）ヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ（HDH）候補と実験的に検証された酵素の全長アミノ酸配列の例
Figure 2022523825000007
Figure 2022523825000008
Figure 2022523825000009
（表３）非植物細胞で機能的なアシルトランスフェラーゼ発現を可能にするためにセリンカルボキシペプチターゼ様アシルトランスフェラーゼのN末端に融合することができる可溶性タンパク質ドメインの全長アミノ酸配列の例
Figure 2022523825000010
（表４）ＴＡ、ＴＡ誘導体、および／またはＴＡ前駆体を細胞脂質膜を横切って移動させるために操作された非植物細胞で発現できる異種トランスポーターの全長アミノ酸配列の例
Figure 2022523825000011
（表５）ナス科植物の葉の濃縮物と精澄化酵母培地に存在する可能性のある不純物の比較
Figure 2022523825000012
添付の条項にかかわらず、開示は以下の条項によって定義され得る。
項１． トロパンアルカロイド産物、トロパンアルカロイド産物の前駆体、またはトロパンアルカロイド産物の誘導体を産生する、操作された非植物細胞。
項２． 細胞が、微生物細胞である、項１に記載の細胞。
項３． 操作された細胞が、複数の酵素をコードするための複数の異種コード配列を含み、酵素のうちの少なくとも１つが、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチンウレオヒドロラーゼ、アグマチナーゼ、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼ、ピロリジンケチドシンターゼ、トロピノンシンターゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、トロピノンレダクターゼ、フェニルピルビン酸レダクターゼ、３－フェニル乳酸ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ８４Ａ２７、リットリンシンターゼ、リットリンムターゼ、ヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ、ヒヨスチアミン６β－ヒドロキシラーゼ／ジオキシゲナーゼ、およびコカインシンターゼからなる群から選択される、項１または２に記載の細胞。
項４． 内因性アルギニン代謝が、細胞内で改変されている、項１～３のいずれかに記載の細胞。
項５． 内因性フェニルアラニンおよびフェニルプロパノイド代謝が、改変されている、項１～４のいずれかに記載の細胞。
項６． 内因性ポリアミン調節機構が、細胞内で破壊されている、請求項１～５のいずれかに記載の細胞。
項７． 内因性酢酸代謝が、細胞内で改変されている、項１～６のいずれかに記載の細胞。
項８ ．内因性グリコシド代謝が、細胞内で改変されている、項１～７のいずれかに記載の細胞。
項９． 細胞が、ヒヨスチアミン、アトロピン、アニソダミン、スコポラミン、カリステギン、コカイン、または非天然トロパンアルカロイドからなる群から選択される、トロパンアルカロイド産物、トロパンアルカロイド産物の前駆体、またはトロパンアルカロイド産物の誘導体を産生する、項１～８のいずれかに記載の細胞。
項１０． 操作された細胞が、セリンカルボキシペプチダーゼ様アシルトランスフェラーゼドメインのＮ末端に融合された１つ以上の可溶性タンパク質ドメインを含む複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を含む、項１～９のいずれかに記載の細胞。
項１１． 細胞内膜を横切るまたは原形質膜を横切るＴＡ、ＴＡ前駆体、および／またはＴＡ誘導体の輸送が、細胞内で改変されている、項１～１０のいずれかに記載の細胞。
項１２． 操作された細胞が、複数のトランスポーターをコードするための複数の異種コード配列を含み、トランスポーターのうちの少なくとも１つが、多剤および毒素排出トランスポーター、硝酸／ペプチドファミリートランスポーター、ＡＴＰ結合カセットトランスポーター、および多面発現性薬剤耐性トランスポーターからなる群から選択される、項１～１１のいずれかに記載の細胞。
項１３． トロパンアルカロイド、トロパンアルカロイド産物の前駆体、またはトロパンアルカロイド産物の誘導体を産生するための方法であって、
（ａ）タンパク質産生に好適な条件下で第１項から第１２項のいずれかに記載の細胞を培養することと、
（ｂ）細胞培養物に出発化合物を添加することと、
（ｃ）トロパンアルカロイドまたはトロパンアルカロイド産物の前駆体を培養物から回収することと、を含む、方法。
上記の発明は、理解を明確にするために、例示および実施例によってある程度詳細に記載されているが、本発明の教示に照らして当業者には、特定の変更および修正が、添付の特許請求の主旨または範囲から逸脱することなく、本発明に対し実施され得ることは容易に明らかである。
したがって、上記の説明は単に本発明の原理を例示するに過ぎない。当業者であれば、本明細書に明示的に記載または図示していないが、本発明の原理を具現化し、その主旨および範囲内に含まれる様々な構成を考案できることが理解されよう。さらに、本明細書に列挙されたすべての例および条件的文言は、主として本発明の原理および発明者らにより当該技術分野の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、このような具体的に列挙された例および条件への限定ではないと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な例を列挙する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図する。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすあらゆる開発要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示および記載の例示的な実施形態に限定されることを意図していない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。

Claims (35)

  1. トロパンアルカロイド産物の前駆体、トロパンアルカロイド産物、またはトロパンアルカロイド産物の誘導体を産生する操作された非植物細胞であって、
    前記操作された非植物細胞は、前記トロパンアルカロイド産物の前駆体、前記トロパンアルカロイド産物、または前記トロパンアルカロイド産物の誘導体を産生するための経路内に複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を含み、
    前記細胞は、内因性アルギニン代謝、内因性フェニルアラニンおよびフェニルプロパノイド代謝、内因性ポリアミン調節機構および代謝、内因性酢酸代謝、ならびに内因性グリコシド代謝の群から選択される１つ以上の内因性代謝経路または調節機構に対する１つ以上の変化を含む、操作された非植物細胞。
  2. 前記細胞が、内因性アルギニン代謝、内因性フェニルアラニンおよびフェニルプロパノイド代謝、内因性ポリアミン調節機構および代謝、ならびに内因性酢酸代謝の群から選択される１つ以上の内因性代謝経路または調節機構に対する１つ以上の変化を含む、請求項１に記載の細胞。
  3. 前記細胞が、内因性グリコシド代謝に対する１つ以上の変化を含む、請求項１に記載の細胞。
  4. 前記細胞が、微生物細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞。
  5. 前記細胞が、真菌細胞である、請求項４に記載の細胞。
  6. 前記操作された細胞が、１つ以上の酵素の１つ以上の異種コード配列を含み、
    前記酵素のうちの少なくとも１つが、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチンウレオヒドロラーゼ、アグマチナーゼ、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼ、ピロリジンケチドシンターゼ、トロピノンシンターゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、トロピノンレダクターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、チロシンアンモニアリアーゼ、フェニルピルビン酸レダクターゼ、４－クマル酸－ＣｏＡリガーゼ、３－フェニル乳酸ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ８４Ａ２７、リットリンシンターゼ、リットリンムターゼ、ヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ、ヒヨスチアミン６β－ヒドロキシラーゼ／ジオキシゲナーゼ、およびコカインシンターゼからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞。
  7. 内因性アルギニン代謝が、１つ以上の内因性酵素の１つ以上のコード配列への改変によって前記細胞内で変化し、
    前記酵素のうちの少なくとも１つが、グルタミン酸Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ－アセチル－γ－グルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、およびアルギナーゼからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞。
  8. 内因性フェニルアラニンおよびフェニルプロパノイド代謝が、１つ以上の内因性酵素の１つ以上のコード配列への改変によって前記細胞内で変化し、
    前記酵素のうちの少なくとも１つが、五官能性ＡＲＯＭポリペプチド、コリスミ酸シンターゼ、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、芳香族アミノトランスフェラーゼ、およびフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞。
  9. 内因性ポリアミン調節機構が、１つ以上の内因性タンパク質の１つ以上のコード配列への改変によって前記細胞内で変化し、
    前記タンパク質のうちの少なくとも１つが、メチルチオアデノシンホスホリラーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼアンチザイム、ポリアミンオキシダーゼ、スペルミジンシンターゼ、スペルミンシンターゼ、ポリアミントランスポーター、およびポリアミンパーミアーゼからなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞。
  10. 内因性酢酸代謝が、１つ以上の内因性酵素の１つ以上のコード配列への改変によって前記細胞内で変化し、
    前記酵素のうちの少なくとも１つが、アルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞。
  11. 内因性グリコシド代謝が、１つ以上の内因性酵素の１つ以上のコード配列への改変によって前記細胞内で変化し、
    前記酵素のうちの少なくとも１つが、グルカン１，３－β－グルコシダーゼおよびステリル－β－グルコシダーゼからなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞。
  12. １つ以上のコード配列への前記改変が、前記細胞生来の生合成酵素または調節タンパク質遺伝子における変異を軽減するフィードバック阻害、前記細胞生来の生合成酵素遺伝子の転写調節改変、および前記細胞生来の酵素またはタンパク質における不活性化変異からなる群から選択される、請求項６～１１のいずれか一項に記載の細胞。
  13. 前記操作された細胞が、
    セリンカルボキシペプチダーゼ様アシルトランスフェラーゼドメインのＮ末端に、前記操作された細胞の細胞内コンパートメントにおける前記アシルトランスフェラーゼドメインの機能的発現を可能にする目的で融合された１つ以上の可溶性タンパク質ドメインを含む、１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種コード配列
    を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の細胞。
  14. 前記細胞が、アグマチン、Ｎ－カルバモイルプトレシン、Ｎ－メチルプトレシン、４－メチルアミノブタナール、Ｎ－メチルピロリニウム、４－（１－メチル－２－ピロジニル）－３－オキソブタン酸、トロピノン、トロピン、プソイドトロピン、エクゴニン、メチルエクゴニン、チオエステル結合によってフェニル乳酸に共有結合した補酵素Ａ、またはグリコシド結合によって、桂皮酸、フェルラ酸、クマリン酸またはフェニル乳酸に共有結合した糖からなる群から選択されるトロパンアルカロイド産物の前駆体を産生する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の細胞。
  15. 前記細胞が、ヒヨスチアミン、アトロピン、アニソダミン、スコポラミン、カリステギン、コカイン、または非天然トロパンアルカロイドからなる群から選択されるトロパンアルカロイド産物を産生する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の細胞。
  16. 前記細胞が、ｐ－ヒドロキシアトロピン、ｐ－ヒドロキシヒヨスチアミン、ｐ－フルオロヒヨスチアミン、ｐ－クロロヒヨスチアミン、ｐ－ブロモヒヨスチアミン、ｐ－フルオロスコポラミン、ｐ－クロロプスコポラミン、ｐ－ブロモスコポラミン、Ｎ－メチルヒヨスチアミン、Ｎ－ブチルヒヨスチアミン、Ｎ－メチルスコポラミン、Ｎ－ブチルスコポラミン、Ｎ－アセチルヒヨスチアミン、およびＮ－アセチルスコポラミンからなる群から選択されるトロパンアルカロイド産物の誘導体を産生する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の細胞。
  17. 前記細胞が、ヒヨスチアミン、アトロピン、またはスコポラミンからなる群から選択されるトロパンアルカロイド産物を産生する、請求項１５に記載の細胞。
  18. 細胞内膜を横切るまたは原形質膜を横切る１つ以上のＴＡ、１つ以上のＴＡ前駆体、および／または１つ以上のＴＡ誘導体の輸送が、前記細胞内で改変されている、請求項１～１７のいずれか一項に記載の細胞。
  19. 改変された輸送が、１つ以上のトランスポーターをコードする１つ以上の異種コード配列によって可能であり、
    前記トランスポーターのうちの少なくとも１つが、多剤および毒素排出トランスポーター、硝酸／ペプチドファミリートランスポーター、ＡＴＰ結合カセットトランスポーター、および多面発現性薬剤耐性（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）トランスポーターからなる群から選択される、請求項１８に記載の細胞。
  20. トロパンアルカロイド産物またはトロパンアルカロイド産物の誘導体を産生する操作された非植物細胞であって、
    前記操作された非植物細胞は、前記トロパンアルカロイド産物または前記トロパンアルカロイド産物の誘導体を産生するための経路内に複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を含む、操作された非植物細胞。
  21. 前記細胞が、微生物細胞である、請求項２０に記載の細胞。
  22. 前記細胞が、真菌細胞である、請求項２１に記載の細胞。
  23. 前記操作された細胞が、１つ以上の酵素の１つ以上の異種コード配列を含み、
    前記酵素のうちの少なくとも１つが、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチンウレオヒドロラーゼ、アグマチナーゼ、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼ、ピロリジンケチドシンターゼ、トロピノンシンターゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、トロピノンレダクターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、チロシンアンモニアリアーゼ、フェニルピルビン酸レダクターゼ、４－クマル酸－ＣｏＡリガーゼ、３－フェニル乳酸ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ８４Ａ２７、リットリンシンターゼ、リットリンムターゼ、ヒヨスチアミンデヒドロゲナーゼ、ヒヨスチアミン６β－ヒドロキシラーゼ／ジオキシゲナーゼ、およびコカインシンターゼからなる群から選択される、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の細胞。
  24. 前記操作された細胞が、
    セリンカルボキシペプチダーゼ様アシルトランスフェラーゼドメインのＮ末端に、前記操作された細胞の細胞内コンパートメントにおける前記アシルトランスフェラーゼドメインの機能的発現を可能にする目的で融合された１つ以上の可溶性タンパク質ドメインを含む、１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種コード配列
    を含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の細胞。
  25. 前記細胞が、ヒヨスチアミン、アトロピン、アニソダミン、スコポラミン、カリステギン、コカイン、または非天然トロパンアルカロイドからなる群から選択されるトロパンアルカロイド産物を産生する、請求項２０～２４いずれか一項に記載の細胞。
  26. 前記細胞が、ｐ－ヒドロキシアトロピン、ｐ－ヒドロキシヒヨスチアミン、ｐ－フルオロヒヨスチアミン、ｐ－クロロヒヨスチアミン、ｐ－ブロモヒヨスチアミン、ｐ－フルオロスコポラミン、ｐ－クロロプスコポラミン、ｐ－ブロモスコポラミン、Ｎ－メチルヒヨスチアミン、Ｎ－ブチルヒヨスチアミン、Ｎ－メチルスコポラミン、Ｎ－ブチルスコポラミン、Ｎ－アセチルヒヨスチアミン、およびＮ－アセチルスコポラミンからなる群から選択されるトロパンアルカロイド産物の誘導体を産生する、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の細胞。
  27. 前記細胞が、ヒヨスチアミン、アトロピン、またはスコポラミンからなる群から選択されるトロパンアルカロイド産物を産生する、請求項２５に記載の細胞。
  28. 細胞内膜を横切るまたは原形質膜を横切る１つ以上のＴＡ、１つ以上のＴＡ前駆体、および／または１つ以上のＴＡ誘導体の輸送が、前記細胞内で改変されている、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の細胞。
  29. 改変された輸送が、１つ以上のトランスポーターをコードする１つ以上の異種コード配列によって可能であり、
    前記トランスポーターのうちの少なくとも１つが、多剤および毒素排出トランスポーター、硝酸／ペプチドファミリートランスポーター、ＡＴＰ結合カセットトランスポーター、および多面発現性薬剤耐性トランスポーターからなる群から選択される、請求項２８に記載の細胞。
  30. トロパンアルカロイド産物、トロパンアルカロイド産物の前駆体、またはトロパンアルカロイド産物の誘導体を産生するための方法であって、
    （ａ）タンパク質産生に好適な条件下で請求項１～２９のいずれか一項に記載の細胞を培養することと、
    （ｂ）細胞培養物に出発化合物を添加することと、
    （ｃ）前記トロパンアルカロイド産物、前記トロパンアルカロイド産物の前駆体、または前記トロパンアルカロイド産物の誘導体を前記培養物から回収することと、を含む、方法。
  31. 前記細胞が、流加発酵またはバッチ発酵で培養される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記細胞培養物に添加される前記出発化合物が、糖であるか、または１種以上の糖を含むか、もしくは微生物発酵中に１種以上の糖に変換される基質である、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 前記細胞培養物に添加される前記出発化合物が、アミノ酸であるか、もしくは１種以上のアミノ酸を含む混合物、または微生物発酵中に１種以上のアミノ酸に変換される基質である、請求項３０または３１に記載の方法。
  34. 前記細胞培養物に添加される前記出発化合物が、トロパンアルカロイド産物の前駆体である、請求項３０または３１に記載の方法。
  35. 前記トロパンアルカロイド産物の前記前駆体、前記トロパンアルカロイド産物、または前記トロパンアルカロイド産物の誘導体が、液液抽出、クロマトグラフィー分離、蒸留、または再結晶化を含むプロセスを介して回収される、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の方法。
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