KR20210138642A - 비-식물 숙주 세포를 생산하는 트로판 알칼로이드(ta), 및 이의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

비-식물 숙주 세포를 생산하는 트로판 알칼로이드(ta), 및 이의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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크리스티나 디. 스몰크
프라샤츠 스리니바산
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

다른 것들 중에서, 트로판 알칼로이드 생성물, 트로판 알칼로이드 생성물의 전구체, 또는 트로판 알칼로이드 생성물의 유도체를 생성하는 조작된 비-식물 세포가 본원에 제공된다. 세포를 이용하는 트로판 알칼로이드, 트로판 알칼로이드 생성물의 전구체, 또는 트로판 알칼로이드 생성물의 유도체의 제조 방법도 기재되어 있다.

Description

비-식물 숙주 세포를 생산하는 트로판 알칼로이드(TA), 및 이의 제조 및 사용 방법
상호 참조
이 출원은 미국 가출원 일련 번호 2019년 3월 8일에 출원된 62/815,709, 2019년 5월 15일에 출원된 62/848,419 및 2019년 8월 26일에 출원된 62/891,771의 이점을 주장하고, 이 출원들은 본원에 참조로 포함된다.
정부의 권리
이 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)이 수여한 계약 GM110699 및 AT007886 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
트로판 알칼로이드(TA)는 가지과(솔라나세아에)의 식물에서 생산되는 항콜린성 2차 대사산물이다. 아트로핀, 하이오스시아민, 스코폴라민을 포함한 여러 TA는 세계보건기구(WHO)에서 유기인산염 및 신경제 중독, 위장 경련, 심장 부정맥과 같은 다양한 신경계 장애의 치료 및 피킨슨 병의 증상 조절을 위한 필수 의약품으로 분류된다. 이와 같이, 연구자와 의사가 이용할 수 있도록 이러한 TA 분자를 적절하고 일관되게 공급하는 것이 관심을 끈다. 의약용 TA에 대한 현재 공급망은 지속 가능하지 않고 지리적으로 제한된 식물 단일 재배에서 추출에 의존하며, 여기서 TA는 건조 중량의 0.2-4%만 축적되고 해충, 토지 이용 및 기후의 변화에 취약하다. 단순 공급원료로부터 TA에 대한 전체 화학 합성은 TA 입체화학으로 인해 발생하는 어려움으로 인해 아직 산업적 사용을 위해 충분히 경제적인 것으로 입증되지 않았다. 더욱이, 열악한 규모의 경제와 긴 생성 시간은 지금까지 개선된 TA 생산을 갖는 형질전환 식물 또는 식물 재배의 조작을 이러한 화합물을 소싱하기 위한 실행 불가능한 전략으로 만들었다. 이와 같이 TA를 준비하는 방법이 관심을 끈다.
본 발명은 전구체 및 당으로부터 다양한 트로판 알칼로이드 (TA)의 생산을 위해 설계된 비-식불 유기체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에는 하이오스시아민, 아트로핀, 아니소다민, 및 스코폴라민, 및 이들의 전구체 및 유도체를 포함하는 현재 의료 실시에서 확립된 용도를 갖는 자연 발생 TA로서 정의되는 의약 TA의 생산을 위한 조작된 미생물 균주가 포함된다. 또한 본 발명에는 비-의약적 TA의 생산을 위한 조작된 미생물 균주가 포함되며, 이는 현재 의료 실시에서 확립된 용도 없이 자연적으로 발생하는 TA로 정의되지만 칼리스테긴, 코카인, 및 그의 전구체 및 유도체를 포함하는 관심 의약물의 생체 활성을 보유할 수 있다. 본 발명은 또한 의약 TA의 유도체 및 비-의약 TA의 유도체를 포함하여 자연 발생 유기체에서 에스테르화되지 않은 아실 공여체 및 아실 수용체 화합물의 에스테르화를 통해 생성된 TA와 같은 비변형 유기체에 의해 생성되지 않은 TA로 정의되는 비-천연 TA의 생산을 위한 조작된 미생물 균주를 포함한다. 본 발명에 포함된 반응식의 예는 도 1-3에 상세히 기재되어 있다.
본 발명은 미생물 촉매로서 적어도 하나의 이종성 효소를 발현하도록 조작된 미생물을 사용하여, 슈도트로핀 및 슈도트로핀에 유래된 알칼로이드, 예를 들어 칼리스테긴을 생산하는 방법을 포함한다. 본 발명은 미생물 촉매로서 적어도 하나의 이종성 효소를 발현하도록 조작된 미생물을 사용하여 TA 스캐폴드의 생합성을을 위한 아실 공여체 및 수용체로서 사용될 수 있는 다양한 화합물을 생산하는 방법을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 미생물 촉매로서 적어도 하나의 이종성 효소를 발현하도록 조작된 미생물을 사용하여 TA 스캐폴드의 생산을 위한 아실 공여체 및 수용체를 에스테르화하는 방법을 포함한다. 본 발명은 히오스시아민 및 스코폴라민과 같은 의약 TA, 칼리스테긴과 같은 비-의약 TA, 및 3-페닐락트산 (PLA) 이외의 아실 공여체 화합물로 트로핀의 에스테르화로부터 유도된 것과 같은 비-천연 TA의 생산을 위해 조작된 미생물 균주를 변형 및 배양하는 방법을 추가로 포함한다.
하이오스시아민 및 스코폴라민과 같은 관심 대상인 트로판 알칼로이드(TA)를 생성하도록 조작된 숙주 세포가 제공된다. 관심 있는 TA는 TA 전구체, TA, 및 TA의 유도체를 비롯한 TA의 변형을 포함할 수 있다. 숙주 세포는 효소 유전자의 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제; 생합성 효소 유전자의 전사 조절 변형; 효소의 불활성화 돌연변이; 및 이종 코딩 서열을 포함한다. 또한, 본 발명의 방법에서 사용되는 숙주 세포 및 조성물, 예를 들어 키트, 시스템 등을 사용하여 관심 있는 TA를 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 양태는 트로판 알칼로이드(TA) 생성물을 갖는 생성물 스트림을 형성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 조작된 비-식물 세포 및 영양소 및 물을 포함하는 공급원료를 회분식 반응기에 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 조작된 비-식물 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변형을 갖는다: 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 돌연변이를 완화하는 피드백 억제; 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 전사 조절 변형; 및 세포에 고유한 효소의 불활성화 돌연변이. 추가로, 방법은 회분식 반응기에서 조작된 비-식물 세포를 약 5분 이상의 기간 동안 인큐베이션하여 TA 생성물 및 세포 물질을 포함하는 용액을 생성함으로써 조작된 비-식물 세포를 발효시키는 단계를 포함한다. 방법은 또한 TA 생성물을 포함하는 상기 생성물 스트림을 제공하기 위해 세포 물질로부터 TA 생성물을 분리하기 위해 적어도 하나의 분리 유닛을 사용하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 TA 생성물을 갖는 생성물 스트림을 형성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 조작된 비-식물 세포 및 영양소 및 물을 포함하는 공급원료를 반응기에 제공하는 단계를 포함한다. 방법은 또한 반응기에서 조작된 효모 세포를 적어도 약 5분(예를 들어, 5분 이상)의 기간 동안 인큐베이션함으로써 조작된 비-식물 세포를 발효시켜세포 물질 및 TA 생성물을 포함하는 용액을 생성하는 단계를 포함한다. 추가로, 방법은 TA 생성물을 포함하는 생성물 스트림을 제공하기 위해 세포 물질로부터 TA 생성물을 분리하기 위해 적어도 하나의 분리 유닛을 사용하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 트로판 알칼로이드(TA) 생성물을 생성하는 조작된 비-식물 세포를 제공하며, 조작된 비-식물 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변형을 갖는다: 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 돌연변이를 완화하는 피드백 억제; 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 전사 조절 변형; 및 세포에 고유한 효소의 불활성화 돌연변이. 조작된 비-식물 세포는 아르기닌 탈탄산효소, 아그마틴 우레오하이드롤라제, 아그마티나제, 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제, N-메틸푸트레신 산화효소, 파이롤리딘 케타이드 합성효소, 트로피논 합성효소, 사이토크롬 P450 환원효소, 트로피논 환원효소, 페닐피루베이트 환원효소, 3-페닐락트산 UDP-글루코실트랜스퍼라제 84A27, 리토린 합성효소, 리토린 뮤타제, 하이오스시아민 탈수소효소, 하이오스시아민 6β-하이드록실라제/디옥시게나제, 및 코카인 합성효소의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 이종성 코딩 서열을 포함한다. 일부 예에서, 조작된 비-식물 세포는 아르기닌 탈탄산효소, 아그마틴 우레오하이드롤라제, 아그마티나제, 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제, N-메틸푸트레신 산화효소, 파이롤리딘 케타이드 합성효소, 트로피논 합성효소, 사이토크롬 P450 환원효소, 트로피논 환원효소, 페닐피루베이트 환원효소, 3-페닐락트산 UDP-글루코실트랜스퍼라제 84A27, 리토린 합성효소, 리토린 뮤타제, 하이오스시아민 탈수소효소, 하이오스시아민 6β-하이드록실라제/디옥시게나제, 및 코카인 합성효소의 군으로부터 선택된 효소를 인코딩하는 복수의 이종성 코딩 서열을 포함한다. 일부 예에서, 이종성 코딩 서열은 작동가능하게 연결될 수 있다. 작동 가능하게 연결된 이종성 코딩 서열은 특정 트로판 알칼로이드 생성물을 생산하는 동일한 경로 내에 있을 수 있다. 일부 예에서, 조작된 비-식물 세포는 효소의 변형된 세포내 트래피킹, 효소의 변형된 세포 아래 국소화, 및 대사산물의 변형된 세포내 수송을 포함하지만 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택되는 세포내 구획화에 대한 하나 이상의 변형을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 치료제가 제공된다. 치료제는 트로판 알칼로이드 생성물을 포함한다.
본 발명은 첨부 도면과 함께 읽을 때 다음의 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해된다. 일반적인 실시에 따르면 도면의 다양한 피처가 축척에 맞지 않음이 강조된다. 이에 반해 다양한 피처의 치수는 명료성을 위해 임의로 확대 또는 축소하였다. 도면에는 다음 도면이 포함된다.
도 1은 L-아르기닌을 비-의약적 TA로 전환하기 위한 예시적인 생합성 반응식을 예시한다. ADC, 아르기닌 탈탄산효소; ARG, 아르기나제; AUH, 아그마틴 우레오하이드롤라제; ODC, 오르니틴 탈탄산효소; PAO, 폴리아민 산화효소; PMT, 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제; MPO, N-메틸푸트레신 산화효소; 자발적, 자발적인 (비-효소적) 단계; PYKS, 파이롤리딘 케타이드 합성효소; CYP82M3, 트로피논 합성효소; CPR, 사이토크롬 P450-NADP+ 환원효소; TR2, 트로피논 환원효소 2; P450, 사이토크롬 P450. 아르기닌, 오르니틴, 스페르민, 스페르미딘, 푸트레신은 효모에서 자연적으로 합성된다. 표시된 다른 모든 대사산물은 효모에서 자연적으로 생성되지 않는다. 상자 안에 표시된 최종 생성물은 비의약 TA의 예이다.
도 2는 아미노산이 관심 있는 의약 TA 분자 및 이의 전구체 분자로 전환될 수 있는 예시적인 생합성 경로를 예시한다. 이 예는 L-아르기닌과 L-페닐알라닌을 의약 TA로 전환하는 것을 보여준다. ADC, 아르기닌 탈탄산효소; ARG, 아르기나제; AUH, 아그마틴 우레오하이드롤라제; ODC, 오르니틴 탈탄산효소; PAO, 폴리아민 산화효소; PMT, 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제; MPO, N-메틸푸트레신 산화효소; 자발적, 자발적인 (비-효소적) 단계; PYKS, 파이롤리딘 케타이드 합성효소; CYP82M3, 트로피논 합성효소; CPR, 사이토크롬 P450-NADP+ 환원효소; TR1, 트로피논 환원효소 1; ArAT, 방향족 아미노트랜스퍼라제; PPR, 페닐피루베이트 환원효소; UGT84A27, 3-페닐락테이트 UDP-글루코실트랜스퍼라제; LS, 리토린 합성효소; CYP80F1, 리토린 뮤타제; HDH, (S)-하이오스시아민 탈수소효소; H6H, (S)-하이오스시아민 6β-하이드록실라제/디옥시게나제. 아르기닌, 오르니틴, 스페르민, 스페르미딘, 푸트레신, 페닐알라닌, 3-페닐피루브산 및 미량의 3-페닐락트산은 효모에서 자연적으로 합성된다. 표시된 다른 모든 대사산물은 효모에서 자연적으로 생성되지 않는다. 상자 안에 표시된 최종 생성물은 의약 TA의 예이다.
도 3은 아미노산이 비-천연 TA 및 이의 전구체 분자로 전환될 수 있는 예시적인 생합성 경로를 예시한다. 이 예에서 L-아르기닌과 L-페닐알라닌은 비-천연 TA로 전환된다. ADC, 아르기닌 탈탄산효소; ARG, 아르기나제; AUH, 아그마틴 우레오하이드롤라제; ODC, 오르니틴 탈탄산효소; PAO, 폴리아민 산화효소; PMT, 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제; MPO, N-메틸푸트레신 산화효소; 자발적, 자발적인 (비-효소적) 단계; PYKS, 파이롤리딘 케타이드 합성효소; CYP82M3, 트로피논 합성효소; CPR, 사이토크롬 P450-NADP+ 환원효소; TR1, 트로피논 환원효소 1; PAL, 페닐알라닌 암모니아-분해효소; 4CL, 4-쿠마레이트-CoA 리가제; CS, 코카인 합성효소. 아르기닌, 오르니틴, 스페르민, 스페르미딘, 푸트레신 및 페닐알라닌은 효모에서 자연적으로 합성된다. 표시된 다른 모든 대사산물은 효모에서 자연적으로 생성되지 않는다. 상자 안에 표시된 최종 생성물은 비-천연 TA의 예이다.
도 4는 아미노산 및 기타 폴리아민 분자로부터 푸트레신을 생산하기 위한 예시적인 생합성 경로를 예시한다. 이 도는 내인성 효모와 이종성 생합성 경로를 사용하여 중앙 대사산물에서 푸트레신을 제조하는 방법을 보여준다.
도 5는 아르기닌 및 폴리아민 대사에 관여하는 내인성 생합성 효소의 과발현을 위해 조작된 효모 균주가 액체 배양에서 푸트레신을 생성할 수 있음을 보여준다. 천연 유전자의 추가 카피는 야생형 효모(CEN.PK2)의 저 카피(low-copy) 플라스미드에서 발현되었다. 형질전환된 균주는 LC-MS/MS 분석 전에 48시간 동안 30℃에서 2% 덱스트로스를 함유한 선택적 배지에서 배양되었다. 모든 데이터는 적어도 3회의 생물학적 복제물의 평균을 나타내며 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. 달리 표시되지 않는 한, 통계적 유의성은 해당 대조군(즉, CEN.PK2)과 관련하여 표시된다.
도 6은 아르기닌 및 폴리아민 대사에 관여하는 효모 이외의 유기체로부터 생합성 효소의 이종성 발현을 위해 조작된 효모 균주가 액체 배양에서 푸트레신 생산을 생성할 수 있음을 도시한다. 이 예에서, 효모 균주는 식물과 박테리아로부터 이종성 생합성 경로를 발현하도록 조작된다. 이종성 효소는 야생형 효모의 저 카피 플라스미드에서 발현되었다. 형질전환된 균주는 LC-MS/MS 분석 전에 48시간 동안 30℃에서 2% 덱스트로스를 함유한 선택적 배지에서 배양되었다. 모든 데이터는 적어도 3회의 생물학적 복제물의 평균을 나타내며 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. 달리 표시되지 않는 한, 통계적 유의성은 해당 대조군(즉, CEN.PK2)과 관련하여 표시된다.
도 7은 효모 이외의 유기체로부터의 아르기닌 및 폴리아민 대사에 관여하는 생합성 효소의 이종성 발현을 위해 조작된 효모 균주가 액체 배양에서 TA 전구체 및 중간체 아그마틴, N-카르바모일푸트레신 및 푸트레신을 생성할 수 있음을 도시한다. 이 도는 효모에서 아그마틴/푸트레신 생합성 경로 유전자의 기능적 검증을 도시한다. 야생형 효모 균주 CEN.PK2는 0(음성 대조군)과 3개의 표시된 생합성 유전자 사이에서 공동 발현하기 위해 3개의 저 카피 플라스미드로 형질전환되었다. 청색 형광 단백질(BFP)을 발현하는 플라스미드를 3개의 영양요구성 선택 마커 URA3, TRP1 및 LEU2 각각에 대한 음성 대조군으로 사용하였다. 형질전환된 균주는 대사산물 생산에 대한 LC-MS/MS 분석 전에 48시간 동안 30℃에서 2% 덱스트로스를 함유한 선택적 배지에서 배양되었다. 모든 데이터는 음성 대조군(CEN.PK2)에 대한 LC-MS/MS 피크 면적으로 측정한 역가를 보여준다. 데이터는 3회의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 8은 정상적인 효모 성장 동안 세포내 푸트레신 수준을 엄격하게 제어하는 내인성 조절 경로를 도시한다.
도 9는 내인성 폴리아민 생합성 조절 메카니즘을 방해하는 효모 균주에서 푸트레신 생산의 히트 맵을 도시한다. 천연 또는 이종성 푸트레신 경로의 과발현을 위해 표시된 유전자는 야생형 효모(WT) 또는 각각의 단일 파괴 균주의 저 카피 플라스미드에서 발현되었다. 균주는 LC-MS/MS 분석 전에 72시간 동안 30℃에서 2% 덱스트로스를 포함하는 선택적(YNB-DO) 배지에서 배양되었다. 모든 데이터는 적어도 3회의 생물학적 복제물의 평균을 나타낸다. 이 도는 폴리아민 대사 유전자의 단일 파괴와 과발현된 내인성 또는 이종성 푸트레신 생합성 경로를 갖는 효모 균주가 액체 배양에서 푸트레신을 생산할 수 있음을 도시한다.
도 10은 효모에서 푸트레신 생산을 증가시키기 위한 공학적 노력의 요약을 제공한다. '+' 기호는 경로로부터의 적어도 하나의 유전자의 발현을 나타내는 반면, '-'는 경로로부터의 유전자의 발현을 나타내지 않는다. 균주는 LC-MS/MS 분석 전에 30℃에서 48시간 동안 2% 덱스트로스를 포함하는 선택적 배지에서 배양되었다. 모든 데이터는 적어도 3회의 생물학적 복제물의 평균을 나타내며 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. 달리 표시되지 않는 한, 통계적 유의성은 해당 대조군(즉, CEN.PK2)과 관련하여 표시된다.
도 11은 본 발명의 구현예에 따른, 조작된 효모에서 중간체 NMP 및 4MAB를 통한 푸트레신의 TA 중간체 NMPy 및 부산물 4MAB 산으로의 단계적 전환을 예시하는 LC-MS/MS 크로마토그램을 도시한다. 내인성 효모 효소(ALD)의 활성을 통한 4MAB 산 부산물의 형성에 대해 제안된 메카니즘이 표시된다. 추출된 이온 크로마토그램 MRM 흔적은 경로를 따라 각 대사산물에 대해 그리고 각 대사산물에 대한 최고 전구체 이온/생성 이온 전이를 사용하는 진짜 표준에 대해 표시된다. 대조군은 저 카피 플라스미드에서 SPE1 , AsADC 및 speB를 발현하는 균주 CSY1235(실시예 1.5 참조)를 나타낸다. 크로마토그램 흔적은 세 가지 생물학적 복제물을 나타낸다. 효소 기호: PMT, 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제; MPO, N-메틸푸트레신 산화효소; ALD, 알데하이드 탈수소효소.
도 12는 본 발명의 구현예에 따라 TA 전구체 (A) 푸트레신, (B) NMP, (C,E) 4MAB, 및 (D,F) AbPMT1 및 MPO 효소를 발현하는 조작된 효모의 액체 배양물에서의 NMPy 상대적 생산을 예시하는 LC-MS/MS 크로마토그램을 도시한다. (A) 푸트레신 과잉생산을 위한 pCS4239를 포함하는 CSY1235에 대한 푸트레신(m/z+ 89 → 72)의 MRM 크로마토그램. (B) pCS4239를 보유하고 저 카피 플라스미드에서 AbPMT1을 발현하는 CSY1235에 대한 NMP(m/z+ 103 → 72)의 MRM 크로마토그램. (C,D) pCS4239를 보유하고 저 카피 플라스미드에서 AbPMT1 및 NtMPO1을 발현하는 CSY1235에 대한 4MAB (m/z+ 102 → 71) 및 NMPy (m/z+ 84 → 57) 각각의 MRM 크로마토그램. (E,F) pCS4239를 보유하고 저 카피 플라스미드에서 AbPMT1 및 DmMPO1ΔC-PTS1을 발현하는 CSY1235에 대한 4MAB (m/z+ 102 → 71) 및 NMPy (m/z+ 84 → 57) 각각의 MRM 크로마토그램. 흔적의 Y축은 원시 MRM 이온 수이다. 모든 크로마토그램은 2% 덱스트로스가 포함된 선택적 배지에서 30℃에서 48시간 동안 성장시킨 세포외 배지의 LC-MS/MS 분석에 의해 생성되었다. 흔적은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
도 13은 AbPMT1에 의한 SAM-의존성 푸트레신 N-메틸화에 대한 MEU1 파괴의 효과를 도시한다. 야생형 균주 CEN.PK2 또는 meu1 파괴 균주 CSY1229는 SPE1 , AsADC, 및 speB 및 AbPMT1을 발현하는 저 카피 플라스미드와 함께 공동 형질전환되었다. 데이터는 2% 덱스트로스가 포함된 선택적 배지에서 30℃에서 48시간 성장 후 3개의 생물학적 복제물에 대한 LC-MS/MS 피크 면적으로 정량화된 CEN.PK2 대조군에 대한 평균 NMP 역가를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 보여준다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
도 14는 SherLoc2 웹 서버를 사용하여 식물 및 효모/진균 세포에서 NMPy 생합성 유전자에 대한 세포 아래 국소화의 인실리코 예측을 도시한다. 값과 색상은 각 구획에 대한 국소화에 대한 확률 점수(0 내지 1)를 나타낸다. CYT, 사이토졸; NUC, 핵; VAC, 액포; CHL, 엽록체; MIT, 미토콘드리아; POX, 페록시솜.
도 15는 본 발명의 구현예에 따라, 조작된 효모의 액체 배양물에서 (A) PEX3 페록시솜 마커를 갖는 N- 및 C-말단 GFP-태깅된 NtMPO1의 공국소화 및 (B) TA 전구체 4MAB 및 NMPy의 생산에 대한 NtMPO1의 N- 및 C-말단 GFP 태깅의 효과를 예시한다. 이 도는 NtMPO1 세포 아래 국소화의 실험적 검증을 보여준다. (A) 야생형 효모(CEN.PK2)에서 페록시솜 마커 mCherry-PEX3와 공동 발현된 NtMPO1 N- 및 C-말단 GFP 융합의 형광 현미경검사. 흰색 화살표는 GFP-태깅된 NtMPO1과 페록시솜의 공국소화를 나타낸다. 스케일 바, 10μm. (B) 4MAB 또는 NMPy 생산에 대한 NtMPO1의 사이토졸 국소화를 강제하는 효과. 야생형 효모(CEN.PK2)는 SPE1, AsADC, 및 speB 및 AbPMT1을 발현하는 저 카피 플라스미드와 함께 야생형 NtMPO1 또는 N- 또는 C-말단 GFP 융합을 발현하는 저 카피 플라스미드로 공동 형질전환되었다. LC-MS/MS 분석은 2% 덱스트로스가 포함된 선택적 배지에서 30℃에서 48시간 동안 성장시킨 후 수행되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고; 오차 막대는 표준 편차를 보여준다. 가장 가능성 있는 세포 아래 구획은 (a)의 현미경 데이터를 기반으로 표시된다.
도 16은 효모에서 이종성 발현될 때 AbPMT1 및 NtMPO1의 세포 아래 국소화를 묘사하는 형광 현미경검사 데이터를 제공한다. 저 카피 플라스미드로부터 N- 또는 C-말단 GFP-태깅된 AbPMT1 또는 NtMPO1을 발현하는 야생형 효모에 대해 현미경검사가 수행되었다. 스케일 바, 10μm.
도 17은 본 발명의 구현예에 따라 (A) 식물 전사체 데이터로부터 확인된 추정 MPO 효소 AbMPO1 및 DmMPO1의 서열 정렬을 도시한다(위에서 아래로: 서열번호: 27-29), (B) NtMPO1, AbMPO1 또는 DmMPO1을 발현하는 조작된 효모 균주의 액체 배양물에서 TA 전구체 4MAB 및 NMPy의 생산 비교, 및 (C) 상동성 모델링으로부터 결정된 NtMPO1, AbMPO1, 및 DmMPO1의 예측된 3차원 구조의 비교를 예시한다. (A) 1000 Plants Project 데이터베이스의 AbMPO1 및 DmMPO1 후보에 대한 쿼리 NtMPO1 서열의 정렬. 청색은 아미노산 구조의 보존을 나타낸다. 적색은 불일치를 나타낸다. (B) MPO 오쏘로그의 상대적 활성 비교. 푸트레신 과생산 균주 CSY1235(실시예 1.5 참조)는 SPE1 , AsADC 및 speB , 및 AbPMT1, 및 3개의 MPO 변이체 중 하나를 발현하는 저 카피 플라스미드와 함께 공동 형질전환되었다. LC-MS/MS 분석은 30 ℃에서 선택적 배지에서 48시간 동안 성장시킨 후 수행되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고; 오차 막대는 표준 편차를 보여준다. (C) 피섬 사티붐 구리 함유 아미노 산화효소(PDB: 1KSI, 청색) RaptorX 웹 서버를 사용한다. 최상부: NtMPO1; 중앙: AbMPO1; 바닥: DmMPO1.
도 18은 푸트레신을 과생산하고 AbPMT1 및 NtMPO1 및 DmMPO1의 N- 및 C-말단 절단을 발현하는 조작된 효모 균주의 액체 배양물에서의 4MAB 생산을 예시한다. 이 도는 조작된 효모에서 4MAB 생산에 대한 메틸푸트레신 산화효소에 대한 N- 및 C-말단 절단의 효과를 보여준다. 야생형(WT) 효소 및 표시된 절단은 푸트레신 과잉생산 균주 CSY1235(실시예 1.5 참조)의 저 카피 플라스미드에서 발현되었다. 균주는 LC-MS/MS 분석 전에 30℃에서 48시간 동안 2% 덱스트로스를 포함하는 선택적 배지에서 배양되었다. 모든 데이터는 적어도 3회의 생물학적 복제물의 평균을 나타내며 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
도 19는 4개의 천연 알데하이드 탈수소효소 유전자 중 하나의 단일 파괴를 보유하는 조작된 효모 균주의 액체 배양물에서 TA 전구체 4MAB 및 NMPy 및 부산물 4MAB 산의 생산을 예시한다. 이 도는 4MAB 산 축적에 대한 개별 알데하이드 탈수소효소를 파괴하는 효과를 보여준다. 푸트레신 과생산 균주 CSY1235(대조군) 또는 hfd1, ald4, ald5 또는 ald6의 넌센스 돌연변이 파괴가 있는 딸 균주를 SPE1 , AsADC, 및 speB , AbPMT1 및 DmMPO1 ΔC - PTS1 을 발현하는 저 카피 플라스미드로 형질전환하였다. 막대는 30 ℃에서 선택적 배지에서 48시간 성장 후 CSY1235(ALD 파괴 없음)로 정규화된 LC-MS/MS 피크 면적으로 측정한 상대적인 4MAB 산 역가를 나타낸다. 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
도 20은 천연 알데하이드 탈수소효소에 대한 하나 이상의 파괴를 보유하는 조작된 효모 균주의 액체 배양물에서 (A) 4MAB 산 부산물뿐만 아니라 (B) TA 전구체 4MAB 및 NMPy의 생산을 예시한다. 이 도는 조작된 효모에서 (A) 4MAB 산 부산물 및 (B) 4MAB 및 NMPy의 생산에 대한 알데하이드 탈수소효소 유전자 파괴의 효과를 보여준다. '+' 및 '-' 기호는 각각 기능성 효소의 유무를 나타낸다. 균주는 LC-MS/MS 분석 전에 72시간 동안 30℃에서 2% 덱스트로스를 포함하는 선택적(YNB-DO) 배지에서 배양되었다. 모든 데이터는 적어도 3회의 생물학적 복제물의 평균을 나타내며 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. 달리 표시되지 않는 한, 통계적 유의성은 해당 대조군(CSY1235)과 관련하여 표시된다.
도 21은 본 발명의 구현예에 따라, 푸트레신 과잉생산 유전자, AbPMT1 및 DmMPO1 절단의 저 카피 플라스미드 기반 또는 게놈 발현을 갖는 조작된 효모 균주의 액체 배양물에서 TA 전구체 NMPy의 생산의 비교를 예시한다. 이 도는 4MAB 및 NMPy 생산과 NMPy 생합성 유전자의 플라스미드 기반(CSY1241) 및 게놈(CSY1243) 발현과의 비교를 제공한다. 균주 CSY1241은 푸트레신 과잉생산 유전자(SPE1 , AsADC , speB), AbPMT1 및 DmMPO1 ΔC - PTS1 을 발현하는 저 카피 플라스미드로 형질전환되었다. 균주 CSY1243은 게놈 통합 카피에서 앞서 언급한 모든 유전자를 발현하였다. NMPy 수준은 30 ℃에서 48시간 동안 선택적(CSY1241) 또는 비-선택적(CSY1243) 배지에서 성장한 후 LC-MS/MS에 의해 정량화되었다. 데이터는 적어도 2개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 22는 본 발명의 구현예에 따라, NMPy 및 MPOB로부터 부산물 하이그린의 생산을 위한 생합성 경로를 예시한다. 효모에서 추정되는 주요 및 부반응은 각각 굵은 화살표와 점선 화살표로 표시된다.
도 23은 저 카피 플라스미드 기반 AbPYKS , AbCYP82M3 , DsTR1, 및 4가지 상이한 CPR 중 하나를 발현하는 조작된 효모 균주의 액체 배양물에서 TA 전구체 트로피논 및 트로핀 및 부산물 하이그린의 생산의 비교를 예시한다. 이 도는 조작된 효모에서 AbPYKS, AbCYP82M3 및 DsTR1이 발현되는 트로핀 및 관련 중간체의 생산을 보여준다. 표시된 유전자는 CSY1246의 저 카피 플라스미드에서 발현되고; '+' 및 '-' 기호는 효소의 유무를 나타낸다. 균주는 LC-MS/MS 분석 전에 30℃에서 48시간 동안 2% 덱스트로스를 포함하는 선택적 배지에서 배양되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
도 24는 (A) 조작된 효모 균주의 액체 배양물에서 생성된 TA 전구체 MPOB의 특징적인 삼중 피크를 예시하는 LC-MS/MS 크로마토그램, 및 (B) 플라스미드로부터 AbPYKS, AbCYP82M3, 및 4개의 CPR 중 하나를 발현하도록 조작된 효모 균주의 액체 배양물에서 TA 전구체 NMPy 및 MPOB의 생성을 예시한다. 이 도는 AbPYKS를 발현하는 조작된 균주의 배지에서 NMPy 및 MPOB의 축적을 도시한다. (A) 저 카피 플라스미드에서만 AbPYKS를 발현하는 CSY1246의 세포외 배지에서 MPOB 검출을 위한 대표적인 LC-MS/MS 다중 반응 모니터링(MRM) 크로마토그램. 세 가지 특징적인 MPOB 동형체 피크는 (I), (II) 및 (III)으로 표시된다. LC-MS/MS 분석은 선택적 배지에서 30 ℃에서 48시간 동안 성장시킨 후 수행되었다. (B) 선택적 배지에서 30 ℃에서 48시간 동안 성장시킨 후 CSY1246 발현 AbPYKS , AbCYP82M3, 및 저 카피 플라스미드로부터의 4개의 CPR 중 하나의 세포외 배지에서 NMPy 및 MPOB (모두 3개의 피크)의 상대 존재비. '+' 및 '-' 기호는 유전자의 유무를 나타낸다. 데이터는 세 가지 생물학적 복제물의 평균을 나타내고; 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 25는 조작된 효모의 액체 배양물에서 TA 전구체 트로핀 및 부산물 하이그린의 생산에 대한 성장 온도의 영향을 예시한다. 이 도는 트로핀 생산 효모 균주(CSY1248)에서 자발적인 하이그린 생산에 대한 성장 온도의 영향을 도시한다. 상대 선택성은 상대 하이그린 역가에 대한 상대 트로핀 역가의 비율을 나타낸다. 균주는 LC-MS/MS 분석 전에 48시간 동안 30 ℃ 또는 25℃에서 2% 덱스트로스를 포함하는 비-선택적 배지에서 배양되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
도 26은 본 발명의 구현예에 따라 (A) 아세테이트 보충이 있거나 없는 배지에서 트로핀-생산 조작된 효모 균주의 성장에 대한 ALD4 및 ALD6 재구성의 효과, 및 (B) (B) 트로핀 생성 조작된 효모 균주의 액체 배양물에서 부산물 4MAB 산 및 하이그린의 생산에 대한 아세테이트 영양요구성 제거 효과를 예시한다. 이 도는 조작된 트로핀 생산 효모 균주에서 아세테이트 영양요구성 제거 효과를 도시한다. (A) 아세테이트 보충 유무에 관계없이 NMPy 생성 효모 균주(CSY1246)의 성장에 대한 기능적 ALD4 또는 ALD6 유전자 재구성의 효과. ALD4 및 ALD6은 저 카피 플라스미드에서 발현되었다. 'WT'는 대조군(BFP) 플라스미드가 있는 CSY1246을 나타낸다. 인접한 열은 10배 희석을 보여준다. (B) 조작된 효모에서 재구성된 아세테이트 대사를 갖는 4MAB 산 및 하이그린 부산물의 생산. '+' 및 '-' 기호는 저 카피 플라스미드에서 발현된 대사산물(아세테이트) 또는 ALD4 및 ALD6 유전자의 존재 또는 부재를 나타낸다. 균주는 LC-MS/MS 분석 전에 48시간 동안 30℃에서 2% 덱스트로스를 포함하는 선택적(YNB-DO) 배지에서 배양되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
도 27은 본 발명의 구현예에 따라 (A) 트로핀을 생산하도록 조작된 효모 균주의 액체 배양물에서 NMPy와 트로피논 사이의 TA 전구체 축적에 대한 아세테이트 영양요구성의 효과, 및 (B) 아세테이트 영양요구 유무에 관계없이 트로핀을 생산하도록 조작된 효모 균주의 액체 배양물에서 생산된 TA 전구체 MPOB의 대표적인 LC-MS/MS 크로마토그램. 이 도는 조작된 효모에서 트로핀에 대한 NMPy를 통한 대사산물 플럭스에 대한 ALD6 활성 재구성의 효과를 도시한다. (A) 기능성 Ald6p가 있거나 없는 조작된 균주에서 NMPy와 트로피논 사이의 중간체 생산. 중간 존재비는 아세테이트 0.1% w/v 아세트산칼륨(회색)로 보충된 비-선택적 배지에서 성장된 통합된 트로핀-생산 균주 또는 아세테이트 보충이 없는 비-선택적 배지(분홍색)에서 48시간 동안 25℃에서 성장된 재구성된 ALD6(CSY1248)을 갖는 트로핀 생산 균주의 세포외 배지에서 LC-MS/MS MRM에 의해 측정되었다. 데이터는 세 가지 생물학적 복제물의 평균을 나타내고; 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. (B) (a)에 설명된 대로 배양된 CSY1248(회색) 및 CSY1249(적색)에서 MPOB 생산을 위한 대표적인 MRM 크로마토그램.
도 28은 조작된 효모 균주의 액체 배양물에서 TA 전구체 트로핀 및 부산물 하이그린의 생산에 대한 개선의 진행을 예시한다. 이 도는 효모에서 트로핀 생산을 증가시키도록 조작된 균주의 요약을 제공한다. '-' 기호는 유전자가 부재를 나타내고; 'p' 및 'i'는 각각 저 카피 플라스미드 또는 게놈 통합으로부터의 유전자 발현을 나타낸다. 균주는 LC-MS/MS 분석 전에 48시간 동안 30 ℃ 또는 25℃에서 2% 덱스트로스를 포함하는 선택적 또는 비-선택적 배지에서 배양되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
도 29는 본 발명의 구현예에 따라, 조작된 효모의 액체 배양물에서 푸트레신과 트로핀 사이의 각각의 TA 전구체의 생산에 대한 이종성 생합성 효소 PMT, MPO, PYKS, 및 CYP82M3의 추가 카피를 발현시키는 효과를 예시한다. 이 도는 최적화된 트로핀 생산 균주(CSY1249)의 대사 병목을 식별한다. 균주 CSY1249는 BFP ("과발현 없음")를 발현하는 대조군 플라스미드 또는 AbPMT1 , DmMPO1 ΔC - PTS1 , AbPYKS, 또는 AbCYP82M3의 추가 카피를 발현하는 저 카피 플라스미드로 형질전환되었다. 세포외 배지의 중간 수준은 48시간 동안 선택적 배지에서 25℃에서 성장시킨 후 LC-MS/MS에 의해 정량화되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 30은 조작된 효모에서 트로핀 생산에 대한 병목 효소 PMT 및 PYKS의 추가 카피의 영향을 설명한다. 이 도는 PMT 및 PYKS 효소의 추가 카피의 게놈 통합을 통한 대사 병목의 완화를 보여준다. 트로핀 생성 균주 CSY1249 및 CSY1251은 성장 배지의 LC-MS/MS 분석 전에 48시간 동안 25℃에서 비-선택적 배지에서 배양되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
도 31은 이종성 락테이트 탈수소효소 및 페닐피루베이트 환원효소 효소를 발현하는 조작된 효모 균주의 액체 배양물에서 TA 전구체 아실 공여체 화합물 PLA의 생산을 예시한다. 이 도는 L-페닐알라닌을 3-페닐락트산으로 전환하도록 조작된 효모 균주의 LC-MS/MS 분석을 도시한다. 효모 균주는 LEU2 선택 마커, TDH3 프로모터, 및 음성 대조군으로부터 BFP에 대한 코딩 서열을 보유하는 저 카피 CEN/ARS 플라스미드; B. 코아굴란스 ( BcLLDH ), L. 카세이 ( LcLLDH ), L. 플란타룸 ( LpLLDH )로부터의 LDH 변이체; 또는 A. 벨라돈나 ( AbPPR ), L. 플란타룸 ( LpPPR ), 에스케리치아 콜라이 ( hcxB ) 또는 W. 플루오레스센스 ( WfPPR )로부터의 PPR 변이체를 갖도록 조작된다. 효모는 96웰 딥웰 미세적정 플레이트의 300μL 선택적 배지(-Leu)에서 새로 형질전환된 콜로니로부터 성장되었다. 25℃ 및 460rpm의 진탕 배양기에서 72시간 동안 성장시킨 후, 효모를 펠렛화하고 배지 상청액을 LC-MS/MS로 분석하였다. 데이터는 추출된 이온 크로마토그램(암모늄 부가물, EIC m/z+ = 184)을 기반으로 음성 대조군에 존재하는 미량 수준으로 정규화된 상대 3-페닐락트산 역가를 보여준다. 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
도 32는 페닐알라닌 암모니아-분해효소를 발현하는 조작된 효모 균주의 액체 배양물에서 TA 전구체 아실 공여체 화합물 신남산의 생성을 예시하는 LC-MS/MS 크로마토그램을 보여준다. 이 도는 L-페닐알라닌을 신남산으로 전환하도록 조작된 효모 균주의 LC-MS/MS 분석을 보여준다. 효모 균주는 TRP1 선택적 마커, TEF1 프로모터, 및 (i) BFP 또는 (ii) A. 탈리아나 페닐알라닌 암모니아-분해효소(AtPAL1)에 대한 코딩 서열을 보유하는 저 카피 CEN/ARS 플라스미드를 갖도록 조작된다. 효모는 96웰 딥웰 미세적정 플레이트의 300μL 선택적 배지(-Trp)에서 새로 형질전환된 콜로니로부터 성장되었다. 30℃ 및 460rpm의 진탕 배양기에서 48시간 동안 성장시킨 후, 효모를 펠렛화하고 배지 상청액을 LC-MS/MS로 분석하였다. 크로마토그램 흔적은 신남산(m/z+ 149 → 131)에 대한 가장 풍부한 다중 반응 모니터링(MRM) 전환을 기반으로 하여 이러한 균주에 의해 생성된 신남산을 보여준다. 각 흔적은 세 가지 샘플을 나타낸다.
도 33은 조작된 효모에서 발현된 TA-생산 가지과로부터의 UDP-글루코실트랜스퍼라제 84A27(UGT84A27) 오쏘로그의 기질 특이성을 예시한다. 이 도는 조작된 효모에서 발현되는 3개의 다른 페닐프로파노이드 화합물에 대한 UGT84A27 오쏘로그의 활성을 비교한 것이다. (A) 페닐프로파노이드는 조작된 효모에서 UGT84A27에 대한 덱스트로스(Glu) 수용체로 테스트되었다. 최상부, (D)-3-페닐락트산(PLA); 중간, 트랜스-신남산(CA); 바닥, 트랜스페룰린산(FA). (B) UGT84A27 발현을 위해 조작된 효모에 의한 공급된 페닐프로파노이드의 글루코사이드로의 전환율의 히트맵. UGT84A27 오쏘로그 또는 BFP 음성 대조군은 CSY1251의 저 카피 플라스미드에서 발현되었다. 형질전환된 세포를 LC-MS/MS 분석 전에 72시간 동안 500μM PLA, CA 또는 FA가 보충된 선택적 배지에서 배양하였다. 데이터는 n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플 ± 표준 편차의 평균을 나타낸다.
도 34는 UGT84A27 활성의 크로마토그래피 및 질량 분광계 분석의 예를 도시한다. 이 도는 보다 완전한 글루코실화를 가능하게 하기 위해 120시간 동안 도 33b에서와 같이 배양된 CSY1251에서 AbUGT에 의한 PLA, CA 및 FA의 동족 글루코사이드로의 전환을 보여주는 대표적인 LC-MS/MS 흔적을 도시한다. PLA의 경우, 산(각 패널의 상단 트레이스)과 글루코사이드(각 패널의 하단 트레이스)는 다른 NH4 + 부가물 모체 질량과 다른 정체 시간으로 구별되었다. CA 및 FA의 경우, 페닐프로파노이드 단편에 의해 생성되는 더 낮은 정체 피크를 기반으로 하는 글루코사이드의 신속한 단편화 검출이 필요하였다.
도 35는 기질 특이성을 변경하기 위한 AbUGT의 구조 유도 활성 부위 조작을 예시한다. 이 도는 PLA에 대한 활성을 증가시키는 잠재적 돌연변이를 식별하기 위한 AbUGT 3D 구조의 구조적 분석을 도시한다. (A) 결합된 UDP(PDB: 5V2K)가 있는 아라비돕시스 탈리아나 살리실레이트 UDP-글루코실트랜스퍼라제 UGT74F2의 결정 구조를 기반으로 구축된 AbUGT84A27의 상동성 모델. PLA(주황색)는 도킹 시뮬레이션을 기반으로 UDP-덱스트로스(분홍색)과 함께 선호하는 결합 포즈로 표시된다. (B) 도킹된 D-PLA 및 UDP-덱스트로스이 있는 AbUGT 활성 사이트의 확대 뷰. PLA 선택성을 향상시키기 위해 확인된 잠재적 돌연변이(F130Y, L205F, I292Q)가 표시되고; 파선은 추정되는 극성/수소 결합 상호작용을 나타낸다.
도 36은 AbUGT84A27 활성 부위 돌연변이체의 기질 특이성을 예시한다. 이 도는 AbUGT 돌연변이의 발현을 위해 조작된 효모에 의해 공급된 페닐프로파노이드의 글루코사이드로의 전환 백분율의 히트맵을 보여준다. AbUGT 야생형, 활성 부위 돌연변이체 또는 BFP 음성 대조군은 CSY1251의 저 카피 플라스미드에서 발현되었다. 형질전환된 세포를 LC-MS/MS 분석 전에 72시간 동안 500μM PLA, CA 또는 FA가 보충된 선택적 배지에서 배양하였다. 데이터는 n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플 ± 표준 편차의 평균을 나타낸다.
도 37은 트로핀 생산을 위해 조작된 효모에서 PLA 글루코사이드의 단계적 생합성을 검증하는 LC-MS/MS 크로마토그램을 도시한다. 이 도는 PLA 글루코사이드의 단계적 재구성을 위해 조작된 효모 균주의 배양 배지에서 다중 반응 모니터링(MRM) 및 추출된 이온 크로마토그램(EIC) 흔적을 도시한다. 배양 상청액의 LC-MS/MS 분석 전에 균주를 72시간 동안 비-선택적 배지에서 성장시켰다. 크로마토그램 흔적은 세 가지 생물학적 복제물을 나타낸다.
도 38은 효모에서 글루코스의 이중 대사 운명의 생합성 경로 개략도를 도시한다. 이 도는 당분해의 억제를 통한 글루코사이드 생산에 대한 시트레이트의 효과를 예시한다. 약어: HXK, 헥소키나제; GPI, 글루코스-6-포스페이트 이성화효소; PFK, 포스포푸룩토키나제; PGM, 포스포글루코뮤타제; UGP, UDP-글루코스 파이로포스포릴라제.
도 39는 조작된 효모에서 이종성 글루코사이드 생산에 대한 시트레이트 보충의 효과를 예시한다. 이 도는 AbUGT 발현을 위해 조작된 효모에 의한 페닐프로파노이드 산의 글루코사이드로의 전환에 대한 2% 시트레이트 보충의 효과를 도시한다. 균주 CSY1288을 2% 시트레이트를 포함하거나 포함하지 않고, 내인성으로 생산된 PLA의 글루코실화를 평가하기 위한 추가의 보충을 포함하지 않거나, 또는 500 μM 트랜스-신남산 (CA) 또는 트랜스-페룰산 (FA)의 보충을 포함하는 비-선택적 배지에서 배양하였다. 배양물을 LC-MS/MS 분석 전에 72시간 동안 성장시켰다. 데이터는 n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플(개방 원)의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 40은 UDP-글루코스 생합성 효소의 과발현을 위해 조작된 효모 균주에서 상대적인 PLA 글루코사이드 생산을 도시한다. 이 도는 조작된 효모에서 PLA 글루코사이드의 생산에 대한 글루코사이드 전구체 UDP-글루코스의 생합성에 관여하는 천연 효소를 과발현하는 효과를 설명한다. 효소 또는 음성 대조군(BFP)은 균주 CSY1288의 저 카피 플라스미드에서 발현되었다. 균주는 배양 상청액에서 대사산물의 LC-MS/MS 분석 전에 선택적 배지에서 72시간 동안 배양되었다. 데이터는 n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플(개방 원)의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. 통계적 유의성은 해당 대조군에 상대적으로 표시된다.
도 41은 내인성 글루코시다아제에 대한 파괴와 함께 CSY1288에서 상대적인 PLA 글루코사이드 생산을 도시한다. 이 도는 조작된 효모에서 PLA 글루코사이드의 축적에 대한 3개의 천연 글리코시다제 유전자 각각을 파괴하는 효과를 설명한다. 균주는 배양 상청액의 LC-MS/MS 분석 전에 72시간 동안 비-선택적 배지에서 배양되었다. 데이터는 n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플(개방 원)의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. 통계적 유의성은 해당 대조군에 상대적으로 표시된다.
도 42는 AbCYP80F1을 발현하는 조작된 효모 세포에 대한 액체 배양에서 리토린으로부터 의약 TA 전구체 하이오스시아민 알데하이드의 생성을 예시하는 LC-MS/MS 크로마토그램을 보여준다. 이 도는 (R)-리토린을 히오스시아민 알데하이드로 전환하도록 조작된 효모 균주의 LC-MS/MS 분석을 도시한다. 효모 균주는 LEU2 선택 마커, TDH3 프로모터, 및 A. 벨라돈나 (AbCYP80F1)로부터의 리토린 뮤타제 CYP80F1에 대한 코딩 서열을 보유하는 저 카피 CEN/ARS 플라스미드를 갖도록 조작된다. 균주는 추가로 TRP1 선택 마커, TDH3 프로모터, 및 (i) 음성 대조군으로서 BFP, (ii) S. 세레비지아에 CPR (NCP1), 또는 (iii) A. 탈리아나 CPR (AtATR1)에 대한 코딩 서열을 갖는 제2 저 카피 플라스미드를 갖는다. 96웰 딥웰 미세적정 플레이트에서 1mM 리토린이 보충된 300μL 선택적 배지(-Leu-Trp)에서 새로 형질전환된 콜로니로부터 효모를 성장시켰다. 30℃ 및 460rpm의 진탕 배양기에서 48시간 동안 성장시킨 후, 효모를 펠렛화하고 배지 상청액을 LC-MS/MS로 분석하였다. 크로마토그램 흔적은 가장 풍부한 MRM 전이 (m/z+ 288 → 124)를 기반으로 이들 균주에 의해 생산된 하이오스시아민 알데하이드를 보여준다. 각 흔적은 세 가지 샘플을 나타낸다.
도 43은 하이오스시아민 6β-하이드록실라제/디옥시게나제(H6H)의 오쏘로그를 발현하는 조작된 효모 세포에 대한 액체 배양물에서 의약 TA 하이오스시아민으로부터 의약 TA 스코폴라민의 생산을 예시한다. 이 도는 H6H 오쏘로그를 발현하는 조작된 효모 균주에 의한 (S)-하이오스시아민의 (S)-스코폴라민으로의 전환을 도시한다. 효모 균주는LEU2 선택 마커, TDH3 프로모터, 및 음성 대조군으로부터 BFP에 대한 코딩 서열 또는 D. 스트라모늄 ( DsH6H ), A. 아쿠탄굴루스 ( AaH6H ), B. 아르보레아 ( BaH6H ), 또는 D. 메텔 ( DmH6H )로부터의 H6H 변이체를 보유하는 저 카피 CEN/ARS 플라스미드를 갖도록 조작된다. 효모는 96웰 딥웰 미세적정 플레이트에서 1mM 하이오스시아민이 보충된 300μL 선택적 배지(-Leu)에서 새로 형질전환된 콜로니로부터 성장되었다. 30℃ 및 460rpm의 진탕 배양기에서 48시간 동안 성장시킨 후, 효모를 펠렛화하고 배지 상청액을 LC-MS/MS로 분석하였다. 데이터는 3회의 생물학적 복제물의 평균을 나타내며 공급된 하이오스시아민에 있는 스코폴라민 오염물의 양으로 정규화되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 상대 스코폴라민 역가는 m/z+ 304 → 138 MRM 전이의 피크 면적을 기준으로 정량화되었다.
도 44는 DsH6H를 발현하는 조작된 효모 세포의 액체 배양물에서 하이오스시아민의 스코폴라민으로의 전환에 대한 배지에서의 보조인자 이용가능성 및 보충의 효과를 예시한다. 이 도는 조작된 효모에서 (S)-하이오스시아민의 (S)-스코폴라민으로의 전환에 대한 보조인자 보충의 효과를 도시한다. 효모 균주는 LEU2 선택 마커, TDH3 프로모터, 및 D. 스트라모늄 (DsH6H)로부터 (i) 음성 대조군으로서 BFP 또는 (iii) 하이오스시아민 6β-하이드록실라제/디옥시게나제에 대한 코딩 서열을 보유하는 저 카피 CEN/ARS 플라스미드를 갖도록 조작된다. 효모는 96웰 딥웰 미세적정 플레이트에서 표시된 기질 및/또는 보조인자가 보충된 300μL 선택적 배지(-Leu)에서 새로 형질전환된 콜로니로부터 성장되었다. 30℃ 및 460rpm의 진탕 배양기에서 48시간 동안 성장시킨 후, 효모를 펠렛화하고 배지 상청액을 LC-MS/MS로 분석하였다. 상대 (S)-스코폴라민 역가는 m/z+ 304 → 138 MRM 전이의 적분 피크 면적을 기반으로 정량화되고 DsH6H를 발현하는 균주 및 모든 보충된 보조인자 및 기질로 정규화되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. Hyo, (S)-히오스시아민; 2-OG, 2-옥소글루타레이트; L-AA, L-아스코르브산.
도 45는 조직 공동발현 데이터의 분석을 통해 A. 벨라돈나 전사체로부터 확인된 하이오스시아민 탈수소효소 유전자 후보의 계층적 클러스터링 히트맵을 도시한다. 이 도는 잠재적으로 하이오스시아민 탈수소효소 활성을 가진 효소를 인코딩하는 A. 벨라돈나 전사체에서 전사체의 조직 특이적 발현 프로필의 클러스터링을 보여준다. 각 후보에 대한 성적표 표현식은 정규 분포를 사용하여 행별로 확장된다. 덴드로그램은 조직 특이적 발현 프로필에 의한 후보자의 계층적 클러스터링을 나타낸다. 알려진 TA 경로 유전자는 이름으로 식별되고; 추정 HDH 후보는 유전자좌 ID로 표시된다. 검은색 삼각형은 활동을 위해 선별된 후보자를 나타내고; 이중 검은색 삼각형은 실험적으로 검증된 HDH 활성을 가진 후보를 나타낸다.
도 46은 하이오스시아민 탈수소효소(HDH) 후보를 발현하는 조작된 효모 세포의 액체 배양물에서 리토린으로부터 의약 TA 스코폴라민의 생산을 예시한다. 이 도는 조작된 효모에서 A. 벨라돈나의 전사체에서 확인된 HDH 후보의 활성에 대한 실험적 스크리닝을 보여준다. 효모 균주는 게놈 내로 통합된 발현 카세트 내의 구성적 프로모터로부터 A. 벨라돈나 리토린 뮤타제 (AbCYP80F1) 및 D. 스트라모늄 하이오스시아민 6β-하이드록실라제/디옥시게나제 (DsH6H),뿐만 아니라 TRP1 선택 마커 및 TDH3 프로모터를 보유하는 저 카피 CEN/ARS 플라스미드로부터의 13개의 HDH 후보 각각의 하나를 발현하도록 조작된다. 96웰 딥웰 미세적정 플레이트에서 1mM 리토린이 보충된 300μL 선택적 배지(-Trp)에서 새로 형질전환된 콜로니로부터 효모를 성장시켰다. 30℃ 및 460rpm의 진탕 배양기에서 72시간 동안 성장시킨 후, 효모를 펠렛화하고 배지 상청액을 LC-MS/MS로 분석하였다. 상대 하이오스시아민 알데하이드 역가는 m/z+ 288 → 124 MRM 전이의 적분 피크 면적을 기반으로 정량화되었고 HDH 후보 대신 BFP를 발현하는 조작된 균주의 것으로 정규화되었다. (S)-스코폴라민 역가는 m/z+ 304 → 138 MRM 전이의 적분 피크 면적과 진정한 스코폴라민 표준의 표준 곡선을 기반으로 정량화되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 47은 A. 벨라돈나의 하이오스시아민 탈수소효소의 3차원 구조를 나타낸 것이다. 이 도는 주형으로서 포퓰러스 트레물로이데스 스나필 알코올 탈수소효소 (PtSAD; PDB: 1YQD)의 결정 구조 기반으로 구축된 상동성 모델로서 AbHDH의 구조를 카툰로 나타낸 것이다. NADPH 및 Zn2 +가 활성 부위에 표시된다. 삽입된 상자는 NADPH 및 도킹된 하이오스시아민 알데하이드가 있는 AbHDH 활성 부위의 확대된 뷰를 보여준다. 파선은 촉매 작용에 중요한 상호 작용을 나타낸다.
도 48은 UniProt/SwissProt 데이터베이스에서 가장 가까운 단백질 히트와 함께 3개의 확인된확인된 HDH 오쏘로그 (AbHDH, DiHDH, DsHDH)의 계통발생 나무를 도시한다. 이 도는 UniProt/SwissProt 데이터베이스의 BLAST 검색을 기반으로 밀접하게 관련된 단백질 서열을 가진 3개의 식별된 HDH 효소 오쏘로그의 클러스터링을 도시한다. 표시된 서열에는 E-값을 기반으로 한 상위 50개의 BLASTp 히트,뿐만 아니라 다음 100개 순위에서 선택된 10개의 추가 히트가 포함된다. ClustalX2에서 n = 1000번의 시도로 부트스트랩 이웃 결합을 통해 계통 발생적 관계가 유래되었으며 결과 나무는 FigTree 소프트웨어로 시각화되었다. 약어: ADH, 알코올 탈수소효소; CADH, 신나밀 알코올 탈수소효소; MTDH, 만니톨 탈수소효소; DPAS, 데하이드로프레콘딜로카핀 아세테이트 합성효소; 8HGDH, 8-하이드록시게라니올 탈수소효소; GDH, 게라니올 탈수소효소; GS, 가이소스키진 합성효소; REDX, 불특정된 산화환원 단백질.
도 49는 하이오스시아민 탈수소효소 오쏘로그를 발현하는 조작된 효모 세포의 액체 배양물에서 리토린으로부터 의약 TA 스코폴라민의 생산을 예시한다. 이 도는 조작된 효모에서 발현되는 확인된 HDH 효소 오쏘로그 간의 활성 비교를 예시한다. 효모 균주는 게놈 내로 통합된 발현 카세트 내의 구성적 프로모터로부터 A. 벨라돈나 리토린 뮤타제 (AbCYP80F1) 및 D. 스트라모늄 하이오스시아민 6β-하이드록실라제/디옥시게나제 (DsH6H),뿐만 아니라 TRP1 선택 마커 및 TDH3 프로모터를 보유하는 저 카피 CEN/ARS 플라스미드로부터의 각 3개의 HDH 오쏘로그 (AbHDH, DiHDH, DsHDH) 중 하나, 및 LEU2 선택 마커 및 TDH3 프로모터를 보유하는 저 카피 CEN/ARS 플라스미드로부터 DsH6H의 추가 카피를 발현하도록 조작된다. 96웰 딥웰 미세적정 플레이트에서 1mM 리토린이 보충된 300㎕ 선택적 배지(-Leu -Trp)에서 새로 형질전환된 콜로니로부터 효모를 성장시켰다. 30℃ 및 460rpm의 진탕 배양기에서 72시간 동안 성장시킨 후, 효모를 펠렛화하고 배지 상청액을 LC-MS/MS로 분석하였다. 상대 하이오스시아민 알데하이드 역가는 m/z+ 288 → 124 MRM 전이의 적분 피크 면적을 기반으로 정량화되었고 DsH6H 대신 AbHDH 및 BFP를 발현하는 조작된 균주의 것으로 정규화되었다. (S)-스코폴라민 역가는 m/z+ 304 → 138 MRM 전이의 적분 피크 면적과 진정한 스코폴라민 표준의 표준 곡선을 기반으로 정량화되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 50은 CYP80F1, HDH 및 H6H의 발현을 위해 조작된 효모에 의한 공급된 리토린의 스코폴라민으로의 전환의 실험적 검증을 예시한다. 이 도는 리토린을 스코폴라민으로 전환하도록 조작된 효모 균주의 배양 배지에서 다중 반응 모니터링(MRM) LC-MS/MS 흔적을 도시한다. 균주는 배양 상청액에서 대사산물의 LC-MS/MS 분석 전에 1mM 리토린이 보충된 비-선택적 배지에서 72시간 동안 배양되었다. 오른쪽 하단 패널(CSY1294, 스코폴라민)의 어두운 흔적은 125nM(38μg/L) 스코폴라민 표준을 나타낸다. 크로마토그램 흔적은 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
도 51은 SCPL 아실트랜스퍼라제(SCPL-AT)에 대한 정식 식물 ER-대-액포 트래피킹 및 성숙 경로를 도시한다. 이 도는 A. 벨라돈나 리토린 합성효소(AbLS)가 예로 표시된 식물에서 SCPL-AT가 뒤따르는 전형적인 ER-대-액포 단백질 트래피킹 경로의 도식적 표현을 도시한다. 원으로 표시된 숫자는 (1) ER 내강 및 (2) 골지, (3) 액포로 트래피킹, 및 액포 (4) 기질 도입 및 (5) 생성물 방출에서 성숙을 포함하여 SCPL-AT 발현 및 활동의 주요 단계를 나타낸다.
도 52는 조작된 효모에서 발현된 A. 벨라돈나로부터의 야생형 리토린 합성효소의 공동 국소화를 나타낸다. 이 도는 N 말단 GFP-태깅된 AbLS(GFP-AbLS)의 발현을 위해 조작되고 액포 막 염색 FM4-64로 염색된 효모의 형광 현미경검사를 도시한다. 저 카피 플라스미드에서 GFP-AbLS를 발현하는 CSY1294에 대해 현미경 검사를 수행하였다. 스케일 바, 5μm.
도 53은 신호 서열 대체를 통한 상이한 효모 세포내 구획으로의 리토린 합성효소의 강제 국소화를 위한 전략을 예시한다. 이 도는 다른 구획에서 기질 가용성에 대한 잠재적인 제한을 해결하기 위해 AbLS의 세포 아래 국소화를 수정하는 단백질 공학 접근 방식을 도시한다. (A) 신호 서열 스와핑을 통한 AbLS의 국소화를 표적으로 하는 효모 세포내 구획의 개략도. 신호 서열 소스 단백질은 각 구획에 대해 표시된다. (B) AbLS 신호 서열 대체를 위해 선택된 말단 및 잔기. 각 신호 서열 도메인을 포함하는 잔기는 UniProt/SwissProt 데이터베이스의 구조적 주석을 기반으로 선택되었다.
도 54는 담배에서 발현되고 데글리코실라제로 처리된 야생형 AbLS의 웨스턴 블롯을 도시한다. 이 도는 식물에서 발현되는 AbLS에 대한 글리코실화 변형 유형의 식별을 보여준다. C-말단 HA-태깅된 AbLS는 아그로침투를 통해 N. 벤타미아나 잎에서 일시적으로 발현되었다. 조 잎 추출물은 처리하지 않았거나(레인 1: '--') N-글리코시다제 F(PNGase F, 레인 2: 'N') 또는 O-글리코시다제(레인 3: 'O')로 처리하여 N- 또는 O-연결된 글리코실화, 각각을 제거하였다. 조 추출물을 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔에서 전기영동으로 분리한 다음, 키메라 토끼 IgG 항-HA HRP-접합 항체를 사용한 면역검출을 위해 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 모든 전기영동 및 블랏팅 단계는 이황화물 환원 조건에서 수행되었다(온라인 방법 참조). 레인(Lane) 'L', Bio-Rad Precision Plus Dual Color 단백질 사다리.
도 55는 효모 및 담배에서 발현된 AbLS 글리코실화 부위 돌연변이체의 웨스턴 블랏을 보여준다. 이 도는 효모와 담배에서 발현되는 AbLS에 대해 존재하는 N-글리코실화 패턴의 비교를 도시한다. C-말단 HA-태깅된 야생형 AbLS, 단일 글리코실화 부위 점 돌연변이체(N → Q) 또는 사중 돌연변이체는 N. 벤타미아나 ('Nb') (A)에서 아그로침윤을 통해 또는 CSY1294 ('효모') (B)에서 저 카피 플라스미드로부터 일시적으로 발현되었다. 담배 및 효모 조 추출물의 제조는 변성, 이황화물 환원 조건에서 수행되었다(온라인 방법 참조). 조 추출물을 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔에서 전기영동으로 분리한 다음, 키메라 토끼 IgG 항-HA HRP-접합 항체를 사용한 면역검출을 위해 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 모든 전기영동 및 블랏팅 단계는 이황화물 환원 조건에서 수행되었다(온라인 방법 참조). (A) 및 (B)의 경우, 해당 효모 및 담배 발현 대조군이 비교를 위해 포함된다. 레인 'L', Bio-Rad Precision Plus Dual Color 단백질 사다리.
도 56은 리토린 합성효소에서 추정 내단백질분해 프로펩타이드 제거의 계통발생학적 확인을 도시한다. 이 도는 단백질 분해로 제거된 내부 프로펩타이드 링커(볼드체, 회색)를 보유(AtSCT, AsSCPL1, TaCBP2)하거나 결여(AtSMT, yPRC1)하는 것으로 알려진 특성화된 세린 카르복시펩티다제 및 SCPL 아실트랜스퍼라제가 있는 AbLS의 서열 정렬을 도시한다. 추정되는 N-말단 신호 펩타이드는 볼드체(흑색)로 표시되고; 이황화 결합은 연결선으로 표시된다. AtSCT, 아라비돕시스 탈리아나 시나포일글루코스: 콜린 시나포일트랜스퍼라제; AtSMT, A. 탈리아나 시나포일글루코스:말레이트 시나포일트랜스퍼라제; AbLS, 아트로파 벨라돈나 리토린 합성효소; AsSCPL1, 아베나 스트리고사 아베나신 합성효소; TaCBP2, 트리티쿰 아에스티범 카복시펩티다아제 2; yPRC1, 효모 카복시펩티다아제 Y. 상부에서 하부로: 서열번호: 30-35.
도 57은 리토린 합성효소에서 추정 내단백질분해 프로펩타이드 제거의 구조적 확인을 보여준다. 이 도는 두 SCPL-AT의 3차원 구조를 비교한 것인데, 그 중 하나는 단백질 분해로 제거된 내부 프로펩타이드 서열을 포함하는 것으로 알려져 있다. 좌측: 디설파이드 결합 및 내부 프로펩티드 제거 부위를 나타내는 (상부) 카툰 및 (하부) 표면 표현에서의 TaCBP2의 결정 구조 (PDB: 1WHT). 우측: 활성 부위 접근을 차단하는 것으로 보이는 N-말단 신호 펩티드, 디설파이드 결합, 및 추정 내부 프로펩티드를 나타내는 (상부) 카툰 및 (하부) 표면 표현에서 TaCBP2의 결정 구조를 기초로 한 AbLS의 상동성 모델.
도 58은 효모에서 AbLS 분할 대조군 및 추정 프로펩타이드-교환 변이체에 대한 단백질 분해 절단 패턴의 분석을 도시한다. 이 도는 조작된 효모에서 발현된 AbLS 분할 대조군 및 프로펩타이드 변이체에 의해 생성된 단백질 단편 크기의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. C-말단 HA-태깅된 AbLS 변이체는 CSY1294(레인 1-6)의 저 카피 플라스미드에서 발현되었고; 니코티아나 벤타미아나(Nb)에서 발현된 HA-태깅된 야생형 AbLS는 추가 대조군(레인 7)으로 표시된다. 겔 전기영동 및 블로팅은 이황화물 환원 조건에서 수행되었고 검출은 항-HA 항체를 사용하여 수행되었다(온라인 방법 참조). 레인 기호: L, 단백질 분자량 사다리; WT, 야생형 AbLS; SPL, 양 단편 상의 신호 펩타이드가 있는 추정 프로펩타이드에서 분할된 AbL; 어느 하나의 단편 상에 신호 펩타이드도 없는 추정 프로 펩타이드에서 분할된 SPL-T, AbLL; 가요성 Gly-Ser 링커가 교체된 야생형 프로펩타이드가 있는 GS, AbLS 변이체; AtSCT 프로펩타이드 서열이 교체된 야생형 프로펩타이드를 갖는 SCT, AbLS 변이체; Kex2p 프로테아제에 의해 인식되고 절단된 합성 폴리-아르기닌 부위이 교체된 야생형 프로펩타이드를 갖는 CUT, AbLS 변이체.
도 59는 AbLS N-말단 융합체의 발현을 위해 조작된 효모 균주에서 새로운 하이오스시아민 및 스코폴라민 생산을 예시한다. 이 도는 N-말단에 융합된 다양한 가용성 단백질 도메인을 가진 AbLS를 발현하는 효모 균주에서 새로운 하이오스시아민과 스코폴라민 생산의 비교를 도시한다. 야생형(대조군) 또는 AbLS 융합체는 CSY1294의 저 카피 플라스미드에서 발현되었다. 형질전환된 균주는 배양 상청액에서 대사산물의 LC-MS/MS 분석 전에 선택적 배지에서 96시간 동안 배양되었다. 데이터는 n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플(개방 원)의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 60은 액포 TA 수송 제한의 완화를 위해 CSY1296에서 발현되는 담배 알칼로이드 수송체의 형광 현미경검사을 도시한다. 이 도는 C-말단에서 GFP에 융합된 담배 알칼로이드 운반체를 발현하는 조작된 효모의 형광 현미경검사 이미지를 보여주어 세포 아래 국소화를 식별할 수 있도록 한다. (A) NtJAT1 및 (B) NtMATE2의 C-말단 GFP 융합은 CSY1296의 저 카피 플라스미드에서 발현되었다. 스케일 바, 5μm.
도 61은 이종성 알칼로이드 수송체의 발현을 위해 조작된 CSY1296에서 트로핀, 히오스시아민 및 스코폴라민의 생산을 도시한다. 이 도는 TA 생산을 위해 조작된 효모에서 세포내 기질 수송 제한을 완화시키는 데 있어 다른 식물 알칼로이드 수송체의 유용성을 도시한다. 니코티아나 타바큠 자스모네이트-유도성 알칼로이드 수송체 1 (NtJAT1), 다중약물 및 독소 압출 (MATE) 수송체 1 또는 2, 또는 음성 대조군 (BFP)은 CSY1296의 저 카피 플라스미드에서 발현되었다. 형질전환된 균주는 배양 상청액에서 대사산물의 LC-MS/MS 분석 전에 선택적 배지에서 96시간 동안 배양되었다. 데이터는 n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플(개방 원)의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 62는 조작된 효모에서 비-천연 TA 신나모일트로핀의 새로운 생성을 보여주는 (A) 생성물 이온 모드 및 (B) 다중 반응 모니터링 모드의 LC-MS/MS 크로마토그램을 도시한다. 이 도는 비-천연 TA 신나모일트로핀을 생산하는 조작된 효모 균주의 LC-MS/MS 분석을 도시한다. (A) (i) 트로핀 생성 균주 CSY1251; (ii) 페닐알라닌 암모니아-분해효소 (AtPAL1), 4-쿠마레이트-CoA 리가제 5 (At4CL5), 및 CSY1282로 나타낸 코카인 합성효소 (EcCS)를 발현하는 CSY1251; 또는 (iii) m/z+ = 272의 모체 질량에 대한 진정한 신나모일트로핀 표준의 세포외 배지의 탠덤 MS/MS 스펙트럼. 청색 다이아몬드는 모 화합물 피크를 나타낸다. (B) 기질 공급을 통한 신남산 및 α-트로핀에 대한 EcCS 아실트랜스퍼라제 활성의 검증. 균주는 AtPAL1(저 카피 플라스미드 pCS4252) 및/또는 At4CL5 및 EcCS(고 카피 플라스미드 pCS4207)를 발현하는 플라스미드의 조합으로 형질전환된 후, 다음과 같이 서로 다른 보충 기질이 있는 배지에서 배양되었다: (i) CEN.PK2 + At4CL5 + EcCS + 0.1 mM 트랜스-신남산; (ii) CEN.PK2 + At4CL5 + EcCS + 0.5 mM α-트로핀; (iii) CEN.PK2 + AtPAL1 + At4CL5 + EcCS; (iv) CEN.PK2 + AtPAL1 + At4CL5 + EcCS + 0.5 mM α-트로핀; (v) CSY1251 + At4CL5 + EcCS; (vi) CSY1251 + At4CL5 + EcCS + 0.2 mM 트랜스-신남산; (vii) CSY1251 + AtPAL1 + At4CL5 + EcCS; (viii) 25 nM 신나모일트로핀 표준. (A) 및 (B)의 경우, 효모 균주를 LC-MS/MS 분석 전에 72시간 동안 25℃에서 선택적 배지(YNB-DO + 2% 덱스트로스 + 5% 글리세롤)에서 배양하였다.
도 63은 조작된 효모의 액체 배양물에서 트로핀 및 관련 TA 전구체의 생산에 대한 (A) 단독 또는 (B) 덱스트로스와 함께 공급된 다양한 탄소 공급원의 영향을 예시한다. 이 도는 조작된 효모에서 트로핀 생산을 개선하기 위한 탄소 공급원의 최적화를 도시한다. 트로핀 생산 균주 CSY1249(실시예 3.3.4 참조)의 밤새 배양물을 비-선택적 풍부 배지(YPD)에서 성장시켰다. 밤새 배양물을 펠릿화하고 모든 아미노산 및 (A) 각 탄소 공급원의 2% 또는 (B) 2% 덱스트로스와 덱스트로스를 포함한 각 추가 탄소 공급원의 2%를 포함하는 비-선택적 한정 배지(YNB-SC)에 재현탁하였다. LC-MS/MS에 의한 성장 배지 분석 전에 배양물을 25℃에서 48시간 동안 성장시켰다. 데이터는 (A) 2% 덱스트로스 또는 (B) 2% + 2% 덱스트로스로 정규화된 각 대사산물의 상대 역가를 도시한다. 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 64는 스코폴라민 생산 균주 CSY1296의 대사 병목 분석을 예시한다. 이 도는 조작된 효모에서 TA 및 TA 전구체의 생산에 대한 플럭스 제한 효소의 추가 카피를 발현하는 효과를 도시한다. 트로핀과 스코폴라민 사이의 각 생합성 효소의 추가 카피는 균주 CSY1296의 다음의 저 카피 플라스미드에서 발현되었다: (A) WfPPR, pCS4436; (B) AbUGT, pCS4440; (C) DsRed-AbLS, pCS4526; (D) AbCYP80F1, pCS4438; (E) DsHDH, pCS4478; (F) DsH6H, pCS4439; 또는 각각의 생합성 유전자 플라스미드와 동일한 영양요구성 마커에 해당하는 BFP 대조군(pCS4208, pCS4212 또는 pCS4213). 형질전환된 균주는 LC-MS/MS에 의한 성장 배지의 대사산물 정량화 전에 96시간 동안 25℃에서 적절한 선택적 배지에서 배양되었다. 데이터는 n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플(개방 원)의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 65는 조작된 효모에서 하이오스시아민 및 스코폴라민 생산에 대한 플럭스 및 수송 제한을 완화시키는 효과를 도시한다. 이 도는 효모 균주 CSY1296 및 CSY1297에서 새로운 하이오스시아민과 스코폴라민 생산의 비료를 도시하고, 후자는 플럭스-제한 효소 (WfPPR 및 DsH6H)의 추가의 게놈 카피뿐만 아니라 담배 액포 알칼로이드 이입기 (NtJAT1)를 보유한다. 균주는 배양 상청액에서 대사산물의 LC-MS/MS 분석 전에 96시간 동안 비-선택적 배지에서 배양되었다. 데이터는 n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플(개방 원)의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 스튜던트 2-테일드 t-시험: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
정의
본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용되는 용어의 의미 및 범위를 예시하고 정의하기 위하여 다음과 같은 정의를 제시한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. Singleton, 등, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), Hale & Markham, THE HARPER Collins DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991)은 본원에 사용된 많은 용어의 일반적인 의미를 당업자에게 제공한다. 그러나 명확성과 참조의 용이성을 위해 특정 용어가 아래에 정의되어 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 점에 유의한다. 예를 들어, 용어 "프라이머"는 하나 이상의 프라이머, 즉 단일 프라이머 및 다중 프라이머를 나타낸다. 청구 범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성되었음을 추가로 유의한다. 이와 같이, 이 진술은 청구 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단독", "오직" 등과 같은 배타적 용어의 사용에 대한 선행 근거로 사용하기 위한 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "결정하는", "측정하는", "평가하는" 및 "분석하는"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며 양적 및 정성적 결정을 모두 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 길이가 2-50개 아미노산 범위인 펩타이드 및 길이가 50개 아미노산을 초과하는 폴리펩타이드를 포함하는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭한다. "폴리펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "폴리펩타이드"는 코딩된 아미노산 및 코딩되지 않은 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산의 중합체, 및 통상적인 골격이 비자연 발생 또는 합성 골격으로 대체된 변형된 펩타이드 골격을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드는 임의의 편리한 길이, 예를 들어, 2개 이상의 아미노산, 예컨대 4개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 20개 이상의 아미노산, 50개 이상의 아미노산, 100개 이상의 아미노산, 300개 이상의 아미노산, 예컨대 최대 500 또는 1000개 이상의 아미노산일 수 있다. "펩타이드"는 2개 이상의 아미노산, 예컨대 4개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 20개 이상의 아미노산, 예컨대 최대 50개의 아미노산일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 길이가 5 내지 30개 아미노산이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 적어도 60% 유리, 적어도 75% 유리, 적어도 90% 유리, 적어도 95% 유리, 적어도 98% 유리, 및 심지어 정제 전에 모이어티와 관련된 다른 성분이 99% 이상 유리된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에 의해 인코딩되는"은 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 핵산 서열을 지칭하며, 여기서 폴리펩타이드 서열 또는 그의 일부는 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드로부터 아미노산 서열 of 3개 이상의 아미노산, 예컨대 5 이상, 8 이상, 10 이상, 15 이상, 또는 20개 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 함유한다. 또한, 이 용어는 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드와 면역학적으로 식별가능한 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
"벡터"는 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터 작제물", "발현 벡터" 및 "유전자 전달 벡터"는 관심 유전자의 발현을 지시할 수 있고 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 의미하도록 상호교환가능하게 사용되며, 이는 벡터의 전부 또는 일부의 게놈 통합, 또는 염색체외 요소로서의 벡터의 일시적 또는 유전가능한 유지에 의해 달성된다. 따라서, 이 용어는 클로닝, 발현 비히클, 통합 벡터를 포함한다.
"발현 카셋트"는 발현 카셋트의 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 유전자/코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 포함한다. 이러한 카셋트는 발현 카셋트를 표적 세포로 전달하기 위해 "벡터", "벡터 작제물", "발현 벡터" 또는 "유전자 전달 벡터"로 구성된다. 따라서, 이 용어는 클로닝 및 발현 비히클뿐만 아니라 바이러스 벡터를 포함한다.
"복수"에는 적어도 2명의 구성원이 함유된다. 특정 경우에, 복수는 10 이상, 예컨대 100 이상, 1000 이상, 10,000 이상, 100,000 이상, 106 이상, 107 이상, 108 이상, 또는 109 이상의 구성원을 가질 수 있다. 임의의 구현예에서, 복수는 2-20개의 구성원을 가질 수 있다.
용어 "트로판 알칼로이드 생성물"은 사이클로헵탄 고리 및 탄소 원자 1과 5를 연결하는 질소 다리를 포함하는 8-아자비사이클로[3.2.1]옥탄 코어 그룹을 골격에 포함하는 임의의 분자를 지칭하도록 의도되며, 8-아자바이사이클로[3.2.1]옥타닐 기는 3 위치에서 에스테르 결합에 의해 아실 기에 공유 결합되고/되거나 여기서 8-아자비시클로[3.2.1]옥타닐 기는 3 위치에서 하이드록실 기, 2, 4, 5, 6 및/또는 7 위치에 하나 이상의 하이드록실 기로 관능화된다. 트로판 알칼로이드 생성물에는 리토린, 하이오스시아민, 아트로핀, 아니소다민, 스코폴라민, 코카인 및 기타 유사한 트로핀/슈도트로핀 + 아실기 천연 또는 비-천연 트로판 알칼로이드(예를 들어, 칼리스테긴)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "트로판 알칼로이드 생성물의 전구체"는 탄소 공급원 및 질소 공급원으로부터 유기체에 의해 생합성될 수 있고 하나 이상(예를 들어, 하나 이상의 또는 2) 생합성 단계에서 트로판 알칼로이드 생성물로 전환될 수 있는 임의의 분자를 지칭하기 위한 것이고; 여기서 탄소 공급원은 탄수화물, 비탄수화물 당, 당 알코올, 지질, 지방산, 또는 대사 경로를 통해 상기 탄소 공급원 중 하나 이상으로 전환되는 기질이고; 질소 공급원은 암모니아, 우레아, 니트레이트, 아질산염, 글루탐산, 아르기닌, 오르니틴, 및 시트룰린을 제외하는 임의의 아미노산, 펩타이드, 단백질, 또는 대사 경로를 통해 상기 질소 공급원 중 하나로 전환되는 임의의 기질이다.
"트로판 알칼로이드 생성물의 유도체"라는 용어는 변형되지 않은 유기체에 의해 자연적으로 생성되지 않은 임의의 분자를 지칭하도록 의도되며, 분자의 골격은 트로판 알칼로이드 생성물을 포함하고 골격 자체의 변형 없이 작용기의 부착에 의해 상기 트로판 알칼로이드 생성물과 다르다. 본원에 사용된 바와 같이, 작용기의 부착은 하이드록실화, 알킬화 및 N-알킬화, 아세틸화 및 N-아세틸화, 아실화 및 N-아실화, 및 할로겐화를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
숫자 범위에는 범위를 정의하는 숫자가 포함된다.
여기에 설명된 방법은 여러 단계를 포함한다. 각 단계는 원하는 대로 단계 사이에 미리 결정된 시간이 경과한 후에 수행될 수 있다. 이와 같이, 각 단계를 수행하는 사이의 시간은 1초 이상, 10초 이상, 30초 이상, 60초 이상, 5분 이상, 10분 이상, 60분 이상일 수 있고 5시간을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 후속 단계는 이전 단계의 완료 직후에 수행된다. 다른 구현예에서, 단계는 인큐베이션 또는 이전 단계의 완료 후 대기 시간, 예를 들어 몇 분 내지 밤새 대기 시간 후에 수행될 수 있다.
용어의 다른 정의는 명세서 전체에 걸쳐 나타날 수 있다.
상세한 설명
하이오스시아민 및 스코폴라민과 같은 관심 대상인 트로판 알칼로이드(TA)를 생성하도록 조작된 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는 하기로부터 선택된 하나 이상의 조작된 변형을 가질 수 있다: 효소 유전자의 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제; 생합성 효소 유전자의 전사 조절 변형; 효소의 불활성화 돌연변이; 및 이종성 코딩 서열. 또한, 본 발명의 방법에서 사용되는 숙주 세포 및 조성물, 예를 들어 키트, 시스템 등을 사용하여 관심 있는 TA를 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명을 보다 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 설명된 특정 실시예로 제한되지 않고 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 명백히 달리 지시되지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이의 하한 단위의 1/10까지의 각각의 개재 값 및 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 또는 개재 값이 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있고 또한 본 발명에 포함되며, 언급된 범위에서 구체적으로 배제된 제한이 적용된다. 명시된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우 포함된 제한 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
특정 범위는 "약"이라는 용어가 앞에 오는 수치 값과 함께 본원에 제시된다. "약"이라는 용어는 앞에 오는 정확한 숫자뿐만 아니라 그 용어가 앞에 오는 숫자에 가깝거나 대략적인 숫자에 대한 문자 그대로의 지원을 제공하기 위해 여기에서 사용된다. 숫자가 구체적으로 인용된 숫자에 가깝거나 대략적인지 여부를 결정할 때, 인용되지 않은 숫자에 가깝거나 근사한 숫자는 제공된 문맥에서 구체적으로 언급된 숫자와 실질적으로 등가를 제공하는 숫자일 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 또한 사용될 수 있지만, 이제 대표적인 예시적인 방법 및 재료가 기재되어 있다.
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되고 참조에 의해 여기에 포함되어 관련 방법 및/또는 재료를 개시하고 설명하는 것처럼 여기에 참조로 포함된다. 간행물이 인용된다. 모든 공보의 인용은 출원일 이전의 공개를 위한 것이며 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 간행물보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한 제공된 발행일은 실제 발행일과 다를 수 있으므로 별도로 확인해야 할 수 있다.
본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 기재되고 예시된 각각의 개별 구현예는 본 발명의 범주 또는 취지로부터 벗어나지 않으면서 다른 여러 구현예 중 임의의 것으로부터 용이하게 분리되거나 또는 그와 조합될 수 있는 개별 성분 및 특색을 갖는다. 인용된 방법은 인용된 사건의 순서 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행된다.
본 발명을 추가로 설명함에 있어서, 관심 있는 TA 전구체, TA, 및 TA의 유도체를 포함하는 TA의 변형이 먼저 보다 상세하게 설명되고, 이어서 이를 생성하기 위한 숙주 세포가 설명된다. 다음으로, 숙주 세포가 사용되는 관심 방법을 검토한다. 본 발명의 방법을 실행하는데 사용될 수 있는 키트가 또한 기술된다.
트로판 알칼로이드(TA) 전구체
상기 요약된 바와 같이, 트로판 알칼로이드 전구체(TA 전구체)를 생성하는 숙주 세포가 제공된다. TA 전구체는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이) 관심 있는 TA의 생성을 유도하는 합성 경로(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)에서 임의의 중간체 또는 전구체 화합물일 수 있다. 일부 경우에, TA 전구체는 TA 또는 그의 유도체로 특성화될 수 있는 구조를 갖는다. 특정 경우에, TA 전구체는 TA의 단편으로 특성화될 수 있는 구조를 갖는다. 일부 경우에, TA 전구체가 초기 TA이다. 본원에 사용된 바와 같이, "초기 TA"란, 세포에서 관심 있는 TA의 합성에서 초기 중간체를 의미하며, 초기 TA는 숙주 세포 공급원료 또는 단순 출발 화합물로부터 숙주 세포에 의해 생성된다. 일부 경우에, 초기 TA는 세포에 출발 화합물을 첨가할 필요 없이 숙주 세포 공급원료(예를 들어, 탄소 및 영양 공급원)만으로 대상 숙주 세포에 의해 생성되는 TA 중간체이다. 초기 TA라는 용어는 초기 TA 자체가 트로판 알칼로이드로 특성화될 수 있는지 여부에 관계없이 관심 있는 TA 최종 생성물의 전구체를 나타낼 수 있다.
일부 경우에, TA 전구체는 프리-트로핀 트로판 알칼로이드 또는 프리-리토린 트로판 알칼로이드와 같은 초기 TA이다. 이와 같이, 프리-트로핀 트로판 알칼로이드(프리-트로핀 TA) 및 프리-리토린 트로판 알칼로이드(프리-리토린 TA)를 생성하는 숙주 세포가 제공된다. 트로핀은 리토린에서 유래된 의약 TA 생성물과 같은 최종 생성물을 생산하기 위한 세포 공학 노력을 통해 다운스트림 TA의 합성에 관심이 있는 주요 분기점 중간체이다(도 2). 대상 숙주 세포는 트로핀, 리토린 및 다운스트림 TA 최종 생성물의 생산에 사용될 수 있는 간단하고 저렴한 출발 물질로부터 TA 전구체를 생산할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사전 에스테르화 트로판 알칼로이드", "사전 에스테르화 TA" 및 "사전 에스테르화 TA 전구체"는 상호교환적으로 사용되며 에스테르화 전구체 자체의 구조가 트로판 알칼로이드로서 특성화되든지 그렇지 않든지 간에 리토린, 신나모일트로핀, 또는 아실 공여체 및 아실 수용체 에스테르화의 다른 생성물의 생합성 전구체를 지칭한다. 사전 에스테르화 TA라는 용어는 리토린과 같은 에스테르화 생성물을 유도할 수 있는 숙주 세포 생합성 경로의 임의의 편리한 구성원의 생합성 전구체, 중간체 및 이의 대사산물을 포함하는 것을 의미한다. 일부 경우에, 사전 에스테르화 TA는 트로핀 단편, 페닐프로파노이드 단편 또는 이들의 전구체 또는 유도체와 같은 트로판 알칼로이드 단편을 포함한다. 특정 예에서, 사전 에스테르화 TA는 트로판 알칼로이드 또는 그의 유도체로 특성화될 수 있는 구조를 갖는다.
관심 있는 TA 전구체에는 트로핀 및 페닐락트산 (PLA),뿐만 아니라 트로핀 및 PLA 전구체, 예컨대 아르기닌, 오르니틴, 아그마틴, N-카바모일푸트레신 (NCP), 푸트레신, N-메틸푸트레신 (NMP), 4-메틸아미노부탄알, N-메틸파이롤리늄 (NMPy), 4-(1-메틸-2-피롤디닐)-3-옥소부탄산 (MPOB), 트로피논, 페닐알라닌, 프레펜산, 및 페닐피루브산 (PPA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 TA 전구체는 트로핀 및 PLA이다. 특정 예에서, 하나 이상의 TA 전구체는 트로핀 및 PLA 이외의 페닐프로파노이드 카복실산, 예를 들어 신남산이다. 도 1, 2 및 3은 다양한 TA 및 비-TA 전구체 분자로부터 각각 비-의약, 의약 및 비-천연 TA의 생합성을 예시한다.
TA 전구체에 대한 합성 경로는 숙주 세포에서 생성될 수 있으며, 임의의 편리한 출발 화합물(들) 또는 물질로 시작할 수 있다. 도 1-4는 아미노산에서 시작하는 TA 전구체에 대한 관심 합성 경로를 보여준다. 출발 물질은 비-자연 발생일 수 있거나 출발 물질은 숙주 세포에서 자연 발생일 수 있다. 숙주 세포에 존재하는 합성 경로에 기초하여 임의의 편리한 화합물 및 물질을 출발 물질로 사용할 수 있다. 출발 물질의 공급원은 숙주 세포 자체, 예를 들어 아르기닌 또는 페닐알라닌일 수 있거나 출발 물질이 외부 공급원으로부터 숙주 세포에 첨가되거나 보충될 수 있다. 이와 같이, 일부 경우에, 출발 화합물은 성장 공급원료 또는 세포 성장 배지의 일부가 아닌 외부 공급원으로부터 숙주 세포에 첨가되는 세포의 합성 경로에 있는 화합물을 지칭한다. 관심 출발 화합물은 N-메틸푸트레신, 4-메틸아미노부탄알, 트로피논, 트로핀, PLA, 신남산뿐만 아니라 도 1-4에 나타낸 임의의 화합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 숙주 세포가 액체 배양에서 성장하는 경우, 세포 배지에 출발 물질이 보충될 수 있으며, 이는 세포로 수송되고 세포에 의해 원하는 생성물로 전환된다. 관심 출발 물질에는 저렴한 공급원료 및 단순 전구체 분자를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 숙주 세포는 출발 물질로서 단순 탄소 공급원을 포함하는 공급원료를 이용하고, 숙주 세포는 이를 이용하여 세포의 합성 경로의 화합물을 생성한다. 숙주 세포 성장 공급원료는 하나 이상의 성분, 예컨대 탄소원 예컨대 셀룰로스, 전분, 유리 당 및 질소 공급원, 예컨대 암모늄 염 또는 저렴한 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 출발 물질로 사용되는 성장 공급원료가 스위치그래스와 조류를 포함한 경작 한계지에서 자란 바이오매스 또는 기타 산업 또는 농업 활동의 바이오매스 폐기물과 같은 지속 가능한 공급원에서 유래될 수 있다.
트로판 알칼로이드(TA)
위에 요약된 바와 같이, 관심 있는 트로판 알칼로이드(TA)를 생산하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 균주는 의약 TA 예컨대 트로핀 및 PLA로부터 유래된 것들; 비-의약 TA 예컨대 트로피논, 슈도트로핀, 또는 노르슈도트로핀로부터 유래된 것들; 및 비-천연 TA 예컨대 트로핀 및 PLA 이외의 TA 전구체의 에스테르화로부터 유래된 것들 (예를 들어, 아실 공여체 및 아실 수용체 화합물)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 몇 개의 부류에 걸쳐 관심 있는 트로판 알칼로이드 및 그의 변형을 생산하기 위한 플랫폼을 제공할 것이다. 이들 부류 각각은 부류의 일원으로 이어질 수 있는 숙주 세포 생합성 경로의 임의의 편리한 일원의 생합성 전구체, 중간체 및 이의 대사산물을 포함하는 것을 의미한다. 화합물의 비제한적 예는 이들 부류 각각에 대해 하기에 제공된다. 일부 구현예에서, 주어진 예의 구조는 그 자체가 트로판 알칼로이드로서 특성화될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 화학적 독립체는 단일 거울상이성질체, 라세미 혼합물, 광학적으로 순수한 형태, 부분입체이성질체의 혼합물 및 중간 혼합물을 포함하는 모든 가능한 이성질체를 포함하는 것을 의미한다.
의약 TA는 식물에 의해 자연적으로 생성되는 리토린, 히오스시아민, 아트로핀, 아니소다민, 스코폴라민 및 이들의 유도체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
비-의약 TA는 식물에 의해 자연적으로 생성되는 칼리스테긴, 코카인 및 이들의 유도체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
비-천연 TA는 신나모일트로핀, 신나모일-3β-트로핀, 쿠마로일트로핀, 쿠마로일-3β-트로핀, 벤조일트로핀, 벤조일-3β-트로핀, 카페오일트로핀, 카페오일-3β-트로핀, 페룰로일트로핀, 및 페룰로일-3β-트로핀을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
유도체를 포함한 TA의 변형
상기 요약된 바와 같이, 관심 있는 트로판 알칼로이드(TA)의 변형된 유도체를 생성하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 균주는 조작된 숙주 세포에 의해 생산되거나 성장 배지에서 조작된 숙주 세포로 공급되는, TA 전구체, 의약 TA, 비-의약 TA 및 비-천연 TA를 유도체화하는 것을 포함하는, 관심 있는 TA의 유도체화를 위한 플랫폼을 제공할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유도체화", "작용화", "유도체화에 의한 변형" 및 "작용화에 의한 변형"은 TA 골격 자체의 변형 없이 관능기의 부착을 통한 TA 또는 TA 전구체의 변형을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 작용기의 부착은 하이드록실화, 알킬화 및 N-알킬화, 아세틸화 및 N-아세틸화, 아실화 및 N-아실화, 및 할로겐화를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 관심 있는 TA의 유도체화는 사전 작용화된 TA 전구체, 예를 들어 할로겐화된 또는 알킬화된 아미노산을, 흡수를 위해 조작된 숙주 세포에 공급하고, 그 다음, 공급된 TA 전구체를 관심 있는 TA로 전환함으로써 효소적으로 달성될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 관심 TA의 유도체화는 변형되지 않은 TA를 생산하는데 필요한 효소 및 세포 변형 이외에도, 표적 TA에 관능기를 부착하는데 있어서 원하는 활성을 갖는 효소를 발현하도록 숙주 세포를 조작함으로써 효소적으로 달성될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 관심 TA의 유도체화는 조작된 숙주 세포에 의해 생산된 비변형된 TA를 원하는 관능기를 부착시킬 수 있는 정제된 효소로, 또는 원하는 유도체화 활성을 갖는 효소를 발현하도록 조작된 숙주 세포의 조 용해물로 처리함으로써 효소적으로 달성될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 관심 있는 TA의 유도체화는 조작된 숙주 세포에 의해 생성된 비변형 TA를 원하는 작용기가 부착된 화학 제제로 처리함으로써 비효소적으로 달성될 수 있다.
TA의 변형된 유도체는 p-하이드록시아트로핀, p-하이드록시하이오스시아민, p-플루오로하이오스시아민, p-클로로하이오스시아민, p-브로모하이오스시아민, p-플루오로스코폴라민, p-클로로스코폴라민, p-브로모스코폴라민, N-메틸하이오스시아민, N-부틸하이오스시아민, N-메틸스코폴라민, N-부틸스코폴라민, N-아세틸하이오스시아민, 및 N-아세틸스코폴라민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
숙주 세포
상기 요약된 바와 같이, 본 발명의 일 양태는 하나 이상의 관심 있는 TA를 생산하는 숙주 세포이다. 임의의 편리한 세포가 대상 숙주 세포 및 방법에서 이용될 수 있다. 일부 경우에, 숙주 세포가 비-식불 세포이다. 일부 경우에, 숙주 세포는 미생물 세포로서 특성화될 수 있다. 특정 경우에, 숙주 세포는 곤충 세포, 포유동물 세포, 박테리아 세포 또는 진균 세포이다. 임의의 편리한 유형의 숙주 세포가 대상 TA-생산 세포를 생산하는데 이용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 8,975,063로 현재 공개된 US2008/0176754, US2014/0273109 및 WO2014/143744 참조); 그 개시내용은 그 전체가 참고로 포함된다. 관심 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대 바실러스 서브틸리스 , 에스케리치아 콜라이 , 스트렙토마이세스 , 아나바에나 , 아스로박터 , 아세토박터, 아세토박테리움 , 바실러스 , 비피도박테리움 , 브라키박테리움 , 브레비박테리움 , 카노박테리움 , 클로스트리듐, 코라이네박테리움 , 엔테로박터, 에스케리치아 , 글루코나세토박터 , 글루코노박터 , 하프니아 , 할로모나스 , 클렙시엘라, 코쿠리아 , 락토바실러스 , 류코논스톡 , 매크로코쿠스 , 메틸로모나스 , 메틸로박터, 메틸로셀라 , 메틸로코쿠스 , 마이크로박테리움 , 마이크로코쿠스 , 마이크로사이스티스 , 무렐라 , 오에노코쿠스 , 페디오코쿠스 , 프로클로로코쿠스 , 프로피오니박테리움 , 프로테우스, 슈도알테로모나스 , 슈도모나스, 사이크로박터 , 로도박터 , 로도코쿠스 , 도로슈도모나스 , 세라티아, 스타필로코쿠스 , 스트렙토코쿠스 , 스트렙토마이세스 , 사이네초코쿠스 , 시네코시스티스 , 테트라제노코쿠스 , 바이셀라 , 자이모모나스, 및 살모넬라 타이피뮤리움 세포, 곤충 세포 예컨대 드로소필라 멜라노가스테르 S2 및 스포도프테라 프루지페르다 Sf9 세포, 및 효모 세포 예컨대 사카로마이세스 세레비지아에 , 쉬조사카로마이세스 폼베베 , 피치아 패스토리스 , 야로위아 리포라이티카 , 칸디다 알비칸스 , 아스페르길루스 spp ., 라이조푸스 spp ., 펜니실리움 spp ., 및 트리코데르마 리세이 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 효모 세포 또는 E. 콜라이 세포이다. 일부 경우에, 숙주 세포가 효모 세포이다. 일부 경우에, 숙주 세포는 관심 있는 TA를 생산하도록 조작된 효모 균주에서 유래한다. 미국 특허 번호 8,975,063로서 현재 공개된 US2008/0176754, US2014/0273109 및 WO2014/143744에 기재된 임의의 숙주 세포는 대상 세포 및 방법에 사용하기 위해 적합화될 수 있다. 특정 구현예에서, 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지아에 (S. 세레비지아에) 종의 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 효모 세포는 쉬조사카로마이세스 폼베 종의 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 효모 세포는 피치아 파스토리스 종의 것일 수 있다. 효모는 일부 생합성 경로에 관여하는 사이토크롬 P450 단백질이 소포체 막으로 적절하게 접혀 활성이 유지될 수 있기 때문에, 숙주 세포로 관심을 받고 있다.
본 발명에서 사용되는 관심 효모 균주는 (유전자형: MATa /α ura3 -52/ura3-52 trp1 -289/ trp1 -289 leu2 -3_112/ leu2 -3_112 his3 Δ1 / his3 Δ 1 MAL2 -8C/MAL2-8C SUC2/SUC2), S288C, W303, D273-10B, X2180, A364A, Δ1278B, AB972, SK1, 및 FL100을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 경우에, 효모 균주는 S288C (MATα; SUC2 mal mel gal2 CUP1 flo1 flo8-1 hap1), BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0), BY4742 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; lys2Δ0; ura3Δ0), BY4743 (MATa/MATα; his3Δ1/his3Δ1; leu2Δ0/leu2Δ0; met15Δ0/MET15; LYS2/lys2Δ0; ura3Δ0/ura3Δ0), 및 WAT11 또는 W(R), W303-B 균주의 유도체 (MATa; ade2-1; his3-11, -15; leu2-3,-112; ura3-1; canR; cyr+) (이는 아라비돕시스 탈리아나 NADPH-P450 환원효소 ATR1 및 효모 NADPH-P450 환원효소 CPR1, 각각을 발현함) 중 임의의 것이. 다른 구현예에서, 효모 세포는 W303alpha (MATα; his3-11,15 trp1-1 leu2-3 ura3-1 ade2-1)이다. 관심 있는 추가 효모 균주의 식별 및 유전자형은 EUROSCARF(web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col_index.html)에서 찾을 수 있다.
일부 경우에, 숙주 세포는 진균 세포이다. 특정 구현예에서, 진균 세포는 아스페르길루스 종의 것일 수 있고 균주는 아스페르길루스 니게르 (ATCC 1015, ATCC 9029, CBS 513.88), 아스페르길루스 오리자에 (ATCC 56747, RIB40), 아스페르길루스 테레우스 (NIH 2624, ATCC 20542) 및 아스페르길루스 니둘란스 (FGSC A4)를 포함한다.
특정 구현예에서, 이종성 코딩 서열은 아스페르길루스 sp.에서의 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 적절한 프로모터로부터 발현된다. 특정 구현예에서, 프로모터는 포스포글리세레이트 키나제 프로모터 (PGK), MbfA 프로모터, 사이토크롬 c 산화효소 서브유닛 프로모터 (CoxA), SrpB 프로모터, TvdA 프로모터, 말레이트 탈수소효소 프로모터 (MdhA), 베타-만노시다제 프로모터 (ManB)로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 종결자는 글루코아밀라아제 종결자 (GlaA) 또는 TrpC 종결자로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터, 이종성 코딩 서열 및 종결자로 이루어진 발현 카셋트는 플라스미드로부터 발현되거나 숙주의 게놈 내로 통합될 수 있다. 특정 구현예에서, 플라스미드 또는 통합 카셋트를 유지하는 세포의 선택은 하이그로마이신과 같은 항생제 선택 또는 단독 질소 공급원으로서 아세트아미드를 사용하는 것과 같은 질소 공급원 이용으로 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, DNA 작제물은 확립된 형질전환 방법 예컨대 원형질 형질전환, 리튬 아세테이트, 또는 전기천공을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 액체 ME 또는 고체 MEA(3% 맥아 추출물, 0.5% 펩톤 및 ±1.5% 아가) 또는 선택이 있거나 없는 Vogel의 최소 배지에서 배양될 수 있다.
일부 경우에, 숙주 세포는 박테리아 세포이다. 박테리아 세포는 임의의 박테리아 속으로부터 선택될 수 있다. 박테리아 세포가 유래할 수 있는 속의 예로는 아나바에나 , 아스로박터 , 아세토박터, 아세토박테리움 , 바실러스 , 비피도박테리움 , 브라키박테리움, 브레비박테리움 , 카노박테리움 , 클로스트리듐, 코라이네박테리움 , 엔테로박터, 에스케리치아 , 글루코나세토박터 , 글루코노박터 , 하프니아 , 할로모나스 , 클렙시엘라 , 코쿠리아 , 락토바실러스 , 류코논스톡 , 매크로코쿠스 , 메틸로모나스 , 메틸로박터 , 메틸로셀라 , 메틸로코쿠스 , 마이크로박테리움 , 마이크로코쿠스 , 마이크로사이스티스, 무렐라 , 오에노코쿠스 , 페디오코쿠스 , 프로클로로코쿠스 , 프로피오니박테리움 , 프로테우스, 슈도알테로모나스 , 슈도모나스, 사이크로박터 , 로도박터 , 로도코쿠스 , 도로슈도모나스 , 세라티아, 스타필로코쿠스 , 스트렙토코쿠스 , 스트렙토마이세스, 사이네초코쿠스 , 시네코시스티스 , 테트라제노코쿠스 , 바이셀라 , 및 자이모모나스를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 방법과 함께 사용될 수 있는 박테리아의 종은 아스로박터 니코티아나에 , 아세토박터 아세티 , 아스로박터 아릴라이텐시스 , 바실러스 세레우스, 바실러스 코아굴란스 , 바실러스 리케니포르미스 , 바실러스 푸밀루스 , 바실러스 스파에리쿠스 , 바실러스 스테아로써모필루스 , 바실러스 서브틸리스, 비피도박테리움 아돌레센티스 , 브라키박테리움 타이로페르멘탄스 , 브레비박테리움 리넨스 , 카노박테리움 다이버겐스 , 코라이네박테리움 플라베센스 , 엔테로코쿠스 패슘 , 글루코나세토박터 유로파에우스 , 글루코나세토박터 요한나에 , 글루코노박터 옥시단 , 하프니아 알베이 , 할로모나스 엘롱가타 , 코쿠리아 라이조필라 , 락토바실러스 아시디파리나에 , 락토바실러스 젠세니 , 락토코쿠스 락티스 , 락토바실러스 야마나쉬엔시스 , 류코노스톡 시트레움 , 매크로코쿠스 카세올리티쿠스 , 마이크로박테리움 폴리오룸 , 마이크로코칼 뉴클레아제, 오에노코쿠스 오에니 , 페디오코쿠스 악시딜락티치 , 프로피오니박테리움 아시디프로피오니치 , 프로테우스 불가리스, 슈도모나스 플루오레스센스 , 사이크로박터 셀레르 , 스타필로코쿠스 콘디멘티 , 스트렙토코쿠스 써모필루스 , 스트렙토마이세스 그리세우스 , 테트라제노코쿠스 할로필루스 , 바이셀라 시바리아 , 바이셀라 코린시스 , 자이모모나스 모빌리스, 코라이네박테리움 글루타미쿰 , 비피도박테리움 비피덤 / 브레베 / 론구움 , 스트렙토마이세스 리비단스 , 스트렙토마이세스 코엘리칼러 , 락토바실러스 플란타룸 , 락토바실러스 사케이 , 락타바실러스 카세이 , 슈도알테로모나스 시트레아 , 슈도모나스 푸티다 , 클로스트리듐 륭달리 / 아세티쿰 / 아세토부틸리쿰 / 베이제린키이 / 부티리쿰 , 및 무렐라 테모셀룸 /써모아세티카를 포함한다.
특정 구현예에서, 박테리아 세포는 에스케리치아 콜라이의 균주의 것일 수 있다. 특정 구현예에서, E. 콜라이의 균주는 BL21, DH5α, XL1-Blue, HB101, BL21, 및 K12로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 이종성 코딩 서열은 E. 콜라이에서의 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있고 적절한 프로모터로부터 발현될 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 T7 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터 (tet), lac 오페론 프로모터 (lac), lacO1 프로모터로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터, 이종성 코딩 서열, 및 종결자로 이루어진 발현 카셋트는 플라스미드로부터 발현되거나 게놈 내로 통합될 수 있다. 특정 구현예에서, 플라스미드는 pUC19 또는 pBAD로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 플라스미드 또는 통합 카셋트를 유지하는 세포의 선택은 카나마이신, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 스펙티노마이신, 겐타마이신, 에리트로마이신 또는 암피실린과 같은 항생제 선택으로 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, DNA 작제물은 확립된 형질전환 방법 예컨대 콘주게이션, 열충격 화학적 변환, 또는 전기천공을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 항생제의 존재 또는 부재하에 약 37℃에서 액체 루리아-베르타니(LB) 배지에서 배양될 수 있다.
특정 구현예에서, 박테리아 세포는 바실러스 서브틸리스의 균주일 수 있다. 특정 구현예에서, B. 서브틸리스의 균주는 1779, GP25, RO-NN-1, 168, BSn5, BEST195, 1A382, 및 62178로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 이종성 코딩 서열은 E. 콜라이에서의 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있고 적절한 프로모터로부터 발현될 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 grac 프로모터, p43 프로모터, 또는 trnQ 프로모터로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터, 이종성 코딩 서열 및 종결자로 이루어진 발현 카셋트는 플라스미드로부터 발현되거나 게놈 내로 통합될 수 있다. 특정 구현예에서, 플라스미드는 pHP13 pE194, pC194, pHT01, 또는 pHT43으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, pDG364 또는 pDG1730과 같은 통합 벡터를 사용하여 발현 카셋트를 게놈 내로 통합할 수 있다. 특정 구현예에서, 플라스미드 또는 통합 카셋트를 유지하는 세포의 선택은 에리트로마이신, 카나마이신, 테트라사이클린 및 스펙티노마이신과 같은 항생제 선택으로 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, DNA 작제물은 확립된 형질전환 방법 예컨대 천연 능숙도, 열충격, 또는 화학적 변환을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 37℃에서 액체 루리아-베르타니(LB) 배지 또는 M9 배지 + 글루코스 및 트립토판에서 배양될 수 있다.
숙주 세포에 대한 유전자 변형
숙주 세포는 관심 있는 TA의 생산을 제공하는 하나 이상의 변형(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 그 초과 개의 변형)을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에, 변형이란 유전자 또는 그의 단편의 돌연변이, 추가 또는 결실, 또는 유전자 또는 그의 단편의 전사 조절과 같은 유전적 변형을 의미한다. 일부 경우에, 하나 이상의 (예컨대 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상) 변형은 하기로부터 선택된다: 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제; 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 전사 조절 변형; 세포에 고유한 효소의 불활성화 돌연변이; 효소를 인코딩하는 이종성 코딩 서열; 및 효소 또는 대사산물의 세포 아래 트래피킹 및/또는 국소화를 변형시키는 단백질을 인코딩하는 이종성 코딩 서열. 하나 이상의 변형을 포함하는 세포는 변형된 세포로 지칭될 수 있다.
변형된 세포는 하나 이상의 전구체 TA, TA 또는 변형된 TA 분자를 과잉생산할 수 있다. 과잉생산이란, 세포가 대조군 세포(예를 들어, 비변형된 세포)에 비해 관심 있는 TA 분자의 생산이 개선되거나 증가되었음을 의미한다. 개선된 또는 증가된 생산이란, 대조군이 TA 전구체 생산을 갖지 않는 관심 있는 TA의 일부 양의 생산뿐만 아니라 대조군이 관심 생산의 일부 TA가 있는 상황에서 10배 이상을 포함하여 약 10% 이상, 예를 들어 약 20% 이상, 약 30%, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 80% 이상, 약 100% 이상, 예를 들어 2배 이상, 예를 들어 5배 이상의 증가 모두를 의미한다.
일부 경우에, 숙주 세포는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 하나 이상의 변형이 결여된 대조군 숙주 세포에 비해 증가된 양의 푸트레신을 생성할 수 있다. 특정 예에서, 푸트레신의 증가된 양은 대조군 숙주 세포에 대한 약 10% 이상, 예컨대 대조군 숙주 세포에 대한 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 80% 이상, 약 100% 이상, 2배 이상, 5배 이상, 또는 심지어 10배 이상이다.
일부 경우에, 숙주 세포는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 하나 이상의 변형이 결여된 대조군 숙주 세포에 비해 증가된 양의 N-메틸파이롤리늄을 생성할 수 있다. 특정 예에서, N-메틸파이롤리늄의 증가된 양은 대조군 숙주 세포에 대한 약 10% 이상, 예컨대 대조군 숙주 세포에 대한 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 80% 이상, 약 100% 이상, 2배 이상, 5배 이상, 또는 심지어 10배 이상이다.
일부 경우에, 숙주 세포는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 하나 이상의 변형이 결여된 대조군 숙주 세포에 비해 증가된 양의 트로핀을 생성할 수 있다. 특정 예에서, 트로핀의 증가된 양은 대조군 숙주 세포에 대한 약 10% 이상, 예컨대 대조군 숙주 세포에 대한 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 80% 이상, 약 100% 이상, 2배 이상, 5배 이상, 또는 심지어 10배 이상이다.
일부 경우에, 숙주 세포는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 하나 이상의 변형이 결여된 대조군 숙주 세포에 비해 증가된 양의 페닐피루브산을 생성할 수 있다. 특정 예에서, 페닐피루브산의 증가된 양은 대조군 숙주 세포에 대한 약 10% 이상, 예컨대 대조군 숙주 세포에 대한 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 80% 이상, 약 100% 이상, 2배 이상, 5배 이상, 또는 심지어 10배 이상이다.
일부 경우에, 숙주 세포는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 하나 이상의 변형이 결여된 대조군 숙주 세포에 비해 증가된 양의 페닐락트산을 생성할 수 있다. 특정 예에서, 페닐락트산의 증가된 양은 대조군 숙주 세포에 대한 약 10% 이상, 예컨대 대조군 숙주 세포에 대한 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 80% 이상, 약 100% 이상, 2배 이상, 5배 이상, 또는 심지어 10배 이상이다.
일부 경우에, 숙주 세포는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 하나 이상의 변형이 결여된 대조군 숙주 세포에 비해 증가된 양의 리토린을 생산할 수 있다. 특정 예에서, 리토린의 증가된 양은 대조군 숙주 세포에 대한 약 10% 이상, 예컨대 대조군 숙주 세포에 대한 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 80% 이상, 약 100% 이상, 2배 이상, 5배 이상, 또는 심지어 10배 이상이다.
일부 경우에, 숙주 세포는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 하나 이상의 변형이 결여된 대조군 숙주 세포에 비해 증가된 양의 하이오스시아민을 생성할 수 있다. 특정 예에서, 하이오스시아민의 증가된 양은 대조군 숙주 세포에 대한 약 10% 이상, 예컨대 대조군 숙주 세포에 대한 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 80% 이상, 약 100% 이상, 2배 이상, 5배 이상, 또는 심지어 10배 이상이다.
일부 경우에, 숙주 세포는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 하나 이상의 변형이 결여된 대조군 숙주 세포에 비해 증가된 양의 스코폴라민을 생성할 수 있다. 특정 예에서, 스코폴라민의 증가된 양은 대조군 숙주 세포에 대한 약 10% 이상, 예컨대 대조군 숙주 세포에 대한 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 80% 이상, 약 100% 이상, 2배 이상, 5배 이상, 또는 심지어 10배 이상이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 출발 화합물 예컨대 아르기닌로부터의 10% 이상의 트로핀 수율, 예컨대 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 심지어 90% 이상의 출발 화합물로부터의 트로핀 수율을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 출발 화합물 예컨대 페닐알라닌로부터의 10% 이상의 페닐락트산 수율, 예컨대 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 심지어 90% 이상의 출발 화합물로부터의 페닐락트산 수율을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 출발 화합물 예컨대 아르기닌 또는 페닐알라닌로부터의 10% 이상의 하이오스시아민 수율, 예컨대 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 심지어 90% 이상의 출발 화합물로부터의 하이오스시아민 수율을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 일부 구현예에서, 숙주 세포는 출발 화합물 예컨대 아르기닌 또는 페닐알라닌로부터의 10% 이상의 스코폴라민 수율, 예컨대 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 심지어 90% 이상의 출발 화합물로부터의 스코폴라민 수율을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 아르기닌, 오르니틴, 아그마틴, 푸트레신, N-메틸푸트레신, 4-메틸아미노부탄알, N-메틸파이롤리늄, 4-(1-메틸-2-피롤디닐)-3-옥소부탄산, 트로피논, 트로핀, 페닐알라닌, 프레펜산, 페닐피루브산, 페닐락트산, 글루코스-1-O-페닐락테이트, 리토린, 하이오스시아민 알데하이드, 하이오스시아민, 아니소다민, 및 스코폴라민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 관심 있는 TA 분자를 과생성한다.
하나 이상의 변형의 임의의 편리한 조합이 대상 숙주 세포에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 2개 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상)의 다른 유형의 변형이 포함된다. 특정 예에서, 동일한 유형의 변형의 2개 이상(예를 들어, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 심지어 그 초과)의 별개의 변형이 대상 세포에 포함된다.
숙주 세포의 일부 구현예에서, 세포가 하나 이상의 효소를 인코딩하는 하나 이상의 이종성 코딩 서열을 포함하는 경우, 이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 변형을 포함한다: 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제; 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 전사 조절 변형; 및 세포에 고유한 효소의 불활성화 돌연변이. 숙주 세포의 특정 구현예에서, 세포가 하나 이상의 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 하나 이상의 전사 조절 변형을 포함하는 경우, 이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 변형을 포함한다: 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제; 세포에 고유한 효소의 불활성화 돌연변이; 효소를 인코딩하는 이종성 코딩 서열; 및 효소 또는 대사산물의 세포 아래 트래피킹 및/또는 국소화를 변형시키는 단백질을 인코딩하는 이종성 코딩 서열. 숙주 세포의 일부 구현예에서, 세포가 하나 이상의 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 하나 이상의 전사 조절 변형을 포함하는 경우, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 변형을 포함한다: 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제; 세포에 고유한 효소의 불활성화 돌연변이; 효소를 인코딩하는 이종성 코딩 서열; 및 효소 또는 대사산물의 세포 아래 트래피킹 및/또는 국소화를 변형시키는 단백질을 인코딩하는 이종성 코딩 서열. 숙주 세포의 특정 예에서, 세포가 세포 고유의 하나 이상의 효소에서 하나 이상의 불활성화 돌연변이를 포함하는 경우, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 변형을 포함한다: 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제; 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 전사 조절 변형; 효소를 인코딩하는 이종성 코딩 서열; 및 효소 또는 대사산물의 세포 아래 트래피킹 및/또는 국소화를 변형시키는 단백질을 인코딩하는 이종성 코딩 서열.
숙주 세포의 특정 구현예에서, 세포는 하나 이상의 세포에 고유한 생합성 효소 유전자에서 하나 이상의 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제; 및 하나 이상의 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 하나 이상의 전사 조절 변형을 포함한다. 숙주 세포의 특정 구현예에서, 세포는 하나 이상의 세포에 고유한 생합성 효소 유전자에서 하나 이상의 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제; 및 하나 이상의 세포에 고유한 효소의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 숙주 세포의 특정 구현예에서, 세포는 하나 이상의 세포에 고유한 생합성 효소 유전자에서 하나 이상의 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제; 및 하나 이상의 이종성 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 표 1에 기재된 관심 유전자 중 하나 이상을 포함하는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 하나 이상의 변형을 포함한다.
돌연변이를 완화시키는 피드백 억제
일부 예에서, 숙주 세포는 세포의 하나 이상의 생합성 효소 유전자에서 돌연변이를 완화시키는 하나 이상 (예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 심지어 그 초과)의 피드백 억제를 포함하는 세포이다. 일부 경우에, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 세포에 고유하다(예를 들어, 변형되지 않은 세포에 존재함). 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "돌연변이를 완화시키는 피드백 억제"는 숙주 세포의 피드백 억제 제어 메카니즘을 완화시키는 돌연변이를 지칭한다. 피드백 억제는 조절된 화합물의 합성 경로에 있는 효소가 그 화합물이 특정 수준까지 축적될 때 억제되어 세포 내 화합물의 양의 균형을 맞추는 세포의 제어 메카니즘이다. 일부 예에서, 돌연변이를 완화시키는 하나 이상의 피드백 억제는 도 1-4의 생합성 경로 또는 도 8의 개략도에 기재된 효소에 있다. 피드백 억제를 완화시키는 돌연변이는 대조군 세포에 비해 관심 세포에서 조절된 효소의 억제를 감소시키고 조절된 화합물 또는 그의 다운스트림 생합성 생성물의 증가된 수준을 제공한다. 일부 경우에, 조절된 효소의 억제를 완화한다는 것은 억제의 IC50이 2배 이상, 예컨대 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 30배 이상, 100배 이상, 300배 이상, 1000배 이상, 또는 그 초과까지 증가됨을 의미한다. 증가된 수준이란, 대조군 세포 또는 그의 다운스트림 생성물에서 조절된 화합물의 수준의 110% 이상, 예컨대 숙주 세포 또는 그의 다운스트림 생성물에서 조절된 화합물의 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 150% 이상, 160% 이상, 170% 이상, 180% 이상, 190% 이상, 또는 200% 이상, 예컨대 적어도 3배 이상, 적어도 5배 이상, 적어도 10배 이상 또는 그 초과인 수준을 의미한다.
TA 전구체 수준의 조절을 지시하는 숙주 세포 고유의 다양한 피드백 억제 제어 메카니즘 및 생합성 효소는 숙주 세포에서 완화를 위해 표적화될 수 있다. 숙주 세포는 하나 이상의 세포에 고유한 생합성 효소 유전자에서 돌연변이를 완화시키는 하나 이상의 피드백 억제를 포함할 수 있다. 돌연변이는 생합성 효소가 조절 제어를 받는 숙주 세포에 고유한 임의의 편리한 생합성 효소 유전자에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 오르니틴 탈탄산효소(ODC), 오르니틴 탈탄산효소 안티자임, 및 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제로부터 선택된 하나 이상의 효소를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 오르니틴 탈탄산효소를 코딩한다. 일부 경우에, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 오르니틴 탈탄산효소 안티자임를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제를 코딩한다. 특정 예에서, 돌연변이를 완화시키는 하나 이상의 피드백 억제는 SPE1, OAZ1, 및 PMT로부터 선택된 생합성 효소 유전자에 존재한다. 특정 예에서, 돌연변이를 완화시키는 하나 이상의 피드백 억제는 SPE1인 생합성 효소 유전자에 존재한다. 특정 예에서, 돌연변이를 완화시키는 하나 이상의 피드백 억제는 OAZ1인 생합성 효소 유전자에 존재한다. 특정 예에서, 돌연변이를 완화시키는 하나 이상의 피드백 억제는 PMT인 생합성 효소 유전자에 존재한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 표 1에 기재된 유전자 중 하나와 같은 하나 이상의 생합성 효소 유전자에서 돌연변이를 완화시키는 하나 이상의 피드백 억제를 포함한다.
임의의 편리한 수 및 유형의 돌연변이를 이용하여 피드백 억제 제어 메카니즘을 완화할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "돌연변이"는 참조 서열 또는 모티프에 대한 아미노산(들) 잔기 또는 뉴클레오타이드(들) 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 지칭한다. 돌연변이는 원래 유전자좌에서 천연 유전자에 대한 지시된 돌연변이로서 혼입될 수 있다. 일부 경우에, 돌연변이는 별도의 유전자좌에서 유전적 통합으로서 도입된 유전자의 추가 카피로서, 또는 2μ 또는 중심절 플라스미드와 같은 에피솜 벡터 상의 추가 카피로서 도입될 수 있다. 특정 예에서, 효소의 피드백 억제된 카피는 천연 세포 전사 조절 하에 있다. 일부 경우에, 효소의 피드백 억제 카피는 합성 프로모터의 제어 하에 배치함으로써 단백질 발현의 조작된 구성적 또는 동적 조절과 함께 도입된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 또는 심지어 15 또는 그 초과 개의 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제, 예컨대 숙주 세포에 고유한 하나 이상의 생합성 효소 유전자 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제를 포함할 수 있다.
전사 조절 변형
숙주 세포는 세포의 하나 이상의 생합성 효소 유전자의 하나 이상의 전사 조절 변형(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 그 초과 개의 변형)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 생합성 효소 유전자가 세포에 고유하다. 세포의 임의의 편리한 생합성 효소 유전자는 전사 조절을 위해 표적화될 수 있다. 전사 조절이란, 변형된 세포에서 관심 유전자의 발현이 대조군 세포(예를 들어, 비변형된 세포)에 비해 조절, 예를 들어 증가 또는 감소, 향상 또는 억제됨을 의미한다. 일부 경우에, 관심 유전자의 전사 조절에는 발현의 증가 또는 향상이 포함된다. 발현을 증가시키거나 향상시킨다는 것은 관심 유전자의 발현 수준이 대조군, 즉, 변형된 (예를 들어, 임의의 편리한 유전자 발현 검정을 사용하여) 변형되지 않는 동일한 세포에서의 발현에 비하여 2-배 이상, 예컨대 5-배 이상 및 때때로 25-, 50-, 또는 100-배 이상 및 특정 구현예에서 300-배 이상 또는 그 초과까지 증가된을 의미한다. 또는, 세포 내에서 관심 유전자의 발현이 너무 낮아 검출이 불가능한 경우, 쉽게 검출될 수 있는 수준으로 발현을 증가시키면 관심 유전자의 발현 수준이 증가된 것으로 간주된다. 특정 예에서, 관심 유전자의 전사 조절은 발현의 감소 또는 억제를 포함한다. 발현을 감소시키거나 억제한다는 것은 대조군에 비하여 2-배 이상, 예컨대 5-배 이상 및 때때로 25-, 50-, 또는 100-배 이상 및 특정 구현예에서 300-배 이상 또는 그 초과까지 줄어듬을 의미한다. 일부 경우에, 발현이 감지할 수 없는 수준으로 감소한다. 대상 숙주 세포에서 사용하기 위해 조정될 수 있는 관심 숙주 세포 프로세스의 변형은 Smolke 등의 미국 공개 번호 20140273109(14/211,611)에 기재되어 있으며, 그 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
임의의 편리한 생합성 효소 유전자는 전사적으로 조절될 수 있으며, ARG2, CAR1, SPE1, FMS1, PHA2, ARO8, ARO9 및 UGP1과 같은 도 1-3에 기술된 생합성 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 ARG2, CAR1, SPE1, 및 FMS1로부터 선택된다. 일부 경우에, 하나 이상의 생합성 효소 유전자가 ARG2이다. 특정 예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 CAR1이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 SPE1이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 생합성 효소 유전자는 FMS1이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 표 1에 기재된 유전자 중 하나와 같은 하나 이상의 유전자에 대한 하나 이상의 전사 조절 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 도 1-4 중 하나의 생합성 경로 또는 도 8의 개략도에 기재된 유전자 중 하나와 같은 하나 이상의 유전자에 대한 하나 이상의 전사 조절 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 전사 조절 변형은 하나 이상의 생합성 효소 유전자의 천연 프로모터에 대한 강한 프로모터의 치환 또는 강한 프로모터의 제어 하에 있는 유전자 또는 유전자들의 추가 카피(들)의 발현을 포함한다. 관심 유전자의 발현을 구동하는 프로모터는 프로모터가 숙주 세포에서 활성일 수 있다면 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 관심 유전자는 그들의 천연 프로모터로부터 발현될 수 있거나, 또는 비-고유 프로모터가 사용될 수 있다. 요구 사항은 아니지만 이러한 프로모터는 사용되는 호스트에서 중간 내지 높은 강도여야 한다. 프로모터는 조절되거나 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 글루코스가 억제되지 않거나 배양 배지 중 글루코스의 존재에 의해 단지 약간만 억제된 프로모터가 사용된다. 적절한 프로모터가 많이 있으며, 그 예로는 B. 서브틸리스 tsr 유전자의 프로모터(푸룩토스 바이포스페이트 알돌라아제를 인코딩) 또는 효모 S. 세레비지아에의 GAPDH 프로모터(글리세르알데하이드-포스페이트 탈수소효소를 인코딩)와 같은 해당 유전자의 프로모터가 있다(Bitter GA, Meth . Enzymol . 152:673 684(1987)). 관심의 다른 강력한 프로모터는 제빵사의 효모의 ADHI 프로모터(Ruohonen L., 등, J. Biotechnol . 39:193 203 (1995)), 포스페이트-기아 유도된 프로모터 예컨대 효모의 PHO5 프로모터 (Hinnen, A., 등, in Yeast Genetic Engineering, Barr, PJ, 등 eds, Butterworths (1989)), B. 리케니포르미스로부터의 알칼리성 포스파타제 프로모터(Lee. J.W.K., 등, J. Gen. Microbiol . 137:1127 1133 (1991)), GPD1 및 TEF1을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 관심 효모 프로모터는 유도성 프로모터 예컨대 Gal1-10, Gal1, GalL, GalS, 억제성 프로모터 Met25, tetO, 및 구성적 프로모터 예컨대 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소 프로모터 (GPD), 알코올 탈수소효소 프로모터 (ADH), 번역-신장 인자-1-알파 프로모터 (TEF), 사이토크롬 c-산화효소 프로모터 (CYC1), MRP7 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK), 트리오스 포스페이트 이성화효소 (TPI), 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 강력한 프로모터가 GPD1이다. 특정 예에서, 강력한 프로모터는 TEF1이다. 글루코코르티코이드, 스테로이드 및 갑상선 호르몬과 같은 호르몬에 의해 유도될 수 있는 프로모터를 함유하는 자율 복제 효모 발현 벡터도 공지되어 있으며, 루코코르티코이드 반응 요소 (GRE) 및 갑상선 호르몬 반응 요소 (TRE)을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,045,290에 기재된 프로모터들을 참조한다. 알파 인자, 알코올 산화효소 및 PGH와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 벡터를 사용할 수 있다. 추가로 모든 프로모터/인핸서 조합(진핵생물 프로모터 데이터베이스 EPDB에 따름)을 사용하여 관심 유전자의 발현을 유도할 수도 있다. 숙주 세포에 특이적인 임의의 편리한 프로모터, 예를 들어 E. 콜라이가 선택될 수 있는 것으로 이해된다. 일부 경우에, 프로모터 선택을 사용하여 전사를 최적화할 수 있으며 따라서 효소 수준은 에너지 자원을 최소화하면서 생산을 최대화할 수 있다.
불활성화 돌연변이
숙주 세포는 세포의 효소에 대한 하나 이상의 불활성화 돌연변이(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 심지어 그 초과)를 포함할 수 있다. 하나 이상의 불활성화 돌연변이의 포함은 관심 있는 TA 또는 이를 유도하는 바람직한 효소 또는 전구체의 수준을 증가시키기 위해 숙주 세포의 합성 경로의 흐름을 수정할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 불활성화 돌연변이는 세포에 고유한 효소에 대한 것이다. 도 8은 폴리아민 생산 경로에 작용하는 효모의 천연 조절 메카니즘을 도시하고 도 9는 푸트레신 생산에 대한 이러한 천연 조절 시스템의 파괴 효과를 도시한다. 본원에 사용된 바와 같이, "불활성화 돌연변이"란, 유전자 또는 세포의 조절 DNA 서열에 대한 하나 이상의 돌연변이를 의미하며, 돌연변이(들)는 관심 유전자에 의해 발현되는 단백질의 생물학적 활성을 불활성화시킨다. 일부 경우에, 유전자가 세포에 고유하다. 일부 경우에, 유전자는 불활성화되고 숙주 세포에 의해 생성된 관심 있는 TA의 합성 경로의 일부이거나 이에 연결된 효소를 인코딩한다. 일부 예에서, 불활성화 돌연변이는 관심 유전자를 제어하는 조절 DNA 서열에 위치한다. 특정 경우에, 불활성화 돌연변이는 유전자의 프로모터에 대한 것이다. 임의의 편리한 돌연변이(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)를 이용하여 관심 유전자 또는 조절 DNA 서열을 불활성화시킬 수 있다. "불활성화" 또는 "불활성화한다"란, 돌연변이된 유전자에 의해 발현되는 단백질의 생물학적 활성이 비-돌연변이된 대조군 유전자에 의해 발현된 대조군 단백질에 대해 10% 이상, 예컨대 by 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상까지 감소됨을 의미한다. 일부 경우에, 단백질이 효소이고 불활성화 돌연변이는 효소의 활성을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 세포는 세포에 고유한 효소에 불활성화 돌연변이를 포함한다. 임의의 편리한 효소가 불활성화에 대해 표적화될 수 있다. 관심 효소에는 숙주 세포의 생합성 경로에서의 작용이 관심 있는 TA의 수준을 감소시키는 경향이 있는 도 1-4, 8, 11, 22 및 41에 기재된 효소를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 효소에 메틸티오아데노신 인산화효소 활성이 있다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이를 포함하는 효소는 MEU1이다(예를 들어, 도 8, 9 및 13 참조). 일부 경우에, 효소가 오르니틴 탈탄산효소 안티자임 활성을 가지고 있다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이를 포함하는 효소는 OAZ1이다. 일부 경우에, 효소에 스페르미딘 합성효소 활성이 있다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이를 포함하는 효소는 SPE3이다. 일부 경우에, 효소에 스페르민 합성 효소 활성이 있다. 일부 구현예에서, 불활성화 돌연변이를 포함하는 효소는 SPE4이다. 일부 경우에, 효소가 폴리아민 방출 활성을 갖는 막 수송체이다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이를 포함하는 효소 또는 단백질은 TPO5이다. 일부 경우에, 효소에 페닐아크릴산 탈탄산효소 활성이 있다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이를 포함하는 효소는 PAD1이다. 일부 경우에, 효소에 알코올 탈수소효소 활성이 있다. 일부 구현예에서, 불활성화 돌연변이를 포함하는 효소는 ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7, 및 SFA1로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이(들)를 포함하는 효소는 ADH2이다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이(들)를 포함하는 효소는 ADH3이다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이(들)를 포함하는 효소는 ADH4이다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이(들)를 포함하는 효소는 ADH5이다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이(들)를 포함하는 효소는 ADH6이다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이(들)를 포함하는 효소는 ADH7이다. 일부 경우에, 효소에 알데하이드 산화환원효소 활성이 있다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이를 포함하는 효소는 HFD1, ALD2, ALD3, ALD4, ALD5, 및 ALD6으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 돌연변이(들)를 포함하고 불활성화하는 효소는 HFD1이다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이(들)를 포함하는 효소는 ALD2이다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이(들)를 포함하는 효소는 ALD3이다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이(들)를 포함하는 효소는 ALD4이다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이(들)를 포함하는 효소는 ALD5이다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이(들)를 포함하는 효소는 ALD6이다. 일부 경우에, 효소에 글루코시다아제 활성이 있다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이를 포함하는 효소는 EXG1, SPR1, 및 EGH1로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이(들)를 포함하는 효소는 EXG1이다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이(들)를 포함하는 효소는 SPR1이다. 특정 구현예에서, 불활성화 돌연변이(들)를 포함하는 효소는 EGH1이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 표 1에 기재된 하나 이상의 유전자에 대한 하나 이상의 불활성화 돌연변이를 포함한다.
비-식물 숙주에서 아실트랜스퍼라제의 기능적 발현을 이용한 TA 아실 전이 반응을 수행하는 방법
본원에 제공된 일부 방법, 공정 및 시스템은 비-식물 세포 내에서 하나 이상의 TA를 생성하기 위한, 아실 공여체 기를 포함하는 하나 이상의TA 전구체와 아실 수용자 기를 포함하는 1종 이상의 TA 전구체의 협동 반응 (이하, TA 아실 전이 반응으로 지칭됨)을 기재한다 이러한 방법, 공정 및 시스템 중 일부는 조작된 숙주 세포를 포함할 수 있다. 일부 예에서, TA 아실 전이 반응은 기질을 다양한 범위의 알칼로이드로 전환시키는 핵심 단계이다. 일부 예에서, TA 아실 전이 반응은 축합 반응을 포함한다.
일부 예에서, TA 아실 전이는 적어도 하나의 축합 반응을 수반할 수 있다. 일부 경우에, 적어도 하나의 축합 반응이 효소의 존재 하에 수행된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 축합 반응이 효소에 의해 촉매된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 효소가 축합 반응을 촉매하는 데 유용한다.
본원에 기재된 일부 방법, 공정 및 시스템에서 축합 반응은 효소의 존재 하에 수행될 수 있다. 일부 예에서, 효소는 아실트랜스퍼라제일 수 있다. 아실트랜스퍼라제는 기질로서 알코올 또는 카복실레이트 작용기를 갖는 TA를 사용할 수 있다. 아실트랜스퍼라제는 당 (이후에 글리코사이드로 지칭함)에 대한 1-O-β 글라이코사이드 결합을 통해 활성화된 카복실레이트기를 함유하는 TA를 기질로 사용할 수 있다. 아실트랜스퍼라제는 TA 알코올 및 카복실레이트/글라이코사이드 작용기를 상응하는 에스테르 유도체로 전환시킬 수 있다. 본 개시내용에서 TA 전구체의 축합에 적합한 효소의 비제한적 예는 세린 카르복시펩티다제-유사 아실트랜스퍼라제(SCPL-AT)를 포함한다. 예를 들어, 리토린 합성효소(EC 2.3.1.-)는 1-O-β-페닐락토일-글루코스 및 기타 TA 글라이코사이드 전구체와 함께 알코올 작용기를 포함하는 트로핀 및 기타 TA 전구체를 리토린 및 기타 상응하는 에스테르 생성물로 축합할 수 있다. 일부 예에서, 선행 예 중 어느 하나의 SCPL-AT 도메인을 포함하는 단백질은 축합을 수행할 수 있다. 일부 예에서, SCPL-AT는 본 명세서에 기재된 바와 같이 조작된 숙주 세포와 같은 숙주 세포 내에서 축합 반응을 촉매할 수 있다. 또 다른 예에서, SCPL-AT는 본 명세서에 기재된 바와 같이 조작된 숙주 세포와 같은 숙주 세포 내부의 세포내 구획 내의 축합 반응을 촉매할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, SCPL-AT 효소와 같은 TA 아실 전이 반응을 수행하는 데 사용되는 아실트랜스퍼라제 효소의 아미노산 서열은 효소의 번역후 프로세싱, 트래피킹, 폴딩, 올리고머화, 및/또는 세포 아래 국소화를 변경시키는 하나 이상의 변형에 적용된다. SCPL-AT 효소를 포함한 일부 아실트랜스퍼라제 효소는 살아있는 비-식물 세포에서 촉매 활성을 나타내는 것으로 입증된 적이 없기 때문에, 이러한 변형은 비-식물 숙주 세포에서의 활성에 유용하거나 필요할 수 있다. 이러한 변형의 예는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: N-말단 신호 펩타이드 서열의 첨가, 제거, 또는 대체; 내부 프로펩타이드 서열의 첨가, 제거, 또는 대체; 아스파라긴-연결된 N-글리코실화 부위의 첨가 또는 제거; 세린-연결된 O-글리코실화 부위의 첨가 또는 제거; 및 단백질 도메인의 아실트랜스퍼라제 도메인의 N- 및/또는 C-말단에의 융합.
본 발명의 한 구현예에서, SCPL-AT 효소 도메인은 가용성 단백질 도메인의 융합에 의해 그의 N-말단에서 변형된다. 이 가용성 도메인은 아실트랜스퍼라제 도메인의 임의의 내부 신호 서열을 마스킹하여 융합된 SCPL-AT 도메인의 트래피킹 및/또는 세포 아래 국소화를 수정한다. 일부 예에서, N-말단 융합된 도메인은 SCPL-AT 도메인을 ER 멤브레인, ER 내강, 시스-골지, 트랜스-골지, 리소좀, 액포 멤브레인, 및 액포 내강을 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포 아래 구획으로 트래피킹하는 것을 유도한다. N-말단 융합된 가용성 도메인은 또한 그것의 원상태 (단량체)로부터 동종이량체, 이종이량체, 동종삼량체, 이종삼량체, 동종사량체, 이종사량체, 동종육량체, 이종육량체, 동종팔량체, 이종팔량체, 또는 더 높은 정도의 올리고머화을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 상태로 SCPL-AT 도메인의 올리고머화 상태를 변형시킬 수 있다.
한 예에서, N-말단 융합된 가용성 단백질 도메인은 아에쿠오리아 sp .에서 유래된 형광 단백질 및 디스코소마 sp .에서 유래된 형광 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택된 형광 단백질이다. 일 예에서, N-말단 융합된 가용성 단백질 도메인은 디스코소마 sp . (DsRed)로부터의 레드 형광 단백질이다. 다른 예에서, N-말단 융합 가용성 단백질 도메인은 오르니틴 탈탄산효소, 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제, 파이롤리딘 케타이드 합성효소, 트로피논 환원효소, 페닐피루베이트 환원효소, 페닐락테이트 UDP-글루코실트랜스퍼라제 84A27, 및 하이오스시아민 탈수소효소을 포함하지만 이에 제한되지 않는 TA 생합성 경로의 또 다른 효소이다.
비-식물 세포 내에서 TA 아실 전이 반응을 수행하는데 사용될 수 있는 SCPL-AT 도메인의 N-말단에 융합될 수 있는 가용성 단백질 도메인의 아미노산 서열의 예는 표 3에 제공된다. 융합된 N-말단 도메인을 포함하고 비-식물 세포에서 TA 아실 전이 반응에 사용되는 SCPL-AT 효소에 대한 아미노산 서열은 표 3에 열거된 주어진 아미노산 서열과 50% 이상 동일할 수 있다. 예를 들어, 이러한 아실트랜스퍼라제에 대한 아미노산 서열은 본원에서 제공된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가로, 특정 구현예에서, "동일한" 아미노산 서열은 특정 아미노산 서열에 대해 아미노산 수준에서 적어도 80%-99% 동일성을 함유한다. 일부 경우에, "동일한" 아미노산 서열은 아미노산 수준에서 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 및 그 초과, 특정 경우에, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 동일성을 함유한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 동일할 수 있지만 DNA 서열은 예를 들어 숙주 유기체에 대한 코돈 사용을 최적화하기 위해 변경된다.
TA 아실 전이 반응을 촉매하는 아실트랜스퍼라제를 생성하는 조작된 비-식물 숙주 세포가 제공될 수 있으며, 아실트랜스퍼라제는 N-말단이 표 3의 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 가용성 단백질 도메인의 아미노산 서열에 융합된 아미노산 서열을 포함한다. 조작된 숙주 세포 내에서 생성된 아실트랜스퍼라제는 생체 촉매를 형성하기 위해 회수 및 정제될 수 있다. 아실트랜스퍼라제를 생산하는 조작된 숙주 세포로부터 회수된 하나 이상의 효소는 TA 아실 전이 반응을 수행하기 위한 과정에서 사용될 수 있다. 공정은 알코올 및/또는 카복실레이트/글라이코사이드 작용기를 보유하는 TA 전구체를 알코올 및/또는 카복실레이트/글라이코사이드 기를 상응하는 에스테르 기로 전환시키기에 충분한 양의 아실트랜스퍼라제와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 예에서, 알코올 및/또는 카복실레이트/글라이코사이드 작용기를 보유하는 TA 전구체는 상기 TA 전구체의 적어도 5%가 상응하는 에스테르로 전환되도록 충분한 양의 하나 이상의 효소와 접촉될 수 있다. 추가의 예에서, 알코올 및/또는 카복실레이트/글라이코사이드 작용기를 보유하는 TA는 상기 TA 전구체의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 84%, 적어도 86%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 100%가 상응하는 에스테르로 전환되도록 충분한 양의 하나 이상의 효소와 접촉될 수 있다.
TA 아실 전이 반응을 수행하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 효소는 시험관내에서 TA 전구체와 접촉할 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, TA 아실 전이 반응을 수행하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 효소는 생체내에서 TA 전구체와 접촉할 수 있다. 추가로, TA 아실 전이 반응을 수행하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 효소는 내부에 TA 전구체를 갖는 세포에 제공될 수 있거나 조작된 비-식물 숙주 세포 내에서 생성될 수 있다.
일부 예에서, 방법은 알칼로이드 생성물을 생성하는 조작된 비-식물 숙주 세포를 제공하며, TA 아실 전이 반응은 알칼로이드 생성물의 생성에서 핵심 단계를 포함할 수 있다. 일부 예에서 생성된 알칼로이드는 의약 TA이다. 또 다른 구현예에서, 생성된 알칼로이드는 예를 들어 비-천연 TA를 포함하는 의약 TA로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 알칼로이드 생성물은 의약 TA, 비-의약 TA, 및 비-천연 TA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 기질은 거된 화합물의 트로핀, 슈도트로핀, 에크고닌, 메틸에크고닌, 페닐락트산, 신남산, 페룰산, 쿠마르산, 및 글리코사이드로 이루어진 군으로부터 선택된 TA 전구체이다.
일부 예에서, 방법은 트로핀 및 1-O-β-페닐락토일글루코스로부터 알칼로이드 생성물을 생성하는 조작된 비-식물 숙주 세포를 제공한다. 트로핀과 1-O-β-페닐락토일글루코스의 리토린으로의 축합은 전구체로부터 다양한 알칼로이드 생성물을 생산하는 핵심 단계를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 전구체는 L-아미노산 또는 당(예를 들어, 글루코스)이다. 다양한 알칼로이드 생성물에는 의약 TA, 비-의약 TA 및 비-천연 TA가 포함될 수 있지만 이에 제한되지 않을 수 있다.
임의의 적합한 탄소 공급원이 TA 아실 전이 반응을 위한 전구체로서 사용될 수 있다. 적합한 전구체는 모노사카라이드 (예를 들어, 글루코스, 푸룩토스, 갈락토스, 자일로스), 올리고당 (예를 들어, 락토스, 수크로스, 라피노오스), 폴리사카라이드 (예를 들어, 전분, 셀룰로스), 또는 그의 조합을 포함하지만 이제 제한되지 않을 수 있다. 일부 예에서, 재생가능한 공급원료로부터의 정제되지 않은 혼합물이 사용될 수 있다(예를 들어, 옥수수 침지액액, 사탕무 당밀, 보리 맥아, 바이오매스 가수분해물). 또 다른 구현예에서, 탄소 전구체는 1-탄소 화합물(예를 들어, 메탄올, 이산화탄소) 또는 2-탄소 화합물(예를 들어, 에탄올)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 다른 탄소-함유 화합물, 예를 들어 메틸아민, 글루코사민 및 아미노산(예를 들어, L-아르기닌 및 L-페닐알라닌)이 사용될 수 있다. 일부 예에서, TA 또는 알코올 및/또는 카복실레이트/글라이코사이드 작용기를 보유하는 TA의 전구체는, 예를 들어, 열거된 화합물의 트로핀, 슈도트로핀, 에크고닌, 메틸에크고닌, 페닐락트산, 신남산, 페룰산, 쿠마르산, 및 글리코사이드를 포함하여 본 발명의 조작된 숙주 세포에 직접 첨가될 수 있다.
일부 구현예에서, 액포 TA 아실 전이 반응을 수행하는 데 사용되는 기질은 하나 이상의 알코올 및/또는 카복실레이트/글라이코사이드 작용기를 포함할 수 있으며, 상기 작용기 중 하나만 해당 에스테르로 축합된다.
TA 알코올-알데하이드 상호전환
본원에 제공된 방법, 및 시스템은 알데하이드 관능기를 갖는 TA의 알콜 (하이드록실) 관능기를 포함하는 TA로의 전환, 및 알콜 관능기를 갖는TA의 알데하이드 관능기를 포함하는TA로의 전환 (이하, TA 알콜-알데하이드 상호전환으로 지칭됨)을 기재한다. 이러한 방법, 공정 및 시스템 중 일부는 조작된 숙주 세포를 포함할 수 있다. 일부 예에서, TA 알코올-알데하이드 상호전환은 기질을 다양한 범위의 알칼로이드로 전환하는 핵심 단계이다. 일부 예에서, TA 알데하이드 기의 TA 알코올 기로의 전환은 환원 반응을 포함한다. 일부 경우에, 기질 TA 알데하이드의 알코올로의 환원은 알데하이드 기질을 상응하는 사면체 옥시음이온 중간체로 환원시킨 다음, 도 2에 제공되고 일반적으로 반응식 1에 제시된 바와 같이 이 중간체를 하이드록실로 양성자화함으로써 수행될 수 있다. 반응식 1에 제공된 바와 같이, R1은 H, CH3, 또는 고차 알킬 기일 수 있고; R2 및 R3은 H, OH, 또는 OCH3일 수 있고; R4는 H일 수 있고; 그리고 R5는 H, OH, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 아실, F, Cl 또는 Br일 수 있다.
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반응식 1
일부 예에서, TA 알코올-알데하이드 상호전환은 하나 이상의 산화 반응 또는 하나 이상의 환원 반응을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 산화 또는 환원 반응 중 적어도 하나가 효소의 존재하에 수행된다. 일부 경우에, 산화 또는 환원 반응 중 적어도 하나가 효소에 의해 촉매된다. 일부 경우에, 산화 및 환원 반응이 모두 하나 이상의 효소가 있는 상태에서 수행된다. 일부 경우에, 하나 이상의 효소가 산화 및 환원 반응을 촉매하는 데 유용한다. 산화 및 환원 반응은 동일한 효소에 의해 촉매될 수 있다.
본 명세서에 기재된 일부 방법, 공정 및 시스템에서, 산화 또는 환원 반응은 효소의 존재 하에 수행될 수 있다. 일부 예에서, 효소는 탈수소효소일 수 있다. 탈수소효소는 기질로서 알코올 또는 알데하이드 작용기를 갖는 TA를 사용할 수 있다. 탈수소효소는 TA 알코올 또는 알데하이드 작용기를 상응하는 알데하이드 또는 알코올 유도체로 전환시킬 수 있다. 탈수소효소는 하이오스시아민 탈수소효소(HDH)로 지칭될 수 있다. 본 개시내용에서 TA의 산화 및/또는 사이토크롬 P450 산화효소, 2-옥소글루타레이트-의존적 산화효소, 플라빈단백질 산화효소, 단쇄 탈수소효소-환원효소 (SDR), 중간-사슬 탈수소효소-환원효소 (MDR), 신나밀 알코올 탈수소효소 (CAD), 및 알도-케토 환원효소 (AKR)을 포함한다. 예를 들어, 트로피논 환원효소 1(EC 1.1.1.206)은 트로피논 및 케톤 작용기가 있는 기타 TA 전구체를 트로핀 (3α-트로파놀) 및 다른 상응하는 알코올 생성물로 산화시킬 수 있다. 일부 예에서, 선행 예 중 어느 하나의 탈수소효소 도메인을 포함하는 단백질은 산화 또는 환원을 수행할 수 있다. 일부 예에서, 탈수소효소는 본원에 기재된 바와 같이 조작된 숙주 세포와 같은 숙주 세포 내에서 산화 및/또는 환원 반응을 촉매할 수 있다.
TA 알코올-알데하이드 상호전환을 수행하는데 사용될 수 있는 탈수소효소의 아미노산 서열의 예는 표 2에 제공된다. TA 알코올-알데하이드 상호전환에 사용되는 탈수소효소에 대한 아미노산 서열은 표 2에 열거된 주어진 아미노산 서열과 50% 이상 동일할 수 있다. 예를 들어, 이러한 탈수소효소에 대한 아미노산 서열은 본원에서 제공된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가로, 특정 구현예에서, "동일한" 아미노산 서열은 특정 아미노산 서열에 대해 아미노산 수준에서 적어도 80%-99% 동일성을 함유한다. 일부 경우에, "동일한" 아미노산 서열은 아미노산 수준에서 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 및 그 초과, 특정 경우에, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 동일성을 함유한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 동일할 수 있지만 DNA 서열은 예를 들어 숙주 유기체에 대한 코돈 사용을 최적화하기 위해 변경된다.
TA 알코올-알데하이드 상호전환을 촉매하는 탈수소효소를 생산하는 조작된 숙주 세포가 제공될 수 있으며, 탈수소효소는 표 2의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 조작된 숙주 세포 내에서 생성된 탈수소효소는 생체 촉매를 형성하기 위해 회수 및 정제될 수 있다. 탈수소효소를 생산하는 조작된 숙주 세포로부터 회수된 하나 이상의 효소는 TA 알코올-알데하이드 상호전환을 수행하기 위한 공정에서 사용될 수 있다. 상기 방법은 알코올 및/또는 알데하이드 작용기를 갖는 TA를 TA의 알코올 및/또는 알데하이드 기를 상응하는 알데하이드 및/또는 알코올 기로 전환시키기에 충분한 양의 탈수소효소와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 예에서, 알코올 및/또는 알데하이드 작용기를 갖는 TA는 상기 TA의 적어도 5%가 상응하는 알데하이드 및/또는 알코올 기로 전환되도록 충분한 양의 하나 이상의 효소와 접촉될 수 있다. 추가의 예에서, 알코올 및/또는 알데하이드 작용기를 보유하는 TA는 상기 TA의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 84%, 적어도 86%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 100%가 그것의 상응하는 알데하이드 및/또는 알코올 기와 전환되도록 충분한 양의 하나 이상의 효소와 접촉될 수 있다.
TA 알코올-알데하이드 상호전환을 수행하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 효소는 시험관내에서 TA와 접촉할 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, TA 알코올-알데하이드 상호전환을 수행하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 효소는 생체내에서 TA와 접촉할 수 있다. 추가로, TA 알코올-알데하이드 상호전환을 수행하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 효소는 내부에 TA를 갖는 세포에 제공될 수 있거나 조작된 숙주 세포 내에서 생성될 수 있다.
일부 예에서, 방법은 알칼로이드 생성물을 생성하는 조작된 숙주 세포를 제공하며, TA 알코올-알데하이드 상호전환은 알칼로이드 생성물 생성의 핵심 단계를 포함할 수 있다. 일부 예에서 생성된 알칼로이드는 의약 TA이다. 또 다른 구현예에서, 생성된 알칼로이드는 예를 들어 비-천연 TA를 포함하는 의약 TA로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 알코올 및/또는 알데하이드 작용기를 보유하는 TA는 조작된 숙주 세포의 생성물에 대한 중간체이다. 또 다른 구현예에서, 알칼로이드 생성물은 의약 TA, 비-의약 TA, 및 비-천연 TA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 기질은 TA 또는 리토린, 히오스시아민 알데하이드, 히오스시아민, 아니소다민, 및 스코폴라민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 TA의 전구체이다.
일부 예에서, 방법은 하이오스시아민 알데하이드로부터 알칼로이드 생성물을 생성하는 조작된 숙주 세포를 제공한다. 하이오스시아민 알데하이드를 하이오스시아민으로 환원시키는 것은 전구체로부터 다양한 알칼로이드 생성물을 생산하는 핵심 단계를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 전구체는 L-아미노산 또는 당(예를 들어, 글루코스)이다. 다양한 알칼로이드 생성물에는 의약 TA, 비-의약 TA 및 비-천연 TA가 포함될 수 있지만 이에 제한되지 않을 수 있다.
임의의 적합한 탄소 공급원은 TA 알코올-알데하이드 상호전환을 위한 전구체로서 사용될 수 있다. 적합한 전구체는 모노사카라이드 (예를 들어, 글루코스, 푸룩토스, 갈락토스, 자일로스), 올리고당 (예를 들어, 락토스, 수크로스, 라피노오스), 폴리사카라이드 (예를 들어, 전분, 셀룰로스), 또는 그의 조합을 포함하지만 이제 제한되지 않을 수 있다. 일부 예에서, 재생가능한 공급원료로부터의 정제되지 않은 혼합물이 사용될 수 있다(예를 들어, 옥수수 침지액액, 사탕무 당밀, 보리 맥아, 바이오매스 가수분해물). 또 다른 구현예에서, 탄소 전구체는 1-탄소 화합물(예를 들어, 메탄올, 이산화탄소) 또는 2-탄소 화합물(예를 들어, 에탄올)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 다른 탄소-함유 화합물, 예를 들어 메틸아민, 글루코사민 및 아미노산(예를 들어, L-아르기닌 및 L-페닐알라닌)이 사용될 수 있다. 일부 예에서, TA 또는 알코올 및/또는 알데하이드 작용기를 보유하는 TA의 전구체는, 예를 들어, 트로핀, 슈도트로핀, 에크고닌, 메틸에크고닌, 리토린, 하이오스시아민 알데하이드, 하이오스시아민, 아니소다민, 및 스코폴라민을 포함하여 본 발명의 조작된 숙주 세포에 직접 첨가될 수 있다.
일부 구현예에서, TA 알코올-알데하이드 상호전환을 수행하기 위해 사용되는 기질은 하나 이상의 알코올 및/또는 알데하이드 작용기를 포함할 수 있으며, 상기 작용기 중 하나만 산화되거나 상응하는 알데하이드 또는 알코올기로 환원된다.
세포내 및 세포외 대사산물 수송을 증가시키는 방법
본원에 제공된 일부 방법, 공정 및 시스템은 지질막을 가로질러 대사산물을 전위하기 위한 단백질(이후 '수송체'로 지칭됨)의 사용을 기재한다(이하 '막횡단 수송'으로 지칭됨). 이러한 방법, 공정 및 시스템 중 일부는 조작된 숙주 세포를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 막횡단 수송은 기질을 다양한 범위의 알칼로이드로 전환하는 핵심 단계이다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 지질 막에 국한되고 동일한 지질 막을 가로질러 TA 또는 TA 전구체를 전위시키는 하나 이상의 수송체 또는 그의 활성 단편에 대한 하나 이상의 이종성 코딩 서열을 포함한다. 일부 예에서, 지질막은 액포 막이다. 다른 예에서, 지질 막은 ER 막이다. 일부 예에서, 지질 막은 페록시솜 막이다. 다른 예에서, 지질막은 세포 원형질막이다.
일부 예에서, 이러한 방식으로 수송되는 TA 및 TA 전구체는 푸트레신, N-메틸푸트레신, 4-메틸아미노부탄알, N-메틸파이롤리늄, 트로피논, 트로핀, 페닐락트산, 1-O-β-페닐락토일글루코스, 리토린, 하이오스시아민, 아니소다민, 및 스코폴라민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 세포 아래 구획에서 이러한 TA 또는 TA 전구체의 축적은 상이한 구획에서 작동가능하게 연결된 생합성 효소에 의한 접근을 방해할 수 있고; 따라서 한 구획에서 다른 구획으로 TA 또는 TA 전구체를 전위시키는 수송체의 사용은 이러한 수송 제한을 완화할 수 있다. 특정 경우에, 숙주 세포 내의 하나 이상의 수송체에 대한 이종성 코딩 서열의 발현은 TA 또는 TA 전구체의 생산을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 수송체 또는 그의 활성 단편은 다중약물 및 독소 압출(MATE) 수송체이다. 전술한 TA 또는 TA 전구체 중 하나 이상을 수송하는 임의의 편리한 MATE 수송체가 대상 숙주 세포에서 사용된다. 관심 수송체 단백질에는 니코티아나 타바큠 자스모네이트-유도성 알칼로이드 수송체 1(NtJAT1), N. 타바큠 MATE1, N. 타바큠 MATE2 또는 표 1 및 표 4에 설명된 기타 효소와 같은 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 수송체 또는 그의 활성 단편은 질산염/펩타이드 패밀리(NPF) 수송체이다. 전술한 TA 또는 TA 전구체 중 하나 이상을 수송하는 임의의 편리한 NPF 수송체가 대상 숙주 세포에서 사용된다. 다른 구현예에서, 수송체 또는 그의 활성 단편은 ATP-결합 카셋트(ABC) 수송체이다. 전술한 TA 또는 TA 전구체 중 하나 이상을 수송하는 임의의 편리한 NPF 수송체가 대상 숙주 세포에서 사용된다. 일부 구현예에서, 수송체 또는 그의 활성 단편은 다면발현성 약물 내성(PDR) 수송체이다. 전술한 TA 또는 TA 전구체 중 하나 이상을 수송하는 임의의 편리한 PDR 수송체가 대상 숙주 세포에서 사용된다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 수송체 또는 그의 활성 단편에 대한 이종성 코딩 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 수송체의 아미노산 서열은 세포 아래 국소화, 기질 전위의 방향, 및/또는 효소의 위상 배향을 변경하는 하나 이상의 변형을 받는다. 이러한 변형의 예에는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: N-말단, C-말단, 또는 내부 신호 서열의 첨가, 제거, 또는 대체; 막횡단 나선의 첨가, 제거, 대체, 또는 재배열; 및 단백질 도메인의 수송체의 N- 및/또는 C-말단에의 융합.
기질 수송 제한을 완화하고/하거나 특정 세포 구획에서 TA 또는 TA 전구체의 축적을 증가시키는 데 사용할 수 있는 수송체의 아미노산 서열의 예는 표 4에 제공되어 있다. 비-식물 세포에서 이러한 방식으로 이용되는 수송체에 대한 아미노산 서열은 표 4에 열거된 주어진 아미노산 서열과 50% 이상 동일할 수 있다. 예를 들어, 이러한 수송체에 대한 아미노산 서열은 본원에서 제공된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 또는 그 초과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 추가로, 특정 구현예에서, "동일한" 아미노산 서열은 특정 아미노산 서열에 대해 아미노산 수준에서 적어도 80%-99% 동일성을 함유한다. 일부 경우에, "동일한" 아미노산 서열은 아미노산 수준에서 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 및 그 초과, 특정 경우에, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 동일성을 함유한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 동일할 수 있지만 DNA 서열은 예를 들어 숙주 유기체에 대한 코돈 사용을 최적화하기 위해 변경된다.
하나의 세포 구획에서 다른 구획으로 하나 이상의 TA 또는 TA 전구체를 전위시키는 수송체를 생성하는 조작된 비-식물 숙주 세포가 제공될 수 있으며, 수송체는 표 4의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 예에서, 방법은 알칼로이드 생성물을 생산하는 조작된 비-식물 숙주 세포를 제공하며, TA 막횡단 수송은 알칼로이드 생성물의 생산에서 핵심 단계를 포함할 수 있다. 일부 예에서 생성된 알칼로이드는 의약 TA이다. 또 다른 구현예에서, 생성된 알칼로이드는 예를 들어 비-천연 TA를 포함하는 의약 TA로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 알칼로이드 생성물은 의약 TA, 비-의약 TA, 및 비-천연 TA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이종성 코딩 서열
일부 예에서, 숙주 세포는 숙주 세포가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 원하는 관심 있는 TA를 생산할 수 있게 하는 활성(들)을 인코딩하는 하나 이상의 이종성 코딩 서열(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 심지어 그 초과)을 보유하는 세포이다. 본원에서 사용된 바와 같이,용어 "이종성 코딩 서열"은 통상적으로 숙주 유기체에 존재하지 않고 적절한 조건 하에 숙주 세포에서 발현될 수 있는 펩타이드 또는 단백질 또는 그의 동등한 아미노산 서열, 예를 들어 효소를 코딩하거나 궁극적으로 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 나타내기 위해 사용된다. 이와 같이, "이종성 코딩 서열"은 숙주 세포에 정상적으로 존재하는 코딩 서열의 다중 카피를 포함하여, 세포가 세포에 정상적으로 존재하지 않는 코딩 서열의 추가 카피를 발현하도록 한다. 이종성 코딩 서열은 RNA 또는 그의 임의의 유형, 예를 들어 mRNA, DNA 또는 그의 임의의 유형, 예를 들어 cDNA, 또는 RNA/DNA의 하이브리드일 수 있다. 관심 코딩 서열은 코딩 서열, 인트론, 프로모터 영역, 3'-UTR 및 인핸서 영역과 같은 특징을 포함하는 전장 전사 단위를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
예에서, 조작된 숙주 세포는 각각 효소를 인코딩하는 복수의 이종성 코딩 서열을 포함한다. 일부 예에서, 복수의 이종성 코딩 서열에 의해 인코딩된 복수의 효소는 서로 상이할 수 있다. 일부 예에서, 복수의 이종성 코딩 서열에 의해 코딩되는 복수의 효소 중 일부는 서로 상이할 수 있고, 복수의 이종성 코딩 서열에 의해 코딩되는 복수의 효소 중 일부는 중복 카피일 수 있다.
일부 예에서, 이종성 코딩 서열은 작동가능하게 연결될 수 있다. 작동 가능하게 연결된 이종성 코딩 서열은 특정 트로판 알칼로이드 생성물을 생산하는 동일한 경로 내에 있을 수 있다. 일부 예에서, 작동가능하게 연결된 이종성 코딩 서열은 특정 트로판 알칼로이드 생성물을 생성하는 경로를 따라 직접적으로 순차적일 수 있다. 일부 예에서, 작동 가능하게 연결된 이종성 코딩 서열은 복수의 이종성 코딩 서열에 의해 인코딩되는 효소 중 하나 이상 사이에 하나 이상의 천연 효소를 가질 수 있다. 일부 예에서, 이종성 코딩 서열은 복수의 이종성 코딩 서열에 의해 코딩되는 하나 이상의 효소 사이에 하나 이상의 이종성 효소를 가질 수 있다. 일부 예에서, 이종성 코딩 서열은 복수의 이종성 코딩 서열에 의해 코딩되는 하나 이상의 효소 사이에 하나 이상의 비-천연 효소를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제(PMT) 활성을 포함한다. 임의의 편리한 PMT 효소가 대상 숙주 세포에서 사용된다. 관심 있는 PMT 효소에는 표 1에 기재된 바와 같이 EC 2.1.1.53과 같은 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 PMT 또는 그의 활성 단편에 대한 이종성 코딩 서열을 포함한다.
일부 경우에, 숙주 세포는 NMP를 4MAB로 전환시키는 하나 이상의 효소 또는 그의 활성 단편에 대한 하나 이상의 이종성 코딩 서열을 포함한다. 특정 경우에, 하나 이상의 효소는 식물 메틸푸트레신 산화효소(MPO) 및 진핵생물 MPO(예를 들어, EC 1.4.3.22)로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 세포는 NMPy를 MPOB로 전환시키는 하나 이상의 효소 또는 그의 활성 단편에 대한 하나 이상의 이종성 코딩 서열을 포함한다. 특정 경우에, 하나 이상의 효소는 III형 폴리케타이드 합성효소(예를 들어, EC 2.3.1.-)이다. 하나 이상의 이종성 코딩 서열은 임의의 편리한 종(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 이종성 코딩 서열은 표 1에 기재된 종으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 이종성 코딩 서열은 표 1에 기재된 것들로부터 선택된 유전자 또는 효소에 존재한다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 트로피논 합성효소 활성을 포함한다. 임의의 편리한 트로피논 합성효소 효소(예를 들어, CYP82M3)는 대상 숙주 세포에서 사용된다. 관심 있는 트로피논 합성효소 효소는 표 1에 기재된 바와 같이 EC 1.14.14.-와 같은 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 트로피논 합성효소 또는 그의 활성 단편에 대한 이종성 코딩 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 트로피논 환원효소 활성을 포함한다. 임의의 편리한 트로피논 환원효소 효소가 대상 숙주 세포에서 사용된다. 관심 있는 트로피논 환원효소 효소에는 표 1에 기재된 바와 같이 EC 1.1.1.206과 같은 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 트로피논 환원효소 또는 그의 활성 단편에 대한 이종성 코딩 서열을 포함한다.
일부 경우에, 숙주 세포는 페닐피루베이트 환원효소(PPR) 활성을 포함한다. 임의의 편리한 PPR 효소가 대상 숙주 세포에서 사용된다. 관심 있는 일부 PPR 효소에는 표 1에 기재된 바와 같이 EC 1.1.1.237과 같은 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 PPR 또는 그의 활성 단편에 대한 이종성 코딩 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 페닐락테이트 글리코실트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 임의의 편리한 페닐락테이트 글리코실트랜스퍼라제 효소가 대상 숙주 세포에서 사용된다. 글리코실트랜스퍼라제 효소에는 표 1에 기재된 바와 같이 글라이코사이드 에스테르 결합을 통해 UDP-글루코스에서 페닐락테이트로 글루코스 모이어티를 전달하는 2.4.1.-과 같은 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 페닐락테이트 글리코실트랜스퍼라제 또는 그의 활성 단편에 대한 이종성 코딩 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 세포는 트로핀 및 1-O-β-페닐락토일글루코스를 리토린으로 전환시키는 하나 이상의 효소 또는 그의 활성 단편에 대한 하나 이상의 이종성 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 리토린 합성효소 활성을 포함한다. 임의의 편리한 리토린 합성효소 효소 또는 리토린 합성효소 활성 단편을 포함하는 효소가 대상 숙주 세포에서 사용된다. 관심 리토린 합성효소 효소는 표 1에 기재된 바와 같은 EC 2.3.1.-와 같은 효소, 및 N-말단이 표 3에 기술된 가용성 단백질 도메인에 융합된 리토린 합성효소 효소를 포함하는 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 리토린 합성효소 또는 그의 활성 단편에 대한 이종성 코딩 서열을 포함한다.
특정 예에서, 숙주 세포는 리토린 뮤타제 활성을 포함한다. 임의의 편리한 리토린 뮤타제 효소가 대상 숙주 세포에서 사용된다. 관심 있는 리토린 뮤타제 효소에는 표 1에 기재된 바와 같이 EC 1.14.19.-와 같은 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 리토린 뮤타제 또는 그의 활성 단편에 대한 이종성 코딩 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 하이오스시아민 탈수소효소(HDH) 활성을 포함한다. 임의의 편리한 HDH 효소는 대상 숙주 세포에서 사용된다. 일부 HDH 효소에는 표 2에 기재된 서열을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 HDH 또는 그의 활성 단편에 대한 이종성 코딩 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 하이오스시아민 6β-하이드록실라제/디옥시게나제(H6H) 활성을 포함한다. 임의의 편리한 H6H 효소가 대상 숙주 세포에서 사용된다. 관심 있는 일부 H6H 효소에는 표 1에 기재된 바와 같이 EC 1.14.11.11과 같은 효소를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 H6H 또는 그의 활성 단편에 대한 이종성 코딩 서열을 포함한다.
특정 예에서, 조작된 숙주 세포는 각각이 막횡단 대사물질 수송체를 인코딩하는 복수의 이종성 코딩 서열을 포함한다. 일부 예에서, 복수의 이종성 코딩 서열에 의해 인코딩된 복수의 수송체는 서로 상이할 수 있다. 일부 예에서, 복수의 이종성 코딩 서열에 의해 인코딩된 복수의 수송체 중 일부는 서로 상이할 수 있고, 복수의 이종성 코딩 서열에 의해 인코딩된 복수의 수송체 중 일부는 복제 카피일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종성 코딩 서열"은 또한 펩타이드 또는 효소의 코딩 부분, 즉 펩타이드 또는 효소 cDNA 또는 mRNA 서열뿐만 아니라 전장 전사 단위, 즉 인트론 및 엑손을 포함하는 유전자의 코딩 부분뿐만 아니라 "코돈 최적화된" 서열, 절단된 서열 또는 동등한 아미노산 서열에 대한 효소 또는 코드를 코딩하는 변경된 서열의 다른 형태를 포함하되, 단 동등한 아미노산 서열은 기능성 단백질을 생성한다. 이러한 동등한 아미노산 서열은 N-말단, C-말단 또는 내부의 결실인 하나 이상의 아미노산의 결실을 가질 수 있다. 절단된 형태는 본 명세서에 표시된 촉매 능력을 갖는 한 구상된다. 촉매 활성이 유지된다면, 경로에서 대사산물의 전달을 촉진하기 위해 둘 이상의 효소의 융합이 또한 구상된다. 또한 비-촉매 단백질 도메인이 융합된 촉매 도메인의 가용화, 폴딩, 성숙 및/또는 활성을 촉진하는 방식으로 하나 이상의 효소 또는 촉매 단백질 도메인과 하나 이상의 비-촉매 단백질 도메인의 융합이 포함된다.
작동 가능한 단편, 돌연변이체 또는 절단된 형태는 모델링 및/또는 스크리닝에 의해 식별될 수 있다. 이는 예를 들어 단백질의 N-말단, C-말단 또는 내부 영역을 단계적 방식으로 첨가 또는 결실시킨 후, 생성된 유도체를 원래의 서열과 비교하여 목적하는 반응에 대한 그의 활성과 관련하여 분석함으로써 가능하다. 해당 유도체가 이 용량으로 작동하는 경우 고유 효소의 동등한 유도체를 구성하는 것으로 간주된다.
본 발명의 양태는 또한 다양한 효소에 대한 천연 아미노산 서열과 등가인 아미노산 서열을 코딩하는 이종성 코딩 서열에 관한 것이다. "동등한" 아미노산 서열은 특정 아미노산 서열과 동일하지 않고 오히려 적어도 일부 아미노산 변화(결실, 치환, 역전, 삽입 등)를 포함하는 아미노산 서열로 정의된다. 원하는 목적으로 사용될 때 특정 아미노산 서열의 유사한 활성과 비교하여 단백질의 생물학적 활성에 본질적으로 영향을 미치지 않는다. 생물학적 활성은 탈탄산효소의 예에서 촉매 활성을 의미한다. 동등 서열은 또한 원래의 아미노산 서열과 상이한 특성을 갖도록 조작 및/또는 진화된 것들을 포함하는 것을 의미한다. 관심의 가변 속성에는 촉매 활성, 기질 특이성, 선택성, 안정성, 용해도, 국소화 등이 포함된다. 특정 구현예에서, "동등한" 아미노산 서열은 특정 아미노산 서열에 대해 아미노산 수준에서 적어도 80%-99% 동일성, 일부 경우에, 아미노산 수준에서 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 및 더 특정 경우에, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 동일성을 함유한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 동일할 수 있지만 DNA 서열은 예를 들어 숙주 유기체에 대한 코돈 사용을 최적화하기 위해 변경된다.
숙주 세포는 또한 이종성 코딩 서열을 수용하기 위해 하나 이상의 유전적 변경을 보유하도록 변형될 수 있다. 천연 숙주 게놈의 변경은 원하는 경로를 방해할 수 있는 특정 단백질의 발현을 감소 또는 제거하기 위해 게놈을 변형하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 천연 단백질의 존재는 경로의 중간체 또는 최종 생성물 중 하나를 원하는 경로에서 사용할 수 없는 대사산물 또는 기타 화합물로 빠르게 전환시킬 수 있다. 따라서, 천연 효소의 활성이 감소되거나 전혀 없다면, 생성된 중간체는 원하는 생성물에 포함시키기 위해 더 쉽게 이용가능할 것이다.
일부 예에서, 단백질 발현의 절제가 관심의 대상이 될 수 있는 경우, 변경은 ATP 결합 카셋트 (ABC) 수송체, 다중약물 내성 (MDR) 펌프, 및 연관된 전사 인자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다면발현성 약물 반응에 관여하는 단백질에 변경이 있다. 이러한 단백질은 TA 분자 및 TA 전구체를 배양 배지로 내보내는 데 관여하므로 결실은 화합물이 배지로 내보내는 것을 제어하여, 원하는 생성물에 더 많이 통합할 수 있도록 한다. 일부 구현예에서, 관심 숙주 세포 유전자 결실은 폴딩되지 않은 단백질 반응 및 소포체(ER) 증식과 관련된 유전자를 포함한다. 이러한 유전자 결실은 개선된 TA 생산으로 이어질 수 있다. 사이토크롬 P450의 발현은 폴딩되지 않은 단백질 반응을 유도할 수 있고 ER이 증식하게 할 수 있다. 이러한 스트레스 반응과 관련된 유전자의 결실은 숙주 세포에 대한 전반적인 부담을 조절하거나 감소시키고 경로 성능을 개선할 수 있다. 유전적 변경은 또한 내인성 유전자의 프로모터를 변형하여 발현을 증가시키고/시키거나 내인성 유전자의 추가 카피를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 이것의 예는 이종성 P450 효소의 활성을 증가시키기 위해 내인성 효모 NADPH-P450 환원효소 Ncp1p를 과발현하는 균주의 구축/사용을 포함한다. 또한 Spe1p, Fms1p, Car1p, Arg2p, Aro8p, Aro9p, Pha2p, Ugp1p, 및 Leu2p와 같이 중간 대사산물의 합성에 직접 관여하는 내인성 효소도 과발현될 수 있다.
관심 있는 이종성 코딩 서열은 식물에서 일반적으로 TA 및 전구체의 생산을 담당하는 야생형 또는 동등 서열의 효소를 인코딩하는 서열을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 이종성 서열이 코딩하는 효소는 TA 경로의 임의의 효소일 수 있고 임의의 편리한 공급원으로부터 유래할 수 있다. 특정 합성 경로에 대한 이종성 코딩 서열에 의해 인코딩되는 효소의 선택 및 수는 원하는 생성물에 기초하여 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 또는 심지어 15 또는 그 초과 개의 이종성 코딩 서열, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 이종성 코딩 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 이종성 코딩 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드 서열은 GENBANK에 보고된 바와 같다. 관심 효소에는 본원에 기재된 효소 및 표 1에 제시된 효소를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 숙주 세포는 임의의 공급원으로부터 열거된 효소의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한 표 1의 등록 번호는 GenBank를 나타낸다. 일부 등록 번호는 사카로마이세스 게놈 데이터베이스(SGD)를 지칭하며, 이 데이터베이스는 월드 와이드 웹 yeastgenome.org에서 이용가능하다.
일부 구현예에서, 숙주 세포(예를 들어, 효모 균주)는 세포 내의 구획에 하나 이상의 효소를 국소화함으로써 관심 있는 TA의 선택적 생산을 위해 조작된다. 일부 경우에, 효소는 숙주 세포에 위치하여 이 효소에 의해 생성된 화합물이 자발적으로 재배열되거나 화합물을 바람직하지 않은 대사산물로 전환할 수 있는 국부적 효소에 도달하기 전에 다른 효소에 의해 바람직한 대사산물로 전환될 수 있다. 두 효소 사이의 공간 거리는 효소 중 하나가 화합물에 직접 작용하여 바람직하지 않은 대사산물을 만드는 것을 방지하고 바람직하지 않은 최종 생성물(예를 들어, 바람직하지 않은 오피오이드 부산물)의 생산을 제한하도록 선택될 수 있다. 일부 다른 경우에, 효소는 그것이 위치한 세포 아래 구획이 더 최적의 pH, 보조인자 농도, 산화환원 전위, 기질 농도 및/또는 효소가 자연적으로 발견되는 구획보다 활성에 대한 기타 생화학적 파라미터를 제공하도록 숙주 세포에 국한될 수 있다. 특정 경우에, 효소는 효소가 상기 구획으로 수송되는 세포내 트래피킹 경로가 활성을 나타내는 효소에 필요한 번역 후 변형을 제공하도록 숙주 세포 내의 특정 구획에 국한될 수 있다. 이러한 번역 후 변형에는 아세틸화, 아세틸글리코실화, 아미드화, 카복실화, 메틸화, 글루타티오닐화, 하이드록실화, 글리코실화, 인산화, 설폰화, 이황화물 결합 형성, 신호 서열의 절단, 및 다중 효소 복합체 형성을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 효소는 단독으로 또는 제2 효소와 함께 세포소기관, 소포체, 골지, 액포, 핵, 원형질막, 미토콘드리아, 페록시솜, 주변세포질, 상기 언급된 세포소기관 중 임의?? 것의 내강, 또는 상기 언급된 세포소기관 중 임의의 것을 둘러싸거나 연관된 막을 포함하지만 이에 제한되지 않는 숙주 세포에서 임의의 편리한 구획으로 국부화될 수 있다. 하나 이상의 효소가 전술한 세포소기관 중 어느 것과 관련된 막에 국한되는 경우, 효소의 촉매 도메인이 사이토졸, 세포소기관의 내강 및/또는 기타 세포내 공간을 향하도록 효소가 배향될 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 국소화 태그를 포함하는 효소 중 하나 이상을 포함한다. 편리한 태그를 사용할 수 있다. 일부 경우에, 국소화 태그는 효소의 N-말단 및/또는 C-말단에 부착된 펩타이드 서열이다.
효소에 태그를 부착하기 위해 임의의 편리한 방법이 이용될 수 있다. 일부 경우에, 국소화 태그가 내인성 효모 단백질에서 유래된다. 이러한 태그는 소포체(ER), 골지체(GA), 미토콘드리아(MT), 원형질막(PM), 페록시솜(POX) 및 액포(V)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 효모 세포소기관에 대한 경로를 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 태그는 ER 라우팅 태그(예를 들어, ER1)이다. 특정 구현예에서, 태그는 액포 태그(예를 들어, V1)이다. 특정 구현예에서, 태그는 원형질막 태그(예를 들어, P1)이다. 특정 구현예에서, 태그는 페록시솜-표적화 서열(예를 들어, PTS1)이다. 특정 예에서, 태그는 꼬리-고정된 부류의 단백질 내로부터의 막횡단 도메인을 포함하거나 그로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 국소화 태그는 세포소기관의 외부에 효소를 위치시킨다. 특정 구현예에서, 국소화 태그는 세포소기관의 내부에 효소를 위치시킨다. 일부 구현예에서, 국소화 태그는 효소의 하나 이상의 부분이 세포소기관의 내부 및 외부 모두에서 발견되도록 효소를 위치시킨다.
본 발명의 일부 구현예에서, 숙주 세포는 상기 기재된 국소화 태그를 포함하는 하나 이상의 효소를 인코딩하는 하나 이상의 코딩 서열의 발현에 의해 변형된다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 효소가 사이토졸에서 발현되도록 하나 이상의 이종성 코딩 서열의 발현에 의해 변형된다. 이러한 효소의 예는 아르기닌 탈탄산효소, 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제, 파이롤리딘 케타이드 합성효소, 트로피논 환원효소, 페닐피루베이트 환원효소, UDP-글루코실트랜스퍼라제, 및 2-옥소글루타레이트-의존적 디옥시게나제 예컨대 하이오스시아민 6β-하이드록실라제/디옥시게나제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 효소가 ER 막에서 발현되도록 하나 이상의 이종성 코딩 서열의 발현에 의해 변형된다. 이러한 효소의 예에는 사이토크롬 P450 예컨대 트로피논 합성효소 (CYP82M3) 및 리토린 뮤타제 (CYP80F1), 및 NADP+-사이토크롬 P450 환원효소를 함하만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 효소가 미토콘드리아에서 발현되도록 하나 이상의 이종성 코딩 서열의 발현에 의해 변형된다. 이러한 효소의 예는 N-아세틸글루타메이트 합성효소를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 효소가 페록시솜에서 발현되도록 하나 이상의 이종성 코딩 서열의 발현에 의해 변형된다. 이러한 효소의 예는 N-메틸푸트레신 산화효소와 같은 아민 산화효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 효소가 액포 내강에서 발현되도록 하나 이상의 이종성 코딩 서열의 발현에 의해 변형된다. 이러한 효소의 예는 세린 카르복시펩티다제-유사 아실트랜스퍼라제, 예를 들어 리토린 합성효소, 및 이의 조작된 변이체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 효소 또는 단백질이 액포 막에서 발현되도록 하나 이상의 이종성 코딩 서열의 발현에 의해 변형된다. 이러한 단백질의 예는 다중약물 및 독소 압출 수송체, 니트레이트/펩타이드 계열 수송체, 및 ATP 결합 카셋트 수송체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 효소 또는 단백질이 원형질막에서 발현되도록 하나 이상의 이종성 코딩 서열의 발현에 의해 변형된다. 이러한 단백질의 예에는 ATP-결합 카셋트 수송체, 다면발현성 약물 내성 수송체 및 다중약물 내성 수송체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 효소의 각 유형의 발현은 중간 축적 및/또는 관심 생산 TA를 증가시키는 추가 유전자 카피(즉, 다중 카피)을 통해 증가된다. 본 발명의 구현예는 단일 또는 다중 효소의 다중 종 변이체의 동시 발현을 통해 숙주 세포에서 증가된 관심 있는 TA 생성을 포함한다. 일부 경우에, 단일 또는 다중 효소의 추가 유전자 카피이 숙주 세포에 포함된다. 숙주 세포에서 효소에 대한 이종성 코딩 서열의 다중 카피를 포함하는 임의의 편리한 방법이 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 효소에 대한 이종성 코딩 서열의 다중 카피, 예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 심지어 10개 이상의 카피를 포함한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 등의 다중 카피와 같은 하나 이상의 효소에 대한 이종성 코딩 서열의 다중 카피를 포함한다. 일부 경우에, 효소에 대한 이종성 코딩 서열의 다중 카피는 숙주 세포와 비교하여 둘 이상의 상이한 공급원 유기체로부터 유래된다. 예를 들어, 숙주 세포는 하나의 이종성 코딩 서열의 다중 카피를 포함할 수 있으며, 카피 각각은 상이한 공급원 유기체로부터 유래된다. 이와 같이, 각각의 카피는 이종성 코딩 서열에 의해 코딩되는 관심 효소의 종간 차이에 기초한 명시적 서열의 일부 변이를 포함할 수 있다.
숙주 세포의 일부 구현예에서, 이종성 코딩 서열은 에스케리치아 콜라이 , 바실러스 코아굴란스 , 락타바실러스 카세이 , 락토바실러스 플란타룸 , 락토바실러스 spp, 윅케르하미아 플루오레스센스 , 아에쿠오리아 spp , 디스코소마 spp , 아라비돕시스 탈리아나 , 아베나 사티바 , 솔라늄 라이코페르시쿰 , 솔라눔 투베로섬 , 니코티아나 타바큠 , 니코티아나 벤타미아나 , 아트로파 벨라돈나 , 하이오스시아무스 니제르, 하이오스시아무스 무티쿠스 , 다투라 스트라모늄 , 다투라 메텔 , 다투라 이녹시아 , 두보이시아 마이오포로이데스 , 아니소두스 루리더스 , 아니소두스 탄구티쿠스 , 아니소두스 아쿠탄굴루스 , 브르그만시아 아르보레아, 브르그만시아 X 칸디다, 브르그만시아 산구이네아 , 에리트록실룸 코카 , 코클레아리아 오피시날리스 , 솔라늄 spp, 니코티아나 spp , 아트로파 spp , 하이오스시아무스 spp , 다투라 spp , 두보이시아 spp , 아니소두스 spp , 브르그만시아 spp , 에리트록실룸 spp , 또는 코클레아리아 spp로 이루어진 군으로부터 선택된 공급원 유기체로부터의 것이다. 특정 예에서, 이종성 코딩 서열은 A. 벨라도나, H. 니거 및 D. 스트라모늄으로부터 선택된 공급원 유기체로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 표 1에 기재된 하나 이상의 공급원 유기체로부터의 이종성 코딩 서열을 포함한다.
조작된 숙주 세포 배지는 관심 있는 TA의 생산에 대해 샘플링되고 모니터링될 수 있다. 관심 있는 TA는 편리한 방법을 사용하여 관찰하고 측정할 수 있다. 관심 방법에는 관심 샘플이 알려진 양의 표준 화합물과 비교하여 분석되는 LC-MS 방법(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 동일성은 예를 들어 m/z 및 MS/MS 단편화 패턴에 의해 확인될 수 있으며, 화합물의 정량화 또는 측정은 해당 LC-MS를 참조하여 알려진 정체 시간의 LC 흔적 피크 및/또는 EIC MS 피크 분석을 통해 달성할 수 있다. 화합물의 알려진 양의 표준 분석.
방법
공정 단계
상기 요약된 바와 같이, 본 발명의 양태는 관심 있는 트로판 알칼로이드(TA)의 제조 방법을 포함한다. 이와 같이, 본 발명의 측면은 세포가 관심 출발 화합물을 관심 생성물 TA 또는 그의 전구체 (예를 들어, 예비-에스테르화 TA)로 전환시키도록 하나 이상의 숙주 세포 변형 (예를 들면, 본원에 기재된 바와 같음)이 기능적으로 발현되는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.. 또한 하나 이상의 이종성 코딩 서열이 기능적으로 발현되고 관심 출발 화합물을 관심 생성물 TA로 전환하도록 단백질 생산에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 경우에, 상기 방법은 트로판 알칼로이드(TA)를 제조하는 방법이며, 숙주 세포를 배양하는 단계(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음); 세포 배양물에 출발 화합물을 첨가하는 단계; 및 세포 배양물로부터 TA를 회수하는 단계를 포함한다. 방법의 일부 구현예에서, 출발 화합물, TA 생성물 및 숙주 세포는 표 1의 항목 중 하나로 기재되어 있다.
발효 배지에는 적절한 탄소 기질이 포함될 수 있다. 본 개시내용의 방법을 수행하기에 적합한 탄소 공급원은 매우 다양한 탄소 함유 기재를 포함할 수 있다. 적합한 기질은 모노사카라이드 (예를 들어, 글루코스, 푸룩토스, 갈락토스, 자일로스), 올리고당 (예를 들어, 락토스, 수크로스, 라피노오스), 폴리사카라이드 (예를 들어, 전분, 셀룰로스), 또는 그의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 재생 가능한 공급원료의 정제되지 않은 혼합물을 사용할 수 있다(예를 들어, 옥수수 침지액, 사탕무 당밀, 보리 맥아). 일부 경우에, 탄소 기질은 1탄소 기질(예를 들어, 메탄올, 이산화탄소) 또는 2탄소 기질(예를 들어, 에탄올)일 수 있다. 다른 경우에, 다른 탄소 함유 화합물, 예를 들어 메틸아민, 글루코사민 및 아미노산이 사용될 수 있다.
숙주 세포를 배양하는 임의의 편리한 방법을 사용하여 관심 있는 TA 전구체 및 다운스트림 TA를 생성할 수 있다. 사용되는 특정 프로토콜은 예를 들어 숙주 세포, 이종성 코딩 서열, 원하는 TA 전구체 및 관심 있는 다운스트림 TA 등에 따라 다를 수 있다. 세포는 세포가 하나 이상의 기능적 이종성 효소를 발현할 수 있는 환경과 같은 임의의 편리한 환경에 존재할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 시험관 내(in vitro)는 단순히 세포의 위치에 관계없이 살아있는 세포의 외부를 의미한다. 본 명세서에서 생체 내(in vivo)라는 용어는 세포의 위치에 관계없이 살아있는 세포 내부를 의미한다. 일부 구현예에서, 세포는 효소 발현에 도움이 되는 조건 하에 그리고 생체내에서 관심 있는 TA 전구체 및 다운스트림 TA의 생산을 가능하게 하는 적절한 기질과 함께 배양된다. 일부 구현예에서, 기능적 효소는 시험관내 조건 하에 TA의 생산을 위해 숙주로부터 추출된다. 일부 경우에, 숙주 세포는 다세포 숙주 유기체에 다시 배치된다. 숙주 세포는 고정 기 및 로그 성장 기 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 성장 기에 있다. 또한, 배양 자체는 연속 배양일 수도 있고 배치 배양일 수도 있다.
세포는 20-40ºC 사이의 온도에서 적절한 발효 배지에서 성장할 수 있다. 세포는 임의의 편리한 속도(예를 들어, 200rpm)에서 흔들면서 성장할 수 있다. 세포는 적절한 pH에서 성장할 수 있다. 발효에 적합한 pH 범위는 pH 5-9일 수 있다. 발효는 호기성, 혐기성 또는 미세호기성 조건에서 수행될 수 있다. 임의의 적합한 성장 배지가 사용될 수 있다. 적합한 성장 배지는 제한 없이 합성 정의된(SD) 적어도 배지 또는 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YEPD) 풍부 배지와 같은 일반적인 상업적으로 제조된 배지를 포함할 수 있다. 미생물에 적합한 기타 풍부하거나 정의된 또는 합성 성장 배지를 사용할 수 있다.
세포는 본질적으로 임의의 크기 및 모양의 용기에서 배양될 수 있다. 본 개시내용의 방법을 수행하기에 적합한 용기의 예는 제한 없이 다중-웰 쉐이크 플레이트, 시험관, 플라스크 (배플드 및 비-배플드), 및 생물반응기를 포함할 수 있다. 배양물의 부피는 10 마이크로리터에서 10,000 리터 초과의 범위일 수 있다.
알칼로이드 생산에 바람직한 방식으로 대사를 조절하는 것으로 알려진 제제를 성장 배지에 첨가하는 것이 포함될 수 있다. 비제한적인 예에서, 고리형 아데노신 2'3'-모노포스페이트를 성장 배지에 첨가하여 이화 대사물 억제를 조절할 수 있다.
특정 세포 유형에 대한 임의의 편리한 세포 배양 조건이 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 변형을 포함하는 숙주 세포는 표준 세포 배양 배지 및 보충물과 함께 표준 또는 용이하게 최적화된 조건 하에 배양된다. 일례로, 플라스미드 유지를 위한 선택적 압력이 필요하지 않은 경우 표준 성장 배지는 20g/L 효모 추출물, 10g/L 펩톤 및 20g/L 덱스트로스(YPD)를 포함할 수 있다. 플라스미드를 포함하는 숙주 세포는 성장 및 선택에 필요한 적절한 아미노산이 보충된 1.7g/L 효모 질소 염기, 5g/L 황산암모늄 및 20g/L 덱스트로스를 포함하는 합성 완전(SC) 배지에서 성장한다. 유도성 효소 발현에 유용할 수 있는 대체 탄소 공급원은 수크로스, 라피노스 및 갈락토스를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 세포는 용기, 예를 들어, 실험실에서 1-1000mL 이상의 부피 범위의 시험관 또는 플라스크에서 편리한 속도(예를 들어, 200rpm)로 진탕하면서 편리한 온도(예를 들어, 30ºC)에서 성장한다.
배양 부피는 예를 들어 산업 공정의 일부로 더 큰 발효 용기에서 성장을 위해 확장될 수 있다. 산업적 발효 공정은 폐쇄-배치, 유가 또는 연속 케모스탯 조건, 또는 임의의 적합한 발효 방식 하에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 전체 세포 촉매로서 기질 상에 고정화될 수 있고 알칼로이드 생산을 위한 발효 조건에 적용될 수 있다.
배치 발효는 배지의 조성이 발효 초기에 설정되고 발효 과정 동안 변경되지 않는 폐쇄 시스템이다. 발효 초기에 원하는 유기체를 배지에 접종한다. 일부 경우에, pH 및 산소 농도(탄소 제외)와 같은 인자를 제어하기 위해 시스템을 변경하여 배치 발효를 실행한다. 이러한 유형의 발효 시스템에서, 시스템의 바이오매스 및 대사산물 조성은 발효 과정에서 지속적으로 변경된다. 세포는 일반적으로 지연기를 거쳐, 로그 기(높은 성장률)로 진행한 다음, 고정 기(성장률이 감소하거나 중단됨)로 진행하고 결국에는 사멸 기(치료하지 않고 방치하면)로 진행한다.
유가식 발효는 발효 과정에서 기질이 일정 간격으로 시스템에 추가된다는 점을 제외하고는 배치 발효와 유사한다. 유가식 시스템은 숙주 세포의 대사에 대한 이화 대사물 억제의 영향을 줄이고 성장 배지에서 기질의 양을 제한해야 하는 기타 상황에서 사용된다.
연속 발효는 정의된 발효 배지가 생물 반응기에 연속적으로 추가되고 동일한 양의 발효 배지가 처리를 위해 용기에서 연속적으로 제거되는 개방형 시스템이다. 연속 발효 시스템은 일반적으로 제거되는 배지로 인한 세포 손실이 발효의 성장률과 균형을 이루어야 하는 정상 상태의 성장 조건을 유지하기 위해 작동된다. 연속 발효는 일반적으로 세포가 일정한 높은 세포 밀도에 있는 조건에서 작동된다. 연속 발효는 표적 생성물 농도 및/또는 세포 성장에 영향을 미치는 하나 이상의 인자의 조절을 허용한다.
액체 매질은 전술한 첨가제 성분을 갖는 풍부하거나 합성 정의된 매질을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 배지 성분은 물에 용해되고 열, 압력, 여과, 방사선, 화학물질 또는 이들의 임의의 조합에 의해 멸균될 수 있다. 여러 배지 성분을 별도로 준비하고 멸균한 다음 발효 용기에서 합칠 수 있다. 배양 배지는 발효 전반에 걸쳐 일정한 pH를 유지하는 데 도움이 되도록 완충될 수 있다.
온도, 용존 산소, pH, 교반, 통기 속도 및 세포 밀도를 포함한 공정 파라미터는 발효 과정에서 모니터링되거나 제어될 수 있다. 예를 들어, 발효 과정의 온도는 배양 배지에 침지된 온도 프로브에 의해 모니터링될 수 있다. 배양 온도는 재킷 온도를 조절하여 설정점에서 제어할 수 있다. 물은 외부 냉각기에서 냉각된 다음, 생물반응기 제어탑으로 흐르고 용기의 설정점 온도를 유지하는 데 필요한 온도에서 재킷으로 순환될 수 있다.
추가로, 가스 흐름 파라미터는 발효 과정에서 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 가스는 스파저를 통해 배지로 흐를 수 있다. 본 개시내용의 방법에 적합한 기체는 압축 공기, 산소 및 질소를 포함할 수 있다. 가스 흐름은 고정된 속도로 이루어지거나 용존 산소 설정점을 유지하기 위해 조절될 수 있다.
배양 배지의 pH도 모니터링할 수 있다. 예에서, pH는 용기 내부의 배양 배지에 침지된 pH 프로브에 의해 모니터링될 수 있다. pH 제어가 유효한 경우, pH는 필요한 속도로 배지에 각 용액을 추가하는 산 및 염기 펌프로 조정할 수 있다. pH 조절에 사용되는 산 용액은 황산 또는 염산일 수 있다. pH 조절에 사용되는 바탕 용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화암모늄일 수 있다.
또한, 배양 배지에 침지된 용존 산소 프로브에 의해 배양 배지 내의 용존 산소를 모니터링할 수 있다. 용존 산소 조절이 유효한 경우, 교반 속도를 높이거나 낮추어 산소 수준을 조정할 수 있다. 용존 산소 수준은 또한 가스 유속을 증가 또는 감소시켜 조정할 수 있다. 가스는 압축 공기, 산소 또는 질소일 수 있다.
교반 속도는 발효 과정에서 모니터링할 수도 있다. 예에서, 교반기 모터는 교반기를 구동할 수 있다. 교반기 속도는 발효 내내 일관된 rpm으로 설정되거나 설정된 용존 산소 수준을 유지하기 위해 동적으로 조절될 수 있다.
또한 발효 과정에서 탁도를 모니터링할 수 있다. 예에서, 세포 밀도는 탁도 프로브를 사용하여 측정할 수 있다. 대안적으로, 세포 밀도는 생물반응기로부터 샘플을 취하여 분광측정기에서 분석함으로써 측정될 수 있다. 추가로, 샘플은 멸균 샘플링 장치를 통해 시간 간격으로 생물반응기로부터 제거될 수 있다. 샘플은 숙주 세포에 의해 생성된 알칼로이드에 대해 분석될 수 있다. 샘플은 또한 다른 대사산물 및 당, 배양 배지 성분의 고갈 또는 세포 밀도에 대해 분석할 수 있다.
다른 예에서, 공급원료 파라미터는 발효 과정 동안 모니터링될 수 있다. 특히, 외부 펌프를 사용하여 발효에 추가될 수 있는 당 및 기타 탄소 공급원, 영양소 및 보조인자를 포함한 공급원료. 항발포제, 염, 착화제, 계면활성제 및 유기 액체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 성분도 발효 동안 첨가될 수 있다.
숙주 세포에서 이종성 폴리뉴클레오타이드의 발현을 최적화하기 위한 임의의 편리한 코돈 최적화 기술은 대상 숙주 세포 및 방법에 사용하기 위해 조정될 수 있다(예를 들어, Gustafsson, C. 등 (2004) Trends Biotechnol, 22, 346-353, 전체 내용이 참고로 포함됨).
본 방법은 또한 출발 화합물을 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 편리한 첨가 방법이 대상 방법에서 사용하기 위해 조정될 수 있다. 세포 배양물은 충분한 양의 관심 출발 물질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음), 예를 들어 출발 화합물의 약 1-5 mM과 같은 mM 내지 μM의 양으로 보충될 수 있다. 출발 물질의 첨가량, 첨가 시기 및 속도, 첨가되는 물질의 형태 등은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있음을 이해하여야 한다. 출발 물질은 그대로 첨가되거나 적절한 용매(예를 들어, 세포 배양 배지, 물 또는 유기 용매)에 미리 용해되어 첨가될 수 있다. 출발 물질은 첨가 시 세포 배양 배지의 희석을 최소화하기 위해 농축된 형태(예를 들어, 원하는 농도보다 10배 이상)로 첨가할 수 있다. 출발 물질은 하나 이상의 배치로, 또는 장기간(예를 들어, 몇 시간 또는 며칠)에 걸쳐 연속적으로 첨가하여 첨가할 수 있다.
발효 배지로부터 생성물을 분리하는 방법
대상 방법은 또한 세포 배양물로부터 관심 있는 TA를 회수하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 편리한 분리 및 분리 방법(예를 들어, 크로마토그래피 방법 또는 침전 방법)은 세포 배양물로부터 관심 있는 TA를 회수하기 위한 대상 방법에 사용하기 위해 적합될 수 있다. 여과 방법을 사용하여 세포 배양물의 불용성 분획에서 가용성 분획을 분리할 수 있다. 일부 경우에, 액체 크로마토그래피 방법(예를 들어, 역상 HPLC, 크기 배제, 순상 크로마토그래피)을 사용하여 관심 있는 TA를 세포 배양물의 다른 가용성 성분으로부터 분리할 수 있다. 일부 경우에, 추출 방법(예를 들어, 액체 추출, pH 기반 정제 등)을 사용하여 관심 있는 TA를 세포 배양물의 다른 성분으로부터 분리할 수 있다.
생성된 알칼로이드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 발효 배지로부터 단리될 수 있다. 원하는 생성물의 초기 회수를 위해 발효 직후(또는 일부 경우에는 발효 동안) 여러 회수 단계를 수행할 수 있다. 이러한 단계를 통해 알칼로이드(예를 들어, TA)는 세포, 세포 잔해 및 폐기물에서 분리될 수 있으며 다른 영양소, 당 및 유기 분자는 사용된 배양 배지에 남아 있을 수 있다. 이 과정을 사용하여 TA가 풍부한 생성물을 얻을 수 있다.
한 예에서, 트로판 알칼로이드(TA) 생성물을 갖는 생성물 스트림은 조작된 효모 세포 및 영양소 및 물을 포함하는 공급원료를 회분식 반응기에 제공함으로써 형성된다. 조작된 효모 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변형을 가질 수 있다: 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제; 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 전사 조절 변형; 및 세포에 고유한 효소의 불활성화 돌연변이 조작된 효모 세포가 회분식 반응기 내에 있는 경우, 조작된 효모 세포는 발효될 수 있다. 특히, 조작된 효모 세포는 TA 생성물 및 세포 물질을 포함하는 용액을 생성하기 위해 약 5분 이상의 기간 동안 조작된 효모 세포를 인큐베이션함으로써 발효될 수 있다. 조작된 효모 세포가 발효되면, TA 생성물을 포함하는 생성물 스트림을 제공하기 위해 세포 물질로부터 TA 생성물을 분리하기 위해 적어도 하나의 분리 유닛이 사용될 수 있다. 특히, 생성물 스트림은 TA 생성물뿐만 아니라 정화된 효모 배양 배지와 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. 추가적으로, TA 생성물은 하나 이상의 TA 화합물과 같은 하나 이상의 관심 있는 TA를 포함할 수 있다.
관심 있는 TA를 포함하는 생물반응기 배지로부터 세포를 제거하기 위해 상이한 방법이 사용될 수 있다. 예에서, 세포는 시간이 지남에 따라 침강에 의해 제거될 수 있다. 이 침강 과정은 냉각 또는 실리카와 같은 청징제(fining agent)의 첨가에 의해 가속화될 수 있다. 그 다음, 소비된 배양 배지는 반응기의 상부로부터 사이펀처리될 수 있거나 세포는 반응기의 바닥으로부터 경사분리될 수 있다. 대안적으로, 세포는 필터, 멤브레인 또는 기타 다공성 물질을 통한 여과에 의해 제거될 수 있다. 세포는 또한 원심분리, 예를 들어 연속 유동 원심분리 또는 연속 추출기를 사용하여 제거할 수 있다.
관심의 일부 가치 있는 TA가 세포 내부에 존재하는 경우, 세포는 투과되거나 용해될 수 있고 세포 잔해은 위에서 설명한 방법 중 하나에 의해 제거될 수 있다. 세포를 투과시키기 위해 사용되는 제제는 제한 없이 유기 용매(예를 들어, DMSO) 또는 염(예를 들어, 리튬 아세테이트)을 포함할 수 있다. 세포를 용해하는 방법에는 나트륨 도데실 설페이트와 같은 계면활성제의 첨가 또는 비드 밀링 또는 초음파 처리에 의한 기계적 파괴가 포함될 수 있다.
관심 있는 TA는 수성 배양 배지와 섞이지 않는 유기 액체의 첨가에 의한 액체-액체 추출을 통해 정화된 폐 배양 배지로부터 추출될 수 있다. 적합한 유기 액체의 예는 이소프로필 미리스테이트, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 메틸이소부틸 케톤, 메틸 올레에이트, 톨루엔, 올레일 알코올, 에틸 부티레이트를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 유기 액체는 수성 매질 부피의 10%만큼 적게 또는 100%만큼 많이 첨가될 수 있다.
일부 경우에, 발효 시작 시 또는 발효 중 언제든지 유기 액체를 첨가할 수 있다. 이러한 추출 발효 과정은 TA 전구체 또는 TA를 유기상으로 지속적으로 제거함으로써 숙주 세포로부터 관심 있는 TA의 수율을 증가시킬 수 있다.
진탕하면, 유기상이 수성 배양 배지와 함께 에멀젼을 형성할 수 있다. 2개의 상을 별개의 층으로 분리하도록 조장하는 방법에는 항유화제 또는 핵화제의 첨가 또는 pH 조정이 포함될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 에멀젼은 또한 예를 들어 연속 원추형 평판 원심분리에 의해 2개의 상을 분리하기 위해 원심분리될 수 있다.
대안적으로, 유기상은 추출 후에 물리적으로 제거될 수 있도록 수성 배양 배지로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 용매는 멤브레인에 캡슐화될 수 있다.
예에서, 관심 있는 TA는 흡착 방법을 사용하여 발효 배지에서 추출될 수 있다. 특히, Amberlite® XAD4 또는 흡착에 의해 TA를 제거하는 다른 제제와 같은 수지를 첨가하여 정화된 소비된 배양 배지에서 관심 있는 TA를 추출할 수 있다. 관심 있는 TA는 유기 용매를 사용하여 수지로부터 방출될 수 있다. 적합한 유기 용매의 예는 메탄올, 에탄올, 에틸 아세테이트 또는 아세톤을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
관심 있는 TA는 또한 여과를 사용하여 발효 배지로부터 추출될 수 있다. 높은 pH에서, 관심 있는 TA는 생물반응기에서 결정질과 같은 침전물을 형성할 수 있다. 이 침전물은 필터, 멤브레인 또는 기타 다공성 물질을 통한 여과에 의해 직접 제거될 수 있다. 침전물은 또한 원심분리 및/또는 경사분리에 의해 수집될 수 있다.
위에서 설명한 추출 방법은 제자리(생물반응기) 또는 현장외(예를 들어, 배지가 생물반응기 밖으로 흘러 추출 제제와 접촉한 다음 다시 용기로 재순환되는 외부 루프)에서 수행할 수 있다. 대안적으로, 추출 방법은 생물반응기 용기로부터 제거된 정화 배지를 사용하여 발효가 종료된 후에 수행될 수 있다.
알칼로이드가 풍부한 용액에서 제품을 정제하는 방법
후속 정제 단계는 관심 있는 개별 생성물 종을 고순도로 회수하기 위해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 발효 후 TA 전구체- 또는 TA-풍부 생성물을 처리하는 것을 포함할 수 있다.
일 예에서, TA 전구체 또는 유기상에서 추출된 TA는 수용액으로 전달될 수 있다. 일부 경우에, 유기 용매는 열 및/또는 진공에 의해 증발될 수 있고, 생성된 분말은 적절한 pH의 수용액에 용해될 수 있다. 추가 예에서, TA 전구체 또는 TA는 수성상으로의 TA 전구체 또는 TA의 추출을 촉진하는 적절한 pH에서 수용액을 첨가함으로써 유기상으로부터 추출될 수 있다. 그 다음, 수성상은 경사분리, 원심분리 또는 다른 방법에 의해 제거될 수 있다.
TA 전구체- 또는 TA-함유 용액은 예를 들어 적절한 착화제로 처리함으로써 금속을 제거하기 위해 추가로 처리될 수 있다. TA 전구체 또는 TA 함유 용액은 침전에 의해 단백질 및 DNA와 같은 다른 불순물을 제거하기 위해 추가 처리될 수 있다. 일 예에서, TA 전구체- 또는 TA-함유 용액은 에탄올, 메탄올, 아세톤, 또는 이소프로판올과 같은 적절한 침전제로 처리된다. 대안적인 예에서, DNA 및 단백질은 투석 또는 오염된 생물학적 거대분자로부터 더 작은 알칼로이드를 분리하는 크기 배제의 다른 방법에 의해 제거될 수 있다.
추가의 예에서, TA 전구체-, TA-, 또는 개질된 TA-함유 용액은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 연속 교차-유동 여과에 의해 고순도로 추출될 수 있다.
용액이 TA 전구체 또는 TA의 혼합물을 함유하는 경우, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 개별 관심 있는 TA 종을 생성하기 위해 산-염기 처리를 받을 수 있다. 이 공정에서, 수용액의 pH는 각각의 pKas에서 개별 TA 전구체 또는 TA를 침전시키도록 조정된다.
고순도, 소규모 제조의 경우, TA 전구체 또는 TA를 액체 크로마토그래피에 의해 단일 단계로 정제할 수 있다.
효모 유래 알칼로이드 API 대 식물 유래 API
정화 효모 배양 배지(CYCM)는 복수의 불순물을 함유할 수 있다. 정화된 효모 배양 배지는 진공 및/또는 열에 의해 탈수되어 알칼로이드가 풍부한 분말을 얻을 수 있다. 이 생성물은 활성 약제학적 성분(API) 제조자가 추가 화학 처리 및 정제를 위해 트로판 알칼로이드를 추출하는 데 사용하는 가지속 잎(CNL) 농축액과 유사한다. 본 발명의 목적을 위해, CNL은 원하는 알칼로이드 생성물(들)이 궁극적으로 추가로 정제될 수 있는 정제된 식물 추출물의 임의 유형의 대표적인 예이다. 표 5는 CYCM 또는 CNL에 특이적이거나 둘 다에 존재할 수 있는 이 두 생성물의 불순물을 강조한다. 이러한 불순물의 하위세트에 대해 출처가 알려지지 않은 생성물을 분석함으로써, 당업자는 제품이 효모 또는 식물 생산 호스트에서 유래했는지 여부를 결정할 수 있다.
API 등급 약제학적 성분은 고도로 정제된 분자이다. 이와 같이, API의 식물 또는 효모 기원을 나타낼 수 있는 불순물(예를 들어, 표 2 및 3에 나열된 것)은 생성물의 해당 API 단계에 존재하지 않을 수 있다. 실제로, 본 발명의 효모 균주로부터 유래된 많은 API 제품은 전통적인 식물 유래 API와 크게 구별할 수 없을 수 있다. 그러나 일부 경우에, 기존의 알칼로이드 화합물이 화학적 변형이 필요한 식물 기반 제품에서 화학적 불순물로 나타날 수 있는 화학적 합성 방법을 사용하여 화학적 변형을 받을 수 있다. 예를 들어, 화학적 유도체화는 종종 화학적 합성 공정과 관련된 일련의 불순물을 생성할 수 있다. 특정 상황에서, 이러한 변형은 효모 생산 플랫폼에서 생물학적으로 수행될 수 있으며, 이로써 효모 유래 제품에 존재하는 화학적 유도와 관련된 일부 불순물을 피할 수 있다. 특히, 화학적 유도 생성물로부터의 이러한 불순물은 화학적 합성 공정을 사용하여 생산되는 API 생성물에 존재할 수 있지만 효모 유래 생성물을 사용하여 생산되는 API 생성물에는 없을 수 있다. 대안적으로, 효모 유래 제품이 화학적 유래 생성물과 혼합되는 경우, 생성된 불순물이 존재할 수 있지만 화학적으로 유래된 생성물만 또는 주로 포함하는 API에서 예상되는 것보다 적은 양으로 존재할 수 있다. 이 예에서, 이러한 불순물의 하위세트에 대한 API 제품을 분석함으로써, 당업자는 제품이 효모 생산 호스트 또는 전통적인 화학적 유도체화 경로에서 유래했는지 여부를 결정할 수 있다.
화학적으로 유도된 트로판 알칼로이드 API에는 존재할 수 있지만 생합성된 API에는 존재할 수 없는 불순물의 비제한적인 예로는 하이오스시아민 및 스코폴라민의 화학적 N-알킬화, 예컨대 N-메틸화 및 N-부틸화에 의해 형성된 수소 할라이드 예컨대 염화수소, 수소 아이오다이드, 및 브롬화수소를 포함한다.
그러나, 효모 유래 화합물과 식물 유래 화합물이 모두 화학적 합성 방법을 통해 화학적 변형을 받는 경우, 화학적 합성 과정과 관련된 동일한 불순물이 제품에서 예상될 수 있다. 이러한 상황에서 출발 물질(예를 들어, CYCM 또는 CNL)은 위에서 설명한 대로 분석할 수 있다.
숙주 세포를 조작하는 방법
또한 관심 있는 TA 또는 그의 전구체를 생성할 목적으로 숙주 세포를 조작하는 방법이 포함된다. 숙주 세포에 DNA를 삽입하는 것은 임의의 편리한 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 방법은 숙주 세포가 효소를 기능적으로 발현하고 관심 출발 화합물을 관심 생성물 TA로 전환하도록 이종성 코딩 서열을 숙주 세포에 삽입하는 데 사용된다.
임의의 편리한 프로모터가 대상 숙주 세포 및 방법에서 사용될 수 있다. 이종성 코딩 서열의 발현을 유도하는 프로모터는 프로모터가 숙주 세포에서 활성인 경우 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 이종성 코딩 서열은 그들의 천연 프로모터로부터 발현될 수 있거나, 비-천연 프로모터가 사용될 수 있다. 이러한 프로모터는 사용되는 숙주에서 강도가 낮거나 높을 수 있다. 프로모터는 조절되거나 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 글루코스가 억제되지 않거나 배양 배지 중 글루코스의 존재에 의해 단지 약간만 억제된 프로모터가 사용된다. 관심 프로모터는 당분해 유전자의 프로모터 예컨대 (푸룩토스 비스포스페이트 알돌라아제 유전자의 프로모터 영역을 인코딩하는) B. 서브틸리스 tsr 유전자의 프로모터 또는 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소 (GPD, GAPDH, 또는 TDH3)를 코딩하는 효모 S. 세레비지아에 유전자로부터의 프로모터, 제빵사의 효모의 ADH1 프로모터, 포스페이트-기아 유도된 프로모터 예컨대 효모의 PHO5 프로모터, B. 리케니포르미스로부터의 알칼리성 포스파타제 프로모터, 효모 유도성 프로모터 예컨대 Gal1-10, Gal1, GalL, GalS, 억제성 프로모터 Met25, tetO, 및 구성적 프로모터 예컨대 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소 프로모터 (GPD), 알코올 탈수소효소 프로모터 (ADH), 번역-신장 인자-1-α 프로모터 (TEF), 사이토크롬 c-산화효소 프로모터 (CYC1), MRP7 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK), 트리오스 포스페이트 이성화효소 (TPI), 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 글루코코르티코이드, 스테로이드 및 갑상선 호르몬과 같은 호르몬에 의해 유도될 수 있는 프로모터를 함유하는 자율 복제 효모 발현 벡터가 또한 사용될 수 있으며, 글루코코르티코이드 반응성 요소(GRE) 및 갑상선 호르몬 반응성 요소(TRE)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이들 및 다른 예는 미국 특허 7,045,290에 기재되어 있고, 이는 인용된 참고 문헌을 포함하여 참고로 포함된다. α 인자, 알코올 산화효소 및 PGH와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 추가 벡터를 사용할 수 있다. 또한 모든 프로모터/인핸서 조합(진핵 프로모터 데이터 베이스 EPDB에 따름)을 사용하여 유전자 발현을 유도할 수도 있다. 임의의 편리한 적절한 프로모터가 숙주 세포, 예를 들어 E. 콜라이에 대해 선택될 수 있다. 또한 전사체를 최적화하기 위해 프로모터 선택을 사용할 수 있으며, 따라서 에너지 자원을 최소화하면서 생산을 최대화하기 위해 효소 수준을 사용할 수 있다.
임의의 편리한 벡터가 대상 숙주 세포 및 방법에서 사용될 수 있다. 관심 벡터에는 효모 및 기타 세포에 사용하기 위한 벡터가 포함된다. 효모 벡터의 유형은 4개의 일반적인 카테고리로 나눌 수 있다: 통합 벡터 (YIp), 자율 복제 고 카피 수 벡터 (YEp 또는 2μ 플라스미드), 자율 복제 저 카피 수 벡터 (YCp 또는 중심절 플라스미드) 및 큰 단편을 클로닝하기 위한 벡터 (YAC). 벡터 DNA는 편리한 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포에 도입된다.
유용성
예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 숙주 세포 및 방법은 다양한 적용에서 사용된다. 관심 적용에는 연구 적용 및 치료적 적용을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법은 TA의 생산이 관심 있는 임의의 편리한 적용을 포함하는 다양한 상이한 적용에서 사용된다.
대상 숙주 세포 및 방법은 다양한 치료 적용에서 사용된다. 관심 있는 치료적 적용에는 TA를 포함하는 약제학적 생성물의 제조가 관심 있는 적용이 포함된다. 본 명세서에 기재된 숙주 세포는 트로판 알칼로이드 전구체(TA 전구체) 및 관심 있는 TA를 생성한다. 트로피논과 트로핀은 의약 TA 생성물과 같은 최종 생성물을 생산하기 위한 공학적 노력을 포함하여 TA 합성에서 관심 있는 주요 분기점 중간체이다. 대상 숙주 세포는 트로피논, 트로핀 및 TA 최종 생성물을 포함하는 관심 있는 TA의 생산에 사용될 수 있는 간단하고 저렴한 출발 물질로부터 TA 전구체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 이와 같이, 대상 숙주 세포는 치료적으로 활성인 TA 또는 그의 전구체의 공급에 사용된다.
일부 사례에서, 숙주 세포 및 방법은 이들 화합물의 화학적 합성이 수율이 낮고 대규모 생산을 위한 실행 가능한 수단이 아닌 상업적 규모의 TA 또는 그의 전구체의 생산에 사용된다. 특정 경우에, 숙주 세포 및 방법은 치료 생성물을 위한 관심 있는 TA 또는 그의 전구체의 신속한 생산을 허용하는 예를 들어 5,000-200,000리터 용량의 생물반응기(발효기)를 포함하는 발효 시설에서 활용된다. 이러한 적용에는 셀룰로오스, 전분 및 유리 당과 같은 발효 가능한 탄소 공급원으로부터 관심 있는 TA의 산업적 규모 생산이 포함될 수 있다.
대상 숙주 세포 및 방법은 다양한 연구 적용에 사용된다. 대상 숙주 세포 및 방법을 사용하여 다양한 관심 있는 TA 또는 그의 전구체의 생합성 경로에 대한 다양한 효소의 효과를 분석할 수 있다. 또한, 숙주 세포는 아직 입증되지 않은 치료 기능에서 관심 생체활성을 테스트하는 데 사용되는 TA 또는 그의 전구체를 생산하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에, 다양한 효소를 인코딩하는 다양한 이종성 코딩 서열을 포함하도록 숙주 세포를 조작하면 관심 있는 TA 또는 그의 전구체에 대한 고수율 생합성 경로가 설명된다. 특정 경우에, 연구 적용에는 원하는 생성물로 추가로 화학적으로 변형되거나 유도체화될 수 있는 관심 치료 분자에 대한 전구체 생산 또는 관심 치료 활성 증가에 대한 스크리닝이 포함된다. 일부 경우에, 숙주 세포 균주는 이러한 경로에서 관심 있는 효소 활성을 스크리닝하는 데 사용되며, 이는 이러한 균주에서 생성된 TA 대사산물의 전환을 통해 효소 발견으로 이어질 수 있다.
대상 숙주 세포 및 방법은 식물 전문 대사산물의 생산 플랫폼으로 사용될 수 있다. 대상 숙주 세포 및 방법은 약물 라이브러리 개발 및 식물 효소 발견을 위한 플랫폼으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상 숙주 세포 및 방법은 하이오스시아민 및 스코폴라민과 같은 흥미로운 스캐폴드 분자를 생산하는 효모 균주를 취하고 조합 생합성 또는 화학적 수단을 통해 화합물 구조를 추가로 기능화함으로써 천연물 기반 약물 라이브러리의 개발에 사용할 수 있다. 이러한 방식으로 약물 라이브러리를 생성함으로써 잠재적인 약물 히트는 이미 대규모 배양 및 생산이 가능한 생산 호스트와 연결된다. 또 다른 예로서, 이들 대상 숙주 세포 및 방법은 식물 효소 발견에서 사용될 수 있다. 대상 숙주 세포는 새로운 효소 활성을 식별하기 위해 식물 발현 서열 태그(EST) 라이브러리를 발현하기 위해 정의된 대사산물의 깨끗한 배경을 제공한다. 대상 숙주 세포 및 방법은 효모에서 식물 효소의 기능적 발현 및 증가된 활성을 위한 발현 방법 및 배양 조건을 제공한다.
키트 및 시스템
본 발명의 양태는 키트 및 시스템을 추가로 포함하며, 키트 및 시스템은 기재된 바와 같은 본 발명의 방법, 예를 들어 숙주 세포, 출발 화합물, 이종성 코딩 서열, 벡터, 배양 배지 등을 포함할 수 있는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 키트는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 숙주 세포, 및 하기로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다: 출발 화합물, 이종성 코딩 서열 및/또는 이를 포함하는 벡터, 벡터, 성장 공급원료, 발현 시스템에 사용하기에 적반한 성분 (예를 들어, 세포, 클로닝 벡터, 다수의 클로닝 부위 (MCS), 양방향성 프로모터, 내부 리보솜 유입 부위 (IRES), 등), 및 배양 배지.
본원에 기재된 임의의 성분은 키트, 예를 들어 하나 이상의 변형, 출발 화합물, 배양 배지 등을 포함하는 숙주 세포에 제공될 수 있다. 이종성 코딩 서열, 클로닝 벡터 및 발현 시스템의 제조 및 사용에 사용하기에 적합한 다양한 성분이 대상 키트에서 사용될 수 있다. 키트에는 튜브, 완충액 등과 사용 지침도 포함될 수 있다. 키트의 다양한 시약 성분은 별도의 용기에 존재할 수 있으며, 이들 중 일부 또는 전부는 원하는 대로 단일 용기의 시약 혼합물로 사전 조합될 수 있다.
또한 관심 있는 TA를 생산하기 위한 시스템이 제공되며, 시스템은 하나 이상의 변형(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음), 출발 화합물, 배양 배지, 발효조 및 발효 장비, 예를 들어, 숙주 세포, 샘플링 및 모니터링 장비 및 구성요소에 대한 성장 조건을 유지하는데 적합한 장치, 등을 포함할 수 있다. 효모 세포의 대규모 발효에 사용하기에 적합한 다양한 성분이 대상 시스템에서 사용될 수 있다.
일부 경우에, 시스템에는 조작된 숙주 세포의 대규모 발효 및 발효된 숙주 세포에 의해 생성된 TA 화합물의 모니터링 및 정제를 위한 구성요소가 포함된다. 특정 구현예에서, 발효기 내의 조작된 숙주 세포가 하나 이상의 원하는 TA 생성물 또는 그의 전구체를 생성하는 조건 하에 하나 이상의 출발 화합물(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)이 시스템에 첨가된다. 일부 경우에, 숙주 세포는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이) 관심 있는 TA를 생성한다. 특정 경우에, 관심 있는 TA 생성물은 히오스시아민, N-메틸히오스시아민, 아니소다민, 스코폴라민, N-메틸스코폴라민 및 N-부틸스코폴라민과 같은 의약 TA 생성물이다.
일부 경우에, 시스템은 대상 숙주 세포에 의해 생성된 하나 이상의 TA 화합물 또는 그의 전구체를 모니터링 및/또는 분석하기 위한 수단을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 LC-MS 분석 시스템, 크로마토그래피 시스템, 또는 샘플이 분석되고 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 표준과 비교될 수 있다. 발효 배지는 샘플링 및 분석을 통해 발효 전 및 발효 중 편리한 시간에 모니터링할 수 있다. 출발 화합물의 관심 있는 TA 생성물 또는 전구체로의 전환이 완료되면 발효가 중단될 수 있고 TA 생성물의 정제가 수행될 수 있다. 이와 같이, 일부 경우에, 대상 시스템은 그것이 생성되는 숙주 세포 배지로부터 관심 있는 TA 생성물 또는 전구체를 정제하기에 적합한 정제 성분을 포함한다. 정제 성분은 실리카 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, HIC 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 액체 추출, 및 pH 추출 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 발효의 TA 생성물 또는 전구체를 정제하기 위해 사용될 수 있는 임의의 편리한 수단을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 대상 시스템은 하나 이상의 출발 화합물을 시스템에 투입한 후 관심 있는 TA 발효 생성물의 생산 및 분리를 제공한다.
하기 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되는 것이며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 것이 아니다. 아래의 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내기 위한 것이다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험 오류 및 편차를 고려해야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
예시 방법
다음 섹션에서는 TA 전구체 및 TA의 생산을 위해 효모 균주와 같은 미생물 균주를 구성, 배양 및 테스트하고 TA 전구체 및 TA를 생산하기 위해 이러한 균주의 발효를 수행하는 데 사용할 수 있는 방법 및 절차의 예를 제공한다. 또한 미생물 숙주의 변형에 필요한 DNA 서열을 생성하고 원하는 DNA 서열을 미생물 숙주에 도입하는 데 사용할 수 있는 방법, 절차 및 재료의 예가 포함된다.
화합물 및 표준. 조작된 숙주 세포에 의해 생성된 대사산물의 동일성 및 정량화를 위한 TA 전구체 및 TA의 화학적 표준은 상업적 공급업체로부터 구입할 수 있다. 예를 들어, 푸트레신 디하이드로클로라이드, N-메틸푸트레신, 하이그린, 트로피논 및 트로핀은 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX)에서 구입할 수 있다. 4-(메틸아미노)부티르산 하이드로클로라이드는 Sigma(St. Louis, MO)에서 구입할 수 있다. γ-메틸아미노부티르알데하이드(4MAB) 디에틸 아세탈 및 리토린은 Toronto Research Chemicals(Toronto, ON)에서 구입할 수 있다. NMPy에 대한 화학적 표준은 앞에서 설명한 대로 60℃에서 30분 동안 2M HCl 5 부피로 디에틸 아세탈 1 부피를 탈보호하고(Feth, F., Wray, V. & Wagner, KG Determination of methylputrescine 참조). 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 산화효소 Phytochemistry 24, 1653-1655 (1985)), 실온에서 밤새 인큐베이팅한 다음, 생성된 농축물을 3 부피의 디에틸 에테르로 2회 세척하여 잔류 유기 불순물을 제거하여 합성할 수 있다.
플라스미드 작제. 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 신규 DNA 서열 생성 및 DNA 서열분석에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 IDT DNA, Twist Bioscience 또는 Stanford Protein and Nucleic Acid Facility(Stanford, CA)와 같은 DNA 합성 회사에서 얻을 수 있다. 천연 효모 유전자는 콜로니 PCR을 통해 S. 세레비지아 게놈 DNA에서 증폭될 수 있다(Kwiatkowski, T. J., Zoghbi, H. Y., Ledbetter, S. A., Ellison, K. A. & Chinault, A. C. Rapid identification of yeast artificial chromosome clones by matrix pooling and crude iysate PCR. Nucleic Acids Res. 18, 7191 (1990) 참조). 이종성 효소에 대한 유전자 서열은 GeneArt GeneOptimizer 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific)와 같은 적절한 코돈 최적화 소프트웨어를 사용하여 S. 세레비지아에에서 발현을 개선하기 위해 코돈 최적화될 수 있다. 이종 유전자 서열은 상업용 DNA 합성 회사에서 선형 이중 가닥 DNA 단편으로 합성할 수 있다. 효모에서 유전자 발현을 위해 두 가지 유형의 플라스미드를 사용할 수 있다. 관심 있는 생합성 유전자를 테스트하기 위한 직접 발현(DE) 플라스미드 및 선택된 프로모터-유전자-종결자 카셋트의 게놈 통합을 위한 주형을 제공하기 위해 플라스미드를 보유하는 효모 통합(YI).
DE 플라스미드는 구성적 프로모터 및 종결자, 저 카피 CEN6/ARS4 효모 복제 기점 및 영양요구성 선택 마커에 의해 측정된 관심 유전자를 포함한다. DE 플라스미드는 프라이머 오버행을 사용하여 5' 및 3' 제한 부위를 추가하기 위해 관심 유전자를 PCR 증폭하고, 적절한 제한 효소 쌍(예를 들어, SpeI, BamHI, EcoRI, PstI, 또는 XhoI), 그 다음, T4 DNA 리가제를 사용하여 유전자 단편을 플라스미드 pAG414GPD-ccdB, pAG415GPD-ccdB 또는 pAG416GPD-ccdB와 같은 적합한 효모 프로모터, 종결자 및 복제 서열을 사용하여 유사하게 소화된 벡터에 연결함으로써 구축된다 (Alberti, S., Gitler, A. D. & Lindquist, S. A suite of Gateway cloning vectors for high-throughput genetic analysis in 사카로마이세스 cerevisiae. Yeast 24, 913-9 (2007) 참조).
YI 플라스미드는 구성적 프로모터 및 종결자에 의해 측접된 관심 유전자를 포함하지만 효모 복제 기원 또는 영양요구성 선택 마커가 없다. YI 플라스미드는 각각 프로모터 및 종결자의 3' 및 5' 말단에서 결합하도록 설계된 프라이머로 '어라운드 더 혼(around-the-horn)' PCR을 사용하여 적절한 프로모터 및 종결자로 비어있는 보유 벡터를 선형화하여 구성할 수 있다. 관심 유전자는 또한 선형화된 벡터 골격의 말단에 35-40bp의 상동성을 갖는 5' 및 3' 오버행를 추가하기 위해 PCR 증폭될 수 있다. YI 벡터로의 유전자 조립은 Gibson 조립을 사용하여 수행될 수 있다. 생합성 효소의 GFP 융합을 발현하는 DE 플라스미드는 먼저 Gibson 어셈블리를 사용하여 GFP, 표적 효소 및 YI 벡터 골격을 별도로 인코딩하는 PCR 증폭된 DNA 단편을 조립하고, 이어서 YI 플라스미드의 융합 작제물을 제한을 사용하여 DE 벡터로 서브클로닝하고 기재된 바와 같이 결찰 클로닝함으로써 제조할 수 있다.
PCR 증폭은 상업적 공급자로부터 입수 가능한 임의의 고충실도 재조합 DNA 중합효소를 사용하여 수행할 수 있으며 선형 DNA는 적합한 DNA 컬럼 정제 키트를 사용하여 정제할 수 있다. 조립된 플라스미드는 루리아-베르타니(LB) 액체배지 또는 카베니실린(100μg/mL), 카나마이신(50μg/mL)이 포함된 LB-아가 플레이트에서 열 충격 변환 및 선택 또는 또 다른 항생제 선택을 사용하여 화학적으로 유능한 E. 콜라이 균주에서 증식할 수 있다. 플라스미드 DNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 플라스미드 정제 컬럼을 사용하여 선택적 LB 배지에서 37℃ 및 250rpm에서 성장한 밤새 E. 콜라이 배양물로부터 알칼리성 용해에 의해 단리될 수 있다. 플라스미드 서열은 Sanger 서열분석으로 확인해야 한다.
효모 균주 작제. 임의의 적합한 실험실 균주의 효모가 숙주 유기체로서 사용될 수 있다. 실험 섹션의 예에 설명된 효모 균주는 CEN.PK2로 지칭된 친계 균주 CEN.PK2-1D에서 유래된다(Entian,
Figure pct00002
, P. 25 Yeast Genetic Strain and Plasmid Collections. Methods Microbiol. 36, 629-666 (2007) 참조). 균주는 2% w/v 덱스트로스 (YPD 배지)가 보충된 효모-펩톤 배지, 합성 완전한 아미노산 혼합물 (YNB-SC) 및 2% w/v 덱스트로스가 보충된 효모 질소 염기 (YNB) 한정 배지에서, 또는 전술한 배지의 아가 플레이트에 비-선택적으로 성장될 수 있다. 영양요구성 선택 마커(URA3, TRP1, HIS3 및/또는 LEU2)를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 균주는 2% w/v 덱스트로스와 적절한 드롭아웃 용액(YNB-DO)이 보충된 YNB 배지에서 또는 YNB-DO 아가 플레이트 상에서 선택적으로 성장할 수 있다. 아세테이트 대사가 결핍된 효모 균주는 0.1% w/v 칼륨 아세테이트(즉, YPAD 또는 YNBA)가 보충된 전술한 배지에서 성장할 수 있다.
효모 게놈 변형은 CRISPRm 방법을 사용하여 수행할 수 있다(Ryan, O. W. 등 Selection of chromosomal DNA library using a multiplex CRISPR system. Elife 3, 1-15 (2014) 참조). CRISPRm 플라스미드는 스트렙토코쿠스 파이오제네스 Cas9와 효모 게놈에서 관심 유전자좌를 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 발현하며, DNA 단편 인코딩 SpCas9, tRNA 프로모터 및 HDV 리보자임, 20-nt guide RNA 서열, 및 tracrRNA 및 종결자의 어셈블리 PCR 및 Gibson 어셈블리에 의해 구축될 수 있다. 유전자 삽입을 위해, 독특한 프로모터 및 종결자가 측접된 하나 이상의 관심 유전자를 포함하는 통합 단편은 PCR 증폭을 사용하여 구축될 수 있고 Gibson 어셈블리에 의해 보유 벡터로 클로닝될 수 있다. 통합 단편은 인접 단편 및/또는 통합 부위의 효모 게놈에 대한 측접 40 bp 미세상동성 영역을 갖는 적합한 고충실도 DNA 중합효소를 사용하여 PCR 증폭된다. 유전자 파괴에 대해, 통합 단편은 열린 해독틀의 전반부에 위치한 파괴 부위에 대해 40bp의 미세상동성에 의해 측접된 3개의 해독틀 모두에서 6-8개의 정지 코돈을 포함한다. 완전한 유전자 결실에 대해, 통합 단편은 결실 부위에 대해 40bp의 미세상동성에 의해 측접된 영양요구성 마커 유전자를 포함한다. 각 통합 단편은 원하는 게놈 부위를 표적으로 하는 CRISPRm 플라스미드와 함께 공동 형질전환된다. 양성 통합체는 효모 콜로니 PCR, Sanger 서열분석 및/또는 액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)에 의한 기능적 스크리닝에 의해 식별될 수 있다.
효모 형질전환. 효모 균주는 열충격, 전기천공 및 화학적 변형을 포함하는 임의의 적절한 방법을 사용하여 형질전환될 수 있다. 예를 들어, 실험 섹션의 예에 설명된 효모 균주는 Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit(Zymo Research)를 사용하여 화학적으로 형질전환되었다. 개별 효모 콜로니를 YP(A)D 배지에 접종하고 30℃ 및 250rpm에서 밤새 성장시킨다. 포화 배양액은 YP(A)D 배지에서 1:10과 1:50 사이에 역희석되고 지수 단계에 도달하기 위해 추가로 5-7시간 동안 성장된다. 배양물을 500×g에서 4분 동안 원심분리하여 펠렛화한 다음, 50mM Tris-HCl 완충액, pH 8.5에 펠렛을 재현탁하여 2회 세척한다. 세척된 펠릿을 형질전환당 20 μL의 EZ2 용액에 재현탁한 다음, 100-600 ng의 총 DNA 및 200 μL의 EZ3 용액과 혼합한다. 효모 현탁액을 30℃에서 1시간 동안 완만하게 회전시키면서 배양한다. 플라스미드 형질전환에 대해, 형질전환된 효모를 YNB(A)-DO 아가 플레이트에 직접 플레이팅한다. Cas9 매개 염색체 변형에 대해, 효모 현탁액을 대신 1mL YP(A)D 배지와 혼합하고 500Хg에서 4분 동안 원심분리하여 펠릿화한 다음, 250μL의 신선한 YP(A)D 배지에 재현탁한다. 그 다음, 현탁액을 추가 2시간 동안 완만하게 회전시키면서 30℃에서 배양하여 G418 내성 단백질을 생성할 수 있도록 한 다음, 400mg/L G418(제네티신) 설페이트를 함유하는 YP(A)D 플레이트에 펼친다. 그 다음, 플레이트를 30℃에서 48-60시간 동안 인큐베이션하여 콜로니 형성을 허용한다.
스팟 희석 분석. 균주를 YNB(A)-DO 배지에 접종하고 30 ℃ 및 250rpm에서 밤새 성장시킨다. 포화된 밤새 배양물을 500Хg에서 4분 동안 원심분리하여 펠릿화하고 멸균 Tris-HCl 완충액, pH 8.0에서 OD600을 기준으로 107 세포/mL의 농도로 재현탁한다. 그 다음, 각 균주의 10배 연속 희석액을 Tris-HCl 완충액에서 준비하고 10 μL의 각 희석액을 미리 가온된 YNB(A)-DO 플레이트에 스팟팅한다. 플레이트를 30℃에서 배양하고 48시간 후에 이미지화한다.
대사산물 검정을 위한 성장 조건. 소규모 대사산물 생산 테스트는 YNB(A)-SC 또는 YNB(A)-DO 배지에서 수행될 수 있다. 효모 콜로니는 300-500μL의 배지에 접종하고 진탕기에서 30℃, 460rpm 및 80% 상대 습도에서 48-72시간 동안 기체 투과성 필름으로 덮인 2mL 딥웰 96웰 플레이트에서 성장할 수 있다.
대사산물 생산 분석. 대사산물 프로파일 및 역가는 액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 분석할 수 있다. 분석을 위해 배지에서 세포를 분리하기 위해, 발효 배양물을 12℃에서 5분 동안 3,500Хg에서 원심분리하여 펠렛화할 수 있으며 상층액의 100-200μL 분취량을 직접 분석을 위해 제거할 수 있다. 대사산물 생성은 Agilent 1260 Infinity Binary HPLC 및 Agilent 6420 Triple Quadrupole 질량 분광계와 같은 삼중 사중극자 질량 분광계와 쌍을 이루는 적절한 HPLC 장치를 사용하여 LC-MS/MS로 분석할 수 있다. 크로마토그래피는 이동상 용매 A로서 물 중 0.1% v/v 포름산 및 용매 B로서 아세토니트릴 중 0.1% v /v 포름산을 갖는 Zorbax EclipsePlus C18 컬럼(2.1 x 50 mm, 1.8 μm; Agilent Technologies)과 같은 C18 역상 컬럼을 사용하여 수행할 수 있다. 컬럼은 40℃에서 0.4mL/min의 일정한 유량과 5μL의 샘플 주입 부피로 작동된다. 화합물 분리는 다음 구배를 사용하여 수행할 수 있다. 0.00-0.75 분, 1% B; 0.75-1.33 분, 1-25% B; 1.33-2.70 분, 25-40% B; 2.70-3.70 분, 40-60% B; 3.70-3.71 분, 60-95% B; 3.71-4.33 분, 95% B; 4.33-4.34 분, 95-1% B; 4.34-5.00 분, 1% B로 평형화. LC 용리액은 양성 방식, 공급원 가스 온도 350 ℃, 가스 유량 11 L/min, 및 네뷸라이저 압력 40 psi에서 전기분무 이온화 (ESI)로 작동하는 0.01-5분으로부터의 MS로 향한다. 대사산물은 다중 반응 모니터링(MRM) 파라미터 및 표준 곡선을 기반으로 하는 통합 피크 면적으로 정량화할 수 있다.
형광 현미경검사. 형광 단백질 리포터에 융합된 생합성 효소를 인코딩하는 플라스미드로 형질전환된 효모 균주의 개별 콜로니를 1mL YNB-DO 배지에 접종하고 30℃ 및 250rpm에서 밤새 성장시킨다. 밤새 배양물을 500Хg에서 4분 동안 원심분리하여 펠릿화하고 2% w/v 덱스트로스를 갖는 2mL YNB-DO 배지에 재현탁한 다음, 추가 4-6시간 동안 30℃ 및 250rpm에서 성장시켜 지수 기에 도달하고, 발현된 형광 단백질은 완전히 접힐 수 있다. 그 다음, 약 5-10 μL의 배양물을 유리 현미경 슬라이드에 발견하고 유리 커버슬립으로 덮은 다음 60X 오일 침지 대물렌즈가 있는 적합한 역 형광 현미경을 사용하여 이미지화한다. 형광 여기는 크세논 아크 램프와 다음 필터 설정을 사용하여 수행할 수 있다: GFP, ET470/40X 여기 필터 및 ET525/50 방출 필터; mCherry, ET572/35X 여기 필터 및 ET632/60 방출 필터. 방출된 빛은 CCD 카메라로 캡처되고 후속 이미지 분석은 ImageJ(NIH)와 같은 적절한 과학적 이미지 분석 소프트웨어에서 수행될 수 있다.
전사체 데이터베이스에서 새로운 유전자 변이체의 확인. 신규 유전자 및 이의 변이체는 전사체 및 게놈 데이터베이스의 서열 정렬 기반 검색을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, N. 타베쿰 N-메틸푸트레신 산화효소 (NtMPO1)의 오쏘로그는 1000 Plants Project 데이터베이스에서 D. metel 및 A. 벨라돈나의 전사체의 tBLASTn 검색을 사용하여 확인되었다(Matasci, N. 등 Data access for 1,000 Plants(1KP) 프로젝트 Gigascience 3, 17(2014) 참조). 이러한 검색 전략을 사용하여 확인된 추정 유전자에 대한 코딩 서열은 효모 발현을 위해 최적화된 다음, 이전에 설명된 바와 같이 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
효소 구조 분석. 이종성 효소는 RaptorX 또는 Rosetta와 같은 적절한 상동성 모델링 또는 새로운 구조 예측 소프트웨어를 사용하여 구축된 상동성 모델을 검사하여 큰 구조화되지 않은 영역과 같은 효모에서 발현하는 동안 문제가 될 수 있는 구조적 특징에 대해 분석할 수 있다. 결과 단백질 모델은 PyMOL(Schrodinger) 또는 UCSF Chimera와 같은 3차원 분자 뷰잉 소프트웨어를 사용하여 시각화할 수 있다. 특정 기질에 대한 효소 친화성은 AutoDock, SwissDock, GOLD 또는 Glide와 같은 적합한 리간드 도킹 시뮬레이션 소프트웨어를 사용하여 분석될 수 있다.
웨스턴 블랏에 의한 효모의 단백질 발현의 분석. 효모 발현 단백질의 면역블롯 분석을 위해, 적절한 균주는 관심 있는 에피토프 태깅된 단백질을 보유하는 발현 벡터로 형질전환된다. 형질전환 후 3일, 형질전환된 콜로니를 2mL YNB-DO 배지에 접종하고 30℃ 및 460rpm에서 고정상으로 밤새(~16-20시간) 성장시킨다. 세포를 5분 동안 3,000 x g에서 원심분리하여 펠렛화하고, 200 μL H2O에 재현탁하고, 200 μL의 0.2 M NaOH와 혼합하고, 실온에서 5분 동안 배양하여 세포벽 당단백질의 가수분해를 허용한다. 세포를 5분 동안 3,000 x g에서 다시 펠릿화하고 75 μL H2O에 재현탁하고 25 μL의 4X NuPAGE LDS 샘플 완충액(Thermo Fisher)과 혼합한 다음, 95 ℃에서 3분 동안 비등시켜 세포를 용해한다. 현탁액을 16,000 Х g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화하여 불용성 잔해를 제거하고 상청액을 미리 냉각된 튜브로 옮긴다. 환원 조건에서의 분석을 위해, 단백질 용해물을 β-머캅토에탄올(최종 농도 10%)과 혼합하고 70℃에서 10분 동안 배양한다. 대략 20-40 μg의 총 단백질을 Precision Plus Dual Color 단백질 분자량 마커(BioRad)를 갖는 NuPAGE Bis-Tris 4-12% 아크릴아미드 겔(Thermo Fisher)에 로딩한다. 전기영동은 150V에서 90분 동안 1X NuPAGE MOPS SDS 작동 완충제에서 수행된다. 니트로셀룰로오스 막으로의 단백질 전달은 제조사 지침에 따라 Trans-Blot Semi-Dry 장치(BioRad) 및 NuPAGE 전달 완충액(Thermo Fisher)을 사용하여 15V에서 15분 동안 수행된다. 환원 조건의 경우, NuPAGE 항산화제(Thermo Fisher)를 실행 완충액과 전달 완충액 모두에 1X의 최종 농도로 첨가한다. 전달된 단백질이 있는 멤브레인은 Tween (TBS-T; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 19 mM 트리스 염기, 0.1% Tween20, pH 7.4)이 있는 Tris 완충 식염수에서 5분 동안 세척한 다음, 실온에서 1시간 동안 TBS-T에서 5% 탈지유로 차단한다. 멤브레인을 5% 밀크와 함께 TBS-T에서 HRP 접합 항체의 적절한 희석액과 함께 4℃에서 밤새 배양하고 TBS-T로 각각 5분 동안 3회 세척한 다음, Western Pico PLUS HRP 기질(Thermo Fisher) 및 적합한 이미저를 사용하여 가시화한다.
실험
일련의 특정 유전자 변형은 사카로마이세스 세레비지아에에서 간단하고 저렴한 공급원료 또는 전구체 분자로부터 TA를 생산하기 위한 생합성 과정을 제공한다. 비-TA 전구체 또는 간단한 공급원료로부터 초기 TA 분자 푸트레신, N-메틸푸트레신, 4-메틸아미노부탄알, N-메틸파이롤리늄 (NMPy), 트로피논, 트로핀, 페닐락트산 (PLA), 및 1-O-β-페닐락토일글루코스 (PLA 글루코사이드)를 생산할 수 있는 신규 균주를 구축하는 방법이 기재되어 있다. NMPy는 알려진 모든 TA 분자의 천연 전구체이다. 효모 생합성 경로의 조절을 조작하고 아미노산 유래 TA 전구체의 생산을 최적화하는 방법도 기재되어 있다. 단순 공급원료로부터 슈도트로핀 알칼로이드 및 칼리스테긴과 같은 비-의약적 TA를 생산할 수 있는 신규 균주를 작제하는 방법이 기재되어 있다. 또한, 비-TA 전구체 또는 단순 공급원료로부터 하이오스시아민, 아니소다민 및 스코폴라민과 같은 의약 TA를 생산할 수 있는 신규 균주를 작제하는 방법이 기재되어 있다. 또한, 비-TA 전구체 또는 단순 공급원료로부터 신나모일트로핀과 같은 비-천연 TA를 생산할 수 있는 신규 균주를 구성하는 방법이 기재되어 있다.
실시예 1. 높은 수준의 푸트레신 생산을 위한 플랫폼 효모 균주의 조작
TA의 트로핀 모이어티는 폴리아민 분자 푸트레신을 통해 아미노산 아르기닌에서 유래된다. S. 세레비지아에의 균주는 푸트레신, NMP, 4MAB 및 NMPy를 포함하는 TA 전구체 분자의 세포내 농도를 증가시키기 위한 목적으로 아르기닌 및 폴리아민 생합성 경로를 통한 개선된 플럭스로 전개된다. 이 균주는 일반적으로 아르기닌 및 폴리아민 생합성을 향한 중앙 대사에서 탄소 및 질소 플럭스를 증가시키기 위한 목적으로 유전적 변형을 결합하고 TA 전구체 푸트레신의 추가 생산을 위한 주요 이종성 효소의 도입을 포함한다. 천연 생합성 효소 및 조절 단백질을 인코딩하는 유전자에 대한 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제 도입, 천연 생합성 효소의 전사 조절 조정, 전구체 분자를 의도된 경로에서 멀어지게 하는 효소 인코딩 유전자의 결실 또는 파괴 및 내인성 분자를 TA 전구체 분자로 전환하기 위한 이종성 효소의 도입을 비롯한 유전적 변형이 사용된다.
1.1) 조작된 균주의 생합성 경로는 아르기닌 대사 및 폴리아민 생합성에 관여하는 천연 효모 유전자의 과발현을 포함한다(도 4).
1.1.1) 효모에서 과발현된 고유 유전자의 예는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 글루타메이트로부터 아르기닌 생합성의 첫 번째 단계를 촉매하는 글루타메이트 N-아세틸트랜스퍼라제(Arg2p); 아르기닌의 구아니디늄 그룹을 제거하여 미토콘드리아 기질에서 오르니틴을 생성하는 아르기나제(Car1p); 미토콘드리아 매트릭스에서 사이토졸로 오르니틴을 내보내는 미토콘드리아 막 수송체(Ort1p); 사이토졸 오르니틴을 푸트레신으로 탈카복실화하는 오르니틴 탈탄산효소(Spe1p); 및 스페르민 및 스페르미딘을 푸트레신으로 탈알킬화하는 폴리아민 산화효소(Fms1p).
1.1.2) 각각이 음성 대조군으로서 SPE1 , ORT1 , CAR1 , ARG2 , FMS1, 또는 청색 형광 단백질 (BFP) 중 하나를 음성 대조군으로서 발현하는 3개의 저 카피 플라스미드의 다른 조합으로 효모 균주를 공동 형질전환함으로써 푸트레신 생산에 대한 이러한 천연 효소의 과발현의 영향을 조사하였다. 선택적 배지에서 48시간 동안 성장시킨 후 공동 형질전환된 세포의 세포외 배지에 축적된 푸트레신의 역가를 LC-MS/MS로 정량화하였다(도 5). SPE1 단독의 과발현은 푸트레신 역가를 23 mg/L로 13.4배 증가시켰다. CAR1 또는 ARG2와 SPE1과의 공동 과발현은 SPE1 단독에 비해 푸트레신 생산에서 27% 및 12% 증가를 초래한 반면, SPE1과 함께 ORT1의 과발현은 SPE1과 비교하여 푸트레신 역가에서 35% 감소를 야기하였다. SPE1 , CAR1 , ARG2 및 FMS1 중 3가지의 과발현은 집합적으로 세포외 푸트레신 역가를 34-35 mg/L로 증가시켰다.
1.2) 조작된 균주의 생합성 경로는 푸트레신 생산을 추가로 증가시키기 위해 효모 이외의 유기체에서 발견되는 폴리아민 생산 경로의 이종성 효소 발현을 통합한다(도 4).
1.2.1) 대부분의 식물, 동물 및 균류에서 발견되는 오르니틴 의존성 경로에 추가하여, 푸트레신은 아르기닌의 탈구아니딘화 후 오르니틴의 탈카복실화를 통해 합성되고, 많은 박테리아 및 식물은 또한 아르기닌이 아르기닌 탈탄산효소(ADC)에 의해 먼저 탈카르복실화되어 아그마틴을 생성하는 대체 경로를 발현한다.. 식물에서 아그마틴의 구아니딘 기는 이미노가수분해효소(AIH)에 의해 요소로 전환되어 N-카르바모일푸트레신(NCP)을 생성하고, 이로부터 아미드기는 아미다제(CPA)에 의해 제거되어 푸트레신을 생성한다(Patel, J. 등 Dual functioning of plant arginases provides a third route for putrescine synthesis. Plant Sci. 262, 62-73 (2017)). 일부 박테리아는 아그마틴에서 구아니딘 그룹을 직접 제거하여 N-카르바모일화된 중간체 없이 푸트레신을 생성할 수 있게 하는 아그마틴 우레오하이드롤라제(AUH) 효소를 진화시켰다(Klein, RD 등 Reconstitution of a bacterial/plant polyamine biosynthesis pathway in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology 145 (Pt 2, 301-7 (1999)).
1.2.2) 효모에서 이종성 푸트레신 생합성 경로를 재구성하기 위해 다음 효소를 사용할 수 있다. ADC, AIH, CPA 및 AUH. 이러한 효소 활성을 보유하는 조작된 균주의 예로서, 이전에 S. 세레비지아에에서 활성이 입증된 귀리(아베나 살티바; AsADC)의 ADC(Klein, RD 등 Reconstitution of a bacteria/plant polyamine biosynthesis pathway in Saccharomyces Microbiology 145(Pt 2, 301-7(1999) 참조), 아라비돕시스 탈리아나 (AtAIH)로부터의 AIH, 토마토 (솔라늄 라이코페르시쿰; SlCPA) 및 A. 탈리아나 (AtCPA)로부터의 2개의 CPA 오쏘로그, 및 E. 콜라이 (speB) 및 A. 탈리아나 (AtARGAH2)로부터의 2개의 AUH는 효모에서의 발현을 위해 선택되었다.
1.2.3) 효모에서 각 이종 효소의 기능을 확립하기 위해 3단계(아르기닌 → 아그마틴 → NCP → 퓨트레신) 또는 2단계(아르기닌 → 아그마틴 → 퓨트레신) 퓨트레신 경로를 AsADC , AtAIH , 및 SlCPA 또는 AtCPA 둘 중 하나; 또는 AsADC 및 speB 또는 AtARGAH2 둘 중 하나를 발현하는 저 카피 플라스미드로 야생형 효소 균주를 공동-형질전환함으로써 단계적 방식으로 재구축하였다. 다양한 영양요구성 수준에서 발생하는 세포 성장 및 대사산물 생산에 대한 영향을 제거하기 위해, 블랭크 또는 부재 플라스미드 대신 음성 대조군으로 BFP를 사용하여 상이한 영양요구성 마커를 포함하는 3개의 저 카피 플라스미드로 모든 형질전환을 수행하였다. 선택적 배지에서 48시간 동안 성장시킨 후 형질전환된 세포의 세포외 배지에서 아그마틴, NCP 및 푸트레신의 상대적 축적을 LC-MS/MS로 분석했는데, 이는 SlCPA 및 AtARGAH2를 제외한 모든 효소가 효모에서 활성을 유지함을 나타낸다(도 6, 7). AsADC, AtAIH 및 AtCPA를 포함하는 식물 특이적 경로의 재구성은 야생형 역가에 비해 22배 개선된 23mg/L 역가에서 푸트레신 생산을 가능하게 하였다. 토마토의 이종성 CPA(SlCPA)는 AsADC 및 AtAIH를 발현하는 세포의 푸트레신 수준과 유사한 AsADC 및 AtAIH와 결합할 때 4.5mg/L의 역가에서 푸트레신 생산을 가능하게 하였다. AsADC 및 E. 콜라이 우레오하이드롤라제(speB)를 통한 박테리아 단축 경로의 재구성은 야생형보다 32배 높은 34mg/L의 역가에서 푸트레신 생산을 가능하게 하였다.
1.3) 조작된 균주의 생합성 경로는 아르기닌 및 폴리아민 생합성과 관련된 천연 효모 유전자의 과발현 및 효모 이외의 유기체에서 발견되는 폴리아민 생산 경로로부터의 이종성 생합성 효소의 발현을 통합하여 푸트레신 생산을 추가로 증가시킨다.
1.3.1) 푸트레신 생합성을 위한 과다발현된 천연 유전자 (SPE1, ARG2, CAR1; 1.1.2)의 상위-수행 트리아드를 야생형 효모 균주를 SPE1, AsADC, 및 speB을 인코딩하는 저 카피 플라스미드, 및 ARG2 및 CAR1을 인코딩하는 저 카피 플라스미드로 공동-형질전환시킴으로써 상위 수행 이종 푸트레신 경로 (AsADC , spEB; 1.2.3)와 조합하였다. 형질전환된 세포의 배양 배지에서 푸트레신 역가는 48시간 후 LC-MS/MS 분석으로 측정하였다. 생성된 균주는 47 mg/L의 역가에서 푸트레신을 생산하였다(도 10).
1.4) 효모의 폴리아민 생합성은 여러 메카니즘에 의해 조절된다(도 8). 조작된 균주의 생합성 경로는 푸트레신 생산의 피드백 억제를 줄이기 위해 이러한 조절 메카니즘 중 하나 이상의 파괴를 통합한다.
1.4.1) 폴리아민 생합성의 조절에 관여하고 따라서 세포내 푸트레신 축적을 개선하기 위해 파괴될 수 있는 천연 효모 유전자에는 다음 예를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다(도 8). 메틸티오아데노신 포스포릴라제(Meu1p)는 탈카복실화된 S-아데노실메티오닌(dcSAM)의 재순환 경로에서 유도 단계를 촉매하며, 이는 푸트레신을 스페르미딘 합성효소(Spe3p) 및 스페르민 합성효소(Spe4p)에 의해 촉매되는 스페르미딘 및 스페르민으로 전환하기 위한 알킬기 공여체를 구성한다. (Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W. & Tabor, H. Methylthioadenosine and polyamine biosynthesis in a Saccharomyces cerevisiae meu1Δ mutant. Biochem. Biophys. Res. Commun. 343, 203-207 (2006) 참조). 메틸티오아데노신은 스페르미딘 합성효소의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다(Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W. & Tabor, H. Studies on the regulation of ornithine decarboxylase in yeast: Effect of deletion in the MEU1 gene. Proc. Natl. Acad. Sci. 102, 16158-16163 (2005) 참조). 폴리아민 생합성은 진균과 후생동물에 걸쳐 보존된 안티자임 매개 음성 피드백 루프에 의해 조절된다(Pegg, A. E. Regulation of ornithine decarboxylase. Journal of Biological Chemistry 281, 14529-14532 (2006) 참조). 효모에서 OAZ1 유전자는 오르니틴 탈탄산효소(Spe1p)의 경쟁적 억제제인 안티자임-1을 집합적으로 인코딩하는 단일 뉴클레오타이드로 분리된 2개의 엑손을 포함한다. 폴리아민 유도 리보솜 프레임 이동 메카니즘은 높은 폴리아민 수준에서만 전장 안티자임의 번역을 가능하게 하여 생합성의 피드백 억제를 부과한다. 마지막으로, 세포 외 환경으로부터의 폴리아민 흡수는 카르니틴, 스페르미딘 및 스페르민에 친화성을 갖는 원형질막의 투과효소인 Agp2p 및 Agp2p와 상호작용하는 것으로 생각되는 단백질 키나제인 Sky1p를 포함하는 신호 전달 경로에 의해 매개된다.
1.4.2) MEU1 , OAZ1 , SPE4 , SKY1 및 AGP2 각각에 대한 효모 단일 유전자 파괴 균주는 야생형 효모에서 각 열린 해독틀의 첫 번째 1/3 내에 일련의 탠덤 넌센스 돌연변이를 삽입하여 구축하였다. 천연 및 이종성 푸트레신 생산 경로의 맥락에서 각 조절 파괴의 효과를 특성화하기 위해, 효모 ODC(SPE1)가 과발현되거나 AsADC 및 speB가 각각의 단일 유전자 파괴 균주에서 저 카피 플라스미드에서 공동 발현되었다. 세포외 배지에서 푸트레신 역가는 성장 72시간 후 LC-MS/MS를 통해 측정되었다(도 9). MEU1 파괴는 SPE1을 통한 천연 푸트레신 생산 경로가 과발현되었을 때 푸트레신 역가를 68%까지 개선하였다. 유사하게, OAZ1 파괴는 SPE1의 과발현과 결합될 때 푸트레신 생산을 174%까지 현저하게 개선하였다. OAZ1의 파괴는 천연 또는 이종성 푸트레신 경로가 과발현되지 않은 형질전환되지 않은 세포에서 푸트레신 역가의 21배 증가를 초래하였다. SKY1 및 AGP2의 파괴는 SPE1로 과발현될 때 푸트레신 역가에서 각각 29% 및 14% 증가를 초래하였다. SKY1 파괴는 AsADC 및 speB의 이종성 발현과 결합될 때 푸트레신 역가에서 41% 감소를 초래하였다.
1.5) 조작된 균주의 생합성 경로는 MEU1 및 OAZ1 조절 유전자 녹아웃을 기본 및 이종성 푸트레신 생합성 유전자의 과발현과 결합하여 조작된 균주에서 푸트레신 생산을 추가로 증가시킨다. 천연 아르기닌 및 폴리아민 생합성 유전자 ARG2, CAR1 및 FMS1의 추가 카피가 meu1/oaz1 이중 파괴 균주의 게놈에 통합되었다. 이 균주는 SPE1, AsADC 및 speB를 발현하는 저 카피 플라스미드로 형질전환되었다. 이 형질전환된 균주의 세포외 배지의 LC-MS/MS 분석은 푸트레신 역가가 선택적 배지에서 48시간 성장 후 86 mg/L에 도달했음을 나타내었다(도 10).
실시예 2. NMPy 생산을 위한 조작 효모 균주
S. 세레비지아에의 균주는 TA 전구체 NMPy의 생산을 위해 실시예 1에서 개발된 푸트레신 과잉생산 균주를 변형하여 개발하였다. 이들 균주는 푸트레신에서 NMPy 생합성을 향한 탄소 및 질소 플럭스를 증가시키기 위한 목적으로 유전적 변형을 결합하고 TA 전구체 NMP, 4MAB 및 NMPy의 생산을 위한 주요 이종성 효소의 도입을 포함한다. 이종 숙주에서 활성을 개선하기 위한 관심 효소의 N- 및/또는 C-말단 도메인의 변형, 및 전구체 분자를 의도된 경로로부터 멀어지게 하는 효소를 인코딩하는 유전자의 결실 또는 파괴를 포함하는 유전적 변형이 사용된다.
2.1) 조작된 균주의 생합성 경로는 내인성 푸트레신으로부터 NMPy의 생산을 가능하게 한다. 푸트레신은 먼저 SAM-의존성 N-메틸트랜스퍼라제(PMT)에 의해 N-메틸푸트레신(NMP)으로 전환되고, 이는 후속적으로 구리 의존성 디아민 산화효소(MPO)에 의해 4-메틸아미노부탄알(4MAB)로 산화된다. 4MAB는 많은 알데하이드 화합물과 마찬가지로 수용액에서 불안정하며 염기 촉매에 의한 친핵성 공격을 통해 자발적으로 순환하여 NMPy를 형성한다(도 11).
2.1.1) 푸트레신 과잉생산을 위한 SPE1, AsADC 및 speB를 발현하는 저 카피 플라스미드를 보유하는 실시예 1.5의 푸트레신 과잉생산 균주를 A. 벨라돈나(AbPMT1)로부터의 PMT를 발현하는 추가 저 카피 플라스미드 및 니코티아나 타바큠(NtMPO1)의 후속 MPO 효소와 동시 형질전환시켰다. 푸트레신과 NMPy 사이에서 각각의 연속적인 효소를 발현하는 형질전환된 세포의 세포외 배지에서 중간체의 축적은 성장 48시간 후 LC-MS/MS 분석을 통해 비교되었다. NtMPO1의 즉시 생성물(4MAB)과 이의 자발적 고리화 생성물(NMPy)은 AbPMT1 및 NtMPO1(도 11)과 이들의 전구체인 NMP 및 푸트레신(도 12)의 발현으로 생성되었다.
2.1.2) NMP의 축적은 LC-MS/MS 분석에 의해 MEU1 유전자(실시예 1.4.2에 기재됨)의 파괴가 있거나 없는 푸트레신 과잉생산 효모 균주의 성장 배지에서 측정되었다. 이 분석은 푸트레신 과잉생산 균주에서 MEU1의 이전 파괴와 SAM 재순환에 대한 부수적인 영향이 AbPMT1에 의한 푸트레신 N-메틸화를 억제하지 않았음을 나타낸다(도 13).
2.2) 효소는 원래의 숙주 유기체에서보다 이종성 발현될 때 상이한 세포 아래 구획에 국한되어 기능이 저하될 수 있다. 조작된 균주의 생합성 경로는 천연 및 이종성 효소의 폴리펩타이드 서열에 대한 변형을 통합하여 이러한 변형된 효소가 자연적으로 국소화되는 것 이외의 세포 아래 구획으로 국소화를 유도할 수 있다. 예를 들어, 이전 연구에 따르면 NtPMT는 담배 세포의 사이토졸에서 발현되지만 NtMPO1은 퍼옥시솜 내강에 국한된다(Naconsie, M., Kato, K., Shoji, T. & Hashimoto, T. Molecular evolution of n-methylputrescine oxidase in Tobacco. Plant Cell Physiol. 55, 436-444 (2014) 참조).
2.2.1) 신호 펩타이드 검출을 위한 SherLoc2 유용성을 사용하여 효소 세포 아래 국소화의 인실리코 예측을 수행하여 NtMPO1의 세포 아래 국소화를 검사하였다(Briesemeister, S. 등 SherLoc2: A high-accuracy hybrid method for predicting subcellular localization of proteins. J. Proteome Res. 8, 5363-5366 (2009) 참조). 이 분석은 NtMPO1이 C-말단(PTS1으로 표시된 Ala-Lys-Leu)에 강력한 효모 공통 페록시솜 표적화 서열(PTS)을 보유하고 있음을 나타내었으며, 이는 NtMPO1이 효모에서 이종적으로 발현될 때 페록시솜에 국한될 수 있음을 시사한다(도 14).
2.2.2) N- 또는 C-말단 GFP-태깅된 AbPMT1 및 NtMPO1을 저 카피 플라스미드에서 발현하는 야생형 효모 세포의 형광 현미경검사는 AbPMT1이 주로 사이토졸에서 발견되는 반면, NtMPO1의 페록시솜으로의 국소화는 노출된 C-말단 PTS에 달려있다(도 15a, 16).
2.2.3) C-말단 PTS를 GFP 융합으로 차폐함으로써 달성된 NtMPO1의 사이토졸 발현은 세포외 4MAB 또는 NMPy 수준에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 15b).
2.3) 조작된 균주의 생합성 경로는 표 1에 나열된 것과 다른 생합성 효소의 오쏘로그를 포함할 수 있다. 효소의 상이한 오쏘로그는 이종성 숙주에서 발현될 때 활성에서 상당한 차이를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 예로서 제공되고 표 1에 열거된 생합성 효소의 오쏘로그는 동일한 생화학적 전환을 수행하기 위해 조작된 비-식물 세포에서도 사용될 수 있다.
2.3.1) 1000 Plants Project 데이터베이스에서 A. 벨라돈나 및 다투라 메텔의 전사체에 대한 tBLASTn 검색(Matasci, N. 등 Data access for the 1,000 Plants (1KP) project. Gigascience 3, 17 (2014) 참조)은 쿼리로 NtMPO1의 아미노산 서열과 10-150의 E-값 역치를 사용하여 수행되었다. AbMPO1 및 DmMPO1으로 표시된 2개의 전장 오쏘로그 서열이 확인되었으며, 각각은 NtMPO1과 91% 서열 동일성을 공유하였다(도 17a).
2.3.2) AbMPO1 및 DmMPO1에 대한 효모 코돈 최적화된 서열이 얻어지고 저 카피 발현 플라스미드로 클로닝되었다. 이들의 활성을 평가하기 위해, 3개의 MPO 변이체 각각을 실시예 1.5의 푸트레신-과잉생산 균주에서 저 카피 플라스미드로부터 AbPMT1과 공동 발현시키고, 선택적 배지에서 48시간 성장 후에 LC-MS/MS에 의해 세포외 배지에서 4MAB 및 NMPy 축적을 측정하였다. DmMPO1은 원래의 NtMPO1 변이체와 비슷한 수준의 4MAB 및 NMPy 생성을 보여주었다(도 17b).
2.3.3) 이종상동성 효소 간의 활성 차이는 종종 적어도 부분적으로 활성 부위의 구조적 차이에 기인할 수 있다. NtMPO1, AbMPO1 및 DmMPO1의 주형 기반 상동성 모델은 RaptorX 웹 서버를 사용하여 파이슘 사티붐 구리 함유 아미노 산화효소(PDB:1KSI)의 결정 구조를 기반으로 구축되었다 (
Figure pct00003
, M. 등 Template-based protein structure modeling using the RaptorX web server. Nat. Protoc. 7, 1511-22 (2012) 참조). 상동성 모델은 오쏘로그가 길고 구조화되지 않은 N-말단 및 C-말단 꼬리 영역을 가지고 있음을 나타낸다(도 17c).
2.3.4) 2개의 활성 오쏘로그인 NtMPO1 및 DmMPO1의 절단이 조작된 효모에서의 활성에 대해 테스트되었다. N-말단 절단은 2개의 오쏘로그의 처음 84개 및 81개 잔기를 각각 제거하였다. C-말단 절단은 마지막 21개 잔기가 제거하였다. 구조화되지 않은 꼬리가 제거되었지만 PTS는 유지된 C-말단 절단도 구축되었다(ΔC - PTS1로 표시됨). 각각의 MPO 절단은 실시예 1.5의 푸트레신-과잉생산 균주에서 저 카피 플라스미드로부터 AbPMT1과 함께 공동발현되었고, 48시간의 성장 후 배지에서 4MAB 및 NMPy 축적은 LC-MS/MS에 의해 정량화되었다. NtMPO1 말단절단 간에 활성의 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 18). C-말단 PTS 트리펩타이드를 유지하면서 DmMPO1에서 C-말단 비구조화 영역을 제거하면 야생형 DmMPO1 효소에 비해 세포외 4MAB 수준이 31% 증가하였다.
2.4) 조작된 균주의 생합성 경로는 바람직하지 않은 부반응의 대사 플럭스을 줄이거나 제거하기 위해 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다. 이종 숙주에서 발현되는 생합성 효소는 원하는 화합물의 생합성에서 대사산물 플럭스를 끌어내는 바람직하지 않은 부반응에 참여할 수 있다. 예를 들어, 효모 알데하이드 탈수소효소는 4MAB와 같은 이종성 알데하이드 분자를 동족 카복실산으로 산화시킬 수 있다. LC-MS/MS 분석에 기초하여, AbPMT1 및 DmMPO1 ΔC - PTS1 이 저 카피 플라스미드로부터 동시발현되었을 때 실시예 1.5의 푸트레신 과잉생산 균주의 성장 배지에서 4MAB 산의 축적이 관찰되었지만, MPO 효소의 부재에서는 아니다(도 11).
2.4.1) 6개의 효모 유전자(ALD2 - ALD6 및 HFD1)가 알데하이드 탈수소효소 활성을 갖는 효소를 인코딩하는 것으로 문헌에서 입증되었다(Datta, S., Annapure, U. S. & Timson, D. J. Different specificities of two aldehyde dehydrogenases from Saccharomyces cerevisiae var. boulardii. Biosci. Rep. 37, BSR20160529 (2017); 및 또한 Nakahara, K. 등 The
Figure pct00004
Syndrome Gene Encodes a Hexadecenal Dehydrogenase of the Sphingosine 1-Phosphate Degradation Pathway. Mol. Cell 46, 461-471 (2012) 참조). ALD2 및 ALD3 유전자는 판토텐산의 생합성에서 3-아미노프로판알의 β-알라닌으로의 산화를 촉매하는 거의 동일한 사이토졸 탈수소효소 쌍을 인코딩한다(White, W. H., Skatrud, P. L., Xue, Z. & Toyn, J. H. Specialization of Function Among Aldehyde Dehydrogenases:Genetics 163, 69-77 (2003) 참조). ALD4, ALD5 및 ALD6 유전자는 각각 2개의 미토콘드리아 및 1개의 사이토졸 아세트알데히드 탈수소효소를 인코딩하며, 이는, 글루코스 및 에탄올에 대한 발효 성장 동안에 아세트알데하이드를 아세테이트로 산화시키는 것 외에 (Saint-Prix,
Figure pct00005
, L. & Dequin, S. Functional analysis of the ALD gene family of Saccharomyces cerevisiae during anaerobic growth on glucose: The NADP+-dependent Ald6p and Ald5p isoforms play a major role in acetate formation. Microbiology 150, 2209-2220 (2004) 참조), 다양한 지방족 및 방향족 알데하이드의 어레이를 카복실산을 산화시키는 것으로 밝혀졌다 (Datta, S., Annapure, U. S. & Timson, D. J. Different specificities of two aldehyde dehydrogenases from Saccharomyces cerevisiae var. boulardii. Biosci. Rep. 37, BSR20160529 (2017) 참조). 이들 4개의 표적 유전자에 대한 개별 녹아웃 균주는 실시예 1.5의 푸트레신-과잉생산 균주에서 열린 해독틀의 첫 번째 1/3 내에 일련의 탠덤 넌센스 돌연변이를 삽입함으로써 구축되었다. 4MAB 산화에 대한 4개의 탈수소효소 각각의 기여는 각각의 단일 파괴 균주에서 저 카피 플라스미드로부터 AbPMT1 및 DmMPO1 ΔC - PTS1 을 공동 발현하고 성장의 48시간 후 LC-MS/MS에 의해 배지에서 4MAB 산 축적을 측정함으로써 평가되었다. 4MAB 산 수준의 주변 감소가 개별 HFD1 및 ALD4-6 파괴로 관찰되었다(도 19).
2.4.2) ALD4 -6은 아세테이트 및 아세틸-CoA 생성에 있어서의 역할 때문에 필수 유전자로 간주되지만, 이전 연구에서는 세 개의 유전자가 적어도 부분적으로 중복되고 이중 및 삼중 녹아웃의 치명적인 표현형이 배지에 아세테이트를 보충함으로써 구제될 수 있음을 입증했다 (Saint-Prix,
Figure pct00006
, L. & Dequin, S. Functional analysis of the ALD gene family of Saccharomyces cerevisiae during anaerobic growth on glucose: The NADP+-dependent Ald6p and Ald5p isoforms play a major role in acetate formation. Microbiology 150, 2209-2220 (2004) 참조; 및 또한 Luo, Z., Walkey, C. J., Madilao, L. L., Measday, V. & Van Vuuren, H. J. J. Functional improvement of Saccharomyces cerevisiae to reduce volatile acidity in wine. FEMS Yeast Res. 13, 485-494 (2013) 참조) 사중 녹아웃 효모 균주는 HFD1 및 ALD4 -6의 열린 해독틀을 파괴하고 저 카피 플라스미드에서 AbPMT1 및 DmMPO1 ΔC - PTS1을 모두 발현하도록 구축되었다. 이 균주는 파괴가 없는 균주와 비교하여 4MAB 산 수준에서 45% 감소(도 20a) 및 수반되는 NMPy 생산에서 46% 증가를 나타내었다(도 20b).
2.4.3) 실시예 2.4.2의 사중 녹아웃 균주의 게놈에서 탠덤 ALD2 - ALD3 유전자를 결실시키고 저 카피 플라스미드로부터 AbPMT1 및 DmMPO1 ΔC - PTS1 을 공동 발현함으로써 ALD-무효 균주를 구축하였다. 48시간의 성장 후, LC-MS/MS 분석은 ALD2 및 ALD3의 결실이 4MAB 산 부산물을 완전히 제거하고 온전한 모두 6개의 ALD 유전자를 갖는 균주에 비하여 4MAB 및 NMPy 생산을 각각 83% 및 75%까지 증가시켰음을 보여주었다(도 20a, b).
2.4.4) NMPy 생산 효모 균주는 실시예 2.4.3의 ALD-무효 균주의 게놈에 이전에 플라스미드-보유 푸트레신-과잉생산 유전자 카셋트(SPE1, AsADC, speB)를 통합하고, 추가로 AbPMT1 및 DmMPO1 ΔC - PTS1 을 통합하여 구축되었다. LC-MS/MS 분석은, 비-선택적 배지에서 48시간 성장 후 이 균주의 NMPy 생산이 저 카피 플라스미드로부터 필수 푸트레신 생산 유전자인 AbPMT1 및 DmMPO1 ΔC - PTS1 을 발현하는 실시예 2.4.3의 ALD-무효 균주의 생산과 유사하고, 선택된 배지에서 배양됨을 확인하였다(도 21).
실시예 3. 단당 및 영양소로부터 트로핀 생산을 위한 조작된 효모 균주
III형 폴리케타이드 합성효소(PKS)와 사이토크롬 P450은 TA 전구체 MPOB를 통해 NMPy를 트로피논으로 전환할 수 있다. 트로피논은 트로피논 환원효소 1(TR1)로 표시된 입체특이 환원효소에 의해 환원되어 트로핀을 생성할 수 있다(Kim, N., Estrada, O., Chavez, B., Stewart, C. & D'Auria, J. C. Tropane and Granatane Alkaloid Biosynthesis: A Systematic Analysis. Molecules 21, (2016) 참조) (도 22).
3.1) 조작된 균주의 생합성 경로는 NMPy를 트로핀으로 전환하기 위해 파이롤리딘 케타이드 합성효소, 트로피논 합성효소 CYP82M3, 하나 이상의 사이토크롬 P450 환원효소, 및 트로피논 환원효소 1을 포함한다.
3.1.1) A. 벨라돈나 파이롤리딘 케타이드 합성효소( AbPYKS ), 트로피논 합성효소(AbCYP82M3) 및 다투라 스트라모늄 트로피논 환원효소 1(DsTR1)을 인코딩하는 효모 코돈 최적화 DNA 서열을 얻었다. A. 탈리아나, 에스크스콜지아 칼리포르니카(캘리포니아 양귀비), 파파베르 솜니페럼 (오피엄 파피) 및 천연 효모 CPR (NCP1)의 3개의 식물 CPR을 포함하여 4가지 다른 CPR 패널에 대한 효모 코돈 최적화 서열도 효모에서 발현을 위해 수득한 것은, P450 효소는 지속적인 전자 교환을 위해 NADP+-사이토크롬 P450 환원효소(CPR) 파트너를 필요로 하기 때문이다. DsTR1을 실시예 2.4.4의 NMPy-생산 균주의 게놈에 통합하고, AbPYKS , AbCYP82M3 및 저 카피 플라스미드로부터 4개의 CPR 각각을 발현함으로써 효모 균주를 구축하였다. 효소 활성을 검증하고 잠재적인 병목을 확인하기 위해, 성장 48시간 후 형질전환된 균주의 배지에서 NMPy, MPOB, 트로피논 및 트로핀의 축적을 LC-MS/MS로 모니터링하였다(도 23). 새로운 트로핀 생산의 비슷한 수준(175-210μg/L)이 검정 조건에서 4개의 CPR 파트너 모두에서 관찰되었다.
3.2) 낮은 활성으로 인해 생합성 경로의 일부를 통한 흐름이 제한되는 자발적인 단계 또는 생합성 효소로 정의되는 대사 병목의 존재는 원하는 TA 및 전구체의 준최적 생산을 초래할 수 있다.
3.2.1) 예를 들어, 실시예 3.1.1의 조작된 균주의 배지에서 TA 중간체의 축적에 대한 분석은 트로피논의 축적, AbCYP82M3의 생성물이 최소이지만 AbPYKS에 의해 생성된 MPOB의 상당한 부분이 AbCYP82M3에 의해 소비되지 않은 채로 남아 있음을 나타내었다 (도 24).
3.2.2) 트로핀 생합성 유전자를 효모 게놈에 통합하면 보다 안정적인 AbCYP82M3 발현을 가능하게 하여 트로핀 생산을 개선시킬 수 있다. 실시예 3.1.1의 NMPy 생산 균주의 게놈에 AbPYKS 및 AbCYP82M3와 AtATR1을 통합하여 트로핀 생산 플랫폼 균주를 구축하였다. 통합 균주에 대한 트로핀 및 하이그린 축적을 48시간 후 LC-MS/MS 분석을 통해 동일한 유전자의 플라스미드 기반 발현과 비교하였다(도 28). AbPYKS , AbCYP82M3 및 AtATR1의 게놈 발현은 플라스미드 기반 발현(189μg/L)에 비해 거의 3배(565μg/L)까지 트로핀 역가를 증가시켰다. 조작된 균주는 또한 하이그린 축적이 2.6배 증가하는 것으로 나타났다.
3.3) 조작된 균주의 생합성 경로에서 부산물의 축적은 원하는 TA 및 전구체의 준최적 생산을 초래할 수 있다.
3.3.1) 예를 들어, 실시예 3.1.1의 조작된 균주의 배지에서 TA 중간체의 축적에 대한 분석은 NMPy의 유도체인 하이그린이 트로핀(775-900 μg/L)보다 거의 4배 더 큰 역가로 축적되었음을 나타낸다. 관련 문헌에서, 하이그린은 MPOB의 자발적인 탈카복실화를 통해 축적되는 것으로 관찰되었다(Bedewitz, M. A., Jones, A. D., D'Auria, J. C. & Barry, C. S. Tropinone synthesis via an atypical polyketide synthase and P450-mediated cyclization. Nat. Commun. 9, 5281 (2018) 참조) (도 22). 또 다른 예로서, 실시예 3.1.1의 조작된 균주의 성장 배지의 LC-MS/MS 분석은 하이그린이 NMPy와의 탈카복실화 축합으로 인해 AbPYKS 및 AbCYP82M3이 결여된 음성 대조군 균주에도 축적되었음을 나타내었다(도 22).
3.3.2) 성장 온도의 조절은 원하는 TA 및 전구체에 대한 플럭스를 증가시키기 위해 조작된 균주의 생합성 경로에서 부산물의 축적을 줄이기 위해 사용될 수 있다. 일 예에서, 자발적인 하이그린 생산에 대한 온도의 영향은 낮은 온도에서 효소 및 자발적 반응 속도가 감소한다는 운동 원리를 활용하여 평가되었다. A. 벨라돈나 및 기타 TA 생성 솔라나세아에가 더 시원한 기후에서 최적의 성장에 적합하기 때문에, 25 ℃에서 솔라나세아에 유전자를 발현하는 효모 균주의 성장은 효소 접힘 및/또는 활성을 개선하여, 자발적인 하이그린 생산의 속도를 감소시키면서 효소적으로 생성된 트로핀의 생산을 30℃에서의 성장에 필적할 수 있게 할 수 있다. 실시예 3.2.2의 트로핀 생산 균주의 배양물을 30 ℃ 및 25 ℃에서 비-선택적 한정 배지에서 성장시키고 48시간 후 성장 배지의 LC-MS/MS 분석을 통해 트로핀 및 하이그린의 축적을 비교하였다. 트로핀 역가는 온도 감소에 의해 최소한의 영향을 받았다. 하이그린 축적은 30 ℃에 비해 25 ℃에서 42% 감소하여, 생성된 하이그린에 대한 트로핀의 비율이 60% 증가하였다(도 25).
3.3.3) 바람직하지 않은 부반응의 감소 또는 제거는 조작된 균주의 생합성 경로에서 바람직한 TA 및 TA 전구체를 향한 대사산물 플럭스를 개선하는 데 사용될 수 있다. 일 예에서, TA 전구체 트로핀을 향한 플럭스는 아세테이트와의 자발적인 탈카복실화 축합으로 인한 하이그린 생성을 감소시킴으로써 개선될 수 있다. 하이그린 및 트로핀 생산에 대한 실시예 2.4.4의 NMPy-생산 균주의 배지로부터 공급된 아세테이트를 제거하는 영향을 평가하였다. 실시예 2.4.4의 조작된 균주에서 아세테이트 영양요구성을 없애는 효과는 저 카피 플라스미드에서 ALD4 및 ALD6의 기능적 카피를 발현시킨 다음, 성장의 48시간 후 LC-MS/MS 분석을 통해 하이그린 및 4MAB 산의 축적을 모니터링함으로써 평가되었다. ALD4 또는 ALD6의 재구성은 공급된 아세테이트의 부재 하에 선택적 배지 상에서 성장을 가능하게 하는 반면(도 26a), ALD4의 첨가는 4MAB 산 축적의 5배 증가를 야기한 반면, ALD6은 유의한 증가를 생성하지 않았다(도 26b). 더욱이, ALD4 또는 ALD6으로 아세테이트 공급을 제거하면 하이그린 축적이 각각 38% 및 59% 감소하였다(도 26b).
3.3.4) ALD6 유전자의 기능적 카피는 이전에 파괴된 ald6 유전자좌에서 실시예 3.2.2의 트로핀 생산 균주로 재통합되었다. NMPy와 트로핀 사이의 모든 대사산물의 축적에 대한 이러한 통합의 영향은 비-선택적 배지에서 48시간 성장 후 LC-MS/MS 분석을 통해 측정되었다. Ald6p를 통한 아세테이트 대사의 회복은 트로핀 역가의 2.7배 증가뿐만 아니라 하이그린 축적의 1.6배 증가를 초래하였다(도 28). 더욱이, ALD6 통합은 NMPy 및 트로피논 생산의 실질적인 증가뿐만 아니라 MPOB의 소비 증가를 초래하였다(도 27).
푸트레신과 트로핀 사이의 각각의 생합성 효소 유전자 (즉, AbPMT1 , DmMPO1 ΔC -PTS1 , AbPYKS , 및 AbCYP82M3)의 추가 카피를 실시예 3.3.4의 조작된 균주에서 저 카피 플라스미드로부터 발현시키고, TA 중간체의 생산을 선택적 배지에서 48시간의 성장 후 LC-MS/MS에 의해 BFP를 발현하는 동일한 균주의 것과 비교하였다. AbPYKS의 추가 카피의 발현은 NMP 축적의 4.3배 증가 및 트로핀 생산의 1.3배 증가를 초래하였다(도 29). AbPMT1의 추가 카피의 발현은 NMP와 트로피논 사이의 모든 TA 전구체 생성의 상당한 개선뿐만 아니라 트로핀 생성의 2.4배 증가를 초래하였다(도 29). 따라서, PMT(AbPMT1 및 DsPMT1) 및 PYKS(AbPYKS)의 추가 카피가 PAD1 유전자좌에서 실시예 3.3.4의 트로핀 생산 균주(CSY1249)의 게놈 내로 통합되었다. 생성된 조작된 균주(CSY1251)를 비-선택적 배지에서 48시간 동안 25℃에서 성장시켰으며, 그 결과 실시예 3.3.4의 트로핀 생산 균주(CSY1249)보다 2.2배 더 큰 3.4mg/L의 역가에서 트로핀 생산이 발생하였다 (도 30).
실시예 4: L-아르기닌으로부터 슈도트로핀 알칼로이드 생산을 위해 조작된 효모.
효모 균주는 L-아르기닌과 같은 초기 아미노산 전구체로부터 비의약 TA의 생산을 위해 조작될 수 있다. 예로서, 실시예 3에 기술된 플랫폼 효모 균주는 L-아르기닌으로부터 슈도트로핀 알칼로이드를 생산하도록 추가로 조작될 수 있다(도 1).
L-아르기닌으로부터 트로피논을 생산하는 플랫폼 효모 균주(실시예 3의 설명 참조)는 생합성된 트로피논을 슈도트로핀으로 전환하기 위해, 입체특이적 환원효소, 예를 들어 트로피논 환원효소 2(TR2; EC 1.1.1.236)를 통합하도록 추가로 조작될 수 있다. TDH3과 같은 강력한 구성적 프로모터 및 TR2 변이체에 대한 코딩 서열, 예를 들어 다투라 스트라모늄 (DsTR2)의 TR2를 포함하는 발현 카셋트는 트로피논-생산 플랫폼 효모 균주의 게놈에 통합될 수 있다. 생성된 균주는 PGK1과 같은 강력한 구성적 프로모터 및 슈도트로핀 스캐폴드에 작용하는 사이토크롬 P450과 같은 하이드록실화 효소를 보유하는 하나 이상의 발현 카셋트를 통합함으로써, 슈도트로핀의 하이드록실화된 유도체, 예를 들어 칼리스테긴을 생산하도록 추가로 조작될 수 있다. 각각 슈도트로핀 골격의 다른 위치에 작용하는 다중 P450 효소를 통합함으로써 다양한 칼리스테긴 및 이의 유도체를 생합성할 수 있다. 그 다음, 조작된 균주를 30 ℃ 또는 25℃에서 48 내지 96시간 동안 비-선택적 합성 완전 배지에서 배양할 수 있으며, 그 후 배양 배지에서 슈도트로핀 알칼로이드의 축적을 LC-MS/MS로 분석할 수 있다.
실시예 5: 페닐피루베이트 및 관련 TA 전구체의 과잉생산을 위해 조작된 효모.
효모 균주는 원하는 TA 및 TA 전구체로의 중추 대사에서 탄소 및 질소 플럭스을 증가시키기 위한 목적으로 의약 TA 생산에 필요한 아실 공여체 분자의 전구체를 나타내는 페닐피루베이트의 과잉생산을 위해 조작될 수 있다(도 2). 효모 균주는 천연 생합성 효소의 전사 조절 조정, 전구체 분자를 의도된 경로에서 멀어지게 하는 효소를 인코딩하는 유전자의 결실 또는 파괴, 및 내인성 분자를 TA 전구체 분자로 전환시키는 이종성 효소의 도입을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유전적 변형을 통합함으로써 페닐피루베이트의 과잉생산을 위해 조작될 수 있다.
일 예에서, 효모 균주는 아미노산 또는 다른 중심 대사산물로부터 페닐피루베이트를 생성하는 생합성 효소를 인코딩하는 천연 유전자의 추가 카피를 통합함으로써 증가된 페닐피루베이트 생성을 위해 조작될 수 있다. 이러한 추가 카피는 GPD, TEF1 또는 PGK1과 같은 강력한 구성적 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 천연 유전자 표적의 예는 방향산 아미노트랜스퍼라제 ARO8 및 ARO9, 및 탈수소효소 PHA2을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일 사례에서, ARO8의 하나 이상의 추가 카피는 강력한 구성적 프로모터의 제어 하에 조작된 균주에 혼입될 수 있다. 일 사례에서, ARO9의 하나 이상의 추가 카피는 강력한 구성적 프로모터의 제어 하에 조작된 균주에 혼입될 수 있다. 다른 예에서, PHA2의 하나 이상의 추가 카피는 강력한 구성적 프로모터의 제어 하에 조작된 균주에 혼입될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, ARO8 , ARO9, 및 PHA2를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 추가 카피는 독특하고 강력한 구성적 프로모터의 제어 하에 조작된 균주에 혼입될 수 있다.
실시예 6: TA 스캐폴드의 생합성을 위해 L-페닐알라닌 또는 L-티로신으로부터 아실 공여체의 생산을 위해 조작된 효모.
효모 균주는 트로핀, 슈도트로핀 또는 이들의 유도체와 에스테르화 반응을 일으켜 의약 TA, 비의약 TA 및 비-천연 TA를 생합성할 수 있는 PLA, 신남산, 쿠마르산, 페룰산, 벤조산, 코엔자임 A 티오에스테르 및 이들 화합물의 글리코사이드 유도체를 포함하여 L-페닐알라닌 및 L-티로신으로부터 다양한 페닐프로파노이드 아실 공여체 화합물의 생산을 위해 조작될 수 있다 (도 1-3).
6.1) 야생형 효모는 미량의 PLA만을 생산하기 때문에, 이 TA 전구체의 생산은 다운스트림 TA의 충분한 축적을 허용하도록 증가되어야 한다. PLA 생산을 개선하기 위해 이종성 페닐피루베이트 환원효소(PPR)가 조작된 숙주 세포에서 발현될 수 있다. CSY1251에서 저 카피 플라스미드로부터의 각각의 효소를 발현시키고, 선택 배지에서 72시간의 성장 후 LC-MS/MS에 의해 PLA 생성을 측정함으로써, 3-페닐피루베이트에 대한 보고된 활성(표 1)을 갖는 E. 콜라이, 락토바실러스, A. 벨라돈나, 및 윅케르하미아 플루오레스센스로부터의 PPR 오쏘로그,뿐만 아니라 바실러스 및 락토바실러스로부터의 락테이트 탈수소효소 (LDHs)를 각 효모에서의 활성에 대해 스크리닝하였다. L. 플란타룸, E. 콜라이 및 A. 벨라돈나의 PPR뿐만 아니라 모든 LDH 후보는 대조군에 비해 PLA 생산에서 약간(1.3~3.5배) 개선된 반면 W. 플루오레스센스의 PPR 발현은 PLA 생산이 ~250mg/L까지 거의 80배 증가하였다(도 31). 이와 같이 WfPPR은 균주 CSY1287을 만들기 위해 CSY1251에 통합하기 위해 선택되었다.
6.2) 또 다른 예로서, 효모 균주는 각각 L-페닐알라닌 및 L-티로신으로부터 비-천연 TA를 형성하기 위해 트로핀 또는 슈도트로핀과의 에스테르화를 위한 아실 공여체 화합물로서 사용될 수 있는 페닐프로파노이드인 신남산 및 쿠마르산의 생산을 위해 조작될 수 있다. 효모는 페닐알라닌 암모니아 분해효소(PAL; EC 4.3.1.24)와 같은 암모니아 분해효소를 통합하여 L-페닐알라닌으로부터 신남산을 생산하도록 조작할 수 있다. 유사하게, 효모는 티로신 암모니아 분해효소(TAL; EC 4.3.1.23)와 같은 암모니아 분해효소를 통합함으로써 L-티로신으로부터 쿠마르산을 생산하도록 조작될 수 있다. 효모 균주는 TRP1 선택 마커, TEF1 프로모터 및 아라비돕시스 탈리아나(AtPAL1)의 PAL 변이체에 대한 코딩 서열이 있는 저 카피 CEN/ARS 플라스미드로 형질전환함으로써 L-페닐알라닌으로부터 신남산을 생산하도록 조작되었다. 저 카피 플라스미드를 보유하는 생성된 균주를 30℃에서 적절한 아미노산 드롭아웃 용액(-Ura)이 있는 합성 완전 배지에서 성장시켰다. 48시간의 성장 후, 배지를 LC-MS/MS 분석에 의해 신남산 함량에 대해 분석하였다(도 32).
6.3) A. 벨라돈나에서 PLA는 UDP-글루코실트랜스퍼라제 84A27(AbUGT)에 의한 글루코실화를 통해 트로핀으로의 아실 전이를 위해 활성화된다(Qiu, F. 등, Functional genomics analysis reveals two novel genes required for littorine biosynthesis. New Phytol., nph.16317 (2019) 참조). 식물 UGT가 다양한 페닐프로파노이드의 생합성에 참여하고 종종 광범위한 기질 범위를 나타내기 때문에(Ross, J., Li, Y., Lim, E.-K., DJ Bowles, Higher plant glycosyltransferases. Genome Biol. 2, 3004.1- 3004.6(2001) 참조), 원하는 아실 공여체에 대해 충분히 높은 활성을 갖는 UGT를 선택하는 것이 필요하다.
6.3.1) 예로서, 정식 기질 PLA를 포함한 상이한 페닐프로파노이드 아실 공여체에 대한 AbUGT의 활성은 CSY1251의 저 카피 플라스미드에서 AbUGT를 발현하고 3개의 페닐프로파노이드 아실 공여체(PLA, 신남산, 페룰산)를 각각의 글루코사이드로 변환함으로써 평가되었다. AbUGT는 각각 신남산과 페룰산의 60% 및 90%를 글루코실화했지만 PLA의 글루코실화는 3% 미만의 전환율에서 테스트된 기질 중 가장 낮았다(도 33).
6.3.2) 다른 TA를 생산하는 솔라나세아에의 AbUGT의 오쏘로그는 PLA 및 기타 페닐프로파노이드에 대한 활성을 평가할 수 있다. 이 예에서, tBLASTn 검색을 사용하여 1000Plants 데이터베이스에 있는 브르그만시아 산구이네아 (BsUGT) 및 D. 메텔 (DmUGT)의 전사체에서 UGT84A27을 인코딩하는 전사체. CSY1251에서 저 카피 플라스미드로부터 AbUGT, BsUGT, DmUGT 또는 BFP 음성 대조군을 발현함으로써 이러한 이종상동 UGT를 인코딩하는 효모 코돈 최적화 서열을 활성에 대해 스크리닝하였다. 덱스트로스 수용체로서 500μM PLA, 신남산(CA) 또는 페룰산(FA)이 보충된 선택적 배지에서 72시간 성장 후 LC-MS/MS를 통해 형질전환된 균주의 배양에서 글루코사이드 생산을 측정하였다. 세 가지 UGT 오쏘로그 모두 CA(34-65% 전환율) 및 FA(85-90% 전환율)의 실질적인 글루코실화 및 PLA에 대한 미량 활성(<3% 전환율)을 나타냈으며, AbUGT는 PLA(2.7%)의 가장 큰 전환율을 나타내었다. (도 33, 34).
6.3.3) 구조적으로 유사한 기질인 신나메이트, 페룰레이트 및 PLA에 대한 AbUGT 활성의 불균형적인 변화를 감안할 때, PLA에 대한 활성 개선을 위해 AbUGT의 활성 부위를 조작하기 위해 구조 유도 합리적 돌연변이유발 접근법이 구현될 수 있다. 이 예에서, RaptorX 웹 서버를 사용하여 아라비돕시스 탈리아나 살리실레이트 UDP-글루코실트랜스퍼라제 UGT74F2 (PDB: 5V2K)의 결정 구조를 기반으로 UDP-글루코스에 결합된 AbUGT의 상동성 모델을 먼저 구축했다(도 35). 다음으로, Maestro/GlideXP 소프트웨어 제품군을 사용하여 활성 부위의 D-PLA 도킹을 시뮬레이션하였다. 에너지 최소화 결합 방식에 기초하여, D-PLA의 아릴 고리는 F130과의 파이-스태킹 상호작용에 의해 안정화될 가능성이 있는 반면, α-하이드록실 및 카복실레이트 기는 각각 Q151 및 H24와의 수소 결합에 의해 안정화되어, 친핵성 카복실레이트 산소는 UDP-덱스트로스의 친전자성 C1 탄소의 4 Å 이내이다(도 35). D-PLA는 또한 잔기 L205 및 I292에 인접해 있으며, 어느 쪽도 기질과 상호 작용하는 것으로 보이지 않는다. 이는, (i) 티로신에 대한 F130의 돌연변이는 신나메이트 및 페룰레이트가 없는, D-PLA의 α-히드록실 산소를 안정화시키기 위해 추가의 수소 결합을 제공하면서 D-LA의 아릴 고리와의 pi-적층을 보존할 수 있고; (ii) 페닐알라닌에 대한 L205의 돌연변이는 F130Y를 사용한 D-PLA의 파이-스택킹 안정화를 증가시킬 수 있고; 그리고 (iii) 글루타민에 대한 I292의 돌연변이는 D-PLA 및 UDP-글루코스와 함께 2개의 추가 안정화 수소 결합을 생성함을 시사한다(도 35). AbUGT의 F130Y, L205F 및 I292Q 점 돌연변이체는 CSY1251의 저 카피 플라스미드에서 각 돌연변이체, 야생형 AbUGT 또는 BFP 대조군을 발현하여 활성에 대해 스크리닝되고, 500 μm PLA, CA, 또는 FA로 보충된 선택 배지에서 72시간의 성장 후 LC-MS/MS에 의해 글루코사이드 생성을 측정하였다. F130Y 및 I292Q 돌연변이가 CA에 대한 UGT 활성을 유의하게 감소시켰지만, 3개의 돌연변이체 모두는 야생형 AbUGT(<3% 전환율)에 비해 PLA에 대해 비교적 낮은(및 통계적으로 구별할 수 없는) 활성을 나타내었다(도 36).
6.3.4) 섹션 6.1 및 6.3에 설명된 결과를 기반으로, 균주 CSY1288은 효모 코돈 최적화 WfPPR 및 AbUGT를 CSY1251의 게놈에 통합하여 구축되었으며, 이는 PLA 생산(66mg/L) 및 최소 PLA 글루코사이드 축적의 검증으로 입증되었다 (도 37).
6.4) PLA에 대한 AbUGT의 불량한 활성은 다운스트림 TA로의 TA 전구체의 흐름을 제한할 가능성이 있으므로, PLA 글루코사이드로의 페닐알라닌의 플럭스는 UDP-글루코스 축적을 촉진하고 글리코사이드 분해를 감소시키는 유전적 변형을 도입함으로써 증가될 수 있다.
6.4.1) UDP-글루코스는 저장 폴리사카라이드, 세포벽 글루칸 및 당단백질의 형성에 중요하므로 생합성이 엄격하게 조절된다(Nishizawa, M., Tanabe, M., Yabuki, N., Kitada, K., Toh-e, A. Pho85 kinase, a yeast cyclin-dependent kinase, regulates the expression of UGP1 encoding UDP- glucose pyrophosphorylase. Yeast. 18, 239-249 (2001) 참조). 글루코스에서 성장하는 동안, 효모는 2개의 주요한 대사 경로, 당분해 및 전분 생합성에 따라 글루코스-6-포스페이트를 지시한다. 시트레이트가 당분해 속도-제한 효소 포스포푸룩토키나제의 알로스테릭 억제제이기 때문에(Li, Y. 등, Production of Rebaudioside A from Stevioside Catalyzed by the Engineered Saccharomyces cerevisiae. Appl. Biochem. Biotechnol. 178, 1586-1598 (2016) 참조), 시트레이트 보충을 통한 당분해의 부분적인 억제는 UDP-글루코스 가용성과 글루코사이드 생산을 증가시킬 수 있다(도 38). 내인성 PLA 글루코사이드 생산을 위한 게놈 WfPPR 및 AbUGT를 인코딩하는 균주 CSY1288을 2% 시트르산 및 500μM CA 또는 FA가 보충된 배지에서 배양하고 글루코사이드 생산을 72시간 성장 후 LC-MS/MS로 비교하였다. 시트레이트 보충은 PLA, CA 및 FA의 글루코실화를 각각 83%, 56% 및 78% 감소시켰다(도 39).
6.4.2) 유전자 산물이 각각 글루코스-6-포스페이트의 글루코스-1-포스페이트로의 이성질체화 및 글루코스-1-포스페이트의 UDP-글루코스로의 전환을 촉매하는 PGM2 및 UGP1의 과발현은 UDP-글루코스 공급을 증가시키는데 사용될 수 있다.
6.4.2.1) PGM2 및 UGP1의 추가 카피는 CSY1288의 저 카피 플라스미드에서 발현되었으며 PLA 글루코사이드 생산은 선택적 배지에서 72시간 성장 후 측정되었다. PGM2 과발현은 대조군에 비해 개선되지 않은 반면, UGP1의 과발현은 PLA 글루코사이드 생산의 ~1.8배 증가를 가져왔고(도 40), UDP-글루코스 풀의 증가가 AbUGT에 의한 PLA 이용을 향상시킨다는 것을 뒷받침한다.
6.4.2.2) 천연 글루코시다제는 PLA 및 기타 TA 전구체 글루코사이드에 작용하여 축적을 감소시킬 수 있는데, 이는 다른 이종 글루코사이드가 효모에서 이러한 방식으로 가수분해되는 것으로 나타났기 때문이다(Schmidt, S., Rainieri, S., Witte, S., Matern, U., Martens, S., Identification of a Saccharomyces cerevisiae glucosidase that hydrolyzes flavonoid glucosides. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1751-1757 (2011) 참조; 또한 Wang, H. 등, Engineering Saccharomyces cerevisiae with the deletion of endogenous glucosidases for the production of flavonoid glucosides. Microb. Cell Fact. 15, 1-12 (2016) 참조). 이 예에서, 3개의 천연 글루코시다제 유전자(EXG1 , SPR1 및 EGH1)는 CSY1288에서 파괴되었고 PLA 글루코사이드 생산은 비-선택적 배지에서 파괴 돌연변이체의 성장 72시간 후에 측정되었다. EGH1의 파괴는 PLA 글루코사이드 생산을 두 배 초과 증가시켰으며(도 41), 이는 Egh1p에 의한 가수분해가 TA 전구체 플럭스의 실질적인 손실을 구성함을 나타낸다.
실시예 7: 리토린을 히오스시아민 알데하이드로 전환하도록 조작된 효모
리토린을 하이오스시아민 알데하이드로 전환하기 위해 효모 균주를 조작할 수 있다(도 2). 예를 들어, 실시예 6에 기재된 트로핀- 및 PLA 글루코시드-생산 효모 균주는 리토린의 하이오스시아민 알데히드로의 재배열을 촉매하기 위해 사이토크롬 P450 CYP80F1 (EC 1.14.19.-)을 발현하도록 추가로 조작될 수 있고, P450 효소의 활성을 뒷받침하기 위해 사이토크롬 P450 환원효소 (CPR; EC 1.6.2.4)를 발현하도록 조작될 수도 있다. LEU2 선택 마커, TDH3 프로모터, 및 A. 벨라돈나 (AbCYP80F1)로부터의 CYP80F1 변이체에 대한 코딩 서열을 갖는 저 카피 CEN/ARS 플라스미드; 및 TRP1 선택 마커, TEF1 프로모터, 및 S. 세레비지아에 (NCP1) 또는 A. 탈리아나 (AtATR1 )로부터의 사이토크롬 P450 환원효소 (CPR) 에 대한 코딩 서열을 갖는 저 카피 CEN/ARS 플라스미드로 형질전환시킴으로써 공급된 리토린을 하이오스시아민 알데하이드로 전환시키기 효모 균주를 조작하였다. 저 카피 플라스미드를 포함하는 생성된 균주를 30℃에서 1mM 리토린이 보충된 적절한 아미노산 드롭아웃 용액(-Leu -Trp)을 사용하여 합성 완전 배지에서 성장시켰다. 48시간의 성장 후, 배지를 LC-MS/MS 분석에 의해 하이오스시아민 알데하이드 함량에 대해 분석하였다(도 42).
실시예 8: 하이오스시아민을 스코폴라민으로 전환하기 위해 조작된 효모.
효모 균주는 하이오스시아민을 스코폴라민으로 전환하도록 조작할 수 있다(도 2). 예를 들어, 실시예 7에 기재된 효모 균주는 아니소다민을 형성하기 위해 하이오스시아민의 6β 위치에서 하이드록실라제 활성을 갖는 효소 및 스코폴라민을 형성하기 위해 아니소다민의 6β-하이드록실 위치에서 디옥시게나제 활성을 갖는 효소, 또는 이 두 가지 활동을 모두 보유하는 효소를 통합하도록 추가로 조작될 수 있다 (EC 1.14.11.11). 효모 균주는 LEU2 선택 마커, TDH3 프로모터, 및 D. 스트라모늄 (DsH6H), 아니소두스 아쿠탄굴루스 (AaH6H), 브르그만시아 아르보레아 (BaH6H), 또는 다투라 메텔 (DmH6H)로부터의 하이오스시아민 6β-하이드록실라제/디옥시게나제 (H6H)에 대한 코딩 서열을 갖는 저 카피 CEN/ARS 플라스미드로 형질전환함으로써 공급된 하이오스시아민을 스코폴라민으로 전환하도록 조작되었다. 저 카피 플라스미드를 포함하는 생성된 균주를 적절한 아미노산 드롭아웃 용액(-Leu)이 있는 합성 완전 배지에서 성장시키고 30℃에서 1mM 하이오스시아민으로 보충하였다. 72시간의 성장 후, 배지를 LC-MS/MS 분석에 의해 스코폴라민 함량에 대해 분석하였다(도 43). D. 스트라모늄의 H6H 변이체를 발현하는 균주는 시험된 모든 변이체가 생체내에서 H6H 활성을 나타내었지만, 공급된 하이오스시아민의 스코폴라민으로의 가장 큰 전환을 나타내었다. 이 조작된 효모 균주의 배양 배지에서 다양한 보조인자를 보충하고 72시간의 성장 후 LC-MS/MS로 배지를 분석함으로써 보조인자 요구사항의 추가 최적화를 수행하였다. 이 분석은 철 보충이 하이오스시아민의 스코폴라민으로의 전환을 증가시킨다는 것을 확인하였다(도 44).
실시예 9. 조작된 비-식물 세포에서 하이오스시아민 데히드로게나제 효소 후보의 확인 및 하이오시스아민 알데히드의 하이오스시아민으로의 환원
본원에 개시된 방법의 TA 알코올-알데하이드 상호전환을 수행하기에 적합한 탈수소효소 효소를 확인하고, 특히 하이오스시아민 알데하이드를 히오스시아민으로 환원시키기 위해, 하이오스시아민 탈수소효소(HDH) 열린 해독틀을 공개적으로 이용가능한 식물 RNA 서열분석 데이터로부터 확인하였다.
9.1) A. 벨라돈나 전사체에서 식별된 43,861개의 고유한 전사체 각각에 대한 조직 특이적 존재비(1백만 매핑된 판독당 콘티그의 킬로베이스당 단편, FPKM) 및 추정 단백질 구조 및 기능 주석은 Michigan State University Medicinal Plant Genomics Resource에서 수득하였다. 하이오스시아민 탈수소효소 후보를 인코딩하는 전사체는 미끼 유전자 CYP80F1(리토린 뮤타제) 및 H6H(하이오스시아민 6β-하이드록실라제/디옥시게나제)의 조직 특이적 발현 프로파일의 클러스터링을 기반으로 식별되었으며, 이들은 다음의 계산 필터링 알고리즘을 사용하여 각각 TA 생합성에서 탈수소효소 단계를 선행하고 따른다.
먼저 43,861개의 전사체 전체 목록을 다음과 같은 PFAM(단백질 패밀리) ID 중 임의의 것으로 주석이 달린 전사체에 대해 필터링하였다: PF00106, PF13561, PF08659, PF08240, PF00107, PF00248, PF00465, PF13685, PF13823, PF13602, PF16884, PF00248; 또는 다음 기능 주석 키워드 중 하나: 알코올 탈수소효소, 알데하이드 환원효소, 단쇄, 알도/케토. 또한, 키워드 푸트레신, 트로피논 및 트로핀을 포함하는 기능적 주석이 있는 모든 전사체는 미끼 유전자와의 클러스터링을 검증하기 위해 양성 대조군 TA 관련 유전자로 필터에 포함되었다. 다음으로, CYP80F1 및 H6H 미끼 유전자에 대한 평균 조직 특이적 발현 프로파일이 생성되었다. 2개의 미끼 유전자 각각에 대해 선형 회귀 모델을 구축하여 미끼 유전자 발현 프로필(FPKM에서)을 각 후보 유전자 프로필의 선형 함수로 표현하고 각 후보에 대한 상관관계 p-값을 계산하였다. 2개의 미끼 유전자 각각을 사용하여 식별된 후보를 풀링하고 중복을 제거하였다. 각 후보에 대한 결합된 p-값은 2개의 미끼 유전자 각각과의 상관관계의 log10 p-값의 합으로 계산되었다. TA 생합성 경로에서 알려진 탈수소효소와 일치하는 전사체(즉, 트로피논 환원효소 I 및 II)를 제거하고, 나머지 후보를 결합된 p-값 및 조직 특이적 발현 프로필의 계층적 클러스터링을 통해 미끼 유전자로부터의 거리에 따라 순위를 매겼다(도 45).
9.2) 실시예 9.1에서 확인된 거의 모든 후보는 알려진 TA 생합성 유전자에 대해 관찰된 동일한 2차 뿌리 특이적 발현 패턴을 나타내었다. UniPROT/SwissPROT 데이터베이스에 대한 결과 ~30개의 후보에 대한 BLASTp 검색은 많은 전사체에서 말단 또는 내부 서열 영역이 누락된 것으로 나타났다. 이 문제를 해결하기 위해 Trinity 소프트웨어 패키지를 사용하여 기탁된 원시 RNAseq 읽기에서 새로운 전사체 어셈블리를 반복했고(Haas, B. J. 등, De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nat. Protoc. 8, 1494-512 (2013) 참조), HDH 후보 중 12개에 대한 모든 누락된 서열 단편은 새로 조립된 전사체에 대해 불완전한 서열 영역의 BLAST 정렬을 수행하여 재구축되었다(표 2).
9.3) 효모에서 실시예 9.1 및 9.2에서 생성된 후보를 스크리닝하여 누락된 HDH 활성을 확인하였다.
9.3.1) 하이오스시아민 알데하이드에 대한 진정한 상업적 표준의 결여 및 화학적 합성으로부터의 불충분한 수율은 HDH 후보와 상류 생합성 효소의 공동-발현을 필요로 하였다―사이토크롬 P450 리토린 뮤타제 (CYP80F1)―공급된 리토린을 통한 생체내 활성 스크리닝에 대한 (실시예 7 참조). 리토린은 HDH 생성물 하이오스시아민과 유사한 크로마토그래피 및 질량 분석 특성을 나타내므로, 효모 코돈 최적화 AbCYP80F1 및 DsH6H(실시예 8 참조)를 CSY1251의 게놈에 통합하여 HDH 스크리닝 균주(CSY1292)를 구축하여, 3단계 생합성 경로를 통해 공급된 리토린 (m/z+ 290)으로부터 생산된 스코폴라민 (m /z + 304)의 검출을 통한 HDH 후보의 스크리닝을 가능하게 한다(도 2).
9.3.2) 12개의 HDH 후보 각각을 인코딩하는 효모 코돈 최적화 서열은 균주 CSY1292의 저 카피 플라스미드에서 발현되었고, 스코폴라민 생산은 1mM 리토린이 보충된 배지에서 72시간 동안 성장시킨 후 측정되었다. 12개의 후보 중 하나인 HDH2(AbHDH라고 함)는 히오스시아민 알데하이드 수준에서 35% 감소와 스코폴라민(7.2μg/L)의 측정 가능한 축적을 나타내어, 누락 HDH 활성을 인코딩함을 나타낸다(도 46).
9.4) 구조적 및 계통발생학적 분석은 HDH의 촉매 메카니즘과 진화 이력에 대한 추가 통찰력을 제공하였다.
9.4.1) AbHDH의 상동성 모델은 포퓰러스 트레물로이데스 스나필 알코올 탈수소효소(PtSAD; PDB: 1YQD)의 결정 구조를 기반으로 구축되었다(도 47). AbHDH는 중간 사슬 탈수소효소/환원효소(MDR) 슈퍼패밀리 내의 아연 의존성 알코올 탈수소효소(ZADH) 계열의 구성원이다. 이 패밀리의 전형인 AbHDH는 잘 보존된 뉴클레오타이드 결합 도메인과 더 가변적인 기질 결합 도메인이 있는 이중 소엽 구조를 나타낸다. AbHDH 뉴클레오타이드 결합 도메인 내의 잔기 S216, T217, S218 및 K221과 PtSAD의 인산염 안정화 잔기 S214, T215, S216 및 K219의 정렬은 AbHDH가 NADPH 의존성 산화환원효소임을 시사한다. 또한 ZADH의 전형인 AbHDH는 단백질 표면(C105, C108, C111 및 C119) 근처의 시스테인 잔기 4개와 활성 부위 내의 촉매 Zn2 +를 사용하여 구조적 Zn2+에 결합하는 것으로 보인다.
9.4.2) AbHDH의 촉매 메카니즘은 Maestro/Glide 소프트웨어 패키지를 사용하여 기질인 하이오스시아민 알데하이드를 활성 부위에 분자 도킹함으로써 설명되었다(도 47). 가장 유리한 결합 모드는 촉매 Zn2 + 및 NADPH 수소화물 공여체 둘 다의 ~5 Å 내에 기질의 알데하이드 그룹을 배치한다. ZADH의 도킹 결과 및 일반적인 메커니즘(Bomati, EK, Noel, JP, Structural and kinetic based for substrate selectivity in Populus tremuloides sinapyl alcohol dehydrogenase. Plant Cell. 17, 1598-1611 (2005) 참조)은 AbHDH용 다음과 같은 촉매 메커니즘을 제안한다. 기질의 부재에서, 활성 부위 내의 촉매 Zn2 +는 C52, H74, C168 및 물 분자에 의해 안정화되며, 이는 S54와의 극성 상호작용을 통해 위치되고 하이오스시아민 알데하이드의 결합 시 치환된다. 디하이드로니코틴아미드 수소화물에 의한 알데하이드 카보닐의 친핵성 공격은 촉매 Zn2 +와의 상호작용에 의해 안정화된 옥시음이온 중간체를 형성하고, 이는 NADP+와 S54의 리보스 기 사이의 양성자 셔틀을 통해 양성자화될 가능성이 있다.
9.5) 이종상동성 산화환원효소가 다른 TA 생산 솔로나세아에에서 하이오스시아민 생합성을 촉매하는지 확인하기 위해, tBLASTx 검색을 사용하여 다투라 이녹시아 및 다투라 스트라모늄의 전사체에서 AbHDH 코딩 서열의 변이체를 확인하였다(도 48). 2개의 확인된 오쏘로그(DiHDH, DsHDH)의 HDH 활성은 CSY1292의 저 카피 플라스미드에서 플럭스 제한 DsH6H의 추가 카피로 효모 코돈 최적화 서열을 공동 발현하고 1mM 리토린이 보충된 배지에서 스코폴라민 생산을 측정함으로써 검증되었다. DsHDH는 시험된 변이체의 가장 높은 기질 고갈 및 생성물 축적을 나타내었다(도 49).
9.6) 최적의 효소 변이체 및 플럭스 제한 효소의 과발현을 포함하는 의약 TA 생합성 가지가 플랫폼 효모 균주에 통합되었다. 균주 CSY1294는 효모 코돈 최적화 WfPPR 및 AbUGT, DsHDH 및 DsH6H의 두 번째 카피를 CSY1292에 통합하여 구축되었다. 공급된 리토린으로부터의 스코폴라민 생산은 CSY1294에서 확인되었다(도 50).
실시예 10: TA 스캐폴드 생산을 위한 아실 공여체 및 수용체의 에스테르화를 위해 조작된 효모.
효모 균주는 다양한 TA 스캐폴드를 생성하기 위해 활성화된 아실 공여체 화합물과 아실 수용체 화합물의 에스테르화를 촉매하는 효소를 발현하도록 조작될 수 있다(도 2, 3). 아실 공여체 그룹의 활성화는 실시예 6에 기재된 바와 같이, 코엔자임 A(CoA) 또는 글루코스(글루코사이드)와 같은 높은 그룹 전달 가능성을 갖는 화학적 모이어티를 아실 공여체의 카복실 기에 추가하는 효소를 통합하도록 아실 공여체 생성 효모 균주를 조작함으로써 달성할 수 있다. 이 능력에서 사용될 수 있는 아실 공여체 활성화 효소의 예는 CoA 리가제 및 UDP-글리코실트랜스퍼라제를 포함한다. 활성화된 아실 공여체 화합물 및 트로핀 및 슈도트로핀과 같은 아실 수용체의 에스테르화를 촉매하는 데 사용할 수 있는 에스테르화 효소의 예는 세린 카복시펩티다아제-유사 아실트랜스퍼라제 (SCPL-AT) 및 BAHD-유형 아실트랜스퍼라제를 비롯한 아실트랜스퍼라제이다. 이러한 아실트랜스퍼라제의 코딩 서열은 효모와 같은 이종성 숙주에서 발현될 때 그들의 활성을 개선하도록 변형될 수 있다.
10.1) SCPL-AT가 일반적으로 자연적으로 발생하는 것으로 밝혀진 식물에서, SCPL-AT의 코딩 서열에는 초기 폴리펩타이드를 소포체(ER)로 안내하는 N-말단 신호 펩타이드가 포함된다. 일단 ER에 국한되면, SCPL-AT 폴리펩타이드는 분비성 트래피킹 경로를 통해 골지를 통해 액포 내강으로 운반되며, 그곳에서 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이 ER-대-액포 트래피킹 과정 동안, 신호 펩타이드 절단, N-글리코실화, 내부 프로펩타이드 서열 제거 및 이황화물 결합 형성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 번역 후 변형(도 51)을 겪는다(Stehle, F., Stubbs, M.T., Strack, D., & Milkowski, C. Heterologous expression of a serine carboxypeptidase-like acyltransferase and characterization of the kinetic mechanism, FEBS Journal, 275, (2008) 참조). 그러나 세포 내 트래피킹 경로와 번역 후 변형 패턴이 유기체마다 다르기 때문에, 이종성 숙주에서 SCPL-AT의 발현은 부정확한 세포 아래 국소화 및/또는 활성에 대한 부정확한 번역 후 변형을 초래할 수 있다. 예로서, 리토린 합성효소(LS)와 같은 SCPL-AT의 코딩 서열(표 1)은 효모에서 발현될 때 활성을 개선하기 위해 변형될 수 있다.
10.1.1) 신호 펩타이드 서열은 효모에서 SCPL-AT의 처리 및 국소화에 영향을 줄 수 있다.
10.1.1.1) AbLS에서 추정 N-말단 신호 펩타이드의 존재는 이것이 식물체에서 예상되는 SCPL ER-액포 트래피킹 경로를 따른다는 것을 암시한다. 효모에서의 AbLS 국소화는 CSY1294에서 저 카피 플라스미드로부터 AbLS의 N- 및 C-말단 GFP 융합을 발현함으로써 조사되었다. 형광 현미경검사는 N-말단 융합체(GFP-AbLS)가 액포 막 염색 FM4-64와 공동 국재화되었음을 보여주었다(도 52). C-말단 융합(AbLS-GFP)에 대해 형광이 검출되지 않았으며, 이는 천연 C-말단이 SCPL 아실트랜스퍼라제의 안정성에 중요하다는 보고와 일치한다(tehle, F., Stubbs, M.T., Strack, D., & Milkowski, C. Heterologous expression of a serine carboxypeptidase-like acyltransferase and characterization of the kinetic mechanism, FEBS Journal, 275, (2008) 참조).
10.1.1.2) 효모에서 SCPL-AT의 액포 격리는 사이토졸 기질 풀에 대한 접근을 방해할 수 있는데, 이는 효모가 사이토졸과 2차 대사산물을 교환하기 위해 식물에 존재하는 필수 공포막 수송체가 부족할 가능성이 높기 때문이다. AbLS의 다른 효모 구획으로의 강제 국소화(아마도 사이토졸 대사산물에 대한 개선된 접근)가 활성을 가능하게 하는지 여부를 결정하기 위해, 야생형 N-말단 SP 서열은 액포 내강 (Prc1p 및 Pep4p), 액포 멤브레인 페이싱 내강 (Dap2p), 트랜스-골지 네트워크 (Och1p), ER 멤브레인 페이싱 내강 (Mns1p), 및 미토콘드리아 매트릭스 (Cit1p)로 표적화된 효모 단백질에서 취한 N-말단 신호 서열의 패널로 대체되었다 (도 53). 야생형 SP도 완전히 제거되었으며 다른 변이체의 경우 표준 페록시솜 표적화 서열(PTS1)이 C-말단에 추가되었다. 이러한 키메라 AbLS 변이체는 CSY1294의 고 카피 플라스미드에서 발현되었으며 형질전환체는 선택적 배지에서 96시간 성장 후 LC-MS/MS에 의해 활성에 대해 스크리닝되었다. 어떤 변이체에서도 리토린 또는 다운스트림 중간체의 생성이 관찰되지 않았다(도 53).
10.1.2) 효모에서 SCPL-AT의 부정확한 번역 후 처리는 활성 효소의 발현을 방지할 수 있다.
10.1.2.1) 단백질 N-글리코실화 패턴은 효모와 식물 간에 다르며 이전 보고서에서는 다양한 식물 효소의 올바른 N-글리코실화가 접힘, 안정성 및/또는 활성에 중요하다고 제안했다(Kar, B., Verma, P., den Haan, R., Sharma, A.K., Effect of N-linked glycosylation on the activity and stability of a
Figure pct00007
-glucosidase from Putranjiva roxburghii. Int. J. Biol. Macromol. 112, 490-498 (2018); see also Podzimek, T. 등, N-glycosylation of tomato nuclease TBN1 produced in N. 벤타미아나 and its effect on the enzyme activity. Plant Sci. 276, 152-161 (2018); see also Strasser, R., Plant protein glycosylation. Glycobiology. 26, 926-939 (2016) 참조). AbLS 폴리펩타이드의 인실리코 분석은 4개의 N-글리코실화 부위(N152, N320, N376, N416)를 예측했고 이 단백질의 O-글리코실화는 N. 벤타미아나에서 검출되지 않았다(도 54). C-말단 HA 태깅된 야생형 AbLS, 4개의 N→ 돌연변이체(N에서 로의 돌연변이가 N-글리코실화(23)를 폐지하는 경우), 또는 사중 N→Q 돌연변이는 CSY1294 및 N. 벤타미아나에서 발현되었고, 글리코실화 프로파일은 웨스턴 블롯에 의해 비교되었다. 반면에 야생형 AbLS, N→Q 단일 돌연변이체 및 사중 돌연변이체는 모두 N. 벤타미아나에서 단일 밴드로 나타나 단일 글리코실화 상태를 나타내는 사중 N→Q 돌연변이는 효모에서 단일 밴드를 생성하였고; 다른 모든 변이체는 이중 또는 삼중 밴드로 나타나 다중 글리코실화 상태의 조합을 나타낸다(도 55). 그러나 효모에서 2개의 야생형 AbLS 밴드의 밀도가 높을수록 담배의 야생형 AbLS 밴드와 부분적으로 겹치기 때문에, 효모 발현된 AbLS의 적어도 일부 분획은 올바른 글리코실화 상태에 있어야 하며 mis-글리코실화는 효모에서 AbLS 활성의 완전한 부족을 설명할 가능성은 거의 없다 (도 54-55).
10.1.2.2) 아라비돕시스 탈리아나의 시나포일글루코스:콜린 시나포일트랜스퍼라제(AtSCT)와 아베나 스트리고사의 아베나신 합성효소(AsSCPL1)를 포함한 SCPL 아실트랜스퍼라제의 하위세트는 이황화물 결합에 의해 연결된 활성 이종이량체를 생성하기 위해 단백질분해로 제거되는 내부 프로펩타이드 링커를 함유하는 것으로 밝혀졌다(Shirley, A.M., Chapple, C., Biochemical characterization of sinapoylglucose:choline sinapoyltransferase, a serine carboxypeptidase-like protein that functions as an acyltransferase in plant secondary metabolism. J. Biol. Chem. 278, 19870-19877 (2003) 참조; 또한 Mugford, S.T. 등, A serine carboxypeptidase-like acyltransferase is required for synthesis of antimicrobial compounds and disease resistance in oats. Plant Cell. 21, 2473-2484 (2009) 참조) AbLS 아미노산 서열을 이전에 특성규명된 식물 세린 카르복시펩티다제 및 SCPL 아실트랜스퍼라제의 것과 비교하여 AtSCT, AsSCPL1, 및 밀 카르복시펩티다제 2 (TaCBP2)의 고도로 가변성인 프로펩타이드드와 정렬되는 내부 25- 내지 30-잔기 서열의 존재를 밝혀냈고, 이는 AbALS가 너무 엔도프로테올분해 절단되어 이종이량체를 형성함을 시사한다(도 56). 또한, AbLS의 상동성 모델은 예측된 내부 프로펩타이드가 활성 부위를 차단하여 활성 제거가 필요함을 시사하였다(도 57). 그러나 N. 벤타미아나에서 발현된 야생형 AbLS는 단백질분해 절단을 겪는 것으로 보이지 않는데, 이는 예상 ~20-25 kDa C-말단 단편이 이황화물-환원 조건 하에서 웨스턴 블롯에 의해 검출되지 않았기 때문이다(도 54, 55). 추정되는 프로펩타이드가 식물체에서 절단되거나 제거되지 않는 것으로 보이기 때문에, AbLS는 프로펩타이드를 활성 부위에서 멀리 이동시키는 식물의 고유 형태를 채택할 수 있지만, 효모 분비 경로 및/또는 액포의 생화학적 환경의 차이가 교대, 활동 차단을 방지한다.
이 실패 모드를 해결하기 위해, 추정 프로펩타이드 링커에 인접하는 N- 및 C-말단 도메인이 별도의 신호 펩타이드가 있거나 없이 독립적으로 발현되는 분할 AbLS 대조군이 구축되었다. 또한, 추정 프로펩티드가 유연한(GGGGS) n (서열번호: 26) 링커로 대체된 AbLS 변이체는 이전에 AtSCT의 내부 프로펩티드가 효모에서 절단되는 것으로 입증되었고(Shirley, A.M., Chapple, C., Biochemical characterization of sinapoylglucose:choline sinapoyltransferase, a serine carboxypeptidase-like protein that functions as an acyltransferase in plant secondary metabolism. J. Biol. Chem. 278, 19870-19877 (2003) 참조), 또는 트랜스-골지 프로테아제 Kex2p에 의해 절단된 폴리-아르기닌 부위를 함유하는 합성 링커 (Chen, X., Zaro, J.L., Shen, W.C., Fusion protein linkers: Property, design and functionality. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1357-1369 (2013); 또한 Redding, K., Seeger, M., Payne, G.S., Fuller, R.S., The effects of clathrin inactivation on localization of Kex2 protease are independent of the TGN localization signal in the cytosolic tail of Kex2p. Mol. Biol. Cell. 7, 1667-1677 (1996) 참조)가 작제되었다(도 58). 분할 AbLS 대조군 및 프로펩타이드/링커 변이체 각각은 CSY1294의 저 카피 플라스미드에서 발현되었고 형질전환체는 선택적 배지에서 96시간 성장 후 LC-MS/MS에 의해 LS 활성에 대해 스크리닝되었다. 임의의 이러한 변이체에서는 리토린 또는 다운스트림 TA의 생성이 관찰되지 않았다.
단백질 발현 문제를 해결하기 위해, 위의 C-말단 HA-태깅된 AbLS 변이체 각각은 CSY1294의 저 카피 플라스미드로부터 발현되었고 겉보기 단백질 크기는 웨스턴 블롯에 의해 분할-AbLS 대조군과 비교되었다(도 58). AtSCT나 폴리-아르기닌 링커는 단백질 분해 절단에서 예상되는 20-25kDa C-말단 단편을 생성하지 않았다. 후자의 경우, 폴리-아르기닌 AbLS 변이체의 절단 실패는 단백질이 트랜스-골지 네트워크(TGN; 효모에서 후기 골지체라고도 함)의 상류 분비 경로에서 정체된다는 것을 의미하며, 이는 야생형 또는 골지-표적화된 (Och1p SP-융합된) AbLS를 발현하는 CSY1294에서 관찰된 심각한 성장 결함을 고려할 수 있다.
10.1.3) 효모에서 SCPL-AT의 기능적 발현은 TGN에서 분류를 변경하는 N-말단 융합을 조작하여 달성할 수 있다. TGN에서 액포로 가용성 효모 단백질을 수송하려면 액포 단백질 분류(Vps) 전달대상물 수송 단백질에 의한 일반적으로 N-말단 신호 서열의 인식이 필요하지만, 효모 TGN에 도달하는 내재성 막 단백질은 디폴트에 의해 액포로 분류되는 것으로 보인다 (SStack, J.H., Receptor-Mediated Protein Sorting to the Vacuole in Yeast: Roles for Protein Kinase, Lipid Kinase and GTP-Binding Proteins. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 1-33 (1995) 참조; 또한 Roberts, C.J., Nothwehr, S.F., Stevens, T.H., Membrane protein sorting in the yeast secretory pathway: Evidence that the vacuole may be the default compartment. J. Cell Biol. 119, 69-83 (1992) 참조). 따라서 SP를 N-말단 융합 가용성 도메인으로 마스킹하여 SCPL-AT를 막횡단 단백질로 전환하면 TGN 분류의 장애를 해결할 수 있다.
10.1.3.1) 일 예에서, AbLS 변이체는 아에쿠오리아 (GFP, BFP, mVenus) 및 디스코소마(mCherry, DsRed) 계열의 형광 단백질; 돌연변이된 프로테아제 절단 부위(SUMO*)가 있는 작은 유비퀴틴 관련 변형자(Smt3p); 및 TA 경로의 업스트림 효소인 AbUGT을 포함하는 N-말단 융합 가용성 도메인 패널로 구축되었다. 이러한 변이체와 야생형 AbLS는 CSY1294의 저 카피 플라스미드에서 발현되었고 선택적 배지에서 96시간 성장 후 리토린 합성효소 활성에 대해 스크리닝되었다. 모든 N-말단 융합된 AbLS 변이체는 하이오스시아민 및 스코폴라민의 측정 가능한 축적을 나타내었다. AbLS에 대한 아에쿠오리아 GFP 유래 형광 단백질의 융합은 각각 ~1μg/L 및 ~0.1μg/L의 히오스시아민 및 스코폴라민 생산을 초래하였고; 디스코소마 유래 형광 단백질의 융합은 DsRed 융합(10.3μg/L 하이오스시아민, 0.87μg/L 스코폴라민)을 통해 달성된 가장 큰 역가와 함께 상당히 더 높은 TA 생산을 유도하였다(도 59). AbLS 활성의 향상은 단량체(GFP, BFP, mVenus, mCherry, SUMO*)에서 동종이량체(AbUGT), 동종사량체(DsRed) 도메인 순으로 스코폴라민 생산이 증가하는 N-말단 도메인의 올리고머화 상태와 상관관계가 있는 것으로 나타났다.
10.2) 완전한 TA 생합성이 가능한 균주를 생성하기 위해, 효모 코돈 최적화 DsRed-AbLS 및 UGP1의 두 번째 카피를 파괴된 EGH1 부위에서 CSY1294의 게놈에 통합하여 CSY1296을 생성하였다. CSY1296은 각각 10.2μg/L 및 1.0 μg/L의 역가에서 새로운 하이오스시아민 및 스코폴라민 생산을 나타내었다.
실시예 11. 이종 수송체를 이용한 세포내 기질 수송 한계 완화
TA 생합성을 수행하는 효소가 여러 세포 아래 구획(사이토졸, ER 막, 페록시솜, 액포, 미토콘드리아)에 걸쳐 분포되어 있기 때문에, 효모는 서로 다른 구획 사이에서 TA 생합성 중간체의 동원을 가능하게 하는 식물에서 발견되는 수송체를 소유하지 않을 것이고, 세포 내 대사산물 수송은 TA 생산을 제한할 가능성이 있다.
11.1) 구획간 수송 제한은 비-식물 숙주 세포에서 식물 수송체의 기능적 발현에 의해 다루어질 수 있다. DsRed-AbLS의 액포 구획화(도 60)는 액포 내강으로의 사이토졸 트로핀 및 PLA 글루코사이드의 유입 및 사이토졸로의 액포 리토린의 배출을 필요로 한다. 액포 알칼로이드 및 배당체 격리를 담당하는 여러 다중 약물 및 독소 압출(MATE) 수송체가 솔라나세아에에서 확인되었으며, TA에 대해 관찰되거나 예측된 활성이 있는 3개를 포함한다(Morita, M. 등, Vacuolar transport of nicotine is mediated by a multidrug and toxic compound extrusion (MATE) transporter in Nicotiana tabacum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 2447-2452 (2009) 참조; 또한 Shoji, T. 등, Multidrug and toxic compound extrusion-type transporters implicated in vacuolar sequestration of nicotine in tobacco roots. Plant Physiol. 149, 708-718 (2009) 참조). 한 예에서, N. 타바큠 자스모네이트-유도성 알칼로이드 수송체 1(NtJAT1)과 2개의 MATE(NtMATE1, NtMATE2)는 CSY1296의 저 카피 플라스미드에서 발현되었고 TA의 축적은 선택적 배지에서 96시간 성장 후 측정되었다. NtJAT1 및 NtMATE2의 발현은 TA 생성을 개선시켰고, 전자는 히오스시아민 및 스코폴라민 역가를 각각 74% 및 18% 증가시켰다(도 61).
11.2) 이러한 수송체의 세포 아래 국소화를 평가하고 작용 메카니즘을 결정하기 위해, 저 카피 플라스미드에서 NtJAT1 또는 NtMATE2의 C-말단 GFP 융합을 발현하는 CSY1296의 형광 현미경검사를 수행하였다. 분석은 NtJAT1이 거의 독점적으로 액포 막에 국한되는 반면(DsRed-AbLS와 공동 국소화), NtMATE2는 액포와 원형질막 사이에 분할되어(도 60), 이는 두 수송체가 모두 액포 기질 수송 제한을 소산시키는 기능을 할 수 있고, 후자는 또한 세포 TA 배출을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 12: L-페닐알라닌 또는 L-티로신 및 L-아르기닌으로부터 비-천연 TA 생산을 위해 조작된 효모
유기체에서 자연적으로 발생하는 의약 및 비의약 TA의 생산을 위해 조작되는 것 외에도, 효소는 비-천연 TA의 생산을 위해 조작될 수도 있다(도 3). 예를 들어, 효모는 식물에 의해 TA에 자연적으로 통합되지 않는 아실 공여체 화합물의 생산을 위한 생합성 경로를 발현하도록 조작될 수 있다.
12.1) 한 예에서, 실시예 3에 기재된 플랫폼 트로핀 생산 효모 균주는 아실 공여체 화합물 신남산(실시예 6에 기재된 바와 같음)을 생산하고 신나메이트 활성화 효소 및 에스테르화 효소를 발현하여 비-천연 TA 예컨대 신나모일트로핀를 생성할 수 있다.
12.1.1) 신나메이트는 페닐알라닌 암모니아 분해효소를 통해 페닐알라닌, 예를 들어 A. 탈리아나로부터 PAL1 (AtPAL1)으로부터 생산될 수 있다. EcCS는 코엔자임 A(CoA) 활성화 아실 공여체를 필요로 하기 때문에, A. 탈리아나(At4CL5)의 4CL5와 같은 신나메이트에 대한 활성이 확립된 4-쿠마레이트-CoA 리가아제(Eudes, A. 등 Exploiting members of the BAHD acyltransferase family to synthesize multiple hydroxycinnamate and benzoate conjugates in yeast. Microbial Cell Factories, 15, (2016) 참조)는, 효모에서 신나모일-CoA 생합성을 가능하게 하기 위해 발현될 수 있다. 실시예 3에 기재된 플랫폼 트로핀 생산 효모 균주는 실시예 6에 기재된 바와 같이 신남산의 생산을 가능하게 하는 저 카피 플라스미드로 형질전환되었다.
12.1.2) 실시예 12.1.1의 조작된 균주는 또한 URA3 선택적 마커, HXT7 및 PMA1 프로모터, 및 A. 탈리아나로부터의 4-쿠마레이트-CoA 리가제 변이체(At4CL5) 및 에리트록실룸 코카로부터의 코카인 합성효소 (EcCS)에 대한 코딩 서열을 갖는 고 카피 2μ 플라스미드로 형질전환시킴으로써 신나모일트로핀을 생산하도록 변형되었다. 저 카피 및 고 카피 플라스미드를 포함하는 생성된 균주는 25℃에서 적절한 아미노산 드롭아웃 용액(-Ura -Trp)이 있는 합성 완전 배지에서 성장되었다. 72시간의 성장 후, 배양 배지는 LC-MS/MS 분석에 의해 신나모일트로핀에 대해 분석되었다(도 62). 탠덤 MS/MS 및 단편화 분석을 사용하여 신나모일트로핀의 동일성을 검출하고 확인하였다. 신나모일트로핀의 모 질량(m/z+ = 272)에 해당하는 MS/MS 스펙트럼의 비교는 3.684분의 정체 시간에서 새로운 피크를 나타내었고, 이는 질량이 진정한 신나모일트로핀 표준에 대한 전이와 일치하는 것으로 보이는 단편을 생성하였다(도 62a). 가장 풍부한 질량 전이, m/z+ 272 → 124는 하이오스시아민의 단편화 동안 생성된 일차 m/z+ = 124 트로핀 단편과 일치한다(Bedewitz, M.A., 등 A Root-Expressed L-Phenylalanine:4-Hydroxyphenylpyruvate Aminotransferase Is Required for Tropane Alkaloid Biosynthesis in Atropa belladonna. The Plant Cell, 26, (2014) 참조).
12.1.3) 실시예 12.1.2에 기재된 신나모일트로핀에 대한 272 → 124 LC-MS/MS 전이에 기초하여, 새로운 신나모일트로핀 생산을 측정하기 위해 다중 반응 모니터링(MRM) LC-MS/MS 방법이 개발되었다. 신나모일트로핀은 실시예 12.1.2의 조작된 균주의 세포외 배지에서 상당한 수준으로 축적되었지만, AtPAL1 , At4CL5 및 EcCS가 없는 경우는 그렇지 않았다(도 62b). 새로 생성된 신나모일트로핀의 역가는 표준 곡선에 기초하여 6.0μg/L로 추정되었다.
실시예 13: TA 및 TA 전구체의 생산을 개선하기 위한 성장 배지의 변형
TA 전구체 및 TA의 생산 역가는 배양 배지 조성을 수정하여 개선될 수 있다. 예를 들어, 배지 유형은 배지 염기(예를 들어, 효모 펩톤, 효모 질소 염기), 탄소원 (예를 들어, 글루코스, 말토덱스트린), 및 질소 공급원 (예를 들어, 아미노산, 황산암모늄, 우레아)에서 다양할 수 있다. 배지 유형은 또한 탄소 공급원의 농도 및 질소 공급원의 농도 또는 각 개별 아미노산의 농도와 같은 각 구성요소의 상대적 비율에서 다양할 수 있다.
13.1) 트로핀 생산 효모 균주(실시예 3에 기재된 바와 같음)는 25℃에서 48시간 성장 후 검정된 다양한 탄소 공급원 및 트로핀 생산과 함께 한정 배지(즉, 황산 암모늄 및 모든 아미노산이 포함된 YNB)에서 초기에 성장되었다. 트로핀의 가장 높은 생산은 2% 갈락토오스에서 관찰되었다(도 63a). 그러나 일부 조작된 균주는 글리세롤, 아라비노스 및 소르비톨과 같은 특정 탄소 공급원과 함께 성장에 실패하거나 심각하게 감소된 성장을 겪었고, 이는 아마도 이러한 탄소 공급원을 중추 대사에 동화할 수 없기 때문일 수 있다.
13.2) 트로핀 생성 효모 균주(실시예 3에 기재됨)를 성장을 위해 2% 덱스트로스와 2%의 추가 탄소 공급원이 보충된 한정 배지에서 배양하고, 트로핀 생성을 25℃에서 성장 48시간 후에 분석하였다. 2% 덱스트로스와 2% 글리세롤에서 가장 높은 트로핀 생산이 관찰되었다(도 63b). 글리세롤은 세포 지질막의 안정화, 이종 단백질의 접힘 및 안정성 개선, 및 사이토크롬 P450 및 일부 단쇄 탈수소효소/환원효소 효소의 활성에 필요한 NADPH 보조인자의 재생을 포함하는 몇 개의 메커니즘을 통해 TA 전구체 및 TA의 더 높은 생산에 기여할 수 있는 비-당 탄소 공급원이다(Li, Y. 등 Complete biosynthesis of noscapine and halogenated alkaloids in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2018, 115(17) E3922-E3931 참조).
13.3) 플럭스 병목 및 수송 제한의 완화를 통해, 조작된 효모에서 새로운 의약 TA 생합성의 개선을 달성할 수 있다.
13.3.1) 병목 효소의 과발현 및 배지 최적화를 통해 TA 생산의 개선이 달성되었다. CSY1296(~mg/L)에서 트로핀 생산이 스코폴라민(~μg/L)으로의 플럭스를 제한할 가능성이 낮기 때문에, 스코폴라민 생산을 제한하는 대사 병목은 페닐피루베이트와 스코폴라민(도 2) 사이에 각 이종성 효소의 추가 카피를 발현하고 CSY1296의 저 카피 플라스미드 및 TA 및 중간체의 생산을 측정함으로써 확인되었다. WfPPR 및 DsH6H의 추가 카피는 각각 히오스시아민 및 스코폴라민 역가의 64% 및 89% 증가를 가져왔고, 이는 이들 효소가 경로 플럭스의 주요 제한자임을 나타낸다(도 64).
13.3.2) NtJAT1 및 WfPPR와 DsH6H의 두 번째 카피를 CSY1296에 통합하여 개선된 스코폴라민 생성 균주를 구축하였다. 생성된 균주 CSY1297은 CSY1296에 비해 하이오스시아민 및 스코폴라민 축적이 각각 2.4배 및 7.1배 증가하는 것으로 나타났다(도 65).
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
첨부된 항에도 불구하고 공개는 다음 항으로 정의될 수 있다.
항목 1. 트로판 알칼로이드 생성물, 트로판 알칼로이드 생성물의 전구체 또는 트로판 알칼로이드 생성물의 유도체를 생산하는 조작된 비-식물 세포.
항목 2. 항목 1에서, 미생물 세포인, 세포.
항목 3. 항목 1 또는 2에 있어서, 조작된 세포는 복수의 효소를 인코딩하기 위한 복수의 이종성 코딩 서열을 포함하고, 효소 중 적어도 하나는 아르기닌 탈탄산효소, 아그마틴 우레오하이드롤라제, 아그마티나제, 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제, N-메틸푸트레신 산화효소, 파이롤리딘 케타이드 합성효소, 트로피논 합성효소, 사이토크롬 P450 환원효소, 트로피논 환원효소, 페닐피루베이트 환원효소, 3-페닐락트산 UDP-글루코실트랜스퍼라제 84A27, 리토린 합성효소, 리토린 뮤타제, 하이오스시아민 탈수소효소, 하이오스시아민 6β-하이드록실라제/디옥시게나제, 및 코카인 합성효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
항목 4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 내인성 아르기닌 대사가 세포에서 변형되는, 세포.
항목 5. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 내인성 페닐알라닌 및 페닐프로파노이드 대사가 세포의 변형된 항목인, 세포.
항목 6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 내인성 폴리아민 조절 기전이 세포에서 파괴된 것인, 세포.
항목 7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 내인성 아세테이트 대사가 세포에서 변형되는, 세포.
항목 8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 내인성 글라이코사이드 대사가 세포에서 변형되는, 세포.
항목 9. 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 트로판 알칼로이드 생성물, 트로판 알칼로이드 생성물의 전구체, 또는 하이오스시아민, 아트로핀, 아니소다민, 스코폴라민, 칼리스테긴, 코카인, 또는 비-천연 트로판 알칼로이드로 이루어진 군으로부터 선택된 트로판 알칼로이드 생성물의 유도체를 생성하는, 세포.
항목 10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 조작된 세포가 세린 카르복시펩티다제-유사 아실트랜스퍼라제 도메인의 N-말단에 융합된 하나 이상의 가용성 단백질 도메인을 포함하는 복수의 효소를 인코딩하는 복수의 이종성 코딩 서열을 포함하는, 세포.
항목 11. 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 세포내 막을 가로질러 또는 원형질막을 가로질러 TA, TA 전구체, 및/또는 TA 유도체의 수송이 세포에서 변형되는, 세포.
항목 12. 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 조작된 세포는 복수의 수송체를 인코딩하기 위한 복수의 이종성 코딩 서열을 포함하고, 수송체 중 적어도 하나는 다중약물 및 독소 압출 수송체, 니트레이트/펩타이드 계열 수송체, ATP 결합 카셋트 수송체, 및 다면발현성 약물 내성 수송체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
항목 13. 트로판 알칼로이드, 트로판 알칼로이드 생성물의 전구체, 또는 트로판 알칼로이드 생성물의 유도체의 생성하는 방법으로서, 하기의 단계들을 포함하는, 방법:
(a) 단백질 생산에 적합한 조건 하에 항목 1 내지 12 중 어느 하나의 세포를 배양하는 단계;
(b) 출발 화합물을 세포 배양물에 첨가하는 단계; 및
(c) 배양물로부터 트로판 알칼로이드 또는 트로판 알칼로이드 생성물의 전구체를 회수하는 단계.
전술한 발명이 이해의 명료함을 위해 예시 및 예를 통해 다소 상세하게 설명되었지만, 본 발명의 교시에 비추어 특정 변경 및 수정이 가능하다는 것은 당업자에게 용이하게 명백하다. 첨부된 청구범위의 정신 또는 범위를 벗어나지 않고 그에 따라 이루어진다.
따라서, 앞의 것은 단지 본 발명의 원리를 예시한다. 당업자는 본 명세서에 명시적으로 기술되거나 도시되지는 않았지만 본 발명의 원리를 구현하고 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 배열을 고안할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 명세서에 인용된 모든 실시예 및 조건부 언어는 주로 독자가 본 발명의 원리 및 발명자에 의해 관련 기술분야의 추가에 기여한 개념을 이해하는 것을 보조하도록 의도되며, 이러한 구체적으로 인용된 실시예 및 조건에 대한 제한 없이 해석되어야 한다. 더욱이, 본 발명의 원리, 양태, 및 구현예뿐만 아니라 그의 특정 예를 인용하는 본원의 모든 진술은 그의 구조적 및 기능적 등가물을 모두 포함하도록 의도된다. 또한, 그러한 등가물은 현재 알려진 등가물과 미래에 개발될 등가물, 즉 구조에 관계없이 동일한 기능을 수행하는 개발된 모든 요소를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 범위는 여기에 도시되고 설명된 예시적인 구현예로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구범위에 의해 구체화된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University <120> TROPANE ALKALOID (TA) PRODUCING NON-PLANT HOST CELLS, AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME <130> STAN-1611WO <150> 62/848,419 <151> 2019-05-15 <150> 62/815,709 <151> 2019-03-08 <150> 62/891,771 <151> 2019-08-26 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 328 <212> PRT <213> Atropa belladonna <400> 1 Met Leu Glu Thr Val Lys Tyr Leu Leu Gly Ser Ala Gly Pro Ser Gly 1 5 10 15 Tyr Gly Ser Lys Ser Thr Ala Glu Lys Val Thr Glu Gln Ser Ile His 20 25 30 Leu Arg Ser Ile Thr Ala Ile Ile Thr Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly 35 40 45 Ala Glu Thr Ala Arg Val Leu Ala Lys Arg Gly Ala Lys Leu Ile Leu 50 55 60 Pro Ala Arg Ser Leu Lys Ala Ala Glu Glu Thr Lys Ser Arg Ile Leu 65 70 75 80 Ser Glu Ser Pro Asp Ala Asp Ile Ile Val Met Ser Leu Asp Leu Ser 85 90 95 Ser Leu Ser Ser Val Arg Lys Phe Val Ala Gln Phe Glu Tyr Leu Asn 100 105 110 Phe Arg Leu Asn Ile Leu Ile Asn Asn Ala Gly Lys Phe Ala His Gln 115 120 125 His Ala Ile Ser Glu Asp Gly Ile Glu Met Thr Phe Ala Thr Asn His 130 135 140 Leu Gly His Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Leu Lys Asn Met Ile Glu 145 150 155 160 Thr Ala Asn Lys Thr Gly Val Gln Gly Arg Ile Val Asn Val Ser Ser 165 170 175 Ser Ile His Gly Trp Phe Ser Gly Asp Ala Ile Gln Tyr Leu Arg Leu 180 185 190 Ile Thr Lys Asp Lys Ser Gln Tyr Asp Ala Thr Arg Ala Tyr Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Leu Ala Asn Val Leu His Thr Lys Glu Leu Ala Gln Ile Leu 210 215 220 Lys Lys Met Val Ala Asn Val Thr Val Asn Cys Val His Pro Gly Ile 225 230 235 240 Val Arg Thr Arg Leu Thr Arg Glu Arg Glu Gly Leu Val Thr Asp Leu 245 250 255 Val Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Leu Lys Thr Ile Pro Gln Ala Ala 260 265 270 Ala Thr Thr Cys Tyr Val Ala Thr His Pro Arg Leu Ala Asp Val Ser 275 280 285 Gly Lys Tyr Phe Ala Asp Cys Asn Glu Ile Ser Ser Ser Lys Leu Gly 290 295 300 Ser Asn Leu Thr Glu Ala Ala Arg Ile Trp Ser Ala Ser Glu Ile Met 305 310 315 320 Val Ala Lys Asn Ser Asn Ala Asn 325 <210> 2 <211> 360 <212> PRT <213> Atropa belladonna <400> 2 Met Ser Lys Thr Thr Pro Asn His Thr Gln Ala Val Ser Gly Trp Ala 1 5 10 15 Ala Leu Asp Ser Ser Gly Lys Ile Thr Pro Tyr Ile Phe Asn Arg Arg 20 25 30 Glu Asn Gly Val Asn Asp Val Thr Ile Lys Ile Leu Tyr Cys Gly Ile 35 40 45 Cys His Thr Asp Leu His Tyr Ala Lys Asn Asp Trp Gly Val Thr Ile 50 55 60 Tyr Pro Val Val Pro Gly His Glu Ile Thr Gly Ile Val Val Glu Val 65 70 75 80 Gly Ser Asn Val Thr Asn Phe Lys Thr Gly Asp Lys Val Gly Val Gly 85 90 95 Cys Met Ser Ala Ser Cys Leu Gln Cys Glu Ser Cys Lys Asn Ser Glu 100 105 110 Glu Asn Tyr Cys Asp Lys Val Gln Phe Thr Tyr Asn Gly Val Phe Trp 115 120 125 Asp Gly Ser Ile Thr Tyr Gly Gly Tyr Ser Lys Met Leu Val Ala Asp 130 135 140 Tyr Arg Phe Val Val Ala Val Pro Glu Asn Leu Pro Met Asp Arg Ala 145 150 155 160 Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Phe Val Pro Met Lys Asp 165 170 175 Asn Asn Leu Ile Gly Ser Pro Arg Lys Asn Ile Gly Val Ile Gly Leu 180 185 190 Gly Gly Leu Gly His Leu Ala Ile Lys Phe Ala Lys Ala Phe Gly His 195 200 205 Arg Val Thr Val Ile Ser Thr Ser Leu Ser Lys Glu Lys Asp Ala Lys 210 215 220 Thr Lys Leu Gly Ala Asp Asp Phe Ile Val Ser Ser Asn Ala Gln Gln 225 230 235 240 Met Gln Ser Arg Gln Lys Thr Leu Asp Phe Ile Leu Asp Thr Val Ser 245 250 255 Ala Asp His Ser Leu Gly Pro Tyr Leu Glu Leu Leu Lys Ile Lys Gly 260 265 270 Thr Phe Val Ile Val Gly Ala Pro Asp Lys Pro Met Gly Leu Pro Ala 275 280 285 Phe Pro Leu Ile Phe Gly Lys Arg Thr Val Lys Gly Ser Met Ile Gly 290 295 300 Ser Ile Lys Glu Thr Gln Glu Met Leu Asp Ile Cys Gly Lys Tyr Asn 305 310 315 320 Ile Met Cys Asp Ile Glu Ile Val Thr Pro Asp Arg Ile Asn Glu Ala 325 330 335 Tyr Glu Arg Ile Glu Lys Asn Asp Ile Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp 340 345 350 Ile Asp Gly Gln Ser Ser Lys Leu 355 360 <210> 3 <211> 346 <212> PRT <213> Atropa belladonna <400> 3 Met Ala Met Glu Gly Thr Lys Val Ala Arg Ile Lys Leu Gly Ser Asp 1 5 10 15 Gly Leu Glu Val Ser Ala Gln Gly Leu Gly Cys Met Gly Met Ser Ala 20 25 30 Phe Tyr Gly Pro Pro Lys Pro Glu Pro Asp Met Ile Gln Leu Ile His 35 40 45 His Ala Ile Asn Ser Gly Val Thr Phe Leu Asp Thr Ser Asp Ile Tyr 50 55 60 Gly Pro His Thr Asn Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Leu Lys Gly Gly 65 70 75 80 Ile Arg Glu Arg Val Glu Leu Ala Thr Lys Phe Gly Ile Ser Phe Ala 85 90 95 Asp Gly Lys Arg Glu Val Arg Gly Asp Pro Ala Tyr Val Arg Ala Thr 100 105 110 Cys Val Ala Ser Leu Lys Arg Leu Asp Val Asp Cys Ile Asp Leu Tyr 115 120 125 Tyr Gln His Arg Ile Asp Thr Arg Val Pro Ile Glu Val Thr Val Gly 130 135 140 Glu Leu Lys Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Val Lys Tyr Ile Gly Leu 145 150 155 160 Ser Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ile Arg Arg Ala His Ala Val His Pro 165 170 175 Ile Thr Ala Val Glu Leu Glu Trp Ser Leu Trp Ser Arg Asp Val Glu 180 185 190 Glu Glu Leu Val Pro Thr Cys Arg Glu Leu Gly Ile Gly Ile Val Ala 195 200 205 Tyr Ser Pro Leu Gly Arg Gly Phe Leu Ser Ser Gly Ser Lys Leu Leu 210 215 220 Glu Asp Met Ser Asn Glu Asp Tyr Arg Lys His Leu Pro Arg Phe Gln 225 230 235 240 Ser Glu Asn Leu Glu His Asn Lys Lys Leu Tyr Glu Arg Ile Cys Gln 245 250 255 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100 105 110 Val Val Lys Glu Gly Ser Leu Leu Asn Lys Leu Asp Pro Leu Gly Phe 115 120 125 Pro Leu Ser Asn His Val Gly Val Leu Gly Phe Ser Gly Leu Ala Ala 130 135 140 Tyr Gly Gly Phe Phe Glu Val Cys Lys Pro Lys Pro Gly Glu Lys Val 145 150 155 160 Phe Val Ser Ala Ala Ser Gly Ser Val Gly Asn Leu Val Gly Gln Tyr 165 170 175 Ala Lys Leu Leu Gly Cys His Val Val Gly Ser Ala Gly Ser Gln Glu 180 185 190 Lys Val Lys Leu Leu Lys Glu Thr Leu Gly Phe Asp Asp Ala Phe Asn 195 200 205 Tyr Lys Glu Glu Thr Asp Leu Lys Ser Ala Leu Lys Arg Cys Phe Pro 210 215 220 Gln Gly Ile Asp Val Cys Phe Asp Asn Val Gly Gly Lys Met Leu Glu 225 230 235 240 Ala Ala Val Ala Asn Met Asn Leu Phe Gly Arg Val Ala Ile Cys Gly 245 250 255 Val Ile Ser Glu Tyr Thr Asn Ala Ser Thr Arg Ala Ala Pro Glu Met 260 265 270 Leu Asp Ile Val Tyr Lys Arg Ile Thr Ile Gln Gly Phe Leu Ala Ala 275 280 285 Asp Phe Met Lys Val Tyr Ala Asp Phe Leu Ser Glu Thr Val Glu Tyr 290 295 300 Leu Gln Asp Gly Lys Leu Lys Ala Val Glu Asp Val Ser Glu Gly Val 305 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Leu Gly His Glu 65 70 75 80 Ala Ser Gly Val Val Glu Ser Val Gly Glu Gly Val Thr Asp Met Lys 85 90 95 Thr Gly Asp His Val Val Pro Ile Phe Asn Gly Glu Cys Gly Glu Cys 100 105 110 Val Tyr Cys Asn Ser Ser Lys Lys Thr Asn Leu Cys Gly Lys Phe Arg 115 120 125 Val Asn Pro Phe Lys Ser Val Met Ala Asn Asp Gly Lys Cys Arg Phe 130 135 140 Arg Asn Lys Asp Gly Asn Pro Ile Tyr His Phe Leu Asn Thr Ser Thr 145 150 155 160 Phe Ser Glu Tyr Thr Val Val Asp Ser Ala Cys Leu Val Asn Ile Asp 165 170 175 Pro His Ala Pro Leu Asp Lys Met Thr Leu Leu Ser Cys Gly Val Ser 180 185 190 Thr Gly Leu Gly Ala Ala Trp Asn Thr Ala Asp Val Gln Thr Gly Glu 195 200 205 Thr Val Ala Val Phe Gly Leu Gly Ala Val Gly Leu Ala Val Val Glu 210 215 220 Gly Ala Arg Thr Arg Gly Ala Ser Arg Ile Ile Gly Val Asp Ile Asn 225 230 235 240 Ser Glu Lys Arg Ile Lys Gly Gln Ala Ile Gly Ile Thr Asp Phe Ile 245 250 255 Asn Pro Lys Glu Ile Asp Val Pro Val His Glu Lys Ile Arg Glu Met 260 265 270 Thr Gly Gly Gly Val His Tyr Ser Phe Glu Cys Ala Gly Asn 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Leu Asp Ser Asn Val Leu Asp Ala Trp Ala Gln 50 55 60 Ile Glu His Leu Tyr Pro Asn Gln Val Met Ser Leu Glu Thr Ser Thr 65 70 75 80 Lys Pro Lys Phe Pro Glu Ala Ile Lys Thr Lys Lys Asp Trp Asp Phe 85 90 95 Val Val Lys Asn Asp Ala Ile Glu Asn Tyr Gln Leu Arg Val Asn Lys 100 105 110 Ile Lys Asp Pro Lys Ile Leu Gly Ile Asp Pro Asn Val Thr Gln Tyr 115 120 125 Thr Gly Tyr Leu Asp Val Glu Asp Glu Asp Lys His Phe Phe Phe Trp 130 135 140 Thr Phe Glu Ser Arg Asn Asp Pro Ala Lys Asp Pro Val Ile Leu Trp 145 150 155 160 Leu Asn Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser Leu Thr Gly Leu Phe Phe Glu 165 170 175 Leu Gly Pro Ser Ser Ile Gly Pro Asp Leu Lys Pro Ile Gly Asn Pro 180 185 190 Tyr Ser Trp Asn Ser Asn Ala Thr Val Ile Phe Leu Asp Gln Pro Val 195 200 205 Asn Val Gly Phe Ser Tyr Ser Gly Ser Ser Gly Val Ser Asn Thr Val 210 215 220 Ala Ala Gly Lys Asp Val Tyr Asn Phe Leu Glu Leu Phe Phe Asp Gln 225 230 235 240 Phe Pro Glu Tyr Val Asn Lys Gly Gln Asp Phe His Ile Ala Gly Glu 245 250 255 Ser Tyr Ala Gly His Tyr Ile Pro Val Phe Ala Ser Glu Ile Leu Ser 260 265 270 His Lys Asp Arg Asn Phe Asn Leu Thr Ser Val Leu Ile Gly Asn Gly 275 280 285 Leu Thr Asp Pro Leu Thr Gln Tyr Asn Tyr Tyr Glu Pro Met Ala Cys 290 295 300 Gly Glu Gly Gly Glu Pro Ser Val Leu Pro Ser Glu Glu Cys Ser Ala 305 310 315 320 Met Glu Asp Ser Leu Glu Arg Cys Leu Gly Leu Ile Glu Ser Cys Tyr 325 330 335 Asp Ser Gln Ser Val Trp Ser Cys Val Pro Ala Thr Ile Tyr Cys Asn 340 345 350 Asn Ala Gln Leu Ala Pro Tyr Gln Arg Thr Gly Arg Asn Val Tyr Asp 355 360 365 Ile Arg Lys Asp Cys Glu Gly Gly Asn Leu Cys Tyr Pro Thr Leu Gln 370 375 380 Asp Ile Asp Asp Tyr Leu Asn Gln Asp Tyr Val Lys Glu Ala Val Gly 385 390 395 400 Ala Glu Val Asp His Tyr Glu Ser Cys Asn Phe Asp Ile Asn Arg Asn 405 410 415 Phe Leu Phe Ala Gly Asp Trp Met Lys Pro Tyr His Thr Ala Val Thr 420 425 430 Asp Leu Leu Asn Gln Asp Leu Pro Ile Leu Val Tyr Ala Gly Asp Lys 435 440 445 Asp Phe Ile Cys Asn Trp Leu Gly Asn Lys Ala Trp Thr Asp Val Leu 450 455 460 Pro Trp Lys Tyr Asp Glu Glu Phe Ala Ser Gln Lys Val Arg Asn Trp 465 470 475 480 Thr Ala Ser Ile Thr Asp Glu Val Ala Gly Glu Val Lys Ser Tyr Lys 485 490 495 His Phe Thr Tyr Leu Arg Val Phe Asn Gly Gly His Met Val Pro Phe 500 505 510 Asp Val Pro Glu Asn Ala Leu Ser Met Val Asn Glu Trp Ile His Gly 515 520 525 Gly Phe Ser Leu 530 <210> 34 <211> 444 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 34 Val Glu Pro Ser Gly His Ala Ala Asp Arg Ile Ala Arg Leu Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Val Asp Phe Asp Met Tyr Ser Gly Tyr Ile Thr Val Asp 20 25 30 Glu Gly Ala Gly Arg Ser Leu Phe Tyr Leu Leu Gln Glu Ala Pro Glu 35 40 45 Asp Ala Gln Pro Ala Pro Leu Val Leu Trp Leu Asn Gly Gly Pro Gly 50 55 60 Cys Ser Ser Val Ala Tyr Gly Ala Ser Glu Glu Leu Gly Ala Phe Arg 65 70 75 80 Val Lys Pro Arg Gly Ala Gly Leu Val Leu Asn Glu Tyr Arg Trp Asn 85 90 95 Lys Val Ala Asn Val Leu Phe Leu Asp Ser Pro Ala Gly Val Gly Phe 100 105 110 Ser Tyr Thr Asn Thr Ser Ser Asp Ile Tyr Thr Ser Gly Asp Asn Arg 115 120 125 Thr Ala His Asp Ser Tyr Ala Phe Leu Ala Lys Trp Phe Glu Arg Phe 130 135 140 Pro His Tyr Lys Tyr Arg Asp Phe Tyr Ile Ala Gly Glu Ser Tyr Ala 145 150 155 160 Gly His Tyr Val Pro Glu Leu Ser Gln Leu Val His Arg Ser Lys Asn 165 170 175 Pro Val Ile Asn Leu Lys Gly Phe Met Val Gly Asn Gly Leu Ile Asp 180 185 190 Asp Tyr His Asp Tyr Val Gly Thr Phe Glu Phe Trp Trp Asn His Gly 195 200 205 Ile Val Ser Asp Asp Thr Tyr Arg Arg Leu Lys Glu Ala Cys Leu His 210 215 220 Asp Ser Phe Ile His Pro Ser Pro Ala Cys Asp Ala Ala Thr Asp Val 225 230 235 240 Ala Thr Ala Glu Gln Gly Asn Ile Asp Met Tyr Ser Leu Tyr Thr Pro 245 250 255 Val Cys Asn Ile Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser 260 265 270 Gln Gln Arg Arg Ser Arg Gly Arg Tyr Pro Trp Leu Thr Gly Ser Tyr 275 280 285 Asp Pro Cys Thr Glu Arg Tyr Ser Thr Ala Tyr Tyr Asn Arg Arg Asp 290 295 300 Val Gln Met Ala Leu His Ala Asn Val Thr Gly Ala Met Asn Tyr Thr 305 310 315 320 Trp Ala Thr Cys Ser Asp Thr Ile Asn Thr His Trp His Asp Ala Pro 325 330 335 Arg Ser Met Leu Pro Ile Tyr Arg Glu Leu Ile Ala Ala Gly Leu Arg 340 345 350 Ile Trp Val Phe Ser Gly Asp Thr Asp Ala Val Val Pro Leu Thr Ala 355 360 365 Thr Arg Tyr Ser Ile Gly Ala Leu Gly Leu Pro Thr Thr Thr Ser Trp 370 375 380 Tyr Pro Trp Tyr Asp Asp Gln Glu Val Gly Gly Trp Ser Gln Val Tyr 385 390 395 400 Lys Gly Leu Thr Leu Val Ser Val Arg Gly Ala Gly His Glu Val Pro 405 410 415 Leu His Arg Pro Arg Gln Ala Leu Val Leu Phe Gln Tyr Phe Leu Gln 420 425 430 Gly Lys Pro Met Pro Gly Gln Thr Lys Asn Ala Thr 435 440 <210> 35 <211> 476 <212> PRT <213> Saccharomycescerevisiae <400> 35 Met Lys Lys Thr Ile Val Val Pro Ile Leu Lys Tyr His Lys Ile Leu 1 5 10 15 Leu Leu Phe Val Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Cys Pro Leu Ile Glu 20 25 30 Ala Ala Gly Thr Pro Val Lys Tyr Leu Pro Gly Phe Gly Pro Leu Pro 35 40 45 Phe Glu Phe Glu Thr Gly Tyr Val Gly Leu Gly Glu Ser Glu Glu Val 50 55 60 Gln Leu Phe Tyr Tyr Phe Phe Lys Ser Glu Ser Asn Pro Glu Val Asp 65 70 75 80 Pro Leu Ile Leu Trp Ile Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Ala Leu Asn 85 90 95 Ala Ile Thr Thr Glu Leu Gly Pro Val Leu Leu Asp Ala Lys Glu Tyr 100 105 110 Asp Gly Ser Leu Pro Thr Leu Ser Leu Asn Pro Tyr Ser Tyr Thr Lys 115 120 125 Val Ala Asn Ile Ile Phe Leu Asp Ser Pro Val Thr Gly Gly Phe Ser 130 135 140 Tyr Ala Thr Thr Lys Glu Ala Asn His Ser Asp Asn Val Gln Met Ala 145 150 155 160 Leu His Thr His Gln Phe Val Gln Lys Trp Leu Val Asp His Ser Glu 165 170 175 Tyr Leu Ser Asn Asp Phe Tyr Val Ala Gly Asp Ser Tyr Ser Gly Ile 180 185 190 Ser Val Pro Ile Ile Thr Gln Val Ile Ser Asp Gly Asn Glu Ala Gly 195 200 205 Asn Lys Pro Trp Ile Asn Leu Lys Gly Tyr Ile Leu Gly Asn Ala Val 210 215 220 Thr Phe Arg Pro Asp Glu Gln Asn Tyr Arg Ile Pro His Ala His Gly 225 230 235 240 Leu Ala Leu Ile Ser Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Leu Glu Ser Ser Cys 245 250 255 Gly Gly Glu Tyr Gln Tyr Ile Asp Gln Thr Asn Thr His Cys Leu Gln 260 265 270 His Val Gln Thr Phe Asn Arg Leu Val Ser Gly Ile Tyr Phe Glu His 275 280 285 Ile Leu Glu Pro Ile Cys Asn Pro Val Ser Thr Lys Ala Arg His Leu 290 295 300 Ser Pro Gln Arg Arg Tyr Leu Asn Gln Lys Leu Gly Gln Leu Lys Asn 305 310 315 320 Pro Thr Met Leu Pro Gly Val Lys Cys Arg Asp Glu Trp His Leu Leu 325 330 335 Ser Glu Ile Trp Val Asn Asp Glu Thr Val Gln Glu Ala Leu His Val 340 345 350 Arg Lys Gly Thr His Gly Ile Trp Lys Gln Cys Pro Asn Tyr Glu Lys 355 360 365 Met Pro Phe Thr Arg Thr Ile Asn Asn Thr Ile Pro Phe His Ala Ser 370 375 380 Leu Ser Lys Lys Gly Tyr Arg Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Tyr Asp 385 390 395 400 Leu Tyr Val Pro Phe Leu Ser Thr Gln Ala Trp Ile Arg Ser Leu Asn 405 410 415 Tyr Ser Ile Asp Thr Glu Trp Arg Arg Trp Phe Val Asp Gly Gln Val 420 425 430 Ala Gly Tyr Val Thr Thr Tyr Ser Asn Gln Met Thr Phe Thr Thr Ile 435 440 445 Lys Gly Ala Gly His Thr Ala Pro Glu Tyr Lys Pro Ala Glu Cys Leu 450 455 460 Ala Met Leu Lys Arg Trp Ile Tyr Tyr Gln Pro Leu 465 470 475

Claims (35)

  1. 트로판 알칼로이드 생성물, 트로판 알칼로이드 생성물의 전구체, 또는 트로판 알칼로이드 생성물의 유도체를 생산하는 조작된 비-식물 세포로서, 상기 조작된 비-식물 세포는 트로판 알칼로이드 생성물, 트로판 알칼로이드 생성물의 전구체, 또는 트로판 알칼로이드 생성물의 유도체를 생산하기 위한 경로 내에 복수의 효소를 인코딩하는 복수의 이종성 코딩 서열을 포함하고;
    상기 세포는 내인성 아르기닌 대사, 내인성 페닐알라닌 및 페닐프로파노이드 대사, 내인성 폴리아민 조절 기전 및 대사, 내인성 아세테이트 대사, 및 내인성 글라이코사이드 대사의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 내인성 대사 경로 또는 조절 메카니즘에 대한 하나 이상의 변경을 포함하는, 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포가 내인성 아르기닌 대사, 내인성 페닐알라닌 및 페닐프로파노이드 대사, 내인성 폴리아민 조절 메카니즘 및 대사, 및 내인성 아세테이트 대사의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 내인성 대사 경로 또는 조절 메카니즘에 대한 하나 이상의 변경을 포함하는, 세포.
  3. 제1항에 있어서, 내인성 글라이코사이드 대사에 대한 하나 이상의 변경을 포함하는, 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 세포인, 세포.
  5. 제4항에 있어서, 진균 세포인, 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포가 하나 이상의 효소에 대한 하나 이상의 이종성 코딩 서열을 포함하며, 상기 효소 중 적어도 하나는 아르기닌 탈탄산효소, 아그마틴 우레오하이드롤라제, 아그마티나제, 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제, N-메틸푸트레신 산화효소, 파이롤리딘 케타이드 합성효소, 트로피논 합성효소, 사이토크롬 P450 환원효소, 트로피논 환원효소, 페닐알라닌 암모니아-분해효소, 티로신 암모니아-분해효소, 페닐피루베이트 환원효소, 4-쿠마레이트-CoA 리가제, 3-페닐락트산 UDP-글루코실트랜스퍼라제 84A27, 리토린 합성효소, 리토린 뮤타제, 하이오스시아민 탈수소효소, 하이오스시아민 6β-하이드록실라제/디옥시게나제, 및 코카인 합성효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 아르기닌 대사가 하나 이상의 내인성 효소의 하나 이상의 코딩 서열에 대한 변형에 의해 세포에서 변경되고, 상기 효소 중 하나 이상이 글루타메이트 N-아세틸트랜스퍼라제, 아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸-γ-글루타밀-포스페이트 환원효소, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제, 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제, 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제, 아르기니노석시네이트 합성효소, 아르기니노석시네이트 분해효소, 및 아르기나제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 페닐알라닌 및 페닐프로파노이드 대사가 하나 이상의 내인성 효소의 하나 이상의 코딩 서열에 대한 변형에 의해 세포에서 변경되고, 상기 효소 중 적어도 하나가 5작용성 AROM 폴리펩타이드, 코리스메이트 합성효소, 코리스메이트 뮤타제, 프리페네이트 탈수효소, 방향족 아미노전이효소 및 페닐아크릴산 탈탄산효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 폴리아민 조절 기전은 이상의 내인성 단백질의 하나 이상의 코딩 서열에 대한 변형에 의해 세포에서 변경되고, 단백질 중 적어도 하나는 메틸티오아데노신 포스포릴라제, 오르니틴 탈탄산효소, 오르니틴 탈탄산효소 안티자임, 폴리아민 산화효소, 스페르미딘 합성효소, 스페르민 합성효소, 폴리아민 수송체, 및 폴리아민 투과효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 아세테이트 대사는 하나 이상의 내인성 효소의 하나 이상의 코딩 서열에 대한 변형에 의해 세포에서 변경되고, 상기 효소 중 적어도 하나는 알코올 탈수소효소 및 알데하이드 탈수소효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 글리코사이드 대사는 하나 이상의 내인성 효소의 하나 이상의 코딩 서열에 대한 변형에 의해 세포에서 변경되고, 상기 효소 중 적어도 하나는 글루칸 1,3-β-글루코시다제 및 스테릴-β-글루코시다제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 코딩 서열에 대한 변형은 세포에 고유한 생합성 효소 또는 조절 단백질 유전자에서 돌연변이를 완화시키는 피드백 억제, 세포에 고유한 생합성 효소 유전자의 전사 조절 변형, 및 세포에 고유한 효소 또는 단백질의 불활성화 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포는 조작된 세포의 세포 아래 구획에서 아실트랜스퍼라제 도메인의 기능적 발현을 가능하게 하는 목적으로 세린 카복시펩티다아제-유사 아실트랜스퍼라제 도메인의 N-말단에 융합된 하나 이상의 가용성 단백질 도메인을 포함하는 하나 이상의 효소를 인코딩하는 하나 이상의 이종성 코딩 서열을 포함하는, 세포.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 아그마틴, N-카바모일푸트레신, N-메틸푸트레신, 4-메틸아미노부탄알, N-메틸파이롤리늄, 4-(1-메틸-2-피롤디닐)-3-옥소부탄산, 트로피논, 트로핀, 슈도트로핀, 에크고닌, 메틸에크고닌, 티오에스테르 결합에 의해 페닐락트산에 공유결합된 코엔자임 A, 또는 글라이코사이드 결합에 의해 신남산, 페룰산, 쿠마르산, 또는 페닐락트산에 공유결합된 당으로 이루어진 군으로부터 선택된 트로판 알칼로이드 생성물의 전구체를 생성하는, 세포.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하이오스시아민, 아트로핀, 아니소다민, 스코폴라민, 칼리스테긴, 코카인, 또는 비-천연 트로판 알칼로이드로 이루어진 군으로부터 선택된 트로판 알칼로이드 생성물을 생성하는, 세포.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, p-하이드록시아트로핀, p-하이드록시하이오스시아민, p-플루오로하이오스시아민, p-클로로하이오스시아민, p-브로모하이오스시아민, p-플루오로스코폴라민, p-클로로스코폴라민, p-브로모스코폴라민, N-메틸하이오스시아민, N-부틸하이오스시아민, N-메틸스코폴라민, N-부틸스코폴라민, N-아세틸하이오스시아민, 및 N-아세틸스코폴라민으로 이루어진 군으로부터 선택된 트로판 알칼로이드 생성물의 유도체를 생성하는, 세포.
  17. 제15항에 있어서, 하이오스시아민, 아트로핀, 또는 스코폴라민로 이루어진 군으로부터 선택된 트로판 알칼로이드 생성물을 생성하는, 세포.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 막을 가로지르는 또는 원형질 막을 가로지르는 하나 이상의 TA, 하나 이상의 TA 전구체, 및/또는 하나 이상의 TA 유도체의 수송은 세포에서 변형되는, 세포.
  19. 제18항에 있어서, 변형된 수송은 하나 이상의 수송체를 인코딩하는 하나 이상의 이종성 코딩 서열에 의해 가능하고, 상기 수송체 중 적어도 하나는 다중약물 및 독소 압출 수송체, 니트레이트/펩타이드 계열 수송체, ATP 결합 카셋트 수송체, 및 다면발현성 약물 내성 수송체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  20. 트로판 알칼로이드 생성물 또는 트로판 알칼로이드 생성물의 유도체를 생성하는 조작된 비-식물 세포로서, 상기 조작된 비-식물 세포는 트로판 알칼로이드 생성물 또는 트로판 알칼로이드 생성물의 유도체를 생성하기 위한 경로 내에서 복수의 효소를 인코딩하는 복수의 이종성 코딩 서열을 포함하는, 세포.
  21. 제20항에 있어서, 미생물 세포인, 세포.
  22. 제21항에 있어서, 진균 세포인, 세포.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포는 하나 이상의 효소에 대한 하나 이상의 이종성 코딩 서열을 포함하고, 상기 효소 중 적어도 하나는 아르기닌 탈탄산효소, 아그마틴 우레오하이드롤라제, 아그마티나제, 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제, N-메틸푸트레신 산화효소, 파이롤리딘 케타이드 합성효소, 트로피논 합성효소, 사이토크롬 P450 환원효소, 트로피논 환원효소, 페닐알라닌 암모니아-분해효소, 티로신 암모니아-분해효소, 페닐피루베이트 환원효소, 4-쿠마레이트-CoA 리가제, 3-페닐락트산 UDP-글루코실트랜스퍼라제 84A27, 리토린 합성효소, 리토린 뮤타제, 하이오스시아민 탈수소효소, 하이오스시아민 6β-하이드록실라제/디옥시게나제, 및 코카인 합성효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 세포는 조작된 세포의 세포 아래 구획에서 아실트랜스퍼라제 도메인의 기능적 발현을 가능하게 하는 목적으로 세린 카복시펩티다아제-유사 아실트랜스퍼라제 도메인의 N-말단에 융합된 하나 이상의 가용성 단백질 도메인을 포함하는 하나 이상의 효소를 인코딩하는 하나 이상의 이종성 코딩 서열을 포함하는, 세포.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 하이오스시아민, 아트로핀, 아니소다민, 스코폴라민, 칼리스테긴, 코카인, 또는 비-천연 트로판 알칼로이드로 이루어진 군으로부터 선택된 트로판 알칼로이드 생성물을 생성하는, 세포.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, p-하이드록시아트로핀, p-하이드록시하이오스시아민, p-플루오로하이오스시아민, p-클로로하이오스시아민, p-브로모하이오스시아민, p-플루오로스코폴라민, p-클로로스코폴라민, p-브로모스코폴라민, N-메틸하이오스시아민, N-부틸하이오스시아민, N-메틸스코폴라민, N-부틸스코폴라민, N-아세틸하이오스시아민, 및 N-아세틸스코폴라민으로 이루어진 군으로부터 선택된 트로판 알칼로이드 생성물의 유도체를 생성하는, 세포.
  27. 제25항에 있어서, 하이오스시아민, 아트로핀, 또는 스코폴라민으로 이루어진 군으로부터 선택된 트로판 알칼로이드 생성물을 생성하는, 세포.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 막을 가로지르는 또는 원형질 막을 가로지르는 하나 이상의 TA, 하나 이상의 TA 전구체, 및/또는 하나 이상의 TA 유도체의 수송은 세포에서 변형되는, 세포.
  29. 제28항에 있어서, 변형된 수송은 하나 이상의 수송체를 인코딩하는 하나 이상의 이종성 코딩 서열에 의해 가능하고, 상기 수송체 중 적어도 하나는 다중약물 및 독소 압출 수송체, 니트레이트/펩타이드 계열 수송체, ATP 결합 카셋트 수송체, 및 다면발현성 약물 내성 수송체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  30. 트로판 알칼로이드 생성물, 트로판 알칼로이드 생성물의 전구체, 또는 트로판 알칼로이드 생성물의 유도체를 생성하는 방법으로서, 하기의 단계들을 포함하는, 방법:
    (a) 단백질 생산에 적합한 조건 하에 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 세포를 배양하는 단계;
    (b) 출발 화합물을 상기 세포 배양물에 첨가하는 단계; 및
    (c) 상기 트로판 알칼로이드 생성물, 트로판 알칼로이드 생성물의 전구체, 또는 트로판 알칼로이드 생성물의 유도체를 배양물로부터 회수하는 단계.
  31. 제30항에 있어서, 상기 세포가 유가식 또는 배치식 발효로 배양되는, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 세포 배양물에 첨가되는 출발 화합물이 당 또는 하나 이상의 당을 함유하거나 미생물 발효 동안 하나 이상의 당으로 전환되는 기질인, 방법.
  33. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 세포 배양물에 첨가되는 출발 화합물이 아미노산 또는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 혼합물, 또는 미생물 발효 동안 하나 이상의 아미노산으로 전환되는 기질인, 방법.
  34. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 세포 배양물에 첨가된 출발 화합물이 트로판 알칼로이드 생성물의 전구체인, 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 트로판 알칼로이드 생성물, 트로판 알칼로이드 생성물의 전구체, 또는 트로판 알칼로이드 생성물의 유도체가 액체-액체 추출, 크로마토그래피 분리, 증류 또는 재결정화를 포함하는 공정을 통해 회수되는, 방법.
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