JP2022510988A - 抗ｃ－Ｍｅｔアゴニスト抗体及びその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】
ｃ－Ｍｅｔ抗体を検出し、抗体を利用して幹細胞の分化を誘導し癌の治療や予防をするのに有用に使用することができる方法を提供する。
【解決手段】
本発明は、抗ｃ－Ｍｅｔアゴニスト抗体及びその使用に関するものであり、より詳細にはヒト由来ｃ－Ｍｅｔタンパク質に特異的に結合するアゴニスト抗体またはその断片、これの生産方法、これを利用したｃ－Ｍｅｔ特異的検出方法、これを含む癌の予防または治療用組成物、幹細胞の分化誘導用組成物及び幹細胞用の培養培地に関するものである。本発明の方法はｃ－Ｍｅｔ抗体を検出し、抗体を利用して幹細胞の分化を誘導し癌の治療や予防をするのに有用に使用することができる。
【選択図】図９ａ

Description

本出願は、２０１８年１２月７日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０１８－０１５７３５５号を優先権主張し、前記明細書の全体は、本出願の参考文献である。

本発明は、抗ｃ－Ｍｅｔアゴニスト抗体及びその使用に関するものであり、より詳細には、ヒト由来ｃ－Ｍｅｔタンパク質に特異的に結合するアゴニスト抗体またはその断片、その生産方法、これを用いるｃ－Ｍｅｔ特異的検出方法、これを含む癌の予防や治療用組成物、幹細胞の分化誘導用組成物及び幹細胞用の培養培地に関するものである。

ｃ－Ｍｅｔは細胞表面に存在する代表的なＲＴＫ（受容体チロシンキナーゼ）として、そのリガンドであるＨＧＦ／ＳＦ（肝細胞成長因子／散乱因子）と結合して細胞内シグナル伝達を促進させ細胞の成長を促進するだけではなく、多種の癌細胞に過剰発現され、癌の発生、癌転移、癌細胞の移動、癌細胞の浸透、新生血管形成にも幅広く関与する。また、リガンドという名前が意味するように、ＨＧＦ／ＳＦを通じたｃ－Ｍｅｔシグナル伝達はおよそ全ての種類の上皮性腫瘍（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｍｏｒ）の細胞間接触（ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｃｏｎｔａｃｔ）を弱めて散乱を起こす代表的な癌転移初期段階のタンパク質である（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１２ Ｊａｎ ２４；１２ （２）：８９－１０３）。特に、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）には低酸素誘導因子（ｈｙｐｏｘｉａｒｅｓｐｏｎｓｅ）が存在し、酸素欠乏の状況でその遺伝子の発現が増加することはよく知らされている（Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ． ２００６ Ｊｕｌ； ４２（６）：５９３－８）。また、ｃ－Ｍｅｔは、開始から進行を経る転移までの癌の発生に於ける様々な段階に寄与するため、ｃ－Ｍｅｔ及びそのリガンドであるＨＧＦは癌標的治療のための先導的候補になってきた（［ Ｃｏｍｏｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ７：５０４］； ［Ｋｎｕｄｓｅｎ ａｎｄ Ｖａｎｄｅ Ｗｏｕｄｅ ２００８ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ １８：８７］）。特にｃ－Ｍｅｔは、従来に知らされた抗癌剤の作用機序が薬剤耐性に関与することが知られてから、パーソナライズ用治療に於ける重要性が更に認識されており、ｃ－Ｍｅｔは抗癌剤に関して多数の製薬会社から注目を浴びている標的分子になっている。

最近、ｃ－Ｍｅｔに対する抗体は拮抗薬（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）として抗癌剤の開発に多く行われてきたが、ｃ－Ｍｅｔに対してより高い親和性を有し特異的に結合することができ、ヒト由来の配列で構成され体内投与時に免疫反応の誘発可能性が低く、より様々な活性を示すｃ－Ｍｅｔ抗体に関する開発が要求される。

［発明の詳細な説明］
［技術的課題］
ここで、本発明者らがｃ－Ｍｅｔを標的としながらも様々な生理活性を示す抗体を開発するために例の努力をした結果、ｃ－Ｍｅｔを標的とするようにｃ－Ｍｅｔに特異的に結合するヒト由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）とフレームワーク領域（ＦＲ）からなるヒト抗体がＨＧＦと同様の活性を示し、細胞表面分子であるｃ－Ｍｅｔと結合してシグナル伝達を誘導するアゴニスト抗体の機能が果せることを確認して本発明を完成した。
従って、本発明の目的は、ヒト由来ｃ－Ｍｅｔタンパク質に特異的に結合するアゴニスト抗体またはその断片を提供するものである。

本発明の他の目的は、前記抗体またはその断片を符号化するポリヌクレオチド、ベクター、及びベクターに形質転換される細胞を提供するものである。
本発明のさらに他の目的は、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合するアゴニスト抗体またはその断片の生産方法、及びｃ－Ｍｅｔ特異的検出方法を提供するものである。

本発明のさらに他の目的は、前記抗体またはその断片を有効成分として含む癌の予防または治療用の薬学的組成物を提供するものである。
また、本発明のさらに他の目的は、前記抗体またはその断片からなる予防または治療用の薬学的組成物を提供するものである。

また、本発明のさらに他の目的は、前記抗体またはその断片で必須に行われる癌の予防または治療用の薬学的組成物を提供するものである。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体を含む幹細胞の分化誘導用組成物及びこれを含む幹細胞用培養培地を提供するものである。

また、本発明のさらに他の目的は、前記抗体からなる幹細胞の分化誘導用組成物及びこれを含む幹細胞用培養培地を提供するものである。
また、本発明のさらに他の目的は、前記抗体に必須に行われる幹細胞の分化誘導用組成物及びこれを含む幹細胞用の培養培地を提供するものである。

本発明のさらに他の目的は、癌の予防または治療用製剤を製造するための、前記抗体またはその断片の使用を提供するものである。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその断片を有効成分として含む組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与する段階を含む癌の治療方法を提供するものである。

本発明のさらに他の目的は、幹細胞の分化誘導用製剤を製造するための、前記抗体の使用を提供するものである。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体を含む組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与する段階を含む幹細胞の分化誘導方法を提供するものである。

前記のような目的を果すために、本発明は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ１、配列番号２で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ２及び配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ２及び配列番号６で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ３を含む抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、を含むヒト由来ｃ－Ｍｅｔタンパク質に特異的に結合するアゴニスト抗体またはその断片を提供する。

本発明の他の目的を果すために、本発明は前記抗体またはその断片を符号化するポリヌクレオチドを提供することである。
本発明の他の目的を果すために、本発明は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明の他の目的を果すために、本発明は、前記ベクターで形質転換される細胞を提供する。

本発明の他の目的を果すために、本発明は、前記細胞をポリヌクレオチドが発現される条件で培養し、軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階、及び前記細胞またはそれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含む、ヒトｃ－Ｍｅ
ｔに結合するアゴニスト抗体またはその断片の生産方法を提供する。
本発明の他の目的を果すために、本発明は、前記抗体またはその断片を試料に接触する段階及び前記アゴニスト抗体またはその断片を検出する段階を含むｃ－Ｍｅｔ特異的検出方法を提供する。

本発明の他の目的を果すために、本発明は、前記抗体またはその断片を有効成分として含む癌の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記抗体またはその断片からなる癌の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記抗体またはその断片に必須に行われる癌の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。

本発明の他の目的を果すために、本発明は、前記抗体を含む幹細胞の分化誘導用組成物を提供する。
また、本発明は、前記抗体からなる幹細胞の分化誘導用組成物を提供する。
また、本発明は、前記抗体に必須に行われる幹細胞の分化誘導用組成物を提供する。

本発明の他の目的を果すために、本発明は、前記組成物を含む幹細胞用の培養培地を提供する。
また、本発明は、前記組成物からなる幹細胞用の培養培地を提供する。
また、本発明は、前記組成物で必須に行われる幹細胞用培養培地を提供する。

本発明の他の目的を果すために、本発明は、癌の予防または治療用製剤を製造するための前記抗体またはその断片の使用を提供する。
本発明の他の目的を果すために、本発明は、前記抗体またはその断片を有効成分として含む組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与する段階を含む癌の治療方法を提供する。

本発明の他の目的を果すために、本発明は、幹細胞の分化誘導用製剤を製造するための前記抗体の使用を提供する。
本発明の他の目的を果すために、本発明は、前記抗体を含む組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与する段階を含む幹細胞の分化誘導方法を提供する。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ１、配列番号２で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ２及び配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ２及び配列番号６で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ３を含む抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、を含むヒト由来ｃ－Ｍｅｔタンパク質に特異的に結合するアゴニスト抗体またはその断片を提供する。

本発明の「ｃ－Ｍｅｔタンパク質」は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の受容体であり、ＨＧＦはｃ－Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼの細胞外部位に結合し、様々な正常細胞と腫瘍細胞で分裂、運動、形態発生、血管形成を誘発するサイトカインの一種である。ｃ－Ｍｅｔは、細胞の表面に存在する代表的な受容体チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）で、その自体が癌誘発遺伝子であり、時にはリガンドであるＨＧＦに関わらず、癌の発生、癌転移、癌細胞の移動、癌細胞侵襲、血管新生などの腫瘍に関連する様々な機序に関与するタンパク質である。前記タンパク質は配列番号７（ＮＣ
ＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００１１２７５００．２）で表示されるヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によって符号化されたポリペプチドまたはその細胞外ドメインを含み、配列番号８（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１１２０９７２．１）で表示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドでもある。

本発明の「抗体」、「抗ｃ－Ｍｅｔ抗体」、「ヒト化抗ｃ－Ｍｅｔ抗体」及び「変形ヒト化抗ｃ－Ｍｅｔ抗体」、「ａｎｔｉ－ｃ－Ｍｅｔ 抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）
」は、本発明で最も広義の意味で使用され、具体的には、単クローン性抗体（モノクローナル抗体、全長モノクローナル抗体を含む）、多クローン性抗体（ポリクローナル抗体）は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体の断片（例えば、可変領域及び目的とする生物活性（例えば、ｃ－Ｍｅｔとの結合）を示す抗体の他の部分）を含む。本発明の抗体は、ｃ－Ｍｅｔと選択的に結合できるよう、特定のアミノ酸配列が軽鎖及び重鎖ＣＤＲに含まれている抗体としてモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を全部含み、好ましくはモノクローナル抗体でもある。また、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体を全部含み、好ましくはヒト抗体でもある。

本発明のモノクローナル抗体は実質的に同質の抗体の集団から得られた抗体を示す。つまり、集団を構成する個々の抗体は少量で存在できる、できるだけ天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一性抗原のエピトープに極めて特異的に結合する。
本発明で「モノクローナル」という言葉は、抗体が実質的な相同性集団から得られること及び抗体の特性を示す言葉であり、必ずしも抗体を特定の方法で生産しなければならないというわけではない。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、文献（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５））に始めて記載されたハイブリドーマ法によって製造することができることや、または組換えＤＮＡ方法（参照：米国特許第４，８１６，５６７号）によって製造することができる。また、例えば、当業界に公知された技術を用いてファージ抗体ライブラリから分離することができる。

本発明の抗体は、具体的にキメラ抗体を含み、この場合に重鎖及び／または軽鎖の一部は特定の種が起源であるか、または特定の抗体の相応する配列と同一であることや相同性を示すが、残りの部分は本発明の抗体が望ましい生物学的活性（例えば、ＮＲＳとの選択的結合）を示す限り、他の種が起源であることまたは他の抗体に相応する配列と同一であることや相同性を示すものでもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。
ヒト化抗体は、ヒト及び非－ヒト（例えば、マウス、ラット）抗体の配列を全部含む抗体であり、一般的にエピトープと結合する部位（ＣＤＲ）を除く残りの部分はヒト抗体のものであり、エピトープと結合する部位（ＣＤＲ）は非－ヒト由来の配列を含むことができる。完全なヒト抗体はヒト免疫グロブリンタンパク質配列だけを含む抗体を意味し、マウス、マウス細胞、またはマウス細胞由来のハイブリドーマから生産すること、またはファージディスプレイ方法で生産することができる。

生体から生産される天然抗体は通常的に２つの同一の軽鎖（Ｌ）と２つの同一の重鎖（Ｈ）で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体性糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド連鎖数は相異な免疫グロブリンのイソ型の重鎖の間に様々な形で存在する。各重鎖及び軽鎖は、規則的に離隔された鎖内のジスルフィドブリッジも有する。各重鎖は、一つの末端に可変ドメイン（ＶＨ）に連なって多くの不変ドメインを有する。各軽鎖は、一つの末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他の末端に不変ドメインを有するが、軽鎖の不変ドメインは重鎖の第１不変ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特別なアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖の可変ドメイン間に界面を形成する
こととして考えられる。抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ－末端ドメインを指す。重鎖の可変領域は、「ＶＨ」と記載し、軽鎖の可変領域は、「ＶＬ」と記載する。これらのドメインは一般的に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。

本発明で「超可変性（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ）」は、前記可変領域内のいくつの配列が抗体間の配列に於いて広範囲に異なり、その特異的な抗原決定因子に対するそれぞれの特定の抗体の結合及び特異性に直接関わる残基を含むという事実を指す。軽鎖及び重鎖可変領域の両方に於いて、超可変性は相補性決定部位（ＣＤＲ）または超可変ループ（ＨＶＬ）として公知された３つの分節に焦点を合わせる。ＣＤＲは文献（Ｋａｂａｔ等、１９９１年、Ｉｎ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）での配列比較によって限定されるのに対し、ＨＶＬは文献（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅや１９８７、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７ ）に開示されたように前記可変領域の３次元構造に基づいて構造的に限定される。

前記重鎖及び軽鎖それぞれの内の３つのＣＤＲは、フレーム部分（ＦＲ）により分離され、前記部位は、以下の可変傾向がある配列を含む。前記重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ末端からカルボキシ末端までに、前記ＦＲ及びＣＤＲは、下記の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。前記ＦＲの大きいβシート配置は、前記各鎖の内部のＣＤＲを、お互い以外にも他の鎖のＣＤＲに近付かせる。生成される形態は、抗原結合部位に寄与するが、すべてのＣＤＲ残基が抗原結合に直接関与する必要はない。

本発明の前記断片はジアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ 、及びｓｃＦｖからなる群から選択される断片であることを特徴とする。
本発明の抗体の断片は、抗体全体の抗原特異的結合力を維持している抗体の断片を意味し、好ましく前記断片は、母性抗体のヒト由来ｃ－Ｍｅｔタンパク質親和性の少なくとも２０％、５０％、７０ ％、８０％、９０％、９５％または１００％またはそれ以上を保持する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ 、ジアボディ、ｓｃＦｖなどの形態でもある。

Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）は、抗体の抗原結合断片であり、重鎖と軽鎖それぞれの一つの可変ドメインと不変ドメインで構成されている。Ｆ（ａｂ’）２は、抗体をペプシンで加水分解させて生成される断片であり、二つのＦａｂが重鎖ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）で二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）にて接続される形をしている。Ｆ（ａｂ’）は、Ｆ（ａｂ’）２断片の二硫化結合を還元し分離させたＦａｂに重鎖ヒンジが付加された形の単量体の抗体断片である。Ｆｖ （ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、重鎖と軽鎖のそれぞれの可変領域だけで構成される抗体断片である。ｓｃＦｖ （ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）が柔軟なペプチドリンカーで接続されている組換え抗体の断片である。ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）は、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬが極めて短いリンカーで接続されて互いに結合できず、同じ形を有する他のｓｃＦｖのＶＬとＶＨにそれぞれ結合して二量体を形成している形態の断片を意味する。

本発明の目的抗体の断片は、ヒト由来ｃ－Ｍｅｔタンパク質に対する結合特異性を維持しているものであれば、構造や形態の制限を受けないが、好ましくｓｃＦｖでもある。本発明に係るｓｃＦｖは、前記ヒト由来ｃ－Ｍｅｔタンパク質に特異的なＣＤＲの構成、またはＶＨとＶＬの構成を有するものであり、ＶＨのＣ－末端とＶＬのＮ－末端がリンカーを
介して接続されたものであれば、その配列は特に限定されない。前記リンカーは、当業界でｓｃＦｖに適用されるリンカーとして公知されたものであれば、その種類は特に制限されない。
本発明の抗体またはその断片は、その生物学的活性を実質的に変更しない保存的なアミノ酸置換（抗体の保存的変異体ともいう）を含むことができる。

また、前述した本発明の抗体またはその断片は、酵素、蛍光物質、放射性物質及びタンパク質などに接合されたこともあるが、これに限定されない。また、抗体の前記物質を接合する方法は、当業界に公知されている。
本発明の抗体は、ヒトを含む哺乳動物、鳥類などを含む任意の動物に由来したものでもある。好ましくは、前記抗体は、ヒト、マウス、ロバ、羊、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、馬や鶏の抗体でもあり、最も好ましくは、ヒトまたはマウスでもある。

ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体であり、ヒト免疫グロブリンライブラリから分離された抗体または複数のヒト免疫グロブリンに対して形質移植され、内在性免疫グロブリンは発現しない動物から分離された抗体も含む（米国特許第５，９３９，５９８号を参照）。
本発明の抗体は、酵素、蛍光物質、放射性物質及びタンパク質などに接合されたこともあるが、これに限定されない。また、抗体に前記物質を接合する方法は当業界に公知されている。

本発明は、前記抗体またはその断片を符号化するポリヌクレオチドを提供する。
本発明で「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドまたは核酸と記載されることもあり、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたは誘電体（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を用いて生成した前記ＤＮＡまたはＲＮＡの類似体（例えば、ペプチド核酸及び非－自然に発生するヌクレオチド類似体）及びこれらのハイブリッドが含まれる。前記ポリヌクレオチドは、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）または二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）でもある。前記ポリヌクレオチドは、前記ＫＲＳ Ｎ－末端領域に特異的なＣＤＲの構成、またはＶＨとＶＬの構成を有する重鎖と軽鎖からなる抗体を符号化する塩基配列を意味する。

本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体またはその断片を符号化するものであれば、その配列が特に制限されないものであり、前に説明した本発明に係る抗体で前述したＣＤＲ配列を符号化するポリヌクレオチドは、その配列が特に制限されないが、好ましく配列番号１（重鎖ＣＤＲ１）、配列番号２（重鎖ＣＤＲ２）、配列番号３（重鎖ＣＤＲ３）、配列番号４（軽鎖ＣＤＲ１）、配列番号５（軽鎖ＣＤＲ２）、配列番号６（軽鎖ＣＤＲ３）に表示される塩基配列を含むこともある。また、本発明に係る抗体に於いて、前述したＶＨとＶＬを符号化するポリヌクレオチドは、その配列が特に限定されない。
本発明の抗体またはその断片を符号化するポリヌクレオチドは、当業界で公知された方法によって収得することができる。例えば、前記抗体の重鎖及び軽鎖の一部または全部をコードするＤＮＡ配列または当該アミノ酸配列に基づいて、当分野でよく知らされるオリゴヌクレオチド合成技法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法などを使用し合成することができる。

本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明の「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、本発明の抗体またはその断片の組換え生産のために本発明のポリヌクレオチドの複製または発現の目的として利用され、一般的にシグナル配列、複製の起源、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうち一つ以上を含む。本発明のベクターは、好ましくは発現ベクターでもあり、より好ましくは調節配列、例えば、プロモーターに作動可能になるよう接続さ
れた本発明のポリヌクレオチドを含むベクターでもある。

ベクターの一種であるプラスミドは、外部のポリヌクレオチド断片が結合することができる線形または円形の二重螺旋のＤＮＡ分子を意味する。ベクターの他の形態は、ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ；例えば、複製・欠失型レトロウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ））であり、ここで付加のＤＮＡ断片らは、前記ウイルスゲノム（ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ）内に導入することができる。特定のベクターらは、その中にこれらが導入する宿主細胞（例えば、細菌由来（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｏｒｉｇｉｎ）及びエピソームの哺乳類ベクター（ｅｐｉｓｏｍａｌ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｖｅｃｔｏｒｓ）を含む細菌性ベクターに（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ））内での自己複製（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）をすることができる。他のベクターに（例えば、非－エピソームの哺乳動物ベクター（ｎｏｎ－ｅｐｉｓｏｍａｌ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｖｅｃｔｏｒｓ））が宿主細胞内への導入により、宿主細胞のゲノム内に統合され、更にそれによって前記宿主ゲノムと一緒に複製される。

本発明で「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」は、選択されるポリヌクレオチドが発現することができるベクターの一つの形態である。一つのポリヌクレオチド配列は、調節配列が前記ポリヌクレオチド配列の発現（例えば、レベル、タイミングまたは発現の位置）に影響を与える場合には、前記調整配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に「作動可能になるように連結」される。前記調節配列は、それが作動可能になるように連結する核酸の発現（例えば、レベル、タイミングまたは発現の位置）に影響を与える配列である。前記調節配列は、例えば、調節された核酸に直接または複数の他の分子（例えば、前記調整配列及び／または前記核酸に結合するポリペプチド）の作用を通して、その影響を及ぼすようにすることができる。前記調節配列はプロモーター、エンハンサー、及び他の発現調節要素が含まれる。本発明のベクターは、好ましくはｐＯｐｔｉＶＥＣ（登録商標）－ＴＯＰＯ及びｐｃＤＮＡ（登録商標）３．３－ＴＯＰＯでもある。
本発明は、前記ベクターで形質転換される細胞を提供する。

本発明の細胞は、本発明の発現ベクターに含まれる抗体またはその断片を符号化するポリヌクレオチドの発現に使用できる細胞であれば、その種類は特に限定されない。本発明に係る発現ベクターで形質転換される細胞（宿主細胞）は、原核生物（例えば、大腸菌）、真核生物（例えば、酵母または他の菌類）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、昆虫細胞、またはこれらに由来するハイブリドーマでもある。好ましくは、ヒトを含む哺乳類に由来する細胞でもある。
本目的に適した原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性の有機体、例えば、腸内細菌科、例えば、エシェリキア、例えば、大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えば、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチア、 例えば、セラチア・マルセッセンス、及び赤痢菌、及びバシラス、例えば、枯草菌及びバチルス・リケニフォルミス、シュードモナス、例えば、シュードモナス・エルギノーサ、及びストレプトマイセスを含む。本発明の細胞は、本発明のベクターを発現することができるものであれば、特に限定されないが、好ましくは、大腸菌でもある。

本発明の細胞として、真核生物は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が最も一般的に用いられる。一方、多くの他の属、種及び菌株、これに限定されないが、例えば、分裂酵母ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス宿主、例えば、Ｋ．ラクチス、Ｋ．フラギリス（ＡＴＣＣ １２
，４２４）、Ｋ．ルガリクス（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ウィケラミー（ＡＴＣＣ
２４，１７８）、Ｋ．ワルチー（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアヌス；ヤロウィア（ＥＰ ４０２，２２６）；ピチアパストリス（ＥＰ １８３，０７０）；カンジダ；
トリコデルマレーシア（ＥＰ ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ；シュワニオミセス、例えば、シュワニオミセス・オクシデンタリス；及びフィラメント性真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム、及びアスペルギルス宿主、例えば、Ａ．ニデュランス、及びＡ．ニガーが使用可能である。

前記用語「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は、外来性ポリヌクレオチドの導入による宿主細胞の遺伝子型の変形を意味し、その形質転換に用いられる方法に関わらず、外来性ポリヌクレオチドが宿主細胞内に導入されることを意味する。宿主細胞内に導入される外来性ポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム内に統合され維持すること、または統合されずに維持することができるが、本発明は両方とも含む。
本発明に係るヒト由来ｃ－Ｍｅｔタンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片を発現することができる組換え発現ベクターは、当業界に公知された方法、例えば、これに限定されないが、一時的形質感染（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注射、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、細胞融合、カルシウムホスフェート沈殿法、リポソーム媒介トランスフェクション（ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション（ＤＥＡＥ
ｄｅｘｔｒａｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリブレン媒介トランスフェクション（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）、及び細胞内に核酸を流入するための公知の方法により、抗体またはその断片を生産するために、細胞の内部に導入して形質転換することができる。

また、本発明の細胞は、本発明のポリヌクレオチドまたはこれを含むベクターで形質転換されるか、または形質感染されることができる培養細胞であり、これは継続的に前記宿主細胞内で発現することができる。組換え細胞は発現するべきなポリヌクレオチドに形質転換されることまたは形質感染細胞を意味する。本発明の細胞はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むが、調節配列が前記ポリヌクレオチドに作動可能な形で連結できるように前記細胞内に導入されない限り、これを所望のレベルまで発現しない細胞になることもある。
本発明の細胞は、様々な培地で培養することができる。商業的に利用可能な培地、例えば、ハム（Ｈａｍ’ｓ）Ｆ１Ｏ（シグマ－アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ） Ｃｏ．、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ＭＯ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）、ＲＰＭＩ－１６４０（シグマ－アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ） Ｃｏ．）、及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ－アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ） Ｃｏ．）は、細胞を培養するのに適している。前記培地は、必要に応じてホルモン及び／または他の成長因子、塩、緩衝液、ヌクレオチド、抗生剤、微量元素及びグルコース、または同等のエネルギー源が追加できる。

本発明は、前記細胞をポリヌクレオチドが発現される条件で培養して、軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階、及び前記細胞またはそれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含む、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合するアゴニスト抗体またはその断片の生産方法を提供する。
本発明で生産方法における細胞については前述した通りであり、本発明の抗体を符号化するポリヌクレオチドを含む。前記生産方法のポリペプチドは本発明の抗体またはその断片自体でもあり、本発明の抗体またはその断片以外の他のアミノ酸配列が追加的に結合され
たことでもある。

この場合、当業界の通常の技術者によく知られている方法を利用して、本発明の抗体またはその断片から取り除くことができる。前記培養は前記細胞の種類に応じて培地組成及び培養条件が変わることもあり、これは当業界の通常の技術者が適切に選択及び調節をすることができる。
前記抗体分子は、細胞の細胞質内に蓄積されることや、細胞から分泌されることや、適切な信号配列によってペリプラズムまたは細胞外培地（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）で標的化（ｔａｒｇｅｔｅｄ）されることができ、ペリプラズムまたは細胞外培地に標的化することが好ましい。また、生産される抗体分子を当業界の通常の技術者によく知られている方法を利用してリフォールディングさせ、機能的形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を有するようにすることが好ましい。前記ポリペプチドの回収は生産されたポリペプチドの特性及び細胞の特性に応じて変わることができ、これは当業界の通常の知識を有する者が適宜選択及び調整をすることができる。

前記ポリペプチドは、細胞内、周辺細胞質の空間に生産されるか、培地内に直接分泌されることができる。ポリペプチドが細胞内で生産される場合、この細胞は第１段階としてタンパク質放出のために破壊されることができる。粒子型破片、宿主細胞または溶解された断片は、例えば、遠心分離または限外濾過により除去される。抗体が培地内に分泌される場合、こんな発現システムからの上澄み液を通常的に最初に商業的利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）またはミリポア ペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過ユニットを使用して濃縮させる。タンパク質分解を抑制するためにプロテアーゼ阻害剤、例えば、ＰＭＳＦが任意の先行段階に含まれることもあるし、偶発的な汚染物質の成長を防止するために抗生剤が含まれることもある。細胞から製造された抗体は、例えば、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及び親和度クロマトグラフィーを使用して精製することができ、本発明の抗体は、好ましくは、親和性クロマトグラフィーを介して精製することができる。

本発明は、前記抗体またはその断片を試料と接触させる段階及び前記アゴニスト抗体またはその断片を検出する段階を含むｃ－Ｍｅｔ特異的検出方法を提供する。
本発明の前記検出方法は、本発明に係る抗体またはその断片を試料と接触させる前に、本発明に係る抗体またはその断片を用いてＫＲＳ（または細胞外膜に露出されたＫＲＳ Ｎ－末端ペプチド）の有無と濃度を測定するための試料を準備する段階（（１）段階）を含むことができる。

通常の技術者は、抗体を利用して、タンパク質を検出する公知の方法を適宜選択して、選択した方法に合わせて試料を準備することができる。また、試料は癌や癌転移のほどを診断する被検体から採取された生検などで得られた細胞や組織、血液、全血、血清、血漿、唾液、脳脊髄液等でもある。前記抗体を用いてタンパク質を検出する方法とは、これに制限されるものではないが、例えば、ウエスタンブロット、免疫ブロット、ドットブロット、免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫検定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ） 、競争的結合分析、免疫沈殿などがある。例えば、ウエスタンブロットを実施するためには、試料または細胞の溶解物に電気泳動に適したバッファーを添加し沸かすことなどの方法で準備することができ、免疫組織化学染色のためには、細胞や組織の切片を固定してブロックキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するなどの前処理を行うことができる。

次に、本発明に係る抗体またはその断片を前述した段階で準備した試料と接触させる段階（（２）段階）を遂行する。
本発明に係る抗体は、先に述べたＣＤＲ、またはＶＨとＶＬの構成を有し、ヒト由来ｃ－
Ｍｅｔタンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片であって、その具体的な種類と配列の構成については前述した通りである。

前記抗体またはその断片は、この「検出」のために一般的に検出可能な部分（ｍｏｉｅｔｙ）で標識ができる。例えば、当業界に公知された技術を用いて放射性同位元素や蛍光標識で標識することができる。また、様々な酵素－基質標識が利用可能であり、前記酵素的標識の例として、ショウジョウバエ・ルシフェラーゼと細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）のようなルシフェラーゼ、ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）のようなペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ ）、ヘテロサイクリックオキシダーゼ（例えば、ユリカーゼとキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどを含む。抗体に酵素を接合させる技術は当業界に公知されている。標識は様々な公知された技術を利用して、抗体に直接または間接な接合をすることができる。例えば、抗体は、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）に接合することができ、前記の３種類の広範なカテゴリに属する任意の標識がアビジン（ａｖｉｄｉｎ ）と、またはそれと逆に接合することができる。ビオチンはアビジンに選択的に結合するので、この標識はこのような間接的方法で抗体に接合することができる。または、抗体の標識の間接的接合を果すために、抗体は小さいハプテン（ｈａｐｔｅｎ ）（例えば、ジゴキシン［ｄｉｇｏｘｉｎ］）と接合することができ、前記の相異する類型の標識らの一つが抗－ハプテン抗体に接合することができる（例えば、抗－ジゴキシン抗体）。従って、抗体に対する標識の間接的接合が達成できる。

本発明で「接触（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」とは、その一般的な意味で使用されるものであり、２つ以上の物質を混合、結合、又は連接をすることを意味する。前記接触は試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または他のコンテナで遂行することができ、また、その場（ｉｎ
ｓｉｔｕ）、生体内、個体内、組織内、細胞内で行うことができる。
次には、前記（２）段階を遂行した後の試料で本発明に係る抗体またはその断片を検出する段階（（３）段階）を遂行する。

前記「検出」は、試料内で形成された本発明に係る抗体またはその断片と抗原の複合体を対象とするものであり、ヒトｃ－Ｍｅｔのペプチド（またはこれを含むタンパク質）が存在するかしないかを感知又は前記ペプチドのレベルを測定（定性的または定量的測定を全部含む）することを意味する。従って、前記（２）段階を行った後、後述する検出段階（（３）段階）の前に、ヒト由来ｃ－Ｍｅｔタンパク質と複合体を形成しない余りの抗体やその断片を除去する段階が追加的に含まれることができる。
前述した（２）段階で使用された抗体またはその断片が、蛍光、放射性同位元素、酵素などで直接標識されるなどの検出可能な部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む場合には、当該部分を検出する当業界に公知された方法にて検出を行うことができる。一例として、放射能は、例えば、シンチレーション計数（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）で測定することができ、蛍光は蛍光計を用いて定量することができる。

また、前述した（２）段階で使用された抗体またはその断片が前に独自に述べた検出部分を含まない場合は、当業界に知らされたように、蛍光、放射能、酵素などで標識された２次抗体を用いて間接的に感知することができる。前記２次抗体は、本発明による抗体またはその断片（１次抗体）に結合する。

最近の研究を通してＨＧＦ／ＳＦも神経系にも作用して特に運動神経細胞の保護機能に関する沢山の研究が報告されている（Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０：３２６－３３７、２０００）。また、心臓の損傷回復（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １０６：１５１１－１５１９、２０００）などの一般的な臓器損傷後の防御・生理学的機序にも重要な機能を担当していることが示唆され、実際にＨＧＦ／ＭＥＴ経路が脳梗塞、進行腎炎、肝硬変と肺線維症の過程に関わり、ＨＧＦがこれらの変性疾患の病変に過剰発現され、組織損傷の生理学的防御機構により保護活性を示すことが証明された（Ｃｏｍｏｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ． 、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ７：５０４－５１６、２００８）。また、ＨＧＦ／ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達の過剰活性が内皮系の様々な細胞の悪性腫瘍化と血管形成に関わり、このような観点でｃ－Ｍｅｔを標的とする拮抗性ｃ－Ｍｅｔ抗体が抗癌剤としての用いられるという可能性が提示された（Ｃｏｍｏｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ． 、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． ７：５０４－５１６、２００８）。例えば、一つの枝を有するｃ－Ｍｅｔ抗体がＨＧＦのｃ－Ｍｅｔ二量体化による活性化を陰性に調節し、移植マウスモデルで効率的に腫瘍の成長を抑制することが報告されている（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６８（１１）：４３６０－４３６８、２００８； Ｃｏｍｏｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ． 、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． ７：５０４－５１６、２００８）。また、Ｔ細胞治療法で癌細胞の表面抗原を選択的に認識するＴ細胞の遺伝子操作にも癌細胞に過剰発現される抗原に対する抗体がＴ細胞の連結のための腫瘍標的化に活用されている（Ｓａｄｅｌａｉｎ 、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ １５（６ ）：４５１ －４５５、２００９）。

本発明は、前記抗体またはその断片を有効成分として含む癌の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。
本発明に係る前記抗体及びその断片は、前記ｃ－Ｍｅｔタンパク質に特異的結合能力に優れており、ｃ－Ｍｅｔ抗体またはその断片はＨＧＦの活性化を陰性に調節して腫瘍の成長を抑制する効果があり、癌治療剤として使用することができる。また、前記抗体又はその断片に癌治療薬を組み合わせて、癌の予防や治療に使用することができ、前記抗体または断片を薬学的に許容される担体と一緒に適した形で製造して癌の予防または治療に使用することができる。

本発明の前記「癌（ｃａｎｃｅｒ）」は、これに限定されないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管癌、結腸・直腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、上咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、甲状腺癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、潤滑膜肉腫、カポジ（Ｋａｐｏｓｉ）肉腫、平滑筋肉腫、悪性線維性組織球種、線維肉腫、急性骨髄性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、膠芽腫、星細胞腫、メラノーマ、中皮腫、ウィルムス腫瘍、及び明細胞肉腫（ＣＣＳ）、胞巣状軟部肉腫（ＡＳＰＳ）及び電位関連腎細胞癌を含むことができる。

本発明に係る薬学的組成物は、ｃ－Ｍｅｔタンパク質に特異的に結合するアゴニスト抗体またはその断片を単独で含有することや、薬学的に許容される担体と一緒に適した形に剤形化することができ、賦形剤または希釈剤を追加で含有することができる。前記で「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与されるとき、通常胃腸障害、めまいなどのアレルギー反応またはこれと類似な反応を起こさない非毒性の組成物をいう。

薬学的に許容される担体としては、例えば、経口投与用担体または非経口投与用の担体をさらに含むことができる。経口投与用担体は、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸などを含むことができる。併せて、ペプチド製剤の経口投与用に使用される様々な薬物伝達物質を含むことができる。また、非経口投与用担体は、水、適切な油、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含むことができ、安定化剤及び保存剤をさらに含むことができる。適切な安定化剤としては、亜硫酸水素ナ
トリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸と同じ抗酸化剤がある。適切な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチル－やプロファイル－パラベン及びクロロブタノールがある。本発明の薬学的組成物は前記成分に加えて潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤などをさらに含むことができる。その他の薬学的に許容される担体及び製剤は当業界に公知されていることを参考にすることができる。

本発明の組成物は、ヒトをはじめとする哺乳動物にどのような方法でも投与することができる。例えば、経口または非経口的に投与することができる。非経口的な投与方法としては、これに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、長官、局所、舌下または直腸内投与でもある。
本発明の薬学的組成物は上述したような投与経路に応じて経口投与用または非経口投与用の製剤として剤形化することができる。

経口投与用製剤の場合、本発明の組成物は、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液などであり、当業界に公知された方法を用いて剤形化することができる。例えば、経口用製剤は活性成分を固体賦形剤と配合して、これを粉砕し適切な補助剤を添加した後、顆粒の混合物で処理することにより、錠剤または糖衣錠剤を収得することができる。適切な賦形剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、及びマルチトールなどを含む糖類、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉及びじゃがいも澱粉などを含む澱粉類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチル－セルロースなどを含むセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなどの充填剤を含むことができる。また、場合によっては、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはナトリウムアルギネートなどを崩解剤として添加することができる。さらに、本発明の薬学的組成物は、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、及び防腐剤などをさらに含むことができる。

非経口投与用製剤の場合には、注射剤、クリーム剤、ローション剤、外用軟膏剤、オイル剤、保湿剤、ゲル剤、エアロゾル及び鼻腔吸入剤の形で、当業界に公知された方法で剤形化することができる。これらの剤形はあらゆる製薬化学に一般的に公知された処方書に記載されている。

本発明の組成物の総有効量は、単回投与用量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与することができ、複回投与用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与する分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって投与することができる。本発明の薬学的組成物は疾患の程度に応じて有効成分の含有量を変えることができる。好ましく、本発明の薬学的組成物の好ましい全体容量は１日当たり患者の体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇないし１０，０００ｍｇ、最も好ましくは０．１μｇないし５００ｍｇことでもある。しかし、前記薬学的組成物の容量は製剤化の方法、投与経路及び治療回数のみならず、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌や排泄率などのさまざまな要因を考慮してから患者の有効投与量が決定されることであるので、この点を考慮する時に、当分野の通常の知識を有する者であれば、本発明の組成物の適切な有効投与量を決定することができる。本発明に係る薬学的組成物は本発明の効果を示す限りその剤形、投与経路及び投与方法に特に限定されない。

本発明は、前記抗体を含む幹細胞の分化誘導用組成物を提供する。
本発明の前記「幹細胞」は、様々な細胞に分化することができる幹性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有する未分化細胞を総称し、幹細胞は特定の分化因子及び／または環境によって特定の細胞への分化を進む。幹細胞の種類には、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ
ｃｅｌｌ）、胚生殖細胞、成体幹細胞、癌幹細胞などがある。幹細胞を利用して、損傷
した組織の再生、糖尿病、白血病、パーキンソン病、心臓病、脊髄外傷などをはじめとする様々な疾患を治療することができ、本発明で最も好ましくは脂肪由来間葉系幹細胞でもある。

本発明は、前記幹細胞の分化誘導用組成物を含む幹細胞用培養培地を提供する。
本発明の「幹細胞用培養培地」は、前記ｃ－Ｍｅｔ抗体を含む幹細胞の分化誘導用組成物を含む培地で、幹細胞を培養または分化させる成分が含む培地である。前記培地は、幹細胞を脂肪、軟骨、骨、神経などすべての細胞に分化させることができる培地を含み、好ましくは幹細胞を脂肪細胞、軟骨細胞または軟骨細胞に分化させる培地でもある。

本発明の一実施例ではヒト組換えｃ－Ｍｅｔ抗体を使用してヒトｓｃＦｖライブラリスクリーニングを行い、出力が増加するサンプルを獲得した後、ＥＬＩＳＡ方法で結合力を確認し、結合信号を表すサンプルを選別して塩基配列分析を行った。次に、このうちで異なる配列を有するヒット（ｈｉｔ）を選択し、ＥＬＩＳＡ方法で結合力を確認して、最も強力に結合する１０個のヒットを選別しヒトＩｇＧ形態に転換した（実施例１、図１ａ、図１ｂ及び図２を参照）。
本発明のさらに他の一実施例ではヒトＩｇＧが天然ｃ－Ｍｅｔに結合することを確認するために２９３Ｆ細胞にプラスミドで形質感染させた後、細胞を収得し、タンパク質Ａビーズで抗体を精製してＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果、前記１０個のヒット（ｈｉｔ）がヒトＩｇＧ形態に変換されて細胞で発現することを確認し、軽鎖及び重鎖のサイズを確認することができた。次に、ｃ－Ｍｅｔ陽性細胞を用いて流動細胞分析を行った結果、抗体の結合パターン（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ）が細胞で表れる最も大きい変化とｃ－Ｍｅｔの発現レベルが一致する４つの抗体を選別した（実施例２、図３、図４ａ及び図４ｂを参照）。

本発明のさらに他の一実施例で抗原であるヒトｃ－Ｍｅｔ組換えタンパク質をバイオ表面（ｂｉｏｓｕｒｆａｃｅ）に固定させた後、抗体（Ａ８、Ａ１１及びＣ８）を流して抗原と反応させた後に結合係数を測定し、オクテット(Ｏｃｔｅｔ)プラットフォームに分析を行った結果、全ての従来のｃ－Ｍｅｔ抗体に比較して３つの抗体全部が高い親和性と解離値を有することが確認できた（実施例３及び図５を参照）。
本発明のさらに他の一実施例でｃ－Ｍｅｔ陽性の細胞株を培養してタンパク質を収得した後にウェスタンブロット法でｃ－Ｍｅｔの信号パターンを確認した結果、Ｈ５９６細胞株でしかｃ－Ｍｅｔ触媒のリン酸化が起こらないことを確認し、Ｈ５９６細胞にＨＧＦを異なる濃度で処理した後にウエスタンブロットを行った結果、Ｔｙｒ１２３４とＴｙｒ１３４９の発現量が濃度依存的に増加することを確認した。その後、Ｈ５９６細胞にＨＧＦ、ｃ－Ｍｅｔ抗体であるＡ８、Ａ１１、Ｂ１０、Ｃ８を濃度別に処理してウエスタンブロットを行った結果、ＨＧＦ、Ａ８、Ａ１１はｐ－Ｅｒｋ及びｐ－Ａｋｔのような主要な下流シグナルを含むリン酸化シグナルを誘導することを確認した（実施例４及び図６ａ～図６ｃを参照）

本発明のさらに他の一実施例でＨ５９６細胞にＨＧＦ、Ａ８またはＡ１１の濃度を違えてＷＳＴ アッセイ（ａｓｓａｙ）法で細胞増殖を分析した結果、抗体を処理した場合がＨＧＦを処理した場合と細胞増殖の速度が同じに表示されなかったが、飽和点がより高いことを確認した（実施例５及び図７を参照）。
本発明のさらに他の一実施例でＨＧＦがない培地、ＨＧＦ、Ａ８またはＡ１１のそれぞれ異なる濃度を含有している培地を使用して間葉系幹細胞を培養し、培養しながら培養時間、生存力及び細胞形態を観察した結果、すべてのグループから細胞の平均生存率が９０％以上であることを示し、これにｃ－Ｍｅｔ抗体は幹細胞の培養形態に影響を及ぼさないことを確認した（実施例６－１、図８ａ及び図８ｂを参照）。

本発明のさらに他の一実施例ではＨＧＦ、Ａ８またはＡ１１を処理して脂肪由来間葉系幹細胞を培養した後、脂肪、軟骨、及び骨分化を誘導した。分化させる細胞系統に応じてそれぞれ異なる培地条件で幹細胞の分化を誘導し、各細胞を染色して観察した結果、幹細胞はすべての培地条件で脂肪細胞に分化し、ＨＧＦがない培地では、軟骨と骨の分化を示さず、Ａ８またはＡ１１はＨＧＦと同様の結果を示すことを確認した。これに幹細胞でＡ８またはＡ１１が ＨＧＦと同じ役割をすることが確認できた（実施例６－２及び図９ａないし図９ｄを参照）。
また、本発明は、癌の予防または治療用製剤を製造用の前記抗体またはその断片の使用を提供する。

また、本発明は、前記抗体またはその断片を有効成分として含む組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与する段階を含む癌の治療方法を提供する。
本発明は、幹細胞の分化誘導用製剤製造用の前記抗体の使用を提供する。
本発明は、前記抗体を含む組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与する段階を含む幹細胞の分化誘導方法を提供する。

本発明の前記「有効量」とは、個体に投与したとき、癌の改善、治療、予防、検出、診断、または癌の抑制または減少効果を示す量を意味し、幹細胞の分化を誘導する効果を示す量を意味する。前記「個体」とは、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物でもあり、動物に由来する細胞、組織、器官等でもある。前記個体は前記効果が必要な患者でもある。
本発明の前記「治療」は、癌または癌の症状を改善することを包括的に示し、これは癌の治癒や、実質的な予防、又は状態の改善を含むことができ、癌から始まる一つの症状やほとんどの症状を緩和や、治療、又は予防をすることを含むが、これに限定されるものではない。

本発明の用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「含有する」または「特徴とする」と同じように使用され、組成物または方法において、記載されていない追加的成分、要素または方法段階などを排除しない。用語「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは、別途に記載されていない追加的要素、段階または成分などを除外することを意味する。用語「必須的にからなる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは、組成物または方法の範囲において、記載された成分要素または段階に加えてこの基本的な特性に実質的に影響を及ぼさない成分要素または段階を含むことを意味する。

従って、本発明は抗ｃ－Ｍｅｔアゴニスト抗体及びその使用を提供する。本発明の方法はｃ－Ｍｅｔ抗体の検出、抗体を利用する幹細胞分化の誘導、癌の治療または予防に有用に利用することができる。

及び はヒトｃ－Ｍｅｔ組換えタンパク質を抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）として用いるファージディスプレイ（図１ａ）及びＥＬＩＳＡによるスクリーニングした結果（図１ｂ）を示したものである。 はＥＬＩＳＡの結果に基づいて選択したヒット（ｈｉｔ）の結合のほどを確認した結果を示したものである。 は精製した抗体の重鎖及び軽鎖のサイズを確認するためにＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果を示したものである。 及び はＡ５４９細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を用いてフローサイトメトリー分析で１０種類のｃ－Ｍｅｔ抗体の結合力を確認した結果（図４ａ）、及びＡ５４９、Ｈ５９６及びＳＫＢＲ－３細胞を利用してフローサイトメトリー分析でｃ－Ｍｅｔ抗体（Ａ８、Ａ１１、Ｂ１０、Ｃ８）の結合力を確認した結果（図４ｂ）を示したものである。 はオクテット（Ｏｃｔｅｔ）分析を用いたｃ－Ｍｅｔ抗体（Ａ８、Ａ１１、Ｂ１０、Ｃ８）の結合親和性を確認した結果を示したものである。 、 及び はウエスタンブロット法を用いてｃ－Ｍｅｔ陽性細胞株でｃ－Ｍｅｔ信号パターンを確認した結果（図６ａ）、Ｈ５９６細胞でそれぞれ異なる濃度のＨＧＦを処理しｃ－Ｍｅｔ信号パターンを確認した結果（図６ｂ）、及びＨ５９６細胞にＨＧＦとｃ－Ｍｅｔ抗体（Ａ８、Ａ１１、Ｂ１０、Ｃ８）を処理しｃ－Ｍｅｔ信号パターンを確認した結果（図６ｃ）を示したものである。 はＷＳＴ分析方法を用いてｃ－Ｍｅｔ抗体とＨＧＦが細胞増殖に及ぼす影響を確認した結果を示したものである。 及び はＨＧＦまたはｃ－Ｍｅｔ抗体（Ａ８）が間葉系幹細胞の集団倍加時間（図８ａ）及び生存力（図８ｂ）に及ぼす影響を確認した結果を示したものである。 、 、 及び は間葉系幹細胞の培養条件による培養形態（図９ａ）と脂肪分化（図９ｂ）、軟骨分化（図９ｃ）及び骨分化（図９ｄ）にＨＧＦまたはｃ－Ｍｅｔ抗体（Ａ８ ）が及ぼす影響を確認した結果を示したものである。

以下、本発明を詳細に説明する。
但し、下記の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。

実験方法
［試薬］
Ａ５４９細胞株とＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞株はＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＵＳＡ）から購入しており、Ｈ５９６細胞、ＳＫＢＲ－３細胞は韓国細胞株銀行（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ、ＫＣＬＢ）から購入した。 脂肪由来間葉系幹細胞は エックスセルセラピューティック（Ｘｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ソウル）から提供された。また、間葉系幹細胞培養用の培養培地は、エックスセルセラピューティック（Ｘｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）から購入した。選別に使用された抗原は受容体の１－９３２アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、ａａ）を含むヒトｃ－Ｍｅｔ組換えタンパク質であり、シノバイオロジカル（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）から購入した。また、対照群としてはアブカム（Ａｂｃａｍ、米国）から購入した抗ｃ－Ｍｅｔ抗体を使用した。

［ファージディスプレイ］
ヒト組換えｃ－Ｍｅｔタンパク質を抗原として使用し、ヒトｓｃＦｖライブラリはｃ－Ｍｅｔの細胞外領域に結合するヒット（ｈｉｔｓ）スクリーニングに使用した。抗原を濃度１０μｇ／μＬの免疫チューブ（ヌンク（Ｎｕｎｃ、ＵＳＡ））にコーティングし、Ｏ／Ｎで培養し結合させた。免疫チューブとファージをブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ内３％牛乳）で活性を抑制した。ファージを抗原がコーティングされた免疫チューブに入れ結合させ、１時間後ＰＢＳＴで４回、ＰＢＳで１回洗浄した。ファージを７～８分間１００ｍＭ ＴＥＡに溶出させた後Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）溶液で中和させた。溶出されたファージを大腸菌に感染させ、一部は固形ＬＡプレートでＯ／Ｎで培養して出力力価（ｏｕｔｐｕｔ ｔｉｔｅｒ）を確認した。残りファージは、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ）を使用して救済し、同様の実験を３回繰り返した。

［ＥＬＩＳＡスクリーニング］
４回目のぺニング後、単一コロニーをそれぞれ９６ウェルプレートのアンピシリンを含むＳＢ１５０μＬに注入した。その次、培地が白く濁れるまで３７℃振とう培養器で培養した。培養後に培養液を円板（皿）に入れて１ｎＭ ＩＰＴＧで誘導した後、３０℃で夜通し培養をした。ｃ－Ｍｅｔ組換えタンパク質を抗原として使用し、ＥＬＩＳＡプレート（コーニング（ｃｏｒｎｉｎｇ）３６９０）に１μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶かしてコーティングし、４℃で夜通し培養をした。その次の日、クローンが注入されたプレートを１５分間３０００ ｒｐｍで遠心分離した。上澄み液を除去してペレットを３７℃で１Ｘ ＴＥＳバッファーで５～７分間再懸濁した後、０．２Ｘ ＴＥＳバッファーを添加して４℃で３０分間反応させて細胞を溶解した。抗原コーティングされたプレートを１５０μＬのＴＢＳＴで３回洗浄し、３％スキムミルクを用いて反応を抑制した。ペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ）抽出物を溶解された細胞から収得しており、新しいプレートで６％スキムミルクを利用して反応を１時間抑制した。その次、溶液を抗原コーティングされたプレートに添加し、室温で１時間インキュベート培養した後、ＴＢＳＴを用いて３回洗浄した。その後、ａｎｔｉ－ＨＡ Ｈｒｐ ２次抗体を添加して１時間培養した後、ＴＢＳＴで３回洗浄した。その後、３０μＬのＴＭＢを処理して反応を開始した後、１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を使用して反応を抑制し、４５０ｎｍで検出した。

［塩基配列解析及びＩｇＧ転換］
前記ＥＬＩＳＡスクリーニングで選別されたヒット（ｈｉｔｓ）の配列を分析した（コスモジーンテック（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ）、韓国）。配列分析及びＥＬＩＳＡスクリーニング後に選別された最終的なヒット（ｈｉｔｓ）をヒトＩｇＧに変換させた。ｓｃＦｖ配列をヒト軽鎖及び重鎖の配列に転換し、クローニングによるｐＯｐｔｉＶＥＣ（登録商標）－ＴＯＰＯ及びｐｃＤＮＡ（登録商標）３．３－ＴＯＰＯ（サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＵＳＡ）ベクターに融和させた。その後、ミディプレップ（ｍｉｄｉ ｐｒｅｐ）（マシェリナゲル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）、ドイツ）を用いてプラスミドを増幅させた。

［過剰発現と抗体精製］
増幅されたプラスミドをフリースタイル発現システム（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＵＳＡ）を利用して一時的に発現した。三角フラスコ（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＵＳＡ）でフリースタイル発現培地（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）でフリースタイル細胞（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ｃｅｌｌ）を解凍させ培養した。細胞が３．０ ｘ １０^６ 細胞／ｍＬの濃度になるまで培養し、２～３日ごとに継代培養し、４回の継代培養後、フリースタイルＭＡＸトランスフェクション （ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ（登録商標） Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＵＳＡ）を使用して重鎖と軽鎖プラスミドを形質感染させた。その後、８％ＣＯ_２ 、３７℃の条件下で振とう機で細胞を培養した。形質感染後７日目に細胞を収得し、上澄み液を取得して濾過した。濾過後、クロマトグラフィーカラム（バイオ－ラッド（Ｂｉｏ－ｒａｄ） 、ＵＳＡ）で上澄み液をマブセレクトスレタンパク質Ａビーズ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｂｅａｄｓ）（ＧＥヘルスケア（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）．ＵＳＡ）に適用した。その次、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとクマシブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）染色でサイズを確認した。

［フローサイトメトリー分析］
Ａ５４９、ＭＤＡ－ＭＰ２３１、Ｈ５９６、及びＳＫＢＲ－３細胞を利用してフローサイトメトリー分析 （ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。細胞に於いて、細胞解離用試薬（ｃｅｌｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＵＳＡ）で細胞を取り出して、ＰＢＳを洗浄した後に２
．０×１０^５個の細胞で分離しチューブに入れた。抗体を１μｇ／チューブの濃度になるように２％ ＦＢＳが含有されたＤＢＰＳ（ウェルジーン（Ｗｅｌｌｇｅｎｅ））溶液で希釈し細胞に添加して１時間反応をした。対照群としては商業用抗ｃ－Ｍｅｔ抗体を使用した。その次、細胞を２回洗浄し、ＦＩＴＣが結合された２次抗体で４０分間反応させた。３回洗浄した後、ＦＡＣＳ ＢＤ カリバー（Ｃａｌｉｂｕｒ）（ＢＤ、ＵＳＡ）を使用して分析した。

［オクテット分析（Ｏｃｔｅｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）］
オクテットサービスはポール（ＰＡＬＬ） ｃｏｒｐ 、フォルテビオ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）で提供された。Ｈｉｓがタグされたヒト組換えｃ－Ｍｅｔタンパク質（シノバイオロジカル（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、中国）を抗原として使用した。ターゲットはバイオ表面で２０ｕｇ／ｍＬの濃度である１２個のＮｉ－ＮＴＡセンサーに取得された。ＰＢＳをリガンドバッファーとして使用し、１× フォルテビオキネティック（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｋｉｎｅｔｉｃ）バッファーを分析水バッファーとして使用した。リガンドの固定後、ｃ－Ｍｅｔ、Ａ８、Ａ１１とＣ８の抗体を結合させ、Ｋｏｎ 及びＫｏｆｆ値を分析して結合能を評価した。

［細胞培養及び抗体治療］
Ｈ５９６細胞を、１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））を含むＲＰＭＩ（ウェルジーン（Ｗｅｌｌｇｅｎｅ））を用いて培養した。抗体がリン酸化シグナルを誘導することができるかを観察するために６ウェルプレートに細胞を培養した。その次、ＦＢＳによる信号の干渉を除去するために、ＦＢＳが含まれていないＲＰＭＩ培地で夜通し培養をした。次の日、培地を除去し、抗体またはＨＧＦを異なる濃度で含有される溶液を１時間処理した。

［ウェスタンブロット］
上述したように細胞を培養した後、ＲＩＰＡ（バイオセザン（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ））、タンパク質分解酵素阻害剤（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））及びリン酸化酵素阻害剤（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を含有している溶解バッファーを用いて細胞を収得しており、１ｍＬ注射器を利用して細胞を溶解させた。溶解後、細胞を１５分間１４０００ｒｐｍで遠心分離した。その後、上澄み液を収得しＢＣＡ分析（サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ））法でタンパク質を定量した。上澄み液を５ｘサンプルローディングバッファーと混合した後、１０分間熱を加えた。その次、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後に活性化したＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ））メンブレイン（バイオ－ラッド（Ｂｉｏ－ｒａｄ））にタンパク質をトランスファーした。５％ ＢＳＡで膜の活性を抑制し１次抗体で反応させた後、Ｈｒｐが結合された２次抗体で反応させた。その後、暗室でＥＣＬ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して確認した。

［細胞増殖分析］
Ｈ５９６細胞を９６ウェルプレートに１．０×１０^４ 細胞／ウェルの濃度で夜通し培養をした。次の日、培地を除去し、３９ｐＭ～１０ｎＭの濃度でＨＧＦまたはａｎｔｉ－ｃ－Ｍｅｔ抗体を含む溶液を処理した。その次、細胞を７２時間培養し、培地をＷＳＴ溶液（ドゥージェン（ＤｏＧｅｎ） ）に交換して２～３時間培養した。その次、マルチリーダ（テカン（Ｔｅｃａｎ））を使用して４５０ｎｍで測定した。

実施例１：ｃ－Ｍｅｔに結合するｓｃＦｖのスクリーニング及び同定
ｃ－Ｍｅｔに結合する抗体を確認するために抗原として細胞外ドメイン（ａａ、１－９３２）のみを含有するヒト組換えｃ－Ｍｅｔ抗体を使用して、前記記載の方法に基づいてヒ
トｓｃＦｖライブラリスクリーニングを行った。抗原を免疫チューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）に結合させた上、４サイクルを繰り返した。
その結果、図１ａで示したように、３回目と４回目のサイクルで出力（ｏｕｔｐｕｔ）が増加することが示され、３回目と４回目のサイクルで得たサンプルはＥＬＩＳＡ法を通して結合力を確認し、その結果を図１ｂに示した。また、対照群プレートと比較して信号を表すことを選択した後に塩基配列を分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）し、このうちに相異な配列を有する３１個の候補（ｈｉｔ）を選択し、再度ＥＬＩＳＡを行って結合力を確認して最も強力に結合する１０個の候補（ｈｉｔ）を選択した。各候補はＥＬＩＳＡの結果に基づいてＡ８、Ａ９、Ａ１１、Ｂ８、Ｂ１０、Ｃ８、Ｃ９、Ｄ７、Ｄ１２、Ｅ１０と命名した。その次、１０個のヒット（ｈｉｔ）をヒトＩｇＧ形態に転換した（図２）。

実施例２：ヒトＩｇＧ形態の天然ｃ－Ｍｅｔ結合のほどの確認
前記実施例１で製造したヒトＩｇＧが天然ｃ－Ｍｅｔに結合することを確認するために次のように実験を行った。
まず、前記実験方法に従って２９３Ｆ細胞をプラスミドで形質感染させ７日間培養した。その後、細胞を収得してタンパク質Ａビーズを用いて抗体を精製しＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。
その結果、図３で示したように、前記実施例１で最も強力に結合する１０個のヒット（ｈｉｔ）がヒトＩｇＧ形態に変換され細胞で発現することを確認しており、軽鎖及び重鎖のサイズが確認できた。
ＩｇＧが転換されたことを確認した後、ＣＣＬＥの情報に基づいてｃ－Ｍｅｔに対して陽性である細胞を選択して前記実験方法に従って流動細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を行った。
その結果、図４ａに示したように、抗体の結合パターンはＡ５４９細胞で示される最も大きい変化とｃ－Ｍｅｔの発現レベルが一致することが示され、この中で最も似通う４つの抗体を選別し他の細胞株を用いて同じ実験を行った。この時、Ｈ５９６細胞株は中間発現細胞株であり、ＳＫＢＲ－３細胞株は陰性対照群として使用された。
その結果、図４ｂに示したように、４つの抗体（Ａ８、Ａ１１、Ｂ１０、Ｃ８）の結合パターンはｃ－Ｍｅｔ発現レベルと関係があることが示され、ｃ－Ｍｅｔの陰性細胞株であるＳＫＢＲ－３細胞株では結合移動がよくみえないことが示された。このうちＡ１１に於いて、Ａ５４９とＨ５９６細胞株は対照群であるａｎｔｉ－ｃ－Ｍｅｔ抗体の発現パターンと類似することを確認しており、ＳＫＢＲ－３細胞株は対照群であるａｎｔｉ－ｃ－Ｍｅｔ抗体の発現率と一致することが確認できた。
これにより、選別された４つのリード（ｌｅａｄｓ）はｃ－Ｍｅｔ受容体に対して特異性があることが確認できた。

実施例３：リード抗体（ｌｅａｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の結合親和性の分析
前記実施例２での抗体が天然ｃ－Ｍｅｔとの結合を確認した結果に基づいて最も高い移動を示すリード（Ａ８、Ａ１１及びＣ８）を使用して、次のように実験を行った。
前記実験方法により、抗原であるヒトｃ－Ｍｅｔ組換えタンパク質をバイオ表面（ｂｉｏｓｕｒｆａｃｅ ）に固定させた後に抗体を流して抗原と反応させた。その次、結合係数Ｋｏｎ及び解離定数Ｋｏｆｆを使用して親和性の定量値であるＫＤを計算した。分析は、オクテット（Ｏｃｔｅｔ）プラットフォームで行った。Ｋｏｎ値が高いほど抗体とリガンドがより速く結合し、Ｋｏｆｆ値が低いほどより遅く解離される。ＫＤ値はＫｏｎとＫｏｆｆの割合で計算した。
その結果、図５に示したように、３つの抗体の両方の既存のｃ－Ｍｅｔ抗体に比べて３つの抗体全部が高い親和性と解離値を有することが示された。このうちＡ１１は、０．０２４４ｎＭのＫＤ値を有し、ａｎｔｉ－ｃ－Ｍｅｔ抗体に比べてＫｏｎ定数が１０倍、Ｋｏｆｆ値が１０程度の差を示すことが示された。
これを通して、従来のｃ－Ｍｅｔ抗体に比べてＡ１１抗体は受容体からより速く結合し、
遅く解離することが確認できた。

実施例４：ｃ－Ｍｅｔ抗体の効能第効果
前記実施例では選別したｃ－Ｍｅｔ抗体がシグナル伝達に及ぼす影響を確認するために、ｃ－Ｍｅｔ陽性で、ＨＧＦシグナル活性に依存的な細胞株を用いて、次のような実験を行った。
まず、ｃ－Ｍｅｔ陽性である複数細胞株（Ｈｓ７４６Ｔ、Ｈ５９６、ＡｓＰＣ１、ＭＫＮ４５、ＳＮＵ６２０、ＳＮＵ５）をそれぞれ培養してからタンパク質を収得した。その後、前記実験方法に記載された通りでウエスタンブロットを行いｃ－Ｍｅｔ信号パターンを確認した。
その結果、図６ａに示したように、Ｈ５９６細胞株でのみｃ－Ｍｅｔ触媒のリン酸化が起こらないことが示された。
ここで、Ｈ５９６細胞にＨＧＦを５０、１００、２００、５００ ｎｇ／ｍＬを添加して同じ方法でウエスタンブロットを行った。その結果、図６ｂに示したように、ＨＧＦを添加するとＴｙｒ１２３４とＴｙｒ１３４９の発現量が濃度依存的に増加することが示された。
また、６ウェルプレートにＨ５９６細胞をＲＰＭＩ培地（無血清）で夜通し培養した後、
ＨＧＦ、ｃ－Ｍｅｔ抗体であるＡ８、Ａ１１、Ｂ１０、Ｃ８をナノモル濃度で１時間処理した。その後に細胞を収得して前記と同じくウエスタンブロットを行った。
その結果、図６ｃに示したように、ＨＧＦ、Ａ８、Ａ１１はｐ－ Ｅｒｋ及びｐ－ Ａｋｔのような主要な下流シグナルを含むリン酸化シグナルを誘導することが示されたが、Ｂ１０及びＣ８は誘導しないことが示された。また、Ａ１１を処理した場合にＴｙｒ１２３４、Ｔｙｒ１３４９の発現量が濃度依存的に増加することが示され、ｐ－ Ｅｒｋ及びｐ－ Ａｋｔの発現を誘導することが示された。

実施例５：ｃ－Ｍｅｔ抗体が細胞増殖に及ぼす効果
前記実施例４で確認したｃ－Ｍｅｔ抗体の信号誘導が細胞に直接に及ぼす影響を確認するために次のような実験を行った。
まず、９６ウェルプレートにＨ５９６細胞を培養し、実施例４で信号活性を誘導したＨＧＦ、Ａ８またはＡ１１を０．０３９～１０ ｎＭの濃度で処理した。その次、細胞を７２時間追加で培養し、ＷＳＴ アッセイ（ａｓｓａｙ）法で細胞増殖を分析した。数値は対照群（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）の細胞増加率に比例して計算した。
その結果、図７に示したように、ＨＧＦ、Ａ８またはＡ１１を処理した場合に細胞が増殖することを確認しており、Ａ１１抗体を処理した場合に高濃度でＨＧＦと増殖力が同様であることが示された。これは前記実施例のオクテット実験結果と一致する傾向であることが確認できた。

実施例６：間葉系幹細胞のｃ－Ｍｅｔ抗体の効果
ｃ－Ｍｅｔ抗体であるＡ８とＡ１１が間葉系幹細胞でＨＧＦと同じ効果を示すことを確認するために次のような実験を行った。
６ウェルプレートに成長因子を含み、化学的に安定した培地を入れて間葉系幹細胞を接種した。このとき、ＨＧＦがない培地、ＨＧＦ、Ａ８またはＡ１１のそれぞれ異なる濃度を含有している培地を使用した。

６－１：ｃ－Ｍｅｔ抗体の細胞毒性効果
前記実験方法により、脂肪由来間葉系幹細胞にＨＧＦ、Ａ８またはＡ１１を異なる濃度で処理してＨＧＦが除去された培地で培養した。培養しながら培地時間、生存力、及び細胞形態を評価し、Ｃｅｄｅｓ細胞計数装置（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、ＵＳＡ）を使用して、トリパンブルー染色（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）後に計数法を使って集団倍加時間及び生存力を評価しており、細胞形態は光学顕微鏡を用いて映像を撮って観
察した。
その結果図８ａ及び図８ｂに示したように、集団倍加時間はＨＧＦを処理しない場合とＨＧＦ及びｃ－Ｍｅｔ抗体Ａ１１を処理した場合において有意な差を示さなかった。また、すべてのグループに於いて、細胞の平均生存率が９０％以上であることが示された。
これにより、ｃ－Ｍｅｔ抗体であるＡ８は幹細胞の培養形態に影響を及ぼさないことであり、ＨＧＦと同様な効果を有することが確認できた。

６－２：ｃ－Ｍｅｔ抗体が幹細胞の分化に及ぼす効果
前記実験方法により、脂肪由来間葉系幹細胞をパサージュ ９までさまざまな調整用培地で培養した。パサージュ ９で細胞を６ウェルプレートに接種して分化する細胞系統に合わせて成長させた。細胞を脂肪、軟骨及び骨分化に誘導した。
まず、次のような方法で脂肪細胞に分化させた。パサージュ １０の細胞が約９０～１００％まで大きくなったら培養培地を細胞分化用培地に交換した。シュテムプロ（ＳｔｅｍＰｒｏ）脂肪生成分化 キット（サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＵＳＡ）を分化培地として使用し、２～３日ごとに培地を交換しながら２～３週間を維持した。脂肪に分化された後に細胞を観察するためにオイルレッド（Ｏｉｌ ｒｅｄ） Ｏで染色し観察した。
また、次のような方法で幹細胞を軟骨細胞に分化させた。パサージュ １０の細胞が約５０％まで大きくなったら培養培地を細胞分化用培地に交換した。ＦＢＳ（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＵＳＡ）、１％ ＩＴＳ－Ｘ、５０ｕｇ／ｍＬアスコルビン酸、１００ｎＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）と１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ－β１を含むＤＭＥＭ低グルコース培地（ウェルジーン（Ｗｅｌｌｇｅｎｅ）、韓国）を分化培地で使用し、２～３日ごとに培地を交換して２～３週間維持した。３週後、細胞を固定して アルシアンブルーで染色し観察した。
また、次のような方法で幹細胞を骨細胞に分化した。パサージュ １０まで細胞を培養した後、培養培地を細胞分化用培地に交換した。ＦＢＳ、１００ｎＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、１０ｎＭグリセロール－２－リン酸塩（ｇｌｙｃｅｒｏｌ－２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５０ｕｇ／ｍＬのアスコルビン酸及び１％ グルタメックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）を含むＤＭＥＭ低グルコース培地（ウェルジーン（Ｗｅｌｌｇｅｎｅ）、韓国）を分化培地として使用し、２～３日ごとに培地を交換しながら３週間維持した。３週後、細胞を固定し、アリザリンレッド溶液で染色し観察した。
その結果、図９ａ～図９ｄに示したように、幹細胞はすべての培地条件で脂肪細胞に分化することが示されたが、軟骨と骨分化はＨＧＦがない培地で分化しないことが示された。また、Ａ１１を含有する培地で培養された細胞はＨＧＦ対照群と同様の密度で染色されることが示された。
これにより、幹細胞の多分化能を維持するのにＨＧＦが重要な役割をすることが確認でき、Ａ１１は幹細胞でＨＧＦと同じ役割をすることが確認できた。

以上述べたように、本発明は、抗ｃ－Ｍｅｔアゴニスト抗体及びその使用を提供する。本発明の方法は、ｃ－Ｍｅｔ抗体を検出し、抗体を利用して幹細胞の分化を誘導し、癌を治療または予防するのに有効に利用することができる。

Claims (16)

1. 配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ１、配列番号２で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ２及び配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ２及び配列番号６で表示されるアミノ酸配列を含む相補性決定部位（ＣＤＲ）Ｈ３を含む抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むヒト由来ｃ－Ｍｅｔタンパク質に特異的に結合するアゴニスト抗体またはその断片。
2. 前記断片は、ジアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ 、及びｓｃＦｖからなる群から選択される断片であることを特徴とする、請求項１記載のアゴニスト抗体またはその断片。
3. 請求項１の抗体またはその断片を符号化するポリヌクレオチド。
4. 請求項３のポリヌクレオチドを含むベクター。
5. 請求項４のベクターで形質転換される細胞。
6. 請求項５の細胞をポリヌクレオチドが発現される条件で培養し、軽鎖及び重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階、及び前記細胞またはそれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含む、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合するアゴニスト抗体またはその断片の生産方法。
7. 請求項１の抗体またはその断片を試料と接触させる段階及び前記アゴニスト抗体またはその断片を検出する段階を含む、ｃ－Ｍｅｔ特異的検出方法。
8. 請求項１の抗体またはその断片を有効成分として含む、癌の予防または治療用の薬学的組成物。
9. 膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管癌、結腸直腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、上咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、甲状腺癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、潤滑膜肉腫、カポジ（Ｋａｐｏｓｉ）肉腫、平滑筋肉腫、悪性線維性組織球種、線維肉腫、急性骨髄性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、膠芽腫、星細胞腫、メラノーマ、中皮腫、ウィルムス腫瘍、及び明細胞肉腫（ＣＣＳ）、胞巣状軟部肉腫（ＡＳＰＳ）、及び電位関連腎細胞癌を含むＭｉＴ腫瘍からなる群から選択される、請求項８記載の癌の予防または治療用の薬学的組成物。
10. 請求項１の抗体を含む幹細胞の分化誘導用組成物。
11. 前記幹細胞は脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１０記載の誘導用組成物。
12. 請求項１０の組成物を含む幹細胞用培養培地。
13. 癌の予防または治療用製剤を製造するための請求項１の抗体またはその断片の使用。
14. 請求項１の抗体またはその断片を有効成分として含む組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、癌の治療方法。
15. 幹細胞の分化誘導用製剤を製造するための請求項１の抗体の使用。
16. 請求項１の抗体を含む組成物の有効量を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、幹細胞の分化誘導方法。
    

Images