CN117157401A - 针对胰腺癌干细胞的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种针对胰腺癌干细胞的抗体。一种针对胰腺癌干细胞的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下的HCDR1～HCDR3所示的重链CDR，所述轻链可变区包含以下的LCDR1～LCDR3所示的轻链CDR，所述抗体具有与胰腺癌干细胞的结合性：包含序列号1的第26位～第35位的氨基酸序列或其相似序列的HCDR1、包含序列号1的第47位～第65位或其相似序列的HCDR2、包含序列号1的第96位～第104位或其相似序列的HCDR3、包含序列号2的第24位～第34位或其相似序列的LCDR1、包含序列号2的第46位～第56位或其相似序列的LCDR2、包含序列号2的第89位～第96位或其相似序列的LCDR3。

Description

针对胰腺癌干细胞的抗体
技术领域
本发明涉及一种针对胰腺癌干细胞的抗体。
背景技术
癌症是日本人的首位死因，对人类来说是最大的威胁。其中，胰腺癌的预后特别差，胰腺癌被发现的患者的约70～80％已经发展至无法手术的状态。进而，胰脏位于被其他脏器包围的位置，因此胰腺癌容易转移到淋巴结、肝脏，难以治疗。随着外科治疗技术的提高和新药的开发，胰腺癌患者的5年存活率远远低于全部癌症的平均水平，由此也可以看出治疗的难度。
因此，提高对胰腺癌的治疗效果是非常重要的课题。作为现有的癌症治疗，可举出外科去除癌症肿瘤的手术疗法、使用抗癌剂的化学治疗、以及放射线疗法等。然而，关于手术疗法，认为患者术后的QOL降低是缺点。另外，关于化学疗法和放射线疗法，表明对癌干细胞带来抵抗性，并研究了其机理(非专利文献1～5)。此外，以化学疗法为首，休止状态的癌干细胞再活化，诱导癌肿瘤的复发这样的假说正在受到支持(非专利文献6)。
虽然在癌干细胞中未阐明的部分较多，但正在进行各种以癌干细胞为靶标的治疗法的开发。例如，开发了以在癌干细胞标志物或癌干细胞中特别活化的信号通路(Wnt、Notch)为靶标的医药品(非专利文献7)。另外，以外周血单核细胞标志物CD33为靶标的抗体-药物复合体即吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin)以急性髓系白血病为对象，已获得FDA(美国食品医药品管理局)批准，但发现其毒性而停售(非专利文献8)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Borst P.(2012).Cancer drug pan-resistance:pumps,cancerstem cells,quiescence,epithelial to mesenchymal transition,blocke d celldeath pathways,persisters or what？Open Biol.2,120066.
非专利文献2：Holohan C.,Van Schaeybroeck,S.,Longley,D.B.&Johnston,P.G.(2013).Cancer drug resistance:an evolving paradigm.Nat.Rev.Cancer.13,714-726.
非专利文献3：Diehn M,Cho RW,Lobo NA,Kalisky T,Dorie MJ et al.(2009).Association of reactive oxygen species levels and radioresis tance in cancerstem cells.Nature.458,780-783.
非专利文献4：Xiaoxian Li,Michael T.Lewis,Jian Huang,CarolinaGutierrez,C.Kent Osborne et al.(2008).Intrinsic resistance of tumorige nicbreast cancer cells to chemotherapy.J.Natl.Cancer Inst.100,672-679.
非专利文献5：Shideng Bao,Qiulian Wu1,Roger E.McLendon,Yue ling Hao,Qing Shi et al.(2006).Glioma stem cells promote radioresista nce bypreferential activation of the DNA damage response.Nature.444,756-760.
非专利文献6：Eduard Batlle&Hans Clevers(2017).Cancer stem cellsrevisited.Nat.Med.23,1124-1134.
非专利文献7：Naoko Takebe,Lucio Miele,Pamela Jo Harris,Woon dongJeong,Hideaki Bando et al.(2015).Targeting Notch,Hedgehog,an d Wnt pathwaysin cancer stem cells:clinical update.Nat.Rev.Clin.Oncol.12,445-464.
非专利文献8：Laszlo G.S.,Estey E.H.&Walter R.B.(2014).The past andfuture of CD33 as therapeutic target in acute myeloid leukemia.Blood Rev.28,143-153.
发明内容
发明所要解决的技术问题
虽然FDA获得批准，但仍有发现毒性而停售的例子，如此，以癌干细胞为靶标的医药品包藏对正常干细胞也产生影响的风险。因此，现状是大多停留在开发的临床试验阶段。因此，本发明的目的在于提供一种针对胰腺癌干细胞的抗体。
用于解决技术问题的技术方案
本发明人使用由对吉西他滨化学疗法具有耐性的晚期胰腺导管腺癌患者建立的人胰腺癌干细胞株KMC07作为抗原，注射混合有使用小鼠成纤维细胞株PA6作为饲养细胞培养得到的KMC07与佐剂的悬浮液，由此进行细胞免疫，通过筛选使用免疫后回收的淋巴细胞制作和选拔得到的杂交瘤产生的抗体，成功得到对胰腺癌干细胞具有结合性的新抗体。基于该见解进一步反复进行了研究，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下记载的方式的发明。
项1.一种针对胰腺癌干细胞的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下的HCDR1～HCDR3所示的重链CDR，所述轻链可变区包含以下的LCDR1～LCDR3所示的轻链CDR：
HCDR1，其包含：序列号1的第26位～第35位、第31位～第35位、第26位～第33位、或第27位～第35位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
HCDR2，其包含：序列号1的第47位～第65位、第50位～第65位、第51位～第57位、或第47位～第59位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
HCDR3，其包含：序列号1的第96位～第104位、第98位～第104位、或第97位～第104位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR1，其包含：序列号2的第24位～第34位、第27位～第32位、或第27位～第34位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR2，其包含：序列号2的第46位～第56位、第50位～第56位、或第50位～第51位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR3，其包含：序列号2的第89位～第96位、或第89位～第95位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列。
项2.根据项1所述的抗体，其中，所述HCDR1包含序列号1或序列号3的第26位～第35位、第31位～第35位、第26位～第33位、或第27位～第35位的氨基酸序列，
所述HCDR2包含序列号1或序列号3的第47位～第65位、第50位～第65位、第51位～第57位、第47位～第59位、或第47位～第60位的氨基酸序列，
所述HCDR3包含序列号1或序列号3的第96位～第104位、第98位～第104位、或第97位～第104位的氨基酸序列，
所述LCDR1包含序列号2或序列号4的第24位～第34位、第27位～第32位、或第27位～第34位的氨基酸序列，
所述LCDR2包含序列号2或序列号4的第46位～第56位、第50位～第56位、或第50位～第51位的氨基酸序列，
所述LCDR3包含序列号2或序列号4的第89位～第96位、或第89位～第95位的氨基酸序列。
项3.根据项1或2所述的抗体，其包含以下的重链可变区和轻链可变区：
重链可变区，其包含：序列号1的氨基酸序列；序列号1的氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于序列号1的氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码序列号1的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
轻链可变区，其包含：序列号2的氨基酸序列；序列号2的氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于序列号2的氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码序列号2的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列。
项4根据项3所述的抗体，其中，所述重链可变区包含序列号1或序列号3的氨基酸序列，所述轻链可变区包含序列号2或序列号4的氨基酸序列。
项5.一种针对胰腺癌干细胞的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下的HCDR1～HCDR3所示的重链CDR，所述轻链可变区包含以下的LCDR1～LCDR3所示的轻链CDR：
HCDR1，其包含：序列号5的第26位～第35位、第31位～第35位、第26位～第33位、或第27位～第35位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
HCDR2，其包含：序列号5的第47位～第66位、第50位～第66位、第51位～第58位、或第47位～第60位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
HCDR3，其包含：序列号5的第97位～第111位、第99位～第111位、或第98位～第111位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR1，其包含：序列号6的第24位～第34位、第27位～第32位、或第27位～第34位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR2，其包含：序列号6的第46位～第56位、第50位～第56位、或第50位～第51位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR3，其包含：序列号6的第89位～第98位、或第89位～第97位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列。
项6.一种抗EpCAM抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下的HCDR1～HCDR3所示的重链CDR，所述轻链可变区包含以下的LCDR1～LCDR3所示的轻链CDR：
HCDR1，其包含：序列号7的第26位～第35位、第31位～第35位、第26位～第33位、或第27位～第35位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
HCDR2，其包含：序列号7的第47位～第66位、第50位～第66位、第51位～第58位、或第47位～第61位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
HCDR3，其包含：序列号7的第97～112位、第99～112位、或第98～112位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR1，其包含：序列号8的第24位～第34位、第27位～第32位、或第27位～第34位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR2，其包含：序列号8的第46位～第56位、第50位～第56位、或第50位～第51位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR3，其包含：序列号8的第89位～第97位、或第89位～第96位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列。
项7.根据项1～6中任一项所述的抗体，其为单克隆抗体。
项8.根据项1～7中任一项所述的抗体，其为人嵌合化抗体或小鼠嵌合化抗体。
项9.一种DNA，其编码项1～8中任一项所述的抗体。
项10.一种重组载体，其包含项9所述的DNA。
项11.根据项10所述的重组载体，其包含序列号20、24或28所示的碱基序列的轻链信号序列。
项12.一种转化体，其导入有项10或项11所述的重组载体。
项13.一种抗体的制造方法，其包含培养项12所述的转化体而产生项1～8中任一项所述的抗体的工序。
项14.一种医药组合物，其含有项1～8中任一项所述的抗体作为有效成分。
项15.根据项14所述的医药组合物，其用于胰腺癌的治疗。
项16.一种体外诊断试剂，其包含项1～8中任一项所述的抗体。
项17.根据项16所述的体外诊断试剂，其用于源自癌细胞的细胞外囊泡的检测。
项18.根据项16或17所述的体外诊断试剂，其用于胰腺癌的诊断。
项19.一种抗体基板，其包含项16～18中任一项所述的体外诊断试剂和固定有所述体外诊断试剂的基板。
项20.一种体外诊断用组合物，其含有项16～18中任一项所述的体外诊断试剂。
发明效果
根据本发明，能够提供针对胰腺癌干细胞具有结合性的新抗体。
附图说明
图1表示试验例1中进行的抗体制作的流程。
图2表示试验例2中进行的抗体基因克隆的流程。
图3表示试验例2中克隆得到的可变区的琼脂糖电泳结果。
图4表示试验例2中表达得到的抗KMC07抗体的免疫染色结果。
图5表示试验例2中进行的信号序列1E7SP重组轻链表达载体构建的流程。
图6是试验例2中通过信号序列1E7SP重组表达得到的抗KMC07抗体的免疫染色结果。
图7表示试验例2中进行的信号序列1B4SP重组轻链表达载体构建的流程。
图8A是试验例2中通过信号序列1B4SP重组表达得到的抗KMC07抗体(大鼠抗体)的基于斑点印迹(dot blot)的抗体分泌量的比较。
图8B是试验例2中通过信号序列1B4SP重组表达得到的抗KMC07抗体(小鼠嵌合化抗体)的基于斑点印迹的抗体分泌量的比较。
图9是使用试验例2中制作的抗体(a：大鼠抗体，b：大鼠/人嵌合化抗体，c：大鼠/小鼠嵌合化抗体)得到的KMC07的免疫染色结果。
图10是使用试验例3中进行的KMC07得到的免疫沉降物的银染色结果。
图11是试验例3中使用抗KMC07抗体结合柱制作的提取液的银染色结果。
图12是使用试验例3中进行的KMC07得到的活细胞免疫染色的结果。
图13表示试验例3中确认的抗KMC07抗体(1F9D4：抗体III)对于胰腺癌细胞的ADCC活性。
图14A是试验例3中确认的抗KMC07抗体(1B4G：抗体I)对于KMC07的ADCC活性的体外(in vitro)评价结果，表示各反应时间的KM C07的集落数(数据以平均±标准误差表示(n＝3))(*P＜0.05，**P＜0.001，双因素方差分析(two-way ANOVA))。
图14B是试验例3中确认的抗KMC07抗体(1F9D4：抗体III)对于KMC07的ADCC活性的体外评价结果，表示各反应时间的KMC07的集落数(数据以平均±标准误差表示(n＝3))(*P＜0.05，**P＜0.001，双因素方差分析(two-way ANOVA))。
图15是使试验例3中得到的1F9D4(抗体III)反应24小时后的KM C07的免疫染色图像。
图16A是试验例3中确认的抗KMC07小鼠嵌合抗体1E7G5(抗体I)、1F9D4(抗体III)的以临床试验开始日为基准的体重增减率的经时变化，红色箭头表示抗体给药，数据以平均±标准误差表示(n＝3)。
图16B是试验例3中确认的抗KMC07小鼠嵌合抗体1E7G5(抗体I)、1F9D4(抗体III)的以临床试验开始日为基准的肿瘤体积比V/V0的经时变化，红色箭头表示抗体给药，数据以平均±标准误差表示(n＝3)(P＜0.05，**P＜0.001，vs.4G8B4，双因素方差分析(two-wayANOVA))。
图17是试验例4中确认的抗KMC07抗体1B4G4(抗体I)、1E7G5(抗体I)、1E9F7(抗体II)、1F9D4(抗体III)的基于斑点印迹的对于源自KMC07的细胞外囊泡的反应性的评价。
图18是试验例4中使用的夹心ELISA实验系统的示意图(a)、以及抗KMC07抗体1B4G4(抗体I)、1E7G5(抗体I)、1E9F7(抗体II)、1F9D4(抗体III)的基于ELISA的对于源自KMC07的细胞外囊泡的反应性的评价。
图19是试验例4中使用的荧光检测夹心ELISA实验系统的示意图(a)、以及抗KMC07抗体1B4G4(抗体I)、1E7G5(抗体I)、1E9F7(抗体II)、1F9D4(抗体III)的对于细胞培养上清中的源自KMC07的外泌体的反应性的评价。
具体实施方式
1.针对胰腺癌干细胞的抗体
本发明是针对胰腺癌干细胞的抗体。针对胰腺癌干细胞的抗体是指至少具有针对胰腺癌干细胞的结合性的抗体，该结合性至少不具有针对正常细胞的结合能力且具有针对胰腺癌干细胞的结合性即可，包含针对胰腺癌干细胞的特异性的结合性和针对胰腺癌干细胞的非特异性的结合性(即，不仅与胰腺癌结合，还与胰腺癌以外的癌细胞结合的特性)这两者。本发明的抗体包含以下的抗体I、抗体II、抗体III。
本发明的抗体的CDR(互补性决定区)包含：由Kabat编号程序(Bioinformatics,32,298-300(2016))、IMGT系统(Dev Comp Immunol.27,55-77(2003))和Paratome算法(Nucleic Acids Res.40(Web Server issue):W521-4(2012).doi:10.1093/nar/gks480和PLoS Comput Biol.8(2):e1002388(2012))的所有组合(以下，也记载为“Kabat/IMGT/Paratome”)定义的CDR，由Kabat编号程序、IMGT系统和Paratome算法中的任一者定义的CDR。由Kabat/IMGT/Paratome定义的CDR的序列包含由Kabat编号程序定义的CDR的序列、由IMGT系统定义的CDR的序列、和由Paratome算法定义的CDR的序列的全部。
＜抗体I＞
抗体I为针对胰腺癌干细胞的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下的(I-1)HCDR1～(I-3)HCDR3所示的重链CDR，所述轻链可变区包含以下的(I-4)LCDR1～(I-6)LCDR3所示的轻链CDR。
以下，序列号1为抗体I的一个例子的重链可变区的氨基酸序列(源自大鼠)，序列号2为抗体I的一个例子的轻链可变区的氨基酸序列(源自大鼠)。
(I-1)HCDR1，其包含：序列号1的第26位～第35位、第31位～第35位、第26位～第33位、或第27位～第35位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(I-2)HCDR2，其包含：序列号1的第47位～第65位、第50位～第65位、第51位～第57位、或第47位～第59位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(I-3)HCDR3，其包含：序列号1的第96位～第104位、第98位～第104位、或第97位～第104位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(I-4)LCDR1，其包含：序列号2的第24位～第34位、第27位～第32位、或第27位～第34位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(I-5)LCDR2，其包含：序列号2的第46～56位、第50～56位、或第50～51位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(I-6)LCDR3，其包含：序列号2的第89～96位、或第89～95位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列。
包含重链和/或轻链互补性决定区(以下也统称为“CDR”)的抗体只要具有针对胰腺癌干细胞的结合性即可，所述重链和/或轻链互补性决定区包含在上述(I-1)～(I-6)中，1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列。被替换、缺失、添加和/或插入的氨基酸的数量没有特别限定，对于1个CDR，可举出：优选为1～3个，更优选为1～2个，特别优选为1个。另外，在本发明的抗体中，在CDR序列中，可以对1个CDR的氨基酸序列进行替换、缺失、添加和/或插入，也可以对2个以上的CDR的氨基酸序列进行替换、缺失、添加和/或插入。
另外，关于所述CDR的氨基酸序列中的氨基酸的替换，可预测除序列号1的第52位以外，利用类似氨基酸的替换(即保守性氨基酸替换)不会对胰腺癌干细胞的结合性带来不良影响，因此优选。具体而言，基于氨基酸侧链的性质，建立了以下分类，属于相同分类的氨基酸彼此为类似氨基酸。
碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸
酸性氨基酸：谷氨酸、天冬氨酸
中性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、脯氨酸
此外，所述中性氨基酸也可以分类为具有极性侧链的中性氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的中性氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有含酰胺侧链的中性氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺)、具有含硫侧链的中性氨基酸(蛋氨酸、半胱氨酸)、具有芳香族侧链的中性氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)、具有含羟基侧链的中性氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、具有脂肪族侧链的中性氨基酸(丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)等。关于序列号1的第52位的氨基酸残基(天冬氨酸残基)，可以替换为类似氨基酸以外的氨基酸，例如天冬酰胺残基等。
关于将一个或多个氨基酸残基替换为目标的其他氨基酸的方法，例如已知位点特异性突变诱导法(Hashimoto-Gotoh T.et al.,Gene,Vol.152,p.271-275(1995)；ZollerMJ.et al.,Methods Enzymol.Vol.100,p.468-500(1983)、Kramer W.et al.,NucleicAcids Res.Vol.12,p.9441-9456(1984)；Kr amer W.et al.,Methods.Enzymol.Vol.154,p.350-367(1987)；Kunkel TA.,Proc Natl Acad Sci USA.,Vol.82,p.488-492(1985)等)，可以使用该位点特异性突变诱导法对CDR的氨基酸序列进行氨基酸替换。另外，作为替换为其他氨基酸的方法，可举出WO2005/080432中记载的文库技术。
包含CDR的抗体只要具有针对胰腺癌干细胞的结合性即可，所述CDR分别包含在上述(I-1)～(I-6)中，具有85％以上的序列一致性的氨基酸序列。序列一致性只要为85％以上即可，可举出：优选为87％以上、进一步优选为92％以上、95％以上、96％以上、97％以上、或98％以上、特别优选为99％以上。其中，例如相对于特定的氨基酸序列的序列一致性是与该特定的氨基酸序列比较而算出的序列一致性。
另外，“序列一致性”是指，通过BLAST PACKAGE[sgi32 bit edition,Version2.0.12；available from National Center for Biotechnology Informa tion(NCBI)]的bl2seq program(Tatiana A.Tatsusova,Thomas L.Madden,FEMS Microbiol.Lett.,Vol.174,p247-250,1999)得到的氨基酸序列的一致性的值。参数只要设定为Gapinsertion Cost value:11、Gap extension Cost value:1即可。
在在上述(I-1)～(I-6)中，“严格条件下”是指，在包含0.5％SDS、5×Denhartz’s〔Denhartz’s、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％聚蔗糖400(Ficoll400)〕以及100μg/ml鲑鱼精子DNA的6×SSC(1×SSC为0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)中，在50℃～65℃下保温4小时～一夜的条件。
在严格条件下的杂交，具体通过以下方法进行。即，制成将DNA文库或cDNA文库固定化而成的尼龙膜，在包含6×SSC、0.5％SDS、5×Den hartz’s、100μg/ml鲑鱼精子DNA的预杂交溶液中，在65℃下封闭尼龙膜。然后，加入用32P标记的各探针，在65℃下保温一夜。将该尼龙膜在6×SSC中，室温下清洗10分钟，在包含0.1％SDS的2×SSC中，室温下清洗10分钟，在包含0.1％SDS的0.2×SSC中，45℃下清洗30分钟后，采取放射自显影术，能够检测出与探针特异性杂交的DNA。
＜抗体I的优选例＞
作为本发明的抗体I的优选例，可举出包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含以下的(I-1')HCDR1～(I-3')HCDR3所示的重链CDR，所述轻链可变区包含以下的(I-4')LCDR1～(I-6')LCDR3所示的轻链CDR。
以下，序列号3为抗体I的另一示例的重链可变区的氨基酸序列(源自大鼠)，序列号4为抗体I的另一示例的轻链可变区的氨基酸序列(源自大鼠)。序列号3是序列号1的氨基酸序列的第60位氨基酸残基(天冬酰胺残基)被替换为半胱氨酸残基，序列号1的氨基酸序列的第62位氨基酸残基(丙氨酸残基)被替换为脯氨酸残基的氨基酸序列。序列号4是序列号2的氨基酸序列的第32位氨基酸残基(异亮氨酸残基)被替换为天冬酰胺残基，序列号2的第46位氨基酸残基(亮氨酸残基)被替换为苯丙氨酸残基，序列号2的氨基酸序列的第52位氨基酸残基(天冬氨酸残基)被替换为天冬酰胺残基的氨基酸序列。
(I-1')所述(I-1)HCDR1包含序列号1或序列号3的第26位～第35位、第31位～第35位、第26位～第33位、或第27位～第35位的氨基酸序列，
(I-2')所述(I-2)HCDR2包含序列号1或序列号3的第47位～第65位、第50位～第65位、第51位～第57位、第47位～第59位、或第47位～第60位的氨基酸序列，
(I-3')所述(I-3)HCDR3包含序列号1或序列号3的第96位～第104位、第98位～第104位、或第97位～第104位的氨基酸序列，
(I-4')所述(I-4)LCDR1包含序列号2或序列号4的第24位～第34位、第27位～第32位、或第27位～第34位的氨基酸序列，
(I-5')所述(I-5)LCDR2包含序列号2或序列号4的第46位～第56位、第50位～第56位、或第50位～第51位的氨基酸序列，
(I-6')所述(I-6)LCDR3包含序列号2或序列号4的第89位～第96位、或第89位～第95位的氨基酸序列。
＜抗体I的优选的另一示例＞
在本发明的抗体I中，重链可变区和轻链可变区的框架区只要不对针对胰腺癌干细胞的结合活性产生实质性影响就没有特别限定。作为本发明的抗体I的优选的另一示例，可举出包含以下的重链可变区和轻链可变区的抗体。
重链可变区，其包含：序列号1的氨基酸序列；在序列号1的氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于序列号1的氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码序列号1的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
轻链可变区，其包含：序列号2的氨基酸序列；在序列号2的氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于序列号2的氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码序列号2的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列。
在上述抗体I的优选的另一示例中，包含重链和/或轻链可变区(以下也统称为“可变区”)的抗体只要具有针对胰腺癌干细胞的结合性即可，所述重链和/或轻链可变区包含1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列。被替换、缺失、添加和/或插入的氨基酸的数量没有特别限定，对于各可变区，可举出：优选为1～15个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，进一步优选为1～4个，更进一步优选为1～3个，特别优选为1～2个，最优选为1个。关于氨基酸的替换的事项(保守性氨基酸替换、替换的方法)的详细情况与上述(I-1)～(I-6)中描述的内容相同。
在上述抗体I的优选的另一示例中，包含可变区的抗体只要具有针对胰腺癌干细胞的结合性即可，所述可变区分别包含具有85％以上的序列一致性的氨基酸序列。关于序列一致性和严格条件下的详细情况，与上述(I-1)～(I-6)中描述的内容相同。
＜抗体I的特别优选的例子＞
作为本发明的抗体I的特别优选的例子，可举出包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含序列号1或序列号3的氨基酸序列，所述轻链可变区序列号2或序列号4的氨基酸序列。
＜抗体II＞
抗体II为针对胰腺癌干细胞的抗体，包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含以下的(II-1)HCDR1～(II-3)HCDR3所示的重链CDR，所述轻链可变区包含以下的(II-4)LCDR1～(II-6)LCDR3所示的轻链CDR。
(II-1)HCDR1，其包含：序列号5的第26位～第35位、第31位～第35位、第26位～第33位、或第27位～第35位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(II-2)HCDR2，其包含：序列号5的第47位～第66位、第50位～第66位、第51位～第58位、或第47位～第60位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(II-3)HCDR3，其包含：序列号5的第97位～第111位、第99位～第111位、或第98位～第111位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(II-4)LCDR1，其包含：序列号6的第24位～第34位、第27位～第32位、或第27位～第34位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(II-5)LCDR2，其包含：序列号6的第46位～第56位、第50位～第56位、或第50位～第51位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(II-6)LCDR3，其包含：序列号6的第89位～第98位、或第89位～第97位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列。
包含CDR的抗体只要具有针对胰腺癌干细胞的结合性即可，所述CDR在分别包含上述(II-1)～(II-6)中，1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列。关于被替换、缺失、添加和/或插入的氨基酸的数量等的详细情况，与上述抗体I的(I-1)～(I-6)中描述的内容相同。关于所述CDR的氨基酸序列中的氨基酸的替换，可预测利用类似氨基酸的替换(即保守性氨基酸替换)不会对针对胰腺癌干细胞的结合性带来不良影响，因此优选。关于氨基酸的替换的详细情况与上述抗体I的(I-1)～(I-6)中描述的内容相同。
包含CDR的抗体只要具有针对胰腺癌干细胞的结合性即可，所述CDR分别包含在上述(II-1)～(II-6)中，具有85％以上的序列一致性的氨基酸序列。关于序列一致性和严格条件下的详细情况与关于上述抗体I的(I-1)～(I-6)中描述的内容相同。
＜抗体II的优选例＞
在本发明的抗体II中，可变区的框架区只要不对针对胰腺癌干细胞的结合活性产生实质性影响就没有特别限定。因此，作为本发明的抗体II的优选例，可举出包含以下的重链可变区和轻链可变区的抗体。
以下，序列号5为抗体II的一个例子的重链可变区的氨基酸序列(源自大鼠)，序列号6为抗体II的一个例子的轻链可变区的氨基酸序列(源自大鼠)。
重链可变区，其包含：序列号5的氨基酸序列；在序列号5的氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于序列号5的氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码序列号5的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
轻链可变区，其包含：序列号6的氨基酸序列；在序列号6的氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于序列号6的氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码序列号6的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列。
在上述抗体II的优选例中，包含可变区的抗体只要具有针对胰腺癌干细胞的结合性即可，所述可变区包含1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列。关于被替换、缺失、添加和/或插入的氨基酸的数量的详细情况与上述抗体I的优选的另一示例中描述的内容相同，关于氨基酸的替换的事项(保守性氨基酸替换、替换的方法)的详细情况与关于上述抗体I的(I-1)～(I-6)中描述的内容相同。
在上述抗体II的优选例中，包含可变区的抗体只要具有针对胰腺癌干细胞的结合性即可，所述可变区分别包含具有85％以上的序列一致性的氨基酸序列。关于序列一致性和严格条件下的详细情况，与关于上述抗体I的(I-1)～(I-6)中描述的内容相同。
＜抗体II的特别优选例＞
作为本发明的抗体II的特别优选例，可举出包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含序列号5的氨基酸序列，所述轻链可变区包含序列号6的氨基酸序列。
＜抗体III＞
抗体III是抗EpCAM抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下的(III-1)HCDR1～(III-3)HCDR3所示的重链CD R的重链可变区，所述轻链可变区包含以下的(III-4)LCDR1～(III-6)LCDR3所示的轻链CDR。EpCAM(上皮细胞粘附因子：epithelial cell ad hesion molecule)是存在于细胞膜表面的包含314个氨基酸的跨膜型糖蛋白质，除胰腺癌干细胞以外，在各种癌组织中过量表达。因此，抗体III也是针对胰腺癌干细胞的抗体。
(III-1)HCDR1，其包含：序列号7的第26位～第35位、第31位～第35位、第26位～第33位、或第27位～第35位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(III-2)HCDR2，其包含：序列号7的第47位～第66位、第50位～第66位、第51位～第58位、或第47位～第61位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(III-3)HCDR3，其包含：序列号7的第97位～第112位、第99位～第112位、或第98位～第112位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(III-4)LCDR1，其包含：序列号8的第24位～第34位、第27位～第32位、或第27位～第34位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(III-5)LCDR2，其包含：序列号8的第46位～第56位、第50位～第56位、或第50位～第51位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
(III-6)LCDR3，其包含：序列号8的第89位～第97位、或第89位～第96位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码这些氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列。
包含CDR的抗体只要具有针对胰腺癌干细胞的结合性即，所述CDR分别包含在上述(III-1)～(III-6)中，1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列。关于被替换、缺失、添加和/或插入的氨基酸的数量等的详细情况，与上述抗体I的(I-1)～(I-6)中描述的内容相同。关于所述CDR的氨基酸序列中的氨基酸的替换，可预测利用类似氨基酸的替换(即保守性氨基酸替换)不会对针对胰腺癌干细胞的结合性带来不良影响，因此优选。关于氨基酸的替换的详细情况，与上述抗体I的(I-1)～(I-6)中描述的内容相同。
包含CDR的抗体只要具有针对胰腺癌干细胞的结合性即可，所述CDR分别包含在上述(III-1)～(III-6)中，具有85％以上的序列一致性的氨基酸序列。关于序列一致性和严格条件下的详细情况，与关于上述抗体I的(I-1)～(I-6)中描述的内容相同。
＜抗体III的优选例＞
在本发明的抗体III中，可变区的框架区只要不对针对胰腺癌干细胞的结合活性产生实质性影响就没有特别限定。因此，作为本发明的抗体II I的优选例，可举出包含以下的重链可变区和轻链可变区的抗体。
以下，序列号7为抗体III的一个例子的重链可变区的氨基酸序列(源自大鼠)，序列号8为抗体III的一个例子的轻链可变区的氨基酸序列(源自大鼠)。
重链可变区，其包含：序列号7的氨基酸序列；序列号7的氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于序列号7的氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码序列号7的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
轻链可变区，其包含：序列号8的氨基酸序列；序列号6的氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于序列号8的氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含互补于编码序列号8的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列。
在上述抗体III的优选例中，包含重链和/或轻链可变区的抗体只要具有针对胰腺癌干细胞的结合性即可，所述重链和/或轻链可变区包含1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列。关于被替换、缺失、添加和/或插入的氨基酸的数量的详细情况，与上述抗体I的优选的另一示例中描述的内容相同，关于氨基酸的替换的事项(保守性氨基酸替换、替换的方法)的详细情况与关于上述抗体I的(I-1)～(I-6)中描述的内容相同。
在上述抗体III的优选例中，包含可变区的抗体只要具有针对胰腺癌干细胞的结合性即可，所述可变区分别包含具有85％以上的序列一致性的氨基酸序列。关于序列一致性和严格条件下的详细情况，与关于上述抗体I的(I-1)～(I-6)中描述的内容相同。
＜抗体III的特别优选例＞
作为本发明的抗体III的特别优选例，可举出包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含序列号7的氨基酸序列，所述轻链可变区包含序列号8的氨基酸序列。
＜恒定区＞
在本发明的抗体中，恒定区的氨基酸序列只要对针对胰腺癌干细胞的结合活性没有实质性影响，就没有特别限定。
序列号1～序列号8所示的可变区的氨基酸序列源自大鼠。因此，作为本发明的抗体的例子，可举出具有源自大鼠的恒定区的大鼠抗体。
＜信号区＞
本发明的抗体可以包含任意的信号区。例如，作为重链信号区的序列，例如可举出：序列号17或21、序列号25、以及序列号29所示的氨基酸序列；作为轻链信号区的序列，例如可举出：序列号19或23、以及序列号27所示的氨基酸序列。
关于抗体I中包含的信号区，作为重链信号区的序列，可举出序列号17或21所示的氨基酸序列，作为轻链信号区的序列，可举出序列号19或23所示的氨基酸序列，优选为序列号19所示的氨基酸序列。关于抗体II中包含的信号区，作为重链信号区的序列，可举出序列号25所示的氨基酸序列，作为轻链信号区的序列，可举出序列号27所示的氨基酸序列。关于抗体III中包含的信号区，作为重链信号区的序列，可举出序列号29所示的氨基酸序列，作为轻链信号区的序列，可举出序列号19所示的氨基酸序列。
＜重组抗体＞
另一方面，作为本发明的抗体的优选例，可举出嵌合抗体(小鼠嵌合化抗体、人嵌合化抗体等)或人源化抗体。
嵌合抗体是指将相互来源不同的区彼此连接而成的抗体。嵌合抗体在用作治疗用的医药组合物的有效成分的情况下，优选为由源自大鼠抗体的可变区和源自人抗体的恒定区构成的大鼠-人嵌合抗体(人嵌合化抗体)。另外，嵌合抗体在用作诊断试剂的情况下，优选为大鼠-人嵌合抗体(人嵌合化抗体)、由源自大鼠抗体的可变区和源自小鼠抗体的恒定区构成的大鼠-小鼠嵌合抗体(小鼠嵌合化抗体)。
另外，人源化抗体是将非人源的CDR序列移植到人抗体的框架区上而成的抗体，是由非人源抗体的CDR和人源抗体的框架区以及人源抗体的恒定区构成的抗体。人源化抗体的人体内的抗原性降低，因此适合于将本发明的抗体用作治疗用的医药组合物的有效成分的情况。
＜同种型＞
关于本发明的抗体的同种型没有特别限制，例如可举出：IgG(具体而言，可举出IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(具体而言，可举出IgA1、IgA2)、IgM、IgD、和IgE。其中，可举出优选为IgG，可举出更优选为IgG2。
另外，作为本发明的抗体的轻链，可以是κ链和λ链中的任一种，可举出优选为κ链。
作为本发明的抗体的最优选的同种型，可举出轻链为κ链的IgG2。
＜形态＞
本发明的抗体的形态可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体，优选为单克隆抗体。单克隆抗体的制作方法没有特别限定，例如可以通过以下方法制作：例如，“Kohler G,Milstein C.,Nature.1975Aug 7；256(5517):495-497.”中记载的杂交瘤法；美国专利第4816567号中记载的重组法；例如，“Clackson et al.,Nature.1991Aug 15；352(6336):624-628.”、或“Marks et al.,J Mol Biol.1991Dec 5；222(3):581-597.”中记载的从噬菌体抗体文库中分离的方法；“蛋白质实验手册，羊土社(2003):92-96.”中记载的方法等。
另外，在本发明的抗体中，只要包含由所述CDR构成的抗原结合位点，则不仅可以包含全长抗体(具有Fab区和Fc区的抗体)，还可以包含片段抗体。作为这样的片段抗体，可举出：Fv抗体、Fab抗体、Fab'抗体、F(ab')2抗体、scFv抗体、dsFv抗体、双特异抗体(diabody)、纳米抗体(nanobody)等。另外，在本发明的抗体中，只要包含上述抗原结合位点，则也可以包含多价特异性抗体(例如双特异性抗体)。这些片段抗体和多特异性抗体可以按照以往公知的方法制作。
本发明的抗体可以是与聚乙二醇、放射性物质、毒素等各种化合物结合而成的偶联物抗体或偶联物抗体片段。另外，本发明的抗体可以根据需要改变结合的糖链，也可以融合其他蛋白质。
2.DNA
本发明的DNA是编码上述“1.针对胰腺癌干细胞的抗体”的DNA。本发明的DNA例如可以通过以编码上述抗体的DNA为模板，利用PCR等取得至少编码该抗体的区而得到。另外，本发明的DNA也可以通过基因的合成法而进行人工合成。
另外，在碱基序列的特定的位点中导入特定突变的情况下，突变导入方法是公知的，例如可利用DNA的位点特异性突变导入法等。作为变换DNA中的碱基的具体的方法，例如也可使用市售的试剂盒而进行。
在碱基序列中导入突变得到的DNA可使用DNA测序仪确认碱基序列。一旦确定碱基序列，之后通过以化学合成、克隆的探针为模板的PCR、或以具有该碱基序列的DNA片段为探针的杂交，可以得到编码本发明抗体的DNA。
另外，也可以通过位点特异性突变诱导法等合成编码本发明抗体的DNA的突变型，且与突变前具有同等功能的DNA。应予说明，为了对编码本发明抗体的DNA导入突变，可以通过Kunkel法、Gapped duplex法、Mega-primer PCR法等公知的方法进行。
关于本发明的DNA的碱基序列，只要是本领域技术人员，就可以按照本发明抗体的上述CDR的序列适当设计。
具体而言，关于抗体I的重链CDR，可以基于编码序列号1的DNA的碱基序列即序列号9(例如，编码序列号1的第26位～第35位的氨基酸序列的DNA包含序列号9的第76位～第105位的碱基序列)或基于编码序列号3的DNA的碱基序列即序列号11(例如，编码序列号3的第26位～第35位的氨基酸序列的DNA包含序列号11的第76位～第105位的碱基序列)，按照上述(I-1)～(I-3)或上述(I-1')～(I-3')的重链CDR的序列进行设计。关于抗体I的轻链CDR，可以基于编码序列号2的DN A的碱基序列即序列号10(例如，编码序列号2的第24位～第34位的氨基酸序列的DNA包含序列号10的第70位～第102位的碱基序列)或基于编码序列号4的DNA的碱基序列即序列号12(例如，编码序列号4的第24位～第34位的氨基酸序列的DNA包含序列号12的第70位～第102位的碱基序列)，按照上述(I-4)～(I-6)或上述(I-4')～(I-6')的轻链CDR的序列进行设计。
关于抗体II的重链CDR，可以基于编码序列号5的DNA的碱基序列即序列号13(例如，编码序列号5的第26位～第35位的氨基酸序列的DNA包含序列号13的第76位～第105位的碱基序列)，按照上述(II-1)～(II-3)的重链CDR的序列进行设计。关于抗体II的轻链CDR，可以基于编码序列号6的DNA的碱基序列即序列号14(例如，编码序列号6的第24位～第34位的氨基酸序列的DNA包含序列号14的第70位～第102位的碱基序列)，按照上述(II-4)～(II-6)的轻链CDR的序列进行设计。
关于抗体III的重链CDR，可以基于编码序列号7的DNA的碱基序列即序列号15(例如，编码序列号7的第26位～第35位的氨基酸序列的DNA包含序列号15的第76位～第105位的碱基序列)，按照上述(III-1)～(III-3)的重链CDR的序列进行设计。关于抗体III的轻链CDR，可以基于编码序列号8的DNA的碱基序列即序列号16(例如，编码序列号8的第24位～第34位的氨基酸序列的DNA包含序列号16的第70位～第103位的碱基序列)，按照上述(III-4)～(III-6)的轻链CDR的序列进行设计。
作为编码本发明的DNA中包含的可变区的碱基序列，只要包含编码上述CDR的碱基序列即可，作为编码框架区的碱基序列，只要该框架区对针对胰腺癌干细胞的结合活性不产生实质性影响，就没有特别限定。作为编码本发明的DNA中包含的可变区的碱基序列的具体例，可举出以下的碱基序列。
作为编码抗体I的重链可变区的碱基序列的例子可举出序列号9，作为编码其轻链可变区的碱基序列的例子可举出序列号10。作为编码抗体II的重链可变区的碱基序列的例子可举出序列号13，作为编码其轻链可变区的碱基序列的例子可举出序列号14。作为编码抗体III的重链可变区的碱基序列的例子可举出序列号15，作为编码其轻链可变区的碱基序列的例子可举出序列号16。
作为编码抗体I～抗体III的可变区的碱基序列的另一示例，还可举出编码包含上述CDR的可变区，且相对于序列号9、10、13～16所示的碱基序列具有85％以上的序列一致性的碱基序列。作为上述序列一致性可举出优选为87％以上，进一步优选为92％以上、95％以上、96％以上、97％以上、或98％以上，特别优选为99％以上。另外，关于“序列一致性”如上述所示。
作为编码抗体I～抗体III的可变区的碱基序列的进一步的另一示例，还可举出与编码包含上述CDR的重链可变区，且包含互补于包含序列号9、10、13～16所示的碱基序列的DNA的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA的碱基序列。另外，“严格条件下”如上述所示。
在编码抗体I的可变区的碱基序列中，作为符合上述另一示例或上述进一步的另一示例的碱基序列的更具体的例子，可举出编码重链可变区的碱基序列的更具体的例子即序列号11、编码轻链可变区的碱基序列的更具体的例子即序列号12。
本发明的DNA优选为使密码子利用频率在宿主中最适化的DNA。例如，如果是使用大肠杆菌作为宿主的情况，则优选为使密码子利用频率在大肠杆菌中最适化的DNA。
3.重组载体
本发明的重组载体包含上述“2.DNA”中记载的本发明的DNA。本发明的重组载体可通过在表达载体中插入本发明的DNA而得到。
作为表达载体，优选由在宿主内可自律性增殖的噬菌体、质粒、或由病毒作为基因重组用途而构建的表达载体。具体而言，可举出：源自大肠杆菌的质粒(例如pET-Blue)、源自枯草杆菌的质粒(例如pUB110)、源自酵母的质粒(例如pSH19)、动物细胞表达质粒(例如pA1-11、pcDNA3.1-V5/His-TOPO)、λ噬菌体等细菌噬菌体、源自病毒的载体等。
重组载体包含可操作地连结于本发明的DNA的控制因子。作为控制因子，可举出启动子、信号序列、复制起点、标记基因、增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI位点、转录终止序列等，可以使用它们中的一种或多种。另外，可操作地连接是指，调节本发明的DNA的各种控制因子和本发明的DNA以能够在宿主细胞中工作的状态连接。
作为信号序列并无特别限定，例如可举出编码上述信号区的序列。例如，作为重链信号序列，例如可举出序列号18或22(分别编码序列号17或21)、序列号26(编码序列号25)、和序列号30(编码序列号29)所示的碱基序列；作为轻链信号序列，例如可举出序列号20或24(分别编码序列号19或23)、和序列号28(编码序列号27)所示的碱基序列。
关于用于抗体I的重组载体中的信号序列，作为重链信号序列，可举出序列号18或22所示的碱基序列；作为轻链信号序列，可举出序列号20或24所示的碱基序列，从提高抗体产生效率的观点出发，优选序列号20所示的氨基酸序列。关于用于抗体II的重组载体中的信号序列，作为重链信号序列，可举出序列号26所示的碱基序列；作为轻链信号序列，可举出序列号28所示的碱基序列。关于用于抗体III的重组载体中包含的信号序列，作为重链信号序列，可举出序列号30所示的碱基序列；作为轻链信号序列，从提高抗体产生效率的观点出发，可举出优选为序列号20所示的氨基酸序列。
关于用于嵌合抗体的重组载体，例如，在用于人嵌合化抗体的重组载体的情况下，可以通过将具有可变区的大鼠抗体的恒定区替换为人抗体的恒定区来制作，所述可变区具有上述各CDR的氨基酸序列。同样地，在用于小鼠嵌合化抗体的重组载体的情况下，可以通过将具有可变区的大鼠抗体的恒定区替换为小鼠抗体的恒定区来制作，所述可变区具有上述各CDR的氨基酸序列。关于人抗体的恒定区，可以使用公知的恒定区。
具体而言，可以通过以下方法制备用于人嵌合化抗体的重组载体。首先，通过化学合成、生物化学切断、再结合等制作编码大鼠重链可变区的DNA，所述大鼠重链可变区包含具有特定的氨基酸序列的CDR。将得到的编码重链可变区的DNA与编码人重链恒定区的DNA连接(ligation)并导入至表达用载体，由此制作重链表达载体。采用同样的方法制作轻链表达载体。
另外，也可以替换抗体的可变区中的框架区的氨基酸，使得大鼠-人嵌合抗体的CDR形成适当的抗原结合位点(Sato,K.etal.,Cancer Research,Vol.53,p.851-856(1993))。对于用于小鼠嵌合化抗体的重组载体，也同样可以通过使用编码小鼠恒定区的DNA代替编码人恒定区的DNA来制作。
另外，用于人源化抗体的重组载体，例如，可以通过将包含所述各氨基酸序列的CDR移植到人抗体的框架区上来制作(例如，Jones et al.,Nature,Vol.321,p.522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,Vol.332,p.323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,Vol.239,p.1534-1536(1988))。
具体而言，可以通过以下方法制作用于人源化抗体的重组载体。通过化学合成、生物化学切断、再结合等制作编码重链可变区的DNA，所述重链可变区是将具有特定的氨基酸序列的CDR和4个源自人抗体的框架区按照特定的顺序连接而成。在此，为了使人源化抗体的各CDR能够形成适当的抗原结合位点，可以施加将框架区的氨基酸替换、缺失和/或添加等突变(Sato,K.et al.,Cancer Research,Vol.53,p.851-856(1993))。将得到的编码重链可变区的DNA与编码人重链恒定区的DNA连接并导入至表达用载体，由此制作重链表达载体。同样地，制作轻链重链表达载体。应予说明，关于人抗体的恒定区，可以使用公知的恒定区。
4.转化体
转化体通过使用上述本发明的DNA或上述重组载体对宿主进行转化而得到。
作为转化体的制造中使用的宿主，只要能够导入基因，且能够自主增殖，能够表达本发明的基因的性状，就没有特别限制，例如可举出：人和不包括人的哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔、牛、猴等)的细胞，更具体而言，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、猴细胞COS-7、源自人胎儿的肾脏细胞(例如，HEK 293细胞(Expi293F、293-F、HEK293、293T等))、小鼠骨髓瘤细胞(例如，Sp2/0、NS0)；昆虫细胞；植物细胞；大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等芽孢杆菌属、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)等属于假单胞菌属等的细菌；放线菌等；酵母等；丝状菌等。
转化体可通过在宿主中导入上述本发明的DNA或上述重组载体而得到。导入本发明的DNA或重组载体的方法，只要目标基因能够导入宿主，就没有特别限定。另外，导入DNA的位置，只要能够表达目标基因，就没有特别限定，可以为质粒上，也可以为基因组上。作为导入本发明的DNA或重组载体的具体方法，例如可举出重组载体法、基因组编集法。
在宿主中导入本发明的DNA或重组载体的条件，可以根据导入方法和宿主的种类等适当设定。如果宿主是细菌的情况下，则例如可举出使用基于钙离子处理的感受态细胞的方法以及电穿孔法等。如果宿主是酵母的情况下，则例如可举出电穿孔法(Electroporation method)、原生质球法和醋酸锂法等。如果是宿主为动物细胞的情况，则例如可举出电穿孔法、磷酸钙法和脂质转染法等。如果是宿主为昆虫细胞的情况，则例如可举出磷酸钙法、脂质转染法和电穿孔法等。如果宿主是植物的情况下，则例如可举出电穿孔法、农杆菌法、基因枪法和PEG法等。
5.抗体的制造方法
上述“1.针对胰腺癌干细胞的抗体”中记载的本发明的抗体可以通过培养上述“4.转化体”中记载的转化体来制造。转化体的培养条件考虑宿主的营养生理性质适宜设定即可，优选举出液体培养。可以从得到的培养物中回收目标的本发明的抗体并进行纯化。
6.医药组合物
本发明提供一种医药组合物，其包含上述“1.针对胰腺癌干细胞的抗体”中记载的本发明的抗体。本发明的医药组合物以本发明的抗体作为有效成分，能够发挥基于与胰腺癌干细胞的结合能力的药理效果。
本发明的医药组合物只要包含有效量的所述本发明的抗体即可，此外，也可以包含医药上可接受的载体或添加剂。作为上述载体或添加剂，例如可举出：表面活性剂、赋形剂、着色剂、香味剂、保存剂、稳定剂、缓冲剂、pH缓冲剂、崩解剂、增溶剂、溶解辅助剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稀释剂、矫味剂等。
另外，关于本发明的医药组合物的给药方式，可以为经口或非经口中的任一种，具体而言，可举出：经口给药；静脉内给药、肌肉内给药、腹腔内给药、皮下给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药、经粘膜给药、眼内给药等非经口给药。
关于本发明的医药组合物的制剂形态，可以根据采用的给药方式适当设定其制剂形态。例如，在以口服给药的方式使用的情况下，制备成粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、悬浮液等制剂形态即可；在以非口服给药的方式使用的情况下，制备成液剂、悬浮液、乳液、喷雾剂、栓剂、滴眼剂等制剂形态即可。
本发明的医药组合物能够利用本发明的抗体具有的抗肿瘤效果，用于胰腺癌的治疗用途。
本发明的医药组合物的给药量和给药次数根据给药方式、患者的年龄或体重、疾病的种类、症状的程度等而不同，不能统一规定，例如在人的情况下，每1次给药，以7～30天1次左右的频率以上述本发明的抗体的重量换算计相当于120mg～480mg的量给药即可。应予说明，为了减少给药次数，可以使用缓释性制剂，或者也可以用渗透泵等长期地每次少量给药。
7.体外诊断试剂
本发明提供一种体外诊断试剂，其包含上述“1.针对胰腺癌干细胞的抗体”中记载的本发明的抗体。本发明的体外诊断试剂可以以本发明的抗体作为肿瘤标志物，发挥基于与胰腺癌干细胞的结合能力的诊断效果。
本发明的抗体由于抗体I、抗体II和抗体III均具有与胰腺癌干细胞的结合性，因此本发明的体外诊断试剂可以用于胰腺癌的诊断。另外，本发明的抗体中，抗体I和抗体II与胰腺癌干细胞特异性结合，因此本发明的体外诊断试剂更优选包含抗体I和抗体II。另一方面，抗体III是抗EpCAM抗体，不仅具有与胰腺癌干细胞的结合性，还具有与具有EpCAM的癌细胞的结合性，因此本发明的体外诊断试剂在包含抗体III的情况下，可以用于表达EpCAM的癌的诊断。作为表达EpCAM的癌，没有特别限定，例如可举出：肾细胞癌、肝细胞癌、尿路上皮癌、乳腺癌、扁平上皮癌、肺癌。
作为本发明的体外诊断试剂的检测对象，可举出从应诊断的生物体采集的胰腺癌干细胞等癌细胞、或能够认为反映其表面状态的源自癌细胞的细胞外囊泡(外泌体等)。在使用源自癌细胞的细胞外囊泡作为检测对象的情况下，在不进行活检而能够期待非侵袭性的诊断、以及在胰腺癌诊断中能够期待得到提高的诊断灵敏度方面是优选的。作为包含检测对象的生物体试样的具体例，可举出：活检试样、采血试样、采尿试样等。
使用了本发明的体外诊断试剂的用于癌的诊断的生物体试样的分析法，包含使本发明的体外诊断试剂(即本发明的抗体)与生物体试样接触，并对抗原抗体反应进行免疫测定的工序。
免疫测定可以基于夹心法、竞争法、凝聚法等中的任一种方法，优选基于夹心法。另外，作为免疫测定法，根据标记的种类，可举出酶免疫测定法(ELISA)、荧光免疫测定法、放射性同位素免疫测定法等，从测定的简易性和/或迅速性的观点出发，可举出优选为酶免疫测定法。
作为本发明的体外诊断试剂的具体方式的例子，可举出固定在基板上的方式。即，本发明还提供一种抗体基板，所述抗体基板包含上述体外诊断试剂和固定有该体外诊断试剂的基板。作为基板的材质，只要是固相就没有特别限定，可举出：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、聚氯乙烯、氟树脂、交联葡聚糖、纸、硅、玻璃、金属、琼脂糖等，作为其形态，也可举出板和膜等。关于在基板上固定本发明的体外诊断试剂(即本发明的抗体)的方法，可以没有特别限制地使用抗体基板的制作技术领域中公知的方法。在抗体基板的使用中，可以将本发明的体外诊断试剂作为补充抗体，进行基于夹心法的免疫测定。
作为本发明的体外诊断试剂的具体方式的另一示例，可举出含有在体外诊断用组合物中的方式。即，本发明还提供含有上述体外诊断试剂的体外诊断用组合物。体外诊断试剂组合物中包含的体外诊断试剂可以是抗体本身的形态，也可以是抗体固定化于不溶性颗粒的形态。体外诊断用组合物中，除上述体外诊断试剂以外，还可以包含选自盐、糖、多元醇、表面活性剂、蛋白质(不包括体外诊断试剂)、稳定剂、防腐剂、缓冲液等中的1种或2种以上的成分。
上述抗体基板和体外诊断用组合物还可以根据免疫测定的测定原理、标记的种类，以包含其他试剂和/或器具的试剂盒的形态提供。例如，在选择酶免疫测定法的情况下，该试剂盒除了上述抗体基板和体外诊断用组合物以外，还可以包含选自反应容器或反应板、显色底物溶液、反应停止液、清洗液、标准溶液等中的1种或2种以上的项目(item)。
实施例
以下，通过实施例更详细说明本发明，但不应解释为本发明限定于这些实施例。
试验例1：针对人胰腺癌干细胞株KMC07的单克隆抗体的制作
将本试验例中进行的抗体制作的流程示于图1。
1-1.材料和方法
细胞培养
使用含有10％FBS[SIGMA,F7524]的D-MEM[Wako,044-29765]作为BxPC-3(人胰腺癌细胞株)、MCF-7(人乳腺癌细胞株)，使用含有10％FBS的RPMI-1640[Wako,189-02025]作为KP-3(人胰腺扁平上皮癌细胞株)、HARA(人肺癌细胞株)、HARA-B2(人肺癌细胞骨转移株)、PC-3(人前列腺癌细胞株)、HeLa(人子宫颈部类癌细胞株)，使用含有20％FBS的D-MEM作为NHDF(人成纤维细胞株)，使用含有10％FBS的杂交瘤-SFM[Gibco,12300-067]作为Sp2(小鼠骨髓瘤细胞株)，在37℃、5体积％CO2中培养。
KMC07的培养
KMC07是由本发明人从胰腺癌组织建立的人胰腺肿瘤原始细胞株(人胰腺癌干细胞)，所述胰腺癌组织是从进行了利用吉西他滨给药的抗癌剂治疗的人胰腺癌患者(年龄：年龄69岁，性别：男性，病理学亚型：管状腺癌，转移：肝脏·腹膜·腹腔内淋巴结、起源：腹膜渗出液)分离的(Shimizu K.,Nishiyama T.,Hori Y.(2017).Gemcitabine EnhancesKras-MEK-Induced Matrix Metalloproteinase-10Expression Via Histone Acetylation in Gemcitabine-Resistant Pancreatic Tumor-initiatingCells.Pancreas.46,268-275.)。KMC07与PA6(小鼠成纤维细胞株)共培养。首先使用含有10％FBS的MEMα[Wako,137-17215]，在37℃、5％CO2中培养PA 6直至汇合。在利用PBS冲洗的PA6上接种KMC07，使用KMC培养基(Stem Medium[KAC,KSDSRK100]，25U/ml青霉素[Gibco,15070-063]，25μg/ml链霉素[Gibco15070-063]，0.1μM 2-巯基乙醇[Wako,137-07521])，在37℃、5体积％CO2中培养。
杂交瘤的制作
为了制作针对KMC07的抗体，使用KMC07作为抗原，对WKY/Izm大鼠[SLC，8周龄雌性]1只进行2次免疫操作。在初次免疫中，相对于约1.0×107细胞的KMC07和PA6的混合PBS悬浮液，以体积比成为1:1的方式与佐剂即Titer Max Gold[CYT,G-1X5]混合，使用超声波仪(sonicator)充分悬浮。将其在WKY/Izm大鼠的脚底以单脚各100μl进行皮下注射。免疫15天后进行追加免疫。在追加免疫中，仅将约6.7×105细胞的KMC07和PA6的混合PBS悬浮液在左右臀部以各100μl进行皮下注射。将追加免疫4天后从髂骨淋巴结分离的淋巴细胞和Sp2以成为3:1的方式混合，将利用PEG法融合得到的细胞(杂交瘤)接种于96孔板。培养基使用HAT培养基(杂交瘤-SFM,10％FBS,100mM次黄嘌呤[SIGMA,H9377-1G]，0.4mM氨基蝶呤[SIGMA,A3411-10MG]，16mM胸苷[Wako,205-08091]，1ng/ml mouse IL-6,100U/ml青霉素[Wako,161-23181]，100μg/ml链霉素[Wako,161-23181]，0.25μg/ml两性霉素B(Amphotericin B)[Wako,161-23181])，进行选择。
免疫染色
使用KMC07的情况：首先，在涂布有1.5μg/ml聚-L-鸟氨酸[SIGMA,P3655-50MG]的96孔免染板[Thermo Scientific,164588]上接种PA6。PA 6利用含有10％FBS的MEMα培养2天。2天后，除去PA6的培养上清，利用PBS冲洗后，将KMC07和PA6一起在KMC培养基中悬浮，使其成为约1500细胞/孔，并接种于各孔。进而在3天后，除去培养上清，添加稀释10倍的杂交瘤培养上清作为一次抗体，孵育1小时。1小时后，利用3.7％甲醛[Wako,064-00406]PBS溶液处理15分钟，固定细胞。最后加入包含Hoechst(R)33342[InvitrogenTM,H3570]的二次抗体(Alexa 488anti-r at IgG(H+L)[InvitrogenTM,A11006])PBS溶液，孵育30分钟。利用荧光显微镜(OLYMPUS,IX71)观察。
使用其他细胞的情况：在免疫染色的2天前，将细胞接种于8孔免染板[MPBiomedicals,6040805E]。以原液的状态使用杂交瘤培养上清作为一次抗体，孵育1小时。1小时后，利用3.7％甲醛PBS溶液处理15分钟，固定细胞。进而，在包含Hoechst(R)33342的二次抗体(Alexa 488anti-rat IgG(H+L))PBS溶液中孵育30分钟。最后添加防褪色剂DABCO[SIG MA,D-2522]，利用荧光显微镜进行观察。
极限稀释
杂交瘤的克隆按照以下方式进行：使用无HAT培养基(杂交瘤-SFM,10％ FBS,1ng/ml小鼠IL-6,100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.25μg/ml两性霉素B)，稀释至1cell/well，接种于96孔板。数天后，利用显微镜确认为单集落。
抗体纯化
利用不包含牛血清的培养基(杂交瘤-SFM,1ng/ml小鼠IL-6)培养杂交瘤，从该培养上清纯化抗体。纯化使用硫酸铵沉淀法，最终将纯化抗体溶液替换为PBS。纯化抗体的浓度确定使用PierceTM BCA Protein Assay Kit[Thermo Scientific,23227]。另外，使用Rat Immunoglobulin Isotyping ELISA Kit[BDBiosciences,557081]，进行各单克隆抗体的分型。
1-2.结果
1-2-1.针对人胰腺癌干细胞株KMC07的单克隆抗体的制作
特异性识别人胰腺癌干细胞株KMC07的单克隆抗体使用大鼠髂骨淋巴结法制作。本研究的目的是制作以KMC07细胞膜为靶标的抗体，但是KMC07在与PA6混合的状态下对大鼠免疫。初次免疫使用细胞悬浮液与佐剂的混合液。初次免疫15天后，仅追加免疫细胞悬浮液。追加免疫4天后从髂骨淋巴结分离淋巴细胞6.0×108细胞，其中将1.5×108细胞通过Sp2和PEG法进行细胞融合。将制作的杂交瘤接种于10枚96孔板。通过免疫染色筛选该杂交瘤培养上清。进行KMC07的免疫染色，结果约40％的孔为阳性。从中选择信号特别强的孔内的杂交瘤，使用极限稀释法进行克隆。然后，使用形成单一集落的杂交瘤培养上清，进行KMC07和PA6的免疫染色。其结果，成功建立了KMC07阳性/PA6阴性的抗体5克隆(1B4G4：相当于抗体I(IgG2b,κ)，1E2D3(IgG2a,λ)，1E7G5：相当于抗体I(IgG2b,κ)，1E9F7：相当于抗体II(IgG2a,κ),1F9D4：相当于抗体III(IgG2b,κ))。另外，进行使用了NHDF(人成纤维细胞株)的免疫染色，确认到各抗体不识别正常的人细胞。
1-2-2.针对各种人癌细胞株的反应性
为了研究纯化的抗体1B4G4、1E2D3、1E7G5、1E9F7、1F9D4对KMC07的结合性和特异性，使用各种源自人的癌细胞株进行免疫染色。作为人癌细胞株，使用BxPC-3(胰腺癌细胞株)、KP-3(胰腺扁平上皮癌细胞株)、HARA(肺癌细胞株)、HARA-B2(肺癌细胞骨转移株)、MCF-7(乳腺癌细胞株)、HeLa(子宫颈部类癌细胞株)、PC-3(前列腺癌细胞株)。按照以下5个阶段评价染色信号的强度。应予说明，KP-3为株化的胰腺癌细胞，但近年来明确了在建立的癌细胞株中也包含少数的癌干细胞样细胞(Christine M F.&Charlotte K.(2008).Humanbreast can cer cell lines contain stem-like cells that self-renew,give riseto phenoty pically diverse progeny and survive chemotherapy.Breast CancerResearch.10,R25.)，因此认为在KP-3中也存在胰腺癌干细胞样细胞。将结果示于表1。
-：未得到染色信号
±：得到微量的染色信号
+：得到染色信号
++：得到强的染色信号
+++：得到更强的染色信号
[表1]
存在包含胰腺癌干细胞的报告
如表1所示，全部抗体对胰腺癌干细胞显示结合性(显示阳性)。
另外，1B4G4(抗体I)、1E7G5(抗体I)和1E9F7(抗体II)对胰腺癌干细胞显示出特异性的结合性。应予说明，关于它们中的1B4G4(抗体I)和1E7G5(抗体I)针对KP-3显示阳性这一点，可认为特异性识别了KP-3中的胰腺癌干细胞样细胞。另外，这些抗体针对PC-3也大致显示阳性，但染色信号强度与针对KMC07的强度相比极弱，因此可以评价为对胰腺癌干细胞是特异性的。
另一方面，1E2D3和1F9D4(抗体III)对于除HeLa以外的所有细胞为阳性，因此可认为对于包含胰腺癌干细胞在内的常规的癌细胞显示结合性。
应予说明，所有抗体在HeLa中为阴性。HeLa由于反复传代，因此性状改变，可认为表达了各种蛋白质，因此识别癌细胞的抗体在HeLa中也大多能够得到染色信号。然而，本试验例中建立的抗体为HeLa阴性，因此提示了本试验例中建立的抗体在未株化的癌细胞中识别出高表达的蛋白质。
试验例2：针对KMC07的抗体的基因克隆和重组嵌合抗体的制备对1B4G4(抗体I)、1E7G5(抗体I)、1E9F7(抗体II)、1F9D4(抗体III)进行基因克隆和重组嵌合抗体的制备。将本试验例中进行的抗体基因克隆的大致流程示于图2。另外，将使用的引物的一览示于表2A～表2B。
2-1.材料和方法
细胞培养
作为HEK293T(人胎儿肾细胞株)，使用含有10％FBS的D-MEM，在37℃、5体积％CO2中进行培养。作为Expi293F(悬浮系293细胞株)，使用含有2mmol/L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液[Wako,016-21841]的HE200[gmep(R),HE200-0010]，在37℃、5体积％CO2中，以125rpm进行振荡培养。KMC07的培养方法按照试验例1的“1-1.材料和方法”的“KMC07的培养”。
从杂交瘤提取RNA和合成抗体可变区cDNA
从在P10培养皿中培养至汇合状态的杂交瘤的一半量提取Total RNA。首先，将杂交瘤以1800rpm离心5分钟。在该细胞团中加入TRIzol[ambion,15596-026]1ml，在室温下静置5分钟。加入氯仿[SIGMA,319988-500ML]200μl，在室温下静置2～3分钟。通过以12000g，在4℃离心15分钟而分离为两层。回收上层，加入异丙醇[Wako,166-04836]500μl进行混合，在室温下静置10分钟。以12000g、4℃离心10分钟后除去上清，加入75％乙醇溶液1ml。以7500g、4℃离心5分钟后除去上清。风干后，溶解于无RNase的水[TaKaRa,9012]20μl。以提取的RNA为基础，使用SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase[Invitrogen,18080-093]合成重链·轻链各自的cDNA。将逆转录PCR溶液1(用高压灭菌蒸馏水将RNA 1μg、2.5mM dNTPs4μl、5μM引物0.4μl定容至13μl的溶液)以65℃反应5分钟后冷却至25℃。在此期间加入逆转录PCR溶液2(5×First-Strand Buffer 4μl,0.1M DTT 1μl,40U/μl Recombinant RNasin(R)Ribonu clease Inhibitor[Promega,N251A]1μl,200U/μl SuperScriptTMIIIRT 1μl)后，在55℃反应30分钟，以70℃反应15分钟。此时，重链使用引物1，轻链使用引物2。
抗体基因表达载体的制作
以cDNA为模板，重链使用引物集4～9和引物1进行PCR，轻链κ的克隆使用引物集10～16和引物2进行PCR，分别扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。将得到的PCR产物插入pGEM(R)-T-easy vector[Promega,A1360]。此时，使用引物17、引物18(轻链的情况下，添加了引物19的三种)对通过蓝白斑筛选选择的集落进行PCR，确认正确地插入了源自杂交瘤的基因。然后，使用表3所示的引物扩增各抗体的VH、VL基因片段。通过NE Builder[NEB,E2621S]将得到的PCR产物插入至预先整合有重链·轻链稳定区基因的动物表达用载体pCEC2.1-rIgG2a、pCEC2.1-rIgK。
抗体表达载体向细胞的导入
使用HEK293T的情况：不包含FBS的D-MEM 221μl中分别添加重链、轻链表达载体各1.3μg。在其中添加1mg/ml PEI[Polysciences,23966]4μl，在室温下静置20分钟后，加入含有2％FBS的D-MEM 1.3ml。除去在12孔板中培养的HEK293T的培养上清，添加制备的溶液。在37℃，5体积％CO2中孵育4天，回收上清。
使用Expi293F的情况：在Opti-MEM[Gibco,31985-062]1.5ml中添加1mg/ml PEIMAX[Polysciences,24765]120μl，在室温下静置5分钟。另外，将重链·轻链表达载体各15μg分别添加至Opti-MEM 1.5ml中，制备质粒溶液。将制备的溶液加入PEI MAX溶液中进行混合，在室温下静置20分钟。在27ml的Expi293 ExpressionMedium[Gibco,A14351-01]中悬浮的7.5×107细胞的Expi293F中添加制备的溶液，在37℃、5体积％CO2中，以125rpm进行振荡培养。20小时后，添加0.5M丙戊酸钠[TCI,S0894]75μl和1M丙酸钠[Wako,194-03012]120μl。转染7天后回收上清。
使用KMC07的免疫染色
按照试验例1的“1-1.材料和方法”的“免疫染色”。在使用导入有抗KMC07抗体表达载体的HEK293T的培养上清作为一次抗体的情况下，不进行稀释而使用。
使用ProteinA的抗体纯化
使Expi 293F强制表达抗体，使用Protein A从其培养上清纯化抗体。在除去了细胞的培养上清30ml中添加1M Tris-HCl 1.5ml和Protein A(rProtein ASepharoseTMFastFlow[GE Healthcare,17-1279-01])PBS溶液0.2ml，4℃振荡一夜。第二天，在柱中填充与抗体反应的Protein A，置换为TBS溶液。将Gentle Ag/Ab ElutionBuffer,pH6.6[Thermo Scientific,21027]各300μl施加至柱上，分成5个级分回收抗体溶液。对每个级分测定280nm的吸光度，将确认到峰的溶液回收到透析管中。通过透析，最终将纯化抗体溶液置换为PBS。纯化抗体的浓度确定使用PierceTMBCA Prot ein Assay Kit。
大鼠重链基因的人嵌合化和小鼠嵌合化
仅将相当于大鼠抗体的Fc区的CH2、CH3人源化和小鼠化。以大鼠重链表达载体为模板，使用表4所示的引物扩增各抗体的大鼠重链基因片段(VH～Hinge)。通过NE Builder将得到的PCR产物插入至预先整合有人和小鼠的Fc区基因的动物表达用载体pCEC2.1-hIgG1、pUC19-mIgG2a。
轻链SP序列(信号序列)的重组
1E7SP-1F9D4轻链表达载体的制备：以1E7G5轻链表达载体为模板，利用引物23和引物35通过PCR扩增1E7G5轻链SP序列基因；以1F9D4轻链表达载体为模板，利用引物36和引物2通过PCR扩增1F9D4VL基因。接着，以得到的2个PCR产物为模板，使用引物23和引物2进行PCR，从而连接各基因片段，进行PCR。最后，将得到的PCR产物插入至预先整合有轻链恒定区基因的动物表达用载体pCEC2.1-rIgK。
1B4SP-1E7G5、1B4SP-1F9D4轻链表达载体的制备：以1B4G4轻链表达载体为模板，利用引物21和引物37通过PCR扩增1B4G4轻链SP序列基因。以1E7G5、1F9D4轻链表达载体为模板，利用引物38和引物2通过PCR分别扩增1E7G5、1F9D4 VL基因。接着，以得到的两个PCR产物(1B4G4轻链SP基因和各抗体VL基因)为模板，利用引物21和引物2进行PCR，从而连接各基因片段，进行PCR。最后，将得到的PCR产物插入至预先整合有轻链恒定区基因的动物表达用载体pCEC2.1-rIgK。
斑点印迹
在膜(membrane)(HybondTM-C Extra[GE Healthcare,BPN303E])上，将强制表达各抗体的Expi293F的培养上清0.5μl进行印迹。此时，培养上清使用原液、连续稀释(日语：段階希釈)为10倍、20倍～640倍的溶液。将膜风干后，在3％脱脂乳TBS-T溶液中浸渍30分钟。封闭后，利用Can Get Signal Solution II稀释的二次抗体(Anti-Rat IgGAP,antibody produced in rabbit)孵育30分钟。最后使用BCIP/NBT溶液使其显色。
[表2A]
[表2B]
[表3]
[表4]
2-2.结果
2-2-1.抗KMC07抗体可变区VH、VL的克隆
首先，从抗KMC07抗体的杂交瘤4克隆中提取总RNA，将其作为模板分别合成重链和轻链可变区VH、VL的cDNA。接着，以cDNA为模板进行PCR，扩增各克隆的VH、VL基因。将可变区的琼脂糖电泳的结果示于图3。此时，将使用引物集4～9扩增得到的PCR产物分别作为VH A～F。其结果，在以下的目标位置(0.4～0.5kb)能够确认到条带：1B4G4VL为A～E的5个样本，1B4G4VH为C的1个样本，1E7G5 VL为B、C、E、G的4个样本，1E7G5 VH为C的1个样本，1E9F7VL为A～E的5个样本，1E9F7 VH为E的1个样本，1F9D4 VL为B、C的2个样本，1F9D4 VH为C。仅选择通过琼脂糖凝胶电泳在目标位置得到条带的样品，进行TA克隆。其后，选择满足两个条件的样品：(1)扩增的PCR产物不是源自Sp2的基因，(2)在PCR的过程中未加入突变。(1)通过集落PCR，确认到除了插入基因以外基因未被扩增。(2)对每个样品PCR多个集落，进行序列比对，由此确认在集落间插入基因序列没有差异。其结果，1B4G4 VL使用A，1B4G4 VH使用C，1E7G5VL使用G，1E7G5 VH使用C，1E9F7 VL使用A，1E9F7 VH使用E，1F9D4 VL使用C，1F9D4 VH使用C的基因片段构建抗体表达载体。
应予说明，基于克隆结果，将各抗KMC07抗体的重链和轻链各自的可变区的氨基酸序列和碱基序列示于以下表5A～5D。在以下表中，也一并示出了重链和轻链各自的信号区(SP)的氨基酸序列和碱基序列。
[表5A]
[表5B]
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[表5C]
[表5D]
2-2-2.抗KMC07抗体表达载体的构建
通过以整合有包含表5A～5D所示的可变区和信号区(SP)的碱基序列的多核苷酸的克隆载体为模板的PCR，扩增1B4G4(抗体I)、1E7G5(抗体I)、1E9F7(抗体II)、1F9D4(抗体III)的四个克隆的可变区基因。然后，使用NE Builder插入至整合有重链·轻链恒定区基因的动物表达用载体pCEC2.1-rIgG2a、pCEC2.1-rIgK。通过测序确认基因序列没有问题后，将制作的抗KMC07抗体表达载体分别导入至HEK293T。使用各细胞的培养上清，进行KMC07的免疫染色。在该免疫染色中，细胞核被染色为蓝，各抗体被染色为绿。将结果示于图4。如图4所示，关于1B4G4(抗体I)、1E7G5(抗体I)、1E9F7(抗体II)，在KMC07的细胞膜上能够得到信号，由此可以确认抗KMC07抗体3克隆的表达。在阳性对照中使用从杂交瘤培养上清纯化的抗体。
另一方面，在1F9D4(抗体III)中未获得信号。在氨基酸结构域数据库SMART上1F9D4VL的SP序列未被识别为SP序列，因此认为SP序列存在某些问题。因此，制备将1E7G5(抗体I)轻链的SP序列(1E7SP；序列号24)重组为1F9D4(抗体III)轻链的1E7SP-1F9D4轻链表达载体。将1E7SP-1F9D4轻链表达载体构建流程示于图5。将制备的1E7SP-1F9D4轻链表达载体和1F9D4重链表达载体导入至HEK293T中培养。对培养上清进行KMC07的免疫染色。将结果示于图6。如图6所示，在KMC07的细胞膜中得到信号。因此，可认为通过将轻链的SP序列重组为1E7G5的序列(序列号24)，抗KMC07抗体即1F9D4(抗体III)在培养上清中的分泌量增加。
2-2-3.抗KMC07人嵌合抗体和小鼠嵌合抗体表达载体的构建
通过进行以抗KMC07抗体重链表达载体为模板的PCR，扩增各克隆的VHCH1-Hinge基因片段。然后，使用NE Builder插入至整合有人和小鼠Fc区基因的动物表达用载体pCEC2.1-hIgG1,pUC19-mIgG2a。通过测序确认基因序列没有问题后，将制备的各抗KMC07抗体人嵌合重链表达载体和小鼠嵌合重链表达载体与轻链表达载体一起导入至Exp293F。从该培养上清进行嵌合抗体的纯化，结果能够以充分的抗体量得到1B4G4(抗体I)和1E9F7(抗体II)的嵌合抗体。
另一方面，几乎无法获得1E7G5(抗体I)和1F9D4(抗体III)的嵌合抗体。因此，制备1B4SP-1E7G5轻链表达载体和1B4SP-1F9D4轻链表达载体(以下，也统称为“带有1B4SP的轻链载体”)，其中在获得足够抗体量的上述两个克隆中，将与1E7G5(抗体I)的轻链SP序列(序列号24)类似的1B4G4(抗体I)的轻链SP序列(1B4SP；序列号20)分别重组为1E7G5(抗体I)和1F9D4(抗体III)的轻链。将带有1B4SP的轻链载体构建流程示于图7。将制备的带有1B4SP的轻链载体、大鼠轻链表达载体、大鼠重链表达载体、小鼠嵌合重链表达载体导入至Expi293F进行培养。将培养上清进行连续稀释，进行斑点印迹，由此比较各抗体向培养上清中的分泌量。作为阳性对照，使用导入有1B4G4表达载体的Expi293F培养上清。将确认到其显色极限的结果示于图8A(导入有大鼠抗体表达载体的Expi293F培养上清)和图8B(导入有小鼠嵌合抗体表达载体的Expi293F培养上清)。如图8A和图8B所示，使用带有1B4SP的轻链载体制备的大鼠抗体和小鼠嵌合抗体与原来的抗体相比，对于1E7G5(抗体I)，抗体量增加约8倍，对于1F9D4(抗体III)，抗体量增加约4倍。可以确认均与用作阳性对照的1B4G4(抗体I)的抗体量相同或在其以上，因此从Expi293F的培养上清中纯化1E7G5和1F9D4的嵌合抗体。如此，通过利用序列号20重组轻链信号序列，能够得到足够量的1E7G5(抗体I)和1F9D4(抗体III)的嵌合抗体。
使用制作的抗体进行KMC07的免疫染色。作为阳性对照，使用从杂交瘤培养上清纯化得到的抗体。在该免疫染色中，细胞核被染色为蓝，各抗体被染色为绿(Alexa 488)或红(Alexa 568)。将结果示于图9(a：大鼠抗体，b：大鼠/人嵌合化抗体，c：大鼠/小鼠嵌合化抗体)。其结果，所有克隆均得到与原来的大鼠抗体同样的信号。由此，可以说成功实现了抗KMC07抗体4克隆的大鼠/人嵌合化和大鼠/小鼠嵌合化。
试验例3：针对KMC07的单克隆抗体的性状分析
3-1.材料和方法
细胞培养
作为NK92/CD16a(强制表达CD16a的NK92(人自然杀伤细胞株))，使用含有100U/ml人IL-2[盐野义制药株式会社，Imunace(R)]的MyeloCult TM H5100[STEMCELL,05150]，在37℃、5体积％CO2中进行培养。其他细胞的培养方法按照试验例1的“1-1.材料和方法”的“细胞培养”、“KMC07的培养”。
免疫沉淀
在使用膜蛋白质提取液制作试剂盒(Mem-PERTM Plus Kit[Thermofisher,89842Y])制作的提取液(蛋白质量600μg)中加入珠25μl，在4℃下搅拌30分钟。除去上清后，利用RIPA缓冲液清洗5次，加入2×样品缓冲液(0.125M Tris-HCl、4％SDS、10％蔗糖、0.1％溴酚蓝、10％2-巯基乙醇)溶液20μl，在98℃下孵育5分钟。使用Hybrid Gel对洗脱的蛋白质进行SDS凝胶电泳(SDS-PAGE)，通过银染色(2D-银染色试剂[Cosmo Bio，423413])进行评价。
蛋白质印迹分析
使用免疫沉淀物作为抗原制作膜。除此以外的方法按照试验例1的“1-1.材料和方法”的“蛋白质印迹分析”。
质谱分析
将对免疫沉淀物进行银染色而得到的条带切出并进行脱银后，供于质谱分析。
使用抗体亲和柱纯化结合蛋白质
将纯化的抗KMC07抗体偶联至HiTrap NHSactivated HP[GE Healt hcare,17-0716-01]1ml。接着，利用刮板回收培养至汇合状态的P10培养皿30枚的KMC07。以1200rpm，在4℃离心10分钟后，除去上清，利用RIPA-缓冲液(ULTRARIPAR Kit for Lipid Raft[BDL,F015],5μg/ml Aprotinin,5μg/ml Leupeptin,20μg/mlAPMSF,cOmpleteTMProteaseInhibitor Cocktail[Roche,04693116001]20ml中1片)制作KMC07细胞悬浮液。利用蠕动泵将KMC07细胞悬浮液施加于抗体偶联柱，在4℃循环1小时。将此时流出的溶液施加于偶联有其他抗KMC07抗体的柱，在4℃循环1小时。对抗KMC07抗体5克隆反复进行该操作，使抗体与蛋白质反应。最后，利用洗脱缓冲液(pH3.0、1％甘氨酸、1％正辛基-β-D-葡萄糖苷[Dojindo,346-05033])洗脱蛋白质，使用12.5％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE后，通过银染色(ProteoSilverTMPlus银染色试剂盒[SIGMA,PROT-SIL2])进行评价。
蛋白质表达载体在HEK293T中的导入及其确认
在不含FBS的D-MEM 80μl中添加蛋白质表达载体1μg。在其中添加1mg/ml PEI MAX3μl，在室温下静置20分钟后，添加含有2％FBS的D-MEM 1ml。除去在12孔板中培养的HEK293T的培养上清，添加制备的溶液。在37℃、5％CO2中孵育，第二天通过免疫染色进行评价。免疫染色按照试验例1的“1-1.材料和方法”的“免疫染色”。作为阳性对照抗体，将抗EpCAM兔多克隆抗体[proteintech,21050-1-AP]分别稀释100倍使用。
在细胞膜上开孔而进行免疫染色的情况：利用3.7％甲醛PBS溶液处理15分钟，固定细胞。利用0.5％Triton X-100PBS溶液处理5分钟，在细胞膜上开孔。利用NGS封闭(100mg/ml BSA,Goat Serum[Gibco,16210-064],37.5mg/ml甘氨酸[Wako,077-00735]，0.1％叠氮化钠[Wako,197-11091])PBS溶液封闭30分钟。除去溶液后，添加一次抗体，孵育1小时。进一步在包含Hoechst(R)33342的二次抗体(Alexa 488anti-rat IgG(H+L))PBS溶液中孵育30分钟。最后添加防褪色剂DABCO，利用荧光显微镜进行观察。
ADCC活性的评价(LDH测定法，对BxPC3)
在效应细胞存在下，为了测定抗KMC07抗体1F9D4(抗体III)相对于BxPC3(胰腺癌细胞株)的ADCC(Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity：抗体依赖性细胞毒性)活性，使用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST[DOJINDO,CK12]测定从细胞释放的LDH(乳酸脱氢酶)活性。在测定开始的18小时前更换效应细胞(NK92/CD16a)的培养基。在测定开始的16小时前将靶细胞(BxPC3)以成为5.0×103细胞/孔的方式接种于96孔板，在37℃、5体积％CO2中进行培养。测定当天，利用Assay Buffe r(含1％FBS的RPMI-1640)稀释效应细胞和抗KMC07大鼠/人嵌合化抗体1F9D4，使其成为终浓度高的2倍浓度，在除去了培养上清的96孔板中分别接种50μl/孔，在4小时37℃、5体积％CO2中孵育(n＝3)。此时，作为阴性对照，制作仅培养靶细胞、仅培养效应细胞的孔、仅培养100μl的Assay Buffer、仅培养Lysis溶液(Assay Buffer 91μl,Lysis Solution 9μl)的孔。进而，在孵育结束的45分钟前，作为阳性对照，在利用91μlAssay buffer培养的靶细胞中添加9μl裂解液。4小时后，将96孔板以200g离心分离4分钟，将其培养上清各50μl转移至新的96孔板。向其中各添加底物溶液(含有DyeMixture的Assay Buffer)50μl，遮光的同时在室温下反应15～30分钟。最后，各添加50μl终止溶液使反应停止后，测定490nm的吸光度。各吸光度将在靶细胞中添加效应细胞和抗体而得到的孔设为A，将仅添加效应细胞的孔设为B，将仅添加靶细胞的孔设为C，将添加裂解液而杀死靶细胞的孔设为D，由以下计算式算出ADCC活性。各自的吸光度使用仅减去各溶液的背景吸光度得到的值。
[数1]
ADCC(％)＝{(A-B-C)/(D-C)}×100
ADCC活性的评价(集落测定法，对KMC07)
在效应细胞的存在下，为了测定抗KMC07抗体对KMC07的ADCC活性，经时测量KMC07的集落数。以下，将该实验系统称为集落测定。在测定开始的3天前，在浸渍有利用1.5μg/ml聚-L-鸟氨酸涂布的玻璃的12孔板中以成为5.0×104细胞/孔的方式接种PA6(小鼠成纤维细胞株)，在37℃、5体积％CO2中培养。在测定开始的18小时前更换效应细胞(NK92/CD16a)的培养基。在测定开始的16小时前将靶细胞(KMC07)以成为5.0×104细胞/孔的方式接种于12孔板，以37℃、5体积％CO2中进行培养。测定当天，利用KMC培养基(组成记载于试验例1的“1-1.材料和方法”的“KMC07的培养”)将效应细胞稀释至适合浓度，以成为1μg/well的方式稀释抗KMC07大鼠/人嵌合化抗体(1B4G4(抗体I)和1F9D4(抗体III))，在除去培养上清的12孔板中各接种500μl/孔，在37℃、5体积％CO2中孵育(n＝2)。此时，假定KMC07相对于PA6存在一半量的约5.0×104细胞/孔，为了使E∶T比＝5∶1，以成为2.5×105细胞/孔的方式接种效应细胞。在6小时后、12小时后、24小时后进行免疫染色，确认KMC07的集落。利用3.7％甲醛PBS溶液处理15分钟，固定细胞后，作为一次抗体使用抗KMC07大鼠抗体1B4G4(抗体I)(1μg/ml)，孵育1小时。进而在包含Hoechst(R)33342的二次抗体(Alexa 488anti-rat IgG(H+L))PBS溶液中孵育30分钟。最后添加防褪色剂DABCO，利用荧光显微镜进行观察。对于各玻璃，随机选择9个位置，测量KMC07集落数。
荷瘤小鼠的制备
将利用含有10％FBS的MEMα悬浮的KMC07+PA6细胞悬浮液(3.5×107cells/ml)各100μl皮下注射到15只BALB/cSlc-nu/nu裸鼠[SLC，6周龄雌性]的背部。
使用荷瘤小鼠的抗肿瘤效果的体内(in vivo)评价
制作荷瘤小鼠3周后，根据肿瘤尺寸，每1个受试抗体各分组为3只(n＝3)。将抗KMC07抗体1E7G5(抗体I)、1F9D4(抗体III)和并非抗KMC07抗体的阴性对照抗体4G8B4分别尾静脉注射0.25mg/ml抗KMC07大鼠/小鼠嵌合抗体PBS溶液200μl、1周1次。进行该操作共计6次。1周2次通过游标卡尺测量各小鼠的体重和肿瘤直径。根据以下的计算式估算肿瘤体积。
[数2]
肿瘤体积(mm3)＝{长径＝×(短径)2}/2
统计分析
统计学的分析全部通过双因素方差分析(two-way ANOVA)进行。
3-2.结果
3-2-1.基于使用KMC07的免疫沉降的抗原分子的研究
通过使用膜蛋白质提取液的免疫沉降，以极力抑制改性而使之可溶化的蛋白质为对象进行免疫沉降。使用KMC07抗体5克隆和作为对照IgG抗体的10A7，对KMC07膜蛋白提取液进行银染色，将结果示于图10。
在1B4G4和1E7G5(抗体I)中75～100kDa之间得到了宽幅状的条带(图中箭头)，在1F9D4(抗体III)中140kDa和37kDa附近得到了条带(图中箭头)。根据银染色的条带图案和试验例1的“1-2.结果”的“1-2-2.针对各种人癌细胞株的反应性”的结果，提示1B4G4和1E7G5(抗体I)识别相同抗原的可能性。
3-2-2.使用抗体结合柱的抗原分子的研究
使抗KMC07抗体5克隆与亲和柱结合，在其中流入KMC07全部细胞提取液，由此使抗体与抗原反应。然后，洗脱抗体，通过银染色进行评价。将结果示于图11。如图11所示，在1B4G4(抗体I)中75～100kDa(图中标记4)、在1B4G4和1E7G5(抗体I)中25kDa附近(图中标记1、2)、在1F9D4(抗体III)中37kDa(图中标记3)得到特异性条带。其中，在1B4G4中检测出的75～100kDa的宽幅状的条带(图中标记4)与图10相同，因此认为有望作为候选抗原。切出各个条带，将进行质谱分析的结果汇总于表6。
[表6]
如表6所示，在1B4G4和1E7G5(抗体I)中，14-3-3protein beta/alpha(14-3-3)命中。但是，已知该14-3-3是在细胞内与信号传导相关的蛋白质，与各种蛋白质显示相互作用，因此可认为与抗体非特异性结合。另一方面，由1B4G4(抗体I)检测到的Olfactomedin-4(OLFM4)是分泌性蛋白质，其分子量约为57kDa，但是因为以下因素，因此作为1B4G4(抗体I)的候选抗原：(1)已知作为肠道上皮干细胞标志物；(2)已知在胃癌和大肠癌中大量表达，与癌的发展相关；(3)已知如果进行糖链修饰则分子量为72kDa；(4)已知与细胞膜中存在的钙黏着蛋白显示相互作用。可认为OLFM4有可能在KMC07中进行特异性的糖链修饰等特殊修饰而被系留于细胞膜。此外，已知由1F9D4(抗体III)检测到的EpCAM为I型跨膜糖蛋白质，不仅与细胞粘附有关，还与信号传导、细胞转移有关，在许多癌症物种中表达，近年来作为癌干细胞标志物也受到关注。即使考虑到1F9D4(抗体III)对KMC07以外的癌细胞株也反应，也判断为识别EpCAM的可能性高，作为1F9D4(抗体III)的候选抗原。
3-2-3.针对候选抗原分子的反应性
将HA-OLFM4和EpCAM表达载体分别导入至HEK293T，通过免疫染色评价抗KMC07抗体5克隆的反应性。使用市售的抗HA抗体和抗EpCAM抗体作为阳性对照抗体，使各抗体与作为阴性对照的未处理的HEK 293T反应。其结果，仅对于1F9D4(抗体III)，在强制表达EpCAM的HEK293T中得到信号。因此，1F9D4(抗体III)的抗原为EpCAM的可能性变高。
认为EpCAM在KMC07中受到特殊的修饰，其表达模式发生了变化，因此通过在产生EpCAM的表达的状态下，或者使用固定后进行了Triton X-100处理的KMC07进行免疫染色来确认。此时，使用抗KMC07抗体1F9D4、市售的EpCAM抗体作为一次抗体。在将KMC07以活细胞的状态进行免疫染色的情况下，利用抗EpCAM抗体在KMC07的细胞膜和PA6的细胞膜上得到信号(图12箭头)。KMC07的染色模式与1F9D4相同。已知抗EpCAM抗体与人、小鼠、大鼠的EpCAM交叉，因此可认为也与小鼠成纤维细胞株PA6反应。另一方面，1F9D4(抗体III)不与PA6反应，仅与KMC07反应，因此提示了1F9D4(抗体III)特异性识别人的EpCAM。
3-2-4.针对BxPC3的ADCC活性的体外评价
通过测定从细胞释放的LDH(乳酸脱氢酶)，测定细胞损伤率。具体而言，对于对KMC07以外的癌细胞也发生反应的1F9D4，评价了针对BxPC3的ADCC活性。此处，使用试验例2中制作的人嵌合抗体1F9D4。
首先，研究了效应细胞即NK92/CD16a相对于靶细胞即BxPC3以何种程度的比率(E:T比)进行反应时，1F9D4显示ADCC活性。1F9D4以抗体浓度1μg/ml使用。其结果，E:T比＝5∶1时显示约40％的细胞损伤率，确认了即使E∶T比进一步增大，死细胞率也不增加。即，可知1F9D4在E:T比＝5∶1时显示充分的ADCC活性，因此，其后的实验以E∶T比＝5∶1进行。接着，改变1F9D4的浓度条件进行试验。作为效应细胞使用NK92/CD16a。将其结果示于图13。如图13所示，在使用NK92/CD16a作为效应细胞的情况下，1F9D4从0.01μg/ml起浓度依赖性地显示ADCC活性。由以上可以确认，在体外，1F9D4对胰腺癌细胞显示ADCC活性。
3-2-5.针对KMC07的ADCC活性的体外评价
测定添加效应细胞和抗KMC07大鼠/人嵌合抗体6小时后、12小时后、24小时后的KMC07的集落数，评价ADCC活性。抗体使用稀释为1μg/ml的1B4G4(抗体I)和1F9D4(抗体III)，以E:T比为5:1进行。将其结果示于图14A(1B4G)和图14B(1F9D4)。如图14A和图14B所示，关于效果细胞CD16a，即使扣除集落数经时地减少(可认为由于与效应细胞的比较长时间的共培养而对KMC07造成了某些损伤)，通过抗KMC07抗体1B4G4(抗体I)和1F9D4(抗体III)也确认到针对KMC07的ADCC活性，提示该ADCC活性经时地变大。
KMC07在形成集落的同时增殖，因此可认为抗体难以浸润到集落的内部。因此，可认为通过延长抗体的反应时间，抗体一边损伤集落外侧的KMC07一边浸润至内部，成功实现显著减少集落。这可以通过在使1F9D4(抗体III)反应24小时后的KMC07的免疫染色图像(图15)中，与仅作为阴性对照的NK92/CD16a相比，在1F9D4-NK92/CD16a中KMC07的集落数明显少，以及，在1F9D4-NK92/CD16a中观察到在一部分KMC07中细胞膜被破坏的情况(图5放大图)来确认。因此，提示因抗KMC07抗体1F9D4(抗体III)的ADCC活性而损伤了KMC07。应予说明，另一个克隆1B4G4(抗体I)也得到同样的结果。
3-2-6.使用荷瘤小鼠的抗肿瘤效果的体内评价
对使用KMC07制作的荷瘤小鼠给药抗KMC07抗体，经时地测定肿瘤体积，由此评价其抗肿瘤效果。此时，使用试验例2中制作的抗KMC07小鼠嵌合抗体1E7G5(抗体I)、1F9D4(抗体III)的两个克隆和本研究室中制作的抗Septin 7小鼠单克隆抗体4G8B4作为阴性对照(以下，记载为对照抗体)。4G8B4是针对在细胞质中表达的蛋白质的抗体，因此可认为对小鼠的毒性小。通过1周1次、共6次尾静脉注射分别对每3只荷瘤小鼠给药抗体(n＝3)。1周2次测定体重和肿瘤体积，将以试验开始日为基准的体重增减率的经时变化示于图16A。如图16A所示，没有观察到各抗体的给药导致的体重大幅减少，因此可认为抗体没有毒性。此外，基于通过将各肿瘤体积V除以初次抗体给药时的肿瘤体积V0而得到的肿瘤体积比V/V0，将以试验开始日为基准的肿瘤体积比V/V0的时间变化示于图16B。如图16B所示，抗KMC07抗体1E7G5(抗体I)、1F9D4(抗体III)的两个克隆也低于给药对照抗体时的V/V0。相对于对照抗体，在1F9D4中，在抗体给药开始后第35、39、42天观察到统计学上的显著差异；在1E7G5中，在抗体给药开始后第39、42天观察到统计学上的显著差异(第35天:1F9D4 P<0.05,第39天:1E7G5 P<0.05,1F9D4 P<0.05,第42天:1E7G5 P<0.001,1F9D4 P<0.001)。
进而，对于各抗体，通过双因素方差分析(two-way ANOVA)对每个测定日的肿瘤体积比进行多重比较，结果抗KMC07抗体1E7G5、1F9D4在各测定日未观察到肿瘤体积比的显著差异，另一方面，对照抗体在表7所示的测定日观察到肿瘤肥大化的显著差异(P＜0.05)。因此，提示在给药抗KMC07抗体1E7G5(抗体I)、1F9D4(抗体III)的小鼠中，从试验的初期阶段起抑制肿瘤的肥大化，在给药对照抗体的小鼠中，肿瘤持续肥大。
[表7]
4G8G4给药小鼠的每个测定日的肿瘤体积V/V0的多重比较结果
根据以上的体外、体内的结果，可以说制作的抗体显示抗肿瘤效果。
试验例4：针对KMC07的单克隆抗体作为体外诊断试剂的用途
4-1.材料和方法
细胞培养
细胞的培养方法按照试验例1的“1-1.材料和方法”的“细胞培养”、“KMC07的培养”。
细胞外囊泡的纯化
使用超速离心法从KMC07+PA6和PA6的培养上清纯化细胞外囊泡。将培养上清30ml以110000rpm，在4℃超速离心70分钟。除去上清后，利用PBS 500μl使其悬浮，由此得到细胞外囊泡级分。
斑点印迹
将细胞外囊泡PBS溶液1μl印迹到膜(HybondTM-C Extra)上。将膜风干后，在3％脱脂乳TBS-T溶液中浸渍30分钟。封闭后，利用Can Get Signal Solution I以稀释至1μg/ml的方式添加一次抗体，孵育1小时。利用TBS-T清洗后，利用Can Get Signal Solution II稀释的二次抗体(Anti-Rat IgG-Peroxidase,antibody produced in rabbit[SIGMA,A5795-1ML])孵育30分钟。最后使用KPL TMB Membrane Peroxidase Substrate[SeraCare,5420-0027]使其显色。
抗体的HRP标记
抗体的HRP标记使用Ab-10 Rapid Peroxidase Labeling Kit[Dojindo,LK33]。标记后，抗体浓度为0.83mg/ml。
显色检测夹心ELISA
在ELISA板[Thermo Scientific,439454]中播种制备成10μg/ml的抗KMC07抗体100μl作为捕获抗体，在4℃孵育一夜。用Wash Buffer(50mM Tris-HCl(pH 8.0),140mMNaCl,0.05％ Tween 20)冲洗3次后，添加5％BSA Wash Buffer 200μl，在室温下孵育1小时。利用Wash Buffer冲洗3次后，添加制备成2μg/ml的细胞外囊泡PBS溶液100μl，在室温下振荡2小时。利用Wash Buffer冲洗3次后，加入稀释2000倍的HRP标记抗CD9抗体/抗CD63抗体溶液100μl作为检测抗体，在室温下孵育1小时。利用Wash Buffer冲洗5次后，添加TMBmicrowell peroxidase substrate[KPL,5120-0053]100μl，在室温下反应20分钟。添加2％H2SO4 50μl使反应停止，测定450nm的吸光度。
细胞培养上清的回收
回收培养9天的KMC07的培养上清和利用KMC培养基培养7天的PA6的培养上清。首先，将回收的培养上清以300g离心5分钟。接着，将该上清以1200g离心20分钟。进而，将该上清以10000g离心30分钟。最后，回收其上清，在以后的操作中使用。
抗体的生物素标记
抗体的生物素标记使用Biotin Labeling Kit-SH[Dojindo,LK10]。
荧光检测夹心ELISA
在荧光检测用ELISA平板[Greiner,655077]中分别播种100μl的制备成5μg/ml的抗KMC07抗体和阳性对照的抗CD9抗体2H12-B11作为捕获抗体，在37℃孵育1小时。利用PBS冲洗1次后，加入封闭溶液(1％BSA PBS溶液)200μl，在室温下孵育30分钟。除去溶液后，添加细胞培养上清100μl，在室温下孵育1小时。利用PBS冲洗3次后，添加制备成1μg/ml的生物素标记抗CD9抗体1G10-C11 100μl，在室温下孵育1小时。利用PBS冲洗3次后，添加利用封闭溶液稀释至0.05U/ml的链霉亲和素-β-半乳糖苷酶溶液[Roche,11112481001]50μl，在室温下孵育1小时。利用PBS冲洗3次后，添加底物溶液(0.2mM 4-MU[SIGMA,M-1633]，0.2M磷酸钠缓冲液，1mM氯化镁，100mM氯化钠，0.4％叠氮化钠，0.1％BSA)50μl，遮光的同时在37℃反应2小时。最后，添加反应停止液(0.1M甘氨酸(pH 10.2))50μl后，在激发光波长372nm下测定波长445nm的荧光。
4-2.结果
4-2-1.基于斑点印迹的针对源自KMC07的细胞外囊泡的反应性的评价
使用从KMC07+PA6和PA6的培养上清纯化的细胞外囊泡，对建立的抗KMC07抗体1B4G4(抗体I)、1E7G5(抗体I)、1E9F7(抗体II)、1F9D4(抗体III)的四个克隆进行斑点印迹。点样PBS作为阴性对照。将结果示于图17。如图17所示，1B4G4、1E7G5、1E9F7仅对源自KMC07+PA6的外泌体显示出反应性。另外，1F9D4对源自KMC07+PA6的细胞外囊泡显示出一些反应性。根据该结果可认为，全部克隆强烈地识别源自KMC07的细胞外囊泡中包含的蛋白质。
4-2-2.基于夹心ELISA的针对源自KMC07的细胞外囊泡的反应性的评价
为了评价作为以细胞外囊泡为靶的诊断试剂的抗体的有用性，在保持细胞外囊泡的结构的状态下调查各抗体对细胞外囊泡的结合力。使用从KMC07+PA6和PA6的培养上清纯化的细胞外囊泡，将建立的抗KMC07抗体4克隆作为捕获抗体，将针对细胞外囊泡共通标志物即CD9、CD63的HRP标记抗体作为检测抗体，进行夹心ELISA。将实验系统的示意图示于图18a，将结果示于图18b。如图18b所示，1B4G4(抗体I)、1E7G5(抗体I)的两个克隆显示与源自KMC07的细胞外囊泡特异性的反应性，1E9F7(抗体II)和1F9D4(抗体III)也稍微与源自KMC07的细胞外囊泡特异性地反应。因此，可认为这些克隆可以用作以细胞外囊泡为特异性靶标的诊断试剂。另外，该结果与使用细胞外囊泡的斑点印迹的结果相关，发现这些克隆在夹心ELISA中也对源自KMC07的外泌体具有反应性。因此，提示针对保持膜结构的细胞外囊泡的反应性可以通过斑点印迹在某种程度上进行评价。认为作为筛选识别细胞外囊泡的抗体的方法，斑点印迹是非常有效的。
4-2-3.针对细胞培养上清中的源自KMC07的外泌体的反应性
以通过高灵敏度的荧光检测夹心ELISA检测细胞培养上清中包含的微量的细胞外囊泡为目标。在预备实验中，确认到荧光检测夹心ELISA与显色检测夹心ELISA相比，显示出大约100倍的灵敏度。使用KMC07+PA6和PA6的培养上清，将建立的抗KMC07抗体1BG4(抗体I)、1E7G5(抗体I)、1E9F7(抗体II)、1F9D4(抗体III)的四个克隆作为捕获抗体，将生物素标记抗CD9抗体1G10-C11作为检测抗体，进行荧光检测夹心ELISA。将实验系统的示意图示于图19a，将结果示于图19b。如图19b所示，1B4G4(抗体I)、1E7G5(抗体I)的两个克隆显示对KMC07培养上清特异性地反应，对1E9F7(抗体II)、1F9D4(抗体III)也稍微显示针对KMC07培养上清的反应性。这些结果显示与显色检测夹心ELISA相同的结果，因此可以说通过抗KMC07抗体能够从细胞培养上清中检测出源自KMC07的细胞外囊泡。另外，作为要求检测样品中包含的微量的细胞外囊泡的胰腺癌诊断工具，提示荧光检测夹心ELISA充分发挥功能。
试验例5：CDR测序
对1B4G4(抗体I)、1E7G5(抗体I)、1E9F7(抗体II)、和1F9D4(抗体III)进行CDR测序。表8A～8C表示由Kabat编号程序(Bioinf ormatics,32,298-300(2016))、IMGT系统(DevComp Immunol.27,55-77(2003))和Paratome算法(Nucleic Acids Res.40(Web Serverissue):W521-4(2012).doi:10.1093/nar/gks480和PLoS Comput Biol.8(2):e1002388(2012))的所有组合(Kabat/IMGT/Paratome)定义的CDR、由Kabat编号程序定义的CDR、由IMGT系统定义的CDR和由Paratome算法定义的CDR。
[表8A]
/>
/>
表中，标注相同字母(括号内)的CDR互相为同一序列。
[表8B]
表中，标注相同字母(括号内)的CDR互相为同一序列。
[表8C]
/>
表中，标注相同字母(括号内)的CDR互相为同一序列。
序列表
<110> 公立大学法人大阪
国立大学法人神户大学
<120> 针对胰腺癌干细胞的抗体
<130> 22013WO
<150> JP2021-064090
<151> 2021-04-05
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> 人
<400> 1
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ile Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Trp Asp Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Asn Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Arg His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Lys Ile
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asp Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Gly Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 3
<211> 115
<212> PRT
<213> 人
<400> 3
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ile Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Trp Asp Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Cys Ser Pro Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Asn Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Arg His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 106
<212> PRT
<213> 人
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Lys Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Gly Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 5
<211> 122
<212> PRT
<213> 人
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20 25 30
Phe Met His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 108
<212> PRT
<213> 人
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Met Ser Ile Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Leu Gly Ser Tyr
20 25 30
Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Ser Ile Ser Asn Met Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Asn Ser Tyr Leu Met
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 7
<211> 123
<212> PRT
<213> 人
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Tyr Asp Gly Ile Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Tyr Val Tyr Tyr Ala Leu Gly Val Pro Phe Ala Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Phe Cys Phe Gln His Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 346
<212> DNA
<213> 人
<400> 9
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtgcagc cctcacagac cctgtctctc 60
acctgcactg tctctgggtt ctcactaagc agctatggtg taatctgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gatgggacta atatgggata atggaaatac aaattataat 180
tcagctctca aatcccgact gagcatcagc agggacacct ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca atctgcaaac tgaagacaca gccatgtact tctgtgccag atcgaggcac 300
tactttgatt actggggcca aggagtcatg gtcacagtct cctcag 346
<210> 10
<211> 319
<212> DNA
<213> 人
<400> 10
gacatccaga tgacccagtc tccttcactc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60
ctcaactgca aagcaagtca gaatatttat aagatcttag cctggtatca gcaaaagctt 120
ggagaagctc ccaaactcct gatttataat gcagacagtt tgcaaacggg catcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcacactca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatgttg ccacatattt ctgccagcag tattatagcg ggtggacgtt cggtggaggc 300
accaagctgg aattgaaac 319
<210> 11
<211> 346
<212> DNA
<213> 人
<400> 11
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtgcagc cctcacagac cctgtctctc 60
acctgcactg tctctgggtt ctcactaagc agctatggtg taatctgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gatgggacta atatgggata atggagatac aaattattgt 180
tcacctctca aatcccgact gagcatcagc agggacacct ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca atctgcaaac tgaagacaca gccatgtact tctgtgccag atcgaggcac 300
tactttgatt actggggcca aggagtcatg gtcacagtct cctcag 346
<210> 12
<211> 319
<212> DNA
<213> 人
<400> 12
gacatccaga tgacccagtc tccttcactc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60
ctcaactgca aagcaagtca gaatatttat aagaacttag cctggtatca gcaaaagctt 120
ggagaagctc ccaaattcct gatttataat gcaaacagtt tgcaaacggg catcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcacactca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatgttg ccacatattt ctgccagcag tattatagcg ggtggacgtt cggtggaggc 300
accaagctgg aattgaaac 319
<210> 13
<211> 367
<212> DNA
<213> 人
<400> 13
caggtacagc tgcagcaatc tggggctgaa ctggtgaagc ctgggtcgtc agtgaaaatt 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agtaacttta tgcactggat aaaacagcag 120
cctggaaatg gccttgagtg gattgggtgg atttctcctg gagatggtga tacagagtac 180
aatcaaaagt tcaatgggaa ggcaacactc actgcagaca aatcctccag cacagcctat 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagggggg 300
tactacagtg gtggaggggg ctactttgat tactggggcc aaggagtcat ggtcacagtc 360
tcctcag 367
<210> 14
<211> 325
<212> DNA
<213> 人
<400> 14
gacattgtga tgactcagtc tcccacatcc atgtccatat cagtaggaga cagggtcacc 60
atgaactgca aggccagtca aaatttgggt tcttatgtag actggtacca acagaaaaca 120
gggcagtctc ctaaactgct tatctacaaa gcatccaacc ggtacacggg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tggaacagat ttcactttct ccatcagcaa catgcaggct 240
gaagacctgg ctgtttatta ctgtatgcag tctaactcct atctcatgta cacgtttgga 300
gctgggacca agctggaact gaaac 325
<210> 15
<211> 370
<212> DNA
<213> 人
<400> 15
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggaaggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctcaggatt cactttcagt gactataaca tggcctgggt ccgccaggct 120
ccaaagaagg gtctggagtg ggtcgcaacc attaattatg atggtattag cacttactat 180
cgagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagata atgcaaaaag caccctatac 240
ctgcaaatgg acagcctgag gtctgaggac acggccactt attactgtgc tagacattct 300
tatgtatact acgcattagg agtcccgttt gcttactggg gccaaggcac tctggtcact 360
gtctcttcag 370
<210> 16
<211> 322
<212> DNA
<213> 人
<400> 16
gacatccaga tgacccagtc tccttcactc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60
atcaactgca aagcaagtca gaatattaac aagtacttaa actggtatca gcaaaagctt 120
ggagaagctc ccaaactcct gatatataat acaaacagtt tgcaaacggg catcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat tacacactca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg gcacatattt ctgctttcag cataatagtt ggccgctcac gttcggttct 300
gggaccaagc tggagatcaa ac 322
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> 人
<400> 17
Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
Ala Leu Ser
<210> 18
<211> 57
<212> DNA
<213> 人
<400> 18
atggctgtcc tagtgctgct cctctgcctg gtgacacttc caagctgtgc cctgtcc 57
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> 人
<400> 19
Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala
1 5 10 15
Met Arg Cys
<210> 20
<211> 57
<212> DNA
<213> 人
<400> 20
atggctccag ttcaactttt agggcttttg gtgctcttcc tcccagccat gagatgt 57
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> 人
<400> 21
Met Ala Val Leu Val Leu Phe Leu Cys Leu Val Thr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
Ala Leu Ser
<210> 22
<211> 57
<212> DNA
<213> 人
<400> 22
atggctgtct tagtgctgtt cctctgcctg gtgacacttc caagctgtgc cctgtcc 57
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<400> 23
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala Met Arg
1 5 10 15
Cys
<210> 24
<211> 51
<212> DNA
<213> 人
<400> 24
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctc ttcctcccag ccatgagatg t 51
<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> 人
<400> 25
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Phe Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Cys
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 26
<211> 57
<212> PRT
<213> 人
<400> 26
Ala Thr Gly Gly Gly Ala Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Thr Ala
1 5 10 15
Thr Cys Ala Thr Gly Thr Thr Cys Thr Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr
20 25 30
Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Ala Cys Ala Thr Gly Thr
35 40 45
Gly Thr Thr Cys Ala Cys Thr Cys Cys
50 55
<210> 27
<211> 20
<212> PRT
<213> 人
<400> 27
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Ile Phe Leu Leu Leu Trp Leu Ser
1 5 10 15
Gly Ala Asp Gly
20
<210> 28
<211> 60
<212> DNA
<213> 人
<400> 28
atggagtcac agacccaggt cttcatattc ctgctgctct ggttgtctgg tgctgatggg 60
<210> 29
<211> 19
<212> PRT
<213> 人
<400> 29
Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu Phe Met Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 30
<211> 57
<212> DNA
<213> 人
<400> 30
atggactcca ggctcaattt agttttcctt gtccttttta tgaaaggtgt ccagtgt 57

Claims (20)

1.一种针对胰腺癌干细胞的抗体，其特征在于，所述针对胰腺癌干细胞的抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下的HCDR1～HCDR3所示的重链CDR，所述轻链可变区包含以下的LCDR1～LCDR3所示的轻链CDR：
HCDR1，其包含：序列号1的第26位～第35位、第31位～第35位、第26位～第33位、或第27位～第35位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
HCDR2，其包含：序列号1的第47位～第65位、第50位～第65位、第51位～第57位、或第47位～第59位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
HCDR3，其包含：序列号1的第96位～第104位、第98位～第104位、或第97位～第104位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR1，其包含：序列号2的第24位～第34位、第27位～第32位、或第27位～第34位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR2，其包含：序列号2的第46位～第56位、第50位～第56位、或第50位～第51位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR3，其包含：序列号2的第89位～第96位、或第89位～第95位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述HCDR1包含序列号1或序列号3的第26位～第35位、第31位～第35位、第26位～第33位、或第27位～第35位的氨基酸序列，
所述HCDR2包含序列号1或序列号3的第47位～第65位、第50位～第65位、第51位～第57位、第47位～第59位、或第47位～第60位的氨基酸序列，
所述HCDR3包含序列号1或序列号3的第96位～第104位、第98位～第104位、或第97位～第104位的氨基酸序列，
所述LCDR1包含序列号2或序列号4的第24位～第34位、第27位～第32位、或第27位～第34位的氨基酸序列，
所述LCDR2包含序列号2或序列号4的第46位～第56位、第50位～第56位、或第50位～第51位的氨基酸序列，
所述LCDR3包含序列号2或序列号4的第89位～第96位、或第89位～第95位的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中，所述抗体包含以下的重链可变区和轻链可变区：
重链可变区，其包含：序列号1的氨基酸序列；序列号1的氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于序列号1的氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码序列号1的氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
轻链可变区，其包含：序列号2的氨基酸序列；序列号2的氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于序列号2的氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码序列号2的氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中，所述重链可变区包含序列号1或序列号3的氨基酸序列，所述轻链可变区包含序列号2或序列号4的氨基酸序列。
5.一种针对胰腺癌干细胞的抗体，其特征在于，所述针对胰腺癌干细胞的抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下的HCDR1～HCDR3所示的重链CDR，所述轻链可变区包含以下的LCDR1～LCDR3所示的轻链CDR：
HCDR1，其包含：序列号5的第26位～第35位、第31位～第35位、第26位～第33位、或第27位～第35位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
HCDR2，其包含：序列号5的第47位～第66位、第50位～第66位、第51位～第58位、或第47位～第60位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
HCDR3，其包含：序列号5的第97位～第111位、第99位～第111位、或第98位～第111位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR1，其包含：序列号6的第24位～第34位、第27位～第32位、或第27位～第34位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR2，其包含：序列号6的第46位～第56位、第50位～第56位、或第50位～第51位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR3，其包含：序列号6的第89～98位、或第89～97位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列。
6.一种抗EpCAM抗体，其特征在于，所述抗EpCAM抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下的HCDR1～HCDR3所示的重链CDR，所述轻链可变区包含以下的LCDR1～LCDR3所示的轻链CDR：
HCDR1，其包含：序列号7的第26位～第35位、第31位～第35位、第26位～第33位、或第27位～第35位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
HCDR2，其包含：序列号7的第47位～第66位、第50位～第66位、第51位～第58位、或第47位～第61位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
HCDR3，其包含：序列号7的第97位～第112位、第99位～第112位、或第98位～第112位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR1，其包含：序列号8的第24位～第34位、第27位～第32位、或第27位～第34位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR2，其包含：序列号8的第46位～第56位、第50位～第56位、或第50位～第51位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；
LCDR3，其包含：序列号8的第89位～第97位、或第89位～第96位的氨基酸序列；在这些氨基酸序列中1个～数个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入得到的氨基酸序列；相对于这些氨基酸序列具有85％以上序列一致性的氨基酸序列；或者，由与包含与编码这些氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下特异性杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列。
7.根据权利要求1、5和6中任一项所述的抗体，其中，所述抗体为单克隆抗体。
8.根据权利要求1、5和6中任一项所述的抗体，其中，所述抗体为人嵌合化抗体或小鼠嵌合化抗体。
9.一种DNA，其特征在于，所述DNA编码权利要求1、5和6中任一项所述的抗体。
10.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求9所述的DNA。
11.根据权利要求10所述的重组载体，其中，所述重组载体包含轻链信号序列，所述轻链信号序列包含序列号20、24或28所示的碱基序列。
12.一种转化体，其特征在于，所述转化体导入有权利要求10所述的重组载体。
13.一种抗体的制造方法，其特征在于，所述抗体的制造方法包含培养权利要求12所述的转化体而产生权利要求1、5和6中任一项所述的抗体的工序。
14.一种医药组合物，其特征在于，所述医药组合物含有权利要求1、5和6中任一项所述的抗体作为有效成分。
15.根据权利要求14所述的医药组合物，其中，所述医药组合物用于胰腺癌的治疗。
16.一种体外诊断试剂，其特征在于，所述体外诊断试剂包含权利要求1、5和6中任一项所述的抗体。
17.根据权利要求16所述的体外诊断试剂，其中，所述体外诊断试剂用于源自癌细胞的细胞外囊泡的检测。
18.根据权利要求16所述的体外诊断试剂，其中，所述体外诊断试剂用于胰腺癌的诊断。
19.一种抗体基板，其特征在于，所述抗体基板包含权利要求16所述的体外诊断试剂和固定有所述体外诊断试剂的基板。
20.一种体外诊断用组合物，其特征在于，所述体外诊断用组合物含有权利要求16所述的体外诊断试剂。
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EP2241576A1 (en) * 2009-04-17 2010-10-20 Trion Pharma Gmbh Use of trifunctional bispecific antibodies for the treatment of tumors associated with CD133+/EpCAM+ cancer stem cells
WO2018233333A1 (zh) * 2017-06-23 2018-12-27 苏州博聚华生物医药科技有限公司 一种靶向人肿瘤干细胞的单克隆抗体及其应用
KR102259298B1 (ko) * 2019-05-15 2021-05-31 강원대학교 산학협력단 암 줄기세포 세포막 단백질에 특이적인 항체 및 그 응용

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