JP2022507752A - 光‐デジタルｐｃｒチャンバおよびこれを用いる光‐デジタルｐｃｒ機器 - Google Patents

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Abstract

本発明は、透明基板と、前記透明基板上に形成された金属薄膜層と、前記金属薄膜層上に形成された遮光層と、前記遮光層上に形成された微細流路構造体とを含む光‐デジタルＰＣＲチャンバ、および、透明基板と、前記透明基板上に形成された金属薄膜層と、前記金属薄膜層上に形成された遮光層とを含む積層体を含む光‐デジタルＰＣＲ機器に関する。

Description

本発明は、光‐デジタルＰＣＲチャンバおよびこれを用いる光‐デジタルＰＣＲ機器に関する。
ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）法は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の特定の領域を試験管内に大量で増幅する技術である。前記のような技術を用いたＰＣＲ装置は、病院、研究所などで血液に入っている少量のＤＮＡを増幅させるために使用され、マラリア、結核、肝炎などの様々な疾病の診断のためにもＰＣＲ装置が使用される。
かかるＰＣＲ方法は、最近、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ）などに発展しており、従来のＰＣＲが提供することができなかったリアルタイム診断、高敏感度、測定結果とのデジタル化など、様々な便宜と高い正確度の結果を提供している。
中でも、デジタルＰＣＲは、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を探知し、定量分析する新たな方法として、かかるデジタルＰＣＲ反応は、サンプル内に数百、数千個の分割されたサンプルで個別に行われ、少量の試料だけでも敏感な測定が可能であるという利点があり、各種の試料を同時に処理することができ、様々な範囲で応用可能であるという利点がある。
デジタルＰＣＲは、検出対象核酸（遺伝子）の相対的な量を確認するために、特定の増幅サイクル後に蛍光の強度を測定し、定量化した標準物質と結果値の比較により定量化する。かかるデジタルＰＣＲの利点は、検出対象核酸を増幅し、サンプル自体で絶対定量が可能であり、良好な再現性と高い敏感度を有する。
しかし、デジタルＰＣＲにおいて、オイルエマルジョンによるＤＮＡ溶液分割技術などの従来技術は、製品をパッケージングする過程で発生する高い必要費用と分割技術などで必要となる長い検出時間が限界として認識されている。そのため、かかるデジタルＰＣＲの限界を解消するための開発が行われ続けている。
一方、ＰＣＲは、変性、結合、伸長の３ステップの過程が１サイクルで行われるが、各ステップに適する温度に合わせて温度を迅速に上昇および降下するようにすることが、ＰＣＲ反応時間を短縮するために非常に重要である。しかし、従来に用いられるＰＣＲ装置は、電気エネルギーを熱エネルギー源として使用し、核酸増幅反応を完了するために１時間以上の長い時間がかかり、発熱装置、ヒートシンク（ｈｅａｔ ｓｉｎｋ）などの付属品が必要であるため、装置が体積を多く占めるという不都合がある問題があり、迅速な疾病の診断を要する現場に適用するには多少不便であった。
韓国公開特許２００９‐００２１９５７号公報には、マイクロポリメラーゼ連鎖反応に用いられるマイクロ反応槽チップとマイクロヒータチップを分離作製し、マイクロヒータチップを半永久に使用することで、作製が容易で、大量生産が可能なマイクロポリメラーゼ連鎖反応用チップが開示されているが、金薄膜に電流をかけて熱を発生させるという点で、光エネルギー基盤のＰＣＲに比べて検出時間が長くかかるという限界がある。また、韓国公開特許２０１７‐０１０６９９５号公報には、光エネルギー基盤のＰＣＲシステムが開示されているが、液体状でＰＣＲ反応を行うものであって、一つのチャンバ内で多重
診断が不可能であり、使用されたプライマーの回収が不可能であるという問題がある。
特に、従来のＰＣＲ装置は、高い値段、装置の巨大化、長い検出時間（１時間以上）によって携帯が不便であり、現場での即時診断において限界があり、かかる問題を解決するために、ＰＣＲに関する研究が行われ続けている。
韓国公開特許２００９‐００２１９５７号公報 韓国公開特許２０１７‐０１０６９９５号公報
本発明は、上記のような問題点を解決するために導き出されたものであって、光エネルギーを照射して発生する熱エネルギーを用いた光‐デジタルＰＣＲで極少量の試料だけでも非常に迅速で、高い敏感度を有するＰＣＲ分析が可能であり、且つ、ＰＣＲ蛍光物質の消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）現象を防止して、ＰＣＲ性能を最適化した光‐デジタルＰＣＲチャンバおよび光‐デジタルＰＣＲ機器を提供することを目的とする。
本発明は、透明基板と、前記透明基板上に形成された金属薄膜層と、前記金属薄膜層上に形成された遮光層と、前記遮光層上に形成された微細流路構造体とを含む光‐デジタルＰＣＲチャンバを提供する。
また、本発明は、透明基板、前記透明基板上に形成された金属薄膜層および前記金属薄膜層上に形成された遮光層を含む積層体を含む光‐デジタルＰＣＲ機器を提供する。
本発明の光‐デジタルＰＣＲチャンバを用いる場合、光によって金属薄膜層で急速に発生する熱でＰＣＲ反応を行うことから（光エネルギー基盤のＰＣＲ）、従来に比べて温度の変化をより迅速に調節することができ、従来のＰＣＲ反応より時間をはるかに短縮することができる効果がある。また、前記金属薄膜層をマイクロパターン化すると、温度差による渦流現象が引き起こされ、前記のような温度調節をより迅速に行うことができた。これにより、ＰＣＲ反応時間をより短縮することができる。
なお、光エネルギー基盤のＰＣＲを適用するために形成された金属薄膜層の上に遮光層を導入して、金属薄膜層に照射された光が微細流路構造体にまで逹しないようにすることで、光‐デジタルＰＣＲ過程で用いられるＰＣＲ蛍光物質の消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）現象による光‐デジタルＰＣＲの性能の減少を防止することができる効果がある。したがって、前記のように、光エネルギー基盤のＰＣＲを適用しても、ＰＣＲ蛍光物質が消光されないことから、従来のデジタルＰＣＲに比べてより少ない量の試料でも迅速且つ敏感な定量分析が可能である。
本発明の光‐デジタルＰＣＲチャンバに含まれるガラス基板／金属薄膜層／微細流路構造体を含む積層体を示す図である。 本発明の光‐デジタルＰＣＲチャンバに含まれる微細流路構造体を示す図である。 実験例１によって実施例１の光‐デジタルＰＣＲチャンバを用いた光‐デジタルＰＣＲ反応にかかる時間を示す図である。 実験例１によって比較例３の光‐デジタルＰＣＲチャンバを用いた光‐デジタルＰＣＲ反応にかかる時間を示す図である。 実験例２によって実施例２の光‐デジタルＰＣＲチャンバを用いた光‐デジタルＰＣＲ反応にかかる時間を示す図である。 実験例２によって実施例４の光‐デジタルＰＣＲチャンバを用いた光‐デジタルＰＣＲ反応にかかる時間を示す図である。 実験例３によってマイクロパターン化した金薄膜のダブシル／カルベンの表面処理の概略図および接触角の分析結果を示す図である。 実験例３によってマイクロパターン化した金薄膜のダブシル／カルベンの表面処理光電子分光法の分析結果を示す図である。 実験例４‐１によって光‐デジタルＰＣＲ反応後、蛍光評価を実施した結果を示す図である。 実験例４‐２によって光‐デジタルＰＣＲ反応後、蛍光評価を実施した結果を示す図である。 実験例５によって実施例４の光‐デジタルＰＣＲ反応後、蛍光評価を実施した結果を示す図である。 実験例６‐１によって光‐デジタルＰＣＲ反応後、ＰＣＲ蛍光物質の消光現象防止効果を評価した結果を示す図である。 実験例６‐２によって光‐デジタルＰＣＲ反応後、ＰＣＲ蛍光物質の消光現象防止効果を評価した結果を示す図である。 本発明のマイクロパターン化した金薄膜の表面写真を示す図である。 本発明のマイクロパターン化した金薄膜表面で熱伝達による渦流現象を示す図である。 本発明のマイクロパターン化した金薄膜表面での温度分布を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、検出対象遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の特定の領域を試験管内に大量で増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）する技術であり、その最初のステップは、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させるステップである。二本鎖ＤＮＡは、加熱することで分離することができ、分離したそれぞれのＤＮＡは、鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）としての役割を果たす。変性温度は、一般的に、９０℃～９６℃であるが、ＤＮＡ内にある塩基Ｇ＋Ｃの量とＤＮＡの長さに応じて変化する。ＰＣＲの二番目のステップは、結合（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）するステップである。このステップでは、２種類のプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ）をそれぞれ相補的な鋳型ＤＮＡに結合させる。結合温度は、反応の正確性を決定する重要な要素であるが、仮に、温度を高めすぎると、プライマーが鋳型ＤＮＡに過剰に弱く結合し、増幅したＤＮＡの産物が非常に少なくなる。仮に、温度を下げすぎると、プライマーが非特異的に結合するため、好ましくないＤＮＡが増幅し得る。一般的な結合温度は、５０℃～６５℃である。ＰＣＲの三番目のステップは、伸長（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）ステップである。このステップでは、熱に強いＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）が鋳型ＤＮＡから新たなＤＮＡを作る。この際、伸長温度は、７０℃～７５℃である。前記のように、ＰＣＲ反応は、一連の３ステップがあり、前記の３ステップを１サイクル（ｃｙｃｌｅ）として、約３０～４０サイクル程度繰り返してＰＣＲ反応が行われる。
また、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）は、従来のＰＣＲで使用するプライマーとＰＣＲ蛍光物質（染色試薬）または酵素などの試薬を採用した形態であり、従来のＰＣＲに比べて、正確な定量分析と検出対象核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の高感度探知が可能である。従
来のＰＣＲの結果分析方式がアナログ方式であることに対し、結果信号が「０」または「１」の値を有するデジタル分析方式であるデジタルＰＣＲは、大容量試料の分析、様々な試料の検査および各種の検査項目を一回に行うことができる利点がある。デジタルＰＣＲ技術は、ＤＮＡ試料を標準曲線を要しない単一分子計数法を適用して絶対定量が可能な技術であり、一つのウェル当たり一つの液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）に対するＰＣＲ反応でより正確な絶対定量を行うことができる利点がある。したがって、従来のＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に比べて１０～１，０００ピコリットル（ｐｉｃｏ ｌｉｔｅｒ）程度のサンプルのみをロードしても、ＰＣＲ反応が行われ、検出対象試料の遺伝子を確認することができる。また、従来の一般的なＰＣＲは、一つのウェル（サンプル）当たり一つの反応を行うのに対し、デジタルＰＣＲは、一つのサンプルが多数の区画で分離され、それぞれの区画内に含まれた試料内で単一反応を行うことで、各種の核酸（遺伝子）を分析／確認することができる利点がある。また、従来の一般的なＰＣＲの場合、その結果を必ずアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）に展開した後、蛍光イメージングで観察しなければならず、定量分析自体が不可能であるが、デジタルＰＣＲの場合には、ＰＣＲ分析結果を蛍光分析プログラムを通じてすぐ確認することができ、さらには、定量分析が可能であるという利点がある。
一方、光ＰＣＲ（ｐｈｏｔｏｎｉｃ ＰＣＲ）は、金属薄膜層表面の光子（ｐｈｏｔｏｎ）、電子（ｅｌｅｃｔｒｏｎ）、フォノン（ｐｈｏｎｏｎ）の相互作用によるプラズモン光熱変換を用いたＰＣＲである。具体的には、励起された（ｅｘｃｉｔｅｄ）エネルギー源から光子が金属薄膜層の表面に逹すると、光吸収が行われ、表面辺りで電子をより高い状態に励起し、高温の電子を形成する。かかる高温の電子が金属薄膜層の全体に迅速に拡散し、均一に分布することで、高温の金属表面によって周辺溶液の加熱が可能である。また、高温の電子は、格子フォノンとのエネルギー交換によってまた冷却することができる。前記のように、プラズモン励起された金属薄膜層は、最大５００℃まで昇温し、金属薄膜層周辺のＰＣＲ試料溶液を１５０℃以上まで速い時間内で加熱することができ、非常に迅速にＰＣＲ反応を行うことができる利点がある。
本発明は、前記のようなデジタルＰＣＲの利点と光ＰＣＲの利点をすべて備えたものであり、光ＰＣＲと同じプラズモン光熱変換に基づいてデジタルＰＣＲを行うことができる技術を提供する。これを本発明では、光‐デジタルＰＣＲ技術と称する。
１．光‐デジタルＰＣＲチャンバ
本発明は、光‐デジタルＰＣＲに用いられるチャンバを提供する。
本発明の光‐デジタルＰＣＲチャンバは、透明基板と、前記透明基板上に形成された金属薄膜層と、前記金属薄膜層上に形成された遮光層と、前記遮光層上に形成された微細流路構造体とを含む。
前記透明基板は、前記金属薄膜層が形成された反対の面の下部に位置した一つ以上の光源から照射された光を、前記金属薄膜層に損失なく伝達し、前記金属薄膜層との付着力に優れるように製造され得る。
前記光源は、可視光線または赤外線を発生し得るものであれば、これに限定されず、ハロゲンランプ、ＬＥＤランプ、蛍光灯、白熱ランプ、アークランプ（ａｒｃ ｓｏｕｒｃｅ ｌａｍｐ）、赤外線ランプ、ＨＭＩランプなどを用いることができ、電力効率、または経済的な面で、ＬＥＤランプが好ましい。
前記透明基板は、照射された光を透過させることができるように透明な素材からなることができ、光または熱による変形がほとんど生じない素材からなることができる。好まし
くは、ガラス基板、プラスチック基板（ポリエステル基板、ポリアクリル基板など）またはシリコン基板などであってもよいが、これに限定されるものではない。
前記透明基板は、一定な厚さを有し、前記透明基板の厚さは０．１ｍｍ～１０ｍｍであってもよく、好ましくは０．３ｍｍ～５ｍｍであってもよく、さらに好ましくは０．３ｍｍ～１．５ｍｍであってもよい。前記透明基板の厚さが前記範囲を満たす場合に、光源から照射された光エネルギーによる熱エネルギーが効率的に伝達され、光‐デジタルＰＣＲ反応サイクルを最適化することができる。
前記光‐デジタルＰＣＲチャンバは光エネルギーの照射による熱エネルギーを用いるために金属薄膜層を用いることができる。前記金属薄膜層に備えられた金属薄膜は、瞬間的に温度が最高５００℃以上上昇することができるため、ＰＣＲサイクルの温度範囲（約５０℃～９５℃）内の温度変化を迅速に行うことができる。
特に、従来のペルチェ基盤の１次エネルギーである電圧を加えることで発生する２次熱エネルギーを活用したＰＣＲは、加熱（ｍａｘ．９５℃）／冷やし（６０℃）の繰り返し時間（１秒当たり２～３℃）が相対的に長くなるが、本発明のように光エネルギーを熱エネルギーに置換する金属薄膜層を用いる場合には、温度変化が１秒当たり４～５℃の速度で行われ得るから、ＰＣＲサイクル（加熱／冷やしの繰り返し）４０回基準で約１０～１１分の非常に速い時間内に光‐デジタルＰＣＲ結果を確認することができる。
前記金属薄膜層の金属は、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、金（Ａｕ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、ロジウム（Ｒｈ）およびこれらの組み合わせ（例えば、二元金属ナノ粒子（ｂｉｍｅｔａｌｌｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ））からなる群から選択されるいずれか一つであってもよい。好ましくは、安定性に優れ、光吸収が速い金（Ａｕ）であってもよい。
前記金属薄膜層を前記透明基板の一面にコーティングする方法は、コーティングまたは蒸着技術であれば、これに限定されず、化学的気相蒸着（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ
Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ、ＣＶＤ）、物理的気相蒸着（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ、ＰＶＤ）、熱蒸発真空蒸着（Ｔｈｅｒｍａｌ ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、スパッタリング蒸着（Ｓｐｕｔｔｅｒｉｎｇ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）または原子層蒸着（Ａｔｏｍｉｃ Ｌａｙｅｒ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ、ＡＬＤ）などの方法により前記透明基板に均一な厚さで形成され得る。
前記金属薄膜層の厚さは、１０ｎｍ～２００ｎｍであってもよい。前記金属薄膜層の厚さが前記範囲を超える場合には、光エネルギーによる熱エネルギー転換に伴う温度変化を行うのに問題がある。
また、前記金属薄膜層は、マイクロパターン化することができる。前記金属薄膜層をマイクロパターン化する場合、マイクロパターン化した部分は、温度が急激に上昇し、パターン化していないパターン間の温度は相対的に低くなり、水温の差による渦流現象が発生する。
換言すると、前記のように金属薄膜層をマイクロパターン化する場合、光‐デジタルＰＣＲ反応時に照射される光によって熱エネルギーが発生する部分は、金属薄膜パターンに限定され、金属薄膜パターンの間では熱エネルギーが発生しないため、図１５および図１６のように金属薄膜パターンと金属薄膜パターンとの温度差が発生し、結局渦流現象が発生する。この際、マイクロパターン間の間隔、パターンのサイズおよび形状によって、熱伝達による渦流現状の程度が決定される。
前記マイクロパターンは、円形または三角形、長方形、五角形、六角形などの多角形であってもよい。前記マイクロパターンのサイズは、平均直径または外接円の半径が１μｍ～２０μｍであってもよい。例えば、マイクロパターンが円である場合、直径またはマイクロパターンが多角形である場合、外接円の半径が１μｍ～２０μｍであってもよい。前記マイクロパターン間の平均間隔は、３μｍ～５μｍであってもよい。
前記金属薄膜層をマイクロパターン化する方法は、パターニング（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）技術であれば、これに制限されず、二重露光リソグラフィ（Ｄｏｕｂｌｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）、ナノインプリントリソグラフィ（Ｎａｎｏ Ｉｍｐｒｉｎｔ Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ、ＮＩＬ）、電子ビームリソグラフィ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｂｅａｍ Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ、ＥＢＬ）、集束イオンビーム（Ｆｏｃｕｓｅｄ Ｉｏｎ Ｂｅａｍ、ＦＩＢ）、ソフトリソグラフィ（Ｓｏｆｔ Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ、ＳＬ）、またはブロック共重合体の自己組立などの方法により、前記金属薄膜層をマイクロパターン化することができる。
好ましくは、従来の単一露光リソグラフィ（ｓｉｎｇｌｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）方法ではなく二重露光リソグラフィ（ｄｏｕｂｌｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）方法によってパターン化することが、より均一な間隔を有するパターン形態で鮮明なマイクロパターン化が可能である。
前記遮光層は、前記金属薄膜層上に形成され、光‐デジタルＰＣＲ反応時に試料に含まれたＰＣＲ蛍光物質の消光現象を防止する。
特に、ＰＣＲ結果を確認する時に使用するＰＣＲ蛍光物質は、ＤＮＡ二重結合に自然に結合するが、これらのＰＣＲ蛍光物質は、光エネルギー基盤のＰＣＲでは、ＰＣＲ反応４０サイクル後に添加して結果を確認する時に使用するものであり、ＰＣＲ蛍光物質の光による消光現象が発生する恐れがないが、デジタルＰＣＲでは、ＰＣＲ反応の初期にＰＣＲ蛍光物質を試料にともに含むことで、ＰＣＲ反応４０サイクル後には、ＰＣＲ蛍光物質に消光現象が発生し得る。
前記遮光層は、本発明の光‐デジタルＰＣＲチャンバ内で、前記金属薄膜層と前記微細流路構造体との間に形成され、光源から照射された光が微細流路構造体にまで逹しないようにすることで、本発明の光‐デジタルＰＣＲの性能減少を防止する効果をもたらし、結果として、金属薄膜層だけある場合より限界検出能力が約１０倍以上増加することを確認することができ、このように遮光層を適用することによって非常に少ない極少量（約２ｐｇ／μｌ）の試料だけでも１０倍以上の性能を向上させることができる。
前記遮光層は、ポリドーパミン膜、光触媒有機化合物膜またはダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）有機化合物膜であってもよい。
前記光触媒有機化合物は、Ｍｅｌｅｍおよびｇ‐Ｃ３Ｎ４（ｇｒａｐｈｉｔｉｃ ｃａｒｂｏｎ ｎｉｔｒｉｄｅ）から選択される少なくとも一つを含むことができる。
前記遮光層の厚さは、１ｎｍ～１μｍであってもよい。前記遮光層の厚さが１ｎｍ未満の場合、微細流路構造体に入る光を効果的に遮断することができず、ＰＣＲ蛍光物質の消光が発生し得、１μｍ超の場合、金属薄膜層で光エネルギーから転換された熱エネルギーが、微細流路構造体内のＰＣＲ試料の温度変化を低下させ得る。
前記ダブシルがカルベンと結合して形成されたダブシル層の厚さは、１０ｎｍ未満であ
り、濃度は、１０μＭ～３ｍＭであってもよい。前記ダブシルの濃度が前記範囲を満たす場合に、微細流路構造体に入る光を効果的に遮断して、ＰＣＲ蛍光物質の消光現象を防止することができる。
前記マイクロパターン化した金属薄膜の表面に前記ダブシルを固定化するためのリンカーとして、Ｎ‐ヘテロサイクリックカルベン化合物を用いることができる。前記Ｎ‐ヘテロサイクリックカルベン化合物は、前記マイクロパターン化した金属薄膜の表面に金属‐カルベン結合により導入することができる。
特に、固相ＰＣＲに用いられるチオール（Ｔｈｉｏｌ：‐ＳＨ）基を有するリンカーは、金属‐硫黄結合の高温（７０℃以上）での不安定性（金属‐硫黄結合の破断）のため、ＰＣＲ反応結果の再現性が劣るという問題がある。これとは対照的に、前記ダブシルをマイクロパターン化した金属薄膜に固定化するためのリンカーとして、Ｎ‐ヘテロサイクリックカルベン化合物を用いる場合には、光源による前記マイクロパターン化した金属薄膜の表面温度が一時的に最高５００℃まで上昇しても、金属‐カルベン結合によって高温で安定性を取得することができ、光エネルギーを用いたＰＣＲ装置にも適用が可能であるという利点がある。
前記Ｎ‐ヘテロサイクリックカルベン化合物は、下記化学式１または２で表され得る。
Figure 2022507752000002
Figure 2022507752000003
前記化学式１および２中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、水素、炭素数１～２０のアルキル基、炭素数３～２０のシクロアルキル基、炭素数６～３０のアリール基または炭素数２～３０のヘテロアリール基であるか、
Ｒ４およびＲ９は、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、水素、または炭素数１～２０のアルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０は、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、水素、炭素数１～２０のアルキル基、炭素数３～２０のシクロアルキル基、炭素数６～３０のアリール基、または炭素数２～３０のヘテロアリール基であるか、Ｒ７およびＲ８は、互いに結合して炭化水素環を形成してもよい。
本発明において、「隣接した」基は、当該置換基が置換された原子と直接連結された原子で置換された置換基、当該置換基と立体構造的に最も近く位置した置換基、または当該置換基が置換された原子で置換された他の置換基を意味し得る。例えば、ベンゼンの環において、オルト（ｏｒｔｈｏ）位置に置換された２個の置換基および脂肪族環において、同一炭素で置換された２個の置換基は、互いに「隣接した」基と解釈され得る。
前記アルキル基は、直鎖または分岐鎖であってもよく、炭素数１～２０であってもよく、好ましくは、炭素数１～１０であってもよい。より好ましくは、炭素数１～６であってもよい。前記アルキル基の具体的な例としては、メチル、エチル、プロピル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、ブチル、ｎ‐ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ‐ブチル、ｓｅｃ‐ブチル、１‐メチルブチル、１‐エチルブチル、ペンチル、ｎ‐ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ‐ペンチル、ヘキシル、ｎ‐ヘキシル、１‐メチルペンチル、２‐メチルペンチル、４‐メチル‐２‐ペンチル、３，３‐ジメチルブチル、２‐エチルブチル、ヘプチル、ｎ‐ヘプチル、１‐メチルヘキシル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、オクチル、ｎ‐オクチル、ｔｅｒｔ‐オクチル、１‐メチルヘプチル、２‐エチルヘキシル、２‐プロピルペンチル、ｎ‐ノニル、２，２‐ジメチルヘプチル、１‐エチルプロピル、１，１‐ジメチルプロピル、イソヘキシル、４‐メチルヘキシル、５‐メチルヘキシル、ベンジルなどがあるが、これに限定されるものではない。
前記シクロアルキル基は、炭素数３～２０であってもよく、好ましくは、炭素数３～１０であってもよい。前記シクロアルキル基の具体的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、３‐メチルシクロペンチル、２，３‐ジメチルシクロペンチ
ル、シクロヘキシル、３‐メチルシクロヘキシル、４‐メチルシクロヘキシル、２，３‐ジメチルシクロヘキシル、３，４，５‐トリメチルシクロヘキシル、４‐ｔｅｒｔ‐ブチルシクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどがあるが、これに限定されるものではない。
前記アリール基は、炭素数６～３０であってもよく、好ましくは、炭素数６～１０であってもよい。前記アリール基は、単環式アリール基または多環式アリール基であってもよい。前記単環式アリール基の具体的な例としては、フェニル基、ビフェニル基、テルフェニル基などがあり、前記多環式アリール基の具体的な例としては、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントリル基、ピレニル基、ペリレニル基、クリセニル基、フルオレニル基、トリフェニレン基などがあるが、これに限定されるものではない。
前記ヘテロアリール基は、異種原子として、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、ＳｉおよびＳｅから選択される１個以上を含む芳香族環基であり、炭素数は、２～３０であってもよく、好ましくは、炭素数２～２０であってもよい。前記ヘテロアリール基の具体的な例としては、チオフェン基、フラン基、ピロール基、イミダゾール基、チアゾール基、オキサゾール基、オキサジアゾール基、トリアゾール基、ピリジル基、ピリミジル基、トリアジン基、トリアゾール基、アクリジル基、キノリニル基、キナゾリン基、キノキサリニル基、フタラジニル基、イソキノリン基、インドール基、カルバゾール基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾチアゾール基、ベンゾカルバゾール基、ベンゾチオフェン基、ジベンゾチオフェン基、ベンゾフラニル基などがあるが、これに限定されるものではない。
前記炭化水素環は、脂肪族環または芳香族環であってもよく、前記脂肪族環は、上述のシクロアルキル基を含むことができ、前記芳香族環は、上述のアリール基またはヘテロアリール基を含むことができる。
また、前記アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基または炭化水素環はまたアルキル基、シクロアルキル基、アリール基またはヘテロアリール基で置換または非置換され得る。
前記マイクロパターン化した金属薄膜の表面には、Ｎ‐ヘテロサイクリックカルベン化合物の一末端が結合してもよく、この際、化学的気相蒸着（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ、ＣＶＤ）、物理的気相蒸着（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ
Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ、ＰＶＤ）、熱蒸発真空蒸着（Ｔｈｅｒｍａｌ ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、スパッタリング蒸着（Ｓｐｕｔｔｅｒｉｎｇ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、原子層蒸着（Ａｔｏｍｉｃ Ｌａｙｅｒ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ、ＡＬＤ）、化学溶液蒸着（Ｃｈｅｍｉｃａｌ‐ｂａｔｈ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ、ＣＢＤ）などの方法によって金属‐カルベン結合が形成され得る。
前記Ｎ‐ヘテロサイクリックカルベン化合物の末端は、カルボキシル基（Ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）で官能化されてもよい。
前記Ｎ‐ヘテロサイクリックカルベン化合物の末端に様々なアミンを使用して官能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を行い、アミン層（ａｍｉｎｅ ｌａｙｅｒ）を形成することができる。
前記アミンは、ジアミン、トリアミン、テトラアミン、ペンタアミン、ヘキサアミンまたはこれらの混合物を含むことができる。具体的には、前記アミンは、メチレンジアミン、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、ブチレンジアミン、ヘキサメチルジアミン、アミノエチルエタノールアミン、フェニレンジアミン、ジメチレントリアミン、ジエチレ
ントリアミン、トリエチレンテトラアミン（ＴＥＴＡ）、テトラエチレンペンタアミン（ＴＥＰＡ）、ペンタエチレンヘキサアミン（ＰＥＨＡ）、ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）などであってもよいが、これに限定されるものではない。
前記アミンは、ポリエチレンイミンであってもよく、この場合、重量平均分子量が１，０００～１，０００，０００ｇ／ｍｏｌであってもよい。
前記Ｎ‐ヘテロサイクリックカルベン化合物のアミン層には、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）が結合して固定化することができる。
前記Ｎ‐ヘテロサイクリックカルベン化合物の他末端が前記カルボキシル基で官能化する場合、図７のように、アミンで表面処理を行って官能基をカルボキシル基からアミンに置換することができ、このように形成されたアミン層にダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）を固定化することができる。これにより、一般的に、ダブシルがマイクロパターン化した金属薄膜と静電気的引力によって結合することに比べ、ダブシルがマイクロパターン化した金属薄膜に、より強固な化学的結合で固定化できることから、これを高温の固相のＰＣＲ反応に用いる場合、優れた安定性、貯蔵性および保管容易性が向上する効果がある。
前記微細流路構造体は、前記遮光層上に形成され、本発明の光‐デジタルＰＣＲ反応の効率を極大化することができる。
特に、前記微細流路構造体には、一つ以上の微細流路セットが独立して形成され得る。前記微細流路セットは、一つ以上の試料注入部と、一つ以上の試料抽出部とを含み、前記試料注入部と前記試料抽出部を連結する複数個の微細流路が形成され得る。また、前記微細流路は、一つの幹流路と、前記幹流路に連結されている複数個の枝流路とを含むことができる。かかる形状を有することで、光‐デジタルＰＣＲ反応が行われるホール（ウェル）の個数を極大化することができ、検出対象試料がスムーズに分配され、微細流路構造体内に存在する多数個のホール（ウェル）内でＰＣＲ反応を行うことができる。
また、一つ以上の微細流路セットが独立して形成されることで、それぞれの微細流路セットに含まれた一つ以上の試料注入部に、検出対象試料を独立して注入し、同時に多重光‐デジタルＰＣＲ反応を行うことができる。
前記微細流路構造体の素材は、透明な材質であるか、熱伝導性がある材質であれば、これに限定されず、具体的には、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの成形が可能な高分子物質であってもよい。
前記微細流路構造体の微細流路は、丸底の微細流路断面を有する溝であり、上部に透明フィルムが付着されてもよく、前記微細流路断面のサイズは、幅５μｍ～１００μｍ、高さ５μｍ～１００μｍであってもよい。
具体的には、本発明の光‐デジタルＰＣＲチャンバを用いた光‐デジタルＰＣＲ反応の一連の過程および作用について説明すると、以下のとおりである。
前記光‐デジタルＰＣＲチャンバは、光源に隣接（近接）するように位置し得る。前記光源から発生する光エネルギーが金属薄膜層に逹することができれば、光源の位置は、これに限定されない。ただし、本発明の一実施形態において、前記光‐デジタルＰＣＲチャンバが透明基板／金属薄膜層／遮光層／微細流路構造体のような積層構造である場合に、前記光源は、前記透明基板の下部（透明基板の金属薄膜層が位置した面の反対側）に位置し得る。
例えば、前記光源が本発明の前記光‐デジタルＰＣＲチャンバの透明基板の下部に配置される場合、前記透明基板の下部に位置した光源から出た光エネルギーは、透明基板を透過して金属薄膜層に逹する。前記金属薄膜層に逹した光エネルギーは、金属薄膜層でプラズモン光熱変換が起こることによって熱エネルギーに転換する。この場合、前記金属薄膜層の温度は、最大５００℃まで昇温し、かかる熱エネルギーは、前記微細流路構造体に存在するＰＣＲ試料の温度変化（約５０℃～９５℃）を起こし、変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）ステップのサイクルを繰り返して行うようにし、これによってＤＮＡ（またはＲＮＡ）を増幅させることができる。このように増幅されたＤＮＡ（またはＲＮＡ）は、ＰＣＲ試料内のＰＣＲ蛍光物質の蛍光を検出し、分析することができる。前記金属薄膜層は、より効率的な光熱変換のために、金薄膜を用いることができ、金薄膜をマイクロパターン化することによって、より迅速な温度変化が可能であり、本発明の光‐デジタルＰＣＲ反応時間を短縮することができる。
前記微細流路構造体には、デジタルＰＣＲのために、平均０．５個～１個のコピー数で希釈されるように準備された検出対象遺伝子（鋳型）、プライマー、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ｄＮＴＰおよびＰＣＲ蛍光物質を含む液滴（ＰＣＲ試料）を微細流路構造体に存在するそれぞれのウェルに分配し、前記のような温度変化にしたがってＰＣＲを行った後、蛍光信号が現れるウェルは「１」の値にカウントし、蛍光信号のないウェルは「０」にカウントすることで、絶対定量を行うことができる。
特に、本発明の光‐デジタルＰＣＲチャンバは、デジタルＰＣＲを用いることによって、前記微細流路構造体に存在するＰＣＲ試料にＰＣＲ蛍光物質もともに含まれるが、ＰＣＲ蛍光物質が前記光源からの光によって消光現象が発生することを防止するために、金属薄膜層と微細流路構造体との間に遮光層を含むことで、前記微細流路構造体に存在するＰＣＲ蛍光物質への光を遮断させ、これにより、非常に迅速で、高い敏感度の光‐デジタルＰＣＲ反応が可能である。
上記のように、本発明の光‐デジタルＰＣＲチャンバは、光源が備えられたＰＣＲ装置にはどこでも備えて、光ＰＣＲとデジタルＰＣＲを同時に用いることで、非常に速い時間内で正確且つ定量的なＰＣＲ分析が可能である。
２．光‐デジタルＰＣＲ機器
本発明は、透明基板と、前記透明基板上に形成された金属薄膜層と、前記金属薄膜層上に形成された遮光層とを含む積層体を含む光‐デジタルＰＣＲ機器を提供する。
前記光‐デジタルＰＣＲ機器に含まれた前記積層体を構成する前記透明基板、前記金属薄膜層、前記遮光層は、上述の光‐デジタルＰＣＲチャンバで定義した内容が同様に適用され得る。
前記積層体を含む光‐デジタルＰＣＲ機器は、光源をさらに含むことができる。前記光源は、可視光線または赤外線を発生できるものであれば、これに限定されず、ハロゲンランプ、ＬＥＤランプ、蛍光灯、白熱ランプ、アークランプ（ａｒｃ ｓｏｕｒｃｅ ｌａｍｐ）、赤外線ランプ、ＨＭＩランプなどを用いることができ、電力効率、または経済的な面で、ＬＥＤランプが好ましい。
前記光‐デジタルＰＣＲ機器内で光源の位置は、前記積層体の金属薄膜層に光エネルギーが逹することができれば、これに限定されるものではないが、好ましくは、積層体（透明基板／金属薄膜層／遮光層）の透明基板の下部（透明基板の金属薄膜層が位置した面の
反対側）に位置し、熱エネルギーの伝達を最も効率的にすることができる。
具体的には、本発明の光‐デジタルＰＣＲ機器を用いた光‐デジタルＰＣＲ反応の一連の過程および作用について説明すると、以下のとおりである。
まず、デジタルＰＣＲのために、検出対象遺伝子（鋳型）、プライマー、Ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよびＰＣＲ蛍光物質を含む液滴（ＰＣＲ試料）を準備し、これを微細流路構造体のそれぞれのウェルに分配する。また、準備された微細流路構造体を、前記光‐デジタルＰＣＲ機器内に存在する前記積層体上に配置する。
その後、前記光‐デジタルＰＣＲ機器の光源から発生する光エネルギーが前記積層体の金属薄膜層に逹するようにすると、前記金属薄膜層に逹した光エネルギーは、金属薄膜層でプラズモン光熱変換が起こることによって熱エネルギーに転換する。この場合、前記金属薄膜層の温度は、最大５００℃まで昇温し、かかる熱エネルギーは、前記光‐デジタルＰＣＲ機器の前記積層体上に配置された前記微細流路構造体に存在するＰＣＲ試料の温度変化（約５０℃～９５℃）を引き起こし、前記微細流路構造体のそれぞれのウェルに分配された試料で変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）ステップのサイクルを繰り返して行うようにし、それにより、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を増幅させることができる。この際、ＰＣＲを行った後、蛍光信号の現れるウェルは「１」の値にカウントし、蛍光信号のないウェルは「０」にカウントすることで、絶対定量を行うことができる。前記金属薄膜層は、より効率的な光熱変換のために、金薄膜を用いることができ、金薄膜をマイクロパターン化することで、より迅速な温度変化が可能であり、本発明の光‐デジタルＰＣＲ反応時間を短縮することができる。
特に、本発明の光‐デジタルＰＣＲ機器は、デジタルＰＣＲを用いることによって、前記微細流路構造体に存在するＰＣＲ試料にＰＣＲ蛍光物質もともに含まれるが、ＰＣＲ蛍光物質が前記光源からの光によって消光現象が発生することを防止するために、金属薄膜層と微細流路構造体との間にポリドーパミン膜、光触媒有機化合物膜またはダブシル有機化合物膜の遮光層を含むことで、前記微細流路構造体に存在するＰＣＲ蛍光物質への光を遮断させることによって、非常に極少量の試薬でも、迅速で、高い敏感度の光‐デジタルＰＣＲ反応および分析が可能である。
上記のように、本発明の光‐デジタルＰＣＲ機器で光‐デジタルＰＣＲ反応を行うにあたり、各種のＰＣＲ試薬を含む微細流路構造体を用いることもでき、一つの微細流路構造体内に、多数のウェルを含むことで、各種の検出対象遺伝子、プライマー、ＰＣＲ蛍光物質を含む液滴を分配し、１回に多重ＰＣＲ反応による分析を可能にすることもでき、光ＰＣＲとデジタルＰＣＲを同時に用いることで、非常に速い時間内で正確且つ定量的なＰＣＲ分析が可能である。
以下、好ましい実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。
しかし、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれによって限定されるものではない。
＜製造例＞
＜製造例１＞
鋳型ＤＮＡとして肺癌細胞株であるＡ５４９のｃＤＮＡを用いており、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ、以下のような逆方向プライマーおよび順方向プライマー、ＰＣＲ蛍光物質としてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎが含まれた液状のＰＣＲ反応物Ａを準備した。
＜製造例２＞
鋳型ＤＮＡとして肺癌細胞株であるＡ５４９のｃＤＮＡを用いており、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ、以下のような逆方向プライマーおよび順方向プライマー、ＰＣＲ蛍光物質としてＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎが含まれた液状のＰＣＲ反応物Ｂを準備した。
［液状のＰＣＲ反応物内のプライマー］
‐順方向プライマー：５´‐ＧＡＣＣＣＡＡＴＣＡＴＧＡＧＣＡＣＴＧ‐３´
‐逆方向プライマー：５´‐ＴＧＡＡＧＣＧＡＣＣＣＴＣＴＧＡＴＧ‐３´
Figure 2022507752000004
＜実施例＞
＜実施例１＞
ガラス基板（０．５ｍｍ）上にマイクロパターン化した金薄膜を１６０ｎｍの厚さで化学的気相蒸着方法で形成し、金薄膜上にポリドーパミン膜を形成した後、次いで、その上に微細流路構造体を配置して、積層体を形成した後、製造例１によって製造されたＰＣＲ反応物Ａを含む光‐デジタルＰＣＲチャンバを製造した。
＜実施例２＞
実施例１において、遮光層としてポリドーパミン膜の代わりに、光触媒１有機化合物（Ｍｅｌｅｍ）膜を形成した以外は、前記実施例１と同じ方法で光‐デジタルＰＣＲチャンバを製造した。
＜実施例３＞
実施例１において、遮光層としてポリドーパミン膜の代わりに、光触媒２有機化合物（ｇ‐Ｃ３Ｎ４）膜を形成した以外は、前記実施例１と同じ方法で光‐デジタルＰＣＲチャンバを製造した。
＜実施例４＞
実施例１において、遮光層としてポリドーパミン膜の代わりに、ダブシル有機化合物膜を形成した以外は、前記実施例１と同じ方法で光‐デジタルＰＣＲチャンバを製造した。
＜実施例５＞
実施例１において、製造例１によって製造されたＰＣＲ反応物Ａの代わりに、製造例２によって製造されたＰＣＲ反応物Ｂを用いる以外は、前記実施例１と同じ方法で光‐デジタルＰＣＲチャンバを製造した。
＜実施例６＞
実施例２において、製造例１によって製造されたＰＣＲ反応物Ａの代わりに、製造例２によって製造されたＰＣＲ反応物Ｂを用いる以外は、前記実施例２と同じ方法で光‐デジタルＰＣＲチャンバを製造した。
＜実施例７＞
実施例３において、製造例１によって製造されたＰＣＲ反応物Ａの代わりに、製造例２によって製造されたＰＣＲ反応物Ｂを用いる以外は、前記実施例３と同じ方法で光‐デジタルＰＣＲチャンバを製造した。
＜実施例８＞
実施例４において、製造例１によって製造されたＰＣＲ反応物Ａの代わりに、製造例２によって製造されたＰＣＲ反応物Ｂを用いる以外は、前記実施例４と同じ方法で光‐デジタルＰＣＲチャンバを製造した。
＜比較例１＞
ガラス基板（０．５ｍｍ）上にマイクロパターン化した金薄膜を１６０ｎｍの厚さで化学的気相蒸着方法で形成し、金薄膜上に微細流路構造体を配置して、積層体を形成した後、製造例１によって製造されたＰＣＲ反応物Ａを含む光‐デジタルＰＣＲチャンバを製造した。
＜比較例２＞
比較例１において、製造例１によって製造されたＰＣＲ反応物Ａの代わりに、製造例２によって製造されたＰＣＲ反応物Ｂを用いる以外は、前記比較例１と同じ方法で光‐デジタルＰＣＲチャンバを製造した。
＜比較例３＞
ガラス基板（０．５ｍｍ）上にマイクロパターン化していない金薄膜を１６０ｎｍの厚さで化学的気相蒸着方法で形成し、金薄膜上にポリドーパミン膜を形成した後、次いで、その上に微細流路構造体を配置して、積層体を形成した後、製造例１によって製造されたＰＣＲ反応物Ａを含む光‐デジタルＰＣＲチャンバを製造した。
＜比較例４＞
ガラス基板（０．５ｍｍ）上にマイクロパターン化した金薄膜を１６０ｎｍの厚さで化学的気相蒸着方法で形成した積層体を形成した後、製造例１によって製造されたＰＣＲ反応物Ａを含む光‐デジタルＰＣＲチャンバを製造した。
＜比較例５＞
比較例４において、製造例１によって製造されたＰＣＲ反応物Ａの代わりに、製造例２によって製造されたＰＣＲ反応物Ｂを用いる以外は、前記比較例４と同じ方法で光‐デジタルＰＣＲチャンバを製造した。
＜実験例１＞
金薄膜のマイクロパターン化有無による光‐デジタルＰＣＲ反応時間評価
前記実施例１および比較例３で製造された光‐デジタルＰＣＲチャンバを用いて、光‐デジタルＰＣＲサイクルを４０回行った結果、かかる時間をそれぞれ図３および図４に示した。
前記実施例１、図３および図４によると、金薄膜をマイクロパターン化した実施例１の場合に、４０サイクルの光‐デジタルＰＣＲ反応を行うために１０分の時間がかかるのに対し、金薄膜をマイクロパターン化していない比較例３の場合には、４０サイクルの光‐デジタルＰＣＲ反応を行うために１２分の時間がかかることを確認することができた。
＜実験例２＞
遮光層による光‐デジタルＰＣＲ反応時間評価
前記実施例２および４で製造された光‐デジタルＰＣＲチャンバを用いて、光‐デジタルＰＣＲサイクルを４０回行った結果、かかる時間を図５および図６に示した。
前記実施例２、４、図５および図６によると、マイクロパターン化した金薄膜に光触媒１有機化合物（Ｍｅｌｅｍ）膜を形成した実施例２（図５）の場合、４０サイクルの光‐デジタルＰＣＲ反応を行うために１０分の時間がかかり、遮光層として光触媒１有機化合物膜の代わりにダブシル有機化合物膜を形成した実施例４（図６）の場合に、４０サイクルの光‐デジタルＰＣＲ反応を行うために９分の時間がかかることを確認することができた。
＜実験例３＞
マイクロパターンされた金薄膜のカルベンおよびダブシル表面処理の概略図および表面特性変化検討
前記実施例４および８のダブシル固定化のためのステップ別の概略図と接触角および光電子分光法測定を実施し、表面処理によって表面性質の変化を図７および図８によって確認することができた。
図８によると、金薄膜（Ｂａｒｅ ｇｏｌｄ）でカルベン処理後、Ｎ １ｓ ｎａｒｒｏｗでピークが生成されることによって、金‐カルベン結合が形成されたことを確認することができた。また、ダブシル固定化した金薄膜の場合に、ピーク強度が増加することは、表面処理されていることを意味する。
＜実験例４＞
１．遮光層による光‐デジタルＰＣＲ反応蛍光評価
前記実施例１、２、４および比較例１で製造された光‐デジタルＰＣＲチャンバを用いて、光‐デジタルＰＣＲサイクルを４０回行った後、蛍光顕微鏡を通じて測定した蛍光結果を図９に示した。
２．遮光層による光‐デジタルＰＣＲ反応蛍光評価
前記実施例５、６、８および比較例２で製造された光‐デジタルＰＣＲチャンバを用いて、光‐デジタルＰＣＲサイクルを４０回行った後、蛍光顕微鏡を通じて測定した蛍光結果を図１０に示した。
前記実験例２によると、ポリドーパミン膜を遮光層として用いた実施例１および５、光触媒１有機化合物（Ｍｅｌｅｍ）膜を遮光層として用いた実施例２および６、ダブシル有機化合物膜を遮光層として用いた実施例４および８の場合には、４０サイクルの光‐デジタルＰＣＲ反応を行った後にも、ＰＣＲ蛍光物質の消光現象を防止して、ＰＣＲ反応結果をより正確且つ精密に検出することができることを確認したが、遮光層を用いていない比較例１および２の場合には、ＰＣＲ蛍光物質の消光現象が発生することを確認することができた。
＜実験例５＞
遮光層ダブシル有機化合物濃度によるＰＣＲ蛍光物質（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）に対する光‐デジタルＰＣＲ反応後の消光防止効果評価
実施例４に対して、ダブシル有機化合物の濃度を０ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭに変動しながら光‐デジタルＰＣＲサイクルを４０回行った後、試料内に含まれたＰＣＲ蛍光物質の蛍光強度を測定した結果を図１１に示した。
前記実験例５および図１１によると、ダブシルの濃度が増加するに伴い、消光現象を防
止する効果が向上することが分かる。
＜実験例６＞
１．ＰＣＲ蛍光物質（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）に対する光‐デジタルＰＣＲ反応後の消光防止効果評価
実施例１、２，３、４および比較例４に対して、光‐デジタルＰＣＲサイクルを４０回行った後、試料内に含まれたＰＣＲ蛍光物質の蛍光強度を測定した結果を図１２に示した（ガラス基板を対照群として評価した。）。
２．ＰＣＲ蛍光物質（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）に対する光‐デジタルＰＣＲ反応の消光防止効果評価
実施例５、６、７、８および比較例５に対して、光‐デジタルＰＣＲサイクルを４０回行った後、試料内に含まれたＰＣＲ蛍光物質の蛍光強度を測定した結果を図１３に示した（ガラス基板を対照群として評価した。）。
前記実験例６、図１２および図１３によると、ポリドーパミン膜、光触媒１有機化合物（Ｍｅｌｅｍ）膜、光触媒２有機化合物（ｇ‐Ｃ３Ｎ４）膜またはダブシル有機化合物膜を遮光層として用いた実施例１～８の場合には、光‐デジタルＰＣＲ反応（４０サイクル）後にもＰＣＲ蛍光物質の消光現象を防止する効果に優れることを確認することができた。
以上、本発明は、上述の実施例についてのみ詳細に説明しているが、本発明の技術思想範囲内で様々な変形および修正が可能であることは、当業者にとって明白なことであり、かかる変形および修正が添付の請求の範囲に属することは言うまでもない。

Claims (11)

  1. 透明基板と、
    前記透明基板上に形成された金属薄膜層と、
    前記金属薄膜層上に形成された遮光層と、
    前記遮光層上に形成された微細流路構造体とを含む、光‐デジタルＰＣＲチャンバ。
  2. 前記金属薄膜層は、金薄膜層である、請求項１に記載の光‐デジタルＰＣＲチャンバ。
  3. 前記金属薄膜層は、マイクロパターン化している、請求項１に記載の光‐デジタルＰＣＲチャンバ。
  4. 前記遮光層は、ポリドーパミン膜、光触媒有機化合物膜およびダブシル有機化合物膜から選択される少なくとも一つを含む、請求項１に記載の光‐デジタルＰＣＲチャンバ。
  5. 前記微細流路構造体は、一つ以上の微細流路セットが独立して形成されている、請求項１に記載の光‐デジタルＰＣＲチャンバ。
  6. 前記微細流路セットは、一つ以上の試料注入部と、一つ以上の試料抽出部とを含み、前記試料注入部と前記試料抽出部を連結する複数個の微細流路を含む、請求項５に記載の光‐デジタルＰＣＲチャンバ。
  7. 透明基板と、前記透明基板上に形成された金属薄膜層と、前記金属薄膜層上に形成された遮光層とを含む積層体を含む、光‐デジタルＰＣＲ機器。
  8. 前記金属薄膜層は、金薄膜層である、請求項７に記載の光‐デジタルＰＣＲ機器。
  9. 前記金属薄膜層は、マイクロパターン化している、請求項７に記載の光‐デジタルＰＣＲ機器。
  10. 前記遮光層は、ポリドーパミン膜、光触媒有機化合物膜およびダブシル有機化合物膜から選択される少なくとも一つを含む、請求項７に記載の光‐デジタルＰＣＲ機器。
  11. 前記積層体の透明基板の下部に光源が配置される、請求項７に記載の光‐デジタルＰＣＲ機器。
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