KR101102454B1

KR101102454B1 - 금속―단백질 격자패턴 바이오칩 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101102454B1
Application number: KR1020080066987A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 박태정; 이혜진; 이석재
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2008-07-10
Filing date: 2008-07-10
Publication date: 2012-01-05
Also published as: KR20100006842A

Abstract

본 발명은 금 박막 표면 위에 형성된 단백질 칩을 대체할 수 있는 새로운 디자인의 금속-단백질 격자패턴 바이오칩 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 기질에 SPR(Surface Plasmon Resonance) 광학 특성을 가지는 동시에 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 가지는 금속의 박막을 형성한 뒤, 단백질을 주입하여 격자패턴이 형성된 금속-단백질 격자패턴 바이오칩 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 금속-단백질 격자패턴 바이오칩 및 바이오센서에 따르면 다양한 종류의 단백질이 부착되어 있어,한 번에 여러 종류의 표적 단백질을 검출하는 것이 가능한 효과가 있다. 또한, 금속-단백질 격자패턴의 크기 및 어레이 패턴을 조절함으로써 SPRI, NEDG, LSPR 등과 같은 대부분의 SPR 기반 바이오센서에 다용도로 사용 가능하며, 형광스캐너나 형광현미경에도 사용할 수 있어, 단백질체학, 의료용 진단학, 신약개발 등의 다양한 바이오텍 연구분야에 활용될 수 있다.

바이오센서, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 금속 박막칩, 격자칩, 단백질칩, 어레이 패턴

Description

금속―단백질 격자패턴 바이오칩 및 그 제조방법{Biochip with Metal-Protein Grating Pattern and Method for Preparing Thereof}

본 발명은 금 박막 표면 위에 형성된 단백질 칩을 대체할 수 있는 새로운 디자인의 일회용 금속-단백질 격자패턴 바이오칩 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 기질에 SPR 광학 특성을 가지는 동시에 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 가지는 금속의 박막을 형성한 뒤, 단백질을 주입하여 격자패턴을 형성된 금속-단백질 격자패턴 바이오칩 및 그 제조방법에 관한 것이다.

표면플라즈몬공명 (surface plasmon resonance, SPR) 광학 현상을 이용한 바이오센서 (예: SPR, nanoparticle-enhanced diffraction grating, SPR imaging)는 주로 금속 표면에 여러 가지 방법으로 고정화된 리간드가 미지의 용액 속에 있는 목표 물질과 특이적 결합을 하였을 때 굴절률의 유의한 변화가 나타나 그 물질의 농도, 결합과 해리 과정 등을 실시간 또는 준 실시간으로 측정할 수 있다 (Brockman, et al ., Annu . Rev . Phys . Chem ., 51:41-63, 2000).

SPR 바이오센서의 가장 큰 장점은 비표지 (label-free) 방식의 센서라는 점이며 현재까지 단백질체학, 유전학 연구, 의료 진단 및 신약개발 등을 포함한 다양한 바이오텍 관련 연구 분야 및 식품가공, 환경과학 분야에 이르기까지 유용하게 사용되고 있다(Ince and Narayanaswamy, Anal . Chim . Acta , 569:1-20, 2006; Lee, et al ., Langmuir , 22:5241-5250, 2006).

이러한 SPR 기반 광학센서에 사용되는 금 박막 바이오 칩 (리간드가 고정화되어 있는 표면)의 기본 구조에는 프리즘을 이용한 전반사 지오메트리가 적용된다 (Nelson, et al ., Anal . Chem ., 71:3928-3934, 1999; Phillips, et al ., Anal . Chem., 78:596-603, 2006). 이때 주로 continuous planar thin gold layer를 유리기판에 증착하고 thin gold layer에 분석하고자 하는 시료의 바이오 물질과 특이성 물질과 결합하는 탐침용 바이오리셉터(예: protein, DNA, RNA)를 고정화한다.

대표적인 예가 Biacore 칩의 경우 continuous planar 금박막 위에 덱스트린(dextrin) 고분자로 처리하여 고분자 매트릭스(matrix) 안에 바이오 물질을 고정하는 방법이다(Myszka, et al ., Biophys . Chem ., 64:127-137, 1997). 또한, 기능기가 부착된 리간드는 SAM(self-assembly monolayer)에 의해 목적 바이오물질로 고정화되거나(Wegner, et al ., Anal . Chem ., 75:4740-4746, 2003) 골드 칩 표면에 화학적인 방법 (예를 들면 Amine, Ligand thiol, Aldehyde) 또는 Ni-NTA, Streptavidin, GST 등의 친화성 태그물질로 수식화된다 (Fang and Ewald, Protein Expres. Purif ., 35:17-24, 2004; Hong et al ., Anal . Chem ., 77:7326-7334, 2005; Tomizaki et al ., Chembiochem ., 6:782-799, 2005).

또한 Continuous 금 박막을 사용하지 않는 예도 있는데, SPR의 경우 나노스케일로 금 기판을 glassification하여 사용하거나(Phillips, et al ., Anal . Chem ., 78:596-603, 2006; Phillips, et al ., J. Am . Chem . Soc ., 128:9590-9591, 2006) 또는 cytop과 같은 특수한 소수성 고분자를 이용하여 각각의 array element로 gold dot array를 유리 기판에 형성하여 원하는 gold dot element에 각각의 바이오 물질을 고정할 수도 있다(Wark, et al ., Anal . Chem ., 77:3904-3907, 2005). Continuous 또는 discontinuous 금 박막 필름을 이용하는 모든 경우, SPR imaging 바이오센서에서는 multi-component의 바이오 리셉터를 50 micron 이상의 array 형태의 각 각의 array element에 고정하여 사용하며(Smith and Corn, Appl . Spect ., 57:320A-332A, 2003), NEDG 바이오센서에서는 gold grating pattern을 유리기판 위에 형성하여 grating surface 전체에 한 종류의 바이오리셉터를 고정하여 사용한다(Lee, et al ., Analyst, 133:596601, 2008). 따라서 SPR imaging에서 사용되는 어레이 역시 규칙적인 line 패턴 또는 square 패턴을 형성해야 하므로 큰 격자패턴에 속한다 할 수 있다. SPR 기반 광학 바이오센서의 응용범위와 센서 성능은 이러한 gold 바이오칩의 디자인 (즉 특정 바이오타겟 검출 연구를 위해 탐칩용 바이오리셉터 종류, surface density, bioactivity)에 따라 결정된다.

이에 본 발명자들은 고분자를 이용하여 제조된 광학 프리즘에 광학 특성 및 특정 단백질과의 특이적 결합 특성을 동시에 가지고 있는 금속의 격자패턴을 형성하고 상기 금속의 격자패턴에 단백질을 고정하여 바이오칩을 제조한 결과, 상기 금속-단백질 격자패턴 바이오칩이 대부분의 SPR 바이오센서에 다용도로 사용가능하다 는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 고분자로 제조된 광학 프리즘 또는 유리기판을 이용한 금속-단백질 격자패턴 바이오칩 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 단백질- 금속 격자패턴 바이오칩에 다양한 종류의 바이오 리셉터가 부착되어 있는 금속-단백질 격자패턴 바이오센서를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 고분자로 제조된 광학 프리즘(prism) 또는 유리기판에 금속 박막을 증착시키는 단계; (b) 격자패턴을 가지는 미세유체 채널(microfluidic channel)을 상기 금속 박막에 부착한 뒤, 화학적 에칭(chemical etching)하여, 금속 격자패턴을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 금속 격자패턴에 수직 방향으로 단백질을 주입·고정하는 단계를 포함하는, 금속-단백질 격자패턴 바이오칩의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 고분자로 제조된 광학 프리즘 또는 유리기판에 광절개성(photocleavable) 물질 또는 광반응성 물질을 코팅시키는 단계; (b) 격자패턴을 가지는 포토마스크(photomask)를 이용하여 포토패터닝(photopatterning) 방법으로 격자패턴을 형성하는 단계; (c) 상기 격자패턴 내에 금속 나노 물질을 고정시켜 금속 격자패턴을 제조하는 단계; 및 (d) 상기 금속 격자패턴에 수직 방향으로 단백질 을 주입·고정하는 단계를 포함하는, 금속-단백질 격자패턴 바이오칩의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속박막에 단백질이 고정화되어 격자패턴이 형성된 것을 특징으로 하는 금속-단백질 격자패턴 바이오칩을 제공한다.

본 발명은 또한, SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속-단백질 격자패턴 바이오칩에 바이오 리셉터가 부착된 것을 특징으로 하는 광학분석용 바이오센서를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 광학분석용 바이오센서를 이용하는, 상기 바이오 리셉터와 결합 또는 반응하는 표적 바이오 물질의 검출방법을 제공한다.

본 발명은 (a) 금속 박막에 격자패턴을 형성하는 단계; (b) 상기 격자패턴이 형성된 금속 박막에 핵산을 반응시켜 금속 격자패턴-핵산 복합체를 제조하는 단계; 및 (c) 아민(amine) 및/또는 라이신(lysin)기가 부착된 기질에 상기 금속 격자패턴-핵산 복합체를 고정시켜, 금속 격자패턴을 포함하는 핵산칩을 제조하는 단계를 포함하는 금속 격자패턴-핵산 복합체를 포함하는 핵산칩의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된, SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-핵산 복합체를 포함하는 핵산칩을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-핵산 복합체를 포함하는 핵산칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA 혼성화 반응의 검출방법을 제공한다.

본 발명은 (a) 금속 박막에 격자패턴을 형성하는 단계; (b) 상기 격자패턴이 형성된 금속 박막에 효소를 반응시켜 금속 격자패턴-효소 복합체를 제조하는 단계; 및 (c) 아민(amine) 및/또는 라이신(lysin)기가 부착된 또는 친화성 태그로 수식화된 기질에 상기 금속 격자패턴-효소 복합체를 고정시켜, 금속 격자패턴을 포함하는 단백질칩을 제조하는 단계를 포함하는, 금속 격자패턴-효소 복합체를 포함하는 단백질칩의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-효소 복합체를 포함하는 단백질칩을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-효소 복합체를 포함하는 단백질칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 효소 반응의 검출방법을 제공한다.

본 발명은 (a) 금속 박막에 격자패턴을 형성하는 단계; (b) 상기 격자패턴이 형성된 금속 박막에 항원(또는 항체)을 반응시켜 금속 격자패턴-효소 복합체를 제조하는 단계; 및 (c) 아민(amine) 및/또는 라이신(lysin)기가 부착된 또는 친화성 태그로 수식화된 기질에 상기 금속 격자패턴-항원(또는 항체) 복합체를 고정시켜, 금속 격자패턴을 포함하는 단백질칩을 제조하는 단계를 포함하는, 금속 격자패턴-항원(또는 항체)을 포함하는 단백질칩의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된, SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특 이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-항원(또는 항체) 복합체를 포함하는 단백질칩을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-효소 복합체를 포함하는 단백질칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 항원-항체 반응의 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 금속-단백질 격자패턴 바이오칩 및 바이오센서에 따르면 다양한 종류의 단백질이 부착되어 있어,한 번에 여러 종류의 표적 단백질을 검출하는 것이 가능한 효과가 있다. 또한, 금속-단백질 격자패턴의 크기 및 어레이 패턴을 조절함으로써 SPRI(Surface Plasmon Resonance Imaging), NEDG(Nanoparticle-Enhanced Diffraction Grating), LSPR(Local Surface Plasmon Resonance) 등과 같은 대부분의 SPR 기반 바이오센서에 다용도로 사용 가능하며, 형광스캐너나 형광현미경에도 사용할 수 있어, 단백질체학, 의료용 진단학, 신약개발 등의 다양한 바이오텍 연구분야에 활용될 수 있다.

본 발명은 일 관점에서,(a) 고분자로 제조된 광학 프리즘(prism) 또는 유리기판에 금속 박막을 증착시키는 단계; (b) 미세유체 채널(microfluidic channel)을 상기 금속 박막에 부착한 뒤, 화학적 에칭(chemical etching)하여, 금속 격자패턴 을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 금속 격자패턴에 수직 방향으로 단백질을 주입·고정하는 단계를 포함하는, 금속-단백질 격자패턴 바이오칩의 제조방법에 관한 것이다.

광학특성을 이용한 바이오칩을 제조하기 위하여 고분자로 제조된 광학 프리즘 또는 유리기판을 사용하며, 상기 광학 프리즘은 고분자를 원료로 하여 사출성형법에 의해 제조된다.

본 발명에 있어서, 상기 고분자는 PDMS(polydimethylsiloxane), PS(polystyrene), PMMA(polymethylmetaacrylate) 및 PET(polyethylen terephthalate)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이때, PDMA(poly(dimethylacrylamide))는 1.42의 저굴절률을 가지며, PS(polystyrene)은 1.6의 고굴절률을 가지는 고분자이다. 다시 말해, 본 발명에서 광학 프리즘을 제조하기 위해 사용하는 고분자는 저굴절렬 및 고굴절률을 가지는 고분자가 제한없이 사용될 수 있다. 다시 말해, 굴절률에 따라서 광학적 바이오센서로서의 민감도 및 정확도가 달라질 수 있는데, 각 금속에 따라 최적의 굴절률이 달라질 수 있다. 본 발명에서 광학 프리즘을 제조하기 위해 사용하는 고분자는 저굴절률 및 고굴절률을 가지는 고분자가 제한없이 사용될 수 있어서 금속 종류 및 바이오센서 타입에 따라 상관없이 다양한 형태로 제작이 가능하여 최적의 바이오센서 검출방법을 도출할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 금속은 SPR(Surface Plasmon Resonance) 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 금속은 Ni, Cu, Zn, Au 및 이들의 합금으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 금속 박막을 형성하기 위해서 사용되는 금속은 SPR 광학적 특성 및 특정 단백질, 즉, 6his-tag fusion protein, copper binding protein 및 zinc finger protein 등과 특이적으로 결합하는 특성을 가지는 금속을 사용한다. 예를 들어, 본 발명에서는 6his-tag fusion protein과 특이적으로 결합하는 Ni, copper binding protein과 특이적으로 결합하는 Cu, zinc finger protein과 특이적으로 결합하는 Zn, silica binding protein과 특이적으로 결합하는 Si, silver binding protein과 특이적으로 결합하는 Ag, 및 gold binding protein과 특이적으로 결합하는 Au를 사용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에서는 고분자로 제조된 프리즘 또는 유리기판에 상기 금속 증착시켜서 금속 박막을 형성하며, 이때, 증착은 전자빔 증착기(electron beam evaporator), CVD(Chemical Vapor Deposition), PVD(Physical Vapor Deposition), 조합 액적 화학 증착기, 단순 증착기 등에 의해 수행될 수 있으나, 당업계에서 통상적으로 사용되는 증착방법이라면 제한없이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 금속 박막의 두께는 10~100nm인 것을 특징으로 할 수 있으며, 증착된 금속 박막의 두께가 10nm 미만의 경우 박막을 증착하기가 힘들고, 100nm를 초과하면 SPR 신호검출이 되지 않는 문제점이 있다.

상기와 같은 두께로 증착된 금속 박막에 격자패턴을 형성하기 위해서, 미세유체 채널을 이용한 화학적 에칭을 수행한다. 구체적으로, 금속 박막에 형성하려는 격자패턴과 반대의 형태, 즉, 격자패턴의 양각과 음각 부분이 반대인 형태를 가지는 미세유체 채널을 상기 금속 박막에 부착한 뒤, 화학적 에칭을 수행하여 금속 박막에 격자패턴을 형성하여, 금속 격자패턴 칩을 제조한다. 이때, 화학적 에칭은 당업계에서 통상적으로 수행하는 화학적 에칭을 의미하며, 예를 들어, 진한 염산과 진한 질산의 혼합액인 왕수(aqua regia)를 미세채널 내에 주입하면, 상기 왕수와 맞닿은 금속 박막 부분이 에칭되는 현상을 이용할 수도 있다.

한편, 본 발명에서 사용하는 미세유체 채널은 micron 단위의 미세한 폭의 하나 이상의 채널을 가지며, 상기 채널 사이로 유체를 흘려주어 금속 박막 위에 격자패턴을 형성하기 위해 사용하는 실험장치로서, 미세유세 채널은 당업계에서 통상적으로 사용하는 미세유체 채널이다. 특히, 본 발명에서 사용되는 미세유세 채널은 elastic polymer molding 방법을 이용하여 제조될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니며, 미세유체 채널의 폭은 10~200μm일 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.

화학적 에칭을 통한 금속 격자패턴 칩의 제조 후에, 상기 금속 격자패턴 칩에 상기 격자패턴의 수직 방향(perpendicular)으로 단백질을 주입하여 금속-단백질 격자패턴 바이오칩을 제조한다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질은 펩타이드, 폴리펩타이드, 효소, 항원, 항체, 핵산 및 PNA로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으며, 하나 이상의 다른 종류의 단백질을 금속 격자패턴 칩 상에 고정시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (c)단계에서 미세유체 채널을 금속 격자패턴 칩에 수직 방향으로 부착시켜 단백질을 주입시키는 것은 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 고분자로 제조된 광학 프리즘 또는 유리기판에 광절개성(photocleavable) 물질 또는 광반응성 물질을 코팅시키는 단계; (b) 격자패턴을 가지는 포토마스크(photomask)를 이용하여 포토패터닝(photopatterning) 방법으로 격자패턴을 형성하는 단계; (c) 상기 격자패턴 내에 금속 나노 물질을 고정시켜 금속 격자패턴 칩을 제조하는 단계; 및 (d) 상기 금속의 격자패턴에 수직 방향으로 단백질을 주입·고정하는 단계를 포함하는, 금속-단백질 격자패턴 바이오칩의 제조방법에 관한 것이다.

광학특성을 이용한 바이오칩을 제조하기 위하여, 광학 프리즘 또는 유리기판에 광절개성 물질 또는 광반응성 물질을 코팅시킨다. 이때, 광절개성 물질이란 빛에 의해서 절단될 수 있는 물질을 가리키고, 광반응성 물질이란 빛과 반응하는 물질을 가리키는 것으로, 광반응에 참여하는 광반응성 작용기가 고분자 주사슬에 그라프트(graft) 되어 있는 구조를 가지며 광 조사에 의한 광반응성 작용기의 반응 거동은 주사슬에 의해서 영향을 받는다. 본 발명에서 사용된 광반응성 물질 및 광반응성 물질은 포토마스크와 빛에 의해 기판 상에 격자패턴을 형성한다.

본 발명에 있어서, 상기 광절개성 물질 또는 광반응성 물질은 NVOC-(6-nitoveratryloxycarbonyl-), TBOC-(t-butoxycarbonyl-), DDZ(α, α-dimethyl-dimethoxybenzyloxycarbonyl), 5-bromo-7-nitroindolinyl, o-hyrdoxy-2-methyl cinnamoyl, 2-oxymethylene anthraquinone, 및 NBOC-(2-nitobenzyloxycarbonyl-)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 광절개성 물질 또는 광반응성 물질로 코팅하는 단계를 거친 후, 포토마 스크를 이용하여 포토패터닝 방법으로 격자패턴을 형성한다. 구체적으로, 코팅된 광절개성 물질 또는 광반응성 물질에 형성하고자 하는 격자패턴과 동일한 형태의 격자패턴을 가지는 포토마스크를 올려놓고 어셈블리(assembly)시켜 UV에 5~20분 정도 노출시키면 상기 코팅된 광절개성 물질 또는 광반응성 물질에 격자패턴이 형성된다. 이때, 상기 포토마스크는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것으로서, 본 발명에서 사용하기 위해서는 격자패턴 형태를 가지는 포토마스크를 사용하는 것이 바람직하다.

격자패턴이 형성된 후, 금속 나노 물질을 고정시켜, 금속 격자패턴 칩을 제조한다. 이때, 금속 나노 물질을 고정시키는 방법으로는 어셈블리, 흡착 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 제조방법으로 제조된, SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속박막에 단백질이 고정화되어 격자패턴이 형성된 것을 특징으로 하는 금속-단백질 격자패턴 바이오칩에 관한 것이다.

상기 금속-단백질 격자패턴 바이오칩은 다양한 크기 및 형상의 어레이 패턴이 형성될 수 있어서, SPRI, NEDG, LSPR 등과 같은 대부분의 SPR 기반 바이오센서에 다양도로 사용 가능하다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속-단백질 격자패턴 바이오칩에 바이오 리셉터가 부착된 것을 특징으로 하는 광학분석용 바이오센서에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오 리셉터는 핵산, PNA, 펩타이드, 단백질, 리간드, 항원, 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오 리셉터는 미세유체채널 또는 친화성 태그물질을 이용하여 부착된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 친화성 태그물질은 Ni-NTA, Streptavidin, β-Galactosidase, Protein A, Polyphenylalanine, Polyalanine 및 GST로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 광학분석용 바이오센서를 이용하는, 상기 바이오 리셉터와 결합 또는 반응하는 표적 바이오 물질의 검출방법에 관한 것이다. 상기 광학분석용 바이오센서에는 다양한 바이오 리셉터가 결합되어 있어 상기 바이오 리셉터와 결합 또는 반응하여 나타나는 SPR 신호의 변화를 통해 다양한 표적 바이오 물질을 검출할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 금속 박막에 격자패턴을 형성하는 단계; (b) 상기 격자패턴이 형성된 금속 박막에 핵산을 반응시켜 금속 격자패턴-핵산 복합체를 제조하는 단계; 및 (c) 아민(amine) 및/또는 라이신(lysin)기가 부착된 기질에 상기 금속 격자패턴-핵산 복합체를 고정시켜, 금속 격자패턴을 포함하는 핵산칩을 제조하는 단계를 포함하는, 금속 격자패턴-핵산 복합체를 포함하는 핵산칩의 제조방법에 관한 것이다.

상기 (a) 단계에서 금속 박막에 격자패턴을 형성하는 방법으로는 기판에 금속 박막을 증착시키고, 격자패턴을 가지는 미세유체 채널(microfluidic channel)을 상기 금속 박막에 부착한 뒤, 화학적 에칭(chemical etching)하여 금속 박막에 격자패턴을 형성하는 방법을 이용할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-핵산 복합체를 포함하는 핵산칩에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-핵산 복합체를 포함하는 핵산칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA 혼성화 반응의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 금속 박막에 격자패턴을 형성하는 단계; (b) 상기 격자패턴이 형성된 금속 박막에 효소를 반응시켜 금속 격자패턴-효소 복합체를 제조하는 단계; 및 (c) 아민(amine) 및/또는 라이신(lysin)기가 부착된 또는 친화성 태그로 수식화된 기질에 상기 금속 격자패턴-효소 복합체를 고정시켜, 금속 격자패턴을 포함하는 단백질칩을 제조하는 단계를 포함하는, 금속 격자패턴-효소 복합체를 포함하는 단백질칩의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-효소 복합체를 포함하는 단백질칩에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-효소 복합체를 포함하는 단백질칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 효소 반응의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 금속 박막에 격자패턴을 형성하는 단계; (b) 상기 격자패턴이 형성된 금속 박막에 항원(또는 항체)을 반응시켜 금속 격자패턴-효소 복합체를 제조하는 단계; 및 (c) 아민(amine) 및/또는 라이신(lysin)기가 부착된 또는 친화성 태그로 수식화된 기질에 상기 금속 격자패턴-항원(또는 항체) 복합체를 고정시켜, 금속 격자패턴을 포함하는 단백질칩을 제조하는 단계를 포함하는, 금속 격자패턴-항원(또는 항체)을 포함하는 단백질칩의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-항원(또는 항체) 복합체를 포함하는 단백질칩에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, SPR 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-효소 복합체를 포함하는 단백질칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 항원-항체 반응의 검출방법에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 금속-단백질 격자패턴 바이오칩의 제조(1)

본 실시예에서는 고분자로 제조된 광학 프리즘을 기질로 하여, 금속 박막을 형성한 뒤, 미세유체 채널을 이용하여 금속 격자패턴을 형성하고, 단백질을 주입하여 금속-단백질 격자패턴 바이오칩을 제조하였다. 사용된 원료로서, 고분자는 polystyrene, 금속은 Ni, 단백질은 6Histidine 융합단백질을 사용하였다.

1-1. 고분자 광학 프리즘에 금속 박막 형성

polystyrene을 원료로 하여 사출성형법으로 제조된 광학 프리즘의 한 면에 Ni를 증착시켜 두께 50nm 인 Ni 박막을 형성하였다.

1-2. 화학적 에칭에 의한 금속 박막에 격자패턴 형성

1-1에서 형성된 Ni 박막에 격자패턴을 형성하기 위하여, 우선 형성하고자 하는 격자패턴과 동일한 폭과 간격의 패턴을 가지는 미세유체 채널을 PDMS(polydimethylsiloxane) elastic polymer molding 방법을 이용하여 제작하였다. 상기 제작된 미세유체 채널을 Ni 박막에 부착한 뒤, 상기 미세유체 채널 내로 왕수를 주입하였다. 이때, 왕수와 맞닿은 부분의 Ni 박막이 에칭되어, 상기 미세유체 채널의 격자패턴의 양각과 음각 부분과 반대인 형태의 격자패턴이 형성되었으며, 이를 Ni 격자패턴이라 하였다.

1-3. 패턴이 형성된 금속 박막에 단백질을 주입하여 격자패턴 형성

1-2에서 형성된 격자패턴 상에 새로운 미세유체 채널을 상기 격자패턴에 수직인 방향으로 부착한 뒤, 상기 미세유체 채널 내로 6Histidine 융합단백질을 각각 주입하여, Ni과 6Histidine 융합단백질이 각각 격자패턴을 형성한 Ni-6Histidine 융합단백질 격자패턴 바이오칩을 제조하였다.

실시예 2: 금속-단백질 격자패턴 바이오칩의 제조(2)

본 실시예에서는 유리기판을 기질로 하여, 광절개성 물질을 코팅 한뒤, 포토마스크을 이용하여 포토패터닝 방법으로 격자패턴을 형성하고, 금속을 고정시켜 금속 격자패턴 칩을 제조한 다음, 단백질을 주입하여 금속-단백질 격자패턴 바이오칩을 제조하였다.

2-1. 유리기판에 광절개성 물질 코팅

유리기판의 한 면 전체에 NVOC-를 5nm의 두께로 코팅하였다

2-2. 포토마스크를 이용하여 격자패턴 형성

2-2에서 코팅된 NVOC-에 형성하고자 하는 격자패턴을 가지는 포토마스크를 올려놓고, 어셈블리시켜 UV에 20분정도 노출시킨 후, 격자패턴을 형성시켰다.

2-3. 금속 나노 물질을 고정시켜 금속 격자패턴 칩 제조

2-2에서 형성된 격자패턴 내에 Ni 나노 물질을 흡착시켜 Ni 격자패턴 칩을 제조하였다.

2-4. 단백질을 주입하여 금속-단백질 격자패턴 바이오칩 제조

2-3에서 형성된 Ni 격자패턴 칩 상에 새로운 미세유체 채널을 상기 격자패턴에 수직인 방향으로 부착한 뒤, 상기 미세유체 채널 내로 6Histidine 융합단백질을 각각 주입하여, Ni과 6Histidine 융합단백질이 각각 격자패턴을 형성한 Ni-6Histidine 융합단백질 격자패턴 바이오칩을 제조하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 금속-단백질 격자패턴 바이오칩의 제조과정을 나타낸 개략도이다.

Claims

다음의 단계를 포함하는, 금속-단백질 격자패턴 바이오칩의 제조방법:

(a) 고분자로 제조된 광학 프리즘(prism) 또는 유리기판에 금속 박막을 증착시키는 단계;

(b) 격자패턴을 가지는 미세유체 채널(microfluidic channel)을 상기 금속 박막에 부착한 뒤, 화학적 에칭(chemical etching)하여, 금속 격자패턴을 제작하는 단계; 및

(c) 상기 금속 격자패턴에 수직 방향으로 단백질을 주입·고정하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 고분자는 PDMS(polydimethylsiloxane), PS(polystyrene), PMMA(polymethylmetaacrylate) 및 PET(polyethylen terephthalate)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 금속은 SPR(Surface Plasmon Resonance) 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 금속은 Ni, Cu, Zn, Au 및 이들의 합금으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 펩타이드, 폴리펩타이드, 효소, 항원 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 금속 박막의 두께는 10~100nm인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (c)단계에서 미세유체 채널(microfluidic channel)을 금속 격자패턴에 수직 방향으로 부착시켜 단백질을 주입시키는 것은 특징으로 하는 방법.
다음의 단계를 포함하는, 금속-단백질 격자패턴 바이오칩의 제조방법:

(a) 고분자로 제조된 광학 프리즘 또는 유리기판에 광절개 성(photocleavable) 물질 또는 광반응성 물질을 코팅시키는 단계;

(b) 격자패턴을 가지는 포토마스크(photomask)를 이용하여 포토패터닝(photopatterning) 방법으로 격자패턴을 형성하는 단계;

(c) 상기 격자패턴 내에 금속 나노 물질을 고정시켜 금속 격자패턴을 제작하는 단계; 및

(d) 상기 금속 격자패턴에 수직 방향으로 단백질을 주입·고정하는 단계.
제7항에 있어서, 상기 고분자는 PDMA, PS, PMMA 및 PET로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 금속은 SPR(Surface Plasmon Resonance) 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 금속은 Ni, Cu, Zn 및 Au로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나, 이들의 합금 및 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 단백질은 펩타이드, 폴리펩타이드, 효소, 항원 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 광절개성 물질 또는 광반응성 물질은 NVOC-(6-nitoveratryloxycarbonyl-), TBOC-(t-butoxycarbonyl-), DDZ(α, α-dimethyl-dimethoxybenzyloxycarbonyl), 5-bromo-7-nitroindolinyl, o-hyrdoxy-2-methyl cinnamoyl, 2-oxymethylene anthraquinone, 및 NBOC-(2-nitobenzyloxycarbonyl-)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 (c)단계에서 미세유체 채널(microfluidic channel)을 금속 격자패턴에 수직 방향으로 부착시켜 단백질을 주입시키는 것은 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된, SPR(Surface Plasmon Resonance) 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시 에 가지는 금속 격자패턴에 단백질이 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 금속-단백질 격자패턴 바이오칩.
제15항의 금속-단백질 격자패턴 바이오칩에 바이오 리셉터가 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 광학분석용 바이오센서.
제16항에 있어서, 상기 바이오 리셉터는 핵산, 펩타이드, 단백질, 리간드, 항원, 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 광학분석용 바이오센서.
제16항에 있어서, 상기 바이오 리셉터는 미세유체채널 또는 친화성 태그물질을 이용하여 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 광학분석용 바이오센서.
제18항에 있어서, 상기 친화성 태그물질은 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid), Streptavidin, β-Galactosidase, Protein A, Polyphenylalanine, Polyalanine, 및 GST(Glutathione S-Transferase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 광학분석용 바이오센서.
제16항의 광학분석용 바이오센서를 이용한, 바이오 리셉터와 결합 또는 반응하는 표적 바이오 물질의 검출방법.
다음의 단계를 포함하는 금속 격자패턴-핵산 복합체를 포함하는 핵산칩의 제조방법:

(a) 고분자로 제조된 광학 프리즘(prism) 또는 유리기판에 금속 박막을 증착시키고, 상기 증착된 금속 박막에 격자패턴을 가지는 미세유체 채널을 부착시킨 다음, 화학적 에칭하여 금속 박막에 격자패턴을 형성하는 단계;

(b) 상기 격자패턴이 형성된 금속 박막에 핵산을 반응시켜 금속 격자패턴-핵산 복합체를 제조하는 단계; 및

(c) 아민(amine) 또는 라이신(lysin)기가 부착된 기질에 상기 금속 격자패턴-핵산 복합체를 고정시켜, 금속 격자패턴을 포함하는 핵산칩을 제조하는 단계.
제21항에 있어서, 상기 금속은 SPR(Surface Plasmon Resonance) 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제21항의 방법으로 제조된, SPR(Surface Plasmon Resonance) 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-핵산 복합체를 포함하는 핵산칩.
제23항의 금속 격자패턴-핵산 복합체를 포함하는 핵산칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA 혼성화 반응의 검출방법.
다음의 단계를 포함하는 금속 격자패턴-효소 복합체를 포함하는 단백질칩의 제조방법:

(a) 고분자로 제조된 광학 프리즘(prism) 또는 유리기판에 금속 박막을 증착시키고, 상기 증착된 금속 박막에 격자패턴을 가지는 미세유체 채널을 부착시킨 다음, 화학적 에칭하여 금속 박막에 격자패턴을 형성하는 단계;

(b) 상기 격자패턴이 형성된 금속 박막에 효소를 반응시켜 금속 격자패턴-효소 복합체를 제조하는 단계; 및

(c) 아민(amine) 또는 라이신(lysin)기가 부착된 또는 친화성 태그로 수식화된 기질에 상기 금속 격자패턴-효소 복합체를 고정시켜, 금속 격자패턴을 포함하는 단백질칩을 제조하는 단계.
제25항에 있어서, 상기 금속은 SPR(Surface Plasmon Resonance) 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제25항의 방법으로 제조된, SPR(Surface Plasmon Resonance) 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-효소 복합체를 포함하는 단백질칩.
제27항의 SPR(Surface Plasmon Resonance) 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-효소 복합체를 포함하는 단백질칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 효소 반응의 검출방법.
다음의 단계를 포함하는 금속 격자패턴-항원 또는 금속 격자패턴-항체를 포함하는 단백질칩의 제조방법:

(a) 고분자로 제조된 광학 프리즘(prism) 또는 유리기판에 금속 박막을 증착시키고, 상기 증착된 금속 박막에 격자패턴을 가지는 미세유체 채널을 부착시킨 다음, 화학적 에칭하여 금속 박막에 격자패턴을 형성하는 단계;

(b) 상기 격자패턴이 형성된 금속 박막에 항원 또는 항체를 반응시켜 금속 격자패턴-항원 복합체 또는 금속 격자패턴-항체 복합체를 제조하는 단계; 및

(c) 아민(amine) 또는 라이신(lysin)기가 부착된 또는 친화성 태그로 수식화된 기질에 상기 금속 격자패턴-항원 복합체 또는 금속 격자패턴-항체 복합체를 고정시켜, 금속 격자패턴을 포함하는 단백질칩을 제조하는 단계.
제29항에 있어서, 상기 금속은 SPR(Surface Plasmon Resonance) 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제29항의 방법으로 제조된, SPR(Surface Plasmon Resonance) 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-항원 복합체 또는 금속 격자패턴-항체 복합체를 포함하는 단백질칩.
제31항의 SPR(Surface Plasmon Resonance) 광학 특성 및 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 특성을 동시에 가지는 금속 격자패턴-항원 복합체 또는 금속 격자패턴-항체 복합체를 포함하는 단백질칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 항원-항체 반응의 검출방법.