JP2022177806A - 皮膚弾力増進又は皮膚しわ改善用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】皮膚弾力増進又は皮膚しわ改善用組成物を提供すること。【解決手段】一側面において、本開示の有効成分である２-イソプロピルリンゴ酸、その塩、水和物又は溶媒和物は、皮膚一次繊毛を活性化し且つＭＭＰ-１の発現を抑制して皮膚弾力を増進させ且つ皮膚しわを改善することができる。また、一側面において、本開示の有効成分である２-イソプロピルリンゴ酸、その塩、水和物又は溶媒和物は安全な物質であって化粧料、食品などの種々の形態で生体に処理され得るという利点がある。【選択図】図１

Description

本明細書は、皮膚弾力増進又は皮膚しわ改善用組成物に関する。

皮膚は、人体の最外郭に存在する器官であって、各種の外部刺激から人体を保護する役割をする。このような皮膚の構成層のうちの表皮は、体内の水分の蒸発を防止する役割をする。表皮は、外側から順に角質層、顆粒層、有棘層、基底層からなり、角質層の細胞はレンガのような働きをし、角質細胞間の細胞間脂質はモルタルのような働きをして皮膚バリアを構成する。

紫外線、浮遊粒子状物質のような外部刺激と、腸内微生物が作り出す代謝体やストレスホルモンなどのような内的な原因によって皮膚の正常機能が低下して、弾力損失、角質化、しわ生成などの現象が促進されることが知られているが、これらを調節できる解決策はほとんどないのが実情である。

一次繊毛（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｉｌｉａ）は、バイオアンテナであって細胞が周辺環境の変化に合わせて行動するうえで重要な役割をする細胞構造体である。皮膚においてかかる一次繊毛が活性化すると、角質を円滑に作って皮膚バリアを堅固にし、且つ過度なメラニン生成を防止するなどの皮膚に好適な効果を奏すると知られている。

本発明者らは、皮膚弾力増進と皮膚しわ改善を図り得る方法について鋭意研究を重ねた結果、２-イソプロピルリンゴ酸が一次繊毛を活性化して皮膚弾力増進と皮膚しわ改善に効果があることを見出して本発明を完成するに至った。

韓国公開特許第１０－２０２１－００３９７３９号公報

一側面において、本開示は、皮膚弾力増進又は皮膚しわ改善用組成物を提供することを目的とする。

一側面において、本開示は、２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物を有効成分として含む、皮膚弾力増進又は皮膚しわ改善用組成物を提供する。

例示的な一具現例において、前記２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物組成物は、１．７～２７ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与されてよい。

例示的な一具現例において、前記組成物は、一次繊毛を活性化するものであってよい。

例示的な一具現例において、前記組成物は、ＭＭＰ-１酵素の発現を抑制するものであってよい。

例示的な一具現例において、前記皮膚しわは、浮遊粒子状物質による皮膚しわであってよい。

例示的な一具現例において、前記組成物は、食品組成物又は化粧料組成物であってよい。

一側面において、本開示は、２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物を有効成分として含む、皮膚一次繊毛活性化用組成物を提供する。

例示的な一具現例において、前記皮膚一次繊毛活性化は、浮遊粒子状物質によって抑制された皮膚一次繊毛の活性化であってよい。

例示的な一具現例において、前記組成物は、皮膚一次繊毛の生成を増進させるものであってよい。

例示的な一具現例において、前記組成物は、食品組成物、化粧料組成物又は薬学組成物であってよい。

他の側面において、本開示は、２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物を有効成分として含む、浮遊粒子状物質に対する皮膚防御力増進用組成物を提供する。

一側面において、本開示に係る組成物は、副作用がなく且つ皮膚弾力を増進させて皮膚しわを改善する効果に優れる。

一側面において、本開示に係る組成物は、ＭＭＰ-１酵素の発現を抑制することができる。

一側面において、本開示に係る組成物は、皮膚一次繊毛を活性化することができる。

一側面において、本開示に係る組成物は、浮遊粒子状物質に対する皮膚防御力を増進させることができる。

本開示の一具現例に係る２-イソプロピルリンゴ酸の細胞毒性を測定した結果である。 本開示の一具現例に係る２-イソプロピルリンゴ酸を一次繊毛モデル細胞に対し処理し、蛍光顕微鏡で観察した結果である。 本開示の一具現例に係る２-イソプロピルリンゴ酸を一次繊毛モデル細胞に対し処理し、一次繊毛の生成の割合及び一次繊毛の長さを測定して、その結果を示したグラフである。 本開示の一具現例に係る２-イソプロピルリンゴ酸を浮遊粒子状物質に露出した一次繊毛モデル細胞に対し処理し、蛍光顕微鏡で観察した結果である。 本開示の一具現例に係る２-イソプロピルリンゴ酸を浮遊粒子状物質に露出した一次繊毛モデル細胞に対し処理し、一次繊毛の生成の割合及び一次繊毛の長さを測定して、その結果を示したグラフである。 本開示の一具現例に係る２-イソプロピルリンゴ酸のｃ-Ｊｕｎリン酸化抑制効果を測定した結果である。 本開示の一具現例に係る２-イソプロピルリンゴ酸のＭＭＰ-１の発現抑制効果を測定した結果である。 本開示の一具現例に係る２-イソプロピルリンゴ酸のコラーゲン生成促進効果を測定した結果である。 本開示の一具現例に係る２-イソプロピルリンゴ酸の炎症性サイトカイン抑制効果を測定した結果である。 本開示の一具現例に係る２-イソプロピルリンゴ酸のＭＭＰ-１の発現抑制効果を人工皮膚モデルで測定した結果である。 本開示の一具現例に係る２-イソプロピルリンゴ酸を処理した人工皮膚モデルにおけるＭＭＰ-１の発現量を定量化したグラフである。

以下、本発明を詳しく説明する。

一側面において、本開示は、２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物を有効成分として含む、皮膚弾力増進又は皮膚しわ改善用組成物を提供する。

本明細書において、２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）は、下記の化学式１で表されてよい。

本明細書において、「塩」は、医薬、化粧品及び食品で許容可能であり且つ親化合物（ｐａｒｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の好ましい活性を有する本発明の一側面に係る塩を意味する。前記塩は、（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸から形成されるか、又は酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンテンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２－エタン－ジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４－クロロベンゼンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、４－トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４－メチルビシクロ［２，２，２］－ｏｃｔ－２－エン－１-カルボン酸、グルコヘプトン酸、３－フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ－ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などのような有機酸から形成される酸付加塩；又は、（２）親化合物に存在する酸性プロトンが置換されるときに形成される塩を含んでよい。また、前記塩は、薬学的に許容可能な塩であってよい。

本明細書において「薬学的に許容可能」とは、通常の医薬的服用量（Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｄｏｓａｇｅ）で用いる際に相当な毒性効果を避けることにより、動物、より具体的には、ヒトに用いることができるという政府又はこれに準ずる規制機構の承認を受けることができ、又は承認を受け、又は薬局方に列挙され、又はその他一般的な薬局方に記載されたものと認定されることを意味する。

本明細書において「水和物（ｈｙｄｒａｔｅ）」は、水が結合している化合物のことを意味し、水と化合物との間で化学的な結合力のない内包化合物を含む広範な概念である。

本明細書において「溶媒和物」は、溶質の分子やイオンと溶媒の分子やイオンとの間で生じた高次の化合物のことを意味する。

本明細書において「有効成分」は、単独で目的とする活性を示すか、又はそれ自体活性のない担体と共に活性を示し得る成分のことを意味する。

本明細書において「皮膚」とは、動物の体表を覆う組織のことを意味し、顔又はボディーなどの体表を覆う組織だけではなく、頭皮や毛髪を含む最広義の概念である。
本明細書において、「皮膚防御力」は、外部の刺激、毒素から皮膚を保護する能力であり、前記刺激は、浮遊粒子状物質、細菌、ウイルス、紫外線、乾燥、傷などの皮膚に有害な刺激をいずれも含む広範な概念である。

一具現例において、前記組成物の投与による２-イソプロピルリンゴ酸、その塩、水和物又は溶媒和物は、１．７～２７ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与されてよい。前記組成物の投与による２-イソプロピルリンゴ酸、その塩、水和物又は溶媒和物の投与量が１．７ｍｇ／ｋｇ／日未満の場合、皮膚弾力増進又は皮膚しわ改善効果を奏し難く、２７ｍｇ／ｋｇ／日超の場合、皮膚に刺激を与え得る。具体的に、前記組成物の投与による２-イソプロピルリンゴ酸、その塩、水和物又は溶媒和物の投与量は、１．７ｍｇ／ｋｇ／日以上、２ｍｇ／ｋｇ／日以上、２．５ｍｇ／ｋｇ／日以上、３ｍｇ／ｋｇ／日以上、３．５ｍｇ／ｋｇ／日以上、４ｍｇ／ｋｇ／日以上、４．５ｍｇ／ｋｇ／日以上、５ｍｇ／ｋｇ／日以上、５．５ｍｇ／ｋｇ／日以上、６ｍｇ／ｋｇ／日以上、６．５ｍｇ／ｋｇ／日以上、７ｍｇ／ｋｇ／日以上、７．５ｍｇ／ｋｇ／日以上、８ｍｇ／ｋｇ／日以上、８．５ｍｇ／ｋｇ／日以上、９ｍｇ／ｋｇ／日以上、９．５ｍｇ／ｋｇ／日以上、１０ｍｇ／ｋｇ／日以上、１０．５ｍｇ／ｋｇ／日以上、１１ｍｇ／ｋｇ／日以上、１１．５ｍｇ／ｋｇ／日以上、１２ｍｇ／ｋｇ／日以上、１２．５ｍｇ／ｋｇ／日以上、又は１３ｍｇ／ｋｇ／日以上であり、且つ２７ｍｇ／ｋｇ／日以下、２６．５ｍｇ／ｋｇ／日以下、２６ｍｇ／ｋｇ／日以下、２５．５ｍｇ／ｋｇ／日以下、２５ｍｇ／ｋｇ／日以下、２４．５ｍｇ／ｋｇ／日以下、２４ｍｇ／ｋｇ／日以下、２３．５ｍｇ／ｋｇ／日以下、２３ｍｇ／ｋｇ／日以下、２２．５ｍｇ／ｋｇ／日以下、２２ｍｇ／ｋｇ／日以下、２１．５ｍｇ／ｋｇ／日以下、２１ｍｇ／ｋｇ／日以下、２０．５ｍｇ／ｋｇ／日以下、又は２０ｍｇ／ｋｇ／日以下であってよい。

一具現例において、前記有効成分は、一次繊毛を活性化してよい。本明細書において一次繊毛を活性化するということは、細胞において一次繊毛の生成を促進したり一次繊毛の長さを増進させたりすることを意味し得る。

本明細書において「一次繊毛」は、細胞体から突出した小器官であって、化学的刺激、物理的刺激、光、浸透圧、流体の流れ、及び重力信号などを含む多様な外部刺激を感知する細胞小器官のことをいう。皮膚一次繊毛の活性が抑制されると、皮膚色素沈着、炎症性皮膚炎などが誘発することがある。

一具現例において、前記有効成分は、浮遊粒子状物質によって抑制された一次繊毛の生成を増加させてよい。

一具現例において、前記有効成分は、ＭＭＰ-１（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ-１）酵素の発現を抑制してよい。

一具現例において、前記皮膚しわは、浮遊粒子状物質による皮膚しわであってよい。

本明細書において「浮遊粒子状物質」とは、人間の目に見えない極めて小さな物質で、大気中に長い間浮遊する又は散乱する粒子状の物質のことを意味する。具体的に、前記浮遊粒子状物質の粒子の大きさは、粒径が１０μｍ以下（ＰＭ１０）、より具体的に、２．５μｍ以下（ＰＭ２．５）であってよい。特に粒径が２．５μｍ以下（ＰＭ２．５）である粒子状の物質は「微小粒子状物質」といい、本明細書において「浮遊粒子状物質」は「微小粒子状物質」も含むものと意図される。

一具現例において、前記組成物は、化粧料組成物であってよい。前記化粧料組成物は、例えば、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、アイクリーム、アイエッセンス、エッセンス、クレンジングクリーム、クレンジングローション、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーエッセンス、ボディー洗浄剤、染毛剤、シャンプー、リンス、整髪剤、養毛剤、軟膏、ゲル、クリーム、パッチ、噴霧剤、粉末剤及び皮膚貼付タイプなどの剤形を有してよいが、これらに限定されない。

また、それぞれの剤形において、前記の必須成分以外の他の成分を、外用剤の種類又は使用目的などに応じて、当業者が難なく適宜選定して配合してよい。

前記化粧料組成物は、局所適用に適合したあらゆる剤形で提供されてよい。例えば、溶液、 水相に油相を分散させて得たエマルジョン、油相に水相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、固体、ゲル、粉末、ペースト、マイクロニードル、泡沫（ｆｏａｍ）又はエアロゾル組成物の剤形で提供されていてよい。このような剤形の組成物は、当該分野の通常の方法に従って製造されてよい。

本明細書に係る化粧料組成物には、本明細書の化合物の他、機能性添加物及び一般的な化粧料組成物に含まれる成分が更に含まれてよい。前記機能性添加物としては、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質及び海草エキスからなる群より選択された成分を含んでいてよい。本明細書に係る化粧料組成物は、主効果を損なわない範囲内で、好ましくは、主効果に相乗効果を与え得る他の成分を含んでよい。さらに、本明細書に係る化粧料組成物は、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、有機及び無機顔料、香料、冷感剤、又は制汗剤を更に含んでよい。これらの成分の配合量は、本明細書の目的及び効果を損なわない範囲内で当業者が容易に選定可能であり、それらの配合量は、組成物の全重量を基準に０．００１～１０重量％、具体的に、０．０１～３重量％であってよい。

一具現例において、前記組成物は、食品組成物であってよい。前記食品組成物の剤形は、特に限定されないが、例えば、錠剤、顆粒剤、丸剤、粉末剤、ドリンク剤といった液剤、キャラメル、ゲル、バー、ティーバッグなどに剤形化されてよい。各剤形の食品組成物は、有効成分の他、当該分野において通常用いられる成分を剤形又は使用目的に応じて当業者が難なく適宜選定して配合してよく、他の原料と併せて適用すると相乗効果が生じることもある。

一具現例に係る食品組成物は、種々の栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含んでよい。また、一具現例に係る食品組成物は、天然果物ジュース並びに果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含んでよい。これらの成分は、独立で、或いは組み合わせて用いてよい。これらの添加剤の割合はそれほど重要ではないが、一具現例に係る組成物１００質量部当たり０～約５０重量部の範囲で含まれるのが一般的である。

一具現例において、前記組成物は、薬学組成物であってよい。前記薬学組成物は、アトピー皮膚炎、乾癬、湿疹又は紅潮の予防又は治療用組成物であってよい。前記薬学組成物は、経口、非経口、直腸、局所、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下などに投与されてよい。経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質及び硬質カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、液剤、乳濁剤又はペレット剤であってよいが、これらに制限されるものではない。非経口投与のための剤形は、溶液剤、懸濁剤、乳液剤、ゲル、注射剤、点滴剤、坐剤、パッチ又は噴霧剤であってよいが、これらに制限されるものではない。前記剤形は、当該分野における通常の方法によって容易に製造でき、界面活性剤、賦形剤、水和剤、乳化促進剤、懸濁剤、浸透圧調節のための塩又は緩衝剤、着色剤、香辛料、安定化剤、防腐剤、保存剤又はその他常用する補助剤を更に含んでよい。

他の側面において、本開示は、２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物を有効成分として含む、皮膚一次繊毛活性化用組成物を提供する。

一具現例において、前記皮膚一次繊毛活性化は、浮遊粒子状物質によって抑制された皮膚一次繊毛の活性化であってよい。皮膚が浮遊粒子状物質に露出すると、皮膚一次繊毛の生成が抑制され且つその長さが減少するようになる。本開示に係る組成物は、このように浮遊粒子状物質によって皮膚一次繊毛の生成が抑制されることを防いで皮膚一次繊毛の生成を増進させ、且つ浮遊粒子状物質に露出した皮膚一次繊毛の長さを増加させる。

一具現例において、前記有効成分は、皮膚一次繊毛の生成を増進させてよい。

他の側面において、本開示は、２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物を有効成分として含む、浮遊粒子状物質に対する皮膚防御力増進用組成物を提供する。

他の側面において、本開示は、皮膚弾力増進又は皮膚しわ改善用組成物の製造のための２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）又はその塩、水和物又は溶媒和物の用途を提供する。

他の側面において、本開示は、有効量の２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物を含む組成物を、皮膚弾力増進又は皮膚しわ改善を必要とする対象体に投与するステップを含む、皮膚弾力の増進又は皮膚しわの改善方法を提供する。

他の側面において、本開示は、皮膚一次繊毛活性化用組成物の製造のための２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物の用途を提供する。

他の側面において、本開示は、有効量の２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物を含む組成物を、皮膚一次繊毛活性化を必要とする対象体に投与するステップを含む、皮膚一次繊毛の活性化方法を提供する。

他の側面において、本開示は、浮遊粒子状物質に対する皮膚防御力増進用組成物の製造のための２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物の用途を提供する。

他の側面において、本開示は、有効量の２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物を含む組成物を、浮遊粒子状物質に対する皮膚防御力増進を必要とする対象体に投与するステップを含む、浮遊粒子状物質に対する皮膚防御力の増進方法を提供する。

以下、実施例などを通じて本発明をより詳しく説明することにする。なお、これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであるに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではないということは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。

［実験例１］細胞毒性測定
ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）が１０％入っているＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）にヒト由来線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を入れ、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。該培養したヒト由来線維芽細胞に対し、２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）を濃度別（１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１０００μＭ）に２４時間処理した。ＣＣＫ-８試薬（Ｄｏｎｊｉｎｄｏ社、ＣＫ０４）を１／１０に希釈してＤＭＥＭ培地に３時間処理してから４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、その結果を図１に示した。

［実験例２］一次繊毛活性化評価
２-イソプロピルリンゴ酸の一次繊毛活性化効果を確認するために、一次繊毛モデル細胞のＲＰＥ／Ｓｍｏ-ＧＦＰを準備した。具体的に、Ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ-ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ（ＲＰＥ）ｃｅｌｌ（ＡＴＣＣ社）にＳｍｏ-ＧＦＰ ｐｌａｓｍｉｄ（Ａｄｄｇｅｎｅ社）を形質転換してＲＰＥ／Ｓｍｏ-ＧＦＰを準備した。ＲＰＥ／Ｓｍｏ-ＧＦＰに対し、２-イソプロピルリンゴ酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を濃度別（２０μＭ、１００μＭ）に２４時間処理してから、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ., Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ｎｙ）で一次繊毛生成の割合と一次繊毛の長さを測定し、その結果を図２及び３に示した。一次繊毛の生成割合は、全体細胞数に対する一次繊毛を有する細胞数の割合を％で示し、一次繊毛の長さは、顕微鏡上で観察される全ての繊毛の実体長さを測定したものである。陽性対照群としては、一次繊毛生成促進物質のＳＡＧ（ＳＭＯ ａｇｏｎｉｓｔ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いた。

図２中の白い矢印は一次繊毛を示し、図２及び３から確認できるように、２-イソプロピルリンゴ酸（２-ＩＭＰＡ）が処理されると、対照群に比べて統計的に有意に一次繊毛を有する細胞の割合が増加し且つ繊毛の長さも長くなることを確認することができた。

［実験例３］浮遊粒子状物質によって抑制された一次繊毛の活性化評価
実験例２における一次繊毛モデル細胞のＲＰＥ／Ｓｍｏ-ＧＦＰに対して浮遊粒子状物質（ＰＭ２．５）を処理した。具体的に、浮遊粒子状物質としては、テフロン（登録商標）フィルタ（Ｔｅｆｌｏｎ ｆｉｌｔｅｒ、Ｚｅｆｌｕｏｒ、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）を用いて空気中（３７．３４°Ｎ、１２７．２７°Ｅ、１６７ ｍ ａｂｏｖｅ ｓｅａ ｌｅｖｅｌ）に存在するものを直接捕集し、これを細胞培養培地に対して５０μｇ／ｍｌの濃度で処理した。その後、２-イソプロピルリンゴ酸１００μＭを２４時間処理してからＳｍｏ-ＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡を用いて目視にて観察した後、一次繊毛生成の割合と一次繊毛の長さを測定し、その結果を図４及び５に示した。一次繊毛の生成の割合は、全体細胞数に対する一次繊毛を有する細胞数の割合を％で示し、一次繊毛の長さは、顕微鏡上で観察される全ての繊毛の実体長さを測定したものである。陽性対照群では一次繊毛生成促進物質のＳＡＧ（ＳＭＯ ａｇｏｎｉｓｔ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いた。

図４及び５から確認できるように、浮遊粒子状物質を処理すると一次繊毛の生成が抑制されるが、２-イソプロピルリンゴ酸を処理すると、浮遊粒子状物質によって抑制された一次繊毛の生成が回復し且つ一次繊毛の長さも長くなることを確認することができた。

［実験例４］バイオマーカーの発現変化評価
ヒト由来線維芽細胞（ＬＯＮＺＡ社）に対して浮遊粒子状物質（ＰＭ２．５）を処理した。その後、２-イソプロピルリンゴ酸１００μＭを２４時間処理してからセルライセート（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を作りタンパク質定量をして同量のタンパク質を電気泳動で分離した。その後、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）でｃ-Ｊｕｎ、ｐ-ｃ-Ｊｕｎ（リン酸化されたｃ-Ｊｕｎ）、ＭＭＰ-１及びコラーゲンに特異的な抗体を用いて抗原-抗体反応で各タンパク質の発現を測定し、その結果をそれぞれ図６～８に示した。

図６から確認できるように、浮遊粒子状物質を処理するとｃ-Ｊｕｎのリン酸化が促進されてｐ-ｃ-Ｊｕｎの量が増加するが、２-イソプロピルリンゴ酸を処理すると、浮遊粒子状物質によるｃ-Ｊｕｎのリン酸化が抑制されることを確認することができた。このような効果は、ｃ-Ｊｕｎのリン酸化を抑制すると知られた物質のＳＰ６００１２５（ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ社）と類似である。ｃ-Ｊｕｎのリン酸化が促進すると一次繊毛生成が抑制され、２-イソプロピルリンゴ酸はｃ-Ｊｕｎのリン酸化を抑制して一次繊毛を活性化させることが分かった。

図７及び８から確認できるように、浮遊粒子状物質を処理するとコラーゲンを分解する酵素のＭＭＰ-１の発現は増加しコラーゲンは減少するが、２-イソプロピルリンゴ酸を処理すると、ＭＭＰ-１は減少しコラーゲンは増加することを確認することができた。

［実験例５］ＩＬ-６及びＴＮＦ-αの発現変化評価
ヒト由来線維芽細胞（ＬＯＮＺＡ社）をＩＦＴ８８に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＩＦＴ８８）又はスクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣ）でそれぞれトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）させてから、浮遊粒子状物質（ＰＭ２．５）５０μｇ／ｍＬ及び２-イソプロピルリンゴ酸１００μＭを２４時間処理した。その後、ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙにて培養条件で炎症性サイトカインであるＩＬ-６及びＴＮＦ-αの発現水準を測定し、その結果を図９に示した。

図９から確認できるように、浮遊粒子状物質を処理するとＩＬ-６とＴＮＦ-αの発現が増加するが、２-イソプロピルリンゴ酸を処理すると、浮遊粒子状物質によって増加していたＩＬ-６とＴＮＦ-αの発現が低下することを確認することができた。また、一次繊毛の形成に重要な役割をするＩＦＴ８８を枯渇させるｓｉＲＮＡ（ｓｉＩＦＴ８８）にトランスフェクションされた群ではＩＬ-６とＴＮＦ-αの発現が高い水準で見られた。これらの結果から、２-イソプロピルリンゴ酸は、浮遊粒子状物質が処理された線維芽細胞において一次繊毛の生成を促進させて抗炎症効果を示すことを確認することができた。

［実験例６］人工皮膚モデルにおけるＭＭＰ-１発現抑制評価
２-ＩＰＭＡが皮膚に及ぼす影響を全層ヒト三次元-皮膚モデル（ｆｕｌｌ-ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｈｕｍａｎ ｔｈｒｅｅ-ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ（３-Ｄ）-ｓｋｉｎ ｍｏｄｅｌ）を用いて評価した。全層ヒト三次元-皮膚モデルは次のような方法にて作製した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）にコラーゲン（Ｎｕｔｒａｇｅｎ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ社）及び線維芽細胞（ＮＤＦｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）の混合物を４００μｌの体積量で担持して人工真皮層を形成した。次いで、該人工真皮層上に線維芽細胞培養培地（Ｍ１０６、Ｇｉｂｃｏ社）を入れて７日間培養して人工真皮層を安定化させた。次いで、該人工真皮層上に角質形成細胞（ＨＥＫｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）をシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、角質形成細胞培養培地（ＥｐｉＬｉｆｅ、Ｇｉｂｃｏ社）で１日間培養した後、表皮層生成培地（ＣｎＴ-３ＤＰＲ、ＣｅｌｌｎＴＥＣ社）で１日間培養し、次いで、同じ表皮層生成培地において１０日間空気中に露出させた状態で培養して人工表皮層を形成することで全層ヒト三次元-皮膚モデルを構築した。このように構築された全層ヒト三次元-皮膚モデルに対して浮遊粒子状物質（ＰＭ２．５）１００μｇ／ｍＬ及び２-イソプロピルリンゴ酸（５０ｕＭ、１００ｕＭ）を４８時間処理した。その後、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色及びＭＭＰ-１免疫細胞染色（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を行い、その結果を図１０に示した。また、ＭＭＰ-１の発現量をイメージ分析（ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって定量化して図１１に示した。

図１０及び１１から確認できるように、Ｈ＆Ｅ染色結果から、三次元皮膚モデルがよく階層化された表皮と真皮を含む線維芽細胞で構成された正常皮膚構造を持っていることを確認することができ、且つ、浮遊粒子状物質のみを処理するとＭＭＰ-１の発現が増加するが、２-イソプロピルリンゴ酸を処理すると合浮遊粒子状物質によって増加したＭＭＰ-１の発現が低減することを確認することができた。

［剤形例１］液状アンプル剤
下記の表１に記載された組成に従い通常の方法にて液状アンプル剤を製造した。

［剤形例２］せっけん
下記の表２に記載された組成に従い通常の方法にてせっけんを製造した。

［剤形例３］ローション
下記の表３に記載された組成に従い通常の方法にてローションを製造した。

［剤形例４］クリーム
下記の表４に記載された組成に従い通常の方法にてクリームを製造した。

［剤形例５］パック
下記の表５に記載された組成に従い通常の方法にてパックを製造した。

［剤形例６］美容液型製剤
下記の表６に記載された組成に従い通常の方法にて美容液型製剤を製造した。

［剤形例７］軟質カプセル剤
２-イソプロピルリンゴ酸１００ｍｇ、Ｌ-カルニチン１６０ｍｇ、大豆油３２０ｍｇ、パーム油２ｍｇ、植物性硬化油８ｍｇ、黄蝋４ｍｇ及びレシチン６ｍｇを混合し、通常の方法にて１カプセルに充填して軟質カプセル剤を製造した。

［剤形例８］錠剤
２-イソプロピルリンゴ酸１００ｍｇ、ガラクトオリゴ糖５００ｍｇ、乳糖８０ｍｇ及び麦芽糖２２０ｍｇを混合し、流動層乾燥機を用いて顆粒化した後、糖エステル（ｓｕｇａｒ ｅｓｔｅｒ）６ｍｇを添加して、打錠機で打錠して錠剤を製造した。

［剤形例９］顆粒剤
２-イソプロピルリンゴ酸１００ｍｇ、無水結晶ブドウ糖２５０ｍｇ及び澱粉５５０ｍｇを混合し、流動層顆粒機を用いて顆粒に成形した後、包に充填して顆粒剤を製造した。

［剤形例１０］ドリンク剤
２-イソプロピルリンゴ酸８０ｍｇ、ブドウ糖１０ｇ、クエン酸０．６ｇ、及び液状オリゴ糖２５ｇを混合した後、精製水５００ｍｌを加えて各瓶に２００ｍｌずつ充填する。瓶に充填した後、１３０℃で４～５秒間殺菌してドリンク剤を製造した。

Claims (16)

1. ２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物を有効成分として含む、皮膚弾力増進又は皮膚しわ改善用組成物。
2. 前記２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物は、１．７～２７ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される、請求項１に記載の組成物。
3. 当該組成物は、一次繊毛を活性化するものである、請求項１に記載の組成物。
4. 当該組成物は、ＭＭＰ-１酵素の発現を抑制するものである、請求項１に記載の組成物。
5. 前記皮膚しわは、浮遊粒子状物質による皮膚しわである、請求項１に記載の組成物。
6. 当該組成物は、食品組成物である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 当該組成物は、化粧料組成物である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
8. ２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物を有効成分として含む、皮膚一次繊毛活性化用組成物。
9. 前記皮膚一次繊毛活性化は、浮遊粒子状物質によって抑制された皮膚一次繊毛の活性化である、請求項８に記載の組成物。
10. 当該組成物は、皮膚一次繊毛の生成を増進させるものである、請求項８に記載の組成物。
11. 前記２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物は、１．７～２７ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される、請求項８に記載の組成物。
12. 当該組成物は、食品組成物である、請求項８～１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 当該組成物は、薬学組成物である、請求項８～１１のいずれか一項に記載の組成物。
14. 当該組成物は、化粧料組成物である、請求項８～１１のいずれか一項に記載の組成物。
15. ２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物を有効成分として含む、浮遊粒子状物質に対する皮膚防御力増進用組成物。
16. 前記２-イソプロピルリンゴ酸（２-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、その塩、水和物又は溶媒和物は、１．７～２７ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される、請求項５に記載の組成物。

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