JP2022159359A - 回収プローブ及びその使用のための方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】術中病理評価に必要な、正確でリアルタイム評価が可能な組織サンプリングデバイスを提供する。【解決手段】マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを作製するための装置であって、溶媒を含むチャンバーと；加圧ガス供給部と；マススペクトロメーターと；リザーバー１１５とプローブ１１０とを含み、リザーバーは、チャンバーと流体連結した導管１１１；加圧ガス供給部と流体連結した導管１１２；マススペクトロメーターと流体連結している導管１１３を含む。【選択図】図１Ｅ

Description

本出願は、２０１６年９月２日に出願した米国特許仮出願第６２／３８３，２３４号；２０１６年１０月２１日に出願した同第６２／４１１，３２１号；及び２０１７年２月２３日に出願した同第６２／４６２，５２４号の利益を主張するものであり、これらの文献のそれぞれは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金第Ｒ００ ＣＡ１９０７８３号の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
１．発明の分野
本発明は、概して医学、分子生物学及び生化学の分野に関する。特に、本発明は、マススペクトロメトリーを使用した組織サンプルの評価のための方法及びデバイスに関する。
２．関連技術の説明
臨床診断は、手術前、手術中、及び手術後、患者の処置過程のいくつかのその他の段階において組織サンプルの評価により一般に行われる。組織評価は、がん患者の診断及び管理において極めて重要である。摘出組織の術中病理評価は、例えば、さまざまながん手術における診断及び切除断片評価のために慣行的に行われている。切除された組織試料は、組織調製、染色、及び評価のために「凍結部屋」と呼ばれることも多い近くの部屋に送られる。組織試料は、凍結され、切断され、染色され、専門家の病理医によって光学顕微鏡を使用して調べられ、病理医は、切除断片ががん細胞を含む（断端陽性）か、または含まない（断端陰性）かを注意深く評価する。術中の凍結切片分析は、数十年間、臨床実務において行われてきたが、これには、多くの問題がある。凍結アーチファクトが組織処理中に生じ、組織構造及び細胞形態を害し、それにより病理学的解釈を複雑にする。さらに、特定の腫瘍細胞は、それらの増殖及び形状の非定型パターンのために識別するのが非常に難しい。分子アプローチは、組織サンプルの極めて正確で、場合によってはリアルタイムの評価をもたらすであろう。しかしながら、今まで、組織サンプルの有効な分子評価を提供する十分なデバイスまたは技法が開発されていない。
第１の実施形態において、マススペクトロメトリープロフィールを得るための方法であって、プローブを使用して、固定または個別の体積の溶媒をアッセイ部位（例えば、組織部位）に適用することと、適用された溶媒を回収するためにプローブを使用して、液体サンプルを得ることと、液体サンプルをマススペクトロメトリー分析に供すること、とを含む、方法が提供される。さらに別の実施形態において、組織サンプルを評価するための方法であって、対象の複数の組織部位から複数の液体サンプルを得ることと、複数の液体サンプルをマススペクトロメトリーに供することと、を含む、方法が提供される。
さらに別の実施形態は、マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを（例えば、組織から）得るための装置であって、本装置は、溶媒を含むチャンバーと；加圧ガス供給部と；マススペクトロメーターと；リザーバー、第１の導管、第２の導管及び第３の導管を備えたプローブとを備え、リザーバーは、第１の導管、第２の導管及び第３の導管と流体連結しており；第１の（溶媒）導管は、チャンバーと流体連結しており；第２の（ガス）導管は、加圧ガス供給部と流体連結しており；第３の（回収）導管は、マススペクトロメーターと流体連結している、装置を提供する。別の態様において、マススペクトロメーターはサンプル分析を提供するコンピュータと通信状態にある。特定の態様において、各サンプル分析の結果は、コンピュータからの視覚的または聴覚的出力によって提供される。例えば、コンピュータによる各サンプル分析の結果は、照射される異なるように染色された光によって、または生成される音の異なる周波数によって示されてもよい。いくつかの態様において、マススペクトロメーターは、可動式マススペクトロメーターである。別の態様において、マススペクトロメーターは、無停電電源（例えば、バッテリー電源）を備えることが可能である。さらなる態様において、マススペクトロメーターは、機器の真空を維持するために閉鎖されてもよい入口を備える。さらに別の態様において、マススペクトロメーターは、（例えば、汚染を阻止するために）メッシュフィルターによってプローブから隔てられる。
いくつかの態様において、リザーバーは、溶媒の液滴を形成するよう構成される。特定の態様において、加圧ガス供給部は、０．１ｐｓｉｇから５．０ｐｓｉｇの間の圧力でガスをプローブに提供する。別の態様において、加圧ガス供給部は、０．５ｐｓｉｇから２．５ｐｓｉｇの間の圧力でガスをプローブに提供する。いくつかの態様において、加圧ガス供給部は、空気をプローブに提供する。他の態様において、加圧ガス供給部は、窒素または二酸化炭素などの不活性ガスをプローブに提供する。
さらなる態様において、本装置は、溶媒をチャンバーから第１の導管を移動させるよう構成されたポンプをさらに備える。別の態様において、本装置は、第３の導管からマススペクトロメーターへの流れを制御するよう構成された第１のバルブを備えてもよい。いくつかの態様において、第１のバルブが開放位置にあるとき、第３の導管は、真空下にある。他の態様において、本装置は、第２の導管を通る加圧ガスの流れを制御するよう構成された第２のバルブを備えてもよい。
特定の態様において、溶媒は、水及び／またはエタノールを含んでもよい。いくつかの態様において、プローブは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）及び／またはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）から形成される。いくつかの態様において、プローブは、使い捨てである。特定の態様において、プローブは、取り出し可能な回収先端部を含んでもよい（例えば、プローブから取り出すことができる）。別の態様において、プローブは、プローブの位置を追跡するよう構成された追跡デバイスを備える。いくつかの態様において、リザーバーは、１マイクロリットルから５００マイクロリットルの間、約１マイクロリットルから１００マイクロリットルの間または約２マイクロリットルから５０マイクロリットルの間の体積を有する。さらなる態様において、リザーバーは、５．０マイクロリットルから２０マイクロリットルの間の体積を有する。
さらなる態様において、装置は、第１の導管を通るチャンバーからリザーバーへの溶媒流（例えば、固定または個別の体積の溶媒の流れ）、第２の導管を通る加圧ガス供給部からリザーバーへの加圧ガス流、及び第３の導管を通るリザーバーからマススペクトロメーターへのサンプル流を制御するよう構成された制御システムをさらに備えてもよい。いくつかの態様において、制御システムは、１から３秒の間の時間、毎分１００から５０００マイクロリットルの間（例えば、毎分２００から４００マイクロリットルの間）の流量に溶媒流を制御するよう；１０から１５秒の間の時間、１から１０ｐｓｉｇの間の流量に加圧ガス流を制御するよう；及び１０から１５秒の間の時間、サンプル流を制御するよう構成される。例えば、いくつかの態様において、制御システムは、溶媒流を開始するためのトリガーまたはボタンを備える。別の態様において、制御システムは、溶媒流を開始するための（すなわち、足の動作によって動作させることができる）ペダルを備える。当業者は、第１及び／または第２の導管の長さがシステムの特定の使用に合うよう調節できることを認識するであろう。さらに別の態様において、制御システムは、第１の導管を通るチャンバーからリザーバーへの溶媒流（例えば、固定された時間の間の流量）を制御するよう構成される。別の態様において、実施形態の装置は、（例えば、組織を破壊するに足りる量の）超音波または振動エネルギーを産生するためのデバイスを含まない。
さらに別の実施形態は、対象からの組織サンプルを評価するための方法であって、溶媒を対象の組織部位に適用することと、適用された溶媒を回収して、液体サンプルを得ることと、サンプルをマススペクトロメトリー分析に供することとを含む、方法を提供する。特定の態様において、溶媒は、滅菌されていてもよい。いくつかの態様において、溶媒は、薬学的に許容される製剤である。特定の態様において、溶媒は、水溶液である。例えば、溶媒は、滅菌水であってもよく、または基本的に水から成ってもよい。他の態様において、溶媒は、約１％から５％、１０％、１５％、２０％、２５％または３０％のアルコールを含んでもよい。いくつかの態様において、溶媒は、０．１％から２０％のアルコール、１％から１０％のアルコールまたは１％から５％１％から１０％のアルコール（例えば、エタノール）を含む。ある場合には、アルコールは、エタノールであってもよい。
いくつかの態様において、溶媒を組織に適用することは、個別の体積の溶媒を組織部位に適用することを含む。いくつかの態様において、溶媒は、１つの液滴として適用される。別の態様において、溶媒は、１から１０の個別の数の液滴として適用される。いくつかの実施形態において、溶媒は、加圧ガスとは無関係のチャネルを介してリザーバーからサンプルに適用される。さらに別の実施形態において、溶媒は、低圧下でサンプルに適用される。例えば、いくつかの態様において、溶媒が、最小限の力で組織部位に適用され（例えば、溶媒が組織部位と接触するリザーバーに移動させられ）、それにより、組織部位において最小限の圧力を作用させる（及び最小限の損傷しか生じない）よう機械式ポンプによって溶媒が適用される。低圧は、１００ｐｓｉｇ未満、９０ｐｓｉｇ未満、８０ｐｓｉｇ未満、７０ｐｓｉｇ未満、６０ｐｓｉｇ未満、５０ｐｓｉｇ未満、または２５ｐｓｉｇ未満であってもよい。いくつかの実施形態において、低圧は、約０．１ｐｓｉｇから１００ｐｓｉｇ、約０．５ｐｓｉｇから５０ｐｓｉｇ、約０．５ｐｓｉｇから２５ｐｓｉｇ、または約０．１ｐｓｉｇから１０ｐｓｉｇである。特定の態様において、溶媒の個別の体積は、約０．１から１００μＬの間、または約１から５０μＬの間である。別の態様において、適用された溶媒を回収することは、適用するステップ後の０．１から３０秒の間である。特定の態様において、適用された溶媒を回収することは、適用するステップ後の１から１０秒の間（例えば、少なくとも１、２、４、５、６、７、８または９秒）である。別の態様において、実施形態の方法は、超音波または振動エネルギーのサンプルまたは組織への適用を含まない。いくつかの態様において、組織部位は、外科的に評価される内部組織部位である。
別の態様において、実施形態の方法は、固定または個別の体積の溶媒を（例えば、機械式ポンプを使用して）溶媒導管を通して組織部位に適用することを含む。いくつかの態様において、固定または個別の体積の溶媒は、溶媒が組織部位と直接接触するリザーバーに溶媒導管を通して移動させられる（例えば、０．５～５．０秒間）。別の態様において、適用された溶媒を回収することは、陰圧をかけて、サンプルを回収導管に引き込むこと及び／またはガス圧をかけて、サンプルを回収導管に押し込むことを含む。いくつかの態様において、溶媒は、回収導管と分離された溶媒導管を通して適用される。ガス圧がかけられて、サンプルを回収導管に押し込む別の態様において、ガス圧は、溶媒導管及び回収導管と分離されたガス導管を通してかけられる。ガス圧がかけられて、サンプルを回収導管に押し込む特定の態様において、１００ｐｓｉｇ未満のかけられるガス圧。例えば、ガス圧は、１０ｐｓｉｇ未満、例えば、０．１から５ｐｓｉｇであるのが好ましい。さらなる態様において、実施形態の方法は、評価される組織に検知可能な物理的損傷を生じさせないものと定義される。
さらなる態様において、本方法は、複数の組織部位からの複数の液体サンプルを回収することをさらに含んでもよい。ある場合には、サンプルを回収するために使用されるデバイス（例えば、プローブ）は、各サンプル回収の間に洗浄される。他の態様において、サンプルを回収するために使用されるデバイスは、各サンプル回収の間に替えることができる使い捨ての回収先端部（プローブ）を含む。特定の態様において、回収先端部は、取り出し可能であってもよい（例えば、デバイスから取り出すことができる）。特定の態様において、複数の組織部位は、インビボの２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の組織部位を含む。別の態様において、複数の組織部位は、外科的に切除された組織の切断部を取り囲む（例えば、エクスビボ）。特定の態様において、切除された組織は、腫瘍である。いくつかの態様において、本方法は、術中法として定義されてもよい。
さらに別の実施形態は、採取される組織部位を特定する方法及びデバイス（プローブ）の操作者にその部位の位置を伝えるための方法を提供する。採取される組織部位の特定は、操作者が組織から回収される分子を採取した後に採取された組織部位で記録された分子情報にアクセスするのを可能にする。少なくとも３タイプの特定アプローチが認識される。第１のアプローチでは、外来性材料が採取した分子情報を特定する採取組織部位に付着させられる。第２のアプローチでは、デバイス（プローブ）は、分子情報が採取されるときにプローブ（デバイス）の位置の記録及びイメージングデバイスへの伝達を可能にする追跡センサー／放射体を備える。第３のアプローチでは、組織領域が、組織分子を回収した後に部位を容易に特定できるよう変更される。第１のアプローチにおいて、採取組織部位に付着させてもよい材料としては、例えば、縫合糸、止血鉗子、組織に付着する生体適合性ポリマー、または容易な読み取り及び除去を可能にする磁気ビーズに付着させるＲＦＩＤチップが挙げられる。第２のアプローチタイプにおいて、プローブは、ＲＦ外科用追跡システムの一部であるＲＦ放射体、術中ＵＳイメージングシステムの一部である超音波放射体または反射体を含んでもよい。この第２のアプローチにおいて、操作者が組織分子の回収を開始するとき、追跡システムは、デバイスと通信できる関連するイメージングシステム（例えば、ＲＦ、ＵＳ、ＣＴ、ＭＲＩ）においてプローブの位置を記録する。その後、操作者は、採取部位の位置を操作者に示すことができる記録されたイメージ（複数可）を参照することによって、後で任意の採取組織部位を特定することができる。第３のアプローチにおいて、組織は、変更される。この第３のアプローチにおいて、プローブと通信状態にあるレーザー源は、採取部位を特定する組織にパターンを蒸散または凝固するために使用することができる。これらの３アプローチのうちの任意のものが組み合わされてもよい。例えば、アプローチ１、２及び３を組み合わせることが可能であろう。この場合、組織分子を採取した後に、外来性材料が組織部位に付着させられ、レーザーが外来性組織に模様をつけると同時に、ＲＦセンサーが採取位置の位置を記録し、イメージングデバイスに伝達する。
さらにまた別の態様において、マススペクトロメトリーは、アンビエントイオン化ＭＳを含む。いくつかの態様において、サンプルをマススペクトロメトリー分析に供することは、組織部位に対応するプロフィールを決定することを含んでもよい。別の態様において、本方法は、プロフィールを参照プロフィールと比較して、患部組織を含む組織部位を特定することをさらに含んでもよい。他の態様において、本方法は、患部組織を含むことが特定された組織部位を切除することも含む。いくつかの態様において、本方法は、上記の任意の実施形態及び態様による装置を使用して実施される。
別の実施形態において、本発明は、組織サンプルを評価するためのエクスビボにおける方法であって、対象の複数の組織部位から複数の液体サンプルを得ることと、複数の液体サンプルをマススペクトロメトリーに供して、組織部位と対応する複数のプロフィールを得ることと、複数のプロフィールを参照プロフィールと比較して、患部組織を含む組織部位を特定することとを含む、方法を提供する。特定の態様において、液体サンプルは、溶媒中に含まれる。別の態様において、患部組織は、がん細胞を含む。
実施形態のいくつかの態様において、実施形態の方法及びデバイスによる評価のための患部組織部位は、がん細胞を含む（または含むことが疑われる）。実施形態により評価することができるがん細胞としては、甲状腺、リンパ節、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭、腎臓、肝臓、肺、上咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、もしくは子宮からの細胞または腫瘍組織（あるいはそのような腫瘍の周辺の組織）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの態様において、がんは、新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化型；巨細胞及び紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管細胞癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌及び胆管細胞癌；柱状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープの腺癌；腺癌、家族性ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺癌；乳頭腺癌；色素嫌性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭及び濾胞腺癌；非被包型硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；のう胞腺癌；乳頭状嚢腺癌；乳頭状漿液性のう胞腺癌；粘液性のう胞腺癌；粘液癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；乳房パジェット病；膵腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生随伴腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；セルトリ間質細胞腫、悪性；セルトリ細胞腫；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロムス肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑に合併した悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児型横紋筋肉腫；胞巣型横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星細胞腫；原形質性星細胞腫；線維性星細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠芽腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン病；または傍肉芽腫であってもよい。別の態様において、がんは、甲状腺癌、脳癌（例えば、神経膠腫）、前立腺癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、膵癌（例えば、膵管腺癌）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、黒色腫、腎細胞癌またはリンパ節に転移したがんである。
本明細書中で使用される場合、「サンプル」または「液体サンプル」は、実施形態に従って組織または生物学的試料を溶媒と接触させることによって得られる、組織からの抽出物またはその他の生物学的試料（例えば、タンパク質及び代謝産物を含む抽出物）を指す場合がある。いくつかの態様において、サンプルは、物（例えば、法医学的サンプル）の表面など非生物学的試料からの抽出物である場合がある。
本明細書中で使用される場合、特定の成分に関して「基本的に～を含まない」は、特定の成分が組成物に意図的に配合されない、及び／または混入物質として、もしくは微量でのみ存在することを意味するよう本明細書中で使用される。したがって、組成物のあらゆる意図されない汚染から生じる特定の成分の総量は、十分に０．０１％を下回る。特定の成分の量が標準的な分析方法で検出できない組成物が最も好適である。
本明細書中で使用される場合、本明細書及び請求項において、「ａ」または「ａｎ」は１つ以上を意味する場合もある。本明細書中で使用される場合、本明細書及び請求項において、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語とともに使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という語は１つまたは２つ以上を意味する場合もある。本明細書中で、本明細書及び請求項において使用される場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」または「さらなる（ｆｕｒｔｈｅｒ）」は、少なくとも２番目以上を意味する場合もある。
本明細書中で使用される場合、本明細書及び請求項において、「導管」及び「管」という用語は、同義に使用され、ガスまたは液体の流れを誘導するために使用することができる構造を指す。
本明細書中で使用される場合、本明細書及び請求項において、「約」という用語は、値が、値を測定するために利用されるデバイス、方法に関する誤差の固有の変動、または調査対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。ただし、本発明の趣旨及び範囲内のさまざまな変更物及び改変物がこの詳細な説明から当業者に明白になるであろうため、詳細な説明及び特定の例は、本発明の特定の実施形態を示すが、説明のために示されたに過ぎないことが理解されるべきである。
以下の図は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書において提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて１つ以上のこれらの図を参照することによってさらに良く理解することができる。
図１Ａは、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。ペンサイズの手持ち型デバイスは、ＰＴＦＥ管（または別の極めて疎水性の材料）による研究室で組み立てたマススペクトロメーターインタフェースに直接組み込まれる。インタフェースはピンチバルブ、マイクロコントローラ、及び、システムをマススペクトロメーター入口と接続するための管を収容する。システムは、フットペダルによりユーザーによって自動的に作動させられる。図１Ｂは、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎは、ＰＤＭＳ ３Ｄ印刷した先端部ならびに先端部への流入水、ガス、及び水滴のための流出導管を提供する３つのＰＴＦＥ導管とともに設計される。図１Ｃは、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。先端部は、分析のための組織と接触し、これは、３つの導管及び溶媒リザーバーとともに設計される。ペダルを介した使用によってシステムが作動されたとき（ｔ＝０秒）、シリンジポンプは制御された体積の水をリザーバーに送達する。個別の水滴は、分子を抽出するために組織と相互作用する。この場合、抽出の３秒後、真空及びガス導管が同時に開放されて、分子分析のために管系を通してＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎからマススペクトロメーターに液滴が輸送される。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎデバイスの例となる機能要素の概略図を示す。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。例となるＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎの先端部の拡大図を示す。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。例となるＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎの先端部の拡大図を示す。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。実施形態のシステムの代替的な構成を示す。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。実施形態のシステムの代替的な構成を示す。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。実施形態のシステムの代替的な構成を示す。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。実施形態のシステムの代替的な構成を示す。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。実施形態のシステムの代替的な構成を示す。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。実施形態のシステムの代替的な構成を示す。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。実施形態のシステムの代替的な構成を示す。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。実施形態のシステムの代替的な構成を示す。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。実施形態のシステムの代替的な構成を示す。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。実施形態のシステムの代替的な構成を示す。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステム及び動作ステップの略図。実施形態のシステムの代替的な構成を示す。
Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐマススペクトロメーターを使用したＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎからのマウス脳組織切片の質量スペクトル。マウス脳切片の質量スペクトル。 Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐマススペクトロメーターを使用したＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎからのマウス脳組織切片の質量スペクトル。トータルイオンクロマトグラフィ、挿入スペクトルは、きれいなスライドガラスバックグラウンドからのものである（バックグラウンド及びマウス脳組織の強度スケールは、同じであるよう設定した）。
エタノール：Ｈ２Ｏ（１：２０）またはエタノール：Ｈ２Ｏ（１：５）から構成される溶媒を使用して得た生物学的サンプルの質量スペクトルの比較を示す。 さまざまな比の水及びエタノールの混合物を使用してマウス脳組織切片から得た代表的なネガティブイオンモードＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ質量スペクトル。
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを使用して、マウス脳切片から収集した質量スペクトルの比較。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを使用して、マウス脳新鮮組織から収集した質量スペクトルの比較。
さまざまながんタイプに関する乳癌組織対正常な組織の質量スペクトルの比較。 さまざまながんタイプに関する腎癌組織対正常な組織の質量スペクトルの比較。 さまざまながんタイプに関する癌性リンパ節組織対正常な組織の質量スペクトルの比較。 さまざまながんタイプに関する卵巣癌組織対正常な組織の質量スペクトルの比較。 さまざまながんタイプに関する甲状腺癌組織対正常な組織の質量スペクトルの比較。
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎから収集した質量スペクトル。 ＤＥＳＩから収集した質量スペクトル。 マウス脳組織切片から得たＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ及びＤＥＳＩネガティブイオンモード質量スペクトルの間の比較。
ネガティブイオンモード下においてヒト組織で検出したチモシンβ－４のスペクトル。
新鮮な甲状腺の正常試料及び癌試料から得たスペクトルの比較。 甲状腺の乳頭癌組織切片及び正常な組織切片のＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析。（上側）正常な甲状腺組織切片、及び（下側）甲状腺乳頭癌組織切片から得た代表的なネガティブイオンモードＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ質量スペクトルを示す。最も豊富な分子イオンの同定を示す。挿入図は、組織病理学によって評価したＨ＆Ｅ染色組織切片の光学イメージを示す。
正常ならびに腫瘍性の甲状腺及び乳房組織切片を含む、ヒト組織切片に関して得たデータのＰＣＡ。スコアプロットにおいて観察されるとおり、ＰＣ１及びＰＣ３は、乳房組織データセットの全分散の４６．１％を説明する一方で、ＰＣ１及びＰＣ２は、甲状腺組織データセットの全分散の４７．９％を説明する。分析したそれぞれの組織タイプに関するローディングプロットも含まれる。
ヒト新鮮組織に関する主成分分析の結果。図Ａは、正常な甲状腺及び腫瘍甲状腺の区別。図Ｂは、正常なリンパ節及び腫瘍リンパ節の区別。
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを使用して組織サンプルから得た分子情報は、ヒトのがんの診断に役立つ。乳房、甲状腺、卵巣及び肺癌ならびに正常な組織サンプルを含む、合計２５３の患者の組織サンプルを分析した。３Ｄ ＰＣＡ（ＰＣ１、ＰＣ２及びＰＣ３）プロットは、得られたがん質量スペクトルと正常な質量スペクトルの間の分離を示している。
サンプル箇所１の位置づけ（図１２Ａ）、サンプル箇所２（図１２Ｂ）、サンプル箇所３（図１２Ｃ）、サンプル箇所４（図１２Ｄ）、及びサンプル箇所５（図１２Ｅ）の位置づけ。
全質量範囲におけるサンプル箇所１～５の質量スペクトル。 ５００から１８００の質量範囲におけるサンプル箇所１～５の質量スペクトル。 ５００から１０００の質量範囲におけるサンプル箇所１～５の質量スペクトル。 ７８５から８０９の質量範囲におけるサンプル箇所１～５の質量スペクトル。 ８７０から９２０の質量範囲におけるサンプル箇所１～５の質量スペクトル。
図１４Ａは、混合組織組成物を用いたＨＧＳＣ組織サンプルのＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析。光学イメージは、直径１．５ｍｍのＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを使用して、境界を定めた箇所（１～５）において分析した組織サンプルを示す。ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析後、組織サンプルを凍結し、切断し、Ｈ＆Ｅ染色した。箇所３において得たＨ＆Ｅ染色組織切片の光学イメージを示し、これは、がん及び隣接する正常な間質組織を含む混合組織組成物を示す。図１４Ｂは、混合組織組成物を用いたＨＧＳＣ組織サンプルのＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析。ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎネガティブイオンモード質量スペクトルを、箇所１（正常な間質）、箇所３（正常な間質とがんの混ざったもの）、及び箇所５（がん）に関して示す。図１４Ｃは、混合組織組成物を用いたＨＧＳＣ組織サンプルのＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析。分析した５つの箇所の病理診断及びこの独立したデータのセットに対するＬａｓｓｏ予測結果を示す。
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎは、組織サンプルの穏やかな非破壊分子分析を可能にする。光学イメージは、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析の前、最中及び後の肺腺癌組織サンプルを示す。組織試料の拡大写真は、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎで分析した組織領域に対する巨視的な損傷を示していない。 ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎは、組織サンプルの穏やかな非破壊分子分析を可能にする。分析した組織領域に対して得たネガティブイオンモード質量スペクトルが示され、最も豊富な分子イオンの同定を含む。
図１６Ａは、マウス動物モデルの手術中の腫瘍及び正常な組織のインビボ分析。麻酔下のマウスに対して実験を行った。光学イメージは、動物及びインビボにおけるＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析前、最中、後を示す。図１６Ｂは、マウス動物モデルの手術中の腫瘍及び正常な組織のインビボ分析。代表的なネガティブイオンモード質量スペクトルは、正常及び腫瘍組織からの異なる分子プロフィールを示す。
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎのさまざまな採取直径を使用して得た代表的なネガティブイオンモードＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ質量スペクトル。
マウス脳組織からの代表的なポジティブイオンモード質量スペクトル。高い相対的存在量で観察されたイオンは、タンデムマススペクトロメトリーを使用して、質量スペクトルに注釈がつけられているとおり、グリセロホスホコリン及びジアシルグリセリド脂質のカリウム（Ｋ＋）及びナトリウム（Ｎａ＋）付加体と同定した。
正常及びがん組織の領域を含むＨＧＳＣ組織サンプルから得た代表的なネガティブイオンモードＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ質量スペクトル。
インビボ分析、後及びＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析後に同じ領域から得たＨ＆Ｅ染色した組織切片の光学イメージ。
マウスモデルの同じ腫瘍サンプルのインビボ及びエクスビボにおいて得たＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎネガティブイオンモード質量スペクトル間の比較。
異なる抽出時間、５ｓ、３ｓ、及び１ｓを用いてマウス脳組織切片から得た代表的なネガティブイオンモード質量スペクトル。
Ｉ．本実施形態
特定の態様において、本出願は、組織サンプルなどのサンプルの分子評価のための方法及びデバイスを提供する。特定の態様において、本方法は、組織の手術（またはバイオプシー）の間に複数の組織部位を評価するために使用することができる。この特徴は、「リアルタイム」で患部組織（例えば、がん細胞を保持する組織部位）の正確な特定を可能にさせ、外科医が周辺の正常な組織に対して患部組織のみにさらに正確に対処することを可能にする。特定の態様において、本明細書中で開示されている方法は、固定または個別の体積の溶媒の組織部位への送達に続いて、その部位からの液体サンプルの回収及びマススペクトロメトリーによる液体サンプルの分析を含むことが可能である。重要なことに、溶媒は、高圧スプレーとして適用されるよりむしろ、個別の液滴として低圧で適用される。これらの方法は、評価する組織に対する損傷を回避しながら、異なる組織部位からのサンプルの正確な回収を可能にさせる。回収したサンプルから得られたマススペクトロメトリープロフィールは、正常な組織部位に対して患部組織を識別可能にさせる。本方法は、目的とする複数の部位で繰り返し、（例えば、組織において）分子変化を極めて正確に位置づけることができる。重要なことに、サンプルのプロフィールは、イオン化源を使用しなくても区別することができた。したがって、実施形態の方法は、イオン化源と共に使用することができるであろうが、そのようなイオン化源の使用は必要ではない。これらの技法は、短い時間の範囲にわたり複数の組織部位の評価を可能にすることができ、それにより、患部組織と正常な組織の境界を極めて正確に評価することを可能にさせる。
いくつかの態様において、本明細書において詳述される方法は、広い範囲のソースからのサンプルを回収及び分析するために使用することができる。例えば、本方法は、法医学的、農業、乱用薬物、医薬品、及び／または油／石油サンプルを評価するために使用することができる。
いくつかの態様において、実施形態のデバイスに使用される材料（ＰＤＭＳ及びＰＴＦＥ）及び溶媒（例えば、水のみの溶媒）は、リアルタイム分析のために手術で使用することができるよう、生物学的に適合している。さらに、デバイスは極めて小型にできるため、手持ち型にすることもでき、または（例えば、自動システムにおける）ダ・ヴィンチ手術システムなどのロボット手術システムに組み込むこともできる。したがって、ヒトの体腔の多くの領域を、手術中に迅速に採取し、（例えば、分子署名のデータベース及び機械学習アルゴリズムを使用することによって）分析することができる。したがって、それぞれの採取領域に関する診断結果をリアルタイムで提供することができる。これらの方法に使用するための例となるデバイスを下に詳述する。
まず図１Ｄを参照して、マススペクトロメトリー分析のための組織を採取するための装置１００を示す。この実施形態において、装置１００は、プローブ１１０、溶媒を含むチャンバー１２０、加圧ガス供給部１３０及びマススペクトロメーター１４０を備える。いくつかの態様において、プローブは、（例えば、手持ち型デバイスの場合にグリップを提供するための）ハウジングに含まれる。別の態様において、ハウジングは、プローブを通る流体及び／またはガス流を制御するために使用することができるスイッチ機能（例えば、トリガー、ボタンまたはペダル）を備えてもよい。いくつかの態様において、プローブは、ＰＤＭＳ及び／またはＰＴＦＥを含む材料から構成される。いくつかの態様において、プローブは、３Ｄ印刷プロセスによって作製される。
図１Ｅは、プローブ１１０のより詳細な断面図を示し、第１の導管１１１、第２の導管１１２、第３の導管１１３及びリザーバー１１５を備えたプローブ１１０を示す。示した実施形態において、第１の導管１１１は、チャンバー１２０と流体連結しており、第２の導管１１２は、加圧ガス供給部１３０と流体連結しており、第３の導管１１３は、マススペクトロメーター１４０と流体連結している。図１Ｆは、特定の実施形態に関する寸法を伴うプローブのさらなる断面図を提供する。
当然のことながら、特定の実施形態において、（任意の所望の長さが可能な）導管１１１、１１２及び１１３のそれぞれは、別個の構成要素を備えてもよい。例えば、プローブ１１０内の導管のそれぞれの部分は、プローブ１１０の製造過程において一体型チャネルとして形成されてもよい。さらに、プローブ１１０とチャンバー１２０、加圧ガス供給部１３０及びマススペクトロメーター１４０の間の導管のそれぞれの部分は、管または流体の流れをもたらすのに適した他の構成要素であってもよい。
この実施形態において、装置１００は、溶媒をチャンバー１２０から第１の導管１１１及びリザーバー１１５に移動させるよう構成されたポンプ１２５を備えてもよい。示した実施形態において、装置１００はまた、第３の導管１１３を通るリザーバー１１５からマススペクトロメーター１４０へのサンプル流を制御するよう構成された第１のバルブ１２１を備えてもよい。装置１００はまた、第２の導管１１２を通るリザーバー１１５への加圧ガスの流れを制御するよう構成された第２のバルブ１２２を備えてもよい。
制御システム１６０は、装置１００の動作パラメータを制御するよう構成することができる。例えば、制御システム１６０は、ポンプ１２５の動作を制御することによって、第１の導管１１１を通るチャンバー１２０からリザーバー１１５への溶媒の流れを制御するよう構成することができる。さらに、制御システム１６０は、第１のバルブ１２１の開閉を制御することによって、リザーバー１１５からマススペクトロメーター１４０へのサンプル流を制御するよう構成することができる。制御システム１６０は、第２のバルブ１２２の開閉を制御することによって、加圧ガス容器１３０からリザーバー１１５への加圧ガス流を制御するようさらに構成することができる。
装置１００の操作の間、ユーザーは、リザーバー１１５がサンプル部位１５０に置かれるよう、プローブ１１０を位置づけることができる。制御システム１６０は、所望の体積の溶媒を第１の導管１１１を介してチャンバー１２０からリザーバー１１５へ移動させるために、特定の時間、ポンプ１２５を動作させることが可能である。例となる実施形態において、チャンバー１２０中の溶媒は、分析のための組織サンプル部位１５０からの分子の効率的な抽出を支援することができる。
さらに、制御システム１６０は、ポンプ１２５の動作と第１のバルブ１２１の開放の間に特定の時間を与えることができる。これは、サンプル材料（例えば、組織サンプル部位１５０からの分子）を、第３の導管１１３を介してリザーバー１１５からマススペクトロメーター１４０へ引き込むたの、マススペクトロメーター１４０（または別個の補助的な吸引システム）からの吸引を可能にする。
第１のバルブ１２１が開放されるとき、制御システム１６０は、第２のバルブ１２２も開放して、不活性ガス（例えば、Ｎ２またはＣＯ２）が第２の導管１１２を介して加圧ガス供給部１３０からリザーバー１１５へ移動されるのを可能にする。不活性ガスは、分析に先立つサンプル組織の乾燥を支援し、さらには、（例えば、リザーバー１１５がサンプル部位１５０と接触したときに、マススペクトロメーター１４０によって引かれる吸引の結果として）第１の導管１１１中の溶媒ギャップを防ぐことができる。不活性ガスは、第３の導管１１３を通るサンプル部位１５０からマススペクトロメーター１４０への溶媒輸送も支援することができる。
制御システム１６０は、装置１００の各種構成要素を動作させるのに適したソフトウェア及びハードウェアを含んでもよい。図１の概略図に示される各種構成要素の特定の実施形態は、実施例１の名称の項を含む、下で述べる例において示される。
図１Ｇは、前の図１Ｄに示される実施形態と類似した装置１００の実施形態を示す。ただし、図１Ｇの実施形態では、装置１００は、導管１１３と流体連結したポンプ１４１をさらに備える。特定の実施形態において、ポンプ１４１は、マススペクトロメーターへの導管１１３を通るサンプル部分の速度を増加させるよう動作可能な外部真空ポンプであってもよい。当然のことながら、前の実施形態に記載されている装置１００の構成要素は、この実施形態（及び次に記載されている実施形態）においてと同等の様式で動作する。明確にするために、図のそれぞれにおいてすべての構成要素に参照番号が付けられている訳ではない。さらに、先に記載した実施形態の構成要素と等価の構成要素の動作の態様は、この実施形態または次の実施形態の解説では繰り返さない。
図１Ｈは、先に記載した実施形態と類似しているが、導管１１３と流体連結したバルブ１４２、廃棄物容器１４３及びポンプ１４４も備えた装置１００の別の実施形態を示す。特定の実施形態において、バルブ１４２は、クリーニングステップ中に溶媒または他のクリーニング溶液を導管１１３から廃棄物容器１４３へ分岐するために使用することができる。廃棄物容器１４３は、ポンプ１４４の動作により空にすることができる。例となる実施形態において、水、エタノール、任意の比率の水及びエタノールの混合物、ならびにその他の溶媒を使用したクリーニングまたは洗浄ステップは、キャリーオーバーの影響を低減するためにサンプル分析の任意の段階で使用することができる。特定の実施形態において、プローブ１１０はまた、それぞれの使用の間に交換することもできる。さらに、プローブ１１０は、自動洗浄ステップの前または後にクリーニングを支援するために、ガス（通気）を使用した洗浄ステップのために溶媒を含むバイアルに挿入されてもよい。滅菌溶液で拭き取ることを含むその他の洗浄方法も使用することができる。例えば、特定の実施形態は、１．プローブの交換、２．５０／５０のエタノール／水の溶液での洗浄、３．１００％エタノールでの洗浄のクリーニング手順を使用してもよい。
図１Ｉは、先に記載した実施形態と類似しているが、導管１１３に加熱要素１４５も備えた装置１００の別の実施形態を示す。特定の実施形態において、加熱要素１４５は、導管１１３のまわりに巻きつけられてもよい加熱線として構成される。他の実施形態において、例えば、セラミックヒーターを含む、異なる加熱要素構成を備えてもよい。導管１１３は、本明細書に記載されている任意の例となる実施形態において、マススペクトロメーター１４０への水または溶媒輸送を改善するため、ならびにイオン化を支援するために加熱されてもよい。加熱は、全導管系を通して、または特定の位置で実施されてもよい。
図１Ｊは、先に記載した実施形態の特徴を組み合わせる装置１００の実施形態を示す。特に、この図に示される実施形態は、導管１１３にある加熱要素１４５及びポンプ１４１を含む。加熱要素１４５及びポンプ１４１の動作の態様については、それぞれ図１Ｉ及び１Ｇの説明において予め述べたため、簡潔にするためにここでは繰り返さない。
図１Ｋは、先に記載した実施形態と類似しているが、マススペクトロメーター１４０に対する入口の近位にスプレーを形成するためのイオン化デバイス１４６も備えた装置１００の実施形態を示す。特定の実施形態において、イオン化デバイス１４６は、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）デバイス、ｎａｎｏ ＥＳＩデバイス、または大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）デバイスであってもよい。特定の実施形態において、導管１１３は、マススペクトロメーター１４０に直接連結されておらず、ベンチュリデバイス１４７は、サンプル１５０の液滴をイオン化デバイス１４６及びマススペクトロメーター１４０のインタフェースへ輸送するために使用することができる。マススペクトロメトリープロフィールは、ベンチュリデバイスを含む装置１００の実施形態の図１Ｌに示される。図１Ｌに示されているとおり、得られたプロフィールは、導管１１３をマススペクトロメーター１４０の入口と直接連結する実施形態と類似している。
ここで図１Ｍと参照すると、装置１００の実施形態は、示されるとおりの外部ポンプ１４１（図１Ｇに予め示され、記載されているとおり）ならびにイオン化デバイス１４６及びベンチュリデバイス１４７（図１Ｋに予め示され、記載されているとおり）を含む。
図１Ｎの実施形態に示されているとおり、装置１００の実施形態は、示されているとおりの加熱要素１４５（図１Ｉに予め示され、記載されているとおり）ならびにイオン化デバイス１４６及びベンチュリデバイス１４７（図１Ｋに予め示され、記載されているとおり）を含む。
図１Ｏの実施形態に示されているとおり、装置１００の実施形態は、示されているとおりの加熱要素１４５（図１Ｉに予め示され、記載されているとおり）ならびにイオン化デバイス１４６及びベンチュリデバイス１４７（図１Ｋに予め示され、記載されているとおり）を含む。さらに、この実施形態は、外部ポンプ１４１（図１Ｇに予め示され、記載されているとおり）も含む。
図１Ｐの実施形態に示されているとおり、装置１００の実施形態は、バルブ１４２、廃棄物容器１４３及びポンプ１４４を含む（図１Ｈに予め示され、記載されているとおり）。さらに、この実施形態は、示されているとおりのイオン化デバイス１４６及びベンチュリデバイス１４７も含む（図１Ｋに予め示され、記載されているとおり）。
図１Ｑの実施形態に示されているとおり、装置１００の実施形態は、バルブ１４２、廃棄物容器１４３及びポンプ１４４を含む（図１Ｈに予め示され、記載されているとおり）。さらに、この実施形態は、示されているとおりのイオン化デバイス１４６及びベンチュリデバイス１４７も含む（図１Ｋに予め示され、記載されているとおり）。この実施形態は、加熱要素１４５をさらに含む（図１Ｉに予め示され、記載されているとおり）。
ＩＩ．アッセイ手法
いくつかの態様において、本開示は、マススペクトロメトリープロフィールの固有のパターンを特定することによって患部組織（例えば、腫瘍組織）の存在を判断する方法または生物学的試料の分子署名を見つける方法を提供する。分析のための生物学的試料は、動物、植物あるいは生体分子または有機体と接触した（生きているもしくは生きていない）任意の材料が可能である。生物学的試料は、インビボ（例えば、手術中）またはエクスビボにおいて採取することができる。
実施形態の方法によって得られたプロフィールは、分析対象の生物学的試料または組織部位からの、例えば、タンパク質、代謝産物、または脂質に対応する可能性がある。これらのパターンは、マススペクトロメトリーを使用して特定のイオンの存在を測定することによって決定されてもよい。このデバイスと連結することができるイオン化方法のいくつかの非限定例としては、化学イオン化、レーザーイオン化、大気圧化学イオン化、電子イオン化、高速原子衝撃、エレクトロスプレーイオン化、熱イオン化が挙げられる。さらなるイオン化方法としては、誘導結合プラズマ源、光イオン化、グロー放電、電界脱離、熱スプレー、ケイ素を用いた脱離／イオン化、リアルタイム直接分析、二次イオン質量分析、スパークイオン化、及び熱イオン化が挙げられる。
特に、本方法は、アンビエントイオン化源または抽出アンビエントイオン化源などの質量スペクトルデータを得るための方法に適用されるか、またはそれとつながれてもよい。抽出アンビエントイオン化源は、この場合、液体抽出プロセスに動力学的に続くイオン化を伴う方法である。抽出アンビエントイオン化源のいくつかの非限定例としては、空気流支援型脱離エレクトロスプレーイオン化（ＡＦＡＤＥＳＩ）、リアルタイム直接分析（ＤＡＲＴ）、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）、電荷交換による脱離イオン化（ＤＩＣＥ）、電極支援型脱離エレクトロスプレーイオン化（ＥＡＤＥＳＩ）、エレクトロスプレーレーザー脱離イオン化（ＥＬＤＩ）、静電スプレーイオン化（ＥＳＴＡＳＩ）、ジェット脱離エレクトロスプレーイオン化（ＪｅＤＩ）、レーザー支援型脱離エレクトロスプレーイオン化（ＬＡＤＥＳＩ）、レーザー脱離エレクトロスプレーイオン化（ＬＤＥＳＩ）、マトリクス支援型レーザー脱離エレクトロスプレーイオン化（ＭＡＬＤＥＳＩ）、ナノスプレー脱離エレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏ－ＤＥＳＩ）、または透過式脱離エレクトロスプレーイオン化（ＴＭ－ＤＥＳＩ）が挙げられる。
多くのマススペクトロメトリー法と同様に、イオン化効率は、溶媒成分、ｐＨ、ガス流量、印加される電圧、及びサンプル溶液のイオン化に影響を及ぼすその他の態様などの回収または溶媒条件を変更することによって最適化することができる。特に、本方法は、ヒトの問題と適合した溶媒または溶液の使用を意図する。イオン化溶媒として使用することができる溶媒のいくつかの非限定例としては、水、エタノール、メタノール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、その酸、または混合物が挙げられる。いくつかの実施形態において、本方法は、アセトニトリル及びジメチルホルムアミドの混合物を意図する。サンプルからの検体の抽出を増大させるためならびにサンプルのイオン化及び揮発性を増加させるためにアセトニトリル及びジメチルホルムアミドの量を変動させることもできる。いくつかの実施形態において、組成物は、約５：１（ｖ／ｖ）のジメチルホルムアミド：アセトニトリルから約１：５（ｖ／ｖ）のジメチルホルムアミド：アセトニトリル、例えば、１：１（ｖ／ｖ）のジメチルホルムアミド：アセトニトリルを含む。しかしながら、好適な実施形態において、実施形態による使用のための溶媒は、滅菌水または緩衝水溶液などの薬学的に許容される溶媒である。
ＩＩＩ．実施例
本発明の好適な実施形態を示すために以下の実施例が含まれる。次に続く実施例において開示されている技術は、発明の実施において十分に機能するよう、発明者によって発見された技術であるため、その実施のための好適な形態を構成すると考慮することができることが当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでも本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得られることを理解すべきである。
実施例１：Ｓｍａｒｔ ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ設計
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ（図１Ａ）を、自動化された生体適合性手持ち型採取プローブとして開発し、これは、個別の水滴を使用して組織サンプルから穏やかで、時間及び体積が制御された分子の抽出を可能にする。システムのいくつかのプロトタイプは、組織損傷を最小限に抑えること、組織検体の抽出を最大にすること、及びマススペクトロメーターへの溶媒移動を最大にすることを目的に設計した。
開発したシステムは、３つの主要な部分から成る：１）制御された流量を使用して個別の溶媒体積を送達するようプログラムされたシリンジポンプ；２）制御された溶媒輸送のための二方ピンチバルブに組み込まれた管系；３）生体組織の直接採取のために使用されるプローブ先端部。システムのいくつかの繰り返しは、組織損傷を最小限に抑えること、組織検体の抽出を最大にすること、及びマススペクトロメーターへの溶媒送達を最大にすることを最終目標に調査及び最適化した。図１Ａは、生体組織を分析するためのＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｅｎ（ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ）デバイスを備えた装置の一例の概略図を示す。
最適化されたシステムは、３つの主要な構成要素を含む：１）定義された水の体積（４～１０μＬ）を採取プローブに送達するようプログラムされたシリンジポンプ；２）ポンプから組織へ、及び組織からマススペクトロメーターへの制御された溶媒輸送のためのファスト（８ｍｓ）二方ピンチバルブに組み込まれた小さな直径（ＩＤ ８００μｍ）のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）管の導管；３）生体組織の直接採取のためのペンサイズの手持ち型プローブ。
ペンサイズの手持ち型プローブの主要な構成要素は、組織との相互作用中に溶媒が保持される３Ｄ印刷したポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）先端部（図１Ｂ）である。先端部は、３Ｄ印刷を使用して製造し、生物学的に適合したポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から作られる。先端部は、３つの主要なポートとともに設計される：流入（溶媒）導管系のためのポート（管１１１または導管１）、ガス（Ｎ２、ＣＯ２または空気）送達のための中心ポート（管１１２または導管２）、及び組織からの水滴中の分子成分をマススペクトロメーターに輸送する流出ポート（管１１３または導管３）。プローブ先端部で、すべてのポートが小さなリザーバーに合体する。このリザーバーで、１つの液滴が保持され、制御された時間（３ｓ）、組織サンプルにさらされ、効率的な検体抽出を可能にする。リザーバーの直径が、組織にさらされる溶媒の体積ならびにデバイスの空間分解能を決定する。現行の工作機械を使用して、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ先端部を、リザーバーの直径によって決定される１．５ｍｍから５．０ｍｍに及ぶ採取サイズで設計した。２．７７ｍｍのリザーバーの直径では、１０μＬの溶媒体積が、リザーバーに保持され、定義された時間、組織サンプルと接触させられる一方で、１．５ｍｍの直径では４．４μＬがリザーバーに保持される。３ｓの抽出時間後に、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを組織から除去する。導管３を開放し、これがマススペクトロメーターへの液滴の真空抽出を可能にすると同時に、導管２を通る低圧ガス送達（＜１０ｐｓｉ）からの陽圧がもたらされ、それにシステムをクリーニングするための洗い流すステップが続く。なお、１秒、３秒及び５秒の液滴と組織サンプルとの間の接触時間を評価した（図２２）。ユーザーによる操作の容易さを可能にし、十分なトータルイオン強度の質量スペクトルを得たため、３秒の接触時間をすべての実験に選択した。第２の管によって提供されるガスは抽出プロセスに関与しないが、代わりに利用される真空によるシステムの崩壊を防ぐため及び組織からマススペクトロメーターへの溶媒輸送を支援するために使用される。同様に、組織からの生体分子の抽出のための洗い流すステップを使用しない。それは、この期間の間に組織との接触がないためである。マススペクトロメーター真空システムの陰圧がイオン化及び質量分析のためにリザーバーからマススペクトロメーターへ液滴を移動させるよう、導管３を高質量分解能Ｏｒｂｉｔｒａｐマススペクトロメーターの移動管に直接接続する。さまざまな接続及びイオン化方法を本発明者らのシステムにつなぐことができるであろうが、この設定は、動作ステップを簡素化し、イオン化源の使用を排除する。幾何学的または空間的制約なく操作者がデバイスを自由に手持ち使用できるよう、すべての導管に対して１．５メートルの管の長さを利用した。
使用した３つの導管は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）から作られ、これも生物学的に適合している。管１１１は、溶媒をシリンジポンプからプローブ先端部へ送達するために使用される。管１１２は、ある場合には、不活性ガス（Ｎ２またはＣＯ２）をプローブ先端部に送達するために使用される。ガスは、３つの主な目的を果たす：１）分析に先立つ組織の乾燥；２）組織試料と接触させることによってリザーバーが閉鎖されたときのマススペクトロメーターの真空による管１１１中の溶媒ギャップを防ぐ；２）管１１３を通る組織からマススペクトロメーターへの溶媒輸送を支援する。しかしながら、一部の状況では、ガスの使用は必要でない。イオン化のために液滴をリザーバーからマススペクトロメーター入口に押しやるためにマススペクトロメーター真空システムの陽圧が使用されるよう、管１１３がマススペクトロメーターの入口に直接接続される。
デバイス動作に関与する時間イベントを、Ａｒｄｕｉｎｏシステム及び２つの二方ピンチバルブと通信するソフトウェアによって自動化し、正確に制御する。すべてのピンチバルブは、プロセスが開始されるまで閉鎖し、それから、１．３００μＬ／分で、パルスがポンプに送られて、溶媒を２秒間注入し、止めて、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎリザーバーを満たす１０μＬの液滴を形成し；２．管１１２及び１１３を閉鎖し、リザーバー中の溶媒が３秒間、組織と相互作用して、分子を抽出することを可能にし；３．管１１２及び１１３を制御するピンチバルブを同時に開放し、イオン化及び分子分析のために液滴がマススペクトロメーターに移動するのを可能にする。４．パルスがポンプに送られて、溶媒をさらに１２秒間注入し、止めて、すべての抽出された分子をマススペクトロメーターに完全に押しやる。５．管１１２及び１１３をさらに２０秒間開いたままにして、管１１３中のすべての溶媒がマススペクトロメトリーに行くのを可能にする。総分析時間は、３７秒間である。
３つの導管及び高速作動ピンチバルブを使用した先端部設計は、液滴の動きの高精度の制御を可能にし、優れた性能及び堅牢性を示した。サンプル採取から質量スペクトル取得までの全プロセスが１０秒以下で完了し、Ａｒｄｕｉｎｏマイクロコントローラを使用して完全に自動化され、その結果、それぞれの取得及び分析はフットペダルを使用した一段階のクリックにより個々に作動される。システム自動化は、確実に各溶媒液滴が別々に入口に送達されるようにし、サンプルの最終的な分子プロフィールのために平均されるいくつかの質量スペクトルを得る。さらに、制御された液滴送達は、明らかな性能劣化が全くなくマススペクトロメーターが動作するのを可能にする。それぞれの使用後、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎは、残留物が確認される場合、高速で自動化されたクリーニング洗浄により、または使い捨ての先端部を交換することによってきれいにすることができる。
実施例２：分子プロフィール及び分析
本明細書に記載されているシステムは、分子分析のために検体含有溶媒をマススペクトロメーターに輸送するために回収導管をマススペクトロメーター入口と直接接続することによって動作する。この設定は、動作詳細を大幅に簡略化し、イオン化源の使用を排除する。プローブが組織と相互作用した後、その溶媒は、その後、マススペクトロメーターに輸送され、付加的なイオン化源を必要とせず直接注入される。それぞれ１０μＬの溶媒液滴が入口に別々に送達されるようシステムが完全に自動化されるため、マススペクトロメーターはその性能に全く影響なく動作する。脱離エレクトロスプレーイオン化などの他の溶媒抽出アンビエントイオン化技術により観察されるものと類似した豊富な分子情報がこの手法で得られる。イオン化メカニズムは、入口イオン化と類似のものであってもよい。入口イオン化方法に関して、イオン化は、気圧から真空の間の入口の圧力低下領域において生じる。いくつかの溶媒系をデバイスに使用することができる。この実施例において、さまざまな比のエタノール及び水の混合物も調査し、同様の結果を得たが、デバイスの完全な生物学的適合性を確実にするために、唯一の溶媒として水を使用した。実証するために、これらのサンプルを、５：１及び２０：１（Ｈ２Ｏ：ＥｔＯＨ）から構成される溶媒による抽出後に分析し、ＥｔＯＨがＰＥ（４０：６）（ｍ／ｚ ７９０．５３９）及びＰＥ（３８：４）（ｍ／ｚ ７６６．５４０）のような、より多くのＰＥ脂質の抽出を助けることになることを発見した（図３の結果を参照）。
分子情報を得る際のＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎの有効性を、薄い組織切片及び組織サンプルの小片を分析することによって試験した。まず、１６μｍの厚い組織切片を、溶媒として純水を使用してＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎに関する上記の自動化動作ステップに従って標準的な組織スライドガラス上で分析した。ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎのさまざまなリザーバーの直径を有するいくつかのプローブ先端部を試験し、マウス脳組織灰白質、白質、またはより大きな採取サイズに関する混合組成物の脂質化学種の特徴を示す質量スペクトルを得た。図２は、マウス脳組織切片の灰白質領域から、２．７ｍｍのペン先端部を使用してネガティブイオンモードで得た代表的な質量スペクトル、及びスライドガラスの領域（サンプルなし）から得た代表的なバックグラウンド質量スペクトルを示す。ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎのいくつかの直径を試験し、類似の質量スペクトルプロフィールを得、より大きなペン先端部の直径に対して増加したトータルイオンカウントが観察された（図１７）。
図２Ｂは、全分析期間の間に得られたトータルイオンクロマトグラムを示す。０．５分の時点において（図２Ｂの挿入グラフを参照）、純粋なガラスと接触させることによって、バックグラウンド質量スペクトルを得た。質量スペクトルから分かるとおり、この質量スペクトルで、非常にきれいなバックグラウンドシグナルを得た。３．４分の時点において（図２Ａ）、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを、上で述べたのと同じ手順に従ってマウス脳組織切片に適用した。注目すべきことに、豊富な分子プロフィールが観察された。生体組織のアンビエントイオン化マススペクトロメトリーを使用して一般に検出される脂質シグナルが、ネガティブイオンモード質量スペクトルに高い相対強度で観察され、脂肪酸（ＦＡ）、セラミド（Ｃｅｒ）、グリセロホスホイノシトール（ＰＩ）、グリセロホスホエタノールアミン（ＰＥ）、グリセロホスホセリン（ＰＳ）及びステロール脂質（ＳＴ）を含んでいた。一次及び二次内因性代謝産物も質量スペクトルにおいて観察された。ポジティブイオンモードでは、ジラディルグリセロール（ＤＧ）、グリセロホスホコリン（ＰＣ）及びスフィンゴリン脂質（ＳＭ）も検出された。スペクトル中の脂質の大半を同定するために、高分解粉体質量分析器（分解能を１４０，０００とセットした）を利用した。
マウス脳組織切片の灰白質領域から得たネガティブイオンモード質量スペクトルは、溶媒ベースのアンビエントイオン化ＭＳ技術を使用して生体組織から一般に検出される脂質化学種の脱プロトン化されたものまたは塩素付加体と対応するさまざまなイオンを含む、豊富な分子情報を示した。高い相対的存在量のピークを、ｍ／ｚ １２０～３５０の脂肪酸（ＦＡ）、ｍ／ｚ ７００～１１００のスルファチドなどのスフィンゴ脂質及びｍ／ｚ ５００～７００のセラミド（Ｃｅｒ）の塩素付加体、ならびにｍ／ｚ ７００～１１００のグリセロホスホイノシトール（ＰＩ）、グリセロホスホエタノールアミン（ＰＥ）、グリセロホスホセリン（ＰＳ）及び二価カルジオリピン（ＣＬ）などのグリセロリン脂質（ＧＬ）と同定した。ｍ／ｚ １１００～１８００のより高い質量範囲では、ＧＬ二量体及び一価ＣＬが観察された。ｍ／ｚ １４５．０６１のグルタミン、ｍ／ｚ １４６．０４５のグルタメート、ｍ／ｚ １７４．０４１のＮ－アセチルアスパラギン酸及びｍ／ｚ ２１５．０３３のヘキソースの塩素付加体を含む、小さな代謝産物と仮に同定したさまざまなピークが、高い質量精度測定及びタンデムマススペクトロメトリーデータ（表１）に基づいてｍ／ｚ １２０～２５０のより低い質量範囲において検出された。重要なことに、同じマウス脳の異なる組織切片の灰白質から得たネガティブイオンモード質量スペクトル（ＲＳＤ＝９．３％、ｎ＝９）は、ＤＥＳＩ－ＭＳＩに関して同じ方法を使用して報告されたもの（ＲＳＤ＝８．０％、ｎ＝５）に匹敵する再現性があった。ポジティブイオンモードでは、得られた質量スペクトルは、ジアシルグリセロール（ＤＧ）、ＰＥ、及びグリセロホスホコリン（ＰＣ）と同定された高い相対的存在量の一般に観察される分子種を示した（図１８）。構造解釈のためにフラグメントイオンの十分な強度が達成された場合に、高い質量精度測定、ならびにタンデムＭＳ分析を使用して仮の割り当てを行った。タンデムＭＳ実験によって得た質量誤差及びフラグメントイオンのｍ／ｚを、原稿全体をとおして同定されたすべての化学種に関して表１、２、３、４及び５に記載する。なお、複合脂質のＦＡ鎖における二重結合の異性が厳密な構造割り当てを複雑にし、これが、ＦＡ鎖が脂質化学種に仮に割り当てられる理由である（Ｄｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２，２０１１）。
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎスペクトルを、同様のＭＳパラメータ下であるが、生体組織から脂質の抽出に関する高い効率のため、一般的に適用されるアセトニトリル及びジメチルホルムアミド溶媒系を使用して得たＤＥＳＩスペクトルと比較した。興味深いことに、ネガティブイオンモードでは、抽出溶媒として水を使用したＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎからのスペクトルは、ｍ／ｚ ５００からｍ／ｚ １８００の大量の分子種をＡＣＮ及びＤＭＦを使用したＤＥＳＩからのスペクトルと共有し、ＰＥ（４０：６）（ｍ／ｚ ７９０．５３９）及びＰＥ（３８：４）（ｍ／ｚ ７６６．５３９）などのやや高い比率のＰＥ脂質を伴う。図６Ａ～Ｂは、ＰＩ（３８：４）（ｍ／ｚ ８８５．５５０）及びＰＳ（３８：６）（ｍ／ｚ ８３４．５２９）がＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ及びＤＥＳＩからの両スペクトルにおける主ピークであったことを示す。さらに、スペクトルにおいて、さらに高いｍ／ｚのイオンの群がｍ／ｚ １５００からｍ／ｚ １６００の質量範囲に示され、これを、一価カルジオリピン（ＣＬ）及び／またはグリセロリン脂質二量体であると仮に割り当てた。
さらなる分析は、ネガティブイオンモードで検出された分子種を、溶媒として水及び同様の実験条件を使用して同じマウス脳の連続した組織切片から得たＤＥＳＩ質量スペクトルにおいて観察された分子種と比較した。ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ及びＤＥＳＩを使用して得た質量スペクトルは、０．９の算出コサイン類似度で類似しており、多数の分子種を類似の相対的存在量及び信号対雑（Ｓ／Ｎ）比で共有していた（図６Ｃ）。さまざまな比率の水とエタノールの混合物を含む、他の溶媒系も、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ用の溶媒系として調査した。得られた質量スペクトルは、相対的存在量が異なるが純水を使用して得た質量スペクトルにおいて観察されたものと類似の脂質化学種を示した（図３Ｂ）。したがって、デバイスの完全な生体適合性を確保するために、行った以下のすべてのＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ実験に対して溶媒として水を選択した。
システムの性能を評価するために、同じ組織切片及び異なる組織切片に対して連続分析を行い、システムが、サンプル内及び異なるサンプル間で極めて再現性があることを証明した。
ヒトがん及び正常な組織切片の分子分析。アンビエントイオン化マススペクトロメトリーは、ヒトのがん組織の分子診断に関して広く調査されてきた。正常及び腫瘍サンプルを区別するための本明細書に記載されているＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステムの能力を試験するために、乳房、腎臓、リンパ節、甲状腺及び卵巣を含む、５つの異なる組織タイプの６２のヒト組織サンプルを分析した。各組織タイプに関して溶媒系として水を使用してネガティブイオンモードで得た質量スペクトルは、高い相対的存在量の代謝産物及び脂質とともにＤＥＳＩ－ＭＳによって一般的に観察される分子イオンを示した。ヒト試料の種間及び種内分析におけるＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎの性能を統計学的に評価するために、主成分分析（ＰＣＡ）を利用した。すべてで全分散の８５％超を含む最初の３つの成分を本研究に使用することに留意すべきである。図９Ａ～Ｂから分かるとおり、正常な甲状腺及び腎臓組織は、腫瘍組織と十分に区別された。驚くべきことに、ネガティブイオンモード下におけるヒト組織切片の分析の間、一連の多価化学種が検出され、高い質量精度測定及びタンデムマススペクトロメトリー分析によってチモシンβ－４と同定された（図７）。各試料の代表的なスペクトルを図５に示す。注目すべきことに、ヒトの正常な甲状腺及びがん組織から得た分子プロフィールは、疾患状態の診断に役立つ異なる分子パターンを示している。分析したすべての他のがん組織に関しても同様の結果を得た。
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎの能力を試験して、正常及び腫瘍ヒト乳房（ｎ＝５正常な乳房、ｎ＝５乳管癌）ならびに甲状腺（ｎ＝５正常な甲状腺、ｎ＝４甲状腺乳頭癌、及びｎ＝１濾胞性甲状腺腺腫）組織の２０の薄い組織切片を分析した。ネガティブイオンモードで得た各組織タイプに関する質量スペクトルは、ＤＥＳＩ－ＭＳＩによってヒト組織から一般的に観察される豊富な種類の分子イオンを高い相対的存在量の代謝産物、脂肪酸、及び複合脂質とともに示した。例えば、甲状腺乳頭癌組織切片に関して得た質量スペクトルは、さまざまな二価ＣＬ、ならびにＰＩ（３８：４）（ｍ／ｚ ８８５．５５０）、ＰＩ（３６：４）（ｍ／ｚ ８５７．５１８）、ＰＥ（３８：４）（ｍ／ｚ ７６６．５３９）、及びＰＥ（３６：２）（ｍ／ｚ ７４２．５３９）などのその他のグリセロリン脂質を含むＤＥＳＩ－ＭＳＩによって診断マーカーと以前に同定された脂質化学種（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７６，２０１６）を示した（表２）。正常な甲状腺組織切片に関して異なる質量スペクトルプロフィールを得、これは、高い相対的存在量のヨウ素と同定されたｍ／ｚ １２６．９０４、グルタミンと同定されたｍ／ｚ １４５．０５０、アスコルビン酸と同定されたｍ／ｚ １７５．０２４、Ｃ３６Ｈ７８Ｏ９Ｎ３Ｉと仮に割り当てられたｍ／ｚ ８２２．４７２、及びＰＩ（３８：４）と同定されたｍ／ｚ ８８５．５５１を示した（図８Ｂ）。興味深いことに、ｍ／ｚ ９９１．０９１（ｚ＝－５）、ｍ／ｚ １２３９．１１３（ｚ＝－４）、及びｍ／ｚ １６５２．４８４（ｚ＝－３）を含む異なる電荷状態（ｚ）の一連の多価分子イオンが分析したすべての組織切片から得た質量スペクトルで検出された。これらのイオンを、高い質量精度測定に基づいて異なる電荷状態のタンパク質チモシンβ－４と仮に同定した（図７及び表１）。特に、分析したヒト組織切片から得たデータに対して行った主成分分析（ＰＣＡ）は、腫瘍組織と正常な組織の間の分離を示した（図９）。
新鮮組織サンプルの分子分析。ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎデバイスを形態に関係なく新鮮組織サンプルに対して動作するよう設計した。新鮮組織分析に関してデバイスを試験するために、新鮮マウス脳組織を最初に使用した。マウス脳組織切片または新鮮脳組織から得たスペクトルに有意な差は確認されなかった。図４Ａ～４Ｂは、マウス脳新鮮組織及び組織切片のほぼ同一のマススペクトロメトリーパターンを示しており、これは、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎからの抽出プロセスが異なるサンプル調製ステップに対して同様に働くことを示す。その後、甲状腺及びリンパ節の２つのタイプの新鮮ヒト試料をさらに分析した。正常及び癌性甲状腺新鮮組織サンプルのスペクトルを図８に示した。
組織バンクから入手したすべての凍結試料は、冷凍庫で－８０℃未満に適切に保存し、使用前に室温で解凍したことに留意すべきである。新鮮ヒト試料から収集したデータもＰＣＡによって処理した。記録されたスペクトルのＰＣＡは、正常サンプルと腫瘍サンプルの間に明らかな相違を示している（図１０Ａ～１０Ｂ）。したがって、新鮮な正常サンプル及び患部サンプルを区別するためにＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎが利用できるであろうことを確定している。サンプル採取プロセスによる組織への損傷が観察されなかったことに留意すべきである。
表１：選択されたネガティブイオンモード分子イオンの同定に関してマウス脳組織から得たデータ。
Figure 2022159359000002
表２．選択されたネガティブイオンモード分子イオンの同定に関してヒト甲状腺組織から得たデータ。
Figure 2022159359000003
表３．選択されたネガティブイオンモード分子イオンの同定に関してヒト卵巣組織から得たデータ。
Figure 2022159359000004
表４．選択されたネガティブイオンモード分子イオンの同定に関してヒト肺組織から得たデータ。
Figure 2022159359000005
表５．選択されたネガティブイオンモード分子イオンの同定に関してヒト乳房組織から得たデータ。
Figure 2022159359000006
表６．この試験に使用した２５３のヒト組織サンプルの患者基本情報。
Figure 2022159359000007
材料及び方法。
マススペクトロメーター。Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐマススペクトロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、サンホゼ、ＣＡ）を使用した。ｍ／ｚ １２０～１８００の範囲でフルスキャンを行い、その他のマススペクトロメトリーパラメータを以下に挙げた：分解能 １４００００、マイクロスキャン ２、最大注入時間 ３００ｍｓ、キャピラリー温度 ３５０℃及びＳ－レンズ ＲＦレベル １００。
生体組織。野生型マウス脳をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴから購入した。乳房、甲状腺、リンパ節、卵巣、及び腎臓を含む、６２の凍結ヒト組織試料を、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ及びＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋから入手した。サンプルを、－８０℃の冷凍庫で保存した。ＣｒｙｏＳｔａｒ（商標）ＮＸ５０クライオスタットを使用して組織スライドを１６μｍで切断した。凍結組織試料を使用前に室温下で解凍した。
統計分析。データのパターンを明らかにするためにＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２２．０（ＩＢＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、アーモンク、ＮＹ、米国）を使用して主成分分析（ＰＣＡ）を行った。未処理データを直接使用して分析を行った。７００～９００のｍ／ｚ範囲の上位の相対強度の１０個のピークをＰＣＡのために使用した。一般に、３つの成分すべてで全分散の８５％超を含む最初の３つの成分を本結果に使用している。
実施例３：手持ち及び腹腔鏡使用のためのシステム自動化
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ設計に使用したすべての材料（ＰＤＭＳ及びＰＴＦＥ）ならびに溶媒（水のみ）は生物学的に適合しているため、このシステムは、リアルタイム分析のために手持ち様式で手術に使用される高い潜在能力を有する。その他に、デバイスの寸法が小さいため、それを、アクセサリーポートまたはそのロボットアームの１つによりダ・ヴィンチ手術システムなどのロボット手術システムに組み込むことさえできる。ヒトの体腔のいくつかの領域は、手術中に迅速に採取され、分子署名のデータベース及び機械学習アルゴリズムを使用することによって分析することができる。したがって、それぞれの採取領域に対する診断結果がリアルタイムで得られる。このシステムは、組織のリアルタイムキャラクタリゼーション及び診断が必要とされる多種多様な腫瘍学的及びその他の外科的処置（子宮内膜症など）に広く使用することができる。
実施例４：組織サンプルの予測分析
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ設計を、正常な組織サンプルとともに乳癌、肺癌、卵巣癌、または甲状腺癌を有する患者からの組織サンプルを分析するために使用した。これらのサンプルを分析する前に、サンプルを質量対電荷比（ｍ／ｚ）が０．０１に最も近くなるように丸め、トータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を正規化することによって処理した。すべてのバックグラウンドｍ／ｚピーク及び患者サンプルのうちの１０％未満に現れたピークも除去した。全質量範囲を分析に使用した。訓練された分類器は、ｌａｓｓｏロジスティック回帰モデルとした。がんの存在が分析された組織サンプルに関して、すべての分類器に関する全般的な性能結果を表７に示す。全般的な結果は、９６．３％の精度、９６．４％の感度、及び９６．２％の特異度を有する。
表７：すべての正常対すべてのがんの実際の判定に対する組織サンプル予測＊
Figure 2022159359000008
肺癌の存在が分析された組織サンプルに関して、表８は、組織サンプルの識別に使用した質量対電荷値（ｍ／ｚ）をその特定の値に対する関連係数とともに示す。
表８：正常な肺対肺癌に関する肺癌の質量対電荷値（ｍ／ｚ）及び係数
Figure 2022159359000009
表９は、分析率ならびに各サンプルの分類を、行に実際の（組織学的）判定及び列に予測値とともに示す。がん組織サンプルの、サンプルは、９６．８％の精度、９７．９％の感度、９５．７％の特異度及び０．９７のＡＵＣで特定された。
表９：肺癌に関する実際の判定に対する組織サンプル予測
Figure 2022159359000010
表１０及び表１１に示したとおり正常な肺対腺癌サンプルに対して同様の分析を行った。サンプルは、９２．２％の精度、８８．２％の感度、９３．６％の特異度、及び０．９８のＡＵＣで特定された。
表１０：正常な肺対腺癌に関する肺癌の質量対電荷値（ｍ／ｚ）及び係数
Figure 2022159359000011
 表１１：肺扁平上皮癌に関する実際の判定に対する組織サンプル予測
Figure 2022159359000012
表１２及び表１３に示したとおり正常な肺対扁平上皮サンプルに対して同様の分析を行った。サンプルは、９３．８％の精度、８８．２％の感度、９５．７％の特異度、及び０．９３のＡＵＣで特定された。
表１２：正常な肺対肺扁平上皮癌に関する肺癌の質量対電荷値（ｍ／ｚ）及び係数
Figure 2022159359000013
 表１３：肺癌に関する実際の判定に対する組織サンプル予測
Figure 2022159359000014
上記の肺癌に対して行った分析と同様に、卵巣癌、甲状腺癌、及び乳癌を用いて同様の分析を行い、サンプルの各セットに関するそれぞれのｍ／ｚピーク及び係数を示す。卵巣癌サンプルは、９４．７％の精度、１００％の感度、８９．７％の特異度、及び０．９８のＡＵＣで検出された。甲状腺癌サンプルは、９４．７％の精度、９０．９％の感度、９６．３％の特異度、及び０．９３のＡＵＣで検出された。最後に、乳癌サンプルは、９５．６％の精度、８７．５％の感度、１００％の特異度、及び１．００のＡＵＣで検出された。
表１４：卵巣癌の質量対電荷値（ｍ／ｚ）及び係数
Figure 2022159359000015
 表１５：卵巣癌に関する実際の判定に対する組織サンプル予測
Figure 2022159359000016
 表１６：正常な甲状腺対良性腫瘍に関する甲状腺癌の質量対電荷値（ｍ／ｚ）及び係数
Figure 2022159359000017
 表１７：正常な甲状腺対良性腫瘍に関する実際の判定に対する組織サンプル予測
Figure 2022159359000018
 表１８：正常な甲状腺対悪性腫瘍に関する甲状腺癌の質量対電荷値（ｍ／ｚ）及び係数
Figure 2022159359000019
 表１９：正常な甲状腺対良性腫瘍に関する実際の判定に対する組織サンプル予測
Figure 2022159359000020
 表２０：正常な乳房対乳癌に関する甲状腺癌の質量対電荷値（ｍ／ｚ）及び係数
Figure 2022159359000021
 表２１：正常な乳房対乳癌に関する実際の判定に対する組織サンプル予測
Figure 2022159359000022
実施例５：ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステムの空間分解能
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎシステムの空間分解能を試験し、特定の箇所を使用してさらに高い空間分解能を判定できるであろうことを確認した。試験は、マウス脳の白質対灰白質を使用して行った。図１１Ａ～１１Ｅに示されているのは、特定のサイズの箇所を用いて試験した脳の部分を示している。特に、サンプル箇所１は、その箇所が主に灰白質から構成されたことを示している。
実施例６：組織サンプルの非破壊分子分析
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎは、組織の硬さ及び形態に関係なく直接組織試料に動作するよう設計した。ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎの性能を試験して、マウス脳ならびにヒト乳房、甲状腺、肺及び卵巣組織を含むさまざまな臓器からの柔らかい組織サンプル（０．１～５ｇ）を分析した。周囲条件において、前に記載した同じ自動化動作ステップに従い単純な一段階実験により組織分析を行った。ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ先端部を、抽出が行われる間の３ｓの期間、組織サンプルの表面と穏やかに接触させた。マウス脳の灰白質の領域に対して得られた質量スペクトルは、再現性があり（ＲＳＤ＝４．６％、ｎ＝１０）、マウス脳組織切片の質量スペクトルと極めて類似しており（０．９３のコサイン類似度）（図４）、それにより組織表面における抽出プロセスが組織形状及び硬さとは関係なく効率的に行われることが示された。同様に、とりわけ、上皮及びがん細胞から構成される組織のヒト組織サンプルのＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析は、豊富な分子情報をもたらした。間質などの柔らかい結合組織から主に構成された非がん組織試料は、あまり豊富でない質量スペクトルプロフィールをもたらした。特に、分析した正常な乳癌組織サンプルの多くは脂肪含有を示し、これは、水と混和しないため、乳癌組織または正常な乳癌腺と比較した場合に質量スペクトルにあまり豊富ではないトータルイオンカウントをもたらした。
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析後のすべての組織サンプルの視覚的及び微視的検査から、調べた領域の組織サンプルの形態に検知可能な損傷は示されなかった。図１５は、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析の前、最中、後の肺組織サンプルから得た光学イメージを示す。分析した領域において組織に確認できる損傷は見られなかったが、豊富な質量スペクトルプロフィールを得た（図１５）。なお、組織は小さな水滴にさらされるだけで、リザーバーからマススペクトロメーターに液滴を輸送するために真空が使用されないため、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎの自動化され、時間制御された動作ステップは組織損傷を防ぐ。したがって、これらの結果は、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎが組織サンプルから豊富な分子情報を得るための非破壊アプローチであるという証拠を提供する。
実施例７：ヒト組織におけるがんの分子診断及び統計的予測
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを使用してヒト組織サンプルから得た分子情報が診断に役立ち、疾患状態の予測に役立つかどうかを次に評価した。９５の肺サンプル（４７の正常なサンプルならびに１７の腺癌、１７の扁平上皮癌、及び１４のその他の組織学的サブタイプのがんサンプルを含む４８のがんサンプル）、５７の卵巣サンプル（２９の正常及び２８のＨＧＳＣ）、５７の甲状腺サンプル（２７の正常、１１の濾胞性甲状腺腺腫及び１８の甲状腺乳頭癌）、及び４５の乳房サンプル（２９の正常及び１６の乳管癌）を含む、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを使用した合計２５３のヒト組織試料（図１１）。患者人口統計学情報を表６に示す。ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析後、分析した領域の境界を定め、一連の光学イメージにより示した。その後、サンプルの平行する小片を、凍結し、境界を定めた領域で切断し、Ｈ＆Ｅ染色し、組織病理学によって評価して、診断を導き出した。主たる細胞組成物を含むサンプルのみ及び明白な診断を使用して、分子データベースを構築した。がんサンプルに対して得られた組織学的に実証された質量スペクトルは、アンビエントイオン化ＭＳ技術を使用して潜在的な疾患マーカーとして以前に示されたいくつかの脂質及び代謝産物と同定された分子種を示した。肺癌組織に関して、ＰＩ（３６：１）と同定されたｍ／ｚ ８６３．５６５、ＰＧ（３６：２）と同定されたｍ／ｚ ７７３．５４２、ＰＧ（３４：１）と同定されたｍ／ｚ ７４７．５１４などの特徴的な分子マーカー及びＦＡ（１８：１）と同定されたｍ／ｚ ２８１．２４９などの脂肪酸が観察された（図１５及び表４）。正常な肺に関して、ＰＩ（３８：４）と同定されたｍ／ｚ ８８５．５５０、及びＰＥ（３６：１）と同定されたｍ／ｚ ７４４．５５２が観察された。乳癌組織に対して得られた質量スペクトルは、ＤＥＳＩ－ＭＳＩ（２９、３０）によって前に示されたＰＩ（３８：４）と同定されたｍ／ｚ ８８５．５５０、ＰＩ（３６：１）と同定されたｍ／ｚ ８６３．５６５、ＰＧ（３６：２）と同定されたｍ／ｚ ７７３．５４２、ならびにＦＡ（２０：４）と同定されたｍ／ｚ ３０３．２３３、及びＦＡ（１８：１）と同定されたｍ／ｚ ２８１．２４９などのいくつかのＦＡを含む診断用脂質マーカーを示した（表５）。分析した２５３のすべてのヒト組織サンプルに対して得られたデータに対して行ったＰＣＡは、各臓器に関してがんと正常な組織の間の分離を示した（図１１）。
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分子署名ががん及び正常な組織の予測に役立つかどうかを評価するために、組織学的に実証された質量スペクトルデータベースを使用して分類モデルを構築するためにＬａｓｓｏ法を適用した。モデルの性能を、リーブ・ワン・ペイシェント・アウト・クロス・バリデーションアプローチにより評価し、がんに対する感度及び特異度、ならびに精度及びＡＵＣによって判定した（表２２）。乳癌（ｎ＝４５）に関して、８７．５％の感度、１００％の特異度（ＡＵＣ＝１．０）、９５．６％の全体的な精度が達成され、これは、ＤＥＳＩ－ＭＳＩ（９８．２％の精度、ｎ＝１２６）（Ｇｕｅｎｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７５，２０１５））、ｉＫｎｉｆｅ（９５．５％の精度、ｎ＝１０）（Ｂａｌｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５，２０１３）、及び脂質及びタンパク質のＭＡＬＤＩイメージング（９４．１％の精度、ｎ＝６８）（３１）を使用して報告された結果と類似している。ＨＧＳＣ（ｎ＝５７）に関して、１００％の感度、８９．７％の特異度、及び９４．７％の精度が達成され（ＡＵＣ＝０．９８）、これもＤＥＳＩ－ＭＳＩ（９７．１％の精度、ｎ＝３１）（Ｓａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７）によって得られた分類結果と類似している。肺癌（ｎ＝９５６）に関して、９８．０９７．９％の感度、９５．７％の特異度、及び９６．８９％の精度が達成された（ＡＵＣ＝０．９７）。肺癌組織学的サブタイプに基づいて予測する場合、それぞれ扁平上皮癌及び腺癌に対して９３．８％及び９２．２％の精度が達成された。調査した甲状腺腫瘍サンプルは、良性濾胞性甲状腺腺腫（ＦＴＡ）及び悪性甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）サンプルを含んでいた。それぞれに対する分類器を構築し、ＦＴＡに対して９４．７％の精度及びＰＴＣに対して９７．８％の精度を得た。全体的に、調査した４つのタイプのがんすべてに対して９６．４％の感度、９６．２％の特異度及び９６．３％の精度が達成された。これらの結果は、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎによってヒト組織サンプルから得た分子情報が高度にがんの予測に役立つことを示している。さらに、この結果は、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを使用して得た分子データに対して構築された統計的分類器が確固としたものであり、組織サンプルの迅速な臨床診断のための自動化アプローチに使用できることを示している。
表２２：ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを使用して得たサンプル及び結果の説明。病理診断、患者サンプルの数、ならびにリーブ・ワン・アウト・クロス・バリデーションアプローチを使用して得たＬａｓｓｏ予測の感度、特異度、精度、及び曲線下面積を示す。
Figure 2022159359000023
実施例８：組織学的に異なる癌周辺組織領域のサンプル内分析
組織学的に異なる領域を特定するためのＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎの能力を、正常な卵巣間質組織に隣接するＨＧＳＣの領域を含む１つのヒト組織サンプルで評価した。図１４Ａに示した光学イメージにおいて境界を定めたとおりの組織サンプルの５つの連続する箇所を、直径が１．５ｍｍのＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを使用して分析した。ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎによって分析した領域を含むサンプルの組織切片を、Ｈ＆Ｅ染色に供し、組織病理学で評価した。箇所１及び２は、専門家の病理医が正常な間質と診断したが、領域４及び５は、ＨＧＳＣと診断した。箇所３は、がん領域と正常な間質組織領域の間の境界部にあり、約５０％腫瘍組織及び約５０％正常な間質組織を示した。図１４Ｂは、箇所１、３及び５に対して得られた質量スペクトルを示す。箇所５、ＨＧＳＣに対して得られたスペクトルは、統計的分類器を構築するためにエクスビボで分析したＨＧＳＣ組織において検出された特徴的な脂質マーカーを示す（表３）。正常な卵巣間質組織と診断された箇所１に対して得られた質量スペクトルは、エクスビボで分析した間質組織に対しても観察された分子イオンをあまり豊富でない量で示した。箇所３は、分析した領域内に存在する正常な間質組織の寄与により、低い総存在量でＨＧＳＣの分子プロフィールの特徴を示した。５つの箇所に対して得られた質量スペクトルは、その後、独立した検証セットとして本発明者らの卵巣癌分子分類器によって評価した。注目すべきことに、これは、予測した箇所１及び２を正常と、３、４及び５をがんと適切に分類した（図１４Ｃ）。組織学的に異なる領域を含む異なる組織サンプルに対して同様の結果を得た（図１９）。これらの結果は、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎによって得た分子情報が正常細胞とがん細胞の混合組成物を用いて境界領域でがんを検出するために使用できることを示している。
実施例９：手術中のヒト乳癌のマウスモデルのインビボ分析
インビボ分子診断ツールとして完全な適合性を確保するために生体適合性材料を用いてＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを設計した。ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを、ヒト乳癌のマウスモデルを使用したインビボ組織分析に関して試験した。ＢＴ４７４ ＨＥＲ２＋乳癌細胞を、胸腺欠損ヌードマウスの皮下に移植した（ｎ＝３）。２５０ｍｍ３の平均になるまで４週間にわたって腫瘍を増殖させた。すべての手術及びＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析手技は、麻酔下で行った。手術用刃を使用して、腫瘍周辺の皮膚の組織弁を切開した後、皮膚組織弁を腫瘍の表面から注意深く切り分けた。露出した腫瘍を、その後、前に記載した同じ自動化実験ステップに従ってＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを使用して分析した。図１６Ａは、手術の開始前、分析前（及び皮膚の外科的除去後）、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析中、ならびに分析後の麻酔下の動物の光学イメージを示す。腫瘍の上部、部分的な腫瘍摘出後の腫瘍の中心、ならびに隣接する正常な柔らかい結合組織の複数の位置を含むいくつかの組織領域を、調査した各動物に対して分析した。腫瘍領域に対して得られた質量スペクトルは、ヒト乳房組織において観察される多くの分子種を、隣接する正常な柔らかい結合組織領域に対して得られたものとは明らかに異なるプロフィールで示す（図１６Ｂ）。Ｈ＆Ｅ染色した組織切片の得られた光学イメージによって示されるとおり、分析した組織領域に対するＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析による観察可能な巨視的または微視的損傷は光学顕微鏡法を使用して検出されなかった（図２０）。さらに、手術中のＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析による動物の健康への明白な影響は観察されなかった。インビボ分析後、新たに切除した腫瘍試料もエクスビボで分析し、同じ組織領域の再分析プロセスのためである可能性が高い、相対的存在量の変動にもかかわらずインビボ分析において観察されたものと共通の脂質化学種を含む質量スペクトルを得た（図２１）。これらの結果は、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎがインビボ分子評価及びがん診断に適していることを示唆している。
実施例１０：材料及び方法
試験デザイン：この試験の目的は、ヒト組織サンプルにおいてがんを非破壊分析し、診断するための新規のマススペクトロメトリーベースのプローブの可能性を評価することである。この試験では、正常ならびにがんの乳房、肺、甲状腺、及び卵巣組織を含む２８２人の患者から得たヒト組織サンプルの分子プロフィールを調査した。すべての患者サンプルは、承認された施設内審査委員会（ＩＲＢ）プロトコルの下でＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）、Ａｓｔｅｒａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（デトロイト、ＭＩ）、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ、及びＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋから入手した。組織サンプルにＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを使用して得た質量スペクトルを、正規化し、バックグラウンド除去し、分類モデルを構築するための統計的技術を使用して分析した。専門委員会による正式認可病理医（Ｊ．Ｌ、Ｗ．Ｙ、及びＮ．Ｃ）が、分析した組織サンプルから得たＨ＆Ｅ染色した組織切片を評価した。マススペクトロメトリー分析からの取得物についてのあらゆる情報は病理医には見えないようにした。サンプルは、細胞組成物中に実質的な不均一性があると病理医によって判断された場合、統計分析から除外し、それには２８のサンプルが含まれた。承認されたＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）プロトコルの下でインビボ動物モデル実験を行った。
ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎの設計及びエンジニアリング：３Ｄ印刷機（Ｍｏｄｅｌ ｕＰｒｉｎｔ ＳＥ ｐｌｕｓ）を使用して、重要な構成要素－－ＰＤＭＳ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、ミッドランド、ＭＩ、米国）プローブ先端部を印刷した。ペン先端部を、陰性モデルによりエラストマーを注入成形した後、モデルを溶解除去することによって作製した。陰性モデルを、ＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓ計算機援用設計（ＣＡＤ）ソフトウェアを使用して設計した後、ＡＢＳプラスチック（Ｓｔｒａｔａｓｙｓ、イーデンプレーリー、ＭＮ、米国）及び可溶性サポート材を使用して３Ｄ印刷機によりかたどった堆積物を融合した。その後、サポート材を除去するために、サポート材が完全に溶解するまでサポート除去装置（ＳＣＡ－１２００ＨＴ、ＳＣＡ）及び溶媒（ＥｃｏＷｏｒｋｓ）を使用して７０℃で２４時間、部品を洗浄した。注入成形のために、ＰＤＭＳエラストマーベース及び硬化剤の混合物（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）をそれぞれ１０：１の重量比で調製した。その混合物を、３Ｄ印刷モデルに注ぎ、オーブン（１０ＧＣＥ－ＬＴ、Ｑｕｉｎｃｙ Ｌａｂ）において７４℃で１時間硬化させた後、アセトン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ、米国）とともに密閉容器に入れて、溶解させた。最終洗浄ステップは、あらゆる残りのＡＢＳを除去するために、先端部をアセトン中で超音波処理しておいた。ＰＴＦＥ管（ＩＤ １／３２インチ、ＯＤ １／１６インチ、Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ、ヴァーノン・ヒルズ、ＩＬ、米国）を、実験のためにプローブ先端部に直接挿入した。
データ取得：すべての実験を、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐマススペクトロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、サンホゼ、ＣＡ）により行った。分解能１４０，０００、３５０℃のキャピラリー温度及び１００のＳ－レンズ ＲＦレベルを使用してｍ／ｚ １２０～１８００の範囲でフルスキャンを行った。野生型マウス脳をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ（ウェストベリー、ＮＹ）から購入した。凍結した乳房、甲状腺、卵巣、及び肺を含む合計２８２のヒト組織試料を入手し、サンプルが室温で解凍される分析まで－８０℃の冷凍庫で保存した。その組織を表面に置き、示した実験ステップを使用したＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎによって分析した。実験後に、分析した組織領域に注釈を付け、凍結し、１６μｍの組織切片をＣｒｙｏＳｔａｒ（商標）ＮＸ５０クライオスタットを使用して作製した。組織小片のさまざまな領域のさらなる組織切片をＭＳ分析のために得た。切片が室温に置かれ、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎによって分析される分析まで、組織切片を凍結状態に維持した。その後、組織切片をＨ＆Ｅ染色し、組織病理学によって評価した。分子データベースのための基準として病理診断を使用した。
インビボ実験：インビボ実験を、マウスが麻酔（２％イソフルラン、９８％Ｏ２）下にある間のマウス動物モデルを使用した腫瘍の外科的摘出中に行った。ＢＴ４７４ ＨＥＲ２＋細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ Ｌ－グルタミン、及び１％インスリンを加えた改変最小必須培地（ＩＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）中、５％Ｏ２及び３７℃で８０～９０％の集密度まで増殖させた。血球計数器及びトリパンブルー色素排除により細胞を計数した。雌の胸腺欠損ヌードマウス（Ｎ＝３）の襟首の皮下に０．７２ｍｇの６０日放出１７β－エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、サラソタ、ＦＬ）を埋め込んだ。およそ２４時間後に、２０％成長因子低減マトリゲルを含む無血清ＩＭＥＭ培地中のＢＴ４７４乳癌細胞（１０７）を、マウスの右脇腹の皮下に注射した（１００μＬの全注射）。腫瘍を、直径０．７～１．０ｃｍ（２５０ｍｍ３の平均）に到達するまで週に１回増殖に関して観察した。その時点で、マウスが麻酔（２％イソフルラン、９８％Ｏ２）下にある間にすべての外科手技を行った。手術用刃を使用して、腫瘍の周囲に推定１～２ｃｍの間隔を残して皮膚の組織弁を切開し、その後、皮膚組織弁を腫瘍の表面から切り分けた。ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎを使用していくつかの領域において分析した腫瘍及び隣接する正常な組織を露出させるために皮膚を折り返した。その後、腫瘍の小片を、メスを使用して切除し、エクスビボで分析した。診断のために、ＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎによって分析した腫瘍組織領域に注釈を付け、急速凍結し、切断し、Ｈ＆Ｅ染色に供した。
統計分析：それぞれ１０秒間のＭａｓＳｐｅｃ Ｐｅｎ分析の間に入手した３つの質量スペクトルの平均を使用して、分子データベースを構築した。Ｘｃａｌｉｂｕｒ未処理データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌスプレッドシート形式に変換した。スペクトルの全質量範囲を、ｍ／ｚ値を小数第２位に丸めることによってビンに分割した。すべての質量スペクトルは、実験間で生じる可能性のあるシグナル強度のわずかな変動を明らかにするために、トータルイオンカウント（ＴＩＣ）に従って、またはｍ／ｚ ８８５．５５の絶対強度に最初に正規化した。その後、バックグラウンドピークならびに分析したサンプルの少なくとも１０％に現れないピークを、ランダムノイズを低減するために除外した。
それぞれの組織切片（乳房または甲状腺）に関して、分析したそれぞれの組織切片の４つの代表的な質量スペクトルを、ウェブサイト組込み関数を使用した主成分分析（ＰＣＡ）のためにｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔ．ｃａ／）にインポートした。スコアプロット及びローディングプロットを、それぞれの組織タイプに対してウェブサイトにより生成した。それぞれの柔らかい組織サンプルタイプ（乳房、甲状腺、肺、及び卵巣）に関して、そのデータをＲプログラミング言語にインポートした。ＰＣＡは、前処理したデータの平均０へのセンタリング及びＲのｐｒｃｏｍｐ関数を使用した主成分の計算によって行った。最初に３つの主成分をＲ用のｒｇｌ及びｐｃａ３ｄパッケージを用いて視覚化した。組織分類に関して、ＣＲＡＮ Ｒ言語ライブラリーのｇｌｍｎｅｔパッケージを使用してＬａｓｓｏ法を適用した。Ｌａｓｓｏを使用して生成されたモデルは、「スパース」モデル、すなわち、特徴のサブセットのみを含むモデルをもたらすため、その他の正則化法よりも解釈が簡単である。統計学的に情報を与えるそれぞれの特徴に対する数学的重みは、特定のクラスを特徴付けする際に質量スペクトルの特徴が有する重要性に応じてＬａｓｓｏによって算出する（がん対正常、またはがんサブタイプ対正常）。訓練セット内の予測精度を評価するために、リーブ・ワン・アウト・クロス・バリデーションアプローチを使用して分類を行った。訓練された分類器の性能を、感度、特異度、精度、及びＡＵＣによって判断した。
・・・
本明細書において開示され、特許請求される方法のすべては、本開示に照らして過度の実験を行うことなく生成し、実行することができる。本発明の組成物及び方法を好適な実施形態の項に記載してきたが、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく本明細書に記載の方法及び方法のステップまたはステップの順序に変化が適用されてもよいことは当業者には明白であろう。さらに具体的には、化学的及び生理学的の両方で関連する特定の薬剤が本明細書に記載されている薬剤に置換されてもよく、それと同時に同じまたは同様の結果が達成されるであろうことは明白であろう。当業者に明白なすべてのそのような類似の代替物及び改変物は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲内にあると考えられる。

Claims (136)

  1. マススペクトロメトリー分析のためのサンプルを作製するための装置であって、
    溶媒を含むチャンバーと；
    加圧ガス供給部と；
    マススペクトロメーターと；
    リザーバー、第１の導管、第２の導管及び第３の導管を備えたプローブと
    を含み、
    前記リザーバーは、前記第１の導管、前記第２の導管及び前記第３の導管と流体連結しており；
    前記第１の導管は、前記チャンバーと流体連結しており；
    前記第２の導管は、加圧ガス供給部と流体連結しており；
    前記第３の導管は、前記マススペクトロメーターと流体連結している、前記装置。
  2. 前記装置は、イオン化源と連結されていない、請求項１に記載の装置。
  3. イオン化源とさらに連結されている、請求項１に記載の装置。
  4. 前記プローブは、手持ち型であるように設計されたハウジングに含まれる、請求項１に記載の装置。
  5. 前記プローブは、腹腔鏡手術デバイスと連結されるよう設計されたハウジングに含まれる、請求項１に記載の装置。
  6. 前記リザーバーは、前記溶媒の液滴を形成し、保持するよう構成される、請求項１に記載の装置。
  7. 前記加圧ガス供給部は、０．１ｐｓｉｇから５．０ｐｓｉｇの間の圧力でガスを前記プローブに提供する、請求項１に記載の装置。
  8. 前記加圧ガス供給部は、０．５ｐｓｉｇから２．５ｐｓｉｇの間の圧力でガスを前記プローブに提供する、請求項１に記載の装置。
  9. 前記加圧ガス供給部は、１００ｐｓｉｇ未満の圧力でガスを前記プローブに提供する、請求項１に記載の装置。
  10. 前記加圧ガス供給部は、空気、窒素または二酸化炭素を前記プローブに提供する、請求項１に記載の装置。
  11. 個別の体積の前記溶媒を前記チャンバーから前記第１の導管に移動させるよう構成されたポンプをさらに備える、請求項１に記載の装置。
  12. 前記ポンプによって提供される前記個別の体積の前記溶媒は、前記第１の導管から前記プローブリザーバーへ通過し、ここで、前記個別の体積の前記溶媒が、表面と直接接触している、請求項１１に記載の装置。
  13. 前記表面は、組織部位である、請求項１２に記載の装置。
  14. 前記第３の導管から前記マススペクトロメーターへの流れを制御するよう構成された第１のバルブをさらに備える、請求項１に記載の装置。
  15. 前記第１のバルブが開放位置にあるとき、前記第３の導管は、真空下にある、請求項１４に記載の装置。
  16. 前記第２の導管を通る加圧ガスの流れを制御するよう構成された第２のバルブをさらに備える、請求項１に記載の装置。
  17. 前記溶媒は、水を含む、請求項１に記載の装置。
  18. 前記溶媒は、エタノールを含む、請求項１に記載の装置。
  19. 前記溶媒は、１から２５％のエタノールを含む、水性混合物を含む、請求項１に記載の装置。
  20. 前記プローブは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）及び／またはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）を含む組成物から形成される、請求項１に記載の装置。
  21. 前記プローブは、使い捨てである、請求項１に記載の装置。
  22. 前記プローブは、取り出し可能な回収先端部を備える、請求項１に記載の装置。
  23. 前記リザーバーは、５．０マイクロリットルから２０マイクロリットルの間の体積を有する、請求項１に記載の装置。
  24. 前記プローブは、前記プローブの位置を追跡するよう構成された追跡デバイスを備える、請求項１に記載の装置。
  25. 前記第１の導管を通る前記チャンバーから前記リザーバーへの溶媒流；
    前記第２の導管を通る前記加圧ガス供給部から前記リザーバーへの加圧ガス流；及び
    前記第３の導管を通る前記リザーバーから前記マススペクトロメーターへのサンプル流
    を制御するよう構成された制御システムをさらに備える、請求項１１に記載の装置。
  26. 前記制御システムは、
    １から３秒の間の時間、毎分２００から４００マイクロリットルの間の流量に前記溶媒流を制御する；
    １０から１５秒の間の時間、０．１から１５ｐｓｉｇの間の流量に前記加圧ガス流を制御する；
    １０から１５秒の間の時間、前記サンプル流を制御するよう構成される、請求項２５に記載の装置。
  27. 前記制御システムは、溶媒流を開始するペダルを備える、請求項２５に記載の装置。
  28. 前記マススペクトロメーターは、サンプル分析を提供可能なコンピュータと電子通信状態にある、請求項１に記載の装置。
  29. 前記コンピュータは、前記サンプル分析の視覚的または聴覚的表示を提供する、請求項２８に記載の装置。
  30. 前記第３の導管と流体連結した廃棄物容器をさらに備える、請求項１に記載の装置。
  31. 流体を前記第３の導管から前記廃棄物容器へ分岐するよう構成されたバルブをさらに備える、請求項３０に記載の装置。
  32. 前記廃棄物容器の内容物を除去するよう構成されたポンプをさらに備える、請求項３０に記載の装置。
  33. 前記第３の導管と流体連結したポンプをさらに備える、請求項１に記載の装置。
  34. 前記ポンプは、前記第３の導管内の内容物の速度を増加させるよう構成される、請求項３３に記載の装置。
  35. 前記第３の導管に結合された加熱要素をさらに備える、請求項１に記載の装置。
  36. 前記加熱要素は、加熱線である、請求項３５に記載の装置。
  37. 前記第３の導管と流体連結したイオン化デバイスをさらに備える、請求項１に記載の装置。
  38. 前記イオン化デバイスは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）デバイスである、請求項３７に記載の装置。
  39. 前記イオン化デバイスは、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）デバイスである、請求項３７に記載の装置。
  40. 前記イオン化デバイスは、マススペクトロメーターに対する入口の近位にスプレーを形成するためのものである、請求項３７に記載の装置。
  41. 前記第３の導管は、前記マススペクトロメーターと直接連結されていない、請求項１に記載の装置。
  42. 前記第３の導管と流体連結したベンチュリデバイスをさらに備える、請求項１に記載の装置。
  43. 前記装置は、超音波または振動エネルギーの適用のためのデバイスを含まない、請求項１に記載の装置。
  44. 対象からの組織サンプルを評価するための方法であって、
    （ａ）固定または個別の体積の溶媒を前記対象の組織部位に適用することと；
    （ｂ）前記適用された溶媒を回収して、液体サンプルを得ることと；
    （ｃ）前記サンプルをマススペクトロメトリー分析に供することと
    を含む、前記方法。
  45. 前記固定または個別の体積の溶媒は、スプレーとして適用されない、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記固定または個別の体積の溶媒は、液滴として適用される、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記固定または個別の体積の溶媒は、１００ｐｓｉｇ未満の圧力を使用して適用される、請求項４４に記載の方法。
  48. 前記固定または個別の体積の溶媒は、１０ｐｓｉｇ未満の圧力を使用して適用される、請求項４４に記載の方法。
  49. 前記固定または個別の体積の溶媒は、前記溶媒を溶媒導管を通して移動させるための機械式ポンプを使用して適用される、請求項４４に記載の方法。
  50. 前記適用された溶媒を回収することは、陰圧をかけて、前記サンプルを回収導管に引き込むこと及び／またはガス圧をかけて、前記サンプルを回収導管に押し込むことを含む、請求項４４に記載の方法。
  51. 前記適用された溶媒を回収することは、陰圧をかけて、前記サンプルを回収導管に引き込むこと及び陽圧をかけて、前記サンプルを回収導管に押し込むことを含む、請求項４４に記載の方法。
  52. 前記溶媒は、前記回収導管とは異なる溶媒導管を通して適用される、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記ガス圧は、前記溶媒導管及び前記回収導管とは異なるガス導管を通してかけられる、請求項５２に記載の方法。
  54. ガス圧をかけて、前記サンプルを回収導管に押し込むことは、１００ｐｓｉｇ未満の圧力をかけることを含む、請求項５０に記載の方法。
  55. 前記方法は、検知可能な物理的損傷を前記組織にもたらさない、請求項４４に記載の方法。
  56. 前記方法は、前記組織への超音波または振動エネルギーの適用を含まない、請求項４４に記載の方法。
  57. 前記溶媒は、滅菌されている、請求項４４に記載の方法。
  58. 前記溶媒は、薬学的に許容される製剤である、請求項４４に記載の方法。
  59. 前記溶媒は、水溶液である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記溶媒は、滅菌水である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記溶媒は、基本的に水から成る、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記溶媒は、約１から２０％のアルコールを含む、請求項５９に記載の方法。
  63. 前記アルコールは、エタノールを含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 溶媒の前記個別の体積は、約０．１から１００μＬの間である、請求項４４に記載の方法。
  65. 溶媒の前記個別の体積は、約１から５０μＬの間である、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記適用された溶媒を回収することは、前記適用するステップ後の０．１から３０秒の間である、請求項４４に記載の方法。
  67. 前記適用された溶媒を回収することは、前記適用するステップ後の１から１０秒の間である、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記組織部位は、外科的に評価される内部組織部位である、請求項４４に記載の方法。
  69. 複数の組織部位からの複数の液体サンプルを回収することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  70. 前記液体サンプルは、プローブにより回収される、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記プローブは、異なるサンプルの回収の間に洗浄される、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記プローブは、使い捨てであり、異なるサンプルの回収の間に替えられる、請求項７０に記載の方法。
  73. 前記プローブは、回収先端部を備え、前記液体サンプルが回収された後に前記プローブから前記回収先端部を取り出すことをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
  74. 前記複数の組織部位は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の組織部位を含む、請求項６９に記載の方法。
  75. 前記複数の組織部位は、外科的に切除された組織の切断部を取り囲む、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記切除された組織は、腫瘍である、請求項７５に記載の方法。
  77. 術中法としてさらに定義される、請求項４４に記載の方法。
  78. 前記マススペクトロメトリーは、アンビエントイオン化ＭＳを含む、請求項４４に記載の方法。
  79. 前記サンプルをマススペクトロメトリー分析に供することは、前記組織部位と対応するプロフィールを決定することを含む、請求項４４に記載の方法。
  80. 前記プロフィールを参照プロフィールと比較して、患部組織を含む組織部位を特定することをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 患部組織を含むことが特定された組織部位を切除することをさらに含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記方法は、請求項４４～７７のいずれか１項に記載の装置を使用して実施される、請求項４４に記載の方法。
  83. 組織サンプルを評価するためのエクスビボにおける方法であって、
    （ａ）対象の複数の組織部位から複数の液体サンプルを得ることと；
    （ｂ）前記複数の液体サンプルをマススペクトロメトリーに供して、前記組織部位と対応する複数のプロフィールを得ることと；
    （ｃ）前記複数のプロフィールを参照プロフィールと比較して、患部組織を含む組織部位を特定することと
    を含む、前記方法。
  84. 前記液体サンプルは、溶媒中に含まれる、請求項６９に記載の方法。
  85. 前記患部組織は、がん細胞を含む、請求項６９に記載の方法。
  86. 前記患部組織は、肺、卵巣または甲状腺癌細胞を含む、請求項６９に記載の方法。
  87. マススペクトロメトリープロフィールを得るための方法であって、
    （ａ）プローブを使用して、個別の体積の溶媒をアッセイ部位に適用することと；
    （ｂ）前記適用された溶媒を回収するために前記プローブを使用して、液体サンプルを得ることと；
    （ｃ）前記液体サンプルをマススペクトロメトリー分析に供することと
    を含む、前記方法。
  88. 前記溶媒は、水溶液である、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記溶媒は、滅菌水である、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記溶媒は、基本的に水から成る、請求項８８に記載の方法。
  91. 前記溶媒は、約１から２０％のアルコールを含む、請求項８８に記載の方法。
  92. 前記アルコールは、エタノールを含む、請求項９１に記載の方法。
  93. 溶媒の前記固定または個別の体積は、約０．１から１００μＬの間である、請求項８７に記載の方法。
  94. 溶媒の前記固定または個別の体積は、約１から５０μＬの間である、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記適用された溶媒を回収することは、前記適用するステップ後の０．１から３０秒の間である、請求項８７に記載の方法。
  96. 前記適用された溶媒を回収することは、前記適用するステップ後の１から１０秒の間である、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記アッセイ部位は、組織である、請求項８７に記載の方法。
  98. 複数のアッセイ部位から複数の液体サンプルを回収することをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
  99. 前記プローブは、異なるサンプルの回収の間に洗浄される、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記プローブは、使い捨てであり、異なるサンプルの回収の間に替えられる、請求項９８に記載の方法。
  101. 前記プローブは、回収先端部を備え、前記液体サンプルを得ることの後に前記プローブから前記回収先端部を取り出すことをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
  102. 前記複数の組織部位は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のアッセイ部位を含む、請求項９８に記載の方法。
  103. 前記マススペクトロメトリーは、アンビエントイオン化ＭＳを含む、請求項８７に記載の方法。
  104. 前記サンプルをマススペクトロメトリー分析に供することは、前記組織部位と対応するプロフィールを決定することを含む、請求項８７に記載の方法。
  105. 前記プロフィールを参照プロフィールと比較することをさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記方法は、請求項１～２６のいずれか１項に記載の装置を使用して実施される、請求項８７に記載の方法。
  107. 肺癌サンプルを特定する方法であって、
    （ａ）少なくとも１つのサンプルを得ることと；
    （ｂ）前記少なくとも１つのサンプルをマススペクトロメトリー分析に供し、それにより、複数の質量対電荷（ｍ／ｚ）比を含むマススペクトロメトリープロフィールを得ることとを含み、
    前記プロフィールが１７５．０２、１８７．０１、２０１．０４、２１５．０３、３０６．０８、３１３．１６、３３０．９８、３３２．９０、３５７．１０、４０９．２３、６１５．１７、７２２．５１、７４４．５５、７４７．５２、７４８．５２、７７１．５２、７７３．５３、８６１．５５、８６３．５７、８８５．５５、及び８８６．５５から成る群から選択される１つ以上の質量対電荷（ｍ／ｚ）比を含む場合に、前記サンプルは肺癌サンプルと特定される、前記方法。
  108. 前記マススペクトロメトリープロフィールは、請求項８７～１０５のいずれか１項に記載の方法に従って得られる、請求項１０７に記載の方法。
  109. 前記少なくとも１つのサンプルは、液体サンプルである、請求項１０７に記載の方法。
  110. 複数の液体サンプルは、マススペクトロメトリー分析に供される、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記プロフィールが１７５．０２、１８７．０１、２０１．０４、２１５．０３、３０６．０８、３１３．１６、３３０．９８、３３２．９０、３５７．１０、４０９．２３、６１５．１７、７２２．５１、７４４．５５、７４７．５２、７４８．５２、７７１．５２、７７３．５３、８６１．５５、８６３．５７、８８５．５５、及び８８６．５５から成る群から選択される少なくとも５つの質量対電荷（ｍ／ｚ）比を含む場合に、前記サンプルは肺癌サンプルと特定される、請求項１０７に記載の方法。
  112. 前記プロフィールが１７５．０２、１８７．０１、２０１．０４、２１５．０３、３０６．０８、３１３．１６、３３０．９８、３３２．９０、３５７．１０、４０９．２３、６１５．１７、７２２．５１、７４４．５５、７４７．５２、７４８．５２、７７１．５２、７７３．５３、８６１．５５、８６３．５７、８８５．５５、及び８８６．５５から成る群から選択される少なくとも１０の質量対電荷（ｍ／ｚ）比を含む場合に、前記サンプルは肺癌サンプルと特定される、請求項１０７に記載の方法。
  113. 前記プロフィールが質量対電荷（ｍ／ｚ）比１７５．０２、１８７．０１、２０１．０４、２１５．０３、３１３．１６、３３０．９８、３３２．９０、３５７．１０、４０９．２３、６１５．１７、７２２．５１、７４４．５５、７４７．５２、７４８．５２、７７１．５２、７７３．５３、８６３．５７、８８５．５５、及び８８６．５５を含む場合に、前記サンプルは肺癌サンプルと特定される、請求項１０７に記載の方法。
  114. 前記プロフィールが質量対電荷（ｍ／ｚ）比１７５．０２、２０１．０４、７４７．５２、７７３．５３、及び８８５．５５を含む場合に、前記サンプルは肺腺癌サンプルと特定される、請求項１０７に記載の方法。
  115. 前記プロフィールが質量対電荷（ｍ／ｚ）比２０１．０４、３０６．０８、７４７．５２、７７３．５３、８６１．５５、及び８８５．５５を含む場合に、前記サンプルは肺扁平上皮癌サンプルと特定される、請求項１０７に記載の方法。
  116. 前記サンプルは、対象から得られる、請求項１０７に記載の方法。
  117. 前記対象に抗がん療法を施すことをさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
  118. 卵巣癌サンプルを特定する方法であって、
    （ａ）少なくとも１つのサンプルを得ることと；
    （ｂ）前記少なくとも１つのサンプルをマススペクトロメトリー分析に供し、それにより、複数の質量対電荷（ｍ／ｚ）比を含むマススペクトロメトリープロフィールを得ることとを含み、
    前記プロフィールが１２４．０１、１７５．０２、１７５．０３、２８３．２７、３１３．１６、及び３４１．２７から成る群から選択される１つ以上の質量対電荷（ｍ／ｚ）比を含む場合に、前記サンプルは卵巣癌サンプルと特定される、前記方法。
  119. 前記マススペクトロメトリープロフィールは、請求項８７～１０５のいずれか１項に従って得られる、請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記少なくとも１つのサンプルは、液体サンプルである、請求項１１８に記載の方法。
  121. 複数の液体サンプルは、マススペクトロメトリー分析に供される、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記プロフィールが１２４．０１、１７５．０２、１７５．０３、２８３．２７、３１３．１６、及び３４１．２７から成る群から選択される少なくとも３つの質量対電荷（ｍ／ｚ）比を含む場合に、前記サンプルは卵巣癌サンプルと特定される、請求項１１８に記載の方法。
  123. 前記プロフィールが質量対電荷（ｍ／ｚ）比１２４．０１、１７５．０２、１７５．０３、２８３．２７、３１３．１６、及び３４１．２７を含む場合に、前記サンプルは卵巣癌サンプルと特定される、請求項１１８に記載の方法。
  124. 甲状腺癌サンプルを特定する方法であって、
    （ａ）少なくとも１つのサンプルを得ることと；
    （ｂ）前記少なくとも１つのサンプルをマススペクトロメトリー分析に供し、それにより、複数の質量対電荷（ｍ／ｚ）比を含むマススペクトロメトリープロフィールを得ることとを含み、
    前記プロフィールが１７５．０２、１９１．０２、１９１．０５、２８３．２７、３４１．２７、３５３．１６、４３２．２０、４３３．２１、６１５．１７、８２２．４７、及び８２２．４８から成る群から選択される１つ以上の質量対電荷（ｍ／ｚ）比を含む場合に、前記サンプルは甲状腺癌サンプルと特定される、前記方法。
  125. 前記マススペクトロメトリープロフィールは、請求項８７～１０５のいずれか１項に従って得られる、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記少なくとも１つのサンプルは、液体サンプルである、請求項１２４に記載の方法。
  127. 複数の液体サンプルは、マススペクトロメトリー分析に供される、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記プロフィールが１７５．０２、１９１．０２、１９１．０５、２８３．２７、３４１．２７、３５３．１６、４３２．２０、４３３．２１、６１５．１７、８２２．４７、及び８２２．４８から成る群から選択される少なくとも５つの質量対電荷（ｍ／ｚ）比を含む場合に、前記サンプルは甲状腺癌サンプルと特定される、請求項１２４に記載の方法。
  129. 前記プロフィールが質量対電荷（ｍ／ｚ）比１７５．０２、１９１．０２、１９１．０５、２８３．２７、３４１．２７、６１５．１７、８２２．４７、及び８２２．４８を含む場合に、前記サンプルは良性甲状腺癌サンプルと特定される、請求項１２４に記載の方法。
  130. 前記プロフィールが質量対電荷（ｍ／ｚ）比１７５．０２、２８３．２７、３４１．２７、３５３．１６、４３２．２０、４３３．２１、６１５．１７、８２２．４７、及び８２２．４８を含む場合に、前記サンプルは悪性甲状腺癌サンプルと特定される、請求項１２４に記載の方法。
  131. 乳癌サンプルを特定する方法であって、
    （ａ）少なくとも１つのサンプルを得ることと；
    （ｂ）前記少なくとも１つのサンプルをマススペクトロメトリー分析に供し、それにより、複数の質量対電荷（ｍ／ｚ）比を含むマススペクトロメトリープロフィールを得ることとを含み、
    前記プロフィールが１８７．０４、２６８．８０、２７９．９２、２８３．２７、３４１．２７、３４５．１６、３８１．２１、６８７．５１、７４２．５４、及び７６６．５４から成る群から選択される１つ以上の質量対電荷（ｍ／ｚ）比を含む場合に、前記サンプルは乳癌サンプルと特定される、前記方法。
  132. 前記マススペクトロメトリープロフィールは、請求項８７～１０５のいずれか１項に従って得られる、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記少なくとも１つのサンプルは、液体サンプルである、請求項１３１に記載の方法。
  134. 複数の液体サンプルは、マススペクトロメトリー分析に供される、請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記プロフィールが１８７．０４、２６８．８０、２７９．９２、２８３．２７、３４１．２７、３４５．１６、３８１．２１、６８７．５１、７４２．５４、及び７６６．５４から成る群から選択される少なくとも５つの質量対電荷（ｍ／ｚ）比を含む場合に、前記サンプルは乳癌サンプルと特定される、請求項１３１に記載の方法。
  136. 前記プロフィールが質量対電荷（ｍ／ｚ）比１８７．０４、２６８．８０、２７９．９２、２８３．２７、３４１．２７、３４５．１６、３８１．２１、６８７．５１、７４２．５４、及び７６６．５４を含む場合に、前記サンプルは乳癌サンプルと特定される、請求項１３１に記載の方法。
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