JP2022146526A - 核酸抽出方法、及び核酸抽出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】核酸と不純物を確実に分離できる核酸抽出方法を提供する。【解決手段】本発明の核酸抽出方法は、核酸を抽出可能な状態にされた検体を収容するフィルタ付きの容器にアルコール溶液を注入すると共に、前記容器を加圧して、前記フィルタに吸着する核酸以外の不純物を除去し、前記アルコール溶液を前記容器から排出する第一洗浄処理を少なくとも１回行う第一洗浄工程と、前記第一洗浄工程において最後に行われた前記第一洗浄処理で注入された前記アルコール溶液よりも高濃度の高濃度アルコール溶液を前記容器に注入し、前記容器内を該高濃度アルコール溶液に置換して、該高濃度アルコール溶液を排出する置換処理を行う第二洗浄側前処理工程と、前記第二洗浄側前処理工程の後に前記高濃度アルコール溶液を乾燥させる乾燥処理を行う第二洗浄側後処理工程と、前記フィルタに付着した前記核酸を回収する核酸回収工程と、を備える。【選択図】 図９

Description

本発明は、加圧により核酸を抽出する核酸抽出方法、及び核酸抽出装置に関する。

検体から核酸を抽出する核酸抽出方法として、抽出カラムを遠心して核酸を抽出する方法（例えば、特許文献１参照、以下、遠心抽出方法と呼ぶ。）や、抽出カラムを加圧して核酸を抽出する方法（例えば、特許文献２参照、以下、加圧抽出方法と呼ぶ。）などが知られている。

特開２００９－１３１２６４号公報 特開２０１５－１３９３９８号公報

しかしながら、特許文献１に記載の遠心抽出方法では、遠心分離機が必須となり、装置の大型化・複雑化が避けられない。また、その装置は高価であるため、抽出コスト低減には限界があった。

また、ｑＰＣＲ（quantitative PCR）法にＲＮＡ（ribonucleic acid）を適用する場合、逆転写酵素を用いてＲＮＡからＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）を作成する必要がある。しかしながら、特許文献２に記載の加圧抽出方法により抽出したＲＮＡを含むＲＮＡ精製物には、逆転写酵素の働きを阻害する阻害物質が含まれている場合がある。阻害物質として、加圧抽出方法で用いられる洗浄液の塩や界面活性剤が挙げられる。特許文献２に記載の加圧抽出方法で用いられる抽出カラムのフィルタは、吸湿性を有することから、加圧のみでは、塩や界面活性剤を除去することは困難である。

本発明は、斯かる実情に鑑み、核酸から従来よりも多くの不純物を分離できる核酸抽出方法、及び、その核酸抽出方法を実現できる小型で安価な核酸抽出装置を提供しようとするものである。

本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、本発明の核酸抽出方法は、溶解されて核酸を抽出可能な状態の検体を収容するフィルタ付きの容器にアルコール溶液を注入すると共に、前記容器を加圧して、該核酸を前記フィルタに吸着させつつ、前記フィルタに吸着する不純物を除去し、前記アルコール溶液を前記容器から排出する第一洗浄処理を少なくとも１回行う第一洗浄工程と、前記第一洗浄工程において最後に行われた前記第一洗浄処理で注入された前記アルコール溶液のアルコール濃度よりも高濃度の高濃度アルコール溶液を前記容器に注入し、前記容器に残存する前記アルコール溶液を該高濃度アルコール溶液に置換して、該高濃度アルコール溶液を排出する置換処理を少なくとも１回行う第二洗浄側前処理工程と、前記第二洗浄側前処理工程の後に前記高濃度アルコール溶液を乾燥させる乾燥処理を行う第二洗浄側後処理工程と、前記フィルタに付着した前記核酸を回収する核酸回収工程と、を備えることを特徴とする。

また、本発明の核酸抽出方法において、最後に行われた前記第一洗浄処理で注入された前記アルコール溶液は、７５％以下のアルコール濃度を有し、前記高濃度アルコール溶液は、９０％以上のアルコール濃度を有することを特徴とする。

また、本発明の核酸抽出方法において、前記アルコール溶液及び前記高濃度アルコール溶液は、エタノール、イソプロパノール及びプロパノールの少なくともいずれかであることを特徴とする。

また、本発明の核酸抽出方法において、前記第一洗浄工程は、第一の濃度の第一のアルコール溶液を前記容器に注入すると共に前記容器を加圧して、前記核酸を前記フィルタに吸着させつつ、前記フィルタに吸着する不純物を除去し、前記第一のアルコール溶液を前記容器から排出する第一前洗浄工程と、前記第一前洗浄工程の後に、前記第一の濃度よりも低い濃度の第二の濃度の第二のアルコール溶液を前記容器に注入すると共に前記容器を加圧して、前記核酸を前記フィルタに吸着させつつ、前記フィルタに吸着する不純物を除去し、前記第二のアルコール溶液を前記容器から排出する第一後洗浄工程と、を有することを特徴とする。

また、本発明の核酸抽出方法において、前記第一のアルコール溶液には、前記検体において前記核酸を凝集させるための塩が含まれることを特徴とする。

また、本発明の核酸抽出方法において、前記置換処理は、前記高濃度アルコール溶液が前記容器に注入された後に、前記容器を加圧して、前記核酸を前記フィルタに吸着させつつ、前記フィルタに吸着する不純物を除去し、前記高濃度アルコール溶液を前記容器から排出することを特徴とする。

また、本発明の核酸抽出方法は、前記検体を溶解して該検体から前記核酸を抽出可能な状態にする検体溶解工程を、前記第一洗浄工程より前に備え、前記検体溶解工程は、前記検体を溶解させるための溶解処理溶液を前記検体に加えて酵素反応をさせる工程と、エタノール溶液を加えて前記酵素反応を停止させる工程と、前記エタノール溶液と前記検体の混合液を前記容器に注入すると共に前記容器を加圧して、該エタノール溶液を排出する工程と、を含むことを特徴とする。

また、本発明の核酸抽出方法は、溶解されて核酸を抽出可能な状態の検体を収容するフィルタ付きの容器にアルコール溶液を注入すると共に、前記容器を加圧して、該核酸を前記フィルタに吸着させつつ、前記フィルタに吸着する不純物を除去し、前記アルコール溶液を前記容器から排出する洗浄処理を複数回行う洗浄工程と、前記フィルタに吸着する前記核酸を回収するための回収用溶液を前記容器に注入すると共に前記容器を加圧して、前記フィルタに付着した前記核酸を回収する核酸回収処理を複数回行う核酸回収工程と、を備えることを特徴とする。

また、本発明の核酸抽出装置は、検体から核酸を抽出する核酸抽出装置であって、前記検体を含む溶液を収容可能で注入開口及び排出開口を有するフィルタ付きの容器を有し、該フィルタにより前記検体から前記核酸を分離可能な分離部と、前記容器を加圧する加圧部と、前記フィルタから前記核酸を回収する核酸回収部と、アルコール溶液を含む複数の試薬を収容する試薬収容部と、複数の前記試薬のいずれかを前記注入開口から前記容器に分注する分注部と、前記加圧部及び前記分注部を制御する制御部と、を備え、前記制御部は、第一洗浄モード、第二洗浄側前処理モード、及び第二洗浄側後処理モードを有し、前記第一洗浄モードでは、溶解されて前記核酸が抽出可能な状態の前記検体が収容された前記容器に、前記分注部により前記アルコール溶液を注入させると共に、前記加圧部に前記容器を加圧させ、前記核酸を該フィルタに吸着させると共に前記フィルタに吸着する不純物を除去しつつ、前記アルコール溶液を前記容器から排出する第一洗浄処理を少なくとも１回行い、前記第二洗浄側前処理モードでは、前記第一洗浄モードにおいて最後に行われた前記第一洗浄処理で注入された前記アルコール溶液のアルコール濃度よりも高濃度の高濃度アルコール溶液を前記分注部により前記容器に注入して、前記容器に残存する前記アルコール溶液を該高濃度アルコール溶液に置換して排出する置換処理を少なくとも１回行い、前記第二洗浄側後処理モードでは、最後の前記置換処理の後に前記高濃度アルコール溶液を乾燥させる乾燥処理を行うことを特徴とする。

また、本発明の核酸抽出装置において、前記分離部は、複数の前記容器を同じ姿勢で第一配列方向に並列に配列可能な容器保持片が、前記第一配列方向に直交する第二配列方向に列状に複数配置された容器保持部を有し、前記加圧部は、前記容器保持片毎に複数の前記容器を同時に加圧可能に構成され、前記分離部に対して前記加圧部を前記第二配列方向に相対移動させる移動機構と、前記容器の前記注入開口側において前記容器に接近及び離反するよう前記分離部に対して前記加圧部を相対的に昇降させる昇降機構と、を備えることを特徴とする。

本発明の核酸抽出方法によれば、核酸と不純物を確実に分離することができるという優れた効果を奏し得る。また、本発明の核酸抽出装置によれば、上記核酸抽出方法を実行する装置を小型で安価で実現することができる。

本発明の実施形態における核酸抽出装置の斜視図である。 本発明の実施形態における核酸抽出装置の内部平面図である。 本発明の実施形態における核酸抽出装置の核酸抽出部及び分注部の斜視図である。 本発明の実施形態における核酸抽出装置の分離部及び加圧部の概略断面図である。 （Ａ）は、本発明の実施形態における核酸抽出装置の核酸抽出部の平面図である。（Ｂ）は、本発明の実施形態における核酸抽出装置の核酸抽出部の側面図である。 （Ａ）は、抽出カラムの真下に廃液用回収容器が位置する場合における本発明の実施形態における核酸抽出装置の核酸抽出部の正面図である。（Ｂ）は、本発明の実施形態における核酸抽出装置の回収部の平面図である。 抽出カラムの真下に核酸用回収容器が位置する場合における本発明の実施形態における核酸抽出装置の核酸抽出部の正面図である。 （Ａ），（Ｂ）は、抽出カラムの真下に廃液用回収容器が位置する場合における本発明の実施形態における核酸抽出装置の核酸抽出部の動作を時系列に並べた核酸抽出部の正面図である。 （Ａ），（Ｂ）は、抽出カラムの真下に核酸用回収容器が位置する場合における本発明の実施形態における核酸抽出装置の核酸抽出部の動作を時系列に並べた核酸抽出部の正面図である。 （Ａ）は、本発明の実施形態における核酸抽出装置の分注部の正面図である。（Ｂ）は、本発明の実施形態における核酸抽出装置の分注部の側面図である。（Ｃ）は、本発明の実施形態における核酸抽出装置の分注側駆動機構の平面図である。 本発明の実施形態における核酸抽出装置を用いた核酸抽出方法のフローチャートである。 （Ａ）～（Ｇ）は、本発明の実施形態における核酸抽出装置の核酸抽出部の動作を時系列に並べた概略図である。 ＲＮＡ（SARS-Cov-2（RdRp）遺伝子）の抽出検証１において得られた結果を示す表である。 ＲＮＡ（293T細胞 精製RNAを用いたACTIN遺伝子）の抽出検証２において得られた結果を示す表である。

以下、本発明の実施の形態について添付図面を参照して説明する。図１～図１２は発明を実施する形態の一例であって、図中、図１,２と同一の符号を付した部分は同一物を表わす。

＜全体構成＞
本発明の実施形態における核酸抽出装置１は、検体から核酸を抽出するものである。本実施形態における核酸として、ＲＮＡが想定されるが、これに限定されるものではなく、ＤＮＡであってもよい。核酸抽出装置１は、図１～図３、及び図８に示すように、核酸抽出部２と、核酸回収部３と、分注部４（図３参照）と、分注側駆動機構５（図８参照）と、チップ保持部６と、廃棄チップ回収部７と、試薬収容部８と、検体保持部９と、制御部１０と、プライマー処理部１１と、操作部１２と、表示部１３と、上記各部を収容する筐体１４と、を備える。

＜筐体＞
図１を参照して筐体１４について説明する。筐体１４は、図１に示すように、内部に基台１４０、及び、基台１４０上に上記各部を配置させるための内部空間１４１を有する。そして、筐体１４には、図１に示すように、側面側から上記各部を外部に開放可能な開閉シャッター１４２が設けられる。なお、図１では、開閉シャッター１４２は閉じられており、内部空間１４１及び上記各部が外部に対して隠された状態にある。

また、筐体１４の上部には、操作部１２及び表示部１３が配置されている。本実施形態において操作部１２は、タッチパネル方式のものであるが、これに限定されるものではなく、操作部１２及び表示部１３は分離していてもよい。

なお、本実施形態において筐体１４の高さ方向は、核酸抽出装置１の上下方向（垂直方向）Ａと平行であり、筐体１４の奥行方向は、核酸抽出装置１の前後方向Ｂと平行となり、筐体１４の幅方向は、核酸抽出装置１の左右方向Ｃと平行になるものとして説明する。

＜核酸抽出部＞
図３～図７Ａを参照して核酸抽出部２について以下説明する。核酸抽出部２では、検体から核酸を抽出する処理が行われる。図３に示すように、核酸抽出部２は、分離部２０と、加圧部２１と、廃液回収部２２と、第一昇降機構２３と、第二昇降機構２４と、加圧側移動機構２５と、回収側移動機構２６と、を有する。

＜分離部＞
図４～図６Ａを参照して分離部２０について以下説明する。図４（Ａ），（Ｂ）に示すように、分離部２０は、フィルタ２０１を内蔵するフィルタ２０１付きの抽出カラム２００と、抽出カラム保持部２０２（図５参照）と、を有する。抽出カラム２００は、筒状の容器であり、一方側に注入開口２００Ａを有し、他方側に排出開口２００Ｂを有する。また、抽出カラム２００の注入開口２００Ａ周りには、抽出カラム２００の外周面を起点として径方向外側に拡張するフランジ２００Ｃが設けられる。

フィルタ２０１は、抽出カラム２００の軸方向において抽出カラム２００の内部空間を２分するように配設される。そして、フィルタ２０１は、例えば、ガラス繊維や荷電樹脂などから成り、フィルタ２０１への核酸の吸着性を利用して検体から核酸を分離する。すなわち、親水的な性質を持つ核酸は、疎水性の高い溶液中ではフィルタ２０１に吸着し、疎水的な性質を持つタンパク質や脂質などはそのまま流れ落ち易い状態となる。

抽出カラム保持部２０２は、図５（Ａ）に示すように、複数の抽出カラム保持片２０３で構成される。抽出カラム保持片２０３は、図３、図５（Ａ），（Ｂ）及び図６Ａ（Ａ）に示すように、一対の脚部２０３Ａと、一対の脚部２０３Ａの間に架設される架設部２０３Ｂと、で構成される。本実施形態において抽出カラム保持片２０３は、略コの字状に形成される。

架設部２０３Ｂは、図６Ａ（Ａ）に示すように、第二昇降機構２４（付勢部２４１）により下方側から支持される。架設部２０３Ｂには、上下方向Ａに架設部２０３Ｂを貫通する穴２０３Ｃが架設方向に沿って４つ設けられる。穴２０３Ｃに抽出カラム２００が挿入されると、抽出カラム２００のフランジ２００Ｃが穴２０３Ｃの入口開口の周囲（架設部２０３Ｂ）に係合して、注入開口２００Ａが上側で、排出開口２００Ｂが下側で、且つ抽出カラム２００の軸方向が上下方向Ａと平行になるような姿勢で抽出カラム２００は架設部２０３Ｂで保持される。４つの穴２０３Ｃそれぞれに抽出カラム２００が挿入されると、抽出カラム２００は、上記姿勢で並列に配列されて保持される。

各抽出カラム保持片２０３は、図５（Ａ）に示すように、各抽出カラム保持片２０３における抽出カラム２００の配列方向が相互に平行となるような姿勢で基台１４０上に配置される。この際、抽出カラム２００の配列方向を第一配列方向Ｄと定義した場合、各抽出カラム保持片２０３は、図５（Ａ），（Ｂ）に示すように、第一配列方向Ｄに対して直交する第二配列方向Ｆに沿って基台１４０上において所定間隔を空けて列状に配置される。この際、隣接する抽出カラム保持片２０３で保持される各抽出カラム２００同士は、第二配列方向Ｆにおいてそれぞれ対向する。本実施形態では、第一配列方向Ｄは、核酸抽出装置１の前後方向Ｂに平行となり、第二配列方向Ｆは、核酸抽出装置１の左右方向Ｃに平行となる。

＜加圧部＞
図４及び図６Ａを参照して加圧部２１について以下説明する。加圧部２１は、抽出カラム２００の内部を加圧するものである。図４（Ａ）及び図６Ａ（Ａ）に示すように、本実施形態において加圧部２１は、加圧用カラムキャップ２１０と、カラムキャップ保持部２１１と、加圧用チューブ２１２と、加圧用シリンジ（加圧源）２１３と、圧力センサ２１４と、を有する。

加圧用カラムキャップ２１０は、図４（Ｂ）に示すように、抽出カラム２００を密閉する。カラムキャップ保持部２１１は、図６Ａ（Ａ）に示すように、複数の加圧用カラムキャップ２１０を第一配列方向Ｄに並列に保持する。つまり、カラムキャップ保持部２１１で保持される複数の加圧用カラムキャップ２１０のそれぞれは、抽出カラム保持片２０３で保持された複数の抽出カラム２００のそれぞれを密閉するものであり、複数の加圧用カラムキャップ２１０の配列は、抽出カラム保持片２０３で保持された複数の抽出カラム２００の配列に応じたものになる。

そして、加圧用チューブ２１２の一端は、図４（Ａ）に示すように、直接又は間接的に加圧用カラムキャップ２１０に連結され、加圧用チューブ２１２の他端は、加圧用シリンジ２１３に連結される。加圧用シリンジ２１３は、円筒形のシリンジ２１３Ａと可動式のプランジャ２１３Ｂからなり、加圧用チューブ２１２を介して抽出カラム２００を加圧する。また、圧力センサ２１４は、例えば、加圧用チューブ２１２に取り付けられ、抽出カラム２００の圧力（抽出カラム２００に加えられる圧力）を測定できるようになっている。

＜廃液回収部＞
図６Ａを参照して廃液回収部２２について以下説明する。図６Ａ（Ａ）に示すように、廃液回収部２２は、抽出カラム２００の排出開口２００Ｂから排出される廃液を回収するものである。廃液回収部２２は、図３に示すように、抽出カラム保持片２０３の架設部２０３Ｂの真下に配置される。本実施形態では、廃液回収部２２は、図６Ａ（Ａ）に示すように、開口２２０Ａを有する廃液用回収容器２２０と、廃液用回収容器保持部２２１とで構成される。

図６Ａ（Ｂ）に示すように、廃液用回収容器保持部２２１は、複数の廃液用回収容器保持片２２２で構成される。廃液用回収容器保持片２２２は、廃液用回収容器２２０を挿入するための穴２２２Ａを有する。廃液用回収容器２２０の開口２２０Ａ周りには、廃液用回収容器２２０の外周面から径方向外側に拡張するフランジ２２０Ｂが設けられる。廃液用回収容器２２０が穴２２２Ａに挿入されると、廃液用回収容器２２０のフランジ２２０Ｂが穴２２２Ａの入口開口の周囲に係合して開口２２０Ａが上側を向いた状態で、廃液用回収容器２２０は、廃液用回収容器保持片２２２に保持される。

また、廃液用回収容器保持片２２２は、廃液用回収容器２２０が架設部２０３Ｂの穴２０３Ｃ（抽出カラム２００）の真下に位置した状態で廃液用回収容器２２０を保持する。架設部２０３Ｂで抽出カラム２００が保持された場合、廃液用回収容器２２０の開口２２０Ａと、抽出カラム２００の排出開口２００Ｂは、上下方向Ａにおいて対向する。そして、各廃液用回収容器保持片２２２は、穴２０３Ｃ（抽出カラム２００が保持される位置）と穴２２２Ａ（廃液用回収容器２２０が保持される位置）が上下方向Ａにおいて対向するように配置される。

廃液用回収容器保持片２２２は、抽出カラム保持片２０３と対となって設けられる。つまり、廃液用回収容器保持片２２２も抽出カラム保持片２０３と同様に、第二配列方向Ｆに沿って基台１４０上において所定間隔を空けて列状に配置される。

＜核酸回収部＞
図６Ｂを参照して核酸回収部３について以下説明する。核酸回収部３は、抽出カラム２００の排出開口２００Ｂから排出される核酸（核酸精製溶液）を回収するものである。本実施形態において核酸回収部３は、図６Ｂに示すように、開口３０Ａを有する核酸用回収容器３０と、核酸用回収容器保持部３１と、で構成される。そして、核酸用回収容器保持部３１は、複数の核酸用回収容器保持片３２で構成される。核酸用回収容器３０は、廃液用回収容器２２０と同様の構成であり、複数の核酸用回収容器保持片３２は、廃液用回収容器保持片２２２と同様の構成である。

そして、核酸用回収容器保持片３２と廃液用回収容器保持片２２２は、図６Ａ（Ｂ）に示すように、基台１４０上において第二配列方向Ｆに沿って列状に交互に配置される。廃液回収部２２、及び核酸回収部３を一纏めに回収部と定義した際、回収側移動機構２６により、回収部（廃液回収部２２、及び核酸回収部３）に対して抽出カラム保持部２０２を第二配列方向Ｆ（左右方向Ｃ）に相対移動させると、図６Ｂに示すように、全ての抽出カラム保持片２０３（抽出カラム保持部２０２）の真下に全ての核酸用回収容器保持片３２（核酸回収部３）を同時に位置させることもできるし、図６Ａ（Ａ）に示すように、全ての抽出カラム保持片２０３（抽出カラム保持部２０２）の真下に全ての廃液用回収容器保持片２２２（廃液回収部２２）を同時に位置させることもできる。

＜第一昇降機構＞
図６Ａ、図６Ｂ、図７Ａ及び図７Ｂを参照して第一昇降機構２３について以下説明する。第一昇降機構２３は、抽出カラム保持片２０３の上側においてカラムキャップ保持部２１１を上下方向に昇降させるものである。第一昇降機構２３により、カラムキャップ保持部２１１と共に加圧用カラムキャップ２１０が下降すると、図７Ａ（Ａ）及び図７Ｂ（Ａ）に示すように、抽出カラム保持片２０３で保持される抽出カラム２００に加圧用カラムキャップ２１０が接近して注入開口２００Ａを閉じる。

第一昇降機構２３は、図６Ａ（Ａ）及び図６Ｂに示すように、案内部２３０と、付勢部２３１と、押圧部２３２と、を有する。案内部２３０は、カラムキャップ保持部２１１を上下方向Ａに案内するものである。本実施形態においてカラムキャップ保持部２１１の第一配列方向Ｄにおける両端近傍には、上下方向にカラムキャップ保持部２１１を貫通する穴２１１Ａが１つずつ設けられる。そして、案内部２３０は、上下方向に延びつつ、一対の穴２１１Ａそれぞれを通過して、カラムキャップ保持部２１１に係合する一対の棒状体２３０Ａにより構成される。一対の棒状体２３０Ａは、図３に示すように、加圧側移動機構２５により左右方向Ｃに移動可能に設けられる。結果、一対の棒状体２３０Ａが左右方向Ｃに移動すると、加圧部２１も棒状体２３０Ａと一体となって左右方向Ｃに移動する。

付勢部２３１は、カラムキャップ保持部２１１を上下方向に付勢するものである。本実施形態において付勢部２３１は、図６Ａ（Ａ）及び図６Ｂに示すように、一対の棒状体２３０Ａの周囲に巻回されつつ、上下方向に延びる一対のコイルばね２３１Ａで構成される。そして、一対のコイルばね２３１Ａは、基端が加圧側移動機構２５に当接し、先端は、カラムキャップ保持部２１１に当接し、カラムキャップ保持部２１１を下方側から支持する。なお、一対のコイルばね２３１Ａは、両端が固定されていてもいなくてもよい。

押圧部２３２は、図６Ａ（Ａ）及び図６Ｂに示すように、カラムキャップ保持部２１１の上面側に設けられた受け部２１１Ｂを介してカラムキャップ保持部２１１を上下方向の下方側に押圧するものである。受け部２１１Ｂは、上下方向Ａにおいて押圧部２３２と対向可能で、押圧部２３２から下方側に向かう押圧力を受けるための受け面を上方側に有する。本実施形態において押圧部２３２は、図３に示すように、分注部４と共に上下方向に昇降可能に分注部４に設けられる。

受け部２１１Ｂを介して押圧部２３２がカラムキャップ保持部２１１を上下方向Ａの下方側に押圧していない初期状態では、一対のコイルばね２３１Ａは下方側に押圧力を受けていない。この際、一対のコイルばね２３１Ａは、伸びた状態にあり、図６Ａ（Ａ）及び図６Ｂに示すように、加圧用カラムキャップ２１０が抽出カラム２００から上方側に離れた位置に位置するようにカラムキャップ保持部２１１を支持する。

そして、押圧部２３２が下降すると、一対のコイルばね２３１Ａは縮み、カラムキャップ保持部２１１は一対のコイルばね２３１Ａから上方側への弾性力を受けつつ、下降する。抽出カラム保持片２０３には、カラムキャップ保持部２１１と対向する側の面からカラムキャップ保持部２１１に向かって立設されたストッパ２０３Ｄが設けられる。カラムキャップ保持部２１１は、図７Ａ（Ａ）に示すように、ストッパ２０３Ｄに接触するまで下降する。カラムキャップ保持部２１１がストッパ２０３Ｄに接触した状態において、加圧用カラムキャップ２１０は、抽出カラム２００を密閉する。この状態から押圧部２３２が上昇すると、一対のコイルばね２３１Ａに対する押圧が解除され、一対のコイルばね２３１Ａの弾性力（復帰力）によりカラムキャップ保持部２１１は押圧されて上昇して、初期状態に対応する位置に復帰する（図６Ａ（Ａ）及び図６Ｂ参照）。

なお、第一昇降機構２３は、以上の構成に限定されるものではなく、例えば、カラムキャップ保持部２１１を上下方向に往復移動可能なモータ及びネジを用いた直動機構、油圧シリンダとピストンを用いた直動機構、ベルト（チェーン）とプーリを用いた直動機構、及びその他の直動機構（昇降機構）のいずれで構成されてもよい。

＜第二昇降機構＞
図４、図６Ａ、図６Ｂ、図７Ａ及び図７Ｂを参照して第二昇降機構２４について以下説明する。第二昇降機構２４は、廃液回収部２２の上側、且つ加圧部２１（カラムキャップ保持部２１１）の下側の領域において抽出カラム保持片２０３を上下方向に昇降させるものである。第二昇降機構２４により、抽出カラム保持片２０３と共に抽出カラム２００が下降すると、図４（Ｂ）及び図７Ａ（Ｂ）に示すように、廃液用回収容器保持片２２２で保持される廃液用回収容器２２０に抽出カラム２００が接近して、抽出カラム２００の排出開口２００Ｂ側が廃液用回収容器２２０に挿入される。また、抽出カラム保持片２０３の真下に核酸用回収容器保持片３２が位置する場合、抽出カラム保持片２０３と共に抽出カラム２００が下降すると、図４（Ｂ）及び図７Ｂ（Ｂ）に示すように、核酸用回収容器保持片３２で保持される核酸用回収容器３０に抽出カラム２００が接近して、抽出カラム２００の排出開口２００Ｂ側が核酸用回収容器３０に挿入される。

第二昇降機構２４は、図６Ａ（Ａ）及び図６Ｂに示すように、案内部２４０と、付勢部２４１と、押圧部２４２と、を有する。案内部２４０は、抽出カラム保持片２０３を上下方向に案内するものである。本実施形態において抽出カラム保持片２０３の第一配列方向Ｄにおける両端近傍には、上下方向に抽出カラム保持片２０３（架設部２０３Ｂ）を貫通する穴２０３Ｅが１つずつ設けられる。そして、案内部２４０は、上下方向に延びつつ、一対の穴２０３Ｅそれぞれを通過して、抽出カラム保持片２０３（架設部２０３Ｂ）に係合する一対の棒状体２４０Ａにより構成される。一対の棒状体２４０Ａは、基台１４０から上下方向Ａに立設されたストッパ２Ａから上下方向Ａに立設するように設けられる。

付勢部２４１は、抽出カラム保持片２０３を上下方向に付勢するものである。本実施形態において付勢部２４１は、一対の棒状体２４０Ａの周囲に巻回されつつ、上下方向に延びる一対のコイルばね２４１Ａで構成される。そして、一対のコイルばね２４１Ａは、基端が基台１４０から上下方向Ａに立設されたストッパ２Ａに当接し、先端が抽出カラム保持片２０３に当接して、抽出カラム保持片２０３（架設部２０３Ｂ）を下方側から支持する。なお、一対のコイルばね２４１Ａは、両端が固定されていてもよいし、固定されていなくてもよい。

押圧部２４２は、抽出カラム保持片２０３（受け部）を上下方向の下方側に押圧するものである。本実施形態において押圧部２４２は、加圧用カラムキャップ２１０、カラムキャップ保持部２１１及び第一昇降機構２３で構成される。つまり、第一昇降機構２３によりカラムキャップ保持部２１１が下降すると、加圧用カラムキャップ２１０が抽出カラム２００を介して抽出カラム保持片２０３を押圧する。この場合、抽出カラム保持片２０３（受け部）は、第一昇降機構２３の受け部２１１Ｂと同様の機能を有する。

なお、押圧部２４２は、抽出カラム保持片２０３の上面側に設けられたストッパ２０３Ｄ（受け部）を介して抽出カラム保持片２０３を上下方向の下方側に押圧する態様であってもよい。この場合、ストッパ２０３Ｄ（受け部）は、第一昇降機構２３の受け部２１１Ｂと同様の機能を有する。

押圧部２４２が抽出カラム保持片２０３を上下方向の下方側に押圧していない初期状態では、一対のコイルばね２４１Ａは下方側に押圧力を受けていない。この際、一対のコイルばね２４１Ａは、伸びた状態で抽出カラム保持片２０３を下方側から支持する。

そして、押圧部２４２が下降すると、一対のコイルばね２４１Ａは縮み、抽出カラム保持片２０３は一対のコイルばね２４１Ａから上方側への弾性力を受けつつ、下降する。そして、一対のコイルばね２４１Ａが最も縮んだ状態か、又は、押圧部２４２の押圧力に対して平衡となる一対のコイルばね２４１Ａの縮みに達する状態になると、抽出カラム保持片２０３は停止する。この際、図７Ａ（Ｂ）に示すように、抽出カラム２００の排出開口２００Ｂ側が廃液用回収容器２２０に挿入された状態になる。この状態から押圧部２４２が上昇すると、一対のコイルばね２４１Ａに対する押圧が解除され、一対のコイルばね２４１Ａの弾性力（復帰力）により抽出カラム保持片２０３は押圧されて上昇して、初期状態に対応する位置に復帰する（図６Ａ（Ａ）及び図６Ｂ参照）。

なお、第二昇降機構２４は、以上の構成に限定されるものではなく、例えば、抽出カラム保持片２０３を上下方向に往復移動可能なモータ及びネジを用いた直動機構、油圧シリンダとピストンを用いた直動機構、ベルト（チェーン）とプーリを用いた直動機構、及びその他の直動機構（昇降機構）のいずれで構成されてもよい。

また、第一昇降機構２３及び第二昇降機構２４は、抽出カラム２００の排出開口２００Ｂ側が廃液用回収容器２２０に挿入された状態になるように構成されればよく、その意味で、回収部（廃液回収部２２、及び核酸回収部３）に対して、抽出カラム保持片２０３及び加圧部２１が相対的に昇降すれば実現できる。つまり、実際には、回収部（廃液回収部２２、及び核酸回収部３）が昇降してもよく、そのようなものも本発明の範囲に含まれる。

＜加圧側移動機構＞
図３を参照して加圧側移動機構２５について以下説明する。図３に示すように、加圧側移動機構２５は、加圧部２１を、各抽出カラム保持片２０３が配列される第二配列方向Ｆ（左右方向Ｃ）に相対移動させるものである。加圧側移動機構２５は、基台１４０に設けられた一対の案内レール２５０と、直動機構２５１と、で構成される。

一対の案内レール２５０は、第一配列方向Ｄにおける抽出カラム保持部２０２の両外側において第二配列方向Ｆ（左右方向Ｃ）に延びる、基台１４０に設けられた溝により構成される。直動機構２５１は、第一昇降機構２３の案内部２３０に連結される。直動機構２５１が動作すると、第一昇降機構２３の案内部２３０は、穴２１１Ａへの係合により繋がる加圧部２１（カラムキャップ保持部２１１）と共に、一対の案内レール２５０に沿って第二配列方向Ｆ（左右方向Ｃ）に直動する。

そして、直動機構２５１は、例えば、モータ及びネジを用いた直動機構、油圧シリンダとピストンを用いた直動機構、ベルト（チェーン）とプーリを用いた直動機構等が一例として挙げられるが、これらに限定されるものではなく、その他のものであってもよい。

＜回収側移動機構＞
図３を参照して回収側移動機構２６について以下説明する。回収側移動機構２６は、抽出カラム保持部２０２に対して回収部（廃液回収部２２、及び核酸回収部３）を第二配列方向Ｆ（左右方向Ｃ）に相対移動させるものである。本実施形態において回収側移動機構２６は、回収部（廃液回収部２２、及び核酸回収部３）を第二配列方向Ｆ（左右方向Ｃ）に移動させる。なお、回収側移動機構２６は、抽出カラム保持部２０２を第二配列方向Ｆ（左右方向Ｃ）に移動させてもよい。

本実施形態において回収側移動機構２６は、例えば、モータ及びネジを用いた直動機構、油圧シリンダとピストンを用いた直動機構、ベルト（チェーン）とプーリを用いた直動機構、及びその他の直動機構（昇降機構）のいずれかで構成される。

＜分注部、分注側移動機構＞
分注部４は、試薬収容部８に収容された各試薬を抽出カラム２００に分注するものである。分注部４は、図８（Ａ）～（Ｃ）に示すように、分注側駆動機構５により筐体１４の内部空間１４１を、上下方向Ａ、前後方向Ｂ、及び左右方向Ｃに移動自在に分注側移動機構にぶら下がっている。

分注部４は、図８（Ａ），（Ｂ）に示すように、複数（本実施形態では、８本）の分注シリンダ４０と、これらを保持するシリンダ保持部４１と、圧力調整部４２と、（図示しない）チップ離脱機構と、を有する。分注シリンダ４０は、先端にチップを着脱可能に保持可能な構造を有する。なお、チップとは、図８（Ａ），（Ｂ）に示すチップ４０３，４０４ように、先端側の開口径が小径で、基端側の開口径が大径のチューブ状の部材である。

本実施形態においてシリンダ保持部４１は、図８（Ａ），（Ｂ）に示すように、左右方向の一方側（左側）に１０００μＬ用の分注シリンダ４０１を４本保持し、左右方向の一方側（右側）に２０μＬ用の分注シリンダ４０２を４本保持するが、これは一例であって、分注シリンダの容量について限定はない。１０００μＬ用の分注シリンダ４０１には、１０００μＬ用のチップ４０３が取り付けられ、２０μＬ用の分注シリンダ４０２には２０μＬ用のチップ４０４が取り付けられる。チップ４０３，４０４は、それぞれ分注シリンダ４０１，４０２の先端に押し込むことによって装着可能であり、（図示しない）チップ離脱機構により逆方向に引き離すことにより離脱可能に構成される。

そして、圧力調整部４２は、分注シリンダ４０内の圧力を調整する。つまり、圧力調整部４２は、チップを通じて液体の吸引を行う場合、分注シリンダ４０内の圧力を減圧し、チップ内の液体を吐出する場合、分注シリンダ４０内に対して加圧を行う。

分注側駆動機構５は、筐体１４の天井部１４３（図１参照）に設けられ、図８（Ｃ）に示すように、例えば、左右方向Ｃに延在する左右方向移動レール５０と、前後方向Ｂに延在する前後方向移動レール５１と、を有する。分注部４は、例えば、左右方向移動部５２により前後方向移動レール５１と共に左右方向移動レール５０に沿って移動可能に構成される。また、分注部４は、例えば、分注部４に連結された前後方向移動部５３と共に前後方向移動レール５１に沿って移動可能に構成される。

なお、左右方向移動部５２又は前後方向移動部５３は、例えば、モータと、そのモータにより駆動するピニオンと、左右方向移動レール５０又は前後方向移動レール５１に沿って設けられ、ピニオンに係合するラックと、により構成されるものが一例として挙げられる。なお、左右方向移動部５２は、左右方向移動レール５０に沿って走行可能なら上記以外のどのような構成であってもよい。同様に、前後方向移動部５３は、前後方向移動レール５１に沿って走行可能なら上記以外のどのような構成であってもよい。

また、分注側駆動機構５は、図８（Ａ）～（Ｃ）に示すように、分注部４を上下方向Ａに昇降させる分注側昇降機構５４を有する。分注側昇降機構５４は、例えば、分注部４を上下方向Ａに昇降可能なモータ及びネジを用いた直動機構、油圧シリンダとピストンを用いた直動機構、ベルト（チェーン）とプーリを用いた直動機構、及びその他の直動機構（昇降機構）のいずれで構成されてもよい。

＜チップ保持部＞
チップ保持部６は、図２に示すように、チップを保持するものであり、基台１４０上に設けられる。チップ保持部６は、上方側からチップを差し込むための穴６０を有する。穴６０は、図２に示すように、マトリクス状に設けられる。チップは、穴６０に差し込まれて起立した状態でチップ保持部６により保持される。図２では、２つのチップ保持部６Ａでは、１０００μＬ用のチップ４０３が複数保持される。また、チップ保持部６Ｂでは、２０μＬ用のチップ４０４が複数保持される。

分注部４が分注側駆動機構５により移動されて、分注シリンダ４０がチップの真上に位置するように位置決めされ、その状態で分注側昇降機構５４により下降すると、分注シリンダ４０の先端がチップに押し込まれて、チップが分注シリンダ４０に装着される。

＜廃棄チップ回収部＞
廃棄チップ回収部７は、廃棄されるチップを回収するものであり、図２に示すように、基台１４０上に設けられる。本実施形態において廃棄チップ回収部７は、上方側に開口を有する容器で構成される。

分注部４が分注側駆動機構５により移動されて、分注シリンダ４０が廃棄チップ回収部７の真上に位置するように位置決めされ、その状態で（図示しない）チップ離脱機構によりチップが逆方向に引き離されることによりチップは廃棄チップ回収部７に落下する。これにより、廃棄チップ回収部７で廃棄されるべきチップが回収される。

＜試薬収容部＞
試薬収容部８は、検体から核酸を抽出する際に用いられる試薬を収容するものであり、図２に示すように、基台１４０上に設けられる。本実施形態において試薬収容部８は、上方側に開口を有する複数の容器で構成される。複数の容器には、異なる種類の複数の試薬が収容される。

複数の試薬として、例えば、溶解処理溶液、溶解反応停止用アルコール溶液（例えば、エタノール溶液）、核酸沈殿用の第一洗浄液Ｗ１、不純物除去用の第二洗浄液Ｗ２、不純物除去用の第三洗浄液Ｗ３、回収用溶液Ｅ等が挙げられる。溶解処理溶液は、検体に反応（酵素反応）すると、検体に含まれる細胞膜等を溶解して核酸を検体から抽出し、その溶液において分散させるものである。溶解反応停止用アルコール溶液は、例えば、溶解処理溶液と検体の間で起こる酵素反応を停止させるためのものであり、例えば、４０％以上のアルコール濃度を有するエタノール溶液で構成される。核酸沈殿用の第一洗浄液Ｗ１は、主として、核酸を沈殿させるために用いられる溶液であり、アルコール溶液と塩が含まれる。そして、第一洗浄液Ｗ１における第一のアルコール溶液は、核酸を沈殿させるために必要な第一の濃度を有する。第一の濃度は、例えば、５０％以上の濃度であることが好ましい。塩として、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、酢酸アンモニウム等が挙げられる。

不純物除去用の第二洗浄液Ｗ２及び不純物除去用の第三洗浄液Ｗ３は、核酸以外の不純物（塩を含む夾雑物質）を除去するための洗浄液であり、アルコール溶液が含まれる。なお、第三洗浄液Ｗ３に対応するアルコール溶液は、第二洗浄液Ｗ２に対応するアルコール溶液よりもアルコール濃度が高い第三濃度を有する高濃度アルコール溶液で構成される。また、第二洗浄液Ｗ２に対応する第二のアルコール溶液の第二の濃度は、核酸沈殿用の第一洗浄液Ｗ１に対応する第一のアルコール溶液の第一の濃度よりもアルコール濃度が低いもので構成されることが好ましい。なお、第一洗浄液Ｗ１～第三洗浄液Ｗ３に対応するアルコール溶液は、例えば、エタノール、又はイソプロパノール、又はプロパノール等の少なくともいずれかで構成される。第二洗浄液Ｗ２に対応するアルコール溶液は、例えば、７５％以下のアルコール濃度を有するエタノールで構成される。第三洗浄液Ｗ３に対応するアルコール溶液は、例えば、９０％以上のアルコール濃度を有するエタノールで構成され、特に、９９％以上のエタノール溶液で構成されることが好ましい。回収用溶液Ｅは、洗浄終了後に、核酸を回収するために用いられる溶液であり、純水（蒸留水）、又は純水（蒸留水）とキレート剤の混合溶液で構成される。

分注部４が分注側駆動機構５により移動されて、分注シリンダ４０が試薬収容部８のうち、目的とする試薬が収容されたものの真上に位置するように位置決めされ、その状態で分注側昇降機構５４により下降すると、分注シリンダ４０の先端に装着されたチップが試薬に浸かる。そして、圧力調整部４２で分注シリンダ４０及びチップ内を減圧すれば、試薬を吸い込んで、分注シリンダ４０及びチップ内で試薬を保持することができる。そして、分注部４が分注側駆動機構５により抽出カラム２００に移動されて、この試薬が抽出カラム２００に注入される。

＜検体保持部＞
検体保持部９は、核酸を抽出する対象となる検体を保持するものであり、図２に示すように、基台１４０上に設けられる。本実施形態において検体保持部９は、上方側に開口を有する複数の容器（以下、検体用容器と呼ぶ。）９０と、検体用容器９０を挿入する穴９２を有する検体用容器保持部９１と、を有する。作業者は、検体用容器９０に対象となる検体、及び検体に対する前処理を行う溶液を入れる。なお、検体及び検体に対する前処理を行う溶液を一纏めに、検体溶液と呼ぶ。

検体用容器保持部９１は、撹拌機能と温度調節機能を有している。このため、検体用容器９０内の検体溶液を撹拌したり、検体溶液を所定の温度に調整したりすることができる。

分注部４が分注側駆動機構５により移動されて、分注シリンダ４０が検体保持部９のうち、目的とする検体が収容された検体用容器９０の真上に位置するように位置決めされ、その状態で分注側昇降機構５４により下降すると、分注シリンダ４０の先端に装着されたチップが検体溶液に浸かる。そして、圧力調整部４２でチップ内を減圧すれば、検体溶液を吸い込んで、分注シリンダ４０及びチップ内で検体溶液を保持することができる。そして、分注部４が分注側駆動機構５により抽出カラム２００に移動されて、この検体溶液が抽出カラム２００に注入される。

＜プライマー処理部＞
プライマー処理部１１は、図２に示すように、基台１４０上に設けられ、プライマー溶液分注用の容器（以下、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）容器という。）を保持するＰＣＲ容器保持部１１０と、複数のプライマー溶液用の容器（以下、プライマー溶液用容器と呼ぶ。）を保持するプライマー保持部１１１と、を有する。

ＰＣＲ容器保持部１１０で保持されるＰＣＲ容器は、複数個準備され、これらがマトリクス状に配列される。プライマー保持部１１１で保持されるプライマー溶液用容器は、複数個準備され、これらがマトリクス状に配列される。ＰＣＲ容器の数は、プライマー溶液用容器の数に対応しているか、それ以上の数である。プライマー溶液用容器には、核酸精製溶液に混合するためのプライマー溶液が収容される。分注部４により核酸抽出部２にて抽出された核酸（核酸精製溶液）がＰＣＲ容器に分注されると共に、各種プライマー溶液が各ＰＣＲ容器に分注される。

＜制御部＞
制御部１０は、核酸抽出装置１の各部の制御を行う。制御部１０は、核酸抽出部２（加圧部２１、第一昇降機構２３、加圧側移動機構２５、回収側移動機構２６）の制御を行う。つまり、制御部１０は、加圧部２１による加圧を制御する。また、制御部１０は、第一昇降機構２３における押圧部２３２の昇降に関する制御を行う。また、制御部１０は、加圧側移動機構２５の移動に関する制御を行う。また、制御部１０は、回収側移動機構２６の移動に関する制御を行う。

また、制御部１０は、分注部４及び分注側駆動機構５の制御を行う。つまり、制御部１０は、分注部４における圧力調整部４２の加圧及び減圧に関する制御を行う。また、制御部１０は、分注側駆動機構５による分注部４の移動及び昇降に関する制御を行う。

そして、制御部１０は、全体の処理を司るＣＰＵ、作業領域として機能するＲＡＭ、プログラムを記憶するＲＯＭ、データやプログラムを記憶するＨＤＤ又はＳＳＤ等の記憶媒体、外部のセンサ等との間でデータの送受信を行うインターフェース等を有する（図示しない）計算機により構成される。制御部１０が行う各制御は、上記プログラムをＣＰＵが実行することにより実行される。そして、ＣＰＵは、例えば、インターフェースを通じて送受信したデータに基づいて処理を行う。

プログラムには、検体溶解モード、第一洗浄モード、第二洗浄側前処理モード、第二洗浄側後処理モード、核酸回収モード及び、プライマー溶液処理モードが含まれる。検体溶解モードでは、検体における細胞の細胞膜等を溶解して検体から核酸を分離し、核酸を抽出可能にする。第一洗浄モードでは、抽出カラム２００のフィルタ２０１に核酸を凝集させつつ、フィルタ２０１から塩を含む不純物（夾雑物質）を除去する。第二洗浄側前処理モードでは、抽出カラム２００のフィルタ２０１に核酸を残しつつ、フィルタ２０１から除去しきれなかった塩を含む不純物（夾雑物質）を除去する。第二洗浄側後処理モードでは、フィルタ２０１に残る溶液を乾燥させる。核酸回収モードでは、フィルタ２０１に吸着したか核酸を回収する。プライマー溶液処理モードでは、核酸に対してプライマー溶液を加えた混合液を調製する。上記各モードは、以下で説明する＜核酸抽出方法＞にあるように、ＣＰＵにより順に実行される。

＜核酸抽出方法＞
次に、本実施形態における核酸抽出装置１を用いて検体から核酸を抽出する核酸抽出方法について以下説明する。なお、核酸抽出方法は、核酸抽出装置１を用いないで、作業者が手作業で以下に説明する各工程を行っても実現可能であり、そのようなものも本発明の範囲に含まれる。

まず、チップ保持部６（６Ａ、６Ｂ）に十分な量のチップを載置するとともに、新たな抽出カラム２００を抽出カラム保持部２０２（抽出カラム保持片２０３）に、新たな核酸用回収容器３０を核酸用回収容器保持部３１に、新たなＰＣＲ容器をＰＣＲ容器保持部１１０にセットする。また、試薬収容部８に複数の試薬をセットすると共に、プライマー溶液を入れたプライマー溶液用容器をプライマー保持部１１１にセットする。そして、準備された検体用容器９０に、検体を所定量分注して検体用容器保持部９１にセットする。以上が準備処理（ステップＳ１）である。

準備処理を終えて準備が整うと、次に、核酸抽出装置１の運転を開始するために、作業者が操作部１２のスタートボタンを押す。作業者がスタートボタンを押すと、検体溶解モードが開始し、第一処理工程が始まる。第一処理工程では、核酸抽出装置１は、まず、初期化され、加圧部２１は、制御部１０の制御の下、加圧側移動機構２５により図２に示す初期位置に移動される。また、分注部４は、制御部１０の制御の下、分注側駆動機構５により初期位置に移動する。分注部４の初期位置は、例えば、分注シリンダ４０がチップ保持部６Ａで保持された１０００μＬ用のチップの真上に位置するような位置が一例として挙げられる。

次に、分注部４は、制御部１０の制御の下、分注側駆動機構５により各分注シリンダ４０をチップ保持部６Ａに向かって下降させて、各分注シリンダ４０の先端を１０００μＬ用のチップ内に挿入して押し込み、各分注シリンダ４０の先端に第一番目の１０００μＬ用のチップを装着する。なお、以下においてもチップを装着する処理は登場するが、これを単にチップ装着処理と呼ぶ。

その後、分注部４は、制御部１０の制御の下、分注側駆動機構５により試薬収容部８上の所定の位置に移動し、チップを通じて溶解処理溶液を所定量吸引する。なお、溶解処理溶液は、検体に反応（酵素反応）すると、検体における細胞の細胞膜等を溶解して検体から核酸を分離し、その溶解処理溶液においてその核酸を分散させるものである。

更に、分注部４は、制御部１０の制御の下、各分注シリンダ４０が対応する検体用容器９０の真上に位置するように、分注側駆動機構５により検体保持部９に移動する。そして、各分注シリンダ４０を下降させて、対応する検体用容器９０にそれぞれ溶解処理溶液の全量を吐出する。その後、分注部４は、制御部１０の制御の下、分注側駆動機構５により廃棄チップ回収部７に移動し、各分注シリンダ４０を下降させて、（図示しない）チップ離脱機構により第一番目のチップを離脱、廃棄した後、初期位置へ移動する。なお、以下においても使用済みのチップを廃棄する処理は登場するが、これを単にチップ廃棄処理と呼ぶ。

つまり、第一処理工程では、準備処理工程で準備された検体用容器９０内の検体に、溶解処理溶液を所定量加える。第一処理工程における処理を溶解処理溶液分注処理（ステップＳ２）と呼ぶ。そして、第一処理工程が終了すると、第二処理工程に移る。なお、第一処理工程は、分注された検体を収容する検体用容器９０に作業者が手作業で溶解処理溶液を分注してもよい。同様に、第二処理工程以降における各処理のいずれかを適宜作業者が手作業で行ってもよい。

第二処理工程では、検体用容器９０内の検体と溶解処理溶液の混合液を所定時間攪拌する。続く第三処理工程では、検体保持部９によりこれらを所定温度下で所定時間、インキュベート（培養）する（ステップＳ３）。既述のごとく検体保持部９は、撹拌機能と温度調節機能を有している。これにより、検体における細胞の細胞膜等は溶解されて検体から核酸が分離され、その混合液においてその核酸が分散する。

第四処理工程では、検体と溶解処理溶液の反応を停止させるため、検体用容器９０内に溶解反応停止用アルコール溶液（例えば、所定のアルコール濃度を有するエタノール溶液）を加える。具体的に、まず、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ装着処理を行い、各分注シリンダ４０の先端に第二番目の１０００μＬ用のチップを装着する。その後、分注部４は、試薬収容部８上に移動して、エタノール溶液を所定量吸引した後に、検体用容器９０の上方に移動して検体用容器９０に向かって下降し、検体用容器９０それぞれに対してエタノール溶液を全量吐出する。そして、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ廃棄処理を行って、第二番目のチップを離脱、廃棄し、初期位置へ移動する。第四処理工程における処理を溶解反応停止用アルコール溶液分注処理（ステップＳ４）と呼ぶ。

第五処理工程では、検体保持部９により検体用容器９０を所定時間間攪拌する（ステップＳ５）。これにより、検体用容器９０内の混合液（検体、溶解処理溶液及び溶解反応停止用アルコール溶液）は十分に混ざり合う。結果、混合液中に検体から分離された核酸が分散した状態で、検体と溶解処理溶液の反応（酵素反応）が停止する。

次に、第六処理工程では、まず、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ装着処理を行い、各分注シリンダ４０の先端に第三番目の１０００μＬ用のチップを装着する。そして、分注部４は、制御部１０の制御の下、分注側駆動機構５により検体用容器９０の上方に移動して検体用容器９０に向かって下降し、検体用容器９０のそれぞれから核酸が分散した状態の混合液を吸引する。その後、分注部４は、制御部１０の制御の下、分注側駆動機構５により各抽出カラム２００の上方に移動して各抽出カラム２００に向かって下降し、各抽出カラム２００それぞれに対して核酸が分散した状態の混合液を全量吐出する。そして、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ廃棄処理を行って、第二番目のチップを離脱、廃棄し、初期位置へ移動する。第六処理工程における処理を混合液カラム移動処理（ステップＳ６）と呼ぶ。

なお、この状態において、回収側移動機構２６は、制御部１０の制御の下、図１０（Ａ）に示すように、各抽出カラム２００の直下に廃液回収部２２が位置するように廃液回収部２２をスライド移動させる。この際、廃液用回収容器２２０の開口２２０Ａは、上下方向Ａにおいて抽出カラム２００の排出開口２００Ｂの真下に位置する。

第七処理工程以降では、抽出カラム２００に分注された混合液に対して加圧部２１で加圧を行い、混合液に含まれる核酸等をフィルタ２０１に吸着させつつ、混合液の廃棄を行う。具体的に、第七処理工程では、加圧部２１は、制御部１０の制御の下、加圧側移動機構２５により、混合液を吐出された抽出カラム２００を保持する各抽出カラム保持片２０３（図２の抽出カラム保持部２０２の左端に位置する抽出カラム保持片２０３）に移動する。この際、図１０（Ｂ）に示すように、加圧部２１の加圧用カラムキャップ２１０は、対応する各抽出カラム２００の真上に位置する（図６Ａ（Ａ）及び図１０（Ａ），（Ｂ）参照）。

そして、分注部４は、制御部１０の制御の下、分注側駆動機構５によりカラムキャップ保持部２１１の上面側に設けられた受け部２１１Ｂの上方に移動した後に下降する。この際、分注部４と共に下降する押圧部２３２が受け部２１１Ｂを押圧して、第一昇降機構２３によりカラムキャップ保持部２１１を下降させる。これにより加圧用カラムキャップ２１０が下降し、対応する抽出カラム２００に当接して、抽出カラム２００を密閉する。（図６Ａ（Ａ）、図７Ａ（Ａ）及び図１０（Ｂ），（Ｃ）参照）。

押圧部２３２が受け部２１１Ｂと共に更に下降すると、第二昇降機構２４により、加圧用カラムキャップ２１０によって抽出カラム２００が密閉された状態で、一対のコイルばね２４１Ａが最も縮んだ状態か、又は、押圧部２３２の押圧力に対して平衡となる一対のコイルばね２４１Ａの縮みに達した状態になるまで抽出カラム保持片２０３（架設部２０３Ｂ）は下降する（図７Ａ（Ｂ）及び図１０（Ｄ）参照）。この際、抽出カラム２００の一部は、図７Ａ（Ｂ）及び図１０（Ｄ）に示すように、廃液用回収容器２２０の内部に挿入された状態になる。

第八処理工程では、加圧部２１は、制御部１０の制御の下、加圧用シリンジ２１３を制御して、密閉された抽出カラム２００のそれぞれに所定の空気圧を加え、設定圧閾値を超える圧力まで圧力を増加させて、第一の加圧を行う。その後、加圧部２１は、加圧（圧力の増加）を停止するとともに、各抽出カラム２００に対して設定圧閾値を超える圧力の印加状態を、所定時間維持する。加圧および所定時間の加圧停止により、各抽出カラム２００では、核酸等がフィルタ２０１に吸着しつつ、廃液が廃液回収部２２に排出される。これにより、各抽出カラム２００に加えられていた圧力は所定時間内に減圧（自然減圧）し、設定圧閾値を下回る。

制御部１０の制御の下、押圧部２３２が受け部２１１Ｂに対する押圧を解除すると、第一昇降機構２３の付勢部２３１の付勢力によりカラムキャップ保持部２１１と共に各加圧用カラムキャップ２１０が上昇し、且つ第二昇降機構２４の付勢部２４１の付勢力により抽出カラム保持片２０３と共に各抽出カラム２００が上昇する。抽出カラム保持片２０３と共に各抽出カラム２００が初期位置で停止した後も、カラムキャップ保持部２１１と共に各加圧用カラムキャップ２１０は更に上昇し、初期位置に復帰するとともに抽出カラム２００の上方が開放される。これにより、各抽出カラム２００は大気圧下に開放され、抽出カラム２００に印加されていた圧力が減少する。以上の処理を、押圧解除処理と呼ぶ。このように本実施形態では、各抽出カラム２００それぞれに対して設定圧閾値を超える圧力まで加圧した後、加圧を停止して各抽出カラム２００を、設定圧閾値を超える圧力で所定時間保持し、その後減圧する加減圧サイクルを１回行っているが、これに限定されるものではなく、加減圧サイクルを複数回（ここでは２回）実行してもよい。

なお、本実施形態において、「加圧」とは圧力を増加させている状態をいい、「加圧の停止」とは圧力の増加（変化）を停止する状態をいい、「減圧」とは圧力を減少させている状態をいう。また、本実施形態の「減圧」は、抽出カラム２００から溶液が全て排出されて自然に圧力が減少する場合や、抽出カラム２００を大気圧下に開放することによって、設定圧閾値を超える圧力から大気圧に戻す（圧力を減少させる）場合を例に説明するが、減圧には、大気圧への開放に代えて（あるいはこれに加えて）吸引することによって設定圧閾値を超える圧力から圧力を減少させる場合も含まれる。

なお、以上の第一～八処理工程を検体溶解工程と呼び、検体溶解工程で行われる処理を、検体溶解処理と呼ぶ。そのうち、特に、第七～八処理工程における処理を加圧処理（ステップＳ７）と呼ぶ。いずれにしても本実施形態における検体溶解工程では、検体から核酸を分離して、核酸を抽出可能な状態にしており、そのことを作業者が上記とは別の方法で実現したものも検体溶解工程として本発明の範囲に含まれる。

第九処理工程以降では、各抽出カラム２００内のフィルタ２０１の洗浄を行い、フィルタ２０１から核酸以外の成分を除去する洗浄工程（第一洗浄、第二洗浄）に入る。具体的に第九処理工程では、第一洗浄モードが開始され、まず、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ装着処理を行い、各分注シリンダ４０の先端に第四番目の１０００μＬ用のチップを装着する。その後、分注部４は、試薬収容部８上に移動して、第一洗浄液Ｗ１を所定量（例えば、５００μＬ）吸引した後、各抽出カラム２００（抽出カラム保持片２０３）の上方に移動して各抽出カラム２００に向かって下降し、各抽出カラム２００それぞれに対して第一洗浄液Ｗ１の全量を吐出する。そして、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ廃棄処理を行って、第四番目のチップを離脱、廃棄し、初期位置へ移動する。

なお、第一洗浄液Ｗ１は、上記説明したように、主として、核酸を沈殿させるために用いられるものである。その意味で、第一洗浄液Ｗ１は、核酸沈殿用溶液として機能する。第一洗浄液Ｗ１には、アルコール溶液（例えば、エタノール溶液）、及び塩が含まれる。抽出カラム２００に第一洗浄液Ｗ１を加えると、核酸のリン酸部分がアルコール溶液で解離して、核酸が全体として、負電荷を帯びた状態になる。そこに、塩が加わると、核酸のリン酸の対イオンとして一価の陽イオンが核酸分子に近づく。これにより、核酸の負電荷が中和されるので、アルコール溶液中で親水性の高い核酸分子が凝集しやすくなる。結果、アルコール溶液中で核酸が沈殿する。つまり、第九処理工程では、主として、核酸を沈殿させて凝集させる処理（核酸沈殿処理）が行われる。なお、第九処理工程を核酸沈殿工程と呼ぶ。

第十処理工程では、加圧処理を行う。具体的に第十処理工程では、制御部１０の制御の下、再び押圧部２３２によって受け部２１１Ｂを押圧して、第一昇降機構２３及び第二昇降機構２４によりカラムキャップ保持部２１１及び抽出カラム保持片２０３を下方に移動させる。この状態では、上記説明したように、加圧用カラムキャップ２１０によって抽出カラム２００が密閉されている。そして、加圧部２１は、制御部１０の制御の下、加圧用シリンジ２１３を制御して、密閉された抽出カラム２００のそれぞれに所定の空気圧を加えて（圧力を増加させて）、設定圧閾値を超える圧力まで圧力を増加させて、第二の加圧を行う。加圧部２１は、設定圧閾値を超えて設定した圧力の印加状態を所定時間維持する（加圧（圧力の増加）を停止する）（図１０（Ｂ）～（Ｄ）参照）。第二の加圧により、第一洗浄液Ｗ１を通じてフィルタ２０１は洗浄されるが、沈殿した核酸はフィルタ２０１に吸着しつつ、不純物（夾雑物質）の一部は洗浄液と共に廃液回収部２２に排出される（図１０（Ｄ））。

以上が終了すると、制御部１０の制御の下、押圧部２３２が受け部２１１Ｂに対する押圧が解除されて、押圧解除処理が行われ、カラムキャップ保持部２１１（各加圧用カラムキャップ２１０）及び抽出カラム保持片２０３（各抽出カラム２００）が初期位置に復帰する。その後、制御部１０の制御の下、分注側駆動機構５、加圧側移動機構２５により、分注部４、加圧部２１は、初期位置に復帰する。なお、第九～十処理工程を第一前洗浄工程と呼び、第一前洗浄工程における処理を第一前洗浄処理（ステップＳ８）と呼ぶ。

第十一処理工程では、まず、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ装着処理を行い、各分注シリンダ４０の先端に第五番目の１０００μＬ用のチップを装着する。その後、分注部４は、試薬収容部８上に移動して、第二洗浄液Ｗ２を所定量（例えば、５００μＬ）吸引した後、各抽出カラム２００（抽出カラム保持片２０３）の上方に移動して各抽出カラム２００に向かって下降し、各抽出カラム２００それぞれに対して第二洗浄液Ｗ２の全量を吐出する。そして、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ廃棄処理を行って、第五番目のチップを離脱、廃棄し、初期位置へ移動する。

なお、第一前洗浄処理が行われた後、フィルタ２０１には、凝集した核酸のみならず、第一洗浄液Ｗ１に含まれる塩を含む不純物（夾雑物質）も残る。第二洗浄液Ｗ２は、フィルタ２０１に凝集した核酸を残しつつ、塩を含む不純物（夾雑物質）を除去するために用いられるものである。第二洗浄液Ｗ２は、例えば、７０％程度のアルコール濃度を有するアルコール溶液（例えば、エタノール溶液）で構成される。

第十二処理工程では、制御部１０の制御の下、押圧部２３２及び加圧部２１により加圧処理を行って、第三の加圧を行い、各抽出カラム２００のフィルタを洗浄する。第三の加圧により第二洗浄液Ｗ２を通じてフィルタ２０１は洗浄され、凝集した核酸はフィルタ２０１に残しつつ、塩を含む不純物（夾雑物質）と共に洗浄液が廃液回収部２２に排出される。これにより、フィルタ２０１に吸着した塩を含む不純物（夾雑物質）をある程度除去することができる。その後、制御部１０の制御の下、押圧部２３２が受け部２１１Ｂに対する押圧が解除されて、押圧解除処理が行われ、カラムキャップ保持部２１１（各加圧用カラムキャップ２１０）及び抽出カラム保持片２０３（各抽出カラム２００）が初期位置に復帰する。その後、制御部１０の制御の下、分注側駆動機構５、加圧側移動機構２５により、分注部４、加圧部２１は、初期位置に復帰する。ここで、第一洗浄モードが終了する。なお、第十一～十二処理工程を第一後洗浄工程と呼び、第一後洗浄工程における処理を第一後洗浄処理（ステップＳ９）と呼ぶ。そして、第一前洗浄工程と第一後洗浄工程を合わせた工程を第一洗浄工程と呼ぶ。

第十三処理工程では、第二洗浄側前処理モードが開始され、まず、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ装着処理を行い、各分注シリンダ４０の先端に第六番目の１０００μＬ用のチップを装着する。その後、分注部４は、試薬収容部８上に移動して、第三洗浄液Ｗ３を所定量（例えば、５００μＬ）吸引した後、各抽出カラム２００（抽出カラム保持片２０３）の上方に移動して各抽出カラム２００に向かって下降し、各抽出カラム２００それぞれに対して第三洗浄液Ｗ３の全量を吐出する。そして、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ廃棄処理を行って、第六番目のチップを離脱、廃棄し、初期位置へ移動する。

なお、第一後洗浄処理が行われた後、フィルタ２０１には、凝集した核酸のみならず、塩を含む不純物（夾雑物質）も未だに残る。例えば、第二洗浄液Ｗ２がアルコール濃度７０％程度のアルコール溶液である場合、第二洗浄液Ｗ２にも不純物（夾雑物質）が含まれ、その不純物（夾雑物質）もフィルタ２０１に残る。フィルタ２０１に不純物（夾雑物質）が多く残ると、その不純物がＲＮＡをＤＮＡに逆転写する逆転写酵素の働きを阻害する可能性があり、結果、ｑＰＣＲ法による検出ができないことがあるため、フィルタ２０１からなるべく多くの不純物（夾雑物質）を除去することが好ましい。第三洗浄液Ｗ３は、フィルタ２０１に凝集した核酸を残しつつ、塩を含む不純物（夾雑物質）を更に除去するために用いられるが、特に、第二洗浄液Ｗ２におけるアルコール以外の不純物（夾雑物質）を機械的に抽出カラム２００（フィルタ２０１）の外に押し出す意義を有する。

不純物を除去する観点から、第三洗浄液Ｗ３には、アルコール溶液以外の余計な不純物（夾雑物質）が含まれていないものが好ましい。その意味で、第三洗浄液Ｗ３は、最後に行われた第一洗浄処理で用いられた第二洗浄液Ｗ２よりも高濃度の高濃度アルコール溶液で構成されることが好ましい。第二洗浄液Ｗ２は、例えば、７５％以下の濃度のアルコール溶液（例えば、エタノール溶液）で構成されるが、本実施形態では７０％のアルコール溶液で構成されることが想定される。この場合、第三洗浄液Ｗ３は、９０％以上の濃度のアルコール溶液であることが好ましく、９９％以上の濃度のアルコール溶液であることがより好ましく、９９．８％のアルコール濃度を有するアルコール溶液が更に好ましい。また、ここで用いられるアルコール溶液として、エタノール溶液が好ましい。

以下で説明する第十四処理工程の加圧処理を経て、最終的にフィルタ２０１に含まれる
成分が、第三洗浄液Ｗ３に起因する成分に置換されることが好ましい。このため、フィルタ２０１の液体最大吸収量をＮとした場合、抽出カラム２００に吐出される第三洗浄液Ｗ３の量は、２Ｎ以上（２回以上置換）が好ましく、５Ｎ以上（５回以上置換）がより好ましく、１０Ｎ以上（１０回以上置換）がさらに好ましい。

第十四処理工程では、加圧処理を行う。具体的に第十四処理工程では、制御部１０の制御の下、再び押圧部２３２によって受け部２１１Ｂを押圧して、第一昇降機構２３及び第二昇降機構２４によりカラムキャップ保持部２１１及び抽出カラム保持片２０３を下方に移動させる。この状態では、上記説明したように、加圧用カラムキャップ２１０によって抽出カラム２００が密閉されている。そして、加圧部２１は、制御部１０の制御の下、加圧用シリンジ２１３を制御して、密閉された抽出カラム２００のそれぞれに所定の空気圧を加えて（圧力を増加させて）、設定圧閾値を超える圧力まで圧力を増加させて、第四の加圧を行う。加圧部２１は、設定圧閾値を超えて設定した圧力の印加状態を所定時間維持する（加圧（圧力の増加）を停止する）（図１０（Ｂ）～（Ｄ）参照）。第四の加圧により、第三洗浄液Ｗ３を通じてフィルタ２０１は洗浄されるが、沈殿した核酸はフィルタ２０１に吸着しつつ、不純物（夾雑物質）は洗浄液と共に廃液回収部２２に排出される（図１０（Ｄ））。

以上が終了すると、制御部１０の制御の下、押圧部２３２が受け部２１１Ｂに対する押圧が解除されて、押圧解除処理が行われ、カラムキャップ保持部２１１（各加圧用カラムキャップ２１０）及び抽出カラム保持片２０３（各抽出カラム２００）が初期位置に復帰する。その後、制御部１０の制御の下、分注側駆動機構５、加圧側移動機構２５により、分注部４、加圧部２１は、初期位置に復帰する。なお、第十三～十四処理工程を第二洗浄側前処理工程と呼び、第二洗浄側前処理工程における処理を置換処理（第二洗浄側前処理：ステップＳ１０）と呼ぶ。本発明において置換処理（第二洗浄側前処理：ステップＳ１０）は、抽出カラム２００（フィルタ２０１）の内部に収容されるものを第三洗浄液Ｗ３に置換するという意味で用いている。置換処理（第二洗浄側前処理）は、複数回行われてもよい。ここで、第二洗浄側前処理モード（置換モード）が終了する。

第十五処理工程では、第二洗浄側後処理モードが開始され、各抽出カラム２００のフィルタ２０１を乾燥させる乾燥処理を行う。乾燥処理とは、所定時間放置してフィルタ２０１に残る第三洗浄液Ｗ３を乾燥させるものであってもよいし、別途備えた（図示しない）熱源を用いてフィルタ２０１に残る第三洗浄液Ｗ３を乾燥させるものであってもよい。第二洗浄側前処理工程において置換処理が複数行われる場合、乾燥処理は、第二洗浄側前処理工程の最後の置換処理の後に行われるが、これに限定されるものではなく、置換処理と交互に行われてもよい。乾燥処理によりフィルタ２０１に残る第三洗浄液Ｗ３を揮発させ、フィルタ２０１から除去することができる。そして、第三洗浄液Ｗ３として、不純物の濃度が低く、揮発性の高い高濃度アルコール溶液が用いられるため、置換処理で第三洗浄液Ｗ３に起因する不純物をフィルタ２０１に多く追加しなくて済むと共に、乾燥処理において、第一後洗浄処理で用いられるようなアルコール溶液と比べて乾燥時間が短くて済む。結果、核酸抽出にかかる時間を短くすることができる。更に、特に、第三洗浄液Ｗ３を用いれば、ｑＰＣＲ法にＲＮＡを適用する場合、ＤＮＡに逆転写することを阻害する阻害物質を従来に比べて低減させることができる。なお、第十五処理工程を第二洗浄側後処理工程（乾燥工程）と呼び、第二洗浄側後処理工程（乾燥工程）における処理を乾燥処理（第二洗浄側後処理：ステップＳ１１）と呼ぶ。乾燥処理（第二洗浄側後処理）は、置換処理（第二洗浄側前処理）毎に行われる。ここで、第二洗浄側後処理モード（乾燥モード）が終了する。

以上において第一前洗浄処理（ステップＳ８）、第一後洗浄処理（ステップＳ９）、第二洗浄側前処理（ステップＳ１０）、第二洗浄側後処理（ステップＳ１１）と複数回の洗浄処理を行ったが、第一洗浄処理は、少なくとも一回行えばよい。そして、第一洗浄処理を何回行おうとも、第二洗浄側前処理で用いられる第三洗浄液Ｗ３に含まれるアルコール溶液は、最後の第一洗浄処理で用いられた洗浄液としてのアルコール溶液よりも高濃度であればよい。

第十六処理工程では、核酸回収モードが開始され、制御部１０の制御の下、図１０（Ｄ），（Ｅ）に示すように、回収側移動機構２６により各抽出カラム２００の直下に核酸回収部３が位置するように核酸回収部３をスライド移動させる（図６Ｂ及び図７Ｂ参照。）。この際、核酸用回収容器３０の開口３０Ａは、上下方向Ａにおいて抽出カラム２００の排出開口２００Ｂの真下に位置する。

第十七処理工程では、まず、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ装着処理を行い、各分注シリンダ４０の先端に第七番目の１０００μＬ用のチップを装着する。その後、分注部４は、試薬収容部８上に移動して、回収用溶液Ｅ（例えば、純水（蒸留水）とキレート剤の混合溶液）を所定量（例えば、５００μＬ）吸引した後、各抽出カラム２００（抽出カラム保持片２０３）の上方に移動して各抽出カラム２００に向かって下降し、各抽出カラム２００それぞれに対して回収用溶液Ｅの全量を吐出する。そして、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ廃棄処理を行って、第七番目のチップを離脱、廃棄し、初期位置へ移動する。

第十八処理工程では、制御部１０の制御の下、押圧部２３２及び加圧部２１により加圧処理を行って、第五の加圧を行う。これにより、各抽出カラム２００のフィルタ２０１に吸着していた核酸が回収用溶液Ｅとともに対応する核酸用回収容器３０に排出され、所定量の核酸精製溶液が得られる（図１０（Ｇ）参照）。その後、制御部１０の制御の下、分注側駆動機構５、加圧側移動機構２５により、分注部４、加圧部２１は、初期位置に復帰する。なお、第十六～十八処理工程を核酸回収工程と呼び、核酸回収工程における処理を核酸回収処理（ステップＳ１２）と呼ぶ。ここで、核酸回収モードが終了する。

なお、核酸回収処理（ステップＳ１２）は、第二洗浄側後処理（ステップＳ１１）及び第二洗浄側前処理（ステップＳ１０）に代わって、又は、追加して、複数回行われてもよい。回収用溶液Ｅにより、フィルタ２０１に残存する不純物を除去するためである。このようなものも本発明の範囲に含まれる。

＜プライマー溶液分注工程（制御部による自動運転）＞
以降の工程では、得られた核酸精製溶液にプライマー溶液を分注する。まず、第十九処理工程では、プライマー溶液処理モードが開始され、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ装着処理を行い、各分注シリンダ４０の先端に第八番目の２０μＬ用チップを装着する。その後、分注部４は、核酸用回収容器３０上に移動して核酸用回収容器３０に向かって下降し、核酸精製溶液を吸引した後、各ＰＣＲ容器（ＰＣＲ容器保持部１１０）の上方に移動して各ＰＣＲ容器に向かって下降し、各ＰＣＲ容器それぞれに対して核酸精製溶液の全量を吐出する。そして、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ廃棄処理を行って、第八番目のチップを離脱、廃棄し、初期位置へ移動する。

その後、第二十処理工程では、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ装着処理を行い、各分注シリンダ４０の先端に第九番目の２０μＬ用チップを装着する。そして、分注部４は、プライマー保持部１１１で保持されるプライマー溶液用容器上に移動してプライマー溶液用容器に向かって下降し、プライマー溶液を吸引した後、ＰＣＲ容器（ＰＣＲ容器保持部１１０）の上方に移動してＰＣＲ容器に向かって下降し、ＰＣＲ容器それぞれに対してプライマー溶液の全量を吐出する。そして、分注部４は、制御部１０の制御の下、チップ廃棄処理を行って、第九番目のチップを離脱、廃棄し、初期位置へ移動する。以下、異なるプライマー溶液を別のＰＣＲ容器に吐出する場合も上記と同様に、チップ装着処理、プライマー溶液吸引処理、プライマー溶液吐出処理、チップ廃棄処理を順に行う。ここで、プライマー溶液処理モードが終了する。

以上のようにして自動運転が終了すると、検体毎の核酸精製溶液に複数のプライマー溶液が分注された混合液が調製される。なお、第十九～二十処理工程をプライマー溶液処理工程と呼び、プライマー溶液処理工程における処理をプライマー溶液処理（ステップＳ１３）と呼ぶ。作業者は、核酸抽出装置１が停止した後、ＰＣＲ容器を取り出し、リアルタイムＰＣＲ工程で核酸を増幅させて、例えば、２３０ｎｍ、２６０ｎｍ、２８０ｎｍについて吸光度測定を行う。

このように、本実施形態によれば、操作者が、検体毎に用意された検体用容器９０に検体を分注した以降は、検体溶液工程からプライマー溶液処理工程までを核酸抽出装置１によって自動連続処理できる。

本実施形態では、以上の操作を自動化することにより、複雑な操作でのミスの回避、
コンタミネーションによるミスの回避、操作者への感染や負担の軽減が可能となり、ひいては判定コストの低減を実現できる。また、検体溶解工程又は第一洗浄工程～核酸回収工程までにおいて、遠心分離機が不要となるので、装置の小型化、低価格化が実現する。さらに、検体溶解工程又は第一洗浄工程～核酸回収工程では、操作も複雑で工程が多く、時間も要するため、自働化が望まれる部分であったが、本実施形態によれば、自動化によって操作時間の短縮、結果の再現性向上を実現できる。

＜ＲＮＡ（SARS-Cov-2（RdRp）遺伝子）の抽出検証１＞
本願発明者は、本願発明の核酸抽出装置を用いた２種類の核酸抽出方法と、遠心操作を手動で行った核酸抽出方法（以下、遠心抽出法と呼ぶ。）と、によりリン酸緩衝溶液（PBS）に標的ＲＮＡ（SARS-Cov-2（RdRp）遺伝子）を添加し、その抽出、精製の可否を検証した。本検証では、ＱＩＡｍｐ（Ｑｉａｇｅｎ社）、及びＣｉｃａ ｇｅｎｅ（関東化学社）の抽出カラムを用いた。本願発明の核酸抽出装置を用いた２種類の核酸抽出方法のうち、一方は、上記説明した本実施形態における核酸抽出方法（以下、第一本願核酸抽出方法と呼ぶ。）であり、他方は、上記説明した本実施形態における核酸抽出方法において、第二洗浄側前処理（ステップＳ１０）及び第二洗浄側後処理（ステップＳ１１）を省いたもの（以下、比較核酸抽出方法と呼ぶ。）である。なお、比較核酸抽出方法は、特開２０１５－１３９３９８号公報に記載されたプロトコルと実質的に同様である。以上の３種類の核酸抽出方法により得られたＲＮＡ精製溶液に逆転写酵素を用いてＤＮＡ精製溶液を作成し、それぞれのＣＴ値をｑＰＣＲ法により算定した。その結果を図１１の表に示す。

遠心抽出法での陽性検体（ＰＢＳ ＋ＲＮＡ）のＣＴ値は、ＱＩＡｍｐの抽出カラム及びＣｉｃａ ｇｅｎｅの抽出カラムに収容された検体間において殆ど差はなく、いずれもＣＴ値は、３２程度であった。いずれの抽出カラムに収容された検体においても添加した標的ＲＮＡが同様に、検出可能に精製されていることが示された。また、陰性検体（ＰＢＳ －ＲＮＡ）では、図１１の表に示すように、標的ＲＮＡは検出されなかったが、内部標準試料（Internal control）のＣＴ値が約１８（１７．７、１７．６）程度であることから、検体間における汚染（コンタミネーション）は確認されなかった。

比較核酸抽出方法では、２種類の抽出カラムに収容された検体において標的ＲＮＡ及び内部標準試料は検出されなかった。内部標準試料も検出できなかったことから、精製、抽出工程において回収できなかった、洗浄液等に含まれる、塩、夾雑物質等がＲＮＡ精製溶液に残っていることで、反応等が阻害されたなどの要因が考えられる。

第一本願核酸抽出方法では、比較核酸抽出方法に第十四処理工程における第二洗浄側前処理（ステップＳ１０）と、第十五処理工程における第二洗浄側後処理（ステップＳ１１）が加わるが、これにより、ＱＩＡｍｐの抽出カラム及びＣｉｃａ ｇｅｎｅの抽出カラムに収容された検体のいずれにおいても、遠心法と近似したＣＴ値結果を得た。また、内部標準試料のＣＴ値が１８（１７．６、１７．７）程度であることから、塩や夾雑物質の除去精製に問題がないことが示された。また、陰性検体（ＰＢＳ －ＲＮＡ）での標的ＲＮＡの検出もされなかったことから、第一本願核酸抽出方法による検体間汚染は無いことが示された。この結果、第一本願核酸抽出方法では、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２遺伝子の検体間汚染なく、抽出、精製処理ができ、且つｑＰＣＲ法による検出が可能であることが示された。このことから、第二洗浄側前処理（ステップＳ１０）と、第十五処理工程における第二洗浄側後処理（ステップＳ１１）によりＲＮＡから塩、夾雑物質等の不純物の多くを除去できたことが証明された。

＜ＲＮＡ（293T細胞 精製RNAを用いたACTIN遺伝子）の抽出検証２＞
本願発明者は、本願発明の核酸抽出装置を用いた４種類の核酸抽出方法と、遠心操作を手動で行った核酸抽出方法と、によりリン酸緩衝溶液（PBS）に標的ＲＮＡ（293T細胞 精製RNAを用いたACTIN遺伝子）を添加し、その抽出、精製の可否を検証した。本願発明の核酸抽出装置を用いた４種類の核酸抽出方法のうち、２種類は、第一本願核酸抽出方法と比較核酸抽出方法である。残りの一方は、本実施形態における核酸抽出方法において、第二洗浄側前処理（ステップＳ１０）及び第二洗浄側後処理（ステップＳ１１）の代わりに、核酸回収処理（ステップＳ１２）を２回行ったもの（以下、第二本願核酸抽出方法と呼ぶ。）であり、残りの他方は、本実施形態における核酸抽出方法において、第二洗浄側前処理（ステップＳ１０）及び第二洗浄側後処理（ステップＳ１１）に追加して、核酸回収処理（ステップＳ１２）を２回行ったもの（以下、第三本願核酸抽出方法と呼ぶ。）である。以上の４種類の核酸抽出方法により得られたＲＮＡ精製溶液に逆転写酵素を用いてＤＮＡ精製溶液を作成し、それぞれの、ＲＮＡの収量を示す「ＲＮＡ ｃｏｎｃ．」、ＲＮＡの純度を示す「Ａ_２６０／Ａ_２８０」、及びＣＴ値を算定した。

その結果を図１２の表に示す。図１２の表において、Ｃ１（遠心、通常）は、一般的な遠心抽出法における通常の流れでＲＮＡを抽出した際のものを表す。Ｃ２（遠心、通常＋エタ乾）は、一般的な遠心抽出法に、洗浄処理として本実施形態の第二洗浄側前処理（ステップＳ１０）及び第二洗浄側後処理（ステップＳ１１）と同様の工程を追加してＲＮＡを抽出した際のものを表す。つまり、Ｃ２では、追加工程にアルコール濃度が９９．８％のエタノール溶液を洗浄液として用い、且つその洗浄液としてのエタノール溶液を乾燥させる工程を加えている。Ｐ１－１（加圧、通常）は、比較核酸抽出方法でＲＮＡを抽出した際のものを表す。Ｐ１－２（加圧、通常＋回収用溶液Ｅ５０μＬ）は、第二本願核酸抽出方法であり、核酸回収工程で回収用溶液Ｅ（純水）を５０μＬ、２回加えて、ＲＮＡを抽出した際のものを表す。Ｐ２－１（加圧、通常＋エタ乾）は、第一本願核酸抽出方法でＲＮＡの抽出した際のものを表す。Ｐ２－２（加圧、通常＋エタ乾＋回収用溶液Ｅ５０μＬ）は、第三本願核酸抽出方法であり、核酸回収工程で２回核酸回収処理を行い、２回目の核酸回収処理で５０μＬの回収用溶液Ｅ（純水）を用いて、ＲＮＡを抽出した際のものを表す。ＰＲ－１（加圧、通常＋エタ乾）は、第一本願核酸抽出方法でＲＮＡの抽出した際のものを表す。ＰＲ２－２（加圧、通常＋エタ乾＋回収用溶液Ｅ５０μＬ）は、第三本願核酸抽出方法であり、核酸回収工程で２回核酸回収処理を行い、２回目の核酸回収処理で５０μＬの回収用溶液Ｅ（純水）を用いて、ＲＮＡを抽出した際のものを表す。

図１２の表に示すＰ１－１を除くＰ１－２～ＰＲ２－２に対応する各値を見れば明らかなように、第一～三本願核酸抽出方法では、遠心抽出法に対応するＣ１，Ｃ２と比較してＲＮＡの収量が１／７～１／８程度なのにも関わらず、遠心抽出法に対応するＣ１，Ｃ２と同様に、問題なく、ｑＰＣＲ法を適用可能な程度に高い精製度でＲＮＡを抽出できている。つまり、第一～三本願核酸抽出方法のように、比較核酸抽出方法に本実施形態の第二洗浄側前処理（ステップＳ１０）及び第二洗浄側後処理（ステップＳ１１）を加えたり、比較核酸抽出方法における核酸回収処理（ステップＳ１２）を複数回行ったりすることにより、高い精製度でＲＮＡを抽出することが証明された。

尚、本発明の核酸抽出方法、及び核酸抽出装置は、上記した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。

１ 核酸抽出装置
２ 核酸抽出部
３ 核酸回収部
４ 分注部
５ 分注側駆動機構
６，６Ａ，６Ｂ チップ保持部
７ 廃棄チップ回収部
８ 試薬収容部
９ 検体保持部
１０ 制御部
１１ プライマー処理部
１２ 操作部
１３ 表示部
１４ 筐体
２０ 分離部
２１ 加圧部
２２ 廃液回収部
２３ 第一昇降機構
２４ 第二昇降機構
２５ 加圧側移動機構
２６ 回収側移動機構
３０ 核酸用回収容器
３１ 核酸用回収容器保持部
３２ 核酸用回収容器保持片
４０ 分注シリンダ
４１ シリンダ保持部
４２ 圧力調整部
９０ 検体用容器
１１０ ＰＣＲ容器保持部
１１１ プライマー保持部
２００ 抽出カラム
２０１ フィルタ
２０２ 抽出カラム保持部
２０３ 抽出カラム保持片
２１０ 加圧用カラムキャップ
２１１ カラムキャップ保持部
２１２ 加圧用チューブ
２１３ 加圧用シリンジ
２１４ 圧力センサ
２２０ 廃液用回収容器
２２１ 廃液用回収容器保持部
２２２ 廃液用回収容器保持片
２３０，２４０ 案内部
２３１，２４１ 付勢部
２３２，２４２ 押圧部

Claims (10)

1. 溶解されて核酸を抽出可能な状態の検体を収容するフィルタ付きの容器にアルコール溶液を注入すると共に、前記容器を加圧して、該核酸を前記フィルタに吸着させつつ、前記フィルタに吸着する不純物を除去し、前記アルコール溶液を前記容器から排出する第一洗浄処理を少なくとも１回行う第一洗浄工程と、
   前記第一洗浄工程において最後に行われた前記第一洗浄処理で注入された前記アルコール溶液のアルコール濃度よりも高濃度の高濃度アルコール溶液を前記容器に注入し、前記容器に残存する前記アルコール溶液を該高濃度アルコール溶液に置換して、該高濃度アルコール溶液を排出する置換処理を少なくとも１回行う第二洗浄側前処理工程と、
   前記第二洗浄側前処理工程の後に前記高濃度アルコール溶液を乾燥させる乾燥処理を行う第二洗浄側後処理工程と、
   前記フィルタに付着した前記核酸を回収する核酸回収工程と、
   を備えることを特徴とする、
   核酸抽出方法。
2. 最後に行われた前記第一洗浄処理で注入された前記アルコール溶液は、７５％以下のアルコール濃度を有し、
   前記高濃度アルコール溶液は、９０％以上のアルコール濃度を有することを特徴とする、
   請求項１に記載の核酸抽出方法。
3. 前記アルコール溶液及び前記高濃度アルコール溶液は、エタノール、イソプロパノール及びプロパノールの少なくともいずれかであることを特徴とする、
   請求項１又は２に記載の核酸抽出方法。
4. 前記第一洗浄工程は、
   第一の濃度の第一のアルコール溶液を前記容器に注入すると共に前記容器を加圧して、前記核酸を前記フィルタに吸着させつつ、前記フィルタに吸着する不純物を除去し、前記第一のアルコール溶液を前記容器から排出する第一前洗浄工程と、
   前記第一前洗浄工程の後に、前記第一の濃度よりも低い濃度の第二の濃度の第二のアルコール溶液を前記容器に注入すると共に前記容器を加圧して、前記核酸を前記フィルタに吸着させつつ、前記フィルタに吸着する不純物を除去し、前記第二のアルコール溶液を前記容器から排出する第一後洗浄工程と、
   を有することを特徴とする、
   請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
5. 前記第一のアルコール溶液には、前記検体において前記核酸を凝集させるための塩が含まれることを特徴とする、
   請求項４に記載の核酸抽出方法。
6. 前記置換処理は、前記高濃度アルコール溶液が前記容器に注入された後に、前記容器を加圧して、前記核酸を前記フィルタに吸着させつつ、前記フィルタに吸着する不純物を除去し、前記高濃度アルコール溶液を前記容器から排出することを特徴とする、
   請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
7. 前記検体を溶解して該検体から前記核酸を抽出可能な状態にする検体溶解工程を、前記第一洗浄工程より前に備え、
   前記検体溶解工程は、
   前記検体を溶解させるための溶解処理溶液を前記検体に加えて酵素反応をさせる工程と、
   エタノール溶液を加えて前記酵素反応を停止させる工程と、
   前記エタノール溶液と前記検体の混合液を前記容器に注入すると共に前記容器を加圧して、該エタノール溶液を排出する工程と、
   を含むことを特徴とする、
   請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
8. 溶解されて核酸を抽出可能な状態の検体を収容するフィルタ付きの容器にアルコール溶液を注入すると共に、前記容器を加圧して、該核酸を前記フィルタに吸着させつつ、前記フィルタに吸着する不純物を除去し、前記アルコール溶液を前記容器から排出する洗浄処理を複数回行う洗浄工程と、
   前記フィルタに吸着する前記核酸を回収するための回収用溶液を前記容器に注入すると共に前記容器を加圧して、前記フィルタに付着した前記核酸を回収する核酸回収処理を複数回行う核酸回収工程と、
   を備えることを特徴とする、
   核酸抽出方法。
9. 検体から核酸を抽出する核酸抽出装置であって、
   前記検体を含む溶液を収容可能で注入開口及び排出開口を有するフィルタ付きの容器を有し、該フィルタにより前記検体から前記核酸を分離可能な分離部と、
   前記容器を加圧する加圧部と、
   前記フィルタから前記核酸を回収する核酸回収部と、
   アルコール溶液を含む複数の試薬を収容する試薬収容部と、
   複数の前記試薬のいずれかを前記注入開口から前記容器に分注する分注部と、
   前記加圧部及び前記分注部を制御する制御部と、
   を備え、
   前記制御部は、第一洗浄モード、第二洗浄側前処理モード、及び第二洗浄側後処理モードを有し、
   前記第一洗浄モードでは、溶解されて前記核酸が抽出可能な状態の前記検体が収容された前記容器に、前記分注部により前記アルコール溶液を注入させると共に、前記加圧部に前記容器を加圧させ、前記核酸を該フィルタに吸着させると共に前記フィルタに吸着する不純物を除去しつつ、前記アルコール溶液を前記容器から排出する第一洗浄処理を少なくとも１回行い、
   前記第二洗浄側前処理モードでは、前記第一洗浄モードにおいて最後に行われた前記第一洗浄処理で注入された前記アルコール溶液のアルコール濃度よりも高濃度の高濃度アルコール溶液を前記分注部により前記容器に注入して、前記容器に残存する前記アルコール溶液を該高濃度アルコール溶液に置換して排出する置換処理を少なくとも１回行い、
   前記第二洗浄側後処理モードでは、最後の前記置換処理の後に前記高濃度アルコール溶液を乾燥させる乾燥処理を行うことを特徴とする、
   核酸抽出装置。
10. 前記分離部は、複数の前記容器を同じ姿勢で第一配列方向に並列に配列可能な容器保持片が、前記第一配列方向に直交する第二配列方向に列状に複数配置された容器保持部を有し、
    前記加圧部は、前記容器保持片毎に複数の前記容器を同時に加圧可能に構成され、
    前記分離部に対して前記加圧部を前記第二配列方向に相対移動させる移動機構と、
    前記容器の前記注入開口側において前記容器に接近及び離反するよう前記分離部に対して前記加圧部を相対的に昇降させる昇降機構と、
    を備えることを特徴とする、
    請求項９に記載の核酸抽出装置。

Images