JP2022110171A

JP2022110171A - 皮膚外用剤

Info

Publication number: JP2022110171A
Application number: JP2021005408A
Authority: JP
Inventors: 茂豊澤木; Shigetoyo Sawaki; 聡道善; Satoshi Michiyoshi; 茉優石黒; Mayu Ishiguro
Original assignee: Kyoei Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Kyoei Kagaku Kogyo KK
Priority date: 2021-01-16
Filing date: 2021-01-16
Publication date: 2022-07-29

Abstract

【課題】皮膚の血行不良等に起因する皮膚の不健全化（クマ、くすみ又は透明感の低下等）に対するすぐれた予防、改善効果を発揮して、皮膚を若々しく健全な状態に保持し、又は改善するとともに、皮膚に対する刺激が少なく生体安全性にもすぐれた新規な有効成分を提供する。【解決手段】キク科（Asteraceae)ベニバナ属(Carthamus)のベニバナ（Carthamus tinctorius）の花部又はその抽出物の加水分解物を有効成分とする皮膚外用剤。【選択図】図１

Description

本発明は、皮膚外用剤に配合可能な植物由来成分に関するものである。

皮膚の老化、肌荒れ又は肌色の不調は、加齢に伴う細胞増殖・分化の不活化、ホルモン分泌の低下、細胞外マトリックス成分の量的低下などの内的要因と、太陽光（紫外線）に誘発される活性酸素による細胞・組織の損傷、又は炎症などの外的要因に加えて、生活習慣の乱れや疲労の蓄積による代謝活性の低下や血行不良が複雑に絡み合って生ずる現象であり、皮膚の老化、肌荒れ又は肌色の不調を総合的に解消する有効成分が求められている。

本発明者らは、かかる従来技術の問題点に鑑みて、天然物由来の安全性にすぐれ、また、安定性及び有効性にすぐれた成分を見出すべく鋭意研究を行った。その結果、キク科ベニバナ属に属するベニバナ（紅花）花部の抽出物の加水分解物が、肌の血流を改善し、肌荒れや肌色を改善することを新たに見出した。

従来、ベニバナ由来成分を皮膚外用剤の配合成分とすることは、例えば、特許文献１～３により公開されている。しかし、ベニバナ又はその抽出物の加水分解物が血流を改善することや、肌荒れや肌色を改善することについては、知られていなかった。

特開昭61-050909号特開昭63-201108 特開2006-169179号

本発明はキク科ベニバナ属に属するベニバナ又はその抽出物の加水分解物を有効成分とする皮膚外用剤である。

本発明は、ベニバナの花又はその抽出物の加水分解物を有効成分とする皮膚外用剤であって、この有効成分は天然物由来のものであるため、皮膚に対する刺激が少なく安全性にすぐれており、また、血流改善等の効果を有するため、有用な皮膚外用剤を提供することができる。

図1は、本発明に係る加水分解物のＮＯ産生促進効果を示す図である。図２は、本発明に係る加水分解物のＮＯ合成酵素（eNOS）の発現促進効果を示す図である。図３は、本発明に係る加水分解物のＮＯ合成酵素（iNOS）の発現抑制効果を示す図である。図４は、本発明に係る加水分解物の皮膚透過性の評価結果を示す図である。図５は、本発明に係る加水分解物の肌色改善効果の評価結果を示す図である。図６は、本発明に係る加水分解物の保湿効果の評価結果を示す図である。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で用いるキク科（Asteraceae)ベニバナ属(Carthamus)のベニバナ（紅花、学名：Carthamus tinctorius）は、品種、産地や色に限定されることなく、ベニバナであればいずれのものでも使用可能である。

ベニバナの花部の開花時期及び大きさ等は特に限定されるものではなく、いずれのものを使用しても良い。又本発明における花部としては、花弁が好ましいが、花弁に加えて、雄しべ、雌しべ等が含まれていてもよい。

抽出物の調製は、まず、ベニバナの花部を、必要ならば予め水洗して異物を除いた後、そのまま又は乾燥した上、必要に応じて細切又は粉砕し、抽出溶媒と接触させて抽出を行う。抽出は、浸漬法等の常法に従って抽出溶媒と接触させることで行うことが可能であるが、超臨界抽出法を用いることも可能である。

抽出溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノールなどの低級アルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチルなどのエステル類；アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類；エチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類；ｎ－ヘキサン、トルエン、クロロホルムなどの炭化水素系溶媒などが挙げられ、それらは単独で又は二種以上混合して用いられる。

それら抽出溶媒のうちでも、皮膚刺激性の観点から、又皮膚外用剤（医薬部外品、化粧品等）への幅広い適用が可能であるという点からも、本発明においては水、低級アルコール類又は多価アルコール類などの親水性溶媒が好適である。この親水性溶媒を用いる場合の好ましい例としては、例えば、水、低級アルコール類（特にエタノール）、又は多価アルコール（特に、１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール又はグリセリン）の単独使用、或いは、水と低級アルコール類（特にエタノール）との混合溶媒、又は水と多価アルコール類（特に、１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール又はグリセリン）との混合溶媒の使用等が挙げられる。

混合溶媒を用いる場合の混合比は、例えば水とエタノールとの混合溶媒であれば、容量比（以下同じ）で１：１～２５：１、水とグリセリンとの混合溶媒であれば１：１～２０：１、水と１，３－ブチレングリコールとの混合溶媒であれば、１：１～２０：１の範囲とすることが好ましい。

また、ベニバナの花部（乾燥したもの）と抽出溶媒との重量比は好ましくは１：１～１：５０の範囲であり、より好ましくは、１：１０～１：３０の範囲である。

抽出物の調製に際して、そのｐＨに特に限定はないが、一般には４～９の範囲とすることが好ましい。かかる意味で、必要であれば、前記抽出溶媒に、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ性調整剤、又はクエン酸、塩酸、リン酸、硫酸などの酸性調整剤を配合し、所望のｐＨとなるように調整してもよい。

抽出温度、抽出時間等の抽出条件は、用いる溶媒の種類やｐＨによっても異なるが、例えば、水、１，３－ブチレングリコール、又は水と１，３－ブチレングリコール又はプロピレングリコールとの混液を溶媒とする場合であれば、抽出温度は一般的には０℃～９５℃の範囲である。また、加圧化で１００℃～１３０℃の温度範囲で抽出することでもよい。又抽出時間は好ましくは３０分～６時間であり、より好ましくは１～４時間の範囲である。

なお、本発明の抽出処理の前段階としての抽出液作成に際して、又は抽出と並行して、加水分解処理を行う。これによって、ベニバナの花部の抽出物よりも高い有効性を創出し、かつ、臭いや着色を改善することができる。

抽出物に酵素加水分解処理を施す場合、酵素としては、例えば、アクチナーゼ類、パパイン、キモパパインなどのパパイン類、グリシルグリシンペプチターゼ、カルボキシペプチターゼ、アミノペプチターゼなどのペプチターゼ類、スミチーム類、ニュートラーゼ類等のタンパク分解酵素、グルコアミラーゼ、α－アミラーゼ、β－アミラーゼなどの澱粉分解酵素、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼなどの繊維素分解酵素、及びリパーゼなどの脂肪分解酵素から選ばれた１種、又はそれらの酵素群からそれぞれ選ばれた１種又は２種以上の酵素を組み合わせて用いることが好ましい。

酵素の添加量は、ベニバナの花部の固形分に対して、合計で０．００１～１０重量％の範囲とすることで良い。

上述のように調製した加水分解物は、一般にはｐＨを４～８に調製した上で、これをそのままの状態で化粧料配合剤として使用しても良く、又減圧濃縮等により所望の濃度として使用しても良い。また、抽出物はスプレードライ法等の常法により乾燥物としても良い。

また、上述のように調製した加水分解物は、保存安定性等を高めるために、一定時間冷蔵保存した上で、使用しても良い。

本発明に係るベニバナ花の抽出物の加水分解物は、溶媒、酵素等を適宜選択することで、脂肪酸、フェノール類又はタンパク質等に由来する臭いを改善したものであることを特徴とする。一方で、本発明に係るベニバナ花の抽出物の加水分解物は、色素成分(Safflomin B,Hydroxysafflor Yellow A）やその他の含有成分の細胞への取り込みを阻害する要因となる成分（フェノール類又はタンパク質等）の分解により、有効性を発揮できるように調製されていることも特徴とする。

本発明に係るベニバナ抽出物の加水分解物を含む皮膚外用剤（医薬部外品、化粧品、外用医薬品）としては、例えば、乳液、化粧水、美容液、クリーム、ローション、エッセンス、パック、口紅、ファンデーション、リクイドファンデーション、メイクアッププレスパウダー、ほほ紅、白粉、洗顔料、ボディシャンプー、毛髪用シャンプー、毛髪用コンディショナー、石けん、マスク用製剤、及び浴剤等が挙げられるが、本発明はそれらに限定されるものではない。

本発明の皮膚外用剤におけるベニバナ花部の抽出物を加水分解して得られる加水分解物の配合量は、固形分濃度として、０．００２～１０．０質量％の範囲である。

本発明に係る有効成分を皮膚外用剤に配合する場合、必須成分の上記組成物のほかに、一般的に皮膚外用剤に用いられる成分、例えば油性成分、界面活性剤（合成系、天然物系）、保湿剤、消炎剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、抗アクネ剤、細胞賦活剤、粉体成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、美白剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。

ここで、油性成分としては、例えば、オリーブ油、ホホバ油、ヒマシ油、大豆油、米油、米胚芽油、ヤシ油、パーム油、カカオ油、メドウフォーム油、シアーバター、ティーツリー油、アボガド油、マカデミアナッツ油、ベルガモット油、ラベンダー油、バラ油、ベルガモット油、カミツレ油等の植物由来スクワラン等の植物由来の油脂類；ビタミンＡ油；ミンク油、タートル油等の動物由来の油脂類；ミツロウ、カルナウバロウ、ライスワックス、ラノリン等のロウ類；流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワラン等の炭化水素類；ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、ｃｉｓ－１１－エイコセン酸等の脂肪酸類；ラウリルアルコール、セタノール、パントテニルアルコール、ステアリルアルコール等の高級アルコール類；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸ブチル、２－エチルヘキシルグリセライド、高級脂肪酸オクチルドデシル（ステアリン酸オクチルドデシル等）等の合成エステル類及び合成トリグリセライド類等が挙げられる。

界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤；脂肪酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪アミン硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル燐酸塩、α－スルホン化脂肪酸アルキルエステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル燐酸塩等のアニオン界面活性剤；第四級アンモニウム塩、第一級～第三級脂肪アミン塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２－アルキル－１－アルキル－１－ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、Ｎ、Ｎ－ジアルキルモルフォルニウム塩、ポリエチレンポリアミン脂肪酸アミド塩等のカチオン界面活性剤；Ｎ、Ｎ－ジメチル－Ｎ－アルキル－Ｎ－カルボキシメチルアンモニオベタイン、Ｎ、Ｎ、Ｎ－トリアルキル－Ｎ－アルキレンアンモニオカルボキシベタイン、Ｎ－アシルアミドプロピル－Ｎ′、Ｎ′－ジメチル－Ｎ′－β－ヒドロキシプロピルアンモニオスルホベタイン等の両性界面活性剤等を使用することができる。

乳化剤及び／又は乳化助剤としては、酵素処理ステビア等のステビア誘導体、サポニン又はその誘導体、カゼイン又はその塩（ナトリウム等）、糖とタンパク質の複合体、ショ糖又はそのエステル、ラクトース、大豆由来の水溶性多糖、大豆由来タンパク質と多糖の複合体、ラノリン又はその誘導体、コレステロール、ステビア誘導体（ステビア酵素処理物等）、ケイ酸塩（アルミニウム、マグネシウム等）、炭酸塩（カルシウム、ナトリウム等）サポニン及びその誘導体、レシチン及びその誘導体（水素添加レシチン等）、乳酸菌醗酵米、乳酸菌醗酵発芽米、乳酸菌醗酵穀類（麦類、豆類、雑穀等）等を配合することもできる。

保湿剤としては、保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１、３－ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、キシリトール、ピロリドンカルボン酸ナトリウム等があり、さらにトレハロース、ラフィノース等の糖類、ムコ多糖類（例えば、ヒアルロン酸及びその誘導体、ヒアルロン酸発酵液、コンドロイチン及びその誘導体、ヘパリン及びその誘導体等）、エラスチン及びその誘導体、コラーゲン及びその誘導体、コラーゲンペプチド、ＮＭＦ関連物質、乳酸、尿素、高級脂肪酸オクチルドデシル、海藻抽出物、エストラジオール、各種アミノ酸及びそれらの誘導体が挙げられる。

増粘剤としては、例えばアルギン酸、寒天、カラギーナン、フコイダン等の褐藻、緑藻又は紅藻由来成分；ペクチン、アロエ多糖体等の多糖類；トラガントガム、ローカストビーンガム、キサンタンガム、グアーガム等のガム類；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース誘導体；カルボシキビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アクリル酸・メタクリル酸共重合体等の合成高分子類；ヒアルロン酸及びその誘導体；ポリグルタミン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸等が挙げられる。

消炎剤としては、アラントイン、グリチルリチン酸ジカリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウム、β－グリチルレチン酸、グリチルレチン酸ステアリル、ε－アミノカプロン酸、d－カンフル、dl－カンフル、酸化亜鉛、パンテノール、ピリドキシン塩酸塩、及びリボフラビン又はその誘導体等がある。

防腐・殺菌剤としては、例えば尿素；安息香酸又はその塩、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル類；フェノキシエタノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、ピリチオン亜鉛、塩化ベンザルコニウム、エタノール、ウンデシレン酸、フェノール類、臭化アルキルイソキノリニウム、レゾルシン、ジャマール（イミダゾデイニールウレア）、イソプロピルメチルフェノール、トリクロサン、トリクロロカルバニド、トリクロロヒドロキシジフェノールエーテル、ヒノキチオール、１、２－ペンタンジオール、プロパンジオール、濃ベンザルコニウム塩化物液５０、ハッカ油、ユーカリ油等の精油類、樹皮乾留物、大根発酵液、サトウキビ、トウモロコシ等の植物由来のエタノール又は１、３－ブチレングリコール等がある。

細胞賦活剤としては、パントテニルアルコール、メントール、dl－メントール、及びγ－オリザノール等がある。

抗アクネ剤としては、イオウ、サリチル酸又はその塩、感光素２０１号、ジカプリル酸ピリドキシン等がある。

粉体成分しては、例えばセリサイト、酸化チタン、タルク、カオリン、ベントナイト、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、無水ケイ酸、雲母、ナイロンパウダー、ポリエチレンパウダー、シルクパウダー、セルロース系パウダー、穀類（米、麦、トウモロコシ、キビ等）のパウダー、豆類（大豆、アズキ等）のパウダー等がある。

紫外線吸収剤としては、例えばパラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシル、サリチル酸アミル及びその誘導体、パラメトキシ桂皮酸２－エチルヘキシル、桂皮酸オクチル、オキシベンゾン、２、４－ジヒドロキシベンゾフェノン、２－ヒドロキシ－４－メトキシベンゾフェノン－５－スルホン酸塩、４－ターシャリーブチル－４－メトキシベンゾイルメタン、２－（２－ヒドロキシ－５－メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、アロエ抽出物等がある。

抗酸化剤としては、例えばブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、アスタキサンチン等のカロテノイド、ビタミンＥ及びその誘導体（例えば、トコフェロール酢酸エステル、トコフェロールニコチン酸エステル）、ビタミンＡ又はその誘導体（パルミチン酸レチノール等）等がある。

また、美白剤として、コウジ酸又はその誘導体、アスコルビン酸又はその誘導体、ハイドロキノン又はその誘導体、エラグ酸及びその誘導体、レゾルシノール誘導体、４－メトキシサリチル酸カリウム塩、ビタミンＥ又はその誘導体、ニコチン酸又はその誘導体、マグノリグナン（5、5'－ジプロピル－ビフェニル－2、2’－ジオール）、ヒドロキシ安息香酸及びその誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体、α－ヒドロキシ酸、ＡＭＰ（アデノシンモノホスフェイト、アデノシン１リン酸）から選択される１以上のものが挙げられる。

上記のコウジ酸誘導体としては、例えばコウジ酸モノブチレート、コウジ酸モノカプレート、コウジ酸モノパルミテート、コウジ酸ジブチレートなどのコウジ酸エステル類、コウジ酸エーテル類、コウジ酸グルコシドなどのコウジ酸糖誘導体等が、アスコルビン酸誘導体としては、例えばＬ－アスコルビン酸－２－リン酸エステルナトリウム、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸エステルマグネシウム、Ｌ－アスコルビン酸－２－硫酸エステルナトリウム、Ｌ－アスコルビン酸－２－硫酸エステルマグネシウムなどのアスコルビン酸エステル塩類、Ｌ－アスコルビン酸－２－グルコシド（２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸）、Ｌ－アスコルビン酸－５－グルコシド（５－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸）などのアスコルビン酸糖誘導体、それらアスコルビン酸糖誘導体の６位アシル化物（アシル基は、ヘキサノイル基、オクタノイル基、デカノイル基など）、Ｌ－アスコルビン酸テトライソパルミチン酸エステル、Ｌ－アスコルビン酸テトララウリン酸エステルなどのＬ－アスコルビン酸テトラ脂肪酸エステル類、３－Ｏ－エチルアスコルビン酸、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸－６－Ｏ－パルミテートナトリウム等が、ハイドロキノン誘導体としては、アルブチン（ハイドロキノン－β－Ｄ－グルコピラノシド）、α－アルブチン（ハイドロキノン－α－Ｄ－グルコピラノシド）等が、レゾルシノール誘導体としては、例えば、４－ｎ－ブチルレゾルシノール、４－イソアミルレゾルシノール等が、２，５－ジヒドロキシ安息香酸誘導体としては、例えば２，５－ジアセトキシ安息香酸、２－アセトキシ－５－ヒドロキシ安息香酸、２－ヒドロキシ－５－プロピオニルオキシ安息香酸等が、ニコチン酸誘導体としては、例えばニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等が、ビタミンＥ誘導体としては、例えばビタミンＥニコチネート、ビタミンＥリノレート等が、α－ヒドロキシ酸としては、例えば乳酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、α－ヒドロキシオクタン酸等がある。

本発明においては、本発明に係る加水分解物と皮膚外用剤の有効成分であるナイアシンアミド、グリチルリチン酸ジカリウム、アスコルビン酸又はその誘導体、トラネキサム酸、ビタミンＥ又はその誘導体等と併用することで、美白効果、肌荒れ改善効果又はシワ改善効果等の相乗効果を発揮することも示唆される。

次に、製造例、処方例及び試験例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、以下において、部はすべて重量部を、また％はすべて重量％を意味する。

製造例１．ベニバナ花抽出物の加水分解物(１)
ベニバナの花を乾燥し、乾燥物１００ｇに精製水を２０００ｇ添加し、１２１℃で１時間抽出した。次に不溶物を濾過で除き、濾液をタンパク分解酵素（スミチーム）で処理した。酵素処理は酵素を１ｇ使用し、酵素の至適ｐHに於いて、５０℃１時間保持することによって行った。ここに得られた酵素処理液を濾過し、１，３－ブチレングリコール５８６．４ｇを添加し、濾過した。得られた液１８５０．２ｇに精製水１２９５．１ｇと１，３－ブチレングリコール５５５．１ｇを添加した。これを濾過し、黄色透明の加水分解物溶液３５７２．４ｇを得た。（固形分濃度０．３９質量％）

製造例２．ベニバナ花抽出物の加水分解物(２)
製造例１において、スミチームに代えて、酵素としてパパインを用いる他は、製造例１と同様の工程にて黄色透明の加水分解物溶液（固形分濃度：０．４１質量％）を得た。

製造例３．ベニバナ花抽出物の加水分解物(３)
製造例１において、スミチームに代えて、酵素としてアクチナーゼを用いる他は、製造例１と同様の工程にて黄色透明の加水分解物溶液（固形分濃度：０．４０質量％）を得た。

比較製造例１．ベニバナ花抽出物の調製
ベニバナの花を乾燥し、乾燥物１００ｇに精製水を２０００ｇ添加し、１２１℃で１時間抽出した。これを濾過し、１，３－ブチレングリコール８１１．１ｇを添加し、濾過した。得られた液２４２５．４ｇに精製水１６９７．８ｇと１，３－ブチレングリコール７２７．６ｇを添加した。これを濾過し、黄色透明のベニバナ花エキス４５７３．３ｇを得た。（固形分濃度０．４０％）

試験例１．ＮＯの産生促進効果の評価試験
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を２４ウェルプレートに播種し、その細胞を培養する培地HuMedia-MvG(クラボウ社製)に、３０％１，３－ブチレングリコール(１．０％)のみを添加したコントール区と、本発明に係る製造例１の加水分解物溶液(０．５％、１．０％)を添加した試験区（１）と、比較製造例１の抽出物(０．５％、１．０％)を添加した試験区（２）を設け、３７℃で、５.０％ＣＯ_２濃度下で２４時間培養した。ここで、コントール区の１，３－ブチレングリコールの濃度は、培地中の溶液としての最終濃度が１．０％となるように調製した。また、試験区（１）（２）の各試料の濃度は、地中の溶液としての最終濃度が０．５％、１．０％となるように調製した。培養終了後、培養上清の回収並びにＭＴＴ試薬（ナカライテスク社製）を用いて細胞のミトコンドリア活性を測定した(ＡＢＳ５７０－６３０ｎｍ)。上清に含まれるタンパクを１０％ＴＣＡ(ナカライテスク)水溶液を用いて除去し、ＮＯ_２／ＮＯ_３Assay Kit(同仁化学研究所)を用いてＮＯ量を定量した。得られたＮＯ量値をＭＴＴ活性（ＡＢＳ５７０－６３０ｎｍ）で除し、細胞あたりのＮＯ量としてt検定を用いて比較した。

試験例１の結果を図１に示す。図１に示すように、本発明の製造例１に係る加水分解物は、コントロール及び比較製造例１の抽出物と比較して、顕著な血管内皮細胞におけるＮＯ産生促進効果を有することが確認された。ＮＯは血管内皮における血管弛緩因子であり、内皮細胞に隣接した血管平滑筋細胞内へ拡散し可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)を活性化することにより血管弛緩反応を引き起こすことから、本発明に係る加水分解物には、皮膚毛細血管の血流促進によって肌色の不調（クマ、くすみ又は透明感の低下等）や乾燥等を改善する効果が示唆される。

試験例２．ＮＯ合成酵素活性（eNOS）効果の評価試験
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を２４ウェルプレートに播種し、その細胞を培養する培地HuMedia-MvG(クラボウ社製)に、３０％１，３－ブチレングリコール(１．０％)のみを添加したコントール区と、本発明に係る製造例１の加水分解物溶液(０．５％、１．０％)を添加した試験区（１）と、比較製造例１の抽出物(０．５％、１．０％)を添加した試験区（２）を設け、３７℃で、５.０％ＣＯ_２濃度下で２４時間培養した。ここで、コントール区の１，３－ブチレングリコールの濃度は、培地中の溶液としての最終濃度が１．０％となるように調製した。また、試験区（１）（２）の各試料の濃度は、培地中の溶液としての最終濃度が０．５％、１．０％となるように調製した。培養終了後、１５％中性ホルマリン溶液（Wako社製）を用いて細胞固定、及びブロキッキングワンＰ(ナカライテスク)を用いてブロッキングを行い、一次抗体としてanti eNOS 抗体(Bioss社製)、蛍光ラベルされた二次抗体 Alexa Fluor^TM 546goat anti-rabbit IgG(H+L)(invitrogen社製)の順に反応させた。二次抗体をPBS(-)で洗浄除去後、蛍光強度(Ex＝544,Em＝590)を測定、蛍光顕微鏡観察を行なった。測定後、PBS(-)で1000倍希釈したHoechst 33342(同仁化学研究所社製)を用いて細胞のDNAを染色し蛍光強度(Ex＝355，Em＝460)を測定した。eNOS抗体の蛍光強度をDNAの蛍光強度で除し、細胞あたりのeNOS量としてt検定を用いて比較した。

試験例２の結果を図２に示す。図２に示すように、本発明の製造例１に係る加水分解物は、コントロール及び比較製造例１の抽出物と比較して、顕著なeNOS（ＮＯ合成酵素）の合成を亢進する効果を有することが確認された。eNOSは、血管内皮におけるＮＯの合成に関与する酵素であることから、ＮＯの合成を促進し、皮膚毛細血管の血流促進によって肌色の不調（クマ、くすみ又は透明感の低下等）や乾燥等を改善する効果が示唆される。

試験例３．ＮＯ合成酵素活性（iNOS）効果の評価試験
正常ヒト線維芽細胞(NB1RGB) を２４ウェルプレートに播種し、その細胞を培養する培地（１０％NCSイーグルMEM）に、３０％１，３－ブチレングリコール(１．０％)を添加し、細胞に紫外線（ＵＶ）照射を行ったコントール区（ＵＶ＋）と細胞に紫外線照射を行わないコントロール区（ＵＶ－）を設け、また、本発明に係る製造例１の加水分解物溶液(０．５％)を添加し、細胞に紫外線（ＵＶ）照射を行った試験区（ＵＶ＋）とを設け、細胞に紫外線照射を行わない試験区（ＵＶ－）を設け、それぞれのコントロール区及び試験区で、細胞を３７℃で、５.０％ＣＯ_２濃度下で２４時間培養した。ここで、コントール区の１，３－ブチレングリコールの濃度は、培地中の溶液としての最終濃度が１．０％となるように調製した。また、培地中の溶液としての最終濃度が０．５％、１．０％となるように調製した。培養終了後、細胞を回収し、total RNAを抽出後リアルタイムPCR装置（タカラバイオ）によってiNOS遺伝子の発現に与える影響を確認した。発現率はGAPDHに対するiNOSの相対的発現量の平均値で示す。

試験例３の結果を図３に示す。図３に示すように、本発明に係る加水分解物は、ＮＯ合成酵素のうち、炎症引き起こす原因となり得るiNOS遺伝子の発現を促進することなく、コントロール区と比較して、この遺伝子の発現を抑制していることも確認した。これにより、過剰なＮＯ合成による炎症等が誘発されるのを抑制する効果が示唆される。

試験例４．透過性試験
in vitro皮膚透過試験/OECD TG428に基づき、経皮拡散試験用メンブレンを静置型拡散セルで挟み、製造例１の加水分解物溶液を添加し、精製水をレセプター液として３２℃、２４時間適用した。得られた透過液をエバポレーターで乾固し、PBS(-)1mlに溶解させた液を、膜透過液とした。得られた透過液について、試験例２と同様に、eNOS（ＮＯ合成酵素）の発現を亢進する効果を有することが確認された。

試験例４の結果を図４に示す。図４に示す通り、本発明に係る加水分解物は、皮膚に浸透し、真皮で効果を発揮することが示唆された。

試験例５．肌色改善効果及び保湿効果の評価試験
まず、被験者６名（２０代～５０代の男女）を対象として、左右の目の下から小鼻にかけて部分を被験部として、ロボスキンアナライザー（Inforword社製）により撮影し、画像解析によるＬ値（明度）を初期値として求めた。また、また、明度の解析に加えて、試験区とコントロール区の角層水分量をＳＫＩＫＯＮ２００（I.B.S社製）により測定し、角層水分量の初期値とした。その後、左の目の下から小鼻にかけて部分を試験区として処方例１のクリームを２週間、朝晩２回塗布した。一方、右の目の下から小鼻にかけて部分をコントロール区として処方例１のクリームから製造例１に係る加水分解物を除いたコントロールクリームを２週間、朝晩２回塗布した。２週間後、試験区とコントロール区をロボスキンアナライザー（Inforword社製）により撮影し、画像解析によるＬ値（明度）を求め、２週間後のＬ値と初期値の差分を算出した。さらに、試験区とコントロール区の角層水分量をＳＫＩＫＯＮ２００（I.B.S社製）により測定し、２週間後の角層水分量と初期値との差分を算出した。

試験例５により評価した明度の解析結果を図５に示す。図５に示す通り、製造例１の加水分解物は、被験部の明度を向上させ、これにより、本発明に係る加水分解物は肌の不調（クマ、くすみ等）を改善する効果を発揮することが示唆された。

また、試験例５の角層水分量の評価試験の結果を図６に示す。図６に示す通り、本発明に係る加水分解物は被験部の角層水分量を向上させ、すなわち、保湿効果も有することも確認された。

処方例１．クリーム
［成分］部
オリーブ油５．０
スクワラン５．０
ホホバ油５．０
ホホバワックス１．０
ベヘニルアルコール１．０
ステアリルアルコール１．０
キャンデリラワックス１．０
乳酸菌発酵米２．０
大豆由来水添レシチン０．５
製造例１の加水分解物１．０
カルボキシビニルポリマー１．０
アルギン酸ナトリウム１．０
グリセリン４．０
ＰＨ調整剤適量
防腐剤５．２
精製水全量が１００部となる量

処方例２．クリーム
処方例１に含まれる製造例１の加水分解物に代えて、製造例２の加水分解物１．０部を用いるほかは、処方例２と同様にしてクリームを得た。

処方例３．クリーム
処方例１に含まれる製造例１の加水分解物に代えて、製造例３の加水分解物１．０部を用いるほかは、処方例２と同様にして化粧水を得た。

処方例４．化粧水
［成分］部
製造例１の加水分解物２．０
ユーカリ油０．２
ポリオキシエチレン（５．５）セチルアルコール５．０
トコフェロール酢酸エステル０．０２
グリチルリチン酸ジカリウム０．５
グリチルリチン酸モノアンモニウム０．５
グリチルリチン酸ステアリル０．０５
イソプロピルメチルフェノール０．１
アライントイン０．１
Ｄ－パントテニルアルコール０．１
サリチル酸０．５
尿素５．０
ｌ－メントール０．９
ｄｌ－メントール０．２
１，３－ブチレングリコール５．０
クエン酸ナトリウム０．２
メチルパラベン０．１
ヒノキチオール０・００３
感光素２０１号０．００２
精製水全量が１００部となる量

処方例５．化粧水
［成分］部
製造例１の加水分解物２．０
カプリル酸グリセリル３．０
ラウリン酸ポリグリセリル－１０３．０
セタノール２．０
ベヘニルアルコール２．０
メチルパラベン０．１
アスコルビン酸３．０
グリチルリチン酸０．５
β－グリチルレチン酸０．０５
トコフェロールニコチン酸エステル０．１
レゾルシン０．１
酸化亜鉛２．０
ｄｌ－カンフル０．５
グリセリン２．０
１，３－ブチレングリコール５．０
水酸化カリウム０．５
精製水全量が１００部となる量

処方例６．化粧水
処方例５に含まれる製造例１の加水分解物に代えて、製造例２の加水分解物２．０部を用いるほかは、処方例５と同様にして化粧水を得た。

処方例７．化粧水
処方例５に含まれる製造例１の加水分解物に代えて、製造例３の加水分解物２．０部を用いるほかは、処方例２と同様にして化粧水を得た。

処方例８．化粧水
［成分］部
製造例１の加水分解物２．０
ホホバ油１．０
ポリオキシエチレン（５．５）セチルアルコール５．０
メチルパラベン０．１
アスコルビン酸グルコシド２．０
トラネキサム酸１．０
ナイアシンアミド５．０
ε－アミノカプロン酸０．１
イオウ０．２
エストラジオール０．１
ピリドキシン塩酸塩０．５
グリセリン５．０
１，３－ブチレングリコール５．０
クエン酸ナトリウム０．２
メタ重亜硫酸ナトリウム０．２
ｄ－カンフル０．１
精製水全量が１００部となる量

処方例９．乳液
［成分］部
製造例１の加水分解物２．０
スクワラン５．０
シクロペンタンシロキサン１．０
ヘキサラン３．０
イソステアリン酸ヘキシルデシル１．０
トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル１．０
ラウリン酸ポリグリセリル－１０５．０
イソステアリン酸ポリグリセリル－１０５．０
ジパルミチン酸アスコルビル１５．０
水添大豆レシチン１．５
アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩３．０
アルブチン３．０
水酸化カリウム０．５
グリセリン３．０
１，３－ブチレングリコール２．０
カルボキシメチルセルロース０．３
キサンタンガム０．２
シロキクラゲ多糖体０．２
ヒアルロン酸ナトリウム０．０１
トコフェロール酢酸エステル０．３
トコフェロールニコチン酸エステル０．１
グリチルリチン酸０．１
グリチルリチン酸ジカリウム０．１
イソプロピルメチルフェノール０．１
水溶性コラーゲン１．０
加水分解コラーゲン１．０
アセチルヒアルロン酸０．１
精製水全量が１００部となる量

処方例１０．乳液
処方例９の成分中、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩２．０部に代えてＬ－アスコルビン酸－２－グルコシド２．０部を用いるほかは処方例６と同様にして乳液を得た。

処方例１１．乳液
処方例９の成分中、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩２．０部に代えて及び水酸化カリウム０．５部に代えてトラネキサム酸２．０部を用いるほかは処方例９と同様にして乳液を得た。

処方例１２．乳液
処方例９の成分中、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩２．０部に代えて３－Ｏ－エチルアスコルビン酸３．０部を用いるほかは処方例６と同様にして乳液を得た。

処方例１３．乳液
処方例９の成分中、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩２．０部に代えてナイアシンアミド３．０部を用いるほかは処方例６と同様にして乳液を得た。

処方例１４．クリーム
［成分］部
製造例１の加水分解物２．０
オリーブ油５．０
ホホバ油５．０
スクワラン５．０
イソステアリン酸ヘキシルデシル５．０
ラウロイルグルタミン酸ジ（オクチルドデシル／フィトステリル
／ベヘニル）５．０
カプリル酸グリセリル１．０
ステアリン酸グリセリル１．０
イソステアリルグリセリル３．０
γ－オリザノール０．１
ベヘニルアルコール２．０
パルミチン酸２．５
Ｄ－パントテニルアルコール３．０
アラントイン０．１
リボフラビン０．０１
レゾルシン０．１
塩化ベンザルコニウム０．０５
尿素３．０
β－グリチルレチン酸０．１
グリチルレチン酸ステアリル０．１
グリチルリチン酸アンモニウム０．１
ナイアシンアミド５．０
乳酸菌発酵米２．０
水添レシチン０．５
水添リゾレシチン０．５
加水分解コラーゲン１．０
キサンタンガム１．０
酸化亜鉛０．５
ｄｌ－カンフル０．３
ｌ－メントール０．５
精製水全量が１００部となる量

実施例１５．パック
製造例１の加水分解物２．０
ジプロピレングリコール５．０
ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油５．０
セタノール３．０
ベヘニルアルコール３．０
アラントイン０．１
グリチルリチン酸ジカリウム０．１
グリチルリチン酸アンモニウム０．１
β－グリチルレチン酸０．１
グリチルレチン酸ステアリル０．１
サリチル酸０．１
トコフェロール酢酸エステル０．５
トコフェロールニコチン酸エステル０．１
Ｄ－パントテニルアルコール０．３
レゾルシン０．１
イオウ２．０
エストラジオール０．００２
水溶性コラーゲン１．０
キサンタンガム２．０
ミリスチン酸ポリグリセリル－６１．０
ココイルグルタミン酸カリウム１．０
水添レシチン３．０
水酸化レシチン３．０
精製水全量が１００部となる量

処方例１６．ヘアシャンプー
［成分］部
製造例１の加水分解物２．０
ラウレス硫酸ナトリウム１０．０
モノステアリン酸グリセリル１．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド２．０
ポリオキシエチレン（４０）硬化ヒマシ油０．５
塩化ベンザルコニウム１．０
ステアリルアルコール２．０
ベヘニルアルコール２．０
ジメチコン３．０
アラントイン０．１
グリチルリチン酸ジカリウム０．１
サリチル酸０．１
サリチル酸ナトリウム０．１
トコフェロール酢酸エステル０．１
ピリチオン亜鉛０．３
安息香酸０．２
トリクロサン０．２
クエン酸０．１
プロピレングリコール２．０
精製水全量が１００部となる量

実施例１７．ヘアコンディショナー
［成分］部
製造例１の加水分解物２．０
ポリオキシエチレン（１０）硬化ヒマシ油１．０
塩化ジステアリルジメチルアンモニウム１．５
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム２．０
２－エチルヘキサン酸グリセリル１．０
塩化ベンザルコニウム１．０
セタノール３．０
ステアリルアルコール１．０
アラントイン０．１
イソプロピルメチルフェノール０．１
グリチルリチン酸ジカリウム０．１
サリチル酸０．１
イオウ０．５
臭化アルキルイソキノリニウム液（７５％）０．０６
ピリチオン亜鉛０．３
メチルパラベン０．１
トリクロサン０．２
レゾルシン０．１
精製水全量が１００部となる量

処方例１８．洗浄用化粧料
［成分］部
製造例１の加水分解物２．０
ココイルグリシンカリウム５．０
グリセリン１０．０
カプリル酸グリセリル１．０
ラウロイルアスパラギン酸ナトリウム１０．０
水溶性コラーゲン５．０
セタノール３．０
ミリスチルアルコール３．０
イソプロピルメチルアルコール０．１
アラントイン０．１
イオウ０．５
グリチルリチン酸０．１
グリチルリチン酸ジカリウム０．１
グリチルリチン酸モノアンモニウム０．１
β－グリチルレチン酸０．０５
グリチルレチン酸ステアリル０．１
サリチル酸０．２
トコフェロール酢酸エステル０．２
トリクロサン０．１
トリクロロカルバニド０．５
トリクロロヒドロキシジフェニルエーテル０．２
濃ベンザルコニウム塩化物液５００．２
ベンザルコニウム塩化物０．１
精製水全量が１００部となる量

処方例１９．シートマスク
不織布に下記の成分を含浸させてシートマスクを得る。
［成分］部
製造例１の加水分解物２．０
グリセリン３．０
１、３－ブチレングリコール２．０
Ｌ－アスコルビン酸２－グルコシド２．０
メチルパラベン０．２
クエン酸０．１
クエン酸ナトリウム０．３
キサンタンガム１．０
水溶性コラーゲン１．０
ヒアルロン酸ナトリウム１．０
水酸化カリウム適量
精製水全量が１００部となる量

処方例２０．美容液
［成分］部
製造例１の加水分解物２．０
ヒアルロン酸ナトリウム１．０
水溶性コラーゲン１．０
トラネキサム酸０．１
エタノール２．０
グリセリン５．０
１、３－ブチレングリコール５．０
メチルパラベン０．１
クエン酸０．３
クエン酸ナトリウム０．６
カタメンキリンサイ抽出物５．０
精製水全量が１００部となる量

Claims

キク科ベニバナ属に属するベニバナの花部又はその抽出物の加水分解物を有効成分とする皮膚外用剤。