JP2016216435A - 評価方法 - Google Patents
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また、本発明は、被験者の血中ビタミンD濃度の測定値を指標として、被験者の皮膚の老化及び/又は肌荒れを評価する方法である。
また、本発明は、被験者の血中ビタミンD濃度の測定値を指標として、被験者の皮膚の老化及び/又は肌荒れを評価する第1のステップと、被験物質によるビタミンD様作用を指標として、第1のステップにより皮膚の老化及び/又は肌荒れの蓋然性が高いと判定された被験者の皮膚に対する上記被験物質の老化防止・改善効果及び/又は肌荒れ防止・改善効果を評価する第2のステップを含む皮膚の評価方法である。
本発明は、ビタミンD様作用を有する物質を含む皮膚外用剤である。
また、本発明は、被験者の血中ビタミンD濃度の測定値を指標として、被験者の皮膚の老化及び/又は肌荒れを評価することを特徴とする評価方法であり、本発明によれば、より効率的かつ簡便に、皮膚の老化及び/又は肌荒れを評価することができる。
また、本発明は、ビタミンD様作用を有する皮膚外用剤であり、本発明によれば、ビタミンD様作用に基づく皮膚の老化防止・改善効果及び/又は肌荒れ防止・改善効果を有する化粧料等の皮膚外用剤を提供することできる。
被験物質のビタミンD様作用を評価した。
(i)被験物質の調製
被験物質の調製例1.シャクヤクの花部の抽出液の調製(1)
ボタン科ボタン属に属する植物のシャクヤク(Paeonia lactiflora)の花を乾燥、粉砕して得られる粉砕物30gを、30%1,3−ブチレングリコール溶液(精製水/1,3ブチレングリコール=70/30)300gに接触させ、80℃で2時間抽出を行った。次に、得られた抽出液を濾過して淡黄色〜褐色透明の花部の抽出液264g(固形分濃度2.61%)を得て、これを被験物質(1)とした。
被験物質の調製例2.シャクヤクの花部の抽出液の調製
抽出溶媒として、30%1,3−ブチレングリコールに代えて、精製水を使用すること以外は調製例1と同様の方法により、褐色透明の花部の抽出液262g(固形分濃度1.40%)を得て、被験物質(2)とした。
(ii)ビタミンD様作用評価試験
正常なヒトの表皮細胞を、増殖添加剤を含有するHumedia−KG2(クラボウ社製)にて1×105個/mLに調製し、96穴マイクロプレートに100μLを播種して、5%CO2、飽和水蒸気下、37℃で培養した。24時間培養後、ビタミンD受容体結合塩基配列(VDRE)を組み込んだホタルルシフェラーゼレポーターベクター及び内部標準としてのウミシイタケルシフェラーゼを組み込んだベクター(Cignal VDRE Reporter Assay Kit)[QIAGEN社製]を細胞へViaFectトランスフェクション試薬[Promega社製]を用いて導入した。さらに、24時間後、試料として被験物質(1)を添加した。試料の添加濃度は、培地全量に対する試料溶液としての終濃度が、1.0%となるように調整した。試料を添加してから24時間培養後、培養した表皮細胞の内容物を抽出し、細胞抽出液のルシフェラーゼ活性をデュアルルシフェラーゼアッセイシステム[Promega社製]を用い、ルミノメーター(Promega GloMax-Multi+Detection System)にて測定した。ホタルルシフェラーゼの測定値(VDRE転写量)をウミシイタケルシフェラーゼの測定値(細胞量)で割った数値を細胞あたりのビタミンD様作用とした。なお、試料の代わりに比較対照として30%の1,3−ブチレングルコール(1,3-BG)を培地に添加した区(培地中の1,3-BGの溶液としての終濃度は1.0%)のビタミンD様作用を100としてその相対値を算出した。また、試験系が正常に機能しているかを確認するために、試料溶液の代わりに陽性対照として活性化ビタミンD3であるカルシトリオール(100nM)を添加した場合についても、同様の試験を行った。
[表1]
4名の被験者A〜D(25歳〜45歳の男女)の前腕内側部に被験部(15mm×15mm)を設定した。次に、Skicon-200を用いて各被験部の角層水分量を、Tewameter TM 300を用いて経皮水分蒸散量を、それぞれ3回測定し、3回の平均を各被験部の初期値(0)とした。各初期値を測定後、2%SDS水溶液を各被験部に1日3回適用することで皮膚バリア機能を破壊し、皮膚の老化、肌荒れを強制的に生じさせた当該被験部を試験区とした。また、SDSを適用しない被験部(リファレンス区)も設定した。その後、それぞれの試験区に試料[被験物質(1)]とコントロール溶液[1,3−ブチレングルコール(1%水溶液)]の塗布を開始した(1日2回)。各被験部の角層水分量及び経皮水分蒸散量の変化を1日目、5日目、8日目に測定した。その結果は、リファレンス区の値を差し引いた各被験部の初期値から、SDS処理直後の角層水分量の変化量を−100とし、又水分蒸散量の変化量を100として、それぞれの相対値を算出した。
図1に示すように、被験物質(1)は、コントロールと比較して、皮膚の角層水分量の低下を顕著に抑えることができ、又SDS処理後、早期にかつ顕著に皮膚の角層水分量を改善させることが明らかとなった。また、図2に示すように、被験物質(1)は、コントロールと比較して、皮膚からの水分蒸散を顕著に抑えることができ、又SDS処理後、早期に皮膚からの水分蒸散を抑える機能を改善することが明らかとなった。以上のことから、ビタミンD様作用を指標として、皮膚の老化防止・改善及び/又は肌荒れ防止・改善効果を有する被験物質を評価できることが確認された。
被験者の血中ビタミンD濃度を測定し、その測定値に基づいて、被験者20名をグループAとグループBに分けた。そして、上記試験例2と同様の方法で各グループの被験者の被験部をSDS処理し、被験物質(1)を塗布した被験部と、コントロール溶液を塗布した被験部の角層水分量と経皮水分蒸散量の変化をそれぞれ評価した。
(i)血中ビタミン濃度の測定
まず、採血担当医師により被験者の腕部の静脈から血液を採取した。そして、採取した血液からラジオイムノアッセイの二次抗体法を用いて、ビタミンDの濃度を測定した。
(ii)皮膚の角層水分量及び経皮水分蒸散量の評価試験
上記(i)の測定により、血中のビタミンDの濃度が基準値(20ng/mL;日本骨粗鬆症学会、米国Institute of Medicine等で報告されている基準値)以下の被験者10名(グループA)と、血中のビタミンDの濃度が基準値を超える被験者10名(グループB)に対して、それぞれの前腕内側部に被験部(15mm×15mm)を設定した。次に、Skicon-200を用いて各被験部の角層水分量を、Tewameter TM 300を用いて経皮水分蒸散量を、それぞれ3回測定し、3回の平均を各被験部の初期値(0)とした。各初期値を測定後、2%SDS水溶液を各被験部に1日3回適用することで皮膚バリア機能を破壊し、強制的に皮膚の老化、肌荒れを生じさせた当該被験部を試験区とした。また、SDSを適用しない被験部(リファレンス区)も設定した。その後、それぞれの試験区に試料[被験物質(1)]とコントロール溶液[30%1,3−ブチレングルコール(1%水溶液)]の塗布を開始した(1日2回)。各被験部の角層水分量及び経皮水分蒸散量の変化を1日目、5日目、8日目に測定した。その結果は、リファレンス区の値を差し引いた各被験部の初期値から、SDS処理直後の角層水分量の変化量を−100とし、又水分蒸散量の変化量を100として、それぞれの相対値を算出し、各グループの平均値を求めた。
[A成分] 部
オリーブ油 1.0
ポリオキシエチレン(5.5)セチルアルコール 5.0
ブチルパラベン 0.1
[B成分]
被験物質(1) 5.0
エタノール 5.0
グリセリン 5.0
1,3−ブチレングリコール 5.0
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が100部となる量
[C成分]
香料 適量
A成分及びB成分をそれぞれ80℃以上に加温後、A成分にB成分を加えて攪拌し、さらにヒスコトロン(5000rpm)で2分間ホモジナイズを行った。これを50℃まで冷却した後、C成分を加えて攪拌混合し、さらに30℃以下まで冷却して化粧水を得た。
[A成分] 部
流動パラフィン 6.0
ヘキサラン 4.0
ホホバ油 1.0
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート 2.0
大豆レシチン 1.5
[B成分]
被験物質(1) 3.0
L−アスコルビン酸−2−グルコシド 2.0
水酸化カリウム 0.5
グリセリン 3.0
グリチルリチン酸ジカリウム 0.5
1,3−ブチレングリコール 2.0
カルボキシメチルセルロース 0.3
ヒアルロン酸ナトリウム 0.01
精製水 全量が100部となる量
[C成分]
香料 適量
上記のA成分とB成分をそれぞれ80℃以上に加熱した後、攪拌混合した。これを50℃まで冷却した後、C成分を加えてさらに攪拌混合して乳液を得た。
処方例2のB成分中、L−アスコルビン酸−2−グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてトラネキサム酸2.0部を用いるほかは処方例2と同様にして乳液を得た。
処方例2のB成分中、L−アスコルビン酸−2−グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてアルブチン3.0部を用いるほかは処方例2と同様にして乳液を得た。
処方例2のB成分中、L−アスコルビン酸−2−グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてニコチン酸アミド3.0部を用いるほかは処方例2と同様にして乳液を得た。
[成分] 部
被験物質(1) 10.0
エタノール 10.0
グリセリン 3.0
1,3−ブチレングリコール 2.0
メチルパラベン 0.2
クエン酸 0.1
クエン酸ナトリウム 0.3
カルボキシビニルポリマー 0.1
香料 適量
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が100部となる量
上記の成分を混合してローションを得た。
[成分] 部
エタノール 2.0
グリセリン 5.0
1,3−ブチレングリコール 5.0
メチルパラベン 0.1
ヒアルロン酸 0.1
被験物質(1) 5.0
クエン酸 0.3
クエン酸ナトリウム 0.6
精製水 全量が100部となる量
精製水にヒアルロン酸を溶解させた後、残りの原料を順次加えて攪拌溶解させ、透明のエッセンスを得た。
[A成分] 部
N−ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム 10.0
ポリオキシエチレン(3)アルキルエーテル硫酸ナトリウム 20.0
ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン 10.0
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド 4.0
メチルパラベン 0.1
[B成分]
クエン酸 0.1
被験物質(1) 2.0
1,3−ブチレングリコール 2.0
精製水 全量が100部となる量
A成分及びB成分をそれぞれ80℃に加温して均一に溶解した後、A成分にB成分を加え、攪拌を続けて室温まで冷却してヘアシャンプーを得た。
[A成分] 部
ポリオキシエチレン(10)硬化ヒマシ油 1.0
塩化ジステアリルジメチルアンモニウム 1.5
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム 2.0
2−エチルヘキサン酸グリセリル 1.0
セタノール 3.2
ステアリルアルコール 1.0
メチルパラベン 0.1
[B成分] 部
被験物質(1) 2.0
1,3−ブチレングリコール 5.0
精製水 全量が100部となる量
A成分及びB成分をそれぞれ80℃に加温して均一に溶解した後、A成分にB成分を加え、攪拌を続けて室温まで冷却してヘアコンディショナーを得た。
Claims (4)
- 被験物質によるビタミンD様作用を指標として、当該被験物質の皮膚の老化防止・改善効果及び/又は肌荒れ防止・改善効果を評価する方法。
- 被験者の血中ビタミンD濃度の測定値を指標として、被験者の皮膚の老化及び/又は肌荒れを評価することを特徴とする評価方法。
- 被験者の血中ビタミンD濃度の測定値を指標として、被験者の皮膚の老化及び/又は肌荒れを評価する第1のステップと、被験物質によるビタミンD様作用を指標として、第1のステップにより皮膚の老化及び/又は肌荒れの蓋然性が高いと判定された被験者の皮膚に対する上記被験物質の老化防止・改善効果及び/又は肌荒れ防止・改善効果を評価する第2のステップを含む皮膚の評価方法。
- ビタミンD様作用を有する物質を含む皮膚外用剤。
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