JP2022068302A - 改善された分化方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】腸内分泌細胞を得るために、細胞を分化させるための方法および培地、ならびに当該方法によって得られる細胞およびオルガノイドの使用を提供する。また、腸内分泌細胞におけるホルモン発現を調節するための方法、およびそのような方法に関連する医学的使用を提供する。【解決手段】前駆細胞を分化させるための方法であって、基礎培地を含み、かつ1つまたは複数のEGFR経路阻害剤、Notch阻害剤および1つまたは複数のWnt阻害剤をさらに含む分化培地中で、該細胞を培養する工程を含む、方法である。【選択図】図５Ａ

Description

本明細書で引用される全ての文献は、その全体が参照により組み入れられる。
技術分野
本発明は、細胞培養培地および方法、特に前駆細胞、例えばヒト上皮幹細胞を分化させるための培養培地および方法の分野にある。
背景
前駆細胞を分化させるための培地および方法には多大の関心が寄せられている。前駆細胞およびそれらの分化した子孫は、細胞アッセイ、薬物スクリーニング、および毒性アッセイにおいて使用することができる。前駆細胞およびそれらの分化した子孫はまた、損傷組織の治療のための再生医療などの細胞ベースの治療法にも有望である。さらに、効率的な細胞培養培地は、研究目的のために細胞の集団を提供し、維持するために重要である。
腸内分泌細胞（EEC）は、Lgr5幹細胞から生成され得るまれなホルモン分泌細胞である（Koo and Clevers（2014）Gastroenterology 147:289-302（非特許文献1））。最も一般的には、それらの分泌ホルモンに基づいてサブタイプが区別され、ソマトスタチン＋（Sst）D細胞、胃抑制タンパク質＋（Gip）K細胞、セクレチン＋（Sct）S細胞、コレシストキニン（Cck）I細胞、グルカゴン様タンパク質1＋（GLP-1）L細胞、ニューロテンシン＋（Nts）N細胞およびセロトニン産生エンテロクロマフィン細胞が含まれる（Gunawardene et al.（2011）International journal of experimental pathology 92:219-231（非特許文献2））。しかしながら、単一のEECは、複数のホルモンを様々なレベルで発現することができ、高レベルの不均一性を明確に示す（Egerod et al.（2012）Nature cell biology 14:1099-1104（非特許文献3））。EECは、腸機能および生物代謝の様々な局面を制御する上で重要な役割を果たすと考えられているが、その不足が、詳細な研究と開発に対する障害となっている。
いくつかの組織（例えば膵臓、結腸、腸陰窩および胃）に由来する前駆細胞を分化させるための方法が記載されている（国際公開公報第2010/090513号（特許文献1）、国際公開公報第2012/014076号（特許文献2）、国際公開公報第2012/168930号（特許文献3）および国際公開公報第2015/173425号（特許文献4）参照）。腸細胞、杯細胞およびパネート細胞の分化を誘導するための方法は公知であった。EEC運命への前駆細胞のより高い効率の分化をもたらす、改善された培地および方法が必要とされている。
Koo and Clevers（2014）Gastroenterology 147:289-302 Gunawardene et al.（2011）International journal of experimental pathology 92:219-231 Egerod et al.（2012）Nature cell biology 14:1099-1104
国際公開公報第2010/090513号 国際公開公報第2012/014076号 国際公開公報第2012/168930号 国際公開公報第2015/173425号
本発明は、前駆細胞を分化させるための方法を提供し、前記方法は、
基本培地を含み、かつ1つまたは複数のEGFR経路阻害剤、Notch阻害剤および1つまたは複数のWnt阻害剤をさらに含む分化培地中で、細胞を培養する工程
を含む。
本発明はさらに、基礎培地を含み、かつ1つまたは複数のEGFR経路阻害剤、Notch阻害剤および1つまたは複数のWnt阻害剤をさらに含む分化培地を提供する。
本発明はさらに、腸内分泌細胞を豊富に含む腸細胞集団を得るために腸前駆細胞を分化させるための方法を提供し、前記方法は、
腸前駆細胞を本発明の分化培地中で培養する工程
を含む。
本発明はさらに、好ましくはオルガノイドを得るために、上皮幹細胞を培養するための方法を提供し、前記方法は、
増殖培地の存在下で1つまたは複数の上皮幹細胞を細胞外マトリックスと接触させて培養する工程;および
1つまたは複数の増殖した上皮幹細胞を本発明の分化培地中で培養する工程
を含む。
本発明はさらに、好ましくは分化した腸オルガノイドを得るために、腸上皮幹細胞を培養するための方法を提供し、前記方法は、
増殖培地の存在下で、1つまたは複数の腸上皮幹細胞を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程であって、好ましくは、増殖培地が、基礎培地を含み、かつ受容体チロシンキナーゼリガンド（例えばEGF）、BMP阻害剤（例えばノギン）およびWntアゴニスト（例えばRスポンジン）、ならびに任意で、バルプロ酸およびGSK-3阻害剤（例えばCHIR99021）をさらに含む、工程;ならびにその後、
本発明の分化培地の存在下で1つまたは複数の増殖した腸上皮幹細胞を細胞外マトリックスと接触させて培養する工程
を含む。
本発明は、さらに、本発明の方法によって得ることのできるまたは得られたオルガノイドを提供する。
本発明はさらに、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％の細胞が腸内分泌細胞マーカーを発現するオルガノイドを提供する。
本発明はさらに、医療において使用するための、本発明のオルガノイドまたは該オルガノイドに由来する細胞を提供する。
本発明はさらに、創薬スクリーニング;毒性アッセイ;診断法;組織発生学、細胞系譜および分化経路の調査;各ホルモンの放出をもたらす化学および/もしくは神経シグナルを同定する調査;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現試験;組織の損傷と修復に関与する機構の調査;炎症性および感染性疾患の調査;発症機構の研究;または細胞形質転換の機構およびがんの病因の研究における、本発明のオルガノイドまたは該オルガノイドに由来する細胞の使用を提供する。
本発明はさらに、1つまたは複数のEGFR経路阻害剤、Notch阻害剤および1つまたは複数のWnt阻害剤を含有する薬学的製剤を提供する。
治療用または予防用の医薬薬物または化粧品をスクリーニングするための方法であって、
本発明の分化したオルガノイドを候補分子（または候補分子のライブラリ）と接触させる工程;
前記オルガノイドを、任意の作用（例えば増殖の減少もしくは消失、形態学的変化および/もしくは細胞死などの、細胞における何らかの変化）またはオルガノイドの変化（例えばオルガノイドのサイズもしくは運動性）について評価する工程;
前記作用を引き起こす候補分子を、薬物または化粧品の可能性を有するものとして同定する工程;ならびに任意で、
前記候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
を含む、方法。
本発明はさらに、Lgr5＋幹細胞において静止を誘導するための方法を提供し、前記方法は、
該細胞を1つまたは複数のEGFR経路阻害剤で処理する工程
を含む。
本発明はさらに、本発明のLgr5＋前駆幹細胞の静止を誘導する方法によって得られる静止状態の幹細胞集団を提供し、細胞は、Lgr5およびLef1を発現し、かつKI67およびM期マーカーであるホスホ-ヒストンH4を発現しない。
本発明はさらに、EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法を提供し、この方法は、本発明の分化培地中で細胞の集団を培養する工程を含む。
本発明はさらに、GLP1分泌EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法を提供し、この方法は、本発明の分化培地中で細胞の集団を培養する工程を含み、分化培地はBMP阻害剤を含む。
本発明はさらに、セクレチン分泌EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法を提供し、この方法は、本発明の分化培地中で細胞の集団を培養する工程を含み、分化培地はBMP経路活性化剤を含む。
本発明はさらに、糖尿病または関連する疾患もしくは障害を治療または予防する方法において使用するためのBMP阻害剤を提供し、この方法は、治療有効量のBMP阻害剤を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。
本発明はさらに、過塩酸症または肥満を治療する方法において使用するためのBMP活性化剤を提供し、この方法は、治療有効量のBMP活性化剤を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。
[本発明1001]
前駆細胞を分化させるための方法であって、
基礎培地を含み、かつ1つまたは複数のEGFR経路阻害剤、Notch阻害剤および1つまたは複数のWnt阻害剤をさらに含む分化培地中で、該細胞を培養する工程
を含む、方法。
[本発明1002]
1つまたは複数のEGFR経路阻害剤が、（1）EGFR阻害剤、（2）EGFRおよびErbB2阻害剤、（3）RAS-RAF-MAPK経路の阻害剤、（4）PI3K/AKT経路の阻害剤ならびに（5）JAK/STAT経路の阻害剤から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
1つまたは複数のEGFR経路阻害剤が、ゲフィチニブなどのEGFR阻害剤を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
1つまたは複数のEGFR経路阻害剤が、アファチニブなどのEGFRおよびErbB-2阻害剤を含む、本発明1002または1003の方法。
[本発明1005]
1つまたは複数のEGFR経路阻害剤が、RAS-RAF-MAPK経路の阻害剤、例えば、PD0325901などのMEK阻害剤、および/またはSCH772984などのERK阻害剤を含む、本発明1002～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
Notch阻害剤が、γ-セクレターゼ阻害剤、任意でDAPTまたはジベンザゼピン（DBZ）またはベンゾジアゼピン（BZ）またはLY-411575である、本発明1001～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
1つまたは複数のWnt阻害剤が、（1）Wnt分泌の阻害剤、（2）WntもしくはRスポンジンとWnt受容体複合体との相互作用の競合的もしくは非競合的阻害剤、（3）Wnt受容体複合体の成分の分解を促進する阻害剤、（4）Dishevelledファミリータンパク質の阻害剤、（5）分解複合体活性を促進する活性化剤、（6）分解複合体の脱オリゴマー化の阻害剤、および/または（7）β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤から選択される、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
1つまたは複数のWnt阻害剤が、Wnt分泌の阻害剤、例えば、IWP 2、LGK974およびIWP 1から選択されるPorc阻害剤を含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
分化培地が、1mM未満のEGFを含む、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
分化培地が、
p38阻害剤、TGF-β阻害剤、ガストリン、糖質コルチコイド、受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP経路活性化剤、cAMP経路活性化剤、ヘッジホッグ活性化剤、ヘッジホッグ阻害剤、mTORシグナル伝達のモジュレータ、B27およびN2からなる群より選択される1つもしくは複数の成分;または
p38阻害剤、TGF-β阻害剤、ガストリン、糖質コルチコイド、受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP阻害剤、cAMP経路活性化剤、ヘッジホッグ活性化剤、ヘッジホッグ阻害剤、mTORシグナル伝達のモジュレータ、B27およびN2からなる群より選択される1つもしくは複数の成分;または
BMP7、BMP4もしくはBMP2などのBMP活性化剤;または
ノギン、スクレロスチン、コーディン、CTGF、フォリスタチン、グレムリン、tsg、sog、LDN193189もしくはドルソモルフィンなどのBMP阻害剤
をさらに含む、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
本発明1001～1010のいずれかの分化培地。
[本発明1012]
本発明1011の分化培地中で腸前駆細胞を培養する工程
を含む、腸内分泌細胞を豊富に含む腸細胞の集団を得るために腸前駆細胞を分化させるための方法。
[本発明1013]
増殖した上皮幹細胞を得るために、上皮幹細胞用の増殖培地の存在下で上皮幹細胞を培養する工程;およびその後、
本発明1011の分化培地中で、1つまたは複数の該増殖した細胞を培養する工程
を含む、上皮幹細胞を培養するための方法。
[本発明1014]
前記細胞を、細胞外マトリックスと接触させて培養する、本発明1001～1010、1012および1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
分化細胞集団または分化オルガノイドを得る工程および/または単離する工程をさらに含む、本発明1001～1010および1012～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前駆細胞が、例えば腸、胃、膵臓、肝臓、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、膀胱、耳または甲状腺由来の、上皮細胞である、本発明1001～1010および1013～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前駆細胞が、腸、胃、膵臓または肺に由来する、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前駆細胞が哺乳動物前駆細胞、例えばヒト前駆細胞である、本発明1001～1010および1012～1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
好ましくは分化腸オルガノイドを得るために、腸上皮幹細胞を培養するための方法であって、
増殖培地の存在下で、1つまたは複数の腸上皮幹細胞を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程であって、好ましくは、該増殖培地が、基礎培地を含み、かつ受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP阻害剤およびWntアゴニスト、ならびに任意で、バルプロ酸およびGSK-3阻害剤（例えばCHIR99021）をさらに含む、工程;ならびにその後、
本発明1011の分化培地の存在下で、該1つまたは複数の増殖した腸上皮幹細胞を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程
を含む、方法。
[本発明1020]
本発明1001～1010および1012～1019のいずれかの方法によって得ることのできるまたは得られたオルガノイド。
[本発明1021]
肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、膀胱、耳または甲状腺に由来する、好ましくは腸、胃、膵臓または肺に由来する、本発明1020のオルガノイド。
[本発明1022]
ヒトに由来し、かつ少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％の細胞が腸内分泌細胞マーカーを発現する、本発明1020または1021のオルガノイド。
[本発明1023]
マウスに由来し、かつ少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％の細胞が腸内分泌細胞マーカーを発現する、本発明1020または1021のオルガノイド。
[本発明1024]
腸内分泌細胞マーカーが、Chga、Chgb、Tac1、Tph1、Gip、Fabp5、Ghrl、Pyy、Nts、Neurod1、Sst、Sct、コレシストキニン、グルカゴンおよび/またはプログルカゴンから選択される、本発明1022または1023のオルガノイド。
[本発明1025]
オルガノイド、例えば本発明1020～1024のいずれかのオルガノイドと、本発明1011の分化培地とを含む、組成物。
[本発明1026]
創薬スクリーニング;毒性アッセイ;診断法;組織発生学、細胞系譜および分化経路の調査;各ホルモンの放出をもたらす化学および/もしくは神経シグナルを同定する調査;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現試験;組織の損傷と修復に関与する機構の調査;炎症性および感染性疾患の調査;発症機構の研究;または細胞形質転換の機構およびがんの病因の研究における、本発明1020～1024のいずれかのオルガノイドまたは該オルガノイドに由来する細胞の使用。
[本発明1027]
医療における使用のための、例えば、障害、状態または疾患の治療における使用のための、本発明1020～1024のいずれかのオルガノイド、または該オルガノイドに由来する細胞。
[本発明1028]
前記医療が再生医療であり、例えば、前記使用が前記オルガノイドまたは前記細胞の患者への移植を含む、本発明1027の使用のためのオルガノイドまたは該オルガノイドに由来する細胞。
[本発明1029]
1つまたは複数のEGFR経路阻害剤、Notch阻害剤および1つまたは複数のWnt阻害剤を含む薬学的製剤。
[本発明1030]
本発明1020～1024のいずれかの分化オルガノイドを候補分子（または候補分子のライブラリ）と接触させる工程、
該オルガノイドを、任意の作用（例えば増殖の減少もしくは消失、形態学的変化および/もしくは細胞死などの、細胞における何らかの変化）またはオルガノイドの変化（例えばオルガノイドのサイズもしくは運動性）について評価する工程、
該作用を引き起こす候補分子を、薬物または化粧品の可能性を有するものとして同定する工程、ならびに任意で、
該候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
を含む、治療用もしくは予防用の医薬薬物または化粧品をスクリーニングするための方法。
[本発明1031]
Lgr5＋幹細胞静止を誘導するための方法であって、
該細胞を1つまたは複数のEGFR経路阻害剤で処理する工程
を含む、方法。
[本発明1032]
前記細胞が、例えばFACSによって評価されるような、継続的なLgr5発現、および/または例えばpTOPFLASHおよびpFOPFLASH Tcfルシフェラーゼレポーター構築物によって評価されるような、Wntシグナル伝達を有する、本発明1031の方法。
[本発明1033]
静止が、KI67発現の喪失によって示される、本発明1031または1032の方法。
[本発明1034]
前記細胞を、1つまたは複数のEGFR経路阻害剤で少なくとも1週間処理する、本発明1031～1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記細胞が、Lgr5およびLef1を発現し、かつ、KI367、およびM期マーカーであるホスホヒストンH3を発現しない、本発明1031～1034のいずれかの方法によって得られる静止幹細胞集団。
[本発明1036]
本発明1011の分化培地中で細胞の集団を培養する工程を含む、EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法。
[本発明1037]
BMP阻害剤を含む本発明1011の分化培地中で細胞の集団を培養する工程を含む、GLP1分泌EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法。
[本発明1038]
BMP経路活性化剤を含む本発明1011の分化培地中で細胞の集団を培養する工程を含む、セクレチン分泌EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法。
[本発明1039]
治療有効量のBMP阻害剤を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、糖尿病または関連する疾患もしくは障害を治療するまたは予防する方法における使用のためのBMP阻害剤。
[本発明1040]
治療有効量のBMP活性化剤を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、過塩酸症または肥満を治療する方法における使用のためのBMP活性化剤。
詳細な説明
様々な組織から前駆細胞を分化させるための方法は、これまでに国際公開公報第2010/090513号、国際公開公報第2012/014076号、国際公開公報第2012/168930号および国際公開公報第2015/173425号に記載されている。腸前駆細胞の、腸細胞、杯細胞またはパネート細胞運命への分化を促進する方法が記載されている。これらは図11に要約されている。しかしながら、腸前駆細胞のEEC運命への分化を増強するための方法および培地はこれまでに記載されていない。 本発明者らは、驚くべきことに、分化培地中のWnt阻害剤、EGFR経路阻害剤およびNotch阻害剤の組み合わせが、前駆細胞のEEC運命への分化を増強することを見出した（実施例2参照）。EECは、インビボで腸上皮の細胞の1％未満を占める。しかしながら、本発明者らの方法および分化培地は、細胞の約50％がEECであるオルガノイドを生成することができた。
本発明者らはまた、驚くべきことに、BMPシグナル伝達経路を調節することによって、特に発現レベルおよびホルモン分泌に関して、EEC表現型を調節できることを見出した（実施例5参照）。本発明者らは、特定のEEC表現型がBMPシグナル伝達を活性化するまたは阻害することによって得られることを示した。本発明者らはまた、これらの方法がインビボで有効であり得、したがって治療法におけるBMP活性化剤および阻害剤のための有望な新しい用途を提供することを示した。
本発明者らはまた、驚くべきことに、培地中のEGFR経路阻害剤の存在がLgr5＋幹細胞の静止を促進することを見出した（実施例1参照）。特に、本発明者らは、幹細胞の潜在能は維持されるが、増殖が一時停止している新しい静止状態を発見した。幹細胞の潜在能と増殖を分離できることは、これまで公知ではなかった。
Wnt阻害剤
本発明の分化培地はWnt阻害剤を含む。任意の適切なWnt阻害剤を使用し得る。
Wntシグナル伝達経路は、活性化された場合、典型的にはβ-カテニン分解を防止し、β-カテニン媒介性シグナル伝達を増強する。この経路は、Frizzled受容体およびLRP5/6を含む細胞表面Wnt受容体複合体が、通常、Wntファミリーのメンバーなどの細胞外シグナル伝達分子によって活性化された場合に生じる一連の事象によって定義される。これは、細胞内β-カテニンを分解するタンパク質の分解複合体を阻害するDishevelledファミリータンパク質の活性化をもたらす。分解複合体は、カゼインキナーゼCK1α、δおよびεならびにGSK-3が動員される、APCおよびアキシンを含む構造成分から形成される。分解複合体は、β-カテニンをリン酸化し、それをユビキチンリガーゼ、β-TrCPに曝露すると考えられる。次いで、β-カテニンのユビキチン化は、プロテアソームにおけるその分解をもたらす。
β-カテニンの主なエフェクター機能は核内にあり、そこで、TCF/LEFファミリーの転写因子（例えばTcf-1、Tcf-3、Tcf-4およびLef1）を含む様々な転写因子との相互作用を介して転写を調節する。
Wnt経路は高度に調節されている。例えば、Rスポンジンがその受容体（Lgr4、Lgr5および/またはLgr6）に結合すると、Wntシグナル伝達が増強される。しかしながら、2つの膜貫通E3ユビキチンリガーゼ、Rnf43およびZnrf3は、細胞表面からRスポンジン受容体（例えばLgr4、Lgr5および/またはLgr6）を除去することが示されている（例えばde Lau et al.2016参照）。Rスポンジンは、脊椎動物特異的Wnt増強剤である。さらに、Dishevelledファミリータンパク質のFrizzled受容体への結合は、Dapperファミリータンパク質（例えばDapper1およびDapper3）によって阻害され得る。さらに、分解複合体の活性は、APC、アキシンおよびGSK-3のリン酸化状態によって部分的に調節されると考えられる。例えば、ホスファターゼ（例えばPP1、PP2CまたはPP2Aなどのセリン/トレオニンホスファターゼ）によるAPCまたはアキシンの脱リン酸化は、β-カテニン分解を阻害し得る。加えて、キナーゼ（例えばp38 MAPK、PKA、PKB、PKC、p90RSKまたはp70S6K）によるGSK-3のリン酸化は、GSK-3活性を阻害し、したがってβ-カテニン分解を阻害し得る。
分解複合体の安定性は、2つのPARP、タンキラーゼ1および2によって部分的に調節されると考えられる。これらのタンキラーゼによるアキシンのポリ（ADP-リボシル）化および自己ポリ（ADP-リボシル）化は、分解複合体の脱オリゴマー化を促進し得る。
核内で、Dishevelledファミリータンパク質は、Wnt標的遺伝子の転写を支援するヒストン脱アセチル化酵素SIRT1と複合体を形成することができる。
Wntの分泌の鍵であると考えられるタンパク質は、マルチパス膜タンパク質、ポーキュパイン（Porc）であり、その喪失は小胞体におけるWntの蓄積をもたらす。
Wntシグナル伝達経路は多くのレベルで阻害することができ、Wnt阻害剤は、Voronkov and Krauss（2013）Current Pharmaceutical Design 19:634-664において詳細に総説されている。
Wnt阻害剤は、細胞または細胞集団におけるTCF/LEF媒介転写を阻害する作用物質と定義される。したがって、本発明における使用に適したWnt阻害剤には以下のものが含まれる:
（1）Wnt分泌の阻害剤（例えばLGK974、IWP-1またはIWP-2などのPorcの阻害剤）、
（2）WntまたはRスポンジンとそれらのそれぞれの受容体との間の相互作用の競合的および非競合的阻害剤（例えばOMP-18R5、OMP54F28）、
（3）LRP（例えばニクロサミド）ならびにZnrf3および/もしくはRnf43などのRスポンジン受容体の分解を促進する因子またはZnrf3および/もしくはRnf43を活性化する因子などの、Wnt受容体複合体の成分の分解を促進する因子、
（4）Frizzled受容体および/もしくは分解複合体の成分へのDishevelledファミリータンパク質の結合を減少させる阻害剤（例えばDapperファミリータンパク質、FJ9、スリンダク、3289-8625、J01-017a、NSC668036）またはDishevelledファミリータンパク質の発現を下方調節する阻害剤（例えばニクロサミド）などの、Dishevelledファミリータンパク質の阻害剤、
（5）（a）アキシンおよび/またはAPCなどの分解複合体の成分を脱リン酸化するホスファターゼ（例えばPP1、PP2Aおよび/またはPP2C）の阻害剤（例えばオカダ酸またはトートマイシン）ならびに（b）GSK-3をリン酸化するキナーゼ（例えばp38 MAPK、PKA、PKB、PKC、p90RSKまたはp70S6K）の阻害剤（例えばSB239063、SB203580またはRp-8-Br-cAMP）を含む、分解複合体活性を促進する因子、
（6）タンキラーゼ1および/または2の阻害剤（例えばXAV939、IWR1、JW74、JW55、2-[4-(4-フルオロフェニル)ピペラジン-1-イル]-6-メチルピリミジン-4(3H)-オンまたはPJ34）などの、分解複合体の脱オリゴマー化の阻害剤、ならびに
（7）β-カテニン:TCF-4複合体を分解する阻害剤（例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14またはFH535）などのβ-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤およびヒストン脱アセチル化酵素SIRT1の阻害剤（例えばカンビノール）を含む、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤。
本発明の分化培地はWnt阻害剤を含む。上記の（1）～（7）に記載されているような、任意の適切なWnt阻害剤を使用し得る。例えば、1つの好ましい態様では、Wnt阻害剤は、例えばIWP-2、IWP-1およびLGK974から選択されるPorc阻害剤などの、Wnt分泌の阻害剤である。別の好ましい態様では、Wnt阻害剤は、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤、例えばβ-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤またはヒストン脱アセチル化酵素SIRT1の阻害剤（例えばカンビノール）である。いくつかの態様では、β-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤は、β-カテニン:TCF-4複合体を分解する阻害剤、例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される阻害剤である。
いくつかの態様では、Wnt阻害剤は、IWP-2、OMP-18R5、OMP54F28、LGK974、3289-8625、FJ9、NSC 668036、IWR1およびXAV939から選択される。
いくつかの態様では、Wnt阻害剤は、iCRT3、PFK115-584、CGP049090、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される。
いくつかの態様では、Wnt阻害剤は、以下の表1に列挙される化合物の1つである。
（表１）Wnt阻害剤
Figure 2022068302000002
Figure 2022068302000003
Figure 2022068302000004
Figure 2022068302000005
Figure 2022068302000006
Figure 2022068302000007
Figure 2022068302000008
Figure 2022068302000009
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、表1に列挙されるWnt阻害剤の任意の1つまたは複数を含む。
Wnt阻害剤は、好ましくは、細胞中のWnt活性を、同じ細胞型で評価した場合、当該分子の不在下での前記Wnt活性のレベルと比較して、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは100％阻害するのに有効な量で培地に添加される。当業者に公知のように、Wntの活性は、例えばpTOPFLASHおよびpFOPFLASH Tcfルシフェラーゼレポーター構築物（Korinek et al. (1997) Science 275:1784-1787）により、Wntの転写活性を測定することによって決定できる。したがって、新規Wnt阻害剤は、当技術分野で公知のアッセイを用いて当業者によって容易に同定され得る。
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.01～150μM、0.1～150μM、0.5～100μM、0.1～100μM、0.5～50μM、1～100μMまたは10～80μM、1～20μMまたは1～5μMの濃度でWnt阻害剤を含む。
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.01～150μM、0.1～100μM、0.5～50μM、1～20μMまたは1～5μMの濃度のIWP-2を含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、約1.5μMの濃度のIWP-2を含む。
いくつかの態様では、分化培地は、ありとあらゆるWntファミリータンパク質およびRスポンジンを含むWnt受容体複合体に結合してこれを活性化するWntアゴニストを含まない。
他の態様では、分化培地は、R-スポンジン1～4またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体などのWntアゴニストをさらに含む。上述したように、R-スポンジンは、細胞表面の受容体におけるWntシグナル伝達を増強する。本発明者らは、EEC分化培地からのR-スポンジンの除去がEEC分化の効率を低下させることを示した（実施例5参照）。細胞を（吸収系統ではなく）分泌系統に向かわせるためには、いくらかのWntシグナル伝達が必要であり得るとの仮説が立てられる。したがって、一部の態様では、分化培地はWntアゴニスト（特にR-スポンジン）とWnt阻害剤の両方を含む。例えば、一部の態様では、分化培地は、R-スポンジンおよびIWP-2などのPorc阻害剤を含む。一部の態様では、R-スポンジンは、1～1000ng/ml、50～1000ng/ml、または100～1000ng/mlの最終濃度で使用される。 一部の態様では、R-スポンジンは、0.1～100μg/ml、0.1～50μg/ml、0.1～20μg/ml、0.1～10μg/ml、0.1～5μg/ml、0.5～100μg/ml、0.5～50μg/ml、0.5～20μg/ml、0.5～10μg/ml、0.5～5μg/ml、1～10μg/ml、または1～5μg/mlの最終濃度で使用される。一部の態様では、R-スポンジンは、少なくとも1ng/ml、少なくとも50ng/ml、少なくとも100ng/ml、少なくとも500ng/mlまたは少なくとも1μg/mlの最終濃度で使用される。一部の態様では、R-スポンジンは約100ng/mlの最終濃度で使用される。一部の態様では、R-スポンジンは約1μg/mlの最終濃度で使用される。
EGFR経路阻害剤
本発明の分化培地はEGFR経路阻害剤を含む。本明細書で定義される任意の適切な阻害剤を使用し得る。
ErbB1またはHER1としても公知の上皮成長因子受容体（EGFR）は、細胞外タンパク質リガンドの上皮成長因子（EGF）ファミリーのメンバーに対する細胞表面受容体である。EGFRは、4つの関連タンパク質（EGFR（HER1/ErbB1）、ErbB2（HER2）、ErbB3（HER3）およびErbB4（HER4））を含むHERファミリーの受容体に属する。HER受容体は、EGF、TGFA、ヘパリン結合性EGF様成長因子、アンフィレグリン、ベータセルリン、およびエピレグリンを含む種々のリガンドに結合することによって活性化されることが公知である。リガンドが受容体の細胞外ドメインに結合した後、受容体は、機能的に活性な二量体（EGFR-EGFR（ホモ二量体）またはEGFR-HER2、EGFR-HER3、EGFR-HER4（ヘテロ二量体））を形成する。二量体化はチロシンキナーゼドメインの活性化を誘導し、それが複数のチロシン残基上の受容体の自己リン酸化をもたらす。これは、一連のアダプタータンパク質（SHC、GRB2など）の動員を導き、一連の細胞内シグナル伝達カスケードを活性化して遺伝子転写に影響を及ぼす。
EGFRの下流作用を媒介する経路はよく研究されており、3つの主要なシグナル伝達経路が同定されている。第一の経路はRAS-RAF-MAPK経路を含み、この経路ではリン酸化EGFRがGRB2およびShcアダプタータンパク質を介してグアニン-ヌクレオチド交換因子を動員し、RASを活性化し、その後RAFおよびMAPキナーゼ経路を刺激して細胞増殖、腫瘍浸潤および転移に影響を及ぼす。活性化RASは、RAFキナーゼのプロテインキナーゼ活性を活性化する。RAFキナーゼはMEK（MAP2KまたはMAPKKとしても公知である）をリン酸化および活性化し、これがMAPキナーゼ（ERK、細胞外シグナル制御キナーゼとしても公知である）をリン酸化および活性化する。第二の経路はPI3K/AKT経路を含み、これは、NFKBなどの核内転写因子を活性化することによって重要な細胞生存および抗アポトーシスシグナルを活性化する。第三の経路は、細胞生存に関連する遺伝子の転写を活性化することにも関与するJAK/STAT経路を含む。EGFR活性化はまた、PLCGのリン酸化ならびにそれに続くホスファチジルイノシトール4,5二リン酸（PIP2）のイノシトール1,4,5-三リン酸（IP3）およびジアシルグリセロール（DAG）への加水分解を導き、プロテインキナーゼC（PRKC）およびCAMKの活性化をもたらす。
抗EGFRモノクローナル抗体および小分子EGFRチロシンキナーゼ阻害剤などのEGFR阻害剤が利用可能である。セツキシマブおよびパニツムマブなどのいくつかの抗EGFR抗体は、EGFR単量体の細胞外ドメインに結合し、内因性リガンドによる受容体結合について競合する;このようにしてそれらはリガンド誘導受容体活性化をブロックする。エルロチニブ、ゲフィチニブおよびラパチニブなどのいくつかの小分子EGFR阻害剤は、ATPと競合してEGFRのキナーゼドメインに結合し、これが次にEGFRの自己リン酸化および下流のシグナル伝達を阻害する。
1つまたは複数のEGFR経路阻害剤、例えば2つ、3つ、4つまたはそれ以上を使用し得る。
EGFR経路阻害剤は、好ましくは、同じ細胞型で評価した場合、前記分子の不在下での前記EGFR経路活性のレベルと比較して、細胞中のEGFR経路活性を少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは100％阻害するのに有効な量で培地に添加される。当業者に公知のように、EGFR経路活性は様々な方法で測定することができる。例えば、EGFR活性および阻害剤感受性を観測するためのアッセイは、Ghosh et al.（2013）Assay and Drug Development Technologies 11（1）:44-51に記載されている。この特定のアッセイは、磁気ビーズに共有結合で固定化されたペプチド基質を含む。キナーゼ反応後、ビーズを洗浄し、ペプチドのリン酸化を、リン酸化チロシンに対するHRP結合一次抗体を用いた化学蛍光法によって検出する。測定された蛍光強度は基質のリン酸化に正比例し、これは次にEGFRキナーゼ活性に比例する。このアッセイはまた、EGFR経路における他のキナーゼ（例えばRAS、RAF、MEKまたはERK）の阻害剤をスクリーニングするためにも使用され得る。キナーゼ活性をアッセイするための代替的な方法は、P32標識ATPからの末端リン酸の取り込みを検出することを含む。したがって、新規のEGFR経路阻害剤は、当技術分野において公知のアッセイを用いて当業者によって容易に同定され得る。
一部の態様では、EGFR経路阻害剤は、EGFRキナーゼ活性を少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは100％阻害するEGFR阻害剤である。
一部の態様では、EGFR経路阻害剤は、RASキナーゼ活性を少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは100％阻害するRAS阻害剤である。
一部の態様では、EGFR経路阻害剤は、RAFキナーゼ活性を少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは100％阻害するRAF阻害剤である。
一部の態様では、EGFR経路阻害剤は、MEKキナーゼ活性を少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは100％阻害するMEK阻害剤である。
一部の態様では、EGFR経路阻害剤は、ERKキナーゼ活性を少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは100％阻害するERK阻害剤である。
一部の態様では、EGFは、分化培地中に1mM未満の濃度で存在する。好ましい態様では、EGFは分化培地中に存在しない。
一部の態様では、EGFR経路阻害剤は、ゲフィチニブ（Santa Cruz Biotechnology）、AG-18、AG-490（チルホスチンB42）、AG-1478（チルホスチンAG-1478）、AZ5104、AZD3759、ブリガチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、CL-387785（EKI-785）、CNX-2006、イコチニブ、ネシツムマブ、オシメルチニブ（AZD9291）、OSI-420、PD153035 HCl、PD168393、ペリチニブ（EKB-569）、ロシレチニブ（CO-1686、AVL-301）、TAK-285、チルホスチン9、バンデタニブ、WHI-P154、WZ3146、WZ4002、WZ8040、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブまたはマツズマブなどのEGFR阻害剤である。一部の態様では、EGFR阻害剤は、EGFR単量体の細胞外ドメインに結合し、EGFによる受容体結合について競合する。一部の態様では、EGFR阻害剤は、ATPと競合してEGFRのキナーゼドメインに結合する。1つまたは複数のEGFR阻害剤、例えば2つ、3つ、4つまたはそれ以上を使用し得る。
一部の態様では、EGFR経路阻害剤は、EGFRおよびErbB-2阻害剤、例えばアファチニブ（Selleckchem）、アファチニブ二マレイン酸塩、AC480（BMS-599626）、AEE788（NVP-AEE788）、AST-1306、カネルチニブ、CUDC-101、ダコミチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、ポジオチニブ（HM781-36B）、サピチニブ（AZD8931）またはバルリチニブである。1つまたは複数のEGFRおよびErbB-2阻害剤、例えば2つ、3つ、4つまたはそれ以上を使用し得る。
一部の態様では、EGFR経路阻害剤はRAS-RAF-MAPK経路の阻害剤である。一部の態様では、EGFR経路阻害剤はPI3K/AKT経路の阻害剤である。一部の態様では、EGFR経路阻害剤はJAK/STAT経路の阻害剤である。
一部の態様では、EGFR経路阻害剤は、RAF阻害剤、例えばGW5074、ZM 336372、NVP-BHG712、TAK-632、ダラフェニブ（GSK2118436）、ソラフェニブ、ソラフェニブトシル酸塩、PLX-4720、AZ 628、CEP-32496またはベムラフェニブ（PLX4032、RG7204）である。
一部の態様では、EGFR経路阻害剤は、PD0325901（Sigma Aldrich）などのMEK阻害剤である。一部の態様では、EGFR経路阻害剤は、SCH772984（Selleckchem）などのERK阻害剤である。
一部の態様では、EGFR経路阻害剤は、0.01～200μM、0.01～100μM、0.1～50μM、0.1～20μM、1～100μM、1～50μM、1～30μM、5～100μM、5～50μMまたは5～20μMの濃度で使用される。例えば、一部の態様では、分化培地は、（i）約5μMの濃度のゲフィチニブ、（ii）約10μMの濃度のアファチニブ、（iii）約5μMの濃度のPD0325901、または（iv）約10μMの濃度のSCH772984を含む。
Notch阻害剤
分化培地はNotch阻害剤を含む。任意の適切なNotch阻害剤を使用し得る。
Notchは、複数のタンパク質分解的切断を通して活性化され得る膜貫通表面受容体であり、そのうちの1つは、γ-セクレターゼと称される、プロテアーゼ活性を有するタンパク質の複合体による切断である。γ-セクレターゼは、膜内でその切断活性を実行するプロテアーゼである。γ-セクレターゼは多成分酵素であり、少なくとも4つの異なるタンパク質、すなわちプレセニリン（プレセニリン1または2）、ニカストリン、PEN-2およびAPH-1から構成される。プレセニリンはγ-セクレターゼの触媒中心である。リガンドに結合すると、Notch受容体は、メタロプロテアーゼであるADAMプロテアーゼの作用を介してエクトドメインシェディングを可能にする立体配座変化を受ける。これに続いて直ちに、Notch細胞内ドメイン（NICD）の放出をもたらすγ-セクレターゼ複合体の作用が生じる。NICDは核に移行し、そこでCSL（C-プロモータ結合因子/組換えシグナル配列結合タンパク質Jκ/Supressor-of-Hairless/Lagl）と相互作用する。NICDの結合は、CSLを転写リプレッサーから活性化因子に変換し、Notch標的遺伝子の発現をもたらす。
いくつかの態様では、Notch阻害剤は、Notchのリガンド媒介活性化を低下させることができる阻害剤（例えばNotchのドミナントネガティブリガンドによって、もしくはドミナントネガティブNotchによって、もしくはNotchリガンドとNotchとの間の相互作用を少なくとも部分的にブロックすることができる抗体によって）、またはADAMプロテアーゼの阻害剤である。
いくつかの態様では、Notch阻害剤は、γ-セクレターゼ阻害剤、例えばDAPT、ジベンザゼピン（DBZ）、ベンゾジアゼピン（BZ）またはLY-411575である。1つまたは複数のNotch阻害剤、例えば2つ、3つ、4つまたはそれより多くのNotch阻害剤を使用し得る。
いくつかの態様では、Notch阻害剤（例えばDAPT）は、0.001～200mM、0.01～100mM、0.1～50mM、0.1～20mM、0.5～10mMまたは0.5～5mMの濃度で使用される。例えば、いくつかの態様では、分化培地は、約1mMの濃度のDAPTを含む。
基礎培地
本発明の方法において使用される分化培地は基礎培地を含む。基礎培地は、本明細書で提供される制限に従う、動物またはヒト細胞用の任意の適切な基礎培地である。
動物またはヒト細胞培養用の基礎培地は、典型的には、培養細胞の維持を支援するのに必要な多数の成分を含む。成分の適切な組み合わせは、以下の開示を考慮して、当業者によって容易に製剤化され得る。本発明における使用のための基礎培地は、一般に、文献および上記により詳細に記載されるように、アミノ酸、ビタミン、脂質添加物、無機塩、炭素エネルギー源および緩衝液などの標準的な細胞培養成分を含む栄養溶液を含む。いくつかの態様では、培養培地は、例えばアミノ酸、ビタミン、脂質添加物、無機塩、炭素エネルギー源および緩衝液から選択される1つまたは複数の標準的な細胞培養成分をさらに添加される。
当業者は、共通の一般知識から、本発明の分化培地中の基礎培地として使用し得る培養培地の種類を理解するであろう。潜在的に適切な細胞培養培地は市販されており、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、最小必須培地（MEM）、ノックアウトDMEM（KO-DMEM）、グラスゴー最小必須培地（G-MEM）、イーグル基礎培地（BME）、DMEM/ハムF12、Advanced DMEM/ハムF12、イスコフ改変ダルベッコ培地および最小必須培地（MEM）、ハムF-10、ハムF-12、199培地およびRPMI 1640培地を含むが、これらに限定されるわけではない。
例えば、基礎培地は、グルタミン、インスリン、ペニシリン/ストレプトマイシンおよびトランスフェリンを添加したDMEM/F12およびRPMI 1640から選択され得る。さらなる好ましい態様では、無血清培養用に最適化され、インスリンを既に含む、Advanced DMEM/F12またはAdvanced RPMIが使用される。この場合、前記Advanced DMEM/F12またはAdvanced RPMI培地は、好ましくはグルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加される。N2およびB27を添加したAdDMEM/F12（Invitrogen）も好ましい。好ましくは、基礎培地はAdvanced DMEM/F12である。より好ましくは、基礎培地は、Advanced DMEM/F12、グルタミンおよびB27を含む。
いくつかの態様では、基礎培地は、Advanced DMEM/F12、HEPES、ペニシリン/ストレプトマイシン、グルタミン、N-アセチルシステイン、およびB27を含む。
いくつかの態様では、基礎培地は、ペニシリン/ストレプトマイシン、10mM HEPES、Glutamax、B27（全てLife Technologies, Carlsbad, CAより）および約1mM N-アセチルシステイン（Sigma）を添加したAdvanced DMEM/F12を含むかまたはこれからなる。
前記基礎培地が、精製、天然、半合成および/または合成増殖因子を添加されており、ウシ胎仔血清などの未定義成分を含まないことがさらに好ましい。様々な異なる血清代替物製剤が市販されており、当業者に公知である。血清代替物が使用される場合、従来の技術に従って、培地の約1体積％～約30体積％で使用され得る。
本発明で使用される分化培地は、本明細書の他の箇所に記載されているように、血清を含み得るか、または無血清および/もしくは血清代替物不含であり得る。培養培地および細胞の調製は、好ましくは、生物学的製品に関してFDAによって要求される基準に合致し、製品の一貫性を保証するGMP工程である。
本発明の分化培地は、通常、脱イオン蒸留水中で製剤化される。本発明の分化培地は、典型的には、例えば紫外光、加熱、照射または濾過によって、汚染を防止するために使用前に滅菌される。分化培地は、貯蔵または輸送のために凍結され得る（例えば-20℃または-80℃で）。培地は、汚染を防止するために1つまたは複数の抗生物質を含み得る。培地は、1ml当たり0.1エンドトキシン単位未満のエンドトキシン含量を有し得るか、または1ml当たり0.05エンドトキシン単位未満のエンドトキシン含量を有し得る。培地のエンドトキシン含量を決定するための方法は当技術分野において公知である。
好ましい基礎培地は、炭酸塩ベースの緩衝液でpH7.4（好ましくはpH7.2～7.6または少なくとも7.2で7.6以下）で緩衝された規定の合成培地であり、細胞は、5％～10％CO2、または少なくとも5％で10％以下のCO2、好ましくは5％CO2を含む雰囲気中で培養される。
いくつかの態様では、分化培地は、分化方法において使用できる状態の基礎培地を含んで提供される。他の態様では、分化培地は、基礎培地なしで、例えば培養培地添加物として提供され、分化方法における使用の前に基礎培地（または他の成分）が添加され得る。したがって、基礎培地が存在しないかまたは基礎培地が単なる任意成分である、本明細書に記載の任意の分化培地が提供される。
さらなる因子
いくつかの因子は、一部の状況において前駆細胞の分化を増強することが以前に示されている。一部の態様では、これらの因子のうちの1つまたは複数が本発明の分化培地に含まれる。これらの因子には、p38阻害剤、TGF-β阻害剤、ガストリン、糖質コルチコイド、受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP経路活性化剤、ヘッジホッグ活性化剤、ヘッジホッグ阻害剤、mTORシグナル伝達GSK-3阻害剤のモジュレータ、CHIR99021アゴニスト、AP-1刺激剤、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト、カルバコールアゴニストおよびcAMP経路活性化剤が含まれるが、これらに限定されるわけではない。一部の態様では、これらの因子は、p38阻害剤、TGF-β阻害剤、ガストリン、糖質コルチコイド、受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP経路活性化剤、BMP経路阻害剤、ヘッジホッグ活性化剤、ヘッジホッグ阻害剤、mTORシグナル伝達GSK-3阻害剤のモジュレータ、CHIR99021アゴニスト、AP-1刺激剤、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト、カルバコールアゴニストおよびcAMP経路活性化剤から選択される。一部の態様では、これらの因子は、ガストリン、糖質コルチコイド、受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP経路活性化剤、BMP経路阻害剤、ヘッジホッグ活性化剤、ヘッジホッグ阻害剤、mTORシグナル伝達GSK-3阻害剤のモジュレータ、CHIR99021アゴニスト、AP-1刺激剤、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト、カルバコールアゴニストおよびcAMP経路活性化剤から選択される。
p38阻害剤
本発明の一部の態様では、分化培地はp38阻害剤をさらに含み、これは、直接的または間接的にp38シグナル伝達を負に調節する任意の阻害剤を意味する。一部の態様では、本発明による阻害剤は、p38（GI番号1432）に結合してその活性を低下させる。p38プロテインキナーゼは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）のファミリーの一部である。MAPKは、環境ストレスおよび炎症性サイトカインなどの細胞外刺激に応答し、遺伝子発現、有糸分裂、分化、増殖および細胞生存/アポトーシスなどの様々な細胞活性を調節するセリン/トレオニン特異的プロテインキナーゼである。p38 MAPKは、α、β、β2、γおよびδアイソフォームとして存在する。p38阻害剤は、少なくとも1つのp38アイソフォームに結合してその活性を低下させる作用物質である。物質がp38阻害剤であるかどうかを決定するための様々な方法が公知であり、本発明と共に使用し得る。例としては、細胞p38の活性化または阻害の十分に確立された尺度を提供する、Thr180/Tyr182でのリン酸化のリン酸化部位特異的抗体検出;生化学的組換えキナーゼアッセイ;腫瘍壊死因子α（TNFα）分泌アッセイ;およびp38阻害剤用のDiscoverRxハイスループットスクリーニングプラットフォーム（http://www.discoverx.com/kinases/literature/biochemical/collaterals/DRx_poster_p38％20KBA.pdf参照）が含まれる。いくつかのp38活性アッセイキットも存在する（例えばMillipore、Sigma-Aldrich）。
様々なp38阻害剤が当技術分野において公知である。一部の態様では、p38シグナル伝達を直接的または間接的に負に調節する阻害剤は、SB-202190、SB-203580、VX-702、VX-745、PD-169316、RO-4402257およびBIRB-796からなる群より選択される。
一態様では、本発明によるp38阻害剤は、細胞アッセイによって評価した場合、その標的に結合して、対照と比較してその活性を10％超、30％超、60％超、80％超、90％超、95％超、または99％超低下させる。標的阻害を測定するための細胞アッセイの例は、上述したように当技術分野において周知である。
SB-203580は、50nM～100μM、または100nM～50μM、または1μM～50μMの濃度で分化培地に添加し得る。例えば、SB-203580は約30μMで培地に添加し得る。
TGF-β阻害剤
いくつかの態様では、分化培地はさらにTGF-β阻害剤を含む。
TGF-βシグナル伝達は、細胞増殖、細胞運命およびアポトーシスを含む多くの細胞機能に関与する。シグナル伝達は、典型的には、I型受容体を動員してリン酸化するII型受容体へのTGF-βスーパーファミリーリガンドの結合から始まる。次いで、I型受容体はSMADをリン酸化し、これが核内の転写因子として働き、標的遺伝子発現を調節する。
TGF-β阻害剤シグナル伝達経路は、以前は前駆細胞の分化の促進に関係づけられていた。例えば、肝臓外植片へのTGF-βの添加はインビトロでの胆管分化を促進する（Clotman et al.（2005）Genes Dev.19（16）:1849-54）。加えて、TGF-β阻害剤を分化培地に含めると、胆管細胞運命を阻害し、より肝細胞表現型へと向かう細胞の分化を引き起こし得ることが以前に示されている（国際公開公報第2012/168930号参照）。特に、TGF-β阻害剤（A83-01など）を分化培地に含めると、成熟肝細胞マーカーの発現を増強し、肝細胞様細胞の数を増加させることが認められた。
TGF-βスーパーファミリーリガンドは、骨形成タンパク質（BMP）、増殖および分化因子（GDF）、抗ミュラー管ホルモン（AMH）、アクチビン、ノーダルおよびTGF-βを含む。一般に、Smad2およびSmad3は、TGF-β/アクチビン経路のALK4、5および7受容体によってリン酸化される。対照的に、Smad1、Smad5およびSmad8は、骨形成タンパク質（BMP）経路の一部としてリン酸化される。経路間に多少の交差が存在するが、本発明に関連して、「TGF-β阻害剤」または「TGF-βシグナル伝達の阻害剤」は、好ましくは、Smad2およびSmad3を介してならびに/またはALK4、ALK5もしくはALK7を介して作用するTGF-β経路の阻害剤である。したがって、いくつかの態様では、TGF-β阻害剤はBMP阻害剤ではない、すなわちTGF-β阻害剤はノギンではない。いくつかの態様では、BMP阻害剤は、TGF-β阻害剤に加えて培養培地に添加される。したがって、TGF-β阻害剤は、TGF-βシグナル伝達経路、好ましくはSmad2および/またはSmad3を介して作用するシグナル伝達経路、より好ましくはALK4、ALK5またはALK7を介して作用するシグナル伝達経路の活性を低下させる任意の作用物質であり得る。
当技術分野で公知であり、本発明と共に使用することができる、TGF-βシグナル伝達経路を破壊する多くの方法がある。例えば、TGF-βシグナル伝達は、低分子干渉RNA戦略によるTGF-β発現の阻害;フーリン（TGF-β活性化プロテアーゼ）の阻害;生理学的阻害剤による経路の阻害;モノクローナル抗体によるTGF-βの中和;TGF-β受容体キナーゼ1（アクチビン受容体様キナーゼ、ALK5としても知られる）、ALK4、ALK6、ALK7または他のTGF-β関連受容体キナーゼの小分子阻害剤による阻害;例えばSmad2およびSmad3の生理学的阻害剤であるSmad7の過剰発現による、またはSmadの活性化を妨げるSmadアンカーとしてチオレドキシンを使用することによる、Smad2およびSmad3シグナル伝達の阻害、によって破壊され得る（Fuchs,O.Inhibition of TGF- Signaling for the Treatment of Tumor Metastasis and Fibrotic Diseases.Current Signal Transduction Therapy,Volume 6,Number 1,January 2011,pp.29-43（15））。
ある物質がTGF-β阻害剤であるかどうかを決定するための様々な方法が公知であり、本発明と共に使用し得る。例えば、細胞が、ヒトPAI-1プロモータまたはSmad結合部位を含むレポーター構築物で安定にトランスフェクトされ、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動する細胞アッセイを使用し得る。対照群と比較したルシフェラーゼ活性の阻害を、化合物の活性の尺度として用いることができる（De Gouville et al. (2005) Br J Pharmacol. 145（2）:166-177）。したがって、新規TGF-β阻害剤は、当業者によって容易に同定され得る。
本発明によるTGF-β阻害剤は、タンパク質、ペプチド、小分子、低分子干渉RNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマーまたは抗体であり得る。阻害剤は、天然に存在するものであってもよくまたは合成物であってもよい。一態様では、TGF-β阻害剤は、ALK4、ALK5および/またはALK7の阻害剤である。例えば、TGF-β阻害剤は、ALK4、ALK5および/またはALK7に結合して、直接阻害し得る。本発明に関連して使用できる好ましい小分子TGF-β阻害剤の例には、以下の表2に列挙する小分子阻害剤が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
（表２）受容体キナーゼを標的とする小分子TGF-β阻害剤
Figure 2022068302000010
いくつかの態様では、TGF-β阻害剤は、A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511からなる群より任意で選択される小分子阻害剤である。
いくつかの態様では、1つだけのTGFβ阻害剤が分化培地中に存在する。他の態様では、複数の、例えば2つ、3つ、4つまたはそれより多くのTGFβ阻害剤が分化培地中に存在する。いくつかの態様では、本発明の分化培地は、表2に列挙される阻害剤のいずれかの1つまたは複数を含む。分化培地は、1つの阻害剤と列挙される別の阻害剤との任意の組み合わせを含み得る。例えば、培地は、SB-525334もしくはSD-208もしくはA83-01を含み得るか、またはSD-208およびA83-01を含み得る。当業者は、主に他のキナーゼを標的とするように設計されているが、高濃度ではTGF-β受容体キナーゼも阻害し得る多数の他の小分子阻害剤が存在することを理解するであろう。例えば、SB-203580は、高濃度（例えば約10μMまたはそれより多く）でALK5を阻害すると考えられるp38 MAPキナーゼ阻害剤である。TGF-βシグナル伝達経路を阻害する任意のそのような阻害剤もまた、本発明に関連して使用することができる。
いくつかの態様では、TGF-β阻害剤（例えばA83-01）は、少なくとも1nM、例えば少なくとも5nM、少なくとも50nM、少なくとも100nM、少なくとも300nM、少なくとも450nMまたは少なくとも475nMで分化培地中に存在する。例えば、TGF-β阻害剤（例えばA83-01）は、1nM～200μM、10nM～200μM、100nM～200μM、1μM～200μM、10nM～100μM、50nM～100μM、50nM～10μM、100nM～1μM、200nM～800nM、350～650nMまたは約500nMで分化培地中に存在する。したがって、いくつかの態様では、分化培地は、約500nMの濃度のA83-01を含む。
いくつかの態様では、分化培地はTGF-β阻害剤を含まない。いくつかの態様では、分化培地はA83-01を含まない。
ガストリン
いくつかの態様では、本発明の分化培地はガストリンをさらに含む。いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.01～500nM、0.1～100nM、1～100nM、1～20nMまたは5～15nMの濃度のガストリンを含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、約10nMの濃度のガストリンを含む。
糖質コルチコイド
いくつかの態様では、本発明の分化培地は糖質コルチコイドをさらに含む。
糖質コルチコイドは、ステロイドホルモンの1つのクラスである、コルチコステロイドのクラスである。糖質コルチコイドは、糖質コルチコイド受容体に結合するコルチコステロイドである。コルチゾールは最も重要なヒト糖質コルチコイドである。ヒドロコルチゾンはコルチゾールの合成版である。関連する構造を有する多くの他の合成糖質コルチコイド（例えばプレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾンおよび酢酸フルドロコルチゾン）が存在する。糖質コルチコイドは、糖質コルチコイド受容体を活性化するために様々な効力を有する。これは糖質コルチコイド効力と呼ばれ、通常、コルチゾールと比較して測定される。様々な糖質コルチコイドの生化学、薬理学および作用機序は、例えばCecil Textbook of Medicine（1988）,pages 128-130およびThe Science and Practice of Pharmacy 20th Edition（2000）,pages 1363-1370に総説されている。
いくつかの態様では、分化培地は糖質コルチコイドを含む。任意の適切な糖質コルチコイドを使用し得る。いくつかの態様では、糖質コルチコイドは、コルチゾール、コルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、塩酸ヒドロコルチゾン、吉草酸ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、フルチカゾン、フルチカゾンアセトニド、プロピオン酸フルチカゾン、フルニソリド、ブデソニド、クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、ジフロラゾン、二酢酸ジフロラゾン、ハロベタゾール、プロピオン酸ハロベタゾール、アムシノニド、デスオキシメタゾン、フルオシノニド、フルオシノニドアセトニド、ハルシノニド、モメタゾン、フランカルボン酸モメタゾン、フルアンドレノリド、プレドニカルベート、アクロメタゾン、ジプロピオン酸アクロメタゾン、デソニド、フルオシノロン、フルオシノロンアセトニド、プラモキシンおよび塩酸プラモキシンの1つまたは複数から選択される。
デキサメタゾンは最も強力な糖質コルチコイドの1つであり、本発明の分化培地での使用に好ましい糖質コルチコイドである。いくつかの態様では、糖質コルチコイドは、デキサメタゾンと同じかまたはより高い糖質コルチコイド効力を有する任意の糖質コルチコイドである。
ベタメタゾンおよび酢酸フルドロコルチゾンも、非常に強力な糖質コルチコイドである。したがって、ベタメタゾンは、本発明の分化培地での使用に好ましい糖質コルチコイドである。いくつかの態様では、糖質コルチコイドは、ベタメタゾンと同じかまたはより高い糖質コルチコイド効力を有する任意の糖質コルチコイドである。したがって、酢酸フルドロコルチゾンは、本発明の分化培地での使用に好ましい糖質コルチコイドである。いくつかの態様では、糖質コルチコイドは、酢酸フルドロコルチゾンと同じかまたはより高い糖質コルチコイド効力を有する任意の糖質コルチコイドである。
いくつかの態様では、糖質コルチコイドは、コルチゾールと同じかまたはより高い糖質コルチコイド効力を有する任意の糖質コルチコイドである。
本発明の分化培地で使用するための例示的な糖質コルチコイドのリストを以下に示す。示されている効力は経口投与を指す。
Figure 2022068302000011
いくつかの態様では、糖質コルチコイド（例えばデキサメタゾン）は、0.01～150μM、0.1～15μM、0.5～10μMまたは1～5μMの濃度で使用される。好ましい態様では、糖質コルチコイドはデキサメタゾンである。例えば、いくつかの態様では、分化培地は、約3μMの濃度のデキサメタゾンを含む。
いくつかの態様では、分化培地は糖質コルチコイドを含まない。
受容体チロシンキナーゼリガンド
いくつかの態様では、分化培地はさらに1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドを含む。
受容体チロシンキナーゼ（RTK）は、ポリペプチド成長因子、サイトカインおよびホルモンに対する高親和性細胞表面受容体である。RTKは、細胞の維持、成長および発達の鍵となる調節因子であり、また多くの種類のがんの発症および進行においても重要な役割を果たす。本発明に関連して、受容体チロシンキナーゼリガンドは、RTKを活性化する任意のリガンドである。多くの受容体チロシンキナーゼリガンドは分裂促進性成長因子である。したがって、いくつかの態様では、分化培地中の1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、1つまたは複数の分裂促進性成長因子を含む。
約20の異なる公知のクラスのRTKが存在し、これには、RTKクラスI（EGF受容体ファミリー）（ErbBファミリー）、RTKクラスII（インスリン受容体ファミリー）、RTKクラスIII（PDGF受容体ファミリー）、RTKクラスIV（FGF受容体ファミリー）、RTKクラスV（VEGF受容体ファミリー）、RTKクラスVI（HGF受容体ファミリー）、RTKクラスVII（Trk受容体ファミリー）、RTKクラスVIII（Eph受容体ファミリー）、RTKクラスIX（AXL受容体ファミリー）、RTKクラスX（LTK受容体ファミリー）、RTKクラスXI（TIE受容体ファミリー）、RTKクラスXII（ROR受容体ファミリー）、RTKクラスXIII（DDR受容体ファミリー）、RTKクラスXIV（RET受容体ファミリー）、RTKクラスXV（KLG受容体ファミリー）、RTKクラスXVI（RYK受容体ファミリー）、RTKクラスXVII（MuSK受容体ファミリー）が含まれる。いくつかの態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、これら20のクラスのRTKの1つまたは複数、または全部に対するリガンドを含む。
いくつかの態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、RTKクラスIV（FGF受容体ファミリー）のリガンドを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、RTKクラスVI（HGF受容体ファミリー）のリガンドを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、RTKクラスIV（FGF受容体ファミリー）のリガンド、およびRTKクラスVI（HGF受容体ファミリー）のリガンドを含む。
したがって、いくつかの態様では、分化培地中の1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、線維芽細胞増殖因子（FGF）および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される。いくつかの態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、FGFおよびHGFを含む。いくつかの態様では、例えば、FGFおよびHGFから選択される1つの受容体チロシンキナーゼリガンドだけが分化培地に含まれる。
FGFは、好ましくはFGFR2またはFGFR4に結合することができるFGFであり、好ましくはFGF19である。
3つまたはそれより多く、例えば3、4、5またはそれより多くの受容体チロシンキナーゼリガンドを本発明の分化培地において使用し得る。
上記で説明したように、本発明者らは、EGFR経路の阻害が腸内分泌細胞の分化に寄与することを見出した。したがって、好ましくは、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、EGFRを活性化するリガンド（例えばEGF）を含まない。一部の態様では、分化培地は1mM未満のEGFを含む。
BMP経路活性化剤
本発明者らは、驚くべきことに、EEC分化培地中にBMP経路活性化剤を含めることが、分化したEEC集団におけるセクレチン分泌細胞の存在を増加させることを見出した（図13および14参照）。したがって、一部の態様では、分化培地はBMP経路活性化剤をさらに含む。一部の態様では、分化培地はBMP経路阻害剤（例えばノギン）を含まない。一部の態様では、分化培地はBMP経路活性化剤をさらに含み、BMP経路阻害剤（例えばノギン）を含まない。
適切なBMP活性化剤を同定するための方法は当技術分野において公知である。BMP活性を測定するための適切なアッセイは、Zilberberg et al.,BMC Cell Biology 2007 8:41に記載されている。
一部の態様では、BMP経路活性化剤は、BMP7、BMP4およびBMP2から選択される。 BMP7が好ましい。BMP7は、SMAD1およびSMAD5のリン酸化を誘導する。したがって、一部の態様では、BMP経路活性化剤は、SMAD1およびSMAD5のリン酸化を誘導することができる任意の化合物である。さらに、BMP7が言及される場合、SMAD1またはSMAD5のリン酸化を誘導する任意の化合物をBMP7の代わりに使用することができる。
一部の態様では、BMP4またはBMP7などのBMP経路活性化剤は、分化培地中に少なくとも0.01ng/ml、少なくとも0.1ng/ml、少なくとも1ng/ml、少なくとも10ng/ml、少なくとも20ng/ml、少なくとも25ng/ml、少なくとも100ng/ml、少なくとも500ng/ml、少なくとも1μg/ml、少なくとも10μg/mlまたは少なくとも50μg/mlで存在する。一部の態様では、BMP4またはBMP7などのBMP経路活性化剤は、分化培地中に約0.01ng/ml～約500ng/ml、約1ng/ml～約500ng/ml、約10ng/ml～約500ng/ml、約20ng/ml～約500ng/ml存在する。一部の態様では、BMP4またはBMP7などのBMP経路活性化剤は、分化培地中に約0.01ng/ml～約200ng/ml、約0.1ng/ml～約100ng/ml、約1ng/ml～約100ng/ml、約10ng/ml～約100ng/ml、約10ng/ml～約50ng/ml、約15ng/ml～約30ng/ml存在する。一部の態様では、BMP4またはBMP7などのBMP経路活性化剤は、分化培地中に約25ng/mlで存在する。一部の態様では、BMP4は、分化培地中に約0.1μg/ml～約50μg/ml、約1～約50μg/ml、約5μg/ml～約25μg/mlまたは約5μg/ml～約15μg/ml存在する。一部の態様では、BMP4は分化培地中に約10μg/mlで存在する。
一部の態様では、分化培地はBMP経路活性化剤を含まない。
また、EECを含む細胞の集団においてセクレチン分泌を増加させるための方法も提供され、この方法は、細胞の集団をBMP活性化剤と接触させることを含む。
また、EECを含む細胞の集団においてGLP-1分泌を減少させるための方法も提供され、この方法は、細胞の集団をBMP活性化剤と接触させることを含む。
また、EECを含む細胞の集団においてPyyおよび/またはNtsの発現を増加させるための方法も提供され、この方法は、細胞の集団をBMP活性化剤と接触させることを含む。
BMP阻害剤
本発明者らはまた、驚くべきことに、EEC分化培地中にBMPシグナル伝達の阻害剤を含めることが、分化したEEC集団において陰窩ホルモンシグネチャーを促進することを見出した（実施例5参照）。陰窩ホルモンシグネチャーは、GLP-1の高発現およびセクレチンの発現の欠如を特徴とする。したがって、一部の態様では、本発明の分化培地はBMP阻害剤をさらに含む。これらの態様では、分化培地は、好ましくはBMP活性化剤を含まない。
BMPは、2つのクラスの細胞表面骨形成タンパク質受容体（BMPR-IおよびBMPRII）に結合する小さなシグナル伝達分子である。BMPR-I受容体クラスは、アクチビン受容体様キナーゼ-2（ALK-2またはActR-IA）、ALK-3（BMPR-IA）およびALK-6（BMPR-IB）の3つの受容体型からなる。BMPR-II受容体クラスは、BMPR-II、ActR-IIAおよびActR-IIBの3つの受容体型から構成される。BMPの結合は、2つのI型受容体および2つのII型受容体を含むヘテロ四量体複合体の形成をもたらす。細胞外結合ドメインに加えて、各BMP受容体は細胞内セリン/トレオニンキナーゼドメインを含む。BMPの結合後、構成的に活性なII型受容体キナーゼはI型受容体キナーゼドメインをリン酸化し、これが次にBMP応答性SMAD1、5、および8をリン酸化し、これが細胞核に入り、転写因子として機能することができる。これらの特定のSMADのリン酸化は、増殖調節および分化を含む様々な細胞作用をもたらす。BMP阻害剤は、これらの経路を介したシグナル伝達の有意な減少をもたらす任意の阻害剤である。例えば、BMP阻害剤は、BMPとBMP受容体との相互作用を破壊する;BMP受容体に結合して下流のシグナル伝達の活性化を阻害する;Smad 1、Smad 5もしくはSmad 8のリン酸化を阻害する;Smad 1、Smad 5もしくはSmad 8の核への移行を阻害する;標的遺伝子のSMAD 1、SMAD 5もしくはSMAD 8媒介転写を阻害する;またはBMPの発現、折りたたみもしくは分泌を阻害する能力を有し得る。一部の態様では、BMP阻害剤は、BMPR-I受容体クラスを介したシグナル伝達を減少させる。一部の態様では、BMP阻害剤は、BMPR-II受容体クラスを介したシグナル伝達を減少させる。一部の態様では、BMP阻害剤は、SMAD 1/5/8を介したシグナル伝達を減少させる。阻害は直接的または間接的であり得る。
多くのBMP阻害剤が、例えばCuny,et al.,（2008）Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein（BMP）signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett 18:4388-4392に開示されているように、当技術分野において公知である。これらのBMP阻害剤のいずれもが、本発明の方法における使用に適する。適切なBMP阻害剤を同定するための方法は当技術分野において公知である。適切なアッセイは、Zilberberg et al., BMC Cell Biology 2007 8:41に記載されている。BMP阻害剤（特にALK2およびALK3を介してSmad 1、5または8のリン酸化を阻害するBMP阻害剤）についての別の適切なアッセイは、Cuny,et al.,（2008）Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein（BMP）signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett 18:4388-4392に記載されているcytobot細胞ELISAアッセイを用いて、当業者によって同定され得る。
一部の態様では、BMP阻害剤は、ノギン、コーディン、フォリスタチン、グレムリン、tsg（ねじれた原腸形成）、sog（短い原腸形成）、ドルソモルフィンおよびLDN193189から選択される。一部の態様では、BMP阻害剤は、
a.ドルソモルフィンまたはLDN193189またはその類似体もしくは変異体;および/または
b.ノギン、スクレロスチン、コーディン、CTGF、フォリスタチン、グレムリン、tsg、sogまたはその類似体もしくは変異体
から選択される。
一部の好ましい態様では、BMP阻害剤はノギンである。ノギンはインビトロ培養法に特に適する。他の好ましい態様では、BMP阻害剤はLDN193189である。LDN193189は、経口的に利用可能であり、したがって経口投与に非常に適しているので、インビボ治療方法に特に適する（後記の治療方法についてのさらなるコメント参照）。
一部の態様では、ノギンは、1～1000ng/ml、10～1000ng/ml、100～1000ng/ml、1～500ng/ml、1～200ng/ml、1～100ng/ml、10～500ng/ml、20～500ng/ml、10～200ng/ml、20～200ng/ml、50～500ng/ml、または50～200ng/mlの最終濃度で分化培地に含まれる。一部の態様では、ノギンは、約100ng/mlの最終濃度で分化培地に含まれる。
一部の態様では、LDN193189は、1nM～10μM、5nM～10μM、10nM～10μM、100nM～10μM、1μM～10μM、または1μM～5μMの最終濃度で分化培地に含まれる。一部の態様では、LDN193189は、少なくとも1nM、少なくとも5nM、少なくとも10nM、少なくとも100nM、少なくとも1μM、または約10μMの最終濃度で分化培地に含まれる。
また、EECを含む細胞の集団においてGLP-1分泌を増加させるための方法も提供され、この方法は、細胞の集団をBMP阻害剤と接触させることを含む。また、EECを含む細胞の集団においてセクレチン分泌を減少させるための方法も提供され、この方法は、細胞の集団をBMP阻害剤と接触させることを含む。
また、EECを含む細胞の集団においてTac1発現を増加させるための方法も提供され、この方法は細胞の集団をBMP阻害剤と接触させることを含む。
また、EECを含む細胞の集団においてGcg発現を増加させるための方法も提供され、この方法は、細胞の集団をBMP阻害剤と接触させることを含む。
ヘッジホッグ活性化剤および阻害剤
本発明者らは、驚くべきことに、EEC分化培地中にヘッジホッグシグナル伝達の阻害剤を含めることが、一部の状況では、分化したEEC集団におけるGLP1分泌細胞およびCCK分泌細胞の存在を増加させ得ることを見出した（図14参照）。したがって、一部の態様では、本発明の分化培地は、1つまたは複数のヘッジホッグ阻害剤をさらに含む。1つまたは複数のヘッジホッグ阻害剤は、細胞内のヘッジホッグシグナル伝達を減少させる任意の適切な阻害剤であり得る。この培地は、GLP1およびCCK分泌細胞を豊富に含むEEC集団を得るのに適する。または、GLP1分泌細胞およびCCK分泌細胞の数が激減しているEEC集団は、ヘッジホッグ活性化剤をさらに含む本発明の分化培地を用いて得られる。したがって、一部の態様では、本発明の分化培地は、1つまたは複数のヘッジホッグ活性化剤をさらに含む。1つまたは複数のヘッジホッグ活性化剤は、細胞内のヘッジホッグシグナル伝達を増加させる任意の適切な活性化剤であり得る。
哺乳動物ヘッジホッグ（Hh）リガンドには、ソニックヘッジホッグ（Shh）、インディアンヘッジホッグ（Ihh）およびデザートヘッジホッグ（Dhh）が含まれる。Hhリガンドは、典型的には、自己触媒的切断および同時に起こるカルボキシ末端でのコレステロール修飾とアミノ末端でのパルミトイル化を受けて、分泌される二重脂質化タンパク質を生じる前駆体タンパク質として合成される。Hhリガンドは、DispatchedとScube2の複合作用によって細胞表面から放出され、その後、細胞表面タンパク質LRP2およびグリピカンファミリーのヘパラン硫酸プロテオグリカン（GPC1～6）との相互作用を介して複数の細胞上を移動する。
Hhタンパク質は、標準的な受容体Patched（PTCH1）および共受容体GAS1、CDONおよびBOCへの結合を介してシグナル伝達を開始する。PTCH1へのHhの結合は、繊毛におけるSMOの蓄積およびその細胞質尾部のリン酸化を生じさせるGPCR様タンパク質Smoothened（SMO）の抑制解除をもたらす。SMOは、キネシンファミリータンパク質Kif7、および重要な細胞内Hh経路調節因子SUFUからのGLIタンパク質（Hh経路の転写エフェクター）の解離を含む下流のシグナル伝達を媒介する。
一部の態様では、1つまたは複数のヘッジホッグ阻害剤はSMO阻害剤を含む。一部の態様では、SMO阻害剤は、シクロパミンまたはシクロパミン競合阻害剤（例えばビスモゲニブ、サリデギブもしくはシクロパミン）である。他の態様では、SMO阻害剤はシクロパミン競合阻害剤（例えばイトラコナゾール）ではない。
一部の態様では、1つまたは複数のヘッジホッグ阻害剤は、PTCH1へのHhの結合を阻害する抗PTCH1抗体を含む（例えば、Nakamura et al.（2007）Anticancer Research 27:3743-3748参照）。
一部の態様では、1つまたは複数のヘッジホッグ活性化剤はSMO活性化剤を含む。一部の態様では、SMO活性化剤は、SAG（Hh-Ag1.3）またはプルモルファミンである。
ヘッジホッグ阻害剤およびヘッジホッグ活性化剤は、当技術分野で公知の方法を用いて、例えばGli1およびPtch1のmRNAレベルを決定するためのRT-PCR法を用いて同定することができる（例えば、Nakamura et al.（2007）Anticancer Research 27:3743-3748参照）。Gli1およびPtch1は、Gli1トランス活性化の標的遺伝子であり、したがってHhシグナル伝達経路活性のマーカーとして使用することができる。例えば、Gli1およびPtch1の発現抑制はHhシグナル伝達経路活性の低下を示す。
一態様では、本発明によるヘッジホッグ阻害剤は、RT-PCRアッセイによって評価した場合、対照と比較してヘッジホッグシグナル伝達経路の活性を10％超、30％超、60％超、80％超、90％超、95％超、または99％超低下させる。阻害を測定するためのRT-PCRアッセイの例は、上述したように当技術分野において周知である。
一態様では、本発明によるヘッジホッグ活性化剤は、RT-PCRアッセイによって評価した場合、対照と比較してヘッジホッグシグナル伝達経路の活性を10％超、30％超、60％超、80％超、90％超、95％超、または99％超上昇させる。活性化を測定するためのRT-PCRアッセイの例は、上述したように当技術分野において周知である。
一部の態様では、ヘッジホッグ阻害剤は、0.01～200μM、0.01～100μM、0.05～100μM、0.1～50μM、0.1～20μM、1～100μM、1～50μM、1～30μM、1～10μM、5～100μM、5～50μMまたは5～20μMの濃度で使用される。一部の態様では、ヘッジホッグ阻害剤（例えばビスモゲニブ）は約5μMの濃度で存在する。
一部の態様では、ヘッジホッグ活性化剤は、0.01～200μM、0.01～100μM、0.05～100μM、0.1～50μM、0.1～20μM、1～100μM、1～50μM、1～30μM、1～10μM、5～100μM、5～50μMまたは5～20μMの濃度で使用される。一部の態様では、ヘッジホッグ活性化剤（例えばSAG（Hh-Ag1.3）またはプルモルファミン）は約5μMの濃度で存在する。
一部の態様では、本発明の分化培地は、2つ、3つ、4つまたはそれ以上のヘッジホッグ阻害剤を含む。
一部の態様では、本発明の分化培地は、2つ、3つ、4つまたはそれ以上のヘッジホッグ活性化剤を含む。
一部の態様では、分化培地はヘッジホッグ阻害剤を含まない。
mTORシグナル伝達のモジュレータ
本発明者らは、驚くべきことに、mTORシグナル伝達のモジュレータを含めることがEECサブタイプの相対比に影響を及ぼし得ることを見出した（例えばmTOR活性化剤は、GLUを発現するEECへの分化を促進し得る）。一部の態様では、本発明の分化培地は、mTORシグナル伝達の1つまたは複数のモジュレータをさらに含む。一部の態様では、mTORシグナル伝達の1つまたは複数のモジュレータは、mTORシグナル伝達の阻害剤を含む。1つまたは複数のmTOR阻害剤は、細胞内のmTORシグナル伝達を減少させる任意の適切な阻害剤であり得る。一部の態様では、mTORシグナル伝達の1つまたは複数のモジュレータは、mTORシグナル伝達の活性化剤（例えばMHY1485）を含む。1つまたは複数のmTOR活性化剤は、細胞内のmTORシグナル伝達を増加させる任意の適切な活性化剤であり得る。
ラパマイシンの機構的標的（mTOR）は、2つの異なる複合体中に存在する非定型セリン/トレオニンキナーゼである。第一のmTOR複合体1（mTORC1）は、mTOR、Raptor、GβL、およびDEPTORから構成され、ラパマイシンによって阻害される。これは、成長因子、エネルギーレベル、細胞ストレス、およびアミノ酸を含む多様な栄養および環境合図を感知し、統合する主要な成長調節因子である。これは、mRNA翻訳および脂質合成などの同化過程を増強するか、またはオートファジーなどの異化過程を制限する基質をリン酸化することによってこれらのシグナルを細胞増殖の促進に結び付ける。そのGTP結合状態にある小型GTPアーゼRhebは、そのGAP、結節硬化症ヘテロ二量体TSC1/2によって負に調節される、mTORC1キナーゼ活性の必要で強力な刺激因子である。大部分の上流入力は、Rhebのヌクレオチド負荷状態を調節するAktおよびTSC1/2を介して送られる。対照的に、アミノ酸は、PI3K/Akt軸とは無関係にmTORC1にシグナルを送ってmTORC1のリソソーム表面への移行を促進し、そこでRhebと接触すると、活性化することができる。この工程は、複数の複合体、特にv-ATPアーゼ、Ragulator、Rag GTPアーゼ、およびGATOR1/2の協調作用によって媒介される。第二の複合体であるmTOR複合体2（mTORC2）は、mTOR、Rictor、GβL、Sin1、PRR5/Protor-1、およびDEPTORで構成される。mTORC2は、Aktを活性化することによって細胞生存を促進し、PKCαを活性化することによって細胞骨格動態を調節し、SGK1リン酸化を介してイオン輸送および増殖を制御する。
一部の態様では、mTORシグナル伝達の活性化剤はMHY1485である。
一部の態様では、mTORシグナル伝達の阻害剤は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体（例えばラパマイシン、デフォロリムス（AP23573）、エベロリムス（RAD001）、およびテムシロリムス（CCI-779））である。一部の態様では、mTORシグナル伝達の阻害剤は、ATP競合mTORキナーゼ阻害剤（例えばMLN0128、pp242またはAZD8055）である。
mTOR阻害剤およびmTOR活性化剤は、当技術分野で公知の方法を用いて、例えばELISAベースのmTORキナーゼアッセイを用いて（例えば、ATPの存在下でのp70S6K-GST融合タンパク質（特異的mTOR基質）のリン酸化を検出するためのELISAベースの活性アッセイであるK-LISA（商標）mTOR活性キットを使用して）同定することができる。
一態様では、本発明によるmTOR阻害剤は、ELISAベースのアッセイによって評価した場合、対照と比較してmTORシグナル伝達経路の活性を10％超、30％超、60％超、80％超、90％超、95％超、または99％超低下させる。阻害を測定するためのELISAベースのアッセイの例は、上述したように当技術分野において周知である。
一態様では、本発明によるmTOR活性化剤は、ELISAベースのアッセイによって評価した場合、対照と比較してmTORシグナル伝達経路の活性を10％超、30％超、60％超、80％超、90％超、95％超、または99％超上昇させる。活性化を測定するためのELISAベースのアッセイの例は、上述したように当技術分野において周知である。
一部の態様では、mTOR阻害剤は、0.01～200μM、0.01～100μM、0.05～100μM、0.1～50μM、0.1～20μM、1～100μM、1～50μM、1～30μM、1～10μM、5～100μM、5～50μMまたは5～20μMの濃度で使用される。一部の態様では、mTOR阻害剤（例えばラパマイシン、デフォロリムス（AP23573）、エベロリムス（RAD001）、およびテムシロリムス（CCI-779））は、約5μMの濃度で存在する。
一部の態様では、mTOR活性化剤は、0.01～200μM、0.01～100μM、0.05～100μM、0.1～50μM、0.1～20μM、1～100μM、1～50μM、1～30μM、1～10μM、5～100μM、5～50μMまたは5～20μMの濃度で使用される。一部の態様では、mTOR活性化剤（例えばMHY1485）は、約5μMの濃度で存在する。
一部の態様では、本発明の分化培地は、2つ、3つ、4つまたはそれ以上のmTOR阻害剤を含む。
一部の態様では、本発明の分化培地は、2つ、3つ、4つまたはそれ以上のmTOR活性化剤を含む。
GSK-3阻害剤
GSK-3阻害剤（例えば、CHIR99021）を含めることも上皮幹細胞の分化を改善することも以前に見出されている（GB 1603569.3参照）。上記で説明したように、GSK-3はβ-カテニン分解複合体の成分である。GSK-3活性を阻害するとβ-カテニンの分解の減少をもたらすので、GSK-3阻害剤はWntアゴニストである。GSK-3阻害剤を分化培地に含めることによって誘発される増強された分化は、分解複合体の下流でTCF/LEF媒介転写を阻害するWnt阻害剤（iCRT3）の添加によって大きく増加した。例えば、Wntアゴニスト（CHIR99021）およびWnt阻害剤（iCRT3）の両方が肝前駆細胞用の分化培地中に含まれる場合、肝細胞マーカー（アルブミンおよびCyp3A4）の発現に顕著な改善が生じた。いかなる理論にも拘束されることを望むものではいが、本発明者らは、GSK-3阻害剤が上皮幹細胞における分化の刺激と阻害の両方を行うことができた（刺激が阻害よりも強い）と考える。GSK-3阻害剤による分化の阻害は、β-カテニン分解の促進によって起こると考えられる。対照的に、GSK-3阻害剤による分化の促進は、別個のエフェクター機構によって起こると考えられる。したがって、GSK-3阻害剤が分化培地に含まれている場合、Wnt阻害剤は、GSK-3阻害剤を含有する分化培地中、分解複合体の下流でTCF/LEF媒介転写を阻害し、GSK-3阻害剤の分化阻害作用に対抗するWnt阻害剤であるはずである。分解複合体の下流で作用するWnt阻害剤には、上記のクラス（7）のWnt阻害剤、すなわち、β-カテニン:TCF-4複合体を分解する阻害剤などのβ-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤（例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14またはFH535）およびヒストン脱アセチル化酵素SIRT1の阻害剤（例えばカンビノール）を含む、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤が含まれる。
したがって、GSK-3阻害剤の分化促進作用は影響を受けないままであり、Wnt阻害剤の分化促進作用によって増強される。
したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地はGSK-3阻害剤を含む。任意の適切なGSK-3阻害剤を使用し得る。GSK-3阻害剤は、GSK-3キナーゼ活性を低下させる作用物質であると定義される。
GSK-3の2つの異なるアイソフォームがヒトにおいて認められる（GSK-3αおよびGSK-3β）。これらのアイソフォームの一方または両方を阻害する阻害剤が公知である。したがって、いくつかの態様では、GSK-3阻害剤は、GSK-3αおよびGSK-3βを阻害する。いくつかの態様では、GSK-3阻害剤は、GSK-3αを阻害するが、GSK-3βは阻害しない。いくつかの態様では、GSK-3阻害剤は、GSK-3βを阻害するが、GSK-3αは阻害しない。
いくつかの態様では、分化培地は、複数のGSK-3阻害剤（例えば2つ、3つ、4つ、5つまたはそれより多くのGSK-3阻害剤）を含む。
いくつかの態様では、GSK-3阻害剤はCHIR99021である。
いくつかの態様では、GSK-3阻害剤は、細胞中のGSK-3活性を、同じ細胞型で評価した場合、当該分子の不在下での前記GSK-3活性のレベルと比較して、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは100％阻害するのに有効な量で培地に添加される。当業者に公知のように、GSK-3活性は、特定のGSK-3基質、例えばβ-カテニンのリン酸化をモニタすることによって測定できる（例えばCole et al.（2008）Methods Mol Biol.468:45-65参照）。したがって、新規GSK-3阻害剤は、当技術分野で公知のアッセイを用いて当業者によって容易に同定され得る。
いくつかの態様では、GSK-3阻害剤は、CHIR99201、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsの1つまたは複数から選択される。
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.001～500μM、0.01～150μM、0.1～100μM、1～100μM、0.5～50μM、1～50μM、1～20μMまたは1～5μMの濃度のGSK-3阻害剤を含む。
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.01～150μM、0.1～100μM、1～100μM、0.5～50μM、1～50μM、1～20μMまたは1～5μMの濃度のCHIR99021を含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、約3μMの濃度のCHIR99021を含む。
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、GSK-3阻害剤と、先に記載したβ-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤などの分解複合体の下流で作用するWnt阻害剤とを含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、GSK-3阻害剤およびβ-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤を含む。β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤には、β-カテニン:TCF-4複合体を分解する阻害剤などのβ-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤（例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654またはBC21）およびヒストン脱アセチル化酵素SIRT1の阻害剤（例えばカンビノール）が含まれる。
したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、GSK-3阻害剤（例えば0.001～500μM、0.01～150μM、0.1～100μM、0.5～50μM、1～20μMまたは1～5μMの濃度）およびβ-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤（例えば0.001～500μM、0.01～150μM、0.1～100μM、0.5～50μM、1～500μM、1～150μM、1～100μM、1～50μM、1～20μMまたは1～5μMの濃度）を含む。いくつかの態様では、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤は、β-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤である。
したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、CHIR99021（例えば0.01～150μM、0.1～100μM、0.5～50μM、1～20μMまたは1～5μMの濃度）およびiCRT3（例えば0.05～150μM、0.1～150μM、1～150μM、0.5～100μM、1～100μMまたは10～80μMの濃度）を含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、約3μMの濃度のCHIR99021および約50μMの濃度のiCRT3を含む。
いくつかの態様では、分化培地はGSK-3阻害剤を含まない。
CHIR99021アゴニスト
上記で説明したように、WntアゴニストCHIR99021を分化培地に含めると分化を促進することが以前に見出されている。したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、CHIR99021またはCHIR99021アゴニストを含む。CHIR99021アゴニストは、本明細書では、CHIR99021と1つまたは複数の生物学的活性を共有する作用物質であると定義される。
AP-1刺激剤
活性化タンパク質1（AP-1）複合体は、Fosタンパク質ファミリー、Jun、ATFおよびJDPファミリーに属するタンパク質からなるヘテロ二量体である転写因子である。この転写因子は、サイトカイン、増殖因子、ストレス、ならびに細菌感染およびウイルス感染を含む様々な刺激に応答して遺伝子発現を調節する。
ヒト肝臓オルガノイドが、初代肝細胞と比較してAP-1複合体の成分の発現低下を有することが以前に認められている。この所見に基づき、本発明者らは、AP-1複合体の形成を刺激することが、肝臓オルガノイド中の上皮幹細胞の肝細胞運命への分化を促進すると仮定した。本発明者らは、分化培地中にAP-1刺激剤、カルバコール（2-[(アミノカルボニル)オキシ]-N,N,N-トリメチルエタンアミニウムクロリド）を含めることが肝細胞マーカー（Cyp3A4およびアルブミンを含む）の発現を増加させることを見出した。
以前に試験されたAP-1刺激剤は、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストである。ムスカリン性アセチルコリン受容体の5つのサブタイプが存在する（M1-M5）。これらは、様々な細胞型（例えばニューロン）の細胞膜に認められるG-タンパク質共役受容体である。
AP-1刺激剤またはムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストはまた、肝臓以外の組織（例えば、腸、胃、膵臓、または肺）からの上皮幹細胞の分化を増強し得ると想定されている。
したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地はAP-1刺激剤を含む。いくつかの態様では、AP-1刺激剤はムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストである。任意の適切なムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストを使用し得る。いくつかの態様では、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストは、M3ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト（例えばアセチルコリン、ベタネコール、カルバコール、オキソトレモリンまたはピロカルピン）である。
いくつかの態様では、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストは、アセチルコリン、ベタネコール、カルバコール、オキソトレモリン、L-689,660（1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン,3-(6-クロロピラジニル)マレエート）、ピロカルピン、ムスカリン、McN-A 343（4-[[[(3-クロロフェニル)アミノ]カルボニル]オキシ]-N,N,N-トリメチル-2-ブチン-1-アミニウムクロリド）、77-LH-218-1（1-[3-(4-ブチル-1-ピペリジニル)プロピル]-3,4-ジヒドロ-2(1H)-キノリノン）およびメタコリンの1つまたは複数から選択される。
いくつかの態様では、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストはカルバコールである。
いくつかの態様では、AP-1刺激剤（例えばムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト）は、0.001～500μM、0.01～500μM、0.01～250μM、0.01～150μM、0.1～500μM、0.1～100μM、0.5～500μM、0.5～100μM、0.5～50μM、1～500μM、1～300μM、1～200μM、1～20μM、1～5μM、10～300μM、50～300μM、50～200μMまたは50～150μMの濃度で本発明の分化培地中に存在する。
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.001～500μM、0.001～300μM、0.01～500μM、0.01～300μM、0.1～500μM、0.1～300μM、1～500μM、10～500μM、100～500μM、1～300μM、10～300μM、50～300μM、50～200μMまたは50～150μMの濃度のカルバコールを含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は100μMの濃度のカルバコールを含む。
ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト
上記で説明したように、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト、すなわちカルバコールを分化培地に含めると分化を促進することが以前に見出されている。したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストをさらに含む。
任意の適切なムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストを使用し得る。いくつかの態様では、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストは、M3ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト（例えばアセチルコリン、ベタネコール、カルバコール、オキソトレモリンまたはピロカルピン）である。
いくつかの態様では、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストは、アセチルコリン、ベタネコール、カルバコール、オキソトレモリン、L-689,660（1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン,3-(6-クロロピラジニル)マレエート）、ピロカルピン、ムスカリン、McN-A 343（4-[[[(3-クロロフェニル)アミノ]カルボニル]オキシ]-N,N,N-トリメチル-2-ブチン-1-アミニウムクロリド）、77-LH-218-1（1-[3-(4-ブチル-1-ピペリジニル)プロピル]-3,4-ジヒドロ-2(1H)-キノリノン）およびメタコリンの1つまたは複数から選択される。
いくつかの態様では、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストはカルバコールである。
いくつかの態様では、AP-1刺激剤（例えばムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト）は、0.001～500μM、0.01～500μM、0.01～250μM、0.01～150μM、0.1～500μM、0.1～100μM、0.5～500μM、0.5～100μM、0.5～50μM、1～500μM、1～300μM、1～200μM、1～20μM、1～5μM、10～300μM、50～300μM、50～200μMまたは50～150μMの濃度で本発明の分化培地中に存在する。
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.001～500μM、0.001～300μM、0.01～500μM、0.01～300μM、0.1～500μM、0.1～300μM、1～500μM、10～500μM、100～500μM、1～300μM、10～300μM、50～300μM、50～200μMまたは50～150μMの濃度のカルバコールを含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は100μMの濃度のカルバコールを含む。
カルバコールアゴニスト
上記で説明したように、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト、すなわちカルバコールを分化培地に含めると分化を促進することが以前に見出されている。したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、カルバコールまたはカルバコールアゴニストをさらに含む。カルバコールアゴニストは、本明細書では、カルバコールと1つまたは複数の生物学的活性を共有する作用物質であると定義される。
cAMP経路活性化剤
一部の態様では、本発明の分化培地は、cAMP経路活性化剤をさらに含む。cAMP経路活性化剤は、細胞内のcAMPのレベルを増加させる任意の適切な活性化剤であり得る。 cAMP経路は、多くの種類のホルモンおよび神経伝達物質のGタンパク質共役受容体の活性化を含む。ホルモンまたは神経伝達物質がその膜結合受容体に結合すると、受容体の立体配座変化が誘発され、これがGタンパク質のαサブユニットの活性化をもたらす。活性化されたGサブユニットはアデニリルシクラーゼを刺激し、一方、非活性化Gサブユニットはアデニリルシクラーゼを阻害する。アデニリルシクラーゼの刺激は、細胞質ATPのcAMPへの変換を触媒し、したがって細胞内のcAMPのレベルを増加させる。したがって、cAMP経路活性化剤は、例えばアデニリルシクラーゼ活性化剤であり得る。 適切なアデニリルシクラーゼ活性化剤の例には、フォルスコリン、フォルスコリン類似体およびコレラ毒素が含まれる。一部の態様では、cAMP経路活性化剤はフォルスコリンである。一部の態様では、cAMP経路活性化剤はコレラ毒素ではない。一部の態様では、cAMP経路活性化剤は、cAMP類似体、例えば8-ブロモ-cAMPであり得る。8-ブロモ-cAMPは、ホスホジエステラーゼによる加水分解に対してcAMPよりも大きな耐性を有する細胞透過性cAMP類似体である。一部の態様では、cAMP経路活性化剤はNKH477（例えばカタログ番号Tocris 1603）である。
cAMP経路活性化剤は、当技術分野で公知の方法を用いて、例えばcAMPレベルを測定する競合的免疫測定法を用いて同定することができる。CatchPoint（登録商標）サイクリックAMP蛍光アッセイキット（Molecular Devices LLC）は、そのような免疫測定法を実施するための市販のキットの一例である。試料または標準品中のcAMPは、抗cAMP抗体上の結合部位についてホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識cAMPコンジュゲートと競合する。cAMPの不在下では、HRP-cAMPコンジュゲートの大部分が抗体に結合する。cAMPの濃度を増加させると、結合したコンジュゲートの量が競合的に減少し、したがって測定されるHRP活性が低下する。cAMP経路活性化剤は、対照と比較して、cAMPレベルの増加および測定されるHRP活性の減少をもたらす。
一部の態様では、cAMP経路活性化剤は、約10nM～約500μM、約10nM～約100μM、約1μM～約50μM、約1μM～約25μM、約5μM～約1000μM、約5μM～約500μM、約5μM～約100μM、約5μM～約50μM、約5μM～約25μM、約10μM～約1000μM、約10μM～約500μM、約10μM～約100μM、約10μM～約50μM、約10μM～約25μM、または約20μMの濃度で使用される。 一部の態様では、cAMP経路活性化剤は、少なくとも10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1μM、少なくとも2μM、少なくとも5μM、少なくとも10μM、少なくとも20μM、少なくとも30μM、少なくとも50μM、または少なくとも100μMの濃度で使用される。
選択される濃度は、使用されるcAMP経路活性化剤に依存し得、cAMP経路活性化剤の効力に応じて当業者によって決定され得る。例えば、NKH477は、一般に8-BR-cAMPおよびフォルスコリンよりも強力である。より強力なcAMP経路活性化剤は、同じ効果のためにより低濃度で使用することができる。
例えば、NKH477は、一部の態様では、約100nM～約10μMの濃度、または約100nM、約1μMまたは約10μMの濃度で使用することができる。8-BR-cAMPまたはフォルスコリンは、一部の態様では、約1μM～約100μMの濃度、または約1μM、約10μMまたは約100μMの濃度で使用することができる。
コレラ毒素は、一部の態様では、約1ng/ml～約500ng/ml、約10ng/ml～約100ng/ml、約50ng/ml～約100ng/ml、または約10ng/ml、約20ng/ml、約30ng/ml、約40ng/ml、約50ng/ml、約60ng/ml、約70ng/ml、約80ng/ml、約90ng/ml、約100ng/ml、約200ng/ml、約300ng/ml、約400ng/mlまたは約500ng/mlの濃度で使用することができる。
追加成分
本発明の分化培地には、好ましくは、B27、N-アセチルシステインおよびN2からなる群より選択される化合物の1つまたは複数（例えば1、2、3または全部）が添加される。したがって、いくつかの態様では、分化培地は、B27、N2およびN-アセチルシステインからなる群より選択される1つまたは複数の成分をさらに含む。例えば、いくつかの態様では、分化培地は、B27、N-アセチルシステインおよびN2をさらに含む。
B27（Invitrogen）、N-アセチルシステイン（Sigma）およびN2（Invitrogen）およびニコチンアミド（Sigma）は、細胞の増殖を制御し、DNAの安定性を助けると考えられる。
いくつかの態様では、N-アセチルシステインは、0.1～200mM、0.1～100mM、0.1～50mM、0.1～10mM、0.1～5mM、0.5～200mM、0.5～100mM、0.5～50mM、0.5～10mM、0.5～5mM、1～100mM、1～50mM、1～10mM、1～5mMの濃度で分化培地中に存在する。いくつかの態様では、N-アセチルシステインは、約1.25mMの濃度で分化培地中に存在する。
いくつかの態様では、B27添加物は、「ビタミンAを含まないB27添加物」（本明細書では「ビタミンAを含まないB27」または「B27 wo VitA」とも称される）であり、Invitrogen,Carlsbad,CA; www.invitrogen.com;現在はカタログ番号12587010から、およびPAA Laboratories GmbH,Pasching,Austria; www.paa.com;カタログ番号F01-002から入手可能である;Brewer et al. (1993) J Neurosci Res.,35（5）:567-76）。いくつかの態様では、B27添加物は、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリ-ヨードサイロニン（T3）、DL-αトコフェロール（ビタミンE）、アルブミン、インスリンおよびトランスフェリンから選択される成分の1つまたは複数を含むジェネリック製剤で置き換えることができる。
PAA Laboratories GmbHによって供給されるB27添加物は、数ある成分の中でも特に、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリ-ヨードサイロニン（T3）、DL-αトコフェロール（ビタミンE）、アルブミン、インスリンおよびトランスフェリンを含む、液体の50倍濃縮物として提供される。これらの成分のうちで、少なくともリノレン酸、レチノール、酢酸レチニルおよびトリ-ヨードサイロニン（T3）は、核内ホルモン受容体アゴニストである。B27添加物は、濃縮物としてまたは分化培地への添加前に希釈して、分化培地に添加され得る。B27添加物は、1x最終濃度または他の最終濃度（例えば0.1x～4x濃度、0.1x～2x濃度、0.5x～2x濃度、1x～4x濃度または1x～2x濃度）で使用され得る。B27添加物の使用は、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、レチノール、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリ-ヨードサイロニン（T3）、DL-αトコフェロール（ビタミンE）、アルブミン、インスリンおよびトランスフェリンを本発明の分化培地に組み込むための好都合な方法である。これらの成分の一部または全部を、B27添加物を使用する代わりに分化培地に別々に添加し得ることも想定される。したがって、分化培地は、これらの成分のいくつかまたは全部を含み得る。
いくつかの態様では、レチノイン酸は、分化培地に使用されるB27添加物には存在しないおよび/または分化培地には存在しない。
「N2添加物」（本明細書では「N2」とも称される）は、Invitrogen,Carlsbad,CA;www.invitrogen.com;カタログ番号17502-048;およびPAA Laboratories GmbH,Pasching,Austria;www.paa.com;カタログ番号F005-004から入手可能である;Bottenstein＆Sato,PNAS,76（1）:514-517,1979。PAA Laboratories GmbHによって供給されるN2添加物は、500μg/mlのヒトトランスフェリン、500μg/mlのウシインスリン、0.63μg/mlのプロゲステロン、1611μg/mlのプトレシンおよび0.52μg/mlの亜セレン酸ナトリウムを含む、100倍の液体濃縮物として提供される。N2添加物は、濃縮物としてまたは分化培地への添加前に希釈して、分化培地に添加され得る。B27添加物は、1x最終濃度または他の最終濃度（例えば0.1x～4x濃度、0.1x～2x濃度、0.5x～2x濃度、1x～4x濃度または1x～2x濃度）で使用され得る。N2添加物の使用は、トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシンおよび亜セレン酸ナトリウムを本発明の分化培地に組み込むための好都合な方法である。言うまでもなく、これらの成分の一部または全部を、N2添加物を使用する代わりに分化培地に別々に添加し得ることも想定される。したがって、分化培地は、これらの成分のいくつかまたは全部を含み得る。
培地がB27を含むいくつかの態様では、培地はN2を同時には含まない。したがって、本発明の態様は、所望する場合、B27が存在する場合はN2を排除するように適合させることができる。
いくつかの態様では、N2は分化培地中に存在しない。
培地がN2を含むいくつかの態様では、培地はB27を同時には含まない。したがって、本発明の態様は、所望する場合、N2が存在する場合はB27を排除するように適合させることができる。
いくつかの態様では、B27は分化培地中に存在しない。
いくつかの態様では、分化培地はB27および/またはN2を添加される。
いくつかの態様では、基礎培地は150ng/ml～250ng/mlのN-アセチルシステインを添加され、好ましくは、基礎培地は約200ng/mlのN-アセチルシステインを添加される。
任意の適切なpHを使用し得る。例えば、培地のpHは、約7.0～7.8の範囲、約7.2～7.6の範囲、または約7.4であり得る。pHは、緩衝液を用いて維持し得る。適切な緩衝液は、当業者によって容易に選択され得る。使用し得る緩衝液には、炭酸緩衝液（例えばNaHCO3）およびリン酸緩衝液（例えばNaH2PO4）が含まれる。これらの緩衝液は、一般に約50～約500mg/lで使用される。N-[2-ヒドロキシエチル]-ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸]（HEPES）および3-[N-モルホリノ]-プロパンスルホン酸（MOPS）などの他の緩衝液も、通常約1000～約10,000mg/lで使用し得る。いくつかの態様では、緩衝液は、リン酸緩衝液（例えばKH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4、NaCl、NaH2PO4）、酢酸緩衝液（例えばHOAcもしくはNaOAc）、クエン酸緩衝液（例えばクエン酸もしくはクエン酸Na）、またはTRIS緩衝液（例えばTRIS、TRIS-HCl）または有機緩衝液の1つまたは複数から選択される。いくつかの態様では、有機緩衝液は、グッド緩衝液などの両性イオン緩衝液であり、例えばHEPES、MOPS、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、コラミンクロリド、BES、TES、DIPSO、アセトアミドグリシン、TAPSO、POPSO、HEPPSO、HEPPS、トリシン、グリシンアミド、ビシン、TAPS、AMPSO、CABS、CHES、CAPSおよびCAPSOから選択される。好ましい緩衝液は、例えば0.1～100mM、0.1～50mM、0.5～50mM、1～50mM、1～20mMまたは5～15mMの濃度のHEPESである。いくつかの態様では、HEPESは、約10mMで培養培地に添加される。分化培地はまた、培地のpH状態を容易にモニタできるように（例えば約5～約50mg/リットルで）、フェノールレッドなどのpH指示薬も含み得る。
本発明で使用するための分化培地は、1つまたは複数のアミノ酸を含み得る。当業者は、分化培地における使用のためのアミノ酸の適切な種類および量を理解する。存在し得るアミノ酸には、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-シスチン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリンおよびそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの分化培地は、これらのアミノ酸の全てを含む。一般に、存在する場合各々のアミノ酸は、約0.05～約1g/L培地（通常約0.1～約0.75g/L）で存在するL-グルタミンを除き、約0.001～約1g/L培地（通常約0.01～約0.15g/L）で存在する。アミノ酸は合成起源のものであってもよい。
本発明で使用するための分化培地は、1つまたは複数のビタミンを含み得る。当業者は、分化培地における使用のためのビタミンの適切な種類および量を理解する。存在し得るビタミンには、チアミン（ビタミンB1）、リボフラビン（ビタミンB2）、ナイアシン（ビタミンB3）、パントテン酸D-カルシウム（ビタミンB5）、ピリドキサール/ピリドキサミン/ピリドキシン（ビタミンB6）、葉酸（ビタミンB9）、シアノコバラミン（ビタミンB12）、アスコルビン酸（ビタミンC）、カルシフェロール（ビタミンD2）、DL-αトコフェロール（ビタミンE）、ビオチン（ビタミンH）およびメナジオン（ビタミンK）が含まれる。
本発明で使用するための分化培地は、1つまたは複数の無機塩を含み得る。当業者は、分化培地における使用のための無機塩の適切な種類および量を理解する。無機塩は、典型的には、細胞の浸透圧バランスの維持を助け、膜電位を調節するのを助けるために分化培地に含まれる。存在し得る無機塩には、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛の塩が含まれる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩および重炭酸塩の形態で使用される。使用し得る具体的な塩には、CaCl2、CuSO4-5H2O、Fe(NO3)-9H2O、FeSO4-7H2O、MgCl、MgSO4、KCl、NaHCO3、NaCl、Na2HPO4、Na2HPO4-H2OおよびZnSO4-7H2Oが含まれる。
培地の浸透圧モル濃度は、約200～約400mOsm/kgの範囲、約290～約350mOsm/kgの範囲、または約280～約310mOsm/kgの範囲であり得る。培地の浸透圧モル濃度は、約300mOsm/kg未満（例えば約280mOsm/kg）であり得る。
本発明で使用するための分化培地は、1つまたは複数の糖の形態の炭素エネルギー源を含み得る。当業者は、分化培地で使用するための糖の適切な種類および量を理解する。存在し得る糖には、グルコース、ガラクトース、マルトースおよびフルクトースが含まれる。糖は、好ましくはグルコース、特にD-グルコース（デキストロース）である。炭素エネルギー源は、通常、約1～約10g/Lで存在する。
本発明の分化培地は血清を含み得る。ウシ胎仔血清（FBS）、ヤギ血清またはヒト血清を含む、任意の適切な供給源から得られる血清を使用し得る。好ましくは、ヒト血清が使用される。血清は、従来技術に従って、培地の約1体積％～約30体積％で使用され得る。
他の態様では、本発明の分化培地は血清代替物を含み得る。様々な異なる血清代替物製剤が市販されており、当業者に公知である。血清代替物が使用される場合、従来の技術に従って、培地の約1体積％～約30体積％で使用され得る。
他の態様では、本発明の分化培地は、無血清および/または血清代替物不含であり得る。無血清培地は、いかなる種類の動物血清も含まない培地である。幹細胞の起こり得る異種成分混入を避けるために、無血清培地が好ましいと考えられる。血清代替物不含培地は、市販の血清代替物製剤が添加されていない培地である。
好ましい態様では、分化培地は、精製、天然、半合成および/または合成増殖因子が添加されており、ウシ胎仔血清などの未定義の成分を含まない。例えば、B27（Invitrogen）、N-アセチルシステイン（Sigma）およびN2（Invitrogen）などの添加物は、いくつかの細胞の増殖を刺激する。いくつかの態様では、分化培地は、これらの添加物の1つまたは複数、例えばこれらの添加物の1つ、任意の2つまたは3つ全部を添加される。
本発明で使用するための分化培地は、バリウム、臭素、コバルト、ヨウ素、マンガン、クロム、銅、ニッケル、セレン、バナジウム、チタン、ゲルマニウム、モリブデン、ケイ素、鉄、フッ素、銀、ルビジウム、スズ、ジルコニウム、カドミウム、亜鉛および/またはアルミニウムのイオンなどの1つまたは複数の微量元素を含み得る。
培地は、約0.1mMの濃度のβ-メルカプトエタノールなどの還元剤を含み得る。
本発明の分化培地は、幹細胞培養を改善することが以前に報告されている栄養素または成長因子、例えばコレステロール/トランスフェリン/アルブミン/インスリン/プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸塩/他の因子などの、1つまたは複数のさらなる作用物質を含み得る。
組成物および容器
本発明はまた、上記の本発明の局面のいずれか1つによる細胞および/またはオルガノイドを含む組成物または細胞培養容器、ならびに上記の本発明の局面のいずれか1つによる分化培地を提供する。例えば、そのような組成物または細胞培養容器は、上記の分化培地中に、本発明の方法に従って培養された任意の数の細胞またはオルガノイドを含み得る。
本発明のさらなる局面によれば、本発明の分化培地を含む密閉容器が提供される。密閉容器は、汚染を防止するために、分化培地の輸送または貯蔵のために好ましいと考えられる。容器は、フラスコ、プレート、ビン、広口ビン、バイアルまたはバッグなどの任意の適切な容器であり得る。
本発明の例示的な分化培地
一部の態様では、本発明の分化培地は、Wnt阻害剤、Notch阻害剤およびEGFR阻害剤を含む。一部の態様では、分化培地は基礎培地をさらに含む。
したがって、一部の態様では、本発明の分化培地は、Wnt阻害剤、Notch阻害剤およびEGFR阻害剤（例えばゲフィチニブ）を含む。例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、IWP-2（例えば約1.5μMの濃度）、DAPT（例えば約1mMの濃度）およびゲフィチニブ（例えば約5μMの濃度）を含む。
例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、Wnt阻害剤、Notch阻害剤、ならびにEGFRおよびErbB2阻害剤（例えばアファチニブ）を含む。例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、IWP-2（例えば約1.5μMの濃度）、DAPT（例えば約1mMの濃度）およびアファチニブ（例えば約10μMの濃度）を含む。
一部の態様では、本発明の分化培地は、Wnt阻害剤、Notch阻害剤およびRAS-RAF-MAPK経路阻害剤（例えばMEK阻害剤）を含む。
例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、IWP-2（例えば約1.5μMの濃度）、DAPT（例えば約1mMの濃度）、およびPD0325901などのMEK阻害剤（例えば約1.5μMの濃度）を含む。
例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、IWP-2（例えば約1.5μMの濃度）、DAPT（例えば約1mMの濃度）、およびSCH772984などのERK阻害剤（例えば約10μMの濃度）を含む。
一部の態様では、本発明の分化培地は、BMP経路活性化剤（例えばBMP4）をさらに含む。上記で論じたように、本発明者らは、驚くべきことに、BMP経路活性化剤を含めることがセクレチン産生細胞の分化を促進し、エンテロクロマフィン細胞の分化を阻害し得ることを見出した。他の態様では、本発明の分化培地は、BMP阻害剤（例えばノギン）をさらに含む。上記で論じたように、本発明者らは、驚くべきことに、BMP阻害剤を含めることがGLP-1産生細胞の分化を促進し、セクレチン産生細胞の分化を阻害し得ることを見出した。
したがって、一部の態様では、本発明の分化培地は、Wnt阻害剤（例えばIWP2）、Notch阻害剤（例えばDAPT）、EGFR阻害剤（例えばゲフィチニブ）およびBMP経路活性化剤（例えばBMP4）を含む。例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、IWP-2（例えば約1.5μMの濃度）、DAPT（例えば約1mMの濃度）、ゲフィチニブ（例えば約5μMの濃度）およびBMP4（例えば約10μg/mlの濃度）を含む。例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、Wnt阻害剤、Notch阻害剤、EGFRおよびErbB2阻害剤（例えばアファチニブ）ならびにBMP経路活性化剤（例えばBMP4）を含む。例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、IWP-2（例えば約1.5μMの濃度）、DAPT（例えば約1mMの濃度）、アファチニブ（例えば約10μMの濃度）およびBMP4（例えば約10μg/mlの濃度）を含む。
一部の態様では、本発明の分化培地は、Wnt阻害剤、Notch阻害剤、RAS-RAF-MAPK経路阻害剤（例えばMEK阻害剤）およびBMP4などのBMP経路活性化剤（例えば約10μg/mlの濃度）を含む。例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、IWP-2（例えば約1.5μMの濃度）、DAPT（例えば約1mMの濃度）、PD0325901などのMEK阻害剤（例えば約1.5μMの濃度）およびBMP4などのBMP経路活性化剤（例えば約10μg/mlの濃度）を含む。例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、IWP-2（例えば約1.5μMの濃度）、DAPT（例えば約1mMの濃度）、SCH772984などのERK阻害剤（例えば約10μMの濃度）およびBMP4などのBMP経路活性化剤（例えば約10μg/mlの濃度）を含む。
一部の態様では、本発明の分化培地は、Wnt阻害剤（例えばIWP2）、Notch阻害剤（例えばDAPT）、EGFR阻害剤（例えばゲフィチニブ）およびBMP阻害剤（例えばノギン）を含む。例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、IWP-2（例えば約1.5μMの濃度）、DAPT（例えば約1mMの濃度）、ゲフィチニブ（例えば約5μMの濃度）およびノギン（例えば約100ng/mlの濃度）を含む。例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、Wnt阻害剤、Notch阻害剤、EGFRおよびErbB2阻害剤（例えばアファチニブ）ならびにBMP阻害剤（例えばノギン）を含む。例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、IWP-2（例えば約1.5μMの濃度）、DAPT（例えば約1mMの濃度）、アファチニブ（例えば約10μMの濃度）およびノギン（例えば約100ng/mlの濃度）を含む。
一部の態様では、本発明の分化培地は、Wnt阻害剤、Notch阻害剤、RAS-RAF-MAPK経路阻害剤（例えばMEK阻害剤）およびノギンなどのBMP阻害剤（例えば約100ng/mlの濃度）を含む。例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、IWP-2（例えば約1.5μMの濃度）、DAPT（例えば約1mMの濃度）、PD0325901などのMEK阻害剤（例えば約1.5μMの濃度）およびノギンなどのBMP阻害剤（例えば約100ng/mlの濃度）を含む。例えば、一部の態様では、本発明の分化培地は、IWP-2（例えば約1.5μMの濃度）、DAPT（例えば約1mMの濃度）、SCH772984などのERK阻害剤（例えば約10μMの濃度）およびノギンなどのBMP阻害剤（例えば約100ng/mlの濃度）を含む。
一部の態様では、本発明の分化培地は、MHY1485などのmTOR活性化剤（例えば約5μMの濃度）をさらに含む。
一部の態様では、本発明の分化培地は、SMO阻害剤などのヘッジホッグ阻害剤（例えば約5μMの濃度）をさらに含む。一部の態様では、SMO阻害剤はビスモゲニブである。
好ましい態様では、分化培地はR-スポンジン（例えば約1μg/mlの濃度）をさらに含む。
好ましい態様では、培地中のEGFの濃度は1mM未満である。
細胞外マトリックス
いくつかの態様では、細胞を分化させるための方法は、細胞を細胞外マトリックス（ECM）と接触させて培養する工程を含む。任意の適切なECMを使用し得る。細胞は、好ましくは、前記細胞が天然に存在する細胞のニッチを少なくとも部分的に模倣する微小環境下で培養される。細胞のニッチは、一部には、細胞によっておよび前記ニッチ内の細胞によって分泌されるECMによって決定される。細胞のニッチは、インテグリンなどの細胞膜タンパク質との相互作用を提供する生体材料または合成材料の存在下で前記細胞を培養することによって模倣され得る。したがって、本明細書に記載のECMは、例えばインテグリンなどの細胞膜タンパク質と相互作用することによって、インビボでの細胞のニッチを模倣する任意の生体材料または合成材料またはそれらの組み合わせである。
本発明の好ましい方法では、細胞をECMと接触させて培養する。「接触して」とは、物理的または機械的または化学的接触を意味し、これは、得られたオルガノイドまたは上皮細胞の集団を前記細胞外マトリックスから分離するために力を使用する必要があることを意味する。いくつかの態様では、ECMは三次元マトリックスである。いくつかの態様では、細胞はECMに埋め込まれる。いくつかの態様では、細胞はECMに付着する。本発明の培養培地は、三次元ECM中に拡散し得る。
別の態様では、ECMは懸濁状態であり、すなわち細胞は懸濁系においてECMと接触している。いくつかの態様では、ECMは、少なくとも1％、少なくとも2％または少なくとも3％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの態様では、ECMは、1％～約10％または1％～約5％の濃度で懸濁液中に存在する。懸濁方法は、洗練された方法の利点を有し得る。
1つの種類のECMは、上皮細胞、内皮細胞、壁内胚葉様細胞（例えばHayashi et al.（2004）Matrix Biology 23:47-62に記載されているEnglebreth-Holm-Swarm壁内胚葉様細胞）および結合組織細胞によって分泌される。このECMは、様々な多糖、水、エラスチンおよび糖タンパク質を含み、前記糖タンパク質は、コラーゲン、エンタクチン（ニドゲン）、フィブロネクチンおよびラミニンを含む。したがって、いくつかの態様では、本発明の方法における使用のためのECMは、多糖、エラスチンおよび糖タンパク質から選択される成分の1つまたは複数を含み、例えば糖タンパク質は、コラーゲン、エンタクチン（ニドゲン）、フィブロネクチンおよび/またはラミニンを含む。例えば、いくつかの態様では、コラーゲンがECMとして使用される。種々の種類の糖タンパク質および/または糖タンパク質の種々の組み合わせを含む種々の組成物を含む、種々の種類のECMが公知である。
ECMは、例えば上皮細胞、内皮細胞、壁内胚葉様細胞または線維芽細胞などのECM産生細胞を容器中で培養した後、これらの細胞を取り出し、単離された組織断片または単離された上皮細胞を添加することによって提供され得る。細胞外マトリックス産生細胞の例は、主にコラーゲンおよびプロテオグリカンを産生する軟骨細胞、主にIV型コラーゲン、ラミニン、間質プロコラーゲンおよびフィブロネクチンを産生する線維芽細胞、ならびに主にコラーゲン（I型、III型およびV型）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチンおよびテネイシン-Cを産生する結腸筋線維芽細胞である。これらは「天然に産生されるECM」である。天然に産生されるECMは、商業的に提供され得る。市販の細胞外マトリックスの例には、細胞外マトリックスタンパク質（Invitrogen）およびEngelbreth-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞からの基底膜調製物（例えばCultrex（登録商標）Basement Membrane Extract（Trevigen,Inc.）またはMatrigel（商標）（BD Biosciences））が含まれる。
したがって、いくつかの態様では、ECMは、天然に産生されるECMである。いくつかの態様では、ECMは、Matrigel（商標）（BD Biosciences）などのラミニン含有ECMである。いくつかの態様では、ECMは、ラミニン、エンタクチンおよびIV型コラーゲンを含むMatrigel（商標）（BD Biosciences）である。いくつかの態様では、ECMは、ラミニン、エンタクチン、IV型コラーゲンおよびヘパリン硫酸プロテオグリカンを含む（例えばCultrex（登録商標）Basement Membrane Extract Type 2（Trevigen,Inc.））。いくつかの態様では、ECMは、コラーゲンおよび/またはラミニンなどの少なくとも1つの糖タンパク質を含む。本発明の方法における使用のための好ましいECMは、コラーゲンおよびラミニンを含む。さらなる好ましいECMは、ラミニン、エンタクチンおよびIV型コラーゲンを含む。所望する場合は、天然に産生されるECMまたは合成ECM材料の混合物を使用し得る。
別の態様では、ECMは合成ECMであり得る。例えば、ProNectin（Sigma Z378666）などの合成ECMを使用し得る。さらなる例では、ECMは、プラスチック、例えばポリエステル、またはヒドロゲルであり得る。いくつかの態様では、合成マトリックスは、生体材料、例えばコラーゲンまたはラミニンなどの1つまたは複数の糖タンパク質で被覆され得る。
三次元ECMは、三次元上皮オルガノイドの培養を支援する。細胞外マトリックス材料は、通常、細胞が懸濁されている皿の底部の滴である。典型的には、マトリックスが37℃で固化すると、培地が添加されてECM中に拡散する。培地中の細胞は、その表面構造との相互作用、例えばインテグリンとの相互作用によってECMに固着する。
培地および/または細胞は、ECM上に配置され得る、ECM中に埋め込まれ得るまたはECMと混合され得る。
例えば、いくつかの態様では、単一細胞、細胞の集団または組織断片は、任意で増殖因子が低減されているおよび/またはフェノールレッドを含まない、Matrigel（商標）に埋め込まれる。
いくつかの態様では、培養培地はECMの上に配置される。次いで、必要に応じておよび必要なときに、培養培地を除去および補充することができる。いくつかの態様では、培養培地は、1、2、3、4、5、6または7日ごとに補充される。成分が培地に「添加される」または培地から「除去される」場合、これは、いくつかの態様では、培地自体がECMから取り出され、次いで、「添加される」成分を含む新しい培地または「除去される」成分が排除された新しい培地がECM上に配置されることを意味し得る。
培養のための前駆細胞および幹細胞、ならびに前記細胞の入手
本分化方法は前駆細胞に有用である。前駆細胞は、本明細書では、分化能を有する任意の細胞と定義される。したがって、「前駆細胞」という用語は、成体幹細胞、胚性幹細胞およびiPS細胞を含むがこれらに限定されるわけではない幹細胞を包含する。前駆細胞は、例えば初代幹細胞または増殖幹細胞または部分分化幹細胞であり得る。いくつかの態様では、前駆細胞は初代細胞であり、生きている組織から直接得られたことを意味する。他の態様では、前駆細胞は二次細胞、すなわち培養および/または継代された細胞である。いくつかの態様では、前駆細胞は増殖細胞である。「増殖された」という用語は、細胞が、分化よりも細胞の拡大（例えば増殖）を促進する培養培地においてインビトロで培養されたことを意味する。
好ましい態様では、前駆細胞は成体前駆細胞であり、すなわち成体組織に由来する。いくつかの態様では、成体前駆細胞は成体幹細胞（例えば成体上皮幹細胞）である。これに関連して、「成体」は、新生児または小児を含むが、胚または胎児は除外する。いくつかの態様では、前駆細胞は、胚性幹細胞または胚性幹細胞株、例えばヒト胚性幹細胞またはヒト胚性幹細胞株に由来しない。
好ましい態様では、前駆細胞は上皮前駆細胞である。例えば、好ましい態様では、前駆細胞は上皮組織、より好ましくは成体上皮組織に由来する。上皮組織には、肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、耳、膀胱または甲状腺が含まれる。したがって、いくつかの態様では、前駆細胞は、肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、耳、膀胱または甲状腺から得られる。いくつかの態様では、前駆細胞は、膵臓、胃、肺、または腸から得られる。好ましい態様では、前駆細胞は腸から得られる。
好ましい態様では、前駆細胞は哺乳動物細胞である。例えば、好ましい態様では、細胞は哺乳動物組織に由来する。例えば、いくつかの態様では、前駆細胞はヒト細胞である。いくつかの態様では、前駆細胞は、実験動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット）、コンパニオン動物（例えばイヌ、ネコ、ウマ）または家畜（例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）由来である。
初代細胞は、インビボ状況の最良の実験モデルである。本発明の好ましい態様では、前駆細胞は、初代前駆細胞（例えば初代上皮幹細胞）である（または初代前駆細胞からの細胞培養に由来する）。初代細胞培養物を継代して二次細胞培養物を形成することができる。がん細胞を除き、従来の二次上皮細胞培養物は寿命に限りがある。一定の数の集団倍加（例えば50～100世代）の後、細胞は老化の過程を経て分裂を停止する。二次培養物からの細胞は、不死化して連続細胞株になることができる。不死化は、自発的に起こり得るか、またはウイルスによってもしくは化学的に誘導され得る。不死化細胞株は形質転換細胞としても知られる。本発明の好ましい態様では、細胞は、不死化または形質転換なしで増殖および/または継代された、増殖された上皮幹細胞培養物、好ましくは増殖されたオルガノイドから得られる。いくつかの態様では、これらの増殖された上皮培養物またはオルガノイドは、（従来の細胞株とは異なり）遺伝的に不均一であり得る。したがって、いくつかの態様では、前駆細胞は、不死化細胞または形質転換細胞ではなく、または、不死化細胞株または形質転換細胞株に由来しない。
前駆細胞は、例えば国際公開公報第2010/090513号、国際公開公報第2012/014076号、国際公開公報第2012/168930号または国際公開公報第2015/173425号に記載されているような任意の適切な方法によって入手し得る。いくつかの態様では、細胞は、例えばDorell et al.,2008（Hepatology.2008 Oct; 48（4）:1282-91.Surface markers for the murine oval cell response. Dorrell C,Erker L,Lanxon-Cookson KM,Abraham SL,Victoroff T,Ro S,Canaday PS,Streeter PR,Grompe M）に記載されているように、コラゲナーゼ消化によって単離される。いくつかの態様では、組織生検材料に関してコラゲナーゼ消化が行われる。いくつかの態様では、本発明で使用する前駆細胞を得るためにコラゲナーゼおよびアキュターゼ消化が用いられる。
いくつかの態様では、前駆細胞は、Lgr5を発現する上皮幹細胞である。オルガノイドは、好ましくは、成体組織由来の細胞、好ましくは成体組織由来の上皮幹細胞、より好ましくはLgr5を発現する上皮幹細胞を用いて得られる。
最も好ましい態様では、前駆細胞は、Lgr5を発現する成体上皮幹細胞であるか、またはそれを含む。
いくつかの態様では、前駆細胞は正常細胞であり、細胞が正常な核型、遺伝子型および/または表現型を有することを意味する。代替的な態様では、前駆細胞は疾患細胞であり、それらが疾患核型、遺伝子型および/または表現型を有することを意味する。例えば、いくつかの態様では、前駆細胞はがん細胞である。したがって、例えば、上皮幹細胞はLgr5陽性がん幹細胞であり得ることが想定される。したがって、細胞は、必要に応じて、腫瘍から入手し得る。代替的な態様では、前駆細胞は病的前駆細胞、例えば細胞内病原体（例えば細菌、ウイルスまたは寄生生物）に感染した前駆細胞である。
例示的な方法
本発明は、前駆細胞を分化させるための方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載の分化培地中で細胞を培養する工程を含む。好ましい態様では、細胞を、本明細書に記載のようにECMと接触させて培養する。
本発明はまた、前駆細胞を培養するための方法を提供し、前記方法は、増殖培地中で細胞を培養し、その後本明細書に記載の分化培地中で細胞を培養する工程を含む。いくつかの態様では、細胞を、増殖工程および/または分化工程の間、本明細書に記載のようにECMと接触させて培養する。いくつかの態様では、分化培地中で細胞を培養する前に、例えば繰り返し洗浄することによってまたは細胞培養物を分割することによって、増殖培地を除去する。
本発明は、好ましくはオルガノイドを得るために、単一の上皮幹細胞、上皮幹細胞の集団、または単離された組織断片を培養するための方法を提供し、この方法は、
増殖した細胞集団を提供するために、上皮幹細胞、上皮幹細胞の集団または単離された組織断片を増殖培地中で培養する工程;
任意で、増殖した細胞集団の静止を誘導する（例えば1つまたは複数のEGFR経路阻害剤での処理によって）工程;および
増殖した細胞集団を分化培地中で培養する工程
を含む。
本発明はまた、単一の前駆細胞または前駆細胞の集団を分化させるための方法を提供し、この方法は、
前駆細胞または前駆細胞の集団を分化培地中で培養する工程
を含む。
分化培地は、本明細書に記載される任意の分化培地であり得る。例えば、一部の態様では、分化培地は、Wnt阻害剤（例えばIWP-2）、Notch阻害剤（例えばDAPT）およびEGFR経路阻害剤（例えばゲフィチニブ、アファチニブ、PD0325901およびSCH772984のうちの1つまたは複数）を含む。この分化培地は、EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法における使用に特に適する。EECに特徴的なマーカーには、Chga、Chgb、Tac1、Tph1、Gip、Fabp5、Ghrl、Pyy、Nts、Neurod1、Sst、Sct、コレシストキニン、グルカゴンおよび/またはプログルカゴンが含まれる。さらなるEEC細胞型およびそれらの特徴は、Grun et al.（2015）Nature 525:251-255に記載されている。後記の表2も参照のこと。したがって、一部の態様では、本発明の分化方法は、Chga、Chgb、Tac1、Tph1、Gip、Fabp5、Ghrl、Pyy、Nts、Neurod1、Sst、Sct、コレシストキニン、グルカゴンおよび/またはプログルカゴンから選択される1つまたは複数のマーカーを発現する細胞集団をもたらす。一部の態様では、本発明の方法によって得られたEECはセロトニンを発現する。
一部の態様では、分化培地は、Wnt阻害剤（例えばIWP-2）、Notch阻害剤（例えばDAPT）ならびにEGFR経路阻害剤（例えばゲフィチニブ、アファチニブ、PD0325901およびSCH772984のうちの1つまたは複数）ならびにBMP阻害剤（例えばノギンまたはLDN193189）を含む。 この分化培地は、GLP1分泌EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法における使用に特に適する。一部の態様では、この方法は、Tac1、GLP1およびChgから選択される1つまたは複数のマーカーに対して陽性、かつセクレチン、pyyおよびntsから選択される1つまたは複数のマーカーに対して陰性の細胞の集団をもたらす。一部の態様では、細胞の集団はセロトニンを発現する。
一部の態様では、分化培地は、Wnt阻害剤（例えばIWP-2）、Notch阻害剤（例えばDAPT）ならびにEGFR経路阻害剤（例えばゲフィチニブ、アファチニブ、PD0325901およびSCH772984のうちの1つまたは複数）ならびにBMP活性化剤（例えばBMP4）を含む。この分化培地は、セクレチン分泌EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法における使用に特に適する。一部の態様では、この方法は、Tac1、GLP1およびChgから選択される1つまたは複数のマーカーに対して陰性ならびにセクレチン、pyyおよびntsから選択される1つまたは複数のマーカーに対して陽性の細胞の集団をもたらす。一部の態様では、細胞の集団はセロトニンを発現する。
増殖培地は、上皮幹細胞または前駆細胞のための任意の適切な増殖培地、好ましくは上皮幹細胞のための適切な増殖培地（例えば国際公開公報第2010/090513号、国際公開公報第2012/014076号、国際公開公報第2012/168930号または国際公開公報第2015/173425号に記載されているような）であり得る。
一部の態様では、増殖培地は、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えばEGF、HGFおよび/またはFGF10）、ニコチンアミドならびに1つまたは複数のWntアゴニスト（例えばRスポンジン馴化培地および/またはWnt馴化培地）を含む。
一部の態様では、増殖培地は、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えばEGF、HGFおよび/またはFGF10）、1つまたは複数のWntアゴニスト（例えばRスポンジン馴化培地および/またはWnt馴化培地）ならびに1つまたは複数のTGF-β阻害剤（例えばA83-01）を含む。
一部の態様では、増殖培地は、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えばEGF、HGFおよび/またはFGF10）、ニコチンアミド、1つまたは複数のWntアゴニスト（例えばRスポンジン馴化培地および/またはWnt馴化培地）ならびに1つまたは複数のTGF-β阻害剤（例えばA83-01）を含む。
これらの態様のいずれかでは、増殖培地は、cAMP経路活性化剤（例えばフォルスコリン）、ガストリンおよび/またはBMP阻害剤（例えばノギン）をさらに含み得る。
例えば、一部の態様では（例えば腸についての好ましい態様では）、増殖培地は、（i）EGF（例えば約10～50ng/ml）;（ii）ノギン馴化培地（例えば約50～100ng/mlまたは約5％の最終容量）;（iii）Rスポンジン馴化培地（例えば約1μg/mlまたは約5％の最終容量）を含む。一部の態様では、増殖培地は、n-アセチルシステイン（例えば約1mM）および1×B27をさらに含む。
一部の態様では、増殖培地は、バルプロ酸（例えば約1mM）およびGSK-3阻害剤（例えば約3μM、例えば約3μMのCHIR99021）をさらに含む。有利には、バルプロ酸およびGSK-3阻害剤を含めることは、幹細胞を豊富に含む細胞集団をもたらすことが見出された。
ヒトオルガノイドのための好ましい増殖培地は、（i）EGF（例えば約10～50ng/ml）;（ii）ノギン馴化培地（例えば約50～100ng/mlまたは約5％の最終容量）;（iii）Rスポンジン馴化培地（例えば約1μg/mlまたは約5％の最終容量）;（iv）p38阻害剤（例えば約30μMの濃度のSB-203580）;（v）TGF-β阻害剤（例えば約500nMの濃度のA83-01）;および（vi）ニコチンアミド（例えば約10mMの濃度）を含む。
好ましくは、細胞を、分化の前に1つまたは複数（例えば少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、10、15、20または20超）のオルガノイドを生成するように増殖させる。
一部の態様では、細胞を最初に本明細書に記載の増殖培地で培養し、成功したオルガノイドが確立されれば、増殖培地を本明細書に記載の分化培地に置き換える。したがって、一部の態様では、1または複数の（例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の）継代後に、増殖培地を分化培地に置き換える。一部の態様では、継代を毎週実施する。一部の態様では、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の日数後に、増殖培地を分化培地に置き換える。好ましい態様では、増殖培地を5日またはそれ以上の日数後に分化培地に置き換える。
一部の態様では、分化の前に細胞の静止を誘導する。
一部の態様では、上皮幹細胞、上皮幹細胞の集団または単離された組織断片を分化の前に洗浄し、細胞外マトリックス（例えばMatrigel）中に播種する。一部の態様では、洗浄は基礎培地またはPBSを用いて実施する。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、この洗浄工程が、上皮幹細胞、上皮幹細胞の集団または単離された組織断片から幹細胞因子を除去するので分化に有利であると考える。
一部の態様では、上皮幹細胞、上皮幹細胞の集団または単離された組織断片を、本発明の分化培地での分化の前に、BMP阻害剤（例えばノギン）およびRスポンジンを含み、かつEGF、ニコチンアミド、TGFβ阻害剤またはWnt馴化培地を含まない分化培地中で培養する。一部の態様では、第一の分化培地中での培養は約1日間である。
当業者には明らかなように、本発明の好ましい培養方法は、フィーダー細胞を必要としないので有利である。フィーダー細胞層は、しばしば、幹細胞の培養を支援し、それらの分化を阻害するために使用される。フィーダー細胞層は、一般に、関心対象の細胞と共培養され、関心対象の細胞の増殖に適した表面を提供する細胞の単層である。フィーダー細胞層は、関心対象の細胞が増殖することができる環境を提供する。フィーダー細胞は、増殖を防止するために有糸分裂を不活性化されることが多い（例えば照射またはマイトマイシンCでの処理によって）。フィーダー細胞の使用は、細胞の継代を複雑にする（細胞を各継代でフィーダー細胞から分離しなければならず、各継代ごとに新たなフィーダー細胞が必要である）ので、望ましくない。フィーダー細胞の使用はまた、所望の細胞へのフィーダー細胞の混入をもたらすこともある。これは、いかなる医学的用途にとっても明らかに問題であり、研究状況においてさえも、細胞に対して行われた任意の実験の結果の分析を複雑にする。本明細書の他の箇所に記載されているように、本発明の培養培地は、フィーダー細胞と接触せずに細胞を培養するために使用できる、すなわち本発明の方法は、増殖が援助される細胞を支持するためにフィーダー細胞の層を必要としないので、特に有利である。
したがって、本発明の組成物はフィーダー細胞不含の組成物であり得る。組成物は、通常、組成物中の細胞がフィーダー細胞層の不在下で少なくとも1継代培養されていれば、フィーダー細胞不含であるとみなされる。本発明のフィーダー細胞不含の組成物は、通常、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、約1％未満のフィーダー細胞（組成物中の細胞の総数の％として表す）を含むか、または好ましくはフィーダー細胞を全く含まない。
さらなる態様では、本発明の分化培地中で前駆細胞を培養する工程を含む、分化した細胞の集団またはオルガノイドを得るための方法が提供される。好ましくは、この方法は、本明細書に記載の分化方法を用いて本発明の分化培地中で前駆細胞を培養する工程を含む。
いくつかの態様では、本発明の方法は、単一の上皮幹細胞からオルガノイド/分化した細胞の集団を得る工程を含む。別の態様では、本発明の方法は、上皮幹細胞の集団または上皮組織断片からオルガノイド/分化した細胞の集団を得る工程を含む。
特定の態様では、分化したオルガノイドを得るための方法が提供され、この方法は、好ましくは上皮前駆細胞をECM、好ましくは三次元ECMと接触させて、本発明の分化培地中で上皮前駆細胞（例えば、任意でLgr5を発現する、上皮幹細胞）を培養する工程を含む。
いくつかの態様では、本発明の方法は、前駆細胞を増殖培地中で一定の期間、例えば3日間～10週間、1～10週間、1～4週間または10日間～3週間にわたって培養する工程、次いで細胞を継代する工程（例えば、細胞を単一の細胞密度に解離させ、1つの容器当たり（例えば1ウェル当たり）1個の細胞の割合で1つまたは複数の細胞を播種する）、増殖培地を用いて細胞を一定の期間、例えば3日間～10週間、1～10週間、1～4週間または10日間～3週間にわたって増殖させ続ける工程、ならびに継代および増殖の工程を少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、少なくとも11回、少なくとも12回、少なくとも13回または少なくとも14回繰り返した後、細胞を分化させる工程を含む。
いくつかの態様では、本発明の方法は、分化培地中で前駆細胞を少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間培養する工程を含む。いくつかの態様では、この方法は、分化培地中で前駆細胞を約1～約20日間、約1～約10日間または約1～約5日間培養する工程を含む。
分化後、本発明の方法はさらに、1つまたは複数の分化した細胞または分化したオルガノイドを取得および/または単離する工程を含み得る。例えば、前駆細胞の培養後に、培養培地中で培養した1つもしくは複数の細胞および/または1つもしくは複数のオルガノイドを、その後の適用に使用するために培養培地から取り出すことが有用であり得る。当技術分野で公知の多数の物理的分離方法のいずれか1つを使用して、本発明の細胞を選択し、これらを他の細胞型と区別し得る。そのような物理的方法は、本発明の細胞によって特異的に発現されるマーカーに基づくFACSおよび様々な免疫親和性方法を含み得る。
一態様では、細胞は、例えばこれらのマーカーの1つに対する抗体を利用したFACSによって単離し得る。当業者には明らかなように、これは、蛍光標識抗体を介して、または一次抗体に結合特異性を有する蛍光標識二次抗体を介して達成され得る。適切な蛍光標識の例には、FITC、Alexa Fluor（登録商標）488、GFP、CFSE、CFDA-SE、DyLight 488、PE、PerCP、PE-Alexa Fluor（登録商標）700、PE-Cy5（TRI-COLOR（登録商標））、PE-Cy5.5、PI、PE-Alexa Fluor（登録商標）750およびPE-Cy7が含まれるが、これらに限定されるわけではない。このリストは単なる例として提供されるものであり、限定を意図しない。
あるいは、当技術分野で周知の分離方法である免疫親和性精製によって細胞を単離し得る。この方法は、精製カラムへの抗体の固定化に基づく。次いで、細胞試料をカラムに負荷し、適切な細胞を抗体に結合させ、したがってカラムに結合させる。洗浄工程後、固定化された抗体に選択的に結合する競合物質を用いて細胞をカラムから溶出させ、カラムから放出させる。
固定化された抗体を使用する免疫親和性精製が、精製された細胞集団を提供することは、当業者には明らかであろう。しかし、いくつかの態様では、他の同定可能なマーカーの1つまたは複数を用いてさらに1回の免疫親和性精製を実施することによって細胞集団をさらに精製し、単離されたクローンのアリコートを使用して他の関連する細胞内マーカーの発現を確認することが好ましいと考えられる。
同じ物理的分離方法を含む連続的な精製工程が必ずしも必要とされないことは、当業者には明らかであろう。
分化した細胞およびオルガノイド
本発明はさらに、分化したオルガノイドまたは1つもしくは複数の分化した細胞の集団を提供する。
分化したオルガノイドは、分化した上皮細胞型を含む三次元構造体である。分化したオルガノイドは、典型的には自己組織化しており、細胞が分化すると共にオルガノイド中の細胞の三次元配置が自発的に生じることを意味する。いくつかの態様では、分化したオルガノイドは、任意でLgr5を発現する、上皮幹細胞に由来する。
一態様では、本発明は、例えば、好ましくは前駆細胞を三次元ECMと接触させて、本発明の分化培地中で前駆細胞を培養する工程を含む、本発明の方法によって得ることのできるまたは得られる分化したオルガノイドまたは1つもしくは複数の分化した細胞の集団を提供する。
細胞の「集団」は、1より大きい任意の数の細胞であるが、好ましくは少なくとも10個の細胞、少なくとも50個の細胞、少なくとも100個の細胞、少なくとも500個の細胞、少なくとも1x103個の細胞、少なくとも1x104個の細胞、少なくとも1×105個の細胞、少なくとも1×106個の細胞、少なくとも1×107個の細胞、少なくとも1×108個の細胞、または少なくとも1×109個の細胞である。
本発明による分化したオルガノイドは、少なくとも10個の細胞、少なくとも50個の細胞、少なくとも100個の細胞、少なくとも500個の細胞、少なくとも1×103個の細胞、少なくとも1×104個の細胞、少なくとも1×105個の細胞、少なくとも1×106個の細胞、少なくとも1×107個の細胞またはそれより多くの細胞の集団を含み得る。いくつかの態様では、各々のオルガノイドは、約1×103個の細胞～5×103個の細胞を含み、一般に、10～20個のオルガノイドを、例えば24ウェルプレートの、1つのウェル中で一緒に成長させ得る。
本発明のオルガノイドは天然に存在する組織断片ではなく、および/または血管を含まないことは、当業者に明らかである。
本発明のオルガノイドは、例えば、上皮細胞型だけを含む（間葉細胞または他の構造細胞型を含まない）ため、天然に存在する組織とは区別される。したがって、いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは上皮細胞だけを含む。いくつかの態様では、分化したオルガノイドは非上皮細胞を含まない。例えば、特定の態様では、分化したオルガノイドは間葉細胞を含まない。
本明細書に記載の分化培地は、好ましくは、培養の少なくとも5日間、細胞の特異的分化を誘導または促進する。分化は、特定の組織系統、例えば本明細書で定義される腸内分泌系統に関連する特異的マーカーの存在を検出することによって測定し得る。分化は、組織系統、例えば本明細書で定義される腸内分泌系統に関連する特異的マーカーの存在を検出することによって測定し得る。マーカーの同一性に依存して、前記マーカーの発現は、本明細書で定義される分化培地での少なくとも5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16日間またはそれ以上の培養後に、RTPCRまたは免疫組織化学によって評価し得る。
「発現される」という用語は、細胞内のマーカーの存在を表すために使用される。発現されるとみなされるためには、マーカーが検出可能なレベルで存在しなければならない。「検出可能なレベル」とは、マーカーが、PCR、ブロッティングまたはFACS分析などの標準的な実験室方法の1つを使用して検出できることを意味する。遺伝子は、1個の細胞につき少なくとも約100コピーの細胞における発現レベルに対応する、30回のPCRサイクル後に発現が合理的に検出され得る場合、本発明の集団の細胞によって発現されるとみなされる。「発現する」および「発現」という用語は対応する意味を有する。この閾値より低い発現レベルでは、マーカーは発現されないとみなされる。本発明の細胞におけるマーカーの発現レベルと、例えば胚性幹細胞などの別の細胞における同じマーカーの発現レベルとの比較は、好ましくは、同じ種から単離された2つの細胞型を比較することによって実施され得る。好ましくは、この種は哺乳動物であり、より好ましくはこの種はヒトである。そのような比較は、好都合には、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）実験を用いて実施され得る。
本発明の分化したオルガノイドまたは本発明の分化した細胞の集団は、好ましくは、少なくとも50％の生存可能な細胞、より好ましくは少なくとも60％の生存可能な細胞、より好ましくは少なくとも70％の生存可能な細胞、より好ましくは少なくとも80％の生存可能な細胞、より好ましくは少なくとも90％の生存可能な細胞を含む。細胞の生存率は、FACSにおけるHoechst染色またはヨウ化プロピジウム染色を用いて評価し得る。生存可能な細胞は、好ましくは対応するインビボ機能または特徴を有する。例えば、生存可能な腸内分泌細胞は、好ましくは腸内分泌細胞の腸内分泌機能または特徴を有する。
好ましい態様では、オルガノイドは腸オルガノイドである。これは、オルガノイドが腸細胞に由来することを意味する。
好ましい態様では、本発明の分化細胞の集団は腸細胞に由来する。
本発明者らは、本発明の方法によって得られる腸オルガノイドでは、以前にGrun et al.（2015）Nature 525（7568）251-5に記載されている分化した腸オルガノイドにおけるよりもより大きな細胞の集団が腸内分泌細胞であるため、本発明の方法によって得られる腸オルガノイドは改善されているということを示した。
哺乳動物の胃腸管に認められる腸内分泌細胞型の一部を以下の表2に要約する。
（表２）哺乳動物の胃腸管の腸内分泌細胞
Figure 2022068302000012
Figure 2022068302000013
Figure 2022068302000014
EECに特徴的なマーカーには、Chga、Chgb、Tac1、Tph1、Gip、Fabp5、Ghrl、Pyy、Nts、Neurod1、Sst、Sct、コレシストキニン、グルカゴンおよび/またはプログルカゴンが含まれる。
さらなるEEC細胞型およびそれらの特徴は、Grun et al.（2015）Nature 525:251-255に記載されている。
一部の態様では、本発明の分化オルガノイドは、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％の細胞が腸内分泌細胞マーカー（例えばChga、Chgb、Tac1、Tph1、Gip、Fabp5、Ghrl、Pyy、Nts、Neurod1、Sst、Sct、コレシストキニン、グルカゴンおよび/またはプログルカゴン）を発現する分化腸オルガノイドである。一部の態様では、mRNA発現は、単一細胞RNA配列決定分析によって測定される。一部の態様では、本発明の分化オルガノイドは、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％の細胞が、特定の腸内分泌細胞型、特に表2に記載の細胞型に特徴的な腸内分泌細胞マーカーを発現する分化腸オルガノイドである。例えば、一部の態様では、特定の腸内分泌細胞型に特徴的な腸内分泌細胞マーカーは、Gcgおよび/またはGLP-1である。Gcgは、GLP-1が由来するプレプログルカゴンを発現する遺伝子である。他の態様では、特定の腸内分泌細胞型に特徴的な腸内分泌細胞マーカーはSctである。
一部の態様では、本発明の分化オルガノイドは、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％の細胞が、表2に列挙される生成物のうちの1つまたは複数（例えば2つ、3つ、4つまたはそれ以上）を発現する分化腸オルガノイドである。
一部の態様では、本発明の分化オルガノイドは、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満または1％未満の細胞が杯細胞またはパネート細胞マーカー（例えばLyz1、Defa6、Agr2、Gob5、Muc2、Ttf3および/またはDefa24）を発現する分化腸オルガノイドである。一部の態様では、mRNA発現は、単一細胞RNA配列決定分析によって測定される。
一部の態様では、本発明の分化オルガノイドは、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満または1％未満の細胞が腸細胞マーカー（例えばAldob、Apoa1および/またはAlpi）を発現する分化腸オルガノイドである。一部の態様では、mRNA発現は、単一細胞RNA配列決定分析によって測定される。
一部の態様では、本発明の分化オルガノイドは、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満または1％未満の細胞が刷子細胞マーカー（例えばDclk1および/またはTrpm5）を発現する分化腸オルガノイドである。一部の態様では、mRNA発現は、単一細胞RNA配列決定分析によって測定される。
いくつかの態様では、分化したオルガノイドは、中心管腔を備えた嚢胞構造を有する。いくつかの態様では、中心管腔は上皮単層によって取り囲まれている。
また、本発明の分化培地中の本発明の腸内分泌細胞の分化したオルガノイドまたは分化した集団も提供される。
一態様では、例えば本明細書に記載のような、分化培地中のオルガノイドが提供される。
一態様では、分化したオルガノイドは、本発明の方法を用いて培養中であり、したがって、細胞外マトリックスと接触しているオルガノイドである。好ましくは、分化したオルガノイドは非間充織細胞外マトリックスに埋め込まれている。
オルガノイドまたは前駆細胞の集団は、任意の哺乳動物組織に由来し得るが、好ましくはヒト由来である。いくつかの態様では、オルガノイドまたは前駆細胞の集団は、マウス、ウサギ、ラット、モルモットまたは他の非ヒト哺乳動物由来である。
（表３）分化した肝臓オルガノイドと初代肝組織との相違
Figure 2022068302000015
分化したオルガノイドの使用
本明細書に記載のオルガノイドおよびオルガノイドに由来する細胞の使用も同様に提供される。この項でオルガノイドに言及する場合、これらは本発明に従う分化したオルガノイドである。用途の多くが本発明の方法によって得られるおよび/または得ることのできる分化細胞の集団にも適用できることは、当業者に理解されるであろう。本発明の方法によって得られるおよび/または得ることのできる分化細胞の集団のそのような使用も提供される。
例えば、本発明は、創薬スクリーニング;毒性アッセイ;組織発生学、細胞系譜および分化経路の調査;各ホルモンの放出をもたらす化学的および/または神経シグナルを同定するための調査;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現試験;組織損傷および修復に関与する機構の調査;炎症性および感染性疾患の調査;発症機構の研究;または細胞形質転換の機構およびがんの病因の研究における、分化したオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞の使用を提供する。
本発明はまた、医療において使用するための、本発明のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を提供する。
本発明はまた、障害、状態または疾患を治療する際に使用するための、本発明のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を提供する。
本発明はまた、再生医療において使用するための本発明のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を提供し、例えばこの使用には、オルガノイドまたは細胞の患者への移植が含まれる。
本発明は、薬物スクリーニング、（薬物）標的検証、（薬物）標的発見、毒物学および毒性スクリーニング、個別化医療、再生医療における、ならびに/または疾患モデルなどのエクスビボ細胞/臓器モデルとしての、本発明のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞の使用を提供する。
本発明の培地および方法に従って培養された細胞およびオルガノイドは、インビボ状況を忠実に表すと考えられる。これは、正常組織から増殖した細胞の分化した集団およびオルガノイド、ならびに病的組織から増殖した細胞の分化した集団およびオルガノイドの両方に当てはまる。したがって、正常エクスビボ細胞/臓器モデルを提供するだけでなく、本発明のオルガノイドはエクスビボ疾患モデルとしても使用することができる。
本発明のオルガノイドはまた、病原体の培養にも使用することができ、したがって、エクスビボ感染モデルとして使用することができる。本発明のオルガノイドを使用して培養し得る病原体の例には、その動物宿主において疾患を引き起こすウイルス、細菌、プリオンまたは真菌が含まれる。したがって、本発明のオルガノイドは、感染状態を表す疾患モデルとして使用することができる。本発明のいくつかの態様では、オルガノイドは、ワクチンの開発および/または製造に使用することができる。
したがって、本発明のオルガノイドによって検討することができる疾患には、例えば、糖尿病（I型またはII型など）、嚢胞性線維症、がん腫、腺がん、腺腫、胃腸膵管系神経内分泌腫瘍、炎症性腸疾患（クローン病など）等を含むがこれらに限定されるわけではない、遺伝性疾患、代謝性疾患、病原性疾患、炎症性疾患等が含まれる。
従来から、細胞株およびより最近ではiPS細胞がエクスビボ細胞/臓器および/または疾患モデルとして使用されてきた（例えばRobinton et al.Nature 481,295,2012参照）。しかし、これらの方法には多くの課題と欠点がある。例えば、全ての患者から細胞株を得ることはできず（特定の生検材料だけが成功した細胞株になる）、したがって、個別化された診断および医療において細胞株を使用することができない。iPS細胞は、通常、細胞を特定の細胞運命に再プログラムするためにある程度の遺伝子操作を必要とする。あるいは、iPS細胞は、核型完全性に影響を及ぼす培養条件にさらされるため、培養時間を最小限に抑えなければならない（これはヒト胚性幹細胞の場合にも当てはまる）。これは、iPS細胞が、インビボ状況を正確に表すことはできないが、その代わりにインビボ細胞の挙動を模倣しようとする試みであることを意味する。細胞株およびiPS細胞はまた、遺伝的不安定性も抱える。
対照的に、本発明のオルガノイドは、インビボ状況を忠実に表す遺伝的に安定なプラットフォームを提供する。いくつかの態様では、本発明のオルガノイドは、対応するインビボ状況に存在する全ての分化した細胞型を含む。他の態様では、本発明のオルガノイドは、インビボで存在する全ての分化した細胞型を提供するためにさらに分化させ得る。したがって、本発明のオルガノイドは、様々な疾患および治療薬に対する機構的洞察を得るため、インビトロ薬物スクリーニングを実施するため、潜在的治療薬を評価するため、将来の新規（薬物）療法開発のための可能な標的（例えばタンパク質）を同定するため、ならびに/または細胞置換療法と組み合わせた遺伝子修復を探索するために使用することができる。
本発明のオルガノイドは、それらの遺伝的完全性または表現型特性を失うことなく、ならびに増殖能力を喪失することなく、凍結および解凍して、培養することができる。したがって、オルガノイドは容易に保存および輸送することができる。したがって、いくつかの態様では、本発明は凍結オルガノイドを提供する。
これらの理由から、本発明のオルガノイドまたは細胞の分化した集団は、薬物スクリーニング、標的検証、標的発見、毒物学および毒性スクリーニングならびに個別化医療のためのツールとなり得る。
したがって、さらなる局面では、本発明は、本発明によるオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞の、創薬スクリーニング、毒性アッセイまたは再生医療などの医療における使用を提供する。例えば、腸オルガノイドの任意の1つを、創薬スクリーニング、毒性アッセイまたは再生医療などの医療において使用し得る。
粘膜ワクチン
オルガノイドのさらなる重要な用途は、粘膜ワクチン接種の開発における使用である。粘膜ワクチンは、粘膜を介して投与されるワクチンである。これは、鼻、口または直腸などの任意の粘膜表面であり得る。粘膜ワクチンは、吸入器、スプレーまたは他の外部補助器具を介して投与することができる。これには、ワクチンの投与に医療スタッフが必要でないなどの、注射に比べていくつかの明確な利点があり、これは、例えば発展途上国において重要であり得る。
腸において、M細胞（または「ミクロフォールド細胞」）は、回腸の集合リンパ小節の濾胞関連上皮に見出される細胞である。M細胞は、生物および粒子を、腸内腔から上皮障壁を横切って免疫細胞に輸送し、したがって、粘膜免疫を刺激する上で重要である。それらは、エンドサイトーシスまたは食作用を介して小腸の内腔から抗原を取り込み、次いでそれを、トランスサイトーシスを介して、基底外側の独特のポケット様構造に位置する樹状細胞（抗原提示細胞）およびリンパ球（すなわちT細胞）に送達するユニークな能力を有する。M細胞は、腸内分泌細胞の一種である。上記に説明したとおり、本発明者らは、前駆細胞を腸内分泌細胞運命へと分化させる改善された方法を見出した。したがって、本発明の分化したオルガノイドは、M細胞などの腸内分泌細胞を豊富に含んでいる。
オルガノイドは、場合によっては、RANKリガンドで刺激されるとM細胞に発達することができる（例えば国際公開公報第2012/169830号の図49参照）。したがって、本発明のいくつかの態様では、分化培地はRANKリガンドをさらに含む。
粘膜ワクチンがM細胞を標的とする場合、粘膜ワクチンの効率は実質的に上昇し得る。したがって、本発明の分化した細胞集団またはオルガノイドは、M細胞が病原体または抗原を取り込み、それらを免疫系に提示する能力を試験するために使用することができる。したがって、いくつかの態様では、本発明は、薬物スクリーニング、例えばワクチン開発および/またはワクチン製造における本発明のオルガノイドの使用を提供する。例えば、いくつかの態様では、オルガノイドは、ウイルス、細菌、真菌または他の寄生生物感染、例えば（限定されることなく）、コレラ、RSウイルス（RSV）、ロタウイルスおよびHIVに対するワクチンの開発または製造のために使用し得る。特定の態様では、本発明は、粘膜ワクチン開発に使用するための、本発明の培養培地で分化したオルガノイドを提供する。
薬物スクリーニング
好ましくはハイスループットの目的のために、本発明の前記オルガノイドは、例えば96ウェルプレートまたは384ウェルプレートなどのマルチウェルプレートで培養される。前記オルガノイドに影響を及ぼす分子を同定するために、分子のライブラリが使用される。好ましいライブラリには、抗体断片ライブラリ、ペプチドファージディスプレイライブラリ、ペプチドライブラリ（例えばLOPAP（商標）、Sigma Aldrich）、脂質ライブラリ（BioMol）、合成化合物ライブラリ（例えばLOP AC（商標）、Sigma Aldrich）または天然化合物ライブラリ（Specs、TimTec）が含まれる。さらに、幹細胞の子孫において1つまたは複数の遺伝子の発現を誘導するまたは抑制する遺伝子ライブラリを使用することができる。これらの遺伝子ライブラリには、cDNAライブラリ、アンチセンスライブラリおよびsiRNAまたは他の非コードRNAライブラリが含まれる。細胞は、好ましくは、複数の濃度の試験作用物質に一定期間曝露される。曝露期間の終わりに、培養物を評価する。「影響を及ぼす」という用語は、増殖の減少または消失、形態変化および細胞死を含むがこれらに限定されるわけではない、細胞の任意の変化をカバーするために使用される。本発明の前記オルガノイドは、上皮がん細胞を特異的に標的とするが、本発明の前記オルガノイドは標的としない薬物を同定するためにも使用できる。
短期間（数日）で本発明の有用なオルガノイドが得られることは、特定の薬物に対する個々の患者の応答を試験し、応答性に従って治療を調整するためにオルガノイドが極めて有用であることを示す。オルガノイドが患者由来の生検材料から得られるいくつかの態様では、オルガノイドは、21日未満、例えば14日未満、13日未満、12日未満、11日未満、10日未満、9日未満、8日未満、7日未満（等）で培養される。
オルガノイドはまた、より広範囲の創薬目的（例えば、嚢胞性線維症またはコレラのための薬物のスクリーニングを記載する国際公開公報第2013/093812号参照）にも有用である。したがって、いくつかの態様では、本発明のオルガノイドは、嚢胞性線維症薬のスクリーニングに使用することができる。しかし、本発明のオルガノイドは、ヒト胃腸管の感染性、炎症性および新生物性病変および胃腸管の他の疾患、ならびに膵臓、胃、または肺などの本明細書記載の他の組織の感染性、炎症性および新生物性病変および他の疾患のための薬物スクリーニングツールとして広く適用できることが当業者に理解されるであろう。いくつかの態様では、本発明のオルガノイドは、がん薬剤のスクリーニングに使用することができる。
いくつかの態様では、本発明のオルガノイドは、化学物質、抗体、天然産物（植物抽出物）等のライブラリを、薬物、化粧品および/または予防薬としての使用の適切性に関して試験するために使用することができる。例えば、いくつかの態様では、がん患者由来の腫瘍細胞などの関心対象の患者からの細胞生検材料を、本発明の培養培地および方法を用いて培養し、次いで化学化合物または化学物質ライブラリで処理することができる。次に、どの化合物が患者の細胞を有効に改変、死滅および/または治療するかを決定することが可能である。これは、特定の薬物に対する特定の患者の応答性を試験することを可能にし、したがって、特定の患者に治療を適合させることを可能にする。したがって、これは個別化医療アプローチを可能にする。
このようにして薬物を同定するためにオルガノイドを使用することのさらなる利点は、どの薬物および化合物が健常組織に対して最小限の影響しか及ぼさないかを調べるために、正常なオルガノイド（健常組織に由来するオルガノイド）をスクリーニングすることも可能であることである。これにより、最小限のオフターゲット活性または望ましくない副作用を有する薬物のスクリーニングが可能になる。
このようにして、任意の数の疾患に対する薬物をスクリーニングすることができる。例えば、本発明のオルガノイドは、糖尿病、嚢胞性線維症、がん腫、腺がん、腺腫、胃腸膵管系神経内分泌腫瘍、炎症性腸疾患（クローン病など）等に対する薬物のスクリーニングに使用することができる。試験パラメータは、関心対象の疾患に依存する。例えば、抗がん剤をスクリーニングする場合、通常、がん細胞死が最終的な目的である。嚢胞性線維症については、薬物およびCFTRの刺激に応答したオルガノイドの拡大を測定することが関心対象である。他の態様では、関心対象の細胞またはオルガノイドに対するスクリーニングの化合物および薬物の作用を試験するために代謝または遺伝子発現を評価し得る。
したがって、本発明は、治療的または予防的な医薬薬物または化粧品をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、
分化した細胞集団またはオルガノイドを候補分子（または候補分子のライブラリ）と接触させる工程;
前記分化細胞集団またはオルガノイドを、任意の作用（例えば増殖の減少もしくは消失、形態学的変化および/もしくは細胞死などの、細胞における任意の変化）またはオルガノイドの変化（例えばオルガノイドの大きさもしくは運動性）について評価する工程;
前記作用を生じさせる候補分子を、薬物または化粧品の可能性を有するものとして同定する工程;ならびに任意で、
前記候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
を含む。
いくつかの態様では、本発明は、医薬薬物または化粧品を調製するための方法を提供し、この方法は、
分化した細胞集団またはオルガノイドを候補分子（または候補分子のライブラリ）と接触させる工程;
前記分化細胞集団またはオルガノイドを、任意の作用（例えば増殖の減少もしくは消失、形態学的変化および/もしくは細胞死などの、細胞における任意の変化）またはオルガノイドの変化（例えばオルガノイドの大きさもしくは運動性）について評価する工程;
前記作用を生じさせる候補分子を、薬物または化粧品の可能性を有するものとして同定する工程;ならびに任意で、
前記候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
を含む。
いくつかの態様では、スクリーニングのスループットを高めるためにコンピュータまたはロボット支援培養およびデータ収集方法が用いられる。いくつかの態様では、オルガノイドは患者の生検材料に由来する。いくつかの態様では、培養した分化細胞集団（例えばオルガノイド）に所望の作用を生じさせる候補分子を前記患者に投与する。
したがって、一局面では、患者を治療する方法であって、
（a）患者における関心対象の病的組織から生検材料を得る工程;
（b）生検材料を培養してオルガノイドを得る工程;
（c）本発明のスクリーニング方法を用いて適切な薬物をスクリーニングする工程;および
（d）工程（c）で得られた薬物により前記患者を治療する工程
を含む、方法が提供される。
いくつかの態様では、薬物または化粧品は、例えば、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患（クローン病など）、がん腫、腺腫、腺がん、結腸がん、糖尿病（I型またはII型など）、胃腸膵管系神経内分泌腫瘍等を含むがこれらに限定されるわけではない、遺伝性疾患、代謝性疾患、病原性疾患、炎症性疾患等の症状を治療する、予防するまたは改善するために使用される。
いくつかの態様では、本発明は、再生医療のための薬物をスクリーニングするための方法を提供する。
標的発見
いくつかの態様では、本発明のオルガノイドは標的発見のために使用することができる。健常組織または病的組織に由来するオルガノイドの細胞は、標的同定のために使用し得る。本発明のオルガノイドは、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患（クローン病など）、がん腫、腺腫、腺がん、結腸がん、糖尿病（I型またはII型など）、胃腸膵管系神経内分泌腫瘍等についての薬物標的の発見のために使用し得る。本発明の培地および方法に従って培養されたオルガノイドは、インビボ状況を忠実に表すと考えられる。この理由から、前記オルガノイドは、特定の疾患における新規（分子）標的を見出すためのツールとなり得る。
新たな薬物標的を探索するために、化合物（siRNAなど）のライブラリを用いて細胞に形質導入し、特定の遺伝子を不活性化し得る。いくつかの態様では、（大きな）遺伝子群の機能を阻害するために、siRNAを細胞に形質導入する。遺伝子群または特定の細胞機能の任意の機能的読み取りを用いて、標的が試験に適切であるかどうかを判定することができる。疾患特異的読み取りは、当技術分野で周知のアッセイを用いて決定することができる。例えば、がんに関与する遺伝子を試験するために細胞増殖をアッセイする。例えば、本明細書に記載のTopflashアッセイを用いて、siRNA阻害によって引き起こされるWnt活性の変化を検出し得る。増殖の減少または細胞死が起こる場合、対応するsiRNA関連遺伝子は、当技術分野で公知の方法によって同定することができる。これらの遺伝子は、これらの細胞の増殖を阻害するための可能性のある標的である。同定に際して、試験した細胞工程について同定された標的の特異性を、当技術分野で周知の方法によって決定する必要がある。これらの方法を用いて、新しい分子を、治療のための可能性のある薬物標的として同定することができる。
標的および薬物検証スクリーニング
病的および/または正常組織から得られた患者特異的オルガノイドは、ハイスループットスクリーニングで同定された分子の標的検証のために使用することができる。同じことが、ハイスループットスクリーニングにおいて可能性のある治療薬として同定された化合物の検証にも当てはまる。オルガノイド培養系で分化させた患者の初代材料の使用は、ハイスループット創薬細胞株試験からの偽陽性等を試験するのに有用であり得る。
いくつかの態様では、本発明のオルガノイドは、ハイスループットスクリーニングにおいて可能性のある薬物または化粧品として同定された化合物の検証に使用することができる。
病原体の培養
さらに、本発明のオルガノイドは、現在適切な組織培養または動物モデルが存在しないノロウイルスなどの病原体の培養に使用することができる。
再生医療および移植
本発明は、再生医療および/または移植におけるオルガノイドの使用を提供する。本発明はまた、動物またはヒトにオルガノイドを移植することを含む治療方法を提供する。
胃オルガノイド、腸オルガノイドまたは膵臓オルガノイドなどの本発明のオルガノイドは、再生医療において、例えば、腸管上皮の放射線後および/または手術後修復、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患に罹患している患者における腸上皮の修復、ならびに短腸症候群に罹患している患者における腸上皮の修復において有用である。小腸/結腸の遺伝性疾患の患者における腸上皮の修復において、さらなる使用が存在する。膵臓オルガノイドを含む培養物はまた、再生医療において、例えば膵臓またはその一部の切除後のインプラントとして、ならびにI型糖尿病およびII型糖尿病などの糖尿病の治療のためにも有用である。
代替的な態様では、オルガノイドまたはオルガノイドから単離された細胞は、例えば膵β細胞を含む膵臓細胞などの関連する組織運命に再プログラムし得る。本発明の培養方法は、密接に関連する前駆細胞を、膵β細胞を含む膵臓細胞または肝細胞に分化転換させる因子を分析することを可能にする。
遺伝子治療を、損傷した組織または病的組織の修復を目的とする方法において付加的に使用できることは当業者に明らかであろう。例えば、DNAおよび/またはRNAのような遺伝情報を幹細胞に送達するために、アデノウイルスまたはレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを使用することができる。当業者は、遺伝子治療において標的とされる特定の遺伝子を置換または修復することができる。例えば、機能していない遺伝子を置換するために、正常遺伝子をゲノム内の非特異的位置に挿入し得る。別の例では、異常な遺伝子配列を、相同組換えを介して正常な遺伝子配列に置き換えることができる。あるいは、選択的復帰突然変異は、遺伝子をその正常な機能に戻すことができる。さらなる例は、特定の遺伝子の調節（遺伝子がオンまたはオフになる程度）を変更することである。好ましくは、オルガノイドの細胞またはオルガノイドに由来する細胞は、遺伝子治療アプローチによってエクスビボで処理され、その後治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに移入される。
成体ドナーから採取された小さな生検材料は、明らかな制限または遺伝的悪影響を伴わずに増殖させることができるので、本発明の技術は、再生目的で移植可能な上皮を生成するのに役立ち得る。オルガノイドが、その3D構造および完全性を失うことなくならびに有意な細胞死を伴わずに凍結および解凍され、培養され得るという事実は、移植目的でのオルガノイドの適用性をさらに高める。さらに、いくつかの態様では、ECMに埋め込まれているまたはECMと接触しているオルガノイドを、哺乳動物、好ましくはヒトに移植することができる。別の態様では、オルガノイドとECMを同時に哺乳動物、好ましくはヒトに移植することができる。
当業者は、ECMが、本発明による細胞の増殖した集団またはオルガノイドを含む組織様構造体を得るための3D足場として使用できることを理解するであろう。次いで、そのような構造体を、当技術分野で周知の方法によって患者に移植することができる。ECM足場は、コラーゲンおよび/またはラミニンなどのECMタンパク質を用いて合成的に作製することができ、あるいは、単離された臓器または組織断片を、ECMからなる足場を残すように「脱細胞化する」ことによって得ることができる（例えばMacchiarini et al.The Lancet,Volume 372,Issue 9655,Pages 2023-2030,2008参照）。いくつかの態様では、ECM足場は、臓器または組織断片を脱細胞化することによって得ることができ、任意で、前記臓器または組織断片は腸、膵臓、肺、または胃由来である。
本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトへの移植に使用するための、本発明のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を提供する。また、本発明のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を、移植を必要とする患者に移植する工程を含む、前記患者を治療する方法が提供され、前記患者は哺乳動物、好ましくはヒトである。いくつかの態様では、オルガノイドを、前記患者に移植する前にさらに分化させる。
例えば、成体ドナーから採取され、増殖方法によって増殖され、その後本発明に従って分化された小さな生検材料。したがって、本明細書で提供される技術は、再生目的で移植可能な上皮を生成するのに役立ち得る。
本発明は、本発明の膵臓オルガノイドまたは本発明の膵臓オルガノイドからの細胞を患者に移植する工程を含む、患者における糖尿病などのインスリン欠乏障害または機能不全の膵臓を有する患者を治療する方法を提供する。
いくつかの態様では、細胞またはオルガノイドは、患者への移植時にはインスリンを発現または分泌しないが、インスリンを分泌するように患者の体内で分化する。例えば、インスリンを分泌する能力は、移植直後には検出可能でない場合があるが、移植後約1ヶ月、例えば移植後6週間、2ヶ月または3ヶ月までに存在し得る。
患者は、好ましくはヒトであるが、代替的にネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギまたはマウスなどの非ヒト哺乳動物であり得る。
したがって、細胞療法によるヒトまたは非ヒト動物患者の治療方法は本発明の範囲内に含まれる。そのような細胞療法は、任意の適切な手段を介して本発明の幹細胞またはオルガノイドを患者に適用することを包含する。具体的には、そのような治療方法は、損傷した組織の再生を含む。本発明に従って、患者を同種異系または自己由来の幹細胞またはオルガノイドで治療することができる。「自己由来」細胞は、例えば組織再生を可能にするために、それらが細胞療法のために再導入される同じ生物に由来する細胞である。しかし、細胞は、必ずしもそれらが導入される組織と同じ組織から単離されていない。自己由来細胞は、拒絶反応の問題を克服するための患者とのマッチングを必要としない。「同種異系」細胞は、同じ種であるが、例えば組織再生を可能にするために、細胞が細胞療法のために導入される個体とは異なる個体に由来する細胞である。拒絶反応の問題を防ぐために、ある程度の患者のマッチングが依然として必要であり得る。したがって、いくつかの態様では、移植は自己由来細胞を含む。いくつかの態様では、移植は同種異系細胞を含む。
一般に、本発明の細胞またはオルガノイドは、注射または移植によって患者の体内に導入される。一般に、細胞は、それらが作用することを意図されている組織に直接注射される。あるいは、細胞は門脈を介して注射される。本発明の細胞および薬学的に許容される担体を含有する注射器は、本発明の範囲内に含まれる。本発明の細胞および薬学的に許容される担体を含有する注射器に取り付けられたカテーテルは、本発明の範囲内に含まれる。
当業者は、移植される物質（すなわち、細胞の集団、細胞懸濁液中の単一細胞、オルガノイドまたはオルガノイドの断片）ならびに治療される臓器に依存して、適切な方法および投与経路を選択することができるであろう。
上記で論じたように、本発明のオルガノイドまたは細胞は、組織の再生に使用することができる。この機能を達成するために、損傷した組織に細胞を直接注射または移植することができ、細胞は、体内でのそれらの位置に応じて、増殖し、最終的に必要な細胞型に分化し得る。あるいは、オルガノイドを、損傷した組織に直接注射または移植することができる。治療に感受性の組織には、特に疾患、傷害、外傷、自己免疫反応によって、またはウイルスもしくは細菌感染によって損傷を受けた可能性があるものを含む、全ての損傷組織が含まれる。本発明のいくつかの態様では、本発明の細胞またはオルガノイドは、結腸、小腸、肺、膵臓、または胃系を再生するために使用される。
例えば、一態様では、本発明の細胞またはオルガノイドは、ハミルトンシリンジを用いて患者に注射される。
当業者は、治療される特定の状態について、本発明の細胞またはオルガノイドの適切な投与量がどのくらいであるかを認識するであろう。
一態様では、本発明のオルガノイドまたは細胞は、様々な組成物の溶液中、ミクロスフェア中または微粒子中のいずれかで、再生を必要とする組織または損傷した臓器の一部を灌流する動脈に投与される。一般に、そのような投与はカテーテルを用いて行われる。カテーテルは、血管形成術および/もしくは細胞送達のために使用される多種多様なバルーンカテーテルの1つ、または細胞を身体の特定の位置に送達する特定の目的のために設計されたカテーテルであり得る。特定の用途では、細胞またはオルガノイドは、多数の異なる生分解性化合物でできた直径約15μmのミクロスフェアに封入され得る。この方法は、血管内投与された細胞またはオルガノイドが損傷の部位に留まり、初回通過で毛細管ネットワークおよび全身循環に入らないようにし得る。毛細管ネットワークの動脈側での保持は、血管外空間への細胞またはオルガノイドの転移も促進し得る。
別の態様では、オルガノイドまたは細胞は、全身に送達するために静脈を介して、または細胞もしくはオルガノイドが差し向けられる組織または身体部分に流入する特定の静脈内に局所的に、血管樹に逆行的に注射され得る。この態様のために、上記の調製物の多くが使用され得る。
別の態様では、本発明の細胞またはオルガノイドは、生体適合性インプラントに接着した損傷組織に移植され得る。この態様では、細胞を、患者に移植する前にインビトロで生体適合性インプラントに接着させ得る。当業者には明らかなように、移植の前に、多くの接着剤のいずれか1つを使用して細胞をインプラントに接着させ得る。単なる例として、そのような接着剤には、フィブリン、インテグリンファミリーの1つまたは複数のメンバー、カドヘリンファミリーの1つまたは複数のメンバー、セレクチンファミリーの1つまたは複数のメンバー、1つまたは複数の細胞接着分子（CAM）、免疫グロブリンファミリーの1つまたは複数、および1つまたは複数の人工接着剤が含まれ得る。このリストは説明のためのみに提供されるものであり、限定することを意図しない。1つまたは複数の接着剤の任意の組み合わせを使用し得ることは、当業者には明らかであろう。
別の態様では、本発明のオルガノイドまたは細胞は、マトリックスを患者に移植する前に、マトリックスに埋め込まれ得る。一般に、マトリックスは患者の損傷組織に移植される。マトリックスの例には、コラーゲンベースのマトリックス、フィブリンベースのマトリックス、ラミニンベースのマトリックス、フィブロネクチンベースのマトリックスおよび人工マトリックスが含まれる。このリストは説明のためのみに提供されるものであり、限定することを意図しない。
さらなる態様では、本発明のオルガノイドまたは細胞は、マトリックス形成成分と共に患者に移植または注射され得る。これは、注射または移植後に細胞がマトリックスを形成することを可能にし、細胞またはオルガノイドが患者の体内の適切な位置に留まることを確実にし得る。マトリックス形成成分の例には、フィブリン糊液体アルキル、シアノアクリレートモノマー、可塑剤、デキストランなどの多糖、エチレンオキシド含有オリゴマー、ポロキサマーおよびPluronicなどのブロックコポリマー、TweenおよびTriton「8」などの非イオン性界面活性剤、ならびに人工マトリックス形成成分が含まれる。このリストは説明のためのみに提供されるものであり、限定することを意図しない。1つまたは複数のマトリックス形成成分の任意の組み合わせを使用し得ることは、当業者には明らかであろう。
さらなる態様では、本発明のオルガノイドまたは細胞は、ミクロスフェア内に含まれ得る。この態様内では、細胞はミクロスフェアの中心内に封入され得る。またこの態様内では、細胞は、ミクロスフェアのマトリックス材料に埋め込まれ得る。マトリックス材料は、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール（PLGA）およびポリウレタンを含むがこれらに限定されるわけではない任意の適切な生分解性ポリマーを含み得る。このリストは単なる例として提供されるものであり、限定を意図しない。
さらなる態様では、本発明の細胞またはオルガノイドは、移植を意図した医療装置に付着され得る。そのような医療装置の例には、ステント、ピン、ステッチ、スプリット、人工関節、人工皮膚およびロッドが含まれる。このリストは説明のためのみに提供されるものであり、限定することを意図しない。様々な方法によって細胞を医療装置に付着させ得ることは、当業者には明らかであろう。例えば、細胞またはオルガノイドは、フィブリン、インテグリンファミリーの1つまたは複数のメンバー、カドヘリンファミリーの1つまたは複数のメンバー、セレクチンファミリーの1つまたは複数のメンバー、1つまたは複数の細胞接着分子（CAM）、免疫グロブリンファミリーの1つまたは複数、および1つまたは複数の人工接着剤を用いて医療装置に付着させ得る。このリストは説明のためのみに提供されるものであり、限定することを意図しない。1つまたは複数の接着剤の任意の組み合わせを使用し得ることは、当業者には明らかであろう。
本発明の方法を用いて得られるオルガノイドまたは分化した細胞の集団は、様々な用途を有する。例えば、本発明は、創薬スクリーニング;毒性アッセイ;発生学、細胞系譜および分化経路の調査; 各ホルモンの放出をもたらす化学的および/または神経シグナルを同定するための調査;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現試験;損傷および修復に関与する機構の調査;炎症性および感染性疾患の調査;発症機構の研究;または細胞形質転換の機構およびがんの病因の研究における、本明細書記載のオルガノイドまたは分化細胞の集団の使用を提供する。
一局面では、本発明は、創薬スクリーニング、毒性アッセイまたは再生医療における本明細書記載のオルガノイドまたは分化細胞の集団の使用を提供する。同様に、本発明は、これらの用途のための本発明のオルガノイドの子孫の使用を提供する。
毒性アッセイは、オルガノイドまたはその一部またはオルガノイドに由来する細胞を用いるインビトロアッセイであり得る。そのような子孫およびオルガノイドは、例えば、毒性アッセイにおいて現在使用されているCaco-2（ATCC HTB-37）、I-407（ATCC CCL6）およびXBF（ATCC CRL 8808）などの上皮細胞株よりも培養が容易であり、初代上皮細胞により密接に類似する。オルガノイドを用いて得られる毒性結果は、患者で得られる結果により密接に類似すると予想される。細胞に基づく毒性試験は、臓器特異的細胞傷害性を測定するために使用される。前記試験において試験される化合物は、がんの化学予防剤、環境化学物質、栄養補助食品および潜在的な毒物を含む。細胞は、複数の濃度の試験作用物質に一定期間曝露される。アッセイにおける試験作用物質の濃度範囲は、5日間の曝露および最も高い可溶性濃度からの対数希釈を用いる予備アッセイにおいて決定される。曝露期間の終わりに、培養物を増殖の阻害について評価する。データを分析して、エンドポイントを50％阻害した濃度（TC50）を決定する。
例えば、本発明のこの局面によれば、候補化合物を本明細書に記載の細胞またはオルガノイドと接触させることができ、細胞に対する任意の変化または細胞の活性における変化をモニタし得る。
ハイスループットの目的のために、前記オルガノイドは、例えば96ウェルプレートまたは384ウェルプレートなどのマルチウェルプレートで培養される。前記オルガノイドに影響を及ぼす分子を同定するために、分子のライブラリが使用される。好ましいライブラリには、抗体断片ライブラリ、ペプチドファージディスプレイライブラリ、ペプチドライブラリ（例えばLOPAP（商標）、Sigma Aldrich）、脂質ライブラリ（BioMol）、合成化合物ライブラリ（例えばLOP AC（商標）、Sigma Aldrich）または天然化合物ライブラリ（Specs、TimTec）が含まれる。さらに、腺腫細胞の子孫において1つまたは複数の遺伝子の発現を誘導または抑制する遺伝子ライブラリを使用することができる。これらの遺伝子ライブラリには、cDNAライブラリ、アンチセンスライブラリおよびsiRNAまたは他の非コードRNAライブラリが含まれる。細胞は、好ましくは、複数の濃度の試験作用物質に一定期間曝露される。曝露期間の終わりに、培養物を評価する。「影響を及ぼす」という用語は、増殖の減少または消失、形態変化および細胞死を含むがこれらに限定されるわけではない、細胞の任意の変化をカバーするために使用される。前記オルガノイドは、上皮がん細胞を特異的に標的とするが、前記オルガノイドを標的としない薬物を同定するためにも使用することができる。
本発明によるオルガノイドは、さらに、創薬スクリーニングおよび潜在的な新規薬物または公知の薬物または公知もしくは新規の栄養補助食品の毒性アッセイにおいてCaco-2細胞などの細胞株の使用を置き換えることができる。
さらに、そのようなオルガノイドは、病原体の培養に使用することができる。
本発明はさらに、治療における使用のための本発明の分化したオルガノイドまたは本発明の分化した細胞の集団を提供する。また、本明細書に記載の疾患または状態を治療する際に使用するための、本発明の分化したオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞も提供される。
同様に、本発明の1つまたは複数のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を投与する工程を含む、本明細書に記載の疾患または状態を治療する方法が提供される。
本発明者らはまた、免疫不全マウスへのオルガノイドの移植に成功したことを実証しており（例えば国際公開公報第2012/014076号の実施例7参照）、移植された肝臓オルガノイド由来の細胞は、インビボで胆管細胞および肝細胞の両方を産生した。したがって、一態様では、本発明は、ヒトまたは動物に移植するための本発明のオルガノイドまたはオルガノイド由来の細胞を提供する。
本発明のオルガノイドの利点は、それらを凍結させ、後で機能を失うことなく解凍できることである。これにより、細胞バンキング、容易な保管、および急な使用のための迅速な入手が可能になる。これは、例えば、「既製の」製品、例えば肝臓の場合、急性肝毒性の治療に使用し得る製品の調製において有用であり得る。オルガノイドはまた、生きているドナーから小さな生検材料として採取された細胞または組織断片から増殖させることもでき、治療に対する倫理的反対を最小限に抑えられる。ドナーは、治療される患者からのものであってもよく、これにより外来細胞および臓器の移植に関連する負の副作用を低減し、免疫抑制薬の必要性を減らすことができる。
薬学的製剤
いくつかの態様では、本発明はまた、本明細書に記載の分化培地の成分ならびに薬学的に許容される希釈剤および/または賦形剤を含有する医薬製剤を提供する。例えば、1つまたは複数のWnt阻害剤（例えばIWP-2）、1つまたは複数のEGFR経路阻害剤（例えばゲフィチニブ、アファチニブ、PD0325901、およびSCH772984の1つまたは複数）、1つまたは複数のNotch阻害剤（例えばDAPT）、ならびに薬学的に許容される希釈剤および/または賦形剤を含有する医薬製剤が提供される。好ましい態様では、医薬製剤は基礎培地を含まない。いくつかの態様では、医薬製剤は細胞外マトリックスを含まない。そのような製剤は、インビボでの幹細胞の分化の促進、例えば再生療法に適し得ると想定される。そのような製剤は、インサイチューで（例えば組織損傷の部位で）または全身的に投与され得る。あるいは、製剤は、当技術分野で公知の任意の投与経路、例えば静脈内、皮下、筋肉内投与、粘膜、皮内、皮内、経口および眼経路による投与に適するように製剤化され得る。したがって、医薬製剤は、そのような投与に適した任意の形態、例えば錠剤、注入液、カプセル、シロップ等であり得る。
一部の態様では、1つまたは複数のWnt阻害剤（例えばIWP-2）、1つまたは複数のEGFR経路阻害剤（例えばゲフィチニブ、アファチニブ、PD0325901およびSCH772984のうちの1つまたは複数）、1つまたは複数のNotch阻害剤（例えばDAPT）、1つまたは複数のBMP阻害剤（例えばドルソモルフィンまたはLDN193189）ならびに薬学的に許容される希釈剤および/または賦形剤を含む薬学的製剤が提供される。
一部の態様では、1つまたは複数のWnt阻害剤（例えばIWP-2）、1つまたは複数のEGFR経路阻害剤（例えばゲフィチニブ、アファチニブ、PD0325901およびSCH772984のうちの1つまたは複数）、1つまたは複数のNotch阻害剤（例えばDAPT）、1つまたは複数のBMP活性化剤（例えばBMP4、BMP7またはBMP2）ならびに薬学的に許容される希釈剤および/または賦形剤を含む薬学的製剤が提供される。
治療方法
インビボでのホルモンレベルの調節
本発明の分化培地および/または薬学的組成物の1つまたは複数の成分を含む治療方法も提供される。特に、インビボでのEECは、特定のホルモンを発現する特定のEEC表現型に向かわせることができると想定され、したがって本発明の方法は、一部の態様では、インビボでホルモンレベルを調節するために使用することができる。
例えば、本発明者らは、BMP活性化剤がEECにおいてセクレチン分泌を促進する（およびGLP-1分泌を抑制する）ことを示した（実施例5参照）。したがって、BMP活性化剤、またはBMP活性化剤を含む薬学的組成物（本明細書に記載の分化培地の他の成分を含むまたは含まない）は、セクレチンレベルの上昇またはGLP-1レベルの抑制に関連する医学的用途の状況において有用であり得ると想定される。セクレチンは、胃酸分泌の阻害による胃のpHの中和（Afroze et al.,Ann Transl Med.2013 Oct;1（3）:29）および食欲抑制（Cheng et al.,Neuropsychopharmacology.2011 Jan;36（2）:459-471）に関連する。インビボでのセクレチンレベルの上昇は、したがって、過塩酸症（過剰な胃酸）または肥満の治療のための有用な機構であり得る。
したがって、過塩酸症または肥満を治療する方法が提供され、この方法は、BMP活性化剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。また、過塩酸症または肥満を治療する方法において使用するためのBMP活性化剤が提供され、前記方法は、治療有効量のBMP活性化剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。また、過塩酸症または肥満を治療するための薬剤を製造するためのBMP活性化剤の使用も提供され、その方法は、治療有効量のBMP活性化剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。適切なBMP活性化剤の例は当技術分野において公知であり、本出願の前の部分に開示されている。
本発明者らはまた、BMP阻害剤がEECにおいてGLP-1分泌を促進する（およびセクレチン分泌を抑制する）ことを示した（実施例5参照）。したがって、BMP阻害剤、またはBMP阻害剤を含む薬学的組成物（本明細書に記載の分化培地の他の成分を含むまたは含まない）は、GLP-1レベルの上昇またはセクレチンレベルの抑制を含む医学的用途の状況において有用であり得ると想定される。
例えば、GLP-1（グルカゴン様ペプチド-1）は内因性インクレチンであり、グルコースホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす（Manandhar＆Ahn J Med Chem.2015 Feb 12;58（3）:1020-1037）。これは、その調節機能を発揮するために、Gタンパク質共役受容体（GPCR）のクラスBファミリーに属するGLP-1受容体（GLP-1R）に結合し、それを活性化する。β細胞上の受容体の活性化は、cAMPおよび細胞内カルシウムのレベルの急速な上昇、続いてグルコース依存的な方法でのインスリンエキソサイトーシスをもたらす。α細胞中のGLP-1Rはβ細胞中のGLP-1Rの0.2％未満であるが、GLP-1は、カルシウムチャネル活性の調節を介してグルカゴン分泌を50％阻害する。GLP-1療法は、健常患者と糖尿病患者の両方においてインスリン分泌を増強することが示されている。他の糖尿病薬とは異なり、GLP-1のインスリン分泌促進作用は、血漿グルコースレベルが正常範囲に低下すると弱まり、低血糖の危険性を減少させるので、自己制限的である。さらに、GLP-1は、インスリン遺伝子転写の促進、膵β細胞の増殖および新生の刺激、β細胞アポトーシスの阻害、ならびにグルカゴン放出のブロックを含む、いくつかの他の機構を介して食後グルコース上昇を調節する。また、胃が空になるのを防ぎ、満腹感を誘発して、体重減少をもたらす。GLP-1療法は心臓保護作用も提供するようである。しかしながら、内因性GLP-1は、ジペプチジルペプチダーゼIV（DPP-IV）および中性エンドペプチダーゼ24.11（NEP 24.11）のようなプロテアーゼによる急速な代謝分解のため、非常に短い半減期を有する。これは治療薬としてのその使用を制限する。GLPアゴニスト（DPP-IV阻害剤など）が存在し、それらはGLP-1を安定化すると考えられる。DPP-IV阻害剤の考えられる難点は、GLP1が安定化されるだけであり、内因性の食品摂取によって制御されていないことである。したがって、真性糖尿病またはそれに関連する疾患および障害を治療するための代替的で改善された治療法のための代替手段が必要とされている。
本発明者らは、BMP阻害剤のインビボ投与がEECにおけるGLP-1分泌を増加させることができ、したがって真性糖尿病ならびに関連する疾患および障害を治療するための療法として働き得ると仮定した。本発明者らは、マウスへのBMP阻害剤の投与がGLP-1分泌を増加させることを示した（実施例6参照）。これらの細胞は、それらのGLP1を放出するために依然として食品摂取を必要とするので、GLP1細胞の数を増加させることは治療に有利である。したがって、GLP1ピークは、インスリンのレベル上昇が対象によって必要とされる時点でより高くなる。これはまた、低い数のGLP1細胞を有する患者にとって特に有利である。
したがって、真性糖尿病またはそれに関連する疾患もしくは障害を治療する方法が提供され、この方法は、治療有効量のBMP阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。また、真性糖尿病またはまたはそれに関連する疾患もしくは障害を治療する方法において使用するためのBMP阻害剤も提供され、前記方法は、治療有効量のBMP阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。また、真性糖尿病またはそれに関連する疾患もしくは障害を治療するための薬剤を製造するためのBMP阻害剤の使用も提供され、その方法は、治療有効量のBMP阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。適切なBMP阻害剤の例は当技術分野において公知であり、本出願の前の部分に開示されている。
「対象」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（任意のマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長動物など）を意味し得る。好ましい態様では、対象は哺乳動物、より好ましくはヒトである。対象は患者であり得、これは、疾患の診断または治療のために医療提供者を訪れるヒトを指す。対象は、疾患または障害に罹患し得るかまたは罹患しやすいが、疾患または障害の症状を示していてもよく示していなくてもよい。
「治療有効量」は、疾患、障害、および/または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に投与した場合、疾患、障害、および/または状態の症状を治療する、診断する、予防する、および/または症状の発症を遅らせるのに十分な治療薬の量を指す。 治療有効量が、典型的には少なくとも1単位用量を含む投与レジメンによって投与されることは当業者に理解されるであろう。
本開示全体を通して使用される「治療すること」、「治療する」、「治療」は、特定の疾患、障害、および/または状態の１つまたは複数の症状または特徴を部分的または完全に軽減する、改善する、緩和する、抑制する、予防する、発症を遅らせる、重症度を低下させる、および/または発生率を低減するのに用いられる任意の方法を指す。 疾患に関連する病変を発症する危険性を減少させる目的で、疾患の徴候を示さないおよび/または疾患の初期の徴候のみを示す対象に治療を施してもよい。
「真性糖尿病」は、I型糖尿病およびII型糖尿病であり得る。またはそれは妊娠糖尿病であり得る。「真性糖尿病」はまた、インスリン非感受性であるが、依然として糖尿病前症であり得る患者を包含する。「関連する疾患および障害」には、高血糖症、肥満、セリアック病、甲状腺疾患、多嚢胞性卵巣症候群、尿崩症、糖尿病性リポイド類壊死症、乳腺症、筋肉状態、および歯の疾患が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
例えば、本発明は以下の番号を付けた態様を提供する。
1.真性糖尿病または関連する疾患もしくは障害を治療するまたは予防する方法において使用するためのBMP阻害剤であって、前記方法が、治療有効量のBMP阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、BMP阻害剤。
2.腸内分泌細胞からのGLP-1分泌を増加させることによって（インスリンレベルを上昇させ、それによって血漿グルコースレベルを低下させるため）真性糖尿病または関連する疾患もしくは障害を治療するまたは予防する方法において使用するためのBMP阻害剤であって、前記方法が、治療有効量のBMP阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、BMP阻害剤。
3.態様1または態様2に記載の使用のためのBMP阻害剤であって、
a.BMPとBMP受容体との相互作用を妨げる;
b.BMP受容体に結合して、下流シグナル伝達の活性化を阻害する;
c.Smad 1、Smad 5もしくはSmad 8のリン酸化を阻害する;
d.Smad 1、Smad 5もしくはSmad 8の核への移行を阻害する;
e.標的遺伝子のSMAD 1、SMAD 5もしくはSMAD 8媒介転写を阻害する;または
f.BMPの発現、折りたたみもしくは分泌を阻害する
ことができる、BMP阻害剤。
4.前記の態様のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、Smad 1、Smad 5またはSmad 8のリン酸化を阻害し、例えば式I:
Figure 2022068302000016
（式中、
XおよびYは、独立してCR15およびNから選択され;
Zは、CR3およびNから選択され;
Arは、置換または非置換アリールおよびヘテロアリールから選択され;
L1は、存在しないか、または置換もしくは非置換アルキルおよびヘテロアルキルから選択され;
AおよびBは、各出現について独立して、CR16およびNから選択され;
EおよびFは、両方ともCR5であり、両方のR5がEおよびFと一緒になって置換または非置換5員または6員シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環を形成し;
R3は、Hおよび置換または非置換アルキル、シクロアルキル、ハロゲン、アシルアミノ、カルバメート、シアノ、スルホニル、スルホキシド、スルファモイル、またはスルホンアミドから選択され;
R4は、Hおよび置換または非置換アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アシル、カルボキシル、エステル、ヒドロキシル、アルコキシル、アルキルチオ、アシルオキシ、アミノ、アシルアミノ、カルバメート、アミド、アミジノ、スルホニル、スルホキシド、スルファモイル、またはスルホンアミドから選択され;
R15は、各出現について独立して、Hおよび置換または非置換アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、ハロゲン、アシルアミノ、カルバメート、シアノ、スルホニル、スルホキシド、スルファモイルまたはスルホンアミドから選択され;
R16は、各出現について独立して、存在しないか、またはHおよび置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、ハロゲン、アシル、カルボキシル、エステル、ヒドロキシル、アルコキシル、アルキルチオ、アシルオキシ、アミノ、アシルアミノ、カルバメート、アミド、アミジノ、シアノ、スルホニル、スルホキシド、スルファモイル、またはスルホンアミドから選択される）
に従う置換ピラゾロ［1,5-a］ピリミジン誘導体、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである、BMP阻害剤。
5.態様4に記載の使用のためのBMP阻害剤であって、
a.AおよびBはそれぞれCHであり;
b.EおよびFはそれぞれCR5であり、両方のR5が結合している原子と一緒になって6員環を形成し;
c.EとFは一緒になって、基:
Figure 2022068302000017
（ここで、R40は存在しないか、または置換もしくは非置換アルキル、シクロアルキル、ハロゲン、アシルアミノ、カルバメート、シアノ、スルホニル、スルホキシド、スルファモイル、またはスルホンアミドから選択される1～4個の置換基を表す）
を表し;
d.L1は、構造:
Figure 2022068302000018
（ここで、
Qは、CR10R11、NR12、O、S、S（O）、およびSO2から選択され;ならびに
R10およびR11は、各出現について独立して、Hおよび置換または非置換アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アミノ、アシルアミノ、カルバメート、アミド、アミジノ、シアノ、スルホニル、スルホキシド、スルファモイルまたはスルホンアミドから選択され;
R12は、Hおよび置換または非置換アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、アミノ、アシルアミノ、カルバメート、アミド、アミジノ、スルホニル、スルファモイル、またはスルホンアミドから選択され;ならびに
nは0～4の整数である）
を有し;
e.R4は、
Figure 2022068302000019
（ここで
Wは存在しないか、またはC（R21）2、O、もしくはNR21であり;
R20は存在しないか、または置換もしくは非置換アルキル、アラルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アシル、スルホニル、スルホキシド、スルファモイル、およびスルホンアミドから選択され;ならびに
R21は、各出現について独立して、Hおよび置換または非置換アルキル、アラルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アシル、スルホニル、スルファモイル、またはスルホンアミドから選択される）
から選択され;ならびに/または
f.Arは、6員のアリールまたはヘテロアリール環であり、任意で、Ｌ1は二環式コアに対してArのパラ位に配置される、
BMP阻害剤。
6.態様4または5に記載の使用のためのBMP阻害剤であって、治療有効量が、
a.少なくとも0.1mg/kg、少なくとも0.2mg/kg、少なくとも0.5mg/kg、少なくとも1.0mg/kg、少なくとも2mg/kg、少なくとも5mg/kg、少なくとも10mg/kg、少なくとも20mg/kg、少なくとも30mg/kgまもしくは約35mg/kg;
b.0.1mg/kg～50 mg/kg、0.1mg/kg～30mg/kg、0.1mg/kg～10mg/kg、0.1mg/kg～1mg/kg、1mg/kg～50mg/kg、1mg/kg～30mg/kg、1mg/kg～10mg/kg;および/または
c.1日1回、2回もしくは3回投与される、
である、BMP阻害剤。
7.BMP阻害剤が、態様1から3のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、
a.ドルソモルフィンまたはLDN193189またはその類似体もしくは変異体;および/または
b.ノギン、スクレロスチン、コーディン、CTGF、フォリスタチン、グレムリン、tsg、sogまたはその類似体もしくは変異体
から選択される、BMP阻害剤。
8.前記態様のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、薬学的に許容される塩の形態である、BMP阻害剤。
9.前記態様のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、対象が哺乳動物、好ましくはヒト、ネコまたはイヌである、BMP阻害剤。
10.前記態様のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、対象がヒトである、BMP阻害剤。
11.前記態様のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、
a.経口的に、局所的にもしくは注射によって、好ましくは経口的に、および/または
b.全身的にもしくは局所的に
投与される、BMP阻害剤。
12.前記態様のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、1つまたは複数の追加の糖尿病治療薬、例えばスルホニル尿素、ビグアニド、メトホルミン、α-グルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン、メグリチニド、ジペプチジルペプチダーゼ-4阻害剤または他のインクレチンミメティック、アミリン類似体、または糖尿病薬と組み合わせて投与される、BMP阻害剤。
13.前記態様のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、GLP-1受容体アゴニスト、例えばエクセナチド、リラグルチド、タスポグルチド、リキシセナチドから選択されるGLP-1受容体アゴニストと組み合わせて投与される、BMP阻害剤。
14.前記態様のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、インスリンまたはその生物学的に活性な類似体と組み合わせて投与される、BMP阻害剤。
15.態様12から14のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、組み合わせが単一組成物としてまたは2つの別々の組成物として投与される、BMP阻害剤。
16.態様12から15のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、組み合わせが同時にまたは連続して投与される、BMP阻害剤。
17.前記態様のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、真性糖尿病が1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病またはインスリン非感受性であり、好ましくは2型糖尿病である、BMP阻害剤。
18.前記態様のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、対象が異常に低いレベルのGLP-1を有する、BMP阻害剤。
19.前記態様のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、前記方法が、陰窩に特徴的なホルモンを発現する腸内分泌細胞の数を増加させることによって糖尿病を治療し、陰窩に特徴的なホルモンがGLP-1、ニューロキニンAおよびサブスタンスPおよびグルカゴンを含む、BMP阻害剤。
20.前記態様のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、前記方法が、同じ患者におけるBMP阻害剤の投与前と比較して少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または100％の循環/腸/膵臓GLP-1ホルモンレベルの上昇をもたらす、BMP阻害剤。
21.前記態様のいずれか1つに記載の使用のためのBMP阻害剤であって、前記方法が、対象において10.0mmol/l未満、9.0mmol/l未満、8.0mmol/l未満、7.0mmol/l未満、6.9mmol/l未満、6.8mmol/l未満、6.7mmol/l未満、6.5mmol/l未満、6.4mmol/l未満、6.3mmol/l未満、6.2mmol/l未満、6.1mmol/l未満または6.0mmol/l未満の空腹時血漿グルコースレベルをもたらす、BMP阻害剤。
細胞療法
したがって、細胞療法によるヒトまたは非ヒト動物患者の治療方法もまた、本発明の範囲内に含まれる。本明細書での「動物」という用語は、全ての哺乳動物を意味する。患者は、胎芽期および胎児期を含む任意の発生段階にあり得る。例えば、患者は成体であってもよく、または治療は小児用（例えば新生児、小児または青年）であってもよい。そのような細胞療法は、任意の適切な手段による、本発明に従って生成された細胞またはオルガノイドの患者への投与を包含する。具体的には、そのような治療方法は、損傷した組織の再生を含む。本明細書で使用される「投与」という用語は、静脈内投与または注射などのよく知られた形態の投与、ならびに移植による投与、例えば手術による移植、グラフティングまたは本発明による細胞もしくはオルガノイドに由来する組織工学的に作製された細胞集団の移植による投与を指す。細胞の場合、個体への全身投与は、例えば、上腸間膜動脈、腹腔動脈、胸管を介した鎖骨下静脈への注入、上大静脈を介した心臓への注入、または腹腔への注入と横隔膜下リンパ管を介したその後の細胞移動、または腸動脈血液供給への（例えば上腸間膜動脈もしくは下腸間膜動脈への）注入を介した腸部位への直接の注入によって可能であり得る。
いくつかの態様では、1回の注入につき、100kgのヒト当たり104～1013個の細胞が投与される。好ましくは、100kgのヒト当たり、約1～5×104個から1～5×107個の間の細胞が静脈内に注入され得る。より好ましくは、100kgのヒト当たり、約1×104～10×106個の細胞が静脈内に注入され得る。いくつかの態様では、細胞またはオルガノイドの単回投与が提供される。他の態様では、複数回投与が用いられる。初期治療レジメンにわたって、例えば連続3～7日間、複数回投与を提供し、その後また別の時点で繰り返すことができる。
本明細書で説明されるように、Lgr5を発現する単一の細胞からオルガノイドを得ることも可能である。この単一細胞は、例えば遺伝的欠損または突然変異を修正するために、本明細書で定義される核酸構築物の導入によって改変されていてもよい。所望に応じて、例えばsiRNAを用いて、発現を特異的に消失させることも可能であろう。発現させる潜在的なポリペプチドは、例えばAAT（αアンチトリプシン）などの代謝性肝疾患におけるポリペプチド欠損を含む、代謝性疾患において欠損しているもののいずれかであり得る。生理学を解明するために、Wnt、EGF、FGF、BMPまたはnotch経路に関与する遺伝子を発現させ得るまたは不活性化し得る。
遺伝子治療を、損傷した組織または病的組織の修復を目的とする方法において付加的に使用できることは当業者に明らかであろう。例えば、DNAおよび/またはRNAのような遺伝情報を幹細胞に送達するために、アデノウイルスまたはレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを使用することができる。当業者は、遺伝子治療において標的とされる特定の遺伝子を置換または修復することができる。例えば、機能していない遺伝子を置換するために、正常遺伝子をゲノム内の非特異的位置に挿入し得る。別の例では、異常な遺伝子配列を、相同組換えを介して正常な遺伝子配列に置き換えることができる。あるいは、選択的復帰突然変異は、遺伝子をその正常な機能に戻すことができる。さらなる例は、特定の遺伝子の調節（遺伝子がオンまたはオフになる程度）を変更することである。好ましくは、幹細胞は、遺伝子治療アプローチによってエクスビボで処理され、その後治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに移入される。例えば、オルガノイド由来細胞は、患者に移植する前に培養下で遺伝的に改変されてもよい。
したがって、いくつかの態様では、上皮幹細胞のオルガノイドまたは集団は、医療において使用するため、例えば障害、状態もしくは疾患を治療するため、および/または再生医療において使用するためのものである。
1つの好ましい態様では、例えば、オルガノイドが再生医療に使用される場合、本方法は、細胞または組織断片が自己由来または同種異系である上皮細胞または組織断片から出発し得る。拒絶反応の問題を防ぐために、ある程度の患者のマッチングが依然として必要であり得る。組織拒絶反応を最小限に抑えるための技術は、当業者に公知である。
オルガノイドおよび/または細胞を患者に移植する態様では、細胞を足場中で投与することが有利であり得る。したがって、本発明の1つまたは複数のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を含む足場が提供される。足場は、二次元または三次元ネットワークを提供する。そのような足場のための適切な合成材料には、多孔性固体、ナノファイバーならびにヒドロゲル、例えば自己組織化ペプチドを含むペプチド、ポリエチレングリコールホスフェート、ポリエチレングリコールフマレート、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリセルロースアセテートおよび/またはそれらのコポリマーからなるヒドロゲルから選択されるポリマーが含まれる（例えば、Saha et al. (2007) Curr Opin Chem Biol.11（4）:381-387;Saha et al. (2008) Biophysical Journal 95:4426-4438;Little et al. (2008) Chem.Rev 108,1787-1796参照）。当業者に公知のように、例えば足場の弾性などの機械的特性は、幹細胞の増殖、分化および移動に影響を与える。好ましい足場は、例えば組織再生および/または創傷治癒を促進するために、対象への移植後に天然に存在する成分によって置換される生分解性（コ）ポリマーを含む。前記足場は、対象への移植後に免疫原性応答を実質的に誘導しないことがさらに好ましい。前記足場には、幹細胞の増殖および/または分化および/または移動に必要なシグナルを提供する天然、半合成または合成リガンドが添加される。好ましい態様では、前記リガンドは規定されたアミノ酸断片を含む。前記合成ポリマーの例には、Pluronic（登録商標）F127ブロックコポリマー界面活性剤（BASF）およびEthisorb（登録商標）（Johnson and Johnson）が含まれる。いくつかの態様では、細胞を足場中で培養する。他の態様では、細胞を培養し、その後足場に加える。
本発明の用途は、単一のオルガノイドを使用してもよく、または複数のオルガノイド、例えば2、3、4、5、10、15、20、30、50、100、200もしくはそれより多くのオルガノイドを使用してもよい。有利には、本発明の方法は指数増殖をもたらし、それにより関心対象の適用における使用のために十分な細胞が利用可能になることを確実にするので、本発明の方法は、多数のオルガノイドおよび上皮幹細胞が短期間で生成されることを可能にする。本明細書で、例えば本発明のオルガノイドまたは本発明のオルガノイドから得られる細胞を含む、「治療方法」または「治療のための方法」に言及される場合、これはまた、「治療における使用のための」オルガノイドまたは細胞、および「医薬の製造における使用のための」オルガノイドまたは細胞を等しく意味する。
人工臓器
いくつかの態様では、分化したオルガノイドまたは分化したオルガノイドに由来する細胞の人工臓器における使用が提供される。人工臓器は、他の場所で説明される方法によってインビボで移植され得る。あるいは、人工臓器はエクスビボであり得る。いくつかの態様では、エクスビボ人工臓器は、例えば血液供給を介して患者に接続され得る。例えば、分化したオルガノイドを含む人工臓器は、透析装置の一部として使用し得る。したがって、分化したオルガノイドは、病的または損傷上皮組織を有する患者を支援するために使用することができる。
腸オルガノイドおよび細胞の集団の使用
本実施例に示すように、本発明の分化培地および方法は、胃から得られた前駆細胞の腸内分泌細胞運命への分化を増強する。
したがって、一部の態様では、本発明は、医療における使用のため、例えば胃の障害、状態もしくは疾患の治療における使用のためまたは再生医療における使用のための腸オルガノイドまたは腸オルガノイドから得られる細胞を提供する。
本発明はさらに、糖尿病（I型またはII型など）、嚢胞性線維症および炎症性腸疾患（クローン病など）の治療に使用するための腸オルガノイドまたは腸オルガノイドから得られる細胞を提供し、それにより治療は、任意で、オルガノイドまたは胃オルガノイドから得られた細胞を、それを必要とする患者に移植することを含む。
胃オルガノイドおよび細胞の集団の使用
胃細胞を培養する方法は、国際公開公報第2010/090513号に記載されている。本発明の分化培地および方法は、胃から得られた前駆細胞の腸内分泌細胞運命への分化を増強すると想定される。
したがって、一部の態様では、本発明は、医療における使用のため、例えば胃の障害、状態もしくは疾患の治療における使用のためまたは再生医療における使用のための胃オルガノイドまたは胃オルガノイドから得られる細胞を提供する。
本発明はさらに、胃炎、萎縮性胃炎、幽門狭窄症、胃がんまたは消化性潰瘍の治療に使用するための胃オルガノイドまたは胃オルガノイドから得られる細胞を提供し、それにより治療は、任意で、オルガノイドまたは胃オルガノイドから得られた細胞を、それを必要とする患者に移植することを含む。
膵オルガノイドおよび細胞の集団の使用
膵細胞を培養する方法は、国際公開公報第2010/090513号に記載されている。本発明の分化培地および方法は、膵臓から得られた上皮幹細胞の腸内分泌細胞運命への分化を増強すると想定される。
したがって、一部の態様では、本発明は、医療における使用のため、例えば膵臓の障害、状態もしくは疾患の治療における使用のためまたは再生医療における使用のための膵オルガノイドまたは膵オルガノイドから得られる細胞を提供する。
本発明はさらに、糖尿病（例えばI型またはII型糖尿病）、膵炎、膵臓がんまたは嚢胞性線維症の治療に使用するための膵オルガノイドまたは膵オルガノイドから得られる細胞を提供し、それにより治療は、任意で、オルガノイドまたは膵オルガノイドから得られた細胞を、それを必要とする患者に移植することを含む。一部の態様では、移植される細胞はインスリン分泌細胞である。他の態様では、細胞は、インスリン分泌細胞への移植後にさらに成熟する前駆細胞である。
肺オルガノイドおよび細胞の集団の使用
肺細胞を培養する方法は、国際公開公報第2016/083613号に記載されている。本発明の分化培地および方法は、肺から得られた上皮幹細胞の腸内分泌細胞運命への分化を増強すると想定される。
したがって、一部の態様では、本発明は、医療における使用のため、例えば肺の障害、状態もしくは疾患の治療における使用のためまたは再生医療における使用のための肺オルガノイドまたは肺オルガノイドから得られる細胞を提供する。
本発明はさらに、小細胞肺がんまたは非小細胞肺がん（例えば腺がん、扁平上皮がんまたは大細胞がん）、間質性肺疾患、肺炎（例えば器質化肺炎）、結核、嚢胞性線維症、気管支炎、肺線維症、サルコイドーシス、II型過形成、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、喘息、肺水腫、急性呼吸窮迫症候群、喘鳴、気管支拡張症、ハンタウイルス肺症候群、中東呼吸器症候群（MERS）、重症急性呼吸器症候群（SARS）またはじん肺症の治療に使用するための肺オルガノイドまたは肺オルガノイドから得られる細胞を提供する。本発明はさらに、アデノウイルス、コロナウイルス（例えばSARS-CoVまたはMERS-CoV）、ヒトメタニューモウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、RSウイルス、ライノウイルス、ハンタウイルス、エンテロウイルス（例えばエンテロウイルスD68（EV-D68））、百日咳菌（Bordetella pertussis）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Chlamydophila pneumoniae）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheria）、コクシエラ・ブルネチ（Coxiella burnetii）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、肺炎マイコプラスマ菌（Mycoplasma pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）または化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）などの病原体によって引き起こされる病原性疾患の治療に使用するための肺オルガノイドまたは肺オルガノイドから得られる細胞を提供する。
静止状態のLgr5＋幹細胞
静止状態のLgr5＋幹細胞はインビボで存在するが、これまでインビトロで生成されたことはなかった。本発明者らは、驚くべきことに、EGFR経路の阻害がインビトロでLgr5＋幹細胞の静止を誘導し得ることを見出した。
したがって、本発明は、Lgr5＋幹細胞において静止を誘導するための方法を提供し、前記方法は、
細胞を1つまたは複数のEGFR経路阻害剤で処理する工程
を含む。
一部の態様では、この方法はインビトロ法である。
本発明はさらに、本発明のLgr5＋前駆幹細胞の静止を誘導する方法によって得られる静止状態の幹細胞集団を提供し、細胞は、Lgr5およびLef1を発現し、KI67およびM期マーカーであるホスホ-ヒストンH4を発現しない。
本発明はさらに、本発明の静止状態の幹細胞集団を含むインビトロ培養物を提供する。
一部の態様では、静止状態は少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、または少なくとも10日間維持される。したがって、一部の態様では、静止状態は少なくとも7～10日間維持される。
本発明の静止状態の幹細胞集団は、複数の利点および用途を提示する。例えば、静止状態の幹細胞集団は保存することができ（例えば冷凍庫内で）、これは、非静止状態の幹細胞集団よりも効率的に再成長する。一部の態様では、本発明の静止状態の幹細胞集団は、幹細胞の細胞周期を検討するためまたは幹細胞の細胞周期進入を誘導する分子を同定するために使用される。
略語
β-TrCP:β-トランスデューシンリピート含有タンパク質
BME:基底膜抽出物
Cck:コレシストキニン
CHGA:クロモグラニンA
DAPI:4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール
EdU:5-エチニル-2'-デオキシウリジン
EEC:腸内分泌細胞
GIP:胃抑制タンパク質
GLP-1:グルカゴン様タンパク質1
GSK-3:グリコーゲンシンターゼキナーゼ3
IDMI:IWP2、DAPTおよびMEK阻害剤
LGR:ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体
LRP:低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質
Nts:ニューロテンシン
PP1:プロテインホスファターゼ1
PP2A:プロテインホスファターゼ2A
PP2C:プロテインホスファターゼ2C
Sct:セクレチン
Sst:ソマトスタチン
定義
本明細書で使用される場合、「含む」という動詞およびその活用形は、この語に続く項目が含まれることを意味するためにその非限定的な意味で使用されるが、具体的に言及されない項目を除外するものではない。 加えて、「～からなる」という動詞は、必要に応じて、本明細書で定義される生成物が、具体的に特定されたものより多い、本発明の固有の特徴を変化させない追加の1つまたは複数の成分を含み得ることを意味する、「本質的に～からなる」に置き換え得る。 さらに、本明細書で定義される方法は、具体的に特定されるものより多い、本発明の固有の特徴を変化させない追加の1つまたは複数の工程を含み得る。さらに、「1つの（aまたはan）」という不定冠詞による要素への言及は、文脈上、要素の1つだけが存在することが明確に求められない限り、複数の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、「1つの（aまたはan）」という不定冠詞は、通常、「少なくとも1つ」を意味する。
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、提示される値が＋/-10％変化し得ることを意味する。 値は正確な値として読み取ることもできるので、「約」という用語は省略することができる。 例えば、「約100」という用語は、90～110および100も包含する。
本明細書で引用される全ての特許および参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。
「腸」という用語は、結腸および小腸を包含する。
EGFR阻害は、腸オルガノイドにおいて細胞周期離脱を誘導する。（A）実験設定。オルガノイドを、BMEに播種した1週間後にEGFR（もしくはMEK/ERK阻害剤）またはDMSOのいずれかで処理した。試料を処理の1日後（d1）、2日後（d2）、4日後（d4）または７日後（d7）に収集した。再播種実験のために、処理工程以降の手順を繰り返した。（B）対照（ENR）またはEGFR阻害（EGFRi）での4日後の腸オルガノイド。Lgr5GFPiresCreER蛍光はEGFRi処理後に増加する。RFPチャネルを使用してバックグラウンドを表示する。下のパネルは明視野像である。（C）腸オルガノイドの細胞周期の分析。犠牲にする1時間前にEdUを投与した。対照（ENR）オルガノイドは継続的にEdUを取り込み（上のパネル）、KI67を発現する（下のパネル）が、EGFRi処理オルガノイドは時間の経過と共に細胞周期を離脱する。（D）Cの定量化。（E）対照またはEGFRi処理オルガノイドのDNA含量のHOECHST分析。左側のピークはENR培地中のEGFRi処理オルガノイドであり、右側のピークはENR培地中の対照オルガノイドである。右側のバーは3つの独立した実験の定量化を示す。バーの上部のバンドはG2/M期の細胞を表し、バーの中央のバンドはS期の細胞を表し、バーの下部のバンドはG0/G1期の細胞を表す。（F）培地中にEGFを再導入した後の腸オルガノイドの細胞周期の分析。（G）Lgr5GFPiresCreER＋細胞は、4日間のEGFRi処理後に細胞周期を離脱する。ホスホ-ヒストンH3（pH3）染色を用いてM期を可視化している。下のグラフは定量化を示す。DAPIを用いて核を視覚化している。スケールバー＝50μm。 図1Aの説明を参照のこと。 図1Aの説明を参照のこと。 図1Aの説明を参照のこと。 図1Aの説明を参照のこと。 図1Aの説明を参照のこと。 図1Aの説明を参照のこと。 EGFRシグナル伝達が誘導する細胞周期離脱は、MAPKシグナル伝達経路によって媒介される。（A）EGFR阻害後のERKリン酸化の組織学的分析。pERKの急激な減少は24時間かけて徐々に起こるが、48時間にわたって低いままである（上のパネル）。この期間はオルガノイドの細胞周期離脱と一致する（KI67染色、下のパネル）。（B）アファチニブを用いたMekまたはErkの単一阻害ならびにEGFRおよびErbB-2の同時阻害は、ゲフィチニブ誘導のEGFR阻害と同様の結果をもたらす。犠牲にする1時間前にEdUを培地に添加する。中央のパネルは、Lgr5GFPiresCreER対立遺伝子からの内因性GFP発現を示す。下のパネルは明視野像である。DAPIを用いて核を視覚化している。スケールバー＝50μm。 図2Aの説明を参照のこと。 系譜追跡は、qLgr5＋細胞が幹細胞であることを示す。（A）実験設定。解離の7日後に、オルガノイドをENR（対照）またはEGFRi培地のいずれかのBMEに再播種した。処理の4日後、4'OHタモキシフェン（T）で16時間組換えを誘導し、EGFシグナル伝達を回復させた。タモキシフェン誘導の4日後または12日後にオルガノイドを収集するか、またはENRに2回再播種した。（B）組換え（YFP＋）細胞は、CHGA＋EEC、LYZ＋パネート細胞（左のパネル）、またはそれらの頂端アクチンおよびアセチル化チューブリン高密度束によって同定された刷子細胞（右のパネル）を生成した。活性（上のパネル）および静止（下のパネル）Lgr5＋細胞の両方を追跡した。（C）Bの定量化。各バーの下部のバンドはCBC、下部のバンドのすぐ上のバンドはEECであり、次の上のバンドはパネートであり、次の上のバンドは刷子であり、各バーの上部のバンドは静止である。（D）組換え（X-Gal染色によって同定）活性（左上のパネル）および静止（左下のパネル）Lgr5＋細胞は、多能性を示す完全なオルガノイドを生成する。組換えDclk1＋細胞（右のパネル）はいずれの条件でも増殖しなかった。スケールバー＝50μm。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 RNA配列決定は、qLgr5＋幹細胞とaLgr5＋幹細胞との間の重要な分子相違を同定する。（A）対照（ENR）またはEGFR阻害（EGFRi）条件からのDclk1GFPiresCreER（Dclk1）対立遺伝子を使用する、Lgr5GFPDTR（Lgr5DTR）、Lgr5GFPiresCreER（Lgr5GFP）および刷子細胞を用いた、選別されたLgr5＋細胞の全転写物の階層的クラスタリング。対照オルガノイドを参照として加えた。（B）主成分分析（PCA）。（C）活性Lgr5細胞と静止Lgr5細胞の比較を示すボルケーノプロット。X軸は調整されたp値（-log10のq値）を示し、y軸は倍数変化（log2）を示す。灰色の点は0.01未満の誤発見率（FDR）の遺伝子を示し、黒色の点は有意に変化していない遺伝子を示す。（D）Lgr5＋細胞においてEGFR阻害によって区別的に調節される遺伝子を表示するヒートマップ。色は各列（遺伝子）のz値を示す。（E）マーカー遺伝子の正規化した発現値を表示する箱ひげ図。（F）個々の活性および静止Lgr5＋細胞の全トランスクリプトームのピアソン相関のk平均クラスタリングを表示するヒートマップ。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 高純度EEC培養物の誘導。（A）EEC（CHGA）およびパネート細胞（LYZ）のマーカー分析。オルガノイドを、Notch阻害剤DAPT（D）、Wnt分泌阻害剤IWP-2（I）、ゲフィチニブ（EGFRi）、またはこれらの処理の組み合わせで4日間処理した。DMSOを対照として使用する。（B）WntおよびNotchシグナル伝達経路と合わせたMekシグナル伝達（Meki）の阻害は、同様にEEC細胞数を増加させる。図の左半分において、濃灰色および薄灰色のV字形の矢印は、それぞれ、高SCTおよび高GIP発現の領域を指す。図の左半分において、濃灰色および薄灰色のV字型の矢印は、それぞれ、高CCKおよび高SST発現の領域を指す。胃抑制タンパク質（GIP）、セクレチン（SCT）、ソマトスタチン（SST）およびコレシストキニン（CCK）陽性細胞数は劇的に増加する。（C）オルガノイドにおけるEEC関連マーカー遺伝子発現のqPCR分析。EI:EGFRiおよびMI:Meki。スケールバー＝50μm。エラーバーは標準偏差を示す。 図5Aの説明を参照のこと。 図5Aの説明を参照のこと。 単一細胞トランスクリプトームプロファイリングは、誘導されたEEC間の不均一性を明らかにする。（A）MekiおよびEGFRi実験からの個々の生オルガノイド細胞の全トランスクリプトームのピアソン相関のk平均クラスタリングを表示するヒートマップ。数字はクラスタを表す。色は全細胞トランスクリプトームのピアソン相関をコード化している。（B）個々の細胞および細胞群によって発現されたマーカー遺伝子を示すt-SNEマップ。（C）それぞれの遺伝子のlog2変換した、色分けした転写物数を表示するt-SNEマップ。（D）クラスタ2、5、6および7中のそれぞれの遺伝子の色分けした転写物数を表示するヒートマップ。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 Lgr5＋細胞の増殖におけるニッチシグナル伝達経路の役割。（A）内因性Lgr5GFPDTR蛍光（上のパネル、x軸）およびKI67efluor660免疫染色（下のパネル、x軸）を示すFACSプロット。バックグラウンドを識別するためにPL3チャネルを使用する（y軸）。ゲートは、野生型対照に関して陽性の細胞を示す。（B）Lgr5GFPiresCreERおよびRosa-TOPCFP対立遺伝子を用いた対照（ENR）およびEGFR阻害（EGFRi）オルガノイドの明視野（上）および蛍光（下）画像。バックグラウンドを識別するためにRFPチャネルを使用する。（C）EGFRi処理の4日後のLgr5GFPiresCreER＋細胞のマーカー遺伝子分析。左側の画像において、薄灰色および濃灰色のV字形の矢印は、それぞれ、高CHGAおよび高LYZ発現の領域を指す。中央および右側の画像において、薄灰色のV字型の矢印は、高ファロイジン発現の領域を指す。（D）4日間のEGFRi処理オルガノイドにおけるマーカー遺伝子発現のqPCR分析。（E）それぞれの対照（DMSO処理、同じ培養日数）と比較した、1（d1）、3（d3）または5（d5）日間のEGFシグナル伝達再導入後のマーカータンパク質陽性細胞の相対数。（F）EGF除去（NR）またはEGFRi処理（2×NR＋EGFRi）の反復サイクル後のEGF導入後のオルガノイドの細胞周期進入。（G）Fの定量化。スケールバー＝50μm。エラーバーは標準偏差を示す。キー:ENR＝EGF、ノギンおよびR-スポンジン1;-R＝R-スポンジン1除去;-N＝ノギン除去;EGFRi＝EGFRシグナル伝達の阻害（培地からのEGFの回収を伴ってゲフィチニブを使用）。 図7Aの説明を参照のこと。 図7Aの説明を参照のこと。 図7Aの説明を参照のこと。 図7Aの説明を参照のこと。 図7Aの説明を参照のこと。 図7Aの説明を参照のこと。 EGFRi処理後のオルガノイドの細胞組成。（A）対照（ENR）またはEGFRi処理オルガノイドのパラフィン切片に関するアルシアンブルー、PASおよびムチン2（MUC2）染色。（B）パネート細胞（LYZ）およびEEC（CHGA）マーカーについて染色された全オルガノイドの3D再構成。両方の細胞型は、対照と比較してEGFRi処理オルガノイドにおいてより豊富に含まれる（下のパネル）。右側のグラフは定量化を示す。（C）Dclk1GFPiresCreER対立遺伝子の内因性蛍光を用いて視覚化した刷子細胞数は、対照（左のパネル）と比較してEGFRi処理後に増加する（右のパネル）。GFP蛍光はEEC（CHGA）またはパネート細胞マーカー（LYZ）と重複しない。スケールバー＝50μm。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 Lgr5＋細胞シグネチャーの遺伝子オントロジー（GO）用語および単一細胞分析。（A）Lgr5細胞におけるEGFRi処理後に下方制御された遺伝子のGO用語解析（Revigoを用いて）。細胞周期および分裂に関連する用語ならびに小分子生合成（全て細胞周期進行に関連する）は、静止状態のLgr5＋細胞と比較して活性細胞では有意に高い。x軸はp値（-log10）を示し、y軸はGO用語セットのサイズを示す。（B）配列決定されたLgr5＋細胞の分布を表示するt-SNEマップ。（C）それぞれパネート細胞および刷子細胞を同定するために使用される、LyzおよびDclk1 mRNAのlog2変換した色分け転写物レベルを表示するt-SNEマップ。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 誘導されたEECオルガノイドの単一細胞配列決定の初期解析。（A）RaceIDによって同定されたクラスタの分布を表示するt-SNEマップ。（B）IDEGFRiおよびIDMeki実験に由来する細胞の分布を比較するt-SNEマップ。（C）腸細胞を同定するために使用されるApoa1 mRNAのlog2変換した色分け転写物レベルを表示するt-SNEマップ。腸管前駆細胞運命の要約。腸前駆細胞は、腸細胞、杯細胞、パネート細胞または腸内分泌細胞などのいくつかの細胞型に分化することができる。Wnt阻害と組み合わせたNotch活性化が腸細胞分化を促進することは以前から公知であった。また、Wnt活性化と組み合わせたNotch阻害がパネート細胞分化を促進し得ることも公知であった。さらに、WntおよびNotch阻害は杯細胞分化を促進し得ることが公知であった。しかしながら、腸内分泌細胞分化を増強する方法に関する理解がこれまで欠如していた。 図10Aの説明を参照のこと。 図10Aの説明を参照のこと。 EEC培養物の組成。IDMI分化培地での処理は、主にエンテロクロマフィン分化に偏った分化をもたらした。オルガノイド当たりのEECの絶対的増加は、主としてエンテロクロマフィン細胞である。GLP1、CCK、NTS、STTおよびGIP産生細胞は、より少ない程度で存在する。 図11A-1の説明を参照のこと。 図11A-1の説明を参照のこと。 種々のEEC分化プロトコルにおけるメッセンジャーRNAレベルを示すqPCR結果。棒グラフは、対照と比較した様々なEECマーカーのmRNA発現倍率を示す。BMP経路の活性化は、TAC1（エンテロクロマフィン細胞のマーカー）を犠牲にしてセクレチンメッセンジャーRNAを選択的に増強する。BMP4は、BMP経路を活性化するために使用され、10μg/mlの濃度で存在した。基本条件:IDMI（IWP2、DAPTおよびMEK阻害剤）。MHY1485は、5μMの濃度で試験したmTOR活性化剤である。ビスモゲニブは、5μMの濃度で試験したヘッジホッグ阻害剤（具体的にはSmoothened阻害剤）である。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。 種々の腸内分泌分化プロトコルにおけるセクレチンおよびGIPの染色。BMP経路の活性化はS細胞の数を大幅に増強する。 図13-1の説明を参照のこと。 図13-1の説明を参照のこと。 種々の腸内分泌分化プロトコルにおけるセロトニンの染色。BMP経路の活性化はエンテロクロマフィン細胞の数を減少させる。 図14-1の説明を参照のこと。 図14-1の説明を参照のこと。 標準的な分化培地と比較した、EEC分化プロトコルにおける種々のEECマーカーのメッセンジャーレベルのlog2変化を示すqPCR結果。EEC分化培地は、ヒトオルガノイド中のEECの数を大幅に増強するが、パネート細胞の数は増強しない。 種々の腸内分泌分化プロトコルにおけるCHGA発現。 図16-1の説明を参照のこと。 図16-1の説明を参照のこと。 Notch、WntおよびMEKの三重阻害は、EECが豊富に含まれる培養物を生成する。オルガノイド当たり30～80％のCHGA＋細胞が観察された。 図17-1の説明を参照のこと。 EEC培養物におけるホルモン発現。EECの全ての異なるサブタイプがIDMI培養物中に存在し、単一のホルモンを発現する。一部の細胞はCHGA-であるが、ホルモンについては陽性である。 図18-1の説明を参照のこと。 培養物中のEECによるホルモン分泌。2日目の培地を-フォルスコリン結果について収集した。次に培養物をフォルスコリンで1時間誘導し、培地を＋フォルスコリン結果について収集した。 腸腺窩および絨毛におけるTac1、GLP1およびセクレチン免疫反応性細胞の特異的局在。A～C）PYY-GLP1二重陽性細胞は陰窩に位置し、一方絨毛のL-細胞はGLP1の発現を喪失している。D～E）セロトニンを発現する陰窩内のエンテロクロマフィン細胞はTac1を共発現する。絨毛におけるTac1発現は失われ、そこではエンテロクロマフィン細胞がセクレチンを共発現し始める。 図20Aの説明を参照のこと。 図20Aの説明を参照のこと。 図20Aの説明を参照のこと。 図20Aの説明を参照のこと。 図20Aの説明を参照のこと。 BMPシグナル伝達は、絨毛ホルモンシグネチャーの推進因子である。A）ノギンの存在によってBMPシグナル伝達が阻害された腸内分泌細胞分化（Wnt、NotchおよびMAPKの阻害）培地は、陰窩を想起させるホルモンシグネチャーを生成する:セクレチンは存在せず、セロトニン＋EECは常にTac1を共発現する。EEC BMP高として定義されるこの分化カクテルからのノギンの排除およびこの分化カクテルへのBMP4の導入は、GLP1数ならびにTac1数を大幅に減少させる。単一のセロトニン＋腸内分泌細胞ならびにセクレチン＋細胞がこの培地中に出現する。B）A）の定量化。C）BMP低または高EECのいずれかの分化培地中の小さな腸オルガノイドの明視野像。GCG-Venusレポーターを用いてGLP1陽性細胞を追跡した。種々の分化プロトコルは形態学的に区別できないオルガノイドを生成するが、GLP1発現は、BMP活性化のバックグラウンドでは大幅に減少する。 図21Aの説明を参照のこと。 図21Aの説明を参照のこと。 インビボでのBMPシグナル伝達の阻害は、GLP1＋区画の拡大を引き起こし、セクレチン発現を抑制する。A）マウスの強制経口投与を介したLDN193189による60時間の処置は、GLP1数の増大を引き起こす。GLP1は、絨毛においてL細胞によって広く発現され、必ずしもPYYを共発現しない。B）セクレチンは、処置した対照と比較して、BMPR阻害マウスの絨毛では大幅に減少する。 図22Aの説明を参照のこと。
材料および方法
オルガノイド培養物
基礎培地（ペニシリン/ストレプトマイシン、10mM HEPES、Glutamax、B27［Life Technologies,Carlsbad,CA］および1mM N-アセチルシステイン［Sigma］を補充したアドバンストダルベッコ改変イーグル培地/F12）に、50ng/mlの、「ENR」培地と呼ばれる、マウス組換え上皮成長因子（EGF;Peprotech,Hamburg,Germany）、R-スポンジン1（馴化培地、5％最終容量）、およびノギン（馴化培地、5％最終容量）を補充した。馴化培地は、HA-マウスRspo1-Fc（Calvin Kuo,Stanford Universityから贈与された）で安定にトランスフェクトしたHEK293T細胞を用いて、またはマウスノギン-Fc発現ベクターで一過性にトランスフェクトした後に作製した。ペニシリン/ストレプトマイシンおよびGlutamaxを補充したアドバンストダルベッコ改変イーグル培地/F12を1週間馴化させた。細胞をBME（Trevigen）に播種した。EGFシグナル伝達の阻害のために、細胞をゲフィチニブ（5μM;Santa Cruz Biotechnology）で処理し、EGFを培地から除去した。Wnt分泌をIWP-2（1.5μM; Sigma Aldrich）で阻害し、NotchをDAPT（1mM、Sigma Aldrich）で阻害した。全ての処理は、継代後5日目のオルガノイドに対して実施した。EGFR再活性化実験のために、EGFR阻害剤を確実に洗い流すために、オルガノイドを新鮮BMEおよびENR培地に再播種した。Cre-ERT活性の誘導のために、オルガノイドを4-ヒドロキシタモキシフェン（1uM）で一晩処理した。全ての対照オルガノイドを同様の濃度の化合物溶解剤、ジメチルスルホキシド（DMSO）で処理した。処理の間に、細胞をEVOS顕微鏡（Electron Microscopy Sciences）を用いて画像化した。
腸内分泌分化の誘導のために、細胞をENRまたはENR＋バルプロ酸およびCHIR99021のいずれかで培養した（Yin et al.（2014）Nature methods 11:106-112）。5日間培養した後、培地を取り出し、オルガノイドをPBSで洗浄した。EEC分化のためのカクテルは、IWP2（1.5μM;Sigma Aldrich）、DAPT（1mM、Sigma Aldrich）およびMEK阻害剤PD0325901（5μM;Sigma Aldrich）を含んだ。
免疫染色
Matrigelを氷冷PBSに穏やかに溶解することによって全オルガノイドを収集し、続いて4％パラホルムアルデヒド中に4℃で一晩固定した。次に、オルガノイドを透過処理し、0.5％Triton X-100および2％正常ロバ血清（Jackson ImunoResearch）を含むPBS中で室温にて30分間ブロックした。一次抗体を含むブロッキング緩衝液中で、オルガノイドを室温で2時間インキュベートした。使用した一次抗体は、ウサギ抗リゾチーム（1:500;DAKO）、ヤギ抗クロモグラニンA（1:500;Santa Cruz）、マウス抗Ki67（1:250;BD Pharmingen）、ウサギ抗ホスホヒストン3（pH3 Ser10、1:1000;Millipore）、マウス抗サイトケラチン20（1:1000;Dako）、ヤギ抗コレストシストキニン（sc-21617、1:100;Santa Cruz）、ウサギ抗ニューロテンシン（sc-20806;1:100; Santa Cruz）、ヤギ抗セクレチン（sc-26630、1:100;Santa Cruz）、ヤギ抗ソマトスタチン（sc-7819、1:100;Santa Cruz）、ウサギ抗胃抑制タンパク質（ab22624-50、1:500、Abcam）、ウサギ抗グルカゴン様ペプチド1（ab22625、1;500、Abcam）およびマウス抗アセチル化チューブリン（1:100;Santa Cruz）であった。オルガノイドを、対応する二次抗体Alexa488、568および647結合抗ウサギ、抗ヤギおよび抗マウス（1:1000;Molecular Probes）と共に、DAPI（1; 1000、Invitrogen）を含むブロッキング緩衝液中で、またはファロイジンテキサスレッド（1:1000;Life technologies）と共にインキュベートした。EdU（10uM）との1時間のプレインキュベーション後に、Click-iTアッセイキット（Thermo Fisher）を用いてEdUの取り込みを視覚化した。LacZ染色を以前に記載されているように実施した（Barker et al.（2007）Nature 449（7165）:1003-7）。切片をVectashield（Vector Labs）に包埋し、Sp5およびSp8共焦点顕微鏡（Leica）を用いて画像化した。ImageJソフトウェアを用いて画像解析を行った。
FACSソーティング
LGR5およびKI67発現のFACS分析のために、Lgr5GFPDTRオルガノイドを、37℃で15分間のトリプシン処理後（TrypLE Express;Life Technologies,Carlsbad,CA）、最初に機械的破壊によって単一細胞に解離させた。単一細胞を、4％パラホルムアルデヒドを用いて30分間氷上で固定し、PBS中で3回洗浄した。細胞を0.5％Triton X-100を含むPBS中で30分間透過処理し、氷上で30分間、eFluor-660結合ラット抗KI67（1:1000;eBioscience）抗体で染色した。細胞周期分析のために、細胞を1ug/ml Hoechst 33342（ThermoFisher）中で染色した。 その後、染色した細胞をBD FACS Calibur（BD Biosciences）で分析した。
発現分析のために、オルガノイドを解離させ、直ちにBD FACS Aria（BD Biosciences）で選別した。細胞を、96ウェルプレートのTrizol中の単一細胞として、またはエッペンドルフチューブ内のTrizol中のバルクとして選別した。
RNAの単離
RNA配列決定のために、細胞をTrizol（Life Technologies）中に選別し、全RNAを、製造業者の指示に従って、以下の変更を加えて単離した。グリコーゲン2ug（Life Technologies）を用いて、RNAを-20℃で一晩沈殿させた。384ウェルに選別した細胞についてさらなるRNA単離工程は使用しなかった。定量的PCR分析のために、RNAを、製造業者のプロトコルに指示されているようにRNAeasyキット（QIAGEN）を用いてオルガノイドから単離した。
定量的PCR
記載されているように（Munoz et al.（2012）The EMBO Journal 31:3079-3091）、SYBR GreenおよびBio-Radシステムを用いてPCR分析を行った。各プライマーについて標準曲線を用いてPCR反応を3回実施した。CFXマネージャーソフトウェア（Bio-Rad）を用いて発現の変化を計算した。プライマーは、NCBIプライマー設計ツールを使用して設計した。
Figure 2022068302000020
単一細胞およびバルクの配列決定
RNA試料を、以前に記載されたように（Grun et al.（2015）Nature 525:251-255;Hashimshony et al.（2012）Cell reports 2:666-673）、修正版のCEL-seqプロトコルを使用して調製した。ERCCスパイクインをTrizol溶液に添加した。RNAペレットをプライマー混合物に溶解し、70℃で2分間インキュベートした。384ウェルに選別した細胞を65℃で5分間直接溶解した。75bpのペアエンドシーケンシングを用いてIllumina NextSeq500でcDNAライブラリを配列決定した。
RNA配列決定データの分析
以下の例外を除き、ペアエンドリードを以前に記載されたように（Grun et al.（2015）Nature 525:251-255）定量化した。整列されなかったかまたは複数の位置に整列されたリードは廃棄した。バルク配列決定の分析のために、UMIは無視した;代わりに、各転写物のリード数を、その転写物に特異的にマッピングされたリード数によって決定した。この数を全ての転写物にマッピングされたリードの総数で除し、100万を乗じて、100万回当たりのリード（RPM）数を得た。CEL-seqでは3'末端の配列決定しかできないため、RPKMではなくRPMを使用した。差次的遺伝子発現を、RプラットフォームでDESeqパッケージを用いて評価した（Anders and Huber（2010）Genome biology 11:R106）。使用したカットオフは、調整したp値＜0,1およびFDR＜0,1ならびに比較した集団に対して少なくとも2倍の差であった。レシオメトリック分析を無効にするリードのない試料を防ぐために、比率計算およびlog 2変換の前に、全ての0リードを0.1のリードに変換した。遺伝子オントロジー解析は、Revigo（Supek et al.（2011）PloS one 6:e21800）およびGorilla（Eden et al.（2009）BMC bioinformatics 10:48）ソフトウェアを用いて行った。単一細胞配列決定データを、以前に記載されているように分析した（Grun et al.（2015）Nature 525:251-255）。
実施例1
Lgr5＋幹細胞がどのように周期に維持されるのかを理解するために、本発明者らは、陰窩ニッチにおいて活性な重要なシグナル伝達経路を操作した。全ての細胞周期段階における周期細胞のマーカーであるKI67に対する抗体を用いたLgr5GFPDTRオルガノイドのフローサイトメトリー分析は、Lgr5＋細胞の大部分が周期回転していることを確認した（図7）。本発明者らは、2つの独立した方法を用いてWntシグナル伝達を阻害した;i）IWP-2処理はパネート細胞によるWnt3分泌を阻害し、およびii）培地からのR-スポンジン1の除去は細胞表面からのFrizzled受容体の喪失をもたらす。R-スポンジン1の除去は、直ちにLgr5GFP発現の喪失を引き起こす（図7A）。IWP処理は、増殖によるリガンドの希釈に依存する、より穏やかなWnt阻害をもたらす。幹細胞が分化している間、Lgr5GFPの発現は徐々に下方調節された。それにもかかわらず、残りのLgr5GFP細胞はKI67発現を維持した（対照における94.4±2.1％に対し、63.5±2.8％）。BMP阻害剤ノギンの除去またはNotch阻害剤DAPTの添加は、どちらもGFP＋細胞数の急速な減少を誘導したが、残りのLgr5細胞の増殖には影響を及ぼさなかった（ノギン除去では82.3±1.4％、DAPT添加では45.1±10％）（図7）。次に、本発明者らは、培地からのEGFの回収を伴って、ゲフィチニブを用いてEGFRシグナル伝達を阻害した（EGFRi処理、図7）。Lgr5GFP発現は持続したが、Lgr5細胞は最終的にKI67発現を喪失し（13.1±1.0％）、細胞周期からの離脱を示した。
本発明者らはさらに、EGFR阻害に関連する初期事象を分析した（図1A）。オルガノイドの「絨毛」区画の広範なアポトーシスにもかかわらず、Lgr5＋（Lgr5GFPiresCreER）細胞を含む陰窩構造に類似した芽は最大1週間まで持続した（図1B）。本発明者らは、Lgr5GFPDTR対立遺伝子を使用してこれらの結果を裏付け（Tian et al.（2011）Nature 478:255-259）、CBCがEGFシグナル伝達の不在下でも生存することを確認した（図7）。4日間のEGFRi処理後、Lgr5＋細胞はオルガノイドの44.4±0.8％（対照では13.6±6.5％）を構成した（図7）。TCFCFP（RosaTCF-CFP）Wntレポーター対立遺伝子（Serup et al.（2012）Disease models＆mechanism 5:956-966）は、Wntシグナルが非増殖性Lgr5細胞において高いままであることを確認した（図7）。KI67タンパク質は最初の24時間持続したが、48時間以降は失われた（図1Cおよび1D）。EdUの短パルスを、そのDNAを複製する細胞の尺度として用いて、本発明者らは、EGFRiが24時間という早い時期にDNA複製の急速な停止をもたらし、これが少なくとも1週間持続することを見出した（図1Cおよび1D）。S期および最終的には細胞周期からの離脱と一致して、Hoechst DNA染色を用いたEGFRi処理オルガノイドのDNA含量の標識化は、全ての細胞がG0/G1期にあることを確認した（図1E）。EGFRi処理の4日後、EGFシグナル伝達の再構成は、24時間以内に急速な細胞周期進入（KI67＋）および48時間以内にS期への進行（EdU＋）を誘導した（図1Fおよび7）。EGFRi処理の2回目のサイクル後でさえも、静止状態のLgr5細胞は再び細胞周期に入った（図7）。
本発明者らは、次に、非分裂EGFRi誘導Lgr5＋細胞の分析をさらに精緻化した。これらの細胞は、まれな分裂細胞がEGFRi処理の間存続したことを除き、細胞周期マーカーKI67およびM期マーカーpH3を有さず、EdUを組み込んでいなかった。（図1G）。リゾチーム（LYZ）およびクロマグラニンA（CHGA）の欠如は、それぞれ、Lgr5＋細胞がパネート細胞または腸内分泌細胞（EEC）に分化しなかったことを意味した（図7）。刷子細胞（腸M細胞）はまた、寄生生物の侵入に応答して関与するまれな機械感覚細胞である（Howitt et al.（2016）Science 351:1329-1333）。それらは、アセチル化チューブリンおよびファロイジンを特徴とする、それらの典型的な頂端アクチン束によって識別され得る（Hofer and Drenckhahn（1996）Histochemistry and cell biology 105:405-412）。大部分のLgr5＋細胞は刷子細胞の形態を示さず、同様に、刷子細胞は主としてLgr5-であった（図7）。定量的PCR分析は、Lgr5細胞が腸細胞、パネート細胞、EEC、杯細胞または刷子細胞に分化しないことを確認した（図7）。
粘液構造を視覚化するためのMuc2（ムチン2）ならびにPASおよびアルシアンブルー染色は、EGFRi処理後の杯細胞数の有意な減少を明らかにした（図S2）。分裂中のTA前駆細胞の大半は成熟腸細胞を生成する。本発明者らは、EGFRi処理の4日後に芽当たりのLYZ＋パネート細胞およびCHGA＋腸内分泌細胞の数の増加を認めたが、いずれの細胞型の総数（オルガノイド当たり）も有意に変化しなかった（図8）。刷子細胞の総数は、EGFRi処理時に増加した（図S2）。本発明者らは、Dclk1GFPiresCreER対立遺伝子を用いてこれらの結果を裏付け（Nakanishi et al.（2013））、EGFRi処理がDclk1＋刷子細胞の絶対数を3.2倍に増加させる（ENRでは11.3±6.6、EGFRiでは35.8±8.8）ことを確認した（図9）。簡単に述べると、EGFR阻害はオルガノイドにおける細胞型組成に影響を与えるが、これは、腸系譜の1つへの分化を誘導することなくLgr5＋細胞を静止に至らせる。
MAPKシグナル伝達は、EGFRシグナル伝達経路の主要な下流標的であり、細胞周期進行を調節する。MAPKキナーゼ（Mek）はMAPK（Erk）をリン酸化してその核局在化および活性化を誘導する。EGFRi処理は、1時間後に早くもERKリン酸化を減少させた（図2A）。しかし、静止状態が継続しているにもかかわらず、48時間以内にホスホERK（pERK）レベルが徐々に回復することが観察された（図2A）。本発明者らは、Mek（PD0325901;Meki）またはErk（SCH772984;Erki）のいずれかの小さな阻害剤を用いて、Mek/Erkシグナル伝達が腸幹細胞の細胞周期進行に必須であるかどうかを検討した。両方の阻害剤がLgr5＋細胞の静止を誘導し、これは、EGFRの下流のERK経路がLgr5＋細胞の増殖を調節することを意味する（図2B）。EGFRとErbB2の両方を阻害するアファチニブを使用すると、同様の結果を生じた（図2B）。本発明者らは、MAPKシグナル伝達によるEGFR阻害は腸オルガノイド幹細胞における可逆的静止状態を誘導するのに十分であると結論した。
静止状態のLgr5細胞が幹細胞の能力を保持しているかどうかを試験するため、本発明者らは、Lgr5＋細胞の運命を追跡するためにLgr5GFPiresCreERRosa26YFP/LacZおよびLgr5GFPiresCreERRosa26tdTomatoオルガノイドを使用した（図3A）。4-OHモキシフェン（Tmx）を用いたCreERの誘導は、YFP（またはtdTomato）蛍光またはLacZ発現によって視覚化され得る迅速な組換えをもたらした（図3Bおよび3C）。標識した分裂Lgr5細胞は、EGFRi処理時に静止状態のLgr5細胞を生成し、後者が実際に活性なLgr5細胞に由来することを示した（図3B）。さらに、標識パネート細胞およびEECの割合はEGFRi処理時に増加した（図3Bおよび3C）。非EGFRi処理対照では、組換え細胞は継代時に完全なオルガノイドを生成し、幹細胞の効率的な標識化を示した（図3D）。継代およびEGFシグナル伝達の再活性化の際に、組換え静止Lgr5細胞の子孫は数継代にわたって存続し、オルガノイドを生成した（図3D）。これらの結果は、EGFRi処理時に誘導された静止Lgr5細胞が真の幹細胞として挙動することを示した。
刷子細胞は分裂しておらず、損傷および腫瘍増殖の際の組織再生に寄与することによって幹細胞様の特性を示し得る（Nakanishi et al.（2013）Nature Genetics 45:98-103）。本発明者らは、Dclk1GFPiresCreERRosaYFP/LacZマウスモデルに由来するオルガノイドを使用して刷子細胞の運命を追跡した。正常およびEGFRi処理オルガノイドの両方において、標識細胞は経時的に単一細胞のままであった（図3C）。EGFの存在下で継代した場合、標識細胞は失われ、オルガノイド環境で幹細胞能を有するDclk1＋刷子細胞に反してオルガノイド生成に寄与しなかった（図3C）。
静止Lgr5細胞の分子特性をよりよく理解するために、本発明者らは、FACSで単離した活性（DMSO対照）および静止（EGFRi処理、d4）Lgr5＋幹細胞についてのRNA配列決定を行った。Lgr5GFPiresCreER（n＝2）およびLgr5GFPDTR（n＝2）の両方の対立遺伝子を試験に含めた。また、比較のために、選別したDclk1GFP刷子細胞およびバルクオルガノイドも含めた。階層的クラスタリングおよび主成分分析（PCA）は、Lgr5＋細胞が、全オルガノイドまたは刷子細胞よりも互いに類似していることを明らかにした（図4Aおよび4B）。それらの細胞周期の違いと一致して、活性および静止Lgr5＋幹細胞は別々にクラスタ化した（図4Aおよび4B）。活性Lgr5細胞と静止Lgr5細胞との間の差次的遺伝子発現分析は、533個の差次的に調節される遺伝子を明らかにし、そのうち290個は静止Lgr5細胞に富んでいた（FDR＜0.01、図5C）。ERK経路の転写エフェクター（Etv4［7.7x、p-adj＜0.001］およびEtv5［7.7x、p-adj＜0.001］）は、静止Lgr5＋幹細胞において下方調節され、効率的なErk阻害を確認した（図4Cおよび4D）。同様に、Ccnb1（2.1x、p-adj＜0.005）およびCcnb2（1.9x、p-adj＜0.05）などのいくつかの細胞周期関連遺伝子は、Ｇ0停止と一致して減少した（図4CおよびS9）。EGFRi処理時に下方調節された遺伝子のGO解析は、細胞周期関連遺伝子の明らかな喪失を確認した（図S9）。静止Lgr5細胞における明確な転写物の1つは、Wntシグナル伝達経路の成分であるLef1（活性Lgr5では検出されない、p-adj＜0.001）である。本発明者らのレポーター発現と一致して、Rnf43（2.3x、p-adj＜0.005）およびLgr5（2x、padj＜0.05）を含む、周知のWnt標的遺伝子の一部の有意な増加が観察された（図4Ｄ）。独立した実験における定量的PCR分析はこれらの結果を確認した（図9）。本発明者らはまた、静止状態のLgr5細胞における転写因子のAP-1ファミリーのメンバー（Junb、Fos、Fosb）の強力な増加を認めた（図4D）。組織学的分析と一致して、パネート細胞、腸細胞および杯細胞特異的遺伝子発現は変化しないままであった。EECおよびその前駆体によって発現されるChgaは、活性Lgr5＋幹細胞と比較して静止状態では7.3倍高かったが、低発現レベルでの大きな変動はさらなる結論を妨げた（p-val＝0.019およびpadj＝0.28）。同様に、Dclk1（6x、p-adj＜0.05）および他のいくつかの刷子細胞マーカーはEGFRi処理時に増加したが、それらのレベルは刷子細胞よりも静止Lgr5細胞において有意に低かった（図4D）。遺伝子発現における全体的な変化は、全ての静止状態のLgr5幹細胞によって共有され得るか、または特定の亜集団における変化の結果であり得る。本発明者らは最近、個々の活性Lgr5細胞がかなり均一であることを示した（Grun et al.（2015）Nature 525:251-255）。本発明者らは、対照またはEGFRi処理オルガノイドからの合計192個のFACS精製単一活性または静止Lgr5細胞の単一細胞配列決定分析を行った。RaceID（Grun et al.（2015）Nature 525:251-255）を使用して、活性および静止Lgr5＋細胞の両方を含む対照およびEGFRi処理細胞の両方からの細胞を含む単一の顕著な集団（クラスタ1）（図4F）を同定した（図9）。小さなクラスタ2（4細胞）および4（1細胞）は、パネート（Lyz1）および刷子（Dclk1）細胞関連遺伝子を発現したが、クラスタ3（1細胞）はクラスタ1に類似していた（図9）。したがって、静止Lgr5集団は均一であり、遺伝子発現におけるいくつかの有意な変化にもかかわらず、静止Lgr5細胞に密接に類似する。
実施例2
ChgaおよびLgr5発現の増加と合わせた静止は（実施例1に記載されているように）、Wintonらによって記載されている標識保持分泌前駆体を想起させる（Buczacki et al.（2013）Nature 495:65-69）。これらの細胞はEECに効率的に分化し、Lgr5細胞の細胞周期離脱がEECの生成を促進し得ることを示唆する。EECによって発現されるホルモンは、胃内容排出、膵酵素の放出、気分および耐糖能のような多種多様な生理学的応答を調節する。それらはサブタイプを定義するためにも使用される（緒言参照）。Gタンパク質共役味覚受容体はホルモン分泌の調節因子として同定されている（Janssen and Depoortere（2013）TEM 24:92-100）。EECは、内腔に直接接触して、微小絨毛で内容物を感知することができる。他のEEC、いわゆる閉鎖型細胞は、管腔内層を有さず、刺激されるためには他の供給源を必要とする（Janssen and Depoortere（2013）TEM 24:92-100）。それらの基底突起の長さも変動し、神経系に接続するために腸ニューロンとシナプス接触を形成し得る。
EEC分化のためのプロトコルを確立するために、出発点として静止状態のLgr5細胞を使用し、分泌分化に関与するNotchおよびWntシグナル伝達経路を変化させた。DAPT処理（D）によるNotchシグナル伝達の阻害は分泌分化を増強し、LYZ＋パネート細胞数の大幅な増加をもたらした（図5A）。DAPTと組み合わせてIWP-2（I）を用いたWnt分泌の阻害は、パネート細胞分化を無効にし、EECおよび杯細胞を誘導した（図5A）。EGFRi処理は杯細胞分化を阻害したが、パネート細胞およびEECは阻害を免れた（図5A）。EGFR/WNT/Notch経路（IDEGFRi）の同時阻害は、腸細胞、杯細胞およびパネート細胞分化を阻害しながら、EECの大幅な増加をもたらした（図5Ａ）。同様に、WntおよびNotchシグナル伝達経路（IDMeki）と合わせたMekの阻害は、CHGA＋細胞数を増加させた。異なるEECサブタイプは、通常の腸オルガノイド培養においてはまれである（図5B）。IDMeki処理は、これらのEEC細胞型の数を確実に増加させた。本発明者らは、qPCRを使用してこれらの結果を裏付けた。汎EECマーカーであるChgaの発現は、IDEGFRiにおいて25倍高く、IDMeki処理オルガノイドでは100倍以上高かった（図5C）。同時に、IDMekiと同様の傾向に従って、IDEGFRi処理の際にSst（55x）、Gip（14x）、Sct（5x）、コレシストキニン（15x）およびグルカゴン（Gcg/プログルカゴン、4x）mRNAの発現が上方調節された（図5C）。Ntsは、対照レベルで発現された、分析した唯一のホルモンであった。したがって、本発明者らのプロトコルは、多数のEECおよび哺乳動物の生理機能を調節する一群のホルモンを発現する様々なサブタイプを成功裏に生成した（Egerod et al.（2012）Endocrinology 153:5782-5795）。
EEC誘導オルガノイドの細胞組成および個々のECCのホルモン発現の不均一性の程度を明らかにするために、本発明者らは単一細胞RNA配列決定分析を行った。IDEGFRiおよびIDMekiで処理したオルガノイドから、生単一細胞（追加マーカーなし）を選別した。本発明者らのフィルタリングに合格した289個の細胞の中で、94個の細胞のクラスタをAldob（4.9x、p-adj＜0.001）、Apoa1（12.6x、p-adj＜0.001）およびAlpi（5.6x、p-adj＜0.001、図10）に富む腸細胞として同定した。残りの集団をよりよく特徴付けるためにこれらをさらなる分析から除外した。IDEGFRiまたはIDMeki処理オルガノイドの両方に由来する細胞をt-SNE空間に同様に分布させ、一緒に分析した（図S4）。
RaceIDを使用して、細胞の12の異なるクラスタを同定した（図6A）。細胞トランスクリプトームのピアソン相関のk平均クラスタリングは、クラスタ間の明確な分離およびクラスタ内の不均一性の可能性を明らかにした（例えば図6Aの7および8）。差次的遺伝子発現分析は各クラスタについてのシグネチャー遺伝子を明らかにし、本発明者らは、これらを、細胞型を分類するために使用した（表S1）。
最も顕著なクラスタは、汎EECマーカーChgaおよびChgbを発現した3（53細胞）および4（35細胞）であった（図6C）。ChgaとReg4の発現は勾配を形成し、どちらもクラスタ4でより高かった。これらのChgb高クラスタにおけるホルモン産生は、どちらもエンテロクロマフィン細胞のマーカーであるTac1およびTph1発現によって最もよく定義された。Tac1はホルモンサブスタンスPをコードし、一方Tph1はセロトニン合成における律速酵素をコードする（Egerod et al.（2012）Endocrinology 153:5782-5795;Grun et al.（2015）Nature 525:251-255）。両方とも、結合した腸管神経細胞を興奮させる神経伝達物質として作用し得る（Latorre et al.（2016）Neurogastroenterology and motility:the official journal of the European Gastrointestinal Motility Society 28（5）:620-630）。
他のクラスタは、比較的低レベルのChgaおよびChgb転写物を有していたが、ホルモンを発現する細胞を含んでいた（図6C）。クラスタ2（21細胞）は、K細胞によって発現されるGip発現（74×）を特徴とした。Fabp5もまた、Gip分泌におけるその役割と一致して、このクラスタにおいて非常に豊富であった（12,6×）（Shibue et al.（2015）American journal of physiology,endocrinology and metabolism 308:E583-591）。クラスタ5（9細胞）メンバーは、それらをD細胞として同定する非常に高レベルのSst（182×）を発現した（図6C）。グレリン（Ghrl）の発現は複数のクラスタに分布していたが、クラスタ6（19×、3細胞）で最も高かった。本発明者らはまた、Islet1（Isl-1、9.7×）がこれらの細胞においてGhrlと共発現していることを認めた。Islet1は細胞運命の特定において重要な役割を果たし、その喪失はグルコースホメオスタシスの障害をもたらす（Terry et al.（2014）American journal of physiology,gastrointestinal and liver physiology 307:G979-991）。クラスタ7（18細胞）の細胞は全てCck（55,7×）を高発現し、このクラスタのサブグループは、Gcg（28,2×）、Ghrl（5,3×）およびPyy（11,4×）などの他のホルモンも豊富であった。一致して、I細胞は様々なレベルで他のホルモンとCckを共発現することが報告されている（Egerod et al.（2012）Endocrinology 153:5782-5795）。
EEC分化の初期の誘発因子の1つはニューロゲニン-3（Neurog3）であり、これにNeurod1が続く。Neurog3（5.2×）の発現は、クラスタ9（6細胞）およびクラスタ9に最も類似するクラスタ3のいくつかの細胞において最も高かった。事実上全てのEECクラスタがNeurod1を発現した。これらの転写因子の一過性の発現を考慮して、本発明者らは、クラスタ9がEEC前駆体であり、これが次にNeurod1を介してEECのパネルを生成すると提案する。クラスタ1（18細胞）は、Agr2（33×）、Muc2（26×）、Ttf3（23×）およびDefa24（28×）などの杯細胞およびパネート細胞関連遺伝子を豊富に含んでいた。濾過した後でさえも、AldobおよびMt1/2を発現するいくつかの残りの腸細胞様細胞が可視であった（クラスタ8、7細胞）。これらのクラスタは、EGFRまたはMek阻害後にそれらの数の増加が見られないので、EEC誘導の前に生成された可能性がある。Dclk1およびTrpm5発現は、クラスタ10（15細胞）を刷子細胞として同定した（図6Bおよび6C）。全体で、分析した145/289個の細胞（全細胞の50％）がEECまたはそれらの前駆細胞であり、本発明者らの誘導プロトコルの高い効率を確認した。
複数のホルモンが同じ細胞内で共発現され得るので、単一細胞レベルでのホルモン発現の不均一性についてさらに調べた（図6D）。本発明者らは、複数のホルモンが発現されるクラスタ2、5、6および7に注目した。Gip、Sst、Cckおよびグレリンの発現に基づく4つの主要な群が可視であった。Cck＋細胞は、Gcg＋Ghrl＋、Gcg＋Ghrl-、Gcg-Ghrl＋およびGcg-Ghrl-クラスタにさらに分けられ、一部は低レベルのSstおよび/またはGipも共発現する。Sst＋細胞のトランスクリプトームはより均質であり、低レベルのGipおよびCckを共発現したが、1つの細胞はGhrlのみを共発現した。本発明者らは以前に、Cck＋細胞とTac1＋細胞との間の部分的な重複を報告した。一致して、クラスタ3および4のTac1＋細胞の一部は低レベルのCckを発現した（図6Bおよび6C）。
全体として、本発明者らの単一細胞分析は、本発明者らのプロトコルが、マーカー遺伝子発現に基づいて培養物の約50％までEECを豊富に含んでいたことを示す。さらに、本発明者らは、複雑なホルモン発現プロフィールを有するいくつかのまれな細胞を含むEECサブタイプのパネルを生成した。
実施例3
Wnt、NotchおよびMAPKシグナル伝達の阻害剤を含有するマウスEEC分化培地を使用してオルガノイドを生成した。これらのオルガノイドは全てのEECサブタイプの混合物を含んだ。セロトニンを産生するエンテロクロマフィン細胞は、これらの培養物中で最も豊富な細胞型であった。異なるEECサブタイプが生成される機構を検討した。これは、培養物の用途を拡大し、これらの細胞の発生を理解することを目的とした。EECサブタイプ特定を制御し得るシグナル伝達経路の最初のスクリーニングにおいて、BMP、ヘッジホッグおよびmTOR経路の調節がEECサブタイプの相対比に影響を与えることが認められた。セクレチン産生S細胞は、Wnt、NotchおよびMAPK阻害の間は特にまれであると考えられる。S細胞は通常、この試験においてオルガノイドが単離されたのと同じ位置である近位十二指腸に存在する。EEC分化培地からノギンを除去し、培地にBMP4（10μg/ml）を添加することによるBMP経路の活性化は、EECサブタイプの相対存在率を変化させた。BMP経路の活性化後、S細胞の数（メッセンジャーでは、対照に比べて400倍）、ならびに細胞当たりのセクレチンレベル（IHCに基づく）の劇的な増加が観察された。S細胞のこの増加は、エンテロクロマフィン細胞の数を犠牲にしていると考えられ、潜在的な発生経路の重複を示唆する。実施例5におけるBMPシグナル伝達の役割についてのさらなる考察を参照のこと。
実施例4
ヒト小腸（SI）オルガノイドを最初に増殖培地中で培養して（Sato et al.（2011）Gastroenterology 141（5）:1762-72に記載されているように）幹細胞数を増加させ、次いで分化培地（Wnt馴化培地、TGFβ阻害剤、p38阻害剤およびニコチンアミドを含まない増殖培地）に再接種して分化に向かわせた。再接種は、冷培地でのMatrigelの破壊（オルガノイドの解離なし）、基礎培地（PBSも使用することができる）によるオルガノイドの洗浄、およびその後の新鮮Matrigelへの接種（オルガノイドの解離なし）を含んだ。次いで、オルガノイドを分化培地中で1日間培養した。その翌日、EEC特異的腸内分泌分化プロトコル。これは、1.5μMのIWP2、10mMのDAPT、100nMのMEKi PD0325901を添加した標準分化培地（Wnt馴化培地、TGFβ阻害剤、p38阻害剤およびニコチンアミドを含まない増殖培地）と同じであるEEC分化培地の5日間の添加を含んだ。この実験では、これらのヒト細胞をEEC運命に分化させるために、おそらくヒトの系でEGFを産生するパネート細胞が存在しないことにより、実施例3におけるマウス細胞のEEC運命への分化に必要なレベルよりもはるかに低いレベルのMAPK阻害剤しか必要としなかった（マウス系での1～5μMに対して100～500nM）。
考察
ここで本発明者らは、EGFシグナル伝達をオルガノイドにおけるLgr5幹細胞増殖の不可欠な推進因子として同定する。Wntシグナル伝達は手つかずであるがEGFシグナル伝達はブロックされる条件下で、活発に分裂するLgr5幹細胞は、様々なWnt標的遺伝子の発現を保持する静止状態のLgr5細胞に変換する。この細胞状態は最大1週間まで維持され得る。それにもかかわらず、EGFシグナル伝達の単純な回復は、静止細胞をそれらの正常な活性幹細胞状態に戻す。差次的発現分析は、Ets様因子Etv4およびEtv5などの周知の増殖誘導転写因子の喪失を明らかにし、それらが幹細胞分裂において重要な役割を果たすことを示唆した。
したがって、EGFRシグナル伝達の化学的阻害は、それらの幹細胞能に影響を及ぼすことなくLgr5＋幹細胞を停止させた。本発明者らは、高レベルのWntシグナル伝達が、誘導された静止の間この幹細胞能を維持すると考える。オルガノイドおよび陰窩において、Lgr5＋細胞は常にWnt3分泌パネート細胞に直接隣接している（Sato et al.（2011）Nature 469:415-418）。この状況では、Wnt3は長い距離にわたって拡散するのではなく、Lgr5幹細胞上に直接負荷される（Farin et al.（2016）Nature 530:340-343）。静止Lgr5幹細胞は、EGFRi処理オルガノイドにおいてパネート細胞と並置されたままであり、したがって、高い局所的Wntシグナルに曝露される。
実際に、3つの独立したWnt標的遺伝子対立遺伝子ならびに遺伝子発現分析は、EGFR阻害時のWntシグナル伝達の増加を確認した。要するに、本発明者らの結果は、幹細胞運命の維持はWntを必要とするがEGFを必要とせず、一方、幹細胞増殖はWntとEGFの組み合わせに依存することを示す。
以前の試験は、幹細胞能を有する「＋4」位置の分化帯に近い静止細胞を同定した（Sangiorgi and Capecchi（2008）Nature Genetics 40:915-920;Takeda et al.（2011）Science 334:1420-1424;Yan et al.（2012）Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109:466-471）。本発明者らは、この位置で分泌細胞を独占的に生成するDll1＋前駆体の存在を報告した（van Es et al.（2012）Nature cell biology 14:1099-1104）。Doug Wintonのグループは、ヒストン標識保持アッセイを用いて、分泌分化能を有する同様の集団を同定した。これらの標識保持細胞は、Lgr5の発現を含めてCBCとシグネチャーを共有するが、Chgaなどの分泌系遺伝子の一部の良好なレベルを発現する（Buczacki et al.（2013）Nature 495:65-69）。合わせて考慮すると、これらの分泌前駆体は一過性の状態であるが、必要が生じた場合は幹細胞に脱分化することができ、したがって通性幹細胞とみなすことができる（Buczacki et al.（2013）Nature 495:65-69;van Es et al.（2012）Nature cell biology 14:1099-1104）。陰窩内の豊富な腸細胞前駆体についても同様の状況が存在する（Tetteh et al.（2016）Cell stem cell 18:203-213）。
驚いたことに、本発明者らは、ChgaなどのEECマーカーの発現に対する静止Lgr5細胞のわずかな偏りを認め、これはDoug Wintonによって同定されたLgr5＋標識保持細胞を想起させた。EECは腸上皮の細胞の1％未満であるが、それでも細胞数の点で人体における最大の内分泌器官を形成する（Latorre et al.（2016）Neurogastroenterology and motility:the official journal of the European Gastrointestinal Motility Society 28（5）:620-630）。EECは、栄養素や微生物などの管腔内容物のセンサーとして作用し、ホルモンの分泌を介してグルコース感受性、胃内容排出、気分および食欲などの生理学的応答を調節すると提案されている（Janssen and Depoortere（2013）TEM 24:92-100）。EECの機能的研究は、これらの細胞を大量に生成するための堅固なインビトロ系の欠如によって妨げられてきた。本発明者らは以前に、Notch阻害による幹細胞の分泌細胞への指向性分化を報告した（van Es et al.（2005）Nature 435:959-963）。パネート細胞形成は、Notch阻害と組み合わせた活性Wntシグナル伝達を必要とし（van Es et al.（2012）Nature cell biology 14:1099-1104;van Es et al.（2005）Nature 435:959-963）、WntおよびNotchシグナル伝達の同時阻害は主に杯細胞を生成する（van Es et al.（2005）Nature 435:959-963;Yin et al.（2014）Nature Methods 11:106-112）。EGFR経路の阻害をWntおよびNotch遮断と組み合わせることによって、多様な種類のEECが初代細胞培養物において効率的に形成される。EGFRシグナル伝達は、杯細胞の産生にとって重要であることが示されている（Heuberger et al.（2014）Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111:3472-3477）。本発明者らは、Notch、WntおよびEGFRシグナル伝達をそれぞれ阻害することによる腸細胞、パネート細胞および杯細胞運命の同時阻害がEECの生成の鍵であると考える。
特定のペプチドの産生に基づいて、最大20のサブタイプのEECを識別することができる。これらの細胞は近位から遠位の消化管に種々の頻度で存在する。ある種のEECは、転写物およびタンパク質レベルの両方でいくつかの機能的に関連するホルモンを発現することが見出されている（Egerod et al.（2012）Endocrinology 153:5782-5795;Grun et al.（2015）Nature 525:251-255）が、この一部は成熟の中間段階である可能性がある。本発明者らは、単一細胞トランスクリプトームプロファイリングによって、EECのいくつかの主要なサブタイプの同時生成を実証する。本発明者らの以前の研究（Grun et al.（2015）Nature 525:251-255）を確認して、EECのChga高およびChga低集団を検出する。前者は、Tac1/Tph1を発現するEECが豊富に含まれており、一部の細胞はCckを低発現する。後者はホルモン発現が非常に多様である。全体的に類似のトランスクリプトームプロフィールを有する細胞は、それらがホルモン発現に基づいていくつかのクラスに細分することができるとしても、一緒に集合する。ホルモン発現レベルの広い分布は、EECサブタイプ間の分離が明確ではないことを示唆する。それらの発現は、少なくとも部分的には確率論的であり、時間的に動的でさえあり得ると推測することは魅力的である。
実施例5
腸内分泌細胞は陰窩から絨毛への移動の間にホルモン発現を変化させる
複数の腸内分泌細胞ホルモンは、腸の陰窩および絨毛において異なって濃縮されている。L細胞は陰窩においてGLP1およびPYYを共発現するが、絨毛ではGLP1発現をほとんど欠く（図20A～C）。エンテロクロマフィン細胞は、陰窩-絨毛軸全体に沿ってセロトニンを産生するが、陰窩内でTac1および絨毛内でセクレチンを選択的に共発現する（図20D～E）。これは、EECが陰窩から絨毛への移動の間にホルモン発現を切り替えることができ、陰窩と絨毛のEECの間に潜在的な系統関係があることを示唆する。しかしながら、この所見に対する別の説明は、絨毛内のセクレチンまたはPYYに対して免疫反応性の細胞は陰窩内の無関係な前駆体に由来し、セロトニンおよびTac1またはGLP1については陰性であるということである。そのような分化転換事象がEECの生存期間中に起こり得ることを示すために、本発明者らはTac1-Cre/Rosa26tdTomatoマウス由来の腸を分析した。このレポーターは、Tac1とセロトニンを共発現する陰窩内の細胞を忠実に標識する。さらに、絨毛中のセロトニン＋細胞およびセクレチン＋細胞の大部分が追跡されるが、Tac1については陰性である。CCKを含む他のホルモンはTac1/セロトニン＋前駆細胞に由来しない。これらのデータは、個々のEECが陰窩と絨毛で異なるセットのホルモンを発現できることを示唆する。セクレチン産生細胞の大部分はエンテロクロマフィン系統の一部である。ホルモン発現を切り替えるEECの能力は、EECの無関係な分化経路が以前に予想されていたよりも少ない可能性があるが、むしろ限られた数の細胞によって産生されるホルモンのタイプの変化がEECの過剰状態を作り出すことを意味する。
BMPシグナル伝達は腸内分泌細胞において絨毛ホルモンシグネチャーを誘導する
次に、陰窩から絨毛への移動が起こるホルモン切り替えがEECのデフォルトの成熟過程の一部であるのかどうか、またはこれが単に、EECが曝露されている種々のニッチシグナルを反映しているのかを検討した。上昇レベルのBMPおよびヘッジホッグ、ならびに下降レベルのWntシグナルを含む、複数のモルフォゲンが陰窩から絨毛に至るまで存在することは公知である。先の実施例に記載されたマウス腸オルガノイド系における腸内分泌細胞の分化プロトコルは、主にWnt、MAPKおよびNotchシグナル伝達経路の三重阻害に基づく。本発明者らは、この分化培地を使用し、幹細胞因子ノギンを分化カクテルに添加して、このようにしてBMP低環境を作り出した。驚くべきことに、本発明者らは、この培養物中の全てのエンテロクロマフィン細胞が常にセロトニンとTac1を共発現するのに対し、セクレチン発現が欠如していることを認めた。したがってこの培養物は、陰窩状態を想起させるEECホルモンシグネチャーを反映しており、ニッチシグナルが時間的に駆動されるEEC成熟よりも優勢であることを意味する。
ニッチシグナルが実際にEECホルモンシグネチャーを調整しているのかどうかを調べるために、本発明者らが以前に定義したEEC分化系を出発点として使用し、このカクテルのバックグラウンドでシグナル伝達経路を変化させた。ヘッジホッグシグナル伝達を阻害するためにビスモゲニブを添加し、BMPR1a/BMPR2シグナル伝達を活性化するためにノギンを除去し、種々のTGF-βファミリー受容体経路を変更するためにALK5/4/7阻害剤A83またはTGF-β1を添加した。WntはPorcupine阻害剤IWP2によってEEC分化カクテルにおいて既に制限されているが、本発明者らは、Wntのより顕著で迅速な阻害を得るために上部のR-スポンジンを除去した。本発明者らは、SctおよびGcg転写物レベルをそれぞれ絨毛および陰窩ホルモンシグネチャーの代用として使用したが、ChgAは、陰窩から絨毛まで一定の発現を有する転写物として含めた。ヘッジホッグシグナル伝達の阻害は、腸間葉におけるその主要な役割と一致して、評価したホルモンのいずれも調節しない。A83とTGF-beta1は両方とも全てのEECホルモンの発現を阻害した。R-スポンジン除去は、同様に、評価した全てのホルモンのEEC分化を障害した。これは、Notchシグナルを失うときに分泌運命を選択するのではなく、Wntシグナルが阻害されるときの幹細胞の吸収系統への急速な分化に起因して潜在的に関連する。最後に、EEC分化の間のノギンの除去は、陰窩から絨毛への発現プロフィールの切り替えと一致して、Gcg転写を抑制しながらSctの発現を誘導した。本発明者らは、BMPシグナル伝達をさらに増幅するためにこのEEC分化カクテルに外因性BMP4を加え、本発明者らが以前に定義した「EEC BMP低」培地と比較してこの組み合わせを「EEC BMP高」と命名した。この「EEC BMP高」分化培地を用いてオルガノイドを刺激すると、セクレチンに対して免疫反応性の細胞、ならびにTac1なしでセロトニンを発現するエンテロクロマフィン細胞の産生を誘導する。GLP1＋細胞数は、このレジメンでは大幅に減少し（図21A～C）、オルガノイドの明らかな形態学的変化を伴わなかった。異なる腸領域から確立されたオルガノイドは、ホルモンシグネチャーに関してそれらの領域同一性を維持しており、近位のSIではGIP、遠位のSIではPyy、NtsおよびGcgが豊富に含まれていた。ChgA、Tph1、CCKおよび十二指腸GIPを含む、陰窩から絨毛への均一な分布を示す他のホルモンまたはEECマーカーは、異なるBMPレベルによって少しだけ影響を受ける。本発明者らは、絨毛で最も高く発現されるPyyとNtsの上方調節を観察する。BMPの作用を以下の表に要約する。まとめると、これらのデータは、絨毛のEECに関連するホルモンの誘導におけるBMPシグナルの役割を示す。
Figure 2022068302000021
実施例6
35mg/kgのLDN193189（Selleckchemカタログ番号S2618）を、60時間の処置においてマウスに強制経口投与によって与えた。LDN193189をpH 3.1のクエン酸に溶解し、強制経口投与を1日2回行った。これは、対照マウスと比較して腸の絨毛においてGLP1発現細胞の拡大をもたらした。セクレチン発現は、対照マウスと比較して腸の絨毛の細胞において大幅に減少した（図22参照）。使用した用量は上限であり、より低い用量も有効であると予想される。これらの結果をヒトに当てはめることができると仮定される。LDN193189は、C2C12細胞において、それぞれ5nMおよび30nMのIC50でI型BMP受容体ALK2およびALK3の転写活性を阻害する選択的BMPシグナル伝達阻害剤であり、TGF-βに比べてBMPに200倍の選択性を示す。本明細書に記載のもののような他のBMPシグナル伝達阻害剤も、インビボで同様の作用を有すると想定される。BMP阻害剤（および逆にBMP活性化剤）は、インビボでのGLP1および/またはセクレチンの調節が望ましい治療法における使用の潜在的可能性を有すると結論付けられる。例としては、糖尿病、肥満、低塩酸症または過塩酸症の治療が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
LDN193189の構造：
Figure 2022068302000022

Claims (40)

  1. 前駆細胞を分化させるための方法であって、
    基礎培地を含み、かつ1つまたは複数のEGFR経路阻害剤、Notch阻害剤および1つまたは複数のWnt阻害剤をさらに含む分化培地中で、該細胞を培養する工程
    を含む、方法。
  2. 1つまたは複数のEGFR経路阻害剤が、（1）EGFR阻害剤、（2）EGFRおよびErbB2阻害剤、（3）RAS-RAF-MAPK経路の阻害剤、（4）PI3K/AKT経路の阻害剤ならびに（5）JAK/STAT経路の阻害剤から選択される、請求項1記載の方法。
  3. 1つまたは複数のEGFR経路阻害剤が、ゲフィチニブなどのEGFR阻害剤を含む、請求項2記載の方法。
  4. 1つまたは複数のEGFR経路阻害剤が、アファチニブなどのEGFRおよびErbB-2阻害剤を含む、請求項2または3記載の方法。
  5. 1つまたは複数のEGFR経路阻害剤が、RAS-RAF-MAPK経路の阻害剤、例えば、PD0325901などのMEK阻害剤、および/またはSCH772984などのERK阻害剤を含む、請求項2～4のいずれか一項記載の方法。
  6. Notch阻害剤が、γ-セクレターゼ阻害剤、任意でDAPTまたはジベンザゼピン（DBZ）またはベンゾジアゼピン（BZ）またはLY-411575である、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
  7. 1つまたは複数のWnt阻害剤が、（1）Wnt分泌の阻害剤、（2）WntもしくはRスポンジンとWnt受容体複合体との相互作用の競合的もしくは非競合的阻害剤、（3）Wnt受容体複合体の成分の分解を促進する阻害剤、（4）Dishevelledファミリータンパク質の阻害剤、（5）分解複合体活性を促進する活性化剤、（6）分解複合体の脱オリゴマー化の阻害剤、および/または（7）β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤から選択される、請求項1～6のいずれか一項記載の方法。
  8. 1つまたは複数のWnt阻害剤が、Wnt分泌の阻害剤、例えば、IWP 2、LGK974およびIWP 1から選択されるPorc阻害剤を含む、請求項7記載の方法。
  9. 分化培地が、1mM未満のEGFを含む、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
  10. 分化培地が、
    p38阻害剤、TGF-β阻害剤、ガストリン、糖質コルチコイド、受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP経路活性化剤、cAMP経路活性化剤、ヘッジホッグ活性化剤、ヘッジホッグ阻害剤、mTORシグナル伝達のモジュレータ、B27およびN2からなる群より選択される1つもしくは複数の成分;または
    p38阻害剤、TGF-β阻害剤、ガストリン、糖質コルチコイド、受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP阻害剤、cAMP経路活性化剤、ヘッジホッグ活性化剤、ヘッジホッグ阻害剤、mTORシグナル伝達のモジュレータ、B27およびN2からなる群より選択される1つもしくは複数の成分;または
    BMP7、BMP4もしくはBMP2などのBMP活性化剤;または
    ノギン、スクレロスチン、コーディン、CTGF、フォリスタチン、グレムリン、tsg、sog、LDN193189もしくはドルソモルフィンなどのBMP阻害剤
    をさらに含む、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
  11. 請求項1～10のいずれか一項記載の分化培地。
  12. 請求項11記載の分化培地中で腸前駆細胞を培養する工程
    を含む、腸内分泌細胞を豊富に含む腸細胞の集団を得るために腸前駆細胞を分化させるための方法。
  13. 増殖した上皮幹細胞を得るために、上皮幹細胞用の増殖培地の存在下で上皮幹細胞を培養する工程;およびその後、
    請求項11記載の分化培地中で、1つまたは複数の該増殖した細胞を培養する工程
    を含む、上皮幹細胞を培養するための方法。
  14. 前記細胞を、細胞外マトリックスと接触させて培養する、請求項1～10、12および13のいずれか一項記載の方法。
  15. 分化細胞集団または分化オルガノイドを得る工程および/または単離する工程をさらに含む、請求項1～10および12～14のいずれか一項記載の方法。
  16. 前駆細胞が、例えば腸、胃、膵臓、肝臓、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、膀胱、耳または甲状腺由来の、上皮細胞である、請求項1～10および13～15のいずれか一項記載の方法。
  17. 前駆細胞が、腸、胃、膵臓または肺に由来する、請求項16記載の方法。
  18. 前駆細胞が哺乳動物前駆細胞、例えばヒト前駆細胞である、請求項1～10および12～17のいずれか一項記載の方法。
  19. 好ましくは分化腸オルガノイドを得るために、腸上皮幹細胞を培養するための方法であって、
    増殖培地の存在下で、1つまたは複数の腸上皮幹細胞を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程であって、好ましくは、該増殖培地が、基礎培地を含み、かつ受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP阻害剤およびWntアゴニスト、ならびに任意で、バルプロ酸およびGSK-3阻害剤（例えばCHIR99021）をさらに含む、工程;ならびにその後、
    請求項11記載の分化培地の存在下で、該1つまたは複数の増殖した腸上皮幹細胞を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程
    を含む、方法。
  20. 請求項1～10および12～19のいずれか一項記載の方法によって得ることのできるまたは得られたオルガノイド。
  21. 肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、膀胱、耳または甲状腺に由来する、好ましくは腸、胃、膵臓または肺に由来する、請求項20記載のオルガノイド。
  22. ヒトに由来し、かつ少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％の細胞が腸内分泌細胞マーカーを発現する、請求項20または21記載のオルガノイド。
  23. マウスに由来し、かつ少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％の細胞が腸内分泌細胞マーカーを発現する、請求項20または21記載のオルガノイド。
  24. 腸内分泌細胞マーカーが、Chga、Chgb、Tac1、Tph1、Gip、Fabp5、Ghrl、Pyy、Nts、Neurod1、Sst、Sct、コレシストキニン、グルカゴンおよび/またはプログルカゴンから選択される、請求項22または23記載のオルガノイド。
  25. オルガノイド、例えば請求項20～24のいずれか一項記載のオルガノイドと、請求項11記載の分化培地とを含む、組成物。
  26. 創薬スクリーニング;毒性アッセイ;診断法;組織発生学、細胞系譜および分化経路の調査;各ホルモンの放出をもたらす化学および/もしくは神経シグナルを同定する調査;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現試験;組織の損傷と修復に関与する機構の調査;炎症性および感染性疾患の調査;発症機構の研究;または細胞形質転換の機構およびがんの病因の研究における、請求項20～24のいずれか一項記載のオルガノイドまたは該オルガノイドに由来する細胞の使用。
  27. 医療における使用のための、例えば、障害、状態または疾患の治療における使用のための、請求項20～24のいずれか一項記載のオルガノイド、または該オルガノイドに由来する細胞。
  28. 前記医療が再生医療であり、例えば、前記使用が前記オルガノイドまたは前記細胞の患者への移植を含む、請求項27記載の使用のためのオルガノイドまたは該オルガノイドに由来する細胞。
  29. 1つまたは複数のEGFR経路阻害剤、Notch阻害剤および1つまたは複数のWnt阻害剤を含む薬学的製剤。
  30. 請求項20～24のいずれか一項記載の分化オルガノイドを候補分子（または候補分子のライブラリ）と接触させる工程、
    該オルガノイドを、任意の作用（例えば増殖の減少もしくは消失、形態学的変化および/もしくは細胞死などの、細胞における何らかの変化）またはオルガノイドの変化（例えばオルガノイドのサイズもしくは運動性）について評価する工程、
    該作用を引き起こす候補分子を、薬物または化粧品の可能性を有するものとして同定する工程、ならびに任意で、
    該候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
    を含む、治療用もしくは予防用の医薬薬物または化粧品をスクリーニングするための方法。
  31. Lgr5＋幹細胞静止を誘導するための方法であって、
    該細胞を1つまたは複数のEGFR経路阻害剤で処理する工程
    を含む、方法。
  32. 前記細胞が、例えばFACSによって評価されるような、継続的なLgr5発現、および/または例えばpTOPFLASHおよびpFOPFLASH Tcfルシフェラーゼレポーター構築物によって評価されるような、Wntシグナル伝達を有する、請求項31記載の方法。
  33. 静止が、KI67発現の喪失によって示される、請求項31または32記載の方法。
  34. 前記細胞を、1つまたは複数のEGFR経路阻害剤で少なくとも1週間処理する、請求項31～33のいずれか一項記載の方法。
  35. 前記細胞が、Lgr5およびLef1を発現し、かつ、KI367、およびM期マーカーであるホスホヒストンH3を発現しない、請求項31～34のいずれか一項記載の方法によって得られる静止幹細胞集団。
  36. 請求項11記載の分化培地中で細胞の集団を培養する工程を含む、EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法。
  37. BMP阻害剤を含む請求項11記載の分化培地中で細胞の集団を培養する工程を含む、GLP1分泌EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法。
  38. BMP経路活性化剤を含む請求項11記載の分化培地中で細胞の集団を培養する工程を含む、セクレチン分泌EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法。
  39. 治療有効量のBMP阻害剤を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、糖尿病または関連する疾患もしくは障害を治療するまたは予防する方法における使用のためのBMP阻害剤。
  40. 治療有効量のBMP活性化剤を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、過塩酸症または肥満を治療する方法における使用のためのBMP活性化剤。
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