KR20190028443A - 개선된 분화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포를 분화시키기 위한, 예를 들어 장내분비세포를 수득하기 위한 방법 및 배지, 및 상기 방법에 의해 수득된 세포 및 오가노이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 장내분비세포에서 호르몬 발현을 조절하는 방법 및 상기와 같은 방법과 관련된 의학적 용도에 관한 것이다.

Description

개선된 분화 방법
본 명세서에 인용된 모든 문서는 내용 전체가 참고로 인용된다.
기술 분야
본 발명은 세포 배양배지 및 방법, 특히 전구세포, 예를 들어 인간 상피 줄기세포를 분화시키기 위한 배양배지 및 방법의 분야에 있다.
전구세포의 분화를 위한 배양 배지 및 방법에 대한 관심이 크다. 전구세포 및 그의 분화된 자손을 세포 분석, 약물 선별, 및 독성 분석에 사용할 수 있다. 전구세포 및 그의 분화된 자손은 또한 세포기반 치료법, 예를 들어 손상된 조직의 치료를 위한 재생의학에 유망성을 보인다. 더욱 또한, 효율적인 세포 배양배지는 연구 목적을 위한 세포 집단의 제공 및 유지에 중요하다.
장내분비세포(EEC)는 Lgr5 줄기세포로부터 생성될 수 있는 희귀한, 호르몬-분비 세포이다(Koo and Clevers (2014) Gastroenterology 147:289-302). 가장 통상으로, 하위유형들은 그들의 분비된 호르몬을 기준으로 구분되며 여기에는 소마토스타틴+(SSt) D세포, 위억제성 단백질+(Gip) K-세포, 세크레틴+(Sct) S-세포, 콜레시스토키닌(Cck) I-세포, 글루카곤-유사 단백질 1+(GLP-1) L-세포, 뉴로텐신+(Nts) N-세포 및 세로토닌 생산 엔테로크로마핀 세포(Gunawardene et al. (2011) International journal of experimental pathology 92:219-231)가 포함된다. 그러나, 단일 EEC는 높은 수준의 이질성을 강조하면서, 다수의 호르몬을 다양한 수준으로 발현한다(Egerod et al. (2012) Nature cell biology 14:1099-1104). EEC는 장 기능 및 유기체 대사의 다양한 태양들을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지지만, 상기 세포의 희소성은 그의 면밀한 연구 및 활용에 장애를 제기하였다.
다수의 조직들(예를 들어 췌장, 결장, 장움 및 위)로부터 유래된 전구세포의 분화 방법들이 기재되었다(WO　2010/090513, WO 2012/014076, WO　2012/168930 및 WO 2015/173425를 참조하시오). 장세포, 배상세포 및 파네스 세포 분화를 유도하는 방법들이 공지되었다.
EEC 운명을 향한 전구세포의 보다 높은 분화 효율을 생성시키는 개선된 배양 배지 및 방법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 전구세포의 분화 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
상기 세포를 기본 배지를 포함하고 하나 이상의 EGFR 경로 억제제, 노취 억제제 및 하나 이상의 Wnt 억제제를 추가로 포함하는 분화 배지에서 배양시킴
을 포함한다.
본 발명은 또한 기본 배지를 포함하고 하나 이상의 EGFR 경로 억제제, 노취 억제제 및 하나 이상의 Wnt 억제제를 추가로 포함하는 분화 배지를 제공한다.
본 발명은 또한 장내분비세포가 풍부한 장세포 집단을 수득하기 위한 장 전구세포의 분화 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
상기 장 전구세포를 본 발명의 분화 배지에서 배양시킴
을 포함한다.
본 발명은 또한, 바람직하게는 오가노이드를 수득하기 위한 상피 줄기세포의 배양 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
하나 이상의 상피 줄기세포를 증식 배지의 존재하에서 세포외 기질과 접촉하여 배양시키고;
상기 하나 이상의 증식된 상피 줄기세포를 본 발명의 분화 배지에서 배양시킴
을 포함한다.
본 발명은 또한, 바람직하게는 분화된 장 오가노이드를 수득하기 위한 장상피 줄기세포의 배양 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
하나 이상의 장상피 줄기세포를 증식 배지의 존재하에서 세포외 기질과 접촉하여 배양시키고; 바람직하게는 상기 증식 배지는 기본 배지를 포함하며, 수용체 티로신 키나제 리간드(예를 들어 EGF), BMP 억제제(예를 들어 노긴) 및 Wnt 작용물질(예를 들어 R스폰딘) 및 임의로 발프로산 및 GSK-3 억제제(예를 들어 CHIR99021)를 추가로 포함하고; 후속적으로
상기 하나 이상의 증식된 장상피 줄기세포를 본 발명의 분화 배지의 존재하에서 세포외 기질과 접촉하여 배양시킴
을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 또는 수득되는 오가노이드를 제공한다.
본 발명은 또한 세포의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 99%가 장내분비세포 마커를 발현하는 오가노이드를 제공한다.
본 발명은 또한 의학에 사용하기 위한 본 발명의 오가노이드, 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 약물 발견 선별; 독성 분석; 진단학; 조직 발생학, 세포 계통 및 분화 경로의 연구; 각각의 호르몬의 방출을 유도하는 화학적 및/또는 뉴런 신호를 식별하기 위한 연구; 재조합 유전자 발현을 포함한 유전자 발현 연구; 조직 손상 및 수복에 관련된 기전의 연구; 염증 및 감염성 질병의 연구; 발병기전의 연구; 또는 세포 형질전환의 기전 및 암 병인학의 연구에서 본 발명의 오가노이드, 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 EGFR 경로 억제제, 노취 억제제 및 하나 이상의 Wnt 억제제를 포함하는 약학 제형을 제공한다.
치료학적 또는 예방학적 약학 약물 또는 화장품에 대한 선별 방법에서, 상기 방법은
본 발명의 분화된 오가노이드를 후보 분자(또는 후보 분자들의 라이브러리)와 접촉시키고,
상기 오가노이드를 임의의 효과(예를 들어 세포에서의 임의의 변화, 예를 들어 증식의 감소 또는 손실, 형태학적 변화 및/또는 세포사) 또는 오가노이드의 변화(예를 들어 오가노이드 크기 또는 운동성)에 대해 평가하고;
잠재적인 약물 또는 화장품으로서 상기 효과를 야기하는 후보 분자를 식별하고; 임의로
상기 후보 분자를 약제 또는 화장품으로서 제조함
을 포함한다.
본 발명은 또한 Lgr5+ 줄기세포의 정지를 유도하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
상기 세포를 하나 이상의 EGFR 경로 억제제로 처리함
을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 Lgr5+ 전구줄기세포 정지를 유도하는 방법에 의해 수득되는 정지성 줄기세포 집단을 제공하며, 여기에서 상기 세포는 Lgr5 및 Lef1을 발현하고 KI67 및 M기 마커 포스포-히스톤 H4를 발현하지 않는다.
본 발명은 또한 EEC가 풍부한 세포 집단을 수득하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 본 발명의 분화 배지에서 세포 집단을 배양시킴을 포함한다.
본 발명은 또한 GLP1-분비 EEC가 풍부한 세포 집단을 수득하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 본 발명의 분화 배지에서 세포 집단을 배양시킴을 포함하고, 여기에서 상기 분화 배지는 BMP 억제제를 포함한다.
본 발명은 또한 세크레틴-분비 EEC가 풍부한 세포 집단을 수득하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 본 발명의 분화 배지에서 세포 집단을 배양시킴을 포함하고, 여기에서 상기 분화 배지는 BMP 경로 활성제를 포함한다.
본 발명은 또한 당뇨병 또는 관련 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 BMP 억제제를 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 치료 또는 예방이 필요한 피실험자에게 치료 유효량의 BMP 억제제를 투여함을 포함한다.
본 발명은 또한 위산과다증 또는 비만의 치료 방법에 사용하기 위한 BMP 활성제를 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 치료가 필요한 피실험자에게 치료 유효량의 BMP 활성제를 투여함을 포함한다.
다양한 조직으로부터 전구세포를 분화시키는 방법은 앞서 WO 2010/090513, WO 2012/014076, WO 2012/168930 및 WO 2015/173425에 기재되었다. 장 전구세포의 장세포, 배상세포 또는 파네스 세포 운명을 향한 분화를 촉진시키는 방법이 기재되었다. 이들은 도 11에 요약되어 있다. 그러나, 장 전구세포의 EEC 운명으로의 분화를 증대시키기 위한 방법 및 배지는 앞서 기재되지 않았다. 본 발명자들은 놀랍게도 분화 배지 중의 Wnt 억제제, EGFR 경로 억제제 및 노취 억제제의 조합이 전구세포의 EEC 운명으로의 분화를 증대시킴을 발견하였다(실시예 2를 참조하시오). EEC는 생체내에서 장 상피 중 세포의 1% 미만을 차지한다. 그러나, 본 발명자들의 방법 및 분화 배지는 상기 세포의 ∼50%가 EEC인 오가노이드를 생성시킬 수 있었다.
본 발명자들은 또한 놀랍게도 BMP 신호전달 경로를 조절함으로써, 특히 발현 수준 및 호르몬 분비와 관련하여 EEC 표현형을 조절할 수 있음을 발견하였다(실시예 5를 참조하시오). 본 발명자들은 몇몇 EEC 표현형이 BMP 신호전달을 활성화시키거나 억제시킴으로써 획득될 수 있음을 입증하였다. 본 발명자들은 또한 상기 방법이 생체내에서 유효할 수 있으며 따라서 치료법에서 BMP 활성제 및 억제제에 유망한 신규의 용도를 제공함을 입증하였다.
본 발명자들은 또한 놀랍게도 배양 배지 중 EGFR 경로 억제제의 존재가 Lgr5+ 줄기세포의 정지를 촉진함을 발견하였다(실시예 1을 참조하시오). 특히, 본 발명자들은 줄기세포 잠재성이 유지되지만 증식은 멈추는 새로운 정지 상태를 발견하였다. 줄기세포 잠재성 및 증식을 분리시킬 수 있음은 이전에는 공지되지 않았다.
Wnt 억제제
본 발명의 분화 배지는 Wnt 억제제를 포함한다. 임의의 적합한 Wnt 억제제를 사용할 수 있다.
상기 Wnt 신호전달 경로는 활성화될 때 전형적으로는 β-카테닌 분해를 방지하고 β-카테닌-매개된 신호전달을 증대시킨다. 상기 경로는 프리즐드(Frizzled) 수용체 및 LRP5/6을 포함하는 세포-표면 Wnt 수용체 복합체가, 대개는 세포외 신호전달 분자, 예를 들어 상기 Wnt과의 일원에 의해 활성화될 때 발생하는 일련의 사건에 의해 한정된다. 상기는 세포내 β-카테닌을 분해하는 단백질의 파괴 복합체를 억제하는 디셰벌드(Dishevelled)과 단백질의 활성화를 생성시킨다. 상기 파괴 복합체는 APC 및 액신(여기에 카제인 키나제 CK1α, δ 및 ε, 및 GSK-3가 모인다)을 포함한 구조 성분들로 형성된다. 상기 파괴 복합체는 β-케테닌을 인산화하고 상기를 유비퀴틴 리가제, β-TrCP에 노출시키는 것으로 생각된다. 이어서 상기 β-카테닌의 유비퀴틴화는 프로테아솜에서 그의 분해를 생성시킨다.
상기 β-카테닌의 주요 효과기 기능은 핵 중에 있으며, 여기에서 상기는 TCF/LEF과 전사인자(예를 들어 Tcf-1, Tcf-3, Tcf-4 및 Lef1)를 포함한 다양한 전사 인자들과의 상호작용을 통해 전사를 조절한다.
상기 Wnt 경로는 고도로 조절된다. 예를 들어, Wnt 신호전달은 R스폰딘이 그의 수용체(Lgr4, Lgr5 및/또는 Lgr6)에 결합할 때 증대된다. 그러나, 2개의 막관통 E3 유비퀴틴 리가제, Rnf43 및 Znrf3는 세포 표면으로부터 R스폰딘 수용체(예를 들어 Lgr4, Lgr5 및/또는 Lgr6)를 제거하는 것으로 나타났다(예를 들어 문헌[de Lau et al. 2016]을 참조하시오). R스폰딘은 척추동물-특이성 Wnt-증대제이다. 또한, 상기 프리즐드 수용체에 대한 디셰벌드과 단백질의 결합은 대퍼(Dapper)과 단백질(예를 들어 대퍼1 및 대퍼3)에 의해 억제될 수 있다. 더욱 또한, 상기 파괴 복합체의 활성은 APC, 액신 및 GSK-3의 인산화 상태에 의해 부분적으로 조절되는 것으로 생각된다. 예를 들어, 포스파타제(예를 들어 세린/쓰레오닌 포스파타제, 예를 들어 PP1, PP2C 또는 PP2A)에 의한 APC 또는 액신의 탈인산화는 β-카테닌 분해를 억제할 수 있다. 또한, 키나제(예를 들어 p38 MAPK, PKA, PKB, PKC, p90RSK 또는 p70S6K)에 의한 GSK-3의 인산화는 GSK-3 활성을 억제할 수 있으며 따라서 β-카테닌 분해를 억제할 수 있다.
상기 파괴 복합체의 안정성은 2개의 PARP, 탱키라제(Tankyrase) 1 및 2에 의해 부분적으로 조절되는 것으로 생각된다. 이들 탱키라제에 의한 액신의 폴리(ADP-리보실)화 및 자가-폴리(ADP-리보실)화는 상기 파괴 복합체의 탈올리고머화를 촉진할 수 있다.
핵에서, 디셰벌드과 단백질은 Wnt 표적 유전자의 전사를 지지하는 히스톤 데아세틸라제 SIRT1과 복합체를 형성할 수 있다.
Wnt 분비에 핵심인 것으로 생각되는 단백질은 다중통과 막 단백질 포큐파인(Porc)이며, 그의 상실은 소포체에 Wnt 축적을 생성시킨다.
상기 Wnt 신호전달 경로는 다수의 수준에서 억제될 수 있으며 Wnt 억제제는 문헌[Voronkov and Krauss (2013) Current Pharmaceutical Design 19:634-664]에 상세히 리뷰되어 있다.
Wnt 억제제는 세포 또는 세포의 집단에서 TCF/LEF-매개된 전사를 억제하는 작용제로서 정의된다. 상응하게, 본 발명에 사용하기에 적합한 Wnt 억제제는
(1) Wnt 분비의 억제제(예를 들어 Porc의 억제제, 예를 들어 LGK974, IWP-1 또는 IWP-2),
(2) Wnt 또는 R스폰딘과 이들 각각의 수용체간의 상호작용의 경쟁적 및 비-경쟁적 억제제(예를 들어 OMP-18R5, OMP54F28),
(3) Wnt 수용체 복합체의 성분들, 예를 들어 LRP의 분해를 촉진하는 인자(예를 들어 니클로스아미드) 및 Znrf3 및/또는 Rnf43과 같은 R스폰딘 수용체의 분해를 촉진하는 인자 또는 Znrf3 및/또는 Rnf43을 활성화시키는 인자,
(4) 디셰벌드과 단백질의 억제제, 예를 들어 디셰벌드과 단백질의 프리즐드 수용체 및/또는 상기 파괴 복합체의 성분들에의 결합을 감소시키는 억제제(예를 들어 대퍼과 단백질, FJ9, 슐린닥, 3289-8625, JO1-017a, NSC668036) 또는 디셰벌드과 단백질의 발현을 하향조절하는 억제제(예를 들어 니클로스아미드),
(5) (a) 상기 파괴 복합체의 성분들, 예를 들어 액신 및/또는 APC(예를 들어 오카다산 또는 토오토마이신)를 탈인산화하는 포스파타제의 억제제(예를 들어 PP1, PP2A 및/또는 PP2C) 및 (b) GSK-3를 인산화하는 키나제의 억제제(예를 들어 p38 MAPK, PKA, PKB, PKC, p90RSK 또는 p70S6K)를 포함하는, 파괴 복합체 활성을 촉진하는 인자(예를 들어 SB239063, SB203580 또는 Rp-8-Br-cAMP),
(6) 상기 파괴 복합체의 탈올리고머화의 억제제, 예를 들어 탱키라제 1 및/또는 2의 억제제(예를 들어 XAV939, IWR1, JW74, JW55, 2-[4-(4-플루오로페닐)피페라진-1-일]-6-메틸피리미딘-4(3H)-온 또는 PJ34), 및
(7) β-카테닌:TCF/Lef 전사 복합체의 억제제를 포함하는 β-카테닌 표적 유전자 발현의 억제제, 예를 들어 β-카테닌:TCF-4 복합체를 붕괴시키는 억제제(예를 들어 iCRT3, CGP049090, PKF118310, PKF115-584, ZTM000990, PNU-74654, BC21, iCRT5, iCRT14 또는 FH535) 및 히스톤 데아세틸라제 SIRT1의 억제제(예를 들어 캄비놀)
을 포함한다.
본 발명의 분화 배지는 Wnt 억제제를 포함한다. 상기 (1) 내지 (7)에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 Wnt 억제제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 Wnt 억제제는 예를 들어 IWP-2, IWP-1 및 LGK974 중에서 선택된 Wnt 분비의 억제제, 예를 들어 Porc 억제제이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 Wnt 억제제는 β-카테닌 표적 유전자 발현의 억제제, 예를 들어 β-카테닌:TCF/Lef 전사 복합체의 억제제 또는 히스톤 데아세틸라제 SIRT1의 억제제(예를 들어 캄비놀)이다. 일부 실시태양에서, 상기 β-카테닌:TCF/Lef 전사 복합체의 억제제는 상기 β-카테닌:TCF-4 복합체를 붕괴시키는 억제제, 예를 들어 iCRT3, CGP049090, PKF118310, PKF115-584, ZTM000990, PNU-74654, BC21, iCRT5, iCRT14 및 FH535 중에서 선택된 억제제이다.
일부 실시태양에서, 상기 Wnt 억제제는 IWP-2, OMP-18R5, OMP54F28, LGK974, 3289-8625, FJ9, NSC 668036, IWR1 및 XAV939 중에서 선택된다.
일부 실시태양에서, 상기 Wnt 억제제는 iCRT3, PFK115-584, CGP049090, iCRT5, iCRT14 및 FH535 중에서 선택된다.
일부 실시태양에서, 상기 Wnt 억제제는 하기 표 1에 나열된 화합물들 중 하나이다.
Wnt 억제제
구조 화합물 표적
Figure pct00001
 XAV939 탱키라제1, 2
Figure pct00002
 IWR1 탱키라제1, 2
Figure pct00003
 IWP-1 포큐파인
Figure pct00004
 IWP-2 포큐파인
Figure pct00005
 JW74 탱키라제1, 2
Figure pct00006
 JW55 탱키라제1, 2
Figure pct00007
 오카다산 PP2A 포스파타제
Figure pct00008
 토오토마이신 PP1 포스파타제
Figure pct00009
 SB239063 p38 MAPK
Figure pct00010
 SB203580 p38 MAPK
Figure pct00011
 ADP-HPD PARG
Figure pct00012
 2-[4-(4-플루오로페닐)피페라진-1-일]-6-메틸피리미딘-4(3H)-온 탱키라제1, 2
PJ34 탱키라제1, 2
Figure pct00014
 니클로스아미드 Dvl-2를 하향조절한다, LRP6 분해를 촉발한다
Figure pct00015
 캄비놀 SIRT1
Figure pct00016
 슐린닥 디셰벌드의 PDZ 도메인
Figure pct00017
 3289-8625 디셰벌드
Figure pct00018
 일련의 유사체에 대한 스캐폴드 A 디셰벌드
Figure pct00019
 일련의 유사체에 대한 스캐폴드 B 디셰벌드
Figure pct00020
 J01-017a 디셰벌드
Figure pct00021
 NSC668036 디셰벌드
Figure pct00022
 필리핀 카베올린-매개된 내포작용
Figure pct00023
 IC261 CK1εδ
Figure pct00024
 PF670462 CK1δ및 CK1ε
Figure pct00025
 보수티니브 Src 키나제
Figure pct00026
 PHA665752 c-Met
Figure pct00027
 이마티니브 상이한 티로신 키나제들
Figure pct00028
 ICG-001 CREB 결합 단백질 (CBP)
Figure pct00029
 에타크린산 Lef-1
Figure pct00030
 에타크린산 유도체 Lef-1
Figure pct00031
 PKF115-584 β카테닌
Figure pct00032
 PNU-74654 β카테닌
Figure pct00033
 PKF118-744 β카테닌
Figure pct00034
 CGP049090 β카테닌
Figure pct00035
 PKF118-310 β카테닌
Figure pct00036
 ZTM000990 β카테닌
Figure pct00037
 BC21 β카테닌
Figure pct00038
 GDC-0941 PI3K
Figure pct00039
 Rp-8-Br-cAMP PKA
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 표 1에 나열된 임의의 Wnt 억제제 중 하나 이상을 포함한다.
상기 Wnt 억제제를 바람직하게는 세포에서 Wnt 활성을 억제하기에 유효한 양으로 상기 배지에, 동일한 세포 유형에서 평가시, 상기 분자 부재하의 상기 Wnt 활성의 수준에 비해 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 100%까지 첨가한다. 숙련가에게 공지된 바와 같이, Wnt 활성을 예를 들어 pTOPFLASH 및 pFOPFLASH Tcf 루시페라제 리포터 구조물(Korinek et al. (1997) Science 275:1784-1787)에 의해, Wnt의 전사 활성을 측정함으로써 측정할 수 있다. 따라서 신규의 Wnt 억제제는 당해 분야에 공지된 분석을 사용하여 숙련가에 의해 용이하게 식별될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 Wnt 억제제를 0.01-150 μM, 0.1-150 μM, 0.5-100 μM, 0.1-100 μM, 0.5-50 μM, 1-100 μM 또는 10-80 μM, 1-20 μM 또는 1-5 μM의 농도로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 IWP-2를 0.01-150 μM, 0.1-100 μM, 0.5-50 μM, 1-20 μM 또는 1-5 μM의 농도로 포함한다. 예를 들어 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 IWP-2를 약 1.5 μM의 농도로 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 모든 Wnt과 단백질 및 R스폰딘을 포함하는 Wnt 수용체 복합체에 결합하고 상기 복합체를 활성화시키는 Wnt 작용물질을 포함하지는 않는다.
다른 실시태양에서, 상기 분화 배지는 Wnt 작용물질, 예를 들어 R-스폰딘 1-4 또는 그의 생물활성 단편 또는 변체를 추가로 포함한다. 상술한 바와 같이 R-스폰딘은 세포 표면의 수용체에서 Wnt 신호전달을 증대시킨다. 본 발명자들은 EEC 분화 배지로부터의 R-스폰딘의 제거가 EEC 분화 효율을 감소시킴을 입증하였다(실시예 5를 참조하시오). 일부 Wnt 신호전달이, 세포가 분비(흡수보다는) 계통을 향하도록 지시하는데 요구될 수 있는 것으로 추정된다. 따라서, 일부 실시태양에서 상기 분화 배지는 Wnt 작용물질(특히 R-스폰딘) 및 Wnt 억제제를 모두 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 R-스폰딘 및 Porc 억제제, 예를 들어 IWP-2를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 R-스폰딘은 1 내지 1000 ng/㎖, 50 내지 1000 ng/㎖ 또는 100 내지 1000 ng/㎖의 최종 농도로 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 R-스폰딘은 0.1 내지 100 ㎍/㎖, 0.1 내지 50 ㎍/㎖, 0.1 내지 20 ㎍/㎖, 0.1 내지 10 ㎍/㎖, 0.1 내지 5 ㎍/㎖, 0.5 내지 100 ㎍/㎖, 0.5 내지 50 ㎍/㎖, 0.5 내지 20 ㎍/㎖, 0.5 내지 10 ㎍/㎖, 0.5 내지 5 ㎍/㎖, 1 내지 10 ㎍/㎖ 또는 1 내지 5 ㎍/㎖의 최종 농도로 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 R-스폰딘은 적어도 1 ng/㎖, 적어도 50 ng/㎖, 적어도 100 ng/㎖, 적어도 500 ng/㎖, 또는 적어도 1 ㎍/㎖의 최종 농도로 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 R-스폰딘은 약 100 ng/㎖의 최종 농도로 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 R-스폰딘은 약 1 ㎍/㎖의 최종 농도로 사용된다.
EGFR 경로 억제제
본 발명의 분화 배지는 EGFR 경로 억제제를 포함한다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 임의의 적합한 억제제를 사용할 수 있다.
상피 성장인자 수용체(EGFR)(또한 ErbB1 또는 HER1으로서 공지됨)는 세포외 단백질 리간드의 상피 성장인자(EGF)과의 구성원들에 대한 세포 표면 수용체이다. EGFR은 4개의 관련 단백질(EGFR(HER1/ErbB1), ErbB2(HER2), ErbB3(HER3) 및 ErbB4(HER4))을 포함하는 수용체들의 HER과에 속한다. 상기 HER 수용체는 EGF, TGFA, 헤파린-결합 EGF-유사 성장인자, 암피레귤린, 베타셀룰린 및 에피레귤린을 포함한 상이한 리간드들에의 결합에 의해 활성화되는 것으로 공지되어 있다. 리간드가 상기 수용체의 세포외 도메인에 결합후, 상기 수용체는 기능적으로 활성인 이량체(EGFR-EGFR(동종이량체) 또는 EGFR-HER2, EGFR-HER3, EGFR-HER4(이종이량체)를 형성한다. 이량체화는 티로신 키나제 도메인의 활성화를 유도하며, 이는 다중 티로신 잔기상의 수용체의 자가인산화를 유도한다. 이는 일련의 어댑터 단백질(예를 들어 SHC, GRB2)의 모집을 유도하고 일련의 세포내 신호전달 캐스케이드를 활성화시켜 유전자 전사에 영향을 미친다.
EGFR의 하류 효과를 매개하는 경로들은 충분히 연구되었으며 3개의 주요 신호전달 경로가 확인되었다. 첫 번째 경로는 RAS-RAF-MAPK 경로를 수반하며, 여기에서 인산화된 EGFR은 GRB2 및 Shc 어댑터 단백질을 통해 구아닌-뉴클레오티드 교환 인자를 모집하여, RAS를 활성화시키고 후속적으로 RAF 및 MAP 키나제 경로를 자극하여 세포 증식, 종양 침범 및 전이에 영향을 미친다. 활성화된 RAS는 RAF 키나제의 단백질 키나제 활성을 활성화시킨다. RAF 키나제는 MEK(또한 MAP2K 또는 MAPKK로서 공지됨)를 인산화하고 활성화시키며, 이는 MAP 키나제(또한 ERK(세포외 신호-조절된 키나제)로서 공지됨)를 인산화하고 활성화시킨다. 두 번째 경로는 PI3K/AKT 경로를 수반하며, 상기 경로는 핵 전사인자, 예를 들어 NFKB의 활성화를 통해 주요 세포 생존 및 세포사멸 방지 신호를 활성화시킨다. 세 번째 경로는 JAK/STAT 경로를 수반하며, 상기 경로는 또한 세포 생존과 관련된 유전자들의 전사 활성화에 연루된다. EGFR 활성화는 또한 PLCG의 인산화 및 포스파티딜이노시톨 4,5 비포스페이트(PIP2)의 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트(IP3) 및 디아실글리세롤(DAG)로의 후속적인 가수분해를 유도하여, 단백질 키나제 C(PRKC) 및 CAMK의 활성화를 생성시킬 수 있다.
EGFR 억제제, 예를 들어 항-EGFR 단클론 항체 및 소분자 EGFR 티로신 키나제 억제제를 입수할 수 있다. 일부 항-EGFR 항체, 예를 들어 세툭시맵 및 파니투무맵은 EGFR 단량체의 세포외 도메인에 결합하고 내인성 리간드에 의한 수용체 결합에 대해 경쟁하며; 이렇게 하여 상기 항체는 리간드-유도된 수용체 활성화를 차단한다. 일부 소분자 EGFR 억제제, 예를 들어 에를로티니브, 제피티니브 및 라파티니브는 ATP와 경쟁하여 EGFR의 키나제 도메인에 결합하고, 이는 차례로 EGFR 자가인산화 및 하류 신호전달을 억제한다.
하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4 또는 그 이상의 EGFR 경로 억제제를 사용할 수 있다.
상기 EGFR 경로 억제제를 바람직하게는 세포에서 EGFR 경로 활성을 억제하기에 유효한 양으로 상기 배지에, 동일한 세포 유형에서 평가시, 상기 분자 부재하의 상기 EGFR 경로 활성의 수준에 비해 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 100%까지 첨가한다. 숙련가에게 공지된 바와 같이, EGFR 경로 활성을 다양한 방식으로 측정할 수 있다. 예를 들어, EGFR 활성 및 억제제 감도의 모니터링 방법이 문헌[Ghosh et al. (2013) Assay and Drug Development Technologies 11(1):44-51]에 기재되어 있다. 상기 특정한 분석은 자기 비드에 공유적으로 고정화된 펩티드 기질을 수반한다. 키나제 반응 후에, 상기 비드를 세척하고 상기 펩티드의 인산화를 인산화된 티로신에 대한 HRP-접합된 1차 항체를 사용하여 화학형광에 의해 검출한다. 상기 측정된 형광 강도는 기질 인산화에 직접 비례하며, 상기 인산화는 차례로 EGFR 키나제 활성에 비례한다. 상기 분석을 또한 상기 EGFR 경로의 다른 키나제들(예를 들어 RAS, RAF, MEK 또는 ERK)의 억제제를 선별하는데 사용할 수 있다. 키나제 활성 분석을 위한 대안의 방법은 P32-표지된 ATP로부터 말단 포스페이트의 통합을 검출함을 수반한다. 따라서 신규의 EGFR 경로 억제제가 당해 분야에 공지된 분석을 사용하여 숙련가에 의해 쉽게 식별될 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 EGFR 경로 억제제는 EGFR 키나제 활성을 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 100%까지 억제하는 EGFR 억제제이다.
일부 실시태양에서, 상기 EGFR 경로 억제제는 RAS 키나제 활성을 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 100%까지 억제하는 RAS 억제제이다.
일부 실시태양에서, 상기 EGFR 경로 억제제는 RAF 키나제 활성을 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 100%까지 억제하는 RAF 억제제이다.
일부 실시태양에서, 상기 EGFR 경로 억제제는 MEK 키나제 활성을 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 100%까지 억제하는 MEK 억제제이다.
일부 실시태양에서, 상기 EGFR 경로 억제제는 ERK 키나제 활성을 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 100%까지 억제하는 ERK 억제제이다.
일부 실시태양에서, EGF는 상기 분화 배지 중에 1 mM 미만의 농도로 존재한다. 바람직한 실시태양에서, EGF는 상기 분화 배지에 존재하지 않는다.
일부 실시태양에서, 상기 EGFR 경로 억제제는 EGFR 억제제, 예를 들어 제피티니브 (산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)), AG-18, AG-490 (티르포스틴 B42), AG-1478 (티르포스틴 AG-1478), AZ5104, AZD3759, 브리가티니브, 에를로티니브, 세툭시맵, CL-387785 (EKI-785), CNX-2006, 이코티니브, 네시투무맵, 오시메르티니브 (AZD9291), OSI-420, PD153035 HCl, PD168393, 펠리티니브 (EKB-569), 로실레티니브 (CO-1686, AVL-301), TAK-285, 티르포스틴　9, 반데타니브, WHI-P154, WZ3146, WZ4002, WZ8040, 파니투무맵, 잘루투무맵, 니모투주맵 또는 마투주맵이다. 일부 실시태양에서, 상기 EGFR 억제제는 EGFR 단량체의 세포외 도메인에 결합하며 EGF에 의한 수용체 결합에 대해 경쟁한다. 일부 실시태양에서, 상기 EGFR 억제제는 ATP와, EGFR의 키나제 도메인 결합에 대해 경쟁한다. 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4 또는 그 이상의 EGFR 억제제를 사용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 EGFR 경로 억제제는 EGFR 및 ErbB-2 억제제, 예를 들어 아파티니브(셀렉켐(Selleckchem)), 아파티니브 디말리에이트, AC480 (BMS-599626), AEE788 (NVP-AEE788), AST-1306, 카네르티니브, CUDC-101, 다코미티니브, 라파티니브, 네라티니브, 포지오티니브 (HM781-36B), 사피티니브 (AZD8931) 또는 발리티니브이다. 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4 또는 그 이상의 EGFR 및 ErbB-2 억제제를 사용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 EGFR 경로 억제제는 RAS-RAF-MAPK 경로의 억제제이다. 일부 실시태양에서, 상기 EGFR 경로 억제제는 PI3K/AKT 경로의 억제제이다. 일부 실시태양에서, 상기 EGFR 경로 억제제는 JAK/STAT 경로의 억제제이다.
일부 실시태양에서, 상기 EGFR 경로 억제제는 RAF 억제제, 예를 들어 GW5074, ZM 336372, NVP-BHG712, TAK-632, 다라페니브 (GSK2118436), 소라페니브, 소라페니브 토실레이트, PLX-4720, AZ 628, CEP-32496 또는 베무라페니브 (PLX4032, RG7204)이다.
일부 실시태양에서, 상기 EGFR 경로 억제제는 MEK 억제제, 예를 들어 PD0325901 (시그마 알드리치)이다. 일부 실시태양에서, 상기 EGFR 경로 억제제는 ERK 억제제, 예를 들어 SCH772984 (셀렉켐)이다.
일부 실시태양에서, 상기 EGFR 경로 억제제는 0.01-200 μM, 0.01-100 μM, 0.1-50 μM, 0.1-20 μM, 1-100 μM, 1-50 μM, 1-30 μM, 5-100 μM, 5-50 μM 또는 5-20　μM의 농도로 사용된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 (i) 약 5 μM 농도의 제피티니브, (ii) 약 10 μM 농도의 아파티니브, (iii) 약 5 μM 농도의 PD0325901, 또는 (iv) 약 10 μM 농도의 SCH772984를 포함한다.
노취 억제제
상기 분화 배지는 노취 억제제를 포함한다. 임의의 적합한 노취 억제제를 사용할 수 있다.
노취는 다중 단백질분해성 절단을 통해 활성화될 수 있는 막관통 표면 수용체이며, 상기 절단 중 하나는 감마-세크레타제라 칭하는, 프로테아제 활성을 갖는 단백질들의 복합체에 의한 절단이다. 감마-세크레타제는 막 내에서 그의 절단 활성을 수행하는 프로테아제이다. 감마-세크레타제는 다성분 효소이며 적어도 4개의 상이한 단백질들, 즉 프레세닐린(프레세닐린 1 또는 2), 니카스트린, PEN-2 및 APH-1으로 구성된다. 프레세닐린은 감마-세크레타제의 촉매 중심이다. 리간드 결합시 상기 노취 수용체는 금속프로테아제인 ADAM 프로테아제의 작용을 통해 엑토도메인 발산을 허용하는 3차원 구조의 변화를 겪는다. 바로 이어서 상기 노취 세포내 도메인(NICD)의 방출을 생성시키는 상기 감마-세크레타제 복합체의 작용이 이어진다. NICD는 핵으로 전위되고 여기에서 CSL(C-프로모터-결합 인자/재조합 신호-서열 결합 단백질 Jκ/무모의 억제인자/Lagl)과 상호작용한다. 상기 NICD의 결합은 CSL을 전사 억제제로부터 활성제로 전환시켜 노취 표적 유전자의 발현을 생성시킨다.
일부 실시태양에서, 상기 노취 억제제는 노취의 리간드 매개된 활성화를 감소시킬 수 있는 억제제(예를 들어 노취의 우성 음성 리간드를 통해 또는 우성 음성 노취를 통해 또는 노취 리간드와 노취간의 상호작용을 적어도 부분적으로 차단할 수 있는 항체를 통해), 또는 ADAM 프로테아제의 억제제이다.
일부 실시태양에서 상기 노취 억제제는 감마-세크레타제 억제제, 예를 들어 DAPT, 디벤즈아제핀(DBZ), 벤조디아제핀(BZ) 또는 LY-411575이다. 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4 또는 그 이상의 노취 억제제를 사용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 노취 억제제(예를 들어 DAPT)는 0.001-200　mM, 0.01-100 mM, 0.1-50 mM, 0.1-20 mM, 0.5-10 mM 또는 0.5-5 mM의 농도로 사용된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 DAPT를 약 1 mM의 농도로 포함한다.
기본 배지
본 발명의 방법에 사용되는 분화 배지는 기본 배지를 포함한다. 상기 기본 배지는 본 명세서에 제공된 제한이 가해진, 동물 또는 인간 세포에 적합한 임의의 기본 배지이다.
동물 또는 인간 세포 배양을 위한 기본 배지는 전형적으로, 배양된 세포의 유지를 지지하는데 필요한 다수의 성분들을 함유한다. 적합한 성분들의 조합은 하기의 내용을 고려하여 숙련가에 의해 쉽게 제형화될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 기본 배지는 일반적으로 문헌 및 상기에 보다 상세히 기재된 바와 같은 표준 세포 배양 성분, 예를 들어 아미노산, 비타민, 지질 보충제, 무기염, 탄소 에어지원, 및 완충제를 포함하는 영양 용액을 포함할 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 배양 배지는, 예를 들어 아미노산, 비타민, 액체 보충제, 무기염, 탄소 에너지원 및 완충제 중에서 선택된 하나 이상의 표준 세포 배양 성분이 추가로 보충된다.
숙련가는 본 발명의 분화 배지 중에 기본 배지로서 사용될 수도 있는 배양 배지의 유형을 통상적인 일반적인 지식으로부터 이해할 것이다. 잠재적으로 적합한 세포 배양 배지는 상업적으로 입수될 수 있으며, 비제한적으로 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 녹아웃-DMEM (KO-DMEM), 글래스고우 최소 필수 배지 (G-MEM), 기본 이글 배지 (BME), DMEM/햄스 F12, 어드밴스드 DMEM/햄스 F12, 아이스코베의 변형된 둘베코의 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Media) 및 최소 필수 배지 (MEM), 햄스 F-10, 햄스 F-12, 배지 199, 및 RPMI 1640 배지를 포함한다.
예를 들어, 상기 기본 배지는 글루타민, 인슐린, 페니실린/스트렙토마이신 및 트랜스페린이 보충된 DMEM/F12 및 RPMI 1640 중에서 선택될 수 있다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 무혈청 배양에 대해 최적화되고 이미 인슐린을 포함하는 어드밴스드 DMEM/F12 또는 어드밴스드 RPMI가 사용된다. 이 경우에, 상기 어드밴스드 DMEM/F12 또는 어드밴스드 RPMI 배지는 바람직하게는 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된다. N2 및 B27이 보충된 AdDMEM/F12(인비트로젠)가 또한 바람직하다. 바람직하게, 상기 기본 배지는 어드밴스드 DMEM/F12이다. 보다 바람직하게, 상기 기본 배지는 어드밴스드 DMEM/F12, 글루타민 및 B27을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 기본 배지는 어드밴스드 DMEM/F12, HEPES, 페니실린/스트렙토마이신, 글루타민, N-아세틸시스테인 및 B27을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 기본 배양 배지는 페니실린/스트렙토마이신, 10 mM HEPES, 글루타맥스, B27(모두 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)로부터) 및 약 1 mM N-아세틸시스테인(시그마)이 보충된 어드밴스드 DMEM/F12를 포함하거나 또는 상기로 이루어진다.
더욱 또한 상기 기본 배양 배지는 정제된 천연, 반-합성 및/또는 합성 성장인자가 보충되고 소 태아 혈청 또는 송아지 태아 혈청과 같은 한정되지 않은 성분을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 다양한 상이한 혈청 대체 제형들이 상업적으로 입수될 수 있으며 숙련가에게 공지되어 있다. 혈청 대체제가 사용되는 경우, 상기를 통상적인 기법에 따라, 배지의 약 1 내지 30 부피%로 사용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 분화 배지는 본 명세서의 달리 어딘가에 기재된 바와 같이, 혈청을 포함하거나, 또는 무혈청이고/이거나 혈청-대체체가 없을 수 있다. 배양 배지 및 세포 제조는 바람직하게는 생물학적 제품에 대해서 및 제품 일관성을 보장하도록 FDA에 의해 요구된 표준에 의거한 GMP 공정이다.
본 발명의 분화 배지는 통상적으로는 탈이온화된 증류수 중에서 제형화될 것이다. 본 발명의 분화 배지는 전형적으로 오염 방지를 위해, 예를 들어 자외선, 가열, 방사선조사 또는 여과에 의해 사용전에 멸균될 것이다. 상기 분화 배지를 보관 또는 수송을 위해 동결(예를 들어 -20 ℃ 또는 -80 ℃에서)시킬 수 있다. 상기 배지는 오염 방지를 위해서 하나 이상의 항생제를 함유할 수 있다. 상기 배지는 ㎖당 0.1 내독소 단위 미만의 내독소 함량을 갖거나, 또는 ㎖당 0.05 내독소 단위 미만의 내독소 함량을 가질 수 있다. 배양 배지의 내독소 함량 측정 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
바람직한 기본 배양 배지는 카보네이트-계 완충제에 의해 7.4의 pH(바람직하게는 pH 7.2 내지 7.6 또는 7.2 이상 7.6 이하)로 완충되는 한정된 합성 배지인 반면, 세포는 5% 내지 10% CO2, 또는 5% 이상 10% 이하의 CO2, 바람직하게는 5% CO2를 포함하는 분위기에서 배양된다.
일부 실시태양에서, 분화 배지에 분화 방법에 사용될 준비가 된 기본 배지를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 분화 배지는, 예를 들어 배양 배지 보충제로서 기본 배지가 없이 제공되며, 상기 기본 배지(또는 다른 성분)를 분화 방법에 사용하기 전에 첨가할 수 있다. 상응하게, 본 명세서에 기재된 임의의 분화 배지를 제공하며, 여기에서 상기 기본 배지는 존재하지 않거나 또는 상기 기본 배지는 단지 선택적인 성분이다.
추가적인 인자
다수의 인자들이 앞서 일부 상황에서 전구세포의 분화를 증대시키는 것으로 입증되었다. 일부 실시태양에서, 이들 인자 중 하나 이상을 본 발명의 분화 배지에 포함시킨다. 이들 인자는 비제한적으로 p38 억제제, TGF-베타 억제제, 가스트린, 글루코코르티코이드, 수용체 티로신 키나제 리간드, BMP 경로 활성제, 헤지호그 활성제, 헤지호그 억제제, mTOR 신호전달 GSK-3 억제제의 조절제, CHIR99021 작용물질, AP-1 자극제, 무스카린 아세틸콜린 수용체 작용물질, 카바콜 작용물질 및 cAMP 경로 활성제를 포함한다. 일부 실시태양에서 이들 인자는 p38 억제제, TGF-베타 억제제, 가스트린, 글루코코르티코이드, 수용체 티로신 키나제 리간드, BMP 경로 활성제, BMP 경로 억제제, 헤지호그 활성제, 헤지호그 억제제, mTOR 신호전달 GSK-3 억제제의 조절제, CHIR99021 작용물질, AP-1 자극제, 무스카린 아세틸콜린 수용체 작용물질, 카바콜 작용물질 및 cAMP 경로 활성제 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 이들 인자는 가스트린, 글루코코르티코이드, 수용체 티로신 키나제 리간드, BMP 경로 활성제, BMP 경로 억제제, 헤지호그 활성제, 헤지호그 억제제, mTOR 신호전달 GSK-3 억제제의 조절제, CHIR99021 작용물질, AP-1 자극제, 무스카린 아세틸콜린 수용체 작용물질, 카바콜 작용물질 및 cAMP 경로 활성제 중에서 선택된다.
p38 억제제
본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 p38 억제제를 추가로 포함하며, 상기 억제제는 p38 신호전달을 직접적으로 또는 간접적으로, 음으로 조절하는 임의의 억제제를 의미한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 억제제는 p38(GI 번호 1432)에 결합하여 그의 활성을 감소시킨다. p38 단백질 키나제는 미토젠-활성화된 단백질 키나제(MAPK)과의 부분이다. MAPK는 세포외 자극, 예를 들어 환경적 스트레스 및 염증성 사이토킨에 응답하고 다양한 세포 활성, 예를 들어 유전자 발현, 유사분열, 분화, 증식 및 세포 생존/세포사멸을 조절하는 세린/쓰레오닌-특이성 단백질 키나제이다. 상기 p38 MAPK는 α, β, β2, γ 및 δ 동형으로서 존재한다. p38 억제제는 적어도 하나의 p38 동형에 결합하여 그의 활성을 감소시키는 작용제이다. 물질이 p38 억제제인지를 측정하는 다양한 방법들이 공지되어 있으며, 이들 방법을 본 발명과 함께 사용할 수 있다. 예로는 세포성 p38 활성화 또는 억제의 잘-확립된 척도를 제공하는 Thr180/Tyr182에서의 인산화의 포스포-특이성 항체 검출; 생화학적 재조합 키나제 분석; 종양 괴사인자 알파(TNFα) 분비 분석; 및 p38 억제제에 대한 디스커버렉스(DiscoverRx) 대량 신속처리 선별 플랫폼(http://www.discoverx.com/kinases/literature/biochemical/collaterals/DRx_poster_p38%20KBA.pdf를 참조하시오)이 있다. 다수의 p38 활성 분석 키트가 또한 존재한다(예를 들어 밀리포어(Millipore), 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)).
다양한 p38 억제제들이 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 실시태양에서, p38 신호전달을 직접적으로 또는 간접적으로 음으로 조절하는 억제제는 SB-202190, SB-203580, VX-702, VX-745, PD-169316, RO-4402257 및 BIRB-796으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 p38 억제제는 그의 표적에 결합하여 상기 표적의 활성을 세포 분석에 의해 평가시, 대조용에 비해 10% 초과; 30% 초과; 60% 초과; 80% 초과; 90% 초과; 95% 초과; 또는 99% 초과까지 감소시킨다. 표적 억제를 측정하기 위한 세포 분석의 예는 상기에 기재된 바와 같이 당해 분야에 주지되어 있다.
SB-203580을 상기 분화 배지에 50 nM 내지 100 μM, 또는 100 nM 내지 50 μM, 또는 1 μM 내지 50 μM의 농도로 첨가할 수 있다. 예를 들어, SB-203580을 상기 배양 배지에 대략 30 μM로 첨가할 수 있다.
TGF-베타 억제제
일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 TGF-베타 억제제를 추가로 포함한다.
TGF-베타 신호전달은 세포 성장, 세포 운명 및 세포사멸을 포함한 다수의 세포 기능들에 수반된다. 신호전달은 전형적으로 TGF-베타 상과 리간드의 II형 수용체(I형 수용체를 모으고 인산화한다)에의 결합으로 시작한다. 이어서 상기 I형 수용체는 SMAD(핵에서 전사 인자로서 작용하며 표적 유전자 발현을 조절한다)를 인산화한다.
상기 TGF-베타 억제제 신호전달 경로는 앞서 전구세포의 분화를 촉진하는데 연루되었다. 예를 들어 TGF-베타의 간 외식편에의 첨가는 시험관내에서 담즙 분화를 촉진한다(Clotman et al. (2005) Genes Dev. 19(16):1849-54). 또한, 분화 배지에 TGF-베타 억제제의 포함은 담도 세포-운명을 억제하고 보다 간세포 표현형으로의 상기 세포의 분화를 촉발할 수 있음이 앞서 입증되었다(WO 2012/168930을 참조하시오). 특히, 분화 배지에 TGF-베타 억제제(예를 들어 A83-01)의 포함은 성숙한 간세포 마커의 발현을 증대시키고 간세포-유사 세포의 수를 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
상기 TGF-베타 상과 리간드는 골형성 단백질(BMP), 성장 및 분화 인자(GDF), 항-뮐러관 호르몬(AMH), 액티빈, 결절 및 TGF-베타를 포함한다. 일반적으로, Smad2 및 Smad3는 TGF-베타/액티빈 경로에서 ALK4, 5 및 7 수용체에 의해 인산화된다. 대조적으로, Smad1, Smad5 및 Smad8은 골형성 단백질(BMP) 경로의 부분으로서 인산화된다. 경로들간에 일부 크로스오버가 존재하지만, 본 발명의 상황에서, "TGF-베타 억제제" 또는 "TGF-베타 신호전달의 억제제"는 바람직하게는 Smad2 및 Smad3를 통해 및/또는 ALK4, ALK5 또는 ALK7을 통해 작용하는 TGF-베타 경로의 억제제이다. 따라서, 일부 실시태양에서 상기 TGF-베타 억제제는 BMP 억제제가 아니다. 즉 상기 TGF-베타 억제제는 노긴이 아니다. 일부 실시태양에서, BMP 억제제를 상기 TGF-베타 억제제 외에 상기 배양 배지에 첨가한다. 따라서, 상기 TGF-베타 억제제는 상기 TGF-베타 신호전달 경로, 바람직하게는 Smad2 및/또는 Smad3를 통해 작용하는 신호전달 경로, 보다 바람직하게는 ALK4, ALK5 또는 ALK7을 통해 작용하는 신호전달 경로의 활성을 감소시키는 임의의 작용제일 수 있다.
상기 TGF-베타 신호전달 경로의 다수의 붕괴 방법들이 당해 분야에 공지되어 있으며 이들을 본 발명과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 TGF-베타 신호전달을 작은-간섭 RNA 전략에 의한 TGF-베타 발현의 억제; 퓨린(TGF-베타 활성화 프로테아제)의 억제; 생리학적 억제제에 의한 상기 경로의 억제; 단클론 항체에 의한 TGF-베타의 중화; TGF-베타 수용체 키나제 1(또한 액티빈 수용체-유사 키나제, ALK5로서 공지됨), ALK4, ALK6, ALK7 또는 다른 TGF-베타-관련된 수용체 키나제의 소분자 억제제에 의한 억제; 예를 들어 생리학적 억제제, Smad7의 과발현에 의한 또는 Smad를 활성화할 수 없게하는 Smad 앵커로서 티오레독신의 사용에 의한 Smad2 및 Smad3 신호전달의 억제에 의해 붕괴시킬 수 있다(Fuchs, O. Inhibition of TGF- Signalling for the Treatment of Tumor Metastasis and Fibrotic Diseases. Current Signal Transduction Therapy, Volume 6,　Number 1, January 2011, pp. 29-43(15)).
물질이 TGF-베타 억제제인지를 측정하기 위한 다양한 방법들이 공지되어 있으며 이들을 본 발명과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포를 인간 PAI-1 프로모터 또는 Smad 결합 부위를 포함하는 리포터 구조물로 안정하게 형질감염시켜 루시페라제 리포터 유전자를 구동시키는 세포 분석을 사용할 수 있다. 대조군에 비해 루시페라제 활성의 억제를 화합물 활성의 척도로서 사용할 수 있다(De Gouville et al. (2005) Br J Pharmacol. 145(2): 166-177). 따라서 신규의 TGF-베타 억제제를 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 TGF-베타 억제제는 단백질, 펩티드, 소분자, 작은 간섭 RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머 또는 항체일 수 있다. 상기 억제제는 천연 또는 합성일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 TGF-베타 억제제는 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7의 억제제이다. 예를 들어, 상기 TGF-베타 억제제는 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7에 결합하여 상기를 직접적으로 억제할 수 있다. 본 발명의 상황에서 사용될 수 있는 바람직한 소분자 TGF-베타 억제제의 예는 비제한적으로 하기 표 2에 나열된 소분자 억제제들을 포함한다.
수용체 키나제를 표적화하는 소분자 TGF-베타 억제제들
억제제 표적 IC50 (nM) Mol Wt 명칭 화학식
A83-01 ALK5 (TGF-βR1) 12 421.52 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아미드 C25H19N5S
ALK4 45
ALK7 7.5
SB-431542 ALK5 94 384.39 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드 C22H16N4O3
ALK4 　
ALK7 　
SB-505124 ALK5 47 335.4 2-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-3급-부틸-3H이미다졸-
4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드 하이드레이트		 C20H21N3O2
ALK4 129
SB-525334 ALK5 14.3 343.42 6-[2-(1,1-디메틸에틸)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-이미다졸-4-일]퀴녹살린 C21H21N5
SD-208 ALK5 49 352.75 2-(5-클로로-2-플루오로페닐)-4-[(4-피리딜)아미노]프테리딘 C17H10ClFN6
LY-36494 TGR-βRI 59 272.31 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린 C17H12N4
TGF-βRII 400
MLK-7K 1400
SJN-2511 ALK5 23 287.32 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘 C17H13N5
일부 실시태양에서, 상기 TGF-베타 억제제는 A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY 364947, SD-208 및 SJN 2511로 이루어지는 그룹 중에서 임의로 선택된 소분자 억제제이다.
일부 실시태양에서, 단지 하나의 TGF 베타 억제제만이 분화 배지 중에 존재한다. 다른 실시태양에서, 하나 초과, 예를 들어 2, 3, 4 또는 그 이상의 TGF 베타 억제제가 상기 분화 배지 중에 존재한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 표 2에 나열된 임의의 억제제들 중 하나 이상을 포함한다. 분화 배지는 하나의 억제제와 나열된 또 다른 억제제와의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 배지는 SB-525334 또는 SD-208 또는 A83-01; 또는 SD-208 및 A83-01을 포함할 수 있다. 숙련가는, 주로 다른 키나제들을 표적화하도록 설계되지만, 고농도에서는 TGF-베타 수용체 키나제를 또한 억제할 수 있는 다수의 다른 소분자 억제제들이 존재함을 알 것이다. 예를 들어, SB-203580은 p38 MAP 키나제 억제제이며, 고농도(예를 들어 대략 10 μM 이상)에서 ALK5를 억제하는 것으로 생각된다. 상기 TGF-베타 신호전달 경로를 억제하는 임의의 상기와 같은 억제제를 또한 본 발명의 상황에서 사용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 TGF-베타 억제제(예를 들어 A83-01)는 상기 분화 배지 중에 적어도 1 nM, 예를 들어 적어도 5 nM, 적어도 50 nM, 적어도 100 nM, 적어도 300 nM, 적어도 450 nM 또는 적어도 475 nM로 존재한다. 예를 들어 상기 TGF-베타 억제제(예를 들어 A83-01)는 상기 분화 배지 중에 1 nM-200 μM, 10 nM-200 μM, 100 nM-200 μM, 1 μM-200 μM, 10 nM-100 μM, 50 nM-100 μM, 50 nM-10 μM, 100　nM-1　μM, 200 nM-800　nM, 350-650 nM 또는 약 500 nM로 존재한다. 상응하게, 일부 실시태양에서 상기 분화 배지는 A83-01을 약 500 nM의 농도로 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 TGF-베타 억제제를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 A83-01을 포함하지 않는다.
가스트린
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 추가로 가스트린을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 가스트린을 0.01-500 nM, 0.1-100 nM, 1-100　nM, 1-20 nM 또는 5-15 nM의 농도로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 가스트린을 약 10 nM의 농도로 포함한다.
글루코코르티코이드
일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 추가로 글루코코르티코이드를 포함한다.
글루코코르티코이드는 스테로이드 호르몬의 한 부류인 글루코코르티코이드의 부류이다. 글루코코르티코이드는 글루코코르티코이드 수용체에 결합하는 코르티코스테로이드이다. 코르티솔이 가장 중요한 인간 글루코코르티코이드이다. 하이드로코르티손은 코르티솔의 합성 버전이다. 관련된 구조를 갖는 다수의 다른 합성 글루코코르티코이드들이 존재한다(예를 들어 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 베타메타손, 트리암시놀론, 베클로메타손 및 플루드로코르티손 아세테이트). 글루코코르티코이드는 글루코코르티코이드 수용체를 활성화하는 다양한 효능을 갖는다. 이를 글루코코르티코이드 효능이라 칭하며 이는 대개 코르티솔과의 비교에서 측정된다. 다양한 글루코코르티코이드의 생화학, 약물학 및 작용 기전이 예를 들어 문헌[Cecil Textbook of Medicine (1988), pages 128-130] 및 문헌[The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition (2000), pages 1363-1370]에 리뷰되어 있다.
일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 글루코코르티코이드를 포함한다. 임의의 적합한 글루코코르티코이드를 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 글루코코르티코이드는 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 코르티솔, 코르티손, 하이드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손 하이드로클로라이드, 하이드로코르티손 발레레이트, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 베타메타손, 베타메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 발레레이트, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토니드, 베클로메타손, 베클로메타손 디프로피오네이트, 플루드로코르티손, 플루드로코르티손 아세테이트, 플루티카손, 플루티카손 아세토니드, 플루티카손 프로피오네이트, 플루니솔리드, 부데소니드, 클로베타솔, 클로베타솔 프로피오네이트, 디플루오라손, 디플루오라손 디아세테이트, 할로베타솔, 할로베타솔 프로피오네이트, 암시노니드, 데속시메타손, 플루오시노니드, 플루오시노니드 아세토니드, 할시노니드, 모메타손, 모메타손 퓨로에이트, 플루안드레놀리드, 프레드니카베이트, 아클로메타손, 아클로메타손 디프로피오네이트, 데소니드, 플루시놀론, 플루시놀론 아세토니드, 프라목신 및 프라목신 하이드로클로라이드.
덱사메타손은 가장 효능있는 글루코코르티코이드 중 하나이며 본 발명의 분화 배지에 사용하기에 바람직한 글루코코르티코이드이다. 일부 실시태양에서, 상기 글루코코르티코이드는 덱사메타손과 동일하거나 또는 이보다 더 높은 글루코코르티코이드 효능을 갖는 임의의 글루코코르티코이드이다.
베타메타손 및 플루드로코르티손 아세테이트가 또한 매우 효능 있는 글루코코르티코이드이다. 상응하게, 베타메타손은 본 발명의 분화 배지에 사용하기에 바람직한 글루코코르티코이드이다. 일부 실시태양에서, 상기 글루코코르티코이드는 베타메타손과 동일하거나 또는 이보다 더 높은 글루코코르티코이드 효능을 갖는 임의의 글루코코르티코이드이다. 상응하게, 플루드로코르티손 아세테이트는 본 발명의 분화 배지에 사용하기에 바람직한 글루코코르티코이드이다. 일부 실시태양에서, 상기 글루코코르티코이드는 플루드로코르티손 아세테이트와 동일하거나 또는 이보다 더 높은 글루코코르티코이드 효능을 갖는 임의의 글루코코르티코이드이다.
일부 실시태양에서, 상기 글루코코르티코이드는 코르티솔과 동일하거나 또는 이보다 더 높은 글루코코르티코이드 효능을 갖는 임의의 글루코코르티코이드이다.
본 발명의 분화 배지에 사용하기 위한 예시적인 글루코코르티코이드의 목록을 하기에 제공한다. 제공된 효능은 경구 투여를 지칭한다.
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일부 실시태양에서, 상기 글루코코르티코이드(예를 들어 덱사메타손)는 0.01-150　μM, 0.1-15　μM, 0.5-10 μM 또는 1-5 μM의 농도로 사용된다. 바람직한 실시태양에서, 상기 글루코코르티코이드는 덱사메타손이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 덱사메타손을 약 3 μM의 농도로 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 글루코코르티코이드를 포함하지 않는다.
수용체 티로신 키나제 리간드
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 추가로 하나 이상의 수용체 티로신 키나제 리간드를 포함한다.
수용체 티로신 키나제(RTK)는 폴리펩티드 성장인자, 사이토킨, 및 호르몬에 대한 고-친화성 세포 표면 수용체이다. RTK는 세포 유지, 성장 및 발달의 핵심 조절제이고, 또한 다수 유형 암의 발생 및 진행에 중요한 역할을 한다. 본 발명의 상황에서, 수용체 티로신 키나제 리간드는 RKT를 활성화하는 임의의 리간드이다. 다수의 수용체 티로신 키나제 리간드는 미토젠 성장인자이다. 따라서 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지 중의 하나 이상의 수용체 티로신 키나제 리간드는 하나 이상의 미토젠 성장인자를 포함한다.
대략 20개의 상이한 공지된 부류의 RTK, 예를 들어 RTK 부류 I (EGF 수용체 과) (ErbB 과), RTK 부류 II (인슐린 수용체 과), RTK 부류 III (PDGF 수용체 과), RTK 부류 IV (FGF 수용체 과), RTK 부류 V (VEGF 수용체 과), RTK 부류 VI (HGF 수용체 과), RTK 부류 VII (Trk 수용체 과), RTK 부류 VIII (Eph 수용체 과), RTK 부류 IX (AXL 수용체 과), RTK 부류 X (LTK 수용체 과), RTK 부류 XI (TIE 수용체 과), RTK 부류 XII (ROR 수용체 과), RTK 부류 XIII (DDR 수용체 과), RTK 부류 XIV (RET 수용체 과), RTK 부류 XV (KLG 수용체 과), RTK 부류 XVI (RYK 수용체 과), RTK 부류 XVII (MuSK 수용체 과)가 존재한다. 일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 수용체 티로신 키나제 리간드는 이들 20개 부류의 RTK 중 하나 이상, 또는 전부에 대한 리간드를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 수용체 티로신 키나제 리간드는 RTK 부류 IV(FGF 수용체 과)에 대한 리간드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 수용체 티로신 키나제 리간드는 RTK 부류 VI(HGF 수용체 과)에 대한 리간드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 수용체 티로신 키나제 리간드는 RTK 부류 IV(FGF 수용체 과)에 대한 리간드 및 RTK 부류 VI(HGF 수용체 과)에 대한 리간드를 포함한다.
따라서, 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지 중의 하나 이상의 수용체 티로신 키나제 리간드는 섬유아세포 성장인자(FGF) 및 간세포 성장인자(HGF)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 수용체 티로신 키나제 리간드는 FGF 및 HGF를 포함한다. 일부 실시태양에서, 단지 하나의 수용체 티로신 키나제 리간드만이 상기 분화 배지에 포함되며, 예를 들어 여기에서 상기 수용체 티로신 키나제는 FGF 및 HGF 중에서 선택된다.
상기 FGF는 바람직하게는 FGFR2 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 FGF이며 바람직하게는 FGF19이다.
3개 이상, 예를 들어 3, 4, 5 또는 그 이상의 수용체 티로신 키나제 리간드가 본 발명의 분화 배지에 사용될 수 있다.
상기에 설명한 바와 같이, 본 발명자들은 상기 EGFR 경로의 억제가 장내분비 세포 분화에 기여함을 발견하였다. 따라서, 바람직하게, 상기 하나 이상의 수용체 티로신 키나제 리간드는 EGFR을 활성화하는 리간드(예를 들어 EGF)를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 1 mM 미만의 EGF를 포함한다.
BMP 경로 활성제
본 발명자들은 놀랍게도 EEC 분화 배지에 BMP 경로 활성제의 포함이 분화된 EEC 집단 중에서 세크레틴-분비 세포의 존재를 증가시킴을 발견하였다(도 13 및 14를 참조하시오). 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 추가로 BMP 경로 활성제를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 BMP 경로 억제제(예를 들어 노긴)를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 추가로 BMP 경로 활성제를 포함하고 BMP 경로 억제제(예를 들어 노긴)를 포함하지 않는다.
적합한 BMP 활성제의 식별 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. BMP 활성의 측정에 적합한 분석은 문헌[Zilberberg et al., BMC Cell Biology 2007 8:41]에 기재되어 있다.
일부 실시태양에서, 상기 BMP 경로 활성제는 BMP7, BMP4 및 BMP2 중에서 선택된다. BMP7이 바람직하다. BMP7은 SMAD1 및 SMAD5의 인산화를 유도한다. 따라서 일부 실시태양에서, 상기 BMP 경로 활성제는 SMAD1 및 SMAD5의 인산화를 유도할 수 있는 임의의 화합물이다. 또한, BMP7이 언급되는 경우에, SMAD1 또는 SMAD5의 인산화를 유도하는 임의의 화합물을 BMP7 대신에 사용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 BMP 경로 활성제, 예를 들어 BMP4 또는 BMP7은 상기 분화 배지 중에 적어도 0.01 ng.㎖, 적어도 0.1 ng/㎖, 적어도 1 ng/㎖, 적어도 10 ng/㎖, 적어도 20 ng/㎖, 적어도 25 ng/㎖, 적어도 100 ng/㎖, 적어도 500 ng/㎖, 적어도 1 ㎍/㎖, 적어도 10 ㎍/㎖ 또는 적어도 50 ㎍/㎖로 존재한다. 일부 실시태양에서, 상기 BMP 경로 활성제, 예를 들어 BMP4 또는 BMP7은 상기 분화 배지 중에 약 0.01 ng/㎖ 내지 약 500 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 약 500 ng/㎖, 약 10 ng/㎖ 내지 약 500 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 약 500 ng/㎖로 존재한다. 일부 실시태양에서, 상기 BMP 경로 활성제, 예를 들어 BMP4 또는 BMP7은 상기 분화 배지 중에 약 0.01 ng/㎖ 내지 약 200 ng/㎖, 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖, 약 10 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖, 약 10 ng/㎖ 내지 약 50 ng/㎖, 약 15 ng/㎖ 내지 약 30 ng/㎖로 존재한다. 일부 실시태양에서, 상기 BMP 경로 활성제, 예를 들어 BMP4 또는 BMP7은 상기 분화 배지 중에 약 25 ng/㎖로 존재한다. 일부 실시태양에서, BMP4는 상기 분화 배지 중에 약 0.1 ㎍/㎖ 내지 약 50 ㎍/㎖, 약 1 내지 약 50 ㎍/㎖, 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 25 ㎍/㎖ 또는 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 15 ㎍/㎖로 존재한다. 일부 실시태양에서, BMP4는 상기 분화 배지 중에 약 10 ㎍/㎖로 존재한다.
일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 BMP 경로 활성제를 포함하지 않는다.
EEC를 포함하는 세포 집단에서 세크레틴 분비를 증가시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포 집단을 BMP 활성제와 접촉시킴을 포함한다.
EEC를 포함하는 세포 집단에서 GLP-1 분비를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포 집단을 BMP 활성제와 접촉시킴을 포함한다.
EEC를 포함하는 세포 집단에서 Pyy 및/또는 Nts의 발현을 증가시키는 방법을 또한 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포 집단을 BMP 활성제와 접촉시킴을 포함한다.
BMP 억제제
본 발명자들은 또한 놀랍게도 EEC 분화 배지 중에 BMP 신호전달의 억제제의 포함이 분화된 EEC 집단에서 움 호르몬 특징을 촉진함을 발견하였다(실시예 5를 참조하시오). 움 호르몬 특징은 GLP-1의 고발현 및 세크레틴의 발현 결여를 특징으로 한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 BMP 억제제를 추가로 포함한다. 이들 실시태양에서, 상기 분화 배지는 바람직하게는 BMP 활성제를 포함하지 않는다.
BMP는 2개 부류의 세포 표면 골형성 단백질 수용체(BMPR-I 및 BMPRII)에 결합하는 작은 신호전달 분자이다. 상기 BMPR-I 수용체 부류는 3개의 수용체 유형, 액티빈 수용체-유사 키나제-2 (ALK-2 또는 ActR-IA), ALK-3 (BMPR-IA) 및 ALK-6 (BMPR-IB)으로 이루어진다. 상기 BMPR-II 수용체는 3개의 수용체 유형, BMPR-II, ActR-IIA 및 ActR-IIB로 구성된다. BMP의 결합은 2개의 I형 및 2개의 II형 수용체를 함유하는 이종사량체성 복합체의 형성을 생성시킨다. 세포외 결합 도메인외에, 각각의 BMP 수용체는 세포내 세린/쓰레오닌 키나제 도메인을 함유한다. BMP의 결합에 이어서, 구성적으로 활성인 II형 수용체 키나제는 I형 수용체 키나제 도메인을 인산화하고 차례로 BMP-응답성 SMAD 1, 5 및 8을 인산화하며, 이들은 세포핵내로 진입하여 전사 인자로서 기능할 수 있다. 이들 특정한 SMAD의 인산화는 성장 조절 및 분화를 포함한 다양한 세포 효과들을 생성시킨다. BMP 억제제는 이들 경로를 통한 신호전달의 현저한 감소를 발생시키는 임의의 억제제이다. 예를 들어, BMP 억제제는 BMP와 BMP 수용체와의 상호작용을 붕괴시키거나; BMP 수용체에 결합하여 하류 신호전달의 활성화를 억제하거나; Smad 1, Smad 5 또는 Smad 8의 인산화를 억제하거나; Smad 1, Smad 5 또는 Smad 8의 핵으로의 전위를 억제하거나; 표적 유전자의 SMAD 1, SMAD 5 또는 SMAD 8 매개된 전사를 억제하거나; 또는 BMP의 발현, 폴딩 또는 분비를 억제할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 BMP 억제제는 BMPR-I 수용체 부류를 통한 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시태양에서 상기 BMP 억제제는 BMPR-II 수용체 부류를 통한 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시태양에서 상기 BMP 억제제는 SMAD 1/5/8을 통한 신호전달을 감소시킨다. 상기 억제는 직접적이거나 간접적일 수 있다.
다수의 BMP 억제제들이 당해 분야에, 예를 들어 문헌[Cuny, et al., (2008) Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett 18: 4388-4392]에 개시된 바와 같이 공지되어 있다. 이들 BMP 억제제 중 어느 하나가 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다. 적합한 BMP 억제제의 식별 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 적합한 분석은 문헌[Zilberberg et al., BMC Cell Biology 2007 8:41]에 기재되어 있다. BMP 억제제(특히 ALK2 및 ALK3를 통한 Smad 1, 5 또는 8의 인산화를 억제하는 BMP 억제제)에 대한 또 다른 적합한 분석은 문헌[Cuny, et al., (2008) Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett 18: 4388-4392]에 기재된 사이토보트 세포 ELISA 분석을 사용하여 당해 분야의 숙련가에 의해 확인될 수 있다.
일부 실시태양에서 상기 BMP 억제제는 노긴, 코르딘, 폴리스타틴, 그렘린, tsg(뒤틀린 낭배형성), sog(짧은 낭배형성), 도르소몰핀 및 LDN193189 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 BMP 억제제는
a. 도르소몰핀 또는 LDN193189 또는 이들의 유사체 또는 변체; 및/또는
b. 노긴, 스클레로스틴, 코르딘, CTGF, 폴리스타틴, 그렘린, tsg, sog 또는 이들의 유사체 또는 변체
중에서 선택된다.
일부 바람직한 실시태양에서 상기 BMP 억제제는 노긴이다. 노긴은 시험관내 배양 방법에 특히 적합하다. 다른 바람직한 실시태양에서 상기 BMP 억제제는 LDN193189이다. LDN193189는 경구적으로 이용 가능하고 따라서 경구 투여에 적합하기 때문에 생체내 치료 방법에 특히 적합하다(이후의 치료 방법에 대한 추가의 언급을 참조하시오).
일부 실시태양에서, 노긴은 상기 분화 배지에 1 내지 1000 ng/㎖, 10 내지 1000 ng/㎖, 100 내지 1000 ng/㎖, 1 내지 500 ng/㎖, 1 내지 200 ng/㎖, 1 내지 100 ng/㎖, 10 내지 500 ng/㎖, 20 내지 500 ng/㎖, 10 내지 200 ng/㎖, 20 내지 200 ng/㎖, 50 내지 500 ng/㎖, 또는 50 내지 200 ng/㎖의 최종 농도로 포함된다. 일부 실시태양에서, 노긴은 상기 분화 배지에 약 100 ng/㎖의 최종 농도로 포함된다.
일부 실시태양에서, LDN193189는 상기 분화 배지에 1 nM 내지 10 μM, 5 nM 내지 10 μM, 10 nM 내지 10 μM, 100 nM 내지 10 μM, 1 μM 내지 10 μM, 또는 1 μM 내지 5 μM의 최종 농도로 포함된다. 일부 실시태양에서, LDN193189는 상기 분화 배지에 적어도 1 nM, 적어도 5 nM, 적어도 10 nM, 적어도 100 nM, 적어도 1 μM, 또는 약 10 μM의 최종 농도로 포함된다.
또한, EEC를 포함하는 세포 집단에서 GLP-1 분비를 증가시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포 집단을 BMP 억제제와 접촉시킴을 포함한다. 또한, EEC를 포함하는 세포 집단에서 세크레틴 분비를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포 집단을 BMP 억제제와 접촉시킴을 포함한다.
또한, EEC를 포함하는 세포 집단에서 Tac1 발현을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포 집단을 BMP 억제제와 접촉시킴을 포함한다.
또한, EEC를 포함하는 세포 집단에서 Gcg 발현을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포 집단을 BMP 억제제와 접촉시킴을 포함한다.
헤지호그 활성제 및 억제제
본 발명자들은 놀랍게도 EEC 분화 배지 중에 헤지호그 신호전달의 억제제의 포함이 일부 상황에서, 분화된 EEC 집단 중 GLP1- 및 CCK-분비 세포의 존재를 증가시킬 수 있음을 발견하였다(도 14를 참조하시오). 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 하나 이상의 헤지호그 억제제를 추가로 포함한다. 상기 하나 이상의 헤지호그 억제제는 세포에서 헤지호그 신호전달을 감소시키는 임의의 적합한 억제제일 수 있다. 상기 배지는 GLP1- 및 CCK-분비 세포가 풍부한 EEC 집단을 수득하는데 적합하다. 한편으로, 상기 GLP1- 및 CCK-분비 세포의 수가 고갈된 EEC 집단은 헤지호그 활성제를 추가로 포함하는 본 발명의 분화 배지를 사용하여 수득될 수 있다. 상응하게, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 하나 이상의 헤지호그 활성제를 추가로 포함한다. 상기 하나 이상의 헤지호그 활성제는 세포에서 헤지호그 신호전달을 증가시키는 임의의 적합한 활성제일 수 있다.
포유동물 헤지호그(Hh) 리간드는 소닉 헤지호그(Shh), 인디언 헤지호그(Ihh) 및 데저트 헤지호그(Dhh)를 포함한다. Hh 리간드는 전형적으로 자기촉매 절단 및 동반되는 카복시 말단에서의 콜레스테롤 변형 및 아미노 말단에서의 팔미토일화를 겪어, 분비된, 이중-지질화된 단백질을 생성시키는 전구체 단백질로서 합성된다. Hh 리간드는 디스패치드(Dispatched) 및 Scube2의 병행 작용을 통해 세포 표면으로부터 방출되고 후속적으로 세포 표면 단백질 LRP2 및 헤파란 설페이트 프로테오글리칸의 글리피칸 과(GPC1-6)와의 상호작용을 통해 다수의 세포에 걸쳐 수송된다.
Hh 단백질은 정준 수용체 패치드(PTCH1) 및 공-수용체 GAS1, CDON 및 BOC에의 결합을 통해 신호전달을 개시한다. PTCH1에의 Hh 결합은, 섬모에 스무든드(Smoothened)(SMO) 축적 및 세포질 꼬리의 인산화를 생성시키는 GPCR-유사 단백질 SMO의 억제해제를 생성시킨다. SMO는 키네신-과 단백질, Kif7 및 핵심 세포내 Hh 경로 조절제 SUFU로부터 GLI 단백질(상기 Hh 경로의 전사 효과기)의 해리를 포함하는 하류 신호 전달을 매개한다.
일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 헤지호그 억제제는 SMO 억제제를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 SMO 억제제는 사이클로파민 또는 사이클로파민-경쟁 억제제(예를 들어 비스모게니브, 사리데지브 또는 사이클로파민)이다. 다른 실시태양에서, 상기 SMO 억제제는 사이클로파민-경쟁적 억제제(예를 들어 이트라코나졸)가 아니다.
일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 헤지호그 억제제는 PTCH1에의 Hh 결합을 억제하는 항-PTCH1 항체를 포함한다(예를 들어 문헌[Nakamura et al. (2007) Anticancer Research 27:3743-3748]을 참조하시오).
일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 헤지호그 활성제는 SMO 활성제를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 SMO 활성제는 SAG(Hh-Ag1.3) 또는 풀모르파민이다.
헤지호그 억제제 및 헤지호그 활성제는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 Gli1 및 Ptch1의 mRNA 수준을 측정하는 RT-PCR 방법을 사용하여 식별될 수 있다(예를 들어 문헌[Nakamura et al. (2007) Anticancer Research 27:3743-3748]을 참조하시오). Gli1 및 Ptch1은 Gli1 트랜스-활성화의 표적 유전자이며, 따라서 Hh 신호전달 경로 활성의 마커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Gli1 및 Ptch1의 억제된 발현은 감소된 Hh 신호전달 경로 활성을 가리킨다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 헤지호그 억제제는 상기 헤지호그 신호전달 경로의 활성을, RT-PCR 분석에 의해 평가시 대조용에 비해, 10% 초과; 30% 초과; 60% 초과; 80% 초과; 90% 초과; 95% 초과; 또는 99% 초과까지 감소시킨다. 억제를 측정하기 위한 RT-PCR 분석의 예는 상기에 기재된 바와 같이 당해 분야에 주지되어 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 헤지호그 활성제는 상기 헤지호그 신호전달 경로의 활성을, RT-PCR 분석에 의해 평가시 대조용에 비해, 10% 초과; 30% 초과; 60% 초과; 80% 초과; 90% 초과; 95% 초과; 또는 99% 초과까지 증가시킨다. 활성화를 측정하기 위한 RT-PCR 분석의 예는 상기에 기재된 바와 같이 당해 분야에 주지되어 있다.
일부 실시태양에서, 상기 헤지호그 억제제는 0.01-200 μM, 0.01-100　μM, 0.05-100 μM, 0.1-50 μM, 0.1-20 μM, 1-100 μM, 1-50 μM, 1-30 μM, 1-10 μM, 5-100 μM, 5-50 μM 또는 5-20　μM의 농도로 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 헤지호그 억제제(예를 들어 비스모게니브)는 약 5 μM의 농도로 존재한다.
일부 실시태양에서, 상기 헤지호그 활성제는 0.01-200 μM, 0.01-100　μM, 0.05-100 μM, 0.1-50 μM, 0.1-20 μM, 1-100 μM, 1-50 μM, 1-30 μM, 1-10 μM, 5-100 μM, 5-50 μM 또는 5-20　μM의 농도로 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 헤지호그 활성제(예를 들어 SAG (Hh-Ag1.3) 또는 풀모르파민)는 약 5 μM의 농도로 존재한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 2, 3, 4 또는 그 이상의 헤지호그 억제제를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 2, 3, 4 또는 그 이상의 헤지호그 활성제를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 헤지호그 억제제를 포함하지 않는다.
mTOR 신호전달의 조절제
발명자들은 놀랍게도 mTOR 신호전달 조절제의 포함이 EEC 하위유형들의 상대적인 비에 영향을 미칠 수 있음을 발견하였다(예를 들어 mTOR 활성제는 GLU-발현 EEC를 향한 분화를 촉진시킬 수 있다). 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 하나 이상의 mTOR 신호전달의 조절제를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 mTOR 신호전달의 조절제는 mTOR 신호전달의 억제제를 포함한다. 상기 하나 이상의 mTOR 억제제는 세포에서 mTOR 신호전달을 감소시키는 임의의 적합한 억제제일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 mTOR 신호전달의 조절제는 mTOR 신호전달의 활성제(예를 들어 MHY1485)를 포함한다. 상기 하나 이상의 mTOR 활성제는 세포에서 mTOR 신호전달을 증가시키는 임의의 적합한 활성제일 수 있다.
라파마이신의 기구학적 표적(mTOR)은 2개의 별개의 복합체 중에 존재하는 비전형적인 세린/쓰레오닌 키나제이다. 첫 번째, mTOR 복합체 1(mTORC1)은 mTOR, 랩터, GβL, 및 DEPTOR로 구성되며, 라파마이신에 의해 억제된다. 상기는 성장인자, 에너지 수준, 세포 스트레스 및 아미노산을 포함한 다양한 영양 및 환경 신호를 감지하여 통합시키는 마스터 성장조절제이다. 상기는 이들 신호를, mRNA 번역 및 지질 합성과 같은 동화 과정을 강화하거나 또는 자가포식과 같은 이화 과정을 제한하는 기질들을 인산화시킴으로써 세포 성장의 촉진에 연결시킨다. 작은 GTPase Rheb는 그의 GTP-결합된 상태에서, 그의 GAP, 결절성 경화증 이종이량체 TSC1/2에 의해 음으로 조절되는 mTORC1 키나제 활성의 필요하고 효능 있는 자극제이다. 대부분의 상류 투입물은 Akt 및 TSC1/2를 통해 공급되어 상기 Rheb의 뉴클레오티드-로딩 상태를 조절한다. 대조적으로, 아미노산은 상기 PI3K/Akt 축과 독립적으로, mTORC1의 리소솜 표면(여기에서 상기 표면은 Rheb와 접촉시 활성화될 수 있다)으로의 전위를 촉진하도록 mTORC1에 신호를 전달한다. 상기 과정은 다수의 복합체, 특히 v-ATPase, 레귤레이터(Ragulator), Rag GTPase, 및 GATOR1/2의 협력 작용에 의해 매개된다. 두 번째 복합체, mTOR 복합체 2(mTORC2)는 mTOR, 릭터(Rictor), GβL, Sin1, PRR5/프로터(Protor)-1, 및 DEPTOR로 구성된다. mTORC2는 Akt를 활성화시킴으로서 세포 생존을 촉진하고, PKCα를 활성화시킴으로써 세포골격 동역학을 조절하고, SGK1 인산화를 통해 이온 수송 및 성장을 조절한다.
일부 실시태양에서, mTOR 신호전달의 활성제는 MHY1485이다.
일부 실시태양에서, mTOR 신호전달의 억제제는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체(예를 들어 라파마이신, 데포로리무스(AP23573), 에베로리무스(RAD001), 및 템시로리무스(CCI-779))이다. 일부 실시태양에서, mTOR 신호전달의 억제제는 ATP-경쟁적인 mTOR 키나제 억제제(예를 들어 MLN0128, pp242 또는 AZD8055)이다.
mTOR 억제제 및 mTOR 활성제를 당해 분야에 공지된 방법들을 사용하여, 예를 들어 ELISA-기반 mTOR 키나제 분석을 사용하여(예를 들어 ATP의 존재하에서 p70S6K-GST 융합 단백질(특이적인 mTOR 기질)의 인산화의 검출을 위한 ELISA-기반 활성 분석인 K-LISA(상표) mTOR 활성 키트를 사용하여) 식별할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 mTOR 억제제는 상기 mTOR 신호전달 경로의 활성을 ELISA-기반 분석에 의해 평가시 대조용에 비해, 10% 초과; 30% 초과; 60% 초과; 80% 초과; 90% 초과; 95% 초과; 또는 99% 초과까지 감소시킨다. 억제를 측정하기 위한 ELISA-기반 분석의 예는 상기에 기재된 바와 같이 당해 분야에 주지되어 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 mTOR 활성제는 상기 mTOR 신호전달 경로의 활성을, ELISA-기반 분석에 의해 평가시 대조용에 비해, 10% 초과; 30% 초과; 60% 초과; 80% 초과; 90% 초과; 95% 초과; 또는 99% 초과까지 증가시킨다. 활성화를 측정하기 위한 ELISA-기반 분석의 예는 상기에 기재된 바와 같이 당해 분야에 주지되어 있다.
일부 실시태양에서, 상기 mTOR 억제제는 0.01-200 μM, 0.01-100　μM, 0.05-100 μM, 0.1-50 μM, 0.1-20 μM, 1-100 μM, 1-50 μM, 1-30 μM, 1-10 μM, 5-100 μM, 5-50 μM 또는 5-20　μM의 농도로 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 mTOR 억제제(예를 들어 라파마이신, 데포로리무스(AP23573), 에베로리무스(RAD001) 또는 템시로리무스(CCI-779))는 약 5 μM의 농도로 존재한다.
일부 실시태양에서, 상기 mTOR 활성제는 0.01-200 μM, 0.01-100　μM, 0.05-100 μM, 0.1-50 μM, 0.1-20 μM, 1-100 μM, 1-50 μM, 1-30 μM, 1-10 μM, 5-100 μM, 5-50 μM 또는 5-20　μM의 농도로 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 mTOR 활성제(예를 들어 MHY1485)는 약 5 μM의 농도로 존재한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 2, 3, 4 또는 그 이상의 mTOR 억제제를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 2, 3, 4 또는 그 이상의 mTOR 활성제를 포함한다.
GSK-3 억제제
앞서, GSK-3 억제제(예를 들어 CHIR99021)의 포함이 또한 상피줄기세포의 분화를 개선시키는 것으로 밝혀졌다(GB 1603569.3을 참조하시오). 상기에 설명된 바와 같이, GSK-3은 β-카테닌 파괴 복합체의 성분이다. GSK-3 활성의 억제는 β-카테닌의 감소된 파괴를 생성시키며, 따라서 GSK-3 억제제는 Wnt 작용물질이다. 상기 분화 배지 중 GSK-3 억제제의 포함에 의해 유도되는 증대된 분화는 상기 파괴 복합체로부터 하류인 TCF/LEF-매개된 전사를 억제하는 Wnt 억제제(iCRT3)의 첨가에 의해 크게 증가되었다. 예를 들어, Wnt 작용물질(CHIR99021) 및 Wnt 억제제(iCRT3) 모두를 간 전구세포용 분화배지에 포함시키는 경우 간세포 마커(알부민 및 Cyp3A4)의 발현의 현저한 개선이 존재하였다. 임의의 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 GSK-3 억제제가 상피줄기세포에서 분화를 자극하기도하고 억제하기도 할 수 있는 것(자극이 억제보다 더 강하다)으로 생각한다. GSK-3 억제제에 의한 분화의 억제는 β-카테닌 파괴의 촉진을 통해 발생하는 것으로 생각된다. 대조적으로, GSK-3 억제제에 의한 분화의 촉진은 별개의 효과기 기전에 의해 발생하는 것으로 생각된다.
상응하게, GSK-3 억제제를 상기 분화 배지에 포함시키는 경우, 상기 Wnt 억제제는, 상기 GSK-3 억제제-포함 분화 배지 중의 파괴 복합체로부터 하류에서 TCF/LEF-매개된 전사를 억제하고 상기 GSK-3 억제제의 분화-억제 효과를 상쇄시키는 Wnt 억제제이어야 한다. 상기 파괴 복합체의 하류에서 작용하는 Wnt 억제제는 상기 언급된 부류(7)의 Wnt 억제제, 즉 β-카테닌 표적 유전자 발현의 억제제, 예를 들어 β-카테닌:TCF/Lef 전사 복합체의 억제제, 예를 들어 β-카테닌:TCF-4 복합체를 붕괴시키는 억제제(예를 들어 iCRT3, CGP049090, PKF118310, PKF115-584, ZTM000990, PNU-74654, BC21, iCRT5, iCRT14 또는 FH535) 및 히스톤 데아세틸라제 SIRT1의 억제제(예를 들어 캄비놀)를 포함한다.
따라서, GSK-3 억제제의 분화-촉진 효과는 영향을 받지 않은 채로 있으며 상기 Wnt 억제제의 분화-촉진 효과에 의해 그 효과가 가중된다.
상응하게, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 GSK-3 억제제를 포함한다. 임의의 적합한 GSK-3 억제제를 사용할 수 있다. GSK-3 억제제는 GSK-3 키나제 활성을 감소시키는 작용제인 것으로서 정의된다.
GSK-3의 2개의 상이한 동형이 인간에서 발견된다(GSK-3α 및 GSK-3β). 이들 동형 중 하나 또는 둘 모두를 억제하는 억제제들이 공지되어 있다. 상응하게, 일부 실시태양에서, 상기 GSK-3 억제제는 GSK-3α 및 GSK-3β를 억제한다. 일부 실시태양에서, 상기 GSK-3 억제제는 GSK-3α를 억제하지만 GSK-3β는 억제하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 GSK-3 억제제는 GSK-3β를 억제하지만 GSK-3α는 억제하지 않는다.
일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 하나 초과의 GSK-3 억제제(예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 GSK-3 억제제)를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 GSK-3 억제제는 CHIR99021이다.
일부 실시태양에서, 상기 GSK-3 억제제를 상기 배지에, 세포에서 GSK-3 활성을 억제하기에 유효한 양으로, 동일한 세포 유형에서 평가시 상기 분자의 부재하에서의 상기 GSK-3 활성의 수준에 비해, 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 100%까지 첨가한다. 숙련가에게 공지된 바와 같이, GSK-3 활성을 특정한 GSK-3 기질, 예를 들어 β-카테닌의 인산화를 모니터링함으로써 측정할 수 있다(예를 들어 문헌[Cole et al. (2008) Methods Mol Biol. 468:45-65]을 참조하시오). 따라서 신규의 GSK-3 억제제는 당해 분야에 공지된 분석을 사용하여 숙련가에 의해 용이하게 식별될 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 GSK-3 억제제는 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: CHIR99201, 6-BIO, 디브로모칸타렐린, 하이메니알데신, 인디루빈스, 메리디아닌스, CT98014, CT98023, CT99021, TWS119, SB-216763, SB-41528, AR-A014418, AZD-1080, 알스테르폴론, 카즈폴론, 켄폴론, 알로이신스, 맨자민A, 팔리뉴린, 트리칸틴, TDZD-8, NP00111, NP031115, 티데글루시브, HMK-32 및 L803-mts.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 GSK-3 억제제를 0.001-500 μM, 0.01-150 μM, 0.1-100 μM, 1-100 μM, 0.5-50 μM, 1-50 μM, 1-20 μM 또는 1-5 μM의 농도로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 CHIR99021을 0.01-150 μM, 0.1-100 μM, 1-100 μM, 0.5-50 μM, 1-50 μM, 1-20 μM 또는 1-5 μM의 농도로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 CHIR99021을 약 3 μM의 농도로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 GSK-3 억제제 및 상기 파괴 복합체의 하류에서 작용하는 Wnt 억제제, 예를 들어 앞서 기재된 바와 같은 β-카테닌 표적 유전자 발현의 억제제를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 GSK-3 억제제 및 β-카테닌 표적 유전자 발현의 억제제를 포함한다. β-카테닌 표적 유전자 발현의 억제제는 β-카테닌:TCF/Lef 전사 복합체의 억제제, 예를 들어 β-카테닌:TCF-4 복합체를 붕괴시키는 억제제(예를 들어 iCRT3, CGP049090, PKF118310, PKF115-584, ZTM000990, PNU-74654 또는 BC21) 및 히스톤 데아세틸라제 SIRT1의 억제제(예를 들어 캄비놀)를 포함한다.
상응하게, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 GSK-3 억제제(예를 들어 0.001-500 μM, 0.01-150 μM, 0.1-100 μM, 0.5-50 μM, 1-20 μM 또는 1-5 μM의 농도로) 및 β-카테닌 표적 유전자 발현의 억제제(예를 들어 0.001-500 μM, 0.01-150 μM, 0.1-100 μM, 0.5-50 μM, 1-500 μM, 1-150 μM, 1-100 μM, 1-50 μM, 1-20 μM 또는 1-5 μM의 농도로)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 β-카테닌 표적 유전자 발현의 억제제는 상기 β-카테닌:TCF/Lef 전사 복합체의 억제제이다.
상응하게, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 CHIR99021(예를 들어 0.01-150 μM, 0.1-100 μM, 0.5-50 μM, 1-20 μM 또는 1-5 μM의 농도로) 및 iCRT3(예를 들어 0.05-150 μM, 0.1-150 μM, 1-150 μM, 0.5-100 μM, 1-100 μM 또는 10-80 μM의 농도로)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 약 3 μM 농도의 CHIR99021 및 약 50　μM 농도의 iCRT3를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 GSK-3 억제제를 포함하지 않는다.
CHIR99021 작용물질
상기에 설명한 바와 같이, 앞서, 분화 배지 중 Wnt 작용물질, CHIR99021의 포함은 분화를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 상응하게, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 CHIR99021 또는 CHIR99021 작용물질을 포함한다. CHIR99021 작용물질은 본 명세서에서 CHIR99021과 하나 이상의 생물학적 활성을 공유하는 작용제인 것으로 정의된다.
AP-1 자극제
활성화 단백질 1(AP-1) 복합체는 Fos 단백질 과, Jun, ATF 및 JDP 과에 속하는 단백질들로 구성되는 이종이량체이다. 상기 전사 인자는 사이토킨, 성장인자, 스트레스 및 세균 및 바이러스 감염을 포함한 다양한 자극들에 응답하여 유전자 발현을 조절한다.
앞서, 인간 간 오가노이드는 1차 간세포에 비해 상기 AP-1 복합체의 성분들의 감소된 발현을 갖는 것으로 관찰되었다. 상기 관찰에 근거하여, AP-1 복합체 형성의 자극이 상기 간 오가노이드 중 상피줄기세포의 간세포 운명으로의 분화를 촉진할 것으로 추정되었다. 본 발명자들은 분화 배지 중 AP-1 자극제, 카바콜 (2-[(아미노카보닐)옥시]-N,N,N-트리메틸에탄아미늄 클로라이드)의 포함이 간세포 마커(Cyp3A4 및 알부민 포함)의 발현을 증가시킴을 발견하였다.
앞서 시험된 AP-1 자극제는 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질이다. 5가지 하위유형의 무스카린성 아세틸콜린 수용체(M1-M5)가 존재한다. 이들은 다양한 세포 유형(예를 들어 뉴런)의 세포막에서 발견되는 G-단백질-결합된 수용체들이다.
AP-1 자극제 또는 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질은 또한 간 이외의 조직(예를 들어 장, 위, 췌장 또는 폐)으로부터 상피줄기세포의 분화를 증대시킬 수 있음이 예상된다.
상응하게, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 Ap-1 자극제를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 AP-1 자극제는 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질이다. 임의의 적합한 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질을 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질은 M3 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질(예를 들어 아세틸콜린, 베타네콜, 카바콜, 옥소트레모린 또는 필로카르핀)이다.
일부 실시태양에서, 상기 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 아세틸콜린, 베타네콜, 카바콜, 옥소트레모린, L-689,660 (1-아자비사이클로[2.2.2]옥탄, 3-(6-클로로피라지닐)말리에이트), 필로카르핀, 무스카린, McN-A 343 (4-[[[(3-클로로페닐)아미노]카보닐]옥시]-N,N,N-트리메틸-2-부틴-1-아미늄 클로라이드), 77-LH-218-1 (1-[3-(4-부틸-1-피페리디닐)프로필]-3,4-디하이드로-2(1H)-퀴놀리논) 및 메타콜린.
일부 실시태양에서, 상기 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질은 카바콜이다.
일부 실시태양에서, 상기 AP-1 자극제(예를 들어 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질)는 본 발명의 분화 배지 중에 0.001-500 μM, 0.01-500　μM, 0.01-250 μM, 0.01-150 μM, 0.1-500 μM, 0.1-100 μM, 0.5-500 μM, 0.5-100 μM, 0.5-50 μM, 1-500 μM, 1-300 μM, 1-200 μM, 1-20 μM,1-5 μM, 10-300 μM, 50-300 μM, 50-200 μM 또는 50-150 μM의 농도로 존재한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 카바콜을 0.001-500 μM, 0.001-300 μM, 0.01-500　μM, 0.01-300 μM, 0.1-500 μM, 0.1-300 μM, 1-500 μM, 10-500 μM, 100-500 μM, 1-300 μM, 10-300 μM, 50-300 μM, 50-200 μM 또는 50-150 μM의 농도로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 카바콜을 100 μM의 농도로 포함한다.
무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질
상기에 설명된 바와 같이, 앞서, 분화 배지 중 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질, 카바콜의 포함은 분화를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 상응하게, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질을 추가로 포함한다.
임의의 적합한 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질을 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질은 M3 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질(예를 들어 아세틸콜린, 베타네콜, 카바콜, 옥소트레모린 또는 필로카르핀)이다.
일부 실시태양에서, 상기 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 아세틸콜린, 베타네콜, 카바콜, 옥소트레모린, L-689,660 (1-아자비사이클로[2.2.2]옥탄, 3-(6-클로로피라지닐)말리에이트), 필로카르핀, 무스카린, McN-A 343 (4-[[[(3-클로로페닐)아미노]카보닐]옥시]-N,N,N-트리메틸-2-부틴-1-아미늄 클로라이드), 77-LH-218-1 (1-[3-(4-부틸-1-피페리디닐)프로필]-3,4-디하이드로-2(1H)-퀴놀리논) 및 메타콜린.
일부 실시태양에서, 상기 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질은 카바콜이다.
일부 실시태양에서, 상기 AP-1 자극제(예를 들어 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질)는 본 발명의 분화 배지 중에 0.001-500 μM, 0.01-500　μM, 0.01-250 μM, 0.01-150 μM, 0.1-500 μM, 0.1-100 μM, 0.5-500 μM, 0.5-100 μM, 0.5-50 μM, 1-500 μM, 1-300 μM, 1-200 μM, 1-20 μM,1-5 μM, 10-300 μM, 50-300 μM, 50-200 μM 또는 50-150 μM의 농도로 존재한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 카바콜을 0.001-500 μM, 0.001-300 μM, 0.01-500　μM, 0.01-300 μM, 0.1-500 μM, 0.1-300 μM, 1-500 μM, 10-500 μM, 100-500 μM, 1-300 μM, 10-300 μM, 50-300 μM, 50-200 μM 또는 50-150 μM의 농도로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 카바콜을 100 μM의 농도로 포함한다.
카바콜 작용물질
상기에 설명된 바와 같이, 앞서, 분화 배지 중 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용물질, 카바콜의 포함은 분화를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 상응하게, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 카바콜 또는 카바콜 작용물질을 추가로 포함한다. 카바콜 작용물질은 본 명세서에서 카바콜과 하나 이상의 생물학적 활성을 공유하는 작용제인 것으로서 정의된다.
cAMP 경로 활성제
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 cAMP 경로 활성제를 추가로 포함한다. 상기 cAMP 경로 활성제는 세포 중 cAMP의 수준을 증가시키는 임의의 적합한 활성제일 수 있다. 상기 cAMP 경로는 다수 유형의 호르몬 및 신경전달물질 G-단백질 결합된 수용체의 활성화를 수반한다. 상기 호르몬 또는 신경전달물질의 그의 막-결합된 수용체에의 결합은 상기 수용체의 구조 변화를 유도하며 상기 변화는 상기 G-단백질의 α-서브유닛의 활성화를 유도한다. 상기 활성화된 G 서브유닛은 아데닐일 사이클라제를 자극하는 반면, 활성화되지 않은 G 서브유닛은 상기를 억제한다. 아데닐일 사이클라제의 자극은 세포질 ATP의 cAMP로의 전환을 촉매화하며 따라서 상기 세포 중 cAMP의 수준을 증가시킨다. 따라서, 상기 cAMP 경로 활성제는 예를 들어 아데닐일 사이클라제 활성제일 수 있다. 적합한 아데닐일 사이클라제 활성제의 예는 포스콜린, 포스콜린 유사체 및 콜레라 독소를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 cAMP 경로 활성제는 포스콜린이다. 일부 실시태양에서, 상기 cAMP 경로 활성제는 콜레라 독소가 아니다. 일부 실시태양에서 상기 cAMP 경로 활성제는 cAMP 유사체, 예를 들어 8-브로모-cAMP일 수 있다. 8-브로모-cAMP는 cAMP보다 포스포디에스테라제에 의한 가수분해에 더 큰 내성을 갖는 세포-침투성 cAMP 유사체이다. 일부 실시태양에서, 상기 cAMP 경로 활성제는 NKH477(예를 들어 카탈로그 번호 토크리스(Tocris) 1603)이다.
cAMP 경로 활성제를 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 cAMP 수준을 측정하는 경쟁 면역분석을 사용하여 식별할 수 있다. 캐치포인트(CatchPoint)(등록상표) 사이클릭-AMP 형광 분석 키트(몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices) LLC)는 상기와 같은 면역분석을 수행하기 위해 상업적으로 입수할 수 있는 키트의 일례이다. 상기 샘플 또는 표준물 중 cAMP는 항-cAMP 항체상의 결합 부위에 대해서 양고추냉이 페록시다제(HRP)-표지된 cAMP 접합체와 경쟁한다. cAMP의 부재하에서, 상기 HRP-cAMP 접합체의 대부분은 항체에 결합한다. cAMP의 증가하는 농도는 결합된 접합체의 양을 경쟁적으로 감소시키며, 따라서 측정된 HRP 활성을 감소시킨다. cAMP 경로 활성제는 대조용에 비해 증가된 수준의 cAMP 및 감소된 측정된 HRP 활성을 생성시킬 것이다.
일부 실시태양에서, 상기 cAMP 경로 활성제는 약 10 nM 내지 약 500 μM, 약 10 nM 내지 약 100 μM, 약 1 μM 내지 약 50 μM, 약 1 μM 내지 약 25 μM, 약 5 μM 내지 약 1000 μM, 약 5 μM 내지 약 500 μM, 약 5 μM 내지 약 100 μM, 약 5 μM 내지 약 50 μM, 약 5 μM 내지 약 25 μM, 약 10 μM 내지 약 1000 μM, 약 10 μM 내지 약 500 μM, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 약 10 μM 내지 약 50 μM, 약 10 μM 내지 약 25 μM, 또는 약 20 μM의 농도로 사용된다. 일부 실시태양에서 상기 cAMP 경로 활성제는 적어도 10 nM, 20 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM, 1 μM, 적어도 2 μM, 적어도 5 μM, 적어도 10 μM, 적어도 20 μM, 적어도 30 μM, 적어도 50 μM, 또는 적어도 100 μM의 농도로 사용된다.
상기 선택된 농도는 상기 사용된 cAMP 경로 활성제에 따라 변할 수 있으며 상기 cAMP 경로 활성제의 효능에 따라 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, NKH477은 일반적으로 8-BR-cAMP 및 포스콜린보다 더 효능이 있다. 더 효능이 있는 cAMP 경로 활성제는 동일한 효과에 대해 더 낮은 농도로 사용될 수 있다.
예를 들어, NKH477은 일부 실시태양에서 약 100 nM 내지 약 10 μM의 농도, 또는 약 100 nM, 약 1 μM 또는 약 10 μM의 농도로 사용될 수 있다. 8-BR-cAMP 또는 포스콜린은 일부 실시태양에서 약 1 μM 내지 약 100 μM의 농도, 또는 약 1 μM, 약 10 μM 또는 약 100 μM의 농도로 사용될 수 있다.
콜레라 독소는 일부 실시태양에서 약 1 ng/㎖ 내지 약 500 ng/㎖, 약 10 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖, 약 50 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖, 또는 약 10 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 30 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 약 50 ng/㎖, 약 60 ng/㎖, 약 70 ng/㎖, 약 80 ng/㎖, 약 90 ng/㎖, 약 100 ng/㎖, 약 200 ng/㎖, 약 300 ng/㎖, 약 400 ng/㎖ 또는 약 500 ng/㎖의 농도로 사용될 수 있다.
보충제
본 발명의 분화 배지는 바람직하게는 B27, N-아세틸시스테인 및 N2로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 화합물들 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3 또는 전부)이 보충된다. 따라서 일부 실시태양에서 상기 분화 배지는 B27, N2 및 N-아세틸시스테인으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 B27, N-아세틸시스테인 및 N2를 추가로 포함한다.
B27(인비트로젠), N-아세틸시스테인(시그마) 및 N2(인비트로젠), 및 니코틴아미드(시그마)는 세포의 증식을 조절하고 DNA 안정성을 돕는 것으로 여겨진다.
일부 실시태양에서, N-아세틸시스테인은 상기 분화 배지 중에 0.1-200 mM, 0.1-100 mM, 0.1-50 mM, 0.1-10 mM, 0.1-5 mM, 0.5-200 mM, 0.5-100 mM, 0.5-50 mM, 0.5-10 mM, 0.5-5 mM, 1-100mM, 1-50 mM, 1-10 mM, 1-5 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시태양에서, N-아세틸시스테인은 상기 분화 배지 중에 약 1.25 mM의 농도로 존재한다.
일부 실시태양에서, 상기 B27 보충제는 'B27 보충제 마이너스 비타민 A'(또한 본 명세서에서 "비타민 A가 없는 B27" 또는 "B27 wo VitA"로서 지칭되며; 인비트로젠(Invitrogen)(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재); www.invitrogen.com; 현재 카탈로그 번호 12587010으로부터; 및 PAA 레보라토리즈(PAA Laboratories) GmbH(오스트리아 파싱 소재); www.paa.com; 카탈로그 번호 F01-002; 문헌[Brewer et al. (1993) J Neurosci Res. 35(5):567-76)]으로부터 입수할 수 있다)이다. 일부 실시태양에서, 상기 B27 보충제는 하기 목록 중에서 선택된 성분들 중 하나 이상을 포함하는 제네릭 제형으로 대체될 수 있다: 비오틴, 콜레스테롤, 리놀레산, 리놀렌산, 프로제스테론, 푸트레신, 레티닐 아세테이트, 나트륨 셀레나이트, 트리-요오도티로닌(T3), DL-알파 토코페롤(비타민 E), 알부민, 인슐린 및 트랜스페린.
PAA 레보라토리즈 GmbH에 의해 공급된 B27 보충제는 다른 성분들 중에서도 비오틴, 콜레스테롤, 리놀레산, 리놀렌산, 프로제스테론, 푸트레신, 레티놀, 레티닐 아세테이트, 나트륨 셀레나이트, 트리-요오도티로닌(T3), DL-알파 토코페롤(비타민 E), 알부민, 인슐린 및 트랜스페린을 함유하는 액체 50x 농축물이다. 이들 성분 중에서 적어도 리놀렌산, 레티놀, 레티닐 아세테이트 및 트리-요오도티로닌(T3)은 핵 호르몬 수용체 작용물질이다. B27 보충제를 분화 배지에 농축물로서 첨가하거나 또는 분화 배지에 첨가 전에 희석할 수 있다. 상기를 1x 최종 농도 또는 다른 최종 농도(예를 들어 0.1x 내지 4x 농도, 0.1x 내지 2x 농도, 0.5x 내지 2x 농도, 1x 내지 4x 농도, 또는 1x 내지 2x 농도)로 사용할 수 있다. B27 보충제의 사용이 본 발명의 분화 배지에 비오틴, 콜레스테롤, 리놀레산, 리놀렌산, 프로제스테론, 푸트레신, 레티놀, 레티닐 아세테이트, 나트륨 셀레나이트, 트리-요오도티로닌(T3), DL-알파 토코페롤(비타민 E), 알부민, 인슐린 및 트랜스페린을 통합시키는 편리한 방법이다. 이들 성분 중 일부 또는 전부를 상기 B27 보충제를 사용하는 대신에 상기 분화 배지에 별도로 첨가할 수 있음이 또한 예상된다. 따라서, 상기 분화 배지는 이들 성분 중 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 레티노산은 상기 분화 배지에 사용되는 B27 보충제에 없고/없거나 상기 분화 배지로부터 존재하지 않는다.
'N2 보충제'(또한 본 명세서에서 "N2"로서 지칭됨)를 인비트로젠(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재); www.invitrogen.com; 카탈로그 번호 17502-048로부터; 및 PAA 레보라토리즈 GmbH(오스트리아 파싱 소재); www.paa.com; 카탈로그 번호 F005-004; 문헌[Bottenstein & Sato, PNAS, 76(1):514-517, 1979]으로부터 입수할 수 있다. 상기 PAA 레보라토리즈 GmbH에 의해 공급된 N2 보충제는 500 ㎍/㎖ 인간 트랜스페린, 500 ㎍/㎖ 소 인슐린, 0.63 ㎍/㎖ 프로제스테론, 1611 ㎍/㎖ 푸트레신, 및 0.52 ㎍/㎖ 나트륨 셀레나이트를 함유하는 100x 액체 농축물이다. N2 보충제를 분화 배지에 농축물로서 첨가하거나 또는 분화 배지에 첨가 전에 희석할 수 있다. 상기를 1x 최종 농도 또는 다른 최종 농도(예를 들어 0.1x 내지 4x 농도, 0.1x 내지 2x 농도, 0.5x 내지 2x 농도, 1x 내지 4x 농도, 또는 1x 내지 2x 농도)로 사용할 수 있다. N2 보충제의 사용이 본 발명의 분화 배지에 트랜스페린, 인슐린, 프로제스테론, 푸트레신 및 나트륨 셀레나이트를 통합시키는 편리한 방법이다. 이들 성분 중 일부 또는 전부를 상기 N2 보충제를 사용하는 대신에 상기 분화 배지에 별도로 첨가할 수 있음이 또한 예상됨은 물론이다. 따라서, 상기 분화 배지는 이들 성분 중 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
상기 배지가 B27을 포함하는 일부 실시태양에서, 상기는 또한 N2를 포함하지 않는다. 따라서 본 발명의 실시태양을, 경우에 따라, B27이 존재하는 경우 N2를 제외시키도록 맞출 수 있다.
일부 실시태양에서 N2는 상기 분화 배지 중에 존재하지 않는다.
상기 배지가 N2를 포함하는 일부 실시태양에서, 상기는 또한 B27을 포함하지 않는다. 따라서 본 발명의 실시태양을, 경우에 따라, N2가 존재하는 경우 B27을 제외시키도록 맞출 수 있다.
일부 실시태양에서 B27은 상기 분화 배지 중에 존재하지 않는다.
일부 실시태양에서 상기 분화 배지에 B27 및/또는 N2가 보충된다.
일부 실시태양에서, 상기 기본 배지는 150 ng/㎖ 내지 250 ng/㎖ N-아세틸시스테인이 보충되고; 바람직하게는, 상기 기본 배지는 약 200 ng/㎖의 N-아세틸시스테인이 보충된다.
임의의 적합한 pH를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 배지의 pH는 약 7.0 내지 7.8의 범위, 약 7.2 내지 7.6의 범위, 또는 약 7.4일 수 있다. 상기 pH를 완충제를 사용하여 유지시킬 수 있다. 적합한 완충제는 숙련가에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 완충제는 카보네이트 완충제(예를 들어 NaHCO3), 및 포스페이트(예를 들어 NaH2PO4)를 포함한다. 이들 완충제는 일반적으로 약 50 내지 약 500 ㎎/ℓ로 사용된다. 다른 완충제, 예를 들어 N-[2-하이드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄설폰산](HEPES) 및 3-[N-모르폴리노]-프로판설폰산(MOPS)은 또한 통상적으로 대략 1000 내지 대략 10,000 ㎎/ℓ로 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 완충제는 하기의 목록 중 하나 이상으로부터 선택된다: 포스페이트 완충제(예를 들어 KH2PO4, K2HPO4, Na2HPO4, NaCl, NaH2PO4) 아세테이트 완충제(예를 들어 HOAc 또는 NaOAc), 시트레이트 완충제(예를 들어 시트르산 또는 Na-시트레이트), 또는 TRIS 완충제(예를 들어 TRIS, TRIS-HCl) 또는 유기 완충제. 일부 실시태양에서, 상기 유기 완충제는 쯔비터이온성 완충제, 예를 들어 굿 완충제이며, 예를 들어 HEPES, MOPS, MES, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, 콜라민 클로라이드, BES, TES, DIPSO, 아세트아민도글리신, TAPSO, POPSO, HEPPSO, HEPPS, 트리신, 글리신아미드, 비신, TAPS, AMPSO, CABS, CHES, CAPS 및 CAPSO 중에서 선택된다. 바람직한 완충제는 예를 들어 0.1-100 mM, 0.1-50 mM, 0.5-50 mM, 1-50 mM, 1-20 mM 또는 5-15 mM 농도의 HEPES이다. 일부 실시태양에서, HEPES를 상기 배양 배지에 약 10 mM로 첨가한다. 분화 배지는 또한 상기 배지의 pH 상태를 쉽게 모니터할 수 있게 pH 지시약, 예를 들어 페놀 레드(예를 들어 약 5 내지 약 50 ㎎/리터)를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 분화 배지는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 숙련가는 분화 배지에 사용하기에 적합한 아미노산의 유형 및 양을 이해한다. 존재할 수 있는 아미노산은 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라진, L-아스파트산, L-시스테인, L-시스틴, L-글루탐산, L-글루타민, L-글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-쓰레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발란 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 분화 배지는 이들 아미노산을 모두 함유할 것이다. 일반적으로, 각각의 아미노산은 존재하는 경우, L-글루탐산(이는 약 0.05 내지 약 1 g/L(대개는 약 0.1 내지 약 0.75 g/L)로 존재한다)을 제외하고, 약 0.001 내지 약 1 g/L의 배지(대개는 약 0.01 내지 약 0.15 g/L)로 존재한다. 상기 아미노산은 합성 기원의 것일 수도 있다.
본 발명에 사용하기 위한 분화 배지는 하나 이상의 비타민을 포함할 수 있다. 숙련가는 분화 배지에 사용하기에 적합한 비타민의 유형 및 양을 이해한다. 존재할 수 있는 비타민은 티아민(비타민 B1), 리보플라빈(비타민 B2), 니아신(비타민 B3), D-칼슘 판토테네이트(비타민 B5), 피리독살/피리독스아민/피리독신(비타민 B6), 폴산(비타민 B9), 시아노코발아민(비타민 B12), 아스코르브산(비타민 C), 칼시페롤(비타민 D2), DL-알파 토코페롤(비타민 E), 비오틴(비타민 H) 및 메나디온(비타민 K)을 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 분화 배지는 하나 이상의 무기염을 포함할 수 있다. 숙련가는 분화 배지에 사용하기에 적합한 무기염의 유형 및 양을 이해한다. 무기염은 전형적으로 세포의 삼투 균형의 유지를 돕고 막 전위의 조절을 돕기 위해 분화 배지에 포함된다. 존재할 수 있는 무기염은 칼슘, 구리, 철, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 아연의 염을 포함한다. 상기 염은 통상적으로 클로라이드, 포스페이트, 설페이트, 니트레이트 및 비카보네이트의 형태로 사용된다. 사용될 수 있는 구체적인 염은 CaCl2, CuSO4-5H2O, Fe(NO3)-9H2O, FeSO4-7H2O, MgCl, MgSO4, KCl, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4, Na2HPO4-H2O 및 ZnSO4-7H2O를 포함한다.
상기 배지의 오스몰 농도는 약 200 내지 약 400 mOsm/㎏의 범위, 약 290 내지 약 350 mOsm/㎏의 범위, 또는 약 280 내지 약 310 mOsm/㎏의 범위일 수 있다. 상기 배지의 오스몰 농도는 약 300 mOsm/㎏ 미만(예를 들어 약 280 mOsm/㎏)일 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 분화 배지는 하나 이상의 당 형태의 탄소 에너지원을 포함할 수 있다. 숙련가는 분화 배지에 사용하기에 적합한 당의 유형 및 양을 이해한다. 존재할 수 있는 당은 글루코스, 갈락토스, 말토스 및 프럭토스를 포함한다. 상기 당은 바람직하게는 글루코스, 특히 D-글루코스(덱스트로스)이다. 탄소 에너지원은 통상적으로 약 1 내지 약 10 g/L로 존재할 것이다.
본 발명의 분화 배지는 혈청을 함유할 수 있다. 임의의 적합한 공급원으로부터 수득되는 혈청, 예를 들어 소 태아 혈청(FBS), 염소 혈청 또는 인간 혈청을 사용할 수 있다. 바람직하게, 인간 혈청이 사용된다. 혈청을 통상적인 기법에 따라, 상기 배지의 약 1 내지 약 30 부피%로 사용할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 다양한 상이한 혈청 대체물 제형을 상업적으로 입수할 수 있으며 이는 숙련가에게 공지되어 있다. 혈청 대체물이 사용되는 경우, 상기는 통상적인 기법에 따라, 상기 배지의 약 1 내지 약 30 부피%로 사용될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 무-혈청 및/또는 무-혈청 대체물일 수 있다. 무-혈청 배지는 어떠한 유형의 동물 혈청도 함유하지 않는 것이다. 무-혈청 배지가 줄기세포의 가능한 외부-오염을 피하기 위해 바람직할 수 있다. 무-혈청 대체물 배지는 어떠한 상업적인 혈액 대체물 제형도 보충되지 않은 것이다.
바람직한 실시태양에서, 상기 분화 배지는 정제된, 천연, 반-합성 및/또는 합성 성장 인자가 보충되며 소 태아 혈청 또는 송아지 태아 혈청과 같은 한정되지 않은 성분을 포함하지 않는다. 예를 들어 B27(인비트로젠), N-아세틸시스테인(시그마) 및 N2(인비트로젠)와 같은 보충제는 일부 세포의 증식을 자극한다. 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 이들 보충제 중 하나 이상, 예를 들어 이들 보충제 중 하나, 임의의 2개 또는 3개 모두가 보충된다.
본 발명에 사용하기 위한 분화 배지는 하나 이상의 미량 원소, 예를 들어 바륨, 브로뮴, 코발트, 요오드, 망간, 크로뮴, 구리, 니켈, 셀레늄, 바나듐, 티타늄, 게르마늄, 몰리브데늄, 규소, 철, 불소, 은, 루비듐, 주석, 지르코늄, 카드뮴, 아연 및/또는 알루미늄을 포함할 수 있다.
상기 배지는 환원제, 예를 들어 베타-머캅토에탄올을 약 0.1 mM의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 분화 배지는 하나 이상의 추가적인 작용제, 예를 들어 줄기세포 배양을 개선시키는 것으로 앞서 보고된 영양소 또는 성장인자, 예를 들어 콜레스테롤/트랜스페린/알부민/인슐린/프로제스테론, 푸트레신, 셀레나이트/다른 인자들을 포함할 수 있다.
조성물 및 용기
본 발명은 또한 상술한 본 발명의 태양들 중 어느 하나에 따른 세포 및/또는 오가노이드, 및 상술한 본 발명의 태양들 중 어느 하나에 따른 분화 배지를 포함하는 조성물 또는 세포 배양 용기를 제공한다. 예를 들어, 상기와 같은 조성물 또는 세포 배양 용기는 상술한 분화 배지 중에 본 발명의 방법에 따라 배양된 임의의 수의 세포 또는 오가노이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 더욱 추가의 태양에 따라, 본 발명의 분화 배지를 함유하는 용봉한(hermetically-sealed) 용기를 제공한다. 용봉한 용기는 오염 방지를 위해 상기 분화 배지를 수송하거나 보관하는데 바람직할 수 있다. 상기 용기는 임의의 적합한 용기, 예를 들어 플라스크, 플레이트, 병, 단지, 바이알 또는 백일 수 있다.
본 발명의 예시적인 분화 배지
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 Wnt 억제제, 노취 억제제 및 EGFR 억제제를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 기본 배지를 추가로 포함한다.
상응하게 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 Wnt 억제제, 노취 억제제 및 EGFR 억제제(예를 들어 제피티니브)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 IWP-2(예를 들어 약 1.5 μM의 농도), DAPT(예를 들어 약 1 mM의 농도) 및 제피티니브(예를 들어 약 5 μM의 농도)를 포함한다.
예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 Wnt 억제제, 노취 억제제 및 EGFR 및 ErbB2 억제제(예를 들어 아파티니브)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 IWP-2(예를 들어 약 1.5 μM의 농도), DAPT(예를 들어 약 1 mM의 농도) 및 아파티니브(예를 들어 약 10 μM의 농도)를 포함한다.
예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 Wnt 억제제, 노취 억제제 및 RAS-RAF-MAPK 경로 억제제(예를 들어 MEK 억제제)를 포함한다.
예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 IWP-2(예를 들어 약 1.5 μM의 농도), DAPT(예를 들어 약 1 mM의 농도) 및 MEK 억제제, 예를 들어 PD0325901(예를 들어 약 1.5 μM의 농도)를 포함한다.
예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 IWP-2(예를 들어 약 1.5 μM의 농도), DAPT(예를 들어 약 1 mM의 농도) 및 ERK 억제제, 예를 들어 SCH772984(예를 들어 약 10 μM의 농도)를 포함한다.
일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 BMP 경로 활성제(예를 들어 BMP4)를 추가로 포함한다. 상기에 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 BMP 경로 활성제의 포함이 세크레틴-생산 세포 분화를 촉진하고 엔테로크로마핀 세포 분화를 억제할 수 있음을 발견하였다. 다른 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 BMP 억제제(예를 들어 노긴)를 추가로 포함한다. 상기에 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 BMP 억제제의 포함이 GLP-1-생산 세포 분화를 촉진하고 세크레틴-생산 세포 분화를 억제할 수 있음을 발견하였다.
상응하게, 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 Wnt 억제제(예를 들어 IWP2), 노취 억제제(예를 들어 DAPT), EGFR 억제제(예를 들어 제피티니브) 및 BMP 경로 활성제(예를 들어 BMP4)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 IWP-2(예를 들어 약 1.5 μM의 농도), DAPT(예를 들어 약 1 mM의 농도), 제피티니브(예를 들어 약 5 μM의 농도) 및 BMP4(예를 들어 약 10 ㎍/㎖의 농도)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 Wnt 억제제, 노취 억제제, EGFR 및 ErbB2 억제제(예를 들어 아파티니브) 및 BMP 경로 활성제(예를 들어 BMP4)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 IWP-2(예를 들어 약 1.5 μM의 농도), DAPT(예를 들어 약 1 mM의 농도), 아파티니브(약 10 μM의 농도) 및 BMP4(예를 들어 약 10 ㎍/㎖의 농도)를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 Wnt 억제제, 노취 억제제, RAS-RAF-MAPK 경로 억제제(예를 들어 MEK 억제제) 및 BMP 경로 활성제, 예를 들어 BMP4(약 10 ㎍/㎖의 농도)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 IWP-2(예를 들어 약 1.5 μM의 농도), DAPT(예를 들어 약 1 mM의 농도), MEK 억제제, 예를 들어 PD0325901(예를 들어 약 1.5 μM의 농도) 및 BMP 경로 활성제, 예를 들어 BMP4(예를 들어 약 10 ㎍/㎖의 농도)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 IWP-2(예를 들어 약 1.5 μM의 농도), DAPT(예를 들어 약 1 mM의 농도), ERK 억제제, 예를 들어 SCH772984(예를 들어 약 10 μM의 농도) 및 BMP 경로 활성제, 예를 들어 BMP4(예를 들어 약 10 ㎍/㎖의 농도)를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 Wnt 억제제(예를 들어 IWP2), 노취 억제제(예를 들어 DAPT), EGFR 억제제(예를 들어 제피티니브) 및 BMP 억제제(예를 들어 노긴)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 IWP-2(예를 들어 약 1.5 μM의 농도), DAPT(예를 들어 약 1 mM의 농도), 제피티니브(예를 들어 약 5 μM의 농도) 및 노긴(예를 들어 약 100 ng/㎖의 농도)을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 Wnt 억제제, 노취 억제제, EGFR 및 ErbB2 억제제(예를 들어 아파티니브) 및 BMP 억제제(예를 들어 노긴)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 IWP-2(예를 들어 약 1.5 μM의 농도), DAPT(예를 들어 약 1 mM의 농도), 아파티니브(약 10 μM의 농도) 및 노긴(예를 들어 약 100 ng/㎖의 농도)를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 Wnt 억제제, 노취 억제제, RAS-RAF-MAPK 경로 억제제(예를 들어 MEK 억제제) 및 BMP 억제제, 예를 들어 노긴(약 100 ng/㎖의 농도)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 IWP-2(예를 들어 약 1.5 μM의 농도), DAPT(예를 들어 약 1 mM의 농도), MEK 억제제, 예를 들어 PD0325901(예를 들어 약 1.5 μM의 농도) 및 BMP 억제제, 예를 들어 노긴(예를 들어 약 100 ng/㎖의 농도)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 분화 배지는 IWP-2(예를 들어 약 1.5 μM의 농도), DAPT(예를 들어 약 1 mM의 농도), ERK 억제제, 예를 들어 SCH772984(약 10 μM의 농도) 및 BMP 억제제, 예를 들어 노긴(예를 들어 약 100 ng/㎖의 농도)을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 mTOR 활성제, 예를 들어 MHY1485(예를 들어 약 5 μM의 농도)를 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 배지는 헤지호그 억제제, 예를 들어 SMO 억제제(예를 들어 약 5 μM의 농도)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 SMO 억제제는 비스모게니브이다.
바람직한 실시태양에서, 상기 분화 배지는 R-스폰딘(예를 들어 약 1 ㎍/㎖의 농도)을 추가로 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 배지 중 EGF의 농도는 1 mM 미만이다.
세포외 기질
일부 실시태양에서, 세포를 분화시키는 방법은 세포를 세포외 기질(ECM)과 접촉하여 배양시킴을 포함한다. 임의의 적합한 ECM을 사용할 수 있다. 세포를 바람직하게는 적어도 부분적으로, 상기 세포가 자연적으로 상주하는 세포 니치를 모방하는 미세환경에서 배양한다. 세포 니치는 부분적으로 상기 세포 및 상기 니치 중의 세포에 의해 분비되는 ECM에 의해 결정된다. 세포 니치는 상기 세포를, 세포막 단백질과의 상호작용을 제공하는 생물물질 또는 합성 물질, 예를 들어 인테그린의 존재하에서 배양시킴으로써 모방될 수 있다. 따라서 본 명세서에 기재된 바와 같은 ECM은, 예를 들어 세포막 단백질과 상호작용함으로써 생체내 세포 니치를 모방하는 임의의 생물물질 또는 합성 물질 또는 이들의 조합, 예를 들어 인테그린이다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 세포를 ECM과 접촉하여 배양시킨다. "접촉하여"는 물리적 또는 기계적 또는 화학적 접촉을 의미하며, 상기 생성되는 오가노이드 또는 상피세포의 집단을 상기 세포외 기질로부터 분리시키기 위해 힘을 사용할 필요가 있음을 의미한다. 일부 실시태양에서, 상기 ECM은 3차원 기질이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 상기 ECM 중에 포매된다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 ECM에 부착된다. 본 발명의 배양 배지는 3차원 ECM내로 확산될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 ECM은 현탁액 중에 있다, 즉 상기 세포는 현탁액 시스템 중에서 상기 ECM과 접촉하고 있다. 일부 실시태양에서, 상기 ECM은 상기 현탁액 중에서 적어도 1%, 적어도 2%, 또는 적어도 3%의 농도로 있다. 일부 실시태양에서, 상기 ECM은 상기 현탁액 중에서 1% 내지 약 10% 또는 1% 내지 약 5%의 농도로 있다. 상기 현탁 방법은 규모확대 방법에 유리할 수 있다.
한 가지 유형의 ECM은 상피 세포, 내피 세포, 외장 내배엽-유사 세포(예를 들어 문헌[Hayashi et al. (2004) Matrix Biology 23:47-62]에 기재된 잉글브레쓰-홀름-스웜(Englebreth-Holm-Swarm) 외장 내배엽-유사 세포) 및 결합조직 세포에 의해 분비된다. 상기 ECM은 다양한 폴리사카라이드, 수, 엘라스틴, 및 당단백질로 구성되며, 여기에서 상기 당단백질은 콜라겐, 엔탁틴(니도겐), 피브로넥틴 및 라미닌을 포함한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 ECM은 하기 목록 중에서 선택된 성분들 중 하나 이상을 포함한다: 폴리사카라이드, 엘라스틴, 및 당단백질, 예를 들어 여기에서 상기 당단백질은 콜라겐, 엔탁틴(니도겐), 피브로넥틴 및/또는 라미닌을 포함한다. 예를 들어 일부 실시태양에서 콜라겐은 ECM으로서 사용된다. 상이한 유형의 당단백질 및/또는 상이한 당단백질들의 조합을 포함하는 상이한 조성물을 포함하는 상이한 유형의 ECM이 공지되어 있다.
상기 ECM은 ECM-생성 세포, 예를 들어 상피 세포, 내피 세포, 외장 내배엽-유사 세포 또는 섬유아세포를, 이들 세포의 제거 및 단리된 조직 단편 또는 단리된 상피 세포의 첨가에 앞서 용기에서 배양시킴으로써 제공될 수 있다. 세포외 기질-생성 세포의 예는 주로 콜라겐 및 프로테오글리칸을 생성시키는 연골세포, 주로 IV형 콜라겐, 라미닌, 간질성 프로콜라겐 및 피브로넥틴을 생성시키는 섬유아세포, 및 주로 콜라겐(I, III, 및 V형), 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸, 히아루론산, 피브로넥틴 및 테나신-C를 생성시키는 결장 근섬유아세포이다. 이들은 "자연적으로 생성된 ECM"이다. 자연적으로 생성된 ECM은 상업적으로 제공될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 세포외 기질의 예는 세포외 기질 단백질(인비트로젠) 및 엔젤브레쓰-홀름-스웜(EHS) 마우스 육종 세포로부터의 기저막 제제(예를 들어 컬트렉스(Cultrex)(등록상표) 기저막 추출물(트레비젠 인코포레이티드(Trevigen, Inc.) 또는 매트리젤(Matrigel)(상표)(BD 바이오사이언시즈))를 포함한다.
따라서, 일부 실시태양에서 자연적으로 생성된 ECM이다. 일부 실시태양에서 상기 ECM은 라미닌-함유 ECM, 예를 들어 매트리젤(상표)(BD 바이오사이언시즈)이다. 일부 실시태양에서, 상기 ECM은 라미닌, 엔탁틴 및 콜라겐 IV를 포함하는 매트리젤(상표)(BD 바이오사이언시즈)이다. 일부 실시태양에서, 상기 ECM은 라미닌, 엔탁틴, 콜라겐 IV 및 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(예를 들어 컬트렉스(등록상표) 기저막 추출물 2형(트레비젠 인코포레이티드))을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 ECM은 적어도 하나의 당단백질, 예를 들어 콜라겐 및/또는 라미닌을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 ECM은 콜라겐 및 라미닌을 포함한다. 추가의 바람직한 ECM은 라미닌, 엔탁틴 및 콜라겐 IV를 포함한다. 경우에 따라, 자연적으로 생성된 또는 합성 ECM 물질들의 혼합물을 사용할 수도 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 ECM은 합성 ECM일 수 있다. 예를 들어, 합성 ECM, 예를 들어 프로넥틴(ProNectin)(시그마 Z378666)을 사용할 수 있다. 추가의 예에서, 상기 ECM은 플라스틱, 예를 들어 폴리에스테르 또는 하이드로젤일 수 있다. 일부 실시태양에서, 합성 기질을 생물물질, 예를 들어 하나 이상의 당단백질, 예를 들어 콜라겐 또는 라미닌으로 코팅할 수도 있다.
3차원 ECM은 3차원 상피 오가노이드의 배양을 지지한다. 상기 세포외 기질 물질은 통상적으로 세포가 현탁되는 접시 바닥상의 한 방울일 것이다. 전형적으로, 상기 기질이 37 ℃에서 고형화하면, 상기 배지를 가하고 상기 배지는 상기 ECM내로 확산된다. 상기 배지 중의 세포는 그의 표면 구조와의 상호작용, 예를 들어 인테그린과의 상호작용에 의해 상기 ECM에 들러붙는다.
상기 배양 배지 및/또는 세포를 상기 ECM상에 놓거나, 상기 ECM 중에 포매시키거나 또는 상기 ECM과 혼합할 수 있다.
예를 들어, 일부 실시태양에서, 단일 세포, 세포들의 집단 또는 조직 단편을 매트리젤(상표)(상기는 임의로 성장인자 감소되고/되거나 페놀 레드가 없다)에 포매시킨다.
일부 실시태양에서, 상기 배양 배지를 상기 ECM의 상부에 놓는다. 이어서 상기 배양 배지를 제거하고 필요에 따라 및 필요한 경우 보충한다. 일부 실시태양에서, 상기 배양 배지를 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다 보충한다. 성분을 "첨가하거나" 또는 상기 배지로부터 "제거하는" 경우, 이는 일부 실시태양에서 상기 배지 자체가 상기 ECM으로부터 제거되고 이어서 상기 "첨가된" 성분 또는 상기 "제거된" 성분을 함유하는 새로운 배지가 상기 ECM 상에 놓임을 의미할 수 있다.
배양을 위한 전구세포 및 줄기세포 및 이들 세포의 수득
상기 분화 방법은 전구세포에 유용하다. 전구세포는 본 명세서에서 분화 가능성을 갖는 임의의 세포로서 정의된다. 따라서 "전구세포"란 용어는 비제한적으로 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 iPS 세포를 포함한 줄기세포들을 포함한다. 상기 전구세포는 예를 들어 1차 줄기세포 또는 증식된 줄기세포 또는 부분-분화된 줄기세포일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 전구세포는 1차 세포이며, 이는 살아있는 조직으로부터 직접 수득됨을 의미한다. 다른 실시태양에서, 상기 전구세포는 2차 세포, 즉 배양 및/또는 계대배양된 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 전구세포는 증식된 세포이다. "증식된"이란 용어는 세포가, 분화보다 우선적으로 증식(예를 들어 확대)을 촉진하는 배양 배지에서 시험관내 배양되었음을 의미한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 전구세포는 성체 줄기세포이다, 즉 성체 조직으로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 상기 성체 전구세포는 성체 줄기세포(예를 들어 성체 상피줄기세포)이다. 이와 관련하여 "성체"는 갓난 아기 또는 아동은 포함하지만 배아 또는 태아는 제외한다. 일부 실시태양에서 상기 전구세포는 배아 줄기세포 또는 배아 줄기세포주, 예를 들어 인간 배아 줄기세포 또는 인간 배아 줄기세포주로부터 유래되지 않는다.
바람직한 실시태양에서, 상기 전구세포는 상피 전구세포이다. 예를 들어, 바람직한 실시태양에서, 상기 전구세포는 상피 조직, 보다 바람직하게는 성체 상피 조직으로부터 유래된다. 상피 조직은 간, 췌장, 장, 위, 전립선, 폐, 유방, 난소, 침샘, 모낭, 피부, 식도, 귀, 방광 또는 갑상선을 포함한다. 따라서 일부 실시태양에서, 상기 전구세포를 간, 췌장, 장, 위, 전립선, 폐, 유방, 난소, 침샘, 모낭, 피부, 식도, 귀, 방광 또는 갑상선으로부터 수득한다. 일부 실시태양에서, 상기 전구세포를 췌장, 위, 폐 또는 장으로부터 수득한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 전구세포를 장으로부터 수득한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 전구세포는 포유동물 세포이다. 예를 들어, 바람직한 실시태양에서, 상기 세포는 포유동물 조직으로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 전구세포는 인간 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 전구세포는 실험 동물(예를 들어 마우스, 토끼, 래트, 기니피그), 반려 동물(예를 들어 개, 고양이, 말) 또는 농장 동물(예를 들어 소, 돼지, 양, 염소)로부터 유래된다.
1차 세포는 생체내 상황에 최상의 실험 모델을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 전구세포는 1차 전구세포(예를 들어 1차 상피 줄기세포)이다(이거나 또는 이들의 세포 배양물에서 유래된다). 1차 세포 배양물을 계대배양하여 2차 세포 배양물을 형성시킨다. 암세포를 제외하고, 전통적인 2차 상피세포 배양물은 제한된 수명을 갖는다. 일정 수의 집단 배가(예를 들어 50 내지 100 세대) 후에 세포는 노쇠 과정을 겪고 분열을 멈춘다. 2차 배양물로부터의 세포는 불멸화되어 무한증식 세포주로 될 수 있다. 불멸화는 자발적으로 발생하거나, 또는 바이러스- 또는 화학적으로-유도될 수 있다. 불멸화된 세포주는 또한 형질전환된 세포로서 공지된다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 세포를 불멸화 또는 형질전환 없이 증식 및/또는 계대배양된, 증식된 상피 줄기세포 배양물, 바람직하게는 증식된 오가노이드로부터 수득한다. 일부 실시태양에서, 이들 증식된 상피 배양물 또는 오가노이드는 유전적으로 이종성(전통적인 세포주와 달리)일 수 있다. 따라서 일부 실시태양에서, 상기 전구세포는 불멸화된 또는 형질전환된 세포가 아니거나 또는 불멸화된 세포주 또는 형질전환된 세포주로부터 유래되지 않는다.
상기 전구세포를 예를 들어 WO　2010/090513, WO 2012/014076, WO 2012/168930 또는 WO 2015/173425에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 방법에 의해 수득할 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포를 예를 들어 문헌[Dorell et al., 2008 (Hepatology. 2008 Oct;48(4):1282-91. Surface markers for the murine oval cell response. Dorrell C, Erker L, Lanxon-Cookson KM, Abraham SL, Victoroff T, Ro S, Canaday PS, Streeter PR, Grompe M]에 기재된 바와 같은 콜라게나제 절단에 의해 단리시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 콜라게나제 절단을 조직 생검상에서 수행한다. 일부 실시태양에서, 콜라게나제 및 애큐타제 절단을 사용하여 본 발명에 사용하기 위한 전구세포를 수득한다.
일부 실시태양에서, 전구세포는 Lgr5를 발현하는 상피 줄기세포이다. 오가노이드를 바람직하게는 성체 조직으로부터의 세포, 바람직하게는 성체 조직으로부터의 상피 줄기세포, 보다 바람직하게는 Lgr5를 발현하는 상피 줄기세포를 사용하여 수득한다.
가장 바람직한 실시태양에서, 전구세포는 Lgr5를 발현하는 성체 상피 줄기세포이거나 또는 상기 세포를 포함한다.
일부 실시태양에서 상기 전구세포는 정상 세포이며, 이는 상기 세포가 정상적인 핵형, 유전자형 및/또는 표현형을 가짐을 의미한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 전구세포는 질병 세포이며, 이는 상기 세포가 질병 핵형, 유전자형 및/또는 표현형을 가짐을 의미한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 전구세포는 암세포이다. 따라서, 예를 들어 상기 상피 줄기세포는 Lgr5 양성 암 줄기세포일 수 있음이 예상된다. 상응하게, 상기 세포를 경우에 따라 종양으로부터 수득할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 전구세포는 병든 전구세포, 예를 들어 세포내 병원체(예를 들어 세균, 바이러스 또는 기생충)로 감염된 전구세포이다.
예시적인 방법
본 발명은 전구세포의 분화 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 본 명세서에 기재된 분화 배지에서 배양함을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같이 EMC과 접촉하여 배양한다.
본 발명은 또한 전구세포의 배양 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 증식 배지에서 배양하고 후속적으로 상기 세포를 본 명세서에 기재된 분화 배지에서 배양함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포를 상기 증식 및/또는 분화 단계 동안 본 명세서에 기재된 바와 같이 ECM과 접촉하여 배양한다. 일부 실시태양에서, 상기 증식 배지를, 예를 들어 반복적인 세척에 의해서 또는 세포 배양물의 분할에 의해서, 상기 세포를 분화 배지에서 배양하기 전에 제거한다.
본 발명은 바람직하게는 오가노이드를 수득하기 위한, 단일 상피 줄기세포, 상피 줄기세포의 집단, 또는 단리된 조직 단편의 배양 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
상피 줄기세포, 상피 줄기세포의 집단 또는 단리된 조직 단편을 증식 배지에서 배양하여 증식된 세포 집단을 제공하고;
임의로 상기 증식된 세포 집단의 정지를 유도하고(예를 들어 하나 이상의 EGFR 경로 억제제 처리에 의해서);
상기 증식된 세포 집단을 분화 배지에서 배양함
을 포함한다.
본 발명은 또한 단일 전구세포 또는 전구세포의 집단의 분화 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
전구세포 또는 전구세포의 집단을 분화 배지에서 배양함을 포함한다.
상기 분화 배지는 본 명세서에 기재된 임의의 분화 배지일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 Wnt 억제제(예를 들어 IWP-2), 노취 억제제(예를 들어 DAPT) 및 EGFR 경로 억제제(예를 들어 제피티니브, 아파티니브, PD0325901 및 SCH772984 중 하나 이상)를 포함한다. 상기 분화 배지는 EEC가 풍부한 세포 집단을 수득하는 방법에 사용하기에 특히 적합하다. EEC의 특징적인 마커는 Chga, Chgb, Tac1, Tph1, Gip, Fabp5, Ghrl, Pyy, Nts, Neurod1, Sst, Sct, 콜레시스토키닌, 글루카곤 및/또는 프로-글루카곤을 포함한다. 추가의 EEC 세포-유형 및 이들의 특징은 문헌[Grun et al. (2015) Nature 525:251-255]에 기재되어 있다. 또한 이후의 표 2를 참조하시오. 따라서 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화 방법은 Chga, Chgb, Tac1, Tph1, Gip, Fabp5, Ghrl, Pyy, Nts, Neurod1, Sst, Sct, 콜레시스토키닌, 글루카곤 및/또는 프로-글루카곤 중에서 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포 집단을 생성시킨다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 EEC는 세로토닌을 발현한다.
일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 Wnt 억제제(예를 들어 IWP-2), 노취 억제제(예를 들어 DAPT) 및 EGFR 경로 억제제(예를 들어 제피티니브, 아파티니브, PD0325901 및 SCH772984 중 하나 이상) 및 BMP 억제제(예를 들어 노긴 또는 LDN193189)를 포함한다. 상기 분화 배지는 GLP1-분비 EEC가 풍부한 세포 집단을 수득하는 방법에 사용하기에 특히 적합하다. 일부 실시태양에서 상기 방법은 Tac1, GLP1 및 Chg 중에서 선택된 하나 이상의 마커에 양성이고; 세크레틴, pyy 및 nts 중에서 선택된 하나 이상의 마커에 음성인 세포 집단을 생성시킨다. 일부 실시태양에서 상기 세포 집단은 세로토닌을 발현한다.
일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 Wnt 억제제(예를 들어 IWP-2), 노취 억제제(예를 들어 DAPT) 및 EGFR 경로 억제제(예를 들어 제피티니브, 아파티니브, PD0325901 및 SCH772984 중 하나 이상) 및 BMP 활성제(예를 들어 BMP4)를 포함한다. 상기 분화 배지는 세크레틴-분비 EEC가 풍부한 세포 집단을 수득하는 방법에 사용하기에 특히 적합하다. 일부 실시태양에서 상기 방법은 Tac1, GLP1 및 Chg 중에서 선택된 하나 이상의 마커에 음성이고; 세크레틴, pyy 및 nts 중에서 선택된 하나 이상의 마커에 양성인 세포 집단을 생성시킨다. 일부 실시태양에서 상기 세포 집단은 세로토닌을 발현한다.
상기 증식 배지는 상피 줄기 또는 전구세포에 적합한 임의의 증식 배지, 바람직하게는 상피 줄기세포에 적합한 증식 배지일 수 있다(예를 들어 WO　2010/090513, WO 2012/014076, WO 2012/168930 또는 WO 2015/173425에 기재된 바와 같이).
일부 실시태양에서, 상기 증식 배지는 하나 이상의 수용체 티로신 키나제 리간드(예를 들어 EGF, HGF 및/또는 FGF10), 니코틴아미드 및 하나 이상의 Wnt 작용물질(예를 들어 R스폰딘 순화 배지 및/또는 Wnt 순화 배지)을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 증식 배지는 하나 이상의 수용체 티로신 키나제 리간드(예를 들어 EGF, HGF 및/또는 FGF10), 하나 이상의 Wnt 작용물질(예를 들어 R스폰딘 순화 배지 및/또는 Wnt 순화 배지) 및 하나 이상의 TGF-베타 억제제(예를 들어 A83-01)를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 증식 배지는 하나 이상의 수용체 티로신 키나제 리간드(예를 들어 EGF, HGF 및/또는 FGF10), 니코틴아미드, 하나 이상의 Wnt 작용물질(예를 들어 R스폰딘 순화 배지 및/또는 Wnt 순화 배지), 및 하나 이상의 TGF-베타 억제제(예를 들어 A83-01)를 포함한다.
이들 실시태양 중 어느 하나에서, 상기 증식 배지는 cAMP 경로 활성제(예를 들어 포스콜린), 가스트린 및/또는 BMP 억제제(예를 들어 노긴)를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 실시태양에서(예를 들어 장에 바람직한 실시태양에서), 상기 증식 배지는 (i) EGF(예를 들어 약 10 내지 50 ng/㎖); (ii) 노긴 순화 배지(예를 들어 약 50 내지 100 ng/㎖ 또는 약 5% 최종 부피); (iii) R스폰딘 순화 배지(예를 들어 약 1 ㎍/㎖ 또는 약 5% 최종 부피)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 증식 배지는 n-아세틸시스테인(예를 들어 약 1 mM) 및 1xB27을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 증식 배지는 발프로산(예를 들어 약 1 mM) 및 GSK-3 억제제(예를 들어 약 3 μM, 예를 들어 약 3 μM의 CHIR99021)를 추가로 포함한다. 유리하게, 상기 발프로산 및 GSK-3 억제제의 포함은 줄기세포가 풍부한 세포집단을 생성시키는 것으로 밝혀졌다.
인간 오가노이드에 바람직한 증식 배지는 (i) EGF(예를 들어 약 10 내지 50 ng/㎖); (ii) 노긴 순화 배지(예를 들어 약 50 내지 100 ng/㎖ 또는 약 5% 최종 부피); (iii) R스폰딘 순화 배지(예를 들어 약 1 ㎍/㎖ 또는 약 5% 최종 부피); (iv) p38 억제제(예를 들어 약 30 μM 농도의 SB-203580); (v) TGF-β 억제제(예를 들어 약 500 nM 농도의 A83-01); 및 (vi) 니코틴아미드(예를 들어 약 10 mM의 농도)를 포함한다.
바람직하게, 상기 세포를 분화 전에 증식시켜 하나 이상(예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20 또는 20 초과)의 오가노이드를 생성시킨다.
일부 실시태양에서, 세포를 처음에 본 명세서에 기재된 증식 배지에서 배양하고, 일단 성공적인 오가노이드가 확립되었으면, 상기 증식 배지를 본 명세서에 기재된 분화 배지로 교체한다. 상응하게, 일부 실시태양에서 1회 이상(예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상) 계대배양후, 상기 증식 배지를 분화 배지로 교체한다. 일부 실시태양에서, 계대배양을 매주 수행한다. 일부 실시태양에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 또는 그 이상 후에, 상기 증식 배지를 분화 배지로 교체한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 증식 배지를 5일 이상 후에 분화 배지로 교체한다.
일부 실시태양에서, 상기 세포의 정지를 분화 전에 유도한다.
일부 실시태양에서, 상기 상피 줄기세포, 상피 줄기세포의 집단 또는 단리된 조직 단편을 세척하고 분화 전에 세포외 기질(예를 들어 매트리젤)에 도말한다. 일부 실시태양에서, 세척을 기본 배지 또는 PBS로 수행한다. 임의의 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 상기 세척 단계가 상기 상피 줄기세포, 상피 줄기세포의 집단 또는 단리된 조직 단편으로부터 줄기세포 인자를 제거하기 때문에 분화에 유리하다고 여긴다.
일부 실시태양에서, 상기 상피 줄기세포, 상피 줄기세포의 집단 또는 단리된 조직 단편을 본 발명의 분화 배지에서 분화 전에, BMP 억제제(예를 들어 노긴) 및 R스폰딘을 포함하고 EGF, 니코틴아미드, TGFβ 억제제 또는 Wnt 순화 배지를 포함하지 않는 분화 배지에서 배양한다. 일부 실시태양에서, 상기 1차 분화 배지에서의 배양은 약 1일 동안이다.
숙련가에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 배양 방법은 배양보조세포가 필요하지 않기 때문에 유리하다. 배양보조세포층은 종종 줄기세포의 배양을 지지하고 그의 분화를 억제하는데 사용된다. 배양보조세포층은 일반적으로, 관심 세포와 공-배양되고 상기 세포의 성장에 적합한 표면을 제공하는 세포 단층이다. 상기 배양보조세포층은 상기 관심 세포가 성장할 수 있는 환경을 제공한다. 상기 배양보조세포를 종종 그의 증식이 방지되도록 유사분열적으로 불활성화시킨다(예를 들어 방사선조사 또는 미토마이신 C 처리에 의해). 상기 배양보조세포의 사용은 바람직하지 않은데, 그 이유는 상기가 세포의 계대배양을 복잡하게 하기 때문이다(상기 세포를 각각의 계대배양에서 상기 배양보조세포로부터 분리시켜야 하고, 새로운 배양보조세포가 각 계대배양에서 요구된다). 상기 배양보조세포의 사용은 또한 상기 배양보조세포에 의한 목적하는 세포의 오염을 도출할 수 있다. 이는 임의의 의학적 용도에 명백하게 문제가 되며, 심지어 연구 상황에서조차 상기 세포상에서 수행되는 임의의 실험 결과의 분석을 복잡하게 한다. 본 명세서에서 다른 어딘가에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 배양 배지는 배양보조세포 접촉 없이 세포를 배양하는데 사용될 수 있기 때문에, 즉 본 발명의 방법은 증식을 후원하는 세포를 지지하기 위해 배양보조세포의 층을 필요로 하지 않기 때문에 특히 유리하다.
상응하게, 본 발명의 조성물은 배양보조세포-없는 조성물일 수 있다. 조성물은 통상적으로 상기 조성물 중의 세포가 배양보조세포층의 부재하에서 적어도 한 번의 계대배양 동안 배양된 경우 배양보조세포-없는 것으로 통상적으로 간주된다. 본 발명의 배양보조세포-없는 조성물은 통상적으로 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만의 배양보조세포(조성물 중의 전체 세포수의 %로서 나타낸다)를 함유하거나 또는 바람직하게는 배양보조세포가 전혀 없을 것이다.
추가의 태양에서, 분화된 세포의 집단 또는 오가노이드를 수득하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 전구세포를 본 발명의 분화 배지에서 배양함을 포함한다. 바람직하게, 상기 방법은 상기 전구세포를 본 명세서에 기재된 분화 방법을 사용하여 본 발명의 분화 배지에서 배양함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 단일 상피줄기세포로부터 분화된 세포의 오가노이드/집단을 수득함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 상피 줄기세포의 집단으로부터 또는 상피 조직 단편으로부터 분화된 세포의 오가노이드/집단을 수득함을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 분화된 오가노이드를 수득하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상피 전구세포(예를 들어 임의로 Lgr5를 발현하는 상피 줄기세포)를 본 발명의 분화 배지에서 배양함을 포함하며, 바람직하게 상기 상피 전구세포를 ECM, 바람직하게는 3차원 ECM과 접촉시킨다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 전구세포를 증식 배지 중에서 일정한 시간 동안, 예를 들어 3일 내지 10주, 1 내지 10주, 1 내지 4주 또는 10일 내지 3주 동안 배양하고 이어서 상기 세포를 계대배양하고(예를 들어 상기 세포를 단일 세포 밀도로 해리시키고, 하나 이상의 세포를 1 세포/용기(예를 들어 웰)의 비로 시딩하고), 상기 세포를 일정한 시간 동안, 예를 들어 3일 내지 10주, 1 내지 10주, 1 내지 4주 또는 10일 내지 3주 동안 증식 배지를 사용하여 계속해서 증식시키고, 상기 계대배양 및 증식 단계를 세포 분화에 앞서, 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 적어도 10회, 적어도 11회, 적어도 12회, 적어도 13회, 또는 적어도 14회 반복함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 전구세포를 분화 배지에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14일 동안 배양함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 전구세포를 분화 배지에서 약 1 내지 약 20일, 약 1 내지 약 10일 또는 약 1 내지 약 5일 동안 배양함을 포함한다.
분화에 이어서, 상기 방법은 하나 이상의 분화된 세포 또는 분화된 오가노이드를 수득하고/하거나 단리함을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 전구세포의 배양에 이어서, 상기 배양 배지에서 배양된 하나 이상의 세포 및/또는 하나 이상의 오가노이드를 후속 용도에 사용하기 위해 상기 배양 배지로부터 제거하는 것이 유용할 수 있다. 당해 분야에 공지된 다수의 물리적 분리 방법 중 어느 하나를 사용하여 본 발명의 세포를 선택하고 상기 세포를 다른 세포 유형들과 구분할 수 있다. 상기와 같은 물리적 방법은 본 발명의 세포에 의해 특이적으로 발현된 마커에 기반한 FACS 및 다양한 면역-친화성 방법을 수반할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 세포를 예를 들어 이들 마커 중 하나에 대한 항체를 사용하여 FACS에 의해 단리시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, 이를 형광 표지된 항체를 통해, 또는 상기 1차 항체에 대한 결합 특이성을 갖는 형광 표지된 2차 항체를 통해 성취할 수 있다. 적합한 형광 표지의 예는 비제한적으로 FITC, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록상표) 488, GFP, CFSE, CFDA-SE, DyLight 488, PE, PerCP, PE-알렉사 플루오르(등록상표) 700, PE-Cy5 (TRI-COLOR(등록상표)), PE-Cy5.5, PI , PE-알렉사 플루오르(등록상표) 750, 및 PE-Cy7을 포함한다. 상기 목록은 단지 예로서 제공되며 제한임을 의도하지 않는다.
한편으로, 세포를 당해 분야에 주지된 분리 방법인 면역-친화성 정제에 의해 단리할 수 있다. 상기 방법은 정제 컬럼상 항체의 고정화에 의존한다. 이어서 상기 세포 샘플을 상기 컬럼상에 로딩하여, 적합한 세포가 상기 항체에 의해 결합되게 하고 따라서 상기는 상기 컬럼에 결합된다. 세척 단계에 이어서, 상기 세포를 상기 고정화된 항체에 우선적으로 결합하는 경쟁자를 사용하여 상기 컬럼으로부터 용출시키고, 상기 세포가 상기 컬럼으로부터 방출되게 한다.
고정화된 항체를 사용하는 면역-친화성 정제가, 정제된 세포 집단을 제공함은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 그러나, 일부 실시태양에서, 상기 세포 집단을 다른 식별성 마커 중 하나 이상을 사용하여 추가 라운드의 면역-친화성 정제를 추가로 수행함으로써 정제시키고 상기 단리된 클론의 분액을 사용하여 다른 관련된 세포내 마커의 발현을 확인하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 순차적인 정제 단계가 동일한 물리적 분리 방법을 수반하는데 반드시 필요한 것은 아님은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다.
분화된 세포 및 오가노이드
본 발명은 또한 분화된 오가노이드 또는 하나 이상의 분화된 세포의 집단을 제공한다.
분화된 오가노이드는 분화된 상피세포 유형을 포함하는 3차원 구조이다. 분화된 오가노이드는 전형적으로 자기-조직화이며, 이는 상기 오가노이드 중의 세포의 3차원 배열이 상기 세포가 분화함에 따라 자발적으로 발생함을 의미한다. 일부 실시태양에서, 분화된 오가노이드는, 임의로 Lgr5를 발현하는 상피 줄기세포로부터 유래된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은, 예를 들어 전구세포를 본 발명의 분화 배지에서 배양함(바람직하게는 여기에서 상기 전구세포를 3차원 ECM과 접촉시킨다)을 포함하는, 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있거나 수득되는 분화된 오가노이드 또는 하나 이상의 분화된 세포의 집단을 제공한다.
세포의 '집단'은 1 초과의 임의의 수의 세포이나, 바람직하게는 적어도 10 세포, 적어도 50 세포, 적어도 100 세포, 적어도 500 세포, 적어도 1x103 세포, 적어도 1x104 세포, 적어도 1x105 세포, 적어도 1x106 세포, 적어도 1x107 세포, 적어도 1x108 세포, 또는 적어도 1x109 세포이다.
본 발명에 따른 분화된 오가노이드는 적어도 10 세포, 적어도 50 세포, 적어도 100 세포, 적어도 500 세포, 적어도 1x103 세포, 적어도 1 x 104 세포, 적어도 1x105 세포, 적어도 1x106 세포, 적어도 1x107 세포 이상의 세포의 집단을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 각각의 오가노이드는 대략 1x103 세포 내지 5x103 세포를 포함하며; 일반적으로 10 내지 20 오가노이드가 하나의 웰, 예를 들어 24 웰 플레이트에서 함께 증식될 수 있다.
본 발명의 오가노이드는 천연 조직 단편이 아니고/아니거나 혈관을 포함하지 않음은 숙련가에게 명백하다.
본 발명의 오가노이드는, 예를 들어 오직 상피세포 유형들만(간엽세포 또는 다른 구조 세포 유형이 아닌)을 포함하기 때문에 천연 조직과 구분된다. 따라서 일부 실시태양에서, 본 발명의 분화된 오가노이드는 오직 상피세포만을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 분화된 오가노이드는 비-상피세포를 포함하지 않는다. 예를 들어, 특정한 실시태양에서, 상기 분화된 오가노이드는 간엽세포를 포함하지 않는다.
본 명세서에 기재된 분화 세포는 바람직하게는 적어도 5일의 배양 기간 동안 세포의 특이적인 분화를 유도하거나 촉진한다. 분화를 본 명세서에 정의된 바와 같은 특정한 조직 계통, 예를 들어 장내분비 계통과 관련된 특정한 마커의 존재를 검출함으로써 측정할 수 있다. 분화를 본 명세서에 정의된 바와 같은 조직 계통, 예를 들어 장내분비 계통과 관련된 특정한 마커의 존재를 검출함으로써 측정할 수 있다. 상기 마커의 정체에 따라, 상기 마커의 발현을 본 명세서에 정의된 바와 같은 분화 배지에서 적어도 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16일 또는 그 이상 배양 후에 RTPCR 또는 면역-조직화학에 의해 평가할 수 있다.
"발현된"이란 용어는 세포내 마커의 존재를 기술하는데 사용된다. 발현되는 것으로서 간주되기 위해서, 마커는 검출 가능한 수준으로 존재해야 한다. "검출 가능한 수준"은 상기 마커를 PCR, 블럿팅 또는 FACS 분석과 같은 표준 실험 방법들 중 하나를 사용하여 검출할 수 있음을 의미한다. 하나의 유전자는 발현이 30 PCR 주기 후에 상당히 검출될 수 있는 경우 본 발명의 세포의 집단에 의해 발현되는 것으로 간주되며, 상기 수준은 세포당 적어도 약 100 사본수의 세포에서의 발현에 해당한다. "발현하다" 및 "발현"이란 용어는 상응하는 의미를 갖는다. 상기 한계 미만의 발현 수준에서, 마커는 발현되지 않는 것으로 간주된다. 본 발명의 세포에서 마커의 발현 수준, 및 또 다른 세포, 예를 들어 배아 줄기세포에서 동일 마커의 발현 수준간의 비교를 바람직하게는 동일한 종으로부터 단리된 2개의 세포 유형을 비교함으로써 수행할 수 있다. 바람직하게 상기 종은 포유동물이며, 보다 바람직하게 상기 종은 인간이다. 상기와 같은 비교를 편의상 역전사효소 폴리머라제 쇄 반응(RT-PCR) 실험을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 분화된 오가노이드 또는 본 발명의 분화된 세포의 집단은 바람직하게는 적어도 50%의 생육성 세포, 보다 바람직하게는 적어도 60%의 생육성 세포, 보다 바람직하게는 적어도 70%의 생육성 세포, 보다 바람직하게는 적어도 80%의 생육성 세포, 보다 바람직하게는 적어도 90%의 생육성 세포를 포함한다. 세포의 생육성을 FACS에서 훽스트(Hoechst) 염색 또는 프로피디움 요오다이드 염색을 사용하여 평가할 수 있다. 상기 생육성 세포는 바람직하게는 상응하는 생체내 기능 또는 특징을 갖는다. 예를 들어 생육성 장내분비 세포는 바람직하게는 장내분비 세포의 장내분비 기능 또는 특징을 갖는다.
바람직한 실시태양에서, 상기 오가노이드는 장 오가노이드이다. 이는 상기 오가노이드가 장 세포로부터 유래됨을 의미한다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 분화된 세포의 집단은 장 세포로부터 유래된다.
본 발명자들은 본 발명의 방법에 의해 수득된 장 오가노이드가, 앞서 문헌[Gr
Figure pct00041
n et al. (2015) Nature 525(7568):251-5]에 기재된 분화된 장 오가노이드에서보다 상기 오가노이드 중에서 더 많은 비율의 세포가 내분비 세포이기 때문에, 개선됨을 입증하였다.
포유동물 위장관에서 발견되는 장내분비 세포 유형 중 일부를 하기 표 3에 요약한다.
포유동물 위장관의 내분비 세포
세포 생성물 관강 수용체 장소 주요 효과
A (X-형) 세포 및 하위유형 그렐린, 네스파틴-1 T1R1-T1R3; T2Rs 위 식욕 조절,
성장 호르몬 방출
ECL 세포 히스타민 없음
(ECL 세포는 관강과 접촉하지 않는다)		 위 위산 분비의 자극
G 세포 가스트린 LPAR5; GPRC6A 위 위산 분비의 자극
D 세포 소마토스타틴 LPAR5; GPRC6A 위, 소장 (및 췌장) 가스트린 방출의 억제
(위);
인슐린 방출의 조절
(췌장)
엔테로크로마핀 세포 5-HT. 5-HT는 또한 I, K 및 L 세포의 하위그룹 중에 함유된다.
 FFARs 2, 3; TRPA1; 독소 수용체; TLRs 위, 소장 및 대장 장 운동성 반사 및 분비의 촉진;
독소에 대한 반응에서 구토 및 오심의 촉발
I 세포 CCK (5-HT) T2Rs; FFA1; GPR120; LPAR5; CaSR; TRPA1; TLRs 근위 소장 담낭 수축의 활성화 및 췌장 효소 분비의 자극
K 세포, 및 하위유형 GIP GPR119, GPR120; FFAR1 근위 소장 인슐린 방출의 자극
L 세포, 및 하위유형 GLP-1, GLP-2, PYY, 옥신토모듈린 (5-HT) T2Rs; T1R2-T1R3; FFARs 1-3; GPR119, LPAR5, GPR120; CaSR 원위 소장, 결장 탄수화물 흡수의 자극, 장 수송의 지연, 식욕 조절, 인슐린 방출
M 세포 모틸린 담즙 수용체 소장 돼지, 개 및 인간에서 근전기 복합체 이동의 개시
N 세포 뉴로텐신 FFARs 소장 및 대장 장 수축의 억제
P 세포 렙틴 영양소 수용체 위 식욕 조절,
음식물 섭취의 감소;
렙틴이 또한 주세포 중에 있을 수도 있다
S 세포 세크레틴 산 수용체 근위 소장 비카보네이트 방출의 자극에 의한 상부 소장 중 산도의 감소
EEC의 특징적인 마커는 Chga, Chgb, Tac1, Tph1, Gip, Fabp5, Ghrl, Pyy, Nts, Neurod1, Sst, Sct, 콜레시스토키닌, 글루카곤 및/또는 프로-글루카곤을 포함한다.
추가의 EEC 세포-유형 및 이들의 특징은 문헌[Grun et al. (2015) Nature 525:251-255]에 기재되어 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화된 오가노이드는 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 99%가 장내분비 세포 마커(예를 들어 Chga, Chgb, Tac1, Tph1, Gip, Fabp5, Ghrl, Pyy, Nts, Neurod1, Sst, Sct, 콜레시스토키닌, 글루카곤 및/또는 프로-글루카곤)를 발현하는 분화된 장 오가노이드이다. 일부 실시태양에서, mRNA 발현을 단-세포 RNA 서열분석에 의해 측정한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 발현된 오가노이드는 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 99%가 특정한 장내분비 세포 유형, 특히 표 2에 기재된 세포 유형의 장내분비 세포 마커 특성을 발현하는 분화된 장 오가노이드이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 특정한 장내분비 세포 유형의 특징적인 장내분비 세포 마커는 Gcg 및/또는 GLP-1이다. Gcg는 GLP-1이 유래된 프리프로글루카곤을 발현하는 유전자이다. 다른 실시태양에서, 특정한 장내분비 세포 유형의 특징적인 장내분비 세포 마커는 Sct이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화된 오가노이드는 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 99%가 표 2에 나열된 생성물 중 하나 이상(예를 들어 2, 3, 4 또는 그 이상)을 발현하는 분화된 장 오가노이드이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화된 오가노이드는 세포의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 1% 미만이 배상세포 또는 파네스 세포 마커(예를 들어 Lyz1, Defa6, Agr2, Gob5, Muc2, Ttf3 및/또는 Defa24)를 발현하는 분화된 장 오가노이드이다. 일부 실시태양에서, mRNA 발현을 단-세포 RNA 서열분석에 의해 측정한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화된 오가노이드는 세포의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 1% 미만이 장세포 마커(예를 들어 Aldob, Apoa1 및/또는 Alpi)를 발현하는 분화된 장 오가노이드이다. 일부 실시태양에서, mRNA 발현을 단-세포 RNA 서열분석에 의해 측정한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 분화된 오가노이드는 세포의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 1% 미만이 술세포 마커(예를 들어 Dclk1 및/또는 Trpm5)를 발현하는 분화된 장 오가노이드이다. 일부 실시태양에서, mRNA 발현을 단-세포 RNA 서열분석에 의해 측정한다.
일부 실시태양에서, 상기 분화된 오가노이드는 중심 관강을 갖는 낭포성 구조를 갖는다. 일부 실시태양에서 상기 중심 관강은 상피 단층에 의해 둘러싸여 있다.
또한 본 발명의 분화 배지 중의 본 발명의 분화된 오가노이드 또는 장내분비 세포의 분화된 집단을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 분화 배지 중의 오가노이드를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 분화된 오가노이드는 본 발명의 방법을 사용하여 여전히 배양 중에 있는 오가노이드이며 따라서 상기는 세포외 기질과 접촉하고 있다. 바람직하게, 분화된 오가노이드는 비-간엽 세포외 기질 중에 포매되어 있다.
상기 오가노이드 또는 전구세포의 집단은 임의의 포유동물 조직으로부터 유래될 수 있으나, 바람직하게는 인간으로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 상기는 마우스, 토끼, 래트, 기니피그 또는 다른 비-인간 포유동물로부터 유래된다.
분화된 장 오가노이드와 1차 장 조직간의 차이
분화된 오가노이드 1차 조직
세포 조성 대략적으로 30-80% EEC 대략적으로 1% EEC.
분화된 오가노이드의 용도
본 명세서에 기재된 오가노이드 및 상기 오가노이드로부터 유래된 세포의 용도를 마찬가지로 제공한다. 오가노이드를 본 섹션에서 언급하는 경우, 상기는 본 발명에 따른 분화된 오가노이드이다. 숙련가는 유용할 수 있음이 본 발명의 방법에 의해 수득되고/되거나 수득될 수 있는 분화된 세포의 집단에도 또한 적용될 수 있음을 알 것이다. 본 발명의 방법에 의해 수득되거나/수득될 수 있는 분화된 세포의 집단의 상기와 같은 용도를 또한 제공한다.
예를 들어, 본 발명은 약물 발견 선별; 독성 분석; 조직 발생학, 세포 계통, 및 분화 경로의 연구; 각각의 호르몬의 방출을 유도하는 화학적 및/또는 뉴런 신호를 식별하기 위한 연구; 재조합 유전자 발현을 포함한 유전자 발현 연구; 조직 손상 및 수복에 관련된 기전의 연구; 염증 및 감염성 질병의 연구; 발병기전의 연구; 또는 세포 형질전환의 기전 및 암 병인학의 연구에서 분화된 오가노이드, 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 의학에 사용하기 위한 본 발명의 오가노이드, 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 질환, 상태 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 오가노이드, 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 재생 의학에 사용하기 위한 본 발명의 오가노이드, 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포를 제공하며, 예를 들어 여기에서 상기 용도는 상기 오가노이드 또는 세포의 환자내로의 이식을 수반한다.
본 발명은 약물 선별, (약물) 표적 확인, (약물) 표적 발견, 독성학 및 독성학 선별, 맞춤 의학, 재생 의학에 및/또는 생체외 세포/장기 모델, 예를 들어 질병 모델로서 본 발명의 오가노이드, 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포의 용도를 제공한다.
본 발명의 배지 및 방법에 따라 배양된 세포 및 오가노이드는 생체내 상황을 충실히 나타내는 것으로 생각된다. 이는 정상 조직으로부터 증식된 분화된 세포의 집단 및 오가노이드 및 병든 조직으로부터 증식된 분화된 세포의 집단 및 오가노이드 모두에 대해 사실이다. 따라서, 본 발명의 오가노이드는 정상적인 생체외 세포/장기 모델을 제공할 뿐만 아니라, 생체외 질병 모델로서 사용될 수 있다.
본 발명의 오가노이드를 또한 병원체의 배양에 사용할 수 있으며 따라서 생체외 감염 모델로서 사용할 수 있다. 본 발명의 오가노이드를 사용하여 배양될 수 있는 병원체의 예는 그의 동물 숙주에서 질병을 일으키는 바이러스, 세균, 프리온 또는 진균을 포함한다. 따라서 본 발명의 오가노이드를 감염된 상태를 나타내는 질병 모델로서 사용할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 오가노이드를 백신 개발 및/또는 생산에 사용할 수 있다.
따라서 본 발명의 오가노이드에 의해 연구될 수 있는 질병은 유전병, 대사병, 병원성 질병, 염증성 질병 등, 예를 들어 비제한적으로 당뇨병(예를 들어 I형 또는 II형), 낭성 섬유증, 암종, 선암종, 선종, 위소장췌장 신경내분비 종양, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병)을 포함한다.
전통적으로, 세포주 및 보다 최근에 iPS 세포가 생체외 세포/장기 및/또는 질병 모델로서 사용되었다(예를 들어 문헌[Robinton et al. Nature 481, 295, 2012]을 참조하시오). 그러나, 이들 방법은 다수의 도전과 단점의 문제가 있다. 예를 들어, 세포주는 모든 환자로부터 수득될 수 없으며(오직 몇몇 생검만이 성공적인 세포주를 생성시킨다) 따라서 세포주를 맞춤 진단 및 의학에 사용할 수 없다. iPS 세포는 대개 특정한 세포 운명으로 세포를 재프로그램화하기 위해 일정 수준의 유전자 조작을 요한다. 한편으로, 상기에 핵형 완전성에 영향을 미치는 배양 조건이 가해지며 따라서 배양 시간을 최소로 유지해야 한다(이는 또한 인간 배아 줄기세포에 대한 경우이기도 하다). 이는 iPS 세포가 생체내 상황을 정확하게 나타낼 수 없고 대신에 생체내 세포의 양상을 모방하는 시도임을 의미한다. 세포주 및 iPS 세포는 또한 유전적 불안정성이 문제가 된다.
대조적으로, 본 발명의 오가노이드는 상기 생체내 상황을 충실히 나타내는 유전학적으로 안정한 플랫폼을 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 오가노이드는 상응하는 생체내 상황에 존재하는 모든 분화된 세포 유형을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 오가노이드는 생체내에 존재하는 모든 분화된 세포 유형으로 추가로 분화될 수 있다. 따라서 본 발명의 오가노이드를, 다양한 질병 및 치료학에 대한 역학적 이해를 획득하여 시험관내 약물 선별을 수행하고, 잠재적인 치료제를 평가하고, 미래의 신규(약물) 치료법 개발에 가능한 표적(예를 들어 단백질)을 식별하고/하거나 세포-대체 요법과 결합된 유전자 복구를 탐구하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 오가노이드를 그의 유전학적 완전성 및 표현형적 특성의 상실 없이 그리고 증식 능력의 상실 없이 동결 및 해동시키고 배양할 수 있다. 따라서 상기 오가노이드를 쉽게 보관 및 수송할 수 있다. 따라서 일부 실시태양에서, 본 발명은 동결된 오가노이드를 제공한다.
이러한 이유 때문에 본 발명의 오가노이드 또는 분화된 세포의 집단은 약물 선별, 표적 확인, 표적 발견, 독성학 및 독성학 선별 및 맞춤 의학의 도구일 수 있다.
상응하게, 추가의 태양에서, 본 발명은 약물 발견 선별, 독성 분석 또는 의학, 예를 들어 재생 의학에서 본 발명에 따른 오가노이드 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포의 용도를 제공한다. 예를 들어, 상기 장 오가노이드 중 어느 하나를 약물 발견 선별, 독성 분석 또는 의학, 예를 들어 재생 의학에 사용할 수 있다.
점막 백신
상기 오가노이드의 추가적인 중요한 용도는 점막 백신화의 개발에 있다. 점막 백신은 점막을 통해 투여되는 백신이다. 상기는, 예를 들어 코, 입 또는 직장을 통한 임의의 점막 표면일 수 있다. 상기를 흡입기, 스프레이 또는 다른 외용 보조제를 통해 투여할 수 있다. 상기는 주사에 비해 다수의 명백한 이득을 가지며, 예를 들어 의료진이 상기 백신을 투여할 필요가 없으며, 이는 예를 들어 개발도상국에서는 중요할 수 있다.
장에서, M 세포(또는 "미세주름세포")는 회장의 응집된 림프절의 여포-관련 상피에서 발견되는 세포이다. 상기는 유기체 및 입자를 장 관강에서부터 상피 장벽을 통해 면역 세포로 수송하며, 따라서 점막 면역의 자극에 중요하다. 상기는 내포작용 또는 식작용을 통해 소장의 관강으로부터 항원을 흡수하고 이어서 이를 통과세포외배출을 통해 기저측면상의 특유의 포켓-유사 구조에 위치한 수지상 세포(항원제공세포) 및 림프구(즉 T 세포)로 전달하는 특유의 능력을 갖는다. M 세포는 장내분비세포의 한 유형이다. 상기에 설명한 바와 같이, 본 발명자들은 전구세포의 장내분비 세포 운명으로의 개선된 분화 방법을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 분화된 오가노이드는 장내분비세포, 예를 들어 M 세포가 풍부하다.
오가노이드는 일부의 경우에 RANK 리간드로 자극시 M 세포로 발달할 수 있다(예를 들어 WO2012/169830의 도 49를 참조하시오). 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 분화 배지는 RANK 리간드를 추가로 포함한다.
점막 백신의 효율은 상기 백신이 M 세포를 표적화하는 경우 실질적으로 증가할 수 있다. 따라서, 본 발명의 분화된 세포 집단 또는 오가노이드를 병원체 또는 항원을 흡수하고 이들을 면역계로 제공하는 M 세포의 능력을 시험하는데 사용할 수 있다. 따라서 일부 실시태양에서 본 발명은 약물 선별에서, 예를 들어 백신 개발 및/또는 백신 생산에서 본 발명의 오가노이드의 용도를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 상기 오가노이드를 바이러스, 세균, 진균 또는 다른 기생충 감염, 예를 들어(비제한적으로) 콜레라, 호흡기융합 바이러스(RSV), 로타바이러스 및 HIV에 대한 백신의 개발 또는 생산에 사용할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 점막 백신 개발에 사용하기 위한, 본 발명의 배양 배지 중에서 분화된 오가노이드를 제공한다.
약물 선별
바람직하게 대량 신속처리 목적을 위해서, 본 발명의 상기 오가노이드를 다중웰 플레이트, 예를 들어 96웰 플레이트 또는 384웰 플레이트에서 배양한다. 분자들의 라이브러리를 사용하여 상기 오가노이드에 영향을 미치는 분자를 식별한다. 바람직한 라이브러리는 항체 단편 라이브러리, 펩티드 파지 디스플레이 라이브러리, 펩티드 라이브러리(예를 들어 LOPAP(상표), 시그마 알드리치), 지질 라이브러리(바이오몰(BioMol)), 합성 화합물 라이브러리(예를 들어 LOP AC(상표), 시그마 알드리치) 또는 천연 화합물 라이브러리(스펙스(Specs), 팀텍(TimTec))를 포함한다. 더욱 또한, 줄기세포의 자손에서 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하거나 억제하는 유전자 라이브러리를 사용할 수 있다. 이들 유전자 라이브러리는 cDNA 라이브러리, 안티센스 라이브러리, 및 siRNA 또는 다른 비-암호화 RNA 라이브러리를 포함한다. 상기 세포를 바람직하게는 일정 기간 동안 다중 농도의 시험제에 노출시킨다. 상기 노출 기간의 끝에서, 상기 배양물을 평가한다. "영향을 미치는"이란 용어는 세포 중의 임의의 변화, 예를 들어 비제한적으로 증식의 감소 또는 손실, 형태학적 변화, 및 세포사를 다루는데 사용된다. 본 발명의 상기 오가노이드는 또한, 상피 암종세포를 특이적으로 표적화하지만 본 발명의 오가노이드는 표적화하지 않는 약물을 식별하는데 사용된다.
단시간(수일)안에 본 발명의 유용한 오가노이드를 수득하는 능력은, 상기 오가노이드가 특정한 약물에 대한 개별적인 환자 응답을 시험하고 상기 응답성에 따라 치료를 맞춤하는데 매우 유용할 것임을 보인다. 일부 실시태양에서, 상기 오가노이드를 환자로부터의 생검으로부터 수득하는 경우, 상기 오가노이드를 21일 미만, 예를 들어 14일 미만, 13일 미만, 12일 미만, 11일 미만, 10일 미만, 9일 미만, 8일 미만, 7일 미만(등) 동안 배양한다.
상기 오가노이드는 또한 보다 넓은 약물 발견 목적에 유용하다(예를 들어 낭성 섬유증 또는 콜레라에 대한 약물의 선별을 기재하는 WO2013/093812를 참조하시오). 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 오가노이드를 낭성 섬유증 약물의 선별에 사용할 수 있었다. 그러나, 숙련가는 본 발명의 오가노이드가 인간 위장관의 감염성, 염증성 및 종양성 병리학 및 상기 위장관의 다른 질병 및 본 명세서에 기재된 다른 조직, 예를 들어 췌장, 위 또는 폐의 감염성, 염증성 및 종양성 병리학 및 다른 질병에 대한 약물 선별 도구로서 널리 적용 가능함을 알 것이다. 일부 실시태양에서 본 발명의 오가노이드를 암 약물의 선별에 사용할 수 있었다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 오가노이드를 약물, 화장품 및/또는 예방 의학으로서의 용도에 대한 적합성에 대해서 화학물질, 항체, 천연 생성물(식물 추출물) 등의 라이브러리를 시험하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 관심 환자로부터의 세포 생검, 예를 들어 암 환자로부터의 종양 세포를 본 발명의 배양 배지 및 방법을 사용하여 배양하고 화학적 화합물 또는 화학적 라이브러리로 치료할 수 있다. 이어서 화합물이 상기 환자의 세포를 유효하게 변형, 사멸 및/또는 치료하는지를 측정하는 것이 가능하다. 이는 시험하고자 하는 특정 약물에 대한 특정 환자의 응답성을 허용하여, 특정 환자에 치료를 맞출 수 있게 한다. 따라서, 이는 맞춤의학 접근법을 허용한다.
이렇게 하여 약물을 식별하기 위해 상기 오가노이드를 사용하는 추가적인 장점은 또한, 약물 및 화합물이 건강한 조직에 최소의 영향을 미치는지를 검사하기 위해 정상적인 오가노이드(건강한 조직으로부터 유래된 오가노이드)를 선별하는 것이 가능하다는 것이다. 이는 최소의 표적-외 활성 또는 불필요한 부작용을 갖는 약물을 선별할 수 있게 한다.
임의의 수의 질병에 대한 약물들을 이러한 방식으로 선별할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 오가노이드를 당뇨병, 낭성 섬유증, 암종, 선암종, 선종, 위소장췌장 신경내분비 종양, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병) 등에 대한 약물의 선별에 사용할 수 있다. 상기 시험 매개변수는 관심 질병에 따라 변한다. 예를 들어, 암 약물을 선별하는 경우, 암 세포사가 대개 궁극적인 목적이다. 낭성 섬유증의 경우, 상기 약물에 대한 오가노이드의 증식 및 CFTR의 자극의 측정이 중요하다. 다른 실시태양에서, 대사 또는 유전자 발현을 관심 세포 또는 오가노이드에 대한 상기 선별 화합물 및 약물의 효과를 연구하기 위해서 평가할 수 있다.
따라서, 본 발명은 치료학적 또는 예방학적 약학 약물 또는 화장품에 대한 선별 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
분화된 세포 집단 또는 오가노이드를 후보 분자(또는 후보 분자의 라이브러리)와 접촉시키고,
상기 분화된 세포 집단 또는 오가노이드를 임의의 효과(예를 들어 세포 중의 임의의 변화, 예를 들어 증식의 감소 또는 손실, 형태학적 변화 및/또는 세포사) 또는 오가노이드 중의 변화(예를 들어 상기 오가노이드 크기 또는 운동성)에 대해 평가하고;
잠재적인 약물 또는 화장품으로서 상기 효과를 야기하는 후보 분자를 식별하고; 임의로
상기 후보 분자를 약제 또는 화장품으로서 제조함
을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 약제 또는 화장품의 제조 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
분화된 세포 집단 또는 오가노이드를 후보 분자(후보 분자의 라이브러리)와 접촉시키고,
상기 분화된 세포 집단 또는 오가노이드를 임의의 효과(예를 들어 세포 중의 임의의 변화, 예를 들어 증식의 감소 또는 손실, 형태학적 변화 및/또는 세포사) 또는 오가노이드 중의 변화(예를 들어 상기 오가노이드 크기 또는 운동성)에 대해 평가하고;
잠재적인 약물 또는 화장품으로서 상기 효과를 야기하는 후보 분자를 식별하고; 임의로
상기 후보 분자를 약제 또는 화장품으로서 제조함
을 포함한다.
일부 실시태양에서, 컴퓨터- 또는 로봇-지원 배양 및 데이터 수집 방법을 사용하여 상기 선별의 신속처리를 증가시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 오가노이드는 환자 생검으로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 상기 배양된 분화된 세포 집단(예를 들어 오가노이드)에 대해 목적하는 효과를 야기하는 후보 분자를 상기 환자에게 투여한다.
상응하게, 하나의 태양에서,
(a) 환자에서 병든 관심 조직으로부터의 생검을 수득하고;
(b) 상기 생검을 배양하여 오가노이드를 수득하고;
(c) 본 발명의 선별 방법을 사용하여 적합한 약물을 선별하고;
(d) 상기 환자를 단계 (c)에서 수득한 약물로 처리함
을 포함하는, 상기 환자의 치료 방법을 제공한다.
일부 실시태양에서, 상기 약물 또는 화장품을 유전병, 대사병, 병원성 질병, 염증성 질병 등, 예를 들어 비제한적으로 낭성 섬유증, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병), 암종, 선종, 선암종, 결장암, 당뇨병(예를 들어 I형 또는 II형), 위소장췌장 신경내분비 종양 등의 증상을 치료하거나, 예방하거나 또는 개선시키기 위해 사용한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 재생 의학용 약물의 선별 방법을 제공한다.
표적 발견
일부 실시태양에서, 본 발명의 오가노이드를 표적 발견을 위해 사용할 수 있다. 건강하거나 병든 조직으로부터 기원하는 오가노이드의 세포를 표적 식별을 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 오가노이드를 낭성 섬유증, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병), 암종, 선종, 선암종, 결장암, 당뇨병(예를 들어 I형 또는 II형), 위소장췌장 신경내분비 종양 등에 대한 약물 표적의 발견에 사용할 수 있다. 본 발명의 배지 및 방법에 따라 배양된 오가노이드는 생체내 상황을 충실히 나타내는 것으로 생각된다. 이러한 이유 때문에 상기는 특정한 질병에서 신규의 (분자)표적을 찾기 위한 도구일 수 있다.
새로운 약물 표적을 탐색하기 위해서, 화합물의 라이브러리(예를 들어 siRNA)를 사용하여 세포를 형질도입시키고 특정한 유전자를 불활성화시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포를 siRNA로 유전자 (큰)그룹의 기능을 억제하도록 형질도입시킨다. 유전자 그룹의 임의의 기능 판독 또는 특정한 세포 기능을 사용하여 표적이 상기 연구와 관련있는 지를 측정할 수 있다. 질병-특이적 판독을 당해 분야에 주지된 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 세포 증식을 분석하여 암에 관련된 유전자들을 시험한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 탑플래시(Topflash) 분석을 사용하여 siRNA 억제에 의해 야기된 Wnt 활성의 변화를 검출할 수 있다. 증식 감소 또는 세포사가 발생하는 경우, 상응하는 siRNA 관련된 유전자를 당해 분야에 공지된 방법에 의해 식별할 수 있다. 이들 유전자는 이들 세포의 증식 억제에 대한 가능한 표적이다. 식별시, 연구된 세포 과정의 식별된 표적의 특이성을 당해 분야에 주지된 방법에 의해 측정할 필요가 있을 것이다. 이들 방법을 사용하여, 새로운 분자를 치료법에 대한 가능한 약물 표적으로서 식별할 수 있다.
표적 및 약물 확인 선별
질병 및/또는 정상 조직으로부터 수득된 환자-특이성 오가노이드를 대량 신속처리 선별에서 식별된 분자의 표적 확인에 사용할 수 있다. 이를 대량 신속처리 선별에서 가능한 치료학적 약물로서 확인된 화합물의 확인에 대해서 진행한다. 상기 오가노이드 배양 시스템에서 분화된 1차 환자 물질의 사용은 대량 신속처리 약물 발견 세포주 연구로부터 거짓 양성 등을 시험하는데 유용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 오가노이드를 대량 신속처리 선별에서 가능한 약물 또는 화장품으로서 식별된 화합물의 확인에 사용할 수 있다.
병원체 배양
더욱 또한, 본 발명의 오가노이드를 병원체, 예를 들어 현재 적합한 조직 배양 또는 동물 모델이 없는 노로바이러스의 배양에 사용할 수 있다.
재생 의학 및 이식
본 발명은 재생 의학 및/또는 이식에서 오가노이드의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 오가노이드를 동물 또는 인간내에 이식함을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 오가노이드, 예를 들어 위 오가노이드, 장 오가노이드 또는 췌장 오가노이드는 재생 의학, 예를 들어 장 상피의 방사선-후 및/또는 수술-후 복구, 염증성 장 질병, 예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염을 앓고 있는 환자에서 장 상피의 복구, 및 단장 증후군을 앓고 있는 환자에서 장 상피의 복구에 유용하다. 추가의 용도는 소장/결장의 유전적 질병이 있는 환자에서 장 상피의 복구에 존재한다. 췌장 오가노이드를 포함하는 배양물은 또한 재생 의학에, 예를 들어 췌장 또는 그의 일부의 절제 후 이식물로서 및 I형 당뇨병 및 II형 당뇨병과 같은 당뇨병의 치료에 유용하다.
또 다른 실시태양에서, 상기 오가노이드 또는 상기 오가노이드로부터 단리된 세포를 관련된 조직 운명, 예를 들어 췌장 베타-세포를 포함한 췌장 세포로 재프로그램화한다. 본 발명의 배양 방법은 밀접하게 관련된 전구세포를 췌장 베타-세포를 포함한 췌장 세포 또는 간세포로 트랜스-분화시키는 인자들에 대한 분석을 가능하게 할 것이다.
숙련가에게 유전자 요법을 손상되거나 병든 조직의 복구에 대한 방법에 추가로 사용할 수 있음은 명백할 것이다. 예를 들어 DNA 및/또는 RNA와 같은 유전 정보를 줄기세포로 전달하기 위해 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 유전자 전달 비히클을 사용할 수 있다. 숙련가는 유전자 요법에서 표적화된 특정 유전자를 교체하거나 복구할 수 있다. 예를 들어, 정상 유전자를 게놈내 불특정 장소에 삽입하여 비기능 유전자를 교체할 수 있다. 또 다른 예에서, 비정상 유전자 서열을 상동성 재조합을 통해 정상 유전자 서열로 교체할 수 있다. 한편으로, 선택성 역 돌연변이는 유전자를 그의 정상 기능으로 복귀시킬 수 있다. 추가의 예는 특정 유전자의 조절(유전자가 켜지거나 꺼지는 정도)을 변경시키는 것이다. 바람직하게, 오가노이드 또는 오가노이드로부터 유래된 세포는 유전자 요법 접근법에 의해 생체외에서 치료되며 후속으로 포유동물, 바람직하게는 치료가 필요한 인간에게 전달된다.
성인 제공자로부터 채취한 작은 생검을 임의의 명백한 제한이나 유전적 피해없이 증식시킬 수 있기 때문에, 상기 기술은 재생 목적으로 이식 가능한 상피를 생성시키기 위해 제공될 수 있다. 오가노이드를 그의 3D 구조 및 완전성의 상실없이 및 현저한 세포사 없이 동결 및 해동시키고 배양시킬 수 있다는 사실은 이식 목적에 대한 오가노이드의 적용성을 가중시킨다. 더욱 또한, 일부 실시태양에서 ECM 중에 포매된 또는 상기 ECM과 접촉된 오가노이드를 포유동물, 바람직하게는 인간에게 이식할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 오가노이드 및 ECM을 포유동물, 바람직하게는 인간에 동시에 이식할 수 있다.
숙련가는 ECM을 본 발명에 따라 증식된 세포의 집단 또는 오가노이드를 포함하는 조직-유사 구조물을 수득하기 위한 3D 스캐폴드로서 사용할 수 있다. 이어서 상기와 같은 구조물을 당해 분야에 주지된 방법에 의해 환자에게 이식할 수 있다. ECM 스캐폴드를 ECM 단백질, 예를 들어 콜라겐 및/또는 라미닌을 사용하여 합성적으로 제조하거나, 또는 한편으로 ECM 스캐폴드를, 상기 ECM으로 이루어지는 스캐폴드를 남기는 단리된 장기 또는 조직 단편의 "세포제거(decellularising)"에 의해 수득할 수 있다(예를 들어 문헌[Macchiarini et al. The Lancet, Volume 372, Issue 9655, Pages 2023 - 2030, 2008]을 참조하시오). 일부 실시태양에서, ECM 스캐폴드를 장기 또는 조직 단편의 세포제거에 의해 수득할 수 있으며, 여기에서 임의로 상기 장기 또는 조직 단편은 장, 췌장, 폐 또는 위로부터 유래된다.
본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간내로의 이식에 사용하기 위한 본 발명의 오가노이드 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포를 제공한다. 또한 이식이 필요한 환자내로 본 발명의 오가노이드 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포를 이식함을 포함하는 상기 환자의 치료 방법을 제공하며, 여기에서 상기 환자는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 일부 실시태양에서, 상기 오가노이드는 상기 환자내로 이식전에 추가로 분화된다.
예를 들어, 작은 생검을 성인 제공자로부처 채취하고 증식 방법에 의해 증식시키고 후속적으로 본 발명에 따라 분화시킨다. 따라서 본 명세서에 제공된 기술은 재생 목적을 위한 이식가능한 상피의 생성을 위해 제공될 수 있다.
본 발명은 환자 또는 기능장애 췌장을 갖는 환자에서 당뇨병과 같은 인슐린-결핍 질환의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 췌장 오가노이드 또는 본 발명의 췌장 오가노이드로부터의 세포를 상기 환자내에 이식함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 세포 또는 오가노이드는 환자내로 이식시 인슐린을 발현하거나 분비하지 않고 인슐린을 분비하도록 상기 환자내에서 분화한다. 예를 들어, 인슐린을 분비하는 능력은 이식시 바로 검출될 수 없고, 이식후 약 1개월까지, 예를 들어 이식후 6주, 2개월 또는 3개월까지 제공될 수 있다.
상기 환자는 바람직하게는 인간이나, 한편으로 비-인간 포유동물, 예를 들어 고양이, 개, 말, 소, 돼지, 양, 토끼 또는 마우스일 수 있다.
따라서, 본 발명의 범위내에 세포 요법을 통한 인간 또는 비-인간 동물 환자의 치료 방법이 포함된다. 상기와 같은 세포 요법은 본 발명의 줄기세포 또는 오가노이드의 임의의 적합한 수단을 통한 환자에의 적용을 포함한다. 구체적으로, 상기와 같은 치료 방법은 손상된 조직의 재생을 수반한다. 본 발명에 따라, 환자를 동종이계 또는 자기유래 줄기세포 또는 오가노이드로 치료할 수 있다. "자기유래" 세포는 상기 세포가 예를 들어 조직 재생을 허용하도록 세포 요법에 재-도입되는 동일한 유기체로부터 기원하는 세포이다. 그러나, 상기 세포는 반드시 상기가 도입되는 조직과 동일한 조직으로부터 단리될 필요는 없다. 자기유래 세포는 거부 문제를 극복하기 위해서 상기 환자와의 합치를 필요로 하지 않는다. "동종이계" 세포는 상기 세포가 세포 요법을 위해, 예를 들어 조직 재생을 허용하도록 도입되는 개인과, 동일한 종이기는 하지만 상이한 개인으로부터 기원하는 세포이다. 상기 거부 문제를 예방하기 위해서 어느 정도의 환자 합치가 요구될 수도 있다. 따라서 일부 실시태양에서 상기 이식은 자기유래 세포를 수반한다. 일부 실시태양에서, 상기 이식은 동종이계 세포를 수반한다.
일반적으로 본 발명의 세포 또는 오가노이드를 주사 또는 이식에 의해 상기 환자의 신체내에 도입시킨다. 일반적으로 상기 세포를 상기 세포가 작용하고자 하는 조직내에 직접 주사할 것이다. 한편으로, 상기 세포를 간문맥을 통해 주사할 것이다. 본 발명의 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 주사기는 본 발명의 범위내에 포함된다. 본 발명의 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 주사기에 부착된 카테터는 본 발명의 범위내에 포함된다.
숙련가는 이식되는 물질(즉 세포의 집단, 세포 현탁액 중의 단세포, 오가노이드 또는 오가노이드의 단편)뿐만 아니라 치료되는 장기에 따라 적합한 투여 방법 및 경로를 선택할 수 있을 것이다.
상기에 논의된 바와 같이, 본 발명의 오가노이드 또는 세포를 조직의 재생에 사용할 수 있다. 상기 기능을 성취하기 위해서, 세포를 손상된 조직내에 직접 주사하거나 이식할 수 있으며, 여기에서 상기는 상기 신체내 그의 장소에 따라 증식하고 최종적으로 필요한 세포 유형으로 분화할 수 있다. 한편으로, 상기 오가노이드를 손상된 조직내로 직접 주사하거나 이식할 수 있다. 치료에 민감한 조직은 모든 손상된 조직, 특히 질병, 손상, 외상, 자가면역 반응에 의해 또는 바이러스 또는 세균 감염에 의해 손상되었을 수도 있는 조직들을 포함한다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 본 발명의 세포 또는 오가노이드를 사용하여 결장, 소장, 폐, 췌장 또는 위 시스템을 재생시킨다.
예를 들어, 하나의 실시태양에서, 본 발명의 세포 또는 오가노이드를 해밀튼(Hamilton) 주사기를 사용하여 환자에게 주사한다.
숙련가는 본 발명의 세포 또는 오가노이드의 적합한 투여량이 치료되는 특정 상태에 대한 것임을 알 것이다.
하나의 실시태양에서 다양한 조성의 용액, 미소구 또는 미세입자 중의 본 발명의 오가노이드 또는 세포를, 재생이 필요한 조직 또는 손상된 장기의 부분을 관류하는 동맥내에 투여할 것이다. 일반적으로 상기와 같은 투여를 카테터를 사용하여 수행할 것이다. 상기 카테터는 혈관성형술 및/또는 세포 전달에 사용되는 매우 다양한 벌룬 카테터 또는 세포를 신체의 특정 국소로 전달하는 특정한 목적으로 설계된 카테터 중 하나일 수 있다. 몇몇 용도의 경우, 상기 세포 또는 오가노이드는 다수의 상이한 생물분해성 화합물로 제조되고 약 15 ㎛의 직경을 갖는 미소구내로 캡슐화될 수 있다. 상기 방법은 혈관내 투여된 세포 또는 오가노이드가 손상 부위에서 머무르게 하고, 1차 계대시 모세관 네트워크를 통해 전신 순환으로 진행하지 않도록 할 수 있다. 상기 모세관 네트워크의 동맥 부분에서의 체류는 또한 혈관외 공간내로의 전위를 촉진할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 오가노이드 또는 세포를 정맥을 통해 전신으로 전달하거나 또는 상기 세포 또는 오가노이드가 향하는 조직 또는 신체 부분내로 배액되는 특정한 정맥내로 국소적으로, 혈관 수상구조내로 역행 주사할 수도 있다. 상기 실시태양을 위해서 상술한 제제들 중 다수를 사용할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 세포 또는 오가노이드를 생체적합성 이식물에 부착된 손상된 조직내로 이식할 수 있다. 상기 실시태양내에서, 상기 세포를 환자에게 이식전에, 시험관내에서 생체적합한 이식물에 부착시킬 수도 있다. 당해 분야의 숙련가에게 명백한 바와 같이, 다수의 부착제 중 임의의 하나를 사용하여 이식전에 상기 세포를 상기 이식물에 부착시킬 수 있다. 단지 예로서, 상기와 같은 부착제는 피브린, 인테그린 과의 하나 이상의 구성원, 카데린 과의 하나 이상의 구성원, 셀렉틴 과의 하나 이상의 구성원, 하나 이상의 세포 부착 분자(CAM), 면역글로불린 과 중 하나 이상 및 하나 이상의 인공 부착제를 포함할 수 있다. 상기 목록을 단지 예시로서 제공하며, 이는 제한임을 의도하지 않는다. 하나 이상의 부착제들의 임의의 조합을 사용할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 분명할 것이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 오가노이드 또는 세포를, 기질을 환자에게 이식하기에 앞서 상기 기질내에 포매시킬 수 있다. 일반적으로 상기 기질을 상기 환자의 손상된 조직내에 이식할 것이다. 기질의 예는 콜라겐계 기질, 피브린계 기질, 라미닌계 기질, 피브로넥틴계 기질 및 인공 기질을 포함한다. 상기 목록을 단지 예시로서 제공하며, 이는 제한임을 의도하지 않는다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 오가노이드 또는 세포를 기질 형성 성분과 함께 환자에게 이식하거나 주사할 수 있다. 이는 상기 세포가 주사 또는 이식에 이어서 기질을 형성하게 하며, 이는 상기 세포 또는 오가노이드가 상기 환자내 적합한 장소에 확실히 남아있게 한다. 기질 형성 성분의 예는 피브린 글루 액체 알킬, 시아노아크릴레이트 단량체, 가소제, 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트란, 에틸렌 옥사이드-함유 올리고머, 블록 공-중합체, 예를 들어 폴록사머 및 플루로닉스, 비-이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈 및 트리톤'8', 및 인공 기질 형성 성분을 포함한다. 상기 목적을 단지 예시로서 제공하며, 이는 제한임을 의도하지 않는다. 하나 이상의 기질 형성 성분들의 임의의 조합을 사용할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 분명할 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 오가노이드 또는 세포는 미소구내에 함유될 수 있다. 상기 실시태양 내에서, 상기 세포를 미소구의 중심내에 캡슐화시킬 수 있다. 또한 상기 실시태양 내에서, 상기 세포를 상기 미소구의 기질 물질내에 포매시킬 수 있다. 상기 기질 물질은 임의의 적합한 생분해성 중합체, 예를 들어 비제한적으로 알기네이트, 폴리에틸렌 글리콜(PLGA) 및 폴리우레탄을 포함할 수 있다. 상기 목적을 단지 예시로서 제공하며, 이는 제한임을 의도하지 않는다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 세포 또는 오가노이드를 이식용 의료 기구에 부착시킬 수 있다. 상기와 같은 의료 기구의 예는 스텐트, 핀, 스티치, 스플릿, 보철 관절, 인공 피부 및 막대를 포함한다. 상기 목적을 단지 예시로서 제공하며, 이는 제한임을 의도하지 않는다. 상기 세포를 다양한 방법에 의해 상기 의료 기구에 부착시킬 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 분명할 것이다. 예를 들어, 상기 세포 또는 오가노이드를 피브린, 인테그린 과의 하나 이상의 구성원, 카데린 과의 하나 이상의 구성원, 셀렉틴 과의 하나 이상의 구성원, 하나 이상의 세포 부착 분자(CAM), 면역글로불린 과 중 하나 이상 및 하나 이상의 인공 부착제를 사용하여 의료 기구에 부착시킬 수 있다. 상기 목록을 단지 예시로서 제공하며, 이는 제한임을 의도하지 않는다. 하나 이상의 부착제들의 임의의 조합을 사용할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 분명할 것이다.
본 발명의 방법을 사용하여 수득한 오가노이드 또는 분화된 세포의 집단은 다양한 용도를 갖는다. 예를 들어, 본 발명은 약물 발견 선별; 독성 분석; 진단학; 조직 발생학, 세포 계통 및 분화 경로의 연구; 각각의 호르몬의 방출을 유도하는 화학적 및/또는 뉴런 신호를 식별하기 위한 연구; 재조합 유전자 발현을 포함한 유전자 발현 연구; 조직 손상 및 수복에 관련된 기전의 연구; 염증 및 감염성 질병의 연구; 발병기전의 연구; 또는 세포 형질전환의 기전 및 암 병인학의 연구에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 오가노이드 또는 분화된 세포의 집단의 용도를 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 약물 발견 선별, 독성 분석 또는 재생 의학에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 오가노이드 또는 분화된 세포의 집단의 용도를 제공한다. 유사하게, 본 발명은 이들 용도를 위한 본 발명의 오가노이드의 자손의 용도를 제공한다.
독성 분석은 오가노이드 또는 그의 부분 또는 오가노이드로부터 유래된 세포를 사용하는 시험관내 분석일 수 있다. 상기와 같은 자손 및 오가노이드는 배양이 용이하며 예를 들어 현재 독성 분석에 사용되는 상피 세포주, 예를 들어 Caco-2 (ATCC HTB-37), I-407 (ATCC CCL6), 및 XBF (ATCC CRL 8808)보다 더 가깝게 1차 상피 세포를 닮는다. 오가노이드에 의해 획득된 독성 결과는 환자에서 획득된 결과를 보다 더 가깝게 닮을 것으로 예상된다. 세포-기반 독성 시험을 장기 특이성 세포독성의 측정에 사용한다. 상기 시험에서 시험되는 화합물은 화학적 암 예방제, 환경적 화학물질, 식품 보충제, 및 잠재적인 독성물질을 포함한다. 상기 세포를 일정 시간 동안 다중 농도의 시험제에 노출시킨다. 상기 분석에서 시험제의 농도 범위를 5일의 노출 및 최고 용해성 농도로부터의 로그 희석을 사용하여 예비 분석에서 측정한다. 상기 노출 기간의 끝에서, 상기 배양물을 증식의 억제에 대해 평가한다. 데이터를 50 퍼센트까지 종점을 억제하는 농도(TC50)를 측정하기 위해 분석한다.
예를 들어, 본 발명의 상기 태양에 따라, 후보 화합물을 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포 또는 오가노이드와 접촉시키고, 세포 또는 세포 활성의 임의의 변화를 모니터할 수 있다.
대량 신속처리를 위해서, 상기 오가노이드를 다중웰 플레이트, 예를 들어 96 웰 플레이트 또는 384 웰 플레이트에서 배양한다. 분자들의 라이브러리를 사용하여 상기 오가노이드에 영향을 미치는 분자를 식별한다. 바람직한 라이브러리는 항체 단편 라이브러리, 펩티드 파지 디스플레이 라이브러리, 펩티드 라이브러리(예를 들어 LOPAP(상표), 시그마 알드리치), 지질 라이브러리(바이오몰), 합성 화합물 라이브러리(예를 들어 LOP AC(상표), 시그마 알드리치) 또는 천연 화합물 라이브러리(스펙스, 팀텍)를 포함한다. 더욱 또한, 줄기세포의 자손에서 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하거나 억제하는 유전자 라이브러리를 사용할 수 있다. 이들 유전자 라이브러리는 cDNA 라이브러리, 안티센스 라이브러리, 및 siRNA 또는 다른 비-암호화 RNA 라이브러리를 포함한다. 상기 세포를 바람직하게는 일정 기간 동안 다중 농도의 시험제에 노출시킨다. 상기 노출 기간의 끝에서, 상기 배양물을 평가한다. "영향을 미치는"이란 용어는 세포 중의 임의의 변화, 예를 들어 비제한적으로 증식의 감소 또는 손실, 형태학적 변화, 및 세포사를 다루는데 사용된다. 상기 오가노이드는 또한, 상피 암종세포를 특이적으로 표적화하지만, 상기 오가노이드는 표적화하지 않는 약물을 식별하는데 사용된다.
본 발명에 따른 오가노이드는 추가로 약물 발견 선별에서 및 잠재적인 신규의 약물 또는 공지된 약물 또는 공지되거나 신규의 식품 보충제의 독성 분석에서 Caco-2 세포와 같은 세포주의 용도를 대신할 수 있다.
더욱 또한, 상기와 같은 오가노이드를 병원체의 배양에 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 치료법에 사용하기 위한 본 발명의 분화된 오가노이드 또는 본 발명의 분화된 세포의 집단을 제공한다. 또한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 질병 또는 상태에 사용하기 위한 본 발명의 분화 오가노이드 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포를 제공한다.
유사하게, 본 발명의 하나 이상의 오가노이드 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포를 투여함을 포함하는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 질병 또는 상태의 치료 방법을 제공한다.
본 발명자들은 또한 생체내에서 연골세포와 간세포를 모두 발생시키는 이식된 간 오가노이드-유래된 세포를 갖는, 면역결핍 마우스내로의 오가노이드의 성공적인 이식을 입증하였다(WO 2012/014076의 실시예 7을 참조하시오). 따라서, 하나의 실시태양에서 본 발명은 인간 또는 동물에 이식하기 위한 본 발명의 오가노이드 또는 오가노이드-유래된 세포를 제공한다.
본 발명의 오가노이드의 장점은 상기 오가노이드를 기능의 상실 없이 동결시키고 나중에 해동시킬 수 있다는 것이다. 이는 세포 뱅킹, 용이한 보관 및 급성 용도를 위한 신속한 입수성을 가능하게 한다. 이는, 예를 들어 간의 경우 급성 간독성의 치료에 사용될 수도 있는, 예를 들어 "규격품"의 제조에 유용할 수 있다. 오가노이드를 또한 치료에 대한 임의의 윤리적 반대를 최소화하면서 간 제공자로부터 작은 생검으로서 채취한 세포 또는 조직 단편으로부터 증식시킬 수 있다. 상기 제공자는 심지어 치료하고자 하는 환자로부터 유래할 수 있으며, 이는 외부 세포 및 장기의 이식과 관련된 임의의 부정적인 부작용을 감소시키고 면역억제 약물에 대한 필요성을 감소시킬 수 있다.
약학 제형
일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 분화 배지의 성분 및 약학적으로 허용 가능한 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 예를 들어, 하나 이상의 Wnt 억제제(예를 들어 IWP-2), 하나 이상의 EGFR 경로 억제제(예를 들어 제피티니브, 아파티니브, PD0325901 및 SCH772984 중 하나 이상), 하나 이상의 노취 억제제(예를 들어 DAPT), 및 약학적으로 허용 가능한 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 약학 제형은 기본 배지를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 약학 제형은 세포외 기질을 포함하지 않는다. 상기와 같은 제형은, 예를 들어 재생 요법을 위해 생체내에서 줄기세포의 분화를 촉진하는데 적합할 수 있을 것으로 예상된다. 상기와 같은 제형을 원위치에(예를 들어 조직 손상 부위에) 또는 전신에 투여할 수 있다. 한편으로, 상기 제형을 당해 분야에 공지된 임의의 투여 경로에 의해, 예를 들어 정맥내, 피하, 근육내 투여에 의해, 점막, 피내, 피하, 경구 및 눈에 투여하기에 적합하도록 제형화할 수 있다. 따라서 약학 제형은 상기와 같은 투여에 적합한 임의의 형태, 예를 들어 정제, 주입액, 캡슐, 시럽 등일 수 있다.
일부 실시태양에서 하나 이상의 Wnt 억제제(예를 들어 IWP-2), 하나 이상의 EGFR 경로 억제제(예를 들어 제피티니브, 아파티니브, PD0325901 및 SCH772984 중 하나 이상), 하나 이상의 노취 억제제(예를 들어 DAPT), 하나 이상의 BMP 억제제(예를 들어 도르소몰핀 또는 LDN193189) 및 약학적으로 허용 가능한 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학 제형을 제공한다.
일부 실시태양에서 하나 이상의 Wnt 억제제(예를 들어 IWP-2), 하나 이상의 EGFR 경로 억제제(예를 들어 제피티니브, 아파티니브, PD0325901 및 SCH772984 중 하나 이상), 하나 이상의 노취 억제제(예를 들어 DAPT), 하나 이상의 BMP 활성제(예를 들어 BMP4, BMP7 또는 BMP2) 및 약학적으로 허용 가능한 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학 제형을 제공한다.
치료 방법
생체내 호르몬 수준 조절
본 발명의 분화 배지 중 하나 이상의 성분 및/또는 약학 조성물을 수반하는 치료 방법을 또한 제공한다. 특히, 생체내에서 EEC가, 특정한 호르몬을 발현하는 특정한 EEC 표현형을 향하게 지시될 수 있으며 따라서 본 발명의 방법을 일부 실시태양에서 사용하여 생체내 호르몬 수준을 조절할 수 있음이 예상된다.
예를 들어, 본 발명자들은 BMP 활성제가 EEC에서 세크레틴 분비를 촉진함(및 GLP-1 분비를 억제함)을 입증하였다(실시예 5를 참조하시오). 따라서, BMP 활성제, 또는 BMP 활성제를 포함하는 약학 조성물(본 명세서에 기재된 분화 배지의 다른 성분들이 있거나 없는)이 상승된 세크레틴 수준 또는 억제된 GLP-1 수준과 관련된 의학적 용도와 관련하여 유용할 수 있음이 예상된다. 세크레틴은 위산 분비의 억제(Afroze et al., Ann Transl Med. 2013 Oct; 1(3): 29) 및 식욕 억제(Cheng et al., Neuropsychopharmacology. 2011 Jan; 36(2): 459-471)에 의한 위 pH의 중화와 관련된다. 따라서 생체내 세크레틴 수준의 증가는 위산과다증(과잉 위산) 또는 비만증의 치료에 유용한 기전일 수 있다.
따라서 위산과다증 또는 비만증의 치료 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 BMP 활성제를 상기 치료가 필요한 피실험자에게 투여함을 포함한다. 또한 위산과다증 또는 비만증의 치료 방법에 사용하기 위한 BMP 활성제를 제공하며, 여기에서 상기 방법은 치료 유효량의 BMP 활성제를 상기 치료가 필요한 피실험자에게 투여함을 포함한다. 또한, 위산과다증 또는 비만증의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 BMP 활성제의 용도를 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 치료가 필요한 피실험자에게 치료 유효량의 BMP 활성제를 투여함을 포함한다. 적합한 BMP 활성제의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며 본 출원에서 보다 앞에 개시되어 있다.
본 발명자들은 또한 BMP 억제제가 EEC에서 GLP-1 분비를 촉진함(및 세크레틴 분비를 억제함)을 입증하였다(실시예 5를 참조하시오). 따라서, BMP 억제제, 또는 BMP 억제제를 포함하는 약학 조성물(본 명세서에 기재된 분화 배지의 다른 성분들이 있거나 없는)이 상승된 GLP-1 수준 또는 억제된 세크레틴 수준을 수반하는 의학적 용도와 관련하여 유용할 수 있음이 예상된다.
예를 들어, GLP-1(글루카곤-유사 펩티드-1)은 내인성 인크레틴이며 글루코스 항상성에 상당한 역할을 한다(Manandhar & Ahn J Med Chem. 2015 Feb 12; 58(3): 1020-1037). 상기는 그의 조절 기능을 발휘하기 위해서 G-단백질-결합된 수용체(GPCR)의 B과 부류에 속하는 GLP-1 수용체(GLP-1R)에 결합하여 이를 활성화시킨다. β-세포상에서 상기 수용체의 활성화는 cAMP 및 세포내 칼슘 수준의 신속한 증가에 이어서 글루코스-의존적인 방식으로 인슐린 세포외배출을 유도한다. α-세포 중 GLP-1R은 β-세포의 경우의 <0.2%이지만, GLP-1은 글루카곤 분비를 칼슘 채널 활성의 조절을 통해 50%까지 억제한다. GLP-1 치료법은 건강한 사람 및 당뇨병 환자 모두에서 인슐린 분비를 강화시키는 것으로 입증되었다. 다른 당뇨병 약물과 달리, GLP-1의 인슐린분비 효과는 일단 혈당 수준이 정상 범위로 낮아지면 진정되어 저혈당증의 위험을 감소시키므로 자기-제한성이다. 또한, GLP-1은 다수의 다른 기전들, 예를 들어 인슐린 유전자 전사 촉진, 췌장 β-세포 증식 및 신생의 자극, β-세포 세포사멸 억제, 및 글루카곤 방출 차단을 통해 식후 글루코스 상승을 조절한다. 상기는 또한 위 배출을 예방하고 포만감을 유도하여, 체중 감소에 이르게 한다. GLP-1 치료법은 또한 심장보호 효과를 제공하는 것으로 보인다. 그러나, 내인성 GLP-1은 디펩티딜 펩티다제 IV(DPP-IV) 및 중성 엔도펩티다제 24.11(NEP 24.11)과 같은 프로테아제에 의한 신속한 대사적 분해로 인해 매우 짧은 반감기를 갖는다. 이는 치료제로서 그의 사용을 제한한다. GLP 작용물질(예를 들어 DPP-IV 억제제)이 존재하며, 이는 GLP-1을 안정화시키는 것으로 생각된다. DPP-IV 억제제의 의심되는 단점은 GLP1이 단지 안정화될 뿐이며 내인성 음식물 섭취에 의해서 조절되지 않는다는 것이다. 따라서, 당뇨병 및 이와 관련된 질환을 치료하기 위한 대안의 개선된 치료법을 위한 대안의 수단이 필요하다.
본 발명자들은 BMP 억제제의 생체내 투여가 EEC 중 GLP-1 분비를 증가시킬 수 있고 따라서 당뇨병 및 관련된 질병 및 질환의 치료를 위한 치료법으로서 작용할 수 있음을 가정하였다. 본 발명자들은 마우스에의 BMP 억제제의 투여가 GLP-1 분비를 증가시킴을 입증하였다(실시예 6을 참조하시오). GLP1 세포수의 증가는 상기 세포가 여전히 GLP-1 방출에 음식물 섭취를 필요로하기 때문에 치료법에 유리하다. 따라서 상기 GLP1 피크는 인슐린의 증가된 수준이 피실험자에 의해 요구될 때 때때로 더 높을 것이다. 낮은 수의 GLP1 세포를 갖는 환자가 또한 특히 유리하다.
따라서, 당뇨병 또는 상기와 관련된 질병 또는 질환의 치료 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 치료가 필요한 피실험자에게 치료 유효량의 BMP 억제제를 투여함을 포함한다. 또한 당뇨병 또는 상기와 관련된 질병 또는 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 BMP 억제제를 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 치료가 필요한 피실험자에게 치료 유효량의 BMP 억제제를 투여함을 포함한다. 또한 당뇨병 또는 상기와 관련된 질병 또는 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 BMP 억제제의 용도를 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 치료가 필요한 피실험자에게 치료 유효량의 BMP 억제제를 투여함을 포함한다. 적합한 BMP 억제제의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며 본 출원에서 보다 앞에 개시되어 있다.
"피실험자"는 인간 또는 임의의 비-인간 동물(예를 들어 임의의 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 피실험자는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 피실험자는 질병의 진단 또는 치료를 위해 의료진에게 제공되는 인간을 지칭하는 환자일 수 있다. 피실험자는 질병 또는 질환으로 고생할 수 있거나 민감할 수 있지만, 상기 질병 또는 질환의 증상을 나타낼 수도 또는 나타내지 않을 수도 있다.
"치료 유효량"은 질병, 질환, 및/또는 상태를 앓고 있거나 또는 이들에 민감한 피실험자에게 투여시 상기 질병, 질환, 및/또는 상태의 증상(들)을 치료, 진단, 예방, 및/또는 상기 증상(들)의 개시를 지연시키기에 충분한 치료제의 양을 지칭한다. 숙련가는 치료 유효량이 전형적으로는 적어도 하나의 단위 용량을 포함하는 투여 섭생을 통해 투여됨을 알 것이다.
본 명세 전체를 통해 사용되는 바와 같은 "치료하는", "치료하다", "치료"는 특정한 질병, 질환, 및/또는 상태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 부분적으로 또는 완전히 경감시키고, 개선시키고, 완화시키고, 억제시키고, 예방하고, 이들의 개시를 지연시키고, 이들의 중증도를 감소시키고, 및/또는 이들의 발생을 감소시키는데 사용되는 임의의 방법을 지칭한다. 치료를 질병과 관련된 병리의 발생 위험을 감소시킬 목적으로, 상기 질병의 징후를 나타내지 않고/않거나 단지 상기 질병의 초기 징후만을 나타내는 피실험자에게 투여할 수도 있다.
"당뇨병"은 I형 당뇨병 및 II형 당뇨병일 수 있다. 상기는 그렇지 않으면 임신성 당뇨병일 수도 있다. "당뇨병"은 또한 인슐린 둔감성이지만 여전히 전-당뇨병일 수 있는 환자들을 포함한다. "관련된 질병 및 질환"은 비제한적으로 고혈당증, 비만증, 셀리악병, 갑상선 질병, 다낭성 난소 증후군, 요붕증, 당뇨성유지방성괴사, 유선증, 근육병 및 치과 문제를 포함한다.
예를 들어, 본 발명은 하기 번호의 실시태양들을 제공한다.
1. 당뇨병 또는 관련된 질병 또는 질환의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 상기 방법은 상기 치료 또는 예방이 필요한 피실험자에게 치료 유효량의 상기 BMP 억제제를 투여함을 포함한다.
2. 장내분비 세포로부터 GLP-1 분비를 증가시킴(인슐린 수준을 증가시키고 따라서 혈당 수준을 감소시키기 위해서)에 의한 당뇨병 또는 관련된 질병 또는 질환의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 상기 방법은 상기 치료 또는 예방이 필요한 피실험자에게 치료 유효량의 상기 BMP 억제제를 투여함을 포함한다.
3. 실시태양 1 또는 실시태양 2에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 상기 BMP 억제제는
a. BMP와 BMP 수용체와의 상호작용을 붕괴시킬 수 있고;
b. BMP 수용체에 결합하여 하류 신호전달의 활성화를 억제할 수 있고;
c. Smad 1, Smad 5 또는 Smad 8의 인산화를 억제할 수 있고;
d. Smad 1, Smad 5 또는 Smad 8의 핵으로의 전위를 억제할 수 있고;
e. 표적 유전자의 SMAD1, SMAD5 또는 SMAD8 매개된 전사를 억제할 수 있고;
f. BMP의 발현, 폴딩 또는 분비를 억제할 수 있다.
4. 선행 실시태양들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 상기 BMP 억제제는 Smad 1, Smad 5 또는 Smad 8의 인산화를 억제하며 예를 들어 하기 화학식 I에 따른 치환된 피라졸로[1,5-a]피리미딘 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르이다:
[화학식 I]
Figure pct00042
상기 식에서,
X 및 Y는 CR15 및 N 중에서 독립적으로 선택되고;
Z는 CR3 및 N 중에서 선택되고;
Ar은 치환되거나 또는 비치환된 아릴 및 헤테로아릴 중에서 선택되고;
L1은 존재하지 않거나 또는 치환되거나 또는 비치환된 알킬 및 헤테로알킬 중에서 선택되고;
A 및 B는 각각의 경우에 독립적으로 CR16 및 N 중에서 선택되고;
E 및 F는 둘 다 CR5이고 상기 두 경우 모두의 R5는 E 및 F와 함께 치환되거나 또는 비치환된 5- 또는 6-원 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
R3은 H 및 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 사이클로알킬, 할로겐, 아실아미노, 카바메이트, 시아노, 설포닐, 설폭시도, 설파모일 또는 설폰아미도 중에서 선택되고;
R4는 H 및 치환되거나 또는 비치환된 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, 아실, 카복실, 에스테르, 하이드록실, 알콕실, 알킬티오, 아실옥시, 아미노, 아실아미노, 카바메이트, 아미도, 아미디노, 설포닐, 설폭시도, 설파모일 또는 설폰아미도 중에서 선택되고;
R15는 각각의 경우에 독립적으로 H 및 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴알킬, 할로겐, 아실아미노, 카바메이트, 시아노, 설포닐, 설폭시도, 설파모일 또는 설폰아미도 중에서 선택되고;
R16은 각각의 경우에 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H 및 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴알킬, 할로겐, 아실, 카복실, 에스테르, 하이드록실, 알콕실, 알킬티오, 아실옥시, 아미노, 아실아미노, 카바메이트, 아미도, 아미디노, 시아노, 설포닐, 설폭시도, 설파모일, 또는 설폰아미도 중에서 선택된다.
5. 실시태양 4에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서:
a. A 및 B는 각각 CH이고;
b. E 및 F는 각각 CR5이고, 두 경우 모두의 R5가 부착된 원자와 함께 6-원 고리를 형성하고;
c. E 및 F는 함께 하기 그룹을 나타내고:
Figure pct00043
상기에서,
R40은 존재하지 않거나 또는 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 사이클로알킬, 할로겐, 아실아미노, 카바메이트, 시아노, 설포닐, 설폭시도, 설파모일 또는 설폰아미도 중에서 선택된 1 내지 4개의 치환체를 나타낸다;
d. L1은 하기 화학식을 갖고:
Figure pct00044
상기 식에서,
Q는 CR10R11, NR12, O, S, S(O), 및 SO2 중에서 선택되고;
R10 및 R11은 각각의 경우에 독립적으로 H 및 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴알킬, 아미노, 아실아미노, 카바메이트, 아미도, 아미디노, 시아노, 설포닐, 설폭시도, 설파모일 또는 설폰아미도 중에서 선택되고;
R12는 H 및 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 아미노, 아실아미노, 카바메이트, 아미도, 아미디노, 설포닐, 설파모일 또는 설폰아미도 중에서 선택되고;
n은 0 내지 4의 정수이다;
e. R4는 하기 중에서 선택되고:
Figure pct00045
및
Figure pct00046
상기에서
W는 존재하지 않거나 또는 C(R21)2, O, 또는 NR21이고;
R20은 존재하지 않거나 또는 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴알킬, 아실, 설포닐, 설폭시도, 설파모일 및 설폰아미도 중에서 선택되고;
R21은 각각의 경우에 독립적으로 H 및 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴알킬, 아실, 설포닐, 설파모일 또는 설폰아미도 중에서 선택되고; 및/또는
f. Ar은 6원 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고, 임의로, 여기에서 L1은 비사이클릭 코어에 대해 Ar의 파리-위치상에 배치된다.
6. 실시태양 4 또는 5에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 상기 치료 유효량은
a. 적어도 0.1 mg/kg, 적어도 0.2 mg/kg, 적어도 0.5 mg/kg, 적어도 1.0 mg/kg, 적어도 2 mg/kg, 적어도 5 mg/kg, 적어도 10 mg/kg, 적어도 20 mg/kg, 적어도 30 mg/kg 또는 약 35 mg/kg;
b. 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 30 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 1 mg/kg, 1 mg/kg 내지 50 mg/kg, 1 mg/kg 내지 30 mg/kg, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg이고/이거나;
c. 여기에서 상기 치료 유효량은 하루에 1, 2 또는 3회 투여된다.
7. 실시태양 1 내지 3 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 상기 BMP 억제제는
a. 도르소몰핀 또는 LDN193189 또는 그의 유사체 또는 변체; 및/또는
b. 노긴, 스클레로스틴, 코르딘, CTGF, 폴리스타틴, 그렘린, tsg, sog 또는 그의 유사체 또는 변체
중에서 선택된다.
8. 선행 실시태양들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 상기 BMP 억제제는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태이다.
9. 선행 실시태양들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 피실험자는 포유동물, 바람직하게는 인간, 고양이 또는 개이다.
10. 선행 실시태양들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 피실험자는 인간이다.
11. 선행 실시태양들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 상기 BMP 억제제는
a. 경구, 국소로, 또는 주사에 의해, 바람직하게는 경구로 및/또는
b. 전신적으로 또는 국소적으로
투여된다.
12. 선행 실시태양들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 상기 BMP 억제제는 하나 이상의 추가적인 당뇨병 치료제, 예를 들어 설포닐우레아, 비구아니드, 메트포르민, 알파-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온, 메글리티니드, 디펩티딜 펩티다제-4 억제제 또는 다른 인크레틴 유사물질, 아밀린 유사체, 또는 글리코슈릭과 함께 투여된다.
13. 선행 실시태양들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 상기 BMP 억제제는, 예를 들어 엑세나티드, 리라글루티드, 타스포글루티드, 릭시세나티드 중에서 선택된 GLP-1 수용체 작용물질과 함께 투여된다.
14. 선행 실시태양들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 상기 BMP 억제제는 인슐린 또는 그의 생물학적 활성 유사체와 함께 투여된다.
15. 실시태양 12 내지 14 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 조합은 단일 조성물로서 또는 2개의 별도의 조성물로서 투여된다.
16. 실시태양 12 내지 15 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 조합은 동시에 또는 연속적으로 투여된다.
17. 선행 실시태양들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 당뇨병은 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 임신성 당뇨병 또는 인슐린 둔감성, 바람직하게는 2형 당뇨병이다.
18. 선행 실시태양들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 피실험자는 비정상적으로 낮은 수준의 GLP-1을 갖는다.
19. 선행 실시태양들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 방법은 움의 특징적인 호르몬을 발현하는 장내분비 세포의 수를 증가시킴으로서 당뇨병을 치료하며, 여기에서 상기 움의 특징적인 호르몬은 GLP-1, 뉴로키닌 A 및 물질 P 및 글루카곤을 포함한다.
20. 선행 실시태양들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 방법은 동일한 환자에서 BMP 억제제 투여 전에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 순환/장/췌장 GLP-1 호르몬 수준의 증가를 생성시킨다.
21. 선행 실시태양들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 BMP 억제제로, 여기에서 방법은 10.0 mmol/ℓ 미만, 9.0 mmol/ℓ 미만, 8.0 mmol/ℓ 미만, 7.0 mmol/ℓ 미만, 6.9 mmol/ℓ 미만, 6.8 mmol/ℓ 미만, 6.7 mmol/ℓ 미만, 65. mmol/ℓ 미만, 6.4 mmol/ℓ 미만, 6.3 mmol/ℓ 미만, 6.2 mmol/ℓ 미만, 6.1 mmol/ℓ 또는 6.0 mmol/ℓ 미만의 피실험자 중 공복혈당 수준을 생성시킨다.
세포 요법
또한 세포 요법을 통한 인간 또는 비-인간 동물 환자의 치료 방법이 본 발명의 범위내에 포함된다. 여기에서 "동물"이란 용어는 모든 포유동물을 나타낸다. 상기 환자는 배아 및 태아 단계를 포함하여, 임의의 발생 단계에 있을 수도 있다. 예를 들어, 상기 환자는 성인이거나, 또는 상기 치료법은 소아과(예를 들어 신생아, 아동 또는 청소년)를 위한 것일 수 있다. 상기와 같은 세포 요법은 본 발명에 따라 생성된 세포 또는 오가노이드의 임의의 적합한 수단을 통한 환자에의 투여를 포함한다. 구체적으로, 상기와 같은 치료 방법은 손상된 조직의 재생을 수반한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "투여"란 용어는 충분히 인식된 형태의 투여, 예를 들어 정맥내 또는 주사뿐만 아니라 이식, 예를 들어 본 발명에 따른 세포 또는 오가노이드로부터 유래된 조직 조작된 세포 집단의 수술, 접목 또는 이식에 의한 이식에 의한 투여를 지칭한다. 세포의 경우에, 예를 들어 흉관을 통한 상장간동맥, 복강동맥, 쇄골하정맥내로의 주입, 상대정맥을 통한 심장내로의 주입, 또는 횡경막하 림프를 통한 세포의 후속 이동과 함께 복강내로의 주입, 또는 장동맥 혈액 공급내로의(예를 들어 상장간동맥 또는 내장간동맥내로의) 주입을 통한 장 부위에의 직접 주입에 의해 개인에의 전신 투여가 가능할 수 있다.
일부 실시태양에서, 100 ㎏의 사람당 104 내지 103 세포가 주입당 투여된다. 바람직하게, 약 1-5 x 104 내지 1-5 x 107 세포가 100 ㎏의 사람당 정맥내로 주입될 수 있다. 보다 바람직하게, 약 1 x 104 내지 10 x 106 세포가 100 ㎏의 사람당 정맥내로 주입될 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포 또는 오가노이드의 단일 투여가 제공된다. 다른 실시태양에서, 수회 투여가 사용된다. 수회 투여는 초기 치료 섭생에 걸쳐, 예를 들어 3 내지 7 연속일에 걸쳐 제공될 수 있으며, 이어서 다른 시간에 반복될 수 있다.
또한 본 명세서에 설명된 바와 같이 Lgr5를 발현하는 하나의 단세포로부터 오가노이드를 수득할 수 있다. 상기 단세포는 예를 들어 유전자 결함 또는 돌연변이를 보정하기 위해 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 구조물의 도입에 의해 변형되었을 수도 있다. 또한, 경우에 따라, 예를 들어 siRNA를 사용하여 발현을 특이적으로 제거하는 것도 가능할 것이다. 발현시키고자 하는 잠재적인 폴리펩티드는 예를 들어 대사성 간 질병에서 폴리펩티드 결핍을 포함하여 대사 질병에 결핍인 것들 중 어느 하나, 예를 들어 AAT(알파 안티트립신)일 수 있다. 생리학을 설명하기 위해서, 우리는 또한 Wnt, EGF, FGF, BMP 또는 노취 경로에 연루된 유전자들을 발현하거나 불활성화시킬 수도 있다.
유전자 요법을 손상된 또는 병든 조직의 복구에 대한 방법에 추가로 사용할 수 있음은 숙련가에게 분명할 것이다. 예를 들어 DNA 및/또는 RNA와 같은 유전자 정보를 줄기세포로 전달하는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 유전자 전달 비히클을 사용할 수 있다. 숙련가는 유전자 요법에서 표적화된 특정 유전자를 교체하거나 복구할 수 있다. 예를 들어, 정상 유전자를 상기 게놈내 불특정 장소에 삽입하여 비-기능성 유전자를 교체할 수 있다. 또 다른 예에서, 비정상적인 유전자 서열을 상동성 재조합을 통해 정상적인 유전자 서열 대신 사용할 수 있다. 한편으로, 선택적인 역돌연변이는 하나의 유전자를 그의 정상적인 기능으로 복귀시킬 수 있다. 추가의 예는 특정 유전자의 조절(유전자가 켜지거나 꺼지는 정도)의 변경이다. 바람직하게, 상기 줄기 세포를 유전자 요법 접근법에 의해 생체외에서 처리하고 후속적으로 상기 치료가 필요한 포유동물, 바람직하게는 인간으로 이동시킨다. 예를 들어, 오가노이드-유래된 세포를 환자에 이식전에 배양물 중에서 유전자 변형시킬 수 있다.
따라서, 일부 실시태양에서, 상기 오가노이드 또는 줄기세포의 집단은 예를 들어 질환, 상태 또는 질병의 치료를 위한 약제에 사용하기 위한 것 및/또는 재생 의학에 사용하기 위한 것이다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 오가노이드를 재생 의학에 사용하고자 하는 경우, 상기 방법은 상기 세포 또는 조직 단편이 자기유래이거나 또는 동종이계인 상피세포로부터 또는 조직 단편으로부터 출발할 수 있다. 거부 문제를 예방하기 위해서 어느 정도의 환자 합치가 여전히 요구될 수 있다. 조직 거부의 최소화 기법은 당해 분야의 숙련가들에게 공지될 것이다.
상기 오가노이드 및/또는 세포를 환자내에 이식하는 실시태양에서, 상기 세포를 스캐폴드 중에서 투여하는 것이 유리할 수 있다. 상응하게, 본 발명의 하나 이상의 오가노이드 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포를 포함하는 스캐폴드를 제공한다. 스캐폴드는 2차원 또는 3차원 네트워크를 제공한다. 상기와 같은 스캐폴드에 적합한 합성 물질은 다공성 고체, 나노섬유, 및 하이드로젤, 예를 들어 자기-조립 펩티드를 포함한 펩티드, 폴리에틸렌 글리콜 포스페이트, 폴리에틸렌 글리콜 푸마레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리하이드록시에틸 메트아크릴레이트, 폴리셀룰로스 아세테이트, 및/또는 이들의 공-중합체로 구성된 하이드로젤 중에서 선택된 중합체를 포함한다(예를 들어 문헌[Saha et al. (2007) Curr Opin Chem Biol. 11(4): 381-387]; 문헌[Saha et al. (2008) Biophysical Journal 95:4426-4438]; 문헌[Little et al. (2008) Chem. Rev 108:1787-1796]을 참조하시오). 숙련가에게 공지된 바와 같이, 상기 스캐폴드의 기계적 성질, 예를 들어 탄성은 줄기세포의 증식, 분화 및 이동에 영향을 미친다. 바람직한 스캐폴드는 예를 들어 조직 재생 및/또는 상처 치유를 촉진하기 위해 피실험자에게 이식후 천연 성분에 의해 교체되는 생분해성 (공)중합체를 포함한다. 더욱 또한 상기 스캐폴드는 피실험자에 이식후 면역원성 응답을 실질적으로 유도하지 않는 것이 바람직하다. 상기 스캐폴드는 줄기세포의 증식 및/또는 분화, 및/또는 이동에 필요한 신호를 제공하는 천연, 반-합성 또는 합성 리간드가 보충된다. 바람직한 실시태양에서, 상기 리간드는 한정된 아미노산 단편을 포함한다. 상기 합성 중합체의 예는 플루로닉(Pluronic)(등록상표) F127 블록 공중합체 계면활성제(BASF), 및 에티솔브(Ethisorb)(등록상표)(존슨 앤드 존슨(Johnson and Johnson))를 포함한다. 일부 실시태양에서 상기 세포를 상기 스캐폴드 중에서 배양한다. 다른 실시태양에서, 상기를 배양하고 이어서 상기 스캐폴드에 가한다.
본 발명의 용도는 단일 오가노이드를 사용하거나 또는 하나 초과, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 200 이상의 오가노이드를 사용할 수 있다. 유리하게, 본 발명의 방법은 큰 수의 오가노이드 및 상피 줄기세포가 단시간안에 생성될 수 있게 하는데, 그 이유는 이들이 기하급수적으로 증식하여 관심 용도에 사용하기에 충분한 세포를 입수할 수 있게 하기 때문이다. 본 명세서에서, 예를 들어 본 발명의 오가노이드 또는 상기 오가노이드로부터 수득된 세포를 수반하는 "치료의 방법" 또는 "치료를 위한 방법"을 언급하는 경우, 상기는 또한 "치료에 사용하기 위한" 오가노이드 또는 세포 및 "약제의 제조에 사용하기 위한" 오가노이드 또는 세포를 균등하게 지칭한다.
인공 장기
일부 실시태양에서, 인공 장기에서 분화된 오가노이드 또는 상기 분화된 오가노이드로부터 유래된 세포의 용도를 제공한다. 상기 인공 장기는 생체내에서 본 명세서의 달리 어딘가에 설명된 방법에 의해 이식될 수 있다. 한편으로, 상기 인공 장기는 생체외에 있을 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 생체외 인공 장기를 예를 들어 혈액 공급을 통해 환자에게 연결할 수 있다. 예를 들어, 분화된 오가노이드를 포함하는 인공 장기를 투석기계의 부분으로서 사용할 수도 있다. 따라서 분화된 오가노이드를 병든 또는 손상된 상피조직을 갖는 환자를 지지하는데 사용할 수 있다.
장 오가노이드 및 세포 집단의 용도
본 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 분화 배지 및 방법은 위에서 수득된 전구세포의 장내분비 세포 운명으로의 분화를 증대시킨다.
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 약제에 사용하기 위한, 예를 들어 위 질환, 상태 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 또는 재생 의학에 사용하기 위한 장 오가노이드 또는 상기 장 오가노이드로부터 수득된 세포를 제공한다.
본 발명은 당뇨병(예를 들어 I형 또는 II형), 낭성 섬유증 및 염증성 장 질병(예를 들어 크론병)의 치료에 사용하기 위한 장 오가노이드 또는 상기 장 오가노이드로부터 수득된 세포를 추가로 제공하며, 이때 상기 치료는 상기 치료가 필요한 환자내로 상기 오가노이드 또는 상기 위 오가노이드로부터 수득된 세포의 이식을 임의로 포함한다.
위 오가노이드 및 세포 집단의 용도
위 세포의 배양 방법은 WO 2010/090513에 기재되어 있다. 본 발명의 분화 배지 및 방법은 위에서 수득된 전구세포의 장내분비 세포 운명으로의 분화를 증대시킬 것으로 예상된다.
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 약제에 사용하기 위한, 예를 들어 위 질환, 상태 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 또는 재생 의학에 사용하기 위한 위 오가노이드 또는 상기 위 오가노이드로부터 수득된 세포를 제공한다.
본 발명은 위염, 위축성 위염, 유문 협착증, 위암 또는 소화성 궤양의 치료에 사용하기 위한 위 오가노이드 또는 상기 위 오가노이드로부터 수득된 세포를 추가로 제공하며, 이때 상기 치료는 상기 치료가 필요한 환자내로 상기 오가노이드 또는 상기 위 오가노이드로부터 수득된 세포의 이식을 임의로 포함한다.
췌장 오가노이드 및 세포 집단의 용도
췌장 세포의 배양 방법은 WO 2010/090513에 기재되어 있다. 본 발명의 분화 배지 및 방법은 췌장으로부터 수득된 전구세포의 장내분비 세포 운명으로의 분화를 증대시킬 것으로 예상된다.
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 약제에 사용하기 위한, 예를 들어 췌장 질환, 상태 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 또는 재생 의학에 사용하기 위한 췌장 오가노이드 또는 상기 췌장 오가노이드로부터 수득된 세포를 제공한다.
본 발명은 당뇨병(예를 들어 I형 또는 II형), 췌장염, 췌장암 또는 낭성 섬유증의 치료에 사용하기 위한 췌장 오가노이드 또는 상기 췌장 오가노이드로부터 수득된 세포를 추가로 제공하며, 이때 상기 치료는 상기 치료가 필요한 환자내로 상기 오가노이드 또는 상기 췌장 오가노이드로부터 수득된 세포의 이식을 임의로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 이식된 세포는 인슐린 분비 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 세포는 인슐린 분비 세포내로 이식후 추가로 성숙하는 전구세포이다.
폐 오가노이드 및 세포 집단의 용도
폐 세포의 배양 방법은 WO 2016/083613에 기재되어 있다. 본 발명의 분화 배지 및 방법은 폐로부터 수득된 상피 줄기세포의 장내분비 세포 운명으로의 분화를 증대시킬 것으로 예상된다.
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 의학에 사용하기 위한, 예를 들어 폐 질환, 상태 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 또는 재생 의학에 사용하기 위한 폐 오가노이드 또는 상기 폐 오가노이드로부터 수득된 세포를 제공한다.
본 발명은 소세포 폐암 또는 비-소세포 폐암(예를 들어 선암종, 편평세포 암종 또는 대세포 암종), 간질성 폐 질병, 폐렴(예를 들어 기질화 폐렴), 결핵, 낭성 섬유증, 기관지염, 폐 섬유증, 사르코이드증, II형 과형성증, 만성 폐쇄성 폐 질병, 폐기종, 천식, 폐 부종, 급성 호흡곤란 증후군, 천명, 기관지확장증, 한타바이러스 폐 증후군, 중동 호흡기 증후군(MERS), 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 또는 진폐증의 치료에 사용하기 위한 폐 오가노이드 또는 상기 폐 오가노이드로부터 수득된 세포를 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 병원체, 예를 들어 아데노바이러스, 코로나바이러스(예를 들어 SARS-CoV 또는 MERS-CoV), 인간 메타뉴모바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기융합 바이러스, 리노바이러스, 한타바이러스, 엔테로바이러스(예를 들어 엔테로바이러스 D68(EV-D68)), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 클라미도필라 뉴모니아에(Chlamydophila pneumoniae), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 콕시엘라 부르네티이(Coxiella burnetii), 하에모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 또는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)에 의해 야기된 병원성 질병의 치료에 사용하기 위한 폐 오가노이드 또는 상기 폐 오가노이드로부터 수득된 세포를 제공한다.
정지성 Lgr5+ 줄기세포
정지성 Lgr5+ 줄기세포는 생체내에 존재하지만, 이전에 시험관내에서는 생성되지 않았다. 본 발명자들은 놀랍게도 EGFR 경로의 억제가 시험관내에서 Lgr5+ 줄기세포의 정지를 유도할 수 있음을 발견하였다.
상응하게, 본 발명은 Lgr5+ 줄기세포에서 정지를 유도하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 하나 이상의 EGFR 경로 억제제로 처리함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다.
본 발명은 본 발명의 Lgr5+ 전구 줄기세포 정지의 유도 방법에 의해 수득된 정지성 줄기세포 집단을 추가로 제공하며, 여기에서 상기 세포는 Lgr5 및 Lef1을 발현하고 KI67 및 M기 마커 포스포-히스톤 H4를 발현하지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명의 정지성 줄기세포 집단을 포함하는 시험관내 배양물을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 정지 상태는 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일 또는 적어도 10일간 유지된다. 상응하게, 일부 실시태양에서, 상기 정지 상태는 적어도 7 내지 10일간 유지된다.
본 발명의 정지성 줄기세포 집단은 다수의 장점 및 용도를 나타낸다. 예를 들어, 상기 정지성 줄기세포 집단을 보관할 수 있으며(예를 들어 냉동기에서) 상기는 비-정지성 줄기세포 집단보다 더 효율적으로 다시 증식할 것이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 정지성 줄기세포 집단을 사용하여 줄기세포의 세포주기를 연구하거나 줄기세포의 세포주기 진입을 유도하는 분자를 식별한다.
약어
β-TrCP: β-트랜드듀신-반복부-함유 단백질
BME: 기저막 추출물
Cck: 콜레시스토키닌
CHGA: 크로모그라닌 A
DAPI: 4,6'-디아미디노-2-페닐인돌
EdU: 5-에티닐-2'-데옥시유리딘
EEC: 장내분비 세포
GIP: 위 억제성 단백질
GLP-1: 글루카곤-유사 단백질 1
GSK-3: 글리코겐 신타제 키나제 3
IDMI: IWP2, DAPT 및 MEK 억제제
LGR: 류신-풍부 반복부-함유 G 단백질-결합된 수용체
LRP: 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질
Nts: 뉴로텐신
PP1: 단백질 포스파타제 1
PP2A: 단백질 포스파타제 2A
PP2C: 단백질 포스파타제 2C
Sct: 세크레틴
Sst: 소마토스타틴
정의
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "포함하다"란 동사 및 그의 동사 활용형은 그의 비제한적인 의미로 상기 단어에 이어지는 항목이 포함되지만 구체적으로 언급되지 않은 항목들을 제외시키지 않음을 의미하는데 사용된다. 또한 "이루어진다"란 동사는, 필요한 경우 "로 필수적으로 이루어진다"에 의해 대체될 수 있으며, 본 명세서에 정의된 바와 같은 생성물이 구체적으로 나타낸 것들 외에 추가적인 성분(들)을 포함할 수 있고, 상기 추가적인 성분(들)이 본 발명의 독특한 특성을 변경시키지 않음을 의미한다. 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 방법은 구체적으로 나타낸 것들보다 추가적인 단계(들)를 포함할 수 있으며, 상기 추가적인 단계(들)는 본 발명의 독특한 특성을 변경시키지 않는다. 또한, 부정관사 "하나의"에 의한 하나의 요소의 언급은, 문맥상 상기 요소 중 하나 및 오직 하나만이 존재할 것을 명백히 요구하지 않는 한, 상기 요소가 하나를 초과하여 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 상기 부정관사 "하나의"는 따라서 대개는 "적어도 하나"를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약" 또는 "대략적으로"란 용어는 나타낸 값이 +/-10%까지 변화할 수 있음을 의미한다. 상기 값을 또한 정확한 값으로 읽을 수 있으며 따라서 "약"이란 용어를 생략할 수 있다. 예를 들어, "약 100"이란 용어는 90 내지 110 및 또한 100을 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고문헌들은 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다.
하기의 실시예들은 단지 예시를 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떠한 식으로도 제한하고자 하지 않는다.
"장"이란 용어는 결장 및 소장을 포함한다.
[도면의 간단한 설명]
도 1. EGFR 억제는 장 오가노이드에서 세포주기 종료를 유도한다. (A) 실험 셋업. 오가노이드를 BME 중에 도말후 1주째에 EGFR(또는 MEK/ERK 억제제) 또는 DMSO로 처리하였다. 샘플을 처리후 1(d1), 2(d2), 4(d4) 또는 7(d7)째에 수집하였다. 상기 과정을 재도말 실험을 향해 상기 처리 단계로부터 반복하였다. (B) 대조용(ENR) 또는 EGFR 억제(EGFRi)에서 4일후 장 오가노이드. Lgr5GFPiresCreER 형광이 EGFRi 처리에 이어서 증가한다. RFP 채널을 사용하여 배경을 나타낸다. 하부 패널들은 명시야 상들이다. (C) 장 오가노이드의 세포주기의 분석. EdU를 희생 1h 전에 투여하였다. 대조용(ENR) 오가노이드는 연속해서 EdU(상부 패널)를 통합하고 KI67(하부 패널)을 발현하는 반면, EGFRi 처리된 오가노이드는 시간이 지남에 따라 세포주기를 종료한다. (D) C의 정량분석. (E) 대조용 또는 EGFRi 처리된 오가노이드의 DNA 함량의 훽스트 분석. 좌측 피크는 EGFRi 처리된 오가노이드이고 우측 피크는 ENR 배지 중 대조용 오가노이드이다. 우측 막대들은 3개의 독립적인 실험들의 정량분석을 도시한다. 상기 막대의 상부 밴드는 G2/M 기의 세포를 나타내고, 상기 막대의 중간 밴드는 S 기의 세포를 나타내고, 상기 막대의 기부 밴드는 G0/G1 기의 세포를 나타낸다. (F) 배양 배지 중 EGF의 재도입에 따른 장 오가노이드의 세포주기의 분석. (G) Lgr5GFPiresCreER+ 세포는 4일의 EGFRi 처리시 상기 세포주기를 종료한다. 포스포-히스톤 H3(pH3) 염색을 사용하여 M 기를 시각화한다. 기부의 그래프는 정량분석을 나타낸다. DAPI를 사용하여 핵을 시각화한다. 스케일 바 = 50 ㎛.
도 2. EGFR 신호전달 유도된 세포주기 종료는 MAPK 신호전달 경로에 의해 매개된다. (A) EGFR 억제에 따른 ERK 인산화의 조직학적 분석. pERK는 24h에 걸쳐 점차적으로 급속하게 상실되나, 48시간에 걸쳐 낮게 유지된다(상부 패널). 상기 기간은 오가노이드의 세포주기 종료와 일치한다(KI67 염색, 하부 패널). (B) 아파티니브를 사용하는 Mek 또는 Erk의 단일 억제뿐만 아니라 EGFR 및 ErbB-2의 동시 억제는 제피티니브 유도된 EGFR 억제와 유사한 결과를 생성시킨다. EdU를 희생 1시간 전에 배양 배지에 가한다. 중간 패널은 Lgr5GFPiresCreER 대립유전자로부터의 내인성 GFP 발현을 도시한다. 하부 패널은 명시야 상들이다. DAPI를 사용하여 핵을 시각화한다. 스케일 바 = 50 ㎛.
도 3. 계통 추적은 qLgr5+ 세포가 줄기 세포임을 가리킨다. (A) 실험 셋업. 오가노이드를 해리후 7일째에 ENR(대조용) 또는 EGFRi 배지에서 BME 중에 재-도말하였다. 상기 처리후 4일째에, 16시간 동안 4'OH 타목시펜(T)으로 재조합을 유도하고 EGF 신호전달을 복원시켰다. 오가노이드를 타목시펜 유도후 4 또는 12일째에 수집하거나, 2 라운드 동안 ENR 중에 재-도말하였다. (B) 재조합된 (YFP+) 세포는 CHGA+ EEC, LYZ+ 파네스 세포(좌측 패널) 또는 정점 액틴 및 아세틸화된 투불린 밀집 다발에 의해 식별되는 술세포(우측 패널)를 생성시킨다. 활동성(상부 패널) 및 정지성(하부 패널) Lgr5+ 세포를 추적하였다. (C) B의 정량분석. 각 막대의 기부 밴드는 CBC이고, 상기 기부 밴드 바로 위의 밴드는 EEC이고, 다음 위의 밴드는 파네스 세포이고 다음 위의 밴드는 술세포이고 각 막대의 상단 밴드는 휴지세포이다. (D) 재조합된(X-Gal 염색에 의해 식별됨) 활동성(상부 좌측 패널) 및 정지성(하부 좌측 패널) Lgr5+ 세포는 다능성을 나타내는 전체 오가노이드를 생성시킨다. 재조합된 Dclk1+ 세포(우측 패널)는 어느 조건에서도 증식하지 않았다. 스케일 바 = 50 ㎛.
도 4. RNA 서열분석은 qLgr5+와 aLgr5+ 줄기세포간의 핵심 분자 차이를 식별한다. (A) 대조용(ENR) 또는 EGFR 억제된(EGFRi) 조건으로부터 Lgr5GFPDTR (Lgr5DTR), Lgr5GFPiresCreER (Lgr5GFP)를 사용하여 분류된 Lgr5+ 세포 및 Dclk1GFPiresCreER (Dclk1) 대립유전자를 사용하여 분류된 술세포의 전체 전사물의 계층 분석. 대조용 오가노이드를 참조로서 가하였다. (B) 주성분 분석(PCA). (C) 활동성 및 정지성 Lgr5 세포의 비교를 도시하는 화산 플롯. X축은 조절된 p 값(q 값, -log10)을 나타내고 y축은 변화 배수(log2)를 나타낸다. 회색 점은 0.01 미만의 오류 발견률(FDR)을 갖는 유전자를 가리키고, 검은색 점은 유의수준의 변화가 없는 유전자를 나타낸다. (D) Lgr5+ 세포에서 EGFR 억제에 의해 차별적으로 조절되는 유전자를 나타내는 열지도. 색상은 각 열(유전자)의 z값을 가리킨다. (E) 마커 유전자의 정규화된 발현 값을 나타내는 상자 플롯이다. (F) 개별적인 활동성 및 정지성 Lgr5+ 세포의 전체 전사체의 피어슨 상관성의 k-평균 군집화를 나타내는 열지도.
도 5. 고순도 EEC 배양물의 유도. (A) EEC(CHGA) 및 파네스 세포(LYZ)의 마커 분석. 오가노이드를 노취 억제제 DAPT(D), Wnt 분비의 억제제 IWP-2(I), 제피티니브(EGFRi) 또는 이들 처리제의 조합으로 4일 동안 처리하였다. DMSO를 대조용으로서 사용한다. (B) Wnt 및 노취 신호전달 경로와 함께 Mek 신호전달의 억제(Meki)는 유사하게 EEC 세포수를 증가시킨다. 짙은 회색 및 밝은 회색 V-모양 화살표는 도면의 좌측 절반에서 각각 높은 SCT 및 높은 GIP 발현 영역을 가리킨다. 짙은 회색 및 밝은 회색 V-모양 화살표는 도면의 좌측 절반에서 각각 높은 CCK 및 높은 SST 발현 영역을 가리킨다. 위 억제성 단백질(GIP), 세크레틴(SCT), 소마토스타틴(SST) 및 콜레시스토키닌(CCK) 양성 세포수는 대단히 증가한다. (C) 오가노이드 중 EEC 관련 마커 유전자 발현의 qPCR 분석. EI: EGFRi 및 MI: Meki. 스케일 바 = 50 ㎛. 오차 막대는 표준 편차를 가리킨다.
도 6. 단세포 전사체 프로파일링은 유도된 EEC들 가운데 이질성을 밝혀낸다. (A) Meki 및 EGFRi 실험으로부터 개별적인 생 오가노이드 세포의 전체 전사체의 피어슨 상관성의 k-평균 군집화를 나타내는 열지도. 숫자는 클러스터를 가리킨다. 색상은 전체 세포 전사체의 피어슨 상관성을 암호화한다. (B) 세포 그룹에 의해 발현된 개별적인 세포 및 마커 유전자를 묘사하는 t-SNE 지도. (C) 각 유전자의 log2 변환된 색상 암호화된 전사체 카운트를 나타내는 t-SNE 지도. (D) 클러스터 2, 5, 6 및 7 중 각 유전자의 색상-암호화된 전사체 카운트를 나타내는 열지도.
도 7. Lgr5+ 세포의 증식에서 니치 신호전달 경로의 역할. (A) 내인성 Lgr5GFPDTR 형광(상부 패널, x축) 및 KI67efluor660 면역염색(하부 패널, x축)을 도시하는 FACS 플롯. PL3 채널을 사용하여(y축) 배경을 구별한다. 게이트는 야생형 대조용에 대한 양성 세포를 나타낸다. (B) Lgr5GFPiresCreER 및 Rosa-TOPCFP 대립유전자를 사용하는 대조용(ENR) 및 EGFR 억제된(EGFRi) 오가노이드의 명시야(상부) 및 형광(하부) 상들. RFP 채널을 사용하여 배경을 구별한다. (C) EGFRi 처리후 4일째에 Lgr5GFPiresCreER+ 세포의 마커 유전자 분석. 밝은 회색 및 짙은 회색 V-모양 화살표는 좌측 상에서 각각 높은 CHGA 및 LYZ 발현 영역을 가리킨다. 중간 및 우측 상에서, 밝은 회색 V-모양 화살표는 높은 팔로이딘 발현 영역을 가리킨다. (D) 4일 EGFRi 처리된 오가노이드에서 마커 유전자 발현의 qPCR 분석. (E) 각각의 대조용(DMSO 처리된, 동일한 배양 일수)에 비해 1(d1), 3(d3) 또는 5(5d)일 동안 EGF 신호전달의 재도입에 따른 마커 단백질 양성 세포의 상대적인 수. (F) EGF 회수(NR) 또는 EGFRi 처리(2xNR+EGFRi)의 반복된 주기후 EGF 도입에 따른 오가노이드의 세포주기 진입. (G) F의 정량분석. 스케일 바 = 50 ㎛. 오차 막대는 표준 편차를 가리킨다. 기호 설명: ENR = EGF, 노긴 및 R-스폰딘1; -R = R-스폰딘 1 철회; -N = 노긴 철회; EGFRi = EGFR 신호전달의 억제(배양 배지로부터 EGF의 철회에 의해 동반되는 제피티니브 사용).
도 8. EGFRi 처리후 오가노이드의 세포 조성. (A) 대조용(ENR) 또는 EGFRi 처리된 오가노이드의 파라핀 섹션상의 알시안 블루, PAS 및 뮤신2(MUC2) 염색. (B) 파네스 세포(LYZ) 및 EEC(CHGA) 마커에 대해 염색된 전체 오가노이드의 3D 재구성. 2개의 세포 유형 모두 대조용에 비해 EGFRi 처리된 오가노이드(하부 패널)가 보다 많이 농축되어 있다. 우측 그래프는 정량분석을 제공한다. (C) Dclk1GFPiresCreER 대립유전자의 내인성 형광을 사용하여 시각화한, 술세포 수는 대조용(좌측 패널)에 비해 EGFRi 처리(우측 패널)후 증가한다. GFP 형광은 EEC(CHGA) 또는 파네스 세포 마커(LYZ)와 겹치지 않는다. 스케일 바 = 50 ㎛.
도 9. Lgr5+ 세포 특징의 유전자 온톨로지(GO) 용어 및 단세포 분석. (A) Lgr5 세포에서 EGFRi 처리후 하향조절된 유전자의 GO 용어 분석(레비고(Revigo) 사용). 세포주기 및 분열관련 용어뿐만 아니라 소분자 생합성(모두 세포주기 진행과 관련된다)은 정지성 Lgr5+ 세포에 비해 활동성에서 현저하게 더 높다. x-축은 p-값(-log10)을 가리키고, y축은 GO 용어 세트의 크기를 도시한다. (B) 서열분석된 Lgr5+ 세포의 분포를 나타내는 t-SNE 지도. (C) 각각 파네스 세포 및 술세포를 식별하는데 사용되는 Lyz 및 Dclk1 mRNA의 log2 변환된 색상 암호화된 전사물 수준을 나타내는 t-SNE 지도.
도 10. 유도된 EEC 오가노이드의 단세포 서열분석의 초기 분석. (A) RaceID에 의해 식별된 클러스터들의 분석을 나타내는 t-SNE 지도. (B) IDEGFRi 및 IDMeki 실험으로부터 유래된 세포의 분포를 비교하는 t-SNE 지도. (C) 장세포의 식별에 사용되는 Apoa1 mRNA의 log2 변환된 색상 암호화된 전사물 수준을 나타내는 t-SNE 지도.
장 전구세포 운명의 요약. 장 전구세포는 다수의 세포 유형들, 예를 들어 장세포, 배상세포, 파네스 세포 또는 장내분비 세포로 분화할 수 있다. Wnt 억제와 결합된 노취 활성화가 장세포 분화를 촉진함은 앞서 공지되었다. 또한 Wnt 활성화와 결합된 노취 억제는 파네스 세포 분화를 촉진할 수 있음도 공지되었다. 또한, Wnt 및 노취 억제는 배상세포 분화를 촉진할 수 있음이 공지되었다. 그러나, 이전에는 장내분비 세포 분화를 어떻게 증대시키는가에 관한 이해는 없었다.
도 11. EEC 배양물의 조성. IDMI 분화 배지에 의한 처리는 주로 엔테로크로마핀 분화를 향해 편향된 분화를 생성시켰다. 오가노이드당 EEC의 절대적인 증가는 주로 엔테로크로마핀 세포이다. GLP1, CCK, NTS, STT 및 GIP 생산 세포는 보다 적은 정도로 제공된다.
도 12. 상이한 EEC 분화 프로토콜에서 메신저 RNA 수준을 나타내는 qPCR 결과. 막대 그래프는 대조용에 비해 다양한 EEC 마커의 mRNA 발현 배수를 나타낸다. BMP 경로의 활성화는 TAC1(엔테로크로마핀 세포의 마커)의 댓가로 세크레틴 메신저 RNA를 선택적으로 증대시킨다. BMP4를 사용하여 상기 BMP 경로를 활성화시켰으며 상기는 10 ㎍/㎖의 농도로 제공되었다. 기본 조건: IDMI(IWP2, DAPT 및 MEK 억제제). MHY1485는 5 μM의 농도로 시험된 mTOR 활성제이다. 비스모게니브는 5 μM의 농도로 시험된 헤지호그 억제제(구체적으로 스무든드 억제제)이다.
도 13. 상이한 장내분비 분화 프로토콜에서 세크레틴 및 GIP 염색. BMP 경로의 활성화는 S 세포의 수를 크게 증대시킨다.
도 14. 상이한 장내분비 분화 프로코톨에서 세로토닌 염색. BMP 경로의 활성화는 엔테로크로마핀 세포의 수를 감소시킨다.
도 15. 표준 분화 배지와 비교된 EEC 분화 프로토콜에서 상이한 EEC 마커의 메신저 수준의 log2-변화를 도시하는 qPCR 결과. EEC 분화 배지는 인간 오가노이드에서 EEC의 수를 크게 증대시키지만, 파네스 세포는 아니다.
도 16. 상이한 장내분비 분화 프로토콜에서 CHGA 발현.
도 17. 노취, Wnt 및 MEK의 삼중 억제는 EEC가 풍부한 배양물을 생성시킨다. 오가노이드당 30 내지 80%의 CHGA+ 세포가 관찰되었다.
도 18. EEC 배양물에서 호르몬 발현. EEC의 모든 상이한 하위유형들이 IDMI 배양물 중에 존재하며 단일 호르몬을 발현한다. 일부 세포는 CHGA-이나 호르몬에 대해서는 양성이다.
도 19. 배양물에서 EEC에 의한 호르몬 분비. 2-일 배양 배지를 -포스콜린 결과에 대해 수집하였다. 이어서 상기 배양물을 1시간 동안 포스콜린으로 유도하고 배지를 +포스콜린 결과에 대해 수집하였다.
도 20. 장움 및 융털에서 Tac1, GLP1 및 세크레틴 면역반응성 세포의 차별적인 국소화 A-C) PYY-GLP1 이중 양성 세포가 상기 움에 위치하는 반면, 상기 융털 중의 L-세포는 GLP1의 발현을 상실한다 D-E) 세포토닌을 발현하는 상기 움 중 엔테로크로마핀 세포는 Tac1을 동시-발현한다. 상기 융털 중에서 Tac1 발현은 상실되며, 이때 엔테로크로마핀 세포는 세크레틴을 동시-발현하기 시작한다.
도 21. BMP 신호전달은 융털 호르몬 특징의 구동인자이다. A) BMP 신호전달이 노긴의 존재에 의해 억제되는 장내분비 세포 분화(Wnt, 노취 및 MAPK의 억제) 배지는 움의 호르몬 특징 연상(reminiscent)을 생성시킨다: 세크레틴은 존재하지 않으며, 세로토닌+ EEC는 항상 Tac1을 동시-발현한다. 노긴의 제외 및 BMP4의 상기 분화 칵테일(EEC BMPhigh로서 정의됨)에의 도입은 Tac1뿐만 아니라 GLP1 수를 크게 감소시킨다. 단일 세로토닌+ 장내분비 세포뿐만 아니라 세크레틴+ 세포가 상기 배지 중에 존재한다. B) A)의 정량분석 C) BMP 저 또는 고 EEC 분화 배지 중 소장 오가노이드의 명시야 상. GCG-비너스(Venus) 리포터를 사용하여 GLP1 양성 세포를 추적하였다. 상기 상이한 분화 프로토콜이 형태학적으로 구분할 수 없는 오가노이드를 생성시키지만, GLP1 발현은 BMP 활성화의 배경에서 크게 감소한다.
도 22. 생체내 BMP 신호전달의 억제는 GLP1+ 구획의 확대를 야기하고 세크레틴 발현을 억제한다. A) LDN193189에 의한 마우스의 경구 위관영양을 통한 60시간 처리는 GLP1 수의 확대를 야기한다. GLP1은 융털에서 L-세포에 의해 광범위하게 발현되며, 상기 세포는 PYY를 항상 동시-발현하지는 않는다. B) 세크레틴은 대조용 처리된 경우에 비해 BMPR 억제된 마우스의 융털에서 크기 감소된다.
실시예
물질 및 방법
오가노이드 배양
기본 배양 배지(페니실린/스트렙토마이신, 10 mM HEPES, 글루타맥스, B27[라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재] 및 1 mM N-아세틸시스테인[시그마]이 보충된 어드밴스드 둘베코의 변형된 이글 배지/F12)에 "ENR" 배지라 칭하는, 50 ng/㎖의 쥐 재조합 상피 성장인자(EGF; 페프로테크(Peprotech), 독일 함부르크 소재), R-스폰딘(순화 배지, 5% 최종 부피) 및 노긴(순화 배지, 5% 최종 부피)을 보충하였다. 순화 배지는 HA-마우스 Rspo1-Fc(스탠포드 대학의 캘빈 쿠오(Calvin Kuo)로부터의 선물)로 안정하게 형질감염되거나 또는 마우스 노긴-Fc 발현 벡터에 의한 일시적인 형질감염후의 HEK293T 세포를 사용하여 생성되었다. 페니실린/스트렙토마이신 및 글루타맥스가 보충된 어드밴스드 둘베코의 변형된 이글 배지/F12를 1주일 동안 컨디셔닝하였다. 세포를 BME(트레비젠(Trevigen))에 도말하였다. EGF 신호전달의 억제를 위해서, 세포를 제피티니브(5 μM; 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)로 처리하고 EGF를 상기 배지로부터 철회하였다. Wnt 분비를 IWP-2(1.5 μM; 시그마 알드리치)로 억제하고 노취를 DAPT(1 mM, 시그마 알드리치)로 억제하였다. 모든 처리는 오가노이드 계대배양후 5일째에 수행되었다. EGFR 재활성화 실험을 위해서, 오가노이드를 EGFR 억제제가 확실히 세척된 신선한 BME 및 ENR 배지에 재도말하였다. Cre-ERT 활성의 유도를 위해서, 오가노이드를 4-하이드록시 타목시펜(1 uM)으로 O/N 처리하였다. 모든 대조용 오가노이드를 유사한 농도의 화합물 용해제, 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 처리하였다. 처리중, 세포를 EVOS 현미경(일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈(Electron Microscopy Sciences))으로 영상화하였다.
장내분비 분화의 유도를 위해서, 세포를 ENR 또는 ENR 플러스 발프로산 및 CHIR99021(Yin et al. (2014) Nature methods 11:106-112)에서 배양하였다. 5일의 배양후에, 배지를 제거하고 오가노이드를 PBS로 세척하였다. EEC 분화용 칵테일은 IWP2(1.5 μM; 시그마 알드리치), DAPT(1 mM, 시그마 알드리치) 및 MEK 억제제 PD0325901(5 μM; 시그마 알드리치)을 포함하였다.
면역염색
전체 오가노이드를, 빙냉 PBS에 매트리젤을 서서히 용해시킴으로써 수집하고 후속적으로 4% 파라포름알데히드 중에서 4 ℃에서 밤새 고정시켰다. 이어서, 오가노이드를 투과화시키고 실온에서 30분 동안 0.5% 트리톤 X-100 및 2% 정상 당나귀 혈청(잭슨 임뮤노리써치(Jackson ImmunoResearch))을 함유하는 PBS 중에서 차단하였다. 오가노이드를 실온에서 2시간 동안 1차 항체를 함유하는 차단 완충제 중에서 배양하였다. 사용된 1차 항체는 토끼 항-리소자임(1:500; DAKO), 염소 항-크로모그라닌 A(1:500; 산타 크루즈), 마우스 항-Ki67(1:250; BD 파밍겐(Pharmingen)), 토끼 항-포스포-히스톤 3(pH3 Ser10; 1:1000; 밀리포어(Millipore)), 마우스 항-사이토케라틴 20(1:1000; Dako), 염소 항-콜레스토시스토킨(sc-21617, 1:100; 산타 크루즈), 토끼 항-뉴로텐신(sc-20806, 1:100; 산타 크루즈), 염소 항-세크레틴(sc-26630, 1:100; 산타 크루즈), 염소 항-소마토스타틴(sc-7819, 1:100; 산타 크루즈), 토끼 항-위 억제성 단백질(ab22624-50, 1:500, 애브캠(Abcam)), 토끼 항-글루카곤 유사 펩티드 1(ab22625, 1:500, 애브캠) 및 마우스 항-아세틸화된 투불린(1:100; 산타 크루즈)이었다. 오가노이드를 DAPI(1;1000, 인비트로젠)를 함유하는 차단 완충액 중에서, 상응하는 2차 항체 알렉사488, 568 및 647 접합된 항-토끼, 항-염소 및 항-마우스(1:1000; 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))와 함께, 또는 팔로이딘 텍사스 레드(1:1000; 라이프 테크놀로지스)와 함께 배양하였다. EdU 통합을, EdU(10 uM)와 1시간 예비-배양후에 클릭-iT 분석 키트(써모 피셔(Thermo Fisher))를 사용하여 시각화하였다. LacZ 염색을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Barker et al. (2007) Nature 449(7165):1003-7). 조각들을 벡타쉴드(Vectashield)(벡터 랩스(Vector Labs)) 중에 포매하고 Sp5 및 Sp8 공초점 현미경(레이카(Leica))을 사용하여 영상화하였다. 상 분석을 이미지J 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
FACS 분류
LGR5 및 KI67 발현의 FACS 분석을 위해, Lgr5GFPDTR 오가노이드를 먼저, 37 ℃에서 15분의 트립신 처리(TrypLE 익스프레스; 라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)후에, 기계적 붕괴를 통해 단세포로 해리시켰다. 단세포를 30분 동안 4% 파라포름알데히드를 사용하여 빙상에 고정시키고, PBS 중에서 3회 세척하였다. 세포를 0.5% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 중에서 30분 동안 투과화시키고, 빙상에서 30분 동안 eFluor-660 접합 래트 항-KI67(1:1000; 이바이오사이언스) 항체로 염색하였다. 세포주기 분석을 위해서, 세포를 1 ug/㎖의 훽스트 33342(써모피셔) 중에서 염색하였다. 후속적으로, 염색된 세포를 BD FACS Calibur(BD 바이오사이언시즈)상에서 분석하였다.
발현 분석을 위해서, 오가노이드를 해리시키고 BD FACS Aria(BD 바이오사이언시즈)상에서 즉시 분류하였다. 세포를 96웰 플레이트에서 트리졸(Trizol) 중에서 단세포로서 또는 에펜도르프 튜브에서 트리졸 중에서 벌크로서 분류하였다.
RNA 단리
RNA-서열분석을 위해서, 세포를 트리졸(라이프 테크놀로지스)로 분류하고 전체 RNA를 하기의 변경과 함께, 제조사의 설명에 따라 단리하였다. RNA를 2 ug 글리코겐(라이프 테크놀로지스)으로, -20 ℃에서 밤새 침전시켰다. 384-웰로 분류된 세포에 대해서 추가적인 RNA 단리 단계를 사용하지 않았다. 정량적인 PCR 분석을 위해서, RNA를 제조사의 프로토콜에 설명된 바와 같이 RNAeasy 키트(퀴아겐(QIAGEN))를 사용하여 오가노이드로부터 단리하였다.
정량적인 PCR
PCR 분석을 기재된 바와 같이 SYBR 그린(Green) 및 바이오 래드(Bio-Rad) 시스템을 사용하여 수행하였다(Munoz et　al. (2012) The EMBO Journal 31:3079-3091). PCR 반응을 모든 프라이머에 대해 표준 곡선으로 3회 중복하여 수행하였다. 발현의 변화를 CFX 매니저 소프트웨어(바이오 래드(Bio-Rad))를 사용하여 산정하였다. 프라이머들은 NCBI 프라이머 설계 도구를 사용하여 설계되었다.
유전자명 센스 올리고 안티센스 올리고
Ki67 CCAGCTGCCTGTAGTGTCAA TCTTGAGGCTCGCCTTGATG
Ccnb2 GCCAAGAGCCATGTGACTATC CAGAGCTGGTACTTTGGTGTTC
Lgr5 ACCCGCCAGTCTCCTACATC GCATCTAGGCGCAGGGATTG
Atoh1 GCTGTGCAAGCTGAAGGG TCTTGTCGTTGTTGAAGG
ChgA CAGCTCGTCCACTCTTTCCG CCTCTCGTCTCCTTGGAGGG
Lyz GGAATGGATGGCTACCGTGG CATGCCACCCATGCTCGAAT
Gob5 ACTAAGGTGGCCTACCTC CAA GGAGGTGACAGTCAAGGTGAGA
Alpi AGGATCCATCTGTCCTTTGG ACGTTGTATGTCTTGGACAG
Sct GACCCCAAGACACTCAGACG TTTTCTGTGTCCTGCTCGCT
Glu CTTCCCAGAAGAAGTCGCCA GTGACTGGCACGAGATGTTG
Cck GAAGAGCGGCGTATGTCTGT CCAGAAGGAGCTTTGCGGA
Sst GACCTGCGACTAGACTGACC CCAGTTCCTGTTTCCCGGTG
Gip AACTGTTGGCTAGGGGACAC TGATGAAAGTCCCCTCTGCG
Nts TGCTGACCATCTTCCAGCTC GAATGTAGGGCCTTCTGGGT
단세포 및 벌크 서열분석
RNA 샘플을 이전에 기재된 바와 같이 CEL-seq 프로토콜의 변형된 버전을 사용하여 제조하였다(Grun et al. (2015) Nature 525:251-255; Hashimshony et al. (2012) Cell reports 2:666-673). ERCC 스파이크-인을 상기 트리졸 용액에 가하였다. RNA 펠릿을 프라이머 믹스에 용해시키고 70 ℃에서 2분간 배양하였다. 384-웰에 분류된 세포를 65 ℃에서 5분간 직접 용해시켰다. cDNA 라이브러리를 75-bp 대응-단부 서열분석을 사용하여 일루미나(Illumina) NextSeq500상에서 서열분석하였다.
RNA 서열분석 데이터의 분석.
대응-단부 판독을 하기를 제외하고, 이전에 기재된 바와 같이 정량분석하였다(Grun et al. (2015) Nature 525:251-255). 정렬되지 않았거나 또는 다중 장소로 정렬된 판독은 버렸다. 벌크 서열분석의 분석을 위해서, UMI는 무시하였으며; 대신에 각 전사물에 대한 판독 카운트를 상기 전사물에 대해 독특하게 맵핑된 판독의 수에 의해 측정하였다. 상기 카운트를 모든 전사물에 대해 맵핑된 판독의 총수로 나누고 100만을 곱하여 백만당 판독(RPM) 카운트를 생성시켰다. RMP을 RPKM보다 우선적으로 사용하였는데 그 이유는 CEL-seq는 오직 3' 단부 서열분석만을 허용하기 때문이다. 차별적인 유전자 발현을 R 플랫폼 중의 DESeq 패키지를 사용하여 평가하였다(Anders and Huber (2010) Genome biology 11:R106). 사용된 컷오프는 조절된 p-값<0,1 및 FDR<0,1 및 비교된 집단에 적어도 2배 차이였다. 비율계량 분석이 불가능한 판독을 갖지 않는 샘플을 방지하기 위해서, 모든 0 판독을 비율 계산 및 log2 전환에 앞서 0,1 판독으로 전환하였다. 유전자 온톨로지 분석을 레비고(Revigo)(Supek et al. (2011) PloS one 6:e21800) 및 고릴라(Gorilla)(Eden et al. (2009) BMC bioinformatics 10:48) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 단세포 서열분석 데이터를 이전에 기재된 바와 같이 분석하였다(Grun et al. (2015) Nature 525:251-255).
실시예 1
Lgr5+ 줄기세포가 주기 중에 어떻게 유지되는지를 이해하기 위해서, 우리는 움 니치에서 활성인 핵심 신호전달 경로를 조작하였다. 모든 세포주기 단계에서 순환 세포의 마커, KI67에 대한 항체를 갖는 Lgr5GFPDTR 오가노이드의 유식 세포측정 분석은 상기 Lgr5+ 세포주기의 대부분을 입증하였다(도 7). 우리는 2개의 독립적인 방법을 사용하여 Wnt 신호전달을 억제하였다; i) IWP-2 처리는 파네스 세포에 의한 Wnt3 분비를 억제하고, ii) 배양 배지로부터 R-스폰딘1의 철회는 세포 표면으로부터 프리즐드 수용체를 상실시킨다. R-스폰딘1 철회는 즉시 Lgr5GFP 발현의 상실을 야기한다(도 7A). IWP 처리는 증식을 통해 리간드의 희석에 의존하는 보다 순한 Wnt 억제를 띤다. Lgr5GFP 발현은 줄기세포가 분화되면서 점진적으로 하향조절된다. 아직, 남아있는 Lgr5GFP 세포는 KI67 발현을 유지하였다(63.5±2.8% 대 대조용에서 94.4±2.1%). 상기 BMP 억제제 노긴의 철회 또는 노취 억제제 DAPT의 첨가는 모두 GFP+ 세포수의 급속한 감소를 유도하였지만, 상기 남아있는 Lgr5 세포의 증식에는 영향을 미치지 않았다(노긴 철회에서 82.3±1.4%, DAPT에서 45.1±10%)(도 7). 이어서, 우리는 배양 배지로부터 EGF의 철회에 의해 동반되는 제피티니브를 사용하여 EGFR 신호전달을 억제하였다(EGFRi 처리, 도 7). Lgr5GFP 발현은 지속되는 반면, Lgr5 세포는 최종적으로 KI67 발현을 상실하였으며(13.1±1.0%), 이는 세포 주기로부터의 종료를 가리킨다.
우리는 EGFR 억제와 관련된 초기 사건들을 추가로 분석하였다(도 1A). 상기 오가노이드의 '융털' 구획의 광범위한 세포사멸에도 불구하고, Lgr5+(Lgr5GFPiresCreER) 세포를 함유하는 움 구조를 닮은 싹들이 1주일까지 지속되었다(도 1B). 우리는 Lgr5GFPDTR 대립유전자(Tian et al. (2011) Nature 478:255-259)를 사용하여 이러한 결과를 확인하였으며 이는 EGF 신호전달 부재하에서의 CBC의 생존을 입증한다(도 7). 4일의 EGFRi 처리후에, Lgr5+ 세포는 상기 오가노이드의 44.4±0.8%(대조용에서 13.6±6.5%)를 구성하였다(도 7). TCFCFP(RosaTCF-CFP) Wnt 리포터 대립유전자(Serup et al. (2012) Disease models & mechanisms 5:956-966)는 Wnt 신호가 비-증식성 Lgr5 세포 중에 높게 남아있음을 입증하였다(도 7). KI67 단백질은 처음 24h 동안 지속되었으나 48시간 진행으로부터 상실되었다(도 1C 및 1D). DNA를 복제하는 세포의 척도로서 EdU의 짧은 펄스를 사용하여, 우리는 EGFRi가 24h만큼 빨리 DNA 복제의 신속한 중단을 유도하고, 이는 적어도 1주일간 지속됨을 발견하였다(도 1C 및 1D). S기로부터 및 결국 세포주기로부터의 종료와 일관되게, 훽스트 DNA 염색을 사용하는 EGFRi 처리된 오가노이드의 DNA 함량 표지화는 모든 세포가 G0/G1 기에 있음을 입증하였다(도 1E). EGFRi 처리후 4일째에, EGF 신호전달의 재구성은 24h 이내에 신속한 세포주기 진입(KI67+) 및 48h 이내에 S기로의 진행(EdU+)을 유도하였다(도 1F 및 7). EGFRi 처리의 제2 주기후에조차, 정지성 Lgr5 세포는 상기 세포주기에 재-진입하였다(도 7).
이어서 우리는 분열하지 않는, EGFRi 유도된 Lgr5+ 세포의 분석을 추가로 재정의하였다. 상기는 세포주기 마커 KI67 및 M기 마커 pH3가 없었으며, EGFRi 처리 동안 드물게 세포 분열이 지속됨을 제외하고, EdU를 통합하지 않았다(도 1G). 리조자임(LYZ) 및 크로마그라닌A(CHGA)의 결여는 상기 Lgr5+ 세포가 각각 분화된 파네스 세포 또는 장내분비 세포(EEC)가 아님을 의미하였다(도 7). 술세포(장 M-세포)는 또한 기생충 침입에 응답하여 수반되는 희귀한 기계감각 세포이다(Howitt et al. (2016) Science 351:1329-1333). 상기는 아세틸화된 투불린 및 팔로이딘에 의해 표시되는, 전형적인 정점 액틴 다발에 의해 구분될 수 있다(Hofer and Drenckhahn (1996) Histochemistry and cell biology 105:405-412). 상기 Lgr5+ 세포의 대다수는 술세포 형태를 나타내지 않았으며, -유사하게- 술세포는 대개 Lgr5-이었다(도 7). 정량적인 PCR 분석은 상기 Lgr5 세포가 장세포, 파네스, EEC, 배상세포 또는 술세포로 분화하지 않음을 입증하였다(도 7).
점막 구조를 시각화하기 위한 Muc2(뮤신 2)뿐만 아니라 PAS 및 알시안 블루 염색은 EGFRi 처리후 배상 세포수의 현저한 감소를 밝혀내었다(도 S2). 분열하는 TA 전구세포의 대부분은 성숙한 장세포를 생성시킨다. 우리는 EGFRi 처리후 4일째에 싹당 LYZ+ 파네스 세포 및 CHGA+ 장내분비세포 수의 증가를 발견하였지만, 어느 한 세포 유형의 총수(오가노이드당)도 그다지 변하지 않았다(도 8). 술세포의 총수는 EGFRi 처리에 따라 증가하였다(도 S2). 우리는 Dclk1GFPiresCreER 대립유전자(Nakanishi et al. (2013))를 사용하여 이들 결과를 확인하였으며, 이는 EGFRi 처리가 Dclk1+ 술세포의 절대수를 3.2배 증가시킴(ENR에서 11.3±6.6, EGFRi에서 35.8±8.8)을 입증한다(도 9). 간단히, EGFR 억제는 오가노이드 중 세포 유형 조성에 영향을 미치지만, 상기는 장 계통 중 하나로의 분화를 유도하지 않으면서 Lgr5+ 세포를 정지성이 되게한다.
MAPK 신호전달은 EGFR 신호전달 경로의 주요 하류 표적이며 세포 주기 진행을 조절한다. KAPK 키나제(Mek)는 MAPK(Erk)를 인산화하여 그의 핵 국소화 및 활성화를 유도한다. EGFRi 처리는 ERK 인산화를 1h후 정도로 빨리 감소시켰다(도 2A). 그러나, 우리는 계속적인 정지에도 불구하고, 48h 이내에 포스포-ERK(pERK) 수준의 점차적인 회복을 관찰하였다(도 2A). 우리는 Mek(PD0325901; Meki) 또는 Erk(SCH772984; Erki) 중 어느 하나의 작은 억제제를 사용하여 Mek/Erk 신호전달이 장 줄기세포의 세포주기 진행에 필수적인지를 알아 보았다. 상기 두 억제제 모두 Lgr5+ 세포의 정지를 유도하였으며 이는 상기 EGFR의 하류 ERK 경로가 Lgr5+ 세포의 증식을 조절함을 의미한다(도 2B). EGFR 및 ErbB2를 모두 억제하는 아파티니브의 사용은 유사한 결과를 생성시켰다(도 2B). 우리는 MAPK 신호전달을 통한 EGFR 억제가 장 오가노이드 줄기세포에서 가역적인 정지 상태의 유도에 충분하다는 결론을 내렸다.
정지성 Lgr5 세포가 줄기세포 잠재성을 유지하는지의 여부를 시험하기 위해서, 우리는 Lgr5GFPiresCreERRosa26YFP/LacZ 및 Lgr5GFPiresCreERRosa26tdTomato 오가노이드를 사용하여 Lgr5+ 세포의 운명을 추적하였다(도 3A). 4-OH 타목시펜(Tmx)을 사용하는 CreER 유도는 빠른 재조합을 유도하였으며 이는 YFP(또는 tdTomato) 형광 또는 LacZ 발현에 의해 시각화될 수 있었다(도 3B 및 3C). 표지된, 분열하는 Lgr5 세포는 EGFRi 처리시 정지성 Lgr5 세포를 생성시켰으며, 이는 후자가 실제로 활동성 Lgr5 세포로부터 유래되었음을 가리킨다(도 3B). 더욱이, 표지된 파네스 세포 및 EEC의 분획은 EGFRi 처리시 증가하였다(도 3B 및 3C). 비-EGFRi 처리된 대조용에서, 재조합된 세포는 계대 배양시 전체 오가노이드를 생성시켰으며, 이는 줄기세포의 효율적인 표지화를 가리킨다(도 3D). 계대 배양 및 EGF 신호전달의 재활성화시, 재조합된 정지성 Lgr5 세포의 자손은 수회 계대배양에 걸쳐 지속되었으며 오가노이드를 생성시켰다(도 3D). 이러한 결과는 EGFRi 처리시 유도된 정지성 Lgr5 세포가 진성 줄기세포로서 행동함을 가리켰다.
술세포는 비-분열성이며 손상 및 종양 성장시 조직 재생에 기여함으로써 줄기세포-유사 성질들을 나타낼 수도 있다(Nakanishi et al. (2013) Nature Genetics 45:98-103). 우리는 Dclk1GFPiresCreERRosaYFP/LacZ 마우스 모델로부터 유래된 오가노이드를 사용하여 술세포의 운명을 추적하였다. 정상 및 EGFRi 처리된 오가노이드 모두에서, 표지된 세포는 시간이 지남에 따라 단세포로서 남아있었다(도 3C). EGF의 존재하에서 계대배양시, 표지된 세포는 상실되었고 오가노이드 생성에 기여하지 않았으며(도 3C) 이는 Dclk1+ 술세포가 오가노이드 환경에서 줄기세포 잠재성을 가짐을 입증한다.
정지성 Lgr5 세포의 분자 특성을 보다 잘 이해하기 위해서, 우리는 FACS-단리된 활동성(DMSO 대조용) 및 정지성(EGFRi 처리, d4) Lgr5+ 줄기세포상에서 RNA 서열분석을 수행하였다. 우리는 우리의 연구에 Lgr5GFPiresCreER (n=2) 및 Lgr5GFPDTR (n=2) 대립유전자를 모두 포함시켰다. 우리는 또한 비교를 위해서 분류된 Dclk1GFP 술세포 및 벌크 오가노이드를 포함시켰다. 계층 분석 및 주성분 분석(PCA)은 Lgr5+ 세포가 전체 오가노이드 또는 술세포에 대해서보다 서로에 대해 더 유사함을 밝혀내었다(도 4A 및 4B). 활동성 및 정지성 Lgr5+ 줄기세포는 이들의 세포주기의 차이와 일치하게 별도로 무리를 이룬다(도 4A 및 4B). 활동성 및 정지성 Lgr5 세포간의 차별적인 유전자 발현 분석은 533개가 유전자를 차별적으로 조절하며, 이 중 290개는 정지성 Lgr5 세포가 풍부함(FDR<0.01 도 5C)을 밝혀내었다. ERK 경로의 전사 효과기(Etv4[7.7x, p-adj<0.001] 및 Etv5[7.7x, p-adj<0.001])는 정지성 Lgr5+ 줄기세포에서 하향조절되었으며 이는 효율적인 Erk 억제를 입증한다(도 4C 및 4D). 유사하게, 다수의 세포주기 관련 유전자, 예를 들어 Ccnb1(2.1x, p-adj<0.005) 및 Ccnb2(1.9x, p-adj<0.05)가 감소하였으며, 이는 G0 정지와 일치하였다(도 4C 및 S9). EGFRi 처리시 하향조절된 유전자들의 GO 분석은 세포주기-관련된 유전자들의 명백한 상실을 입증하였다(도 S9). 정지성 Lgr5 세포에서 한정 전사물 중 하나는 Wnt 신호전달 경로의 한 성분인 Lef1(활동성 Lgr5에서 검출되지 않음, p-adj< 0,001)이다. 우리의 리포터 발현과 일관되게, 우리는 Rnf43(2.3x, p-adj<0.005) 및 Lgr5(2x, padj<0.05)를 포함한, 주지된 Wnt 표적 유전자 중 일부의 상당한 증가를 관찰하였다(도 4D). 독립적인 실험에서 정량적인 PCR 분석은 상기 결과를 입증하였다(도 9). 우리는 또한 정지성 Lgr5 세포에서 전사 인자의 AP-1 과 구성원들(Junb, Fos, Fosb)의 강한 증가에 주목하였다(도 4D). 조직 분석과 일치하게, 파네스 세포, 장세포 및 배상세포 특이적 유전자 발현은 불변인 채로 남아있었다. EEC 및 그의 전구체에 의해 발현된 Chga는, 낮은 발현 수준에서 높은 변화가 추가적인 결론을 방해하였지만(p-val=0.019 및 padj=0.28) 활동성 Lgr5+ 줄기세포에 비해 정지시 7.3-배 더 높았다. 유사하게, Dclk1(6x, p-adj<0.05) 및 일부 다른 술세포 마커는 EGFRi 처리시 증가하였지만, 이들의 수준은 술세포에서보다 정지성 Lgr5 세포에서 현저하게 더 낮았다(도 4D). 유전자 발현의 전반적인 변화는 모든 정지성 Lgr5 줄기세포에 의해 공유되거나, 또는 특정한 하위집단에서의 변화의 결과일 수도 있다. 우리는 최근에 개별적인 활동성 Lgr5 세포들이 상당히 동종임을 입증하였다(Grun et al. (2015) Nature 525:251-255). 우리는 대조용 또는 EGFRi 처리된 오가노이드로부터 총 192개의 FACS 정제된 단일 활동성 또는 정지성 Lgr5 세포의 단세포 서열분석을 수행하였다. RaceID(Grun et al. (2015) Nature 525:251-255)를 사용하여, 우리는 활동성 및 정지성 Lgr5+ 세포를 모두 함유하는 EGFRi 처리된 세포(도 4F) 및 대조용 세포 모두로부터의 세포를 함유하는 단일의 현저한 집단(클러스터 1)을 확인하였다(도 9). 소수의 클러스터 2(4개의 세포) 및 4(하나의 세포)는 파네스(Lyz1) 및 술(Dclk1) 세포 관련 유전자를 발현하였지만, 클러스터 3(하나의 세포)은 클러스터 1을 닮았다(도 9). 따라서, 정지성 Lgr5 집단은 동종이며 유전자 발현에서의 일부 현저한 변화에도 불구하고, 정지성 Lgr5 세포를 가깝게 닮는다.
실시예 2
증가된 Chga 및 Lgr5 발현(실시예 1에 기재된 바와 같은)을 겸비한 정지성은 문헌[Winton and colleagues, Buczacki et al. (2013) Nature 495:65-69]에 기재된 표지-보유 분비성 전구체의 연상이다. 이들 세포는 EEC로 효율적으로 분화하며, 이는 Lgr5 세포의 세포주기 종료가 EEC의 생성을 촉진할 수 있음을 암시한다. EEC에 의해 발현된 호르몬들은 공복, 췌장 효소의 방출, 기분 및 글루코스 허용성같은 광범위하게 다양한 생리적 반응들을 조절한다. 상기를 또한 하위유형들을 한정하는데 사용한다(도입을 참조하시오). G 단백질-결합된 맛 수용체가 호르몬 분비의 조절인자로서 확인되었다(Janssen and Depoortere (2013) TEM 24:92-100). EEC는 미세융털과의 직접적인 관강 접촉을 가질 수 있으며 내용물을 감지할 수 있다. 다른 EEC(소위 폐쇄된 유형의 세포)는 관강 내층을 갖지 않으며 자극되기 위해 다른 소스들을 필요로 한다(Janssen and Depoortere (2013) TEM 24:92-100). 이들의 기본 과정의 길이도 또한 다양하며 신경계에의 접속을 위해 장 뉴런과 시냅스 접촉을 형성할 수 있다.
EEC 분화를 위한 프로토콜을 확립시키기 위해서, 우리는 출발점으로서 정지성 Lgr5를 사용하였으며 노취 및 Wnt 신호전달 경로를 조절하였고, 상기 경로는 분비성 분화에 관련된다. DAPT 처리(D)에 의한 노취 신호전달의 억제는 분비성 분화를 증대시켰으며, 이는 LYZ+ 파네스 세포수의 큰 증가를 유도하였다(도 5A). DAPT와 함께 IWP-2(I)를 사용하는 Wnt 분비의 억제는 파네스 세포 분화를 없애고 EEC 및 배상 세포를 유도하였다(도 5A). EGFRi 처리는 배상 세포 분화를 억제하였으나, 파네스 세포 및 EEC는 면하게 하였다(도 5A). EGFR/WNT/노취 경로의 병행 억제(IDEGFRi)는 장세포, 배상세포 및 파네스세포 분화를 억제하면서 EEC의 대량 증가를 생성시켰다(도 5A). 유사하게, Wnt 및 노취 신호전달 경로와 함께 Mek의 억제(IDMeki)는 CHGA+ 세포수를 증가시켰다. 상이한 EEC 하위유형은 정상적인 장 오가노이드 배양물 중에 드물다(도 5B). IDMeki 처리는 이들 EEC 세포 유형의 수의 확고한 증가를 생성시켰다. 우리는 qPCR을 사용하여 상기 결과를 제공하였다. 범-EEC 마커 Chga의 발현은 IDEGFRi에서 25배 더 높았고 IDMeki 처리된 오가노이드에서 100-배 넘게 더 높았다(도 5C). 일관되게, Sst(55x), Gip(14x), Sct(5x), 콜레시스토키닌(15x) 및 글루카곤(Gcg/프로글루카곤, 4x) mRNA의 발현은 IDEGFRi 처리시 상향조절되었으며, 이는 IDMeki와 유사한 성향에 따른다(도 5C). Nts는 대조용 수준에서 발현되는 것으로 분석된 유일한 호르몬이었다. 따라서, 우리의 프로토콜은 포유동물 생리학을 조절하는 호르몬 패널을 발현하는 다수의 EEC 및 다양한 하위유형들을 성공적으로 생성시켰다(Egerod et al. (2012) Endocrinology 153:5782-5795).
EEC 유도된 오가노이드의 세포 조성 및 개별적인 EEC의 호르몬 발현에서의 이질성 정도를 설명하기 위해서, 우리는 단-세포 RNA 서열분석을 수행하였다. 우리는 IDEGFRi 및 IDMeki 처리된 오가노이드로부터 살아있는 단세포(추가적인 마커 없이)를 분류하였다. 우리의 여과를 통과한 상기 289개 세포 중에서 우리는 Aldob(4.9x, p-adj<0.001), Apoa1(12.6x, p-adj<0.001) 및 Alpi(5.6x, p-adj<0.001, 도 10)가 풍부한 장세포로서 94개 세포의 클러스터를 식별하였다. 이들을 남아있는 집단을 보다 잘 특성화하기 위해서 추가의 분석으로부터 제외시켰다. IDEGFRi 또는 IDMeki 처리된 오가노이드로부터 유래된 세포를 t-SNE 공간에 유사하게 분포시키고 함께 분석하였다(도 S4).
RaceID를 사용하여, 우리는 세포의 12개의 별개의 클러스터를 식별하였다(도 6A). 세포 전사체의 피어슨 상관성의 k-평균 군집화는 클러스터들간의 분명한 분리뿐만 아니라 클러스터들 내 가능한 이질성을 밝혀내었다(예를 들어 도 6A, 7 및 8). 차별적인 유전자 발현 분석은 각 클러스터에 대한 특징 유전자들을 밝혀내었으며, 우리는 상기를 세포 유형의 분류에 사용하였다(표 S1).
가장 현저한 클러스터는 범-EEC 마커 Chga 및 Chgb를 발현하는 3(53 세포) 및 4(35 세포)였다. Chga 및 Reg4 발현은 구배를 형성하였으며, 이들은 둘 다 클러스터 4에서 더 높았다. 이들 Chgb 고 클러스터에서 호르몬 생산은 Tac1 및 Tph1 발현(둘 다 엔테로크로마핀 세포의 마커들이다)에 의해 가장 잘 한정되었다. Tac1은 호르몬 물질 P를 암호화하는 반면 Tph1은 세로토닌 합성에서 율속 효소를 암호화한다(Egerod et al. (2012) Endocrinology 153:5782-5795; Grun et al. (2015) Nature 525:251-255). 상기 둘 모두 접속된 장 뉴런을 흥분시키는 신경전달물질로서 작용할 수 있다(Latorre et al. (2016) Neurogastroenterology and motility: the official journal of the European Gastrointestinal Motility Society 28(5):620-630).
다른 클러스터들은 비교적 낮은 수준의 Chga 및 Chgb 전사물을 갖지만 호르몬을 발현하는 세포를 포함하였다(도 6C). 클러스터 2(21 세포)는 K-세포에 의해 발현되는 Gip 발현(74x)에 의해 표시된다. Fabp5는 또한 상기 클러스터 중에 매우 풍부하였으며(12,6x), 이는 Gip 분비에서의 그의 역할과 일치한다(Shibue et al. (2015) American journal of physiology, endocrinology and metabolism 308:E583-591). 클러스터 5(9 세포) 구성원은 매우 높은 수준의 Sst(182x)를 발현하였으며, 이들은 D-세포로서 확인되었다(도 6C). 그렐린(Ghrl) 발현은 하나 초과의 클러스터에 분포되었으나, 클러스터 6에서 가장 높았다(19x, 3 세포). 우리는 또한 Islet1(Isl-1, 9,7x)이 상기 세포에서 Ghrl과 동시발현됨을 알았다. Islet1은 세포 운명 사양에서 중요한 역할을 하며 그의 상실은 손상된 글루코스 항상성에 이르게 한다(Terry et al. (2014) American journal of physiology, gastrointestinal and liver physiology 307:G979-991). 클러스터 7 중의 세포(18 세포)는 모두 Cck를 고도로 발현하였으며(55,7x), 상기 클러스터 중 하위그룹들도 또한 다른 호르몬, 예를 들어 Gcg(28,2x), Ghrl(5,3x) 및 Pyy(11,4x)이 풍부하였다. 일관되게, I-세포는 다양한 수준으로 다른 호르몬들과 함께 Cck를 동시-발현하는 것으로 보고된다(Egerod et al. (2012) Endocrinology 153:5782-5795).
EEC 분화의 초기 유도인자들 중 하나는 뉴로제닌-3(Neuro3)이며, 다음은 Neurod1이다. Neurog3(5,2x) 발현은 클러스터 9(6 세포), 및 클러스터 9와 가장 유사한 클러스터 3의 일부 세포에서 가장 높았다. 실제로 모든 EEC 클러스터가 Neurod1을 발현하였다. 이들 전사 인자의 일시적인 발현을 고려하여, 우리는 클러스터 9가 EEC 전구세포를 나타내고, 이어서 Neurod1을 통해 EEC의 패널을 생성시킴을 제시한다. 클러스터 1(18 세포)은 배상세포 및 파네스 세포 관련 유전자, 예를 들어 Agr2 (33x), Muc2 (26x), Ttf3 (23x) 및 Defa24 (28x)가 풍부하였다. 여과후에 조차, Aldob 및 Mt1/2를 발현하는 일부 남아있는 장세포-유사 세포들을 볼 수 있었다(클러스터 8,7 세포). 이들 클러스터는, 우리가 EGFR 또는 Mek 억제에 이어서 그들의 수의 증가를 보지 못하므로, EEC 유도 전에 생성되었을 수도 있다. Dclk1 및 Trpm5 발현은 클러스터 10(15 세포)을 술세포로서 식별하였다(도 6B 및 6C). 통틀어, 분석된 289개 세포 중 145개 세포(모든 세포의 50%)가 EEC 또는 그의 전구세포였으며, 이는 우리의 유도 프로토콜의 높은 효율을 입증한다.
다수의 호르몬들이 동일한 세포에서 동시-발현될 수 있기 때문에, 우리는 단세포 수준에서 호르몬 발현의 이질성을 추가로 조사하였다(도 6D). 우리는 다수의 호르몬들이 발현된 클러스터 2, 5, 6 및 7에 집중하였다. Gip, Sst, Cck 및 그렐린 발현을 기준으로 4개의 주요 그룹들을 볼 수 있었다. Cck+ 세포는 Gcg+Ghrl+, Gcg+Ghrl-, Gcg-Ghrl+ 및 Gcg-Ghrl- 클러스터로 추가로 분할되며, 이때 일부는 또한 낮은 수준의 Sst 및/또는 Gip를 동시-발현한다. Sst+ 세포의 전사체는 보다 동종이었으며, 낮은 수준의 Gip 및 Cck를 동시 발현한 반면, 하나의 세포는 오직 Ghrl만을 동시-발현하였다. 우리는 앞서 CCk+ 및 Tac1+ 세포간에 부분적인 중복을 보고하였다. 일관되게, 클러스터 3 및 4 중 Tac1+ 세포 중 일부는 낮은 수준의 Cck를 발현하였다(도 6B 및 6C).
종합적으로, 우리의 단세포 분석은 우리의 프로토콜이 마커 유전자 발현을 기준으로 EEC를 클러스터의 ∼50%까지 농축시켰음을 가리킨다. 더욱이, 우리는 복잡한 호르몬 발현 프로파일을 갖는 일부 희귀 세포들을 포함하여 EEC 하위유형의 패널을 생성시켰다.
실시예 3
Wnt, 노취 및 MAPK 신호전달의 억제제들을 함유하는 쥐 EEC 분화 배지를 사용하여 오가노이드를 생성시켰다. 이들 오가노이드는 모든 EEC 하위유형들의 혼합물을 함유하였다. 세로토닌을 생산하는 엔테로크로마핀 세포가 이들 배양물에서 가장 풍부한 세포 유형이었다. 상이한 EEC 하위유형을 생성시키는 기전을 조사하였다. 이는 배양물의 용도를 확장시키고 이들 세포의 발생을 이해할 목적이었다. EEC 하위유형 사양을 조절할 수도 있는 신호전달 경로의 첫 번째 선별에서, BMP, 헤지호그 및 mTOR 경로의 조절제들이 상기 EEC 하위유형의 상대적인 비에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 세크레틴-생산 S 세포는 Wnt, 노취 및 MAPK 억제 중에 특히 드문 것으로 보인다. S 세포는 통상적으로 근위 십이지장에 상주하며, 이는 상기 연구에서 오가노이드가 단리된 장소와 동일한 장소이다. 상기 EEC 분화 배지로부터 노긴을 철회하고 상기 배양 배지에 BMP4(10 ㎍/㎖)를 가함에 의한 상기 BMP 경로의 활성화는 EEC 하위유형의 상대적인 풍부성을 변화시켰다. 세포당 세크레틴 수준(IHC를 기준으로)뿐만 아니라 S-세포수의 극적인 증가(메신저 기준, 대조용에 비해 400배)가 상기 BMP 경로의 활성화후에 관찰되었다. 이러한 S-세포의 증가는 엔테로크로마핀 세포수의 댓가로 진행하는 것으로 보이며, 이는 발생 경로의 잠재적인 중복을 암시한다. 실시예 5의 BMP 신호전달 역할의 추가적인 논의를 참조하시오.
실시예 4
인간 소장(SI) 오가노이드를 먼저 증식 배지(문헌[Sato et al. (2011) Gastroenterology 141(5):1762-72]에 기재된 바와 같이)에서 배양하여 줄기세포수를 증가시키고, 이어서 분화 배지(Wnt 순화 배지, TGFβ-억제제, p38 억제제 및 니코틴아미드가 없는 증식 배지)에 재도말하여 분화를 지시하였다. 재도말은 저온 배지 중 매트리젤의 붕괴(오가노이드의 해리 없이), 기본 배양 배지(PBS가 또한 사용될 수 있다)에 의한 상기 오가노이드의 세척 및 신선한 매트리젤 중에서의 후속적인 도말(오가노이드의 해리 없이)을 수반하였다. 이어서 오가노이드를 1일 동안 상기 분화 배지에서 배양하였다. 다음날, 상기 EEC 특이성 장내분비 분화 프로토콜. 상기는 5일 동안 EEC 분화 배지의 첨가를 수반하였으며, 이는 1.5 μM IWP2, 10 mM DAPT, 100 nM MEKi PD0325901이 첨가된 표준 분화 배지(Wnt 순화 배지, TGFβ-억제제, p38 억제제 및 니코틴아미드가 없는 증식 배지)와 동일하였다. 본 실험에서 이들 인간 세포의 EEC 운명으로의 분화에 대해, 가능하게는 상기 인간 시스템에서 EGF를 생산하는 파네스 세포의 부재로 인해, 실시예 3에서 쥐 세포의 EEC 운명으로의 분화에 필요한 것보다 훨씬 더 낮은 수준의 MAPK 억제제가 필요하였다(100 내지 500 nM 대 쥐 시스템에서 1 내지 5 μM).
논의
여기에서 우리는 오가노이드에서 Lgr5 줄기세포 증식의 필수적인 구동인자로서 EGF 신호전달을 확인한다. Wnt 신호전달은 닿지 않지만 EGF 신호전달은 차단되는 조건하에서, 능동적으로 분열하는 Lgr5 줄기세포는 다양한 Wnt 표적 유전자의 발현을 유지하는 정지성 Lgr5 세포로 전환된다. 이러한 세포 상태는 1주일까지 유지될 수 있다. 그렇지만, EGF 신호전달의 단순한 복원은 상기 정지성 세포를 다시 그의 정상적인 활동성 줄기세포로 전환시킨다. 차별적인 발현 분석은 주지된 증식-유도 전사 인자, 예를 들어 Ets-유사 인자 Etv4 및 -5의 상실을 밝혀내었으며, 이는 상기 인자들이 이들의 줄기세포 분열에 핵심적인 역할을 함을 암시한다.
따라서, EGFR 신호전달의 화학적 억제는 줄기세포 잠재성에 영향을 미치지 않으면서 Lgr5+ 줄기세포를 정지시켰다. 우리는 높은 수준의 Wnt 신호전달이, 유도된 정지 중에 상기 줄기세포 잠재성을 유지하는 것으로 생각한다. 오가노이드뿐만 아니라 움에서, Lgr5+ 세포는 항상 Wnt3-분비 파네스 세포의 직접적인 이웃들이다(Sato et al. (2011) Nature 469:415-418). 이러한 상황에서, Wnt3는 거리에 걸쳐 확산되지 않고, Lgr5 줄기세포상에 직접 로딩된다(Farin et al. (2016) Nature 530:340-343). 상기 정지성 Lgr5 줄기 세포는 EGFRi 처리된 오가노이드에서 파네스 세포와 나란히 놓인채로 있으며 따라서 높은 국소적 Wnt 신호에 노출된다.
실제로, 3개의 독립적인 Wnt 표적 유전자 대립유전자뿐만 아니라 유전자 발현 분석은 EGFR 억제시 Wnt 신호전달의 증가를 입증하였다. 요약하면, 우리의 결과들은 줄기세포 운명의 유지가 EGF가 아닌 Wnt를 필요로 하는 반면, 줄기세포 증식은 Wnt 및 EGF의 조합에 따라 변함을 보인다.
선행 연구들은 줄기세포 잠재성을 갖는 '+4'번 위치의 분화 대역에 가까운 정지성 세포들을 식별하였다(Sangiorgi and Capecchi (2008) Nature Genetics 40:915-920; Takeda et al. (2011) Science 334:1420-1424; Yan et al. (2012) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109:466-471). 우리는 상기 위치에서 분비 세포를 독점적으로 생성시키는 Dll1+ 전구체의 존재를 보고하였다(van Es et al. (2012) Nature cell biology 14:1099-1104). 히스톤 표지 체류 분석을 사용하여, 더그 윈튼(Doug Winton)의 그룹은 분비성 분화 잠재성을 갖는 유사한 집단을 식별하였다. 상기 표지 유지 세포는 Lgr5의 발현을 포함하여 CBC와 특징을 공유하지만, 양호한 수준의 Chga와 같은 분비 계통 유전자 중 일부를 발현한다(Buczacki et al. (2013) Nature 495:65-69). 종합해보면, 이들 분비성 전구체는 일시적인 상태를 나타내며, 필요한 경우 여전히 줄기세포로 탈-분화할 수 있고 따라서 조건적 줄기세포로 간주될 수 있다(Buczacki et al. (2013) Nature 495:65-69; van Es et al. (2012) Nature cell biology 14:1099-1104). 유사한 상황이 움 중 풍부한 장세포 전구체에 대해서 존재한다(Tetteh et al. (2016) Cell stem cell 18:203-213).
놀랍게도, 우리는 EEC 마커, 예를 들어 Chga의 발현을 향한 정지성 Lgr5 세포의 약간의 편향을 주목하였으며, 이는 상기 마커가 더그 윈튼에 의해 식별된 Lgr5+ 표지-유지 세포를 연상하게 만든다. EEC는 장 상피 세포의 1% 미만을 차지하지만, 세포수에 관하여 함께 인간 신체 중에서 가장 큰 내분비 장기를 형성한다(Latorre et al. (2016) Neurogastroenterology and motility: the official journal of the European Gastrointestinal Motility Society 28(5):620-630). EEC는 영양소 및 미생물과 같은 관강 내용물의 센서로서 작용하고 호르몬의 분비를 통해 글루코스 민감성, 공복, 기분 및 식욕과 같은 생리학적 응답을 조절하는 것으로 제시되었다(Janssen and Depoortere (2013) TEM 24:92-100). EEC의 기능성 연구는 상기 세포를 다량으로 생성시키는 확고한 시험관내 시스템의 결여에 의해 방해되었다. 우리는 앞서 노취 억제에 의한 줄기세포의 분비 세포로의 직접적인 분화를 보고하였다(van Es et al. (2005) Nature 435:959-963). 파네스 세포 형성은 노취 억제와 병용된 활성 Wnt 신호전달을 요하며(van Es et al. (2012) Nature cell biology 14:1099-1104; van Es et al. (2005) Nature 435:959-963), Wnt 및 노취 신호전달의 병행된 억제는 주로 배상세포를 생성시킨다(van Es et al. (2005) Nature 435:959-963; Yin et al. (2014) Nature Methods 11:106-112). EGFR 경로의 억제와 Wnt 및 노취 차단을 병행함으로써, 다양한 유형의 EEC가 1차 세포 배양에서 효율적으로 형성된다. EGFR 신호전달은 배상세포의 생산에 중요한 것으로 입증되었다(Heuberger et al. (2014) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111:3472-3477). 우리는 각각 노취, Wnt 및 EGFR 신호전달의 억제에 의한 장세포, 파네스 및 배상 세포 운명의 동시 억제가 EEC 생성에 핵심인 것으로 믿는다.
20개 이하의 EEC 하위유형들이 특정한 펩티드의 생성을 기준으로 구분될 수 있다. 이들 세포는 원위 GI관에 가깝게 상이한 빈도로 존재한다. 몇몇 EEC는 전사물 및 단백질 수준 모두에서 다수의 기능적으로 관련된 호르몬을 발현하는 것으로 밝혀졌지만(Egerod et al. (2012) Endocrinology 153:5782-5795; Grun et al. (2015) Nature 525:251-255), 이들 중 일부는 성숙화의 중간 단계일 수도 있다. 우리는 단-세포 전사체 프로파일링에 의해, EEC의 다수의 주요 하위유형들의 동시적인 생성을 입증한다. 우리의 선행 연구를 확인하여(Grun et al. (2015) Nature 525:251-255), 우리는 EEC의 Chga-고 및 -저 집단을 검출한다. 전자는 Cck를 낮게 발현하는 일부 세포와 함께 EEC를 발현하는 Tac1/Tph1이 풍부하다. 후자는 호르몬 발현이 매우 다양하다. 전체적으로 유사한 전사체를 갖는 세포들은 함께 클러스터를 프로파일링하지만, 이들은 호르몬 발현을 기준으로 다수의 부류들로 세분될 수 있다. 상기 호르몬 발현 수준의 넓은 분포는 EEC 하위유형들간의 분리가 명백하지 않음을 암시한다. 이들의 발현은 적어도 부분적으로 확률론적이며 심지어 일시적으로 역동적일 수도 있는 것으로 추정할 생각이 들기도 한다.
실시예 5
장내분비 세포는 움에서 융털로의 이동 중 호르몬 발현을 변경시킨다
다수의 장내분비 세포 호르몬들이 장움 및 융털에 상이하게 풍부하다. L-세포는 움에서 GLP1 및 PYY를 동시-발현하지만, 융털에서는 대개 GLP1 발현이 없다(도 20A-C). 엔테로크로마핀 세포는 전체 움-융털 축을 따라 세로토닌을 생산하지만, 움에서는 Tac1을, 융털에서는 세크레틴을 선택적으로 동시-발현한다(도 20D-E). 이는 EEC가 움에서 융털로 이동 중에 호르몬 발현을 전환시킬 수 있고 움과 융털 EEC간에 잠재적인 계통 관계가 존재함을 암시한다. 그러나, 상기 관찰에 대한 또 다른 설명은 융털 중 세크레틴 또는 PYY에 대한 세포 면역반응성이, 세로토닌 및 Tac1 또는 GLP1에 대해 음성인, 상기 움에서의 관련되지 않은 전구체로부터 유래된다는 것이다. 상기와 같은 트랜스분화 사건이 EEC의 수명 중에 발생할 수 있음을 입증하기 위해서, 우리는 Tac1-Cre/Rosa26tdTomato 마우스의 장을 분석하였다. 상기 리포터는 Tac1 및 세로토닌을 동시-발현하는 움 중의 세포들을 충실히 표지한다. 더욱 또한, 상기 융털 중에서 세로토닌+ 세포 및 세크레틴+ 세포의 대부분이, Tac1에 대해서는 음성이지만, 추적된다. CCK를 포함한 다른 호르몬들은 Tac1/세로토닌+ 전구세포로부터 유래되지 않는다. 이들 데이터는 개별적인 EEC가 상기 움 및 융털에서 상이한 호르몬 세트를 발현할 수 있음을 암시한다. 상기 세크레틴-생산 세포의 대부분은 엔테로크로마핀 계통의 부분이다. 호르몬 발현을 전환시키는 EEC의 능력은, 이전에 예상된 것보다 더 적은 EEC의 관련되지 않은 분화 경로가 존재할 수 있음을 의미하지만, 제한된 수의 세포에 의해 생산된 호르몬 유형의 상당한 변경은 과다한 EEC 상태를 생성시킴을 의미한다.
BMP 신호전달은 장내분비 세포에서 융털 호르몬 특징을 유도한다
이어서 우리는 움에서 융털로의 이동을 발생시키는 호르몬 스위치가 EEC의 디폴드 성숙화 과정의 부분인지, 또는 단순히 EEC가 노출되는 상이한 니치 신호를 반영하는지의 여부를 알아보았다. 상승하는 수준의 BMP 및 헤지호그, 및 하강하는 수준의 Wnt 신호를 포함하여, 움에서 융털로 나오는 다수의 형태형성물질이 공지되어 있다. 선행 실시예에 기재된 쥐 장 오가노이드 시스템에서 장내분비 세포에 대한 분화 프로토콜은 주로 Wnt, MAPK 및 노취 신호전달 경로의 3중 억제를 기본으로 한다. 우리는 상기 분화 배지를 사용하였으며 상기 분화 칵테일에 줄기세포 인자 노긴을 가하여, BMP 저 환경을 생성시켰다. 현저하게도, 우리는 상기 배양물 중 모든 엔테로크로마핀 세포가 세로토닌 및 Tac1을 항상 동시-발현하지만, 세크레틴 발현은 없음을 관찰하였다. 따라서 상기 배양물은 상기 움 상태의 EEC 호르몬 특징 연상을 반영하며, 이는 니치 신호가 일시적으로 구동된 EEC 성숙화보다 우세함을 의미한다.
니치 신호가 실제로 EEC 호르몬 특징들을 조직화할 수 있는지의 여부를 다루기 위해서, 우리는 출발점으로서 우리가 앞서 정의한 EEC 분화 시스템을 사용하고 상기 칵테일의 배경에 대해 신호전달 경로를 조절하였다. 헤지호그 신호전달을 억제하기 위해 비스모게니브를 가하고, BMPR1a/BMPR2 신호전달을 활성화시키기 위해 노긴을 철회하였으며, 상이한 TGF-베타 과 수용체 경로를 조절하기 위해 ALK5/4/7 억제제 A83 또는 TGF-베타1을 가하였다. Wnt가 이미 포큐파인 억제제 IWP2에 의해 EEC 분화 칵테일 중에서 제한되지만, 우리는 상부의 R-스폰딘을 제거하여 Wnt의 보다 현저하고 빠른 억제를 획득하였다. 우리는 각각 융털 및 움 호르몬 특징의 프록시로서 Sct 및 Gcg 전사물 수준을 사용한 반면, ChgA를 움에서 융털로의 일정한 발현을 갖는 전사물로서 포함시켰다. 헤지호그 신호전달의 억제는 평가된 호르몬들 중 어느 것도 조절하지 않으며, 이는 장 간충직에서 그의 우세한 역할과 일치한다. A83 및 TGF-베타1은 둘 다 모든 EEC 호르몬의 발현을 억제하였다. R-스폰딘 제거는 평가된 모든 호르몬의 EEC 분화를 유사하게 손상시켰다. 이는 노취 신호 상실시 분비 운명을 선택하기보다는 Wnt 신호가 억제되는 경우 흡수성 계통으로의 줄기세포의 빠른 분화로 인해 잠재적으로 관련된다. 최종적으로, EEC 분화 중 노긴의 철회는 Gcg 전사를 억제하면서 Sct의 발현을 유도하며, 이는 움에서 융털 발현 프로파일로의 전환과 일치한다. 우리는 외인성 BMP4를 상기 EEC 분화 칵테일에 가하여 BMP 신호전달을 추가로 증폭시켰으며, 상기 조합을, 우리가 앞서 정의한 바와 같은 "EEC BMPlow"에 비해 "EEC BMPhigh"라 명명하였다. 상기 "EEC BMPhigh" 분화 배지에 의한 오가노이드 자극은 세크레틴에 면역반응성인 세포뿐만 아니라 Tac1 없이 세로토닌을 발현하는 엔테로크로마핀 세포의 생성을 유도한다. 상기 GLP1+ 세포수는 상기 오가노이드의 명백한 형태적 변화 없이 상기 섭생에서 크게 감소하였다(도 21A-C). 상이한 장 영역들로부터 확립된 오가노이드는 근위 SI에서 GIP 및 원위 SI에서 Pyy, Nts 및 Gcg의 풍부와 함께 호르몬 특징에 관하여 그의 영역적 정체성을 유지한다. ChgA, Tph1, CCK 및 십이지장 GIP를 포함하여, 움에서부터 융털까지 균일한 분포를 나타내는 다른 호르몬 또는 EEC 마커는 상이한 BMP 수준에 의해 단지 순한 영향을 받는다. 우리는 Pyy 및 Nts(이들은 융털에서 최고로 발현된다)의 상향조절을 관찰한다. 상기 BMP의 영향을 하기 표에 요약한다. 집합적으로, 이들 데이터는 융털 중 EEC와 관련된 호르몬의 유도에 있어서 BMP 신호의 역할을 가리킨다.
Figure pct00047
실시예 6
LDN193189(셀렉켐(Selleckchem) 카탈로그 번호 S2618) 35 ㎎/㎏을 경구 위관영양에 의해 마우스에게 60시간 처리로 투여하였다. 상기 LDN193189를 pH 3.1의 시트르산에 용해시키고 상기 경구 위관영양을 하루에 2회 제공하였다. 이는 대조용 마우스에 비해 장의 융털에서 GLP1 발현 세포의 증식을 생성시켰다. 세크레틴 발현은 대조용 마우스에 비해 장 융털 중의 세포를 크게 감소시켰다(도 22를 참조하시오). 상기 사용된 용량은 높은 끝이며 보다 낮은 용량도 또한 유효할 것으로 예상된다. 이러한 결과를 인간에 대해 추론할 수 있을 것으로 가정된다. LDN193189는 BMP I형 수용체 ALK2 및 ALK3의 전사 활성을 C2C12 세포에서 각각 5 nM 및 30 nM의 IC50으로 억제하고, TGF-β에 비해 BMP에 200배 선택성을 나타내는 선택적인 BMP 신호전달 억제제이다. BMP 신호전달의 다른 억제제들, 예를 들어 본 명세서에 기재된 것들이 또한 생체내에서 유사한 효과를 가질 것으로 예상된다. BMP 억제제(및 환언하면 BMP 활성제)는, 생체내에서 GLP1 및/또는 세크레틴의 조절이 바람직한 치료법에 사용 가능성을 갖는다는 결론을 내린다. 예로서, 비제한적으로 당뇨병, 비만증, 위산감소증 또는 위산과다증이 포함된다.
LDN193189의 구조
Figure pct00048
<110> KONINKLIJKE NEDERLANDSE AKADEMIE VAN WETENSCHAPPEN <120> Improved differentiation method <130> P068547WO <150> GB 1610748.4 <151> 2016-06-20 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ccagctgcct gtagtgtcaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcttgaggct cgccttgatg 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gccaagagcc atgtgactat c 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cagagctggt actttggtgt tc 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acccgccagt ctcctacatc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcatctaggc gcagggattg 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gctgtgcaag ctgaaggg 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gctgtgcaag ctgaaggg 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cagctcgtcc actctttccg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cctctcgtct ccttggaggg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggaatggatg gctaccgtgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 catgccaccc atgctcgaat 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 actaaggtgg cctacctcca a 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggaggtgaca gtcaaggtga ga 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 aggatccatc tgtcctttgg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 acgttgtatg tcttggacag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gaccccaaga cactcagacg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ttttctgtgt cctgctcgct 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cttcccagaa gaagtcgcca 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gtgactggca cgagatgttg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gaagagcggc gtatgtctgt 20 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ccagaaggag ctttgcgga 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gacctgcgac tagactgacc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ccagttcctg tttcccggtg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 aactgttggc taggggacac 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tgatgaaagt cccctctgcg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 tgctgaccat cttccagctc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gaatgtaggg ccttctgggt 20

Claims (40)

  1. 전구세포의 분화 방법으로,
    상기 세포를 기본 배지를 포함하고 하나 이상의 EGFR 경로 억제제, 노취 억제제 및 하나 이상의 Wnt 억제제를 또한 포함하는 분화 배지에서 배양시킴
    을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    하나 이상의 EGFR 경로 억제제가 (1) EGFR 억제제, (2) EGFR 및 ErbB2 억제제, (3) RAS-RAF-MAPK 경로의 억제제, (4) PI3K/AKT 경로의 억제제 및 (5) JAK/STAT 경로의 억제제 중에서 선택되는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    하나 이상의 EGFR 경로 억제제가 EGFR 억제제, 예를 들어 제피티니브를 포함하는 방법.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    하나 이상의 EGFR 경로 억제제가 EGFR 및 ErbB-2 억제제, 예를 들어 아파티니브를 포함하는 방법.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 EGFR 경로 억제제가 RAS-RAF-MAPK 경로의 억제제, 예를 들어 MEK 억제제, 예를 들어 PD0325901, 및/또는 ERK 억제제, 예를 들어 SCH772984를 포함하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    노취 억제제가 감마-세크레타제 억제제, 임의로 DAPT 또는 디벤즈아제핀(DBZ) 또는 벤조디아제핀(BZ) 또는 LY-411575인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 Wnt 억제제가 (1) Wnt 분비의 억제제, (2) Wnt 또는 R스폰딘과 Wnt 수용체 복합체간의 상호작용의 경쟁적 및 비-경쟁적 억제제, (3) Wnt 수용체 복합체의 성분들의 분해를 촉진하는 억제제, (4) 디셰벌드(Dishevelled)과 단백질의 억제제, (5) 파괴 복합체 활성을 촉진하는 활성제, (6) 파괴 복합체의 탈올리고머화의 억제제 및/또는 (7) β-카테닌 표적 유전자 발현의 억제제 중에서 선택되는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    하나 이상의 Wnt 억제제가 Wnt 분비의 억제제, 예를 들어 IWP 2, LGK974 및 IWP 1 중에서 선택된 Porc 억제제를 포함하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분화 배지가 1 mM 미만의 EGF를 포함하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분화 배지가
    p38 억제제, TGF-베타 억제제, 가스트린, 글루코코르티코이드, 수용체 티로신 키나제 리간드, BMP 경로 활성제, cAMP 경로 활성제, 헤지호그(Hedgehog) 활성제, 헤지호그 억제제, mTOR 신호전달의 조절제, B27 및 N2로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 성분; 또는
    p38 억제제, TGF-베타 억제제, 가스트린, 글루코코르티코이드, 수용체 티로신 키나제 리간드, BMP 억제제, cAMP 경로 활성제, 헤지호그 활성제, 헤지호그 억제제, mTOR 신호전달의 조절제, B27 및 N2로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 성분; 또는
    BMP 활성제, 예를 들어 BMP7, BMP4 또는 BMP2; 또는
    BMP 억제제, 예를 들어 노긴, 스클레로스틴, 코르딘, CTGF, 폴리스타틴, 그렘린, tsg, sog, LDN193189 또는 도르소몰핀
    을 또한 포함하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 분화 배지.
  12. 장내분비세포가 풍부한 장세포 집단을 수득하기 위한 장 전구세포의 분화 방법으로,
    상기 장 전구세포를 제 11 항에 따른 분화 배지에서 배양시킴
    을 포함하는 방법.
  13. 상피 줄기세포의 배양 방법으로,
    상기 상피 줄기세포를 상피 줄기세포용 증식 배지의 존재하에서 배양시켜 증식된 상피 줄기세포를 수득하고; 후속적으로
    상기 하나 이상의 증식된 세포를 제 11 항에 따른 분화 배지에서 배양시킴
    을 포함하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 10 항, 제 12 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포를 세포외 기질과 접촉하여 배양시키는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분화된 세포 집단 또는 분화된 오가노이드를 수득하고/하거나 단리함을 또한 포함하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    전구세포가 예를 들어 장, 위, 췌장, 간, 전립선, 폐, 유방, 난소, 침샘, 모낭, 피부, 식도, 방광, 귀 또는 갑상선으로부터의 상피 세포인 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    전구세포가 장, 위, 췌장 또는 폐로부터 유래하는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    전구세포가 포유동물 전구세포, 예를 들어 인간 전구세포인 방법.
  19. 바람직하게는 분화된 장 오가노이드를 수득하기 위한 장상피 줄기세포의 배양 방법으로,
    하나 이상의 장상피 줄기세포를 증식 배지의 존재하에서 세포외 기질과 접촉하여 배양시키고; 바람직하게는 상기 증식 배지가 기본 배지를 포함하며, 수용체 티로신 키나제 리간드, BMP 억제제 및 Wnt 작용물질, 및 임의로 발프로산 및 GSK-3 억제제(예를 들어 CHIR99021)를 또한 포함하고; 후속적으로
    상기 하나 이상의 증식된 장상피 줄기세포를 제 11 항에 따른 분화 배지의 존재하에서 세포외 기질과 접촉하여 배양시킴
    을 포함하는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있는 또는 수득되는 오가노이드.
  21. 제 20 항에 있어서,
    간, 췌장, 장, 위, 전립선, 폐, 유방, 난소, 침샘, 모낭, 피부, 식도, 방광, 귀 또는 갑상선으로부터, 바람직하게는 장, 위, 췌장 또는 폐로부터 유래된 오가노이드.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    인간으로부터 유래되고 세포의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 99%가 장내분비세포 마커를 발현하는 오가노이드.
  23. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    마우스로부터 유래되고 세포의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 99%가 장내분비세포 마커를 발현하는 오가노이드.
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,
    장내분비세포 마커가 Chga, Chgb, Tac1, Tph1, Gip, Fabp5, Ghrl, Pyy, Nts, Neurod1, Sst, Sct, 콜레시스토키닌, 글루카곤 및/또는 프로-글루카곤 중에서 선택되는 오가노이드.
  25. 예를 들어 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 오가노이드, 및 제 11 항에 따른 분화 배지를 포함하는 조성물.
  26. 약물 발견 선별; 독성 분석; 진단학; 조직 발생학, 세포 계통 및 분화 경로의 연구; 각각의 호르몬의 방출을 유도하는 화학적 및/또는 뉴런 신호를 식별하기 위한 연구; 재조합 유전자 발현을 포함한 유전자 발현 연구; 조직 손상 및 수복에 관련된 기전의 연구; 염증 및 감염성 질병의 연구; 발병기전의 연구; 또는 세포 형질전환의 기전 및 암 병인학의 연구에서 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 오가노이드, 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포의 용도.
  27. 의학에 사용하기 위한, 예를 들어 질환, 상태 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 오가노이드 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포.
  28. 제 27 항에 있어서,
    의학이 재생 의학이고, 예를 들어 용도가 환자에서 오가노이드 또는 세포의 이식을 수반하는 오가노이드 또는 상기 오가노이드로부터 유래된 세포.
  29. 하나 이상의 EGFR 경로 억제제, 노취 억제제 및 하나 이상의 Wnt 억제제를 포함하는 약학 제형.
  30. 치료학적 또는 예방학적 약학 약물 또는 화장품에 대한 선별 방법으로,
    제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 분화된 오가노이드를 후보 분자(또는 후보 분자들의 라이브러리)와 접촉시키고,
    상기 오가노이드를 임의의 효과(예를 들어 세포에서의 임의의 변화, 예를 들어 증식의 감소 또는 손실, 형태학적 변화 및/또는 세포사) 또는 오가노이드의 변화(예를 들어 오가노이드 크기 또는 운동성)에 대해 평가하고;
    잠재적인 약물 또는 화장품으로서 상기 효과를 야기하는 후보 분자를 식별하고; 임의로
    상기 후보 분자를 약제 또는 화장품으로서 제조함
    을 포함하는 방법.
  31. Lgr5+ 줄기세포의 정지를 유도하는 방법으로,
    상기 세포를 하나 이상의 EGFR 경로 억제제로 처리함
    을 포함하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    세포가, 예를 들어 FACS에 의해 평가된 바와 같은 계속된 Lgr5 발현, 및/또는 예를 들어 pTOPFLASH 및 pFOPFLASH Tcf 루시페라제 리포터 구조물에 의해 평가된 바와 같은 Wnt 신호전달을 갖는 방법.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서,
    정지가 KI67 발현의 상실에 의해 지시되는 방법.
  34. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포를 적어도 1주일 동안 하나 이상의 EGFR 경로 억제제로 처리하는 방법.
  35. 제 31 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 정지성 줄기세포 집단으로, 상기 세포가 Lgr5 및 Lef1을 발현하고 KI367 및 M기 마커 포스포-히스톤 H4를 발현하지 않는 상기 세포 집단.
  36. EEC가 풍부한 세포 집단을 수득하는 방법으로, 제 11 항에 따른 분화 배지에서 세포 집단을 배양시킴을 포함하는 방법.
  37. GLP1-분비 EEC가 풍부한 세포 집단을 수득하는 방법으로, 제 11 항에 따른 분화 배지에서 세포 집단을 배양시킴을 포함하고, 상기 분화 배지가 BMP 억제제를 포함하는 방법.
  38. 세크레틴-분비 EEC가 풍부한 세포 집단을 수득하는 방법으로, 제 11 항에 따른 분화 배지에서 세포 집단을 배양시킴을 포함하고, 상기 분화 배지가 BMP 경로 활성제를 포함하는 방법.
  39. 당뇨병 또는 관련 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 BMP 억제제로, 상기 방법이 상기 치료 또는 예방이 필요한 피실험자에게 치료 유효량의 BMP 억제제를 투여함을 포함하는 상기 억제제.
  40. 위산과다증 또는 비만의 치료 방법에 사용하기 위한 BMP 활성제로, 상기 방법이 상기 치료가 필요한 피실험자에게 치료 유효량의 BMP 활성제를 투여함을 포함하는 상기 활성제.
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