JP2022066763A - 化合物、光応答性ニトロソニウムイオンドナー - Google Patents

Abstract

【課題】光の照射に応答してＮＯ＋を特異的に放出する化合物；前記化合物を含む光応答性ＮＯ＋ドナーを提供する。【解決手段】下式（１）～（３）で表される化合物；前記化合物を含む、光応答性ＮＯ＋ドナー。［化１］TIFF2022066763000024.tif60170【選択図】なし

Description

本発明は、化合物、光応答性ニトロソニウムイオンドナー（光応答性ＮＯ^＋ドナー）に関する。

一酸化窒素（ＮＯ）は、血管拡張、神経伝達、免疫応答等の種々の生理学的応答に関与していることが知られている。しかし、ＮＯは、反応性が高く、実験試薬としての貯蔵、取扱いが困難である。そこで、光照射に応答してＮＯを放出する合成化合物が提案されている（例えば、非特許文献１）。

非特許文献１には、Ｎ－ニトロソアミノフェノールに由来するＮＯ放出部位と酸素含有型のローダミン色素部位とを有する化合物として、ＮＯ－Ｒｏｓａ５が開示されている。ＮＯ－Ｒｏｓａ５は、下式（１００）で表される化合物である。

図７に示す合成化合物１００は、酸素含有型のローダミン色素部位（アンテナ部位）１０１とＮＯ放出部位１０２を有する。合成化合物１００は、ローダミン色素部位１０１で照射光のエネルギーを吸収し、不安定なフェノキシラジカル１０３を生成した後、安定なキノン体１０４となる。キノン体１０４の生成に際して、ＮＯ放出部位１０２から一分子のＮＯが放出される（非特許文献１参照）。
加えて、非特許文献１では、ＮＯ－Ｒｏｓａ５のネガティブコントロールとしてＮＯ－Ｒｏｓａ６が開示されている。ＮＯ－Ｒｏｓａ６は、酸素含有型のローダミン色素部位を有する。

Ｉｅｄａ，Ｎ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１９，９，１４３０．

しかし、従来、ＮＯによる生理学的作用は、ニトロソニウムイオン（ＮＯ^＋）による生理学的作用と厳密に区別されていない。そのため、ＮＯ^＋の放出に特化した合成化合物の開発例はない。
そこで、本発明は、光の照射に応答してＮＯ^＋を特異的に放出する化合物；前記化合物を含む光応答性ＮＯ^＋ドナーを提供する。

本発明者は非特許文献１の発表後に実験を繰り返し、ＮＯ－Ｒｏｓａ６が一酸化窒素を放出しない代わりにＮＯ^＋を放出していることを突き止めた。加えて本発明者は、ＮＯ^＋がＮＯよりもニトロシル化反応を起こしやすいことを見出し、光の照射に応答してＮＯ^＋を放出する合成化合物が生体内でのニトロシル化を伴う生理学的反応等の分析試薬等の用途に有用であることに想到した。

本発明は下記の［１］～［４］の態様を有する。
［１］ 下式（１）～（３）で表される化合物。

式（１）～（３）中、Ｘはケイ素含有型のローダミン色素基またはリン含有型のローダミン色素基であり、Ｒはメチル基またはエチル基である。
［２］ 前記ケイ素含有型のローダミン色素基が、下式（ｇ１）～下式（ｇ４）のいずれかで表される基である、［１］の化合物。

［３］ 前記リン含有型のローダミン色素基が、下式（ｈ１）～下式（ｈ４）のいずれかで表される基である、［１］または［２］の化合物。

式（ｈ１）～式（ｈ４）中、リン原子に結合する「Ｐｈ」はフェニル基である。
［４］ ［１］～［３］のいずれかの化合物を含む、光応答性ＮＯ^＋ドナー。

本発明によれば、光の照射に応答してＮＯ^＋を特異的に放出する化合物；前記化合物を含む光応答性ＮＯ^＋ドナーが提供される。

本発明の化合物の光応答の一態様を説明するための図である。 ＮＯＲＤ－１、ＮＯＲＤ－２のＮＯ^＋放出能をＨＰＬＣで分析した結果を示す図である。 実施例における血管弛緩応答の確認方法を説明するための図である。 ＮＯ^＋のｓＧＣへの作用を予想した図である。 ＮＯＲＤ－２について血管弛緩応答を確認した結果を示すグラフである。 ＯＤＱの存在下でＮＯＲＤ－２について血管弛緩応答を確認した結果を示すグラフである。 従来の合成化合物の光応答を説明するための図である。

本明細書においては、式（１）で表される化合物を化合物（１）と記す。他の式で表される化合物も同様に記す。
本明細書においては、式（ｇ１）で表される基を基（ｇ１）と記す。他の式で表される基も同様に記す。
本明細書において数値範囲を示す「～」は、その前後に記載された数値を下限値および上限値として含むことを意味する。

本発明の化合物は、下式（１）～（３）で表される。

式（１）～（３）中、Ｘはケイ素含有型のローダミン色素基またはリン含有型のローダミン色素基であり、Ｒはメチル基またはエチル基である。

ケイ素含有型のローダミン色素基は、ケイ素原子を含むローダミン色素骨格を有する。ケイ素含有型のローダミン色素基は、本発明の化合物の光吸収部位である。
ケイ素含有型のローダミン色素基としては、例えば、下記の基（ｇ１）～基（ｇ４）が挙げられる。ただし、ケイ素含有型のローダミン色素基は、発明の効果が得られる範囲内であれば特に限定されず、下記の例示に限定されない。

これらの中でも基（ｇ１）が好ましい。本発明の化合物が基（ｇ１）を有すると、長波長の光に応答してＮＯ^＋を放出できる。そのため、外部刺激として照射する光の生体透過性が高くなり、生体内に投与した際でも外部刺激の光に対する応答性がよくなる。

リン含有型のローダミン色素基は、リン原子を含むローダミン色素骨格を有する。リン含有型のローダミン色素基は、本発明の化合物の光吸収部位である。
リン含有型のローダミン色素基としては、下記の基（ｈ１）～基（ｈ４）が挙げられる。ただし、リン含有型のローダミン色素基は、発明の効果が得られる範囲内であれば特に限定されず、下記の例示に限定されない。

式（ｈ１）～式（ｈ４）中、リン原子に結合する「Ｐｈ」はフェニル基である。

本発明の化合物としては、光応答性の点から化合物（１）、化合物（２）が好ましく、化合物（１）がより好ましい。以下、化合物（１）の具体的態様を開示するが、本発明は、以下の例示に限定されない。
化合物（１）としては、例えば、下記の化合物（１－ｇ１）、化合物（１－ｇ２）、化合物（１－ｇ３）、化合物（１－ｇ４）、化合物（１－ｈ１）、化合物（１－ｈ２）、化合物（１－ｈ３）、化合物（１－ｈ４）が挙げられる。

化合物１としては、外部刺激としての光の生体透過性の点から、化合物（１－ｇ１）、化合物（１－ｇ２）、化合物（１－ｇ３）、化合物（１－ｇ４）、（１－ｈ１）、化合物（１－ｈ２）、化合物（１－ｈ３）および化合物（１－ｈ４）からなる群から選ばれる少なくとも１種以上が好ましく、化合物（１－ｈ１）、化合物（１－ｈ２）、化合物（１－ｈ３）および化合物（１－ｈ４）からなる群から選ばれる少なくとも１種以上がより好ましい。

図１は、本発明の化合物の光応答の一態様を示す図である。
図１に示すように、化合物２０は、ローダミン色素含有基（アンテナ部位）２１とＮＯ^＋放出部位２２とを有する。化合物２０に光が照射されるとローダミン色素含有基２１がアンテナとして機能して照射光のエネルギーｈνを吸収する。そして、ローダミン色素含有基２１が照射光を吸収することで、化合物２０内で電子移動が起き、不安定なラジカルカチオン中間体２３を生成した後、電荷のない安定なアニリルラジカル２４となる。電荷のない安定なアニリルラジカル２４の生成に際して、ＮＯ^＋放出部位２２からＮＯ^＋が放出される。

図１に示すように本発明の化合物においては、光の照射によって光誘起電荷分離が起き、ＮＯ^＋が放出される。光の照射によってＮＯ^＋の生成時期を制御できるため、光を照射する場所、照射時間、照射時期をそれぞれ制御することで、ＮＯ^＋の生成およびＮＯ^＋の活性の発現を時空間的に任意に制御できる。

以上説明したように、本発明の化合物はケイ素含有型のローダミン色素基またはリン含有型のローダミン色素基で光を吸収し、ＮＯ^＋を特異的に放出する。そのため、本発明の化合物は、Ｓ－ニトロシル化等のＮＯ^＋が関与する生体シグナルの解明に有用である。
他にも、後述の実施例に示すように、ＮＯ^＋は血管弛緩作用を示すことから、本発明の化合物は循環器系疾患の治療剤として有用である可能性がある。

本発明の化合物は、例えば、後述の実施例で示す方法によって合成できる。ただし、本発明の化合物の合成方法は、式（１）～（３）に示す化学構造を実現できる方法であれば、特に限定されず、実施例の方法に限定されない。

（用途）
本発明の化合物は、光応答性ＮＯ^＋ドナーに適用できる。本発明の化合物を含む光応答性ＮＯ^＋ドナーにあっては、光の照射に応じてＮＯ^＋の出現を制御できる。
そのため、光応答性ＮＯ^＋ドナーは、光の照射時間、照射時期を適宜選択することで、ＮＯ^＋の出現を時空間的に制御する用途に適用できる。
例えば、光応答性ＮＯ^＋ドナーをマウス等のモデル生物に投与し、光の照射時間、照射時期を適宜選択することで、ＮＯ^＋の放出時間、放出時期を時間的に制御できる。加えて、光を照射するモデル生物の臓器部位を選択することで、ＮＯ^＋がモデル生物の体内で放出される部位を選択的に、かつ、空間的に制御できる。

生体内でのＮＯ^＋の時空間制御への適用を考慮する場合、外部刺激としての光は可視光が好ましい。この場合、可視光の波長は、５００ｎｍ以上が好ましく、５６０ｎｍ以上がより好ましく、６５０ｎｍ以上がさらに好ましい。可視光域の光の波長が前記下限値以上であると、生体に対する負荷が少なく、また、生体透過性もよくなり、生体内部の組織、細胞に本発明の化合物が存在するときでも光応答性がよくなる。
可視光域の光の波長の上限値は特に限定されない。可視光域の光の波長の上限値は、例えば、８００ｎｍ程度である。
以上より、可視光域の光の波長は、５００～８００ｎｍが好ましく、５６０～８００ｎｍがより好ましく、６５０～８００ｎｍがさらに好ましい。ただし、本発明において外部刺激としての光は可視光に限定されない。

（光応答性ＮＯ^＋ドナー）
光応答性ＮＯ^＋ドナーは、本発明の化合物を含む。光応答性ＮＯ^＋ドナーは、液状媒体をさらに含んでもよい。本発明の光応答性ＮＯ^＋ドナーは、本発明の効果が得られる範囲内であれば、本発明の化合物および液状媒体以外の任意成分として添加剤をさらに含んでもよい。

液状媒体は、水性媒体でも有機媒体でもよい。
水性媒体としては、水、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸－リン酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、メタリン酸緩衝液、ソルビン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン－ＨＣｌ緩衝液（トリス塩酸緩衝液）、ＭＥＳ緩衝液（２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液）、ＴＥＳ緩衝液（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸緩衝液）、ＭＯＰＳ緩衝液（３－モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液）等の緩衝液；グリシン－塩酸緩衝液、グリシン－ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン－ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン－ＫＯＨ緩衝液等のアミノ酸系緩衝液；トリス－ホウ酸緩衝液、ホウ酸－ＮａＯＨ緩衝液、ホウ酸緩衝液等のホウ酸系緩衝液；イミダゾール緩衝液等が挙げられる。
有機媒体としては、エタノール、２－プロパノール等のアルコール；ジエチルエーテル等のエーテル；トリエチルアミン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、アセトニトリル等の脂肪族溶媒；トルエン、クロロベンゼン等の芳香族溶媒が挙げられる。

添加剤としては、水酸化ナトリウム、アンモニア塩等のｐＨ調整剤；乳糖、デンプン、ソルビトール等の賦形剤；アラビアゴム等の乳化剤；メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等の懸濁剤；プロピレングリコール等の安定剤；ベンジルアルコール等の保存剤等が挙げられる。

光応答性ＮＯ^＋ドナーの組成は、特に限定されない。光応答性ＮＯ^＋ドナーの組成は、所望の用途、使用方法に応じて適宜変更できる。
例えば、本発明の化合物の含有量は、１～１０００ｎＭでもよく、１～１０００μＭでもよく、１～１０００ｍＭでもよい。

光応答性ＮＯ^＋ドナーの剤型は特に限定されない。所望の用途、使用方法、使用量、用法、用量に応じて適時選択できる。剤型の具体例としては、液剤、乳剤、懸濁剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、座剤等が挙げられる。
光応答性ＮＯ^＋ドナーは、剤型に応じて経口投与、非経口投与のいずれにも適用できる。非経口投与としては、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮投与、経鼻投与、経粘膜投与等が挙げられる。

光応答性ＮＯ^＋ドナーは、血管弛緩作用を示すことから血管弛緩剤としても有用である。血管拡張に際しては、例えばｓＧＣ（ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ）のような酵素が関与する。光応答性ＮＯ^＋ドナーは、光照射によりＮＯ^＋を放出することで、ｓＧＣを活性化すると考えられる。ｓＧＣの活性化の結果、血管拡張が起き、血管弛緩が観測される。

血管拡張、血管弛緩の程度の制御を目的として、ＯＤＱ（（１Ｈ［１，２，３］ｏｘａｄｉａｚｏｌｏ［４，３－ａｌｐｈａ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ））等のｓＧＣの阻害剤を併用してもよい。ＯＤＱはｓＧＣの酵素活性を阻害して、血管収縮を起こすように作用する。そのため、ＯＤＱ等の阻害剤の併用により、血管拡張、血管弛緩の程度を負に制御することも可能である。

光応答性ＮＯ^＋ドナーは、例えば、ＮＯ^＋の生理活性、生理学的作用の分析のための研究試薬；ＮＯ^＋が生理学的応答に関与する疾患の治療薬として使用できると期待できる。

次に実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されない。

＜合成例＞
以下に示す反応経路により、ＮＯＲＤ－２を合成した。以下、化合物２、化合物３、化合物５、ＮＯＲＤ－２の順に合成反応を詳細に説明する。

（化合物２の合成）
３－ブロモ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン（２．３６ｍＬ，１．６１ｍｍｏｌ）を酢酸（５０ｍＬ）に溶かし、攪拌しながら３７％ホルムアルデヒド水溶液（３２．０ｍｍｏｌ，２．０当量）を加えた。７０℃で５０分間攪拌した後、さらに３７％ホルムアルデヒド水溶液（２．０ｍＬ，１．７当量）を加え、３０分間攪拌した。水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）を加えた後、ジクロロメタンで３回抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過し、溶媒を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）し、化合物２を２．９３ｇ（３５％）、白色固体として得た。
化合物２の^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）６．９３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ），６．８４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），６．５０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，８．６Ｈｚ），２．９１（１２Ｈ，ｓ）．

（化合物３の合成）
化合物２（５．１９ｇ，１２．６ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）の溶液に、－７８℃，アルゴン雰囲気下で１．０５Ｍのｓｅｃ－ｂｕｔｙｌｌｉｔｈｉｕｍのｎ－ヘキサン溶液（３．２７ｍＬ，３７．４ｍｍｏｌ，３．０ｅｑｕｉｖ．）を１０分以上かけて滴下した。１時間攪拌した後、ジクロロジメチルシラン（２．７７ｍＬ，２３．０ｍｍｏｌ，１．８ｅｑｕｉｖ．）を加え、室温にして２時間攪拌した。反応を２規定塩酸でクエンチし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した後に、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥した後に、濾過し、ろ液の溶媒を留去した。残渣をアセトン（６０．０ｍＬ）に溶解し、－１５℃で攪拌しながら過マンガン酸カリウム（４．５５ｇ）を５分ごと６回に分けて溶液に添加した。－１５℃で３０分間撹拌した後、反応混合物をジクロロメタンで洗浄しながらセライトで濾過して、ろ液を濃縮した。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ－ヘキサン＝１／４）で精製し、淡黄色固体として化合物３（１．８０ｇ，５．５５ｍｍｏｌ，４４％）を得た。
化合物３の^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）８．３９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．８４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，９．０Ｈｚ），６．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），３．１０（１２Ｈ，ｓ），０．４６６（６Ｈ，ｓ）．

（化合物５の合成）
化合物４（２．６７ｍＬ，１７．８ｍｍｏｌ，３．３ｅｑｕｉｖ．）の無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）の溶液に、－７８℃，アルゴン雰囲気下で１．０５Ｍのｓｅｃ－ｂｕｔｙｌｌｉｔｈｉｕｍのｎ－ヘキサン溶液（１６．０ｍＬ，１８．３ｍｍｏｌ，３．０ｅｑｕｉｖ．）を１０分以上かけて滴下した。１時間攪拌した後、化合物３（１．７５ｇ，５．４０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液（６０ｍＬ）を滴下添加し、室温に出してさらに１５分間攪拌した。２規定塩酸を加えて反応液をクエンチし、１５分間撹拌した。水を加え、混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後に、ろ液を濃縮した。残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝１５／１→１０／１）で精製した。アルデヒドとヘミアセタールの混合物として回収した精製物をアセトニトリル（４０ｍＬ）に溶解し、２規定塩酸（４０ｍＬ）を加えて室温で５分間撹拌した。ヘミアセタールの加水分解をＥＳＩ－ＭＳで確認し、反応混合物に水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。これをろ過し、ろ液を濃縮して濃青色の固体として化合物５（１．５５ｇ，３．７４ｍｍｏｌ，７０％）を得た。
化合物５の^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）９．８２（１Ｈ，ｓ），８．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，７．２Ｈｚ），７．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，７．５Ｈｚ）７．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．２５（２Ｈ，ｓ），６．９２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），６．６４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），３．４２（１２Ｈ，ｓ），０．６９（３Ｈ，ｓ），０．６５（３Ｈ，ｓ）．

（ＮＯＲＤ－２の合成）
化合物５（９０ｍｇ，０．２００ｍｍｏｌ）およびｐ－アニシジン（２６ｍｇ，０．２１１ｍｍｏｌ，１．１ｅｑｕｉｖ．）の溶液に、酢酸（０．２ｍＬ）を加えた。室温で３０分間撹拌した後、反応混合物に水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（１２６ｍｇ，０．５９５ｍｍｏｌ，３．０ｅｕｉｑｖ．）を加えた。さらに１０分間撹拌した後、反応混合物をジクロロメタンで希釈し、２規定水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ×３回）で洗浄した。水層をジクロロメタンで抽出し、合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。これをろ過し、ろ液を濃縮し、残渣を酢酸（２ｍＬ）に溶かし、亜硝酸ナトリウム（１５ｍｇ，０．２１７ｍｍｏｌ，１．１ｅｑｕｉｖ．）の水（２ｍＬ）の溶液を氷浴上で加えた。氷浴上で２０分間撹拌した後、反応混合物に飽和塩化ナトリウム水溶液（４０ｍＬ）と２規定塩酸（１ｍＬ）を加え、これをジクロロメタンで３回抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に、ろ液を溶媒留去氏、ＭＰＬＣ（ジクロロメタン／メタノール＝９４／６～９０／１０～７０／３０）による精製を行い、ＮＯＲＤ－２を濃青色固体として８０ｍｇ（６８％）得た。
ＮＯＲＤ－２の^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）７．４３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，３．６Ｈｚ），７．２６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），７．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．１５－７．０９（２Ｈ，ｍ），７．０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），６．８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．６８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，９．６Ｈｚ），４．８５（２Ｈ，ｓ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．４４（１２Ｈ，ｂｒｓ），０．６６（３Ｈ，ｓ），０．６４（３Ｈ，ｓ）；
ＮＯＲＤ－２の^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，１２５ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）１６６．６０，１５９．１５，１５４．１９，１４８．３８，１４１．１７，１３７．４２，１３４．５３，１３２．３０，１２９．６３，１２９．３９，１２７．５６，１２７．３７，１２７．０３，１２１．３５，１２１．２６，１１４．７２，１１４．２５，５５．７２，４５．９７，４１．２６，－０．６７，－０．６９；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５１９（［Ｍ－ＮＯ］^＋）；Ａｎａｌ． Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ_３３Ｈ_３７ＣｌＮ_４Ｏ_２Ｓｉ・７／２Ｈ_２Ｏ：Ｃ，６１．１４；Ｈ，６．８４；Ｎ，８．６４．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６１．３１；Ｈ，６．８２；Ｎ，８．６３．

＜ＮＯＲＤ－１の合成＞

上述と同様の操作により、化合物５を合成した。次いで、以下に示す反応経路により、ＮＯＲＤ－１を合成した。

まず、化合物５（５００ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶かし、攪拌しながら酢酸（２．５ｍＬ）と化合物６（２９７ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ，１．１ｅｑｕｉｖ．）を加えた。これを室温で１時間撹拌した後、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（７６９ｍｇ，３．６３ｍｍｏｌ，３．０ｅｑｕｉｖ．）を加え、さらに５分間撹拌を続けた。反応混合物を０．１ＮのＨＣｌ（５０ｍＬ）でクエンチし、ジクロロメタンで３回抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、濾過し、溶媒を留去させた。残渣を酢酸（１４ｍＬ）に溶解し、氷水浴上で撹拌した。反応混合物に、亜硝酸ナトリウム（１００ｍｇ，１．４５ｍｍｏｌ，１．２ｅｑｕｉｖ．）の水溶液（１４ｍＬ）を加えた。撹拌をさらに５分間続けた後、０．１ＮのＨＣｌ（５０ｍＬ）を加えてクエンチした。これをジクロロメタンで３回抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過、濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝１５／１→１０／１）で精製し、化合物７（６１１ｍｇ，０．９４１ｍｍｏｌ，７８％）を濃青色固体として得た。
化合物７の^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）７．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），７．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．２６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），７．１８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，４．５Ｈｚ），７．０９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，４．５Ｈｚ），７．０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），６．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），６．６７（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，９．７Ｈｚ），４．８４（２Ｈ，ｓ），３．４４（１２Ｈ，ｓ），０．９８（９Ｈ，ｓ），０．６５（３Ｈ，ｓ），０．６５（３Ｈ，ｓ），０．２０（６Ｈ，ｓ）．

化合物７（６１１ｍｇ，０．９４１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１４ｍＬ）に溶かし、攪拌しながら０．１ＭのＮａＦ／ＨＦ緩衝液（１４ｍＬ）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌した後、水と飽和食塩水を加え、ジクロロメタンで３回抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した後、濾過し、濾液の溶媒を留去させた。残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝１０／１）および中圧分取液体クロマトグラフ（ジクロロメタン／メタノール＝９４／６→９０／１０→７０／３０）で精製し、ＮＯＲＤ－１（３１２ｍｇ，０．５１０ｍｍｏｌ，５４％）を濃青色の固体として得た。
ＮＯＲＤ－１の^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，１２５ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）１６６．３１，１５８．５４，１５４．００，１４７．５８，１４０．９３，１３７．８１，１３３．６０，１３１．６１，１２９．５５，１２９．４７，１２９．４０，１２７．６０，１２７．５１，１２２．７３，１２０．９１，１１６．４６，１１４．１４，４４．８７，４１．２５，－０．５５，－０．８０；
ＮＯＲＤ－１のＡｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ_３２Ｈ_３５ＣｌＮ_４Ｏ_２Ｓｉ・２Ｈ_２Ｏ：Ｃ，６３．３０；Ｈ，６．４７；Ｎ，９．２３．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，６２．９９；Ｈ，６．２８；Ｎ，９．１６；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）ｃａｌｃｄ：５３５．２５２９３；ｆｏｕｎｄ：５３５．２５２４９（Ｍ^＋，－０．８１ｐｐｍ）．

ＮＯＲＤ－２は、下式で表される化合物である。

ＮＯＲＤ－１は、下式で表される化合物である。

＜ＮＯ^＋放出の確認＞
合成したＮＯＲＤ－２、ＮＯＲＤ－１のＮＯ^＋放出能を評価した。ＮＯ^＋放出能の評価には、ＤＡＮ（２，３－ジアミノナフタレン）を用いた。下式に示すように、ＤＡＮはＮＯ^＋の存在下でＮＡＴ（ナフタレン）を生成する。ＮＡＴの極大蛍光発光波長は、４６０ｎｍである。そのため、４６０ｎｍ付近の傾向を観測することで、ＮＯ^＋によるＮＡＴの生成を確認できる。

ＮＯＲＤ－２、ＮＯＲＤ－１（各１０μＭ）およびＤＡＮ（１０μＭ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．３，総体積１０ｍＬ）を調製し、６３０～６９０ｎｍバンドパスフィルターを装備したＭＡＸ－３０３（朝日分光）を用いて３７℃で光を照射した（８０ｍＷ／ｃｍ^２）。照射時間が０分、１分、２分、３分、４分、５分の時点でサンプルを２０μＬずつ採取した。
各溶液２０μＬをＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳカラム（５μｍ；１５０×４．６ｍｍ）を取り付けた株式会社島津製作所製のＨＰＬＣシステムでモニターした（励起波長３６０ｎｍ，検出波長４６０ｎｍ）。
移動相として、０．１％ギ酸含有ＭｉｌｌｉＱ（Ａ）、０．１％ギ酸含有アセトニトリル（Ｂ）を使用した。使用条件は下記の通りである。
０分，Ｂ５％→２分，Ｂ５％→３分，Ｂ２０％→１５分，Ｂ８０％→１７分，Ｂ８０％→１８分，Ｂ１００％→２３分，１００％→２４分，Ｂ５％→３０分，Ｂ５％．

図２は、ＮＯＲＤ－１、ＮＯＲＤ－２のＮＯ^＋放出能をＨＰＬＣで分析した結果を示す。図２の右側に示すようにＮＯＲＤ－２では、ＮＡＴに由来するピークが測定開始から１３．５分程経過した後に観察された。これに対し図２の左側に示すようにＮＯＲＤ－１では、ＤＡＮに由来するピークのみが観察され、ＮＡＴに由来するピークが観察されない。
以上のことから、ＮＯＲＤ－２が光の照射に応答してＮＯ^＋を放出していることを確認した。加えて、ＮＯＲＤ－２のＨＰＬＣの分析結果におけるＮＡＴのピークの高さから生成量を算出し、１．３μＭのＮＡＴが生成したことを確認した。したがって、少なくとも１．３μＭのＮＯ^＋がＮＯＲＤ－２から生成したと考えられる。

＜血管弛緩応答の確認＞
図３に示すように、ラットの大動脈切片３０をマグヌス管３１に設置し、光照射に対する血管弛緩応答を確認した。

ＮＯ^＋は、ＮＯと同様にｓＧＣのリガンド分子として機能すると考えられる。ｓＧＣは、本来、ＮＯの存在下でＧＴＰをｃＧＭＰに変換する酵素であるが、ＮＯ^＋の存在下でも同様に、ＧＴＰをｃＧＭＰに変換すると予想される（図４）。その結果、血管拡張が起きると考えられる。

図５は、ＮＯＲＤ－２について血管弛緩応答を確認した結果を示すグラフである。まず、実験開始から５分程経過したときに、内皮細胞外のＮＯの産生を抑制するためにＬ－ＮＡＭＥ（株式会社同仁化学研究所製）をラットの大動脈切片を設置したガラス管内の緩衝液に投与した。次に、実験開始から７分程経過したときに、ＮＡ（ノルアドレナリン）を投与したところ、血管収縮が起き、大動脈切片の張力が増加した。
さらに、実験開始から３６分程経過したときに、ＭＡＸ－３０３（朝日分光）を用いて３７℃で３分間、光を照射した（８０ｍＷ／ｃｍ^２）。このとき、大動脈切片の張力はほとんど変化しなかった。
続いて、ＮＯＲＤ－２を投与し、再度、ＭＡＸ－３０３（朝日分光）を用いて３７℃で３分間、光を照射した（８０ｍＷ／ｃｍ^２）。このとき、大動脈切片の張力は急激に低下し、血管弛緩が起きたことを確認した。

図６は、ＯＤＱの存在下でＮＯＲＤ－２について血管弛緩応答を確認した結果を示すグラフである。図６に示す実験においては、ｓＧＣの阻害剤であるＯＤＱを使用した。具体的にはまず、実験開始から５分程経過したときに、Ｌ－ＮＡＭＥ、ＯＤＱ、ＮＡを順次投与し、大動脈切片の張力の上昇、血管収縮を確認した。
次いで、実験開始から２９分程経過したときに、ＭＡＸ－３０３（朝日分光）を用いて３７℃で３分間、光を照射した（８０ｍＷ／ｃｍ^２）。このとき、大動脈切片の張力はほとんど変化しなかった。
続いて、ＮＯＲＤ－２を投与し、実験開始から３９分程経過したときに再度、ＭＡＸ－３０３（朝日分光）を用いて３７℃で３分間、光を照射した（８０ｍＷ／ｃｍ^２）。このとき、大動脈切片の張力は低下し、血管弛緩が起きたことを確認した。

図５、図６の結果を比較すると、ＯＤＱの存在の有無で大動脈切片の張力の低下量が変化することがわかる。これは、ＮＯＲＤ－２から放出されたＮＯ^＋によって活性化したｓＧＣの活性がＯＤＱによって阻害されたためであると考えられる。このように、ＮＯＲＤ－２による血管拡張、血管弛緩の作用は、ＯＤＱとの併用によって負に制御できることを確認した。
本来、ｓＧＣはＮＯによって活性化することから、図５、６に示す結果によれば、ＮＯ^＋はＮＯと同様の生理活性を血管弛緩において示すことがわかる。このことから、ＮＯ^＋は、血管弛緩以外にも生体内でＮＯと同様の生理学的応答に関与し得ると考えられる。

本発明によれば、光の照射に応答してＮＯ^＋を放出する化合物；前記化合物を含む光応答性ＮＯ^＋ドナーを提供できる。

２０…化合物、２１…ローダミン色素含有基、２２…ＮＯ^＋放出部位、２３…ラジカルカチオン中間体、２４…アニリルラジカル、３０…ラットの大動脈切片、３１…マグヌス管、１００…合成化合物、１０１…酸素含有型のローダミン色素部位、１０２…ＮＯ放出部位、１０３…フェノキシラジカル、１０４…キノン体

Claims (4)

1. 下式（１）～（３）で表される化合物。
   

   

   式（１）～（３）中、Ｘはケイ素含有型のローダミン色素基またはリン含有型のローダミン色素基であり、Ｒはメチル基またはエチル基である。
2. 前記ケイ素含有型のローダミン色素基が、下式（ｇ１）～下式（ｇ４）のいずれかで表される基である、請求項１に記載の化合物。
   

   
3. 前記リン含有型のローダミン色素基が、下式（ｈ１）～下式（ｈ４）のいずれかで表される基である、請求項１または２に記載の化合物。
   

   

   式（ｈ１）～式（ｈ４）中、リン原子に結合する「Ｐｈ」はフェニル基である。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物を含む、光応答性ＮＯ^＋ドナー。

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