JP2022016209A - 細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、及び細胞の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 細胞を高密度に培養するためのガス透過性と強度に優れた細胞培養容器を提供する。【解決手段】 少なくとも１つのポートを有し、対向する平面状器材によって形成された袋状の閉鎖系の細胞培養容器１であって、平面状器材１１の少なくとも一方がガス透過性フィルムからなり、少なくとも１つのガス透過性フィルムにおける容器の外面側に通気性補強部材１３を備えると共に、当該ガス透過性フィルムにおける容器の内面側に細胞を培養するための培養空間Ｓを備え、当該ガス透過性フィルムの厚みが１００μｍ未満である。【選択図】 図１

Description

本発明は、細胞培養技術に関し、特に細胞を高密度で培養可能にするための細胞培養容器に関する。

近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、袋状の細胞培養容器を用いて閉鎖系で細胞を自動的に大量培養することが提案されている。

袋状の細胞培養容器を用いて細胞を培養する場合、容器の強度とガス透過性の大きさが重要となる。
例えば、ポリエチレンやエチレン酢酸ビニルなどのガス透過性フィルムを用いて袋状の細胞培養容器を製造する場合、容器の強度を確保するためには、通常１００μｍ以上の厚みが必要であった。

しかしながら、この場合、培養細胞の密度が５０万個／ｃｍ^２以上の高密度になると、容器のガス透過性能が不十分となり、細胞の周辺の酸素濃度が低下して、増殖効率が低減してしまうという問題があった。
一方、例えば５０μｍ以下の厚みのガス透過性フィルムを用いて細胞培養容器を製造する場合、培養細胞が高密度の状態でもガス透過性能は十分であるものの、容器の強度が不十分となって破袋の恐れが生じ、取り扱いが困難になるという問題があった。

特開２０１６－７７１６４号公報

そこで、袋状の細胞培養容器のガス透過性能と強度を向上させるために、容器を構成するフィルムとして、その材料や密度が異なるものを積層して製膜した多層フィルムを用いる場合があるが、大きな性能向上には至っていない。

また、ガス透過性能に優れた素材として、シリコーン材を挙げることができる。シリコーン材は強度が低いものの、厚みを３００μｍ以上にしても優れたガス透過性能を得ることができるため、取り扱い時の強度を確保することはできる。
しかしながら、シリコーン材には、ポートなどを溶着することが困難であるという問題があった。また、シリコーン材は、放射線滅菌などによって有害な物質が溶出されるため、その後の培養性能に悪影響を及ぼす危険性があった。さらに、シリコーン材は、接着性細胞の培養に必要な表面処理が困難であるため、浮遊性細胞用の培養容器の製造は可能であるが、接着性細胞用の培養容器の製造が困難であるという問題もあった。

そこで、本発明者らは鋭意研究して、容器を構成するガス透過性フィルムの外面側に通気性補強部材を備えることで、ガス透過性フィルムの厚みを１００μｍ未満にした場合でも取り扱い時の強度を確保でき、かつガス透過性の大きさを細胞を高密度で培養可能なものとすることに成功して、本発明を完成させた。

ここで、特許文献１には、ガス透過性フィルムに支持層を備えた細胞培養容器が記載されている。しかしながら、その支持層はフラスコなどの容器内に平置きに載置されるガス透過性フィルムの撓み防止するためのものであり、支持層によって容器の強度を向上させるものではなく、袋状の細胞培養容器のガス透過性と強度を向上させて細胞を高密度で培養可能にするという課題を解消可能なものではなかった。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞を高密度で培養するためのガス透過性と強度に優れた細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、及び細胞の製造方法の提供を目的とする。

上記目的を達成するため、本発明の細胞培養容器は、少なくとも１つのポートを有し、対向する平面状器材によって形成された袋状の閉鎖系の細胞培養容器であって、前記平面状器材の少なくとも一方がガス透過性フィルムからなり、少なくとも１つの前記ガス透過性フィルムにおける容器の外面側に通気性補強部材を備えると共に、当該ガス透過性フィルムにおける容器の内面側に細胞を培養するための培養空間を備え、当該ガス透過性フィルムの厚みが１００μｍ未満である構成としてある。

また、本発明の細胞培養容器を、前記通気性補強部材が、メッシュ状材料又は多孔質材料からなる構成とすることが好ましい。
また、本発明の細胞培養容器を、前記通気性補強部材が、凹凸加工されたフィルムからなり、前記ガス透過性フィルムと前記通気性補強部材を密着させた際に前記凹凸加工によって空気が通り抜けることが可能な隙間が形成された構成とすることも好ましい。

また、本発明の細胞培養容器を、前記通気性補強部材が、前記ガス透過性フィルムに熱溶着により固定された構成とすることが好ましい。
また、本発明の細胞培養容器を、前記通気性補強部材が外面側に備えられたガス透過性フィルムの厚みが、７０μｍ以下で１０μｍ以上である構成とすることが好ましく、該ガス透過性フィルムの厚みが、３５μｍ以下で２０μｍ以上である構成とすることがより好ましい。

また、本発明の細胞培養容器の製造方法は、少なくとも１つのポートを有し、対向する平面状器材によって形成された袋状の細胞培養容器の製造方法であって、１００μｍ未満の厚みのガス透過性フィルムを前記平面状器材として用いて、対向する前記平面状器材に前記ポートを挟み込んで袋状に成形し、前記ガス透過性フィルムにおける容器の内面側に細胞を培養するための培養空間を形成し、前記ガス透過性フィルムの外面側周縁部又は外面側全面に通気性補強部材を固定する方法としてある。

また、本発明の細胞培養容器の製造方法は、少なくとも１つのポートを有し、対向する平面状器材によって形成された袋状の細胞培養容器の製造方法であって、１００μｍ未満の厚みのガス透過性フィルムを前記平面状器材として用いて、前記ガス透過性フィルムの外面側周縁部又は外面側全面に通気性補強部材を固定し、対向する前記平面状器材に前記ポートを挟み込んで袋状に成形し、前記ガス透過性フィルムにおける容器の内面側に細胞を培養するための培養空間を形成する方法としてある。

さらに、本発明の細胞の製造方法は、上記の細胞培養容器を用いて細胞を培養する方法としてある。

本発明によれば、細胞を高密度で培養するためのガス透過性と強度に優れた細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、及び細胞の製造方法の提供が可能となる。

本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の平面図（ａ）及び正面図（ｂ）を示す図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養容器に用いることができるガス透過性フィルムの酸素透過度を示す図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養容器に備えられる通気性補強部材の拡大図（ａ）、図１（ａ）のＡＡ断面における部分断面図（ｂ）、及び同ＢＢ断面における部分断面図（ｃ）を示す図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養容器による細胞培養の様子を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の変形例の平面断面図（ガス透過性フィルムと通気性補強部材の間）である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の変形例の平面断面図に対応する平面図（図示省略）のＣＣ断面における部分断面図（ａ）、及び同ＤＤ断面における部分断面図（ｂ）である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の変形例の平面断面図（２つのガス透過性フィルムの間）を示す図である。 実施例１の細胞培養容器（試作品１）の写真を示す図である。 実施例１の細胞培養容器のＥＥ断面における部分断面写真（ａ）、及び同ＦＦ断面における部分断面写真（ｂ）を示す図である。 実施例１の細胞培養容器に液体を充填して強度の確認を行う様子を表す写真を示す図である。 実施例２の細胞培養容器（試作品２）の写真を示す図である。 実施例２の細胞培養容器のＧＧ断面における部分断面写真を示す図である。 試験１の細胞培養容器（実施例３：フィルム厚33μｍ＋メッシュ溶着，実施例４：フィルム厚50μｍ＋メッシュ溶着，比較例１：フィルム厚110μｍ）のガス透過性能の測定結果を表すグラフを示す図である。 試験２の細胞培養容器（実施例５：フィルム厚50μｍ＋凹凸加工フィルム溶着，比較例２：フィルム厚110μｍ）のガス透過性能の測定結果を表すグラフを示す図である。 試験３の細胞培養容器（実施例６：フィルム厚33μｍ＋メッシュ溶着，比較例３：フィルム厚110μｍ）を用いた細胞培養の結果を表すグラフを示す図である。

以下、本発明の細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、及び細胞の製造方法の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態及び実施例の具体的な内容に限定されるものではない。

本実施形態の細胞培養容器は、少なくとも１つのポートを有し、対向する平面状器材によって形成された袋状の閉鎖系の細胞培養容器であって、平面状器材の少なくとも一方がガス透過性フィルムからなり、少なくとも１つのガス透過性フィルムにおける容器の外面側に通気性補強部材を備えると共に、当該ガス透過性フィルムにおける容器の内面側に細胞を培養するための培養空間を備え、当該ガス透過性フィルムの厚みが１００μｍ未満であることを特徴とする。

具体的には、図１（ａ）に示すように、本実施形態の細胞培養容器１は、例えば矩形状の２枚の平面状器材１１の周縁部Ｈをヒートシールにより熱溶着させることによって得ることができる。２枚の平面状器材１１の間に形成された空間は、細胞を培養するための培養空間Ｓとして用いられる。平面状器材１１における培養空間Ｓを形成する領域は、細胞培養容器１において培養部を構成する。なお、平面状器材１１の全体形状や周縁部Ｈの形状、及び培養空間Ｓの形状は特に限定されず、任意の形状のものを用いることができる。

平面状器材１１の少なくとも一方は、ガス透過性フィルムからなり、両方にガス透過性フィルムからなるものを用いることが好ましい。
なお、平面状器材１１の「平面状」は、器材表面が凹凸のない平坦であることを意味せず、器材の全体形状が概ねであることを意味しており、平面状器材１１の表面に凹凸が形成されたものも含まれる。

平面状器材１１としては、樹脂フィルムなどを好適に用いることができ、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン系樹脂等を用いることができる。例えば、ポリエチレン、エチレンとα－オレフィンの共重合体、エチレンと酢酸ビニルの共重合体、エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等を挙げることができる。また、ポリオレフィン、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーン樹脂等を用いることもできる。さらに、シリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン－酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）、ポリオレフィン樹脂、フッ素系樹脂等を用いてもよい。

ガス透過性フィルムとしては、上記の平面状器材１１の材料のうち、特にガス透過性能に優れた熱可塑性樹脂を用いることが好ましく、例えば直鎖状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ，Linear Low Density Polyethylene）などのポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系樹脂を好適に用いることができる。また、細胞培養容器１の内部を視認可能にするために、ガス透過性フィルムは、透明材であることが好ましい。

ガス透過性フィルムは、一般にその厚みが小さければ小さい程、ガス透過性能が高くなる。例えば、図２に示すように、直鎖状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ，Linear Low Density Polyethylene）からなるフィルムでは、厚みが１１０μｍの場合の酸素透過度（ｍｌ／ｍ^２・２４Ｈｒ・ａｔｍ）は約９，０００であり、厚みが７５μｍの場合の酸素透過度は約１３，０００であり、厚みが５０μｍの場合の酸素透過度は約１９，０００であり、厚みが３０μｍの場合の酸素透過度は約３１，０００であり、厚みが２０μｍの場合の酸素透過度は約４８，０００となっている。

一方、ガス透過性フィルムの厚みが小さくなればなる程、その取り扱いが困難となり、特に厚みが３０μｍや２０μｍのものは食品用ラップ（厚み約１０μｍ）のような状態であるため、容器の強度が不足して破袋の恐れがある。
このため、本実施形態の細胞培養容器１は、ガス透過性と強度に優れたものとするため、後述のように、ガス透過性フィルムの外側面に通気性補強部材１３を備えた構成としている。

平面状器材１１の周縁部Ｈにおいて、少なくとも１つのポート１２が、２枚の平面状器材１１に挟み込まれ、熱溶着されて備えられている。図１（ａ）、図１（ｂ）において、ポート１２は、平面状器材１１の両端部において対向して２つ備えられているが、ポート１２の個数はこれに限定されず、１個でも３個以上であってもよい。
ポート１２の材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン系エラストマー、ＦＥＰなどの熱可塑性樹脂等を用いることができる。

ガス透過性フィルムの外面側には、通気性補強部材１３が固定されており、図１（ａ）、図１（ｂ）の例では、２枚のガス透過性フィルムのそれぞれに通気性補強部材１３が固定されている。
本実施形態の細胞培養容器１は、通気性補強部材１３を備えることによって、ガス透過性フィルムの厚みが１００μｍ未満であっても、取り扱い時の強度を確保することが可能になっている。

また、前述のとおり、ガス透過性フィルムは、一般にその厚みが小さければ小さい程、ガス透過性能が高くなる一方で、ガス透過性フィルムの厚みが小さくなればなる程、その取り扱いが困難となる。このため、本実施形態の細胞培養容器１は、通気性補強部材１３を用いることによって、ガス透過性と強度の両方を向上させている。
このような観点から、通気性補強部材１３が外面側に備えられたガス透過性フィルムの厚みは、７０μｍ以下で１０μｍ以上であることがより好ましく、３５μｍ以下で２０μｍ以上であることがさらに好ましい。

なお、本実施形態の細胞培養容器１において、ガス透過性フィルムが平面状器材１１の一方のみに用いられている場合には、通気性補強部材１３は、当該ガス透過性フィルムの外側面にのみ備えることもできる。

本実施形態において、通気性補強部材１３としては、大きく分けて、第一の補強部材と第二の補強部材の２種類を用いることができる。
第一の補強部材としては、図３（ａ）に示すようなメッシュ状材料を用いることができる。また、第一の補強部材として、例えばスポンジのような多孔質材を用いることもできる。

具体的なメッシュ状材料及び多孔質材としては、特に限定されないが、平面状器材１１と融点が近く、材質が同様のものが好ましく、例えばポリエチレン製メッシュ材（株式会社ＮＢＣメッシュテック，PE 200目等）やポリエチレン製多孔質（帝人株式会社，ミライム 大口径≦3μｍ）などを好適に用いることができる。

本実施形態の細胞培養容器１において、通気性補強部材１３としては、図３（ａ）に示すメッシュ状材料を好適に用いることができる。また、通気性補強部材１３としてメッシュ状材料を用いた場合の図１（ａ）のＡＡ断面における部分断面図（培養空間が含まれる領域）を図３（ｂ）に、同ＢＢ断面における部分断面図（周縁部Ｈの溶着領域）を図３（ｃ）に示す。

通気性補強部材１３としてメッシュ状材料や多孔質材などを用いる場合、通気性補強部材１３は、ガス透過性フィルムの外面側における周縁部Ｈに固定された構成とすることが好ましい。また、通気性補強部材１３を、ガス透過性フィルムの外面側の全面に固定された構成とすることもできる。
このような通気性補強部材１３のガス透過性フィルムの外面側への固定は、熱溶着によって好適に行うことが可能である。

図４において、通気性補強部材１３としてメッシュ状材料を用いて形成された細胞培養容器１の中に、培養液を充填すると共に、培養液によって容積が拡大された培養空間Ｓに細胞２を播種して、培養が行われる様子が示されている。

本実施形態の細胞培養容器１によって培養される細胞２としては、特に限定されず、培養液中に浮遊させて培養が行われるリンパ球や樹状細胞などの浮遊性細胞であっても、容器内の培養部に接着させて培養が行われる人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、肝細胞、膵島細胞、心筋細胞、角膜内皮細胞、及び活性化工程のリンパ球等の接着性細胞であってもよい。

このような、通気性補強部材１３を備えた細胞培養容器１によれば、ガス透過性と強度に優れたものとすることができるため、細胞を高密度で培養することが可能である。
なお、通気性補強部材１３として後述する第二の補強部材を用いた場合についても、同様に細胞を高密度で培養することが可能である。

次に、通気性補強部材として第二の補強部材を用いた本実施形態の細胞培養容器の変形例について、図５～図７を参照して説明する。
本変形例では、第二の補強部材として、容器の内面側に凹凸が形成されたフィルム（以下、凹凸加工フィルムと称する場合がある）が用いられている。
凹凸加工フィルムの材料としては、特に限定されないが、ガス透過性フィルムと融点が近く、材質が同様のものが好ましく、特に直鎖状低密度ポリエチレンなどを好適に用いることができる。

本実施形態の細胞培養容器の変形例の平面断面図（ガス透過性フィルムと通気性補強部材の間）を図５に示す。また、同平面断面図に対応する平面図（図示省略）のＣＣ断面における部分断面図を図６（ａ）に、同ＤＤ断面における部分断面図を図６（ｂ）に示す。さらに、本実施形態の細胞培養容器の変形例の平面断面図（２つのガス透過性フィルムの間）を図７に示す。

これらの図に示されるように、細胞培養容器１ａにおいて、通気性補強部材１３ａとして凹凸加工が施された樹脂フィルムが用いられ、通気性補強部材１３ａには凹凸加工によって複数の突起部１３１ａが形成されている。そして、凹凸加工が形成された内面側（突起部１３１ａが形成された側）が、ガス透過性フィルムの外側面に積層して備えられている。

通気性補強部材１３ａは、ガス透過性フィルムの外面側における周縁部Ｈａに固定されており、かつ、周縁部Ｈａにおいて、通気性補強部材１３ａとガス透過性フィルムが密着していない複数の通気口Ｔが形成されている。
通気孔Ｔの形状や個数は、図５に示すものに限定されず、開口径が数十μｍ程度の微細な通気孔を多数形成することも好ましい。

細胞培養容器１ａにおいて、このような通気孔Ｔを形成することによって、通気性補強部材１３ａの内面側の凹凸加工における隙間と通気孔Ｔを介して、ガス透過性フィルムの外側面から細胞培養容器１ａの外部に空気の抜ける通路を形成することが可能になっている。
また、該凹凸加工における隙間と通気孔Ｔに対して送風を行うことにより、細胞培養容器１ａのガス透過性能をより向上させることも可能である。

このように細胞培養容器１ａにおいて通気孔Ｔを形成するために、通気性補強部材１３ａのガス透過性フィルムの外面側周縁部Ｈａへの固定は、例えば図５に示されるように、直方体状の突起部１３１ａの壁面に平行な通気孔Ｔが形成されるように行うことが好ましい。
また、通気性補強部材１３ａのガス透過性フィルムの外面側への固定は、熱溶着によって好適に行うことが可能である。

細胞培養容器１ａにおいて、平面状器材１１ａ及びポート１２ａは、それぞれ前述した細胞培養容器１における平面状器材１１及びポート１２と同様の構成とすることができる。
また、通気性補強部材１３ａが外面側に備えられたガス透過性フィルムの厚みも、７０μｍ以下で１０μｍ以上であることがより好ましく、３５μｍ以下で２０μｍ以上であることがさらに好ましい。

このように、細胞培養容器１ａにおいて、通気性補強部材１３ａを備えることによって、容器をガス透過性と強度に優れたものにすることができるため、培養空間Ｓａに培養液を充填して細胞を播種することで、細胞を高密度で培養することが可能である。

また、本実施形態の細胞の製造方法は、前述した本実施形態の細胞培養容器を用いて細胞を培養することを特徴とする。

さらに、本実施形態の細胞培養容器の製造方法は、少なくとも１つのポートを有し、対向する平面状器材によって形成された袋状の細胞培養容器の製造方法であって、１００μｍ未満の厚みのガス透過性フィルムを平面状器材として用いて、対向する平面状器材にポートを挟み込んで袋状に成形し、ガス透過性フィルムにおける容器の内面側に細胞を培養するための培養空間を形成し、ガス透過性フィルムの外面側周縁部又は外面側全面に通気性補強部材を固定することを特徴とする。

このような細胞培養容器の製造方法によれば、袋状の容器を成形した後に通気性補強部材をガス透過性フィルムの外側面に熱溶着させることなどによって、ガス透過性と強度に優れた細胞培養容器を容易に製造することが可能である。

また、本実施形態の細胞培養容器の製造方法として、少なくとも１つのポートを有し、対向する平面状器材によって形成された袋状の細胞培養容器の製造方法であって、１００μｍ未満の厚みのガス透過性フィルムを平面状器材として用いて、ガス透過性フィルムの外面側周縁部又は外面側全面に通気性補強部材を固定し、対向する平面状器材にポートを挟み込んで袋状に成形し、ガス透過性フィルムにおける容器の内面側に細胞を培養するための培養空間を形成することも好ましい。

このような細胞培養容器の製造方法によれば、通気性補強部材をガス透過性フィルムの外側面に熱溶着させることにより容器の器材を作成した後、この器材を袋状に成形することによって、ガス透過性と強度に優れた細胞培養容器を容易に製造することが可能である。

以上説明したように、本実施形態の細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、及び細胞の製造方法によれば、細胞を高密度で培養するためのガス透過性と強度に優れた細胞培養容器を製造することができ、これによって細胞を大量培養することが可能である。

以下、本発明の実施形態に係る細胞培養容器の効果を確認するために行った実施例及び試験について、具体的に説明する。

［実施例１］
本実施形態の細胞培養容器の試作品１を作製した。
具体的には、平面状器材として厚み３０μｍの直鎖状低密度ポリエチレン（東洋製罐グループホールディングス株式会社製）２枚、通気性補強部材としてポリエチレン製メッシュ材（株式会社ＮＢＣメッシュテック，ＰＥ２００目）２枚を使用し、周縁部に１つのポートを挟んで熱溶着により袋状に形成した。外形のサイズは１２０ｍｍ×６５ｍｍであり、培養空間の底面積は４８ｃｍ^２であった。この細胞培養容器の試作品の写真を図８に示す。また、この試作品の図８のＥＥ断面における部分断面写真を図９（ａ）に、同ＦＦ断面における部分断面写真を図９（ｂ）に示す。

これらの図に示されるように、厚み３０μｍの極めて薄い平面状器材を用いた場合でも、その外側面にメッシュ状材料からなる通気性補強部材を備えることによって、袋状の細胞培養容器を形成できていることが分かる。なお、図９（ａ）では、２枚の平面状器材が下方の通気性補強部材の付近に位置し、上方の通気性補強部材が浮き上がった状態で撮影されている。また、図９（ｂ）では、薄いポリエチレンフィルムとポリエチレン製メッシュ材がしっかり溶着されている様子が分かる。

また、この細胞培養容器の試作品１の培養空間にインク入りの液体２０ｍｌを入れたとき、液厚は４ｍｍであった。そして、この細胞培養容器を手で叩くことにより、その強度を確認した。その結果、図１０に示されるように、細胞培養容器は破袋することなく、十分な強度を備えていることが分かった。

［実施例２］
本実施形態の細胞培養容器の試作品２を作製した。
具体的には、平面状器材として厚み３０μｍの直鎖状低密度ポリエチレン（東洋製罐グループホールディングス株式会社製）２枚、通気性補強部材として凹凸加工フィルム（厚み110μｍ、幅0.1mm，長さ1mm，高さ0.1mm，間隔1mmの突起を形成したもの）２枚を使用し、周縁部を熱溶着により袋状に形成した。外形のサイズは１２０ｍｍ×６５ｍｍであった。この細胞培養容器の試作品２の写真を図１１に示す。また、この細胞培養容器の図１１のＧＧ断面における部分断面写真を図１２に示す。

これらの図に示されるように、厚み３０μｍの極めて薄い平面状器材を用いた場合でも、その外側面に凹凸加工フィルムからなる通気性補強部材を備えることによって、袋状の細胞培養容器を形成できていることが分かる。

［試験１］
本実施形態の細胞培養容器として、フィルムの厚みが異なるものを準備すると共に、従来の細胞培養容器を準備して、それぞれのガス透過性能を比較する試験を行った。

具体的には、本実施形態の細胞培養容器として、次の２種類（実施例３：３３μｍ＋メッシュ溶着，実施例４：５０μｍ＋メッシュ溶着）を準備した。
すなわち、厚み３３μｍと５０μｍの直鎖状低密度ポリエチレン（東洋製罐グループホールディングス株式会社製）各２枚、通気性補強部材としてポリエチレン製メッシュ材（株式会社ＮＢＣメッシュテック，ＰＥ２００目）４枚を使用し、周縁部に１つのポートを挟んで熱溶着により袋状に形成した。外形のサイズ１２０ｍｍ×６５ｍｍであり、培養空間の底面積は４８ｃｍ^２であった。

また、従来の細胞培養容器（比較例１）として、厚み１１０μｍの直鎖状低密度ポリエチレン（東洋製罐グループホールディングス株式会社製）２枚を使用し、周縁部に１つのポートを挟んで熱溶着により袋状に形成した。外形のサイズは１２０ｍｍ×６５ｍｍであり、培養空間の底面積は４８ｃｍ^２であった。

そして、各細胞培養容器内における底面付近の酸素ガス濃度の変化を測定した。
具体的には、各細胞培養容器内に非接触式酸素濃度計を設置して、純水３０ｍｌを充填し、各細胞培養容器内における底面付近の水の溶存酸素濃度の変化を測定した。
このとき、各細胞培養容器を培養用治具に固定して、３７℃のＣＯ_２インキュベータに入れて一旦放置し、容器内の溶存酸素を大気中の酸素濃度である約２１％にした。容器内の酸素濃度が安定した後、ＣＯ_２インキュベータ内の酸素濃度を５％に下げた。

また、培養用治具としては、細胞培養容器が配置される架台の上面全体と、細胞培養容器を上方から押圧する押圧部材の下面全体とが平坦なものを使用した。なお、細胞培養容器は、架台の上面及び押圧部材の下面のサイズより小さい。以下の試験においても同様である。

ここで、容器周囲の酸素濃度が２１％から５％に変化することによって容器内外に酸素分圧差が生じるため、容器内の酸素がガス透過性フィルムを介して容器の中から抜け出す。このとき、酸素濃度の変化速度は、フィルムのガス透過性能と相関があるため、これによってガス透過性能を定量的に測定することができる。その結果を図１３に示す。

同図に示されるように、実施例３，４の細胞培養容器は、比較例１の細胞培養容器に比べて、酸素濃度が大きく変化しており、酸素透過性に優れていることが分かる。
具体的には、実施例３の細胞培養容器における１分あたりの酸素濃度変化量の最大値は、１．１％／分であり、実施例４の細胞培養容器における１分あたりの酸素濃度変化量の最大値は、０．８％／分であった。

これに対して、比較例１の細胞培養容器における１分あたりの酸素濃度変化量の最大値は、０．４％／分であった。すなわち、実施例３のガス透過性能は比較例１の２．７５倍を示し、実施例４のガス透過性能は比較例１の２倍を示していた。
このように、本実施形態の細胞培養容器は、取り扱いに適する強度を備え、かつ優れた酸素透過性を示すことが分かった。

［試験２］
本実施形態の細胞培養容器と従来の細胞培養容器を準備して、それぞれのガス透過性能を比較する試験を行った。

具体的には、本実施形態の細胞培養容器（実施例５）として、厚み５０μｍの直鎖状低密度ポリエチレン（東洋製罐グループホールディングス株式会社製）２枚、通気性補強部材として凹凸加工フィルム（厚み110μｍ、幅0.1mm，長さ1mm，高さ0.1mm，間隔1mmの突起を形成したもの）２枚を使用し、周縁部に１つのポートを挟んで熱溶着により袋状に形成した。外形のサイズは１２０ｍｍ×６５ｍｍであり、培養空間の底面積は４８ｃｍ^２であった。

また、従来の細胞培養容器（比較例２）として、試験１と同様のものを準備した。
そして、各細胞培養容器に純水３０ｍｌ入れて、細胞培養容器内における底面付近の酸素ガス濃度の変化を試験１と同様に測定した。その結果を図１４に示す。

なお、図１４において、測定開始時の実施例５の細胞培養容器内の酸素濃度が２２％程度であるのに対し、比較例２の細胞培養容器内の酸素濃度が２４％程度であった理由は、本試験で用いた非接触式酸素濃度計による測定は、容器内に取り付けた素子の変化を測定器で非接触にて行う仕組みであり、素子と計測部が接触している場合が正確な値であって、素子と測定部が離れるにつれ値が大きくなる特性であるため、通常３７℃の溶存酸素は２１％であるが、容器の厚みや設置状態によって大きい値となる。ただし、変化量については影響がなく、酸素透過性を変化量にもとづき判断しているため、性能評価の上では問題のない測定である。

図１４に示されるように、実施例５の細胞培養容器は、比較例２の細胞培養容器に比べて、酸素濃度が大きく変化しており、酸素透過性に優れていることが分かる。
具体的には、実施例５の細胞培養容器における１分あたりの酸素濃度変化量の最大値は、０．５％／分であった。

これに対して、比較例２の細胞培養容器における１分あたりの酸素濃度変化量の最大値は、０．２％／分であった。すなわち、実施例５のガス透過性能は比較例２の２．５倍を示していた。
このように、本実施形態の細胞培養容器は、取り扱いに適する強度を備え、かつ優れた酸素透過性を示すことが分かった。

［試験３］
本実施形態の細胞培養容器と従来の細胞培養容器を用いて細胞培養を行い、これらの培養性能を比較する試験を行った。

具体的には、本実施形態の細胞培養容器（実施例６）における平面状器材として厚み３３μｍの直鎖状低密度ポリエチレン（東洋製罐グループホールディングス株式会社製）２枚を使用すると共に、通気性補強部材としてポリエチレン製メッシュ材（株式会社ＮＢＣメッシュテック，ＰＥ２００目）２枚を使用して、周縁部の長手方向両端に２つのポートを挟んで熱溶着により袋状に形成した。外形のサイズは１２０ｍｍ×６５ｍｍであり、培養空間の底面積は４８ｃｍ^２であった。

また、従来の細胞培養容器（比較例３）における平面状器材として厚み１１０μｍの直鎖状低密度ポリエチレン（東洋製罐グループホールディングス株式会社製）２枚を使用し、周縁部の長手方向両端に２つのポートを挟んで熱溶着により袋状に形成した。外形のサイズは１２０ｍｍ×６５ｍｍであり、培養空間の底面積は４８ｃｍ^２であった。

さらに、培養用治具として、細胞培養容器が配置される架台の上面全体と、細胞培養容器を上方から押圧する押圧部材の下面全体とが平坦なものを使用した。

培養する細胞としては、Jurkat（ヒト白血病Ｔ細胞由来の株化細胞）を使用した。また、培養液としては、細胞科学研究所製ALyS505N-0にFBS（ウシ胎児血清）を２％添加したものを使用し、これらを各細胞培養容器に充填した。このとき、培養開始時に細胞を１００万個／ｍｌとなるように播種し、１日目と２日目に細胞数を計数した後、遠心分離を行い、上清を排出して培養液の交換を行った。そして、３日目まで培養を行って細胞数を計数し、細胞密度を算出した。その結果を図１５に示す。

同図に示されるように、実施例６の細胞培養容器による細胞の増殖性能は、比較例３の細胞培養容器よりも大きいことが分かる。
具体的には、３日目において、実施例６の細胞密度は、比較例３のそれに対して２３％大きくなっている。
このように、本実施形態の細胞培養容器によれば、ガス透過性フィルムの厚みを３０μｍ程度に薄くした場合でも取り扱い時の強度を確保でき、かつ細胞を高密度で培養する場合において適切なガス透過性が得られていることが分かった。

本発明は、以上の実施形態及び実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。例えば、通気性補強部材として凹凸加工フィルムを用いる場合、その突起部の形状をその他の様々な形状にするなど適宜変更することが可能である。

本発明は、細胞培養バッグを使用して、細胞を高密度で大量培養する場合などに、好適に利用することが可能である。

１，１ａ，１ｂ，１ｃ 細胞培養容器
１１，１１ａ，１１ｂ，１１ｃ 平面状器材
１２，１２ａ ポート
１３，１３ａ，１３ｂ，１３ｃ 通気性補強部材
１３１ａ 突起部
２ 細胞
Ｓ，Ｓａ 培養空間
Ｈ，Ｈａ 周縁部
Ｔ 通気孔

Claims (11)

1. 少なくとも１つのポートを有し、対向する平面状器材によって形成された袋状の閉鎖系の細胞培養容器であって、
   前記平面状器材の少なくとも一方がガス透過性フィルムからなり、少なくとも１つの前記ガス透過性フィルムにおける容器の外面側に通気性補強部材を備えると共に、当該ガス透過性フィルムにおける容器の内面側に細胞を培養するための培養空間を備え、当該ガス透過性フィルムの厚みが１００μｍ未満である
   ことを特徴とする細胞培養容器。
2. 前記通気性補強部材が、メッシュ状材料又は多孔質材料からなることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。
3. 前記通気性補強部材が、凹凸加工されたフィルムからなり、前記ガス透過性フィルムと前記通気性補強部材を密着させた際に前記凹凸加工によって空気が通り抜けることが可能な隙間が形成されたことを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。
4. 前記通気性補強部材が、前記ガス透過性フィルムの外面側周縁部に固定されたことを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の細胞培養容器。
5. 前記通気性補強部材が、前記ガス透過性フィルムの外面側全面に固定されたことを特徴とする請求項１又は２記載の細胞培養容器。
6. 前記通気性補強部材が、前記ガス透過性フィルムに熱溶着により固定されたことを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の細胞培養容器。
7. 前記通気性補強部材が外面側に備えられたガス透過性フィルムの厚みが、７０μｍ以下で１０μｍ以上であることを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載の細胞培養容器。
8. 前記通気性補強部材が外面側に備えられたガス透過性フィルムの厚みが、３５μｍ以下で２０μｍ以上であることを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載の細胞培養容器。
9. 少なくとも１つのポートを有し、対向する平面状器材によって形成された袋状の細胞培養容器の製造方法であって、
   １００μｍ未満の厚みのガス透過性フィルムを前記平面状器材として用いて、対向する前記平面状器材に前記ポートを挟み込んで袋状に成形し、前記ガス透過性フィルムにおける容器の内面側に細胞を培養するための培養空間を形成し、
   前記ガス透過性フィルムの外面側周縁部又は外面側全面に通気性補強部材を固定する
   ことを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
10. 少なくとも１つのポートを有し、対向する平面状器材によって形成された袋状の細胞培養容器の製造方法であって、
    １００μｍ未満の厚みのガス透過性フィルムを前記平面状器材として用いて、前記ガス透過性フィルムの外面側周縁部又は外面側全面に通気性補強部材を固定し、
    対向する前記平面状器材に前記ポートを挟み込んで袋状に成形し、前記ガス透過性フィルムにおける容器の内面側に細胞を培養するための培養空間を形成する
    ことを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
11. 請求項１～８のいずれかに記載の細胞培養容器を用いて細胞を培養することを特徴とする細胞の製造方法。
    

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