JP2021522822A

JP2021522822A - 幹細胞由来の細胞培養物、幹細胞由来の三次元組織製品、及びそれらの製造及び使用方法

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Publication number: JP2021522822A
Application number: JP2020563522A
Authority: JP
Inventors: バレリアカント−ソラーマリア; フロレスベルバーミゲル; リーカン; アパリシオドミンゴシルビア
Original assignee: University of Colorado
Current assignee: University of Colorado
Priority date: 2018-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2021-09-02
Anticipated expiration: 2039-05-09
Also published as: EP3790959A1; WO2019217630A1; JP2024086789A; US20210317403A1; JP7473210B2; AU2019266276A1

Abstract

幹細胞由来の網膜色素上皮単層培養物の生成方法、及びそれを用いる方法がまた提供される。それらの方法に従って調製された網膜色素上皮細胞の集団もまた提供される。さらに、ヒト人工多能性幹細胞由来の３次元組織製品も、その製造方法及び使用方法と共に提供される。
【選択図】図５

Description

政府の支援
本発明は、国立衛生研究所／国立眼病研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ＥＹ０２２６３１の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

関連出願
本出願は、２０１８年５月９日に出願された米国仮出願第６２／６６９，１３３号、及び２０１９年３月２９日に出願された米国仮出願第６２／８２６，１９６号に優先権を主張し、それらの個々は、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。

発明の分野
本発明は、一般的に、幹細胞の分野に関する。より具体的には、本発明は、ヒト網膜オルガノイドからの幹細胞由来の網膜色素上皮（ＲＰＥ）単層培養物の生成方法、ヒト人工多能性幹細胞由来の３次元組織製品、及びそれらの製造及び使用方法を提供する。

発明の背景
網膜変性疾患は、網膜光受容体細胞の機能不全及び死が不可逆的な視力喪失、及び時々、完全な失明を導く臨床状態のグループである。現在、多くの網膜変性疾患を予防するために利用できる治療法は存在しない。従って、網膜の発達、細胞の相互作用、及び生理学的及び疾患のメカニズムを研究するための手段を開発する必要が、当技術分野において残っている。さらに、それらの疾患に対する追加の治療法を開発する必要もある。

発明の要約
機能的に成熟した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、及び３次元神経網膜（３ＤＮＲ）の一部を含む、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の３次元組織製品が提供され、ここで前記３ＤＮＲ及びＲＰＥ細胞は、神経網膜の層及びＲＰＥ細胞の下層を含む複合体を形成するよう、物理的及び機能的に統合される。種々の実施形態によれば、この３次元組織製品においては、ＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲは両方とも、ヒト網膜オルガノイドから得られる。

実施形態によれば、前記３ＤＮＲは、ｉ) 未分化の偽重層神経網膜上皮；ｉｉ) 全ての網膜層及びそれらに対応する網膜前駆体細胞型を含む積層神経網膜組織；及び／又はｉｉｉ)外顆粒層（ＯＮＬ）及び双極細胞層（ＢＣＬ）を含む高度に分化された網膜組織、ここで前記ＯＮＬは桿体富化、錐体富化又はそれらの任意の組合せにされ得る、を含む。

それらの製品においては、ＲＰＥ細胞は、本明細書に記載される方法のいずれかに従って、又は類似するＲＰＥ組織を生成する当業界において知られている任意の方法に従って調製され得る。種々の実施形態によれば、ＲＰＥ細胞は、ｉ) 最初のプレーティング又はその後の継代から；ｉｉ) 分化の初期段階で；及び／又はｉｉｉ) 分化のより進行した段階、培養時間、又はそれらの組合せで得られる。

本明細書に記載される３次元組織製品のいずれも、製品に統合される追加の生体適合性成分を含むことができる。非限定的な例によれば、追加の生体適合性成分は、細胞の生存及び機能のための適切な生体力学的環境を提供し、そして／又は製品の操作を可能にする、液体又はゲル形での天然又は合成化合物（例えば、ヒドロゲル）であり得る。この追加の生体適合性成分の包含は、移植された細胞の生存及び機能を促進する。

さらに又は他方では、本明細書に記載される３次元組織製品のいずれかは、生体適合性足場をさらに含むことができ、ここでＲＰＥ細胞は、３ＤＮＲとの統合の前、前記足場の上部で増殖する。非限定的な例によれば、そのような生体適合性足場は、天然又は合成の足場、生分解性材料から製造された足場、非生分解性材料から製造された足場、又はそれらの組合せを含むことができる。

機能的に成熟した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、及び３次元神経網膜（３ＤＮＲ）の一部を含む、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の３次元組織製品がまた提供され、ここで前記３ＤＮＲ及びＲＰＥ細胞は、神経網膜の層及びＲＰＥ細胞の下層を含む複合体を形成するよう、物理的及び機能的に統合される。種々の実施形態によれば、この３次元組織製品においては、ＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲは両方とも、ヒト網膜オルガノイドから得られる。

実施形態によれば、３次元組織製品は、機能的に成熟した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、及び３次元神経網膜（３ＤＮＲ）の一部、追加の生体適合性成分、並びに生体適合性足場を含む、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来し、前記３ＤＮＲ、ＲＰＥ細胞及び追加の生体適合性成分が、神経網膜の層及びＲＰＥ細胞の下層を含む複合体を形成するよう、物理的及び機能的に統合され、前記３ＤＮＲが、ｉ) 未分化の偽重層神経網膜上皮；ｉｉ) 全ての網膜層及びそれらに対応する網膜前駆体細胞型を含む積層神経網膜組織；又はｉｉｉ)外顆粒層（ＯＮＬ）及び双極細胞層（ＢＣＬ）を含む高度に分化された網膜組織、ここで前記ＯＮＬは桿体富化、錐体富化又はそれらの任意の組合せにされ得る、を含み、前記追加の生体適合性成分が、細胞の生存及び機能のための適切な生体力学的環境を提供し、前記製品の操作を可能にするか、又はその両方を可能にする液体又はゲル形での天然又は合成化合物を含み、そして前記ＲＰＥ細胞が、３ＤＮＲとの統合の前、前記生体適合性足場の上部で増殖され、そして前記３ＤＮＲがＲＰＥ細胞の上部に配置される。

それらの３次元組織製品において、ＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲは両方とも、ヒト網膜オルガノイドから得られる。

同様に、それらの３次元組織製品においては、ＲＰＥ細胞は、ａ) 外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーターが補充されていない第１培地においてヒト網膜オルガノイドを培養し、ＲＰＥ細胞及び神経網膜（ＮＲ）を生成し；ｂ）前記培養された網膜オルガノイドからＲＰＥ細胞組織を単離し；ｃ）前記単離されたＲＰＥ組織を、単一のＲＰＥ細胞の懸濁液に解離させ；ｄ）単一ＲＰＥ細胞を付着培養にプレーティングし；そしてｅ) 外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーターが補充されていない第２培地において、前記プレーティングされた細胞を培養し、ＲＰＥの単層を生成することにより調製されえ得る。

それらの３次元組織製品のいずれにおいても、ＲＰＥ細胞は、ｉ) 最初のプレーティング又はその後の継代から；ｉｉ) 分化の初期段階で；及び／又は
ｉｉｉ) 分化のより進行した段階、培養時間、又はそれらの組合せで得られる。

適切な生体適合性足場は以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：天然又は合成の足場、生分解性材料から製造された足場、非生分解性材料から製造された足場、又はそれらの組合せ。

ａ）ＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲを生成するためにヒト網膜オルガノイドを培養し；
ｂ）ＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲを分離し；
ｃ）ＲＰＥ細胞の上部に神経網膜パッチを播種し、複合体を形成し；そして
ｄ）適切な培地において前記複合体を共培養することにより、機能的に成熟した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、及び３次元神経網膜（３ＤＮＲ）から得られた神経網膜パッチを含む、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の３次元組織製品を製造する方法がまた提供され、ここで共培養に続いて、３ＤＮＲ及びＲＰＥ細胞が物理的に及び機能的に統合し、神経網膜の層及びＲＰＥ細胞の下層を含む３次元組織製品を形成する。

いくつかの実施形態によれば、工程ｃ）の前、ＲＰＥ細胞が培養され、ＲＰＥ単層培養物が生成される。

１つの非限定的な実施形態によれば、ＲＰＥ単層培養物は、ｉ）ＲＰＥ細胞を、単一ＲＰＥ細胞の懸濁液に解離させ；ｉｉ）付着培養において単一のＲＰＥ細胞をプレーティングし；そしてｉｉｉ）外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーター（すなわち、アゴニスト及び/又はアンタゴニスト）が補充されていない第２培地において、前記プレーティングされた細胞を培養し、ＲＰＥの単層を生成することにより生成される。

実施形態によれば、３ＤＮＲは、ｉ) 未分化の偽重層神経網膜上皮；ｉｉ) 全ての網膜層及びそれらに対応する網膜前駆体細胞型を含む積層神経網膜組織；又はｉｉｉ)外顆粒層（ＯＮＬ）及び双極細胞層（ＢＣＬ）を含む高度に分化された網膜組織、ここで前記ＯＮＬは桿体富化、錐体富化又はそれらの任意の組合せにされ得る、を含むことができる。

それらの製品においては、ＲＰＥ細胞は、本明細書に記載される方法のいずれかに従って、又は類似するＲＰＥ組織を生成する当業界において知られているいずれかの方法に従って調製され得る。種々の実施形態によれば、ＲＰＥ細胞は、ｉ) 最初のプレーティング又はその後の継代から；ｉｉ) 分化の初期段階で；又はｉｉｉ) 分化のより進行した段階、培養時間、又はそれらの組合せで得られる。

それらの方法のいずれかによれば、ＲＰＥ細胞は、酵素反応（例えば、コラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ、TrypLE、パパイン、および/またはそれらの任意の組み合わせを用いて）、酵素を含まない解離溶液、又は機械的手段（例えば、機械的解離）を用いて、単一のＲＰＥ細胞に解離される。

種々の実施形態によれば、単一のＲＰＥ細胞は、以下の密度でプレーティングされ得る：約２５，０００; ５０，０００; ７５，０００; １００，０００；１２５，０００; １５０，０００；１７５，０００; ２００，０００；２２５，０００；２５０，０００；２７５，０００；又は３００，０００細胞/ ｃｍ^２。単一のＲＰＥ細胞は、約１００，０００細胞／ｃｍ^２の密度でプレーティングされ得る。

この方法の工程ｅ）においては、第２培地は、ＲＰＥ細胞の増殖を助ける任意の培地であり得る。非制限的な例によれば、この第２培地は、以下の成分の１つ又は複数を含むことができる：最小必須培地（ＭＥＭ）α修飾、Ｎ１サプリメント、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、タウリン、ヒドロコルチゾン、トリヨードチロニン、及び/又はウシ胎児血清。第２の培地のための適切な成分の決定は、当業者の日常的なレベルの範囲内である。

それらの方法においては、第２培地は、定期的に交換され得る（例えば、１、２、３、４、５、６又はそれ以上の日ごと）。同様に、付着培養中の細胞は定期的に継代され得る。例えば、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上の日ごとに継代され得る。１つの非制限的な実施形態によれば、細胞は、１０日ごとに継代され、完全な単層が発達し、そして細胞が不規則な石畳の形状を発達し始めることを確実にする。他の実施形態によれば、得られた単層培養物内の細胞は、外因性因子の添加をすることなく、少なくとも４継代（すなわち、少なくとも継代４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）まで、それらのＲＰＥ分化及び成熟能力を保持する。

示されたように、ヒト網膜オルガノイドは、当業界において知られている任意の方法により調製され得る。非制限的例によれば、ヒト網膜オルガノイドは、i）ｈｉＰＳＣを培養して凝集体を形成し； ii）凝集体を神経誘導培地に移行させ；iii）細胞外マトリックスでコーティングされた細胞培養基質に凝集体を播種し； iv）神経誘導培地を化学的に定義された分化培地と交換し；v）ＮＲドメインの切り離し； vi）懸濁液中で培養して三次元網膜オルガノイドを形成し；そして／又はvii）動物の血清又は血漿成分及びレチノイン酸を添加することにより調製され得る。この方法に対する日常的な変更は、当業者の日常的なレベルの範囲内である。

本明細書に開示される３次元組織製品の方法のいずれも、ｅ）３ＤＮＲからの神経網膜パッチ、ＲＰＥ細胞、又は３ＤＮＲからの神経網膜パッチ及びＲＰＥ細胞の両方を、製品に統合された追加の生体適合性成分に埋め込むことのさらなる工程を含むことができる。非制限的な例によれば、追加の生体適合性成分は、細胞の生存及び機能のための適切な生体力学的環境を提供し、前記製品の操作を可能にするか、又はその両方を可能にする液体又はゲル形での天然又は合成化合物である。この追加の生体適合性成分の包含は、移植された細胞の生存及び機能を促進する。

それらの方法のいずれかによれば、ＲＰＥ単層は、３ＤＮＲとの統合の前、生体適合性足場の上部で増殖される。適切な生体適合性足場は、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：天然又は合成の足場、生分解性材料から製造された足場、非生分解性材料から製造された足場、又はそれらの組合せ。

本明細書に記載される方法のいずれかによれば、３ＤＮＲ及びＲＰＥ細胞は、細胞成熟の異なる時点で共培養され得る。いくつかの実施形態によれば、３ＤＮＲ及びＲＰＥ細胞は、桿体富化３次元組織製品をもたらす培地において共培養される。他の実施形態によれば、３ＤＮＲ及びＲＰＥ細胞は、錐体富化３次元組織製品をもたらす培地において共培養される。当業者は、桿体富化及び／又は錐体富化細胞の任意の組合せが、本明細書に記載される３次元組織構造体のいずれかで使用され得ることを認識するであろう。

実施形態によれば、本開示は、機能的に成熟した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、及び３次元神経網膜（３ＤＮＲ）から得られた神経網膜パッチ、追加の生体適合性成分、並びに生体適合性足場を含む、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の３次元組織製品の製造方法を提供する。例えば、それらの方法は、ａ）ＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲを生成するためにヒト網膜オルガノイドを培養し；ｂ）ＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲを分離し；ｃ）ＲＰＥ細胞の上部に神経網膜パッチを播種し、複合体を形成し；ｄ）適切な培地において前記複合体を共培養し；そして／又はｅ）３ＤＮＲからの神経網膜パッチ、ＲＰＥ細胞、又は３ＤＮＲからの神経網膜パッチ及びＲＰＥ細胞の両方を、製品に統合された追加の生体適合性成分に埋め込む工程を含むことができ、ここで共培養に続いて、３ＤＮＲ、ＲＰＥ細胞及び追加の生体適合性成分が物理的及び機能的に統合し、神経網膜の層及びＲＰＥ細胞の下層を含む３次元組織製品を形成し、前記３ＤＮＲが、ｉ) 未分化の偽重層神経網膜上皮；ｉｉ) 全ての網膜層及びそれらに対応する網膜前駆体細胞型を含む積層神経網膜組織；及び／又はｉｉｉ)外顆粒層（ＯＮＬ）及び双極細胞層（ＢＣＬ）を含む高度に分化された網膜組織、ここで前記ＯＮＬは桿体富化、錐体富化又はそれらの任意の組合せにされ得る、を含み、前記追加の生体適合性成分が、細胞の生存及び機能のための適切な生体力学的環境を提供し、前記製品の操作を可能にするか、又はその両方を可能にする液体又はゲル形での天然又は合成化合物を含み、そして前記ＲＰＥ細胞が、３ＤＮＲとの統合の前、前記生体適合性足場の上部で増殖され、そして前記３ＤＮＲがＲＰＥ細胞の上部に配置される。

それらの方法のいずれにおいても、工程ｃ）の前、ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ単層培養物を生成するために培養され得る。例えば、ＲＰＥ単層培養物は、ｉ）ＲＰＥ細胞を、単一ＲＰＥ細胞の懸濁液に解離させ；ｉｉ）付着培養において単一のＲＰＥ細胞をプレーティングし；そして／又はｉｉｉ）外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーターが補充されていない第２培地において、前記プレーティングされた細胞を培養し、ＲＰＥの単層を生成することにより生成される。

それらの方法に使用されるＲＰＥ細胞は、ｉ) 最初のプレーティング又はその後の継代から；ｉｉ) 分化の初期段階で；及び／又はｉｉｉ) 分化のより進行した段階、培養時間、又はそれらの組合せで得られる。さらに、それらの方法のいずれにおいても、ＲＰＥ細胞は、酵素反応、酵素を含まない解離溶液、又は機械的手段（例えば、解離したＲＰＥ組織は機械的に解離される）を用いて単一のＲＰＥ細胞に解離される。

実施形態によれば、単一のＲＰＥ細胞は、約２５，０００〜約３００，０００細胞／ｃｍ^２の密度、例えば約１００，０００細胞／ｃｍ^２の密度でプレーティングされる。

それらの方法のいずれにおいても、第２培地は、ＲＰＥ細胞の増殖を助ける。

適切な生体適合性足場は、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：天然又は合成の足場、生分解性材料から製造された足場、非生分解性材料から製造された足場、又はそれらの組合せ。

実施形態によれば、３ＤＮＲ及びＲＰＥ細胞は、細胞成熟の異なる時期に共培養され；３ＤＮＲ及びＲＰＥ細胞は、桿体富化３次元組織製品をもたらす培地において共培地され；そして／または３ＤＮＲ及びＲＰＥ細胞は、錐体富化３次元組織製品をもたらす培地において共培地される。

本明細書に記載される３次元組織製品のいずれかを、それを必要とする患者の眼に移植することにより、網膜疾患、障害、又は状態を治療する方法もまた提供される。非制限的な例によれば、網膜の疾患、障害又は状態は、網膜色素変性症（ＲＰ）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、シュタルガルト病、アッシャー症候群、脈絡膜血症、桿体-錐体又は錐体-桿体ジストロフィー、繊毛病、ミトコンドリア障害、進行性網膜萎縮、変性網膜疾患、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、地図状萎縮、家族性又は後天性黄斑症、網膜光受容体疾患、網膜色素上皮性疾患、糖尿病性網膜症、嚢胞性黄斑浮腫、ブドウ膜炎、網膜剥離、外傷性網膜損傷、医原性網膜損傷、黄斑円孔、黄斑部毛細血管拡張症、神経節細胞疾患、視神経細胞疾患、緑内障、視神経症、虚血性網膜疾患、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、家族性大動脈瘤、網膜血管疾患、眼血管疾患、血管疾患、及び虚血性視神経障害から成る群から選択される。

網膜の疾患、障害又は状態の治療への使用のための本明細書に記載される３次元組織製品もまた提供される。製品は、その必要な患者の眼への移植のためである。非制限的な例によれば、網膜の疾患、障害又は状態は、網膜色素変性症（ＲＰ）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、シュタルガルト病、アッシャー症候群、脈絡膜血症、桿体-錐体又は錐体-桿体ジストロフィー、繊毛病、ミトコンドリア障害、進行性網膜萎縮、変性網膜疾患、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、地図状萎縮、家族性又は後天性黄斑症、網膜光受容体疾患、網膜色素上皮性疾患、糖尿病性網膜症、嚢胞性黄斑浮腫、ブドウ膜炎、網膜剥離、外傷性網膜損傷、医原性網膜損傷、黄斑円孔、黄斑部毛細血管拡張症、神経節細胞疾患、視神経細胞疾患、緑内障、視神経症、虚血性網膜疾患、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、家族性大動脈瘤、網膜血管疾患、眼血管疾患、血管疾患、及び虚血性視神経障害から成る群から選択される。

さらに、ａ）本明細書に記載の３次元組織製品のいずれかと、少なくとも１つの薬剤（例えば、生物学的薬剤）とを接触させ；そしてｂ）前記薬剤が、網膜の発達、機能、増殖、成熟、分化、生存又はそれらの任意の組合せに対する効果を有するかどうかを決定することにより、網膜の発達、機能、増殖、成熟、分化、生存又はそれらの任意の組合せに影響を及ぼす薬剤のスクリーニング方法が本明細書に提供される。例えば、生物学的薬剤は、成長因子、栄養因子、調節因子、ホルモン、抗体又はその抗原結合フラグメント、小分子、及びペプチドであり得る。

本明細書に記載される３次元組織製品のいずれも、網膜の発達を試験するために使用され得る。例えば、ａ）３次元組織製品を調製し；そしてｂ）前記３次元組織製品内の細胞の細胞相互作用、機能、増殖、成熟、分化、生存、又はそれらの任意の組合せをモニターすることにより、網膜の発達を試験するためのインビトロ方法が、本明細書に提供される。そのようなモニターリングは、正常な網膜の発達に関する情報（すなわち、網膜及びＲＰＥの相互作用に関する情報）、及び／又は網膜の異常発達、疾患、障害又は状態に関する情報（すなわち、網膜の異常発達、疾患、障害又は状態の根本的メカニズムに関する情報）を提供することができる。

また、ａ) 外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーター（すなわち、アゴニスト及び/又はアンタゴニスト）が補充されていない第１培地においてヒト網膜オルガノイドを培養し、ＲＰＥ細胞及び神経網膜（ＮＲ）を生成し；ｂ）前記培養された網膜オルガノイドからＲＰＥ細胞組織を単離し；ｃ）前記単離されたＲＰＥ組織を、単一のＲＰＥ細胞の懸濁液に解離させ（例えば、酵素反応（例えば、コラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ、ＴｒｙｐＬＥ、パパイン、及び/又はそれらの任意の組み合わせを使用して）、酵素を含まない解離溶液、機械的手段、又はそれらの任意の組み合わせを用いて単一のＲＰＥ細胞に解離することによって）；ｄ）単一ＲＰＥ細胞を付着培養にプレーティングし；そしてｅ) 外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーターが補充されていない第２培地において、前記プレーティングされた細胞を培養し、ＲＰＥの単層を生成することにより、幹細胞由来の網膜色素上皮（ＲＰＥ）単層培養物を生成するための方法も提供される。種々の実施形態によれば、ヒト網膜オルガノイドは、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の３次元網膜オルガノイドである。

ヒト網膜オルガノイドは、当業界において知られている任意の方法により調製され得る。非制限的な例によれば、ヒト網膜オルガノイドは、i）ｈｉＰＳＣを培養して凝集体を形成し； ii）凝集体を神経誘導培地に移行させ；iii）細胞外マトリックスでコーティングされた細胞培養基質に凝集体を播種し； iv）神経誘導培地を化学的に定義された分化培地と交換し；v）ＮＲドメインの切り離し； vi）懸濁液中で培養して三次元網膜オルガノイドを形成し；そして／又はvii）動物の血清又は血漿成分及びレチノイン酸を添加することにより調製され得る。この方法に対する日常的な変更は、当業者の日常的なレベルの範囲内である。

本明細書に記載される方法のいずれにおいても、生成されるＲＰＥ細胞は、網膜オルガノイドに関連する単層分極化ＲＰＥ組織又は無秩序なＲＰＥ組織の塊として見出される。当業者は、ＲＰＥ組織が網膜オルガノイドから機械的に解剖され、そして／又は解離されたＲＰＥ組織が機械的に解離され得ることを理解するであろう。

それらの方法においては、第２培地は、定期的に交換され得る（例えば、１、２、３、４、５、６又はそれ以上の日ごと）。同様に、付着培養中の細胞は定期的に継代され得る。例えば、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上の日ごとに継代され得る。１つの非制限的な実施形態によれば、細胞は、１０日ごとに継代され、完全な単層が発達し、そして細胞が不規則な石畳の形状を発達し始めることを確実にする。他の実施形態によれば、得られた単層培養物内の細胞は、外因性因子の添加をすることなく、少なくとも４継代（すなわち、少なくとも継代４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）まで、それらのＲＰＥ分化及び成熟能力を保持する

本明細書に記載される方法のいずれかを用いて、単層におけるＲＰＥ細胞は、初代ＲＰＥ細胞の機能的、分子的及び／又は細胞的特徴を発現する。

非制限的な例によれば、単層中のＲＰＥ細胞は、以下を含む（但し、それらだけには限定されない）ＲＰＥ細胞の分化及び機能的成熟に関連する特定の分子を発現することができる：血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、メラニン形成関連転写因子（ＭＩＴＦ）、エズリン、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）; 閉鎖帯−１（ＺＯ−１）; ベストロフィン−１（ＢＥＳＴ１）; 細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）; レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）; チロシナーゼ（ＴＹＲ）; 色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、トリロシナーゼ、プレメラノソームタンパク質（ＰＭＥＬ）、クローディン３、受容体型チロシンキナーゼ（ＭＥＲＫＴ）、オルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）、及びそれらの組み合わせ。

さらに（又は他方では）、単層中のＲＰＥ細胞は、以下を含むＲＰＥの特殊な機能的構造体の形成を伴って適切な分極を達成する：豊富な頂端微絨毛、付着接合部、密着結合、経上皮抵抗（ＴＥＲ）、又はそれらの任意の組み合わせ。

本明細書に記載される方法のいずれかに従って調製された網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を含む集団がまた提供される。得られる集団は、本明細書に記載される方法のいずれかに利用され得る。

本開示はまた、本明細書に記載される方法のいずれかに従って調製されたＲＰＥ細胞の有効量を、その必要な患者に投与することを含む、網膜の疾患、障害又は状態を治療するための方法を提供する。非制限的な例によれば、前記網膜の疾患、障害又は状態は、網膜色素変性症（ＲＰ）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、シュタルガルト病、アッシャー症候群、脈絡膜血症、桿体-錐体又は錐体-桿体ジストロフィー、繊毛病、ミトコンドリア障害、進行性網膜萎縮、変性網膜疾患、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、地図状萎縮、家族性又は後天性黄斑症、網膜光受容体疾患、網膜色素上皮性疾患、糖尿病性網膜症、嚢胞性黄斑浮腫、ブドウ膜炎、網膜剥離、外傷性網膜損傷、医原性網膜損傷、黄斑円孔、黄斑部毛細血管拡張症、神経節細胞疾患、視神経細胞疾患、緑内障、視神経症、虚血性網膜疾患、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、家族性大動脈瘤、網膜血管疾患、眼血管疾患、血管疾患、及び虚血性視神経障害から成る群から選択される。

本開示はまた、網膜疾患、障害又は状態の治療への使用のための、本明細書に記載される方法のいずれかに従って調製されたＲＰＥ細胞も提供する。非制限的な例によれば、前記網膜の疾患、障害又は状態は、網膜色素変性症（ＲＰ）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、シュタルガルト病、アッシャー症候群、脈絡膜血症、桿体-錐体又は錐体-桿体ジストロフィー、繊毛病、ミトコンドリア障害、進行性網膜萎縮、変性網膜疾患、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、地図状萎縮、家族性又は後天性黄斑症、網膜光受容体疾患、網膜色素上皮性疾患、糖尿病性網膜症、嚢胞性黄斑浮腫、ブドウ膜炎、網膜剥離、外傷性網膜損傷、医原性網膜損傷、黄斑円孔、黄斑部毛細血管拡張症、神経節細胞疾患、視神経細胞疾患、緑内障、視神経症、虚血性網膜疾患、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、家族性大動脈瘤、網膜血管疾患、眼血管疾患、血管疾患、及び虚血性視神経障害から成る群から選択される。

ＲＰＥ細胞の機能、増殖、成熟、分化又は生存に影響を及ぼす薬剤についてスクリーニングする方法がまた提供され、ここで前記方法は、ａ）本明細書に記載されるいずれかに従って調製されたＲＰＥ細胞集団と、少なくとも１つの薬剤とを接触し；そしてｂ）前記薬剤が、ＲＰＥ細胞の機能、増殖、成熟、分化又は生存に対する効果を有するかどうかを決定することを含む。種々の実施形態によれば、少なくとも１つの薬剤は、生物学的薬剤（例えば、成長因子、栄養因子、調節因子、ホルモン、抗体又はその抗原結合フラグメント、小分子、及び／又はペプチドから成る）である。

さらに、本開示はまた、ａ）本明細書に記載される方法のいずれかに従ってＲＰＥ単層培養物を調製し：そしてｂ）網膜の発達の間、ＲＰＥ単層培養物内の細胞の機能、増殖、成熟、分化、生存又はそれらの任意の組合わせをモニターリングすることにより、網膜発達におけるＲＰＥ細胞の役割をモニターリングするためのインビトロ方法も提供する。例えば、そのような方法においては、モニターリングは、正常な網膜の発達に関する情報及び／又は網膜の異常発達、疾患、障害又は状態に関する情報（例えば、網膜の異常発達、疾患、障害又は状態の根本的メカニズムに関する情報）を提供する。

本明細書に記載の側面及び実施形態のいずれも、本発明の概要、図面、及び／又は本発明の以下の特定の非限定的な例／実施形態を含む、本発明の詳細な説明に本明細書に開示される他の任意の側面又は実施形態と組み合わせることができる。

特にことわらない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本出願が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。明細書では、文脈が明確に別段の指示をしない限り、単数形には複数形も含まれる。

本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法及び材料を、出願の実施及び試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に説明する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照により組み込まれる。

本明細書で引用された参考文献は、請求された出願の先行技術であると認められていない。矛盾する場合は、定義を含む現在の仕様が優先される。さらに、材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。

出願の他の特徴及び利点は、例と併せて以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

特許又は出願ファイルは、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含む。この特許又は特許出願の出版物とカラーの図面のコピーは、要求、及び必要料金の支払いに応じて官庁から提供されるであろう。

図１Ａ−１Ｉは、ヒト３次元（３Ｄ）網膜からの誘発された一次網膜色素上皮（ｉｐＲＰＥ）培養物の単離及び誘導を示す。図１Ａにおいては、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）は、３Ｄ網膜から解剖される。３Ｄ網膜から単離されたＲＰＥ細胞のクラスターが収集され（図１Ｂ−１Ｅ）、そして培養のために単一の細胞に解離された（図１Ｆ、挿入図）。それらの条件下で、それらは、ヒト初代ＲＰＥ培養において観察されたものと類似する挙動を示すＲＰＥ単層に発達する（図１Ｇ−１Ｉ）。

図２Ａ−２Ｊは、３Ｄ網膜に由来するＲＰＥの特性評価を示す。図２Ａにおいては、ＲＰＥが３Ｄ網膜から解剖され、単一細胞に解離され、そしてトランスウェルに播種され（図２Ｂ）、ここでそれらは、特徴的な着色された石畳状のパターン（図２Ｂ）及び適切な超微細構造の分化（図２Ｃ−２Ｉ）を有する単層を形成する。継代２回のｉｐＲＰＥ培養は、石畳状のパターン（図２Ｄ−２Ｅ）、機能的タンパク質の発現（図２Ｆ−２Ｇ）、密着結合及び微絨毛の形成を伴っての分極（図２Ｈ−２Ｉ）、Ｚ０１及びＥＺＲＩＮの適切な細胞内局在、及びヒト胎児初代ＲＰＥ培養に観察されたものに匹敵する経上皮抵抗（図２Ｊ）を示す。

図３Ａ−３Ｄは、３Ｄ網膜に由来するＲＰＥの特性評価を示す。ｉｐＲＰＥ培養物は、それらのＲＰＥアイデンティティを維持しながら、連続継代に適している。図３Ａ−３Ｂは、４つの異なる継代（Ｐ１〜Ｐ４）から得られたｉｐＲＰＥ培養物における遺伝子及びタンパク質の発現を示している。図３Ｃ−３Ｄは、異なる継代後、トランスウェル挿入体上で増殖された頂端及び基底細胞外培地ｉｐＲＰＥ単層において測定されたｉｐＲＰＥ培養物へのＶＥＧＦ−Ａの極性放出を示す。

図４Ａ−４Ｆは、ｈｉＰＳＣから得られた３Ｄ網膜を示す。図４Ａは、ｈｉＰＳＣが神経網膜及び先端に束ねられたＲＰＥから構成される３Ｄ網膜を形成することを示す。図４Ｂ−４Ｃにおいては、ＮＲは、桿体富化ＯＮＬを含む特徴的な層を示す。図４Ｄ−４Ｆは、光受容体が、外側のセグメント（矢じり）の形成及び光反応を含む、高度な形態学的、分子的及び超微細構造的な分化を達成していることを示す。

図５Ａ−５Ｄは、幹細胞由来の網膜／ＲＰＥ移植片を示す。図５Ａ−５Ｂは、上面図（図５Ａ）及び底面図（図５Ｂ）の代表的な光学顕微鏡画像であり、網膜とＲＰＥとの間の物理的関連を示している。Ａにおける網膜の透明な外観は、その健康状態を反映している。図５Ｃｌは、網膜／ＲＰＥ移植片の厚さの測定を可能にした２０個の連続した画像平面（５μｍの深さ間隔）の３Ｄ再構成を示す。図５Ｄは、Ｈｏｅｃｈｓｔ（ＲＰＥ）及びＳＹＴＯＧｒｅｅｎ（網膜）により標識された網膜／ＲＰＥ移植片上の３Ｄレンダリングである。

図６Ａ−６Ｊは、桿体富化対錐体富化３ＤＮＲの生成を示す。図６Ａにおいては、１５０日間の分化の３ＤＮＲは、高度に分化した光受容体を備えた十分に組織化されたＯＮＬを示している。初期分化の間、培地の組成（例えば、レチノイン酸（ＲＡ）レジーム）を微調整することにより、桿体富化（図６Ｂ）及び錐体富化３ＤＮＲ（図６Ｃ−６Ｄ）を生成することが可能である。さらなる分化に基づいて、網膜双極前駆体は、以下を含む全ての双極細胞型を生成する：桿体双極細胞 (ＲＢ: Ｃｈｘ１０＋ＰＫＣα+/Ｉｓｌｅｔ１＋; 図６Ｅ−６Ｆ); 錐体ＯＦＦ双極細胞 (ＯＦＦ−ＣＢ：Ｃｈｘ１０＋/Ｓｃｇｎ＋/Ｉｓｌｅｔ１− (矢じり);図６Ｇ−６Ｉ); 及び桿体ＯＮ双極細胞(ＯＮ−ＣＢ: Ｃｈｘ１０＋/Ｓｃｇｎ−/Ｉｓｌｅｔ１＋ (矢印); 図６Ｇ−６Ｉ)。図６Ｊは、発達している外網状層の境界を定めるＳＶ２発現を示している。

発明の詳細な説明
定義：
本開示において、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（containing）」、「有する（having）」などは、米国特許法においてそれらに帰する意味を有することができ、そして「含む（includes）」、「含む（including）」などを意味する場合もあり；用語「本質的になる（consisting essentially of）」又は「本質的になる（consist essentially）」などは、同様に米国特許法に基づく意味を有し、そしてそれらの用語は、制限がなく、基本的又は新規の特性である限り、記載されている以上の存在を可能にし、記載されているものは、記載されているもの以上の存在により変化しないが、しかし先行技術の実施形態を除外する。

本明細書で使用される場合、具体的に言及されているか、又は文脈から明らかでない限り、用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、単数形又は複数形であると理解される。

本明細書で使用される場合、具体的に言及されているか、又は文脈から明らかでない限り、用語「又は」は、包括的であると理解される。

本明細書で使用される場合、用語「約（about）」とは、特にことわらない限り、列挙された値、例えば量、用量、温度、時間、百分率など、±１０％、± ９％、± ８％、± ７％、± ６％、± ５％、± ４％、± ３％、± ２％又は± １％を言及する。

本明細書で使用される場合、用語「患者」又は「対象」とは、以下を含む任意の哺乳類を言及するために、本明細書においては、互換的に使用される：ヒト、家畜、及び動物園、スポーツ、ペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、及びウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどの農業用動物。１つの好ましい哺乳類は、成人、子供及び高齢者を含むヒトである。対象はまた、イヌ、ネコ及びウマを含むペット動物であり得る。好ましい農業用動物は、ブタ、ウシ及びヤギであろう。

用語「治療する（Treat）」、「治療する（treating）」、「治療（treatment）」などは、本明細書で使用される場合、特にことわらない限り、そのような用語が適用される疾患、障害又は状態、又は症状又は合併症の発症を防ぐために、本明細書に記載される組成物、医薬組成物又は投与形のいずれかの投与を含む、そのような疾患、障害又は状態の１又は複数の症状のプロセスの逆転、緩和、阻害又は予防、又は症状又は合併症の緩和、又は疾患、障害又は状態の排除を言及する。好ましくは、治療は、治癒的又は改善的である。

本明細書において使用される場合、「予防する（preventing）」とは、予防されるべきもの又は事象、例えば疾患、障害又は状態の生成又は発症を、全体的に又は部分的に予防すること、又は改善又は抑制すること、又は低減又は停止することを意味する。

用語「治療的有効量」及び「有効量」などは、本明細書で使用される場合、治療効果、例えば改善又は他方では治療効果を達成するために、患者、又は患者の細胞、組織又は器官に投与するのに必要な量を示す。有効量は、研究者、獣医、医師、又は臨床医により求められている細胞、組織、システム、動物又はヒトの生物学的又は医学的反応を引き出すのに十分である。適切な有効量又は治療的有効量の決定は、当業者の日常的なレベルの範囲内である。

用語「投与する（administering）」、「投与する（administer）」、「投与（administration）」などは、本明細書に使用される場合、そのような薬剤による治療の必要な対象に治療剤を移送し、送達し、導入し、又は輸送する任意の様式を指す。そのような様式は、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：眼内、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、鼻腔内、及び皮下投与。

用語「ＲＰＥ」及び「ｉｐＲＰＥ」などは、本明細書に記載される方法のいずれかに従って培養され、そして／又は本明細書に記載される３次元組織製品に使用される網膜色素上皮細胞を指すために、本明細書において互換的に使用される。

用語「ヒト網膜オルガノイド」、「３ＤＮＲ」、「３次元神経網膜」などは、本明細書においては、網膜を指すために互換的に使用される。

用語「網膜／ＲＰＥ移植片」及び「３ＤＮＲ／ＲＰＥ移植片」などは、本明細書に記載される３次元組織製品のいずれかを指すために、本明細書においては互換的に使用される。
網膜の発達及び網膜オルガノイドの形成：

網膜の発達は、直接接触又は拡散性シグナルを介した高度に調整された細胞間相互反応を含む非常に動的で且つ複雑な微小環境内で起こる。（Adler et al., Dev Biol 305:1-12 (2007); Bassett et al., Trends in Neurosciences 35:5650573 (2012)を参照のこと）。以前の研究は、ｈｉＰＳＣが単純な手順を用いて３次元網膜カップに自己組織化した網膜前駆体に分化するよう誘発され得ることを実証した。（ＵＳ２０１６／０３３３１２を参照のこと、これは参照によりその全体が本明細書に組込まれる）。

胚の神経板における眼の発達は、網膜前駆体にさらに特定されるようになった前部神経上皮細胞の亜集団から成る中枢組織ドメインである視野（ＥＦ）の形成から始まる。ＥＦは、ＰＡＸ６、ＲＸ、ＬＨＸ２、ＳＩＸ３及びＳＩＸ６を含む転写因子のグループの発現により特徴付けられるが、周囲の前部神経上皮細胞はＰＡＸ６及びＳＯＸ１を発現する。（Zuber, Curr Top Dev Biol 93:29-60 (2010); Zhang et al., Cell Stem Cell 7:90-100 (2010); Peny et al, Development 125:1967-78 (1998)を参照のこと）。ネイティブイベントと平行して、ｈｉＰＳＣ由来の凝集体は、化学的に定義された神経分化培地での８日間の分化（Ｄ８）の後、マトリゲル被覆培養皿上に付着し、ＰＡＸ６及びＳＯＸ１を発現する前神経上皮の運命を獲得した。その後すぐに、ＬＨＸ２を発現する網膜前駆体細胞が、分化中の凝集体の中央領域に出現した。Ｄ１２までに、適切な転写因子を発現する十分に定義されたＥＦ様ドメインが、前神経上皮様細胞により囲まれて観察され得た。それらの前神経上皮様細胞は、典型的には、ロゼットを形成し、これは、本来の状況では見られないが、培養中のそれらの細胞の特徴である。（Xia et al., Methods Mol Biol 549:51-58 (2009)を参照のこと）。

ＥＦはインビボで、左及び右の眼胞を生ぜしめ、それらのそれぞれの網膜前駆体は、最終的に、将来の神経網膜（ＮＲ）及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）を形成する。ＮＲ又はＲＰＥのいずれかへの細胞運命の指定は、２つの転写因子、ＶＳＸ２及びＭＩＴＦにより決定的に調節され、前記因子は、ニ能性前駆体細胞において共発現されるが、その後、それぞれＮＲ及びＲＰＥに制限される。（Adler et al., Dev Biol 305:1-13 (2007); Nguyen et al., Development 127:3581-3591 (2000); Horsford et al., Development 132:177-187 (2005)を参照のこと）。我々の培養におけるＥＦ様ドメイン内の細胞は、同じ分化配列に従った。培養中のＤ１７とＤ２５との間で、それらのＮＲ及びＲＰＥドメインは、眼杯のような構造に移行し、ＮＲは、ＲＰＥにより囲まれた、眼杯の内壁を連想させる馬蹄形のドーム形状を徐々に獲得する。

それらの培養においては、ＥＦドメイン中の網膜前駆体は、ＮＲ及びＲＰＥへの自発的分化を効率的且つ再現可能的に受け、正しい時間的順序でそれらのインビボトポロジー構成を厳密に模倣した。

培養中のＮＲドメインの眼杯のような形状は、それらを容易に識別可能にし、そしてそれらを１つずつ機械的剥離及び懸濁状態でのさらなる培養のための収集の適したものにした。Ｄ２１−Ｄ２８で収集されたＮＲドメインは、ＮＲ前駆体の高い富化を有し、そして懸濁液で培養される場合、３Ｄ網膜カップを形成した。網膜カップは、隣接するＲＰＥと連続する厚くて透明なＮＲで構成され、これは、網膜カップの先端に束ねられているように見え、そして徐々に色素沈着した。ＮＲドメイン収集時からＤ３５（第５週又はＷ５）まで、ＮＲは、同じ年齢のヒト胚性網膜の実際の特徴に似た分子的及び組織学的特徴を示し（Ｏ’Ｒａｈｉｌｌｙｅｔａｌ．，ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＳｔａｇｅｓｉｎＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｓ（ＣａｒｎａｇｉｅＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｏｆＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ）（１９８７）を参照のこと）、増殖細胞が運動間核移動を起こし、そして適切な転写因子を発現する、分極された偽重層上皮を含む。Ｗ５−Ｗ７の間、ＮＲ細胞は自発的に分化し始め、神経新生の特徴的な中心から周囲への波に続いて、それらの対応する網膜層に移動した。
幹細胞由来のＲＰＥ単層培養を生成するために使用される以前の方法の要約：

ほとんどの従来の方法は、付着状態での幹細胞の分化に基づかれている（表１を参照のこと）。具体的には、幹細胞がプレーティングされ、成長因子（又は特定の成長因子なし）、モルフィゲン又はモジュレーター（すなわち、アゴニスト及び／又はアンタゴニスト）の存在下で培養され、ＲＰＥ分化が誘導される。そのような方法は、ＲＰＥ細胞の島又はパッチを含む細胞の混合集団を生成する。培養に続いて、ＲＰＥ（色素沈着）パッチが手動的に選択され、拡張され、そしてＲＰＥ単層を達成するまで、富化される。

従来の方法の別のグループは、胚様体（混合細胞集団の浮遊凝集体）から成る最初の工程に基づかれている。（表２を参照のこと）。そのような方法においては、幹細胞が最初に、胚様体に分化され、そしてしばらくの間、培養される。次に、胚様体が付着状態でプレーティングされ、そして分化細胞が胚様体から成長し、そしてＲＰＥのパッチに分化し、これが、手動的に選択され、拡張され、そしてＲＰＥ単層を形成するまで、富化される。

最終的に、方法の第３グループは、眼胞又は網膜オルガノイド分化から成る初期工程に基づかれている（表３を参照のこと）。例えば、Meyer et al., Stem Cells 29(8):1206-18 (2011)においては、幹細胞が最初に、３Ｄ眼胞構造に分化され、そして次に、ＲＰＥ細胞分化のためにアクチビンＡにより処理される。次に、３Ｄ着色された小胞がプレーティングされ、そしてＲＰＥ細胞が眼胞から成長し、そしてＲＰＥ単層を形成する。Wu et al., Oncotarget 7(16):22819-33 (2016)においては、幹細胞が最初に、眼胞を含むニューロスフィアに分化される。長時間の培養に続いて、眼胞は、切除され、そしてプレーティングされるＲＰＥ色素沈着塊又は病巣を発達させる。ＲＰＥ細胞は病巣から成長し、そしてＲＰＥ単層を形成する。

ｈＥＳＣ：ヒト胚性幹細胞; ｈｉＰＳＣ：ヒト人工多能性幹細胞; Ｒ：レギュラープレート; ＴＷ：トランスウェルインサート; ＧＮ：ゼラチン; ＭＥＦ：マウス胚性線維芽細胞; ＭＧ：マトリゲル; ＶＮ−ＰＡＳ：ビトロネクチンペプチド-アクリレート表面; ＰＬＤ：ポリ−Ｄ−リジン; ＦＮ：フィブロネクチン; ＬＮ：ラミニン; Ｃ−ＩＶ：コラゲナーゼ−ＩＶ; ＧＸ：geltrex; ＲＰＥ：網膜色素上皮; ＴＥＲ：経上皮抵抗; ＰＨ：食作用; ＴＥＭ：透過型電子顕微鏡; ＩＣＣ：細胞内カルシウム濃度; ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子; ＰＥＤＦ：色素上皮由来因子; Ｎ / Ａ：該当なし、利用不可、又は回答なし；Ｘ：実行済み；
*ワンステップアプローチ：選択または手動ピッキング
*ＰＤＦのみ
ヒト網膜オルガノイドからの人工一次ＲＰＥ（ｉｐＲＰＥ）の単離及び特性評価：

それらの従来の方法とは対照的に、本明細書に記載される培養方法においては、ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞の運命、分化及び／又は成熟を促進するための外因性因子を必要とせずに、自発的な分化工程に従う。純粋なＲＰＥ単層が、この方法の最初の工程から、手動的選択及び／又は精製／富化工程を必要とせずに得られ、培養で３０日までに機能的成熟を達成する。それらの方法においては、幹細胞が最初に、網膜オルガノイドに分化される。網膜オルガノイドが分化するにつれて、それらはまた、網膜オルガノイドに付着された塊又はＲＰＥ組織を形成するＲＰＥ組織を生成する。重要なことには、外因性成長因子、モルフォゲン又はモジュレーター（すなわち、アゴニスト及び／又はアンタゴニスト）は、網膜オルガノイド及びＲＰＥを分化するために使用されない。むしろ、それらの培養は、自発的分化を受ける。ＲＰＥ塊は網膜オルガノイドから切除され、そして単一細胞の懸濁液に解離される。単一細胞ＲＰＥがペトリ皿に播種され、そしてそれらがＲＰＥの単層を形成するまで、培養される。再び、外因性因子モルホゲン又はモジュレーター（すなわち、アゴニスト及び／又はアンタゴニスト）は、ここにおいても添加されない。

ヒト網膜オルガノイド（ｈＲｅｔＯ）からＲＰＥ細胞を単離及び培養するための単純且つ効率的な戦略が本明細書に提供される。簡単に説明すると、ｈＲｅｔＯは、前述のようにして生存された。（Zhong et al., Nature Communications 5:4047 (2014) 及び米国公開特許出願番号第2016/033312号を参照のこと、それらのそれぞれは、参照により全体が本明細書に組込まれる）。それらのｈｉＰＳＣ由来の３Ｄ網膜オルガノイドは、機能的光受容体を含み、適切に積層され（高度に分化された桿体及び錐体（赤、緑、及び青）を含む高度に組織化された外顆粒層を伴う）、内側及び外側のセグメント及び光応答を示し（図４を参照のこと）、そしてインビボでのヒト網膜の発達を複製する空間的及び時間的特徴を示す。ヒトｉＰＳ細胞は多能性マーカーＯＣＴ４を発現する。Nanog、SEEA1 及びNestinは、マトリゲル被覆のプレート上で維持された。

分化の０日目（Ｄ０）、ｉＰＳ細胞コロニーを分離し、機械的に小さな塊に解離し、そして懸濁液中で培養し、凝集体の形成を誘発した。凝集体を徐々に神経誘導培地に移行し、前部神経分化を誘発した。Ｄ７で、神経凝集体を、マトリゲル被覆皿上に播種した。

分化が開始された後、Ｄ１４で、神経網膜前駆体マーカーを発現するドメインが出現し始め、典型的なＲＰＥ石畳を有し、そしてそれらの神経網膜（ＮＲ）ドメインを取り囲むＭＩＴＦを発現する非色素細胞を伴う。それらのＮＲドメインは、それらを取り囲むＭＩＴＦ発現ＲＰＥ細胞を有する馬蹄型を徐々に獲得する。

Ｄ２１で、馬蹄型のＮＲ及びＲＰＥドメインの個々の機械的分離及び収集が行われ、そして懸濁液中でのさらなる培養に基づいて、それらは徐所に３Ｄ網膜組織を形成する。Ｄ３０で、３Ｄ網膜組織は完全に折りたたまれて３Ｄ網膜オルガノイドになり、そして同じ年齢のヒト胚性網膜の実際の特性に似たままになる。３Ｄ網膜オルガノイドに付着されたＲＰＥ組織が、早くも分化の２５〜３０日目に観察される（図１を参照のこと）。

Ｄ２５〜Ｄ５０の間、３Ｄ網膜オルガノイドに付着されたＲＰＥは、分極し、色素決着し、そして以下のようなＲＰＥキーマーカーのいくつかを発言する：ＲＰＥ６５（視覚色素の再生に重要なイソメロヒドロラーゼ）; ＥＳＴ１（カルシウム活性化陰イオンチャネル）; ＯＴＸ２（ＲＰＥの開発と維持に不可欠な転写因子）;及び/又はＥＺＲＩＮ（頂端突起に局在するタンパク質）。

色素沈着ＲＰＥが、３Ｄ網膜オルガノイドから機械的に単離され（例えば、タングステン針を用いて）、単一細胞ＲＰＥに解離され、そしてトランスウエルフィルター（半多孔性ポリエステル膜）上にプレーティングされ、分極ＲＰＥ単層が得られた。（図１を参照のこと）。この技法を用いて、４週間の全分化の後、純粋な色素着色ＲＰＥ組織が、ｈｉＰＳＣ由来の３Ｄ網膜オルガノイドから再現性よく単離された。単離されたＲＰＥ組織の収量を高めるために、純粋な色素着色ＲＰＥ組織が分化のＤ５０で単離され得る。

本明細書で使用押される場合、単離されたＲＰＥが、継代０（Ｐ０）として３Ｄ網膜オルガノイドから得られた。単離されたＲＰＥは、ＥＰＥ単離培養を生成するために使用され、これは人工一次ＲＰＥ単層（ｉｐＲＰＥ）と呼ばれるであろう。
ヒト人工一次ＲＰＥ（ｉｐＲＰＥ）単層の特性評価及び開発：

ｈｉＰＳＣ由来の３Ｄ網膜オルガノイドからのＲＰＥ（Ｐ０）が単離され、そしてトランスウェル（Ｐ１）上で培養され、人工一次ＲＰＥ（ｉｐＲＰＥ）単層が確立される。ｉｐＲＰＥをプレーティングした後のＤ１で、色素沈着が最初に、細胞のほとんどで失われた。しかしながら、細胞は分裂し続けるので、色素密度は上昇し、これは色素のデノボ合成を示す（図１を参照のこと）。新しく分裂する細胞は、それらの類上皮形態を保持していた。

培養中の細胞が成熟するにつれて、特徴的な多角形の形状及び色素密度がより均一になった。（図２を参照のこと）。Ｐ１ｉｐＲＰＥ単層が確立されると、ＲＰＥ細胞の続く継代及び増殖が、１０日ごとに実行された。ｉｐＲＰＥ単層は、Ｐ１からＰ４まで特徴付けられており、そしてｉｐＲＰＥ単層はＲＰＥ表現型を保持し、そして全ての継代で、ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスターンブロットにより主要ＲＰＥマーカーを発現していることが見出された。（図３を参照のこと）。ｉｐＲＰＥは、少なくとも継代４まで、それらのＲＰＥ分化及び成熟能力を維持しながら、連続継代に適していることが示されている。

最良の継代を使用するために、Ｐ１及びＰ２が比較された。（図３を参照のこと）。iｐＲＰＥ−Ｐ１は、Ｐ２と比較して、高い経上皮抵抗（ＴＥＲ）レベルに達した。両方の細胞継代は、ＶＥＧＦの極性放出できた。（図３の参照のこと）。ｉｐＲＰＥ−Ｐ２を検証するために、細胞が、Ｄ５０で特性評価された。ｉｐＲＰＥ単層は、ＭＩＴＦ及びＲＰＥ６５を発現した。（図２を参照のこと）。細胞の頂端側のＺＯＩ発現及び基底側上でのＢＥＳＴ１が、十分に分極されたＲＰＥ単層を確認した。（図２を参照のこと）。

色素沈着された細胞は、透過型電子顕微鏡下で観察された、多くの頂端微絨毛、付着性接合部、及び密着結合（ｉｐＲＰＥ細胞がプラトーに達するまで成熟するにつれて徐々に上昇する経上皮抵抗の測定により証明されるように）を含むＲＰＥの構造的特徴を有した。（図２を参照のこと）。まとめると、それらのデータは、継代２のｉｐＲＰＥ色素沈着単層が分極され、機能し、そして真正なＲＰＥ細胞の重要な特徴を発現したことを実証した。
ＲＰＥ細胞単層の使用：

本開示の方法に従って生成されたＲＰＥ細胞は、種々の方法で使用され得る。例えば、細胞は、網膜疾患の幹細胞ベースの再生医療のための移植片として使用され得る。（Bharti et al., Invest. Ophthalmolol. Vis Sci 55:1191 -1201 (2014); Trounson et al., Cell Stem Cell 17:11-22 (2015)を参照のこと）。網膜疾患、例えば加齢性黄斑変性症の乾燥型のための治療法は現在利用できないので、本明細書に記載される方法のいずれかに従って調製されたＲＰＥ細胞を利用する治療法には大きな潜在的市場がある。

同様に、それらの細胞はまた、疾患メカニズムを明らかにし、治療法を開発するためのインビトロ疾患としても使用され得る。他方では（又はさらに）、そのようなＲＰＥ細胞はまた、ＲＰＥ細胞の機能、増殖、成熟、分化及び／又は生存に影響を及ぼす薬剤を同定するための薬物スクリーニングのためにも使用され得る。
幹細胞由来の網膜／ＲＰＥ複合体：

統合された３Ｄ網膜組織及びＲＰＥ組織を含む３次元組織製品生物学的ユニットから成る幹細胞ベースの製品が本明細書に提供される。この３次元組織製品は、幹細胞（例えば、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ））に由来し、そして機能的に成熟したＲＰＥ及び分化した神経網膜から構成される。共培養法により、幹細胞由来の網膜及びＲＰＥは、細胞成熟の異なる時点で組合わされ得る。

本明細書に記載されるこの３次元組織製品は、他の製品とは区別され得る。例えば、Eiraku et al., Nature 472(7341):51-6 (2011) 及びNakano et al., Cell Stem Cell 10:771-85 (2012)は、眼杯の初期形成について記載しており、ここで未分化の神経網膜は眼杯中に陥入し、そしてまだ未分化のＲＰＥ組織に並置されている。この空間構成は単に一時的であり、そして２つの組織は組合わされた複合体として分化を達成していない。同様に、Zhu et al., PLoS One. 2013;8(1):e54552 (2013)は、ｈＥＳＣ由来のＲＰＥ細胞及びマウス網膜外植片（マウスの眼から直接得られた網膜組織の外植片）の共培養を含む１つの実験を記載する。最後に、Yanai et al., Tissue Eng Part A. (11-12):1763-71 (2015)は、ｈＥＳＣ由来のＲＰＥ単層及びヒト及び齧歯動物からの網膜外植片（ヒト及び齧歯動物の眼から直接得られた網膜組織）を含む共培養システムを使用する。

対照的に、この技法は、本明細書に記載される幹細胞由来の３次元組織製品を生成するために、機能的光受容体及びｈｉＰＳＣ由来の３Ｄ網膜から生成された機能的に成熟したＲＰＥを有するｈｉＰＳＣ由来の３Ｄ網膜を利用する。機能的光受容体を含むｈｉＰＳＣ由来の３Ｄ網膜組織は、Zhong et al., Nature Communications 5:4047 (2014) 及び米国公開特許出願番号第2016/033312号に記載される方法に従って生成される。それらの３Ｄ網膜は、未分化の神経網膜上皮から始まり、完全に積層された網膜組織で終わる、ネイティブヒト網膜と同じプログラム及び分化のタイミングに従う。図４に示されるように、それらのｈｉＰＳＣ由来の３Ｄ網膜は、内側及び外側のセグメント及び光応答を示す高度に分化された桿体及び錐体（赤、緑及び青）を含む高度に組織化された外顆粒層（ＯＮＬ）を伴って、適切なラミネーションを達成する。

ＲＰＥ細胞はまた、このシステムで分化するが、それらは外顆粒層を覆う単層を形成しない。（図４Ａを参照のこと）。重要なことには、ＲＰＥ細胞は、容易に解剖され得、３Ｄ神経網膜（３ＤＮＲ）及びＲＰＥ細胞の独立した培養を可能にする。（図２を参照のこと）。従って、３Ｄ網膜からＲＰＥ単層培養を誘導するための新規の方法論が確立されている。本明細書に記載されるように、ＲＰＥ組織は３Ｄ網膜から解剖され、単一細胞に解離され、そしてトランスウェル上に播種され、ここでそれらは、ヒト初代ＲＰＥ培養に観察されるものと類似する挙動性を示す特徴的なＲＰＥ単層を形成する。分化の５０日までに、ＲＰＥ単層は、微絨毛、密着結合、及び基底折り畳みなどの特殊な機能構造を含む通常の超微細構造の分化（図４Ｂ−４Ｃを参照のこと）、及びネイティブヒトＲＰＥ細胞及び初代培養に観察される成熟状態を示す特徴的遺伝子の適切な細胞内発現及び局在化を示す。

ｈｉＰＳＣ由来の３Ｄ網膜及びＲＰＥ組織は、神経網膜の層及びＲＰＥ細胞の下層から構成される機能的に結合された複合体を形成するために、組合され得る。網膜層及びＲＰＥ層の両方は、正常なヒト網膜に観察される細胞及びトポロジー構成を再現する。この３次元組織製品は、ネイティブ網膜において発生する神経網膜とＲＰＥとの間の物理的及び機能的相互作用を再現する最初の幹細胞由来のシステムである。重要なことは、この製品は、神経網膜とＲＰＥとの間の物理的及び機能的相互作用を再現できる幹細胞由来のシステムの欠如という現在の問題を解決する。

ｈｉＰＳＣ由来の３Ｄ網膜組織は、Zhong et al., Nature Communications 5:4047 (2014) 及び米国公開特許出願番号第2016/033312号に記載されるようにして生成される。神経網膜パッチ（３ＤＮＲ）は、３Ｄ網膜から調製される。具体的には、ｈｉＤＳＣ由来の３Ｄ網膜は、３Ｄ網膜は、３Ｄ網膜カップの内部を露出させ、網膜フラットマウントとして平らにし、そして網膜外植片を得るために、開かれる（例えば、タングステン針又は当業界において知られている任意の他の方法を用いて）。次に、それらの網膜外植片（又はパッチ）（例えば、約１．５ｍｍ×１．５ｍｍ）が、ｉｐＲＰＥ（継代２）上に播種され、そして種々の期間（例えば、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、又はそれ以上）共培養される。それらの条件下で、３ＤＮＲは、ＲＰＥ単層に付着し、３ＤＮＲ／ＲＰＥ複合体が形成される。（図５を参照のこと）。追加の生体適合性成分（例えば、細胞の生存及び機能のための適切な生体力学的環境を提供する液体又はゲル形の天然又は合成化合物（例えば、ヒドロゲル）、及び／又は生体適合性足場（例えば、天然又は合成足場、生分解性材料から製造された足場、非生分解性材料から製造された足場、及び／又はそれらの任意の組合せ））のシステムへの組込みはさらに、より長い培養期間及び移植中の操作を可能にする改善された生体力学的環境を提供する。この追加の生体適合性成分の包含は、移植された細胞の生存及び機能を促進される。

従って、本明細書に記載されるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する３次元組織製品は、機能的に成熟したＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲの一部を含む。実施形態によれば、そのような３次元組織製品はまた、追加の生体適合性成分（すなわち、移植された細胞の細胞生存及び機能を促進するために、及び/又は製品の操作を可能にするために、細胞の生存及び機能のための適切な生体力学的環境を提供する液体又はゲル形の天然又は合成化合物（例えば、ヒドロゲル））、及び／又は生体適合性足場（すなわち、天然又は合成足場、生分解性材料から製造された足場、非生分解性材料から製造された足場、及び／又はそれらの任意の組合せ））を含むことができ、ここで３ＤＮＲ、ＲＰＥ細胞及び追加の生体適合性成分が、神経網膜の層及びＲＰＥ細胞の下層を含む複合体を形成するよう、物理的及び機能的に統合される。ＲＰＥ細胞は、３ＤＮＲとの統合の前、生体適合性足場の上部で成長され得、その結果、３ＤＮＲはＲＰＥ細胞の上部に配置される。例えば、３ＤＮＲ及びＲＰＥは、追加の生体適合性成分に埋め込まれ得る。

当業者は、３ＤＮＲは、ｉ) 未分化の偽重層神経網膜上皮；ｉｉ) 全ての網膜層及びそれらに対応する網膜前駆体細胞型を含む積層神経網膜組織；及び／又はｉｉｉ)外顆粒層（ＯＮＬ）及び双極細胞層（ＢＣＬ）を含む高度に分化された網膜組織であり得、ここで前記ＯＮＬは桿体富化、錐体富化又はそれらの任意の組合せにされ得、そして／又はＲＰＥ細胞は、ｉ) 最初のプレーティング又はその後の継代から；ｉｉ) 分化の初期段階で；及び／又はｉｉｉ) 分化のより進行した段階、培養時間、又はそれらの組合せで得られることを認識しているであろう。それらの３ＤＮＲ及びＲＰＥの任意の組合せは、本明細書に記載される３次元組織製品のいずれにも使用され得る。

ＲＰＥ細胞は、本明細書に記載される方法のいずれかを用いて調製され得る。非制限的な例によれば、ＲＰＥ細胞は、ａ) 外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーターが補充されていない第１培地においてヒト網膜オルガノイドを培養し、ＲＰＥ細胞及び神経網膜（ＮＲ）を生成し；ｂ）前記培養された網膜オルガノイドからＲＰＥ細胞組織を単離し；ｃ）前記単離されたＲＰＥ組織を、単一のＲＰＥ細胞の懸濁液に解離させ；ｄ）単一ＲＰＥ細胞を付着培養にプレーティングし；そしてｅ) 外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーターが補充されていない第２培地において、前記プレーティングされた細胞を培養し、ＲＰＥの単層を生成することにより調製される。

本明細書に記載される方法を用いて、桿体富化及び錐体富化ｈｉＰＳＣ由来の網膜組織の両方を生成することが可能である。（図６Ａ−６Ｊを参照のこと）。例えば、＃Zhong et al., Nature Communications 5:4047 (2014)に記載されるレチノイン酸（ＲＡ）レジームを用いて、桿体富化３ＤＮＲを再現性よく生成することが可能である。（また、米国公開特許出願番号代２０１６／０３３３１２号を参照のこと）。同様に、ＲＡレジームの修飾は、錐体富化ｈｉＰＳＣ由来の網膜組織の生成を可能にする。さらに、３ＤＮＲ中の双極細胞は、桿体、錐体ＯＮ及び錐体ＯＦＦ双極細胞を含む全ての主要な双極細胞サブタイプに分化する能力を有する。さらに、桿体及び錐体は、双極細胞とのシナップス接続を確立する能力を有する。

当業者は、本明細書に記載される共培養アプローチの多様性により、異なる３次元組織製品を生成するために、光受容体成熟の異なる時間で３ＤＮＲ及びＲＰＥを組合すことができることを認識するであろう。
３次元組織製品の製造方法：

ａ）ＲＰＥ細胞（すなわち、ｉ) 最初のプレーティング又はその後の継代から；ｉｉ) 分化の初期段階で；及び／又はｉｉｉ) 分化のより進行した段階、培養時間、又はそれらの組合せで得られる）及び３ＤＮＲを生成するためにヒト網膜オルガノイドを培養し；ｂ）ＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲを分離し；ｃ）ＲＰＥ細胞の上部に神経網膜パッチを播種し、複合体を形成し；ｄ）適切な培地において前記複合体を共培養し；そして／又はｅ）３ＤＮＲからの神経網膜パッチ、ＲＰＥ細胞、又は３ＤＮＲからの神経網膜パッチ及びＲＰＥ細胞の両方を、製品に統合された追加の生体適合性成分に埋め込むことにより、機能的に成熟した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、及び３次元神経網膜（３ＤＮＲ）から得られた神経網膜パッチ、追加の生体適合性成分、並びに生体適合性足場を含む、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の３次元組織製品の製造方法もまた提供され、ここで共培養に続いて、３ＤＮＲ、ＲＰＥ細胞及び追加の生体適合性成分が物理的及び機能的に統合し、神経網膜の層及びＲＰＥ細胞の下層を含む３次元組織製品を形成し、前記３ＤＮＲは、ｉ) 未分化の偽重層神経網膜上皮；ｉｉ) 全ての網膜層及びそれらに対応する網膜前駆体細胞型を含む積層神経網膜組織；及び／又はｉｉｉ)外顆粒層（ＯＮＬ）及び双極細胞層（ＢＣＬ）を含む高度に分化された網膜組織、ここで前記ＯＮＬは桿体富化、錐体富化又はそれらの任意の組合せにされ得る、を含み、前記追加の生体適合性成分は、細胞の生存及び機能のための適切な生体力学的環境を提供し、前記製品の操作を可能にするか、又はその両方を可能にする液体又はゲル形での天然又は合成化合物を含み、そして前記ＲＰＥ細胞は、３ＤＮＲとの統合の前、前記生体適合性足場の上部で増殖され、そして前記３ＤＮＲがＲＰＥ細胞の上部に配置される。

実施形態によれば、工程ｃ）の前、ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ単層培養物を生成するために培養される（例えば、ｉ）ＲＰＥ細胞を、単一ＲＰＥ細胞の懸濁液に解離させ；
ｉｉ）付着培養において単一のＲＰＥ細胞をプレーティングし（例えば、約２５，０００〜約３００，０００細胞/ｃｍ^２（すなわち、約１００，０００細胞/ｃｍ^２）で）；そして／又はｉｉｉ）ＲＰＥの単層を生成するために、外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーターが補充されていない第２培地において、前記プレーティングされた細胞を培養することによる）。ＲＰＥ細胞は、酵素反応、酵素を含まない解離溶液、又は機械的手段（すなわち、機械的解離）を用いて、単一のＲＰＥ細胞に解離される。
３次元組織製品の使用：

本明細書に記載される３次元組織製品の何れも、種々の方法で使用され得る。例えば、それは網膜の疾患、障害又は状態に対する幹細胞ベースの再生治療のための移植体として使用され得る。非限定的な例によれば、それらの組織製品は、ＡＭＤ及び／又は網膜ジストロフィー、例えば網膜色素変性症（ＲＰ）を治療するために使用され得る。（Bharti et al., Invest. Ophthalmolol. Vis Sci 55:1191 -1201 (2014); Trounson et al., Cell Stem Cell 17:11-22 (2015)を参照のこと）。

同様に、それはまた、網膜発達、網膜及びＲＰＥを含む正常なメカニズムを研究するためのインビトロシステムとして、及び／又は生理学的及び／又は疾患メカニズムを明らかにし、そして治療法を開発するための疾患モデルとしても使用され得る。さらに（又は他方では）、３次元組織製品はまた、創薬のためのインビトロモデルとしても使用され得る。例えば、それは、網膜の発達、機能、増殖、成熟、分化及び／又は生存に影響を及ぼす薬剤についてスクリーニングするために使用され得る。それらの製品はまた、現在の治療法の毒物学を研究するためにも使用され得る。
組成物：

１又は複数の医薬的に又は獣医学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はビークルと共に注入可能な細胞集団（例えば、本明細書に記載される方法に従って培養されたＲＰＥ細胞）が本明細書に提供される。

用語「医薬的に許容できる」及び「獣医学的に許容できる」とは、医薬的に又は獣医学的に許容できる材料、組成物又はビークル、例えば液体又は固体の充填剤、賦形剤、溶媒又はカプセル化材料を指す。各成分は、医薬製剤の他の成分と適合できるという意味で、「医薬的に許容できる」、又は「獣医学的に許容できる」必要がある。それは、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、免疫原生、又は他の問題又は合併症を伴わないで、ヒト及び動物の組織又は器官と接触して使用するのに適している必要がある。（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th Edition; Rowe et al., Eds., The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2005; and Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd Edition; Ash and Ash Eds., Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, Gibson Ed., CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2004を参照のこと）。

本開示の医薬組成物は、その意図された投与経路（すなわち、眼内、網膜下、非経口、静脈内、動脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮、局所、経粘膜、腹腔内又は胸膜内、及び/又は直腸投与）と適合できるように処方される。

注射可能な使用に通した医薬組成物は、無菌の水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び無菌の注射可能な溶液又は細胞の分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。すべての場合、組成物は無菌でなければならず、そして容易な注射可能性が存在する程度まで流動性でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定している必要があり、そして微生物、例えば細菌及び真菌の汚染作用から保護される必要がある。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合、必要とされる粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。いくつかの実施形態によれば、等張剤、例えば砂糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含むことが所望されるであろう。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによりもたらすことができる。

無菌の注射可能溶液は、必要に応じて、上に列挙された成分の１つ又は組合せを含む適切な溶媒に、必要とされる量の活性化合物を組み込み、続いて濾過減菌することにより調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒体及び上に列挙されたものから必要とされる他の成分を含む減菌ビークルに組込むことにより調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、活性成分の粉末、及び以前に無菌濾過された溶液からの任意の所望の成分を得る真空乾燥及び凍結乾燥である。

１つの実施形態によれば、活性化合物は、移植体及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤などの身体からの急速な排除に対する化合物を保護するであろう担体を用いて調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸が使用され得る。そのような製剤の調製方法は、当業者に明らかであろう。材料はまた、Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.からも市販されている。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞を標的とするリポソームを含む）はまた、医薬的に許容できる担体としても使用され得る。それらは、米国特許第４，５２２，８１１号に記載のようにして、当業者に知られている方法に従って調製され得る。

本明細書で使用される投与単位形は、治療される対象の単一投薬量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果を生成するように計算された所定量の活性化合物を含む。本開示の投与単位形の仕様は、活性化合物の固有の特性、及び達成されるべき特定の治療効果、並びに個人の治療のためにそのような活性化合物を配合することの技術的に固有の制限により決定され、そして直接的に依存する。
キット、医薬品及び製造品：

本開示の方法に従って培養されたＲＰＥ細胞、及び／又は本開示の３次元組織製品は、単独で、又は１又は複数の他の治療剤と組合して、薬剤の製造に使用され得る。

網膜の発達におけるＲＰＥ細胞の役割を試験し；網膜の発達、機能、増殖、成熟、分化及び／又は生存に影響を及ぼす薬剤についてスクリーニングし；そして／又は網膜の発達を試験するための、網膜疾患、障害又は状態を治療するためのキット（任意には、使用説明書と共に）がまた提供される。

本明細書に記載される細胞又は３次元組織製品のいずれかを含む容器及び使用説明を含む製造品もまた提供される。

本明細書に記載される組成物のいずれも、投与の指示と共に、容器、パック又はディスペンサー含まれ得る。
治療方法：

本明細書に記載される組成物のいずれも、哺乳類における網膜疾患、障害又は状態を治療するために使用され得る。

本開示による治療実体の投与は、改善された移動、送達、耐性などを提供するために製剤中に組込まれる適切な担体、賦形剤及び他の薬剤と共に投与され得ることは理解されるであろう。多数の適切な処方が、全ての医薬品化学者に知られている処方集に見出されえる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１５ｔｈｅｄ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９７５）），特に、Blaug、Seymour によるChapter 87。それらの製剤は以下を含む：例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、小胞（リポフェクチン（登録商標）など）を含む脂質（カチオン性又はアニオン性）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型及び油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカーボワックスを含む半固体混合物。前述の混合物のいずれも、製剤中の活性成分が製剤により各活性化されず、そして製剤が生理学的に適合性があり、そして投与経路に対して耐性であるという条件で、本開示による治療及び療法に適切であり得る。また、以下を参照のこと：ＢａｌｄｒｉｃｋＰ． “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｅｘｃｉｐｉｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅｎｅｅｄｆｏｒｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌｇｕｉｄａｎｃｅ．” Ｒｅｇｕｌ．ＴｏｘｉｃｏｌＰｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０−８（２０００），ＷａｎｇＷ． “Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｓｏｌｉｄｐｒｏｔｅｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．” Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１−２）：１−６０（２０００），ＣｈａｒｍａｎＷＮ “Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃｄｒｕｇｓ，ａｎｄｏｒａｌｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅｅｍｅｒｇｉｎｇｃｏｎｃｅｐｔｓ．” ＪＰｈａｒｍＳｃｉ．８９（８）：９６７−７８（２０００），Ｐｏｗｅｌｌｅｔａｌ． “Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓｆｏｒｐａｒｅｎｔｅｒａｌｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ” ＰＤＡＪＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１（１９９８）、及び医薬品化学者に良く知られている製剤、賦形剤及び担体に関連する追加の情報については、それらにおける引用。

以下の実施例は、当業者に、本明細書に記載および特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、及び／又は方法がどのように作成および評価されるかについての完全な開示及び説明を提供するために提示されており、そして純粋に例示することを意図しており、発明者が彼らの発明と見なす範囲を制限することを意図していない。数値（量、温度など）に関して正確さを確保するための努力がなされてきたが、ここではいくつかの誤差及び偏差を考慮する必要がある。特にことわらない限り、部は重量部であり、温度は摂氏又は周囲温度であり、圧力は大気圧又はそれに近い。記載されたプロセスから得られる生成物の純度および収率を最適化するために使用できる反応条件、例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、及び他の反応範囲及び条件の多くのバリエーション及び組み合わせが存在する。そのようなプロセス条件を最適化するには、合理的で日常的な実験のみが必要である。

実施例１：ヒト幹細胞由来の網膜オルガノイドからの網膜色素上皮の誘導：
製品を生成するための方法：
工程１．ヒトｉＰＳＣからの機能的光受容体を備えた３次元網膜組織の生成。

３次元網膜組織を、Zhong et al., Nature Communications 5:4047 (2014) 及び米国公開特許出願第US2016 / 0333312号（それらの個々は、その全体が参照により本明細書に組込まれる）に記載される方法に従って調製する。そのようなｈｉＰＳＣ由来の３Ｄ網膜オルガノイドにおいては、ＲＰＥ細胞は、網膜オルガノイドの先端で塊として見出される。

工程２．ヒト３Ｄ網膜からのＲＰＥ細胞の単離及び誘導一次ＲＰＥ（ｉｐＲＰＥ）培養の確立（図１）。
１．３Ｄ網膜カップ及び／又は浮遊ＲＰＥ組織凝集体からＲＰＥ組織の解剖、及びそれらをペトリ皿の中央に集め、培地を吸引する。
２．ＰＢＳ（約５ｍｌ）で２回すすぐ。
３．最後の洗浄液を吸引した後、０．２５％のコラゲナーゼＩＶ（又は他の解離試薬）を含むＤＭＥＭ培地を添加し、そしてそれを４時間放置する（重量を計り、混合し、そして１５分間温め、そして使用の前、コラゲナーゼを濾過する）。
４．インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ_２）での４時間後、激しくピペッティングすることによりＲＰＥ組織を小片に細かくする。
５．２５℃で８００ｒｐｍで５分間、遠心分離する。
６．培地を吸引し、そしてＡｃｃｕｍａｘ（又は他の解離試薬）により塊を再懸濁し、そしてインキュベーター内で２０〜３０分間インキュベートする。
７．割り当てられた時間の後、単一の細胞への解離まで、塊を静かにピペッティングし、そして４０μｍのナイロンメッシュを用いて溶液を濾過する。
８．細胞を、１ｃｍ^２当たり約１００，０００細胞でプレーティングし、そしてＲＰＥ培地で増殖される必要がある（表４）。例えば、１２ｍｍのマトリゲル（又は他の被覆溶液）被覆されたトランスウェルプレーティングを使用できる。
９．１日ごとに培地を交換する（残骸及び細胞死をきれいにするために、最初の２回は、前にＰＢＳによりすすぐ）。

実施例２：３次元組織製品の調製。

ｈｉＰＳＣ由来の３Ｄ網膜組織を、Zhong et al., Nature Communications 5:4047 (2014) 及び米国公開特許出願第US2016 / 0333312号に記載のようにして生成する。神経網膜パッチ（３ＤＮＲ）を、当業界において知られている任意の方法を用いて、３Ｄ網膜から調製する。例えば、ｈｉＰＳＣ由来の３Ｄ網膜を、３Ｄ網膜カップの内部を露出するために開き（例えば、タングステン針又は当業界において知られている任意の他の方法を用いて）、網膜フラットマウントとして平らにし、そして網膜外植片を得る。他方では、網膜外植片はまた、３Ｄ網膜からレーザーを用いて直接的に得られる。

次に、それらの網膜外植片（又はパッチ）を、ｉｐＲＰＥ（継代２）上に播種し、そして異なる時間、共培養する。それらの条件下で、３ＤＮＲは、ＲＰＥ単離に付着し、３ＤＮＲ／ＲＰＥ複合体を形成する。（図５を参照のこと）。追加の生体適合性成分（例えば、細胞生存及び機能のための適切な生体力学的環境を提供する液体又はゲル形での天然又は合成化合物（例えば、ヒドロゲル））、及び／又は生体適合性足場（例えば、天然又は合成足場、生分解性材料から製造された足場、非生分解性材料から製造された足場、及び／又はそれらの組合せ）のシステム中への組込みはさらに、より長い培養期間及び移植中の操作を可能にする改善された生体力学的環境を提供する。この追加の生体適合性成分の包含は、移植された細胞の生存及び機能を促進する。

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同等物
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、上記の添付の説明に記載されている。本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。

前述の説明は、例示の目的でのみ提示されており、本発明を開示された正確な形に限定することを意図するものではなく、本明細書に添付された特許請求の範囲による。

Claims

機能的に成熟した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、及び３次元神経網膜（３ＤＮＲ）の一部、追加の生体適合性成分、並びに生体適合性足場を含み、前記３ＤＮＲ、ＲＰＥ細胞及び追加の生体適合性成分が、神経網膜の層及びＲＰＥ細胞の下層を含む複合体を形成するよう、物理的及び機能的に統合され、
前記３ＤＮＲが、
ｉ) 未分化の偽重層神経網膜上皮；
ｉｉ) 全ての網膜層及びそれらに対応する網膜前駆体細胞型を含む積層神経網膜組織；又は
ｉｉｉ)外顆粒層（ＯＮＬ）及び双極細胞層（ＢＣＬ）を含む高度に分化された網膜組織、ここで前記ＯＮＬは桿体富化、錐体富化又はそれらの任意の組合せにされ得る、を含み、
前記追加の生体適合性成分が、細胞の生存及び機能のための適切な生体力学的環境を提供し、前記製品の操作を可能にするか、又はその両方を可能にする液体又はゲル形での天然又は合成化合物を含み、そして
前記ＲＰＥ細胞が、３ＤＮＲとの統合の前、前記生体適合性足場の上部で増殖され、そして前記３ＤＮＲがＲＰＥ細胞の上部に配置される、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の３次元組織製品。
前記ＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲが両方ともヒト網膜オルガノイドから得られる、請求項１に記載の３次元組織製品。
前記ＲＰＥ細胞が、
ａ) 外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーターが補充されていない第１培地においてヒト網膜オルガノイドを培養し、ＲＰＥ細胞及び神経網膜（ＮＲ）を生成し；
ｂ）前記培養された網膜オルガノイドからＲＰＥ細胞組織を単離し；
ｃ）前記単離されたＲＰＥ組織を、単一のＲＰＥ細胞の懸濁液に解離させ；
ｄ）単一ＲＰＥ細胞を付着培養にプレーティングし；そして
ｅ) 外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーターが補充されていない第２培地において、前記プレーティングされた細胞を培養し、ＲＰＥの単層を生成することにより調製される、請求項１に記載の３次元組織製品。
前記ＲＰＥ細胞が、
ｉ) 最初のプレーティング又はその後の継代から；
ｉｉ) 分化の初期段階で；又は
ｉｉｉ) 分化のより進行した段階、培養時間、又はそれらの組合せで得られる、請求項１又は３に記載の３次元組織製品。
前記生体適合足場が、天然又は合成の足場、生分解性材料から製造された足場、非生分解性材料から製造された足場、又はそれらの組合せから成る群から選択される、請求項１に記載の３次元組織製品。
機能的に成熟した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、及び３次元神経網膜（３ＤＮＲ）から得られた神経網膜パッチ、追加の生体適合性成分、並びに生体適合性足場を含む、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の３次元組織製品の製造方法であって、
ａ）ＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲを生成するためにヒト網膜オルガノイドを培養し；
ｂ）ＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲを分離し；
ｃ）ＲＰＥ細胞の上部に神経網膜パッチを播種し、複合体を形成し；
ｄ）適切な培地において前記複合体を共培養し；そして
ｅ）３ＤＮＲからの神経網膜パッチ、ＲＰＥ細胞、又は３ＤＮＲからの神経網膜パッチ及びＲＰＥ細胞の両方を、製品に統合された追加の生体適合性成分に埋め込むことを含み、
共培養に続いて、３ＤＮＲ、ＲＰＥ細胞及び追加の生体適合性成分が物理的及び機能的に統合し、神経網膜の層及びＲＰＥ細胞の下層を含む３次元組織製品を形成し、
前記３ＤＮＲが、
ｉ) 未分化の偽重層神経網膜上皮；
ｉｉ) 全ての網膜層及びそれらに対応する網膜前駆体細胞型を含む積層神経網膜組織；又は
ｉｉｉ)外顆粒層（ＯＮＬ）及び双極細胞層（ＢＣＬ）を含む高度に分化された網膜組織、ここで前記ＯＮＬは桿体富化、錐体富化又はそれらの任意の組合せにされ得る、を含み、
前記追加の生体適合性成分が、細胞の生存及び機能のための適切な生体力学的環境を提供し、前記製品の操作を可能にするか、又はその両方を可能にする液体又はゲル形での天然又は合成化合物を含み、そして
前記ＲＰＥ細胞が、３ＤＮＲとの統合の前、前記生体適合性足場の上部で増殖され、そして前記３ＤＮＲがＲＰＥ細胞の上部に配置される、方法。
工程ｅ）の前、前記ＲＰＥ細胞が、培養され、ＲＰＥ単層培養物が生成される、請求項６に記載の方法。
前記ＲＰＥ単層培養物が、
ｉ）ＲＰＥ細胞を、単一ＲＰＥ細胞の懸濁液に解離させ；
ｉｉ）付着培養において単一のＲＰＥ細胞をプレーティングし；そして
ｉｉｉ）外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーターが補充されていない第２培地において、前記プレーティングされた細胞を培養し、ＲＰＥの単層を生成することにより生成される、請求項７に記載の方法。
前記ＲＰＥ細胞が、
ｉ) 最初のプレーティング又はその後の継代から；
ｉｉ) 分化の初期段階で；又は
ｉｉｉ) 分化のより進行した段階、培養時間、又はそれらの組合せで得られる、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記ＲＰＥ細胞が、酵素反応、酵素を含まない解離溶液、又は機械的手段を用いて単一のＲＰＥ細胞に解離される、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記解離されたＲＰＥ細胞が機械的に解離される、請求項１０に記載の方法。
前記単一のＲＰＥ細胞が、約２５，０００〜約３００，０００細胞／ｃｍ^２の密度でプレーティングされる、請求項１０に記載の方法。
前記単一のＲＰＥ細胞が、約１００，０００細胞／ｃｍ^２の密度でプレーティングされる、請求項１２に記載の方法。
前記第２培地がＲＰＥ細胞の増殖を助ける、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の方法。
前記生体適合足場が、天然又は合成の足場、生分解性材料から製造された足場、非生分解性材料から製造された足場、又はそれらの組合せから成る群から選択される、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の方法。
前記３ＤＮＲ及びＲＰＥ細胞が、細胞成熟の異なる時期に共培養される、請求項６〜１５のいずれか１項に記載の方法。
前記３ＤＮＲ及びＲＰＥ細胞が、桿体富化３次元組織製品をもたらす培地において共培地される、請求項６〜１５のいずれか１項に記載の方法。
前記３ＤＮＲ及びＲＰＥ細胞が、錐体富化３次元組織製品をもたらす培地において共培地される、請求項６〜１５のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜５のいずれか１項に記載の３次元組織製品を、それを必要とする患者の眼に移植することを含む、網膜の疾患、障害又は状態を治療する方法。
前記網膜の疾患、障害又は状態が、網膜色素変性症（ＲＰ）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、シュタルガルト病、アッシャー症候群、脈絡膜血症、桿体-錐体又は錐体-桿体ジストロフィー、繊毛病、ミトコンドリア障害、進行性網膜萎縮、変性網膜疾患、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、地図状萎縮、家族性又は後天性黄斑症、網膜光受容体疾患、網膜色素上皮性疾患、糖尿病性網膜症、嚢胞性黄斑浮腫、ブドウ膜炎、網膜剥離、外傷性網膜損傷、医原性網膜損傷、黄斑円孔、黄斑部毛細血管拡張症、神経節細胞疾患、視神経細胞疾患、緑内障、視神経症、虚血性網膜疾患、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、家族性大動脈瘤、網膜血管疾患、眼血管疾患、血管疾患、及び虚血性視神経障害から成る群から選択される、請求項１９に記載の方法。
網膜の発達、機能、増殖、成熟、分化、生存又はそれらの任意の組合せに影響を及ぼす薬剤のスクリーニング方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の３次元組織製品と、少なくとも１つの薬剤とを接触させ；そして
ｂ）前記薬剤が、網膜の発達、機能、増殖、成熟、分化、生存又はそれらの任意の組合せに対する効果を有するかどうかを決定することを含む方法。
前記少なくとも１つの薬剤が生物学的薬剤である、請求項２１に記載の方法。
前記生物学的薬剤が、成長因子、栄養因子、調節因子、ホルモン、抗体又はその抗原結合フラグメント、小分子、及びペプチドから成る群が選択される、請求項２２に記載の方法。
網膜の発達を試験するためのインビトロ方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の３次元組織製品を調製し；そして
ｂ）前記３次元組織製品内の細胞の細胞相互作用、機能、増殖、成熟、分化、生存、又はそれらの任意の組合せをモニターすることを含む、インビトロ方法。
前記モニターリングが、正常な網膜の発達に関する情報を提供する、請求項２４に記載のインビトロ方法。
前記モニターリングが、網膜及びＲＰＥの相互作用に関する情報を提供する、請求項２５に記載のインビトロ方法。
前記モニターリングが、網膜の異常発達、疾患、障害又は状態に関する情報を提供する、請求項２４に記載のインビトロ方法。
前記モニターリングが、網膜の異常発達、疾患、障害又は状態の根本的メカニズムに関する情報を提供する、請求項２７に記載のインビトロ方法。
その必要な患者の眼への移植のためである、網膜の疾患、障害又は状態の治療への使用のための請求項１〜５のいずれか１項に記載の３次元組織製品。
前記網膜の疾患、障害又は状態が、網膜色素変性症（ＲＰ）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、シュタルガルト病、アッシャー症候群、脈絡膜血症、桿体-錐体又は錐体-桿体ジストロフィー、繊毛病、ミトコンドリア障害、進行性網膜萎縮、変性網膜疾患、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、地図状萎縮、家族性又は後天性黄斑症、網膜光受容体疾患、網膜色素上皮性疾患、糖尿病性網膜症、嚢胞性黄斑浮腫、ブドウ膜炎、網膜剥離、外傷性網膜損傷、医原性網膜損傷、黄斑円孔、黄斑部毛細血管拡張症、神経節細胞疾患、視神経細胞疾患、緑内障、視神経症、虚血性網膜疾患、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、家族性大動脈瘤、網膜血管疾患、眼血管疾患、血管疾患、及び虚血性視神経障害から成る群から選択される、請求項２９に記載の３次元組織製品。