JPWO2019217630A5

JPWO2019217630A5 -

Info

Publication number: JPWO2019217630A5
Application number: JP2020563522A
Authority: JP
Publication date: 2022-06-01
Anticipated expiration: 2039-05-09

Claims

機能的に成熟した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、及び３次元神経網膜（３ＤＮＲ）の一部、追加の生体適合性成分、並びに生体適合性足場を含み、前記３ＤＮＲ、ＲＰＥ細胞及び追加の生体適合性成分が、神経網膜の層及びＲＰＥ細胞の下層を含む複合体を形成するよう、物理的及び機能的に統合され、
前記３ＤＮＲが、
ｉ)未分化の偽重層神経網膜上皮；
ｉｉ)全ての網膜層及びそれらに対応する網膜前駆体細胞型を含む積層神経網膜組織；又は
ｉｉｉ)外顆粒層（ＯＮＬ）及び双極細胞層（ＢＣＬ）を含む高度に分化された網膜組織、ここで前記ＯＮＬは桿体富化、錐体富化又はそれらの任意の組合せにされ得る、を含み、
前記追加の生体適合性成分が、細胞の生存及び機能のための適切な生体力学的環境を提供し、前記製品の操作を可能にするか、又はその両方を可能にする液体又はゲル形での天然又は合成化合物を含み、そして
前記ＲＰＥ細胞が、３ＤＮＲとの統合の前、前記生体適合性足場の上部で増殖され、そして前記３ＤＮＲがＲＰＥ細胞の上部に配置される、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の３次元組織製品。
前記ＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲが両方ともヒト網膜オルガノイドから得られる、請求項１に記載の３次元組織製品。
前記ＲＰＥ細胞が、
ａ) 外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーターが補充されていない第１培地においてヒト網膜オルガノイドを培養し、ＲＰＥ細胞及び神経網膜（ＮＲ）を生成し；
ｂ）前記培養された網膜オルガノイドからＲＰＥ細胞組織を単離し；
ｃ）前記単離されたＲＰＥ組織を、単一のＲＰＥ細胞の懸濁液に解離させ；
ｄ）単一ＲＰＥ細胞を付着培養にプレーティングし；そして
ｅ)外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーターが補充されていない第２培地において、前記プレーティングされた細胞を培養し、ＲＰＥの単層を生成することにより調製される、請求項１に記載の３次元組織製品。
前記ＲＰＥ細胞が、
ｉ)最初のプレーティング又はその後の継代から；
ｉｉ)分化の初期段階で；又は
ｉｉｉ)分化のより進行した段階、培養時間、又はそれらの組合せで得られる、請求項１に記載の３次元組織製品。
前記生体適合足場が、天然又は合成の足場、生分解性材料から製造された足場、非生分解性材料から製造された足場、又はそれらの組合せから成る群から選択される、請求項１に記載の３次元組織製品。
機能的に成熟した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、及び３次元神経網膜（３ＤＮＲ）から得られた神経網膜パッチ、追加の生体適合性成分、並びに生体適合性足場を含む、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の３次元組織製品の製造方法であって、
ａ）ＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲを生成するためにヒト網膜オルガノイドを培養し；
ｂ）ＲＰＥ細胞及び３ＤＮＲを分離し；
ｃ）ＲＰＥ細胞の上部に神経網膜パッチを播種し、複合体を形成し；
ｄ）適切な培地において前記複合体を共培養し；そして
ｅ）３ＤＮＲからの神経網膜パッチ、ＲＰＥ細胞、又は３ＤＮＲからの神経網膜パッチ及びＲＰＥ細胞の両方を、製品に統合された追加の生体適合性成分に埋め込むことを含み、
共培養に続いて、３ＤＮＲ、ＲＰＥ細胞及び追加の生体適合性成分が物理的及び機能的に統合し、神経網膜の層及びＲＰＥ細胞の下層を含む３次元組織製品を形成し、
前記３ＤＮＲが、
ｉ)未分化の偽重層神経網膜上皮；
ｉｉ)全ての網膜層及びそれらに対応する網膜前駆体細胞型を含む積層神経網膜組織；又は
ｉｉｉ)外顆粒層（ＯＮＬ）及び双極細胞層（ＢＣＬ）を含む高度に分化された網膜組織、ここで前記ＯＮＬは桿体富化、錐体富化又はそれらの任意の組合せにされ得る、を含み、
前記追加の生体適合性成分が、細胞の生存及び機能のための適切な生体力学的環境を提供し、前記製品の操作を可能にするか、又はその両方を可能にする液体又はゲル形での天然又は合成化合物を含み、そして
前記ＲＰＥ細胞が、３ＤＮＲとの統合の前、前記生体適合性足場の上部で増殖され、そして前記３ＤＮＲがＲＰＥ細胞の上部に配置される、方法。
工程ｅ）の前、前記ＲＰＥ細胞が、培養され、ＲＰＥ単層培養物が生成される、請求項６に記載の方法。
前記ＲＰＥ単層培養物が、
ｉ）ＲＰＥ細胞を、単一ＲＰＥ細胞の懸濁液に解離させ；
ｉｉ）付着培養において単一のＲＰＥ細胞をプレーティングし；そして
ｉｉｉ）外因性成長因子、モルフォゲン、又はそれらのシグナル伝達経路のモジュレーターが補充されていない第２培地において、前記プレーティングされた細胞を培養し、ＲＰＥの単層を生成することにより生成される、請求項７に記載の方法。
前記ＲＰＥ細胞が、
ｉ)最初のプレーティング又はその後の継代から；
ｉｉ)分化の初期段階で；又は
ｉｉｉ)分化のより進行した段階、培養時間、又はそれらの組合せで得られる、請求項６に記載の方法。
前記ＲＰＥ細胞が、酵素反応、酵素を含まない解離溶液、又は機械的手段を用いて単一のＲＰＥ細胞に解離される、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
前記解離されたＲＰＥ細胞が機械的に解離される、請求項１０に記載の方法。
前記単一のＲＰＥ細胞が、約２５，０００～約３００，０００細胞／ｃｍ^２の密度でプレーティングされる、請求項１０に記載の方法。
前記単一のＲＰＥ細胞が、約１００，０００細胞／ｃｍ^２の密度でプレーティングされる、請求項１２に記載の方法。
前記第２培地がＲＰＥ細胞の増殖を助ける、請求項６に記載の方法。
前記生体適合足場が、天然又は合成の足場、生分解性材料から製造された足場、非生分解性材料から製造された足場、又はそれらの組合せから成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
前記３ＤＮＲ及びＲＰＥ細胞が：
ｉ）細胞成熟の異なる時期に；
ｉｉ）桿体富化３次元組織製品をもたらす培地において；及び／又は
ｉｉｉ）錐体富化３次元組織製品をもたらす培地において；
共培地される、請求項６に記載の方法。
請求項１～５のいずれか１項に記載の３次元組織製品を、それを必要とする患者の眼に移植することを含む、網膜の疾患、障害又は状態を治療する方法。
前記網膜の疾患、障害又は状態が、網膜色素変性症（ＲＰ）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、シュタルガルト病、アッシャー症候群、脈絡膜血症、桿体-錐体又は錐体-桿体ジストロフィー、繊毛病、ミトコンドリア障害、進行性網膜萎縮、変性網膜疾患、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、地図状萎縮、家族性又は後天性黄斑症、網膜光受容体疾患、網膜色素上皮性疾患、糖尿病性網膜症、嚢胞性黄斑浮腫、ブドウ膜炎、網膜剥離、外傷性網膜損傷、医原性網膜損傷、黄斑円孔、黄斑部毛細血管拡張症、神経節細胞疾患、視神経細胞疾患、緑内障、視神経症、虚血性網膜疾患、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、家族性大動脈瘤、網膜血管疾患、眼血管疾患、血管疾患、及び虚血性視神経障害から成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
網膜の発達、機能、増殖、成熟、分化、生存又はそれらの任意の組合せに影響を及ぼす薬剤のスクリーニング方法であって、
ａ）請求項１～５のいずれか１項に記載の３次元組織製品と、少なくとも１つの薬剤とを接触させ；そして
ｂ）前記薬剤が、網膜の発達、機能、増殖、成熟、分化、生存又はそれらの任意の組合せに対する効果を有するかどうかを決定することを含む方法。
前記少なくとも１つの薬剤が生物学的薬剤であり、前記生物学的薬剤が、成長因子、栄養因子、調節因子、ホルモン、抗体又はその抗原結合フラグメント、小分子、及びペプチドから成る群が選択される、請求項１９に記載の方法。
網膜の発達を試験するためのインビトロ方法であって、
ａ）請求項１～５のいずれか１項に記載の３次元組織製品を調製し；そして
ｂ）前記３次元組織製品内の細胞の細胞相互作用、機能、増殖、成熟、分化、生存、又はそれらの任意の組合せをモニターすることを含む、インビトロ方法。
前記モニターリングが、以下：
ｉ）正常な網膜の発達；
ｉｉ）網膜及びＲＰＥの相互作用；
ｉｉｉ）網膜の異常発達、疾患、障害又は状態；及び
ｉｖ）網膜の異常発達、疾患、障害又は状態の根本的メカニズム；
に関する１つ以上の情報を提供する、請求項２１に記載のインビトロ方法。
その必要な患者の眼への移植のためである、網膜の疾患、障害又は状態の治療への使用のための請求項１～５のいずれか１項に記載の３次元組織製品。
前記網膜の疾患、障害又は状態が、網膜色素変性症（ＲＰ）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、シュタルガルト病、アッシャー症候群、脈絡膜血症、桿体-錐体又は錐体-桿体ジストロフィー、繊毛病、ミトコンドリア障害、進行性網膜萎縮、変性網膜疾患、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、地図状萎縮、家族性又は後天性黄斑症、網膜光受容体疾患、網膜色素上皮性疾患、糖尿病性網膜症、嚢胞性黄斑浮腫、ブドウ膜炎、網膜剥離、外傷性網膜損傷、医原性網膜損傷、黄斑円孔、黄斑部毛細血管拡張症、神経節細胞疾患、視神経細胞疾患、緑内障、視神経症、虚血性網膜疾患、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、家族性大動脈瘤、網膜血管疾患、眼血管疾患、血管疾患、及び虚血性視神経障害から成る群から選択される、請求項２３に記載の３次元組織製品。