JP2021522318A - アシル化glp−1誘導体 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
cell)から分泌されるポリペプチドホルモンであり、グルコース依存性インスリン分泌及び生物合成を促進し、グルカゴン分泌を阻害し、胃内容排出を阻害するなど、多くの機能を有する。GLP−2類似体は、腸組織と中枢神経系の脳幹と視床下部の神経細胞で合成され、主に正常な小腸の成長と腸粘膜の損傷の修復を促進する(付 剛、▲キョウ▼ ▲ミン▼、徐 為人、グルカゴン様ペプチド1及びその受容体アゴニストについての
研究の進展[J]、天津医薬、2012、40(2):181−184)。
, et al.Crystal structure of human dipeptidyl peptidase IV in complex with a dipeptide peptidase reveals details on substrate spe
cificity and tetrahedral intermediate [J].
Protein Sci,2004,13(2):412−421)。SARRAUST
E DE MENTHIEREらはGLP−1モデルを構築し、アミノ酸置換後GLP−1類似体と受容体の親和性と固有活性の変化を観察した結果、7位のヒスチジンが親和性と固有活性の決定要因であり、その芳香環はトリプトファンよりも小さく、極性置換基はない;8位のアラニンの側鎖には極性基があるとGLP−1の活性に影響を与え、側鎖の体積は大きすぎてはならず、一定の制限を超えると、活性が低下する;9位のグルタミン酸が、酸性、極性、及び疎水性アミノ酸などの特定のアミノ酸に置き換えられる場合、活性は変化せず、塩基性アミノ酸に置き換えられると活性が低下し、さらに不活性になることもある;GLP−1は受容体との結合状態にあり、その中のアミノ酸残基がイオン結合作用を持っている場合、7〜15位のアミノ酸の間に発生して環構造を形成し、Ala8−Glu9−Gly10−Thr11はβターンを形成して7位のヒスチジン、12位のフェニルアラニン、及び19位のチロシンなどの3つの芳香核が互いに作用し、受容体上の芳香族疎水性ポケットに対応し、それらが受容体を活性化する役割を果たすと推定される;22位のグリシンは柔軟なアミノ酸であり、柔軟に連結する役割を果たし、らせん状のコイル形状を維持する。グリシンを破壊すると、すべての芳香族アミノ酸がクラスター化するが、受容体との親和性が1/40減少する(SARAUSTE DE MENTHIEREC,CHAVANIEUA,GRASSYG,et al.Structural requirements of the N−terminal region of GLP−1−[7−37]−NH2 for receptor interaction an
d cAMP production [J].Eur J Med Chem,2004,39(6):473−480)。
の2つが同じ生物学的活性を有すると一般に考えられている。腸粘膜L細胞から分泌されるGLP−1(1−37)は不活性であり、活性なGLP−1(7−37)になるにはN末端の6つのアミノ酸をさらに加水分解により切除する必要がある。GLP−1(7−3
7)は体内に存在する時間が短く、すぐに分解される。したがって、抗DPP IVを有するGLP−1類似体について様々な研究が行われている。例えば、米国特許第5545618号には、アルキル基またはアシル基でのN末端の修飾が記載され、また、Gallwitzらは、DPP−IVへの耐性を高めて生理学的活性を維持するために、7位のHisのN−メチル化またはαメチル化し、またはHis全体をイミダゾールで置き換えることについて記載した。
示され、脂肪酸修飾部位はLys26にあり、初期の動物実験から、血糖降下作用においてセマグルチドより優れていることが示されている。この方法は、GLP−1類似体の生体内の作用時間を適切に延ばすことができるが、延ばした時間はまだ理想的ではない。
HX8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37
式中、X8は、V、T、I、L、GまたはSから選択され、X19はYまたはKであり、
X23はQまたはKであり、X27はEまたはKであり、X30はAまたはKであり、X34はRまたはKであり、X36はRまたはKであり、X37はGまたはKであり、
ただし、X19、X23、X27、X30、X34、X36、またはX37のうちの1つのみがK残基であり、
前記誘導体は、前記K残基に連結する延長部分を含み、
前記延長部分は、
xは4〜38の整数である。
HOOC(CH2)19CO−、HOOC(CH2)20CO−、HOOC(CH2)21CO−
、及びHOOC(CH2)22CO−からなる群より選択され、より好ましくはHOOC(
CH2)16CO−である。
HX8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37
配列を含み、この配列は、8位、19位、23位、27位、30位、34位、36位、及び37位からなる群より選択される1つ以上の部位の変異を含む。1つの好ましい実施形態では、8位のアミノ酸残基は、V、T、I、L、GまたはSから選択され、19位のアミノ酸残基はYまたはKであり、23位のアミノ酸残基はQまたはKであり、27位のアミノ酸残基はEまたはKであり、30位のアミノ酸残基はAまたはKであり、34位のア
ミノ酸残基はRまたはKであり、36位のアミノ酸残基はRまたはKであり、37位のアミノ酸残基はGまたはKであり、ただし、19位、23位、27位、30位、34位、36位または37位のうちの1つのみがK残基である。
1、GLP−1(7−37)類似体の誘導体またはその薬学上許容される塩であって、GLP−1(7−37)類似体は、下記式で表されるアミノ酸配列を含み、
HX8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37
、
式中、X8は、V、T、I、L、GまたはSから選択され、X19はYまたはKであり、
X23はQまたはKであり、X27はEまたはKであり、X30はAまたはKであり、X34はRまたはKであり、X36はRまたはKであり、X37はGまたはKであり、
ただし、X19、X23、X27、X30、X34、X36、またはX37のうちの1つのみがK残基であり、
前記誘導体は、前記GLP−1(7−37)類似体のK残基に連結する延長部分を含み、
前記延長部分は、
xは4〜38の整数である、GLP−1(7−37)類似体の誘導体またはその薬学上許容される塩。
2、前記延長部分は、
HOOC(CH2)14CO−、HOOC(CH2)15CO−、HOOC(CH2)16CO
−、HOOC(CH2)17CO−、HOOC(CH2)18CO−、HOOC(CH2)19C
O−、HOOC(CH2)20CO−、HOOC(CH2)21CO−、及びHOOC(CH2
)22CO−からなる群より選択される、請求項1に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩。
3、前記延長部分は、リンカーを介してGLP−1(7−37)類似体のK残基に連結されている、請求項1または2に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩。
4、前記リンカーは、
好ましくは、リンカーは、
式中、mは1または2であり;nは1または2であり;pは1〜5の任意の整数である、請求項3に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩。
5、前記リンカーは、
6、N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M2)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M4)、N
−ε34−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Arg26Lys34−GLP−1
(7−37))ペプチド(M5)、N−ε37−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8G
lu22Arg26,34Lys37−GLP−1(7−37))ペプチド(M7)、N−ε23−
[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Ile8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M9)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Thr8Glu22
Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M13)、N−ε30−[2
−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Ile8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M14)からなる群より選択されるいずれか一つの誘導体またはその薬学上許容される塩である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩。
7、(1)上記請求項のいずれか一項に記載のGLP−1類似体が溶解されている溶液と、上記請求項のいずれか一項に記載の延長部分が溶解されている溶液とを混合すること;
(2)pHを4〜5に調整して反応を停止させ、沈殿が生じるまで静置した後、沈殿を採取すること;及び
(3)TFAを沈澱に加え、pHを7.5〜8.5に調整して反応を停止すること
を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩を調製する方法。
8、上記請求項のいずれか一項に記載の延長部分が溶解されている溶液と混合する前に、GLP−1類似体が溶解されている溶液にトリエチルアミンを加えることをさらに含む、請求項7に記載の方法。
9、上記請求項のいずれか一項に記載の延長部分の溶液が、アセトニトリルで溶解されたものである、請求項7または8に記載の方法。
10、請求項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩、及び薬学上許容される補助材料を含む、薬物組成物。
11、糖尿病(1型糖尿病と2型糖尿病を含む)または糖尿病合併症を予防及び/または治療するための薬物の調製における、請求項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩の使用。
12、前記糖尿病合併症が糖尿病性腎症である、請求項11に記載の使用。
13、血糖の低減、耐糖能の改善、膵島β−細胞アポトーシスの減少、膵島β−細胞機能の増強、膵島β−細胞数の増加及び/または膵島β−細胞のグルコース感受性の回復のための薬物の調製における、請求項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩の使用。
14、前記血糖の低減は、空腹時血糖及び/または食後血糖を低下させることを含む、請求項13に記載の使用。
15、被験者に予防または治療有効量の請求項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩を投与することを含む、糖尿病(1型糖尿病と2型糖尿病を含む)または糖尿病合併症を予防及び/または治療するための方法。
16、前記糖尿病合併症が糖尿病性腎症である、請求項15に記載の方法。
17、被験者に治療有効量の請求項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬
学上許容される塩を投与することを含む、血糖の低減、耐糖能の改善、膵島β−細胞アポトーシスの減少、膵島β−細胞機能の増強、膵島β−細胞数の増加及び/または膵島β−細胞のグルコース感受性の回復のための方法。
18、前記血糖の低減は、空腹時血糖及び/または食後血糖を低下させることを含む、請求項17に記載の方法。
19、下記式で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、GLP−1(7−37)類似体。
HX8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37
式中、X8は、V、T、I、L、GまたはSから選択され、X19はYまたはKであり、
X23はQまたはKであり、X27はEまたはKであり、X30はAまたはKであり、X34はRまたはKであり、X36はRまたはKであり、X37はGまたはKであり、しかも、X19、X23、X26、X27、X30、X34、X36、またはX37のうちの1つのみがK残基である。
20、請求項19の類似体を含む薬物組成物。
21、糖尿病、糖尿病合併症を予防及び/または治療するための薬物の調製における、請求項19に記載の類似体の使用。
22、請求項10または請求項20に記載の薬物組成物を含む容器と、前記薬物組成物のプロトコルを含む添付文書とを含む、製品。
23、1つ以上の他の薬物を含む容器をさらに含む、請求項22に記載の製品。
24、前記1つ以上の他の薬物が、糖尿病または糖尿病合併症を治療するための他の薬物である、請求項23に記載の製品。
ある。複数の宿主細胞において本発明のペプチドをコードするDNAの転写を指導するのに適するプロモーターの例は、本分野で周知である。例えば、Sambrook,J,Fritsch,EFとManiatis,T,Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,1989を参照できる。
VX34GX36X37を含むポリペプチドを表し、式中、X8は、V、T、I、L、Gまたは
Sから選択され、X19はYまたはKであり、X23はQまたはKであり、X27はEまたはKであり、X30はAまたはKであり、X34はRまたはKであり、X36はRまたはKであり、X37はGまたはKである。このGLP−1(7−37)ポリペプチド類似体は、延長部分と連結することによって、GLP−1(7−37)ポリペプチド類似体の誘導体を形成する。具体的には、本発明は、GLP−1(7−37)類似体のアシル化誘導体に係る。このアシル化誘導体は顕著な治療効果を有するだけではなく、現在公認されている最も良い薬物セマグルチドと比較して、そのインビボでの活性の持続時間は約1倍長くなることができる。これは、人体内で少なくとも、1週間おきで投与する、さらに2週間おきでまたはより長い間隔で投与するという投与頻度を達成できることを意味する。
(1)上記のGLP−1類似体が溶解されている溶液と、延長部分(例えば、脂肪酸)が溶解されている溶液とを混合すること;
(2)pHを4〜5に調整して反応を停止させ、沈殿が生じるまで静置した後、沈殿を採取すること;及び
(3)TFAを沈澱に加え、pHを7.5〜8.5に調整して反応を停止すること
を含む、上記の誘導体またはその薬学上許容される塩を調製する方法に係る。
(2)そして、工程(1)で得られた溶液にトリエチルアミンを添加すること;
(3)下記構造を有する脂肪酸を、GLP−1類似体の量(モル比)の2倍以上、好ましくはGLP−1類似体の量の3倍以上の量を量り、アセトニトリルに溶解すること;
(5)pHを4〜5に調整して反応を停止させ、低温で静置して沈殿を起こさせて沈殿を採取すること;
(6)ポリペプチドの最終濃度が5〜15mg/mlになるように、工程(5)で得られた酸沈澱サンプルにTFAを加え、0.5〜2時間静置した後、NaOHなどのアルカリ性溶液を反応液に滴加し、pHを7.5〜8.5に調整して反応を停止すること;
(7)得られた生成物を分離精製することを含む。
またはグリコーゲン分解の刺激に係る肝酵素の阻害剤、グルコース摂取調節剤、NPYア
ンタゴニスト、PYYアゴニスト、PYY2アゴニスト、PYY4アゴニスト、TNFアゴニスト、コルチコトロピン放出因子アゴニスト、5HT、ボンベシンアゴニスト、ガングリオインアンタゴニスト、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニスト、TRβアゴニスト、ヒスタミンH3アンタゴニスト、リパーゼ/アミラーゼ阻害剤、胃
抑制性ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニスト、ガストリンおよびガストリン類似体などが挙げられる。一部の実施形態では、本発明に記載の薬物組成物、製剤、薬物と、その他の薬物、薬物化合物または組成物とは、それぞれ異なる容器に入れられる。
剤、グルコース摂取調節剤、CARTアゴニスト、NPYアンタゴニスト、PYYアゴニスト、PYY2アゴニスト、PYY4アゴニスト、TNFアゴニスト、コルチコトロピン放出因子アゴニスト、5HT、ボンベシンアゴニスト、ガングリオインアンタゴニスト、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニスト、TRβアゴニスト、ヒスタミンH3アンタゴニスト、リパーゼ/アミラーゼ阻害剤、胃抑制性ポリペプチドアゴニス
トまたはアンタゴニスト、ガストリンおよびガストリン類似体などが挙げられる。好ましい実施形態では、前記糖尿病は2型糖尿病または糖尿病腎症である。
以下、具体的な実施例を使用して本発明を説明する。特に明記しない限り、当業者によく知られている『Molecular Cloning:A Laboratory Manual』、『Cells:A Laboratory manual』などの実験マニュアルおよびCFDAの実験ガイドラインなどに記載されている方法に従って実施することができる。その中で使用される試薬原料はすべて市販品であり、オープンチャネルで購入できる。
Val8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37)のDNAの構築
6−Hisタグ、SUMOタグ、およびVal8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37)をコードする遺伝子配列(SEQ ID NO:7)を順に融合し、化学合成により遺伝子断片(SEQ ID NO:18)を得た。BamHIとXhoI部位を介して、上記断片を原核生物発現プラスミドpET−24(+)に挿入してシーケンシングによって検証した。得られた形質転換アッセイのための発現プラスミドは、pET−24(+)−His−SUMO−Val8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37)と呼ばれる。
上記の方法に従って、Val8Glu22Lys26Arg34−GLP−1(7−37)(
コード遺伝子はSEQ ID NO:3)、Val8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:11)、Val8Glu22L
ys19Arg26,34−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:5
)、Val8Glu22Lys27Arg26,34−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:9)、Val8Glu22Lys34Arg26−GLP−1(7−37)
(コード遺伝子はSEQ ID NO:13)、Val8Glu22Arg26,34Lys36−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:15)、Val8Glu22Arg26,34Lys37−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:17)、Thr8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:20)、Ile8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:22)、Leu8Glu22Lys23Ar
g26,34−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:24)、Gl
y8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:26)、Ser8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:28)、Thr8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:30)、Ile8Glu22L
ys30Arg26,34−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:3
2)、Leu8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:34)、Gly8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:36)、Ser8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37)(コード遺伝子はSEQ ID NO:38)の対応する発現プラスミドを順に構築した。
実施例1に記載のDNA構築物を使用して融合タンパク質を発現させ、細胞BL21(
TrabsGenBiotech.,catalog#CD601)を発現させることによって標的タンパク質を得た。BL21コンピテントセル50μlを氷浴に入れて溶かし、標的DNAを加えて軽く均一に振り、氷浴に30分間放置した。続いて、42℃水浴で30秒間熱ショックを与えた後、遠心管を振らないように遠心管を迅速に氷浴に移して2分間放置した。500μlの滅菌LB培地(抗生物質を含まない)を遠心管に加え、均一に混合した後に37℃に置き、180rpmで1時間培養して細菌を蘇らせた。200μlの形質転換されたコンピテントセルをピペットで取り、カナマイシン耐性を有するLB寒天培地プレート上に加え、細胞を均一に広げた。液体が吸収されるまでプレートを37℃に置き、そしてプレートを反転させて37℃で一晩培養した。翌日、播種ループを使用して形質転換プレート内のモノクローナルコロニーを取り出し、15mlの滅菌LB培地(抗生物質を含む)に播種し、30℃で一晩培養した。
50μlの細菌溶液(GLP−1発現細菌溶液)を50mlのLB培地に加えると共に、50μlのカナマイシンを加え、よく混合してから30℃の恒温シェーカーに入れて播種して一晩置いた。一晩播種した細菌溶液10mlを取り、1000mlのLB培地に加えると同時に、1000μlのカナマイシンを加えた。均一に振った後、37℃のシェーカーに入れて200rpmで、播種して4時間後に、最終濃度0.1mоl/LのIPTGを培地に加え、よく振った後、30℃のシェーカーに入れて180rpmで一晩置き、発現を誘導した。一晩発現した細菌溶液を13000gで60分間遠心分離した。細胞収量は約4g菌体/L発酵液であり、SDS−PAGEによって測定されたタンパク質発現量は約40%に達することができる。
100gの細胞スラリーを計量し、500mlの50mM Tris−HCl、pH8.0、50mM NaClに再懸濁し、細胞が破砕するように超音波細胞粉砕機で30分間超音波処理した。ホモジネートを4℃で13000gで60分間遠心分離し、遠心分離後に収集した上澄はNiカラムクロマトグラフィーサンプルであった。
得られた上澄を、50mM Tris−HCl、pH8.0、500mM NaCl、および10mMイミダゾール(平衡化溶液1)で予め平衡化したChelating Sepharose FFで濃縮した。平衡液1で洗浄した後、50mM Tris−HCl、pH8.0、500mM NaCl、および0.3Mイミダゾール(溶出液)で溶出した。SDS−PAGE分析によれば、上記の精製プロセスで生成されたGLP−1中間生成物の純度は70%より高かった。
ULP酵素を使用してSumoタグ配列を切除した。20mM PB、pH7.4緩衝液を中間生成物に加えて3倍に希釈し、4℃条件下でULP酵素:中間生成物が1:150でULPを加えて混合し、一晩消化した。SDS−PAGE分析によると、消化率はほぼ100%であった。
GLP−1類似体の精製:消化後に得られた生成物を、20mM Na2HPO4、0.7M NaCl(平衡液2)で予め平衡化したTosoh Butyl 550C媒質で濃縮した。平衡液2で洗浄した後、20%エタノールで溶出し、SDS−PAGE分析による純度は約90%であった。
溶出したサンプルに0.2M Na2HPO4を加えて最終濃度を20mM Na2HP
O4にし、1Mクエン酸でpHを4.8〜5.0に調整し、4℃で一晩沈殿させた。SD
S−PAGEによって検出された収率は90%以上であった。4℃で13000gで30分間遠心分離し、沈殿物を収集して−20℃で保存した。
下記式に表されるGLP−1類似体の誘導体、N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシ
ブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M2と略称する)の調製
g26,34−GLP−1(7−37)沈澱に水を加えて4〜6mg/ml溶液を調製し、1
M水酸化ナトリウムを加えてpHを11.0〜11.5に調整し、タンパク質が完全に溶解するように均一に振り、HPLCでポリペプチド濃度を定量した。ポリペプチドと脂肪酸(構造は下記通りである)とのモル比が1:4となるように脂肪酸粉末を取ってアセトニトリルに溶かした。体積が1000分の2のトリエチルアミンをポリペプチド溶液に加え、脂肪酸溶液と混合し、混合液を4℃で1時間静置した。
2、脂肪酸の脱保護と精製:ポリペプチドの最終濃度が約10mg/mlになるようにTFAを酸沈殿したサンプルに加え、振とうして沈澱を溶解し、室温で30分間静置して脱保護し、4M NaOHを反応液に滴加してpHを7.5〜8.5に調整して反応を停止した。
分取液体分析装置(島津LC−8A)を使用して、停止した反応液を流速4ml/minで、10mM酢酸アンモニウム、20%エタノール(平衡液3)で予め平衡化したUniSil 10−120C18(Suzhou Nano-Micro Technology CO., LTD.から購入)にポンプして濃縮した。平衡液3で洗浄した後、0〜100%溶出液(10mM酢酸アンモニウム、80%エタノール)で段階的に溶出し、溶出ピークを収集してRP−HPLCで検出した結果、純度は約90%であった。
溶出ピークを水で3倍に希釈し、酸沈殿によりpHを4.80に調整し、4℃で30分間酸沈殿させた。遠心分離後、PBST緩衝液(pH7.0)を沈殿物に加えて再溶解し、−80℃で保存した。
上記の方法に従って、N−ε26−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Ly
s26Arg34−GLP−1(7−37))ペプチド(M0)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M4)、N−ε19−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Lys19Glu22Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M1)、N−ε27−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Lys27Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M3)、N−ε34−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Arg26Lys34−GL
P−1(7−37))ペプチド(M5)、N−ε36−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Arg26,34Lys36−GLP−1(7−37))ペプチド(M6)、N−ε37−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Arg26,34Lys37−GLP−1(7−37))ペプチド(M7)、N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Thr8Gl
u22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M8)、N−ε23−[
2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Ile8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M9)、N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Leu8Glu22L
ys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M10)、N−ε23−[2−
(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Gly8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M11)、N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Ser8Glu22Ly
s23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M12)、N−ε30−[2−(
2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Thr8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M13)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Ile8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M14)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Leu8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M15)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カル
ボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Gly8Glu22Lys30A
rg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M16)、N−ε30−[2−(2−[
2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Ser8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M17)を順に調製した。
培養状態の良いRIN−m5F細胞を選択した。細胞を収集して計数し、RPMI1640基礎培養液で1×105細胞/mlの細胞懸濁液にした。ウェルあたり100μlで
細胞懸濁液を96ウェル細胞培養プレートに播種し、37℃、5%CO2条件下で一晩培
養した。cAMP検出キット(Promega)を使用してGLP−1類似体の誘導体のインビトロ活性を検出した;アッセイ培養液を調製してサンプル(Aib、M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7)を300ng/mlに希釈した後、96ウェルプレートで3倍段階的に希釈し、合計で8つの濃度にし、各希釈度で2つの複製孔を作り、M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7を上記のように調製した。Aibは、N−ε26−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP−1(7−37)
ペプチドであり(CN101133082Bの実施例4参照)、商品名はセマグルチドであり、特許CN101133082Bに開示された方法に従って調製された。
用意した細胞プレートを取り出し、培地を捨て、ろ紙で吸い取って乾かした。それに応じてサンプル溶液を細胞プレートに移し、40μl/ウェルにした。37℃、5%CO2
の条件下で蓋を開けて15分間処理した。インキュベーターから細胞培養プレートを取り出し、10μlのCD溶液(cAMP検出キット(Promega))を各ウェルに加え、細胞プレートを22℃〜25℃で500rpmで水平に振とうして20分間放置した。50μlのKG溶液(cAMP検出キット(Promega))を各ウェルに加え、22℃〜25℃、500rpmで水平に振って暗所に10分間放置した。Molecular
Devices SpectraMax L化学発光メーターを使用して化学発光値を
読み取り、30分間以内に検出を完了した。サンプルのEC50を、sоftmax Pro sоftwareの4パラメータ回帰によって計算した。
GLP−1が細胞膜上の受容体と結合できることに応じて、HEK293/CRE−Luc/GLP1R細胞株を構築し、一連のシグナル伝達を通してcAMP応答エレメント(CRE)を活性化し、下流のルシフェラーゼ発現を開始させた。発現量は、GLP−1の生物学的活性と正の相関があり、ルシフェラーゼ基質を加えた後、化学発光検出を行い、その発光強度を測定し、これによってGLP−1生物学的活性を測定した。
実験材料
96ウェル細胞培養プレート(白色不透明)、DMEM培地(GIBCO)、0.05%TRYPSIN−EDTA(GIBCO)、ウシ胎児血清(GIBCO)、G418、ハイグロマイシンB、Bright−GloTM Luciferase Assay Systemキット(Promega)、HEK293/CRE−luc/GLP1R細胞。
実験操作
(1)細胞の調製:細胞を活発な生長状態、且つ十分な量まで培養した。培養瓶内の培養液を捨て、3mlのVersene液を加えて1回振って、2mlの0.05%TRYPSIN−EDTA消化液を加え、蓋をして1分間平らに静置してから、6mlのアッセイ培養液を加えて消化を停止し、1000r/minで3分間遠心分離した後、上澄を捨て、細胞を5mlアッセイ培地に再懸濁し、血球計算盤でカウントした。DMEMアッセイ培養液を使用して細胞の密度を適切な範囲に調整して後ほどの使用のために放置した。
(2)サンプルの調製:表1の様々なGLP−1類似体の誘導体をアッセイ培養液で20ng/mlに希釈した後、96ウェルプレートに段階的に8つの濃度を希釈し、サンプルの代わりにアッセイ培養液を細胞ブランク対照として使用し、各希釈濃度で2つの複製孔を作製した。
(3)サンプル添加培養:調製した対照品と試験品溶液を96ウェル細胞培養プレート(ホワイトボード)に移し、各ウェルに50μlを加え、そして調製した細胞懸濁液を各ウェルに50μlを加え、37℃、5%CO2条件下で一定期間培養した。
(4)化学発光検出:基質を加え、96ウェル細胞培養プレートを取り出し、各ウェルに100μlのBright Glo試薬を加え、暗所に3分間放置した。
(5)読み取り:化学発光マイクロプレートリーダーSpectraMax Lで測定し、30分間以内にプレートを読み取り、測定結果を記録した。
4〜6週齢の健康なCD−1メスマウス28匹を選択し、4つの群に分け、それぞれM2、M4、M0及びセマグルチド(Aib)を0.15mg/kg体重の用量で皮下注射により投与した。投与前、投与後6時間、1日、2日、3日、4日の間隔で、2g/kg体重の用量で20%ブドウ糖を強制投与し、投与前に6時間禁食し、投与後の0、0.5、1、2時間にそれぞれ尾先端から血液を採取し、Roche血糖テストストリップを使用してリアルタイムで血糖を検出し、0〜120分間以内の血糖AUC(血糖〜時間曲線下の面積)を計算して血糖抑制率を算出した(表4)。
4〜6週齢の健康なCD−1メスマウス28匹を選択し、4つの群に分け、それぞれM4、M5、M7及びM0を0.15mg/kg体重の用量で皮下注射により投与した。投与前、投与後6時間、1日、2日、3日、4日の間隔で、2g/kg体重の用量で20%ブドウ糖を強制投与し、20%ブドウ糖の強制投与前に6時間禁食し、投与後の0、0.5、1、2時間にそれぞれ尾先端から血液を採取し、Roche血糖テストストリップを使用してリアルタイムで血糖を検出し、0〜120分間以内の血糖AUC(血糖〜時間曲線下の面積)を計算して血糖抑制率を算出した(表5)。
ICRマウスOGTT試験:4〜6週齢のICRマウス30匹を選択し、6つの群に分け、各群5匹ずつとし、それぞれM0、セマグルチド、M2、M4、M5およびM7を0.15mg/kg体重の用量で皮下注射により単回投与した。4時間、1日、2日、3日、4日、5日の時間に応じて、2g/kg体重の用量で毎日20%ブドウ糖を強制投与し、投与前に6時間禁食し、20%ブドウ糖の強制投与後の0、0.5、1、2時間にそれぞれ尾先端から血液を採取し、Roche血糖テストストリップを使用してリアルタイムで血糖を検出し、0〜120分間以内の血糖AUC(血糖〜時間曲線下の面積)を計算して血糖抑制率を算出した(表6)。
8〜9週齢のdb/dbメスマウス50匹を選択し、投与前の体重、空腹血糖値(FBG)によって平均的に10つの群に分け、各群5匹ずつとし、それぞれ溶媒、M2、M4、セマグルチド、M9、M11、M13、M14、M16およびM17を10ml/kgで皮下注射により単回投与し、投与量がいずれも0.05mg/kgであり、投与時間を0時間とした。各試験群の動物の空腹時血糖が投与前のものに回復するまで、毎日マウスを6〜8時間禁食させた後に空腹血糖を検出し、投与後に毎日空腹血糖を検出した。投与前に測定した血糖値を基礎血糖値といい、0に設定した。
空腹血糖変化値(Δ:delta)=投与後の血糖値−投与前の基礎血糖値。
その結果を図1に示し、4日目と5日目から分かるように、M9、M13、M14の血糖降下作用はセマグルチドより優れており、M2と比べても低くなく、M11、M16およびM17は2日目に、セマグルチドより低い血糖降下作用を示した。
8〜9週齢のdb/dbメスマウス35匹を選択し、投与前の体重、血糖曲線下面積(G−AUC)によって平均的に7つの群に分け、各群5匹ずつとし、それぞれ溶媒、M4
(0.15、0.015mg/kg)、セマグルチド(0.15、0.015mg/kg)、およびM0(0.15、0.015mg/kg)を10ml/kgで皮下注射により単回投与した。投与時間を0時間とした。毎日マウスを7〜8時間禁食させた後に空腹血糖とOGTT(経口糖負荷試験)を測定し、1g/kg体重の用量で10%ブドウ糖を強制投与し、糖負荷後の0、0.5、1、2時間にそれぞれ尾先端から血液を採取してリアルタイムで血糖を検出した。投与後、各試験群の動物の血糖が投与前のレベルに回復するまで、毎日禁食する前に血糖を測定し、ランダム血糖とした。投与前に測定した基礎血糖値、ランダム血糖値、および血糖曲線下面積(G−AUC)値はいずれも薬効を測定するためのベースであり、いずれも0に設定した。
血糖変化量(Δ:delta)=投与後の血糖値−投与前の基礎血糖値;
血糖曲線下面積変化量(Δ:delta)=投与後の血糖曲線下面積−投与前の血糖曲線下面積。
結果を表7、8、9および図2、3、4に示す。
空腹時血糖:M4 0.15mg/kg用量群は投与後123時間に投与前の基礎血糖ベース値に回復し、0.015mg/kg用量群は投与後99時間に投与前の基礎血糖ベース値に回復した;セマグルチド 0.15mg/kg用量群は投与後51時間に投与前の基礎血糖ベース値に回復し、0.015mg/kg用量群は投与後27時間に投与前の基礎血糖ベース値に回復した;M0 0.15mg/kg用量群は投与後75時間に投与前の基礎血糖ベース値に回復し、0.015mg/kg用量群は投与後51時間に投与前の基礎血糖ベース値に回復した;その中で、M4の0.015mg/kg用量群の各検出時点の空腹時血糖降下値はいずれも、セマグルチドまたはM0の0.15mg/kg用量群よりも低くはなかった。
ランダム血糖:M4 0.15mg/kg用量群は投与後115時間に投与前のランダム血糖ベース値に回復し、0.015mg/kg用量群は投与後115時間に投与前のランダム血糖ベース値に回復した;セマグルチド 0.15mg/kg用量群は投与後67時間に投与前のランダム血糖ベース値に回復し、0.015mg/kg用量群は投与後67時間に投与前のランダム血糖ベース値に回復した;M0 0.15mg/kg用量群は投与後67時間に投与前のランダム血糖ベース値に回復し、0.015mg/kg用量群は投与後67時間に投与前のランダム血糖ベース値に回復した;その中で、M4の0.015mg/kg用量群の各検出時点のランダム血糖に対する抑制作用はいずれも、セマグルチドまたはM0の0.15mg/kg用量群よりも低くはなかった。
血糖曲線下面積(G−AUC):M4 0.15mg/kg用量群は投与後99時間に投与前の血糖曲線下面積ベース値に回復し、0.015mg/kg用量群は投与後99時間に投与前の血糖曲線下面積ベース値に回復した;セマグルチド 0.15mg/kg用量群は投与後51時間に投与前の血糖曲線下面積ベース値に回復し、0.015mg/kg用量群は投与後51時間に投与前の血糖曲線下面積ベース値に回復した;M0 0.15mg/kg用量群は投与後51時間に投与前の血糖曲線下面積ベース値に回復し、0.015mg/kg用量群は投与後27時間に投与前の血糖曲線下面積ベース値に回復した;その中で、M4の0.015mg/kg用量群の各検出時点の血糖曲線下面積はいずれも、セマグルチドまたはM0の0.15mg/kg用量群よりも低くはなかった。
これらの血糖降下の結果から明らかに、M4またはセマグルチドまたはM0を単回皮下注射後、各群は明らかな血糖降下作用を示したが、M4の血糖降下効果は最も良かった。M4の0.015mg/kg用量の血糖降下効果は、セマグルチドの0.15mg/kg用量またはM0の0.15mg/kg用量の血糖降下効果とほぼ同じであった。
ペプシン(3200〜4500U/mgタンパク質、sigmaから由来、ロット番号P6887)、トリプシン(約10000AEE U/mgタンパク質、sigmaから由来、ロット番号T8003)。
(1)反応溶液
A:ペプシン反応緩衝液:3つの異なるpH(2.6、4.0、7.4)の20mMクエン酸−リン酸緩衝液を調製し、0.005%Tween 20および0.001%BSAを加えてペプシン反応緩衝液とした。
B:トリプシン反応緩衝液:3つの異なるpH(4.0、6.8、8.0)の20mMクエン酸−リン酸緩衝液を調製し、0.005%Tween 20および0.001%BSAを加えてトリプシン反応緩衝液とした。
C:ペプシン含有模擬胃液(SGF):0.1M塩酸5mlを取り、0.019gペプシンを加えて溶解させて得た。
D:トリプシン含有模擬腸液(SIF):リン酸二水素カリウム0.0684gを取り、水2.5mlを加えて溶解させ、0.2M水酸化ナトリウム溶液0.77mlと水5mlを加え、トリプシン0.1001gを加えて溶解させ、pHを6.82に測定した後、水を加えて10mlに希釈して得た。
(2)サンプル調製
M4とセマグルチドのサンプルを取り、pH7.4のPB緩衝液を使用して1.33mg/mlに希釈して試験用母液とした。
(3)ペプシン分解試験
試験用母液を適量取り、異なるpHのペプシン反応緩衝液で0.06mg/mlに希釈し、各群の反応溶液を1ml/チューブ、合計7本のチューブに分け、よく混合してから37℃の水浴に置いて30分間インキュベーションした。そのうちの1本のチューブを取り出してSGFを加えずに非酵素反応0点(−5min点と表記)とし、そして6本のチューブを取り出してそれぞれSGFを加えてよく混合し、その中の1本のチューブに適切な体積の1M NaOHを直ちに加えて反応を終止させ、酵素添加後の0点(0min点と表記)とし、残りの5本のチューブを引き続き37℃に置いて反応させ、5min、10min、20min、35min、50minでそれぞれ1つの群を取り出して適切な体積の1M NaOHを加えて反応を終止させた。すべての実験群の各チューブについて、反応終了後の総体積が一致することを確保した。
(4)トリプシン分解試験
試験用母液を適量取り、異なるpHのトリプシン反応緩衝液で0.06mg/mlに希釈し、各群の反応溶液を1ml/チューブ、合計7本のチューブに分け、よく混合してから37℃の水浴に置いて30分間インキュベーションした。そのうちの1本のチューブを取り出してSIFを加えずに非酵素反応0点(−5min点と表記)とし、そして6本のチューブを取り出してそれぞれSIFを加えてよく混合し、その中の1本のチューブに適切な体積の6M HClを直ちに加えて反応を終止させ、酵素添加後の0点(0min点と表記)とし、残りの5本のチューブを引き続き37℃に置いて反応させ、5min、10min、20min、35min、50minでそれぞれ1つの群を取り出して適切な体積の6M HClを加えて反応を終止させた。すべての実験群の各チューブについて、反応終了後の総体積が一致することを確保した。
酵素分解試験についてサンプリングしてHPLC検出を行い、非酵素反応0点(−5min点と表記)のサンプルのメインピークエリアをベースピークエリアとし、酵素添加後に得られた異なる時点でのメインピークエリアの残りのパーセンテージを計算した。
ペプシン分解の実験データ(n=3)(図5)には、M4とセマグルチド分子の酸性条件下(pH2.6)での分解速度がほぼ同じであることは示されており、これは、ペプシンがこのpHでの活性が最も高いからである;中性pH7.4では、両方の分子は基本的に分解されず、この時点で胃タンパク質の活性が最も低い;pH4.0では、セマグルチドの分解速度はM4より有意に高く、前者のt1/2は約10minであり、後者のt1
/2は約45minである。これは、ペプシン分解に対するM4の耐性能力がセマグルチドよりも有意に優れていることを示した。
トリプシン分解の実験データ(n=4)(図6)には、pH6.8および8.0では両方の分解速度が基本的に一致していることは示されており、これは、このpH範囲がトリプシンの最も高い活性範囲であるからである;pH4.0では、M4とセマグルチドもトリプシン分解に対する耐性能力を示し、両方の間は基本的に差がなかった。
HX8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37 (SEQ ID NO: 39)
式中、X8は、V、T、I、L、GまたはSから選択され、X19はYまたはKであり、X23はQまたはKであり、X27はEまたはKであり、X30はAまたはKであり、X34はRまたはKであり、X36はRまたはKであり、X37はGまたはKであり、
ただし、X19、X23、X27、X30、X34、X36、またはX37のうちの1つのみがK残基であり、
前記誘導体は、前記K残基に連結する延長部分を含み、
前記延長部分は、
であり、
xは4〜38の整数である。
HX8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37 (SEQ ID NO: 39)配列を含み、この配列は、8位、19位、23位、27位、30位、34位、36位、及び37位からなる群より選択される1つ以上の部位の変異を含む。1つの好ましい実施形態では、8位のアミノ酸残基は、V、T、I、L、GまたはSから選択され、19位のアミノ酸残基はYまたはKであり、23位のアミノ酸残基はQまたはKであり、27位のアミノ酸残基はEまたはKであり、30位のアミノ酸残基はAまたはKであり、34位のアミノ酸残基はRまたはKであり、36位のアミノ酸残基はRまたはKであり、37位のアミノ酸残基はGまたはKであり、ただし、19位、23位、27位、30位、34位、36位または37位のうちの1つのみがK残基である。
1、GLP−1(7−37)類似体の誘導体またはその薬学上許容される塩であって、GLP−1(7−37)類似体は、下記式で表されるアミノ酸配列を含み、
HX8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37 (SEQ ID NO: 39)、
式中、X8は、V、T、I、L、GまたはSから選択され、X19はYまたはKであり、X23はQまたはKであり、X27はEまたはKであり、X30はAまたはKであり、X34はRまたはKであり、X36はRまたはKであり、X37はGまたはKであり、
ただし、X19、X23、X27、X30、X34、X36、またはX37のうちの1つのみがK残基であり、
前記誘導体は、前記GLP−1(7−37)類似体のK残基に連結する延長部分を含み、
前記延長部分は、
であり、
xは4〜38の整数である、GLP−1(7−37)類似体の誘導体またはその薬学上許容される塩。
2、前記延長部分は、
HOOC(CH2)14CO−、HOOC(CH2)15CO−、HOOC(CH2)16CO−、HOOC(CH2)17CO−、HOOC(CH2)18CO−、HOOC(CH2)19CO−、HOOC(CH2)20CO−、HOOC(CH2)21CO−、及びHOOC(CH2)22CO−からなる群より選択される、項1に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩。
3、前記延長部分は、リンカーを介してGLP−1(7−37)類似体のK残基に連結されている、項1または2に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩。
4、前記リンカーは、
であり、式中、mは0、1、2または3であり;nは1、2または3であり;sは0〜6の任意の整数であり;pは1〜8の任意の整数である。
好ましくは、リンカーは、
であり、
式中、mは1または2であり;nは1または2であり;pは1〜5の任意の整数である、項3に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩。
5、前記リンカーは、
であり、式中、mは1であり、nは1または2である、項4に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩。
6、N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M2)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M4)、N−ε34−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Arg26Lys34−GLP−1(7−37))ペプチド(M5)、N−ε37−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Arg26,34Lys37−GLP−1(7−37))ペプチド(M7)、N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Ile8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M9)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Thr8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M13)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Ile8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M14)からなる群より選択されるいずれか一つの誘導体またはその薬学上許容される塩である、項1〜5のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩。
7、(1)上記項のいずれか一項に記載のGLP−1類似体が溶解されている溶液と、上記項のいずれか一項に記載の延長部分が溶解されている溶液とを混合すること;
(2)pHを4〜5に調整して反応を停止させ、沈殿が生じるまで静置した後、沈殿を採取すること;及び
(3)TFAを沈澱に加え、pHを7.5〜8.5に調整して反応を停止すること
を含む、項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩を調製する方法。
8、上記項のいずれか一項に記載の延長部分が溶解されている溶液と混合する前に、GLP−1類似体が溶解されている溶液にトリエチルアミンを加えることをさらに含む、項7に記載の方法。
9、上記項のいずれか一項に記載の延長部分の溶液が、アセトニトリルで溶解されたものである、項7または8に記載の方法。
10、項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩、及び薬学上許容される補助材料を含む、薬物組成物。
11、糖尿病(1型糖尿病と2型糖尿病を含む)または糖尿病合併症を予防及び/または治療するための薬物の調製における、項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩の使用。
12、前記糖尿病合併症が糖尿病性腎症である、項11に記載の使用。
13、血糖の低減、耐糖能の改善、膵島β−細胞アポトーシスの減少、膵島β−細胞機能の増強、膵島β−細胞数の増加及び/または膵島β−細胞のグルコース感受性の回復のための薬物の調製における、項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩の使用。
14、前記血糖の低減は、空腹時血糖及び/または食後血糖を低下させることを含む、項13に記載の使用。
15、被験者に予防または治療有効量の項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩を投与することを含む、糖尿病(1型糖尿病と2型糖尿病を含む)または糖尿病合併症を予防及び/または治療するための方法。
16、前記糖尿病合併症が糖尿病性腎症である、項15に記載の方法。
17、被験者に治療有効量の項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩を投与することを含む、血糖の低減、耐糖能の改善、膵島β−細胞アポトーシスの減少、膵島β−細胞機能の増強、膵島β−細胞数の増加及び/または膵島β−細胞のグルコース感受性の回復のための方法。
18、前記血糖の低減は、空腹時血糖及び/または食後血糖を低下させることを含む、項17に記載の方法。
19、下記式で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、GLP−1(7−37)類似体。
HX8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37 (SEQ ID NO: 39)
式中、X8は、V、T、I、L、GまたはSから選択され、X19はYまたはKであり、X23はQまたはKであり、X27はEまたはKであり、X30はAまたはKであり、X34はRまたはKであり、X36はRまたはKであり、X37はGまたはKであり、しかも、X19、X23、X26、X27、X30、X34、X36、またはX37のうちの1つのみがK残基である。
20、項19の類似体を含む薬物組成物。
21、糖尿病、糖尿病合併症を予防及び/または治療するための薬物の調製における、項19に記載の類似体の使用。
22、項10または項20に記載の薬物組成物を含む容器と、前記薬物組成物のプロトコルを含む添付文書とを含む、製品。
23、1つ以上の他の薬物を含む容器をさらに含む、項22に記載の製品。
24、前記1つ以上の他の薬物が、糖尿病または糖尿病合併症を治療するための他の薬物である、項23に記載の製品。
下記式に表されるGLP−1類似体の誘導体、N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M2と略称する)の調製
1、脂肪酸による修飾:上記実施例で調製、収集されたVal8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37)沈澱に水を加えて4〜6mg/ml溶液を調製し、1M水酸化ナトリウムを加えてpHを11.0〜11.5に調整し、タンパク質が完全に溶解するように均一に振り、HPLCでポリペプチド濃度を定量した。ポリペプチドと脂肪酸(構造は下記通りである)とのモル比が1:4となるように脂肪酸粉末を取ってアセトニトリルに溶かした。体積が1000分の2のトリエチルアミンをポリペプチド溶液に加え、脂肪酸溶液と混合し、混合液を4℃で1時間静置した。
サンプルを水で5倍に希釈し、1Mクエン酸(または10%酢酸)でpHを4.8に調整して反応を停止し、4℃で10分間置いて沈殿(酸沈殿)させた後、13000g、4℃で30分間遠心分離し、沈殿物を−80℃で保存した。
2、脂肪酸の脱保護と精製:ポリペプチドの最終濃度が約10mg/mlになるようにTFAを酸沈殿したサンプルに加え、振とうして沈澱を溶解し、室温で30分間静置して脱保護し、4M NaOHを反応液に滴加してpHを7.5〜8.5に調整して反応を停止した。
分取液体分析装置(島津LC−8A)を使用して、停止した反応液を流速4ml/minで、10mM酢酸アンモニウム、20%エタノール(平衡液3)で予め平衡化したUniSil 10−120C18(Suzhou Nano-Micro Technology CO., LTD.から購入)にポンプして濃縮した。平衡液3で洗浄した後、0〜100%溶出液(10mM酢酸アンモニウム、80%エタノール)で段階的に溶出し、溶出ピークを収集してRP−HPLCで検出した結果、純度は約90%であった。
溶出ピークを水で3倍に希釈し、酸沈殿によりpHを4.80に調整し、4℃で30分間酸沈殿させた。遠心分離後、PBST緩衝液(pH7.0)を沈殿物に加えて再溶解し、−80℃で保存した。
上記の方法に従って、N−ε26−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Lys26Arg34−GLP−1(7−37))ペプチド(M0)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M4)、N−ε19−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Lys19Glu22Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M1)、N−ε27−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Lys27Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M3)、N−ε34−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Arg26Lys34−GLP−1(7−37))ペプチド(M5)、N−ε36−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Arg26,34Lys36−GLP−1(7−37))ペプチド(M6)、N−ε37−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Arg26,34Lys37−GLP−1(7−37))ペプチド(M7)、N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Thr8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M8)、N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Ile8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M9)、N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Leu8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M10)、N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Gly8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M11)、N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Ser8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M12)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Thr8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M13)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Ile8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M14)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Leu8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M15)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Gly8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M16)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Ser8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M17)を順に調製した。
Claims (24)
- GLP−1(7−37)類似体の誘導体またはその薬学上許容される塩であって、GLP−1(7−37)類似体は、式
HX8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37
[式中、X8は、V、T、I、L、GまたはSから選択され、X19はYまたはKであり
、X23はQまたはKであり、X27はEまたはKであり、X30はAまたはKであり、X34はRまたはKであり、X36はRまたはKであり、X37はGまたはKであり、
ただし、X19、X23、X27、X30、X34、X36、またはX37のうちの1つのみがK残基である。]で表されるアミノ酸配列を含み、
前記誘導体は、前記GLP−1(7−37)類似体のK残基に連結する延長部分を含み、
前記延長部分は、
xは4〜38の整数である、GLP−1(7−37)類似体の誘導体またはその薬学上許容される塩。 - 前記延長部分は、
HOOC(CH2)14CO−、HOOC(CH2)15CO−、HOOC(CH2)16CO
−、HOOC(CH2)17CO−、HOOC(CH2)18CO−、HOOC(CH2)19C
O−、HOOC(CH2)20CO−、HOOC(CH2)21CO−、及びHOOC(CH2
)22CO−からなる群より選択される、請求項1に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩。 - 前記延長部分は、リンカーを介してGLP−1(7−37)類似体のK残基に連結されている、請求項1または2に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩。
- N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M2)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M4)、N−ε
34−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Arg26Lys34−GLP−1(7
−37))ペプチド(M5)、N−ε37−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Val8Glu22Arg26,34Lys37−GLP−1(7−37))ペプチド(M7)、N−ε23−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Ile8Glu22Lys23Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M9)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Thr8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M13)、N−ε30−[2−(2−[2−(2−[2−(2−[4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)−4(s)−カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセトアミド)エトキシ]エトキシ)アセチル](Ile8Glu22Lys30Arg26,34−GLP−1(7−37))ペプチド(M14)からなる群より選択されるいずれか一つの誘導体またはその薬学上許容される塩である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩。 - (1)上記請求項のいずれか一項に記載のGLP−1類似体が溶解されている溶液と、上記請求項のいずれか一項に記載の延長部分が溶解されている溶液とを混合すること;
(2)pHを4〜5に調整して反応を停止させ、沈殿が生じるまで静置した後、沈殿を採取すること;及び
(3)TFAを沈澱に加え、pHを7.5〜8.5に調整して反応を停止すること
を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩を調製する方法。 - 上記請求項のいずれか一項に記載の延長部分が溶解されている溶液と混合する前に、GLP−1類似体が溶解されている溶液にトリエチルアミンを加えることをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 上記請求項のいずれか一項に記載の延長部分の溶液が、アセトニトリルで溶解されたものである、請求項7または8に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩、及び薬学上許容される補助材料を含む、薬物組成物。
- 糖尿病または糖尿病合併症を予防及び/または治療するための薬物の調製における、請求項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩の使用。
- 前記糖尿病合併症が糖尿病性腎症である、請求項11に記載の使用。
- 血糖の低減、耐糖能の改善、膵島β−細胞アポトーシスの減少、膵島β−細胞機能の増強、膵島β−細胞数の増加及び/または膵島β−細胞のグルコース感受性の回復のための薬物の調製における、請求項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩の使用。
- 前記血糖の低減は、空腹時血糖及び/または食後血糖を低下させることを含む、請求項
13に記載の使用。 - 被験者に予防または治療有効量の請求項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩を投与することを含む、糖尿病または糖尿病合併症を予防及び/または治療するための方法。
- 前記糖尿病合併症が糖尿病性腎症である、請求項15に記載の方法。
- 被験者に治療有効量の請求項1〜6のいずれか一項に記載の誘導体またはその薬学上許容される塩を投与することを含む、血糖の低減、耐糖能の改善、膵島β−細胞アポトーシスの減少、膵島β−細胞機能の増強、膵島β−細胞数の増加及び/または膵島β−細胞のグルコース感受性の回復のための方法。
- 前記血糖の低減は、空腹時血糖及び/または食後血糖を低下させることを含む、請求項17に記載の方法。
- 式: HX8EGTFTSDVSSX19LEEX23AARX27FIX30WLVX34GX36X37
[式中、X8は、V、T、I、L、GまたはSから選択され、X19はYまたはKであり
、X23はQまたはKであり、X27はEまたはKであり、X30はAまたはKであり、X34はRまたはKであり、X36はRまたはKであり、X37はGまたはKであり、しかも、X19、X23、X26、X27、X30、X34、X36、またはX37のうちの1つのみがK残基である。]で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、GLP−1(7−37)類似体。 - 請求項19の類似体を含む薬物組成物。
- 糖尿病、糖尿病合併症を予防及び/または治療するための薬物の調製における、請求項19に記載の類似体の使用。
- 請求項10または請求項20に記載の薬物組成物を含む容器と、前記薬物組成物のプロトコルを含む添付文書とを含む、製品。
- 1つ以上の他の薬物を含む容器をさらに含む、請求項22に記載の製品。
- 前記1つ以上の他の薬物が、糖尿病または糖尿病合併症を治療するための他の薬物である、請求項23に記載の製品。
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