JP2021517119A - 腫瘍溶解性アデノウイルスとcdk4/6阻害剤との組み合わせによる腫瘍の処置 - Google Patents
腫瘍溶解性アデノウイルスとcdk4/6阻害剤との組み合わせによる腫瘍の処置 Download PDFInfo
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Abstract
Description
組み合わせ。
細胞培養
ヒト膀胱がん細胞株を、10% FBS(Biochrom AG)及び1% NEA(Biochrom AG)を補充したRPMI又はDMEM培地(Biochrom AG)中において、それぞれ5%又は10% CO2でサブコンフルエントな条件下で培養した。細胞株及び実験条件に応じて、0.2〜1×106、0.5〜1×105、0.25〜0.5×105及び500〜700個 細胞をそれぞれ10cmあたりに、6ウェル、12ウェル及び96ウェルフォーマットに播種した。
HeLaP
HeLaP細胞(ATCC CCL−2)は、患者Henrietta Lacksにちなんで命名された子宮頚部腺がん由来の上皮細胞である。この細胞株は、最も広く分布し、最も古い細胞株である(Rahbari et al., 2009)。1951年に確立された最初の永久細胞株であったためである(Gey et al., 1952)。培養は、37℃、10% CO2条件下でDMEM(10% FBS、1% PS)中で行った。
HeLaRDBは、HeLaP細胞株の亜細胞株であり、糖タンパク質Pの過剰発現に基づいて、ダウノブラスチンに対する耐性を有する。このアントラサイクリンを含有する培地での培養により耐性が達成された。この細胞増殖抑制剤は、二本鎖DNA配列に介在し、細胞の転写と複製を阻害する(Mizuno et al., 1975)。ダウノブラスチン処理により引き起こされるストレス反応の結果として、細胞因子YB−1は、親細胞株と比較して、より高い核局在化を示す(Holm et al., 2004)。ダウノブラスチンに対する耐性を維持するために、細胞を、0.25μg/ml ダウノブラスチンを含有するDMEM(10% FBS、1% PS)中において、10% CO2条件下、37℃で14日毎に培養した。
A549細胞(ATCC CCL−185)は、1972年にヒト肺胞基底の腺がんから単離された(Giard et al., 1973)。培養を37℃及び10% CO2で、Dulbecco’s MEM(10% FBS及び1% PS)中において行った。
T24細胞(ATCC HTB−4)は、1970年に原発性ヒト膀胱がんから得られた(Bubenik, Baresova et al., 1973)。HRAS遺伝子における点突然変異により(Reddy et al., 1982)、MAPK及びPI3K経路が活性化されている。さらに、この細胞株には、腫瘍サプレッサー遺伝子p53の遺伝子座における更なる突然変異が存在する(Pinto-Leite et al., 2014)。細胞を、10% FCS、1% PS及び1% 非必須アミノ酸を含有するRPMIにより、37℃、5% CO2条件下で培養した。
HEK293細胞(ATCC CRL−1573)は、1973年に単離されたヒト胚性腎細胞である。全E1領域を含むアデノウイルス血清型5のゲノムの4.5kbサイズ部分の安定したトランスフェクションのために(Graham and Smiley, 1977)、この細胞株は、E1欠損アデノウイルスの産生及びウイルス力価の測定に使用される。
名称 フォワードプライマー リバースプライマー
企業名
繊維
Eurofins AAGCTAGCCCTGCAAACATCA CCCAAGCTACCAGTGGCAGTA
E2初期
Invitrogen
CCGTCATCTCTACAGCCCAT GGGCTTTGTCAGAGTCTTGC
E2後期
Invitrogen CTTCCTAGCGACTTTGTGCC GTCAGAGTGGTAGGCAAGGT
E1A12S
Metabion CGACGAGGATGAAGTCCTGTGTCTG CTCAGGATAGCAGGCGCCAT
E1A12Sショート
Metabion GAGGATGAAGTCCTGTGT CTCAGGATAGCAGGCGCCAT
E1A13S
Metabion TGTTTGTCTACAGTCCTGTGTCTG CTCAGGATAGCAGGCGCCAT
E1A13Sショート
Metabion TTGTCTACAGTCCTGTGT CTCAGGATAGCAGGCGCCAT
E4orf6
Metabion TCCCTCCCAACACACAGAGT GACAGGAAACCGTGTGGAAT
Rb
Life Techno. AGCAACCCTCCTAAACCACT TGTTTGAGGTATCCATGCTATCA
E2F1
Life Technology ACGCTATGAGACCTCACTGAA TCCTGGGTCAACCCCTCAAG
E2F2
Life Technology CGTCCCTGAGTTCCCAACC GCGAAGTGTCATACCGAGTCTT
GAPDH
MWG TGGCATGGACTGTGGTCATGAG ACTGGCGTCTTCACCACCATGG
アクチン
Eurofins TAAGTAGGTGCACAGTAGGTCTGA AAAGTGCAAAGAACACGGCTAAG
L4 33K
Eurofins GAACCAGGGCCGCCCATACTG GGGCTTTGTCAGAGTCTTGC
L4 22K
Eurofins CCGTTAGCCCAAGAGCAAC CGGCCGTGATGGTAGAGAAG
L4HexAss
Eurofins CTGTGGTACTTCCCAGAGAC CAGGTGAGTTATACCCTGCC
Ad−WT+AdWT−RGD 野生型マストアデノウイルス、C型、血清型5及びADWT及び更なるRGD繊維モチーフ
AdWT−E2Fmut. マストアデノウイルス、C型、血清型5、E2初期プロモーターの両E2F結合部位における突然変異、追加のRGD繊維モチーフ及びE3領域における2,7kbサイズの欠失(ΔE3)
XVir−N−31 マストアデノウイルス、C型、血清型5、E1B領域(1.716〜1915、200bp)における欠失、E3領域(28.132〜30.813)における欠失及びE1A領域における12塩基欠失を伴う。核YB−1発現のみを表わすがん細胞中で複製する。
XVir−N−31/E2FM マストアデノウイルス、C型、血清型5
E1B領域(1.716〜1915、200bp)における欠失、E3領域(28.132〜30.813)における欠失及びE1A領域における12塩基欠失を伴う。核YB−1発現のみを表わすがん細胞中で複製する。E2初期プロモーターの両E2F結合部位における突然変異、追加のRGD繊維モチーフ及びE3領域における2,7kbサイズの欠失(ΔE3)
対照 対照(非sil.)siRNA、20μM Qiagen、the Netherlands
E2F−1 E2F−1(SASI_Hs01_00162220)、10μM Sigma, Merck、Germany
YB−1 YBX1 siRNA FlexiTube、10μM Qiagen、the Netherlands
siRNAトランスフェクション
特定の遺伝子のダウンレギュレーションを、siRNAトランスフェクションを使用して行った。ここで、リポフェクタミンRNAiMAX(Thermo Fischer)試薬 5μlを一方のチューブ中のOpti-MEM 150μlに加え、36pmol siRNAを他方のチューブ中のOpti-MEM 150μlと合わせた。両チューブの内容物を合わせ、軽くボルテックスした後、この溶液を室温で5分間インキュベーションした。ついで、siRNA−脂質複合体 250μlを前日に6ウェルプレートに播種された250.000〜1.000.000個 細胞に、培地を変えずに加え、ウェル当たり30pmolのsiRNAの最終濃度に達した。37℃、10% CO2で48時間インキュベーションした後、感染又は溶解が起こった。
ウイルスをsiRNAトランスフェクションと組み合わせた細胞中のRNAも定量した。ここで、125.000個 細胞を播種し、翌日、30pmol 対照−、YB−1−、及びE2F1−siRNAのsiRNA構築物でトランスフェクションした。48時間のインキュベーション後、感染が起こり、感染後24時間で溶解が起こった。ライゼートを−20℃で保存した。
細胞をPBSですすぎ、溶解バッファー(mirVana miRNA単離キット、Life Technologies)で溶解し、1.5mlの反応チューブに移した。ホモジネート添加剤(mirVana miRNA単離キット、Life Technologies) 50μlをこのライゼートに加え、再懸濁させ、氷上で10分間インキュベーションした。酸−フェノール−クロロホルム 500μlを加え、約30秒間ボルテックスし、氷上で2分間インキュベーションした。室温で14.000g、5分間遠心分離した後、水相と有機相とを分離する。上側の水相を新たなスナップキャップに移し、等量のイソプロパノールと合わせ、転倒混和した。室温で10分間インキュベーションした後、サンプルを4℃及び14.000gで30分間遠心分離した。続けて、上清を除去し、RNAペレットを75% エタノール 1mlで洗浄した。サンプルを7500g、4℃で5分間軽く遠心分離した。上清を除去した後、風乾させたペレットを、ヌクレアーゼを含まない水 20μlに溶解させ、サーモミキサー中において、55℃及び500rpmで10分間インキュベーションした。続けて、RNA濃度を分光光度測定により測定した。DNAのrutの増幅を避けるために、DNAse消化を行った。ここで、デオキシリボヌクレアーゼI,増幅グレードキット(Invitrogen、life technologies製)を使用した。1μg RNAに、10×DNAse I反応バッファー 1μl及びDNAse I 1μlを加え、DEPC処理水で10μlの最終容量まで満たし、室温で正確に15分間インキュベーションする。25mM EDTA溶液 1μlを加えることにより、DNase Iを不活性化し、それにより、DNAse消化の進行を停止させる。サンプルを65℃で10分間インキュベーションし、ついで、逆転写に使用した。
RNAをcDNAに書き換えるために、高性能cDNA逆転写キット(Thermo Scientific)を使用した。2μg DNA消化サンプルのRNAを、PCRソフトチューブ中の転写バッファー、100mM dNTP及びRNAse阻害剤を含有するMastermixに加えた。ここで、E2初期プロモーター及びE2後期プロモーターを介して転写されるRNAは、通常、逆転写に使用されるランダムプライマーでは書き換えることができないと考えなければならなかった。これらのランダムプライマーは、二本鎖アデノウイルスゲノムの両鎖に結合するであろうためである。したがって、E2初期定量及びE2後期定量に使用されたサンプルについてのRNAからcDNAへの書き換えを、特異的E2初期リバースプライマー(表1)を使用することにより行った。結果を正規化するのに使用されたハウスキーピング遺伝子であるアクチンについては、ランダムプライマーを使用した。
感染細胞内でのウイルス複製を調査するために、DNA複製分析を行った。125.000個 細胞を6ウェルプレートに播種し、10〜20MOIで感染させた。感染後それぞれ2、8、12、24、36及び48時間後、溶解を行った。ここで、培地を除去し、接着細胞をPBS 1mlで洗浄した。DNA溶解バッファー 200μlを加えた後、接着細胞を、細胞スクレーパーを使用してプレートから掻き取った。ついで、ライゼートをスナップキャップに移した。酵素プロテイナーゼK 3μlを加え、サーモミキサーにおいて、56℃及び550rpmで一晩インキュベーションした。翌日、DNA分離を行った。
DNA精製のために、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール 200μlをライゼートに加えた。ボルテックスし、続けて、氷上で5分間インキュベーションした後、相分離を4℃、16430gで3分間遠心分離することにより達成した。上側の水相を、相のより良好な可視化のために、10mM TrisCl中のクロロホルム 200μl及びクレゾールレッド 20μlを含有する新たなスナップキャップに移した。ボルテックスし、氷上で5分間インキュベーションした後、4℃、16430gで3分間遠心分離を行った。再度、上側の水相をエタノール 800μl及び3M 酢酸ナトリウム溶液 50μlと合わせた。より良好な沈殿を達成するために、グリコーゲン 2μlを加えた。チューブを短く転倒混和させた後、この溶液を4℃、16430gで30分間遠心分離した。続けて、DNAペレットを70% エタノール 400μlで覆い、室温で10分間インキュベーションした。室温、4760gで7分間遠心分離した後、DNAペレットを37℃で約5〜10分間乾燥させた。続けて、このペレットを0,1×TEバッファー 100μlに溶解させ、40℃、400rpmで約3時間振とうした。DNAが完全に溶解したら、DNA濃度を、測定用DNA溶液 2μ及びブランク溶液としての0,1×TEバッファーを使用する分光光度計により測定した。ついで、DNAを4℃で保存した。
更なる定量のために、リアルタイム定量PCRを使用した。テンプレートDNA又はcDNA 5μlそれぞれを、10ng/μlの最終濃度で使用した。qPCRを、Mastermix GoTaq PCR(Promega Corporation)(Mastermix 7.5μl、プライマー 1.5μl、H2O 1μl) 10μl及びDNAテンプレート 5μlを使用して、ダプリケートでピペットされた96ウェルプレートで行った。相対的定量を、2つの正規化遺伝子を用いた比較CT法を使用して行った。プレートをホイルで閉じ、室温、220gで2分間遠心分離した。ついで、プレートをサーマルサイクラーでの特定の温度−時間プログラムに従ってインキュベーションした。使用されたプライマーを表1に列記する。反応をCFX96リアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad Laboratories)で行った。
繊維:94℃で2分間、94℃で15秒間、60℃で15秒間及び72℃で15秒間、45サイクル
他のウイルス遺伝子:94℃で1.5分間、94℃で15秒間、58℃で15秒間及び72℃で15秒間、45サイクル
Rb:94℃で2分間、94℃で15秒間、60℃で30秒間及び72℃で1分間、44サイクル
E2F:95℃で2分間、95℃で15秒間、60℃で30秒間及び72℃で30秒間、40サイクル
細胞を、1% SDSバッファーを使用して溶解し、核膜の破壊を達成した。タンパク質の変性を避けるために、全プロセスを氷上で行った。培地を吸引した後、細胞を冷PBSで2回洗浄した。ダプリケートのアプローチの1つのウェルの接着細胞を、1% SDSバッファー 200μlで溶解し、細胞スクレーパーにより掻き取った。ついで、ライゼートをダプリケートのアプローチの他のウェルに移し、再度掻き取った。ついで、両ウェルのライゼートを合わせて、スナップキャップチューブに移した。続けて、ライゼートをシリンジで処理して、粘性DNAを破壊し、4℃、31000rpmで30分間遠心分離した。タンパク質が上清中に存在するため、上清を新たなスナップキャップチューブに移し、更なる工程に使用した。
タンパク質の量を定量するために、Pierce TM BCAタンパク質キットによるビシンコニン酸(BCA)アッセイを行った。ここで、BCA溶液A+B(50:1) 112.5μl及びサンプル 12.5μlを96ウェルプレートの1つのウェルに加え、37℃で30分間インキュベーションした。タンパク質濃度に応じて、溶液の染色が生じた。既知のタンパク質濃度を有する標準系列により、サンプルのタンパク質濃度をマイクロプレートリーダーにおける562nmでの測光測定により決定した。
後続のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動においてタンパク質を分離するために、計算量のライゼート及び溶解バッファーをローディングバッファー−DDT−混合物(6:1) 15μlと混合した。ついで、タンパク質ロード物質を100℃で5分間加熱した。色タンパク質標準 5μl及びサンプル 40μlをゲル上にロードした。ウイルスタンパク質の検出についてのタンパク質分離のために、10% ゲルを使用した。siRNAによるダウンレギュレートされた遺伝子を研究するために、12% ゲルを使用した。分離ゲル及びスタッキングゲルの組成をバッファー及び溶液のセクションに列記する。約20分間、ゲルをTGS−バッファー中、90Vで泳動させて、全てのタンパク質を1つのバンドに集めた。続けて、ゲルをTGS−バッファー中、150Vで約60分間泳動させて、タンパク質をサイズにより分離した。
タンパク質をゲルからメンブランに転写するために、ウェスタンブロット技術を使用してブロットした。疎水性PVDF膜を活性化するために、メタノール中で約2分間インキュベーションした。続けて、メンブランをスポンジ、ろ紙及びゲルと共にブロッティングバッファー中において堆積させた。4℃、100Vでの約2時間の電気泳動により、タンパク質をブロッティングバッファー中でメンブランに移した。非特異的な抗体結合を避けるために、メンブランを、細胞タンパク質をそれぞれ分析するために、TBST中の5% 粉乳 10ml中で、その後のウイルスタンパク質を検出する抗体の使用のために、5% BSA−TBST 5ml中でそれぞれ、室温で1時間回転させることでブロッキングした。メンブランをそれぞれ5分間TBST中で5回洗浄した後、メンブランを一次抗体溶液と共に4℃で一晩回転させながらインキュベーションした。抗体GAPDH、E1A、E1B55K、E2A及びE4orf6については、この工程を室温で1時間行った。ここで、抗体を、0.02% アジ化ナトリウムを含むTBST中の5% BSAに、異なる係数で希釈した。更なる5回の洗浄工程後、メンブランを二次抗体の1:10.000希釈中、室温で30分間回転させてインキュベーションした。ウイルス抗体に対する二次抗体(抗マウス)を5% BSA−TBST中に希釈し、他の全ての抗体をTBST中の5%粉乳中に希釈した。これらの二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしている。5回の最後の洗浄工程後、ペルオキシダーゼのシグナルを可視化するために、メンブランをEnhanced-Chemi-Luminescence(ECL)溶液中で5分間インキュベーションした。一次抗体DP−1及びE2F−1と共にインキュベーションされたメンブランについては、GE−Healthcare製のAmersham ECL Primeウェスタンブロット検出試薬を使用して、より明るいシグナルを達成した。他の全てについては、研究室において調製されたECL溶液を使用した。使用直前に1:1で混合されたECL A及びECL Bの組成を、バッファー及び溶液のセクションに列記する。最後に、フィルム上にシグナルを呈することによりタンパク質を検出することができた。
チェックポイントキナーゼ1(sc−377231、Santa Cruz Biotechnology)
総RB(554136、BD Biosciences)
ホスホRB Ser780(8180、Cell Signaling Technology)
E2F1(sc−251、Santa Cruz Biotechnology)
E2F2(ab138515、abcam)
E2F3(PG37、Thermo FisherScientific)
E2F4(WUF10、Thermo FisherScientific)
E2F5(sc−999、Santa Cruz Biotechnology)
サイクリンD1(92G2、Cell Signaling Technology)
サイクリンE2(4132、Cell Signaling Technology)
CDK2(78B2、Cell Signaling Technology)
GAPDH(14C10、Cell Signaling Technology)
アクチン(A2066、Sigma-Aldrich Chemie GmbH)
E1A(sc−25、Santa Cruz Biotechnology)
E1B55k(M. Dobbelsteinが親切に提供)
E4orf6(M. Dobbelsteinが親切に提供)
E2A(DBP、M. Dobbelsteinが親切に提供)
ヘキソン(ABIN2686029、Antibodies online)
PD−0332991 イセチオナート(パルボシクリブ、Sigma-Aldrich Chemie GmbH)及びLY−2835219(アベマシクリブ、Selleck Chemicals)を10mM ストック溶液として滅菌水中に溶解させた。LEE011(リボシクリブ、MedChem Express)及びNutlin−3a(Sigma)をそれぞれ、10mM及び5μM ストック溶液としてDMSO中に溶解させた。作業濃度を直ちに使用するために新鮮に調製した。
ウイルス誘引細胞死の決定のために、細胞を12ウェルプレートに播種した。PD−033299、LY−2835219及びLEE011との併用処理のために、細胞を阻害剤で24時間前処理した。この細胞を、FBSを含まない培地 200〜400μl中において、示されたMOIで示されたウイルスに感染させた。低分子阻害剤を1hpiで含むか又は含まない完全培地を細胞に加えた。
細胞を10% TCAにより、4℃で1時間固定し、1% 酢酸中の0.5% スルホローダミンB(SRB、Sigma-Aldrich Chemie GmbH)により、RTで30分間染色し、続けて、1% 酢酸で洗浄して、過剰のSRBを除去した。乾燥SRBを10mM Trisバッファー中に溶解させ、定量を590nmでの測光測定により行った。
感染性ウイルス粒子産生の決定のために、感染細胞及び上清を、細胞スクレーパーを使用して3dpiで回収した。ウイルスを、複数サイクルの凍結融解、続けて、1600rcfでの遠心分離により、インタクトな細胞から放出させた。細胞ライゼートの上清をAdEasyウイルス力価キットの取扱説明書(972500)に記載されているように、Hek293細胞を使用してウイルス粒子産生について試験した。下記試薬を使用した:ヤギ抗ヘキソン抗体(1056、Chemicon)、ウサギ抗ヤギ抗体(P0449、Dako)、DAB溶液(Dako)。
E1欠失アデノウイルスは、非常に低い効力ではあるが、がん細胞において複製することが示された。T24細胞を、100MOI 緑色蛍光タンパク質を発現するE1マイナスアデノウイルス(Ad−GFP)に感染させ、感染の1日前及びインキュベーション時間中に500nM PD0332991で処理した。このような条件下で、GFP発現の増加が観察されたため、E1A非依存性ウイルス複製及びアデノウイルスE2初期プロモーターの活性化により媒介される遺伝子発現が示された。
E2初期突然変異アデノウイルスAd−WT/E2M及びAd−GFPをPD0332991と組み合わせて使用した結果に基づいて、実験を、種々のCDK4/6阻害剤を野生型アデノウイルスAd−WT又はXVir−N−31のいずれかと組み合わせて使用して行った。これらの薬剤は、細胞をG1期で停止させるため、全ての阻害剤が、ウイルス複製を支持することができたことが見出されたのは驚くべきことであった。
CDK4/6阻害剤PD−033299、LY−2835219及びLEE011を細胞のアデノウイルス感染と組み合わせた。細胞の感染は、処理後24時間に行った。ターゲット分子に対する下流の影響は、処理後8〜24時間の間にしか検出できないためである。
これらの効果をより詳細に分析するために、選択されたウイルスタンパク質の発現レベルを処理された細胞又は処理されていない細胞において決定した。この実験のために、阻害剤パルボシクリブ(PD−033299)を代表的なCDK4/6阻害剤として使用した。細胞を15MOIで感染させた。500nMでのPD処理を、感染24時間及びタンパク質単離を行うまで行った。12、24及び36時間後、タンパク質単離を、1% SDSバッファーを使用して行った。アクチンをポジティブ対照として含めた。ローディング対照は、全ての系統において同じタンパク質レベルの細胞アクチンを示すため、系統間の適切な比較が保証される。hpi:感染後時間。
実施例5に従うCDK4/6阻害剤のクラスは、RBの発現を必要とする。したがって、3つのRB陽性及び2つのRBマイナス膀胱がん由来細胞株を使用し、これらの細胞を併用療法で処理した。細胞株をIC50濃度のPD−0332991(T24:500nM、RT112:2000nM、253J:100nM)で24時間前処理し、XVir−N−31(T24 MOI50、253J MOI25、RT112 MOI450)に感染させた。値は、少なくとも2つの独立した実験の平均である。エラーバーは、標準誤差を示す。4dpiで、細胞生存を、SRBアッセイ(a、c)を使用して測定した。(b、d)細胞ライゼートを3dpiで調製し、力価試験をHek293細胞について行った。ウイルス力価は、対照に対する倍 変化として示す。
RB陽性細胞株におけるウイルス複製に対するPD−0332991の効果を調査するため、繊維DNAコピーの相対定量を、qPCRを使用して行った。膀胱がん細胞株を24時間前処理し、XVir−N−31(T24 MOI40、UMUC3及び253J MOI20、RT112 MOI400)に感染させた。DNAを24〜48hpiで抽出し、qPCRを使用してウイルス繊維について分析した。値をGAPDHに対して正規化する。データは、少なくとも2つの独立した実験の代表である。エラーバーS.D。
RBの脱リン酸化及び分解に対するCDK4/6阻害剤の時間動特性は、細胞の処理後約10時間である。また、上記示された結果から、RB下流ターゲットの経時的で部分的な回復が示された(図1)。この観察は、CDK4/6阻害剤の時間動特性及びウイルス誘引細胞死に対する効果が実施例7に例示されたように、この併用療法の重要なパラメータであることを意味する。併用療法の適用のために、細胞の前処理のための異なる時点を試験した。それに従って、細胞を感染前(感染前日/時間、dai/hai)又は感染後1時間のいずれかで処理し、細胞増殖を、SRBアッセイを使用して測定した。エラーバーは、S.E.を表わし、値は、3つの独立した実験の平均である。
本実施例を、細胞殺傷のために、種々の腫瘍溶解性アデノウイルスをCDK4/6阻害剤、例えば、PD0332991と共に使用することができ、ウイルス複製及び細胞殺傷における観察された増加がXVir−N−31に限定されなかったという実験的証拠を提供するために行った。それに従い、以下のように、Ad−デルタ24及びOnyx−015によるT24がん細胞:T24膀胱がん細胞を、20MOI 示された腫瘍溶解性アデノウイルスに感染させた。500nM CDK4/6阻害剤PD0332991での処理を感染の1日前及び感染後4日間行った。感染から4日後に撮影した。細胞変性効果(CPE)の発生は、ウイルス複製と細胞殺傷を示す。
100.000個 T24細胞/ウェルを6ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するRPMI培地中において、5% CO2、37℃で増殖させた。T24細胞を、感染の24時間前及び再度感染後1時間で、500nM パルボシクリブで処理した。GFPを発現するE1欠失アデノウイルス(Ad−マイナス/GFP)の感染を、血清を含まない培地 400μl中で行った。10倍の倍率の蛍光顕微鏡を使用して、感染後48時間で写真を撮った。
異なる処理条件下でのdl703(Mantwill et al.2013, Journal of Translational Medicine, 11, 216)の複製の差異を調査するため、DNA複製分析を行った。100.000個 UMUC細胞を6ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するDMEM培地中において、5% CO2条件下、37℃で増殖させた。播種後24時間で、細胞を10μM Lee(リボシクリブ)、1μM CI−1040、10μM Nutlin−3a及び10μM ロスコビチンで24時間処理し、感染後、適切な量の阻害剤を培地に再度加えた。50MOI dl703(マストアデノウイルス、C型、血清型5、E1領域に3.2kbサイズの欠失を有する)の感染を処理後24時間後で行った。感染後4時間及び48時間で、DNAを単離し、qPCRを、ウイルス繊維遺伝子に特異的なプライマーを使用して行った。繊維fwd.5’−AAGCTAGCCCTGCAAACATCA−3’;繊維rev.5’−CCCAAGCTACCAGTGGCAGTA−3’。
示された濃度のCI−1040、ロスコビチン、Nutlin−3a及びLEE011(リボシクリブ)で処理されたUMUC細胞のウェスタンブロット分析。1×106個 細胞を10cm皿に播種した。処理後24時間で、核膜の破壊を達成するために、1% SDSバッファーを使用して、タンパク質を単離した。全てのサンプルをシリンジに数回吸引して、DNAを破壊し、続けて、4℃、30000rpmで30分間遠心分離した。上清を新たな反応チューブに移し、更なる工程に直接使用するか又は−80℃で保存した。タンパク質を分離するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。4℃、100Vで約2時間の電気泳動により、40μg 総タンパク質をロードし、示された特異抗体に対してプローブした。
細胞周期分析のために、細胞を6ウェルプレート(2,5×10E4c/ウェル)に播種した。dl703による感染前8時間で、細胞を示された濃度の細胞周期阻害剤で処理した。10MOI dl703による感染後、細胞を再度48時間処理した。未処理細胞及びdl703感染のみさせた細胞を対照とした。感染後48時間で、細胞をトリプシン処理により回収し、ボルテックスしながら、80% エタノールで固定した。細胞周期の状態を調査するために、固定された細胞をRT及び300gで5分間遠心分離し、エタノールを吸引した。細胞を再懸濁させ、1% BSA−PBS(ウシ血清アルブミン)で洗浄し、再度遠心分離した。細胞をEDUで染色し、細胞周期分析を、Thermo Fischer製のClick-iT(商標)Plus EdUフローサイトメトリーアッセイキット、カタログ番号.C10632を使用して行った。加えて、1% BSA/PBS細胞で3回洗浄した後、PI(ヨウ化プロピジウム、50μg/ml)で染色した。FACScaliburフローサイトメトリーシステムで染色した後、測定を直接行った。データをFlowJoソフトウェアで分析した。
CI1040:二重特異的スレオニン/チロシンキナーゼであるマップキナーゼキナーゼ(MEK)は、多くの場合ヒト腫瘍で活性化されるRAS/RAF/MEK/ERKシグナル伝達経路の重要な成分である。CI−1040は、MEKを強力に阻害し(Allen et al. 2003, Semin Oncol. (5 Suppl 16):105-16)、G1停止を引き起こすベンズヒドロキサマート化合物である。
膀胱細胞株RT112、T24及びUMUCを6ウェルプレートに播種した(2×105個/ウェル)。播種後1日目に、細胞を500nM パルボシクリブで感染前24時間及び再度感染後1時間で処理した。示されたMOIのAD−WTによる感染を、血清を含まないDMEM培地 400μl中で行った。ヘキソン染色を、Agilent(cat:972500)製のAdeasyウイルス力価キットを使用して、製造メーカーの説明書に従って、感染後2日目に行った。
XVir−N−31、パルボクリブ及びPARP阻害剤(BMN673(タラゾラリブ))を含む3剤併用療法を使用するT24細胞の3剤併用療法の有効性を示すために、効力アッセイを行った。
XVir−N−31、パルボクリブ及びPARP阻害剤(BMN673(タラゾラリブ))を含む3剤併用療法を使用するT24細胞の3剤併用療法の動力学を示すために、効力アッセイを行い、効力を種々の時点で評価した。
XVir−N−31、パルボクリブ及びPARP阻害剤(BMN673(タラゾラリブ))を含む3剤併用療法を使用するUMUC細胞の3剤併用療法の動力学を示すために、効力アッセイを行い、効力を種々の時点で評価した。
5000個 T24細胞を12ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するRPMI培地 1ml中において増殖させた。翌日、細胞を500nM パルボシクリブ及び300nM JQ−1で処理した。処理後24時間で、細胞を、FCSを含有しないRPMI培地 200μl中において、示されたMOIのXVir−N−31で感染させた。1時間後、10% FCSを含有するRPMI培地 800μlを各ウェルに加えた。加えて、500nM パルボシクリブ及び300nM JQ−1を培地に加えた。SRB染色を感染後5日で行った。モック処理細胞を100% 細胞生存に設定した。
100.000個 SK−N−MC細胞/ウェルを12ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するRPMI培地中において、5% CO2、37℃で増殖させた。細胞を、200nM アベマシクリブ+500nM JQ1により、感染前24時間及び再度感染後1時間で、適切な量を培地に加えることにより処理した。XVir−N−31の感染は、血清を含まないRPMI培地 500μl中において行った。SRB染色を感染後5日で行った。モック処理細胞を100% 細胞生存に設定した。
1×106個 細胞を10cm皿に播種した。処理後24時間で、核膜の破壊を達成するために、1% SDSバッファーを使用して、タンパク質を単離した。全てのサンプルをシリンジに数回吸引して、DNAを破壊し、続けて、4℃、30000rpmで30分間遠心分離した。上清を新たな反応チューブに移し、更なる工程に直接使用するか又は−80℃で保存した。タンパク質を分離するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。4℃、100Vで約2時間の電気泳動により、40μg 総タンパク質をロードし、示された特異抗体に対してプローブした。
100.000個 SK−N−MC細胞/ウェルを12ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するRPMI培地中において、5% CO2、37℃で増殖させた。細胞を、200nM アベマシクリブにより、感染前24時間及び再度感染後1時間で、適切な量を培地に加えることにより処理した。XVir−N−31の感染は、血清を含まないRPMI培地 500μl中において行った。SRB染色を感染後5日で行った。モック処理細胞を100% 細胞生存に設定した。
処理後48時間で、細胞をPBS(RNase Aを含有、100U/ml)で2回洗浄した。細胞をトリプシン処理し、1500rpm、4℃で5分間遠心分離した。細胞を、氷冷した80% エタノール 1mlをペレットにゆっくり滴加し、一晩インキュベーションすることにより固定した。染色を、染色溶液(ヨウ化プロピジウム、50μg/ml) 1mlを細胞に加え、穏やかに揺り動かしながらRTで30〜60分間インキュベーションすることにより行った。MK:MK−1775;LY:LY−2835219。
I.
ウェル当たりに2×105個 T24、A549及びHeLa細胞を6ウェルプレートに播種し、10% FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン及び非必須アミノ酸を含有するRPMI1640培地(又はDMEM培地) 1.5ml中において増殖させた。翌日、30pmol siRNA−陰性対照siRNA(Qiagen #1022076)又はsiE2F1(Sigma #NM_005225、siRNA ID SASI_Hs01_00162220)のいずれかをOpti-MEM培地 150μLで希釈し、リポフェクタミンRNAiMAX 9μlをOpti-MEM 150μL中で調製した。siRNA溶液及びリポフェクタミンRNAiMAX溶液を混合し、5分間インキュベーションした。この混合物を細胞に滴加した。48時間後、RNAを単離し、RT−qPCRを行った。
6ウェルプレートの各ウェルについて、2×105個 T24細胞を、10% FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン及び非必須アミノ酸を含有するRPMI1640培地 1.5mlに播種した。翌日、30pmol siRNA−陰性対照siRNA(Qiagen #1022076)又はsiE2F1(Sigma #NM_005225、siRNA ID SASI_Hs01_00162220)のいずれかをOpti-MEM培地 150μLで希釈し、リポフェクタミンRNAiMAX 9μlをOpti-MEM 150μL中で調製した。siRNA溶液及びリポフェクタミンRNAiMAX溶液を混合し、5分間インキュベーションした。この混合物をT24細胞に滴加した。感染を、血清を含まない培地 400μl中で10MOI ADWTRGDと共に細胞をインキュベーションし、10〜15分毎にプレートを揺り動かしながら48時間後に行った。1時間後、完全培地 1.6mlを加えた。RNA分離を感染後24時間で行った。
細胞を冷PBSですすぎ、MirVanaキット(Thermo Fisherカタログ番号AM1560)からの溶解バッファー 500μlを加えることにより破壊し、ライゼートをスパチュラで収集し、1.5mlチューブにピペットで移した。有機抽出のために、ホモジネート添加物 50μlを加え、サンプルを氷上で10分間インキュベーションし、酸−フェノール:クロロホルム 500μlを加え、サンプルを60秒間ボルテックスし、氷上で2分間インキュベーションした。サンプルを14000×g、室温で5分間遠心分離して、水相と有機相とに分離した。上相を注意深く新たなチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えた。室温で10分間インキュベーションした後、RNAを沈殿させ(14000×g、4℃、30分)、75% エタノール 1mLで2回洗浄した(遠心分離 7500×g、4℃、5分)。RNAを5〜10分間風乾させ、RNaseを含まない水 20〜50μlに再懸濁させ、500rpm、55℃で10分間振とうすることにより溶解させ、Nanodropで測定した。DNA消化(デオキシリボヌクレアーゼI、Invitrogen Cat.No.18068−015)後、1μg RNAサンプルを10×DNAse I反応バッファー 1μl、ヌクレアーゼを含まない水、DNaseI(1U/μl) 1μlと合わせて、9μlの容量にし、室温で15分間インキュベーションした。25mM EDTA溶液 1μlを加え、65℃で10分間加熱することにより、DNAse Iを不活性化する。逆転写を、高性能cDNA逆転写キット(Thermo Fisher/Applied Biosystems(商標)カタログ番号:4368814)を使用して行った。線維及びアクチンPCRの転写にはランダムヘキサマーを使用し、E2初期PCRの転写にはE2初期プライマーを使用する。
E2初期fw:CCGTCATCTCTACAGCCCAT
E2初期rev:GGGCTTTGTCAGAGTCTTGC
繊維fw:AAGCTAGCCCTGCAAACATCA
繊維rev:CCCAAGCTACCAGTGGCAGTA
アクチンfw:TCACCCACACTGTGCCCATCTACG
アクチンrev:CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG
E2F1fw:CATCCCAGGAGGTCACTTCTG
E2F1rev:GACAACAGCGGTTCTTGCTC
対照siRNA
センス:UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT
アンチセンス:ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT
E2F−1 siRNA
CUGAGGAGUUCAUCAGCCU[dT][dT]
AGGCUGAUGAACUCCUCAG[dT][dT]
アデノウイルスE2初期プロモーターの2つのE2F結合部位に突然変異を有する突然変異アデノウイルスを生成した。野生型E2初期プロモーターと変異型E2初期プロモーターとの両方のプロモーターを図23に示す。
Claims (15)
- アデノウイルスとCDK4/阻害剤とを含む、組み合わせ。
- 組み合わせが、さらに、PARP阻害剤を含む、請求項1記載の組み合わせ。
- 組み合わせが、さらに、ブロモドメイン阻害剤を含む、請求項1及び2のいずれか一項記載の組み合わせ。
- 腫瘍又はがんの処置のための方法における使用のための、請求項1〜3のいずれか一項記載の組み合わせ。
- 対象における腫瘍又はがんの処置のための方法における使用のためのアデノウイルスであって、
該方法は、対象にアデノウイルス及びCDK4/6阻害剤を投与することを含む、
アデノウイルス。 - 対象における腫瘍又はがんの処置のための方法における使用のためのCDK4/6阻害剤であって、
該方法は、対象にアデノウイルス及びCDK4/6阻害剤を投与することを含む、
CDK4/6阻害剤。 - アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、請求項1記載の組み合わせ、請求項4記載の使用のための組み合わせ、請求項5記載の使用のためのアデノウイルス及び請求項6記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- アデノウイルスが、XVir−N−31、dl520、AdΔ24、AdΔ24−RGD、dl922−947、E1Ad/01/07、dl1119/1131、CB016、VCN−01、E1Adl1107、E1Adl1101、ORCA−010、Enadenotucirev及び機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、請求項1及び7のいずれか一項記載の組み合わせ、請求項4及び7のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項5及び7のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項6及び7のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- アデノウイルスが、XVir−N−31である、請求項1及び7〜8のいずれか一項記載の組み合わせ、請求項4及び7〜8のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項5及び7及び8のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項6及び7〜8のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- CDK4/6阻害剤が、細胞をG1期で停止させ、E2F1を阻害するCDK4/6阻害剤である、請求項1及び7〜9のいずれか一項記載の組み合わせ、請求項4及び7〜9のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項5及び7〜9のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項6及び7〜9のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- CDK4/6阻害剤が、PD0332991とも呼ばれるパルボシクリブ、LY−2835219とも呼ばれるアベマシクリブ、LEE011とも呼ばれるリボシクリブ、G1T28とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、請求項1及び7〜10のいずれか一項記載の組み合わせ、請求項4及び7〜10のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項5及び7〜10のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項6及び7〜10のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- 病的腫瘍又はがんが、Rbを発現しているか又はRb陽性である、請求項4及び7〜11のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項5及び7〜11のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項6及び7〜11のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- 腫瘍細胞の細胞が、1つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び/又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、請求項4及び7〜12のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項5及び7〜12のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項6及び7〜12のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- 腫瘍又はがんが、細胞周期とは無関係に細胞核にYB−1を含有する、請求項4及び7〜13のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項5及び7〜13のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項6及び7〜13のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- 疾患が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん(mBC)、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項4及び7〜14のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項5及び7〜14のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項6及び7〜14のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
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