RU2811278C2 - Лечение опухолей комбинацией онколитического аденовируса и ингибитора cdk4/6 - Google Patents
Лечение опухолей комбинацией онколитического аденовируса и ингибитора cdk4/6 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2811278C2 RU2811278C2 RU2020132466A RU2020132466A RU2811278C2 RU 2811278 C2 RU2811278 C2 RU 2811278C2 RU 2020132466 A RU2020132466 A RU 2020132466A RU 2020132466 A RU2020132466 A RU 2020132466A RU 2811278 C2 RU2811278 C2 RU 2811278C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- inhibitor
- adenovirus
- cells
- cdk4
- tumor
- Prior art date
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 268
- 229940124297 CDK 4/6 inhibitor Drugs 0.000 title claims abstract description 181
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 121
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 96
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 264
- 239000012661 PARP inhibitor Substances 0.000 claims description 96
- 229940121906 Poly ADP ribose polymerase inhibitor Drugs 0.000 claims description 96
- AHJRHEGDXFFMBM-UHFFFAOYSA-N palbociclib Chemical group N1=C2N(C3CCCC3)C(=O)C(C(=O)C)=C(C)C2=CN=C1NC(N=C1)=CC=C1N1CCNCC1 AHJRHEGDXFFMBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 87
- 229940125763 bromodomain inhibitor Drugs 0.000 claims description 86
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 80
- 229960004390 palbociclib Drugs 0.000 claims description 65
- 102100024026 Transcription factor E2F1 Human genes 0.000 claims description 49
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 claims description 40
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 claims description 28
- 101000904152 Homo sapiens Transcription factor E2F1 Proteins 0.000 claims description 26
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 25
- RHXHGRAEPCAFML-UHFFFAOYSA-N 7-cyclopentyl-n,n-dimethyl-2-[(5-piperazin-1-ylpyridin-2-yl)amino]pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-6-carboxamide Chemical compound N1=C2N(C3CCCC3)C(C(=O)N(C)C)=CC2=CN=C1NC(N=C1)=CC=C1N1CCNCC1 RHXHGRAEPCAFML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 229950003687 ribociclib Drugs 0.000 claims description 24
- UZWDCWONPYILKI-UHFFFAOYSA-N n-[5-[(4-ethylpiperazin-1-yl)methyl]pyridin-2-yl]-5-fluoro-4-(7-fluoro-2-methyl-3-propan-2-ylbenzimidazol-5-yl)pyrimidin-2-amine Chemical compound C1CN(CC)CCN1CC(C=N1)=CC=C1NC1=NC=C(F)C(C=2C=C3N(C(C)C)C(C)=NC3=C(F)C=2)=N1 UZWDCWONPYILKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 229950001573 abemaciclib Drugs 0.000 claims description 21
- PDGKHKMBHVFCMG-UHFFFAOYSA-N 2-[[5-(4-methylpiperazin-1-yl)pyridin-2-yl]amino]spiro[7,8-dihydropyrazino[5,6]pyrrolo[1,2-d]pyrimidine-9,1'-cyclohexane]-6-one Chemical compound C1CN(C)CCN1C(C=N1)=CC=C1NC1=NC=C(C=C2N3C4(CCCCC4)CNC2=O)C3=N1 PDGKHKMBHVFCMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 claims description 18
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 16
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 15
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 14
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 13
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 11
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 claims description 10
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 10
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 10
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 10
- 229950007127 trilaciclib Drugs 0.000 claims description 10
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 claims description 9
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 claims description 9
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 8
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 claims description 6
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 38
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 abstract description 22
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 19
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 144
- 102100022224 Y-box-binding protein 1 Human genes 0.000 description 109
- 108010048626 Y-Box-Binding Protein 1 Proteins 0.000 description 108
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 91
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 91
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 83
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 72
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 70
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 58
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 57
- 101710199711 Early E1A protein Proteins 0.000 description 54
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 42
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 35
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 35
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 35
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 35
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 33
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 30
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 29
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 28
- 230000037057 G1 phase arrest Effects 0.000 description 27
- DNVXATUJJDPFDM-KRWDZBQOSA-N JQ1 Chemical group N([C@@H](CC(=O)OC(C)(C)C)C1=NN=C(N1C=1SC(C)=C(C)C=11)C)=C1C1=CC=C(Cl)C=C1 DNVXATUJJDPFDM-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 27
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 27
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 26
- HXJDWCWJDCOHDG-RYUDHWBXSA-N S-hexylglutathione Chemical compound CCCCCCSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O HXJDWCWJDCOHDG-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 25
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 25
- 239000000047 product Substances 0.000 description 25
- 101710138750 Transcription factor E2F1 Proteins 0.000 description 23
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 22
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 22
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 20
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 19
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 18
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 18
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 18
- IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(diethylamino)-3-(diethyliminiumyl)-3h-xanthen-9-yl]-5-sulfobenzene-1-sulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 16
- HWGQMRYQVZSGDQ-HZPDHXFCSA-N chembl3137320 Chemical compound CN1N=CN=C1[C@H]([C@H](N1)C=2C=CC(F)=CC=2)C2=NNC(=O)C3=C2C1=CC(F)=C3 HWGQMRYQVZSGDQ-HZPDHXFCSA-N 0.000 description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229950009557 adavosertib Drugs 0.000 description 14
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 14
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 14
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 14
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 14
- 102000001805 Bromodomains Human genes 0.000 description 13
- 108050009021 Bromodomains Proteins 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- BKWJAKQVGHWELA-UHFFFAOYSA-N 1-[6-(2-hydroxypropan-2-yl)-2-pyridinyl]-6-[4-(4-methyl-1-piperazinyl)anilino]-2-prop-2-enyl-3-pyrazolo[3,4-d]pyrimidinone Chemical compound C1CN(C)CCN1C(C=C1)=CC=C1NC1=NC=C2C(=O)N(CC=C)N(C=3N=C(C=CC=3)C(C)(C)O)C2=N1 BKWJAKQVGHWELA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LTZZZXXIKHHTMO-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-fluoro-3-[4-(4-fluorobenzoyl)piperazine-1-carbonyl]phenyl]methyl]-2H-phthalazin-1-one Chemical compound FC1=C(C=C(CC2=NNC(C3=CC=CC=C23)=O)C=C1)C(=O)N1CCN(CC1)C(C1=CC=C(C=C1)F)=O LTZZZXXIKHHTMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010006533 ATP-Binding Cassette Transporters Proteins 0.000 description 12
- 102000005416 ATP-Binding Cassette Transporters Human genes 0.000 description 12
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 12
- 102100036252 Cyclin-dependent kinase 4 Human genes 0.000 description 12
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 11
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 11
- 230000009471 action Effects 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- BDUHCSBCVGXTJM-WUFINQPMSA-N 4-[[(4S,5R)-4,5-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methoxy-2-propan-2-yloxyphenyl)-4,5-dihydroimidazol-1-yl]-oxomethyl]-2-piperazinone Chemical compound CC(C)OC1=CC(OC)=CC=C1C1=N[C@@H](C=2C=CC(Cl)=CC=2)[C@@H](C=2C=CC(Cl)=CC=2)N1C(=O)N1CC(=O)NCC1 BDUHCSBCVGXTJM-WUFINQPMSA-N 0.000 description 10
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 description 10
- 201000003076 Angiosarcoma Diseases 0.000 description 10
- 101000715943 Caenorhabditis elegans Cyclin-dependent kinase 4 homolog Proteins 0.000 description 10
- 108010025468 Cyclin-Dependent Kinase 6 Proteins 0.000 description 10
- 102100026804 Cyclin-dependent kinase 6 Human genes 0.000 description 10
- 208000001258 Hemangiosarcoma Diseases 0.000 description 10
- 102100023712 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 Human genes 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 10
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 10
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 10
- BTIHMVBBUGXLCJ-OAHLLOKOSA-N seliciclib Chemical compound C=12N=CN(C(C)C)C2=NC(N[C@@H](CO)CC)=NC=1NCC1=CC=CC=C1 BTIHMVBBUGXLCJ-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 10
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 9
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 9
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 9
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 9
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 9
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 9
- 229950002830 enadenotucirev Drugs 0.000 description 9
- 206010016629 fibroma Diseases 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 9
- 229960000572 olaparib Drugs 0.000 description 9
- FAQDUNYVKQKNLD-UHFFFAOYSA-N olaparib Chemical group FC1=CC=C(CC2=C3[CH]C=CC=C3C(=O)N=N2)C=C1C(=O)N(CC1)CCN1C(=O)C1CC1 FAQDUNYVKQKNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- AAAQFGUYHFJNHI-SFHVURJKSA-N 2-[(4S)-6-(4-chlorophenyl)-8-methoxy-1-methyl-4H-[1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]benzodiazepin-4-yl]-N-ethylacetamide Chemical compound N([C@H](C1=NN=C(C)N1C1=CC=C(OC)C=C11)CC(=O)NCC)=C1C1=CC=C(Cl)C=C1 AAAQFGUYHFJNHI-SFHVURJKSA-N 0.000 description 8
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 8
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 8
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 8
- 108010036466 E2F2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 8
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 8
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 8
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 8
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 8
- 108050002653 Retinoblastoma protein Proteins 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 102100024024 Transcription factor E2F2 Human genes 0.000 description 8
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 8
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 8
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 description 8
- 229950004707 rucaparib Drugs 0.000 description 8
- HMABYWSNWIZPAG-UHFFFAOYSA-N rucaparib Chemical compound C1=CC(CNC)=CC=C1C(N1)=C2CCNC(=O)C3=C2C1=CC(F)=C3 HMABYWSNWIZPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 8
- 229950011257 veliparib Drugs 0.000 description 8
- JNAHVYVRKWKWKQ-CYBMUJFWSA-N veliparib Chemical compound N=1C2=CC=CC(C(N)=O)=C2NC=1[C@@]1(C)CCCN1 JNAHVYVRKWKWKQ-CYBMUJFWSA-N 0.000 description 8
- GFMMXOIFOQCCGU-UHFFFAOYSA-N 2-(2-chloro-4-iodoanilino)-N-(cyclopropylmethoxy)-3,4-difluorobenzamide Chemical compound C=1C=C(I)C=C(Cl)C=1NC1=C(F)C(F)=CC=C1C(=O)NOCC1CC1 GFMMXOIFOQCCGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- PIMQWRZWLQKKBJ-SFHVURJKSA-N 2-[(2S)-1-[3-ethyl-7-[(1-oxido-3-pyridin-1-iumyl)methylamino]-5-pyrazolo[1,5-a]pyrimidinyl]-2-piperidinyl]ethanol Chemical compound C=1C(N2[C@@H](CCCC2)CCO)=NC2=C(CC)C=NN2C=1NCC1=CC=C[N+]([O-])=C1 PIMQWRZWLQKKBJ-SFHVURJKSA-N 0.000 description 7
- TXZPMHLMPKIUGK-UHFFFAOYSA-N 2-methoxy-N-(3-methyl-2-oxo-1,4-dihydroquinazolin-6-yl)benzenesulfonamide Chemical compound COC1=CC=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(NC(=O)N(C)C2)C2=C1 TXZPMHLMPKIUGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- GNMUEVRJHCWKTO-FQEVSTJZSA-N 6h-thieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepine-6-acetamide, 4-(4-chlorophenyl)-n-(4-hydroxyphenyl)-2,3,9-trimethyl-, (6s)- Chemical compound C([C@@H]1N=C(C2=C(N3C(C)=NN=C31)SC(=C2C)C)C=1C=CC(Cl)=CC=1)C(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 GNMUEVRJHCWKTO-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 7
- VUVUVNZRUGEAHB-CYBMUJFWSA-N 7-(3,5-dimethyl-4-isoxazolyl)-8-methoxy-1-[(1R)-1-(2-pyridinyl)ethyl]-3H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-one Chemical compound C1([C@@H](C)N2C3=C4C=C(C(=CC4=NC=C3NC2=O)C2=C(ON=C2C)C)OC)=CC=CC=N1 VUVUVNZRUGEAHB-CYBMUJFWSA-N 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 7
- 101000904150 Homo sapiens Transcription factor E2F3 Proteins 0.000 description 7
- 241000701244 Mastadenovirus Species 0.000 description 7
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 7
- 108010064218 Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 Proteins 0.000 description 7
- 102100024027 Transcription factor E2F3 Human genes 0.000 description 7
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 7
- 229950000080 birabresib Drugs 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 7
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 7
- DZTGIRNXWSZBIM-UHFFFAOYSA-N chembl3086883 Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(N=NC=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1N DZTGIRNXWSZBIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QECMENZMDBOLDR-AWEZNQCLSA-N cpi 203 Chemical compound N([C@@H](CC(N)=O)C1=NN=C(N1C=1SC(C)=C(C)C=11)C)=C1C1=CC=C(Cl)C=C1 QECMENZMDBOLDR-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 7
- 229950009859 dinaciclib Drugs 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 201000010260 leiomyoma Diseases 0.000 description 7
- 230000004777 loss-of-function mutation Effects 0.000 description 7
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 7
- GCWIQUVXWZWCLE-INIZCTEOSA-N pelabresib Chemical compound N([C@@H](CC(N)=O)C=1ON=C(C=1C1=CC=CC=C11)C)=C1C1=CC=C(Cl)C=C1 GCWIQUVXWZWCLE-INIZCTEOSA-N 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 108010027410 Adenovirus E3 Proteins Proteins 0.000 description 6
- 108091005625 BRD4 Proteins 0.000 description 6
- 102100029895 Bromodomain-containing protein 4 Human genes 0.000 description 6
- 101150041972 CDKN2A gene Proteins 0.000 description 6
- 101100005789 Caenorhabditis elegans cdk-4 gene Proteins 0.000 description 6
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 101150069156 Cdkn2b gene Proteins 0.000 description 6
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 description 6
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 6
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 6
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 6
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 6
- 206010020843 Hyperthermia Diseases 0.000 description 6
- 102000004232 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Human genes 0.000 description 6
- 108090000744 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Proteins 0.000 description 6
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 6
- 108010012271 Positive Transcriptional Elongation Factor B Proteins 0.000 description 6
- 102000019014 Positive Transcriptional Elongation Factor B Human genes 0.000 description 6
- 101150002130 Rb1 gene Proteins 0.000 description 6
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 6
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000036031 hyperthermia Effects 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 230000025308 nuclear transport Effects 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 108700042657 p16 Genes Proteins 0.000 description 6
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 6
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 5
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 5
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 5
- -1 p18INK4C Proteins 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 5
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 description 4
- 229940123587 Cell cycle inhibitor Drugs 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 4
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 4
- 108010058546 Cyclin D1 Proteins 0.000 description 4
- 108010024986 Cyclin-Dependent Kinase 2 Proteins 0.000 description 4
- 102100036239 Cyclin-dependent kinase 2 Human genes 0.000 description 4
- GUGHGUXZJWAIAS-QQYBVWGSSA-N Daunorubicin hydrochloride Chemical compound Cl.O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 GUGHGUXZJWAIAS-QQYBVWGSSA-N 0.000 description 4
- 102100024165 G1/S-specific cyclin-D1 Human genes 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010024612 Lipoma Diseases 0.000 description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 4
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 4
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 4
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 4
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 231100000338 sulforhodamine B assay Toxicity 0.000 description 4
- 238000003210 sulforhodamine B staining Methods 0.000 description 4
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 3
- 108700026758 Adenovirus hexon capsid Proteins 0.000 description 3
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 3
- 102100033641 Bromodomain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 3
- 102100033642 Bromodomain-containing protein 3 Human genes 0.000 description 3
- 102000002435 Cyclin T Human genes 0.000 description 3
- 108010068106 Cyclin T Proteins 0.000 description 3
- 102000009512 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p15 Human genes 0.000 description 3
- 108010009356 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p15 Proteins 0.000 description 3
- 108010009392 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p16 Proteins 0.000 description 3
- 102100032857 Cyclin-dependent kinase 1 Human genes 0.000 description 3
- 229940083347 Cyclin-dependent kinase 4 inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 102100024457 Cyclin-dependent kinase 9 Human genes 0.000 description 3
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 3
- 102100037854 G1/S-specific cyclin-E2 Human genes 0.000 description 3
- 102100038885 Histone acetyltransferase p300 Human genes 0.000 description 3
- 101000871850 Homo sapiens Bromodomain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 101000871851 Homo sapiens Bromodomain-containing protein 3 Proteins 0.000 description 3
- 101000980930 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 9 Proteins 0.000 description 3
- 101000738575 Homo sapiens G1/S-specific cyclin-E2 Proteins 0.000 description 3
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 3
- 208000007727 Muscle Tissue Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 201000004404 Neurofibroma Diseases 0.000 description 3
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 101710179684 Poly [ADP-ribose] polymerase Proteins 0.000 description 3
- 229920000776 Poly(Adenosine diphosphate-ribose) polymerase Polymers 0.000 description 3
- 102100038042 Retinoblastoma-associated protein Human genes 0.000 description 3
- 101150040313 Wee1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 3
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 3
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 208000021592 benign granular cell tumor Diseases 0.000 description 3
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 3
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 201000009020 malignant peripheral nerve sheath tumor Diseases 0.000 description 3
- 206010027191 meningioma Diseases 0.000 description 3
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 3
- 201000004130 myoblastoma Diseases 0.000 description 3
- 208000029974 neurofibrosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 3
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 3
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 3
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical group ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 2
- 208000005440 Basal Cell Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000003170 Bronchiolo-Alveolar Adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 101150035324 CDK9 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 2
- 102000003910 Cyclin D Human genes 0.000 description 2
- 108090000259 Cyclin D Proteins 0.000 description 2
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 2
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 101100440985 Danio rerio crad gene Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 2
- 108010063774 E2F1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000015699 E2F1 Transcription Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 2
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001976 Endocrine Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010053717 Fibrous histiocytoma Diseases 0.000 description 2
- 230000006370 G0 arrest Effects 0.000 description 2
- 208000006050 Hemangiopericytoma Diseases 0.000 description 2
- 101710155878 Histone acetyltransferase p300 Proteins 0.000 description 2
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 2
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000868333 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000909198 Homo sapiens DNA polymerase delta catalytic subunit Proteins 0.000 description 2
- 101000742859 Homo sapiens Retinoblastoma-associated protein Proteins 0.000 description 2
- 241000620571 Human mastadenovirus A Species 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 2
- 101710192606 Latent membrane protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 206010025219 Lymphangioma Diseases 0.000 description 2
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 208000006644 Malignant Fibrous Histiocytoma Diseases 0.000 description 2
- 101100440987 Mus musculus Cracd gene Proteins 0.000 description 2
- 101100467905 Mus musculus Rdh16 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 206010048757 Oncocytoma Diseases 0.000 description 2
- 208000002063 Oxyphilic Adenoma Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 208000031839 Peripheral nerve sheath tumour malignant Diseases 0.000 description 2
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 2
- 208000037062 Polyps Diseases 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 2
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 2
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 208000034541 Rare lymphatic malformation Diseases 0.000 description 2
- 208000005678 Rhabdomyoma Diseases 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- 101710109576 Terminal protein Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 208000015778 Undifferentiated pleomorphic sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 208000014616 embryonal neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010842 high-capacity cDNA reverse transcription kit Methods 0.000 description 2
- 201000000284 histiocytoma Diseases 0.000 description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 206010022498 insulinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000022013 kidney Wilms tumor Diseases 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 206010024627 liposarcoma Diseases 0.000 description 2
- 208000025036 lymphosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 206010061526 malignant mesenchymoma Diseases 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 201000008806 mesenchymal cell neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 201000010225 mixed cell type cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000029638 mixed neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010051747 multiple endocrine neoplasia Diseases 0.000 description 2
- NCJPFQPEVDHJAZ-UHFFFAOYSA-N n-[5-[(4-ethylpiperazin-1-yl)methyl]pyridin-2-yl]-5-fluoro-4-(7-fluoro-2-methyl-3-propan-2-ylbenzimidazol-5-yl)pyrimidin-2-amine;methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O.C1CN(CC)CCN1CC(C=N1)=CC=C1NC1=NC=C(F)C(C=2C=C3N(C(C)C)C(C)=NC3=C(F)C=2)=N1 NCJPFQPEVDHJAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 206010061311 nervous system neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 208000008798 osteoma Diseases 0.000 description 2
- 208000029211 papillomatosis Diseases 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 208000029340 primitive neuroectodermal tumor Diseases 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 2
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 208000000649 small cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010576 undifferentiated carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- CJIPEACKIJJYED-KRWDZBQOSA-N (4S)-7,8-dimethoxy-N,4-dimethyl-1-[4-(4-methylpiperazin-1-yl)phenyl]-4,5-dihydro-2,3-benzodiazepine-3-carboxamide Chemical compound COC=1C(=CC2=C(C[C@@H](N(N=C2C2=CC=C(C=C2)N2CCN(CC2)C)C(=O)NC)C)C1)OC CJIPEACKIJJYED-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 2-(4,4-difluoropiperidin-1-yl)-6-methoxy-n-(1-propan-2-ylpiperidin-4-yl)-7-(3-pyrrolidin-1-ylpropoxy)quinazolin-4-amine Chemical compound N1=C(N2CCC(F)(F)CC2)N=C2C=C(OCCCN3CCCC3)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C(C)C)CC1 RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AMSUHYUVOVCWTP-INIZCTEOSA-N 4-[6-(3,5-dimethyl-1,2-oxazol-4-yl)-1-[(1s)-1-pyridin-2-ylethyl]pyrrolo[3,2-b]pyridin-3-yl]benzoic acid Chemical compound C1([C@H](C)N2C3=CC(=CN=C3C(C=3C=CC(=CC=3)C(O)=O)=C2)C2=C(ON=C2C)C)=CC=CC=N1 AMSUHYUVOVCWTP-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- SRNWOUGRCWSEMX-KEOHHSTQSA-N ADP-beta-D-ribose Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SRNWOUGRCWSEMX-KEOHHSTQSA-N 0.000 description 1
- 102100033350 ATP-dependent translocase ABCB1 Human genes 0.000 description 1
- 206010001197 Adenocarcinoma of the cervix Diseases 0.000 description 1
- 208000034246 Adenocarcinoma of the cervix uteri Diseases 0.000 description 1
- 206010001258 Adenoviral infections Diseases 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 208000037540 Alveolar soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 241001443586 Atadenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701802 Aviadenovirus Species 0.000 description 1
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 description 1
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 description 1
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700020462 BRCA2 Proteins 0.000 description 1
- 102000052609 BRCA2 Human genes 0.000 description 1
- KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N Benzamide Chemical group NC(=O)C1=CC=CC=C1 KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101150008921 Brca2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029894 Bromodomain testis-specific protein Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 201000000274 Carcinosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000006459 Checkpoint Kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010019244 Checkpoint Kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 201000005262 Chondroma Diseases 0.000 description 1
- 201000009047 Chordoma Diseases 0.000 description 1
- 102000005853 Clathrin Human genes 0.000 description 1
- 108010019874 Clathrin Proteins 0.000 description 1
- 102000008169 Co-Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010060434 Co-Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000010091 Cold shock domains Human genes 0.000 description 1
- 108050001774 Cold shock domains Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000009798 Craniopharyngioma Diseases 0.000 description 1
- 108010068192 Cyclin A Proteins 0.000 description 1
- 108010058544 Cyclin D2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003909 Cyclin E Human genes 0.000 description 1
- 108090000257 Cyclin E Proteins 0.000 description 1
- 102100025191 Cyclin-A2 Human genes 0.000 description 1
- 102000009506 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p19 Human genes 0.000 description 1
- 108010009361 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p19 Proteins 0.000 description 1
- 102100036876 Cyclin-K Human genes 0.000 description 1
- 101710106279 Cyclin-dependent kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100026810 Cyclin-dependent kinase 7 Human genes 0.000 description 1
- 102000010907 Cyclooxygenase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010037462 Cyclooxygenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 201000005171 Cystadenoma Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000005971 DNA damage repair Effects 0.000 description 1
- 239000012623 DNA damaging agent Substances 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000011799 Desmoglein Human genes 0.000 description 1
- 108050002238 Desmoglein Proteins 0.000 description 1
- 208000002699 Digestive System Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 101710114676 E1B 55 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 102000019274 E2F Family Human genes 0.000 description 1
- 108050006730 E2F Family Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010014967 Ependymoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005231 Epithelioid sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000005163 Extra-Adrenal Paraganglioma Diseases 0.000 description 1
- 208000007659 Fibroadenoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 102100024185 G1/S-specific cyclin-D2 Human genes 0.000 description 1
- 206010061968 Gastric neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 1
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 1
- 208000007569 Giant Cell Tumors Diseases 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010019043 Hair follicle tumour benign Diseases 0.000 description 1
- 102000003893 Histone acetyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000246 Histone acetyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101000794028 Homo sapiens Bromodomain testis-specific protein Proteins 0.000 description 1
- 101000934320 Homo sapiens Cyclin-A2 Proteins 0.000 description 1
- 101000713127 Homo sapiens Cyclin-K Proteins 0.000 description 1
- 101000911952 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000961414 Homo sapiens Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 1
- 101001113440 Homo sapiens Poly [ADP-ribose] polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000735456 Homo sapiens Protein mono-ADP-ribosyltransferase PARP3 Proteins 0.000 description 1
- 101000895882 Homo sapiens Transcription factor E2F4 Proteins 0.000 description 1
- 101000866336 Homo sapiens Transcription factor E2F5 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101150117869 Hras gene Proteins 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000620147 Human mastadenovirus C Species 0.000 description 1
- 241000886703 Human mastadenovirus E Species 0.000 description 1
- 241000886705 Human mastadenovirus F Species 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 101710123134 Ice-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101710082837 Ice-structuring protein Proteins 0.000 description 1
- 241001651351 Ichtadenovirus Species 0.000 description 1
- 108010007403 Immediate-Early Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000008869 Juxtacortical Osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010023347 Keratoacanthoma Diseases 0.000 description 1
- 201000004462 Leydig Cell Tumor Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229940124647 MEK inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010025566 Malignant haemangiopericytoma Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 1
- 102100039373 Membrane cofactor protein Human genes 0.000 description 1
- 208000002030 Merkel cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- DTERQYGMUDWYAZ-ZETCQYMHSA-N N(6)-acetyl-L-lysine Chemical compound CC(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O DTERQYGMUDWYAZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 206010029098 Neoplasm skin Diseases 0.000 description 1
- 201000010133 Oligodendroglioma Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000033014 Plasma cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 102100023652 Poly [ADP-ribose] polymerase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102000006478 Protein Phosphatase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010058956 Protein Phosphatase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000009516 Protein Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010009341 Protein Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100034935 Protein mono-ADP-ribosyltransferase PARP3 Human genes 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 101710124357 Retinoblastoma-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 201000010208 Seminoma Diseases 0.000 description 1
- 208000003274 Sertoli cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 241000620568 Siadenovirus Species 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010068771 Soft tissue neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 208000025194 Sweat Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010042658 Sweat gland tumour Diseases 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102100021783 Transcription factor E2F4 Human genes 0.000 description 1
- 102100031632 Transcription factor E2F5 Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108010079351 Tumor Suppressor Protein p14ARF Proteins 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- 101710107540 Type-2 ice-structuring protein Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 201000008629 Zollinger-Ellison syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002534 adenoid Anatomy 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010084938 adenovirus receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229950010817 alvocidib Drugs 0.000 description 1
- BIIVYFLTOXDAOV-YVEFUNNKSA-N alvocidib Chemical compound O[C@@H]1CN(C)CC[C@@H]1C1=C(O)C=C(O)C2=C1OC(C=1C(=CC=CC=1)Cl)=CC2=O BIIVYFLTOXDAOV-YVEFUNNKSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000001348 anti-glioma Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229940049706 benzodiazepine Drugs 0.000 description 1
- 150000001557 benzodiazepines Chemical class 0.000 description 1
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003443 bladder cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 description 1
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000003149 breast fibroadenoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000012820 cell cycle checkpoint Effects 0.000 description 1
- 230000009743 cell cycle entry Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 201000006662 cervical adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 1
- ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO.OC1=CC=CC=C1 ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229930193282 clathrin Natural products 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940000425 combination drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 238000002247 constant time method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N cresol red Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C=C(C)C(O)=CC=2)=C1 OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017763 cutaneous neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940043378 cyclin-dependent kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 108060002430 dynein heavy chain Proteins 0.000 description 1
- 102000013035 dynein heavy chain Human genes 0.000 description 1
- 230000000531 effect on virus Effects 0.000 description 1
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003020 exocrine pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006355 external stress Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 201000008815 extraosseous osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 208000024519 eye neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 208000028149 female reproductive system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 201000008361 ganglioneuroma Diseases 0.000 description 1
- 201000000052 gastrinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 201000002076 hair follicle neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 201000002222 hemangioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- SUMDYPCJJOFFON-UHFFFAOYSA-N isethionic acid Chemical compound OCCS(O)(=O)=O SUMDYPCJJOFFON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 208000012804 lymphangiosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004995 male reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 208000012166 male reproductive system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000002829 mitogen activated protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 108010066052 multidrug resistance-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000002071 myeloproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 210000004457 myocytus nodalis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 208000025402 neoplasm of esophagus Diseases 0.000 description 1
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 210000000826 nictitating membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 201000008106 ocular cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012379 oncolytic virotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000004279 orbit Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 208000021262 pancreatic insulin-producing neuroendocrine tumor Diseases 0.000 description 1
- 208000021255 pancreatic insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002990 parathyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 201000008785 pediatric osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 1
- 201000005528 peripheral nervous system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009038 pharmacological inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 208000028591 pheochromocytoma Diseases 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 208000010626 plasma cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 102000009929 raf Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010077182 raf Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012107 replication analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 201000010383 sebaceous gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229950000055 seliciclib Drugs 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000002311 subsequent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 208000027371 sweat gland benign neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 230000005029 transcription elongation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 210000003956 transport vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 208000025421 tumor of uterus Diseases 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 208000026517 ureter neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000011476 ureteral benign neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000024722 urethra neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 208000029584 urinary system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024719 uterine cervix neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
- 101150041050 ybx1 gene Proteins 0.000 description 1
Abstract
Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины. 1 объект представляет собой комбинацию для лечения опухоли с клетками, имеющими YB-1 в ядре, включающую онколитический аденовирус и ингибитор CDK4/6, причем онколитический аденовирус представляет собой XVir-N-31. 2 объект – способ лечения опухоли с клетками, имеющими YB-1 в ядре, согласно которому субъекту вводят онколитический аденовирус и ингибитор CDK4/6, причем онколитический аденовирус представляет собой XVir-N-31. Технический результат заключается в увеличении эффективности терапии опухолей и увеличении репликации вируса. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 34 ил., 1 табл., 24 пр.
Description
Настоящее изобретения относится к комбинации онколитического вируса и ингибитора CDK4; к применению такой комбинации в лечении такого заболевания, как опухоль; к онколитическому вирусу, предпочтительно, онколитическому аденовирусу для применения в лечении такого заболевания, как опухоль, совместно с ингибитором CDK4/6; и к ингибитору CDK4/6 для применения в лечении такого заболевания, как опухоль, совместно с онколитическим вирусом, предпочтительно, онколитическим аденовирусом.
В настоящее время в лечении опухолей используется ряд терапевтических концепций. Помимо хирургического вмешательства, преобладают химиотерапия и лучевая терапия. Однако все эти методы связаны со значительными побочными эффектами. Использование онколитических вирусов, селективных к репликации, предоставляет новую идейную основу для лечения опухолей. В связи с этим инициируется селективная репликация вирусного агента внутри опухоли, что приводит к репликации вируса, лизису инфекционной опухолевой клетки и распространению вируса на смежные опухолевые клетки. Поскольку способность вируса к репликации вируса ограничена опухолевыми клетками, то нормальная ткань защищена от репликации и, таким образом, от лизиса вирусом.
Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в предоставлении средств повышения эффективности терапии опухолей на основе онколитических вирусов и, в частности, аденовируса.
Эти и другие задачи решаются с помощью объекта изобретения, описанного в прилагаемых независимых пунктах формулы изобретения; предпочтительные варианты осуществления могут быть взяты из прилагаемых зависимых пунктов формулы изобретения.
Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, также решается в первом аспекте, который также является первым вариантом осуществления такого первого аспекта, посредством комбинации, содержащей аденовирус и ингибитор CDK4/6.
Далее раскрываются дополнительные варианты осуществления такого первого аспекта.
Вариант осуществления 2: Комбинация по варианту осуществления 1, где аденовирусом является онколитический аденовирус.
Вариант осуществления 3: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1 и 2, где аденовирус реплицируется YB-1-зависимым образом.
Вариант осуществления 4: Комбинация по варианту осуществления 3, где аденовирус является дефицитным по репликации в клетках, не содержащих YB-1 в ядре, но реплицируется в клетках, которые содержат YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 5: Комбинация по любому из вариантов осуществления 2-4, где аденовирус кодирует онкогенный белок, где онкогенный белок трансактивирует по меньшей мере один аденовирусный ген, причем аденовирусный ген выбран из группы, включающей E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 и E3ADP.
Вариант осуществления 6: Комбинация по варианту осуществления 5, где онкогенным белком является белок E1A.
Вариант осуществления 7: Комбинация по варианту осуществления 6, где белок E1A способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 8: Комбинация по варианту осуществления 6, где белок E1A не способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 9: Комбинация по любому из вариантов осуществления 6-8, где белок E1A не вызывает локализацию YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 10: Комбинация по любому из вариантов осуществления 5-9, где онкогенный белок демонстрирует одну или несколько мутаций или делеций по сравнению с белком онкогена E1A дикого типа.
Вариант осуществления 11: Комбинация по варианту осуществления 10, где делеция выбрана из группы, включающей делеции фрагментов CR3 и делеции N-конца и делеции C-конца.
Вариант осуществления 12: Комбинация по любому из вариантов осуществления 6-11, где белок E1A способен связываться с Rb.
Вариант осуществления 13: Комбинация по любому из вариантов осуществления 6-12, где белок E1A содержит одну или несколько мутаций или делеций по сравнению с онкогенным белком дикого типа, причем делеция, предпочтительно, является делецией в области CR1 и/или области CR2.
Вариант осуществления 14: Комбинация по варианту осуществления 13, где белок E1A не способен связываться с Rb.
Вариант осуществления 15: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-14, где вирусом является аденовирус, экспрессирующий белок E1A12S.
Вариант осуществления 16: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-15, где вирусом является аденовирус, не экспрессирующий белок E1A13S.
Вариант осуществления 17: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-16, где вирусом является аденовирус, не содержащий функционально активную аденовирусную область E3.
Вариант осуществления 18: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-17, где вирусом является аденовирус, не экспрессирующий белок E1B 19 кДа.
Вариант осуществления 19: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-18, где вирусом является аденовирус, экспрессирующий RGD-мотив на волокне.
Вариант осуществления 20: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-19, где вирусом является аденовирус серотипа 5.
Вариант осуществления 21: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-20, где аденовирус выбран из группы, включающий XVir-N-31, dl520, AdΔ24, AdΔ24-RGD, dl922-947, E1Ad/01/07, dl1119/1131, CB 016, VCN-01, E1Adl1107, E1Adl1101, ORCA-010, Enadenotucirev и вирусы, не содержащие экспрессированный вирусный онкоген, который способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 22: Комбинация по варианту осуществления 21, где аденовирусом является XVir-N-31.
Вариант осуществления 23: Комбинация по варианту осуществления 21, где аденовирусом является dl520, и где аденовирусная область E3 является функционально неактивной.
Вариант осуществления 24: Комбинация по любому из вариантов осуществления 21-23, где аденовирусом является dl520, и где в dl520 отсутствует экспрессия белка E1B 19 кДа.
Вариант осуществления 25: Комбинация по любому из вариантов осуществления 21-24, где аденовирусом является dl520, экспрессирующий RGD-мотив на волокне.
Вариант осуществления 26: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-25, где вирус кодирует YB-1.
Вариант осуществления 27: Комбинация по варианту осуществления 26, где ген, кодирующий YB-1, находится под контролем тканеспецифического промотора, опухолеспецифического промотора и/или YB-1 зависимого промотора.
Вариант осуществления 28: Комбинация по варианту осуществления 27, где YB-1 зависимым промотором является аденовирусный Е2-поздний промотор.
Вариант осуществления 29: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-28, где ингибитор CDK4/6 представляет собой соединение, которое снижает фосфорилирование Rb в клетке, предпочтительно, в опухолевой клетке.
Вариант осуществления 30: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-29, где ингибитор CDK4/6 представляет собой соединение, которое уменьшает экспрессию Rb в клетке, предпочтительно, в опухолевой клетке.
Вариант осуществления 31: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-30, где ингибитор CDK4/6 выбран из группы, включающей палбоциклиб, который также упоминается как PD 0332991, абемациклиб, который также упоминается как LY-2835219, рибоциклиб, который также упоминается как LEE011, трилациклиб, который также упоминается как G1T28, и динациклиб.
Вариант осуществления 32: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-31, где ингибитор CDK4/6 вызывает арест G1 в клетке и ингибирует E2F1.
Вариант осуществления 33: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-32, где композиция дополнительно содержит ингибитор PARP.
Вариант осуществления 34: Комбинация по варианту осуществления 33, где ингибитор PARP выбран из группы, включающей олапариб, велипариб, рукапариб и BMN673.
Вариант осуществления 35: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-32, где композиция дополнительно содержит ингибитор бромодомена.
Вариант осуществления 36: Комбинация по варианту осуществления 35, где ингибитор бромодомена выбран из группы, включающей JQ1, OTX-015, I-BET151, CPI-0610, I-BET762, CPI203, PFI-1 и MS 436.
Вариант осуществления 37: Комбинация по любому из вариантов осуществления 1-36, где компоненты комбинации предназначены для отдельного введения.
Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, также решается во втором аспекте, который также является первым вариантом осуществления такого второго аспекта, посредством комбинации в соответствии с первым аспектом, включая любые ее варианты осуществления, для применения в лечении заболеваний, более предпочтительно, опухоли или злокачественного новообразования, содержащей аденовирус и ингибитор CDK4/6.
Далее раскрываются дополнительные варианты осуществления такого второго аспекта.
Вариант осуществления 1: Комбинация, содержащая аденовирус и ингибитор CDK4/6 для применения в способе лечения и/или предупреждения заболевания, предпочтительно, опухоли или злокачественного новообразования.
Вариант осуществления 2: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 1, где аденовирусом является онколитический аденовирус.
Вариант осуществления 3: Комбинация для применения в соответствии с одним из вариантов осуществления 1 и 2, где аденовирус реплицируется YB-1-зависимым образом.
Вариант осуществления 4: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 3, где аденовирус является дефицитным по репликации в клетках, не содержащих YB-1 в ядре, но реплицируется в клетках, которые содержат YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 5: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 2-4, где аденовирус кодирует онкогенный белок, где онкогенный белок трансактивирует по меньшей мере один аденовирусный ген, причем аденовирусный ген выбран из группы, включающей E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 и E3ADP.
Вариант осуществления 6: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 5, где онкогенным белком является белок E1A.
Вариант осуществления 7: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 6, где белок E1A способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 8: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 6, где белок E1A не способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 9: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 6-8, где белок E1A не вызывает локализацию YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 10: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 5-9, где онкогенный белок демонстрирует одну или несколько мутаций или делеций по сравнению с белком онкогена E1A дикого типа.
Вариант осуществления 11: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 10, где делеция выбрана из группы, включающей делеции фрагментов CR3 и делеции N-конца и делеции C-конца.
Вариант осуществления 12: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 6-11, где белок E1A способен связываться с Rb.
Вариант осуществления 13: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 6-12, где белок E1A содержит одну или несколько мутаций или делеций по сравнению с онкогенным белком дикого типа, причем делеция, предпочтительно, является делецией в области CR1 и/или области CR2.
Вариант осуществления 14: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 13, где белок E1A не способен связываться с Rb.
Вариант осуществления 15: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-14, где вирусом является аденовирус, экспрессирующий белок E1A12S.
Вариант осуществления 16: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-15, где вирусом является аденовирус, не экспрессирующий белок E1A13S.
Вариант осуществления 17: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-16, где вирусом является аденовирус, не содержащий функционально активную аденовирусную область E3.
Вариант осуществления 18: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-17, где вирусом является аденовирус, не экспрессирующий белок E1B 19 кДа.
Вариант осуществления 19: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-18, где вирусом является аденовирус, экспрессирующий RGD-мотив на волокне.
Вариант осуществления 20: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-19, где вирусом является аденовирус серотипа 5.
Вариант осуществления 21: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-20, где аденовирус выбран из группы, включающий XVir-N-31, dl520, AdΔ24, AdΔ24-RGD, dl922-947, E1Ad/01/07, dl1119/1131, CB 016, VCN-01, E1Adl1107, E1Adl1101, ORCA-010, Enadenotucirev и вирусы без экспрессированного вирусного онкогена, способный связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 22: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 21, где аденовирусом является XVir-N-31.
Вариант осуществления 23: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 21, где аденовирусом является dl520, и где аденовирусная область E3 является функционально неактивной.
Вариант осуществления 24: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 21-23, где аденовирусом является dl520, и где в dl520 отсутствует экспрессия белка E1B 19 кДа.
Вариант осуществления 25: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 21-24, где аденовирусом является dl520, экспрессирующий RGD-мотив на волокне.
Вариант осуществления 26: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-25, где вирус кодирует YB-1.
Вариант осуществления 27: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 26, где ген, кодирующий YB-1, находится под контролем тканеспецифического промотора, опухолеспецифического промотора и/или YB-1 зависимого промотора.
Вариант осуществления 28: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 27, где YB-1 зависимым промотором является аденовирусный Е2-поздний промотор.
Вариант осуществления 29: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-28, где ингибитор CDK4/6 представляет собой соединение, которое снижает фосфорилирование Rb в клетке, предпочтительно, в опухолевой клетке.
Вариант осуществления 30: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-29, где ингибитор CDK4/6 представляет собой соединение, которое уменьшает экспрессию Rb в клетке, предпочтительно, в опухолевой клетке.
Вариант осуществления 31: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-30, где ингибитор CDK4/6 выбран из группы, включающей палбоциклиб, который также упоминается как PD 0332991, абемациклиб, который также упоминается как LY-2835219, рибоциклиб, который также упоминается как LEE011, трилациклиб, который также упоминается как G1T28, и динациклиб.
Вариант осуществления 32: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-31, где ингибитор CDK4/6 вызывает арест G1 в клетке и ингибирует E2F1.
Вариант осуществления 33: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-32, где композиция дополнительно содержит ингибитор PARP.
Вариант осуществления 34: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 33, где ингибитор PARP выбран из группы, включающей олапариб, велипариб, рукапариб и BMN673.
Вариант осуществления 35: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-32, где композиция дополнительно содержит ингибитор бромодомена.
Вариант осуществления 36: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 35, где ингибитор бромодомена выбран из группы, включающей JQ1, OTX-015, I-BET151, CPI-0610, I-BET762, CPI203, PFI-1 и MS 436.
Вариант осуществления 37: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-36, где компоненты комбинации предназначены для отдельного введения.
Вариант осуществления 38: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-37, где клетки опухоли имеют нарушение сигнального пути CDK4/6.
Вариант осуществления 39: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют неконтролируемый переход G1-S клеточного цикла.
Вариант осуществления 40: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют потерю функцию мутации или делеции в гене, выбранном из группы, включающей ген RB1, ген CDKN2A и ген CDKN2B.
Вариант осуществления 41: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют амплификацию гена и/или активирующую мутацию гена.
Вариант осуществления 42: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 41, где ген выбран из группы, включающей CCND1, E2F1, E2F2, E2F3, CDK4 и CDK6.
Вариант осуществления 43: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 41, где ген является геном, кодирующим компонент митогенного сигнального пути.
Вариант осуществления 44. Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 43, где митогенный сигнальный путь выбран из группы, включающей сигнальный путь PI3K и сигнальный путь MAPK.
Вариант осуществления 45. Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-44, где клетки опухолевых клеток обладают устойчивостью к одному или нескольким фармацевтически активным агентам и/или к радиации или нечувствительны к ним.
Вариант осуществления 46: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 45, где фармацевтически активный агент является цитостатическим.
Вариант осуществления 47: Комбинация для применения по п.46, где резистентность опосредована транспортером ABC.
Вариант осуществления 48: Комбинация для применения по п.47, где транспортер ABC выбран из группы, включающей MRP и MDR, в частности, MDR-1.
Вариант осуществления 49: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 45-48, где резистентность представляет собой множественную резистентность или полирезистентность, в частности, мульти- или полирезистентность в отношении цитостатиков и/или излучения.
Вариант осуществления 50: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-49, где клетки опухоли являются Rb-позитивными.
Вариант осуществления 51: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-50, где клетки опухоли содержат YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 52: Комбинация для применения по любому из вариантов осуществления 1-51, где клетки опухоли содержат YB-1 в ядре после индукции.
Вариант осуществления 53: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 52, где транспорт YB-1 в ядре запускается по меньшей мере одним действием, выбранным из группы, включающей облучение, введение цитостатиков и гипертермию.
Вариант осуществления 54: Комбинация для применения в соответствии с вариантом осуществления 53, где действие применяется к клетке, органу или организму, предпочтительно, к организму, который в этом нуждается, более предпочтительно, к организму, страдающему опухолью.
Вариант осуществления 55: Комбинация для применения по любому из пп.1-54, где опухоль выбрана из группы, включающей рак мочевого пузыря, рак молочной железы, метастатический рак молочной железы (mBC), меланому, глиому, рак поджелудочной железы, гепатоцеллюлярную карциному, аденокарциному легкого, саркому, рак яичников, рак почек, рак предстательной железы и лейкоз.
Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, также решается в третьем аспекте, который также является первым вариантом осуществления такого третьего аспекта, посредством аденовируса для применения в лечении и/или профилактике заболеваний у субъекта, более предпочтительно, опухоли или злокачественного новообразования, где способ включает введение субъекту аденовируса и ингибитора CDK4/6.
Далее раскрываются дополнительные варианты осуществления такого третьего аспекта.
Вариант осуществления 2: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 1, где аденовирусом является онколитический аденовирус.
Вариант осуществления 3: Аденовирус для применения в соответствии с одним из вариантов осуществления 1 и 2, где аденовирус реплицируется YB-1-зависимым образом.
Вариант осуществления 4: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 3, где аденовирус является дефицитным по репликации в клетках, не содержащих YB-1 в ядре, но реплицируется в клетках, которые содержат YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 5: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 2-4, где аденовирус кодирует онкогенный белок, где онкогенный белок трансактивирует по меньшей мере один аденовирусный ген, причем аденовирусный ген выбран из группы, включающей E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 и E3ADP.
Вариант осуществления 6: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 5, где онкогенным белком является белок E1A.
Вариант осуществления 7: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 6, где белок E1A способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 8: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 6, где белок E1A не способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 9: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 6-8, где белок E1A не вызывает локализацию YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 10: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 5-9, где онкогенный белок демонстрирует одну или несколько мутаций или делеций по сравнению с белком онкогена E1A дикого типа.
Вариант осуществления 11: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 10, где делеция выбрана из группы, включающей делеции фрагментов CR3 и делеции N-конца и делеции C-конца.
Вариант осуществления 12: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 6-11, где белок E1A способен связываться с Rb.
Вариант осуществления 13: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 6-12, где белок E1A содержит одну или несколько мутаций или делеций по сравнению с онкогенным белком дикого типа, причем делеция, предпочтительно, является делецией в области CR1 и/или области CR2.
Вариант осуществления 14: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 13, где белок E1A не способен связываться с Rb.
Вариант осуществления 15: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-14, где вирусом является аденовирус, экспрессирующий белок E1A12S.
Вариант осуществления 16: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-15, где вирусом является аденовирус, не экспрессирующий белок E1A13S.
Вариант осуществления 17: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-16, где вирусом является аденовирус, не содержащий функционально активную аденовирусную область E3.
Вариант осуществления 18: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-17, где вирусом является аденовирус, не экспрессирующий белок E1B 19 кДа.
Вариант осуществления 19: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-18, где вирусом является аденовирус, экспрессирующий RGD-мотив на волокне.
Вариант осуществления 20: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-19, где вирусом является аденовирус серотипа 5.
Вариант осуществления 21: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-20, где аденовирус выбран из группы, включающий XVir-N-31, dl520, AdΔ24, AdΔ24-RGD, dl922-947, E1Ad/01/07, dl1119/1131, CB 016, VCN-01, E1Adl1107, E1Adl1101, ORCA-010, Enadenotucirev и вирусы без экспрессированного вирусного онкогена, способный связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 22: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 21, где аденовирусом является XVir-N-31.
Вариант осуществления 23: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 21, где аденовирусом является dl520, и где аденовирусная область E3 является функционально неактивной.
Вариант осуществления 24: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 21-23, где аденовирусом является dl520, и где в dl520 отсутствует экспрессия белка E1B 19 кДа.
Вариант осуществления 25: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 21-24, где аденовирусом является dl520, экспрессирующий RGD-мотив на волокне.
Вариант осуществления 26: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-25, где вирус кодирует YB-1.
Вариант осуществления 27: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 26, где ген, кодирующий YB-1, находится под контролем тканеспецифического промотора, опухолеспецифического промотора и/или YB-1 зависимого промотора.
Вариант осуществления 28: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 27, где YB-1 зависимым промотором является аденовирусный Е2-поздний промотор.
Вариант осуществления 29: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-28, где ингибитор CDK4/6 представляет собой соединение, которое снижает фосфорилирование Rb в клетке, предпочтительно, в опухолевой клетке.
Вариант осуществления 30: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-29, где ингибитор CDK4/6 представляет собой соединение, которое уменьшает экспрессию Rb в клетке, предпочтительно, в опухолевой клетке.
Вариант осуществления 31: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-30, где ингибитор CDK4/6 выбран из группы, включающей палбоциклиб, который также упоминается как PD 0332991, абемациклиб, который также упоминается как LY-2835219, рибоциклиб, который также упоминается как LEE011, трилациклиб, который также упоминается как G1T28, и динациклиб.
Вариант осуществления 32: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-31, где ингибитор CDK4/6 вызывает арест G1 в клетке и ингибирует E2F1.
Вариант осуществления 33: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-32, где способ дополнительно включает введение субъекту ингибитора PARP.
Вариант осуществления 34: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 33, где ингибитор PARP выбран из группы, включающей олапариб, велипариб, рукапариб и BMN673.
Вариант осуществления 35: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-32, где способ дополнительно включает введение субъекту ингибитора бромодомена.
Вариант осуществления 36: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 35, где ингибитор бромодомена выбран из группы, включающей JQ1, OTX-015, I-BET151, CPI-0610, I-BET762, CPI203, PFI-1 и MS 436.
Вариант осуществления 37: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-36, где аденовирус, ингибитор CDK4/6, ингибитор PARP и/или ингибитор бромодомена вводятся субъекту отдельно или в виде комбинации.
Вариант осуществления 38: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-37, где клетки опухоли имеют нарушение сигнального пути CDK4/6.
Вариант осуществления 39: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют неконтролируемый переход G1-S клеточного цикла.
Вариант осуществления 40: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют потерю функцию мутации или делеции в гене, выбранном из группы, включающей ген RB1, ген CDKN2A и ген CDKN2B.
Вариант осуществления 41: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют амплификацию гена и/или активирующую мутацию гена.
Вариант осуществления 42: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 41, где ген выбран из группы, включающей CCND1, E2F1, E2F2, E2F3, CDK4 и CDK6.
Вариант осуществления 43: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 41, где ген является геном, кодирующим компонент митогенного сигнального пути.
Вариант осуществления 44. Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 43, где митогенный сигнальный путь выбран из группы, включающей сигнальный путь PI3K и сигнальный путь MAPK.
Вариант осуществления 45. Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-44, где клетки опухолевых клеток обладают устойчивостью к одному или нескольким фармацевтически активным агентам и/или к радиации или нечувствительны к ним.
Вариант осуществления 46: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 45, где фармацевтически активный агент является цитостатическим.
Вариант осуществления 47: Аденовирус для применения по п.46, где резистентность опосредована транспортером ABC.
Вариант осуществления 48: Аденовирус для применения по п.47, где транспортер ABC выбран из группы, включающей MRP и MDR, в частности, MDR-1.
Вариант осуществления 49: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 45-48, где резистентность представляет собой множественную резистентность или полирезистентность, в частности, мульти- или полирезистентность в отношении цитостатиков и/или излучения.
Вариант осуществления 50: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-49, где клетки опухоли являются Rb-позитивными.
Вариант осуществления 51: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-50, где клетки опухоли содержат YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 52: Аденовирус для применения по любому из вариантов осуществления 1-51, где клетки опухоли содержат YB-1 в ядре после индукции.
Вариант осуществления 53: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 52, где транспорт YB-1 в ядре запускается по меньшей мере одним действием, выбранным из группы, включающей облучение, введение цитостатиков и гипертермию.
Вариант осуществления 54: Аденовирус для применения в соответствии с вариантом осуществления 53, где действие применяется к клетке, органу или организму, предпочтительно, к организму, который в этом нуждается, более предпочтительно, к организму, страдающему опухолью.
Вариант осуществления 55: Аденовирус для применения по любому из пп.1-54, где опухоль выбрана из группы, включающей рак мочевого пузыря, рак молочной железы, метастатический рак молочной железы (mBC), меланому, глиому, рак поджелудочной железы, гепатоцеллюлярную карциному, аденокарциному легкого, саркому, рак яичников, рак почек, рак предстательной железы и лейкоз.
Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, также решается в четвертом аспекте, который также является первым вариантом осуществления такого четвертого аспекта, посредством ингибитора CDK4/6 для применения в лечении и/или профилактике заболеваний у субъекта, более предпочтительно, опухоли или злокачественного новообразования, где способ включает введение субъекту аденовируса и ингибитора CDK4/6.
Далее раскрываются дополнительные варианты осуществления такого четвертого аспекта.
Вариант осуществления 2: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 1, где аденовирусом является онколитический аденовирус.
Вариант осуществления 3: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с одним из вариантов осуществления 1 и 2, где аденовирус реплицируется YB-1-зависимым образом.
Вариант осуществления 4: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 3, где аденовирус является дефицитным по репликации в клетках, не содержащих YB-1 в ядре, но реплицируется в клетках, которые содержат YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 5: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 2-4, где аденовирус кодирует онкогенный белок, где онкогенный белок трансактивирует по меньшей мере один аденовирусный ген, причем аденовирусный ген выбран из группы, включающей E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 и E3ADP.
Вариант осуществления 6: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 5, где онкогенным белком является белок E1A.
Вариант осуществления 7: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 6, где белок E1A способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 8: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 6, где белок E1A не способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 9: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 6-8, где белок E1A не вызывает локализацию YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 10: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 5-9, где онкогенный белок демонстрирует одну или несколько мутаций или делеций по сравнению с белком онкогена E1A дикого типа.
Вариант осуществления 11: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 10, где делеция выбрана из группы, включающей делеции фрагментов CR3 и делеции N-конца и делеции C-конца.
Вариант осуществления 12: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 6-11, где белок E1A способен связываться с Rb.
Вариант осуществления 13: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 6-12, где белок E1A содержит одну или несколько мутаций или делеций по сравнению с онкогенным белком дикого типа, причем делеция, предпочтительно, является делецией в области CR1 и/или области CR2.
Вариант осуществления 14: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 13, где белок E1A не способен связываться с Rb.
Вариант осуществления 15: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-14, где вирусом является аденовирус, экспрессирующий белок E1A12S.
Вариант осуществления 16: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-15, где вирусом является аденовирус, не экспрессирующий белок E1A13S.
Вариант осуществления 17: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-16, где вирусом является аденовирус, не содержащий функционально активную аденовирусную область E3.
Вариант осуществления 18: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-17, где вирусом является аденовирус, не экспрессирующий белок E1B 19 кДа.
Вариант осуществления 19: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-18, где вирусом является аденовирус, экспрессирующий RGD-мотив на волокне.
Вариант осуществления 20: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-19, где вирусом является аденовирус серотипа 5.
Вариант осуществления 21: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-20, где аденовирус выбран из группы, включающий XVir-N-31, dl520, AdΔ24, AdΔ24-RGD, dl922-947, E1Ad/01/07, dl1119/1131, CB 016, VCN-01, E1Adl1107, E1Adl1101, ORCA-010, Enadenotucirev и вирусы без экспрессированного вирусного онкогена, способный связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 22: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 21, где аденовирусом является XVir-N-31.
Вариант осуществления 23: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 21, где аденовирусом является dl520, и где аденовирусная область E3 является функционально неактивной.
Вариант осуществления 24: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 21-23, где аденовирусом является dl520, и где в dl520 отсутствует экспрессия белка E1B 19 кДа.
Вариант осуществления 25: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 21-24, где аденовирусом является dl520, экспрессирующий RGD-мотив на волокне.
Вариант осуществления 26: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-25, где вирус кодирует YB-1.
Вариант осуществления 27: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 26, где ген, кодирующий YB-1, находится под контролем тканеспецифического промотора, опухолеспецифического промотора и/или YB-1 зависимого промотора.
Вариант осуществления 28: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 27, где YB-1 зависимым промотором является аденовирусный Е2-поздний промотор.
Вариант осуществления 29: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-28, где ингибитор CDK4/6 представляет собой соединение, которое снижает фосфорилирование Rb в клетке, предпочтительно, в опухолевой клетке.
Вариант осуществления 30: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-29, где ингибитор CDK4/6 представляет собой соединение, которое уменьшает экспрессию Rb в клетке, предпочтительно, в опухолевой клетке.
Вариант осуществления 31: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-30, где ингибитор CDK4/6 выбран из группы, включающей палбоциклиб, который также упоминается как PD 0332991, абемациклиб, который также упоминается как LY-2835219, рибоциклиб, который также упоминается как LEE011, трилациклиб, который также упоминается как G1T28, и динациклиб.
Вариант осуществления 32: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-31, где ингибитор CDK4/6 вызывает арест G1 в клетке и ингибирует E2F1.
Вариант осуществления 33: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-32, где способ дополнительно включает введение субъекту ингибитора PARP.
Вариант осуществления 34: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 33, где ингибитор PARP выбран из группы, включающей олапариб, велипариб, рукапариб и BMN673.
Вариант осуществления 35: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-32, где способ дополнительно включает введение субъекту ингибитора бромодомена.
Вариант осуществления 36: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 35, где ингибитор бромодомена выбран из группы, включающей JQ1, OTX-015, I-BET151, CPI-0610, I-BET762, CPI203, PFI-1 и MS 436.
Вариант осуществления 37: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-36, где аденовирус, ингибитор CDK4/6, ингибитор PARP и/или ингибитор бромодомена вводятся субъекту отдельно или в виде комбинации.
Вариант осуществления 38: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-37, где клетки опухоли имеют нарушение сигнального пути CDK4/6.
Вариант осуществления 39: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют неконтролируемый переход G1-S клеточного цикла.
Вариант осуществления 40: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют потерю функцию мутации или делеции в гене, выбранном из группы, включающей ген RB1, ген CDKN2A и ген CDKN2B.
Вариант осуществления 41: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют амплификацию гена и/или активирующую мутацию гена.
Вариант осуществления 42: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 41, где ген выбран из группы, включающей CCND1, E2F1, E2F2, E2F3, CDK4 и CDK6.
Вариант осуществления 43: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 41, где ген является геном, кодирующим компонент митогенного сигнального пути.
Вариант осуществления 44. Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 43, где митогенный сигнальный путь выбран из группы, включающей сигнальный путь PI3K и сигнальный путь MAPK.
Вариант осуществления 45. Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-44, где клетки опухолевых клеток обладают устойчивостью к одному или нескольким фармацевтически активным агентам и/или к радиации или нечувствительны к ним.
Вариант осуществления 46: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 45, где фармацевтически активный агент является цитостатическим.
Вариант осуществления 47: Ингибитор CDK4/6 для применения по п.46, где резистентность опосредована транспортером ABC.
Вариант осуществления 48: Ингибитор CDK4/6 для применения по п.47, где транспортер ABC выбран из группы, включающей MRP и MDR, в частности, MDR-1.
Вариант осуществления 49: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 45-48, где резистентность представляет собой множественную резистентность или полирезистентность, в частности, мульти- или полирезистентность в отношении цитостатиков и/или излучения.
Вариант осуществления 50: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-49, где клетки опухоли являются Rb-позитивными.
Вариант осуществления 51: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-50, где клетки опухоли содержат YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 52: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из вариантов осуществления 1-51, где клетки опухоли содержат YB-1 в ядре после индукции.
Вариант осуществления 53: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 52, где транспорт YB-1 в ядре запускается по меньшей мере одним действием, выбранным из группы, включающей облучение, введение цитостатиков и гипертермию.
Вариант осуществления 54: Ингибитор CDK4/6 для применения в соответствии с вариантом осуществления 53, где действие применяется к клетке, органу или организму, предпочтительно, к организму, который в этом нуждается, более предпочтительно, к организму, страдающему опухолью.
Вариант осуществления 55: Ингибитор CDK4/6 для применения по любому из пп.1-54, где опухоль выбрана из группы, включающей рак мочевого пузыря, рак молочной железы, метастатический рак молочной железы (mBC), меланому, глиому, рак поджелудочной железы, гепатоцеллюлярную карциному, аденокарциному легкого, саркому, рак яичников, рак почек, рак предстательной железы и лейкоз.
Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, также решается в пятом аспекте, который также является первым вариантом осуществления такого пятого аспекта, посредством ингибитора PARP для применения в лечении и/или профилактике заболеваний у субъекта, более предпочтительно, опухоли или злокачественного новообразования, где способ включает введение субъекту аденовируса, ингибитора CDK4/6 и ингибитора PARP.
Далее раскрываются дополнительные варианты осуществления такого пятого аспекта.
Вариант осуществления 2: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 1, где аденовирусом является онколитический аденовирус.
Вариант осуществления 3: Ингибитор PARP для применения в соответствии с одним из вариантов осуществления 1 и 2, где аденовирус реплицируется YB-1-зависимым образом.
Вариант осуществления 4: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 3, где аденовирус является дефицитным по репликации в клетках, не содержащих YB-1 в ядре, но реплицируется в клетках, которые содержат YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 5: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 2-4, где аденовирус кодирует онкогенный белок, где онкогенный белок трансактивирует по меньшей мере один аденовирусный ген, причем аденовирусный ген выбран из группы, включающей E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 и E3ADP.
Вариант осуществления 6: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 5, где онкогенным белком является белок E1A.
Вариант осуществления 7: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 6, где белок E1A способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 8: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 6, где белок E1A не способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 9: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 6-8, где белок E1A не вызывает локализацию YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 10: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 5-9, где онкогенный белок демонстрирует одну или несколько мутаций или делеций по сравнению с белком онкогена E1A дикого типа.
Вариант осуществления 11: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 10, где делеция выбрана из группы, включающей делеции фрагментов CR3 и делеции N-конца и делеции C-конца.
Вариант осуществления 12: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 6-11, где белок E1A способен связываться с Rb.
Вариант осуществления 13: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 6-12, где белок E1A содержит одну или несколько мутаций или делеций по сравнению с онкогенным белком дикого типа, причем делеция, предпочтительно, является делецией в области CR1 и/или области CR2.
Вариант осуществления 14: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 13, где белок E1A не способен связываться с Rb.
Вариант осуществления 15: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-14, где вирусом является аденовирус, экспрессирующий белок E1A12S.
Вариант осуществления 16: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-15, где вирусом является аденовирус, не экспрессирующий белок E1A13S.
Вариант осуществления 17: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-16, где вирусом является аденовирус, не содержащий функционально активную аденовирусную область E3.
Вариант осуществления 18: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-17, где вирусом является аденовирус, не экспрессирующий белок E1B 19 кДа.
Вариант осуществления 19: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-18, где вирусом является аденовирус, экспрессирующий RGD-мотив на волокне.
Вариант осуществления 20: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-19, где вирусом является аденовирус серотипа 5.
Вариант осуществления 21: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-20, где аденовирус выбран из группы, включающий XVir-N-31, dl520, AdΔ24, AdΔ24-RGD, dl922-947, E1Ad/01/07, dl1119/1131, CB 016, VCN-01, E1Adl1107, E1Adl1101, ORCA-010, Enadenotucirev и вирусы без экспрессированного вирусного онкогена, способный связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 22: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 21, где аденовирусом является XVir-N-31.
Вариант осуществления 23: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 21, где аденовирусом является dl520, и где аденовирусная область E3 является функционально неактивной.
Вариант осуществления 24: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 21-23, где аденовирусом является dl520, и где в dl520 отсутствует экспрессия белка E1B 19 кДа.
Вариант осуществления 25: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 21-24, где аденовирусом является dl520, экспрессирующий RGD-мотив на волокне.
Вариант осуществления 26: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-25, где вирус кодирует YB-1.
Вариант осуществления 27: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 26, где ген, кодирующий YB-1, находится под контролем тканеспецифического промотора, опухолеспецифического промотора и/или YB-1 зависимого промотора.
Вариант осуществления 28: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 27, где YB-1 зависимым промотором является аденовирусный Е2-поздний промотор.
Вариант осуществления 29: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-28, где ингибитор CDK4/6 представляет собой соединение, которое снижает фосфорилирование Rb в клетке, предпочтительно, в опухолевой клетке.
Вариант осуществления 30: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-29, где ингибитор CDK4/6 представляет собой соединение, которое уменьшает экспрессию Rb в клетке, предпочтительно, в опухолевой клетке.
Вариант осуществления 31: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-30, где ингибитор CDK4/6 выбран из группы, включающей палбоциклиб, который также упоминается как PD 0332991, абемациклиб, который также упоминается как LY-2835219, рибоциклиб, который также упоминается как LEE011, трилациклиб, который также упоминается как G1T28, и динациклиб.
Вариант осуществления 32: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-31, где ингибитор CDK4/6 вызывает арест G1 в клетке и ингибирует E2F1.
Вариант осуществления 33: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-32, где способ дополнительно включает введение субъекту ингибитора PARP.
Вариант осуществления 34: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 33, где ингибитор PARP выбран из группы, включающей олапариб, велипариб, рукапариб и BMN673.
Вариант осуществления 35: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-32, где способ дополнительно включает введение субъекту ингибитора бромодомена.
Вариант осуществления 36: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 35, где ингибитор бромодомена выбран из группы, включающей JQ1, OTX-015, I-BET151, CPI-0610, I-BET762, CPI203, PFI-1 и MS 436.
Вариант осуществления 37: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-36, где аденовирус, ингибитор CDK4/6, ингибитор PARP и/или ингибитор бромодомена вводятся субъекту отдельно или в виде комбинации.
Вариант осуществления 38: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-37, где клетки опухоли имеют нарушение сигнального пути CDK4/6.
Вариант осуществления 39: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют неконтролируемый переход G1-S клеточного цикла.
Вариант осуществления 40: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют потерю функцию мутации или делеции в гене, выбранном из группы, включающей ген RB1, ген CDKN2A и ген CDKN2B.
Вариант осуществления 41: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют амплификацию гена и/или активирующую мутацию гена.
Вариант осуществления 42: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 41, где ген выбран из группы, включающей CCND1, E2F1, E2F2, E2F3, CDK4 и CDK6.
Вариант осуществления 43: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 41, где ген является геном, кодирующим компонент митогенного сигнального пути.
Вариант осуществления 44. Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 43, где митогенный сигнальный путь выбран из группы, включающей сигнальный путь PI3K и сигнальный путь MAPK.
Вариант осуществления 45. Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-44, где клетки опухолевых клеток обладают устойчивостью к одному или нескольким фармацевтически активным агентам и/или к радиации или нечувствительны к ним.
Вариант осуществления 46: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 45, где фармацевтически активный агент является цитостатическим.
Вариант осуществления 47: Ингибитор PARP для применения по п.46, где резистентность опосредована транспортером ABC.
Вариант осуществления 48: Ингибитор PARP для применения по п.47, где транспортер ABC выбран из группы, включающей MRP и MDR, в частности, MDR-1.
Вариант осуществления 49: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 45-48, где резистентность представляет собой множественную резистентность или полирезистентность, в частности, мульти- или полирезистентность в отношении цитостатиков и/или излучения.
Вариант осуществления 50: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-49, где клетки опухоли являются Rb-позитивными.
Вариант осуществления 51: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-50, где клетки опухоли содержат YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 52: Ингибитор PARP для применения по любому из вариантов осуществления 1-51, где клетки опухоли содержат YB-1 в ядре после индукции.
Вариант осуществления 53: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 52, где транспорт YB-1 в ядре запускается по меньшей мере одним действием, выбранным из группы, включающей облучение, введение цитостатиков и гипертермию.
Вариант осуществления 54: Ингибитор PARP для применения в соответствии с вариантом осуществления 53, где действие применяется к клетке, органу или организму, предпочтительно, к организму, который в этом нуждается, более предпочтительно, к организму, страдающему опухолью.
Вариант осуществления 55: Ингибитор PARP для применения по любому из пунктов 1-54, где опухоль выбрана из группы, включающей рак мочевого пузыря, рак молочной железы, метастатический рак молочной железы (mBC), меланому, глиому, рак поджелудочной железы, гепатоцеллюлярную карциному, аденокарциному легкого, саркому, рак яичников, рак почек, рак предстательной железы и лейкоз.
Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, решается в шестом аспекте, который также является первым вариантом осуществления такого шестого аспекта, посредством ингибитора бромодомена для применения в лечении и/или профилактике заболеваний у субъекта, более предпочтительно, опухоли или злокачественного новообразования, где способ включает введение субъекту аденовируса, ингибитора CDK4/6 и ингибитора бромодомена.
Далее раскрываются дополнительные варианты осуществления такого шестого аспекта.
Вариант осуществления 2: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 1, где аденовирусом является онколитический аденовирус.
Вариант осуществления 3: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с одним из вариантов осуществления 1 и 2, где аденовирус реплицируется YB-1-зависимым образом.
Вариант осуществления 4: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 3, где аденовирус является дефицитным по репликации в клетках, не содержащих YB-1 в ядре, но реплицируется в клетках, которые содержат YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 5: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 2-4, где аденовирус кодирует онкогенный белок, где онкогенный белок трансактивирует по меньшей мере один аденовирусный ген, причем аденовирусный ген выбран из группы, включающей E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 и E3ADP.
Вариант осуществления 6: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 5, где онкогенным белком является белок E1A.
Вариант осуществления 7: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 6, где белок E1A способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 8: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 6, где белок E1A не способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 9: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 6-8, где белок E1A не вызывает локализацию YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 10: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 5-9, где онкогенный белок демонстрирует одну или несколько мутаций или делеций по сравнению с белком онкогена E1A дикого типа.
Вариант осуществления 11: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 10, где делеция выбрана из группы, включающей делеции фрагментов CR3 и делеции N-конца и делеции C-конца.
Вариант осуществления 12: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 6-11, где белок E1A способен связываться с Rb.
Вариант осуществления 13: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 6-12, где белок E1A содержит одну или несколько мутаций или делеций по сравнению с онкогенным белком дикого типа, причем делеция, предпочтительно, является делецией в области CR1 и/или области CR2.
Вариант осуществления 14: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 13, где белок E1A не способен связываться с Rb.
Вариант осуществления 15: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-14, где вирусом является аденовирус, экспрессирующий белок E1A12S.
Вариант осуществления 16: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-15, где вирусом является аденовирус, не экспрессирующий белок E1A13S.
Вариант осуществления 17: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-16, где вирусом является аденовирус, не содержащий функционально активную аденовирусную область E3.
Вариант осуществления 18: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-17, где вирусом является аденовирус, не экспрессирующий белок E1B 19 кДа.
Вариант осуществления 19: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-18, где вирусом является аденовирус, экспрессирующий RGD-мотив на волокне.
Вариант осуществления 20: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-19, где вирусом является аденовирус серотипа 5.
Вариант осуществления 21: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-20, где аденовирус выбран из группы, включающий XVir-N-31, dl520, AdΔ24, AdΔ24-RGD, dl922-947, E1Ad/01/07, dl1119/1131, CB 016, VCN-01, E1Adl1107, E1Adl1101, ORCA-010, Enadenotucirev и вирусы без экспрессированного вирусного онкогена, способный связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 22: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 21, где аденовирусом является XVir-N-31.
Вариант осуществления 23: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 21, где аденовирусом является dl520, и где аденовирусная область E3 является функционально неактивной.
Вариант осуществления 24: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 21-23, где аденовирусом является dl520, и где в dl520 отсутствует экспрессия белка E1B 19 кДа.
Вариант осуществления 25: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 21-24, где аденовирусом является dl520, экспрессирующий RGD-мотив на волокне.
Вариант осуществления 26: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-25, где вирус кодирует YB-1.
Вариант осуществления 27: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 26, где ген, кодирующий YB-1, находится под контролем тканеспецифического промотора, опухолеспецифического промотора и/или YB-1 зависимого промотора.
Вариант осуществления 28: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 27, где YB-1 зависимым промотором является аденовирусный Е2-поздний промотор.
Вариант осуществления 29: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-28, где ингибитор CDK4/6 представляет собой соединение, которое снижает фосфорилирование Rb в клетке, предпочтительно, в опухолевой клетке.
Вариант осуществления 30: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-29, где ингибитор CDK4/6 представляет собой соединение, которое уменьшает экспрессию Rb в клетке, предпочтительно, в опухолевой клетке.
Вариант осуществления 31: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-30, где ингибитор CDK4/6 выбран из группы, включающей палбоциклиб, который также упоминается как PD 0332991, абемациклиб, который также упоминается как LY-2835219, рибоциклиб, который также упоминается как LEE011, трилациклиб, который также упоминается как G1T28 и динациклиб.
Вариант осуществления 32: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-31, где ингибитор CDK4/6 вызывает арест G1 в клетке и ингибирует E2F1.
Вариант осуществления 33: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-32, где способ дополнительно включает введение субъекту ингибитора PARP.
Вариант осуществления 34: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 33, где ингибитор PARP выбран из группы, включающей олапариб, велипариб, рукапариб и BMN673.
Вариант осуществления 35: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-32, где способ дополнительно включает введение субъекту ингибитора бромодомена.
Вариант осуществления 36: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 35, где ингибитор бромодомена выбран из группы, включающей JQ1, OTX-015, I-BET151, CPI-0610, I-BET762, CPI203, PFI-1 и MS 436.
Вариант осуществления 37: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-36, где аденовирус, ингибитор CDK4/6, ингибитор PARP и/или ингибитор бромодомена вводятся субъекту отдельно или в виде комбинации.
Вариант осуществления 38: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-37, где клетки опухоли имеют нарушение сигнального пути CDK4/6.
Вариант осуществления 39: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют неконтролируемый переход G1-S клеточного цикла.
Вариант осуществления 40: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют потерю функцию мутации или делеции в гене, выбранном из группы, включающей ген RB1, ген CDKN2A и ген CDKN2B.
Вариант осуществления 41: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют амплификацию гена и/или активирующую мутацию гена.
Вариант осуществления 42: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 41, где ген выбран из группы, включающей CCND1, E2F1, E2F2, E2F3, CDK4 и CDK6.
Вариант осуществления 43: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 41, где ген является геном, кодирующим компонент митогенного сигнального пути.
Вариант осуществления 44. Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 43, где митогенный сигнальный путь выбран из группы, включающей сигнальный путь PI3K и сигнальный путь MAPK.
Вариант осуществления 45. Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-44, где клетки опухолевых клеток обладают устойчивостью к одному или нескольким фармацевтически активным агентам и/или к радиации или нечувствительны к ним.
Вариант осуществления 46: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 45, где фармацевтически активный агент является цитостатическим.
Вариант осуществления 47: Ингибитор бромодомена для применения по п.46, где резистентность опосредована транспортером ABC.
Вариант осуществления 48: Ингибитор бромодомена для применения по п.47, где транспортер ABC выбран из группы, включающей MRP и MDR, в частности, MDR-1.
Вариант осуществления 49: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 45-48, где резистентность представляет собой множественную резистентность или полирезистентность, в частности, мульти- или полирезистентность в отношении цитостатиков и/или излучения.
Вариант осуществления 50: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-49, где клетки опухоли являются Rb-позитивными.
Вариант осуществления 51: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-50, где клетки опухоли содержат YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 52: Ингибитор бромодомена для применения по любому из вариантов осуществления 1-51, где клетки опухоли содержат YB-1 в ядре после индукции.
Вариант осуществления 53: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 52, где транспорт YB-1 в ядре запускается по меньшей мере одним действием, выбранным из группы, включающей облучение, введение цитостатиков и гипертермию.
Вариант осуществления 54: Ингибитор бромодомена для применения в соответствии с вариантом осуществления 53, где действие применяется к клетке, органу или организму, предпочтительно, к организму, который в этом нуждается, более предпочтительно, к организму, страдающему опухолью.
Вариант осуществления 55: Ингибитор бромодомена для применения по любому из пп.1-54, где опухоль выбрана из группы, включающей рак мочевого пузыря, рак молочной железы, метастатический рак молочной железы (mBC), меланому, глиому, рак поджелудочной железы, гепатоцеллюлярную карциному, аденокарциному легкого, саркому, рак яичников, рак почек, рак предстательной железы и лейкоз.
Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, решается в седьмом аспекте, который также является первым вариантом осуществления такого седьмого аспекта способа лечения и/или предупреждения заболеваний у субъекта, более предпочтительно, опухоли или злокачественного новообразования, где способ включает введение субъекту аденовируса и ингибитора CDK4/6.
Далее раскрываются дополнительные варианты осуществления такого седьмого аспекта.
Вариант осуществления 2: Способ в соответствии с вариантом осуществления 1, где аденовирусом является онколитический аденовирус.
Вариант осуществления 3: Способ по любому из вариантов осуществления 1 и 2, где аденовирус реплицируется YB-1-зависимым образом.
Вариант осуществления 4: Способ в соответствии с вариантом осуществления 3, где аденовирус является дефицитным по репликации в клетках, не содержащих YB-1 в ядре, но реплицируется в клетках, которые содержат YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 5: Способ по любому из вариантов осуществления 2-4, где аденовирус кодирует онкогенный белок, где онкогенный белок трансактивирует по меньшей мере один аденовирусный ген, причем аденовирусный ген выбран из группы, включающей E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 и E3ADP.
Вариант осуществления 6: Способ в соответствии с вариантом осуществления 5, где онкогенным белком является белок E1A.
Вариант осуществления 7: Способ в соответствии с вариантом осуществления 6, где белок E1A способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 8: Способ в соответствии с вариантом осуществления 6, где белок E1A не способен связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 9: Способ по любому из вариантов осуществления 6-8, где белок E1A не вызывает локализацию YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 10: Способ по любому из вариантов осуществления 5-9, где онкогенный белок демонстрирует одну или несколько мутаций или делеций по сравнению с белком онкогена E1A дикого типа.
Вариант осуществления 11: Способ в соответствии с вариантом осуществления 10, где делеция выбрана из группы, включающей делеции фрагментов CR3 и делеции N-конца и делеции C-конца.
Вариант осуществления 12: Способ по любому из вариантов осуществления 6-11, где белок E1A способен связываться с Rb.
Вариант осуществления 13: Способ по любому из вариантов осуществления 6-12, где белок E1A содержит одну или несколько мутаций или делеций по сравнению с онкогенным белком дикого типа, причем делеция, предпочтительно, является делецией в области CR1 и/или области CR2.
Вариант осуществления 14: Способ в соответствии с вариантом осуществления 13, где белок E1A не способен связываться с Rb.
Вариант осуществления 15: Способ по любому из вариантов осуществления 1-14, где вирусом является аденовирус, экспрессирующий белок E1A12S.
Вариант осуществления 16: Способ по любому из вариантов осуществления 1-15, где вирусом является аденовирус, не экспрессирующий белок E1A13S.
Вариант осуществления 17: Способ по любому из вариантов осуществления 1-16, где вирусом является аденовирус, не содержащий функционально активную аденовирусную область E3.
Вариант осуществления 18: Способ по любому из вариантов осуществления 1-17, где вирусом является аденовирус, не экспрессирующий белок E1B 19 кДа.
Вариант осуществления 19: Способ по любому из вариантов осуществления 1-18, где вирусом является аденовирус, экспрессирующий RGD-мотив на волокне.
Вариант осуществления 20: Способ по любому из вариантов осуществления 1-19, где вирусом является аденовирус серотипа 5.
Вариант осуществления 21: Способ по любому из вариантов осуществления 1-20, где аденовирус выбран из группы, включающий XVir-N-31, dl520, AdΔ24, AdΔ24-RGD, dl922-947, E1Ad/01/07, dl1119/1131, CB 016, VCN-01, E1Adl1107, E1Adl1101, ORCA-010, Enadenotucirev и вирусы без экспрессированного вирусного онкогена, способный связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Вариант осуществления 22: Способ в соответствии с вариантом осуществления 21, где аденовирусом является XVir-N-31.
Вариант осуществления 23: Способ в соответствии с вариантом осуществления 21, где аденовирусом является dl520, и где аденовирусная область E3 является функционально неактивной.
Вариант осуществления 24: Способ по любому из вариантов осуществления 21-23, где аденовирусом является dl520, и где в dl520 отсутствует экспрессия белка E1B 19 кДа.
Вариант осуществления 25: Способ по любому из вариантов осуществления 21-24, где аденовирусом является dl520, экспрессирующий RGD-мотив на волокне.
Вариант осуществления 26: Способ по любому из вариантов осуществления 1-25, где вирус кодирует YB-1.
Вариант осуществления 27: Способ в соответствии с вариантом осуществления 26, где ген, кодирующий YB-1, находится под контролем тканеспецифического промотора, опухолеспецифического промотора и/или YB-1 зависимого промотора.
Вариант осуществления 28: Способ в соответствии с вариантом осуществления 27, где YB-1 зависимым промотором является аденовирусный Е2-поздний промотор.
Вариант осуществления 29: Способ по любому из вариантов осуществления 1-28, где ингибитор CDK4/6 представляет собой соединение, которое снижает фосфорилирование Rb в клетке, предпочтительно, в опухолевой клетке.
Вариант осуществления 30: Способ по любому из вариантов осуществления 1-29, где ингибитор CDK4/6 представляет собой соединение, которое уменьшает экспрессию Rb в клетке, предпочтительно, в опухолевой клетке.
Вариант осуществления 31: Способ по любому из вариантов осуществления 1-30, где ингибитор CDK4/6 выбран из группы, включающей палбоциклиб, который также упоминается как PD 0332991, абемациклиб, который также упоминается как LY-2835219, рибоциклиб, который также упоминается как LEE011, трилациклиб, который также упоминается как G1T28, и динациклиб.
Вариант осуществления 32: Способ по любому из вариантов осуществления 1-31, где ингибитор CDK4/6 вызывает арест G1 в клетке и ингибирует E2F1.
Вариант осуществления 33: Способ по любому из вариантов осуществления 1-32, где способ дополнительно включает введение субъекту ингибитора PARP.
Вариант осуществления 34: Способ в соответствии с вариантом осуществления 33, где ингибитор PARP выбран из группы, включающей олапариб, велипариб, рукапариб и BMN673.
Вариант осуществления 35: Способ по любому из вариантов осуществления 1-32, где способ дополнительно включает введение субъекту ингибитора бромодомена.
Вариант осуществления 36: Способ в соответствии с вариантом осуществления 35, где ингибитор бромодомена выбран из группы, включающей JQ1, OTX-015, I-BET151, CPI-0610, I-BET762, CPI203, PFI-1 и MS 436.
Вариант осуществления 37: Способ по любому из вариантов осуществления 1-36, где аденовирус, ингибитор CDK4/6, ингибитор PARP и/или ингибитор бромодомена вводятся субъекту отдельно или в виде комбинации.
Вариант осуществления 38: Способ по любому из вариантов осуществления 1-37, где клетки опухоли имеют нарушение сигнального пути CDK4/6.
Вариант осуществления 39: Способ по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют неконтролируемый переход G1-S клеточного цикла.
Вариант осуществления 40: Способ по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют потерю функцию мутации или делеции в гене, выбранном из группы, включающей ген RB1, ген CDKN2A и ген CDKN2B.
Вариант осуществления 41: Способ по любому из вариантов осуществления 1-38, где клетки опухоли имеют амплификацию гена и/или активирующую мутацию гена.
Вариант осуществления 42: Способ в соответствии с вариантом осуществления 41, где ген выбран из группы, включающей CCND1, E2F1, E2F2, E2F3, CDK4 и CDK6.
Вариант осуществления 43: Способ в соответствии с вариантом осуществления 41, где ген является геном, кодирующим компонент митогенного сигнального пути.
Вариант осуществления 44: Способ в соответствии с вариантом осуществления 43, где митогенный сигнальный путь выбран из группы, включающей сигнальный путь PI3K и сигнальный путь MAPK.
Вариант осуществления 45: Способ по любому из вариантов осуществления 1-44, где клетки опухолевых клеток обладают устойчивостью к одному или нескольким фармацевтически активным агентам и/или к радиации или нечувствительны к ним.
Вариант осуществления 46: Способ в соответствии с вариантом осуществления 45, где фармацевтически активный агент является цитостатическим.
Вариант осуществления 47: Способ по п.46, где резистентность опосредована транспортером ABC.
Вариант осуществления 48: Способ по п.47, где транспортер ABC выбран из группы, включающей MRP и MDR, в частности, MDR-1.
Вариант осуществления 49: Способ по любому из вариантов осуществления 45-48, где резистентность представляет собой множественную резистентность или полирезистентность, в частности, мульти- или полирезистентность в отношении цитостатиков и/или излучения.
Вариант осуществления 50: Способ по любому из вариантов осуществления 1-49, где клетки опухоли являются Rb-позитивными.
Вариант осуществления 51: Способ по любому из вариантов осуществления 1-50, где клетки опухоли содержат YB-1 в ядре.
Вариант осуществления 52: Способ по любому из вариантов осуществления 1-51, где клетки опухоли содержат YB-1 в ядре после индукции.
Вариант осуществления 53: Способ в соответствии с вариантом осуществления 52, где транспорт YB-1 в ядре запускается по меньшей мере одним действием, выбранным из группы, включающей облучение, введение цитостатиков и гипертермию.
Вариант осуществления 54: Способ в соответствии с вариантом осуществления 53, где действие применяется к клетке, органу или организму, предпочтительно, к организму, который в этом нуждается, более предпочтительно, к организму, страдающему опухолью.
Вариант осуществления 55: Способ в соответствии с пунктами 1-54, где опухоль выбрана из группы, включающей рак мочевого пузыря, рак молочной железы, метастатический рак молочной железы (mBC), меланому, глиому, рак поджелудочной железы, гепатоцеллюлярную карциному, аденокарциному легкого, саркому, рак яичников, рак почек, рак предстательной железы и лейкоз.
В восьмом аспекте настоящее изобретение также относится к применению композиции при изготовлении лекарственного препарата, где композиция представляет собой композицию, описанную в связи с первым аспектом настоящего изобретения, включая любой его вариант осуществления, и к лекарственному препарату, предназначенному для лечения и/или предупреждения заболевания, указанного в связи со вторым аспектом настоящего изобретения, включая любой его вариант осуществления.
В девятом аспекте настоящее изобретение также относится к применению аденовируса при изготовлении лекарственного препарата, где аденовирусом является аденовирус, описанный в связи с третьим аспектом настоящего изобретения, включая любой его вариант осуществления, и к лекарственному препарату, предназначенному для лечения и/или предупреждения заболевания, указанного в связи с третьим аспектом настоящего изобретения, включая любой его вариант осуществления.
В десятом аспекте настоящее изобретение также относится к применению ингибитора CDK4/6 при изготовлении лекарственного препарата, где ингибитором CDK4/6 является ингибитор CDK4/6, описанный в связи с четвертым аспектом настоящего изобретения, включая любой его вариант осуществления, и к лекарственному препарату, предназначенному для лечения и/или предупреждения заболевания, указанного в связи с четвертым аспектом настоящего изобретения, включая любой его вариант осуществления.
В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение также относится к применению ингибитора PARP при изготовлении лекарственного препарата, где ингибитором PARP является ингибитор PARP, описанный в связи с пятым аспектом настоящего изобретения, включая любой его вариант осуществления, и к лекарственному препарату, предназначенному для лечения и/или предупреждения заболевания, указанного в связи с пятым аспектом настоящего изобретения, включая любой его вариант осуществления.
В двенадцатом аспекте настоящее изобретение также относится к применению ингибитора бромодомена при изготовлении лекарственного препарата, где ингибитором бромодомена является ингибитор бромодомена, описанный в связи с шестым аспектом настоящего изобретения, включая любой его вариант осуществления, и к лекарственному препарату, предназначенному для лечения и/или предупреждения заболевания, указанного в связи с шестым аспектом настоящего изобретения, включая любой его вариант осуществления.
Специалисту в данной области техники понятно, что каждый и любой вариант осуществления одного аспекта настоящего изобретения также является вариантом осуществления каждого и любого из других аспектов настоящего изобретения, включая любой его вариант осуществления.
Не желая связывать себя какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что комбинациия онколитического вируса, предпочтительно, онколитического аденовируса, с ингибитором CDK4/6 увеличивает эффективность терапии опухолей на основе такого онколитического аденовируса. Более конкретно, предполагается, что ингибитор CDK4/6 ингибирует E2F-1, таким образом снижая его эффективную концентрацию, предпочтительно, в опухолевых клетках, и синхронизирует арест G1 в клетках. Благодаря этому большее количество инфицированных клеток может завершить весь жизненный цикл вируса.
Основываясь на доказательствах и выводах, представленных в настоящем документе, специалист в данной области поймет, что при практическом осуществлении настоящего изобретения для использования подходит любой - мутант - аденовирус, что дает по меньшей мере всего 10%, 20% или 30% экспрессии дикого типа и, соответственно, таким аденовирусом достигается активность E1B55K и E4orf6. Специалисту в данной области будет понятно, что такой мутантный аденовирус может быть получен путем модификации E1A. Примерами мутантных аденовирусов являются аденовирус XVir-N-31, dl520, AdΔ24, AdΔ24-RGD, dl922-947, E1Ad/01/07, dl1119/1131, CB 016, VCN-01, E1Adl1107, E1Adl1101, ORCA-010, Enadenotucirev и вирусы без экспрессированного вирусного онкогена, способный связывать функциональный продукт гена-супрессора опухоли Rb.
Эпонимом аденовирусов является первое выделение вируса в миндалинах и аденоидной ткани человека в 1953 г., осуществленное Уоллесом П. Роу и Робертом Дж. Хюбнером (Rowe et al., 1953). Семейство Adenoviridae включает пять родов, а именно мастаденовирусы, авиаденовирусы, сиаденовирусы, атаденовирусы и ихтаденовирусы (Modrow, 2013). По онкогенности для новорожденных грызунов их можно разделить на семь подгрупп от HAdV-A до HAdV-G (Boulanger and Blair, 1991), всего 62 серотипа. Таким образом, исследования онколитической виротерапии в основном сосредоточены на мастаденовирусе типа C серотипа 5.
Непокрытый икосаэдрический капсид размером от 80 до 110 нм состоит из 252 капсомеров, которые состоят из 12 пентонов, собранных из пентонной основы и шипообразных белковых структур, называемых волокнами, на вершинах капсида и 249 граней, называемых гексонами (Modrow, 2013). Весь жизненный цикл аденовирусов можно подразделить на раннюю фазу с проникновением в клетку, ядерную транслокацию вирусного генома, транскрипцию и трансляцию ранних генов и позднюю фазу с транскрипцией и трансляцией поздних генов. Таким образом, за сборку структурных белков и созревание вирионов в основном ответственны поздние белки (Russell, 2000). В пермиссивных клетках ранняя фаза занимает около 6-8 часов с последующей поздней фазой около 4-6 часов. Присоединение происходит за счет взаимодействия утолщенной структуры, которая присутствует на каждом конце волокнистых структур, с рецептором на клетках-мишенях, по крайней мере, в случае аденовирусов HAdV-A, -C, -E и -F. Поскольку этот рецептор был обнаружен как тот же самый, который отвечает за адсорбцию вируса Коксаки B, этот рецептор получил название рецептора вируса Коксаки и аденовируса (CAR) (Bergelson, 1997). Кроме того, связывание на поверхности клетки-мишени поддерживается «мостиковыми молекулами», растворимыми белками в жидкостях организма, такими как факторы свертывания крови VII и X, которые опосредуют связывание белков волокон определенных типов аденовирусов (Modrow, 2013).
После этой стадии адсорбции RGD-мотив (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота) в основании пентона взаимодействует с гетеродимерными интегринами αvβ3 или αvβ5, которые действуют в этом процессе как корецепторы. Это взаимодействие приводит к интернализации вируса (Wickham et al., 1993). Впоследствии происходит эндоцитоз через клатрин-опосредованную интернализацию в цитоплазматической мембране, и вирус находится в эндосомах. После подкисления эндоцитарных пузырьков белок вирусного волокна меняет свою конформацию, что приводит к разрушению эндосомальной мембраны (Greber et al., 1996). Теперь вирусные частицы в цитоплазме свободны. За счет связывания остаточных частиц с динеинами микротрубочек вирусный геном переносится в ядро (Modrow, 2013).
Геном аденовирусов состоит из двухцепочечной линейной ДНК длиной 36-38 т.п.н. Путем взаимодействия двух концевых молекул белка (TP), ковалентно связанных с обоими 5ʼ-концами, образуется квазициклическое состояние (Modrow, 2013). В целом, пять кодирующих областей аденовирусного генома можно подразделить на ранние гены E1-E4, активные в основном в ранней фазе инфекции, и поздние гены (L1-L5), которые кодируют белки, в основном необходимые для образования вирусных частиц (Modrow, 2013).
Репликация аденовирусов особенно зависит от экспрессии раннего вирусного гена E2, который сильно индуцируется большим белком E1A (E1A13S). Первым вирусным геном, который будет транскрибироваться после инфицирования, является ранняя область 1A (E1A). Первичный транскрипт E1A обрабатывается с помощью дифференциального сплайсинга с получением пяти различных сообщений с коэффициентами седиментации 13S, 12S, 11S, 10S и 9S. мРНК 13S и 12S наиболее многочисленны на ранних этапах инфицирования, тогда как мРНК 9S наиболее распространена на поздних этапах. мРНК 11S и 10S представляют собой второстепенные виды, которые становятся более многочисленными на поздних сроках после инфицирования. мРНК 13S, 12S, 11S, 10S и 9S E1A кодируют 289 остатков (R), 243R, 217R, 171R и 55R белков, соответственно, все из которых обнаруживаются in vivo, за исключением продукта 9S, который был обнаружен только in vitro. Обычно экспрессия аденовирусного гена сильно регулируется в ходе инфекции с высокой степенью сложности. Таким образом, транскрипция генов E2, продукты которых кодируют вирусную ДНК-полимеразу и другие белки, необходимые для эффективной репликации вируса, находится под контролем двух промоторов, E2-раннего и E2-позднего промотора.
Благодаря двум перекрывающимся областям контроля транскрипции, E2-ранний промотор может быть подразделен на главный промотор, начинающийся в положении +1, и минорный промотор, начинающийся в положении -26, которые оба содержат мотив TATA (Swaminathan and Thimmapaya, 1996). Активация E2-раннего промотора посредством E1A в основном зависит от двух сайтов связывания E2F, локализованных в основной части промотора. На промежуточных стадиях инфицирования, примерно через 6 hpi (часов после инфицирования), экспрессия генов E2 контролируется E2-поздним промотором. В положениях от -33 до -22 его последовательности из 157 п.н. находится ТАТА-бокс, который может связываться и активироваться клеточным ТВР (Swaminathan and Thimmapaya, 1996). Более того, для E2-позднего промотора характерны два сайта узнавания SP1 и три бокса CCAAT.
На промежуточных стадиях инфицирования, примерно через 6 hpi (часов после инфицирования), экспрессия генов E2 контролируется E2-поздним промотором. В положениях от -33 до -22 его последовательности из 157 п.н. находится ТАТА-бокс, который может связываться и активироваться клеточным ТВР (Swaminathan and Thimmapaya, 1996). Более того, для E2-позднего промотора характерны два сайта узнавания SP1 и три бокса CCAAT.
Поскольку было показано, что клеточный фактор YB-1 способен связываться с инвертированными боксами CCAAT, было исследовано взаимодействие между связывающим белком 1 Y-бокса (YB-1) и E2-поздним промотором. Holm et al. показали в 2002 г., что на самом деле существует специфическое взаимодействие YB-1 с Y-боксами (инвертированные CCAAT-боксы), присутствующими в E2-позднем промоторе, и способными контролировать активность этого промотора (Holm et al., 2002). Чтобы проявить свою трансактивирующую активность, YB-1 должен быть перемещен в ядро через аденовирусный комплекс E1B-55k/E4-orf6. Эти ранние вирусные гены экспрессируются после трансактивации E1A-13S (Frisch and Mymryk, 2002).
Клеточный фактор YB-1, кодируемый геном YBX1, представляет собой домен холодового шока, несущий ДНК-связывающий белок с множеством функций в транскрипции, сплайсинге, контроле трансляции и восстановлении повреждений ДНК (Kohno et al., 2003). Более того, он играет важную роль в устойчивости к лекарствам из-за активации генов MDR1 и MRP1, которые участвуют в развитии фенотипа множественной лекарственной устойчивости в раковых клетках (Mantwill et al., 2006). Экспрессия YB-1 индуцируется последующим переносом ядер посредством воздействия внешних стрессовых факторов, таких как аденовирусная инфекция, химиотерапия или УФ-излучение (Mantwill et al., 2006).
Активация транскрипции ранних и поздних генов аденовируса имеет решающее значение для жизненного цикла вируса. Вкратце, жизненный цикл вируса начинается с активации транскрипции E1A, за которой следует каскад активации генов E2, E3 и E4. Наконец, главный поздний промотор (MLP) активируется, чтобы координировать экспрессию капсида и дополнительных белков, в значительной степени участвующих в инкапсидации генома (Turner et al 2015). Чтобы преодолеть блокировку репликации вирусной ДНК, присутствующей в непролиферирующих клетках, вирус экспрессирует ранние белки 1A (E1A). Эти немедленные ранние белки переводят клетки в S-фазу и вызывают экспрессию всех других вирусных ранних генов. В процессе инфицирования несколько изоформ E1A экспрессируются с белками из 289, 243, 217, 171 и 55 остатков, представленных для аденовируса человека типа 5. В контексте инфекции основным драйвером экспрессии вирусного гена является большой белок (Radko et al 2015).
После инфицирования экспрессия аденовирусного белка E1A способствует прогрессированию клеточного цикла из фазы G0/G1 в S-фазу и репликации вируса даже в терминально дифференцированных эпителиальных клетках, основной мишени аденовирусов человека. Этот процесс считается необходимым для жизненного цикла аденовирусов.
Аденовирусы были разработаны для инфицирования, репликации и уничтожения раковых клеток, сохраняя при этом нормальные клетки. После инфицирования и репликации в опухолевых клетках онколитические вирусы убивают клетки, высвобождая вирионы для последующих циклов амплификации. Для достижения репликации только в опухолевых клетках были проделаны два вида генетических модификаций, в результате чего были сконструированы три подкласса онколитического аденовируса (также называемого в настоящем документе как CRAd), все из которых могут быть использованы при практическом осуществлении настоящего изобретения. Кроме того, в WO 2003/099859 описаны онколитические аденовирусы, подходящие для использования при практическом осуществлении настоящего изобретения, среди прочего.
CRAd типа I характеризуются мутациями или делециями в области E1 генома, препятствующими инактивации регуляторов клеточного цикла, таких как p53 и белок ретинобластомы (Rb). Как следствие, CRAd типа I реплицируются в активно делящихся опухолевых клетках. Например, Onyx-015, также известный как dl1520, который не может экспрессировать белок E1B-55 кДа, не может инактивировать p53 и избежать ареста клеточного цикла, вызванного p53. Некоторые исследования объясняют молекулярную основу избирательности Onyx-015 отсутствием экспрессии p53 или одного из генов, участвующих в пути p53. Однако OʼShea et al. показали, что поздний экспорт вирусной РНК, а не инактивация p53, определяет селективность вируса Onyx-015. Другие CRAd типа I с делециями в области E1A неспособны связывать Rb и запускать вхождение в S-фазу. Например, dl922-947 и Δ24 содержат делецию 24 нуклеотида в домене CR2 области E1A, что исключает взаимодействие E1A-Rb. В результате эти вирусы реплицируются в основном в опухолевых клетках, где доступен свободный, несвязанный E2F.
Другим способом ограничить репликацию аденовируса опухолевыми клетками является регулирование транскрипции вирусных генов, необходимых для репликации вируса. В CRAd типа II геном находится под контролем опухолеспецифического промотора. Эти промоторы произошли от генов, которые, как известно, преимущественно экспрессируются в некоторых опухолях по сравнению с нормальной тканью (например, теломераза или циклооксигеназа II); или которые сверхэкспрессируются в опухолях (например, специфический антиген предстательной железы, PSA или α-фетопротеин, AFP) по сравнению с нормальными тканями. В CRAd типа III, таких как XVir-N-31 (Ad-Delo3-RGD), характерна делеция домена CR3 трансактивации в белке E1A13S. XVir-N-31 представляет собой аденовирусы с дефектом репликации в нормальных клетках. XVir-N-31 восстанавливает свою репликационную способность за счет присутствия в ядре клеточного многофункционального белка YB-1. Соответственно, CRAd способны реплицироваться только в опухолевых клетках и, таким образом, в конечном итоге лизировать их. Ни мутации p53, ни ras, ни RB не эффективны для восполнения дефицита репликации XVir-N-31. В XVir-N-31 отсутствует E1A13S, следовательно, белок E1B55k и белок E4orf6 не экспрессируются. Этот дефицит дополняется наличием YB-1 в ядре опухолевых клеток, который запускает экспрессию E1B55k и E4orf6 независимо от E1A13S. После индуцирования присутствием YB-1 в ядре E1B55k и E4orf6 переносят дальнейший клеточный YB-1 в ядро, вызывая репликацию вируса.
Клеточный цикл последовательно проходит через стадии промежутка 1 (G1), синтеза (S), промежутка 2 (G2) и митоза (M). Этот прогресс регулируется сложной сигнальной сетью. Белки CDK (циклин-зависимая киназа), CDK1, CDK2, CDK4 и CDK6, являются основными регуляторами развития клеточного цикла при образовании комплекса со специфическими белками циклинов. Конститутивная экспрессия CDK и временной контроль различных циклинов делает возможным регулирование конкретных фаз клеточного цикла с помощью различных комплексов циклин-CDK. Активность CDK негативно регулируется несколькими ингибирующими белками. Различные аспекты биологии и функции CDK были ранее всесторонне рассмотрены.
CDK4 и CDK6, которые демонстрируют структурную и функциональную гомологию, регулируют переход покоящихся клеток в фазе G1 в фазу S при образовании комплекса с белками циклина D. Белки циклина D имеют три подтипа, циклины D1-3, и накапливаются в присутствии митогенных стимулов. Отрицательные регуляторы CDK4/6 включают ингибиторы белков CDK4 (INK4), p16INK4A, p15INK4B, p18INK4C и p19INK4D, которые ингибируют активность CDK4/6, либо уменьшая их связывание с циклином D1, либо непосредственно занимая их каталитические домены.
Киназная активность CDK4/6 приводит к фосфорилированию членов семейства белков ретинобластомы (Rb), включая Rb, p107 и p130, что приводит к их функциональной инактивации. В покоящихся клетках активный гипофосфорилированный Rb связывается с членами семейства факторов транскрипции E2F, которые образуют комплекс с DP-1/2 вместе с другими корепрессорами и подавляют функцию E2F (Rubin et al 2005). При фосфорилировании Rb диссоциирует из этого комплекса и позволяет транскрипцию генов-мишеней E2F, включая циклин A, циклин E и DHFR, среди прочих, которые необходимы для перехода клеточного цикла в S-фазу Следовательно, ингибирование активности CDK4/6 приводит к дефосфорилированию Rb и подавлению активности E2F, что способствует аресту G0/G1. Это стимулировало разработку ингибиторов CDK4/6 в качестве целевой терапии раковых клеток.
Нарушение сигнального пути CDK4/6-Rb и неконтролируемый переход G1-S клеточного цикла является общей чертой раковых клеток. Это может происходить из-за различных молекулярных изменений, включая мутации потери функции или делеции гена RB1 (кодирование Rb), CDKN2A (кодирование p16INK4A и p14ARF) или CDKN2B (кодирование p15INK4B). Такая дерегуляция также может быть результатом амплификации или активации мутаций в CCND1 (кодирующем циклин D1), E2F1-3, CDK4, CDK6 или компонентах различных путей передачи митогенных сигналов, таких как пути PI3K или MAPK.
Было разработано несколько АТФ-конкурентных низкомолекулярных ингибиторов CDK. Однако ингибиторы первого поколения, такие как флавопиридол, не селективны и могут подавлять ряд CDK, что может привести к ограниченной эффективности и высокой токсичности. Ингибиторы CDK4/6 следующего поколения обладают высокой селективностью и включают палбоциклиб (PD-0332991 от компании Pfizer), абемациклиб (LY-2835219 от компании Eli Lilly) и рибоциклиб (LEE011 от компании Novartis) и трилациклиб (G1T28). Эти ингибиторы CDK4/6 были протестированы доклинически на моделях in vitro и in vivo нескольких видов рака, включая лейкоз, рак молочной железы, меланому, глиому, рак поджелудочной железы, гепатоцеллюлярную карциному, аденокарциному легких, саркому, рак яичников, рак почек, предстательной железы и метастатический рак молочной железы (mBC). В большинстве исследований они продемонстрировали устойчивый молекулярный и функциональный фенотип с дозозависимым снижением фосфорилирования Rb, экспрессии белка и транскрипции генов-мишеней E2F, что коррелирует с арестом G0/G1 и ингибированием пролиферации клеток. Кроме того, все эти отчеты демонстрируют, что экспрессия Rb является предпосылкой чувствительности к этим ингибиторам.
Ингибиторы CDK4/6, такие как PD-0332991, приводят к дозозависимому снижению общего белка Rb, которое коррелирует со снижением фосфорилированного Rb. Это снижение общего Rb частично коррелирует со снижением уровней транскрипта RB1 и транскрипцией генов-мишеней E2F CCNA2 и CCNE2. Кроме того, уровень экспрессии E2F значительно снижается.
Ингибиторы CDK4/6, подходящие для использования при практическом осуществлении настоящего изобретения, представлены на фиг. 25.
Как видно из экспериментальной части, ингибитор CDK4/6 подходит для использования в комбинации с вирусом, предпочтительно, аденовирусом и, более предпочтительно, онколитическим аденовирусом, в результате чего ингибитор CDK4/6 вызывает арест G1 клеток и ингибирует E2F1, более конкретно, активность E2F1.
Специалисту в данной области будет понятно, что ингибитор CDK4/6 используется в терапевтически эффективной концентрации.
PARP1 является белком, который важен для восстановления одноцепочечных разрывов («зазубрины» в ДНК). У млекопитающих обнаружено 17 членов семейства PARP, и только 6 из них синтезируют поли-АДФ-рибозу (pADPr). PARP1, PARP2 и PARP3 играют роль в репарации ДНК. PARP1 связывается с ДНК, которая пострадала от одноцепочечных разрывов (SSB) и двухцепочечных разрывов (DSB). Затем PARP1 претерпевает конформационное изменение, которое выравнивает ключевые аминокислотные остатки в активном сайте, тем самым увеличивая его активность. Как только PARP1 активируется, он синтезирует pADPr, который связывается с белками и изменяет их функцию. pADPr быстро разрушается гликогидролазой pADPr для гарантии того, что уровни присутствующего pADPr отражают повреждение ДНК и что ответ на pADPr прекращается после репарации ДНК.
Ингибируя пути репарации ДНК, ингибиторы PARP1 вызывают увеличение одноцепочечных разрывов в ДНК. Это повреждение ДНК не восстанавливается и переносится в дочерние клетки после репликации, поскольку BER больше не возникает. Это приводит к увеличению DSB в опухолях, которые имеют мутации BRCA1 и BRCA2 (Scott et al. 2015, J Clin Oncol., 33(12): 1397-140). Химические структуры ингибиторов PARP, включая препараты-кандидаты PARP рукапариб, велипариб и олапариб, показаны на фиг. 26 и описаны Antolin и Mestres 2014, Oncotarget, 30;5(10):3023-8, включая бензамидный фрагмент, который характеризует все структуры ингибиторов PARP.
Кроме того, хорошо известно, что YB-1 усиливает активность PARP и снижает эффективность ингибиторов PARP1 (Alemasova et al., 2018, Oncotarget, 34, 23349-65), что позволяет предположить, что YB-1 зависит от онколитического аденовируса в сочетании с обоими CDK. Ингибиторы 4/6 и ингибиторы PARP действуют синергетически при уничтожении раковых клеток. Примерами ингибиторов PARP являются олапариб и BMN673 (талазолариб, разработанный Pfizer, США, Clin Cancer Res. 2013, 15; 19 (18): 5003-15).
Специалисту в данной области будет понятно, что ингибитор PARP используется в терапевтически эффективной концентрации.
Ингибиторы CDK4/6, подходящие для использования при практическом осуществлении настоящего изобретения, представлены на фиг. 25.
Аберрации в эпигенетическом ландшафте являются признаком рака, а ацетилирование остатков лизина представляет собой посттрансляционную модификацию, имеющую большое значение для передачи сигналов в клетках и в биологии болезни. Ферменты, которые «записывают» (гистоновые ацетилтрансферазы, HAT) и «стирают» (гистоновые деацетилазы, HDAC) сайты ацетилирования, являются областью обширных исследований при разработке современных лекарственных средств. Рекрутирование белков в макромолекулярные комплексы с помощью ацетилированных остатков лизина опосредуется бромодоменами (BRD), которые являются эволюционно высококонсервативными модулями взаимодействия белков, распознающими мотивы ацетилирования ɛ-N-лизина. Консервативная складка BRD содержит глубокий, в значительной степени гидрофобный сайт связывания ацетиллизина, который представляет собой привлекательный карман для развития небольших фармацевтически активных молекул. В развитие большого количества заболеваний вовлечены белки, содержащие BRD.
Недавно для двух высокоэффективных и селективных ингибиторов, нацеленных на BRD, из семейства BET (бромодомены и экстра-терминальный), были предоставили убедительные данные, подтверждающие нацеливание этих BRD на злокачественное новообразование. Подсемейство BET (бромодомен и экстратерминальный домен) бромодоменных белков, состоящее из BRD2, BRD3, BRD4 и BRDT, выполняет различные роли в регуляции транскрипции с помощью РНК-полимеразы II (POLII) и представляет собой новый класс эпигенетических мишеней для лекарственных средств. Эти белки облегчают фазы инициации и элонгации транскрипции за счет связывания с активированным хроматином по ацетилированным остаткам лизина. Распознавание активированного хроматина этими так называемыми эпигенетическими «читателями» способствует привлечению комплекса РНК-полимеразы II к участкам активной транскрипции. Взаимодействие BRD4/P-TEFb важно для быстрой повторной инициации транскрипции после митоза (Muller et al., 2011, Expert Rev. Mol. Medicine, 13, e19). P-TEFb был идентифицирован и очищен как фактор, необходимый для генерации длинных транскриптов с использованием транскрипционной системы in vitro, полученной из клеток дрозофилы. Он представляет собой циклинзависимую киназу, содержащую каталитическую субъединицу Cdk9 и регуляторную субъединицу циклин Т у дрозофилы. У человека существует несколько форм P-TEFb, которые содержат Cdk9 и одну из нескольких субъединиц циклина, циклин T1, T2 и K. P-TEFb ассоциируется с другими факторами, включая белок бромодомена BRD4, и, как было обнаружено, связан с большим комплексом белков, который называется комплексом суперэлонгации (Yang Z, et al., 2005. Mol Cell; 19:535-45; Fu et al., 1999, J Biol Chem., 274:34527-30).
JQ1 (тиено-триазоло-1-4-диазепин) является мощным ингибитором семейства бромодоменных белков BET, которое включает BRD2, BRD3, BRD4 (Filippakopoulos et al., 2010 Nature 468, 1067-1073). JQ1 предотвращает взаимодействие между бромодоменом и ацетильной группой, вызывая подавление определенных генов. Были описаны другие бромодомены-ингибиторы BET, включая OTOX15, BAY1238097, GSK2820151, I-BET762 и PLX51107 (Perez-Salvia and Esteller 2017, EPIGENETICS, 12, 323-339; Brandt et al., 2015ACS Chem. Biol., 10, 22−39). JQ-1 структурно родственен бензодиазепинам. Его формулой является C23H25ClN4O2S.
Недавно было показано, что ингибитор BET JQ1 облегчает аденовирусную инфекцию и опосредованную аденовирусным вектором доставку генов. Обработка клеток JQ1 вызывает увеличение ассоциации BRD4 с CDK9, субъединицей P-TEFb элонгации транскрипции. Однако, как указано в документе, необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить механизм, с помощью которого BED4 используется для регулирования аденовирусной инфекции и экспрессии трансгенов (Baojie Lv et al 2018, Scientific reports, 8, 11554). Важно отметить, что вирусная репликация и транскрипция вируса не исследовались. Однако известно, что CDK9 стимулирует высвобождение приостановленной полимеразы и активирует транскрипцию за счет увеличения количества транскрибирующих полимераз и, следовательно, количества синтеза мРНК за период времени (Gressel et al. 2017, eLife, 6, e29736). Кроме того, было показано, что устойчивость к ингибиторам BET можно преодолеть с помощью ингибиторов CDK 4/6 (Jin et al. 2018, Mol Cell;71(4):592-605). Недавно было продемонстрировано резкое усиление взаимодействия P-TEFb-Brd4 от позднего митоза до ранних фаз G1 клеточного цикла и активное привлечение P-TEFb в хромосомы с последующим инициированием транскрипции ключевых генов для прогрессирования G1. Важно отметить, что истощение Brd4 отменяет весь процесс за счет снижения транскрипции основных генов G1, что приводит к аресту клеточного цикла G1 и апоптозу (Yang et al., 2008, Mol Cell Biol., 28:967-976, Kohoutek, 2009, Cell Division, 4. 19).
Однако об использовании YB-1-зависимых онколитических аденовирусов в сочетании с ингибиторами CDK 4/6 и ингибиторами BET ничего не известно.
Следует принимать во внимание и в рамках настоящего изобретения, что другие бромодомены-ингибиторы будут в равной степени подходящими для использования в тройной терапии с использованием вируса, предпочтительно, аденовируса, более предпочтительно, онколитического аденовируса, такого как XVir-N-31, и ингибитора CDK4/6.
Специалисту в данной области будет понятно, что ингибитор бромодомена (Bet) используется в терапевтически эффективной концентрации.
Ингибиторы бромодомена, подходящие для использования при практическом осуществлении настоящего изобретения, представлены на фиг. 27.
Опухоли, которые, в частности, можно лечить с помощью вирусов и, таким образом, комбинаций по настоящему изобретению, описанные в настоящем документе, предпочтительно, представляют собой опухоли, выбранные из группы, включающей опухоли нервной системы, опухоли глаз, опухоли кожи, опухоли мягких тканей, опухоли желудочно-кишечного тракта, опухоли дыхательной системы, опухоли костей, опухоли эндокринной системы, опухоли женской половой системы, опухоли молочной железы, опухоли мужской половой системы, опухоли мочевыводящей системы, опухоли кроветворной системы, включая смешанные и эмбриональные опухоли, и лейкоз. В рамках настоящего изобретения эти опухоли являются, в частности, устойчивыми опухолями, в частности, определенным в настоящем документе.
Группа опухолей нервной системы предпочтительно включает:
1. опухоли черепа, а также головного мозга (внутричерепные), предпочтительно, астроцитому, олигодендроглиому, менингиому, нейробластому, ганглионеврому, эпендимому, шванноглиому, нейрофиброму, гемангиобластому, липому, краниофарингиому, тератому и хордому;
2. опухоли спинного мозга и позвоночного канала, предпочтительно, глиобластому, менингиому, нейробластому, нейрофиброму, остеосаркому, хондросаркому, гемангиосаркому, фибросаркому и множественную миелому; и
3. опухоли периферических нервов, предпочтительно, шванноглиому, нейрофиброму, нейрофибросаркому и периневральную фибробластому.
Группа глазных опухолей предпочтительно включает:
1. опухоли век и желез на веках, предпочтительно, аденому, аденокарциному, папиллому, гистиоцитому, опухоль тучных клеток, базальноклеточную опухоль, меланому, плоскоклеточную карциному, фиброму и фибросаркому;
2. опухоли конъюнктивы и мигательной перепонки, предпочтительно, плоскоклеточный рак, гемангиому, гемангиосаркому, аденому, аденокарциному, фибросаркому, меланому и папилломуа; и
3. опухоли орбиты, зрительного нерва и глазного яблока, предпочтительно, ретинобластому, остеосаркому, тучноклеточную опухоль, менингиому, ретикулярно-клеточную опухоль, глиому, шванноглиому, хондрому, аденокарциному, плоскоклеточную карциному, плазматическую клеточную опухоль, лимфому, рабдомиосаркому и меланому.
Группа опухолей кожи предпочтительно включает:
опухоли гистиоцитому, липому, фибросаркому, фиброму, тучноклеточные опухоли, злокачественную меланому, папиллому, базальноклеточную опухоль, кератоакантому, гемангиоперицитому, опухоли волосяных фолликулов, опухоли потовых желез, опухоли сальных желез, гемангиому, гемангиосаркому, липому, липосаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, плазмоцитому и лимфангиому.
Группа опухолей мягких тканей предпочтительно включает:
опухоли альвеолярной саркомы мягких тканей, эпителиоидноклеточную саркому, хондросаркому мягких тканей, остеосаркому мягких тканей, саркому Юинга мягких тканей, примитивные нейроэктодермальные опухоли (PNET), фибросаркому, фиброму, лейомиосаркому, лейомиому, липосаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, злокачественную гемангиоперицитому, гемангиому, гемангиосаркому, злокачественную мезенхимому, злокачественную опухоль оболочки периферических нервов (MPNST), злокачественную шванноглиому, злокачественную меланоцитарную шванноглиому, рабдомиосаркому, синовиальную саркому, лимфангиому и лимфангиосаркому.
Группа опухолей желудочно-кишечного тракта предпочтительно включает:
1. опухоли ротовой полости и языка, предпочтительно, плоскоклеточную карциному, фибросаркому, опухоль из клеток Меркеля, индуктивную фиброамелобластому, фиброму, фибросаркому, вирусный папилломатоз, идиопатический папилломатоз, полипы носоглотки, лейомиосаркому, миобластому и опухоль тучных клеток;
2. опухоли слюнных желез, предпочтительно, аденокарциному;
3. опухоли пищевода, предпочтительно, плоскоклеточную карциному, лейомиосаркому, фибросаркому, остеосаркому, карциному Барретта и параэзофагеальные опухоли;
4. опухоли экзокринной части поджелудочной железы, предпочтительно, аденокарциному; и
5. опухоли желудка, предпочтительно, аденокарциному, лейомиому, лейомиосаркому и фибросаркому.
Группа опухолей дыхательной системы предпочтительно включает:
1. опухоли носа и носовой полости, гортани и трахеи, предпочтительно, плоскоклеточную карциному, фибросаркому, фиброму, лимфосаркому, лимфому, гемангиому, гемангиосаркому, меланому, опухоль тучных клеток, остеосаркому, хондросаркому, онкоцитому (рабдомиому), аденокарциному и миобластому; и
2. опухоли легкого, предпочтительно, плоскоклеточную карциному, фибросаркому, фиброму, лимфосаркому, лимфому, гемангиому, гемангиосаркому, меланому, тучноклеточную опухоль, остеосаркому, хондросаркому, онкоцитому (рабдомиому), аденокарциному, миобластому, мелкоклеточную карциному, немелкоклеточную карциному, бронхиальную аденокарциному, бронхоальвеолярную аденокарциному и альвеолярную аденокарциному.
Группа опухолей костей предпочтительно включает:
остеосаркому, хондросаркому, паростальную остеосаркому, гемангиосаркому, синовиально-клеточную саркому, гемангиосаркому, фибросаркому, злокачественную мезенхимому, гигантоклеточную опухоль, остеому и многодолевую остеому.
Группа опухолей эндокринной системы предпочтительно включает:
1. опухоли щитовидной железы/паращитовидной железы, предпочтительно, аденому и аденокарциному;
2. опухоли надпочечников, предпочтительно, аденому, аденокарциному и феохромоцитому (медуллосупрареному);
3. опухоли гипоталамуса/гипофиза, предпочтительно, аденому и аденокарциному;
4. опухоли эндокринной поджелудочной железы, предпочтительно, инсулиному (бета-клеточная опухоль, APUDom) и синдром Золлингера-Эллисона (опухоль, выделяющая гастрин дельта-клетками поджелудочной железы); и
5. а также множественные эндокринные неоплазии (MEN) и хемодэктомы.
Группа опухолей женской половой системы предпочтительно включает:
1. опухоли яичников, предпочтительно, аденому, аденокарциному, цистаденому и недифференцированную карциному;
2. опухоли матки, предпочтительно, лейомиому, лейомиосаркому, аденому, аденокарциному, фиброму, фибросаркому и липому;
3. опухоли шейки матки, предпочтительно, аденокарциному, аденому, лейомиосаркому и лейомиому;
4. опухоли влагалища и вульвы, предпочтительно, лейомиому, лейомиосаркому, фибролейомиому, фиброму, фибросаркому, полипы и плоскоклеточную карциному.
Группа опухолей молочных желез предпочтительно включает:
фиброаденому, аденому, аденокарциному, мезенхимальную опухоль, карциному, карциносаркому.
Группа опухолей мужской половой системы предпочтительно включает:
1. опухоли яичек, предпочтительно, семиному, интерстициально-клеточную опухоль и опухоль из клеток Сертоли;
2. опухоли предстательной железы, предпочтительно, аденокарциному, недифференцированную карциному, плоскоклеточную карциному, лейомиосаркому и переходно-клеточную карциному; и
3. опухоли полового члена и наружных половых органов, предпочтительно, опухоль тучных клеток и плоскоклеточную карциному.
Группа опухолей системы оттока мочи предпочтительно включает:
1. опухоли почки, предпочтительно, аденокарциному, переходно-клеточную карциному (эпителиальные опухоли), фибросаркому, хондросаркому (мезенхимальные опухоли), опухоль Вильма, нефробластому и эмбриональную нефрому (эмбриональную плюрипотентную бластому);
2. опухоли мочеточника, предпочтительно, лейомиому, лейомиосаркому, фибропапиллому, переходно-клеточную карциному;
3. опухоли мочевого пузыря, предпочтительно, переходно-клеточную карциному, плоскоклеточную карциному, аденокарциному, ботриоидную (эмбриональную рабдомиосаркому), фиброму, фибросаркому, лейомиому, лейомиосаркому, папиллому и гемангиосаркому; и
4. опухоли уретры, предпочтительно, переходно-клеточную карциному, плоскоклеточную карциному и лейомиосаркому.
Группа опухолей кроветворной системы предпочтительно включает:
1. лимфому, лимфатический лейкоз, нелимфактический лейкоз, миелопролиферативный лейкоз, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому.
Группа смешанных и эмбриональных опухолей предпочтительно включает:
гемангиосаркому, тимому и мезотелиому.
Предпочтительно эти опухоли выбраны из группы, включающей рак молочной железы, карциному яичников, карциному предстательной железы, остеосаркому, глиобластому, меланому, мелкоклеточную карциному легкого и колоректальную карциному. Другие опухоли представляют собой опухоли, которые являются устойчивыми, как описано в данном документе, предпочтительно, опухоли с множественной устойчивостью, особенно опухоли из группы, описанной выше.
В рамках настоящего изобретения также идентифицируются и проверяются субъекты, которым должна быть введена комбинация по изобретению. Такая идентификация пациентов, которым может быть полезно настоящее изобретение в его разнообразных аспектах, основана на обнаружении YB-1 в ядре образца от субъекта.
В одном варианте осуществления исследование опухолевой ткани проводят с использованием агента, который выбран из группы, включающей антитела против YB-1, аптамеры против YB-1 и шпигельмеры против YB-1, а также антикалины против YB-1. В принципе, те же средства могут быть изготовлены для соответствующих маркеров и использоваться соответственно. Производство антител, в частности, моноклональных антител, известно специалистам в данной области. Дополнительным средством специфического обнаружения YB-1 или маркеров являются пептиды, которые связываются с высоким сродством с целевыми структурами, в данном случае с YB-1 или указанными маркерами. Из уровня техники известны такие методы, как фаговый дисплей, для получения таких пептидов. Обычно за отправную точку берут пептидную библиотеку, при этом отдельные пептиды имеют длину от 8 до 20 аминокислот, а размер библиотеки составляет примерно от 102 до 1018, предпочтительно, от 108 до 1015 различных пептидов. Особой формой полипептидов, связывающих молекулу-мишень, являются так называемые антикалины, которые, например, описаны в заявке на патент Германии DE 19742706.
Дополнительным средством для специфического связывания YB-1 или соответствующих маркеров, описанных в настоящем документе, и, таким образом, для обнаружения независимой от клеточного цикла локализации YB-1 в клеточном ядре, являются так называемые аптамеры, то есть D-нуклеиновые кислоты, присутствующие либо в виде РНК, либо в виде ДНК, либо в виде одной цепи, либо в виде двойной цепи и специфически связывающиеся с молекулой-мишенью. Получение аптамеров описано, например, в европейском патенте ЕР 0533838. Особой формой аптамеров являются так называемые аптазимы, которые, например, описаны Piganeau, N. et al. (2000), Angew. Chem. Int. Ed., 39, № 29, стр. 4369-4373. Это особые варианты аптамеров, поскольку они содержат, помимо аптамерной части, рибозимную часть и становятся каталитически активными при связывании или высвобождении молекулы-мишени, связывающейся с аптамерной частью и расщепляющей субстрат нуклеиновой кислоты, который сопровождается генерацией сигнала.
Другой формой аптамеров являются так называемые шпигельмеры, то есть нуклеиновые кислоты, связывающие молекулу-мишень, которые состоят из L-нуклеиновых кислот. Способ получения таких шпигельмеров описан, например, в WO 98/08856.
Образец опухолевой ткани может быть получен путем пункции или хирургического вмешательства. Оценка того, локализуется ли YB-1 в ядре независимо от клеточного цикла, часто проводится с использованием микроскопических методов и/или иммуно-гистоанализа, предпочтительно, с использованием антитела или любого из других вышеупомянутых средств. Дополнительные средства для обнаружения YB-1 в ядре и, в частности, для обнаружения того, что YB-1 находится там независимо от клеточного цикла, известны специалистам в данной области. Например, локализация YB-1 может быть легко обнаружена в окрашенных срезах ткани при их скрининге. Частота присутствия YB-1 в ядре уже указывает на то, что локализация не зависит от клеточного цикла. Другой вариант независимого от клеточного цикла обнаружения YB-1 в ядре заключается в окрашивании против YB-1 и определении того, локализуется ли YB-1 в ядре, и определении фазы клеток. Это, а также обнаружение YB-1 можно также выполнить с использованием вышеупомянутых средств, направленных против YB-1. Обнаружение средств осуществляется методами, известными специалистам в данной области. С помощью указанных агентов, специфически связывающихся с YB-1, а не с какими-либо другими структурами в анализируемом образце, в частности, с клетками, их локализацией, а также благодаря их специфическому связыванию с YB-1 также может быть обнаружена и установлена локализация YB-1 подходящей маркировкой средств. Способы маркировки указанных средств известны специалистам в данной области.
Далее настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано со ссылкой на фигуры и образцы, из которых могут быть выявлены новые особенности, варианты осуществления и преимущества.
Фиг. 1a представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую относительную абсорбцию в качестве индикатора жизнеспособности клеток для XVir-N-31 (XVir), аденовируса дикого типа (WT) и контроля (Ctrl) при использовании в сочетании с ингибиторами CDK4/6 LY (LY-2835219), PD (PD-032991) или LEE (LEE011).
Фиг. 1b представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую титр вируса для XVir-N-31 (XVir) и аденовируса дикого типа (WT) в сочетании с ингибиторами CDK4/6 LY (LY-2835219), PD (PD-032991) или LEE (LEE011)
Фиг. 1c представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую сравнение волокон ДНК для XVir-N-31 (XVir) и аденовируса дикого типа (WT) в сочетании с ингибиторами CDK4/6 LY (LY-2835219), PD (PD-032991) или LEE (LEE011)
На фиг. 2 показаны результаты вестерн-блоттинга.
На фиг. 3a-d представлены столбчатые диаграммы.
На фиг. 4a-d представлены столбчатые диаграммы.
На фиг. 5 представлены столбчатые диаграммы.
Фиг. 6 представляет собой серию микрофотографий.
На фиг. 7 представлено флуоресцентное микроскопическое изображение клеток Т24, инфицированных аденовирусом с удаленным E1, экспрессирующим GFP, с обработкой палбоциклибом и без нее.
Фиг. 8 представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую репликацию вирусной ДНК аденовируса dl703 через 48 часов с использованием соединений нутлин-3a, Lee, Cl1040 и росковитина.
На фиг. 9A-C показаны результаты вестерн-блоттинга клеток UMUC, обработанных указанными концентрациями нутлин-3a и LEE011 (рибоциклиб) (фиг.9A), росковитина (фиг.9B) и CI-1040 (фиг.9C); Rb означает белок ретинобластомы; phRB означает фосфорилированный белок ретинобластомы; E2F-1 означает фактор транскрипции E2F-1; и GAPDH служил контролем загрузки.
Фиг. 10 представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую распределение клеточного цикла в клетках UMUC3, определенное через 48 часов после обработки, при этом концентрации ингибиторов CDK4/6 были следующими: росковитин: 10 мкМ, CI-1040: 1 мкМ, нутлин-3a: 10 мкМ и LEE011: 10 мкМ.
Фиг. 11 представляет собой панель микроскопических изображений, показывающих экспрессию гена гексона аденовируса с обработкой палбоциклибом и без нее.
Фиг. 12 представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую результаты анализа активности клеток Т24, подвергнутых воздействию только XVir-N-31, 15 нМ ингибитора PARP PARPi, 500 нМ PD (палбоциклиб) или комбинацией 15 нМ PARPi и 500 нМ PD, в виде процента выживаемости клеток, при этом клетки были либо не инфицированы (левый столбец), либо инфицированы MOI 10 (средний столбец) или MOI 50 (правый столбец).
Фиг. 13 представляет собой панель изображений, показывающих культуры клеток Т24, окрашенных SRB после обработки XVir-N-31 (20 MOI), XVir-N-31 и 15 нМ PARPi, XVir-N-31 и 500 нМ PD, и XVir-N-31, 15 нМ PARPi и 500 нМ PD, 1 дпи, 2 дпи, 3 дпи, 4 дпи, 5 дпи и 6 дпи.
Фиг. 14 представляет собой панель изображений, показывающих культуры клеток UMUC, окрашенных SRB, после обработки XVir-N-31 (10 MOI), XVir-N-31 и 160 нМ PARPi, XVir-N-31 и 400 нМ PD, и XVir-N-31, 160 нМ PARPi и 400 нМ PD, 1 дпи, 2 дпи, 3 дпи, 4 дпи, 5 дпи и 6 дпи.
Фиг. 15 представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую результаты анализа активности клеток Т24 через 5 дней после инфицирования XVir-N-31, ингибитором CDK 4/6 палбоциклибом и ингибитором бромодомена JQ-1; ось Y: выживаемость клеток в %.
Фиг. 16 представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую результаты анализа активности клеток SK-N-MC через 5 дней после воздействия только XVir-N-31, 200 нМ абемациклиба, 500 нМ JQ1 или комбинацией 200 нМ абемациклиба и 500 нМ JQ1 в виде процента выживаемости клеток, при этом клетки либо не были инфицированы, либо инфицированы MOI 5, 10 или 20.
На фиг. 17 показаны результаты вестерн-блоттинга клеток SK-N-MC, обработанных указанными концентрациями ингибитора CDK 4/6 LY-2835219 (абемациклиб) и ингибитора Wee-MK-1775 (адавосертиб) через 24 и 48 часов после обработки; Rb означает белок ретинобластомы; phRB означает фосфорилированный белок ретинобластомы; E2F-1 означает фактор транскрипции E2F-1; и GAPDH служил контролем загрузки.
На фиг. 18 показаны результаты анализа активности клеток SK-N-MC через 5 дней после инфицирования XVir-N-31, ингибитором CDK 4/6 абемациклибом и адавосертибом (ингибитор Wee MK-1775), выраженные в процентах выживаемости клеток.
На фиг. 19 показано распределение клеточного цикла после обработки клеток SK-N-MC указанными ингибиторами.
Фиг. 20 представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую влияние направленной на E2F1 миРНК на экспрессию E2F1 в различных клеточных линиях; ось Y: экспрессия E2F1, нормализованная по актину, в % от клеток, трансфицированных siCTRL.
Фиг. 21 представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую, что ингибирование E2F1 вызывает повышенную экспрессию E2 на ранней стадии в клетках T24, обработанных миРНК-E2F-1; ось Y: экспрессия аденовирусного гена, нормализованная к актину (в% от siCTRL).
Фиг. 22 представляет собой схему, показывающую расположение праймеров для определения экспрессии ранних E2 аденовируса.
На фиг. 23 представлена нуклеотидная последовательность E2-раннего промотора аденовируса дикого типа (вверху) и мутантного E2-раннего промотора, имеющего мутации в сайтах связывания E2F (внизу).
Фиг. 24 представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую экспрессию РНК в инфицированных AdWT-RGD и AdE2Fm (также содержащих мотив RGD в волокне) клетках Т24, полученных с помощью RT-qPCR через 24 часа после инфицирования; экспрессия гена AD-WT была установлена на 100%.
На фиг. 25 показаны различные ингибиторы CDK4/6, подходящие для использования по настоящему изобретению.
На фиг. 26 показаны различные ингибиторы PARP, подходящие для использования по настоящему изобретению.
На фиг. 27 показаны различные ингибиторы Bet, подходящие для использования по настоящему изобретению.
На фиг. 28 показана структура WT-Ad5 и аденовируса dl520, который представляет собой онколитический аденовирус, экспрессирующий только белок E1A12 посредством делеции CR3-домена гена E1A.
На фиг. 29 показана структура XVir-N-31, которая характеризуется делецией белка E1B19K, делецией 2 т.п.н. в области E3, делецией белка E1A13S и введением мотива RGD в волоконный белок.
На фиг. 30 показана структура Ad-Delta 24 и Ad-Delta 24-RGD, которые также описаны Kleijn et al. (Kleijn et al., PLoS One. 2014; 9 (5): e97495) и характеризуюся делецией CR2-домена гена E1A; они реплицируется только в опухолевых клетках с нарушенным регулированием пути ретинобластомы (Rb). Ad-Delta 24-RGD дополнительно содержит мотив RGD в утолщении волокна, как показано на XVir-N-31. Обращается внимание на то, что онколитический аденовирус dl922-947 похож на delta24, поскольку делеция в этом вирусе также находится в домене E1A-CR2 и влияет на связывание RB (белок ретинобластомы).
На фиг. 31 показана структура VCN-01, который представляет собой компетентный по репликации аденовирус, специально созданный для репликации в опухолях с дефектным путем RB, демонстрирует повышенную инфекционность за счет модифицированного волокна и улучшенное распределение за счет экспрессии растворимой гиалуронидазы (Pascual-Pasto et al. Sci Transl Med. 2019,11 476). Делеция в E1A а VCN-01 аналогична делеции в delta24 (делеция CR2-домена в E1A). Кроме того, экспрессия этого белка E1A регулируется путем введения сайтов связывания E2F в промотор E1A. Кроме того, он содержит мотив RGD в утолщении волокна и экспрессирует растворимую гиалуронидазу (Martínez-Vélez et al. 2016, Clin Cancer Res. 1; 22(9):2217-25. The Oncolytic Adenovirus VCN-01 as Therapeutic Approach Against Pediatric Osteosarcoma).
На фиг. 32 показана структура E1Adl1107 и E1Adl1101, в результате чего делеция этих двух онколитических аденовирусов влияет на связывание с p300 (гистонацетилтрансфераза p300, также известная как p300 HAT или связанный с E1A белок p300) или pRb (белок ретинобластомы) (Howe et al., MOLECULAR THERAPY 2000, 2, 485-495).
На фиг. 33 показана структура онколитического аденовируса CB016 и аденовируса 5 дикого типа (WT-Ad5), где делеция в домене E1A-CR2 аналогична Ad-Delta 24. Кроме того, CB016 содержит делецию в домене CR1. Кроме того, он содержит либо мотив RGD в волокне, либо волокно от серотипа 3 (LaRocca et al., Oral Oncol. 2016, 56, 25-31).
На фиг. 34 показана структура аденовируса ORCA-010, который содержит делецию E1AΔ24 в CR2-домене E1A, мутацию T1, повышающую эффективность в белке E3/19K, и модификацию RGD волокна, повышающую инфекционность (Dong et al., Hum Gene Ther. 1 октября 2014; 25(10): 897-904).
Пример 1
: Материалы и методы
Культура клеток
Клеточные линии рака мочевого пузыря человека культивировали в субконфлюэнтных условиях в среде RPMI или DMEM (Biochrom AG) при 5% или 10% CO2, соответственно, дополненной 10% FBS (Biochrom AG) и 1% NEA (Biochrom AG). В зависимости от клеточной линии и условий эксперимента 0,2-1×106, 0,5-1×105, 0,25-0,5×105 и 500-700 клеток засевали в 10 см, 6-луночном, 12-луночном и 96-луночном форматах, соответственно.
Клеточные линии
HeLaP
Клетки HeLa P (ATCC CCL-2) представляют собой эпителиальные клетки аденокарциномы шейки матки, названные в честь пациентки Генриетты Лакс. Эта клеточная линия является наиболее широко распространенной и самой старой клеточной линией (Rahbari et al., 2009), поскольку это была первая постоянная клеточная линия, созданная в 1951 году (Gey et al., 1952). Культивирование происходило в среде DMEM (10% FBS, 1% PS) в условиях 10% CO2 при 37ºC.
HeLaRDB
HeLaRDB представляет собой субклеточную линию линии клеток HeLaP с устойчивостью к даунобластину на основе сверхэкспрессии гликопротеина Р. Устойчивость была достигнута путем культивирования на среде, содержащей этот антрациклин. Этот цитостатический агент внедряется в последовательности двухцепочечной ДНК и ингибирует клеточную транскрипцию и репликацию (Mizuno et al., 1975). В результате стрессовых реакций, вызванных обработкой даунобластином, клеточный фактор YB-1 показывает более высокую ядерную локализацию по сравнению с родительской клеточной линией (Holm et al., 2004). Для поддержания устойчивости к даунобластину каждые 14 дней клетки культивировали в среде DMEM (10% FBS, 1% PS), содержащей 0,25 мкг/мл даунобластина, в условиях 10% CO2 при 37ºC.
A549
Клетки A549 (ATCC CCL-185) были выделены в 1972 г. из аденокарциномы базального альвеолярного отростка человека (Giard et al., 1973). Культивирование происходило в MEM Дульбекко (10% FBS и 1% PS) при 37ºC и 10% CO2.
T24
Клетки T24 (ATCC HTB-4) получены в 1970 г. из первичной карциномы мочевого пузыря человека (Bubenik, Baresovà et al., 1973). Из-за точечной мутации в гене HRAS (Reddy et al., 1982) активируются пути MAPK и PI3K. Более того, в этой линии клеток присутствует дополнительная мутация в локусе гена супрессора опухолей р53 (Pinto-Leite et al., 2014). Клетки культивировали с RPMI, содержащим 10% FCS, 1% PS и 1% заменимых аминокислот, при 37ºC в условиях 5% CO2.
HEK293
Клетки HEK293 (ATCC CRL-1573) представляют собой человеческие эмбриональные клетки почек, выделенные в 1973 году. Благодаря стабильной трансфекции части генома размером 4,5 т.п.н. аденовируса серотипа 5, который включает всю область E1 (Graham и Smiley, 1977), эта клеточная линия используется для производства Е1-дефицитных аденовирусов и для измерения титра вируса.
Таблица 1: Праймер
Название Компания | Прямой праймер Обратный праймер |
Волокно Eurofins | AAGCTAGCCCTGCAAACATCA CCCAAGCTACCAGTGGCAGTA |
E2-ранний Invitrogen |
CCGTCATCTCTACAGCCCAT GGGCTTTGTCAGAGTCTTGC |
E2-поздний Invitrogen |
CTTCCTAGCGACTTTGTGCC GTCAGAGTGGTAGGCAAGGT |
E1A 12S Metabion |
CGACGAGGATGAAGTCCTGTGTCTG CTCAGGATAGCAGGCGCCAT |
E1A 12S короткий Metabion |
GAGGATGAAGTCCTGTGT CTCAGGATAGCAGGCGCCAT |
E1A 13S Metabion |
TGTTTGTCTACAGTCCTGTGTCTG CTCAGGATAGCAGGCGCCAT |
E1A 13S короткий Metabion |
TTGTCTACAGTCCTGTGT CTCAGGATAGCAGGCGCCAT |
E4orf6 Metabion |
TCCCTCCCAACA CACAGAGT GACAGGAAACCG TGTGGAAT |
Rb Life Techno |
AGCAACCCTCCTAAACCACT TGTTTGAGGTATCCATGCTATCA |
E2F1 Life Technology |
ACGCTATGAGACCTCACTGAA TCCTGGGTCAACCCCTCAAG |
E2F2 Life Technology |
CGTCCCTGAGTTCCCAACC GCGAAGTGTCATACCGAGTCTT |
GAPDH MWG |
TGGCATGGACTGTGGTCATGAG ACTGGCGTCTTCACCACCATGG |
Актин Eurofins |
TAAGTAGGTGCACAGTAGGTCTGA AAAGTGCAAAGAACACGGCTAAG |
L4 33K Eurofins |
GAACCAGGGCCGCCCATACTG GGGCTTTGTCAGAGTCTTGC |
L4 22 K Eurofins |
CCGTTAGCCCAAGAGCAAC CGGCCGTGATGGTAGAGAAG |
L4HexAss Eurofins |
CTGTGGTACTTCCCAGAGAC CAGGTGAGTTATACCCTGCC |
Характеристики вируса
Ad-WT+AdWT-RGD: Мастаденовирус дикого типа, тип C, серотип 5 и ADWT с дополнительным мотивом RGD-волокна
AdWT-E2Fmut: Мастаденовирус, тип C, серотип 5, мутации в обоих сайтах связывания E2F E2-раннего промотора с дополнительным мотивом RGD-волокна и делецией размером 2,7 т.п.н. в области E3 (ΔE3)
XVir-N-31: Мастаденовирус, тип C, серотип 5 с делециями в области E1B (1,716-1915, 200 п.н.), области E3 (28,132-30,813) и делецией 12 оснований в области E1A. Реплицируется в раковых клетках, демонстрируя только ядерную экспрессию YB-1.
XVir-N-31/E2FM: Мастаденовирус, тип C, серотип 5 с делециями в E1B-области (1,716-1915, 200 п.н.), E3-области (28.132-30.813) и делецией 12 оснований в E1A-области. Реплицируется в раковых клетках, демонстрируя только ядерную экспрессию YB-1. Мутации в обоих сайтах связывания E2F E2-раннего промотора с дополнительным мотивом RGD-волокна и делецией размером 2,7 т.п.н. в области E3 (ΔE3)
Целевой ген | Конструкция миРНК | Производитель |
Контроль | Контроль (non-sil.) миРНК, 20 мкМ | Qiagen, Нидерланды |
E2F-1 | E2F-1 (SASI_Hs01_00162220), 10 мкМ | Sigma, Merck, Германия |
YB-1 | YBX1 миРНК FlexiTube, 10 мкМ | Qiagen, Нидерланды |
Методы
Трансфекция миРНК
Подавление определенных генов осуществляли с помощью трансфекции миРНК. Таким образом, 5 мкл реагента Lipofectamin RNAiMAX (Thermo Fischer) добавляли к 150 мкл Opti-MEM в одной пробирке и 36 пмоль миРНК объединяли с 150 мкл Opti-MEM в другой пробирке. После объединения содержимого обеих пробирок и кратковременного встряхивания раствор инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем 250 мкл комплекса миРНК-липид добавляли к 250000-1000000 клеток, засеянных в 6-луночные планшеты в предыдущий день, без изменения среды, до достижения конечной концентрации миРНК 30 пмоль на лунку. После 48 часов инкубации при 37ºC в условиях 10% CO2 имело место инфицирование или лизирование.
Количественное определение РНК в комбинации с миРНК
РНК также количественно определяли в клетках, в которых вирус объединяли с трансфекцией миРНК. При этом 125000 клеток были засеяны и на следующий день трансфицированы 30 пмоль миРНК-конструкции Ctrl-, YB-1- и E2F1-миРНК. Через 48 часов инкубации имело место инфицирование, и через 24 часа после инфицирования произошел лизис. Лизаты хранили при -20ºC.
Выделение РНК
Клетки промывали PBS и лизировали лизисным буфером (набор для выделения miRNA mirVana, Life Technologies) и переносили в реакционную пробирку на 1,5 мл. К лизатам добавляли 50 мкл добавки гомогената (набор для выделения miRNA mirVana, Life Technologies), ресуспендировали и инкубировали в течение 10 минут на льду. Добавляли 500 мкл смеси кислота-фенол-хлороформ, встряхивали в течение примерно 30 секунд и инкубировали в течение 2 минут на льду. После центрифугирования в течение 5 минут при комнатной температуре при 14000 g водную и органическую фазы разделяют. Верхнюю водную фазу переносили в новую защелкивающуюся крышку, объединяли и инвертировали с равным количеством изопропанола. После инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре образцы центрифугировали при температуре 4ºC и 14000 g в течение 30 минут. Затем супернатант удаляли, а осадок РНК промывали 1 мл 75% этанола. Образцы ненадолго центрифугировали при 7500 g в течение 5 минут при температуре 4ºC. После удаления супернатанта высушенный на воздухе осадок растворяли в 20 мкл воды, не содержащей нуклеазы, и инкубировали в течение 10 минут при 55ºC и 500 об/мин в термомиксере. Далее определяли концентрации РНК спектрофотометрическим методом. Чтобы избежать амплификации колей ДНК, проводили расщепление ДНКазой. При этом использовалась деоксирибонуклеаза I, набор для амплификации Deoxyribonuclease I, Amplification Grade-Kit от компании Invitrogen by life technologies. К 1 мкг РНК добавляли 1 мкл 10× реакционного буфера ДНКазы I и 1 мкл ДНКазы I, заполняли водой, обработанной DEPC, до конечного объема 10 мкл и инкубировали ровно 15 минут при комнатной температуре. При добавлении 1 мкл 25 мМ раствора ЭДТА ДНКаза I инактивируется и тем самым останавливается процесс переваривания ДНКазой. Образцы инкубировали в течение 10 минут при 65ºC, а затем использовали для обратной транскрипции..
Обратная транскрипция
Для перезаписи РНК в кДНК использовали набор для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Thermo Scientific). 2 мкг РНК расщепленных образцов ДНК добавляли к Mastermix, содержащей транскрипционный буфер, 100 мМ dNTP и ингибитор РНКазы, в мягких пробирках для ПЦР. При этом необходимо учитывать, что РНК, транскрибируемая через E2-ранний и E2-поздний промоторы, не может быть перезаписана случайными праймерами, обычно используемыми для обратной транскрипции, потому что эти случайные праймеры будут связываться с обеими цепями двухцепочечного аденовирусного генома. При этом перезапись с РНК на кДНК для образцов, используемых для количественного определения E2-раннего и E2-позднего, выполнялась с использованием специфического E2-раннего обратного праймера (таблица 1). Для гена «домашнего хозяйства» актина, который использовали для нормализации результатов, использовали случайный праймер.
Анализ репликации ДНК
Для исследования репликации вируса в инфицированных клетках был проведен анализ репликации ДНК. 125000 клеток высевали в 6-луночные планшеты и инфицировали 10-20 MOI. Через 2, соответственно, 8, 12, 24, 36 и 48 часов после инфицирования происходил лизис. При этом среду удаляли и прилипшие клетки промывали 1 мл PBS. После добавления 200 мкл буфера для лизиса ДНК прилипшие клетки отделяли от планшета с помощью скребка для клеток. Затем лизат переносили в защелкивающийся колпачок. Добавляли 3 мкл фермента протеиназы К и инкубировали при 56ºC и 550 об/мин в термомиксере в течение ночи. На следующий день проводили выделение ДНК.
Выделение ДНК
Для очистки ДНК к лизату добавляли 200 мкл смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт. После встряхивания и последующей инкубации в течение 5 минут на льду разделение фаз было достигнуто центрифугированием в течение 3 минут при 16430 g при температуре 4ºC. Верхнюю водную фазу переносили в новую защелкивающуюся крышку, содержащую 200 мкл хлороформа и 20 мкл крезолового красного в 10 мМ TrisCl для лучшей визуализации фаз. После встряхивания и инкубации в течение 5 минут в течение 5 минут на льду центрифугировали в течение 3 минут при 16430 g при температуре 4ºC. Снова верхнюю водную фазу объединяли с 800 мкл этанола и 50 мкл 3М раствора ацетата натрия. Добавляли 2 мкл гликогена для достижения лучшего осаждения. После непродолжительного переворачивания пробирки раствор центрифугировали 30 минут при 16430 g при температуре 4ºC. После этого осадок ДНК покрывали 400 мкл 70% этанола и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. После центрифугирования в течение 7 минут при 4760 g при комнатной температуре осадок ДНК сушили в течение примерно 5-10 минут при 37ºC. Затем гранулы растворяли в 100 мкл 0,1×TE-буфера и встряхивали при 40ºC при 400 об/мин в течение приблизительно 3 часов. Когда ДНК полностью растворялась, определяли концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра, используя 2 мкл раствора ДНК для измерения и 0,1×TE-буфер в качестве холостого раствора. Затем ДНК хранили при температуре 4ºC.
qPCR
Для дальнейшего количественного определения использовали количественную ПЦР в реальном времени. Использовали 5 мкл матричной ДНК или кДНК в конечной концентрации 10 нг/мкл. qPCR выполняли с использованием 10 мкл Mastermix GoTaq qPCR (Promega Corporation) (7,5 мкл Mastermix, 1,5 мкл праймера, 1 мкл H2O) и 5 мкл матрицы ДНК в 96-луночном планшете, пипетированных в виде дубликатов. Относительную количественную оценку выполняли с использованием метода сравнительной КТ с двумя генами-нормализаторами. Планшет закрывали фольгой и центрифугировали при комнатной температуре в течение 2 минут при 220 g. Затем планшет инкубировали в соответствии с определенной температурно-временной программой в термоциклере. Используемые праймеры перечислены в таблице 1. Реакции проводили на системе обнаружения ПЦР в реальном времени CFX96 (Bio-Rad Laboratories).
Условия циклирования qPCR
Волокно: 94ºC в течение 2 минут, 94ºC в течение 15 секунд, 60ºC в течение 15 секунд и 72ºC в течение 15 секунд, в течение 45 циклов
Другие вирусные гены: 94ºC в течение 1,5 минут, 94ºC в течение 15 секунд, 58ºC в течение 15 секунд и 72ºC в течение 15 секунд, в течение 45 циклов.
Rb: 94ºC в течение 2 минут, 94ºC в течение 15 секунд, 60ºC в течение 30 секунд и 72ºC в течение 1 минуты, для 44 циклов
E2Fs: 95ºC в течение 2 минут, 95ºC в течение 15 секунд, 60ºC в течение 30 секунд и 72ºC в течение 30 секунд, для 40 циклов
Выделение белка
Клетки лизировали с использованием 1% SDS-буфера, чтобы добиться разрушения ядерной мембраны. Чтобы избежать денатурации белков, весь процесс проводился на льду. После отсасывания среды клетки дважды промывали холодным PBS. Прилипшие клетки одной лунки дублированного подхода лизировали 200 мкл 1% буфера SDS и соскабливали с помощью скребка для клеток. Затем лизат переносили в другую лунку дублированного подхода и снова соскребали. Затем лизат из обеих лунок переносили в пробирку с защелкивающимся колпачком. Затем лизаты обрабатывали шприцем для разрушения вязкой ДНК и центрифугировали в течение 30 минут при температуре 4ºC со скоростью 31000 об/мин. Поскольку в супернатанте присутствовали белки, супернатант переносили в новую пробирку с защелкивающимся колпачком и использовали на следуюших стадиях.
Количественное определение белка
Чтобы количественно определить долю белка, был проведен анализ бицинхониновой кислоты (BCA) с помощью набора Pierce TM BCA Protein Kit. При этом 112,5 мкл раствора BCA A+B (50:1) и 12,5 мкл образца добавляли в одну лунку 96-луночного планшета и инкубировали в течение 30 минут при температуре 37ºC. В зависимости от концентрации белка происходило окрашивание раствора. С помощью стандартной серии с известными концентрациями белка фотометрическим измерением при 562 нм в считывающем устройстве для микропланшетов определяли концентрации белка в образцах.
SDS-гель-электрофорез
Для разделения белков при последующем электрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия рассчитанные количества лизата и лизисного буфера смешивали с 15 мкл смеси загрузочный буфер-DDT (6:1). Затем вещества, нагружающие белок, готовили в течение пяти минут при температуре 100ºC. Затем в гель загружали 5 мкл стандарта окрашенного белка и 40 мкл образцов. Для разделения белков с обнаружением вирусных белков использовали 10% гель. Для разделения белков с обнаружением вирусных белков использовали 10% гель. Для изучения генов с пониженной регуляцией через миРНК использовали 12% гели. Состав разделяющего и концентрирующего гелей указан в разделе «Буферы и растворы». В течение примерно 20 минут гель работал в TGS-буфере при 90 В для концентрации всех белков в одной полосе. Затем гели работали в течение приблизительно 60 минут при 150 В в буфере TGS для разделения белков по размеру.
Вестерн-блоттинг
Для переноса белков из геля на мембрану ее подвергали блоттингу методом вестерн-блоттинга. Чтобы активировать гидрофобную PVDF-мембрану ее инкубировали в течение примерно 2 минут в метаноле. Затем мембрану вместе с губчатыми веществами, фильтровальной бумагой и гелем осаждали в буфере для блоттинга. Посредством электрофореза в течение приблизительно двух часов при 100 В при температуре 4ºС белки переносили на мембрану в буфере для блоттинга. Чтобы избежать неспецифического связывания антител мембрану блокировали вращением в течение одного часа при комнатной температуре в 10 мл 5% сухого молока в TBST для анализа клеточных белков, соответственно, в 5 мл 5% BSA-TBST для последующего использования антител, обнаруживающих вирусные белки. После пятикратной промывки мембраны в TBST в течение пяти минут каждую мембрану инкубировали с раствором первичных антител при температуре 4ºС, вращая в течение ночи. Для антител GAPDH, E1A, E1B55K, E2A и E4orf6 эту стадию осуществляли в течение одного часа при комнатной температуре. При этом антитела разбавляли различными факторами в 5% BSA в TBST с 0,02% азидом натрия. После дополнительных пяти стадий промывки мембрану инкубировали при вращении в течение 30 минут при комнатной температуре при разведении вторичного антитела 1:10000. Вторичные антитела (антимышиные) к вирусным антителам разводили в 5% BSA-TBST, все остальные в 5% сухом молоке в TBST. Эти вторичные антитела были конъюгированы с пероксидазой хрена. После пяти заключительных стадий промывки мембрану инкубировали пять минут в растворе с усиленной хемилюминесценцией (ECL) для визуализации сигнала пероксидазы. Для мембран, инкубированных с первичными антителами DP-1 и E2F-1, использовался реагент Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent от GE-Healthcare для достижения более ярких сигналов, для всех остальных использовались растворы ECL, полученные в лаборатории. Состав ECL A и ECL B, которые смешивали незадолго до использования в соотношении 1:1, перечислены в разделе «Буферы и растворы». Наконец, белки могут быть обнаружены посредством проявления сигнала на пленке.
Антитела:
Киназа контрольной точки 1 (sc-377231, Santa Cruz Biotechnology)
общий RB (554136, BD Biosciences)
фосфо RB Ser 780 (8180, Cell Signaling Technology)
E2F1 (sc-251, Santa Cruz Biotechnology)
E2F2 (ab138515, abcam)
E2F3 (PG37, Thermo Fisher Scientific)
E2F4 (WUF10, Thermo Fisher Scientific)
E2F5 (sc-999, Santa Cruz Biotechnology)
циклин D1 (92G2, Cell Signaling Technology)
циклин E2 (4132, Cell Signaling Technology)
CDK2 (78B2, Cell Signaling Technology)
GAPDH (14C10, Cell Signaling Technology)
актин (A2066, Sigma-Aldrich Chemie GmbH)
E1A (sc-25, Santa Cruz Biotechnology)
E1B55k (любезно предоставлено компанией M. Dobbelstein)
E4orf6 (любезно предоставлено компанией M. Dobbelstein
E2A (DBP, любезно предоставлено компанией M. Dobbelstein)
Гексон (ABIN2686029, Antibodies online)
Обработка низкомолекулярными ингибиторами
Изетионат PD-0332991 (палбоциклиб, Sigma-Aldrich Chemie GmbH) и LY-2835219 (абемациклиб, Selleck Chemicals) растворяли в стерильной воде в виде 10 мМ исходного раствора. LEE011 (рибоциклиб, MedChem Express) и нутлин-3a (Sigma) растворяли в ДМСО в виде 10 мМ и 5 мкМ маточного раствора, соответственно. Рабочие концентрации были приготовлены для немедленного использования.
Инфицирование вирусом и комбинированная обработка
Для определения индуцированного вирусом уничтожения клеток клетки высевали в 12-луночные планшеты. Для комбинированной обработки PD-033299, LY-2835219 и LEE011 клетки предварительно обрабатывали ингибиторами в течение 24 часов. Клетки инфицировали указанными вирусами при указанной MOI в 200-400 мкл среды без FBS. При 1 hpi к клеткам добавляли полную среду с низкомолекулярными ингибиторами или без них.
Жизнеспособность клеток (анализ SRB)
Клетки фиксировали 10% TCA в течение 1 часа при температуре 4ºС и окрашивали 0,5% сульфородамином B (SRB, Sigma-Aldrich Chemie GmbH) в 1% уксусной кислоте в течение 30 минут при комнатной температуре с последующей промывкой 1% уксусной кислотой чтобы удалить излишки СРБ. Высушенный SRB растворяли в 10 мМ Трис-буфере, и количественное определение выполняли фотометрическим измерением при 590 нм..
Титровальный тест
Для определения продукции инфекционных вирусных частиц инфицированные клетки и супернатант собирали в трех точках на дюйм с использованием скребков для клеток. Вирус высвобождался из интактных клеток с помощью нескольких циклов замораживания-оттаивания с последующим центрифугированием при 1600 rcf (относительное ускорение центрифуги). Супернатанты клеточных лизатов тестировали на продуцирование вирусных частиц с использованием клеток Hek293, как описано в руководстве по набору AdEasy Viral Titer Kit (972500). Использовали следующие реагенты: козье анти-гексон антитело (1056, Chemicon), кроличье антикозье антитело (P0449, Dako), раствор DAB (Dako).
Пример 2
: Влияние ингибитора CDK4/6 PD0332991 на репликацию E1-минус аденовируса
Было показано, что аденовирус с удаленным E1 реплицируется в раковых клетках, хотя и с очень низкой эффективностью. Клетки Т24 инфицировали 100 MOI Е1-минус аденовируса, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок (Ad-GFP), и обрабатывали 500 нМ PD0332991 за день до инфицирования и во время инкубации. В таких условиях наблюдалось увеличение экспрессии GFP, что указывает на E1A-независимую вирусную репликацию и экспрессию гена, опосредованную активацией E2-раннего промотора аденовируса.
Пример 3
: Комбинированное применение аденовируса дикого типа или XVir-N-31 вместе с различными ингибиторами CDK4/6.
На основании результатов с использованием аденовируса Ad-WT/E2M с ранней мутацией E2 и Ad-GFP в комбинации с PD0332991, были проведены эксперименты с использованием различных ингибиторов CDK4/6 в комбинации с аденовирусом Ad-WT дикого типа или XVir-N-31. Поскольку эти агенты делают арест клеток в фазе G1, было неожиданным обнаружить, что все ингибиторы способны поддерживать репликацию вируса.
Далее было исследовано, может ли обработка клеток тремя клинически продвинутыми ингибиторами CDK4/6 PD-033299, LY-2835219 и LEE011 влиять на воздействие инфицирования на жизнеспособность клеток, репликацию вируса и продукцию титра вируса.
После обработки все три ингибитора проявляли сходные эффекты на уровень экспрессии и фосфорилирования RB, которые были описаны ранее в многочисленных публикациях. После почти полного дефосфорилирования, а также подавления общего белка через 24 часа, уровень фосфорилирования частично восстанавливался с течением времени. Уровень CDK2 повышался после обработки, а уровень циклина D2, а также циклина E2 снижался.
Пример 4
: Синергетические эффекты, возникающие при комбинации ингибиторов CDK4/6 и онколитических аденовирусов
Ингибиторы CDK4/6 PD-033299, LY-2835219 и LEE011 были объединены с инфицированием клеток аденовирусом. Инфицирование клеток происходило через 24 часа после обработки, поскольку последующее воздействие на молекулы-мишени можно обнаружить только между 8 и 24 часами после обработки.
Результаты показаны на фиг. 1.
Ингибиторы CDK4/6 индуцировали синергетический эффект на жизнеспособность клеток, репликацию вируса и титр вируса. (a) Клетки предварительно обрабатывали тремя ингибиторами CDK4/6 PD-033299, LY-2835219 и LEE011 в течение 24 часов и инфицировали XVir-N-31 (Moi 60) или аденовирусом дикого типа (Moi 80). Через четыре дня после инфицирования жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа SRB. На графиках показаны средние значения минимум трех независимых экспериментов. (b) Через три дня после инфицирования из клеток готовили лизаты и проводили титровальный тест на клетках HEK293. Титр вируса показан как кратное изменение относительно контроля. (c) ДНК экстрагировали из инфицированных клеток через 4, 24, 36 и 48 hpi и анализировали на вирусную репликацию с помощью кПЦР для кДНК волокна. Значения нормализованы к GAPDH при 4 hpi. На графиках представлены как минимум два независимых эксперимента. Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку.
Как видно из фиг. 1, все три ингибитора CDK4/6 наглядно поддерживали лизис клеток (фиг. 1a), репликацию внутри клеток (фиг. 18) и образование вирусных частиц (фиг. 1b).
Пример 5
: Влияние ингибитора CDK4/6 палбоциклиба (PD-033299) на уровень экспрессии выбранных вирусных белков
Чтобы проанализировать эти эффекты более подробно, уровень экспрессии выбранных вирусных белков определяли в обработанных или необработанных клетках. Для этого эксперимента в качестве типичного ингибитора CDK4/6 использовали ингибитор палбоциклиб (PD-033299). Клетки инфицировали с MOI, равным 15. Обработка PD 500 нМ происходила в течение 24 часов и до тех пор, пока не происходило выделение белка. Через 12, 24 и 36 часов осуществляли выделение белка с использованием 1% SDS-буфера. Актин был включен в качестве положительного контроля. Поскольку контроль загрузки показывает одинаковые уровни белка клеточного актина во всех линиях, обеспечивается надлежащее сравнение между линиями. hpi: часы после инфицирования.
Результаты показаны на фиг. 2, где представлены результаты экспрессии вирусного белка клеток Т24, инфицированных Ad-WT и XVir-N-31, в комбинации с ингибитором CDK4/6 PD0332991 (PD). Все вирусные белки, исследованные в этом эксперименте (E1A, E1B-55k, DBP (E2A) и гексон), были экспрессированы на более высоком уровне в клетках, обработанных ингибитором CDK4/6 PD-0332991, по сравнению с вирусом аденовируса дикого типа. Этот эффект можно было наблюдать уже через 12 hpi для E1A и 24 hpi для других белков.
Пример 6
: Специфичность эффектов, опосредованных ингибиторами CDK4/6
Класс ингибиторов CDK4/6 согласно примеру 5 требует экспрессии RB. Поэтому использовали три RB-положительные и две RB-отрицательные клеточные линии, происходящие от рака мочевого пузыря, и клетки, обработанные комбинированными препаратами. Клеточные линии предварительно обрабатывали в течение 24 часов PD-0332991 (T24: 500 нМ, RT112: 2000 нМ, 253J: 100 нМ) с концентрацией IC50 и инфицировали XVir-N-31(T24 MOI50, 253J MOI 25, RT112 MOI450). Значения представляют собой среднее значение минимум 2 независимых экспериментов. Планки погрешностей показывают стандартную ошибку. Четыре точки на дюйм, жизнеспособность клеток измеряли с помощью тестов SRB (a, c). (b, d) Лизаты клеток готовили с разрешением 3 точки на дюйм, и титровальный тест проводили на клетках Hek293. Титр вируса показан как кратное изменение относительно контроля.
Результаты показаны на фиг. 3.
Как видно из фиг. 3, только линии клеток, положительные по RB, показали значительное снижение роста и жизнеспособности клеток, соответственно (фиг. 3 a, c). Кроме того, образование вирусных частиц увеличивалось только в RB-положительных клеточных линиях после обработки PD-0332991 (фиг. 3b, d).
Пример 7
: Эффект комбинированной обработки ингибитора CDK4/6 PD-0332991 с XVir-N-31
Чтобы исследовать влияние PD-0332991 на репликацию вирусов в RB-положительных клеточных линиях, проводили относительную количественную оценку копий ДНК волокна с помощью кПЦР. Клеточные линии рака мочевого пузыря предварительно обрабатывали в течение 24 часов и инфицировали XVir-N-31 (T24 MOI 40, UMUC3 и 253J MOI 20, RT112 MOI 400). ДНК экстрагировали 24-48 hpi и анализировали на вирусные волокна с помощью КПЦР. Значения нормализовали к GAPDH. Данные являются характерными как минимум для двух независимых экспериментов; планки погрешностей S.D.
Результаты показаны на фиг. 4.
Как можно понять из фиг. 4, комбинированная обработка ингибитором CDK4/6 PD-0332991 с XVir-N-31 резко увеличивает репликацию вируса.
Пример 8
: Временная кинетика ингибиторов CDK4/6
Временная кинетика ингибиторов CDK4/6 на дефосфорилирование и деградацию RB составляет около 10 часов после обработки клеток. Кроме того, представленные выше результаты показали частичное восстановление целей RB в направлении 3ʼ с течением времени (фигура 1). Это наблюдение подразумевает, что временная кинетика ингибитора CDK4/6 и его влияние на вызванную вирусом гибель клеток являются важным параметром для этой комбинированной терапии, как показано в примере 7. Для применения комбинированной терапии были протестированы различные временные точки для предварительной обработки клеток. В соответствии с этим клетки обрабатывали либо до (день/час до инфицирования, день/час), либо через 1 час после инфицирования, и рост клеток определяли с использованием анализа SRB. Планки погрешностей представляют S.E., а значения являются средним значением трех независимых экспериментов.
Результаты показаны на фиг. 5.
Как видно из фиг. 5, для увеличения гибели клеток уже было достаточно параллельной обработки.
Пример 9
: Комбинированная обработка различных аденовирусов ингибитором CDK4/6 PD0332991
Этот пример был выполнен, чтобы предоставить экспериментальные доказательства того, что для уничтожения могут использоваться клеток различные онколитические аденовирусы вместе с ингибиторами CDK4/6, такими как PD0332991, и что наблюдаемое увеличение репликации вирусов и уничтожение клеток не ограничивалось XVir-N-31. В соответствии с этим раковые клетки Т24 с Ad-Delta24 и Onyx-015 были следующими: клетки рака мочевого пузыря Т24 были инфицированы 20 MOI указанных онколитических аденовирусов. Обработка 500 нМ ингибитора CDK4/6 PD0332991 проводилась за один день до инфицирования и в течение 4 дней после инфицирования. Фотографии были сделаны через 4 дня после инфицирования. Возникновение цитопатического эффекта (ЦПЭ) указывает на репликацию вируса и гибель клеток.
Результаты показаны на фиг. 6.
Как видно из фиг. 6, ингибитор CDK4/6 PD0332991 в качестве характерного примера ингибиторов CDK4/6, снижающих фосфорилирование RB, увеличивает гибель клеток в сочетании с другими онколитическими аденовирусами, такими как Ad-Delta24 и Onyx-015.
Пример 10
: Инфицирование клеток Т24 рекомбинантным аденовирусом с удаленным E1, экспрессирующим GFP (Ad-минус/GFP), в комбинации с палбоциклибом вызывает повышение экспрессии GFP
100000 клеток Т24 на лунку высевали в 6-луночные планшеты и выращивали в среде RPMI, содержащей 10% FCS при 5% CO2 при 37ºC. Клетки Т24 обрабатывали 500 нМ палбоциклиба за 24 часа до и опять через 1 час после инфицирования. Инфицирование аденовирусом с делецией E1, экспрессирующим GFP (Ad-минус/GFP), происходило в 400 мкл среды без сыворотки. Снимки были сделаны через 48 часов после инфицирования с использованием флуоресцентного микроскопа с 10-кратным увеличением.
Результат флуоресцентного микроскопического анализа экспрессии GFP с обработкой палбоциклибом и без нее показан на фиг. 7.
Результат показывает, что обработка клеток Т24 палбоциклибом вызвала сильное увеличение экспрессии GFP, которое опосредовано репликацией вирусной ДНК, индуцированной палбоциклибом.
Пример 11
: E1A-независимая репликация вируса в клетках UMUC, обработанных различными ингибиторами клеточного цикла
Чтобы исследовать различия в репликации dl703 (Mantwill et al. 2013, Journal of Translational Medicine, 11, 216) при различных условиях обработки был проведен анализ репликации ДНК. 100000 клеток UMUC высевали в 6-луночные планшеты и выращивали в среде DMEM, содержащей 10% FCS в условиях 5% CO2 при 37ºC. Через 24 часа после посева клетки обрабатывали в течение 24 часов 10 мкМ Lee (рибоциклиб), 1 мкМ CI-1040, 10 мкМ нутлин-3a и 10 мкМ росковитин, а затем снова после инфицирования добавляли в среду соответствующее количество ингибиторов. Инфицирование 50 MOI dl703 (мастаденовирус, тип C, серотип 5 с делецией размером 3,2 т.п.н. в области E1) происходило через 24 часа после обработки. Через 4 и 48 часов после инфицирования выделяли ДНК и проводили количественную ПЦР с использованием специфических праймеров для гена вирусного волокна. Волокно fwd. 5ʼ-AAGCTAGCCCTGCAAACATCA-3ʼ; Волокно rev. 5ʼ-CCCAAGCTACCAGTGGCAGTA-3ʼ.
Результаты показаны на фиг. 8.
Как видно из фиг. 8, обработка клеток UMUC ингибитором CDK 4/6 LEE011 (рибоциклиб) вызывала резкое увеличение репликации вирусной ДНК E1-минус аденовируса dl703 (почти в 100 раз). Это увеличение убедительно свидетельствует о том, что специфически индуцированный G1-арест рибоциклибом в сочетании с ингибированием экспрессии E2F-1 способствует независимой от E1 репликации аденовирусов. Как следствие, не только вирусы со специфическими делециями в гене E1A демонстрируют усиленную репликацию аденовирусной ДНК при обработке CDK 4/6, но даже аденовирусы с полной делецией гена E1A демонстрируют усиление репликации вирусной ДНК.
Хотя Mek-ингибитор GI-1040 продемонстрировал аналогичные свойства в отношении ингибирования экспрессии E2F-1 и ареста G1, репликация была намного ниже по сравнению с клетками, обработанными рибоциклибом. Это может быть связано с тем, что одновременно ингибируются другие важные пути, связанные с клеточным циклом, такие как MEK/ERK, который необходим для репликации вируса. Кроме того, было показано, что ингибирование пути MEK/ERK снижает образование частиц более чем в 100 раз, что делает его непригодным в клинических условиях для комбинированной терапии с репликацией онколитического аденовируса (Schümann и Doppelstein 2016, Cancer Research, 66, 1282-1288).
Пример 12
: Вестерн-блот-анализ клеток UMUC, обработанных указанными ингибиторами клеточного цикла
Вестерн-блоттинг клеток UMUC, обработанных указанными концентрациями CI-1040, росковитина, нутлина-3а и LEE011 (рибоциклиб). 1×106 клеток высевали в чашки диаметром 10 см. Через 24 часа после обработки белки выделяли с использованием 1% SDS-буфера, чтобы добиться разрушения ядерной мембраны. Все образцы набирали несколько раз в шприц для разрушения ДНК и затем центрифугировали при 30000 об/мин при температуре 4ºC в течение 30 минут. Супернатант переносили в новую реакционную пробирку и непосредственно использовали для дальнейших стадий или хранили при температуре -80ºC. Для разделения белков проводили электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Посредством электрофореза в течение приблизительно двух часов при 100 В при температуре 4ºC загружали 40 мкг общих белков и зондировали их против специфических указанных антител.
Результаты показаны на фиг. 9A, 9B и 9C.
Как видно из фиг. 9, в то время как росковитин и нутлин-3a не оказывали выраженного эффекта на экспрессию Rb, phRB и E2F-1, LEE-011 (рибоциклиб) при 10 мкМ и MI-1040 при 1 мкМ индуцировали ингибирование E2F-1, а также экспрессию Rb и phRb.
Пример 13
: Анализ ингибиторов CDK 4/6 на репликацию вирусной ДНК аденовируса dl703, дефектного по репликации с удаленной E1
Для анализа клеточного цикла клетки высевали в 6-луночные планшеты (2,5×10E4 с/лунку). За 8 часов до инфицирования dl703 клетки обрабатывали указанной концентрацией ингибиторов клеточного цикла. После инфицирования 10 MOI клетки dl703 снова обрабатывали в течение 48 часов. Контролем служили необработанные клетки и клетки, инфицированные только dl703. Через 48 часов после инфицирования клетки собирали трипсинизацией и фиксировали 80% этанолом при встряхивании. Чтобы исследовать статус клеточного цикла, фиксированные клетки центрифугировали 5 мин при комнатной температуре и 300 g и аспирировали этанол. Клетки ресуспендировали и промывали 1% BSA-PBS (бычий сывороточный альбумин) и снова центрифугировали. Клетки окрашивали EDU и анализ клеточного цикла выполняли с использованием наборов для проточной цитометрии Click-iTTM Plus EdU, каталожные номера C10632 от компании Thermo Fischer. Кроме того, после трехкратной промывки 1% BSA/PBS клетки окрашивали PI (пропидиум йод, 50 мкг/мл). Измерение проводили непосредственно после окрашивания с помощью системы проточной цитометрии FACScalibur. Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo.
Характеристики ингибиторов CDK4/6
CI1040: двойная специфическая треонин/тирозинкиназа, киназа митоген-активированная протеинкиназы (MEK), является ключевым компонентом пути передачи сигналов RAS/RAF/MEK/ERK, который часто активируется в опухолях человека. CI-1040 представляет собой бензгидроксаматное соединение, которое сильно ингибирует MEK (Allen et al. 2003, Semin Oncol. (5 Suppl 16):105-16) и вызывает арест G1.
Нутлин-3a: Нутлин-3, низкомолекулярный антагонист MDM2, эффективно восстанавливает функцию p53 как в нормальной экспрессии MDM2, так и в линиях клеток со сверхэкспрессией MDM2 с p53 дикого типа, что приводит к аресту клеточного цикла и апоптозу (Wang et al 2012, Acta Biochimica et Biophysica Sinica, том 44, пункт 8, 1 августа 2012, стр. 685-691).
Росковитин (селициклиб или CYC202) является экспериментальным лекарственным средством-кандидатом в семействе фармакологических ингибиторов циклин-зависимой киназы (CDK), которые предпочтительно ингибируют несколько ферментных мишеней, включая CDK2, CDK7 и CDK9, которые изменяют фазу роста или состояние в пределах клеточного цикла обработанных клеток (Whitaker et al. 2004, Cancer Research 64, 262-272).
LEE011 (рибоциклиб; торговое название Kisqali]) является ингибитором циклина D1/CDK4 и CDK6 и используется для лечения некоторых видов рака молочной железы. Ингибирование CDK 4/6 вызывает арест клеточного цикла G1 и ингибирование экспрессии E2F-1 (Kim S. et al, Oncotarget. 16 октября 2018; 9(81):35226-35240; Yang C et al., Oncogene (2017) 36, 2255-2264).
Результаты показаны на фиг. 10.
Ингибиторы CDK 4/6 LEE011 (рибоциклиб) и CI-1040 вызывали явный арест G1. Обработка росковитином показала небольшое увеличение количества арестованных клеток G2/m. Нутлин-3a в используемой концентрации оказывал незначительное влияние на клеточный цикл или не оказывал никакого влияния на него. Инфицирование клеток UMUC рекомбинантным E1-удаленным (не имеющим белка E1A) аденовирусом dl703 существенно не меняло распределение клеточного цикла.
Пример 14
: Палбоциклиб увеличивал окрашивание гексоном аденовируса in vitro после обработки.
Линии клеток мочевого пузыря RT112, T24 и UMUC высевали в 6-луночные планшеты (2×105 клеток/лунку). Через сутки после посева клетки обрабатывали 500 нМ палбоциклиба в течение 24 часов до и опять через 1 час после инфицирования. Инфицирование указанными MOI AD-WT происходило в 400 мкл среды DMEM, не содержащей сыворотки. Окрашивание гексоном проводили в соответствии с инструкциями производителя с использованием титровального набора Adeasy Viral Titer Kit от компании Agilent (номер по каталогу 972500) через два дня после инфицирования.
Результаты показаны на фиг. 11.
Как видно из фиг. 11, обработка палбоциклибом (500 нМ) в качестве иллюстративного ингибитора CDK4/6 значительно увеличивала количество гексон-положительных клеток в клетках, обработанных палбоциклибом, через 48 часов после инфицирования, что показано коричневым/красным цветом. Следует сделать вывод, что большее количество клеток, подвергшихся обработке палбоциклибом, способно продуцировать вирусные частицы и показывать усиление репликации вирусной ДНК, поскольку экспрессия гексона аденовируса происходит исключительно в начале репликации вируса.
Из результатов, приведенных в примерах 10-14, очевидно, что только ингибиторы CDK4/6, но никакие другие ингибиторы клеточного цикла не способны увеличивать репликацию и экспрессию генов дефектного по репликации аденовируса (dl703, не содержащего генов E1) и Ad-GFP. Кроме того, ингибитор CDK4/6 для обеспечения такой повышенной репликации вируса и экспрессии гена должен вызывать арест G1 (инфицированных) клеток и ингибирование экспрессии F2F1.
Пример 15
: Обработка клеток Т24 с использованием тройной терапии, включающей XVir-N-31, палбоциклиб и ингибитор PARP
Чтобы продемонстрировать эффективность тройной терапии клеток T24 с использованием тройной терапии, включающей XVir-N-31, палбоциклиб и ингибитор PARP (BMN673 (талазолариб)), был проведен анализ активности.
12500 клеток Т24 высевали на лунку в 12-луночные планшеты и выращивали в течение ночи в среде RPMI, содержащей 10% FCS, при температуре 37ºC. Обработка клеток ингибитором происходила через 24 часа после посева клеток и опять через 1 час после инфицирования путем добавления указанной концентрации в среду. Инфицирование клеток происходило через 24 часа после обработки ингибитором в 250 мкл среды без сыворотки. Фиксацию и окрашивание SRB проводили через 4 дня после инфицирования. PD, палбоциклиб; PARPi: BMN673.
Для окрашивания SRB среду удаляли аспирацией. Клетки фиксировали 1 мл (на лунку) 10% холодной TCA при температуре 4ºC в течение 1 часа. TCA удаляли путем аспирации, а слои клеток промывали 4 раза водопроводной водой. Клетки окрашивали 1 мл (на лунку) 0,5% SRB (сульфородамин B) в 1% уксусной кислоте в течение 30 мин. Несвязанный SRB удаляли за пять стадий промывки 1 мл 1% уксусной кислоты на лунку; после каждой стадии промывки уксусную кислоту удаляли аспирацией. Планшеты сушили на воздухе в течение 2 часов. Для солюбилизации окрашенных SRB клеток в каждую лунку добавляли 200 мкл 10 мМ трис-основания. После этого 20 мкл соответственно распределяли в лунки 96-луночного планшета. 96-луночный планшет загружали в устройство для чтения планшетов для ELISA и измеряли поглощение образцов при 560 нм. Макетные обработанные клетки имели 100% выживаемость клеток.
Результаты показаны на фиг. 12.
Результаты, показанные на фиг. 12, ясно демонстрируют, что тройная терапия, состоящая из палбоциклиба, BMN673 и XVir-N-31, показала превосходные характеристики по сравнению с моно- или комбинированной терапией в отношении уничтожения клеток. Почти 90% уничтожения клеток может быть достигнуто с использованием 10 MOI XVir-N-31 в сочетании с ингибитором PARP PARPi (BMN673) и ингибитором CDK4/6 палбоциклибом (PD). Комбинация PARPi и палбоциклиба, не содержащая XVir-N-31, убила только 65% клеток. Клетки T24 и клетки UMUC чувствительны к ингибиторам CDK 4/6 (обеспечивая арест G1 с подавлением E2F-1).
Пример 16
: Кинетика тройной терапии, включающей XVir-N-31, палбоциклиб и ингибитор PARP
Чтобы продемонстрировать кинетику тройной терапии клеток Т24 с использованием тройной терапии, включающей XVir-N-31, палбоциклиб и ингибитор PARP (BMN673 (талазолариб)), был проведен анализ активности, и эффективность оценивалась в разные моменты времени.
3000 клеток Т24 высевали на лунку в 12-луночные планшеты и выращивали в течение ночи в среде RPMI, содержащей 10% FCS, при температуре 37ºC. Обработка клеток ингибитором происходила через 24 часа после посева клеток и опять через 1 час после инфицирования путем добавления указанной концентрации в среду. Инфицирование клеток происходило через 24 часа после обработки ингибитором в 250 мкл среды без сыворотки. Фиксацию и окрашивание SRB проводили через 1-5 дней после инфицирования (dpi: дни после инфицирования). 15 нМ PARPi соответствуют значению IC-80 в клетках Т24.
Результаты показаны на фиг. 13.
Как видно из фиг. 13, тройная терапия с использованием помимо XVir-N-31 ингибитора CDK4/6 (палбоциклиба (PD) и ингибитора PARP PARPI (BMN673) с кинетической точки зрения также намного более эффективна, чем монотерапия с использованием только XVir-N-31 или комбинированная терапия с использованием XVir-N-31 либо ингибитора PARP, либо ингибитора CDK4/6. Важно отметить, что повторный рост опухолевых клеток был значительно снижен на 4 и 5 день в линиях клеток, чувствительных к CDK 4/6, UMUC и T24 (dpi: дни после инфицирования).
Пример 17
: Кинетика тройной терапии, включающей XVir-N-31, палбоциклиб и ингибитор PARP
Чтобы продемонстрировать кинетику тройной терапии клеток UMUC с использованием тройной терапии, включающей XVir-N-31, палбоциклиб и ингибитор PARP (BMN673 (талазолариб)), был проведен анализ эффективности, и эффективность оценивалась в разные моменты времени.
Посев UMUC-3: 3000 клеток высевали на лунку в 12-луночные планшеты и выращивали в течение ночи в среде DMEM, содержащей 10% FCS, при температуре 37ºC. Обработка клеток ингибитором происходила через 24 часа после посева и опять через 1 час после инфицирования путем добавления указанной концентрации в среду. Инфицирование клеток происходило через 24 часа после обработки ингибитором. Фиксацию и окрашивание SRB проводили через 1-6 дней после инфицирования (dpi: дни после инфицирования). 160 нМ PARPi соответствуют значению IC-80 в ячейках UMUC3.
Результаты показаны на фиг. 14.
Результаты, показанные на фиг. 14, ясно демонстрируют, что тройная терапия, состоящая из палбоциклиба, BMN673 и XVir-N-31, показала превосходные характеристики по сравнению с моно- или комбинированной терапией. Важно отметить, что повторный рост опухолевых клеток был значительно снижен на 4 и 5 день в линиях клеток, чувствительных к CDK 4/6, UMUC и T24 (dpi: дни после инфицирования).
Пример 18
: Тройная терапия, включающая XVir-N-31, ингибитор CDK4/6 и ингибитор бромодомена
5000 клеток Т24 высевали в 12-луночные планшеты и выращивали в 1 мл среды RPMI, содержащей 10% FCS. На следующий день клетки обрабатывали 500 нМ палбоциклиба и 300 нМ JQ-1. Через 24 часа после обработки клетки инфицировали указанными MOI XVir-N-31 в 200 мкл среды RPMI, не содержащей FCS. Через 1 час в каждую лунку добавляли 800 мкл среды RPMI, содержащей 10% FCS. Кроме того, в среду добавляли 500 нМ палбоциклиба и 300 нМ JQ-1. SRB-окрашивание проводили через 5 дней после инфицирования. Макетные обработанные клетки имели 100% выживаемость клеток.
Результаты показаны на фиг. 15.
Как видно из фиг. 15, ингибитор бромодомена JQ1 увеличивал способность XVir-N-31 убивать клетки в комбинации с ингибитором CDK 4/6 палбоциклиба при низких значениях MOI. Световой микроскопический анализ через 48 часов после инфицирования показывал уже массовую гибель клеток в случае клеток, обработанных JQ1/палбоциклиб/XVir-N-31. Следует сделать вывод, что JQ-1 увеличивал транскрипцию вируса и, следовательно, репликацию вируса в клетках, обработанных палбоциклибом, поскольку монотерапия только 300 нМ JQ1 не увеличивала гибель клеток XVir-N-31 при 10 и 20 MOI.
Предпосылкой для наблюдаемого усиления JQ-1 в инфицированных аденовирусом раковых клетках является способность палбоциклиба вызывать арест G1. В клетках, устойчивых к палбоциклибу (см. пример 18, идентичная процедура обработки), не наблюдалось увеличения гибели клеток. Это наблюдение резко контрастировало с данными Baojie Lv et al 2018, Scientific reports, 8, 11554, где клетки обрабатывали концентрациями JQ1, не вызывающими арест G1, и одновременно не использовали палбоциклиб.
Пример 19
: Тройная терапия, включающая XVir-N-31, ингибитор CDK4/6 и ингибитор бромодомен
100000 клеток SK-N-MC на лунку высевали в 12-луночные планшеты и выращивали в среде RPMI, содержащей 10% FCS при 5% CO2 при температуре 37ºC. Клетки обрабатывали 200 нМ абемациклиб+500 нМ JQ1 за 24 часа до и опять через 1 час после инфицирования, добавляя соответствующее количество в среду. Инфицирование XVir-N-31 происходило в 500 мкл среды RPMI, не содержащей сыворотки. SRB-окрашивание проводили через 5 дней после инфицирования. Макетные обработанные клетки имели 100% выживаемость клеток.
Результаты показаны на фиг. 16.
Установлено, что клетки SK-N-MC устойчивы к ингибиторам CDK 4/6, которые, таким образом, не вызывают арест G1. Добавление JQ1 не увеличивало гибель клеток SK-N-MC, устойчивых к CDK 4/6 (абемациклиб), что указывает на то, что арест G1, опосредованный CDK 4/6, является предпосылкой опосредованного JQ1 эффекта на гибель клеток.
Таким образом, на фиг. 16 (а также на фиг. 15) показано, что ингибиторы бромодомена, нацеленные на BRD2, BRD3, BRD4, еще больше увеличивают эффект уничтожения клеток XVir-N-3 при условии, что ингибиторы CDK 4/6 вызывают арест G1 в обработанных клетках.
Пример 20
: Вестерн-блоттинг клеток SK-N-MC, обработанных ингибитором CDK 4/6 LY-2835219 (абемациклиб) и ингибитором Wee MK-1775 (адавосертиб)
1×106 клеток высевали в чашки диаметром 10 см. Через 24 часа после обработки выделяли белки с использованием 1% SDS-буфера, чтобы добиться разрушения ядерной мембраны. Все образцы набирали несколько раз в шприц для разрушения ДНК и затем центрифугировали при 30000 об/мин при температуре 4ºC в течение 30 минут. Супернатант переносили в новую реакционную пробирку и непосредственно использовали для дальнейших стадий или хранили при температуре -80ºC. Для разделения белков проводили электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Посредством электрофореза в течение приблизительно двух часов при 100 В при температуре 4ºC загружали 40 мкг общих белков и зондировали их против специфических указанных антител.
Результаты показаны на фиг. 17.
Известно, что клетки SK-N-MC устойчивы к обработке абенациклибом (Dowless M et al., 2018, Clin Cancer Res: 24, 6028-6039). Wee1 является критическим компонентом контроля контрольной точки клеточного цикла G2/M и опосредует арест клеточного цикла, регулируя фосфорилирование CDC2. Сообщалось, что ингибирование Wee1 с помощью MK1775 усиливает цитотоксический эффект агентов, повреждающих ДНК, при различных типах карцином. В ряде исследований было продемонстрировано, что фармакологическое ингибирование Wee1 низкомолекулярным ингибитором киназы MK-1775 приводит к удалению фосфорилирования CDC2 по Tyr15 в опухолевых клетках (Kreahling et al 2013, PLoS One.8 (3), e 57523). Хотя при комбинированной обработке наблюдается сильный арест G1, изменений в экспрессии Rb и E2F-1 не наблюдается.
Пример 21
: Тройная терапия, включающая XVir-N-31, ингибитор CDK4/6 абемациклиб и адавосертиб (ингибитор Wee MK-1775)
100000 клеток SK-N-MC на лунку высевали в 12-луночные планшеты и выращивали в среде RPMI, содержащей 10% FCS при 5% CO2 при температуре 37ºC. Клетки обрабатывали 200 нМ абемациклиба за 24 часа до и опять через 1 час после инфицирования, добавляя соответствующее количество в среду. Инфицирование XVir-N-31 происходило в 500 мкл среды RPMI, не содержащей сыворотку. SRB-окрашивание проводили через 5 дней после инфицирования. Макетные обработанные клетки имели 100% выживаемость клеток.
Результаты показаны на фиг. 18.
На фиг. 17 (и 18) продемонстрировано, что комбинация ингибитора CDK 4/6 абемациклиба и ингибитора Wee-MK-1775 индуцировала арест G1 без ингибирования E2F-1. Анализ активности на фиг. 18 показывает, что эта комбинация не усиливает эффект уничтожения клеток онколитического аденовируса XVir-N-31. Эти результаты ясно демонстрируют, что индуцированный арест G1 комбинацией ингибитора CDK 4/6 абемациклиба и ингибитора Wee MK-1775 не способствовал способности уничтожать клетки XVir-N-31. Таким образом, ингибирование экспрессии E2F-1 является дополнительным требованием для усиления вирусного онколиза.
Пример 22
: Арест G1 в комбинации с ингибированием E2F-1 является предпосылкой для усиленного уничтожения клеток с помощью XVir-N-31 в сочетании с ингибиторами CDK 4/6
Через 48 часов после обработки клетки дважды промывали PBS (содержащим РНКазу A, 100 Ед/мл). Клетки трипсинизировали и центрифугировали при 1500 об/мин и температуре 4ºC в течение 5 мин. Клетки фиксировали, медленно добавляя по каплям к осадку 1 мл ледяного 80% этанола и инкубируя в течение ночи. Окрашивание проводили, добавляя к клеткам 1 мл окрашивающего раствора (пропидиум йодид, 50 мкг/мл) и инкубируя 30-60 мин при комнатной температуре с осторожным покачиванием. MK: MK-1775; LY: LY-2835219.
Результаты показаны на фиг. 19.
Как видно из фиг. 19, обработка клеток SK-M-NC LY (абемациклиб) не влияла на клеточный цикл. Обработка только MK-1775 вызывала на 500 нМ увеличение G2/M клеток. Комбинация обоих вызывала сильный арест G1.
Пример 23
: Роль экспрессии E2F-1 в репликации вирусной ДНК
I.
2×105 клеток T24, A549 и HeLa высевали на лунку в 6-луночный планшет и выращивали в 1,5 мл среды RPMI 1640, содержащей (или среду DMEM) 10% FBS, пенициллин/стрептомицин и заменимые аминокислоты. На следующий день 30 пмоль миРНК - будь то миРНК отрицательного контроля (Qiagen # 1022076) или siE2F1 (Sigma # NM_005225, миРНК ID SASI_Hs01_00162220) разводили в 150 мкл среды Opti-MEM и получали 9 мкл липофектамина Opti-MEM RNAiMAX. Раствор миРНК и раствор липофектамина RNAiMAX смешивали и инкубировали в течение 5 минут. Смесь по каплям добавляли к клеткам. Через 48 часов РНК выделяли и проводили RT-qPCR.
Результаты показаны на фиг. 20. Как явствует из фиг. 20, E2-ранняя экспрессия снижена.
II.
Для каждой лунки 6-луночного планшета 2×105 клеток Т24 высевали в 1,5 мл среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS, пенициллин/стрептомицин и заменимые аминокислоты. На следующий день 30 пмоль миРНК - будь то миРНК отрицательного контроля (Qiagen # 1022076) или siE2F1 (Sigma # NM_005225, миРНК ID SASI_Hs01_00162220) разводили в 150 мкл среды Opti-MEM и получали 9 мкл липофектамина Opti-MEM RNAiMAX. Раствор миРНК и раствор липофектамина RNAiMAX смешивали и инкубировали в течение 5 минут. Смесь по каплям добавляли к клеткам Т24. Инфицирование происходило через 48 часов во время инкубации клеток с 10 MOI ADWTRGD в 400 мкл бессывороточной среды и покачивания планшета каждые 10-15 минут. Через 1 час добавляли 1,6 мл полной среды. Выделение РНК проводили через 24 часа после инфицирования.
Результаты показаны на фиг. 21.
III.
Клетки промывали холодным PBS и разрушали добавлением 500 мкл лизирующего буфера из набора MirVana, номер по каталогу AM1560 компании Thermo Fisher, лизаты собирали шпателем и переносили пипеткой в пробирку на 1,5 мл. Для органической экстракции добавляли 50 мкл добавки гомогената и образцы инкубировали на льду в течение 10 мин. Добавляли 500 мкл смеси кислота-фенол:хлороформ, образцы встряхивали в течение 60 секунд и инкубировали на льду в течение 2 минут. Образцы центрифугировали при 14000 g при комнатной температуре в течение 5 минут для разделения водной и органической фаз. Верхнюю фазу осторожно переносили в новую пробирку и добавляли равное количество изопропанола. После инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут РНК осаждали (14000×g, 4ºC, 30 минут) и дважды промывали 1 мл 75% этанола (центрифуга 7500×g, 4ºC, 5 минут). РНК сушили на воздухе в течение 5-10 минут и ресуспендировали в 20-50 мкл воды, не содержащей РНКазы, и растворяли встряхиванием при 500 об/мин, 55ºC в течение 10 минут и измеряли с помощью Nanodrop. После расщепления ДНК (дезоксирибонуклеаза I, Invitrogen, номер по каталогу 18068-015) с использованием 1 мкг образца РНК и 1 мкл 10-кратного реакционного буфера ДНКазы I, воды, не содержащей нуклеазу, до объема 9 мкл, 1 мкл ДНКазы I (1 Ед/мкл), инкубация 15 мин при комнатной температуре, инактивация ДНКазы I путем добавления 1 мкл 25 мМ раствора EDTA, нагревание в течение 10 мин при температуре 65ºC. Обратную транскрипцию выполняли с использованием набора для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (номер по каталогу Thermo Fisher/Applied BiosystemsTM: 4368814). С использованием случайного гексамера для транскрипции для ПЦР волокон и актина и с использованием раннего праймера E2 для транскрипции для E2Early-ПЦР.
Используемые праймеры и миРНК
E2 Earlyfw: CCGTCATCTCTACAGCCCAT
E2 Earlyrev: GGGCTTTGTCAGAGTCTTGC
fiberfw : AAGCTAGCCCTGCAAACATCA
fiberrev: CCCAAGCTACCAGTGGCAGTA
Actinfw: TCACCCACACTGTGCCCATCTACG
Actinrev: CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG
E2F1 fw: CATCCCAGGAGGTCACTTCTG
E2F1 rev: GACAACAGCGGTTCTTGCTC
Контрольная миРНК
Смысловая: UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT
Антисмысловая: ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT
E2F-1 миРНК
CUGAGGAGUUCAUCAGCCU[dT][dT]
AGGCUGAUGAACUCCUCAG[dT][dT]
Чтобы доказать роль E2-ранней экспрессии с помощью RT-qPCR, абсолютно необходимо выбрать правильный праймер. Местоположение праймера должно быть между E2-ранним и E2-поздним промоторами. В противном случае E2-поздний промотор сильно повлияет на результаты. Расположение праймеров показано на фиг. 22.
Как видно из фиг. 20 и 21, подавление E2F1 с помощью миРНК вызывает повышение E2-ранней экспрессии. Это можно объяснить только репрессивной ролью E2F1 в E2-ранней экспрессии. Если бы E2F-1 был активатором, следствием этого было бы снижение E2-ранней экспрессии. Кроме того, миРНК против E2F-1 имитирует эффект ингибиторов CDK 4/6, который также ингибирует экспрессию E2F-1 (Yang C et al., Oncogene 2017, 36,2255-2264).
Пример 24
: Рекомбинантный аденовирус с мутациями двух сайтов связывания E2F в аденовирусном E2-раннем промоторе показывает повышенную экспрессию раннего E2.
Был получен мутантный аденовирус, имеющий мутации в двух E2F-связывающих сайтах аденовирусного E2-раннего промотора. Промотор как E2-раннего промотора дикого типа, так и мутантного E2-раннего промотора показан на фиг. 23.
Анализ экспрессии РНК проводили в клетках Т24, инфицированных AdWT-RGD и AdE2Fm (содержащих также мотив RGD), полученных с помощью RT-qPCR через 24 часа после инфицирования. Экспрессия гена AD-WT была установлена на 100%. Метод был идентичен методу, описанному в разделе III примера 23.
Результаты показаны на фиг. 24.
Как явствует из фиг. 24, экспрессия в случае экспрессии E2-раннего гена была выше в клетках, инфицированных AdE2Fm, по сравнению с клетками, инфицированными AD-WT. Следовательно, следует сделать вывод, что E2F-1 играет репрессивную роль в активации E2-раннего промотора. Это резко контрастирует с нынешним пониманием, согласно которому E2F-1 постулируется как активатор (DeCaprio JA, Virology. 20 февраля 2009; 384(2):274-84.
Хорошо известно, что структура E2-области во всех известных в настоящее время онколитических аденовирусах построена, как показано на фиг. 22. Таким образом, механизм действия E2F-1 идентичен описанному в настоящем документе. Следовательно, все они, то есть все онколитические аденовирусы, могут использоваться в комбинации с ингибиторами CDK 4/6, включая ColoAd1 и Delta-24-RGD.
ColoAd1 можно охарактеризовать следующим образом:
Enadenotucirev (ранее ColoAd1) представляет собой опухолелективный химерный аденовирус с продемонстрированной доклинической активностью. Капсид ColoAd1 происходит от Ad11p, серотипа с ограниченной серологической распространенностью у людей. EnAd инфицирует клетки путем связывания с CD46 и/или десмоглеином 2,6, которые широко экспрессируются на многих клетках карциномы. Большая часть генома EnAd происходит от Ad11p с большой делецией в E3 и меньшей делецией в E4. Кроме того, область E2B состоит из химеры последовательностей Ad11p и Ad3. Делеция E4 в EnAd находится в E4ORF4, который в Ad5 кодирует белок, который инактивирует протеин-фосфатазу 2A и, таким образом, активирует аппарат трансляции белка, а также регулирует активность белка E1A в петле ингибирования обратной связи. Эти делеции, возможно в сочетании с химерным участком E2B, вероятно, способствуют поразительной избирательной репликации EnAd в отношении злокачественного новообразования (Deyer et al., Mol Ther Oncolytics. 2017, 16; 5: 62-74)
Delta-24-RGD (DNX-2401) можно охарактеризовать следующим образом:
Delta-24-RGD (DNX-2401) представляет собой онколитический вирус, способный к условной репликации, сконструированный для преимущественной репликации и лизиса опухолевых клеток с аномалиями пути p16/RB/E2F. Fueyo et al., Oncogene. 2000 Jan 6;19(1):2-12. Мутантный онколитический аденовирус, нацеленный на путь Rb, оказывает антиглиомный эффект in vivo; Dai B. et al. Mol Cancer Therapy. 2017 Apr;16(4):662-670.
Признаки изобретения, раскрытые в предшествующем описании, формуле изобретения, а также на чертежах, могут как по отдельности, так и в любой комбинации быть важными при практическом воплощении изобретения в различных его вариантах осуществления.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität
München
<120> ЛЕЧЕНИЕ ОПУХОЛЕЙ КОМБИНАЦИЕЙ ОНКОЛИТИЧЕСКОГО АДЕНОВИРУСА И
ИНГИБИТОРА CDK4/6
<130> H 10067 PCT
<140> PCT/EP2019/000067
<141> 2019-03-05
<150> EP 18 000 210.7
<151> 2018-03-05
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 1
aagctagccc tgcaaacatc acccaagcta ccagtggcag ta
42
<210> 2
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 2
ccgtcatctc tacagcccat gggctttgtc agagtcttgc
40
<210> 3
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 3
cttcctagcg actttgtgcc gtcagagtgg taggcaaggt
40
<210> 4
<211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 4
cgacgaggat gaagtcctgt gtctgctcag gatagcaggc gccat
45
<210> 5
<211> 38
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 5
gaggatgaag tcctgtgtct caggatagca ggcgccat
38
<210> 6
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 6
tgtttgtcta cagtcctgtg tctgctcagg atagcaggcg ccat
44
<210> 7
<211> 38
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 7
ttgtctacag tcctgtgtct caggatagca ggcgccat
38
<210> 8
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 8
tccctcccaa cacacagagt gacaggaaac cgtgtggaat
40
<210> 9
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 9
agcaaccctc ctaaaccact tgtttgaggt atccatgcta tca
43
<210> 10
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 10
acgctatgag acctcactga atcctgggtc aacccctcaa g
41
<210> 11
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 11
cgtccctgag ttcccaaccg cgaagtgtca taccgagtct t
41
<210> 12
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 12
tggcatggac tgtggtcatg agactggcgt cttcaccacc atgg
44
<210> 13
<211> 47
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 13
taagtaggtg cacagtaggt ctgaaaagtg caaagaacac ggctaag
47
<210> 14
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 14
gaaccagggc cgcccatact ggggctttgt cagagtcttg c
41
<210> 15
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 15
ccgttagccc aagagcaacc ggccgtgatg gtagagaag
39
<210> 16
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 16
ctgtggtact tcccagagac caggtgagtt ataccctgcc
40
<210> 17
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 17
aagctagccc tgcaaacatc a
21
<210> 18
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 18
cccaagctac cagtggcagt a
21
<210> 19
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 19
ccgtcatctc tacagcccat
20
<210> 20
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 20
gggctttgtc agagtcttgc
20
<210> 21
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 21
aagctagccc tgcaaacatc a
21
<210> 22
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 22
cccaagctac cagtggcagt a
21
<210> 23
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 23
tcacccacac tgtgcccatc tacg
24
<210> 24
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 24
cagcggaacc gctcattgcc aatgg
25
<210> 25
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 25
catcccagga ggtcacttct g
21
<210> 26
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 26
gacaacagcg gttcttgctc
20
<210> 27
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> siRNA
<400> 27
uucuccgaac gugucacgut t
21
<210> 28
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> siRNA
<400> 28
acgugacacg uucggagaat t
21
<210> 29
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> siRNA
<400> 29
cugaggaguu caucagccut t
21
<210> 30
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> siRNA
<400> 30
aggcugauga acuccucagt t
21
<---
Claims (18)
1. Комбинация для лечения опухоли с клетками, имеющими YB-1 в ядре, включающая онколитический аденовирус и ингибитор CDK4/6, причем онколитический аденовирус представляет собой XVir-N-31.
2. Комбинация по п. 1, где ингибитор CDK4/6 представляет собой ингибитор CDK4/6, блокирующий клетки в фазе G1 и ингибирующий E2F1.
3. Комбинация по любому из пп. 1, 2, где ингибитор CDK4/6 выбран из группы, включающей палбоциклиб, который также упоминается как PD 0332991, абемациклиб, который также упоминается как LY-2835219, рибоциклиб, который также упоминается как LEE011, и трилациклиб, который также упоминается как G1T28.
4. Комбинация по любому из пп. 1-3, где комбинация дополнительно включает ингибитор PARP.
5. Комбинация по любому из пп. 1-4, где комбинация дополнительно включает ингибитор бромодомена.
6. Комбинация по любому из пп. 1-5, где опухоль экспрессирует Rb или является Rb-положительной.
7. Комбинация по любому из пп. 1-6, где опухолевые клетки имеют резистентность или являются нечувствительными к одному или нескольким фармацевтически активным агентам и/или облучению.
8. Комбинация по любому из пп. 1-7, где опухоль содержит YB-1 в ядре клетки независимо от клеточного цикла.
9. Комбинация по любому из пп. 1-8, где опухоль выбрана из группы, включающей рак мочевого пузыря, рак молочной железы, метастатический рак молочной железы (mBC), меланому, глиому, рак поджелудочной железы, гепатоцеллюлярную карциному, аденокарциному легкого, саркому, рак яичников, рак почки, рак предстательной железы и лейкоз.
10. Способ лечения опухоли с клетками, имеющими YB-1 в ядре, согласно которому субъекту вводят онколитический аденовирус и ингибитор CDK4/6, причем онколитический аденовирус представляет собой XVir-N-31.
11. Способ по п. 10, в котором ингибитор CDK4/6 представляет собой ингибитор CDK4/6, блокирующий клетки в фазе G1 и ингибирующий E2F1.
12. Способ по любому из пп. 10, 11, в котором ингибитор CDK4/6 выбран из группы, включающей палбоциклиб, который также упоминается как PD 0332991, абемациклиб, который также упоминается как LY-2835219, рибоциклиб, который также упоминается как LEE011, трилациклиб, который также упоминается как G1T28.
13. Способ по любому из пп. 10-12, в котором субъекту вводят ингибитор PARP.
14. Способ по любому из пп. 10-13, в котором субъекту вводят ингибитор бромодомена.
15. Способ по любому из пп. 10-14, в котором опухоль экспрессирует Rb или является Rb-положительной.
16. Способ по любому из пп. 10-15, в котором опухолевые клетки имеют резистентность или являются нечувствительными к одному или нескольким фармацевтически активным агентам и/или облучению.
17. Способ по любому из пп. 10-16, в котором опухоль содержит YB-1 в ядре клетки независимо от клеточного цикла.
18. Способ по любому из пп. 10-17, в котором опухоль выбрана из группы, включающей рак мочевого пузыря, рак молочной железы, метастатический рак молочной железы (mBC), меланому, глиому, рак поджелудочной железы, гепатоцеллюлярную карциному, аденокарциному легкого, саркому, рак яичников, рак почки, рак предстательной железы и лейкоз.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EPEP18000210.7 | 2018-03-05 | ||
EP18000210 | 2018-03-05 | ||
PCT/EP2019/000067 WO2019170283A1 (en) | 2018-03-05 | 2019-03-05 | Treatment of tumors by a combination of an oncolytic adenovirus and a cdk4/6 inhibitor |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2023135076A Division RU2023135076A (ru) | 2018-03-05 | 2019-03-05 | Лечение опухолей комбинацией онколитического аденовируса и ингибитора cdk4/6 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020132466A3 RU2020132466A3 (ru) | 2022-04-05 |
RU2020132466A RU2020132466A (ru) | 2022-04-05 |
RU2811278C2 true RU2811278C2 (ru) | 2024-01-11 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014153204A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Salk Institute For Biological Studies | Oncolytic adenovirus compositions |
WO2016178167A1 (en) * | 2015-05-04 | 2016-11-10 | Vcn Biosciences Sl | Oncolytic adenoviruses with mutations in immunodominant adenovirus epitopes and their use in cancer treatment |
WO2017198685A1 (en) * | 2016-05-18 | 2017-11-23 | Université Libre de Bruxelles | Method for determining sensitivity to a cdk4/6 inhibitor |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014153204A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Salk Institute For Biological Studies | Oncolytic adenovirus compositions |
WO2016178167A1 (en) * | 2015-05-04 | 2016-11-10 | Vcn Biosciences Sl | Oncolytic adenoviruses with mutations in immunodominant adenovirus epitopes and their use in cancer treatment |
WO2017198685A1 (en) * | 2016-05-18 | 2017-11-23 | Université Libre de Bruxelles | Method for determining sensitivity to a cdk4/6 inhibitor |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
DONG W. et al. ORCA-010, a novel potency-enhanced oncolytic adenovirus, exerts strong antitumor activity in preclinical models // Human Gene Therapy. - 2014. - Vol. 25. - No. 10. - P. 897-904. * |
GARCIA-MOURE M. et al. Oncolytic adenoviruses as a therapeutic approach for osteosarcoma: A new hope // Journal of bone oncology. - 2017. - Vol. 9. - P. 41-47. * |
HOLM P. S. et al. YB-1-basierte Virotherapie: Ein neues Therapiekonzept beim Urothelkarzinom der Harnblase [YB-1-based virotherapy: A new therapeutic intervention for transitional cell carcinoma of the bladder?]. Urologe A. 2016 Mar; 55(3): P. 356-363. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
O’Shea et al. | Heat shock phenocopies E1B-55K late functions and selectively sensitizes refractory tumor cells to ONYX-015 oncolytic viral therapy | |
JP6072414B2 (ja) | 腫瘍選択的e1aおよびe1b変異体 | |
CN101128593B (zh) | 逆转动物细胞中多种抗性的方法 | |
Alonso et al. | ICOVIR-5 shows E2F1 addiction and potent antiglioma effect in vivo | |
US20090270484A1 (en) | WWOX Vectors and Uses in Treatment of Cancer | |
JP4982680B2 (ja) | デコリン遺伝子を含む薬剤学的抗腫瘍組成物 | |
EP3762004B1 (en) | Treatment of tumors by a combination of an oncolytic adenovirus and a cdk4/6 inhibitor | |
Holzmüller et al. | YB‐1 dependent virotherapy in combination with temozolomide as a multimodal therapy approach to eradicate malignant glioma | |
Koch et al. | Targeting the Retinoblastoma/E2F repressive complex by CDK4/6 inhibitors amplifies oncolytic potency of an oncolytic adenovirus | |
JP2002508187A (ja) | P53+新生細胞の選択的殺死及び診断 | |
Zhang et al. | Mutant p53 driven-LINC00857, a protein scaffold between FOXM1 and deubiquitinase OTUB1, promotes the metastasis of pancreatic cancer | |
Tookman et al. | RAD51 and BRCA2 enhance oncolytic adenovirus type 5 activity in ovarian cancer | |
Aguirre-Hernández et al. | Sensitisation to mitoxantrone-induced apoptosis by the oncolytic adenovirus Ad∆∆ through Bcl-2-dependent attenuation of autophagy | |
US20220354911A1 (en) | Treatment of tumors by a combination of an oncolytic adenovirus, a cdk4/6 inhibitor and a further therapeutically active agent | |
Yoo et al. | Vaccinia virus‐mediated cell cycle alteration involves inactivation of tumour suppressors associated with Brf1 and TBP | |
RU2811278C2 (ru) | Лечение опухолей комбинацией онколитического аденовируса и ингибитора cdk4/6 | |
Wang et al. | HSF1 overexpression enhances oncolytic effect of replicative adenovirus | |
Srivastava et al. | Mode of cell death associated with adenovirus-mediated suicide gene therapy in HNSCC tumor model | |
Guo et al. | Antiglioma effects of combined use of a baculovirual vector expressing wild‐type p53 and sodium butyrate | |
Lin et al. | A system for the enhancement of adenovirus mediated gene transfer to uro-epithelium | |
Meng et al. | Loss of Histone Methyltransferase KMT2D Attenuates Angiogenesis in the Ischemic Heart by Inhibiting the Transcriptional Activation of VEGF-A | |
Majhen et al. | Vincristine-resistant human laryngeal carcinoma cells demonstrate increased Rous sarcoma virus promoter activity | |
Zhang | TALEN-mediated site-specific integration of human CFTR gene by a helper-dependent adenoviral vector | |
Chen et al. | Advancing Lung Cancer Treatment with Combined c-Met Promoter-Driven Oncolytic Adenovirus and Rapamycin | |
Aguirre | The oncolytic adenoviral AdΔΔ mutant sensitizes prostate cancer cells to mitoxantrone by promoting apoptosis and attenuating autophagy |