ES2965632T3 - Tratamiento de tumores mediante una combinación de un adenovirus oncolítico y un inhibidor de CDK4/6 - Google Patents

Abstract

La presente invención está relacionada con una combinación de un adenovirus y un inhibidor/CDK4. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de tumores mediante una combinación de un adenovirus oncolítico y un inhibidor de CDK4/6

La presente invención se refiere a la combinación de un virus oncolítico y un inhibidor/CDK4; la combinación para el uso en un método para el tratamiento de un tumor o un cáncer; un adenovirus para el uso en un método para el tratamiento de un tumor o un cáncer en un sujeto junto con un inhibidor de CDK4/6; y un inhibidor de CDK4/6 para el uso en un método para el tratamiento de un tumor o un cáncer en un sujeto junto con un adenovirus.

Actualmente se utilizan varios conceptos terapéuticos en el tratamiento de tumores. Además de la cirugía, predominan la quimioterapia y la radioterapia. Sin embargo, todas estas técnicas conllevan efectos secundarios considerables. El uso de virus oncolíticos selectivos de replicación proporciona una nueva plataforma para el tratamiento de tumores. En relación con esto, se inicia una replicación intratumoral selectiva de un agente viral que da como resultado la replicación del virus, la lisis de la célula tumoral infectada y la propagación del virus a las células tumorales adyacentes. Como la capacidad de replicación del virus se limita a las células tumorales, el tejido normal se salva de la replicación y, por tanto, de la lisis por parte del virus.

Lypova N et al. (CANCERS, vol. 11, n.° 5, 16 de mayo de 2019, 684) informan sobre cómo atacar las células de cáncer de mama positivas para receptores de estrógeno resistentes a palbociclib mediante viroterapia oncolítica.

Koll FJ et al. (URL: https://www.eusupplements.europeanurology.com/article/S1569-9056(15)60035-5/pdf; 1 de enero de 2015) informa sobre estudiosin vitropreliminares relacionados con el tratamiento del cáncer de vejiga con un adenovirus oncolítico dependiente de YB-1.

Gee Y et al. (Molecular Medicine Reports 15: 3521-3528, 2017) informan sobre los efectos antitumorales sinérgicos del inhibidor de CDK SNS-032 y un adenovirus oncolítico que coexpresa TRAIL y Smac en el cáncer de páncreas. El documento WO 2014/153204 A1 se refiere a un adenovirus que comprende un polipéptido E1A que comprende una o más modificaciones y que comprende un polipéptido E4orf6/7 que comprende una o más modificaciones. El documento WO 2016/178167 A1 se refiere a un adenovirus oncolítico con deleciones funcionales de epítopos de células T inmunodominantes de proteínas de adenovirus y al uso de dicho adenovirus para el tratamiento del cáncer. El documento WO 03/099859 A2 se refiere al uso de un adenovirus en la fabricación de un medicamento, en el que el adenovirus es deficiente en replicación en las células que no contienen YB-1 en el núcleo y codifica un oncogén que transactiva un gen adenoviral seleccionado del grupo que comprende E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 y E3ADP.

Los documentos WO 2004/0356616 A2 y WO 2005/052143 A2 se refieren a un adenovirus que expresa una primera proteína que se selecciona del grupo que comprende una proteína E1B y una proteína E4 antes de una proteína E1A. Kobayashi S et al. (URL: http://clincancerres.aacrjounals.org/content/clincanres/5/12/4182.full.pdf; 1 de enero de 1999) informan sobre la inhibición de la proliferación de células cancerosas de páncreas utilizando un vector de adenovirus que expresa p16INK4a.

Wong HH et al. (Viruses 2010, 2, 78-106) informan sobre la superación de obstáculos en el uso de virus oncolíticos para la terapia del cáncer.

Bai M et al. (Cell Physiol Biochem 2016; 40:1367-1376) informan sobre los efectos de la sobreexpresión de CDKN2A (p16INK4A/p14ARF) sobre la proliferación y migración de células A375 de melanoma humano.

Kostova Y et al. (Cancer Gene Therapy (2015) 22, 30-43) informan sobre un adenovirus oncolítico armado dependiente de YB-1 como candidato para un enfoque combinatorio antiglioma de viroterapia, terapia génica suicida y tratamiento quimioterapéutico.

El problema subyacente a la presente invención es proporcionar medios para aumentar la eficacia de la terapia tumoral basada en virus oncolíticos y en particular en adenovirus.

Estos y otros problemas se resuelven mediante la materia de las reivindicaciones independientes adjuntas; se pueden tomar realizaciones preferidas a partir de las reivindicaciones dependientes adjuntas. La invención se define en las reivindicaciones.

Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un primer aspecto mediante una combinación que comprende un adenovirus oncolítico y un inhibidor de CDK4/6, en donde el adenovirus se replica de una manera dependiente de YB-1 y en donde el adenovirus carece de expresión de E1A13S.

En una realización del primer aspecto, el adenovirus es deficiente en replicación en las células que carecen de YB-1 en el núcleo pero se replica en las células que tienen YB-1 en el núcleo.

En una realización del primer aspecto, la combinación comprende además un inhibidor de PARP.

En una realización del primer aspecto, la combinación comprende además un inhibidor de bromodominios.

Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un segundo aspecto mediante una combinación según el primer aspecto, que incluye cualquier realización de la misma, para el uso en un método para el tratamiento de un tumor o cáncer.

Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un tercer aspecto mediante un adenovirus para el uso en un método para el tratamiento de un tumor o un cáncer en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto un adenovirus y un inhibidor de CDK4/6, en donde el adenovirus se define como en el primer aspecto, que incluye cualquier realización del mismo. Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un cuarto aspecto mediante un inhibidor de CDK4/6 para el uso en un método para el tratamiento de un tumor o un cáncer en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto un adenovirus y el inhibidor de CDK4/6, en el que el adenovirus se define como en el primer aspecto, que incluye cualquier realización del mismo.

En una realización del primer aspecto que incluye cualquier realización del mismo, del segundo aspecto que incluye cualquier realización del mismo, del tercer aspecto que incluye cualquier realización del mismo y del cuarto aspecto que incluye cualquier realización del mismo, el adenovirus se selecciona del grupo que comprende XVir-N-31, dl520, AdA24, AdA24-RGD, dl922-947, E1Ad/01/07, dl1119/1131, CB 016, VCN-01, E1Adl1107, E1Adl1101, ORCA-010, Enadenotucirev y los virus que carecen de un oncogén viral expresado que es capaz de unirse a un producto del gen inhibidor de tumores Rb funcional.

En una realización del primer aspecto que incluye cualquier realización del mismo, del segundo aspecto que incluye cualquier realización del mismo, del tercer aspecto que incluye cualquier realización del mismo y del cuarto aspecto que incluye cualquier realización del mismo, el adenovirus es XVir-N-31.

En una realización del primer aspecto que incluye cualquier realización del mismo, del segundo aspecto que incluye cualquier realización del mismo, del tercer aspecto que incluye cualquier realización del mismo y del cuarto aspecto que incluye cualquier realización del mismo, en el que el inhibidor de CDK4/6 es un inhibidor de CDK4/6 que detiene las células en la fase G1 e inhibe E2F1.

En una realización del primer aspecto que incluye cualquier realización del mismo, del segundo aspecto que incluye cualquier realización del mismo, del tercer aspecto que incluye cualquier realización del mismo y del cuarto aspecto que incluye cualquier realización del mismo, el inhibidor de CDK4/6 se selecciona del grupo que comprende palbociclib, que también se denomina PD 0332991, abemaciclib, que también se denomina LY-2835219, ribociclib, que también se denomina LEE011, Trilaciclib, que también se denomina G1T28, y Dinaciclib.

En una realización del segundo aspecto que incluye cualquier realización del mismo, del tercer aspecto que incluye cualquier realización del mismo, y del cuarto aspecto que incluye cualquier realización del mismo, la enfermedad tumoral o el cáncer expresa Rb o es positivo para Rb.

En una realización del segundo aspecto que incluye cualquier realización del mismo, del tercer aspecto que incluye cualquier realización del mismo, y del cuarto aspecto que incluye cualquier realización del mismo, las células tumorales tienen resistencia o son insensibles a uno o varios agentes farmacéuticamente activos y/o a la radiación.

En una realización del segundo aspecto que incluye cualquier realización del mismo, del tercer aspecto que incluye cualquier realización del mismo y del cuarto aspecto que incluye cualquier realización del mismo, el tumor o cáncer contiene YB-1 en el núcleo celular independientemente del ciclo celular.

En una realización del segundo aspecto que incluye cualquier realización del mismo, del tercer aspecto que incluye cualquier realización del mismo, y del cuarto aspecto que incluye cualquier realización del mismo, la enfermedad se selecciona del grupo que comprende cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de mama metastásico (mBC), melanoma, glioma, cáncer de páncreas, carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma de pulmón, sarcoma, cáncer de ovario, cáncer renal, cáncer de próstata y leucemia.

En una realización del primer aspecto, el adenovirus codifica una proteína oncogénica, en donde la proteína oncogénica transactiva al menos un gen adenoviral, por lo cual el gen adenoviral se selecciona del grupo que comprende E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 y E3ADP.

En una realización del primer aspecto, la proteína oncogénica es la proteína E1A.

En una realización del primer aspecto, la proteína E1A es capaz de unirse a un producto del gen inhibidor de tumores Rb funcional.

En una realización del primer aspecto, la proteína E1A es incapaz de unirse a un producto del gen inhibidor de tumores Rb funcional.

En una realización del primer aspecto, la proteína E1A no induce la localización de YB-1 en el núcleo.

En una realización del primer aspecto, la proteína oncogénica exhibe una o varias mutaciones o deleciones en comparación con la proteína oncogénica E1A de tipo natural.

En una realización del primer aspecto, la deleción es una seleccionada del grupo que comprende las deleciones de tramos de CR3 y las deleciones del extremo N-terminal y las deleciones del extremo C-terminal.

En una realización del primer aspecto, la proteína E1A es capaz de unirse a Rb.

En una realización del primer aspecto, la proteína E1A comprende una o varias mutaciones o deleciones en comparación con la proteína oncogénica de tipo natural, por lo que la deleción es preferiblemente una deleción en la región CR1 y/o la región CR2.

En una realización del primer aspecto, la proteína E1A es incapaz de unirse a Rb.

En una realización del primer aspecto, el virus es un adenovirus que expresa la proteína E1A12 S.

En una realización del primer aspecto, el virus es un adenovirus que carece de una región E3 adenoviral funcionalmente activa.

En una realización del primer aspecto, el virus es un adenovirus que carece de expresión de la proteína E1B de 19 kDa.

En una realización del primer aspecto, el virus es un adenovirus que expresa un motivo RGD en una fibra.

En una realización del primer aspecto, el virus es un adenovirus de serotipo 5.

En una realización del primer aspecto, el adenovirus es dl520, en el que la región E3 adenoviral es funcionalmente inactiva.

En una realización del primer aspecto, el adenovirus es dl520, en el que dl520 carece de expresión de la proteína E1B de 19 kDa.

En una realización del primer aspecto, el adenovirus es dl520 que expresa un motivo RGD en una fibra.

En una realización del primer aspecto, el virus codifica YB-1.

En una realización del primer aspecto, el gen que codifica YB-1 está bajo el control de un promotor específico de tejido, un promotor específico de tumor y/o un promotor dependiente de YB-1.

En una realización del primer aspecto, el promotor dependiente de YB-1 es el promotor tardío E2 adenoviral.

En una realización del primer aspecto, el inhibidor de CDK4/6 es un compuesto que reduce la fosforilación de Rb en una célula, preferiblemente una célula tumoral.

En una realización del primer aspecto, el inhibidor de CDK4/6 es un compuesto que reduce la expresión de Rb en una célula, preferiblemente una célula tumoral.

En una realización del primer aspecto, el inhibidor de CDK4/6 provoca la detención en G1 en una célula e inhibe E2F1. En una realización del primer aspecto, la composición comprende además un inhibidor de PARP.

En una realización del primer aspecto, el inhibidor de PARP se selecciona del grupo que comprende olaparib, veliparib, rucaparib y BMN673.

En una realización del primer aspecto, la composición comprende además un inhibidor de bromodominios.

En una realización del primer aspecto, el inhibidor de bromodominios se selecciona del grupo que comprende JQ1, OTX-015, I-BET151, CPI-0610, I-BET762, CPI203, PFI-1 y MS 436.

En una realización del primer aspecto, los constituyentes de la combinación son para la administración por separado. En una realización del segundo aspecto, el adenovirus se replica de manera dependiente de YB-1.

En una realización del segundo aspecto, el adenovirus es deficiente en replicación en las células que carecen de YB-1 en el núcleo, pero se replica en las células que tienen YB-1 en el núcleo.

En una realización del segundo aspecto, el adenovirus codifica una proteína oncogénica, en donde la proteína oncogénica transactiva al menos un gen adenoviral, por lo cual el gen adenoviral se selecciona del grupo que comprende E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 y E3ADP.

En una realización del segundo aspecto, la proteína oncogénica es la proteína E1A.

En una realización del segundo aspecto, la proteína E1A es capaz de unirse a un producto del gen inhibidor de tumores Rb funcional.

En una realización del segundo aspecto, la proteína E1A es incapaz de unirse a un producto del gen inhibidor de tumores Rb funcional.

En una realización del segundo aspecto, la proteína E1A no induce la localización de YB-1 en el núcleo.

En una realización del segundo aspecto, la proteína oncogénica exhibe una o varias mutaciones o deleciones en comparación con la proteína oncogénica E1A de tipo natural.

En una realización del segundo aspecto, la deleción es una seleccionada del grupo que comprende las deleciones de tramos de CR3 y las deleciones del extremo N-terminal y las deleciones del extremo C-terminal.

En una realización del segundo aspecto, la proteína E1A es capaz de unirse a Rb.

En una realización del segundo aspecto, la proteína E1A comprende una o varias mutaciones o deleciones en comparación con la proteína oncogénica de tipo natural, por lo que la deleción es preferiblemente una deleción en la región CR1 y/o la región CR2.

En una realización del segundo aspecto, la proteína E1A es incapaz de unirse a Rb.

En una realización del segundo aspecto, el virus es un adenovirus que expresa la proteína E1A12 S.

En una realización del segundo aspecto, el virus es un adenovirus que carece de una región E3 adenoviral funcionalmente activa.

En una realización del segundo aspecto, el virus es un adenovirus que carece de expresión de la proteína E1B de 19 kDa.

En una realización del segundo aspecto, el virus es un adenovirus que expresa un motivo RGD en una fibra.

En una realización del segundo aspecto, el virus es un adenovirus de serotipo 5.

En una realización del segundo aspecto, el adenovirus es dl520, en el que la región E3 adenoviral es funcionalmente inactiva.

En una realización del segundo aspecto, el adenovirus es dl520, en el que dl520 carece de expresión de la proteína E1B de 19 kDa.

En una realización del segundo aspecto, el adenovirus es dl520 que expresa un motivo RGD en una fibra.

En una realización del segundo aspecto, el virus codifica YB-1.

En una realización del segundo aspecto, el gen que codifica YB-1 está bajo el control de un promotor específico de tejido, un promotor específico de tumor y/o un promotor dependiente de YB-1.

En una realización del segundo aspecto, el promotor dependiente de YB-1 es el promotor tardío E2 adenoviral. En una realización del segundo aspecto, el inhibidor de CDK4/6 es un compuesto que reduce la fosforilación de Rb en una célula, preferiblemente una célula tumoral.

En una realización del segundo aspecto, el inhibidor de CDK4/6 es un compuesto que reduce la expresión de Rb en una célula, preferiblemente una célula tumoral.

En una realización del segundo aspecto, la composición comprende además un inhibidor de PARP.

En una realización del segundo aspecto, el inhibidor de PARP se selecciona del grupo que comprende olaparib, veliparib, rucaparib y BMN673.

En una realización del segundo aspecto, la composición comprende además un inhibidor de bromodominios.

En una realización del segundo aspecto, el inhibidor de bromodominios se selecciona del grupo que comprende JQ1, OTX-015, I-BET151, CPI-0610, I-BET762, CPI203, PFI-1 y MS 436.

En una realización del segundo aspecto, los constituyentes de la combinación son para la administración por separado. En una realización del segundo aspecto, las células del tumor tienen una alteración de la vía de señalización de CDK4/6.

En una realización del segundo aspecto, las células del tumor tienen una transición G1-S no controlada del ciclo celular.

En una realización del segundo aspecto, las células del tumor tienen una mutación con pérdida de función o una deleción en un gen seleccionado del grupo que comprende el gen RB1, el gen CDKN2A y el gen CDKN2B.

En una realización del segundo aspecto, las células del tumor tienen una amplificación de un gen y/o una mutación activadora en un gen.

En una realización del segundo aspecto, el gen se selecciona del grupo que comprende CCND1, E2F1, E2F2, E2F3, CDK4 y CDK6.

En una realización del segundo aspecto, el gen codifica un componente de una vía de señalización mitogénica. En una realización del segundo aspecto, la vía de señalización mitogénica se selecciona del grupo que comprende la vía PI3K y la vía MAPK.

En una realización del segundo aspecto, las células tumorales tienen resistencia o son insensibles a uno o varios agentes farmacéuticamente activos y/o la radiación.

En una realización del segundo aspecto, el agente farmacéuticamente activo es un citostático.

En una realización del segundo aspecto, la resistencia está mediada por un transportador ABC.

En una realización del segundo aspecto, el transportador ABC se selecciona del grupo que comprende MRP y MDR, en particular MDR-1.

En una realización del segundo aspecto, la resistencia es una resistencia múltiple o polirresistencia, en particular una resistencia múltiple o polirresistencia contra un citostático y/o la radiación.

En una realización del segundo aspecto, las células del tumor son positivas para Rb.

En una realización del segundo aspecto, las células del tumor tienen YB-1 en el núcleo.

En una realización del segundo aspecto, las células del tumor tienen YB-1 en el núcleo después de la inducción. En una realización del segundo aspecto, el transporte de YB-1 al núcleo se desencadena mediante al menos una medida seleccionada del grupo que comprende irradiación, administración de citostáticos e hipertermia.

En una realización del segundo aspecto, la medida se aplica a una célula, un órgano o un organismo, preferiblemente un organismo que lo necesita, más preferiblemente un organismo que padece el tumor.

En una realización del tercer aspecto, el adenovirus codifica una proteína oncogénica, en donde la proteína oncogénica transactiva al menos un gen adenoviral, mediante lo cual el gen adenoviral se selecciona del grupo que comprende E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 y E3ADP.

En una realización del tercer aspecto, la proteína oncogénica es la proteína E1A.

En una realización del tercer aspecto, la proteína E1A es capaz de unirse a un producto del gen inhibidor de tumores Rb funcional.

En una realización del tercer aspecto, la proteína E1A es incapaz de unirse a un producto del gen inhibidor de tumores Rb funcional.

En una realización del tercer aspecto, la proteína E1A no induce la localización de YB-1 en el núcleo.

En una realización del tercer aspecto, la proteína oncogénica exhibe una o varias mutaciones o deleciones en comparación con la proteína oncogénica E1A de tipo natural.

En una realización del tercer aspecto, la deleción es una seleccionada del grupo que comprende las deleciones de tramos de CR3 y las deleciones del extremo N-terminal y las deleciones del extremo C-terminal.

En una realización del tercer aspecto, la proteína E1A es capaz de unirse a Rb.

En una realización del tercer aspecto, la proteína E1A comprende una o varias mutaciones o deleciones en comparación con la proteína oncogénica de tipo natural, por lo que la deleción es preferiblemente una deleción en la región CR1 y/o la región CR2.

En una realización del tercer aspecto, la proteína E1A es incapaz de unirse a Rb.

En una realización del tercer aspecto, el virus es un adenovirus que expresa la proteína E1A12 S.

En una realización del tercer aspecto, el virus es un adenovirus que carece de una región E3 adenoviral funcionalmente activa.

En una realización del tercer aspecto, el virus es un adenovirus que carece de expresión de la proteína E1B de 19 kDa. En una realización del tercer aspecto, el virus es un adenovirus que expresa un motivo RGD en una fibra.

En una realización del tercer aspecto, el virus es un adenovirus de serotipo 5.

En una realización del tercer aspecto, el adenovirus es dl520, en el que la región E3 adenoviral es funcionalmente inactiva.

En una realización del tercer aspecto, el adenovirus es dl520, en el que dl520 carece de expresión de la proteína E1B de 19 kDa.

En una realización del tercer aspecto, el adenovirus es dl520 que expresa un motivo RGD en una fibra.

En una realización del tercer aspecto, el virus codifica YB-1.

En una realización del tercer aspecto, el gen que codifica YB-1 está bajo el control de un promotor específico de tejido, un promotor específico de tumor y/o un promotor dependiente de YB-1.

En una realización del tercer aspecto, el promotor dependiente de YB-1 es el promotor tardío E2 adenoviral.

En una realización del tercer aspecto, el inhibidor de CDK4/6 es un compuesto que reduce la fosforilación de Rb en una célula, preferiblemente una célula tumoral.

En una realización del tercer aspecto, el inhibidor de CDK4/6 es un compuesto que reduce la expresión de Rb en una célula, preferiblemente una célula tumoral.

En una realización del tercer aspecto, el método comprende además administrar un inhibidor de PARP al sujeto. En una realización del tercer aspecto, el inhibidor de PARP se selecciona del grupo que comprende olaparib, veliparib, rucaparib y BMN673.

En una realización del tercer aspecto, el método comprende además administrar un inhibidor de bromodominios al sujeto.

En una realización del tercer aspecto, el inhibidor de bromodominios se selecciona del grupo que comprende JQ1, OTX-015, I-BET151, CPI-0610, I-BET762, CPI203, PFI-1 y MS 436.

En una realización del tercer aspecto, el adenovirus, el inhibidor de CDK4/6, el inhibidor de PARP y/o el inhibidor de bromodominios se administran al sujeto por separado o en cualquier combinación.

En una realización del tercer aspecto, las células del tumor tienen una alteración de la vía de señalización de CDK4/6. En una realización del tercer aspecto, las células del tumor tienen una transición G1-S no controlada del ciclo celular. En una realización del tercer aspecto, las células del tumor tienen una mutación con pérdida de función o una deleción en un gen seleccionado del grupo que comprende el gen RB1, el gen CDKN2A y el gen CDKN2B.

En una realización del tercer aspecto, las células del tumor tienen una amplificación de un gen y/o una mutación activadora en un gen.

En una realización del tercer aspecto, el gen se selecciona del grupo que comprende CCND1, E2F1, E2F2, E2F3, CDK4 y CDK6.

En una realización del tercer aspecto, el gen codifica un componente de una vía de señalización mitogénica.

En una realización del tercer aspecto, la vía de señalización mitogénica se selecciona del grupo que comprende la vía PI3K y la vía MAPK.

En una realización del tercer aspecto, las células tumorales tienen resistencia o son insensibles a uno o varios agentes farmacéuticamente activos y/o la radiación.

En una realización del tercer aspecto, el agente farmacéuticamente activo es un citostático.

En una realización del tercer aspecto, la resistencia está mediada por un transportador ABC.

En una realización del tercer aspecto, el transportador ABC se selecciona del grupo que comprende MRP y MDR, en particular MDR-1.

En una realización del tercer aspecto, la resistencia es una resistencia múltiple o polirresistencia, en particular una resistencia múltiple o polirresistencia contra un citostático y/o la radiación.

En una realización del tercer aspecto, las células del tumor son positivas para Rb.

En una realización del tercer aspecto, las células del tumor tienen YB-1 en el núcleo.

En una realización del tercer aspecto, las células del tumor tienen YB-1 en el núcleo después de la inducción.

En una realización del tercer aspecto, el transporte de YB-1 al núcleo se desencadena mediante al menos una medida seleccionada del grupo que comprende irradiación, administración de citostáticos e hipertermia.

En una realización del tercer aspecto, la medida se aplica a una célula, un órgano o un organismo, preferiblemente un organismo que lo necesita, más preferiblemente un organismo que padece el tumor.

En una realización del cuarto aspecto, el adenovirus codifica una proteína oncogénica, en donde la proteína oncogénica transactiva al menos un gen adenoviral, por lo cual el gen adenoviral se selecciona del grupo que comprende E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 y E3ADP.

En una realización del cuarto aspecto, la proteína oncogénica es la proteína E1A.

En una realización del cuarto aspecto, la proteína E1A es capaz de unirse a un producto del gen inhibidor de tumores Rb funcional.

En una realización del cuarto aspecto, la proteína E1A es incapaz de unirse a un producto del gen inhibidor de tumores Rb funcional.

En una realización del cuarto aspecto, la proteína E1A no induce la localización de YB-1 en el núcleo.

En una realización del cuarto aspecto, la proteína oncogénica exhibe una o varias mutaciones o deleciones en comparación con la proteína oncogénica E1A de tipo natural.

En una realización del cuarto aspecto, la deleción es una seleccionada del grupo que comprende las deleciones de tramos de CR3 y las deleciones del extremo N-terminal y las deleciones del extremo C-terminal.

En una realización del cuarto aspecto, la proteína E1A es capaz de unirse a Rb.

En una realización del cuarto aspecto, la proteína E1A comprende una o varias mutaciones o deleciones en comparación con la proteína oncogénica de tipo natural. En una realización del cuarto aspecto, la deleción es preferiblemente una deleción en la región CR1 y/o la región CR2.

En una realización del cuarto aspecto, la proteína E1A es incapaz de unirse a Rb.

En una realización del cuarto aspecto, el virus es un adenovirus que expresa la proteína E1A12 S.

En una realización del cuarto aspecto, el virus es un adenovirus que carece de una región E3 adenoviral funcionalmente activa.

En una realización del cuarto aspecto, el virus es un adenovirus que carece de expresión de la proteína E1B de 19 kDa. En una realización del cuarto aspecto, el virus es un adenovirus que expresa un motivo RGD en una fibra.

En una realización del cuarto aspecto, el virus es un adenovirus de serotipo 5.

En una realización del cuarto aspecto, el adenovirus es dl520, en el que la región E3 adenoviral es funcionalmente inactiva.

En una realización del cuarto aspecto, el adenovirus es dl520, en el que dl520 carece de expresión de la proteína E1B de 19 kDa.

En una realización del cuarto aspecto, el adenovirus es dl520 que expresa un motivo RGD en una fibra.

En una realización del cuarto aspecto, el virus codifica YB-1.

En una realización del cuarto aspecto, el gen que codifica YB-1 está bajo el control de un promotor específico de tejido, un promotor específico de tumor y/o un promotor dependiente de YB-1.

En una realización del cuarto aspecto, el promotor dependiente de YB-1 es el promotor tardío E2 adenoviral.

En una realización del cuarto aspecto, el inhibidor de CDK4/6 es un compuesto que reduce la fosforilación de Rb en una célula, preferiblemente una célula tumoral.

En una realización del cuarto aspecto, el inhibidor de CDK4/6 es un compuesto que reduce la expresión de Rb en una célula, preferiblemente una célula tumoral.

En una realización del cuarto aspecto, el método comprende además administrar un inhibidor de PARP al sujeto. En una realización del cuarto aspecto, el inhibidor de PARP se selecciona del grupo que comprende olaparib, veliparib, rucaparib y BMN673.

En una realización del cuarto aspecto, el método comprende además administrar un inhibidor de bromodominios al sujeto.

En una realización del cuarto aspecto, el inhibidor de bromodominios se selecciona del grupo que comprende JQ1, OTX-015, I-BET151, CPI-0610, I-BET762, CPI203, PFI-1 y MS 436.

En una realización del cuarto aspecto, el adenovirus, el inhibidor de CDK4/6, el inhibidor de PARP y/o el inhibidor de bromodominios se administran al sujeto por separado o en cualquier combinación.

En una realización del cuarto aspecto, las células del tumor tienen una alteración de la vía de señalización de CDK4/6. En una realización del cuarto aspecto, las células del tumor tienen una transición G1-S no controlada del ciclo celular. En una realización del cuarto aspecto, las células del tumor tienen una mutación con pérdida de función o una deleción en un gen seleccionado del grupo que comprende el gen RB1, el gen CDKN2A y el gen CDKN2B.

En una realización del cuarto aspecto, las células del tumor tienen una amplificación de un gen y/o una mutación activadora en un gen.

En una realización del cuarto aspecto, el gen se selecciona del grupo que comprende CCND1, E2F1, E2F2, E2F3, CDK4 y CDK6.

En una realización del cuarto aspecto, el gen codifica un componente de una vía de señalización mitogénica.

En una realización del cuarto aspecto, la vía de señalización mitogénica se selecciona del grupo que comprende la vía PI3K y la vía MAPK.

En una realización del cuarto aspecto, las células tumorales tienen resistencia o son insensibles a uno o varios agentes farmacéuticamente activos y/o la radiación.

En una realización del cuarto aspecto, el agente farmacéuticamente activo es un citostático.

En una realización del cuarto aspecto, la resistencia está mediada por un transportador ABC.

En una realización del cuarto aspecto, el transportador ABC se selecciona del grupo que comprende MRP y MDR, en particular MDR-1.

En una realización del cuarto aspecto, la resistencia es una resistencia múltiple o polirresistencia, en particular una resistencia múltiple o polirresistencia contra un citostático y/o la radiación.

En una realización del cuarto aspecto, las células del tumor son positivas para Rb.

En una realización del cuarto aspecto, las células del tumor tienen YB-1 en el núcleo.

En una realización del cuarto aspecto, las células del tumor tienen YB-1 en el núcleo después de la inducción. En una realización del cuarto aspecto, el transporte de YB-1 al núcleo se desencadena mediante al menos una medida seleccionada del grupo que comprende irradiación, administración de citostáticos e hipertermia.

En una realización del cuarto aspecto, la medida se aplica a una célula, un órgano o un organismo, preferiblemente un organismo que lo necesita, más preferiblemente un organismo que padece el tumor.

Un experto en la técnica reconocerá que todas y cada una de las realizaciones de un aspecto de la presente invención son también una realización de todos y cada uno de los otros aspectos de la presente invención, incluida cualquier realización de la misma.

Sin desear limitarse por ninguna teoría, los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que combinar un virus oncolítico, preferiblemente un adenovirus oncolítico, con un inhibidor de CDK4/6 aumenta la eficacia de la terapia tumoral basada en dicho adenovirus oncolítico. Más específicamente, se supone que el inhibidor de CDK4/6 inhibe E2F-1, reduciendo así su concentración efectiva, preferiblemente en la células tumorales, y sincroniza la detención en G1 en las células. Debido a esto, más células infectadas pueden completar todo el ciclo de vida viral.

Basándose en la evidencia y los conocimientos proporcionados en la presente memoria, un experto en la técnica entenderá que es adecuado cualquier adenovirus (mutante) para su uso en la práctica de la presente invención que permita que se consiga al menos tan solo un 10%, 20% o 30% de la expresión de tipo natural y, respectivamente, la actividad de E1B55K y E4orf6 mediante dicho adenovirus. Un experto en la técnica apreciará que dicho adenovirus mutante puede generarse modificando E1A. Los adenovirus mutantes ejemplares son los adenovirus XVir-N-31, dl520, AdA24, AdA24-RGD, dl922-947, E1Ad/01/07, dl1119/1131, CB 016, VCN-01, E1Adl1107, E1Adl1101, ORCA-010, Enadenotucirev y los virus que carecen de un oncogén viral expresado que sea capaz de unirse a un producto del gen inhibidor de tumores Rb funcional.

El epónimo de los adenovirus es el primer aislamiento del virus en las amígdalas y tejido adenoideo humano en 1953 por Wallace P. Rowe y Robert J. Huebner (Rowe et al., 1953). La familia Adenoviridae comprende cinco géneros, a saber, Mastadenovirus, Aviadenovirus, Siadenovirus, Atadenovirus e Ichtadenovirus (Modrow, 2013). Debido a su oncogenicidad en roedores recién nacidos, se pueden clasificar en siete subgrupos HAdV-A a HAdV-G (Boulanger y Blair, 1991) con un total de 62 serotipos. Por tanto, la investigación sobre la viroterapia oncolítica se centra principalmente en el serotipo 5 del mastadenovirus tipo C.

La cápside icosaédrica no revestida, con un tamaño de 80 a 110 nm, está compuesta por 252 capsómeros, que constan de 12 pentonas, ensamblados a partir de una base de pentona y estructuras proteicas en forma de púas, llamadas fibras, en los vértices de la cápside y 249 caras, llamadas hexonas (Modrow, 2013). Todo el ciclo de vida de los adenovirus se puede subdividir en una fase temprana con entrada celular, translocación nuclear del genoma viral, transcripción y traducción de los genes tempranos y una fase tardía con transcripción y traducción de los genes tardíos. Por tanto, las proteínas tardías son las principales responsables del ensamblaje de las proteínas estructurales y la maduración de los viriones (Russell, 2000). En las células permisivas, la fase inicial dura entre 6 y 8 horas, seguida de una fase tardía de entre 4 y 6 horas. La unión se produce mediante la interacción de una estructura de protuberancia, que está presente en cada extremo de las estructuras fibrosas, con un receptor en las células diana al menos para los adenovirus HAdV-A, -C, -E y -F. Dado que se detectó que este receptor es el mismo responsable de la adsorción del virus coxsackie B, el receptor se denomina receptor de coxsackievirus y adenovirus (CAR) (Bergelson, 1997). Además, la unión a la superficie de la célula diana está respaldada por "moléculas puente", proteínas solubles en los fluidos corporales como los factores de coagulación sanguínea VII y X, que median en la unión de las proteínas de las fibras de ciertos tipos de adenovirus (Modrow, 2013). Después de esta etapa de adsorción, un motivo RGD (arginina-glicina-ácido aspártico) de la base de pentona interactúa con las integrinas heterodiméricas avp3 o avp5, que funcionan como correceptores en este proceso. Esta interacción da como resultado la internalización del virus (Wickham et al., 1993). Posteriormente, se produce la endocitosis mediante una internalización mediada por clatrina en la membrana citoplasmática y el virus está presente en los endosomas. Después de la acidificación de las vesículas endocíticas, la proteína de la fibra viral cambia su conformación con la consiguiente destrucción de la membrana endosómica (Greber et al., 1996). Las partículas virales ahora están libres en el citoplasma. Mediante la unión de partículas residuales a las dineínas de los microtúbulos, el genoma viral se transfiere al núcleo (Modrow, 2013).

El genoma de los adenovirus consta de un ADN lineal bicatenario de 36 a 38 kb de longitud. Mediante la interacción de dos moléculas de proteína terminal (TP), que están unidas covalentemente a ambos extremos 5', se forma un estado cuasi circular (Modrow, 2013). En general, las cinco regiones codificantes del genoma adenoviral se pueden subdividir en los genes tempranos E1-E4, activos principalmente en la fase temprana de la infección y los genes tardíos (L1-L5), que codifican proteínas principalmente necesarias para la formación de las partículas virales (Modrow, 2013).

La replicación adenoviral depende especialmente de la expresión del gen viral temprano E2, que está fuertemente inducido por la proteína E1A grande (E1A13S). El primer gen viral que se transcribe después de la infección es la región temprana 1A (E1A). La transcripción primaria de E1A se procesa mediante corte y empalme diferencial para producir cinco mensajes distintos con coeficientes de sedimentación de 13S, 12S, 11S, 10S y 9S. Los ARNm 13S y 12S son los más abundantes en las primeras etapas de la infección, mientras que el ARNm 9S es el más abundante en las últimas etapas. Los ARNm 11S y 10S son especies menores que se vuelven más abundantes en momentos tardíos después de la infección. El ARNm de E1A 13S, 12S, 115, 10S y 9S codifica las proteínas de 289 residuos (R), 243R, 217R, 171R y 55R respectivamente, todas las cuales son detectablesin vivocon la excepción del producto 9S que solo se ha detectadoin vitro.En general, la expresión de genes adenovirales está altamente regulada en el curso de una infección con un alto grado de complejidad. De este modo, la transcripción de los genes E2 cuyos productos codifican la ADN polimerasa viral y otras proteínas necesarias para la replicación viral eficiente está bajo el control de dos promotores, el promotor E2 temprano y el promotor E2 tardío.

Debido a sus dos regiones de control transcripcional superpuestas, el promotor temprano E2 se puede subdividir en el promotor principal que comienza en la posición 1 y el promotor menor que comienza en la posición -26, y ambos contienen un motivo TATA (Swaminathan y Thimmapaya, 1996). Estos motivos sirven como sitios de unión para las proteínas de unión a cajas TATA (TBP). Además, un sitio de unión para el factor de transcripción activador (ATF) entre las posiciones -68 y -77 y dos sitios de unión de E2F/DP-1 (TTTCGCGC) [AKB: menos de 10 nt, no es necesario incorporar la secuencia en una alineación de secuencia], alineados en orientación invertida entre sí, están ubicados en las posiciones -35 y -63 del promotor temprano principal E2 (Swaminathan y Thimmapaya, 1996). La activación del promotor temprano E2 a través de E1A depende principalmente de los dos sitios de unión de E2F localizados en la parte principal del promotor.

En las etapas intermedias de la infección, después de aproximadamente 6 hpi (horas después de la infección), el promotor tardío E2 controla la expresión de los genes E2. En la posición nt -33 a -22 de su secuencia de 157 pb, hay una caja TATA, que puede unirse y activarse mediante TBP celular (Swaminathan y Thimmapaya, 1996). Además, dos sitios de reconocimiento SP1 y tres cajas CCAAT son característicos del promotor tardío E2.

Dado que se demostró que el factor celular YB-1 es capaz de unirse a cajas CCAAT invertidas, se investigó la interacción entre la proteína 1 de unión a la caja Y (YB-1) y el promotor tardío E2. Holm et al. demostró en 2002 que, de hecho, existe una interacción específica de YB-1 con las cajas Y (cajas CCAAT invertidas), presentes en el promotor tardío E2 con capacidad para controlar la actividad de este promotor (Holm et al., 2002). Para ejercer su actividad transactivadora, YB-1 debe translocarse al núcleo a través del complejo adenoviral E1B-55k/E4-orf6. Estos genes virales tempranos se expresan después de la transactivación de E1A-13S (Frisch y Mymryk, 2002).

El factor celular YB-1, codificado por el gen YBX1, es un dominio de choque frío que contiene una proteína de unión al ADN con múltiples funciones en la transcripción, corte y empalme, control traduccional y reparación de daños en el ADN (Kohno et al., 2003). Además, desempeña un papel importante en la resistencia a los fármacos, debido a su activación de los genes MDR1 y MRP1 que participan en el desarrollo de un fenotipo resistente a múltiples fármacos en las células cancerosas (Mantwill et al., 2006). La expresión de YB-1 se induce con el transporte nuclear posterior mediante la exposición a factores de estrés extrínsecos como la infección adenoviral, la quimioterapia o la radiación UV (Mantwill et al., 2006).

La activación transcripcional de los genes tempranos y tardíos del adenovirus es fundamental para el ciclo de vida viral. Brevemente, el ciclo de vida viral se inicia con la activación de la transcripción de E1A, seguida de una cascada de activación de los genes E2, E3 y E4. Finalmente, el promotor tardío principal (MLP) se activa para coordinar la expresión de la cápside y las proteínas accesorias involucradas en gran medida en la encapsidación del genoma (Turner et al. 2015). Para superar el bloqueo de la replicación del ADN viral presente en las células que no proliferan, el virus expresa las proteínas 1A tempranas (E1A). Estas proteínas tempranas inmediatas conducen a las células a la fase S e inducen la expresión de todos los demás genes tempranos virales. Durante la infección, se expresan varias isoformas de E1A con proteínas de 289, 243, 217, 171 y 55 residuos presentes en el adenovirus humano tipo 5. En el contexto de la infección, el principal impulsor de la expresión del gen viral es la proteína grande E1A 289R (Radko et al. 2015).

Tras la infección, la expresión de la proteína adenoviral E1A promueve la progresión del ciclo celular desde la fase G0/G1 a la fase S y la replicación viral incluso en las células epiteliales terminalmente diferenciadas, el principal objetivo de los adenovirus humanos. Este proceso se considera esencial para el ciclo de vida de los adenovirus.

Los adenovirus han sido diseñados para infectar, replicar y matar células cancerosas sin afectar a las células normales. Después de la infección y replicación en las células tumorales, los virus oncolíticos matan las células y liberan viriones para los ciclos posteriores de amplificación. Para lograr la replicación solo en las células tumorales, se han realizado dos tipos de modificaciones genéticas, lo que lleva a que se hayan diseñado tres subclases de adenovirus oncolíticos (también denominados CRAd en la presente memoria), todas las cuales pueden usarse en la práctica de la presente invención. Además, los adenovirus oncolíticos adecuados para su uso en la práctica de la presente invención se describen, entre otros, en el documento WO 2003/099859.

Los CRAd de tipo I se caracterizan por mutaciones o deleciones en la región E1 del genoma, lo que interfiere con la inactivación de los reguladores del ciclo celular como p53 y la proteína de retinoblastoma (Rb). Como consecuencia, los CRAd de tipo I se replican en células tumorales que se dividen activamente. Por ejemplo, Onyx-015, también conocido como dl1520, que no puede expresar la proteína E1B-55 kDa, no puede inactivar p53 y evitar la detención del ciclo celular inducida por p53. Varios estudios atribuyeron la base molecular de la selectividad de Onyx-015 a la falta de expresión de p53 o de uno de los genes implicados en la vía de p53. Sin embargo, O'Shea et al. demostraron que la exportación del ARN viral tardío, en lugar de la inactivación de p53, determina la selectividad del virus Onyx-015. Otros CRAd de tipo I con deleciones en la región E1A no pueden unirse a Rb y desencadenar la entrada a la fase S. Por ejemplo, dl922-947 y A24 contienen una deleción de 24 nucleótidos en el dominio CR2 de la región E1A, lo que anula la interacción E1A-Rb. Como resultado, estos virus se replican principalmente en las células tumorales donde está disponible E2F libre, sin unir.

Otra forma de restringir la replicación adenoviral a las células tumorales es regular la transcripción de los genes virales necesarios para la replicación viral. En los CRAd de tipo II, el genoma se coloca bajo el control de un promotor específico del tumor. Esos promotores se obtuvieron de genes que se sabe que se expresan preferentemente en algunos tumores en comparación con el tejido normal (p. ej., telomerasa o ciclooxigenasa II); o que se sobreexpresan en los tumores (p. ej., antígeno prostático específico, PSA o a-fetoproteína, AFP) en comparación con los tejidos normales. En los CRAd de tipo III, como XVir-N-31 (Ad-Delo3-RGD), se caracteriza por la deleción del dominio de transactivación CR3 en la proteína E1A13S. XVir-N-31 son adenovirus de replicación defectuosa en las células normales. XVir-N-31 restablece su competencia de replicación mediante la presencia de la proteína celular multifuncional YB-1 en el núcleo. En consecuencia, los CRAd sólo son capaces de replicarse en las células tumorales y, por tanto, en última instancia, las lisan. Ni las mutaciones de p53, ni ras ni RB son efectivas para complementar la deficiencia de replicación de XVir-N-31. XVir-N-31 carece de E1A13S, por lo que la proteína E1B55k y la proteína E4orf6 no se expresan. Esta deficiencia se complementa con la presencia de YB-1 en el núcleo de las células tumorales que desencadena la expresión de E1B55k y E4orf6 independientemente de E1A13S. Una vez inducidos por la presencia de YB-1 en el núcleo, E1B55k y E4orf6 transfieren más YB-1 celular al núcleo, impulsando la replicación viral.

El ciclo celular progresa secuencialmente a través de las etapas de la brecha 1 (G1), síntesis (S), brecha 2 (G2) y mitosis (M). Esta progresión está regulada a través de una compleja red de señalización. Las proteínas CDK (quinasa dependiente de ciclina), CDK1, CDK2, CDK4 y CDK6, son reguladores importantes de la progresión del ciclo celular cuando forman complejos con proteínas ciclina específicas. La expresión constitutiva de CDK y el control temporal de varias ciclinas permiten la regulación de fases específicas del ciclo celular mediante distintos complejos ciclina-CDK. La actividad de CDK está regulada negativamente por varias proteínas inhibidoras. Los diversos aspectos de la biología y función de CDK se han revisado previamente de manera exhaustiva.

CDK4 y CDK6, que muestran homología estructural y funcional, regulan la transición de células inactivas en la fase G1 a la fase S cuando forman complejos con proteínas ciclina D. Las proteínas ciclina D tienen tres subtipos, ciclina D1-3, y se acumulan en presencia de estímulos mitogénicos. Los reguladores negativos de CDK4/6 incluyen el inhibidor de las proteínas CDK4 (INK4), p16INK4A, p15INK4B, p18INK4C y p19INK4D, que inhiben la actividad de CDK4/6 al reducir su unión con la ciclina D1 o al ocupar directamente sus dominios catalíticos.

La actividad quinasa de CDK4/6 conduce a la fosforilación de los miembros de la familia de proteínas de retinoblastoma (Rb), incluidos Rb, p107 y p130, lo que da como resultado su inactivación funcional. En las células inactivas, la Rb hipofosforilada activa se une a miembros de la familia de factores de transcripción E2F que forman un complejo con DP-1/2, junto con otros correpresores y suprime la función de E2F (Rubin et al. 2005). Tras la fosforilación, Rb se disocia de este complejo y permite la transcripción de genes diana E2F, incluidos ciclina A, ciclina E y DHFR, entre otros, que son necesarios para la transición del ciclo celular a la fase S. Por lo tanto, la inhibición de la actividad de CDK4/6 conduce a la desfosforilación de Rb y a la represión de la actividad de E2F, lo que promueve una detención en G0/G1. Esto ha impulsado el desarrollo de inhibidores de CDK4/6 como terapia diana en las células cancerosas.

La interrupción de la vía de señalización de CDK4/6-Rb y una transición G1-S incontrolada del ciclo celular es una característica común de las células cancerosas. Esto puede ocurrir debido a diversas alteraciones moleculares, incluida la pérdida de función, mutaciones o deleciones del gen RB1 (que codifica Rb), CDKN2A (que codifica p16INK4A y p14ARF) o CDKN2B (que codifica p15INK4B). Dicha desregulación también puede resultar de la amplificación o activación de mutaciones en CCND1 (que codifica la ciclina D1), E2F1 -3, CDK4, CDK6 o componentes de diversas vías de señalización mitogénica, como las vías PI3K o MAPK.

Se han desarrollado varios inhibidores de CDK de molécula pequeña competitivos con el ATP. Sin embargo, los inhibidores de primera generación, como el flavopiridol, no son selectivos y pueden inhibir múltiples CDK, lo que podría dar lugar a una eficacia limitada y una alta toxicidad. Los inhibidores de CDK4/6 de siguiente generación muestran una alta selectividad e incluyen palbociclib (PD-0332991 de Pfizer), abemaciclib (LY-2835219 de Eli Lilly) y ribociclib (LEE011 de Novartis) y Trilaciclib (G1T28). Estos inhibidores de CDK4/6 se han probado preclínicamente en modelosin vitroein vivode varias entidades cancerosas, incluidas leucemia, cáncer de mama, melanoma, glioma, cáncer de páncreas, carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma de pulmón, sarcoma, cáncer de ovario, cáncer renal, cáncer de próstata, y cáncer de mama metastásico (mBC). En la mayoría de los estudios, han demostrado un fenotipo molecular y funcional coherente con una reducción dependiente de la dosis en la fosforilación de Rb, la expresión de proteínas y la transcripción de los genes diana E2F, lo que se correlaciona con una detención en G0/G1 y una inhibición de la proliferación celular. Además, todos estos informes demuestran que la expresión de Rb es un requisito previo para la sensibilidad a estos inhibidores.

Los inhibidores de CDK4/6, como PD-0332991, dan como resultado una reducción dependiente de la dosis en la proteína Rb total que se correlaciona con una disminución en la Rb fosforilada. Esta disminución en la Rb total se correlaciona parcialmente con una reducción en los niveles de transcripción de RB1 y la transcripción de los genes diana de E2F, CCNA2 y CCNE2. Además, el nivel de expresión de E2F está significativamente inhibido.

Los inhibidores de CDK4/6 adecuados para el uso en la práctica de la presente invención se describen en la Fig. 25.

Como se desprende de la parte del ejemplo, cualquier inhibidor de CDK4/6 es adecuado para su uso en combinación con un virus, preferiblemente un adenovirus y más preferiblemente un adenovirus oncolítico, por lo que el inhibidor de CDK4/6 provoca la detención en G1 de las células e inhibe E2F1, más específicamente, la actividad de E2F1.

Un experto en la técnica apreciará que cualquier inhibidor de CDK4/6 se utiliza en una concentración terapéuticamente eficaz.

PARP1 es una proteína importante para reparar roturas monocatenarias (“mellas” en el ADN). En los mamíferos, se han descubierto 17 miembros de la familia PARP, y sólo 6 de ellos sintetizan poli ADP-ribosa (pADPr). PARP1, PARP2 y PARP3 desempeñan funciones en la reparación del ADN. PARP1 se une al ADN que ha sufrido roturas monocatenarias (SSB) y roturas bicatenarias (DSB). Luego, PARP1 sufre un cambio conformacional que alinea residuos de aminoácidos clave en el sitio activo, aumentando así su actividad. Una vez que se activa PARP1, sintetiza pADPr, que se une a las proteínas y altera su función. El pADPr se degrada rápidamente por la pADPr glicohidrolasa para garantizar que los niveles de pADPr presentes reflejen el daño del ADN y que la respuesta al pADPr finalice después de la reparación del ADN.

Al inhibir las vías de reparación del ADN, los inhibidores de PARP1 provocan un aumento de las roturas monocatenarias dentro del ADN. Este daño en el ADN no se repara y se transporta a las células hijas después de la replicación, ya que ya no se produce BER. Esto conduce a un aumento de DSB en los tumores que tienen mutaciones BRCA1 y b Rc A2 (Scott et al. 2015, J Clin Oncol., 33(12): 1397-140). Las estructuras químicas de los inhibidores de PARP, incluidos los fármacos candidatos de PARP rucaparib, veliparib y olaparib, se muestran en la Fig. 26 y se describen en Antolín y Mestres 2014, Oncotarget, 30;5(10):3023-8, incluido el resto benzamida que caracteriza todas las estructuras inhibidoras de PARP.

Además, está bien establecido que YB-1 potencia la actividad de PARP y disminuye la eficacia de los inhibidores de PARP1 (Alemasova et al. 2018, Oncotarget, 34, 23349-65), lo que sugiere que el adenovirus oncolítico dependiente de YB-1 en combinación con inhibidores de CDK4/6 e inhibidores de PARP funcionará de forma sinérgica en la destrucción de células cancerosas. Olaparib y BMN673 (talazolarib desarrollado por Pfizer, EE. UU., Clin Cancer Res.

2013, 15;19(18):5003-15) son ejemplos de inhibidores de PARP.

Un experto en la técnica apreciará que cualquier inhibidor de PARP se utiliza en una concentración terapéuticamente eficaz.

Los inhibidores de CDK4/6 adecuados para su uso en la práctica de la presente invención se describen en la Fig. 25.

Las anomalías en el panorama epigenético son un sello distintivo del cáncer y la acetilación de los residuos de lisina es una modificación postraduccional con amplia relevancia para la señalización celular y la biología de las enfermedades. Las enzimas que "escriben" (histonas acetiltransferasas, HAT) y "borran" (histonas desacetilasas, HDAC) los sitios de acetilación son un área de extensa investigación en el desarrollo de fármacos actuales. El reclutamiento de proteínas en complejos macromoleculares mediante residuos de lisina acetilada está mediado por bromodominios (BRD), que son módulos de interacción de proteínas altamente conservados desde un punto de vista evolutivo que reconocen motivos de acetilación de s-N-lisina. El pliegue BRD conservado contiene un sitio de unión de acetil lisina profundo y en gran medida hidrófobo, que representa un bolsillo atractivo para el desarrollo de moléculas pequeñas y farmacéuticamente activas. Las proteínas que contienen BRD se han implicado en el desarrollo de una gran variedad de enfermedades.

Recientemente, dos inhibidores muy potentes y selectivos que se dirigen a los BRD de la familia BET (bromodominios y extraterminales) proporcionaron datos convincentes que respaldan la orientación de estos BRD en el cáncer. La subfamilia BET (bromodominio y dominio extraterminal) de proteínas de bromodominios, compuesta por BRD2, BRD3, BRD4 y BRDT, desempeña diversas funciones en la regulación de la transcripción por la ARN polimerasa II (POLII) y es una nueva clase interesante de dianas farmacológicas epigenéticas. Estas proteínas facilitan las fases de inicio y elongación de la transcripción uniéndose a la cromatina activada en los residuos de lisina acetilada. El reconocimiento de la cromatina activada por estos llamados "lectores" epigenéticos promueve el reclutamiento del complejo de ARN polimerasa II en los sitios de transcripción activa. La interacción BRD4/P-TEFb es importante para el reinicio transcripcional rápido después de la mitosis (Muller et al., 2011, Expert Rev. Mol. Medicine, 13, e19). P-TEFb se identificó y purificó como un factor necesario para la generación de transcripciones de larga duración utilizando un sistema de transcripciónin vitroderivado de células de Drosophila. Es una quinasa dependiente de ciclina que contiene la subunidad catalítica, Cdk9, y una subunidad reguladora, ciclina T en Drosophila. En los seres humanos existen múltiples formas de P-TEFb que contienen Cdk9 y una de varias subunidades de ciclina, ciclina T1, T2 y K. P-TEFb se asocia con otros factores, incluida la proteína de bromodominio BRD4, y se encuentra asociado con un gran complejo de proteínas llamadas complejo de súper elongación (Yang Z. et al., 2005. Mol Cell; 19:535-45; Fu et al., 1999, J Biol Chem., 274:34527-30).

JQ1 (tieno-triazolo-1 -4-diazepina) es un potente inhibidor de la familia BET de proteínas de bromodominios que incluye BRD2, BRD3, BRD4 (Filippakopoulos et al., 2010 Nature 468, 1067-1073). JQ1 previene la interacción entre el bromodominio y el grupo acetilo, provocando la regulación negativa de ciertos genes. Se han descrito otros inhibidores del bromodominio BET, incluidos OTOX15, BAY1238097, GSK2820151, I-BET762 y PLX51107 (Pérez-Salvia y Esteller 2017, EPIGENETICS, 12, 323-339; Brandt et al., 2015ACS Chem. Biol., 10, 22-39). JQ-1 está estructuralmente relacionado con las benzodiazepinas. La fórmula es C23H25ClN4O2S.

Recientemente, se ha demostrado que el inhibidor de BET JQ1 facilita la infección por adenovirus y la administración de genes mediada por vectores adenovirales. El tratamiento de células con JQ1 induce un aumento en la asociación de BRD4 con CDK9, una subunidad de P-TEFb de elongación de la transcripción. Sin embargo, como se indica en el artículo, se requieren más estudios para detallar el mecanismo mediante el cual se utiliza BED4 para regular la infección por adenovirus y la expresión transgénica (Baojie Lv et al. 2018, Scientific Reports, 8, 11554). Es importante destacar que no se investigaron la replicación viral ni la transcripción viral. Sin embargo, se sabe que CDK9 estimula la liberación de la polimerasa en pausa y activa la transcripción aumentando el número de polimerasas transcriptoras y, por tanto, la cantidad de síntesis de ARNm por tiempo (Gressel et al. 2017, eLife, 6, e29736). Además, se demostró que la resistencia a los inhibidores de BET puede superarse con inhibidores de CDK4/6 (Jin et al. 2018, Mol Cell; 71(4):592-605). Recientemente se demostró un aumento drástico en la interacción P-TEFb-Brd4 desde la mitosis tardía hasta las fases G1 tempranas del ciclo celular y el reclutamiento activo de P-TEFb en los cromosomas, seguido del inicio de la transcripción de genes clave para la progresión de G1. Es importante destacar que el agotamiento de Brd4 anuló todo el proceso al reducir la transcripción de genes de G1 esenciales, lo que llevó a la detención del ciclo celular en G1 y a la apoptosis (Yang et al., 2008, Mol Cell Biol., 28:967-976, Kohoutek, 2009, Cell Division, 4. 19).

Sin embargo, no se sabe nada sobre el uso de adenovirus oncolíticos dependientes de YB-1 junto con inhibidores de CDK4/6 e inhibidores de BET.

Se apreciará y está dentro de la presente invención que otros inhibidores de bromodominios serán igualmente adecuados para el uso en la terapia triple mediante el uso de un virus, preferiblemente un adenovirus, más preferiblemente un adenovirus oncolítico tal como XVir-N-31, y un inhibidor de CDK4/6.

Un experto en la técnica apreciará que cualquier inhibidor de bromodominios (Bet) se utiliza en una concentración terapéuticamente eficaz.

Los inhibidores de bromodominios adecuados para el uso en la práctica de la presente invención se describen en la Fig. 27.

Los tumores que pueden tratarse en particular con los virus y, por tanto, las combinaciones de la presente invención descritas en la presente memoria son preferentemente aquellos tumores que se seleccionan del grupo que comprende tumores del sistema nervioso, tumores oculares, tumores de la piel, tumores del tejido blando, tumores gastrointestinales, tumores del sistema respiratorio, tumores del esqueleto, tumores del sistema endocrino, tumores del sistema genital femenino, tumores de la glándula mamaria, tumores del sistema genital masculino, tumores del sistema de salida de la orina, tumores del sistema hematopoyético, incluidos los tumores mixtos y embrionarios, y la leucemia. Está dentro de la presente invención que estos tumores son en particular tumores resistentes como se define en particular en la presente memoria.

El grupo de tumores del sistema nervioso comprende preferentemente:

1. Tumores del cráneo así como del cerebro (intracraneales), preferentemente astrocitoma, oligodendroglioma, meningioma, neuroblastoma, ganglioneuroma, ependimoma, schwannoglioma, neurofibroma, hemangioblastoma, lipoma, craneofaringioma, teratoma y cordoma;

2. Tumores de la médula espinal y del canal vertebral, preferentemente glioblastoma, meningioma, neuroblastoma, neurofibroma, osteosarcoma, condrosarcoma, hemangiosarcoma, fibrosarcoma y mieloma múltiple; y

3. Tumores de los nervios periféricos, preferentemente schwannoglioma, neurofibroma, neurofibrosarcoma y fibroblastoma perineural.

El grupo de los tumores oculares comprende preferentemente:

1. Tumores de los párpados y de las glándulas palpebrales, preferentemente adenoma, adenocarcinoma, papiloma, histiocitoma, tumor de mastocitos, tumor de células basales, melanoma, carcinoma de células escamosas, fibroma y fibrosarcoma;

2. Tumores de la conjuntiva y de la membrana nictitante, preferentemente carcinoma de células escamosas, hemangioma, hemangiosarcoma, adenoma, adenocarcinoma, fibrosarcoma, melanoma y papiloma; y

3. Tumores de la órbita, del nervio óptico y del globo ocular, preferentemente retinoblastoma, osteosarcoma, mastocitoma, meningioma, tumor de células reticulares, glioma, schwannoglioma, condroma, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, tumor de células plasmáticas, linfoma, rabdomiosarcoma y melanoma.

El grupo de tumores de piel comprende preferentemente:

Tumores de histiocitoma, lipoma, fibrosarcoma, fibroma, tumor de mastocitos, melanoma maligno, papiloma, tumor de células basales, queratoacantoma, hemangiopericitoma, tumores de los folículos pilosos, tumores de las glándulas sudoríparas, tumores de las glándulas sebáceas, hemangioma, hemangiosarcoma, lipoma, liposarcoma, histiocitoma fibroso maligno, plasmocitoma y linfangioma.

El grupo de tumores de los tejidos blandos comprende preferentemente:

Tumores del sarcoma alveolar de tejidos blandos, sarcoma de células epitelioides, condrosarcoma de tejidos blandos, osteosarcoma de tejidos blandos, sarcoma de Ewing de tejidos blandos, tumores neuroectodérmicos primitivos (PNET), fibrosarcoma, fibroma, leiomiosarcoma, leiomioma, liposarcoma, histiocitoma fibroso maligno, hemangiopericitoma maligno, hemangioma, hemangiosarcoma, mesenquimoma maligno, tumor maligno de la vaina del nervio periférico (MPNST), schwannoglioma maligno, schwannoglioma melanocítico maligno, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial, linfangioma y linfangiosarcoma.

El grupo de tumores gastrointestinales comprende preferentemente:

1. Tumores de la cavidad bucal y de la lengua, preferentemente carcinoma de células escamosas, fibrosarcoma, tumor de células de Merkel, fibroameloblastoma inductivo, fibroma, fibrosarcoma, papilomatosis viral, papilomatosis idiopática, pólipos nasofaríngeos, leiomiosarcoma, mioblastoma y tumor de mastocitos;

2. Tumores de las glándulas salivales, preferiblemente adenocarcinoma;

3. Tumores del esófago, preferentemente carcinoma de células escamosas, leiomiosarcoma, fibrosarcoma, osteosarcoma, carcinoma de Barrett y tumores paraesofágicos;

4. Tumores del páncreas exocrino, preferiblemente adenocarcinoma; y

5. Tumores del estómago, preferentemente adenocarcinoma, leiomioma, leiomiosarcoma y fibrosarcoma. El grupo de tumores del sistema respiratorio comprende preferentemente:

1. Tumores de la nariz y de la cavidad nasal, de la laringe y de la tráquea, preferentemente carcinoma de células escamosas, fibrosarcoma, fibroma, linfosarcoma, linfoma, hemangioma, hemangiosarcoma, melanoma, tumor de mastocitos, osteosarcoma, condrosarcoma, oncocitoma (rabdomioma), adenocarcinoma. y mioblastoma; y 2. Tumores de pulmón, preferentemente carcinoma de células escamosas, fibrosarcoma, fibroma, linfosarcoma, linfoma, hemangioma, hemangiosarcoma, melanoma, tumor de mastocitos, osteosarcoma, condrosarcoma, oncocitoma (rabdomioma), adenocarcinoma, mioblastoma, carcinoma de células pequeñas, carcinoma de células no pequeñas, adenocarcinoma bronquial, adenocarcinoma broncoalveolar y adenocarcinoma alveolar. El grupo de tumores esqueléticos comprende preferentemente:

osteosarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma parostal, hemangiosarcoma, sarcoma de células sinoviales, hemangiosarcoma, fibrosarcoma, mesenquimoma maligno, tumor de células gigantes, osteoma y osteoma multilobular.

El grupo de tumores del sistema endocrino comprende preferentemente:

1. Tumores de la glándula tiroides/paratiroides, preferiblemente adenoma y adenocarcinoma;

2. Tumores de la glándula suprarrenal, preferiblemente adenoma, adenocarcinoma y feocromocitoma (medulosuprarrenoma);

3. Tumores del hipotálamo/hipófisis, preferiblemente adenoma y adenocarcinoma;

4. Tumores del páncreas endocrino, preferiblemente insulinoma (tumor de células beta, APUDom) y síndrome de Zollinger-Ellison (tumor secretor de gastrina de las células delta del páncreas); y

5. Otras neoplasias endocrinas múltiples (MEN) y quimiodectoma.

El grupo de tumores del sistema sexual femenino comprende preferentemente:

1. Tumores de ovario, preferiblemente adenoma, adenocarcinoma, cistadenoma y carcinoma indiferenciado; 2. Tumores del útero, preferentemente leiomioma, leiomiosarcoma, adenoma, adenocarcinoma, fibroma, fibrosarcoma y lipoma;

3. Tumores del cuello uterino, preferentemente adenocarcinoma, adenoma, leiomiosarcoma y leiomioma; 4. Tumores de vagina y vulva, preferentemente leiomioma, leiomiosarcoma, fibroleiomioma, fibroma, fibrosarcoma, pólipos y carcinoma de células escamosas.

El grupo de tumores de las glándulas mamarias comprende preferentemente:

fibroadenoma, adenoma, adenocarcinoma, tumor mesenquimatoso, carcinoma, carcinosarcoma.

El grupo de tumores del sistema sexual masculino comprende preferentemente:

1. Tumores de testículos, preferentemente seminoma, tumor de células intersticiales y tumor de células de Sertoli; 2. Tumores de próstata, preferentemente adenocarcinoma, carcinoma indiferenciado, carcinoma de células escamosas, leiomiosarcoma y carcinoma de células de transición; y

3. Tumores del pene y de los genitales externos, preferentemente mastocitomas y carcinoma de células escamosas.

El grupo de tumores del sistema de salida urinario comprende preferentemente:

1. Tumores del riñón, preferentemente adenocarcinoma, carcinoma de células transicionales (tumores epiteliales), fibrosarcoma, condrosarcoma (tumores mesenquimales), tumor de Wilm, nefroblastoma y nefroma embrionario (blastoma embrionario pluripotente);

2. Tumores del uréter, preferiblemente leiomioma, leiomiosarcoma, fibropapiloma, carcinoma de células de transición;

3. Tumores de la vejiga urinaria, preferentemente carcinoma de células de transición, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, botrioide (rabdomiosarcoma embrionario), fibroma, fibrosarcoma, leiomioma, leiomiosarcoma, papiloma y hemangiosarcoma; y

4. Tumores de la uretra, preferiblemente carcinoma de células de transición, carcinoma de células escamosas y leiomiosarcoma.

El grupo de tumores del sistema hematopoyético comprende preferentemente:

1. Linfoma, leucemia linfática, leucemia no linfáctica, leucemia mieloproliferativa, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin.

El grupo de los tumores mixtos y embrionarios comprende preferentemente:

Hemangiosarcoma, timoma y mesotelioma.

Preferiblemente, estos tumores se seleccionan del grupo que comprende cáncer de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, osteosarcoma, glioblastoma, melanoma, carcinoma de pulmón de células pequeñas y carcinoma colorrectal. Otros tumores son aquellos que son resistentes como se describe en la presente memoria, preferiblemente aquellos que son multirresistentes, particularmente también aquellos tumores del grupo descrito anteriormente.

Los sujetos a los que se les va a administrar la combinación de la invención como se define en las reivindicaciones se identifican y examinan, respectivamente. Dicha identificación de los pacientes que pueden beneficiarse de la presente invención en sus diversos aspectos se basa en la detección de YB-1 en el núcleo de una muestra de un sujeto.

El examen del tejido tumoral se puede realizar usando un agente que se selecciona del grupo que comprende anticuerpos contra YB-1, aptámeros contra YB-1 y espiegelmeros contra YB-1 así como anticalinas contra YB-1. Básicamente se pueden fabricar los mismos medios para los marcadores correspondientes y utilizarlos correspondientemente. Los expertos en la técnica conocen la fabricación de anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales. Otro medio para la detección específica de YB-1 o de los marcadores son péptidos que se unen con alta afinidad a las estructuras diana, en el presente caso YB-1 o dichos marcadores. En la técnica anterior se conocen métodos tales como la presentación en fagos para generar dichos péptidos. Normalmente, se toma como punto de partida una biblioteca de péptidos, donde los péptidos individuales tienen una longitud de 8 a 20 aminoácidos y el tamaño de la biblioteca es de aproximadamente 102 a 1018, preferiblemente de 108 a 1015 péptidos diferentes. Una forma especial de polipéptidos que se unen a las moléculas diana son las denominadas anticalinas, que se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente alemana DE 19742706.

Otro medio adicional para la unión específica de YB-1 o los marcadores correspondientes descritos en la presente memoria y, por tanto, para la detección de la localización independiente del ciclo celular de YB-1 en el núcleo celular, son los denominados aptámeros, es decir, los ácidos D-nucleicos que están presentes ya sea como ARN o ADN en forma monocatenaria o bicatenaria y que se unen específicamente a la molécula diana. La generación de aptámeros se describe, por ejemplo, en la patente europea EP 0533 838. Una forma especial de aptámeros son las llamadas aptazimas, que se describen, por ejemplo, en Piganeau, N. et al. (2000), Angew. Chem. Int. Ed., 39, núm. 29, páginas 4369-4373. Estas son formas especiales de aptámeros en la medida en que comprenden, además de la parte de aptámero, una parte de ribozima y se vuelven catalíticamente activas tras la unión o liberación de la molécula diana que se une a la parte del aptámero y escinden un sustrato de ácido nucleico que acompaña a la generación de una señal.

Otra forma de aptámeros son los llamados espiegelmeros, es decir, ácidos nucleicos que se unen a la molécula diana que están hechos de ácidos L-nucleicos. El método para la fabricación de tales espiegelmeros se describe, por ejemplo, en el documento WO 98/08856.

La muestra del tejido tumoral se puede obtener mediante punción o mediante cirugía. La evaluación de si YB-1 está localizado en el núcleo independientemente del ciclo celular se realiza frecuentemente mediante técnicas microscópicas y/o inmunohistoanálisis, preferiblemente utilizando el anticuerpo o cualquiera de los otros medios antes mencionados. El experto en la técnica conoce otros medios para detectar YB-1 en el núcleo y en particular para detectar que YB-1 se encuentra allí independientemente del ciclo celular. Por ejemplo, la localización de YB-1 se puede detectar fácilmente al examinar cortes de tejido teñidos. La frecuencia de la presencia de YB-1 en el núcleo ya indica que la localización es independiente del ciclo celular. Una opción adicional para la detección independiente del ciclo celular de YB-1 en el núcleo reside en la tinción contra YB-1 y la detección de si YB-1 está localizado en el núcleo y la determinación de la fase de las células. Esto, además de la detección de YB-1, también se puede realizar utilizando los medios antes mencionados dirigidos contra YB-1. La detección del medio se realiza mediante métodos conocidos por el experto en la técnica. Mediante la unión específica de dichos agentes a YB-1 y no a ninguna otra estructura dentro de la muestra a analizar, particularmente las células, se puede detectar y establecer su localización y, debido a su unión específica a YB-1, también se puede detectar y establecer la localización de YB-1 mediante un marcaje adecuado del medio. Los expertos en la técnica conocen los métodos para el marcaje de dichos medios.

A continuación, la presente invención se ilustrará con más detalle haciendo referencia a las figuras y muestras de las que se pueden extraer nuevas características, realizaciones y ventajas.

La Fig. 1 a es un diagrama de barras que muestra la absorbancia relativa como indicador de la viabilidad celular para XVir-N-31 (XVir), adenovirus de tipo natural (WT) y el control (Ctrl) cuando se usan en combinación con los inhibidores de CDK4/6 LY (LY-2835219), PD (PD-032991) o LEE (LEE011).

La Fig. 1b es un diagrama de barras que muestra el título viral de XVir-N-31 (XVir) y del adenovirus de tipo natural (WT) cuando se combinan con los inhibidores de CDK4/6 LY (LY-2835219), PD (PD-032991) o LEE (LEE011).

La Fig. 1c es un diagrama de barras que muestra el ADN de fibra relativo para XVir-N-31 (XVir) y el adenovirus de tipo natural (WT) cuando se combinan con los inhibidores de CDK4/6 LY (LY-2835219), p D (PD-032991) o LEE (LEE011).

La Fig. 2 muestra el resultado de un análisis de transferencia de Western.

Las Figs. 3a-d son diagramas de barras.

Las Figs. 4a-d son diagramas de barras.

La Fig. 5 son diagramas de barras.

La Fig. 6 es una serie de microfotografías.

La Fig. 7 es una imagen microscópica de fluorescencia de células T24 infectadas con un adenovirus con deleción de E1 que expresa GFP con y sin tratamiento con Palbociclib.

La Fig. 8 es un diagrama de barras que muestra la replicación del ADN viral del adenovirus dl703 después de 48 h usando los compuestos Nutlina-3a, Lee, Cl1040 y Roscovetina.

Las Figs. 9A-C muestran el resultado de un análisis de transferencia de Western de células UMUC tratadas con las concentraciones indicadas de Nutlina-3a y LEE011 (Ribociclib) (Fig. 9A), Roscovetina (Fig. 9B) y CI-1040 (Fig. 9C); Rb significa proteína de retinoblastoma; phRB significa proteína de retinoblastoma fosforilada; E2F-1 significa factor de transcripción E2F-1; y la GAPDH sirvió como control de carga.

La Fig. 10 es un diagrama de barras que muestra la distribución del ciclo celular en células UMUC3, medida 48 horas después del tratamiento, donde las concentraciones de los inhibidores de CDK4/6 fueron las siguientes: Roscovetina: 10 pM, CI-1040: 1 pM, Nutlina-3a: 10 pM y LEE011: 10 pM.

La Fig. 11 es un panel de imágenes microscópicas que muestra la expresión del gen de hexona de adenovirus con y sin tratamiento con Palbociclib.

La Fig. 12 es un diagrama de barras que muestra el resultado de un ensayo de potencia de células T24 expuestas a XVir-N-31 solo, con el inhibidor de PARP PARPi 15 nM, PD 500 nM (Palbociclib) o una combinación de PARPi 15 nM y PD 500 nM, como porcentaje de la supervivencia celular, donde las células no se infectaron (columna izquierda), se infectaron con una MDI de 10 (columna central) o una MDI de 50 (columna derecha).

La Fig. 13 es un panel de imágenes que muestran cultivos de células T24 teñidas con SRB después del tratamiento con XVir-N-31 (MDI de 20), XVir-N-31 y PARPi 15 nM, XVir-N-31 y PD 500 nM, y XVir-N-31, PARPi 15 nM y PD 500 nM, 1 dpi, 2 dpi, 3 dpi, 4 dpi, 5 dpi y 6 dpi.

La Fig. 14 es un panel de imágenes que muestran cultivos de células UMUC teñidas con SRB después del tratamiento con XVir-N-31 (MDI de 10), XVir-N-31 y PARPi 160 nM, XVir-N-31 y PD 400 nM, y XVir-N-31, PARPi 160 nM y PD 400 nM, 1 dpi, 2 dpi, 3 dpi, 4 dpi, 5 dpi y 6 dpi.

La Fig. 15 es un diagrama de barras que muestra el resultado de un ensayo de potencia en células T245 días después de la infección con XVir-N-31, el inhibidor de CDK4/6 Palbociclib y el inhibidor de bromodominios JQ-1; Eje Y: supervivencia de las células en %.

La Fig. 16 es un diagrama de barras que muestra el resultado de un ensayo de potencia de células SK-N-MC 5 días después de la exposición a XVir-N-31 solo, con abemaciclib 200 nM, JQ1 500 nM o una combinación de abemaciclib 200 nM y JQ1 500 nM, como porcentaje de la supervivencia celular, donde las células no se infectaron o se infectaron con una MDI de 5, 10 o 20.

La Fig. 17 muestra el resultado de un análisis de transferencia de Western de células SK-N-MC tratadas con las concentraciones indicadas del inhibidor de CDK4/6 LY-2835219 (Abemaciclib) y el inhibidor de Wee MK-1775 (Adavosertib) 24 y 48 horas después del tratamiento; Rb significa proteína de retinoblastoma; phRB significa proteína de retinoblastoma fosforilada; E2F-1 significa factor de transcripción E2F-1; y la GAPDH sirvió como control de carga.

La Fig. 18 muestra el resultado de un ensayo de potencia en células SK-N-MC 5 días después de la infección con XVir-N-31, el inhibidor de CDK4/6 Abemaciclib y Adavosertib (inhibidor de Wee MK-1775) expresado como porcentaje de las células vivas.

La Fig. 19 muestra la distribución del ciclo celular después del tratamiento de células SK-N-MC con los inhibidores indicados.

La Fig. 20 es un diagrama de barras que muestra el efecto del ARNip dirigido a E2F1 sobre la expresión de E2F1 en diversas líneas celulares; eje Y: expresión de E2F1 normalizada respecto de actina como % de las células transfectadas con siCTRL.

La Fig. 21 es un diagrama de barras que muestra que la inhibición de E2F1 provoca un aumento de la expresión temprana de E2 en células T24 tratadas con ARNip-E2F-1; eje Y: expresión del gen adenoviral normalizada respecto de actina (en % de siCTRL).

La Fig. 22 es un esquema que muestra la ubicación de los cebadores para determinar la expresión temprana del adenovirus E2.

La Fig. 23 es una representación de la secuencia de nucleótidos del promotor temprano E2 de adenovirus de tipo natural (arriba) y un promotor temprano E2 mutante que tiene mutaciones en los sitios de unión a E2F (abajo).

La Fig. 24 es un diagrama de barras que muestra la expresión de ARN en células T24 infectadas con AdWT-RGD y AdE2Fm (que también contiene el motivo RGD en la fibra) obtenida mediante RT-qPCR 24 horas después de la infección; la expresión del gen AD-WT se estableció en el 100%.

La Fig. 25 muestra diversos inhibidores de CDK4/6 adecuados para el uso en la presente invención.

La Fig. 26 muestra diversos inhibidores de PARP adecuados para el uso en la presente invención.

La Fig. 27 muestra diversos inhibidores de Bet adecuados para el uso en la presente invención.

La Fig. 28 muestra la estructura de WT-Ad5 y el adenovirus dl520, que es un adenovirus oncolítico que expresa sólo la proteína E1A12, mediante la deleción del dominio CR3 del gen E1A.

La Fig. 29 muestra la estructura de XVir-N-31 que se caracteriza por la deleción de la proteína E1B19K, la deleción de 2 kb en la región E3, la deleción de la proteína E1A13S y la introducción de un motivo RGD en la proteína de la fibra.

La Fig. 30 muestra la estructura de Ad-Delta 24 y Ad-Delta 24-RGD que también describen Kleijn et al. (Kleijn et al., PLoS One. 2014; 9(5): e97495), y se caracteriza por la deleción del dominio CR2 del gen E1A; se replica solo en las células tumorales con la vía de retinoblastoma (Rb) desregulada. Ad-Delta 24-RGD contiene además un motivo RGD en la protuberancia de la fibra, como se muestra en XVir-N-31. Téngase en cuenta que el adenovirus oncolítico dl922-947 es similar al delta24, ya que la deleción en este virus también se encuentra en el dominio E1A-CR2 y afecta la unión a RB (proteína de retinoblastoma).

La Fig. 31 muestra la estructura de VCN-01, que es un adenovirus competente en replicación diseñado específicamente para replicarse en tumores con una vía RB defectuosa, presenta una infectividad mejorada a través de una fibra modificada y una distribución mejorada a través de la expresión de una hialuronidasa soluble (Pascual-Pasto et al. Sci Transl Med. 2019,11 476). La deleción en E1A en VCN-01 es similar a la deleción en delta24 (deleción del dominio CR2 en E1A). Además, la expresión de esta proteína E1A se regula mediante la introducción de sitios de unión de E2F en el promotor E1A. Además, contiene un motivo RGD en la protuberancia de la fibra y expresa una hialuronidasa soluble (Martínez-Vélez et al. 2016, Clin Cancer Res. 1 ;22(9):2217-25. The Oncolytic Adenovirus VCN-01 as Therapeutic Approach Against Pediatric Osteosarcoma).

La Fig. 32 muestra la estructura de E1 Adl1107 y E1 Adl1101, por lo que la eliminación de estos dos adenovirus oncolíticos afecta a la unión a p300 (histona acetiltransferasa p300 también conocida como p300 HAT o proteína p300 asociada a E1A) o pRb (proteína de retinoblastoma). Howe et al., MOLECULAR THERAPY 2000, 2, 485 495).

La Fig. 33 muestra la estructura del adenovirus oncolítico CB016 (y la del adenovirus 5 de tipo natural (WT-Ad5), donde la deleción en el dominio E1A-CR2 es similar a la de Ad-Delta 24. Además, CB016 contiene una deleción en el dominio CR1. Además, contiene un motivo RGD en la fibra o una fibra del serotipo 3 (LaRocca et al., Oral Oncol. 2016, 56, 25-31).

La Fig. 34 muestra la estructura del adenovirus ORCA-010 que contiene una deleción E1AA24 en el dominio CR2 de E1A, la mutación T1 que mejora la potencia en la proteína E3/19K y la modificación RGD de la fibra que mejora la infectividad (Dong et al., Hum Gene Ther. 1 de octubre de 2014; 25(10): 897-904).

Ejemplo 1: Materiales y métodos

Cultivo de células

Se cultivaron líneas celulares de cáncer de vejiga humana en condiciones subconfluentes en medio RPMI o DMEM (Biochrom AG) al 5% o 10% de CO<2>, respectivamente, suplementado con 10% de FBS (Biochrom AG) y 1% de NEA (Biochrom AG). Dependiendo de la línea celular y las condiciones experimentales, se sembraron 0,2-1x106, 0,5-1x105, 0,25-0,5x105 y 500-700 células en formatos de 10 cm, 6 pocillos, 12 pocillos y 96 pocillos, respectivamente.

Líneas celulares

HeLaP

Las células HeLa P (ATCC CCL-2) son células epiteliales de adenocarcinoma de cuello uterino que llevan el nombre de la paciente Henrietta Lacks. Esta línea celular es la más antigua y de mayor distribución (Rahbari et al., 2009), ya que fue la primera línea celular permanente, establecida en 1951 (Gey et al., 1952). El cultivo se produjo en DMEM (10% de<f>B<s>, 1% de PS) en condiciones de 10% de CO<2>a 37 °C.

HeLaRDB

HeLaRDB es una sublínea celular de la línea celular HeLaP, con resistencia a la daunoblastina basada en la sobreexpresión de la glicoproteína P. La resistencia se logró mediante el cultivo en un medio que contenía esta antraciclina. Este agente citostático se intercala en las secuencias de ADN bicatenario e inhibe la transcripción y replicación celular (Mizuno et al., 1975). Como resultado de las reacciones de estrés causadas por el tratamiento con daunoblastina, el factor celular YB-1 muestra una localización nuclear más alta en comparación con la línea celular parental (Holm et al., 2004). Para mantener la resistencia contra la daunoblastina, las células se cultivaron en DMEM (10% FBS, 1% PS) que contenía 0,25 pg/ml de daunoblastina en condiciones del 10% de CO<2>a 37 °C cada 14 días. A549

Las células A549 (ATCC CCL-185) se aislaron en 1972 de un adenocarcinoma en la membrana basal alveolar humana (Giard et al., 1973). El cultivo se realizó en MEM de Dulbecco (10% de FBS y 1% de PS) a 37 °C y un 10% de CO<2>. T24

Las células T24 (ATCC HTB-4) derivaron en 1970 de un carcinoma primario de vejiga urinaria humana (Bubenik, Baresova et al., 1973). Debido a una mutación puntual en el gen HRAS (Reddy et al., 1982), se activa la vía MAPK y PI3K. Además, en esta línea celular está presente una mutación adicional en el locus genético del gen inhibidor de tumores p53 (Pinto-Leite et al., 2014). Las células se cultivaron con RPMI que contenía un 10% de FCS, 1% de PS y 1% de aminoácidos no esenciales a 37 °C en condiciones del 5% de CO<2>.

HEK293

Las células HEK293 (ATCC CRL-1573) son células de riñón embrionario humano aisladas en 1973. Debido a una transfección estable de una parte de 4,5 kb del genoma del serotipo 5 adenoviral, que incluye toda la región E1 (Graham y Smiley, 1977), esta línea celular se utiliza para la producción de adenovirus deficientes en E1 y para la medición del título del virus.

Tabla 1: Cebadores

Características del virus

Métodos

Transfección de ARNip

La inhibición de ciertos genes se realizó mediante transfección con ARNip. De este modo, se añadieron 5 pl de reactivo Lipofectamina RNAiMAX (Thermo Fischer) a 150 pl de Opti-MEM en un tubo y se combinaron 36 pmol de ARNip con 150 pl de Opti-MEM en otro tubo. Después de combinar el contenido de ambos tubos y agitar brevemente, la disolución se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación se añadieron 250 pl del complejo ARNip-lípido a las 250.000-1.000.000 células, sembradas en placas de 6 pocillos el día anterior sin cambiar el medio, alcanzando una concentración final de ARNip de 30 pmol por pocillo. Después de 48 horas de incubación a 37 °C en condiciones del 10% de CO<2>, tuvo lugar la infección o lisis.

Cuantificación de ARN en combinación con ARNip

El ARN también se cuantificó en las células donde el virus se combinó con la transfección con ARNip. De este modo, se sembraron 125.000 células y se transfectaron al día siguiente con 30 pmol de construcción de ARNip de Ctrl, YB-1 y E2F1. Después de 48 horas de incubación, tuvo lugar la infección y la lisis se produjo 24 horas después de la infección. Los lisados se almacenaron a -20 °C.

Aislamiento del ARN

Las células se lavaron con PBS y se lisaron con tampón de lisis (kit de aislamiento de miARN mirVana, Life Technologies) y se transfirieron a un tubo de reacción de 1,5 ml. Se añadieron 50 pl de aditivo homogeneizado (kit de aislamiento de miARN mirVana, Life Technologies) a los lisados, se resuspendieron y se incubaron durante 10 minutos en hielo. Se añadieron 500 pl de ácido-fenol-cloroformo, se agitaron durante aproximadamente 30 segundos y se incubaron durante 2 minutos en hielo. Después de la centrifugación durante 5 minutos a temperatura ambiente a 14.000 g, se separan las fases acuosa y orgánica. La fase acuosa superior se transfirió a un nuevo tubo con tapa a presión y se combinó e invirtió con la misma cantidad de isopropanol. Después de una incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron a 4 °C y 14.000 g durante 30 minutos. Posteriormente, se eliminó el sobrenadante y el sedimento de ARN se lavó con 1 ml de etanol al 75%. Las muestras se centrifugaron brevemente a 7500 g durante 5 minutos a 4 °C. Después de retirar el sobrenadante, el sedimento secado al aire se disolvió en 20 pl de agua libre de nucleasas y se incubó durante 10 minutos a 55 °C y 500 rpm en un termomezclador. Posteriormente, se midieron las concentraciones de ARN mediante medición espectrofotométrica. Para evitar la amplificación de fragmentos de ADN, se realizó una digestión con una ADNasa. Para ello se utilizó el kit de grado de amplificación desoxirribonucleasa I de Invitrogen de Life Technologies. A 1 pg de ARN, se le añaden 1 pl de tampón de reacción de ADNasa I 10x y 1 pl de ADNasa I y se rellena con agua tratada con DEPC hasta un volumen final de 10 pl y se incuba durante exactamente 15 minutos a temperatura ambiente. Añadiendo 1 pl de disolución de EDTA 25 mM, se inactiva la ADNasa I y, por tanto, se detiene el proceso de digestión de la ADNasa. Las muestras se incubaron durante 10 minutos a 65 °C y luego se utilizaron para la transcripción inversa.

Transcripción inversa

Para reescribir el ARN hasta ADNc, se utilizó el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Thermo Scientific). Se añadieron 2 pg de ARN de las muestras de ADN digeridas a una Mastermix que contenía tampón de transcripción, dNTP 100 mM e inhibidor de ARNasa en tubos blandos de PCR. Por lo tanto, había que tener en cuenta que el ARN transcrito a través de los promotores E2 temprano y E2 tardío no podía reescribirse mediante cebadores aleatorios, normalmente utilizados para la transcripción inversa, porque estos cebadores aleatorios se unirían a ambas cadenas del genoma bicatenario del adenovirus. Por lo tanto, la reescritura de ARN a ADNc para las muestras utilizadas para la cuantificación temprana y tardía de E2 se realizó utilizando el cebador inverso temprano de E2 específico (Tabla 1). Para el gen constitutivo de actina, que se utilizó para normalizar los resultados, se utilizó el cebador aleatorio.

Análisis de la replicación del ADN

Para investigar la replicación viral dentro de las células infectadas, se realizó un análisis de la replicación del ADN. Se sembraron 125.000 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con una MDI de 10-20. Después de 2, 8, 12, 24, 36 y 48 horas, respectivamente, tras de la infección, tuvo lugar la lisis. De este modo, se eliminó el medio y las células adherentes se lavaron con 1 ml de PBS. Después de añadir 200 gl de tampón de lisis de ADN, las células adherentes se separaron de la placa utilizando un raspador de células. Luego se transfirió el lisado a un tubo con tapa a presión. Se añadieron 3 gl de la enzima proteinasa K y se incubaron a 56 °C y 550 rpm en un termomezclador durante la noche. Al día siguiente se realizó el aislamiento del ADN.

Aislamiento de ADN

Para la purificación del ADN, se añadieron al lisado 200 gl de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico. Después de agitar en vórtex y tras la incubación posterior durante 5 minutos en hielo, se logró una separación de fases mediante centrifugación durante 3 minutos a 16430 g a 4 °C. La fase acuosa superior se transfirió a un nuevo tubo con tapa a presión, que contenía 200 gl de cloroformo y 20 gl de rojo cresol en TrisCl 10 mM para una mejor visualización de las fases. Después de agitar e incubar durante 5 minutos en hielo, se llevó a cabo una centrifugación durante 3 minutos a 16430 g a 4 °C. De nuevo, la fase acuosa superior se combinó con 800 gl de etanol y 50 gl de disolución de acetato de sodio 3 M. Se añadieron 2 gl de glucógeno para lograr una mejor precipitación. Después de una breve inversión del tubo, la disolución se centrifugó durante 30 minutos a 16430 g a 4 °C. Posteriormente, el sedimento de ADN se cubrió con 400 gl de etanol al 70% y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar durante 7 minutos a 4760 g a temperatura ambiente, los sedimentos de ADN se secaron durante aproximadamente 5-10 minutos a 37 °C. Posteriormente, los sedimentos se disolvieron en 100 gl de tampón TE 0,1X y se agitaron a 40 °C a 400 rpm durante aproximadamente 3 horas. Cuando el ADN se disolvió por completo, se midió la concentración de ADN mediante un espectrofotómetro utilizando 2 gl de disolución de ADN para la medición y tampón TE 0,1x como disolución de blanco. Luego el ADN se almacenó a 4 °C.

qPCR

Para una cuantificación adicional se utilizó la PCR cuantitativa en tiempo real. Se usaron 5 gl de ADN molde, respectivamente ADNc a una concentración final de 10 ng/gl. La qPCR se realizó utilizando 10 gl de Mastermix GoTaq qPCR (Promega Corporation) (7,5 gl de Mastermix, 1,5 gl de cebador, 1 gl de H<2>O) y 5 gl de ADN molde en una placa de 96 pocillos pipeteados por duplicado. La cuantificación relativa se realizó mediante el método de CT comparativo con dos genes normalizadores. La placa se cerró con una lámina y se centrifugó a temperatura ambiente durante 2 minutos a 220 g. Luego la placa se incubó siguiendo un determinado programa de temperatura-tiempo en el termociclador. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 1. Las reacciones se llevaron a cabo en un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad Laboratories).

Condiciones de los ciclos de qPCR

Fibra: 94 °C durante 2 minutos, 94 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 15 segundos, durante 45 ciclos

Otros genes virales: 94 °C durante 1,5 minutos, 94 °C durante 15 segundos, 58 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 15 segundos, durante 45 ciclos

Rb: 94 °C durante 2 minutos, 94 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 minuto, durante 44 ciclos

E2F: 95 °C durante 2 minutos, 95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 30 segundos, durante 40 ciclos

Aislamiento de proteínas

Las células se lisaron utilizando un tampón SDS al 1% para lograr la rotura de la membrana nuclear. Para evitar la desnaturalización de las proteínas, todo el proceso se realizó en hielo. Después de aspirar el medio, las células se lavaron dos veces con PBS frío. Las células adherentes de un pocillo de un método por duplicado se lisaron con 200 gl de tampón SDS al 1% y se rasparon mediante un raspador de células. Luego se transfirió el lisado al otro pocillo del método por duplicado y se raspó nuevamente. Luego se transfirió el lisado de ambos pocillos combinados a un tubo con tapa a presión. Posteriormente los lisados se trataron con una jeringa para destruir el ADN viscoso y se centrifugaron durante 30 minutos a 4 °C con 31000 rpm. Debido a que las proteínas están presentes en el sobrenadante, el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo con tapa a presión y se usó para las etapas posteriores.

Cuantificación de proteínas

Para cuantificar la cantidad de proteína se realizó el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) mediante el kit Pierce TM BCA Protein. De este modo, se añadieron 112,5 pl de la disolución BCA A+B (50:1) y 12,5 pl de la muestra a un pocillo de una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Dependiendo de la concentración de proteínas se produjo una coloración de la disolución. Mediante una serie de patrones con concentraciones de proteínas conocidas se determinaron las concentraciones de proteínas de las muestras mediante la medición fotométrica a 562 nm en el lector de microplacas.

Electroforesis en gel SDS

Para separar las proteínas en la electroforesis posterior en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, las cantidades calculadas de lisado y tampón de lisis se mezclaron con 15 pl de mezcla de tampón de carga-DDT (6:1). Luego se calentaron las sustancias de carga de proteínas durante cinco minutos a 100 °C. Luego se cargaron en el gel 5 pl del patrón de proteínas coloreado y 40 pl de las muestras. Para la separación de las proteínas con detección de las proteínas virales se utilizó un gel al 10%. Para estudiar los genes regulados negativamente mediante ARNip, se utilizaron geles al 12%. La composición de los geles de resolución y concentración se enumeran en la sección Tampones y disoluciones. Durante aproximadamente 20 minutos, el gel se sometió a electroforesis en tampón TGS a 90 V para concentrar todas las proteínas en una banda. Posteriormente los geles se sometieron a electroforesis durante aproximadamente 60 minutos a 150 V en tampón TGS para separar las proteínas por tamaño.

Transferencia de Western

Para transferir las proteínas del gel a una membrana, se utilizó la técnica de transferencia de Western. Para activar la membrana de PVDF hidrofóbica, se incubó durante aproximadamente 2 minutos en metanol. Posteriormente, la membrana junto con las esponjas, los papeles de filtro y el gel se depositaron en tampón de transferencia. Mediante electroforesis durante aproximadamente dos horas a 100 V a 4 °C, las proteínas se transfirieron a la membrana en tampón de transferencia. Para evitar la unión inespecífica de anticuerpos, la membrana se bloqueó con rotación durante una hora a temperatura ambiente en 10 ml de TBST con un 5% de leche en polvo para analizar las proteínas celulares, respectivamente, en 5 ml de BSA al 5%-TBST para el uso posterior de anticuerpos que detectan las proteínas virales. Después de lavar la membrana cinco veces en TBST durante cinco minutos cada una, la membrana se incubó con la disolución de anticuerpo primario a 4 °C con rotación durante la noche. Para los anticuerpos hacia GAPDH, E1A, E1B55K, E2A y E4orf6, esta etapa se realizó durante una hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos se diluyeron con diferentes factores en BSA al 5% en TBST con azida sódica al 0,02%. Después de cinco etapas de lavado adicionales, la membrana se incubó en rotación durante 30 minutos a temperatura ambiente en una dilución 1:10,000 del anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario (anti-ratón) para los anticuerpos virales se diluyó en BSA al 5%-TBST, todos los demás en leche en polvo al 5% en TBST. Estos anticuerpos secundarios están conjugados con una peroxidasa de rábano. Después de cinco etapas de lavado finales, la membrana se incubó durante cinco minutos en una disolución de quimioluminiscencia mejorada (ECL) para visualizar la señal de la peroxidasa. Para las membranas, incubadas con los anticuerpos primarios DP-1 y E2F-1, se utilizó el reactivo de detección de transferencia de Western Amersham ECL Prime de GE-Healthcare para lograr señales más brillantes; para todos los demás, se utilizaron disoluciones de ECL producidas en el laboratorio. La composición de ECL A y ECL B, que se mezclan poco antes del uso 1:1, se enumeran en la sección Tampones y soluciones. Finalmente, las proteínas se pudieron detectar revelando la señal en una película.

Anticuerpos:

Punto de control quinasa 1 (sc-377231, Santa Cruz Biotechnology)

RB total (554136, BD Biosciences)

fosfo RB Ser 780 (8180, Cell Signaling Technology)

E2F1 (sc-251, Santa Cruz Biotechnology)

E2F2 (ab138515, Abcam)

E2F3 (PG37, Thermo Fisher Scientific)

E2F4 (WUF10, Thermo Fisher Scientific)

E2F5 (sc-999, Santa Cruz Biotechnology)

ciclina D1 (92G2, Cell Signaling Technology)

ciclina E2 (4132, Cell Signaling Technology)

CDK2 (78B2, Cell Signaling Technology)

GAPDH (14C10, Cell Signaling Technology)

actina (A2066, Sigma-Aldrich Chemie GmbH)

E1A (sc-25, Santa Cruz Biotechnology)

E1B55k (amablemente proporcionado por M. Dobbelstein)

E4orf6 (amablemente proporcionado por M. Dobbelstein

E2A (DBP, amablemente proporcionado por M. Dobbelstein)

Hexona (ABIN2686029, Antibodies online)

Tratamiento con inhibidores de molécula pequeña

Se disolvieron isetionato de PD-0332991 (Palbociclib, Sigma-Aldrich Chemie GmbH) y LY-2835219 (Abemaciclib, Selleck Chemicals) en agua estéril como disolución madre 10 mM. Se disolvieron LEE011 (Ribociclib, MedChem Express) y Nutlina-3a (Sigma) en DMSO como disolución madre 10 mM y 5 gM, respectivamente. Las concentraciones de trabajo se prepararon poco antes del uso inmediato.

Infección con virus y tratamiento combinado.

Para la determinación de la muerte celular inducida por el virus, se sembraron células en placas de 12 pocillos. Para el tratamiento combinado con PD-033299, LY-2835219 y LEE011, las células se trataron previamente con los inhibidores durante 24 h. Las células se infectaron con los virus indicados a la MDI indicada en 200-400 gl de medio sin FBS. A 1 hpi, se añadió a las células medio completo con o sin inhibidores de moléculas pequeñas.

Viabilidad celular (ensayo SRB)

Las células se fijaron con TCA al 10% durante 1 h a 4 °C y se tiñeron con sulforrodamina B al 0,5% (SRB, Sigma-Aldrich Chemie GmbH) en ácido acético al 1% durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de lavado con ácido acético al 1% para eliminar el exceso de SRB. La SRB seca se disolvió en tampón Tris 10 mM y la cuantificación se realizó mediante medición fotométrica a 590 nm.

Titulación

Para determinar la producción de partículas virales infecciosas, las células infectadas y el sobrenadante se recolectaron tres dpi utilizando raspadores de células. El virus se liberó de las células intactas mediante múltiples ciclos de congelación-descongelación seguidos de centrifugación a 1600 fcr. Se analizó la producción de partículas virales en los sobrenadantes de los lisados celulares utilizando células Hek293 como se describe en el manual de instrucciones del AdEasy Viral Titer Kit (972500). Se utilizaron los siguientes reactivos: anticuerpo anti-hexona de cabra (1056, Chemicon), anticuerpo anti-cabra de conejo (P0449, Dako), disolución DAB (Dako).

Ejemplo 2: Efecto del inhibidor de CDK4/6 PD0332991 sobre la replicación de un adenovirus E1-negativo

Se demostró que el adenovirus con deleción de E1 se replica en las células cancerosas, aunque con muy baja eficacia. Las células T24 se infectaron a una MDI de 100 de un adenovirus E1-negativo que expresaba la proteína verde fluorescente (Ad-GFP) y se trataron con PD0332991 500 nM un día antes de la infección y durante el tiempo de incubación. En tales condiciones, se observó un aumento de la expresión de GFP, lo que indica la replicación viral independiente de E1A y la expresión génica mediada por la activación del promotor temprano E2 del adenovirus. Ejemplo 3: Uso combinado de adenovirus de tipo natural o XVir-N-31 junto con diferentes inhibidores de CDK4/6 Según los resultados utilizando el adenovirus con mutación del E2 temprano Ad-WT/E2M y Ad-GFP en combinación con PD0332991, se realizaron experimentos usando diferentes inhibidores de CDK4/6 en combinación con adenovirus de tipo natural Ad-WT o XVir-N-31. Dado que estos agentes detienen las células en la fase G1, fue sorprendente descubrir que todos los inhibidores podían apoyar la replicación viral.

Se examinó más a fondo si el tratamiento de las células con los tres inhibidores de CDK4/6 clínicamente avanzados PD-033299, LY-2835219 y LEE011 podría influir en los efectos de la infección sobre la viabilidad celular, la replicación viral y la producción de títulos virales.

T ras el tratamiento, los tres inhibidores muestran efectos similares sobre la expresión y el nivel de fosforilación de RB, que se han descrito anteriormente en numerosas publicaciones. Después de una desfosforilación casi completa y también una regulación negativa de la proteína total a las 24 horas, el nivel de fosforilación se recupera parcialmente con el tiempo. Los niveles de CDK2 aumentaron durante el tratamiento y los niveles de ciclina D2 y ciclina E2 disminuyeron.

Ejemplo 4: Efectos sinérgicos derivados de la combinación de inhibidores de CDK4/6 y adenovirus oncolíticos.

Los inhibidores de CDK4/6 PD-033299, LY-2835219 y LEE011 se combinaron con la infección de células con adenovirus. La infección de las células se realizó 24 horas después del tratamiento porque los efectos posteriores sobre las moléculas diana solo pueden detectarse entre 8 y 24 horas después del tratamiento.

Los resultados se muestran en la Fig. 1.

Los inhibidores de CDK4/6 indujeron efectos sinérgicos sobre la viabilidad celular, la replicación viral y el título viral. (a) Las células se trataron previamente con los tres inhibidores de CDK4/6 PD-033299, lY-2835219 y l Ee011 durante 24 horas y se infectaron con XVir-N-31 (MDI de 60) o adenovirus de tipo natural (MDI de 80). Cuatro días después de la infección, se midió la viabilidad celular mediante un ensayo SRB. Los gráficos muestran los promedios de un mínimo de tres experimentos independientes. (b) Tres días después de la infección, se prepararon lisados a partir de las células y se realizó un ensayo de titulación en células HEK293. El título de virus se muestra como un cambio respecto del control. (c) Se extrajo<a>D<n>de células infectadas a 4, 24, 36 y 48 hpi y se analizó la replicación viral utilizando una qPCR para el ADNc de las fibras. Los valores están normalizados respecto de la GAPDH a 4 hpi. Los gráficos muestran representaciones de al menos dos experimentos independientes. Las barras de error representan el error estándar.

Como se desprende de la Fig. 1, los tres inhibidores de CDK4/6 apoyaron drásticamente la lisis celular (Fig. 1a), la replicación dentro de las células (Fig. 18) y la formación de partículas virales (Fig. 1 b).

Ejemplo 5: Efecto del inhibidor de CDK4/6 palbociclib (PD-033299) sobre el nivel de expresión de proteínas virales seleccionadas

Para analizar estos efectos con mayor detalle, se determinó el nivel de expresión de proteínas virales seleccionadas en células tratadas o no tratadas. Para este experimento se utilizó el inhibidor palbociclib (PD-033299) como inhibidor de CDK4/6 representativo. Las células se infectaron con una MDI de 15. El tratamiento con PD con 500 nM tuvo lugar durante 24 horas de infección y hasta que se produjo el aislamiento de proteínas. Después de 12, 24 y 36 horas se produjo el aislamiento de proteínas usando tampón SDS al 1%. Se incluyó actina como control positivo. Dado que el control de carga muestra los mismos niveles de proteína actina celular en todas las líneas, se garantiza una comparación adecuada entre las líneas. hpi: horas después de la infección

Los resultados se indican en la Fig. 2, que muestra los resultados de la expresión de proteínas virales de células T24 infectadas con Ad-WT y XVir-N-31 en combinación con el inhibidor de CDK4/6 PD0332991 (PD). Todas las proteínas virales investigadas en este experimento (E1A, E1B-55k, DBP (E2A) y Hexona) se expresaron a un nivel más alto en las células tratadas con el inhibidor CDK4/6 PD-0332991 en comparación con el adenovirus de tipo natural. Este efecto se pudo observar ya a las 12 hpi para E1A y a las 24 hpi para las otras proteínas.

Ejemplo 6: Especificidad de los efectos mediados por los inhibidores de CDK4/6.

La clase de inhibidores de CDK4/6 utilizados en el Ejemplo 5 requiere la expresión de RB. Por lo tanto, se utilizaron tres líneas celulares derivadas de cáncer de vejiga positivas para RB y dos negativas para RB y las células se trataron con la terapia combinada. Las líneas celulares se trataron previamente durante 24 horas con una concentración CI<50>de PD-0332991 (T24: 500 nM, RT112: 2000 nM, 253J: 100 nM) y se infectaron con XVir-N-31 (T24 MDI de 50, 253J MDI 25, RT112 MDI de 450). Los valores son el promedio de al menos 2 experimentos independientes. Las barras de error muestran el error estándar. A cuatro dpi, se midió la viabilidad celular utilizando ensayos de SRB (a, c). (b, d) Se prepararon lisados de células a 3 dpi y se realizó una ensayo de titulación en células Hek293. El título viral se muestra como un cambio respecto del control.

Los resultados se muestran en la Fig. 3.

Como se desprende de la Fig. 3, solo las líneas celulares positivas para RB mostraron una disminución significativa del crecimiento celular y la viabilidad celular, respectivamente (Fig. 3 a, c). Además, la formación de partículas virales solo aumentó en las líneas celulares positivas para RB tras el tratamiento con PD-0332991 (Fig. 3 b, d).

Ejemplo 7: Efecto del tratamiento combinado del inhibidor de CDK4/6 PD-0332991 con XVir-N-31

Para investigar el efecto de PD-0332991 sobre la replicación viral en las líneas celulares positivas para RB, se realizó una cuantificación relativa de las copias de ADN de la fibra mediante qPCR. Las líneas celulares de cáncer de vejiga se trataron previamente durante 24 horas y se infectaron con XVir-N-31 (T24 MDI de 40, UMUC3 y 253J MDI de 20, RT112 MDI de 400). El ADN se extrajo entre 24 y 48 hpi y se analizó en busca de la fibra viral mediante qPCR. Los valores están normalizados respecto de la GAPDH. Los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes; barras de error, D.E.

Los resultados se muestran en la Fig. 4.

Como se puede deducir de la Fig. 4, el tratamiento combinado del inhibidor de CDK4/6 PD-0332991 con XVir-N-31 aumenta espectacularmente la replicación viral.

Ejemplo 8: Cinética temporal de los inhibidores de CDK4/6

La cinética temporal de los inhibidores de CDK4/6 sobre la desfosforilación y degradación de RB es de aproximadamente 10 horas después del tratamiento de las células. Además, los resultados presentados anteriormente mostraron una recuperación parcial de los objetivos posteriores de RB a lo largo del tiempo (Figura 1). Esta observación implica que la cinética temporal del inhibidor de CDK4/6 y el efecto sobre la muerte celular inducida por el virus es un parámetro importante para esta terapia combinada, como se ejemplifica en el Ejemplo 7. Para la aplicación de la terapia combinada, se probaron diferentes puntos temporales para el pretratamiento de las células. De acuerdo con esto, las células se trataron antes (día/hora antes de la infección, dai/hai) o 1 hora después de la infección y se midió el crecimiento celular usando un ensayo de SRB. Las barras de error representan el E.E. y los valores son el promedio de tres experimentos independientes.

Los resultados se muestran en la Fig. 5

Como se desprende de la Fig. 5, el tratamiento paralelo ya fue suficiente para aumentar la muerte celular.

Ejemplo 9: Tratamiento combinado de diferentes adenovirus con el inhibidor de CDK4/6 PD0332991

Este ejemplo se realizó para proporcionar pruebas experimentales de que se pueden usar diferentes adenovirus oncolíticos junto con inhibidores de CDK4/6 como PD0332991 para la destrucción celular, y que el aumento observado en la replicación viral y la destrucción celular no se limitó a XVir-N-31. De acuerdo con esto, se infectaron células cancerosas T24 con Ad-Delta24 y Onyx-015 de la siguiente manera: se infectaron células cancerosas de vejiga T24 con una MDI de 20 de los adenovirus oncolíticos indicados. El tratamiento con el inhibidor de CDK4/6 PD0332991 500 nM se realizó un día antes de la infección y durante 4 días después de la infección. Las fotografías se tomaron 4 días después de la infección. La aparición de un efecto citopático (CPE) indica la replicación viral y la muerte celular.

Los resultados se muestran en la Fig. 6.

Como se puede observar en la Fig. 6, el inhibidor de CDK4/6 PD0332991 como ejemplo representativo de los inhibidores de CDK4/6 que reducen la fosforilación de RB, aumentó la muerte celular cuando se combinó con otros adenovirus oncolíticos como Ad-Delta24 y Onyx-015.

Ejemplo 10: La infección de células T24 con el adenovirus recombinante con deleción de E1 que expresa GFP (Adminus/GFP) en combinación con Palbociclib provoca un aumento de la expresión de GFP

Se sembraron 100.000 células T24/pocillo en placas de 6 pocillos y se cultivaron en medio RPMI que contenía FCS al 10% con CO<2>al 5% a 37 °C. Las células T24 se trataron con Palbociclib 500 nM 24 horas antes y nuevamente 1 hora después de la infección. La infección del adenovirus con deleción de E1 que expresa GFP (Ad-minus/GFP) tuvo lugar en 400 pl de medio sin suero. Las fotografías se tomaron 48 horas después de la infección utilizando un microscopio de fluorescencia con un aumento de 10x.

El resultado del análisis microscópico de fluorescencia de la expresión de GFP con y sin tratamiento con Palbociclib se muestra en la Fig. 7.

El resultado muestra que el tratamiento de las células T24 con Palbociclib provocó un fuerte aumento de la expresión de GFP mediada por la replicación del ADN viral inducida por Palbociclib.

Ejemplo 11: Replicación viral independiente de E1A en células UMUC tratadas con varios inhibidores del ciclo celular

Para investigar las diferencias en la replicación de dl703 (Mantwill et al. 2013, Journal of Translational Medicine, 11, 216) en diferentes condiciones de tratamiento, se realizó un análisis de la replicación del ADN. Se sembraron 100.000 células UMUC en placas de 6 pocillos y se cultivaron en medio DMEM que contenía FCS al 10% en CO<2>al 5% a 37 °C. 24 horas después de la siembra, las células se trataron durante 24 horas con Lee 10 pM (Ribociclib), CI-1040 1 pM, Nutlina-3a 10 pM y Roscovetina 10 pM y nuevamente después de la infección se añadió una cantidad adecuada de inhibidores al medio. La infección con una MDI de 50 de dl703 (Mastadenovirus, tipo C, serotipo 5 con una deleción de 3,2 kb en la región E1) tuvo lugar 24 horas después del tratamiento. Después de 4 y 48 horas después de la infección, se aisló el ADN y se realizó una qPCR utilizando cebadores específicos para el gen de la fibra viral. Cebador directo de la fibra: 5'-AAGCTAGCCCTGCAAACATCA-3' (SEQ ID N°: 17); Cebador inverso de la fibra: 5'-CCCAAGCTACCAGTGGCAGTA-3' (SEQ ID N2: 18).

El resultado se muestra en la Fig. 8.

Como se desprende de la Fig. 8, el tratamiento de las células UMUC con el inhibidor de CDK4/6 LEE011 (Ribociclib) provocó un aumento espectacular de la replicación del ADN viral del adenovirus dl703 negativo para E1 (casi 100 veces). Este aumento sugiere fuertemente que la detención específica en G1 inducida por Ribociclib junto con la inhibición de la expresión de E2F-1 facilita la replicación adenoviral independiente de E1. En consecuencia, no sólo los virus con deleciones específicas en el gen E1A muestran una replicación mejorada del ADN del adenovirus con el tratamiento de CDK4/6, sino que incluso los adenovirus con una deleción completa del gen E1A muestran un aumento de la replicación del ADN viral.

Aunque el inhibidor de Mek GI-1040 mostró propiedades similares con respecto a la inhibición de la expresión de E2F-1 y la detención en G1, la replicación fue mucho menor en comparación con las células tratadas con Ribociclib. Esto podría deberse al hecho de que simultáneamente se inhiben otras vías importantes relacionadas con el ciclo celular, como MEK/ERK, que es necesaria para la replicación viral. Además, se demostró que la inhibición de la vía MEK/ERK reducía la formación de partículas más de 100 veces, lo que la hacía inadecuada, en un entorno clínico, para la terapia combinada con replicación de adenovirus oncolíticos (Schümann y Doppelstein 2016, Cancer Research, 66, 1282-1288).

Ejemplo 12: Análisis de transferencia de Western de células UMUC tratadas con los inhibidores indicados del ciclo celular

Análisis de transferencia de Western de células UMUC tratadas con las concentraciones indicadas de CI-1040, Roscovetina, Nutlina-3a y LEE011 (Ribociclib). Se sembraron 1 x 106 células en placas de 10 cm. 24 horas después del tratamiento se aislaron las proteínas utilizando tampón SDS al 1%, para lograr la rotura de la membrana nuclear. Todas las muestras se extrajeron varias veces con una jeringa para romper el ADN y posteriormente se centrifugaron a 30000 rpm a 4 °C durante 30 minutos. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de reacción y se usó directamente para las etapas adicionales o se almacenó a -80 °C. Para separar las proteínas se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. Mediante electroforesis durante aproximadamente dos horas a 100 V a 4 °C, se cargaron 40 pg de proteínas totales y se analizaron con sondas contra los anticuerpos específicos indicados.

Los resultados son visibles en las Figs. 9A, 9B y 9C.

Como se desprende de la Fig. 9, mientras que Roscovetina y Nutlina-3a no tuvieron un efecto pronunciado sobre la expresión de Rb, phRB y E2F-1, LEE-011 (Ribociclib) a 10 pM y MI-1040 a 1 pM indujeron la inhibición de E2F-1 así como la expresión de Rb y phRb.

Ejemplo 13: Análisis de los inhibidores de CDK4/6 en la replicación del ADN viral del adenovirus dI703 deficiente en replicación con deleción de E1

Para el análisis del ciclo celular, las células se sembraron en placas de 6 pocillos (2,5x104 células/pocillo). 8 horas antes de la infección con dl703, las células se trataron con la concentración indicada de inhibidores del ciclo celular. Después de la infección con una MDI de 10, las células dl703 se trataron nuevamente durante 48 horas. Las células no tratadas y las células infectadas con dl703 únicamente sirvieron como control. 48 h después de la infección, las células se recolectaron mediante tripsinización y se fijaron con etanol al 80% mientras se agitaban con un vórtex. Para investigar el estado del ciclo celular, las células fijadas se centrifugaron durante 5 minutos a temperatura ambiente y 300 g y se aspiró el etanol. Las células se resuspendieron y se lavaron con BSA al 1%-PBS (albúmina de suero bovino) y se centrifugaron nuevamente. Las células se tiñeron con EDU y el análisis del ciclo celular se realizó utilizando el kit de ensayo de citometría de flujo Click-iT™ Plus EdU, número de catálogo C10632 de Thermo Fischer. Además, después de lavar 3 veces con BSA al 1%/PBS, las células se tiñeron con PI (yoduro de propidio, 50 pg/ml). La medición se realizó directamente después de la tinción con un sistema de citometría de flujo FACScalibur. Los datos se analizaron con el programa informático FlowJo.

Características de los inhibidores de CDK4/6

CI1040: La treonina/tirosina quinasa específica dual, MAP quinasa quinasa (MEK), es un componente clave de la vía de señalización RAS/RAF/<m>E<k>/ERK que se activa con frecuencia en los tumores humanos. CI-1040 es un compuesto de benzohidroxamato que inhibe potentemente MEK (Allen et al. 2003, Semin Oncol. (5 suplemento 16): 105-16) y provoca la detención en G1.

Nutlina-3a: Nutlina-3, un antagonista de molécula pequeña de MDM2, restaura eficazmente la función de p53 tanto en la expresión normal de MDM2 como en las líneas celulares con sobreexpresión de MDM2 con p53 de tipo natural, lo que lleva a la detención del ciclo celular y la apoptosis (Wang et al. 2012, Acta Biochimica et Biophysica Sinica, volumen 44, número 8, 1 de agosto de 2012, páginas 685-691).

Roscovitina (Seliciclib o CYC202) es un fármaco experimental candidato de la familia de inhibidores farmacológicos de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) que inhiben preferentemente múltiples dianas enzimáticas, incluidas CDK2, CDK7 y CDK9, que alteran la fase o el estado de crecimiento dentro del ciclo celular de las células tratadas (Whitaker et al. 2004, Cancer Research 64, 262-272). LEE011 (Ribociclib; nombre comercial Kisqali) es un inhibidor de la ciclina D1/CDK4 y CDK6 y se utiliza para el tratamiento de ciertos tipos de cáncer de mama. La inhibición de CDK4/6 provoca la detención del ciclo celular en G1 y la inhibición de la expresión de E2F-1 (Kim S. et al., Oncotarget.

16 de octubre de 2018; 9(81):35226-35240; Yang C et al., Oncogene (2017) 36,2255-2264).

Los resultados se muestran en la Fig. 10.

Los inhibidores de CDK4/6 LEE011 (Ribociclib) y CI-1040 indujeron una clara detención en G1. El tratamiento con Roscovitina mostró un ligero aumento de células detenidas en G2/m. Nutlina-3a tuvo poco o ningún efecto sobre el ciclo celular en la concentración utilizada. La infección de células UMUC con el adenovirus dl703 recombinante con deleción de E1 (sin proteína E1A) no cambió significativamente la distribución del ciclo celular.

Ejemplo 14: Palbocilib aumentó la tinción de hexonas de adenovirusin vitrodespués del tratamiento

Se sembraron las líneas celulares de vejiga RT112, T24 y UMUC en placas de 6 pocillos (2 x 105 células/pocillo). Un día después de la siembra, las células se trataron con Palbociclib 500 nM durante 24 horas antes y nuevamente 1 hora después de la infección. La infección con las MDI indicadas de AD-WT tuvo lugar en 400 |ul de medio DMEM sin suero. La tinción de Hexonas se realizó según las instrucciones del fabricante utilizando el kit Adeasy Viral Titer de Agilent (cat.: 972500) dos días después de la infección.

El resultado se muestra en la Fig. 11.

Como se desprende de la Fig. 11, el tratamiento con Palbociclib (500 nM) como inhibidor de CDK4/6 ejemplar aumentó significativamente las células positivas para hexonas en las células tratadas con Palbociclib 48 horas después de la infección, como lo indica el color marrón/rojo. Se debe llegar a la conclusión de que más células con el tratamiento con Palbociclib son capaces de producir partículas virales y mostrar una mayor replicación del ADN viral, ya que la expresión de las hexonas del adenovirus ocurre exclusivamente con el inicio de la replicación viral.

A partir de los resultados de los Ejemplos 10 a 14, es evidente que sólo los inhibidores de CDK4/6, pero ningún otro inhibidor del ciclo celular, son capaces de aumentar la replicación y la expresión génica del adenovirus deficiente en replicación (dl703 que carece de los genes E1) y Ad-GFP. Además, un inhibidor de CDK4/6, para proporcionar tal aumento de la replicación viral y la expresión génica, debe provocar la detención en G1 de las células (infectadas) y la inhibición de la expresión de F2F1.

Ejemplo 15: Tratamiento de células T24 mediante terapia triple que comprende XVir-N-31, Palbociclib y un inhibidor de PARP

Para mostrar la eficacia de una terapia triple de células T24 utilizando una terapia triple que comprende XVir-N-31, Palbociclib y un inhibidor de PARP (BMN673 (Talazolarib)), se llevó a cabo un ensayo de potencia.

Se sembraron 12.500 células T24 por pocillo en placas de 12 pocillos y se cultivaron durante la noche en medio RPMI que contenía FCS al 10% a 37 °C. El tratamiento con inhibidor de las células se produjo 24 h después de la siembra celular y nuevamente 1 hora después de la infección añadiendo la concentración indicada al medio. La infección de las células tuvo lugar 24 h después del tratamiento con el inhibidor en 250 |ul de medio sin suero. La fijación y la tinción con SRB se realizaron 4 días después de la infección. PD: Palbociclib; PARPi: BMN673.

Para la tinción con SRB, el medio se eliminó mediante aspiración. Las células se fijaron con 1 ml (por pocillo) de TCA frío al 10% a 4 °C durante 1 hora. El TCA se eliminó mediante aspiración y las capas celulares se lavaron 4 veces con agua del grifo. Las células se tiñeron con 1 ml (por pocillo) de SRB al 0,5% (sulforrodamina B) en ácido acético al 1% durante 30 minutos. La SRB no unida se eliminó en cinco etapas de lavado con 1 ml de ácido acético al 1%/pocillo; Después de cada etapa de lavado, se eliminó el ácido acético mediante aspiración. Las placas se secaron al aire durante 2 horas. Para solubilizar las células teñidas con SRB, se añadieron a cada pocillo 200 |ul de Tris base 10 mM. Después se dispensaron 20 |ul, respectivamente, en los pocillos de una placa de 96 pocillos. La placa de 96 pocillos se cargó en un lector de placas de Elisa y se midió la absorción de las muestras a 560 nm. A las células tratadas de forma simulada se les asignó una supervivencia celular del 100%.

El resultado se muestra en la Fig. 12.

El resultado mostrado en la Figura 12 demuestra claramente que la terapia triple que consiste en Palbociclib, BMN673 y XVir-N-31 exhibió un rendimiento superior frente a la monoterapia o la terapia combinada con respecto a la destrucción celular. Se pudo lograr casi el 90% de la destrucción celular utilizando una MDI de 10 de XVir-N-31 en combinación con el inhibidor de PARP PARPi (BMN673) y el inhibidor de CDK4/6 Palbociclib (PD). La combinación de PARPi y Palbociclib sin XVir-N-31 mató sólo el 65% de las células. Las células T24 y las células UMUC son sensibles a los inhibidores de CDK4/6 (que proporcionan la detención en G1 con la inhibición de E2F-1).

Ejemplo 16: Cinética de la terapia triple compuesta por XVir-N-31, Palbociclib y un inhibidor de PARP.

Para mostrar la cinética de una terapia triple de células T24 utilizando una terapia triple que comprende XVir-N-31, Palbociclib y un inhibidor de PARP (BMN673 (Talazolarib)), se llevó a cabo un ensayo de potencia y se evaluó la potencia en diferentes momentos.

Se sembraron 3000 células T24 por pocillo en placas de 12 pocillos y se cultivaron durante la noche en medio RPMI que contenía FCS al 10% a 37 °C. El tratamiento con inhibidor de las células se produjo 24 h después de la siembra celular y nuevamente 1 hora después de la infección añadiendo la concentración indicada al medio. La infección de las células tuvo lugar 24 h después del tratamiento con inhibidor en 250 |ul de medio sin suero. La fijación y la tinción con SRB se realizaron entre 1 y 5 días después de la infección (dpi: días después de la infección). PARPi 15 nM corresponde al valor de CI-80 en las células T24.

Los resultados se muestran en la Fig. 13.

Como se desprende de la Fig. 13, la terapia triple utilizando además de XVir-N-31 un inhibidor de CDK4/6 (Palbociclib (PD) y un inhibidor de PARP PARPi (BMN673) es, también desde un punto de vista cinético, mucho más eficaz que una monoterapia con XVir-N-31 únicamente o una terapia combinada con XVir-N-31 y el inhibidor de PARP o el inhibidor de CDK4/6. Es importante destacar que el nuevo crecimiento de células tumorales se redujo significativamente en los días 4 y 5 en las líneas celulares UMUC y T24 sensibles a CDK4/6 (dpi: días después de la infección).

Ejemplo 17: Cinética de la terapia triple compuesta por XVir-N-31, Palbociclib y un inhibidor de PARP.

Para mostrar la cinética de una terapia triple de células UMUC utilizando una terapia triple que comprende XVir-N-31, Palbociclib y un inhibidor de PARP (BMN673 (Talazolarib)), se llevó a cabo un ensayo de potencia y se evaluó la potencia en diferentes momentos.

Siembra de UMUC-3: Se sembraron 3000 células por pocillo en placas de 12 pocillos y se cultivaron durante la noche en medio DMEM que contenía FCS al 10% a 37 °C. El tratamiento con inhibidor de las células se produjo 24 h después de la siembra y nuevamente 1 hora después de la infección añadiendo la concentración indicada al medio. La infección de las células tuvo lugar 24 h después del tratamiento con el inhibidor. La fijación y la tinción con SRB se realizaron entre 1 y 6 días después de la infección (dpi: días después de la infección). PARPi 160 nM corresponde al valor de CI-80 en las células UMUC3.

El resultado se muestra en la Fig. 14.

Los resultados que se muestran en la Fig. 14 demuestran claramente que la terapia triple que consiste en Palbociclib, BMN673 y XVir-N-31 exhibió un rendimiento superior frente a la monoterapia o la terapia combinada. Es importante destacar que el nuevo crecimiento de células tumorales se redujo significativamente en los días 4 y 5 en las líneas celulares UMUC y T24 sensibles a CDK4/6 (dpi: días después de la infección).

Ejemplo 18: Terapia triple que comprende XVir-N-31, un inhibidor de CDK4/6 y un inhibidor de bromodominios.

Se sembraron 5000 células T24 en placas de 12 pocillos y se cultivaron en 1 ml de medio RPMI que contenía FCS al 10%. Al día siguiente, las células se trataron con Palbociclib 500 nM y JQ-1 300 nM. 24 horas después del tratamiento, las células se infectaron con las MDI indicadas de XVir-N-31 en 200 |ul de medio RPMI que no contenía FCS. Después de 1 hora, se añadieron a cada pocillo 800 |ul de medio RPMI que contenía FCS al 10%. Además, se añadieron al medio Palbociclib 500 nM y JQ-1 300 nM. La tinción con SRB se realizó 5 días después de la infección. A las células tratadas de forma simulada se les asignó una supervivencia celular del 100%.

Los resultados se muestran en la Fig. 15.

Como se desprende de la Fig. 15, el inhibidor de bromodominios JQ1 aumentó la capacidad de destrucción celular de XVir-N-31 en combinación con el inhibidor de CDK4/6 Palbociclib a MDI bajas. El análisis con microscopio óptico 48 horas después de la infección revela una muerte celular ya masiva en las células tratadas con JQ1/Palbociclib/Xvir-N-31. Se debe llegar a la conclusión de que JQ-1 aumentó la transcripción viral y, por lo tanto, la replicación viral en las células tratadas con Palbociclib, ya que la monoterapia solo con JQ1 300 nM no aumentó la destrucción celular de XVir-N-31 a una MDI de 10 y 20.

Un requisito previo para la mejora observada de JQ-1 en las células cancerosas infectadas con adenovirus es la capacidad de Palbociclib de inducir la detención en G1. En las células que son resistentes a Palbociclib (véase el Ejemplo 18, procedimiento de tratamiento idéntico), no se observó ningún aumento de la destrucción celular. Esta observación contrastaba marcadamente con Baojie Lv et al. 2018, Scientific reports, 8, 11554, donde las células se trataron con concentraciones de JQ1, sin causar detención en G1 y no se utilizó Palbociclib en conjunto.

Ejemplo 19: Terapia triple que comprende XVir-N-31, un inhibidor de CDK4/6 y un inhibidor de bromodominios.

Se sembraron 100.000 células SK-N-MC/pocillo en placas de 12 pocillos y se cultivaron en medio RPMI que contenía FCS al 10% con CO<2>al 5% a 37 °C. Las células se trataron con Abemaciclib 200 nM JQ1 500 nM 24 horas antes y nuevamente 1 hora después de la infección añadiendo la cantidad adecuada al medio. La infección de XVir-N-31 tuvo lugar en 500 |ul en medio RPMI sin suero. La tinción con SRB se realizó 5 días después de la infección. A las células tratadas de forma simulada se les asignó una supervivencia celular del 100%.

Los resultados se muestran en la Fig. 16.

Se ha establecido que las células SK-N-MC son resistentes a los inhibidores de CDK4/6, por lo que no provocan una detención en G1. La adición de JQ1 no aumentó la destrucción celular de las células SK-N-MC resistentes a CDK4/6 (Abemaciclib), lo que indica que la detención en G1 mediada por CDK4/6 es un requisito previo del efecto mediado por JQ1 sobre la destrucción celular.

Así, las Figs. 16 (así como la Fig. 15) muestran que los inhibidores de bromodominios dirigidos a BRD2, BRD3, BRD4 aumentan aún más el efecto de destrucción celular de XVir-N-3 bajo la premisa de que los inhibidores de CDK4/6 inducen una detención en G1 en las células tratadas.

Ejemplo 20: Análisis de transferencia de Western de células SK-N-MC tratadas con el inhibidor de CDK4/6 LY-2835219 (Abemaciclib) y el inhibidor de Wee MK-1775 (Adavosertib)

Se sembraron 1 x 106 células en placas de 10 cm. 24 horas después del tratamiento se aislaron las proteínas utilizando un tampón con SDS al 1%, para lograr la rotura de la membrana nuclear. Todas las muestras se extrajeron varias veces con una jeringa para romper el ADN y posteriormente se centrifugaron a 30000 rpm a 4 °C durante 30 minutos. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de reacción y se usó directamente para las etapas posteriores o se almacenó a -80 °C. Para separar las proteínas se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. Mediante electroforesis durante aproximadamente dos horas a 100 V a 4 °C, se cargaron 40 gg de proteínas totales y se analizaron con sondas contra los anticuerpos específicos indicados.

El resultado se muestra en la Fig. 17.

Se sabe que las células SK-N-MC son resistentes al tratamiento con Abenaciclib (Dowless M et al., 2018, Clin Cancer Res: 24, 6028-6039). Wee1 es un componente crítico del control del punto de control del ciclo celular G2/M y media en la detención del ciclo celular regulando la fosforilación de CDC2. Se ha informado que la inhibición de Wee1 mediante MK1775 mejora el efecto citotóxico de los agentes que dañan el ADN en diferentes tipos de carcinomas. Varios estudios han demostrado que la inhibición farmacológica de Wee1 mediante la molécula pequeña inhibidora de la quinasa MK-1775 conduce a la eliminación de la fosforilación de CDC2 en Tyr15 en las células tumorales. Kreahling et al. 2013, pLoS One. 8(3), e 57523). Aunque se observa una fuerte detención en G1 en el tratamiento combinado, no se observa ningún cambio en la expresión de Rb y E2F-1.

Ejemplo 21: Terapia triple que comprende XVir-N-31, un inhibidor de CDK4/6, Abemaciclib y Adavosertib (inhibidor de Wee MK-1775)

Se sembraron 100.000 células SK-N-MC/pocillo en placas de 12 pocillos y se cultivaron en medio RPMI que contenía FCS al 10% con CO<2>al 5% a 37 °C. Las células se trataron con Abemaciclib 200 nM 24 horas antes y nuevamente 1 hora después de la infección añadiendo una cantidad adecuada al medio. La infección de XVir-N-31 tuvo lugar en 500 gl de medio RPMI sin suero. La tinción con SRB se realizó 5 días después de la infección. A las células tratadas de forma simulada se les asignó una supervivencia celular del 100%.

Los resultados se muestran en la Fig. 18.

Las Figs. 17 (y 18) demuestran que la combinación del inhibidor de CDK4/6 Abemaciclib y el inhibidor de Wee MK-1775 indujo la detención en G1 sin inhibición de E2F-1. El ensayo de potencia en la Fig. 18 muestra que esta combinación no mejoró el efecto de destrucción celular del adenovirus oncolítico XVir-N-31. Estos resultados demuestran claramente que la detención en G1 inducida por la combinación del inhibidor de CDK4/6 Abemaciclib y el inhibidor de Wee MK-1775 no facilitó la capacidad de destrucción de células de XVir-N-31. Por tanto, la inhibición de la expresión de E2F-1 es un requisito adicional para mejorar la oncólisis viral.

Ejemplo 22: La detención en G1 en combinación con la inhibición de E2F-1 es un requisito previo para mejorar la destrucción celular de XVir-N-31 en combinación con los inhibidores de CDK4/6

48 horas después del tratamiento, las células se lavaron dos veces con PBS (que contenía ARNasa A, 100 U/ml). Las células se tripsinizaron y se centrifugaron a 1500 rpm, 4° C durante 5 min. Las células se fijaron añadiendo lentamente 1 ml de etanol al 80% helado gota a gota al sedimento y se incubaron durante la noche. La tinción se realizó añadiendo 1 ml de disolución de tinción (yoduro de propidio, 50 gg/ml) a las células e incubando durante 30-60 minutos a temperatura ambiente con un balanceo suave. MK: MK-1775; LY: LY-2835219.

El resultado se muestra en la Fig. 19.

Como se desprende de la Fig. 19, el tratamiento de las células SK-M-NC con LY (Abemaciclib) no tuvo ningún efecto en el ciclo celular. El tratamiento con MK-1775 solo provocó a 500 nM un aumento de células en G2/M. La combinación de ambos provocó una fuerte detención en G1.

Ejemplo 23: Papel de la expresión de E2F-1 en la replicación del ADN viral.

I. Se sembraron 2 x 105 células T24, A549 y HeLa por pocillo en una placa de 6 pocillos y se cultivaron en 1,5 ml de medio RPMI 1640 que contenía (o medio DMEM) FBS al 10%, penicilina/estreptomicina y aminoácidos no esenciales. Al día siguiente, se diluyeron 30 pmol de ARNip, ya sea ARNip de control negativo (Qiagen, n.° 1022076) o siE2F1 (Sigma, n.° NM_005225, ID de ARNip SASI_Hs01_00162220) en 150 gl de medio Opti-MEM y se prepararon 9 gl de lipofectamina RNAiMAX en 150 gl de Opti-MEM. La disolución de ARNip y la disolución de Lipofectamina RNAiMAX se mezclaron y se incubaron durante 5 minutos. La mezcla se añadió gota a gota a las células. Después de 48 horas, se aisló el ARN y se realizó una RT-qPCR.

El resultado se muestra en la Fig. 20. Como se desprende de la Fig. 20, la expresión temprana de E2 disminuye.

II. Para cada pocillo de una placa de 6 pocillos, se sembraron 2 x 105 células T24 en 1,5 ml de medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10%, penicilina/estreptomicina y aminoácidos no esenciales. Al día siguiente, se diluyeron 30 pmol de ARNip, ya sea ARNip de control negativo (Qiagen, n.° 1022076) o siE2F1 (Sigma, n.° NM_005225, ID de ARNip SASI_Hs01_00162220) en 150 gl de medio Opti-MEM y se prepararon 9 gl de lipofectamina RNAiMAX en 150 gl de Opti-MEM. La disolución de ARNip y la disolución de Lipofectamina RNAiMAX se mezclaron y se incubaron durante 5 minutos. La mezcla se añadió gota a gota a las células T24. La infección tuvo lugar 48 h más tarde durante la incubación de las células con una MDI de 10 de ADWTRGD en 400 gl de medio libre de suero con balanceo de la placa cada 10-15 minutos. Después de 1 h, se añadieron 1,6 ml de medio completo. El aislamiento del ARN se realizó 24 h después de la infección.

El resultado se muestra en la Fig. 21.

III. Las células se lavaron con PBS frío y se rompieron añadiendo 500 gl del tampón de lisis del kit MirVana, número de catálogo de Thermo Fisher AM1560, los lisados se recogieron con una espátula y se pipetearon en un tubo de 1,5 ml. Para la extracción orgánica, se añadieron 50 gl de aditivo homogeneizado y las muestras se incubaron en hielo durante 10 minutos. Se añadieron 500 gl de ácido-fenol:cloroformo y las muestras se agitaron durante 60 segundos y se incubaron en hielo durante 2 minutos. Las muestras se centrifugaron a 14.000 x g, a temperatura ambiente durante 5 minutos para separar las fases acuosa y orgánica. La fase superior se transfirió cuidadosamente a un tubo nuevo y se añadió una cantidad igual de isopropanol. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 10 min, se precipitó el ARN (14.000 x g, 4 °C, 30 min) y se lavó dos veces con 1 ml de etanol al 75% (centrifugar a 7500 x g, 4 °C, 5 min). El ARN se secó al aire durante 5 a 10 minutos y se resuspendió en 20 a 50 gl de agua libre de ARNasas y se resolvió agitando a 500 rpm, 55 °C durante 10 minutos y se midió con Nanodrop. Después de la digestión del ADN (desoxirribonucleasa I, n.° de cat. de Invitrogen 18068-015) usando 1 gg de muestra de ARN con 1 gl de tampón de reacción de ADNasa I 10x, agua libre de nucleasas hasta un volumen de 9 gl, 1 gl de ADNasa I (1 U/gl), incubación durante 15 min a temperatura ambiente, inactivación de la ADNasa I mediante la adición de 1 gl de disolución de EDTA 25 mM, calentamiento durante 10 min a 65 °C. La transcripción inversa se realizó utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Thermo Fisher/Applied Biosystems™, número de catálogo: 4368814). Utilizando un hexámero aleatorio para la transcripción mediante PCR de fibra y actina, y utilizando el cebador de E2 temprano para la transcripción mediante E2Early-PCR.

Cebadores y ARNip usados

E2 temprano directo: CCGTCATCTCTACAGCCCAT (SEQ ID N2: 19)

E2 temprano inverso: GGGCTTTGTCAGAGTCTTGC (SEQ ID N2: 20)

Fibra directo: AAGCTAGCCCTGCAAACATCA (SEQ ID N2: 21)

Fibra inverso: CCCAAGCTACCAGTGGCAGTA (SEQ ID N2: 22)

Actina directo: TCACCCACACTGTGCCCATTCTACG (SEQ ID N2: 23)

Actina inverso: CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG (SEQ ID N2: 24)

E2F1 directo: CATCCCAGGAGGTCACTTCTG (SEQ ID N2: 25)

E2F1 inverso: GACAACAGCGGTTCTTGCTC (SEQ ID N2: 26)

ARNip de control

Directo: UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT (SEQ ID N2: 27)

Inverso: ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT (SEQ ID N2: 28)

ARNip de E2F-1

CUGAGGAGUUCAUCAGCCU[dT][dT] (SEQ ID N2: 29)

AGGCUGAUGAACUCCUCAG[dT][dT] (SEQ ID N2: 30)

Para probar el papel de la expresión de E2 temprano mediante RT-qPCR, es absolutamente necesario elegir el cebador correcto. La ubicación del cebador debe estar entre el promotor E2 temprano y el promotor E2 tardío. De lo contrario, el promotor E2 tardío influirá fuertemente en los resultados. La ubicación de los cebadores se muestra en la Fig. 22.

Como se desprende de las Figs. 20 y 21, la regulación negativa de E2F1 mediante el ARNip provoca un aumento de la expresión temprana de E2. Esto sólo podría explicarse por el papel represivo de E2F1 en la expresión temprana de E2. Si E2F-1 fuera un activador, la consecuencia sería una disminución de la expresión temprana de E2. Además, el ARNip contra E2F-1 imita el efecto de los inhibidores de CDK4/6, que también inhiben la expresión de E2F-1 (Yang C et al., Oncogene 2017, 36,2255-2264).

Ejemplo 24: El adenovirus recombinante con mutaciones de los dos sitios de unión de E2F en el promotor temprano de E2 del adenovirus muestra una mayor expresión temprana de E2.

Se generó un adenovirus mutante que tenía mutaciones en los dos sitios de unión a E2F del promotor temprano de E2 adenoviral. En la Fig. 23 se muestra tanto el promotor temprano E2 de tipo natural como el promotor temprano E2 mutante.

El análisis de la expresión de ARN se llevó a cabo en células T24 infectadas con AdWT-RGD y AdE2Fm (que también contienen el motivo RGD) obtenidas mediante RT-qPCR 24 horas después de la infección. La expresión del gen AD-WT se consideró el 100%. El método fue idéntico al descrito en la sección III del Ejemplo 23.

El resultado se muestra en la Fig. 24.

Como se desprende de la Fig. 24, la expresión del gen E2 temprano fue mayor en las células infectadas con AdE2Fm en comparación con las células infectadas con AD-WT. Por lo tanto, se debe concluir que E2F-1 está desempeñando un papel represivo en la activación temprana del promotor E2. Esto contrasta marcadamente con la comprensión actual, donde se postula que E2F-1 es un activador (DeCaprio JA, Virology. 20 de febrero de 2009; 384 (2): 274-84.

Es bien sabido que la estructura de la región E2 en todos los adenovirus oncolíticos actualmente conocidos está formada como se muestra en la Fig. 22. Por lo tanto, el modo de acción de E2F-1 es idéntico al descrito en la presente memoria. En consecuencia, todos ellos, es decir, todos los adenovirus oncolíticos, pueden usarse en combinación con inhibidores de CDK4/6, incluidos ColoAd1 y Delta-24-RGD.

ColoAd1 se puede caracterizar de la siguiente manera:

Enadenotucirev (anteriormente ColoAd1) es un adenovirus quimérico selectivo de tumores con actividad preclínica demostrada. La cápside de ColoAd1 proviene de Ad11 p, un serotipo con seroprevalencia limitada en humanos. EnAd infecta células uniéndose a CD46 y/o desmogleína 2,6, ambas ampliamente expresadas en muchas células de carcinoma. La mayor parte del genoma de EnAd deriva de Ad11p con una deleción grande en E3 y una deleción más pequeña en E4. Además, la región E2B consta de una quimera de secuencias de Ad11p y Ad3. La deleción de E4 en EnAd está en E4ORF4, que en Ad5 codifica una proteína que inactiva la proteína fosfatasa 2A y, por lo tanto, activa la maquinaria de traducción de proteínas, además de regular la actividad de la proteína E1A en un bucle inhibidor con retroalimentación. Estas deleciones, quizás combinadas con la región quimérica E2B, probablemente contribuyen a la sorprendente replicación selectiva del cáncer de EnAd (Deyer et al., Mol Ther Oncolytics. 2017, 16; 5: 62-74).

Delta-24-RGD (DNX-2401) se puede caracterizar de la siguiente manera:

Delta-24-RGD (DNX-2401) es un virus oncolítico con capacidad de replicación condicional diseñado para replicarse preferentemente y lisar células tumorales con anomalías en la vía p16/RB/E2F. Fueyo et al., Oncogene. 6 de enero de 2000; 19 (1): 2-12. A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo; Dai B. et al., Mol Cancer Therapy. Abril de 2017;16(4):662-670.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una combinación que comprende un adenovirus oncolítico y un inhibidor de CDK4/6, en donde el adenovirus se replica de manera dependiente de YB-1 y en la que el adenovirus carece de expresión de E1A13S.

2. La combinación de la reivindicación 1, en donde el adenovirus es deficiente en replicación en las células que carecen de YB-1 en el núcleo, pero se replica en las células que tienen YB-1 en el núcleo.

3. La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la combinación comprende además un inhibidor de PARP.

4. La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la combinación comprende además un inhibidor de bromodominios.

5. La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el uso en un método para el tratamiento de un tumor o cáncer.

6. Un adenovirus para el uso en un método para el tratamiento de un tumor o un cáncer en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto un adenovirus y un inhibidor de CDK4/6, en donde el adenovirus se define como en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

7. Un inhibidor de CDK4/6 para el uso en un método para el tratamiento de un tumor o cáncer en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto un adenovirus y el inhibidor de CDK4/6, en donde el adenovirus se define como en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

8. La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la combinación para el uso de la reivindicación 5, el adenovirus para el uso de la reivindicación 6 y el inhibidor de CDK4/6 para el uso de la reivindicación 7, en donde el adenovirus se selecciona del grupo que comprende XVir-N-31, dl520, AdA24, AdA24-RGD, dl922-947, E1Ad/01/07, dl1119/1131, CB 016, VCN-01, E1 Adl1107, E1 Adl1101, Or Ca -010, Enadenotucirev y virus que carecen de un oncogén viral expresado que es capaz de unirse a un producto del gen inhibidor de tumores Rb funcional.

9. La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 8, la combinación para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5 y 8, el adenovirus para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 y 8, y el inhibidor de CDK4/6 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, en donde el adenovirus es XVir-N-31.

10. La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 8 a 9, la combinación para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5 y 8 a 9, el adenovirus para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 y 8 a 9, y el inhibidor de CDK4/6 para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8 a 9, en donde el inhibidor de CDK4/6 es un inhibidor de CDK4/6 que detiene las células en la fase G1 e inhibe E2F1.

11. La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 8 a 10, la combinación para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5 y 8 a 10, el adenovirus para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 y 8 a 10, y el inhibidor de CDK4/6. para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8 a 10, en donde el inhibidor de CDK4/6 se selecciona del grupo que comprende palbociclib que también se denomina PD 0332991, abemaciclib que también se denomina LY-2835219, ribociclib que también se denomina LEE011, Trilaciclib, que también se denomina G1T28, y Dinaciclib.

12. La combinación para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5 y 8 a 11, el adenovirus para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 y 8 a 11, y el inhibidor de CDK4/6 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8 a 11, en donde la enfermedad tumoral o cáncer expresa Rb o es positivo para Rb.

13. La combinación para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5 y 8 a 12, el adenovirus para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 y 8 a 12, y el inhibidor de CDK4/6 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8 a 12, en donde las células tumorales tienen resistencia o son insensibles a uno o varios agentes farmacéuticamente activos y/o la radiación.

14. La combinación para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5 y 8 a 13, el adenovirus para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 y 8 a 13, y el inhibidor de CDK4/6 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8 a 13, en donde el tumor o cáncer contiene YB-1 en el núcleo celular independientemente del ciclo celular.

15. La combinación para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 5 y 8 a 14, el adenovirus para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 y 8 a 14, y el inhibidor de CDK4/6 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8 a 14, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que comprende cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de mama metastásico (mBC), melanoma, glioma, cáncer de páncreas, carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma de pulmón, sarcoma, cáncer de ovario, cáncer renal, cáncer de próstata y leucemia.