JP2009535037A - 単離されたヒトａ３３プロモーターのｄｎａフラグメントおよび腫瘍細胞において異種遺伝子の発現を制御するためのその使用 - Google Patents

Abstract

照射、低酸素およびフリーラジカル形成といったストレスに応答する配列を包含する、他の任意の調節配列と併用できる、塩基対-105〜塩基対+307のヒトA33遺伝子プロモーターの領域に対応する、目的とする異種遺伝子の発現を制御できる単離されたDNA配列。組換えDNA発現のための組み立て物およびウイルスベクターが提供され、これは、このヒトA33遺伝子プロモーターの配列、および、それに機能的に結合した少なくとも一つの異種遺伝子を含む。この調節配列（群）は、結腸直腸癌細胞を包含する細胞において少なくとも一つの異種遺伝子の発現を制御する。結腸直腸癌を治療するための医薬組成物および方法もまた記載する。

Description

技術分野
本発明は、遺伝子および癌治療、より詳細には、例えば腫瘍細胞において目的遺伝子の発現を制御する能力を有する単離されたDNA配列に関するものである。より具体的には、本発明は、目的遺伝子に関連するA33プロモーターを含むベクターおよび医薬組成物および結腸直腸癌治療におけるそれらの使用に関するものである。
本発明は、癌治療、より詳細には結腸癌の治療に有用な腫瘍溶解性アデノウイルスに関するものである。

発明の背景
結腸直腸癌は悪性腫瘍による死亡の主たる原因の一つであり、結腸直腸癌患者のおよそ50%が原発癌の治療後5年以内に再発をみる。これらの症例の大多数において、この癌は平均余命がおよそ5年の慢性疾患となる。この疾病のより進行した病期では、肺、肝臓、卵巣および骨への転移があり得る（Taylor et al., Ann. Surg. Oncol., 9:177-185, 2002）。

この疾病の最初の症状は、便に血液が現れる事であるが、この時点までに癌は既に極めて進行した病期となっている。患者は通常放射線療法には応答せず、フルオラシル5のような化学療法薬に対して部分的にでも応答するのは20%に満たない。化学療法、放射線療法または免疫療法のような常套的治療に対する応答の欠如は、この癌の治療法の発見に対する関心を招き、遺伝子療法は一般に癌治療のための一つの関連戦略である。癌に関連する膨大な前臨床試験および多くの治験がなされているものの、これらの試みのうち結腸直腸癌または結腸直腸癌に起因する肝転移の治療のための遺伝子治療を特徴とするものは比較的少数に過ぎない（Friedmann, Acta Paediatr. 85:1261-1265, 1996; Sangro et al., J. Clin. Oncol. 22:1389-1397, 2004; Sung et al., Mol. Ther. 4:182-191, 2001; およびHabib et al., Human Gene Ther. 12:219-226, 2001）。

要約
本発明は、部分的には、本発明者等のA33抗原についての仕事に基づくものであり、この抗原は、結腸直腸癌および胃癌細胞を包含する或る種の悪性細胞において選択的にアップレギュレートされる。したがって本発明は、発現ベクター中に組み込まれ、結腸直腸癌および胃癌の診断および治療に使用され得るDNA配列、より一般的にはヌクレオチド配列を特徴とするものである。この配列は、結腸癌細胞特異的調節配列（例えば、A33抗原遺伝子配列の一部）を使用して異種蛋白（即ち、A33抗原以外の蛋白）の発現を促すものを包含する。この異種蛋白は、標識または診断マーカーとして有用なものであっても、また、治療薬として有用なものであってもよい。故に本発明の一つの目的は、特に腫瘍細胞、そしてとりわけ結腸直腸癌または胃癌細胞において目的とする遺伝子の発現を制御できる、プロモーター活性を有する単離されたDNA配列を提供することである。

本発明は、腫瘍細胞、特にA33抗原が発現または過剰発現される腫瘍細胞において、目的とする異種遺伝子の発現を調節できる、下にさらに説明するヒトA33調節配列の一部を含む、単離されたDNAフラグメントを提供する。より具体的には、本発明は、配列番号1を含む第一調節配列またはその生物活性変異体を含む単離されたDNA配列を特徴とする。調節配列またはその生物活性変異体は、異種遺伝子と機能的に結合している時、目的とする異種遺伝子の発現を促進することができる。読み取りを容易にするため、本発明者等は「またはその生物活性変異体」という語を毎回反復し続けることはしない。A33調節配列（例えば配列番号1）が使用できる時にはその生物活性変異体もまた使用できることを理解されたい。第一調節配列の生物活性変異体は、配列番号1と少なくとも50%一致する配列であってよく、またはそれを包含し（さらなる変異体は下に記載する）、その相違は1またはそれ以上のヌクレオチドの挿入、除去または置換により引き起こされる。

この配列は、1以上の調節配列を含むことができ、本発明者等はそれらを「第一」および「第二」配列と呼ぶ。A33調節配列（例えば配列番号1）に加えて第二の配列が存在する場合、その第二配列は、ストレス刺激によって活性化される配列であり得る。これらの配列は、低酸素応答エレメントまたはストレス蛋白に本来付随しているプロモーター、NFkB応答エレメント、および反応性酸素種応答エレメント（例えば、ヒトVEGFプロモーターの-80bp〜-50bp）ならびにEgr-1プロモーターに存在するCArGモチーフを包含する（Greco et al., Cancer Gene Ther. 12:655-662, 2005）。

本明細書に記載の任意の配列（例えば、配列番号1または配列番号1が異種遺伝子配列に機能的に結合している組み立て物）を、発現ベクター、例えばプラスミド、コスミド、人工染色体、またはウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター、またはアデノウイルス随伴ベクター中に組み込むことができる。これらのタイプのベクターは当分野で周知であり、本明細書に記載の特異的配列を発現させるために使用することができる。下にさらに記載するように、アデノウイルスベクターは腫瘍溶解性アデノウイルスを構成できる。

本発明はさらに、本明細書に記載のDNAもしくは核酸配列または本明細書に記載の発現ベクターを含む単離された細胞を特徴とする。
調節配列（例えば、配列番号1を含む配列またはその生物活性変異体）は、目的とする異種遺伝子と機能的に結合でき、これらの核酸配列、それらを含む発現ベクター、ならびにそれらを含む細胞もまた本発明の範囲内にある。調節配列がA33配列の生物活性変異体を包含し得るように、それらもまた（またはその代わりに）目的とする異種遺伝子の生物活性変異体を包含し得る。目的とする異種遺伝子は、治療用遺伝子産物、例えばアデノウイルス蛋白（例えばE1A）、プロアポトーシス蛋白（例えば、Bak、Bax、SIVA、Par-4、Bcl-2、チミジンキナーゼ、またはカスパーゼ）、腫瘍壊死因子、またはインターロイキン（例えば、IL-2、IL-10、IL-12、またはIL-23）をコードすることができる。アデノウイルス蛋白がコードされている場合、それは任意のアデノウイルス血清型のものであってよい。同様に、アデノウイルスベクターが作製され使用される場合、それは任意の血清型のアデノウイルスであってよい（例えば、血清型2、血清型5、血清型3、または血清型35）。

本発明配列のいかなるものも、内部リボソーム進入部位（IRES）を含み得る。IRESはmRNA上の内部部位で翻訳開始をさせる核酸配列として理解されるようになった。

本明細書に記載の配列、発現ベクター、および細胞を、医薬組成物の活性成分（または一つの活性成分）として配合することができる。この組成物は癌治療薬の投与に好適であることが知られている任意の方法で調合することができる。これらは、経口または非経口投与いずれかのための調合物を包含する（例えば、経口投与、静脈内投与、または動脈内投与（例えば、肝内動脈投与））この医薬組成物は、胃腸管の癌部位に直接投与されるよう調合することもできる。

医薬の製造における、本明細書に記載の特徴を有する単離されたDNA配列、核酸配列、発現ベクターまたは細胞の使用もまた本発明の範囲内にある。この医薬は、癌の治療に有用なものであってよい（例えば、結腸直腸癌または胃癌のようなA33抗原陽性癌）。

本発明方法は、本発明に係る単離されたDNA配列または核酸配列、発現ベクター、および細胞の製造方法、ならびに、これらの物質による治療に従う癌を有する患者を治療する方法を包含する。例えば、その患者は、結腸直腸癌を有する患者または結腸直腸癌を発症する危険性があると考えられる患者であろう。その方法は、患者に、本明細書に記載の核酸配列（例えば、配列番号1またはその生物活性変異体である、またはそれを含む第一調節配列、および、それらに機能的に結合した、抗結腸直腸癌物質をコードしている異種遺伝子）を投与することによって実施できる。患者は人間であってよく、この方法はさらに、治療を必要とする人間を同定する工程を包含できる。前述のように異種遺伝子はE1Aをコードすることができ、この核酸配列が発現ベクター（例えばアデノウイルスベクター）の中に入っている事もある。治療方法はさらに、患者を第二の治療レジメンに付すことを含むことがあり、それは癌を照射する目的であることもある。例えば、第二の治療レジメンは、5-フルオロウラシル（5-FU）、カペシタビン（Xeloda（登録商標））、ロイコボリン（LV；ホリン酸）、またはオキサリプラチン（Eloxatin（登録商標））のようなアジュバント化学療法薬の投与を含み得る。

本発明者等は「治療」または患者を「治療する」と言い、また、治療が癌の完全な寛解または治癒をもたらすことはあるが、その他の有益な結果もまた良好な治療であると考えられる。例えば、本発明方法が平均余命の増大、生活の質の向上（例えば、癌の症状を低減させることによって）、癌再発の危険性の低下、転移の危険性の低下などをもたらすならば、患者は良好に治療されている。

より詳細には、本発明は、塩基対-105〜塩基対+307のヒトA33遺伝子プロモーターの領域に対応する、ポリヌクレオチド配列 配列番号1、または、1またはそれ以上のヌクレオチドの挿入、置換、または除去によって修飾されたこのポリヌクレオチド配列の生物活性フラグメントまたはその他の変異体を提供する。A33プロモーターに通常付随している（即ち、通常その指令下で発現される）蛋白は、膜糖蛋白である。本明細書に記載のA33調節配列がA33コード配列に隣接していない場合、このA33調節配列は「単離されている」。

本発明の別の側面は、本発明が、目的とする異種遺伝子と機能的に結合した本発明に係るプロモーター配列を含む、単離された組換え発現のDNAを提供するということである。
本発明のさらなる側面は、ヒトA33遺伝子プロモーターの領域に対応するポリヌクレオチド配列 配列番号1は、他の何らかのプロモーター配列、例えば照射、低酸素、フリーラジカルなどに応答するための配列とさらに結合できるという事である。

本発明のもう一つの関連する側面は、本発明が、本発明に係る前記定義によるプロモーターDNA（ここでこのDNA配列は、目的遺伝子と機能的に結合していることが見いだされている）を含む組換え発現ウイルスベクターを提供するということである。
本発明はさらに、宿主細胞において外来DNAを発現させる方法を提供し、その方法は、所望ポリペプチドをコードしている外来DNAまたはこのDNAが発現されるRNAと機能的に結合した、ポリヌクレオチド配列 配列番号1のDNAプロモーターモジュールを含む、本発明に係るDNAプロモーター分子または組換えウイルスベクターを含む、介入組み替え発現DNA組み立て物を、宿主細胞に導入することを含む。

本発明はさらに、結腸直腸癌に罹患している患者においてこの疾患を治療する方法を提供し、その方法は、本発明に係るプロモーター配列を含み且つ治療遺伝子および／またはこれに機能的に結合したウイルス複製の発現を制御できる、組換え発現DNA組み立て物または組換え発現ウイルスベクターを含む有効量の医薬組成物を患者に投与することで構成される。

前記定義のように、本発明の一つの側面は、本発明が、塩基対-105〜塩基対+307のヒトA33遺伝子プロモーターの領域に対応する、ポリヌクレオチド配列 配列番号1、または、1またはそれ以上のヌクレオチドの挿入、置換、または除去によって修飾されたこのポリヌクレオチド配列のフラグメントまたは変異体（これは実質的に同等の機能を有する）を含む、単離されたDNA配列を提供するということである。

本明細書で使用する「単離された」という語は、その核酸が本来存在する細胞または生物中の夾雑配列に関して実質的に分離または精製されていることを表し、標準的な精製技術により精製された核酸および組換え技術または化学合成により製造された核酸を包含する。

本明細書で使用する「変異体」という語は、そのヌクレオチド配列が、配列番号1として確立されている配列と実質上同一である、DNA分子を指す。変異体は、そのような修飾がもし中立突然変異であり、当該DNA分子の機能に影響しないならば、または、当該DNA分子が下にさらに記載するように機能するならば、1またはそれ以上の核酸の挿入、置換または除去といった修飾によって達成できる。

本明細書で使用する、核酸配列の「フラグメント」は、完全な長さに満たない核酸の一部であり、少なくとも、緊縮条件下で本発明の核酸配列と特異的にハイブリダイズできる最小限の長さを含み、このフラグメントは本発明に必要な生物学的性質を維持している。
本明細書で使用する「異種遺伝子」という語は、他のDNA配列と結合した、目的とするアミノ酸配列または蛋白をコードしているDNA配列を指し、この結合は天然には見いだされない。

本明細書で使用する「治療遺伝子」は、宿主細胞に直接的または間接的な治療効果を及ぼすことのできる、アミノ酸または蛋白配列をコードしているDNA配列を指す。本発明のために好ましい宿主細胞は結腸腫瘍細胞である。

以下の具体的態様は、本発明の範囲内にある。
塩基対-105〜塩基対+307のヒト遺伝子A33プロモーターの領域に対応する、ポリヌクレオチド配列 配列番号1、または、1もしくはそれ以上のヌクレオチドの挿入、置換、または除去によって修飾されたこのポリヌクレオチド配列のフラグメントまたは変異体（これは実質的に同等の機能を有する）を含む、単離されたDNA配列；
それに機能的に結合した、目的とする異種遺伝子の発現を制御できる、直上に記載された単離されたDNA配列に従う、プロモーター活性を有する配列；
他の任意のプロモーター活性に関連する、直上に記載された単離されたDNA配列に従う、プロモーター活性を有する配列（例えば、別のプロモーター配列、例えば照射、低酸素またはフリーラジカルに応答する配列）；

これに機能的に結合した、少なくとも一つの目的とする異種遺伝子を制御するための、塩基対-105〜塩基対+307のヒトA33遺伝子プロモーターの領域に対応する、ポリヌクレオチド配列 配列番号1、または、1またはそれ以上のヌクレオチドの挿入、置換、または除去によって修飾されたこのポリヌクレオチド配列のフラグメントまたは変異体（これは実質的に同等の機能を有する）を含む、単離されたDNA配列の用途；
(a) 上記のDNA配列に従う、プロモーター活性を有するDNA配列（例えば、プロモーター配列は腫瘍細胞における異種遺伝子の発現の制御に特異的である）；および、
(b) このプロモーター配列に機能的に結合した少なくとも一つの異種遺伝子（ここでこのプロモーター配列は、この、少なくとも一つの異種遺伝子の発現を制御する（例えば、治療遺伝子））；
を含む、組換えDNA発現の組み立て物；
腫瘍細胞が結腸腫瘍細胞である、本明細書に記載の組み立て物；
異種遺伝子が、E1A遺伝子、hsv-TK遺伝子のような自殺遺伝子、E3アデノウイルスゲノム領域、IL-10、IL-12またはIL-23のようなインターロイキンの遺伝子より成る群から選ばれる、本明細書に記載の組み立て物；
プロモーター活性を有するDNA配列がさらに、他の何らかのプロモーター配列（例えば、照射、低酸素またはフリーラジカルに応答する配列）を含む、またはそれに関連していることが見いだされている、本明細書に記載の組み立て物；

上記の組み立て物を含むベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、組換えアデノウイルスまたは腫瘍溶解性の条件付き複製アデノウイルス；
(i) 塩基対-105〜塩基対+307のヒトA33遺伝子プロモーターの領域に対応する、ポリヌクレオチド配列 配列番号1、または、1もしくはそれ以上のヌクレオチドの挿入、置換、または除去によって修飾されたこのポリヌクレオチド配列のフラグメントまたは変異体（これは実質的に同等の機能を有する）を含む、プロモーター活性を有するDNA配列；および、
(ii) プロモーター活性を有するこのDNA配列に機能的に結合した少なくとも一つの異種遺伝子（ここでこのプロモーター配列は、この、少なくとも一つの異種遺伝子の発現を制御する（例えば、治療遺伝子））；
を含むベクター；

請求項6〜12のいずれかに記載の組換えDNA発現の組み立て物を宿主細胞中に導入することを特徴とする、宿主細胞において外来DNAを発現させる方法であって、この組み立て物が、塩基対-105〜塩基対+307のヒトA33遺伝子プロモーターの領域に対応する、ポリヌクレオチド配列 配列番号1、または、1もしくはそれ以上のヌクレオチドの挿入、置換、または除去によって修飾されたこのポリヌクレオチド配列のフラグメントまたは変異体（これは実質的に同等の機能を有する）を含む、プロモーター活性を有するDNA配列；および、プロモーター活性を有するこのDNA配列に機能的に結合した異種遺伝子（ここでこのDNA配列は、この宿主細胞においてこの異種遺伝子の発現を制御する）、を含む方法。

本明細書に記載のベクターを含む医薬組成物；および、
本明細書に記載の医薬組成物の有効量を患者に投与することを特徴とする、結腸直腸腫瘍に罹患している患者においてこの疾患を治療するための方法。

本発明の1またはそれ以上の態様の詳細を、添付の図面および以下の説明に開示する。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、この説明および図面、ならびに請求項から明らかであろう。

詳細な説明
癌は、細胞の無秩序な増殖を特徴とする種類の疾患または異常として理解されるようになっている。無秩序な分割する細胞は、直接隣接する組織に侵入し、または遠隔部位に転移し得る。根本的な原因は、細胞の増殖および分化の調節に関わる蛋白をコードしている遺伝子の特別な小集団の発現に影響を及ぼすDNAの損傷であると考えられる。突然変異または過剰発減すると癌を引き起こす遺伝子はプロトオンコジーンとして知られ、突然変異遺伝子自身はオンコジーンである。

結腸直腸癌、腸癌（intestinal cancer）、または腸癌（bowel cancer）とも呼ばれる結腸癌は、胃腸管を蔽っている上皮細胞を起源とする、結腸、直腸または盲腸における癌性増殖を含み得る。ポリープは、結腸の粘膜から突出した組織の潜在的癌性異常増殖であり、胃、鼻、膀胱、子宮頸部、小腸または子宮にも起こり得る。ポリープが粘膜表面に付着していると、これは有茎性と呼ばれる。逆に、茎が存在しないと、そのポリープは無茎性と呼ばれる。腺腫は、腺を起源とする、結腸内部のもう一つの潜在的癌性増殖である。腺腫は副腎、下垂体、および甲状腺にも発生し得る。腺腫は普通、最初は良性であるが、時間と共に進行して悪性となることがあり、その時点で腺癌と呼称される。腺癌は最も一般的な結腸癌であり、全症例のおよそ90%を占める。本明細書に記載のように、患者の治療方法は、治療の候補者として患者（例えば人間の患者）を同定する工程を包含し、その工程は、ポリープおよび腺腫を包含する異常増殖についてその患者を評価すること、および、他の任意の標準的診断または癌スクリーニングを実施することを包含し得る。

現在推奨されている結腸直腸癌の治療は、この疾患の病期に依存する。現在、手術が主要な行動方針であり、例えば、根治目的、症状緩和目的、バイパス、糞便分流、および「開閉」と表現される手術が包含される。結腸癌に冒された患者のおよそ70%が外科的切除を受ける。残念ながらこれらの患者のおよそ30-40%はその後疾患が再発する。さらに、患者のおよそ10%は、外科的切除に適さない、局所で進行した疾患を呈する（Taylor et al., Ann. Surg. Oncol. 9:177-185, 2002; Curley et al., Am. J. Surg. 163:553-559, 1992）。これらの患者の予後は暗く、その治療は典型的には化学療法、照射療法、および免疫療法を包含する併用療法を含む（Scott et al., Caner Res. 11:4810-4817, 2005）。本明細書に記載のように、患者を治療する方法は、直前に述べた種類の、そして後に詳細に記載する特異的治療のうちいずれかを含む、他の治療との組み合わせによって実施できる。例えば、結腸直腸癌のための発現ベクター（例えばアデノウイルス組み立て物）を投与された患者は、結腸直腸癌治療のための、現在知られている、または後に開発される任意の方法で治療され得る。外科的介入に加えて、結腸直腸癌のための現在の治療レジメンは、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、緩和的化学療法、免疫療法、およびワクチンを包含する。アジュバント化学療法薬には、5-フルオロウラシル（5-FU）、カペシタビン（Xeloda（登録商標））、ロイコボリン（LV；ホリン酸）、およびオキサリプラチン（Eloxatin（登録商標））がある。

肝臓は、最も一般的な転移性結腸癌の部位であり、この臓器の状態は、進行した疾患を持つ患者の生存の重要な決定因子である。肝転移の完全な外科的切除は若干の患者には長期治癒をもたらすが、肝転移の大多数は外科手術に従わない（Mayer-Kuckuk et al., Mol. Ther. 5:492-500, 2002）。本発明に係る治療方法は、結腸直腸癌であるかどうか、そして初期治療の前または後に肝臓に転移しているかどうかを決定するための患者の評価の工程を含み得、また、本発明に係る組成物は、結腸直腸癌を治療するよう構成される場合、少なくとも部分的には、癌が他の場所、例えば肝臓に転移する危険性を低下させることにより、結腸直腸癌を治療する。

局所化学療法は、選択的に殺腫瘍剤をデリバリーし、このことが全身毒性および正常な肝細胞の損傷を最小化する。本組成物は全身的ではなく局所的に投与できる。肝動脈を経由してデリバリーされる化学療法薬は、根治的切除後の肝転移の再発を低下させ、さらに、切除不能な疾患を有する患者に投与される時、生存を延長することもできる。本発明に係る医薬組成物は肝動脈を経由して投与できる。EGFレセプターまたは可溶性VEGFを標的とする抗体に基づく治療である、セツキシマブおよびベバシズマブのような薬物による免疫療法が、肝転移の治療に使用されているが、患者の生存の短期延長が観察されるに過ぎないため、これらの治療の有効性には異論がある（Alekshun et al., Cancer Control 12:105-110, 2005）。もう一つの抗体に基づく治療である、ゲフィチニブ（Irressa（登録商標））の投与もまた、効果が上がらず、転移性結腸直腸癌患者の単剤療法として期待できなかった（Rothenberg et al., Proc. Annu. Meeting Am. Soc. Clin. Oncol., 2004）。したがって、現在利用できる結腸癌および転移性結腸癌の治療は概して効果が無く、患者の生存率を有意に増大させるためには追加的または代替的戦略を要する可能性がある。

その目的に向けて、DNA配列、および、より一般的には、核酸配列が本明細書に記載される。これらの配列を発現ベクター（本発明者等はこれを組換え発現組み立て物とも称する）に組み込むことができる。このDNA配列は、選ばれたコード配列の転写制御に有効であるよう設計され、その理由で本発明者等はこれらを調節配列と称することがある。これらは遺伝子の5’非翻訳領域内またはイントロン内にあり得る（例えば、第一のエキソンに先行するイントロン）。調節配列はプロモーターおよびエンハンサーを含むことが知られており、これらのいずれかまたは両者が特別な調節エレメントを含み得る。この配列は、ヒトA33プロモーターに対応するDNA配列を含み、そしてこの核酸配列は、(a) ヒトA33プロモーターに対応するDNA配列；および(b) 目的とする異種遺伝子のコード配列、を含み得る。ヒトA33プロモーターに対応する配列は、A33プロモーターの全てまたは一部およびA33第一イントロンの全てまたは一部を有する配列を包含する。調節配列（例えば配列番号1）および異種遺伝子のコード配列を含む配列の両者が存在する場合、調節配列はコード配列と機能的に結合しており、よって目的とする異種遺伝子は宿主細胞（例えば、組織培養中に維持された細胞またはインビボ細胞）において転写および翻訳される。ヒトA33プロモーターに対応する有用なDNA配列は、ヒトA33の塩基対-105から塩基対+307までのヌクレオチド（配列番号1）およびその生物活性変異体を包含する。

幾つかの態様では、配列番号1（これは本明細書の他所に記載するように、ヒトA33遺伝子調節配列に対応する）は、少なくとも一つの異種遺伝子（例えば単一の異種遺伝子）の発現を制御できる。別の態様では、配列番号1は、目的とする異種遺伝子を含む融合蛋白と、または別の態様では、独立して2またはそれ以上の目的遺伝子と、機能的に結合し得る（E1Aおよびその他の目的とする異種遺伝子を下に詳細に記載する）。これらの態様のいずれにおいても、配列番号1をもう一つの調節配列、例えばストレス因子（例えば、照射、低酸素、熱、など）に応答する調節または応答エレメントと共に使用できる。これらは通常プロモーターの上流にある、確定したDNA配列である。例えば、本発明配列は、A33調節配列(例えば配列番号1)またはその生物活性変異体、および、ストレス蛋白および／または低酸素応答エレメント（HRE）またはその他任意の反応性酸素種に応答する因子に通常関連するプロモーターを含み得る（例えば、ヒトVEGFプロモーターの-80bp〜-50bp）。Egr-1プロモーターに存在するようなCArGモチーフもまた含まれ得る（Greco et al., Cancer Gene Ther. 12(7):655-662, 2005）。HREは、低酸素ストレスの状態においてプロモーターまたは応答エレメントの転写活性を高める。Herndez-Alcocebaおよび協力者は、乳癌におけるエストロゲン応答エレメントを含むプロモーターの応答を増強するためにHREを使用している（Hernandez-Alcoceba et al., Cancer Gene Ther, 8:298-307, 2001）。これら同じエレメント照射応答エレメントと結びつけられており（Greco et al., Gene Ther. 9:1403-1411, 2002）、これもまた本発明配列に含まれている。これらのエレメントはウイルスベクターの一部を形成し得る（例えば、増殖性または非増殖性アデノウイルス；Ido et al., Cancer Res. 61:3016-3021, 2001; Park et al., J. Clin. Invest. 110:403-410, 2002; Cowen et al., Cancer Res. 64:1396-1402, 2004）。もう一つの有用な調節エレメントはNF-κB応答エレメントである。

調節配列および／または調節エレメント（群）のヌクレオチド配列は、ヒトにおいて発見されたものと同一となり得る。したがって或る態様では、異種プロモーターはヒトのものであり、例えばヒトA33プロモーターまたはその生物活性変異体を包含する。他の種由来の対応するA33配列（例えば、ヒト以外の霊長類、またはイヌ、ネコ、マウス（または他の齧歯類）、ウシ、またはブタ由来のA33配列）もまた本明細書に記載のように使用できる。

本明細書に記載の任意の態様において、配列番号1の44位にあるヌクレオチド「t」をヌクレオチド「c」に置き換えることができる。

A33抗原は、(1) アフリカツメガエルの皮質胸腺細胞のマーカー（CTX）；(2) そのニワトリオーソログ（ChT1と呼ばれる）；(3) CTXのマウスおよびヒト相同体；ならびに(4) コクサッキーウイルスB群ならびにアデノウイルス2型および5型のレセプター（CAR）、を包含する、免疫グロブリンスーパーファミリー内のサブファミリーの一員である（(1) Zhan et al., Cancer Gene Ther. 12:19-25, 2005）; Shirakawa et al., Clin. Cancer Res. 10:4342-4348, 2004; Sakamoto et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 46: Supplemental material 27-32, 2000; (4) Welt et al., J. Clin. Oncol. 8:1894-1906, 1990;およびWelt et al., Clin. Cancer Res. 9:1338-1346, 2003）。

記載のように、生物活性な配列番号1の変異体は、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、およびA33抗原を天然に発現するその他任意の細胞または癌性細胞に、診断用または治療用蛋白を選択的にデリバリーするために使用することもできる。A33調節配列の生物活性変異体は、それに機能的に結合している異種遺伝子の発現を、有用な程度にまで促進する配列である。異種遺伝子の発現は、程度の差はあるものの配列番号1を使用した場合よりも強く、異種遺伝子の発現は、検出可能であるほどに（異種遺伝子産物が診断アッセイで評価される場合）、または患者に利益を与えるほどに（異種遺伝子産物が治療物質である場合）充分高くありさえすればよい。

特別な態様では、配列番号1の生物活性変異体の配列は、配列番号1と少なくとも30%一致することができ（例えば、配列番号1と少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%一致する）、その相違は、配列番号1に存在するヌクレオチドの1またはそれ以上の付加、除去または置換によって説明される。配列番号1と相違するヌクレオチドは、その配列のいずれかの末端または配列全体に見いだされ得る。例えば、特別な態様では、配列番号1の生物活性変異体の最初の100-105ヌクレオチドの配列は配列番号1の最初の100-105ヌクレオチドに一致し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド100-412）の配列は存在しないか、または配列番号1の対応ヌクレオチドとは、上記の程度まで（例えば、少なくとも30%、35%、40%、など）相違することがある。或いは、配列番号1の生物活性変異体の最初の100-105ヌクレオチドの配列が上記のように相違し、残りのヌクレオチドの配列が、配列番号1のヌクレオチド100-412または105-412と一致することもある。

調節配列と機能的に結合した異種遺伝子は、天然に存在する全長蛋白をコードしている全長遺伝子であってもよいし、末端切除もしくは突然変異蛋白をコードしている末端切除もしくはその他の突然変異遺伝子であってもよい。本発明者等は、「蛋白」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という語を、任意のアミノ酸配列を呼称するために互換的に使用する。本発明者等は、ペプチドは一般的には蛋白よりも短いと考えられることを認識している。

A33は、原発性および転移性結腸癌の約95%に、そして均一に抗原を発現するびまん性胃癌の約38%に見いだされる。しかしながら、他の殆どの正常組織または他の上皮性癌、肉腫、神経外胚葉性腫瘍、またはリンパ性新生物には観察されていない（King et al., Br. J. Cancer 72:1364-1372, 1995）。本発明者等は、本発明に係る配列および組み立て物の有用性を、結腸直腸癌の治療との関連において記載してきた。当業者は、A33がどこで発現されようとも本組成物が使用でき（A33プロモーターがその状況で活性化されるため）；A33プロモーターが、例えばA33発現癌細胞において異種蛋白（例えば、抗癌蛋白）の発現を促進できるということが容易に理解できるであろう。

A33の発現は、正常な腸粘膜の陰窩底部では僅かである。これは、陰窩底部は結腸細胞の複製部位であるため、A33抗原の潜在的用途を結腸癌治療の標的として決定するのに適切な性質である。この観察は、正常に複製している結腸細胞が、A33プロモーター標的に対する抗癌治療の標的とはならないことを示唆する。A33は、胃腸癌の患者において極めて癌特異的なターゲッティングを可能にする、構成的に発現される組織特異的上皮性膜抗原の最初の例である（King et al., Br. J. Cancer 72:1364-1372, 1995）。この観察は、最近の薬物動態学的研究によってさらに支持されている（Scott et al., Clin. Cancer Res. 11:4810-4817, 2005）。その結果として、抗体に基づく免疫療法を用いてA33を標的とする治験が開始されている（Welt et al., J. Clin. Oncol. 8:1894-1906, 1990; Welt et al., Clin. Cancer Res. 9:1338-1346, 2003; およびKing et al., Br. J. Cancer 72:1364-1372, 1995; さらに、Welt et al., J. Clin. Oncol. 8:1894-1906, 1990およびWelt et al., J. Clin. Oncol. 12:1561-1571, 1994をも参照されたい）。モノクローナル抗体A33（mAbA33）はA33抗原に結合し、記載したように、これは結腸癌細胞を包含する幾つかの細胞表面で差別的に発現される。

A33抗原は、コクサッキーアデノウイルス2型および5型レセプターと同じ免疫グロブリンスーパーファミリーに属する（Sakamoto et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 46 suppl:S27-32, 2000; Bergelson et al., Science 275(5304):1320-1323, 1997）。ヒトA33遺伝子のプロモーター（Johnstone et al., J. Biol. Chem. 277:34531-34539, 2002）およびマウスA33遺伝子（Johnstone et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 279(3):G500-510, 2000）がクローニングおよび特性解明されている。これらのプロモーターの比較は、遺伝子レベルでまさに観察されたとおり、高度の配列相同性がある事を示している。ヒトA33プロモーターがbp-12および-224に二つのTATAボックスコンセンサスを有し（Johnstone et al., J. Biol. Chem. 277(37):34531-34539, 2002）、これらがマウスには存在しないこともまた観察された。さらに、両遺伝子は転写開始配列（Inr）を含む。このプロモーターは、「腸に多いクルッペル様因子」のような腸上皮の特異的発現に関わる転写因子のための部位を含む（GKLF/KLF4およびIKLF/KLF5）（Mao et al., Oncogene 22:4434-4443, 2003）。これらのエレメントを、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルス1型を使用して、ウイルスベクターを包含する本発現ベクター中に組み込むことができる。

記載のように、本組成物は、この遺伝子によりコードされている蛋白が発現され、癌細胞に直接または間接的に働き、疾病の状態を改善するというやり方で、結腸直腸腫瘍細胞中の目的遺伝子の方向付けに使用することができる。目的遺伝子はさらに、リポーターまたはマーカー蛋白（例えば、蛍光蛋白（例えばGFP）もしくは抗原、または酵素（例えば、β-ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールトランスフェラーゼ）をコードしていて診断的価値を有することもある。

或る態様では、CRAdまたは腫瘍溶解性ベクター（腫瘍溶解性条件付複製アデノウイルス）を、A33プロモーターDNA配列のフラグメントにより調節されるE1A蛋白の遺伝子を含むアデノウイルスを用いて調製する。有利なことに、CRAdが結腸腫瘍細胞中のE1Aの発現を制御して、関係するウイルスの複製により細胞の溶解および排除を引き起こす。有利なことに、後の実施例に示すような、E1A遺伝子を含むCRAdは、それらの発現が、主に腫瘍細胞で発現されるプロモーターにより制御されるため、正常な細胞では溶解活性が低下している。より一般的には、CRAdは、必要とされる組織または細胞型において活性となるプロモーターを有するE1A遺伝子の発現を調節するような方法でアデノウイルスゲノムを修飾することにより組み立てられる、「新世代」ベクターと呼ばれてきた。全てのウイルスのオープンリーディングフレームが除去されたウイルスベクターが報告されており、それを本発明で使用することができる（Fisher et al., Virology 217:11-22, 1996を参照されたい）。本組み立て物中のウイルスIL-10の同時発現は、アデノウイルス抗原に対する免疫反応を阻害し得る（Qin et al., Human Gene Therapy 8:1365-1374, 1997）。

目的遺伝子は、診断的にまたは治療的に有効な任意の遺伝子であってよい。より具体的には、目的遺伝子は、アデノウイルス遺伝子（例えば、E1A遺伝子またはアデノウイルスゲノムのE3領域）、自殺遺伝子またはプロアポトーシス蛋白をコードしている遺伝子（例えば、hsv-TK、Bak、Bax、BiK、SIVA、Par-4、Bcl-2のようなチミジンキナーゼ、またはカスパーゼ）、腫瘍壊死因子遺伝子、またはインターロイキン（例えば、IL-10、IL-12またはIL-23）であってよい。興味の持たれるその他の遺伝子には、腫瘍抑制遺伝子、例えばp53、ならびにp202およびPEA3がある。興味の持たれるその他の遺伝子は、プロドラッグを代謝する酵素をコードしている。興味の持たれるその他の遺伝子は、毒性蛋白（例えばリシン）をコードしている。

目的遺伝子は、天然に存在するまたは野生型蛋白をコードすることができ、その蛋白の生物活性変異体をコードしているかも知れない。A33調節配列の場合のように、目的遺伝子の配列は、診断アッセイまたは治療に有用な程度に機能する蛋白をコードしている限り、様々である。目的遺伝子は、1またはそれ以上のヌクレオチドの付加、除去、または置換のため、野生型とは相違していることがある。置換が施されている場合、それはコードされているアミノ酸残基を変化させることもあれば変化させないこともある。目的遺伝子の生物活性変異体の配列は、対応する野生型配列と、少なくとも50%一致し得る（例えば、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%一致する）。対応する蛋白もまたそのような程度まで相違し得る。例えば、目的遺伝子は、対応する野生型蛋白と、少なくとも50%（例えば、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%）一致する蛋白をコードし得る。目的遺伝子は、ウイルス蛋白またはその他の起源の蛋白をコードし得る（例えばヒト蛋白）。

E1Aは、感染後に初期領域1A(E1A)で転写される最初のウイルス遺伝子であるため、このように命名された。E1A一次転写物は、差別的スプライシングによりプロセシングされて沈降係数13S、12S 11S、10S、および9Sを有する5つの異なるメッセージを生成し、本組成物は、E1A一次転写物に転写される任意の配列を包含し得る。E1A蛋白、特に289Rおよび243Rの主要な蛋白は、感染した細胞においてウイルスおよび細胞の両遺伝子の転写を調節する。E1A mRNA転写物の構造およびE1A蛋白の保存領域の位置は当分野で知られている。様々なヒトおよびサルアデノウイルス血清型のE1A配列の比較が、保存アミノ酸相同性をもつ3つの領域を同定した。Ad5において、アミノ酸40-80間に保存領域1（CR1）が、アミノ酸121-139間にCR2が、そして残基140-188間にCR3がマッピングされており、これは13Sユニーク領域にほぼ一致している。E1A遺伝子の生物活性変異体を発現させようと決めた場合、この性質の情報が、その決定に情報を与える。これらの特別な配列の、進化の際における保存は、それらがE1Aの機能にとって重要であり（但し、他の領域が少なくとも同じように重要であるという可能性を制限するものでは決してない）、そのため変異体配列中に維持されているという事を示唆している。

E1A蛋白は、プロリンに富み、酸性であり、そして核に局在する。迅速な核局在化は、このポリペプチドのカルボキシ最末端にある極めて塩基性のペンタペプチドシグナル配列（Lys-Arg-Pro-Arg-Pro）によって仲介される。したがって、E1Aシグナル配列をコードしている配列を包含または保持することが望まれるかも知れない。プロリン含有量が高いことにより課せられる構造制約は、E1A蛋白における実質的な二次構造の形成を制限する。細菌により生成されたE1A蛋白の極端な熱安定性（これは、5分間煮沸した後でさえ顕著な転写活性化活性を保持する）は、E1Aが活性なコンホメーションに容易に再折りたたみされるか、またはE1Aがランダムコイルとして機能することを示唆している。生物活性を完全に崩壊させることなく大幅な除去および挿入を寛容するE1A蛋白の驚くべき能力は、E1Aが、周囲の配列から比較的独立した一連の小さなモジュラードメインであるという概念を導いた。既知の活性な除去または挿入突然変異体が、本配列によって発現され得る。

一般に、いかなるコンセンサス配列も保持され得る（但し必ずしもその必要がある訳ではない）。例えば、コンセンサス亜鉛フィンガーモチーフを有する潜在的金属結合ドメイン（Cys-Xaa₂-Cys-Xaa₁₃-Cys-Xaa₂-Cys）が、E1A 289R蛋白のユニーク領域内に同定されている。より大きなE1A蛋白は単一の亜鉛イオンに結合し、予想されるように、この領域を欠く小さい方のE1A蛋白は結合しない。このモチーフ内部にある4個のシステインのうちいずれかがグリシンに置換されると、E1AがZn²⁺に結合する能力が廃絶されるのみならず、トランス活性化活性の喪失をもたらすことから、この構造は、E1Aによる転写活性化に必須であると思われる。

翻訳後修飾された目的の異種遺伝子によりコードされている生成物内部の残基は、保存の標的とされることもある。例えば、目的の異種遺伝子がE1Aをコードしている場合、燐酸化されるセリン残基の保存が望まれるかも知れない。E1A生成物の翻訳後修飾は、セリン残基89、132、219およびことによると96および231に起こる燐酸化に限定される。しかしながら文献は、燐酸化がE1A活性を殆ど調節しないことを示唆している。
アデノウイルスE1Aは、網膜芽腫腫瘍抑制蛋白およびその類縁蛋白ならびにp300およびCBP転写コアクチベーターと相互作用して、細胞周期の進行を調節解除し、その結果p53安定化と最終的にはp53依存性のアポトーシスを導く、広く研究されている小さなDNA腫瘍ウイルス癌蛋白である。p53欠失細胞において、Bcl-2ファミリーの成員であるBAXおよびBAKはp53非依存性アポトーシスを促進する。より詳細には、E1Aは、BAK調節因子MCL-1のダウンレギュレーションおよびこれに続くプロアポトーシス性BAKの遊離によってBAK依存性アポトーシスを促進し、それがBax依存性アポトーシスを導く。さらに、E1Aは、c-FLIP-short発現を弱めることにより、腫瘍壊死因子αで仲介されるカスパーゼ-8の活性化を増強し、それがサイトカインTNF-αに対して細胞を感受性とし、そのようにしてp-53非依存性アポトーシスを促進する（Cuconati et al., Genes Dev. 17:2922-2932, 2003）。故にE1A発現は、細胞の増殖と、多くのp-53依存性および非依存性経路を介したその後のアポトーシスを誘発すると考えられる。上記のように、本配列は、異種E1A遺伝子（またはその生物活性変異体）をコードしている配列のみならず、他のプロアポトーシス遺伝子をコードしている配列をも包含し得る。p53経路にあるこれらのうち1またはそれ以上が包含され得る。

所望により、E1Aをコードしているベクターの有効性および特異性を改善するために当分野で既知の戦略を使用することもできる。例えば、ウイルスベクターを使用する場合、E1A遺伝子以外の遺伝子を部分的または完全に除去することができる。或いは、またはこれに加えて、E1Aを突然変異させることができる。例えば、E1B-55kDaまたはE1B-19kDaをコードしている遺伝子を除去できる（米国特許No.5677178をも参照されたい）。或いは、またはこれに加えて、E1Aを包含する幾つかのウイルス遺伝子を過剰発現させることができる。アデノウイルス致死蛋白（ADP）の過剰発現は、ウイルスの伝搬および腫瘍溶解効率を亢進し得る。したがって、本発明に係る配列および／またはベクターは、野生型ウイルスゲノム（例えばアデノウイルスゲノム）または操作されたウイルスゲノム（例えば、腫瘍細胞における、ウイルス複製および細胞死の促進に必要でない1またはそれ以上のウイルス遺伝子産物を移動させ、除去し、突然変異させ、または操作して、有効性を改善した、アデノウイルスゲノム）を包含し得る。

本組み立て物は、癌細胞または腫瘍特異性を示し；正常な細胞または組織ではあまり複製せず（そして／または細胞または組織に対して非毒性であり）；そして、複製および細胞殺滅に関して極めて有効であるため、条件付き複製をする腫瘍溶解性ウイルスと称することができる。条件付き複製をする腫瘍溶解性アデノウイルスは、癌の遺伝子治療の分野において有望である（Yu et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 4:435-43, 2002; Post et al., Oncogene 22:2065-2072, 2003; Li et al., Mol. Cancer. Ther. 2:1003-1009, 2003; およびBauerschmitz et al., Mol. Ther. 14:164-174, 2006）。本明細書に記載の組成物は、或る特定のメカニズムによって働くものに限定される訳ではないが、腫瘍または悪性細胞の破壊は、例えばプログラムされた細胞死（アポトーシス）および／または壊死性細胞死を包含する細胞死の結果として起こり得る。複製しつつある腫瘍溶解性アデノウイルスは、近傍の腫瘍または悪性細胞に伝搬し、感染し、そしてそれらを破壊するが、正常または非癌性もしくは非悪性細胞は影響を受けないままである。

本発明に係る腫瘍溶解性アデノウイルス、アデノウイルスE1A遺伝子、またはその生物活性変異体は、異種プロモーター（例えば、通常、ウイルスゲノムにおいてE1Aに関連せず、結腸癌細胞において差別的に発現される遺伝子であるA33に通常関連するプロモーター）と機能的に結合することができる。一般に、遺伝子およびプロモーターは、プロモーターがその遺伝子の発現を促進する時、機能的に結合している。例えば、プロモーターが遺伝子コード配列の開始部位より上流に位置しており、その遺伝子が、プロモーターの不在時よりも大幅に発現される時、そのプロモーターは当該遺伝子に機能的に結合しており、そして／またはそれが遺伝子発現を促進すると言うことができる。本件においては、E1A遺伝子が異種プロモーターの制御下に発現される場合、E1A発現は、プロモーターがない場合よりも大きく、そしてE1A自身のプロモーターがある場合よりも大きくなる場合もあれば大きくならない場合もある。

宿主細胞中への核酸（例えばDNA配列）の導入は、宿主細胞内で複製可能な任意のベクターまたは組み立て物を用いて実施できる。本方法にとって好適なベクターには、プラスミド、コスミド、人工染色体（例えば、BACまたはYAC）、DNAウイルス、レトロウイルス、および単離されたヌクレオチド分子がある。移動はリポソームを使用して行うこともでき、本発明に係る核酸配列を内包するリポソームもまた本発明の範囲内にある。

ウイルスが遺伝物質を或る細胞から別の細胞へと移動させる容易さが、遺伝子ベクターとしてそれらを使用することに繋がっている。一般に、癌治療にアデノウイルスを包含するウイルスを使用することに関心が持たれており、この話題に関して多くの論文を入手できる（例えば、Dobbelstein, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 273:291-334, 2004を参照されたい）。理想的には、このようなウイルスは、感染を受けた腫瘍細胞を溶解し、そして／または感染を受けた腫瘍細胞に対する宿主の免疫反応の増強を引き起こす。好ましくは、この細胞破壊反応は癌細胞を標的とし、非悪性もしくは非癌性細胞または組織に対しては毒性が低い（Ring, J. Gen. Virol. 83:491-502, 2002）。本発明者等は、非悪性もしくは非癌性細胞または組織を「正常」もしくは「健康な」細胞または組織と称する。腫瘍溶解性アデノウイルスは複製能を保持しており、このことは、アデノウイルス組み立て物の有効用量を維持する際に有益となり得る（Dobbelstein、上記）。アデノウイルスは、上皮細胞を包含する膨大な数のヒト細胞型に感染し、それは結腸癌のみならず他の多くの型の悪性腫瘍を引き起こし得る。アデノウイルスはさらに、高力価にまで増殖させるのが比較的容易であり、ウイルス組換え体の創成が良好に確立されている。最後に、このウイルス型については既に、その操作を容易にする数多くの基礎的研究が存在している。アデノウイルスを修飾および増幅するための様々なアプローチが当分野で知られており、Dobbelstein（上記）を含む種々の論文に論評されている。

記載のように、本発明に使用できるDNAウイルスの一例がアデノウイルスである。ヒトアデノウイルスには40以上の周知の血清型があり、Ad5アデノウイルスが、本発明におけるウイルスベクターとして特に好ましいが、Ad5カプシドおよび／または修飾された線維、例えばアデノウイルス3型カプシドおよび／またはRGD線維を却下してはならない。
プロモーター配列、目的遺伝子、およびその他任意の本明細書に記載のエレメントを含むものを包含する、適当なベクターの組み立てを、標準的な結合、制限、およびクローニング技術（これらは当分野で周知である）を用いて達成することができる。特定部位のDNA部分または配列を、供給者に指示された条件の下で、およそ3-16時間にわたる適当な制限酵素による処理を用いて取得する。一般に、制限結果は、TAE溶液（40mMトリアセタート、2mM Na₂EDTA・2H₂O、pH8.5）中のアガロースゲル（0.8-1.6%）で、エチルブロミドを利用した電気泳動分離によって確認し、トランスイルミネーター（Ultraviolet products Inc., Upland, CA）中のUV光で可視化できる。結紮は、供給者（New England Biolabs Inc., Beverly, MA）のプロトコルに従い、バクテリオファージT4 DNAリガーゼを用いて実施できる。挿入物：ベクター比1:1〜3:1を使用し、以下の式を用いてフラグメント間の比率を算出する：

ベクター組み立て物において、迅速試験により、外来DNAが組み込まれているベクターを、修飾されていないベクターから識別できることが有利である。一般に、細胞を適当な培地で増殖させる時、その発現が、形質転換された細胞に同定可能な表現型を付与する遺伝子を含む、既知のマーカー系がある。β-ガラクトシダーゼ遺伝子は、例えばクローン中で検出可能な遺伝子であり、X-galを伴うプレート上で青色の表現型を示す。このように、目的遺伝子および本明細書に記載のその他任意のエレメントに加えて検出可能なマーカーをコードしている遺伝子を、本発明に係る配列および／またはベクター中に組み込むことができる。

ウイルスベクターを包含する発現ベクターの組み立ておよび使用についての指針を提供する、入手可能な文献は多数ある。例えば、アデノウイルスおよびパポバウイルスの生物学についての一般的な説明をVirology（eds. Fields and Knipe, Raven Press, New York, NY）に見いだすことができる。他のアデノウイルス血清型を使用することもできるが、アデノウイルス5型は、E1Aウイルス遺伝子領域およびその他のウイルス遺伝子の、ウイルスによりコードされているポリペプチドのウイルスポリヌクレオチドのヌクレオチド付番慣例およびアミノ酸付番のための一般的な基準点を提供する。アデノウイルス2型は、E1bウイルス遺伝子領域およびその他のウイルス遺伝子領域の付番慣例のための好都合な基準を提供する。当業者は、他のアデノウイルス血清型における対応位置も容易に同定できるであろう。

幾つかの種類のアデノウイルスのDNA配列がGenbank（登録商標）から取得できる。アデノウイルスDNA配列は、現在同定されている41のヒトアデノウイルスタイプのいずれからも取得できる。種々のアデノウイルス株がAmerican Type Culture Collection（Manassas, VA）から、または幾つかの商業的および学際的供給源から要請によって入手できる。目的とする異種遺伝子を任意のアデノウイルスベクター中に組み込み、標準的なデリバリープロトコル（例えば、CFTRまたはその他の遺伝子をベクター中に導入するためにかつて用いられた方法により）を用いて発現させることができる。アデノウイルス配列の選択された部分、目的遺伝子に隣接する5’および3’ AAV ITR配列、およびその他の常套的ベクター調節エレメントを含むアデノウイルスカプシドによって表されるハイブリッドアデノウイルス-AAVベクターもまた使用できる（例えば、Wilson et al., WO 96/13598を参照されたい）。本発明方法において有用となり得る、アデノウイルスおよびハイブリッドアデノウイルス-AAV技術に関するさらなる詳細な指針については、WO 94/28938、WO 96/13597、WO 96/26285、およびそれらに引用されている参考文献を参照できる。

前記のように、(1) 癌細胞または腫瘍特異性；(2) 正常細胞または組織における僅かな複製および／または毒性；(3) 極めて効率的なウイルス複製および殺滅、を促進するために、アデノウイルス遺伝子の発現または転写を制御、調節、促進、転写調節、転写制御、または転写促進する戦略として、標的癌細胞中で差別的にアップレギュレートされる腫瘍特異的異種プロモーターを腫瘍溶解性アデノウイルス中に組み込んで、条件付き複製を行う腫瘍溶解性アデノウイルスを作製する。正常細胞におけるウイルス複製および／または毒性は僅かであるが、感染したまたは暴露された細胞の1-20%に起こり得、患者によって変わり得る。或いは、ウイルス複製および／または毒性は、感染したまたは暴露された細胞の1-15%；1-10%；1-5%；1-3%；1%；および1%未満に起こり得る。

本発明に係る配列および／または発現ベクターは、例えば界面活性剤、適当な担体、またはデリバリー媒質を含み得る医薬組成物として調合できる。次いでこの医薬組成物をキットの一部として組み込むか、パッケージ化することができる。このキットは、当該医薬組成物の投与に必要な任意のデリバリー器具および使用説明書を含むことができる。

本発明配列および発現ベクターの作製方法もまた本発明の範囲内にある。その方法は、(a) 標的癌細胞において差別的に調節される異種プロモーターに機能的に結合した目的遺伝子（例えばアデノウイルス遺伝子）を提供し、そして、(b) その目的遺伝子を発現ベクター（例えば、アデノウイルスバックボーンまたは組み立て物）中にクローニングする、という工程を包含できる。この異種プロモーターを、配列番号5および6で示されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅させることができる。この反応の生成物は、長さ412塩基対でA33プロモーターを含むPCR生成物を含み得る。アデノウイルス遺伝子またはその任意の生物活性等価物を取得するために、明確な反応を利用でき、ここで、このアデノウイルス遺伝子はアデノウイルスE1A遺伝子であり、このE1A遺伝子は、単離されたオリゴヌクレオチド配列番号9および10を用いてHEK293細胞から増幅される。この反応のPCR生成物は、アデノウイルスE1A遺伝子のコード領域を含む1072塩基対フラグメントであり得る。標的癌細胞またはその任意の生物活性等価物において差別的に調節される腫瘍特異的異種プロモーターを、異種プロモーターが目的遺伝子の発現を制御できるような位置で、アデノウイルス組み立て物中にクローニングすることができる。調節配列は、目的遺伝子（例えばアデノウイルス遺伝子）の発現を調節（例えば、転写調節）または促進（例えば、転写促進）することによって、目的遺伝子を「制御」することができる。調節配列および目的遺伝子の間には介在配列があるかも知れない。典型的には、調節配列は目的遺伝子の上流に位置する。

本発明はさらに、宿主細胞で外来DNAを発現させる方法を提供する。この方法は、本明細書に記載の調節配列を有するDNA配列または発現ベクターおよびそれに機能的に結合した目的遺伝子を宿主細胞中に導入することによって実施できる。発現のためには、細胞を、生存性を維持し、目的遺伝子の発現を支持するのに好適な条件下に維持しなければならない（例えば、生理的条件、または細胞の培養に典型的に用いられる温度および湿度の条件）。

癌を治療する方法は、治療を必要とする対象または患者（例えば人間の患者）に、本明細書に記載の抗癌組み立て物（例えば、E1Aのようなアデノウイルス遺伝子が、標的癌細胞（例えばA33）中で差別的に調節される異種プロモーターによって調節されるアデノウイルスベクター）を投与することを含み得る。治療を必要とする対象または患者は初期または進行癌を有するか、または癌を発症する危険性があるかも知れない。この患者または対象は、良性または悪性の腫瘍を有し得る。その癌は、A33が発現される任意の型であってよい（例えば、結腸直腸癌または胃癌）。この対象または患者はさらに、転移した結腸直腸癌または胃癌を有するかも知れない（例えば、転移性肝疾患を伴う癌）。上の全ての例における対象または患者は、ヒト以外の哺乳動物であってよい。上の全ての例における対象または患者はヒトであってもよい。

本発明の医薬組成物は、例えば経口、静脈内、鼻腔内、眼科的に、そして非角膜的に、といったような幾つかの経路を介して投与できる。この組成物は例えば胃管または結腸鏡を介して胃または結腸に局所的に投与でき、また、肝内動脈のような動脈内に注射することもできる。

アデノウイルスを含む医薬組成物を包含する本組成物は、患者への治療的および診断的投与のために調合できる。予防目的の治療のためには、薬理学的有効用量の当該ベクター（例えば、アデノウイルスのようなウイルス）を含む無菌組成物を、新生物状態の治療のため、人間患者または人間以外の患畜に投与する。この組成物は、ベクターおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。使用できる水溶液の例は、例えば水、緩衝化された水、生理食塩水、緩衝食塩水（例えば、燐酸緩衝化食塩水）、および0.3%グリシンを包含できる。これらの溶液は、好ましくは無菌である。本組成物はさらに、生理的条件（例えばpH）に近づけるために必要な薬学的に許容される補助物質を含むことができる。pH調節剤および緩衝剤には、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムがある。細胞のアデノウイルス感染を増強する賦形剤もまた含むことができる。アデノウイルスベクターを包含するベクターは、リポソームまたは免疫リポソームデリバリーによって新生物細胞にデリバリーされ得る。

この医薬組成物を投与するための有効な用量およびスケジュールは経験的に決定でき、そのような決定は当業者の技術の範囲内にある。一般にアデノウイルスは、患者の体重1kgあたりおよそ1x10²-10²⁰、1x10³-10¹⁵、1x10⁴-10¹⁴、1x10⁴-10¹²、1x10⁴-10¹⁰、1x10⁴-10¹⁰、1x10⁴-10⁸、1x10⁴-10⁶粒子形成単位（PFU）の間、または約0.001〜100、0.001〜90、0.001〜80、0.001〜70、0.001〜60、0.001〜50の範囲の感染多重度（MOI）の用量で投与できる。ポリヌクレオチド（即ち、ウイルスとしてパッケージングされていない）として投与される場合は、約0.01g〜約1000gのアデノウイルスベクターを投与できる。有効となるために投与されねばならない用量は、例えばその哺乳動物、治療しようとする癌の種類、癌の病期、腫瘍の大きさ、腫瘍の位置、癌の増殖または転移の程度、腫瘍の生物学的部位または身体の区画、ウイルスの株、投与経路、その哺乳動物に施されている他の薬物、物質、治療があればその存在、および目的とする異種遺伝子の毒性に応じて変わるであろう。本組成物は、1またはそれ以上の回数で、または複数の用量で投与され得る。この組成物の複数用量を長期にわたり投与することが必要となることもある（例えば、毎日、毎週、隔週、または隔月で、数週間、数ヶ月、または数年にわたり）。そのような複数用量の間の最適な間隔は経験的に決定できる。本組成物の投与は、患者の健康が改善されるまで継続すべきであり、回復するまで継続することができる。本組成物は、免疫抑制剤と共に、または、ウイルスによる望ましくない免疫反応を減弱させるため、血液からアデノウイルスを除去する免疫吸着法（例えば免疫アフェレシス）と組み合わせて投与できる。

このウイルスは、哺乳動物に、注射（例えば、静脈内、病変内、腹腔内、皮下、筋肉内、内視鏡により、または肝臓内）により、局所もしくは局部注射で腫瘍部位に、または全身的に（例えば血流を介して）投与できる。当業者は、このウイルスを、鼻腔内、経口、直腸内、または局所適用を包含する（但しこれらに限定されない）数多くの投与用式で投与することもできると理解できるであろう。

いずれの本組成物も、第二の治療薬または治療との併用療法の一部として投与できる（例えば外科的手技または照射療法に関連して）。結腸直腸癌または胃癌の治療に適当であると考えられる、または転移の危険性を低下させるために投与される薬用物質と組み合わせた使用が最も好ましい。

本組成物は、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）インヒビターとの併用療法の一部としても投与できる。HDACインヒビターは、CAR発現をアップレギュレートし、そのようにして細胞内へのアデノウイルスの進入を促進すると証明されている（Wantanabe et al., Exp. Cell Res. 312:256-265, 2006）。例えば本組成物は、FR901228、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（SAHA（例えば、MK0638、およびボリノスタット）およびその他のヒドロキサム酸）、スベロイル ビス-ヒドロキサム酸、BML-210、デプデシン、HC毒素、ヌルスクリプト、フェニルブトラート、バルプロ酸、スクリプタイド、スプリトマイシン、スラミンナトリウム、トリコスタチンA（TSA）、APHA化合物8、アピシジン、酪酸ナトリウム、ピバロイルオキシメチルブチラート、トラポキシンB、クラミドシン、デプシペプチド、ベンズアミド（例えば、CI-994およびMS-27-275）、MGCD0103、NVP-LAQ-824、CBHA、JNJ16241199、ツバシン、A-161906、プロキサミド、オキサムフラチン、3-Cl-UCHA、AOE、CHAP31、およびCHAP50といったようなクラスIまたはクラスIIのHDACインヒビターと共に投与できる。

本発明は、本明細書に記載のものを包含する抗癌性組み立て物を含む組成物に対する患者の反応を予測する方法を含む。細胞を含む試料を患者から取得し（例えば、生検試料）、癌特異的組み立て物（例えば、A33調節配列および目的遺伝子を含むアデノウイルスベクター）に暴露する。第一段階では、A33調節配列と機能的に結合したリポーターまたはマーカー遺伝子の発現を検出することにより、細胞が、それが癌性であることを示すA33を発現するかどうかを決定できる。第二段階では、細胞試料を治療用組み立て物（例えば、A33調節領域がE1A遺伝子の発現を促進する、アデノウイルスベクター）に暴露し、細胞が増殖できる速度が低下するかどうか；細胞が死滅するかどうか；または細胞が運動性を低下させるかどうかを測定することにより、その患者が治療用遺伝子による処置に応答し易いかどうかを決定できる。この方法は、RT-PCR、マイクロアレイ、免疫ブロット遺伝子リポーターアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、血液検査、および緑色蛍光蛋白コード化組み立て物といったような技術によって容易にできる。

本明細書に記載の任意の配列またはベクターを、細胞培養アッセイまたは認可された疾病動物モデルで試験することができる。例えば、ヌードマウスを用いて結腸直腸癌または胃癌に対する与えられた配列および／またはベクターの効果を調べることができる。
本発明に係る組み立て物またはベクターは、適当な担体に運搬させて、注射、経口投与または局所的に、必要な時に患者に投与することができる。適当な担体は、水性、脂質、リポソーム性などとすることができる。

分散分析（ANOVA）を使用し、続いてルシフェラーゼおよびスフェロイドアッセイ、ならびにインビボ実験のデータ解析のためのテューキー検定を行った。0.05未満のP値を有意であると考えた。同様に、カプラン・メイヤー法に従って生存曲線を作製し、ログ・ランク検定の適用により、異なる群間の統計学的比較を実施した。

実施例
実施例1. A33抗原mRNA発現レベルおよびプロモーター活性
半定量的実時間ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を用いて10種類の異なる悪性または非悪性哺乳動物セルラインで、A33抗原mRNA発現レベルを分析した。

悪性セルラインは、3種のヒト結腸癌セルライン（LoVo（American Type Culture Collection(ATCC) Accession Number CCL-229）、T84（ATCC Accession Number CCL-248）、およびHT29（ATCC Accession Number HTBL-38））、2種のヒトメラノーマセルライン（A375N（A375（ATCC Accession Number CRL-1619）およびSB2から誘導））、および一つのヒト乳癌セルライン（T47D(ATCC Accession Number HTB-133)）を含んでいた。分析された非悪性セルラインは、一つのヒト結腸セルライン（CCD841（ATCC Accession Number CRL-1790））、2種類のヒト胎児肺線維芽細胞セルライン（WI-38（ATCC Accession Number CCL-75）およびHFL-1（ATCC Accession Number CCL-153））、および一つのウシ内皮細胞セルライン（BAEC（ATCC Accession Number CRL-1395））を含んでいた。

LoVo、HT29、およびT84は、10%牛胎児血清（FBS）；2.5U/ml ペニシリン；および2.5U/ml ストレプトマイシンを添加したDMEM/F12（1:1）（Invitrogen Corp, Carlsbad, California）で培養した。A375NおよびSB2は、DMEM（5g）；F12（5.35g）；NaHCO₃（2.425g）；アスコルビン酸（17.6g）；ピルビン酸（150mg）；ガラクトース（300mg）；グルタミン（292mg）；ストレプトマイシン（132.5mg）；ペニシリン（63.5mg）；インスリン 10mg/ml（0.5ml）；セレナイト35μg/ml（100μl）；10%牛胎児血清（FBS）；2.5U/mlペニシリン；および2.5U/ml ストレプトマイシンを含有するMEL培地で培養した。WI-38およびHFL-1は、10%FBSを含む高グルコースDMEM（Invitrogen）で培養した。BAECは、5%FBSを含む高グルコースDMEMで培養した。T47Dは、ウシインスリン（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis）を添加したDMEM/F12で培養した。CCD841は、DMEM（5g）；F12（5.35g）；NaHCO₃（1.5g）；アスコルビン酸（17.6g）；ピルビン酸（150mg）；ガラクトース（300mg）；グルタミン（292mg）；ストレプトマイシン（132.5mg）；ペニシリン（63.5mg）；インスリン 10mg/ml（0.5ml）；セレナイト35μg/ml（100μl）；トリヨードチロニン（100pM）；O-ホスホエタノールアミン（0.01mM）；エタノールアミン（0.01mM）；EGF（1ng/ml）；ウシアルブミン（0.5g/100ml）；transferring（0.01mg/ml）を含有する培地で培養した。

RT-PCR反応は標準的方法を用いて実施した。簡潔に述べると、Tri-reagent（Sigma-Aldrich）を用いてRNA 5μgを単離し、Superscript II逆転写酵素（Invitrogen）を用いて逆転写し、相補的DNA（cDNA）を作製した。次にこのcDNAを鋳型として利用し、オリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってA33抗原プロモーターおよびGAPDH cDNAを増幅した。A33抗原PCRオリゴヌクレオチドは配列番号2および配列番号3を含んでいた：

GAPDH PCRオリゴヌクレオチドは配列番号4および配列番号5を含んでいた：

配列番号2および3を合してA33抗原を増幅した。配列番号4および5を合してGAPDHを増幅した。初期変性工程（94℃で90秒間）、その後の30サイクルの変性（94℃で30秒間）、アニーリング（60℃で30秒間）、および伸張（72℃で30秒間）を使用してPCRを実施した。

A33抗原mRNA発現レベルを3つの独立した半定量的RT-PCR実験の平均値から算出し、対照であるGAPDHに対して正規化して本明細書に表す。

図1Aに示すように、分析された3種のヒト結腸癌セルライン（LoVo、T84、およびHT29）の各々で、異なるレベルのA33抗原mRNAが検出された。A33抗原mRNAもまた正常なヒト結腸CCD841セルラインで検出されたが、LoVoで観察されたレベルよりも9倍低いレベルであった。A33抗原mRNA発現は、分析された他の悪性および正常セルラインの各々においてはごく僅かであった。

これらの結果は、A33抗原mRNAはもっぱら結腸細胞で発現され、悪性結腸細胞では非常にアップレギュレートされていることを示唆している。
上記の観察をRT-PCR以外の技術を用いて支持するため、A33プロモーター転写活性を、以下のようなデュアルルシフェラーゼ遺伝子リポーターアッセイを用いて解析した。

A33抗原プロモーター（A33Pr）（本明細書では配列番号1と称する）の転写制御下にある、蛍ルシフェラーゼ（pGL3；Promega）の修飾されたコード領域を含む遺伝子リポーター組み立て物を、当分野で周知の分子生物学技術を用いて作製した。簡潔に述べると、公開されているA33抗原プロモーター配列（AF200626）中の転写開始コドンに対してヌクレオチド-105〜+307を含む412塩基対（bp）フラグメントを、下記のオリゴヌクレオチド配列番号6および配列番号7を用いてヒトリンパ球ゲノムDNAから増幅した（小文字のフォントは制限エンドヌクレアーゼ部位を示す）：

配列番号6および7を合し、A33Prを標準PCRを用いて増幅した。次に、前記のように各々配列番号6および7中のRE部位を認識するXhoIおよびBglII制限エンドヌクレアーゼ（RE）を用いてA33Pr PCR生成物を消化し、pGEM-Teasy（Promega Corp. Madison, WI）中にクローニングして、pGEM-A33と称する組み立て物を創成した。ユニバーサルプライマーSP6（配列番号8）およびT7（配列番号9）を用いる配列分析によってクローニングを確認し、A33Prがヌクレオチド49で始まりヌクレオチド460まで続いている配列番号10として示す。

その後、修飾されたルシフェラーゼコード領域のすぐ上流にあるBglIIおよびXhoI RE部位を用いてA33PrをpGEM-A33からpGL3へとサブクローニングし、得られたルシフェラーゼリポーター組み立て物をpGL3-A33と命名した。ユニバーサルプライマーP2（配列番号11）およびp3（配列番号12）を用いる配列分析によってクローニングを確認し、A33Prがヌクレオチド97で始まりヌクレオチド508まで続いている配列番号13として示す。

pGL3-A33を、ヒト結腸癌（LoVo、T84、およびHT29）、メラノーマ（A375N）、および乳癌（T47D）セルライン中にトランスフェクトすることにより、リポーターアッセイを実施した。簡潔に述べると、細胞を24ウェルプレートにウェルあたり4x10⁴細胞の密度で撒き、24時間インキュベートした。次に、0.8μgのpGL3-A33および0.1μgの対照リポーターpRL-CMV（Promega Corp. Madison, WI）を、製造者（Invitrogen）の指示に従ってLipofectamine 2000を用いて細胞中にトランスフェクトした。或いは、pGL3-A33の代わりに対照組み立て物である0.80μgのpGL3-Basic（Promega Corp. Madison, WI）（これは、ルシフェラーゼ遺伝子を含むが真核生物プロモーターまたはエンハンサーを欠いている）、または、pGL3-プロモーター（Promega Corp. Madison, WI）（これは、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にSV40プロモーターを含む）を使用した。トランスフェクションの46時間後に細胞を収穫し、Genios照度計（TECAN, Maennedorf, Switzerland）を使用してデュアルルシフェラーゼアッセイを実施した。3つの独立した実験から平均データを算出し、上記の対照プラスミドpGL3-Basicと比較して表した。

図1Bに示すように、A33Prは試験された3種類の結腸癌細胞において活性であり、最高活性はLoVo細胞で観察された。さらに、A33リポーター活性は、図1Aで観察されるA33 mRNA発現レベルと高度に一致した。A33Pr活性はメラノーマ（A375N）または乳癌（T47D）セルラインでは観察されなかった。

実施例2. アデノウイルスの組み立て
ヒトアデノウイルス発現系は、哺乳動物細胞におけるそれらの遺伝子導入および蛋白発現能力の故に、広く利用されており、それらの組み立てに要する方法およびプロトコルは当分野で周知である。

アデノウイルスの組み立ては、典型的には非ウイルスシャトルプラスミド中への目的遺伝子のクローニング、および、直線化されたアデノウイルス組み立て物を用いたパッケージングセルライン、例えばHEK293の内部への、直線化されたシャトルプラスミドの同時トランスフェクションを必要とする。その後、ウイルス組換えおよび増殖が1〜10日間にわたって起こる。ここに開発されたAV22ELと命名されたアデノウイルスは、このような標準技術を用いて組み立てられた。

本発明者等が使用した非ウイルスシャトルプラスミドは前記のpAdYPSYシャトルプラスミドを修飾することによって製造され、これは、E1およびE3領域を除去してラウスサルコーマウイルス（RSV）プロモーターおよびSV40ポリアデニル化シグナルに置き換えた、ヒト5型アデノウイルスの左端を含んでいる（Mariano et al. (2005) Cancer Research. 65:5123-5132）。まず、pADYPSY RSVプロモーター配列を、配列番号14（これは、SpeI、BclI、KpnI、NheI、MluI、BglII、EcoRV、ClaI、SnaBI、およびSalI RE部位を有する多重クローニング部位（MCS）である）に置き換えてpADYPSYのクローニング能力を高め、本発明者等がpAd-XPと命名した組み立て物を得た。

次に、β-グロビン停止コドンコード領域に対応する234bp配列をpAD-XP MCSにクローニングし、下流のエレメントをウイルスの転写調節機構から隔離した（Steinwaerder et al.(2004) Human Gene Ther. 15:995-1002）。このβ-グロビンインシュレーターを、下に示すオリゴヌクレオチド配列番号15および配列番号16を用いて増幅した。小文字のフォントは制限エンドヌクレアーゼ部位を示すことに留意されたい。

配列番号15および16を合してβ-グロビンインシュレーターを増幅し、得られたPCR生成物をSpeIおよびKpnI（これらは各々配列番号15および16において小文字のフォントで示された配列を認識する）で消化し、pAd-XP MCS中にクローニングしてpAd-I-XPを得た。プライマーpAd-センス（配列番号18）およびpAd-アンチセンス（配列番号19）を用いる配列分析によりクローニングを確認し、配列番号17として示す。

第三に、アデノウイルスゲノム内のヌクレオチド560〜1632に対応するアデノウイルスE1A遺伝子を、オリゴヌクレオチド配列番号20および配列番号21を用いて増幅した。

配列番号20および21を合してE1Aを増幅した。得られたE1A PCR生成物をTOPO-pCR4中にクローニングし、このクローニングを配列分析により確認し、配列番号22として示す。次に、E1AをpcDNA3（Invitrogen）中にクローニングし、E1A蛋白発現を、M73抗E1A抗体（Santa Cruz Biotechnology）を用いる免疫ブロッティングによりHEK293細胞において立証した。

次いでE1A組み立て物をBglIIおよびBamHIを用いてpcDNA3から切り取り、上記のpAd-I-XPおよびpAd-XPにあるBglII RE部位にクローニングした。このE1A組み立て物を、pAD-I-XPにクローニングしたβ-グロビンインシュレーターの下流にクローニングした。得られたプラスミドをpAD-I-XP-E1A（配列番号23）およびpAD-XP-E1A（配列番号24）と命名した。配列番号23はβ-グロビンインシュレーター（ヌクレオチド71〜ヌクレオチド314）およびE1A（ヌクレオチド344から始まる）を示す。

次に、A33Pr 配列番号1を、上記のpGEM-A33（配列番号10）から直接pAD-I-XP-E1Aにサブクローニングした。A33PrをMluIおよびBglIIを用いてpGEM-A33（配列番号10）から切り取り、E1Aのすぐ上流でpAD-I-E1A MCSにクローニングした。pAD-I-A33-E1Aと命名された最終組み立て物の発現カセットを図2Aに示す。pAd-センス（配列番号18）およびpAd-アンチセンス（配列番号19）を用いる配列分析によりクローニングを確認し、配列番号25として示す。配列番号25は、β-グロビン停止コドンコード領域（ヌクレオチド72〜ヌクレオチド314）；A33Pr（ヌクレオチド365〜ヌクレオチド765）およびE1A（およそヌクレオチド766から始まる）を示す。

次いでpAD-I-A33-E1A（配列番号25）を制限エンドヌクレアーゼFspIを用いて直線化した。かつてBett et al. (1994) PNAS. 91:pp.8802-6に記載されたように、ClaIで直線化されたアデノウイルス5型を用いて、直線化したpAD-I-A33-E1AシャトルプラスミドをHEK293中にトランスフェクトすることにより、アデノウイルスAV22ELを作製した。過去にLieber et al. (1996) J. Virol. 70:8944-60に記載されたように、生存ウイルスを精製した。配列番号18（本明細書では配列番号26として示す）および配列番号19（本明細書では配列番号27として示す）を用いてAV22ELを配列決定した。

AV22ELの粒子濃度をOD₂₆₀を用いて測定し、HEK293細胞での標準プラークアッセイを実施することにより50%組織培養感染用量（TC ID₅₀）を決定した。
漸増する感染多重度（MOI）のウイルスでLoVo細胞を形質導入することにより、AV22EL E1A発現を立証した。感染の72時間後に細胞溶解液を集め、M73抗体を使用する免疫ブロッティングによりE1A蛋白発現を確認した。

図2Bに示すように、E1Aは、AV22ELを用いて形質導入したLoVo細胞で効率的に発現された。さらに、AV22EL E1A発現レベルは、野生型アデノウイルス（Ad-WT）で検出されたレベルに匹敵するものであった。上記のクローニング戦略の要約を図3に示す。

実施例3. AV22ELのインビトロ腫瘍溶解活性の分析
AV22ELの腫瘍溶解能をインビトロ細胞毒性試験を用いて以下のように分析した。3種のヒト結腸癌セルライン（LoVo、HT29、およびT84）、2種のヒトメラノーマセルライン（SB2およびA375N）、1つのヒト乳癌セルライン（T47D）、1つのウシ内皮セルライン（BAEC）、2種のヒト胎児肺線維芽細胞セルライン（HFL-1およびWI-38）、および1つのヒト肝細胞癌セルライン（Hep-3B）を、ウェルあたり1x10⁴細胞の密度で24ウェルプレートに撒いた。翌日、細胞を、1〜1000の範囲のMOIでAV22ELまたはAd-WTに感染させた。感染の10日後にクリスタルバイオレットで細胞を染色し、撮影した。

図4Aに示すように、健康な細胞は明確なクリスタルバイオレット染色（暗色）で表される。逆に、生存性の低下した感染細胞は、低下したクリスタルバイオレット染色で表される（透明な壁）。

図4Aに示すように、AV22ELは3種の結腸癌セルラインの各々、特にLoVoおよびT84に対して極めて有効であった。しかしながら興味深いことに、AV22ELの有効性はHT29に対しては少なくとも2桁低かった。AV22ELは非結腸癌セルラインSB2、A375N、およびHep-3B細胞における細胞溶解反応をも促進したが、MOIが1000の場合のみであった。T47D、WI-38、HFL-1、またはBAECでは効果が見られなかった。対照的に、Ad-WTは、MOIが1において殆どの細胞に有効であった。

これらの結果は、AV22ELが結腸癌細胞において細胞溶解性であるが、メラノーマ、乳癌、または肝癌セルラインにおいてはそうでないことを示している。換言すると、AV22ELは結腸細胞において選択的に腫瘍溶解性である。興味深いことに、AV22ELの腫瘍溶解能は、実施例1に記載されたA33活性レベルに比例するように思われる。A33PrをコードしていないAd-WTは選択的でなく、全てのセルラインにおいて極めて細胞溶解性である。

AV22ELをさらに、CCD841およびFHC正常ヒト結腸細胞ならびにLoVo結腸癌細胞におけるさらなる細胞毒性試験を用いて試験した。前記のように細胞を撒き、100もしくは500のMOIのAV22EL、または100のMOIのAd-WTで形質導入した。感染の10日後、細胞を、位相差顕微鏡を用いて細胞毒性の形態学的徴候について分析した。

図4B、C、およびDに示すように、AV22ELはLoVo結腸癌細胞では細胞溶解性であったが（細胞が丸くなり、明らかに死滅または死にかけている）、試験された正常な結腸セルラインではそうでなかった（細胞は規則的な健康な形態を有している）。対照的に、Ad-WTは全てのセルラインにおいて極めて細胞溶解性であった。
これらの結果は図4Aと極めて整合性があり、AV22ELの選択的腫瘍溶解能をさらに裏付けるものである。

AV22ELを、緑色蛍光蛋白を発現しているT84結腸癌セルライン（濃い影付き）およびWI-38ヒト線維芽細胞を含む混合細胞集団において試験した。図4Eに示すように、AV22ELはT84細胞を選択的に殺滅したが（濃い影付きの上および下の図）、WI-38は殺滅しなかった。興味深いことに、いずれの細胞型もアデノウイルス感染を等しく許容した。対照的に、Ad-WTは両方の細胞型を排除した（最上部の図）。
これらの結果は、AV22ELは混合集団において全ての細胞に感染するものの、結腸癌セルラインに対してのみ腫瘍溶解性であることを示唆している。また、上記の結果は、AV22ELが結腸癌細胞に対して選択的に腫瘍溶解性であることを明白に立証している。

実施例4. 悪性および正常セルラインにおけるAV22ELの複製
AV22ELの選択性を確認する代替戦略として、選択された悪性および正常セルラインにおいてウイルス転写を分析した。簡潔に述べると、細胞をウェルあたり1x10⁵細胞の密度で6ウェルプレートに撒いた。翌日、細胞をMOI 50でAV22ELまたはAd-WTのいずれかに2時間暴露した。次にウイルス含有培地を取り除き、細胞を72時間培養した。次いでLi et al. (2001) Cancer Res. 61:6428-36に従ってウイルス力価を測定した。

図5に示すように、AV22EL力価は種々のセルラインで著しく相違し、これは、ウイルス複製の程度が異なっていることを示すが、最大力価は結腸癌LoVoおよびT84セルラインで観察された。逆に、AV22ELは正常結腸細胞、線維芽細胞、または内皮細胞においては複製しないように見受けられた。これらのデータは、図1Aに示したA33 mRNAレベルと極めて整合性がある。興味深いことに、AV22EL力価はA33陽性結腸癌HT29細胞およびA33陰性メラノーマSB2細胞において同程度であったが（A33発現レベルの定量については実施例1を参照されたい）、それは、β-ガラクトシダーゼコード化アデノウイルス（Ad-βgal）を用いて測定されるように、SB2細胞がアデノウイルス感染に対して極めて許容性であるという事実による。換言すると、SB2細胞について観察されるウイルス力価は高いウイルス取り込みによるものであって、ウイルス複製によるものではない。Ad-WTは試験された全ての細胞型で等しく発現された。
これらのデータはさらに、A33陽性結腸癌細胞に対するAV22ELの選択能力を支持するものである。

実施例5. 多細胞スフェロイドにおけるAV22ELの腫瘍溶解活性
無血管性腫瘍のインビボ環境を模した多細胞スフェロイドがインビトロ腫瘍モデルとしてしばしば使用される。故にAV22ELの特異性および腫瘍溶解活性を、ヒトメラノーマA375N細胞またはヒト結腸癌LoVo細胞より成る多細胞スフェロイドで分析した。

多細胞スフェロイドを、Lopez et al. (2006) Mol. Cancer Ther. 5:2503-11に従って半固体液体積層技術を用いて培養した。簡潔に述べると、細胞をウェルあたり1x10⁴細胞の密度で96ウェルプレートに撒き、各ウェルには培地200μL中の半固体1%(w/v)アガロースが入っていた。次に細胞を72時間、またはスフェロイドが形成されるまで培養した。次いでスフェロイドをMOI 10、100、または500のAV22ELまたはAd-WTに感染させた。その後スフェロイドを撮影し、感染の7日後に測定した。

図6Aおよび表1にそれぞれ示すように、AV22ELはA375NまたはHeLaスフェロイドの大きさを縮小させなかった。対照的にAV22ELは、LoVo結腸癌細胞スフェロイドの大きさを62%縮小させた。Ad-WTは、3種全てのセルラインについてスフェロイドサイズの非特異的縮小を惹起した。
これらの結果は、結腸癌細胞に対するAV22ELの選択的腫瘍溶解能をさらに裏付けるものであり、このウイルスが腫瘍様環境にある細胞に有効であることを証明している。

実施例6. AV22ELのインビボ腫瘍溶解活性
AV22ELのインビボ腫瘍溶解能を解明するため、5〜6週齢ヌードマウスの脇腹に、5.0x10⁶ヒト結腸癌LoVo細胞またはヒトSB2メラノーマ細胞のいずれかで構成される発癌性接種材料を皮下注射によって異種移植した。次に、キャリパー測定を利用して腫瘍体積を週に2回測定し、その体積が100mm³に達したならばマウスを無作為に分離した。次いでこれらの群をAV22EL（マウスあたり1x10¹⁰ウイルス粒子）または媒質（PBS）のいずれかで無作為に処置したが、これらはいずれも1、4、および7日目に腫瘍内注射によって投与した。しかる後、動物を感染の55日後まで調査した。

図7Aに示すように、AV22ELはこの実験期間中、LoVo腫瘍の体積を縮小させた。対照的に、AV22ELは、これらの細胞がアデノウイルス感染に対して極めて受容性であるという事実にもかかわらず、SB2腫瘍の体積を縮小させなかった。同様に、媒質対照で処置されたマウスでは、腫瘍体積の縮小は観察されなかった。

図7Bに示すように、LoVo腫瘍の体積縮小に加えて、AV22ELは動物の生存率も増大させ、40日目までは生存率100%、そして実験終了時（およそ55日間）まで生存率75%であった。対照的に、AV22ELはSB2腫瘍マウスを防御せず、この実験の43日目までに全ての動物が死亡した。同様に、全ての対照媒質動物はこの試験の43日目までに死亡した。LoVo腫瘍を持つAV22ELおよび媒質処置マウスの代表的画像を図7Cに示す。この実験期間中、消耗の徴候または視認できる毒性徴候を示した動物はなかった。
これらのデータは、AV22ELがインビボ結腸癌腫瘍に対して潜在的に腫瘍溶解性であると証明することにより、AV22ELのインビボ応用を支持するものである。

実施例7. AV22ELを用いる肝転移の治療
結腸癌の治療は常に転移疾患の治療を必要とする。故に、マウスにおいて肝転移を促進するインビボ系が開発された。次にこれらの動物を利用して、確立された肝転移の増殖に対するAV22EL全身投与の治療的可能性を決定した。

雄性および雌性ヌードマウスの門脈にヒト結腸癌LoVo細胞を注射することにより、肝転移を誘発した。接種の7日後、平行群のマウスを殺し、肝転移の徴候について調べた。肝転移を発症していることを確認した後、残りの生存動物を、最初のLoVo注射の7、10、および14日後に尾静脈注射で投与することにより、AV22EL、対照ウイルス（Ad-βgal）、または媒質（PBS）で処置した。次いで7日後にマウスを殺し、肝試料を、ヘマトキシリン-エオシンを含む常套的組織学的方法を用いて処理し、光学顕微鏡を用いて評価した。
AV22ELは、性別にかかわらず、処置動物11例のうち10例（90%）で肝転移性結節の出現を減少させた。対照的に、Ad-βgalまたは媒質対照での処置は、各々1/10（10%）および0/4（0%）の動物で結節の出現を減少させた。代表的な肝臓を図8Aに示す。巨視的観察は全てヘマトキシリン-エオシン染色を用いて確認し、代表的画像を図8Bに示す。投与されたアデノウイルスが肝転移を標的としたことを確認するため、平行してAd-βgal感染およびβ-ガラクトシダーゼ染色を使用した。

これらのデータは、間接的に投与された場合でもAV22EL療法が結腸癌細胞の転移を減少させるのに有効であることを証明することにより、AV22ELのインビボ適用をさらに支持するものである。

実施例8. AV22ELの毒性試験
図8Bに示すように、AV22ELへの長期暴露は肝毒性の形態学的徴候を何ら伴わない。にもかかわらず、AV22ELおよび対照で処置された動物における肝機能を評価する標準的生化学試験を実施した。表2に示すように、ASTおよびALPレベルの同時増加を伴う血清アルブミンレベル低下を特徴とする肝機能変化の特徴的徴候が、非処置、Ad-βgal、および媒質処置された転移動物に検出された。対照的に、AV22ELに暴露された動物は正常な血清アルブミン、ALT、およびALPレベルを呈し、これは正常な肝機能を示唆している。
この結果は、AV22ELが肝毒性がないだけでなく、ウイルスのインビボ適応を支持することを証明している。

実施例9. AV22ELおよび5-FUを用いる併用療法
併用療法は、癌患者における化学療法の有効性を改善する古典的アプローチである。結腸癌治療の治療戦略としての、一般的に使用されている化学療法薬である5-FU、およびAV22ELの併用の有用性を調査するため、さらなるインビトロ実験を行った。

ヒト結腸癌HT-29およびLoVo細胞を、2x10³細胞／ウェルの密度で96ウェル平底プレートに撒いた。翌日、細胞を、漸増するMOIのAV22EL単独、またはこれを前処置とする5μg/ml 5-FUとの組み合わせを用いて以下のように感染させた（例えば、図9Aおよび9B）。全細胞を24時間AV22ELに感染させた後、ウイルス含有培地を除去した。次いで、併用療法を必要とする細胞を、5-FUを含有する新鮮な培地でさらに4日間培養した。或いは、細胞を、漸増濃度の5-FU単独またはこれを前処置とするMOI 10のAV22ELとの組み合わせで処置した（例えば、図9Cおよび9D）。全細胞を24時間5-FUで処置した後、5-FU含有培地を除去した。次いで、併用療法を必要とする細胞を、4日間AV22ELに感染させた。細胞を、市販の比色MTT細胞生存性アッセイを用いて、処置の5日後に分析した。簡潔に述べると、0.5mg/ml MTTを含有する100μl PBS中で細胞を4時間インキュベートした。次にMTT溶液をDMSOに交換し、マイクロプレートリーダー（BIO-RAD）を用いて570nmの吸光度を測定した。全試料で6回の独立した実験を反復し、図9A、9B、9C、および9Dに示すようにデータをグラフにプロットした。

図9Aおよび9Bに示すように、AV22EL単剤療法（黒い棒）は、LoVoおよびHT-29細胞の両者に対して細胞溶解作用を誘発した。図4Aと一致して、LoVo細胞はHT-29よりもAV22ELに対してより感受性であり、各々MOI 500および10において細胞溶解作用が観察された。図9Cおよび9Dに示すように、LoVoおよびHT-29は5-FU単剤療法に対しても感受性である。しかしながら興味深いことに、5-FUに暴露する前にLoVoおよびHT-29細胞をAV22ELで処置すると、個々の治療の細胞溶解作用が著明に改善された。さらに、この効果は単に相加的なのではなく、相乗的であるように見受けられる。意外なことに、AV22ELと組み合わせた5-FUによる前処置は、個々の治療の細胞溶解作用を改善しなかった。さらに、AV22ELおよび5-FUを同時に加える併用療法を用いると、異なった効果は観察されなかった。
このように、A33抗原プロモーターは結腸癌細胞における選択的複製能を付与する。これらのデータは、AV22ELが抗癌治療薬として有効であるかも知れないことを示唆している。

本発明の幾つかの態様を記載してきた。にもかかわらず、本発明の本質および範囲を逸脱することなく、様々な修飾を施し得ることが理解できるであろう。例えば、マウスの微小ウイルス、H1ヒトレオウイルス、および水疱性口内炎ウイルス（VSV）を包含する、複製および細胞溶解性において幾らかの腫瘍選択性を示した他の型の天然ウイルスを使用することができる。これらのウイルスは当業者によって腫瘍溶解性ウイルスと呼ばれている。しかしながら殆どのウイルスは、例えば異種プロモーターを導入することにより、腫瘍選択性を示すよう遺伝的に修飾せねばならない。この技術の利点は、ウイルス選択性を、特定の細胞型および癌細胞を指向するよう改変できることである。したがって、他の態様もまた以下の請求項の範囲内にある。

LoVo、T84、HT-29、CCD841、A375、SB2、T47D、WI-38、HFL-1、およびBAECセルラインにおけるA33アッセイを示す棒グラフである。(A) A33 mRNAの発現を半定量的RT-PCRを用いて分析した。(B) A33抗原プロモーター活性をデュアルルシフェラーゼリポーター解析を用いて解析した。 非ウイルスpAD-I-A33-E1Aシャトルプラスミド発現カセットの図式的表示である。 非処置の、または、感染多重度（MOI）1〜500のAV22ELで形質導入した、またはMOI 500の野生型アデノウイルスで形質導入した、LoVo細胞由来のE1Aの免疫ブロットである。 アデノウイルスクローニング戦略の図式的概要である。 アデノウイルスクローニング戦略の図式的概要である。 アデノウイルスクローニング戦略の図式的概要である。 AV22ELおよび野生型アデノウイルスのインビトロ細胞溶解活性を示す写真である。(A) LoVo、HT-29、T84、SB2、A375N、T47D、BAEC、HFL-1、WI-38、およびHEP-3B細胞を24ウェル培養皿に撒き、0〜1000の範囲のMOIのAV22ELまたは野生型アデノウイルスで形質導入し、クリスタルバイオレットで染色した（暗い陰影）。 (B-D)CCD841、FHC、およびLoVo細胞を、非処置のままとするか、またはMOI 100の野生型アデノウイルスもしくはMOI 100および500のAV22ELで形質導入した。画像を位相差顕微鏡でとらえた。(E) T84（暗い陰影）およびWI-38細胞（明るい）を含む混合細胞集団を、非処置のままとするか、またはAV22ELの野生型アデノウイルスで形質導入した。画像を蛍光顕微鏡を用いてとらえた。 図5は、CCD841、LoVo、T84、HT29、A375N、SB2、T47D、BAEC、WI-38、およびHFL-1セルラインにおける野生型アデノウイルスまたはAV22EL力価を示す棒グラフである。 図6A-6Bは、非処置の、または、MOI 10、100および500の野生型アデノウイルスもしくはAV22ELで形質導入した、多細胞球体の大きさを示す写真である。(A) A375N細胞を含む多細胞球体。(B) LoVo細胞を含む多細胞球体。 AV22ELを用いたインビボマウス実験から得られたデータを示す折れ線グラフである。(A) 媒質対照で処置された、またはAV22ELで形質導入した、LoVoまたはSB2細胞腫瘍を持つ動物における、55日までの期間にわたり評価した腫瘍体積。 (B) 媒質対照で処置された、またはAV22ELで形質導入した、LoVoまたはSB2細胞腫瘍を持つ動物における、66日までの期間にわたり監視した生存率。 媒質対照で処置された、またはAV22ELで形質導入した、LoVo細胞腫瘍を持つ代表的マウスを示す画像である。 LoVo細胞転移性肝結節を示す写真である。(A) PBSで処置した、またはβ-ガラクトシダーゼをコードしているアデノウイルス（Ad-βgal）もしくはAV22ELで形質導入した動物を殺し、肝臓を摘出して撮影した。(B) 単離した肝臓をヘマトキシリン-エオシンで染色し、光学顕微鏡を用いて評価した。 AV22ELで形質導入した、または単剤療法もしくは併用療法のいずれかとして5-FUで処置した細胞における、MTT細胞生存性アッセイの結果を示す棒グラフである。（AおよびC）LoVo細胞。（BおよびD）HT-29細胞。

Claims (41)

1. 配列番号1を含む第一調節配列またはその生物活性変異体を含む単離されたDNA配列であって該調節配列またはその生物活性変異体は、目的とする異種遺伝子と機能的に結合している時、目的とする当該異種遺伝子の発現を促進することができる前記ＤＮＡ配列。
2. 生物活性変異体が配列番号1と少なくとも50%一致する配列を含む、請求項1に記載の単離されたDNA配列。
3. 生物活性変異体が少なくとも1個のヌクレオチドの挿入または除去によって配列番号1と相違している、請求項1に記載の単離されたDNA配列。
4. 生物活性変異体が少なくとも1個のヌクレオチドの置換によって配列番号1と相違している、請求項1に記載の単離されたDNA配列。
5. ストレス刺激により活性化された第二調節配列をさらに含む、請求項1に記載の単離されたDNA配列。
6. 第二調節配列が低酸素応答エレメントまたはストレス蛋白に本来付随しているプロモーターを含む、請求項5に記載の単離されたDNA配列。
7. 請求項1-6のいずれかに記載の単離されたDNA配列を含む発現ベクター。
8. 発現ベクターがプラスミド、コスミド、または人工染色体である、請求項7に記載の発現ベクター。
9. 発現ベクターがウイルスベクターである、請求項7に記載の発現ベクター。
10. ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項9に記載の発現ベクター。
11. 請求項7-10のいずれかに記載の発現ベクターを含む、単離された細胞。
12. 配列番号1を含む第一調節配列またはその生物活性変異体、およびそれに機能的に結合した目的とする異種遺伝子を含む核酸配列。
13. 生物活性変異体が配列番号1と少なくとも50%一致する配列を含む、請求項12に記載の核酸配列。
14. 生物活性変異体が少なくとも1個のヌクレオチドの挿入または除去によって配列番号1と相違している、請求項12に記載の核酸配列。
15. 生物活性変異体が少なくとも1個のヌクレオチドの置換によって配列番号1と相違している、請求項12に記載の核酸配列。
16. ストレス刺激により活性化された第二調節配列をさらに含む、請求項12に記載の核酸配列。
17. 第二調節配列が、低酸素応答エレメント、反応性酸素種応答エレメント、NFkB応答エレメント、ストレス蛋白に本来付随しているプロモーター、またはCArGモチーフを含む、請求項16に記載の核酸配列。
18. 目的とする異種遺伝子が治療遺伝子産物をコードしており、該核酸配列が所望により内部リボソーム進入部位（IRES）を含む、請求項12に記載の核酸配列。
19. 治療遺伝子生成物がアデノウイルス蛋白、プロアポトーシス蛋白、腫瘍壊死因子、またはインターロイキンである、請求項18に記載の核酸配列。
20. アデノウイルス蛋白がE1Aである、請求項19に記載の核酸配列。
21. プロアポトーシス蛋白がBak、Bax、SIVA、Par-4、Bcl-2、チミジンキナーゼ、またはカスパーゼである、請求項19に記載の核酸配列。
22. インターロイキンがIL-10、IL-12、またはIL-23である、請求項19に記載の核酸配列。
23. 請求項12-22のいずれかに記載の核酸配列を含む発現ベクター。
24. 発現ベクターがプラスミド、コスミド、または人工染色体である、請求項23に記載の発現ベクター。
25. 発現ベクターがウイルスベクターである、請求項23に記載の発現ベクター。
26. ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項25に記載の発現ベクター。
27. アデノウイルスベクターが腫瘍溶解性アデノウイルスである、請求項26に記載の発現ベクター。
28. 請求項23に記載の発現ベクターを含む単離された細胞。
29. 請求項23に記載の発現ベクターを含む医薬組成物。
30. 該組成物が経口投与、静脈内投与、または肝内動脈投与用に調合されている、請求項29に記載の医薬組成物。
31. アデノウイルス蛋白が血清型5、血清型3、または血清型35のアデノウイルスのものである、請求項19に記載の核酸配列。
32. 医薬の製造における、請求項12-22のいずれかに記載の核酸配列の用途。
33. 癌の治療用医薬の製造における、請求項12-22のいずれかに記載の核酸配列の用途。
34. 癌が結腸直腸癌である、請求項33に記載の核酸配列の用途。
35. 結腸直腸癌をもつまたは結腸直腸癌を発症する危険性があると考えられる患者を治療する方法であって、配列番号1を含む第一調節配列またはその生物活性変異体、およびそれに機能的に結合した抗結腸直腸癌物質をコードしている異種遺伝子を含む核酸配列を患者に投与することを含む方法。
36. 患者が人間であり、該方法が、治療を必要とする人間を同定する工程をさらに含む、請求項35に記載の方法。
37. 異種遺伝子がE1Aをコードしている、請求項35に記載の方法。
38. 核酸配列が発現ベクター中に入っている、請求項35に記載の方法。
39. 発現ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項38に記載の方法。
40. 患者を第二の治療レジメンに付すことを含む、請求項35に記載の方法。
41. 第二の治療レジメンが、5-フルオロウラシル（5-FU）、カペシタビン（Xeloda（登録商標））、ロイコボリン（LV；ホリン酸）、およびオキサリプラチン（Eloxatin（登録商標））より成る群から選ばれるアジュバント化学療法薬の投与を含む、請求項40に記載の方法。

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