JP2009535037A - 単離されたヒトa33プロモーターのdnaフラグメントおよび腫瘍細胞において異種遺伝子の発現を制御するためのその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、遺伝子および癌治療、より詳細には、例えば腫瘍細胞において目的遺伝子の発現を制御する能力を有する単離されたDNA配列に関するものである。より具体的には、本発明は、目的遺伝子に関連するA33プロモーターを含むベクターおよび医薬組成物および結腸直腸癌治療におけるそれらの使用に関するものである。
本発明は、癌治療、より詳細には結腸癌の治療に有用な腫瘍溶解性アデノウイルスに関するものである。
結腸直腸癌は悪性腫瘍による死亡の主たる原因の一つであり、結腸直腸癌患者のおよそ50%が原発癌の治療後5年以内に再発をみる。これらの症例の大多数において、この癌は平均余命がおよそ5年の慢性疾患となる。この疾病のより進行した病期では、肺、肝臓、卵巣および骨への転移があり得る(Taylor et al., Ann. Surg. Oncol., 9:177-185, 2002)。
本発明は、部分的には、本発明者等のA33抗原についての仕事に基づくものであり、この抗原は、結腸直腸癌および胃癌細胞を包含する或る種の悪性細胞において選択的にアップレギュレートされる。したがって本発明は、発現ベクター中に組み込まれ、結腸直腸癌および胃癌の診断および治療に使用され得るDNA配列、より一般的にはヌクレオチド配列を特徴とするものである。この配列は、結腸癌細胞特異的調節配列(例えば、A33抗原遺伝子配列の一部)を使用して異種蛋白(即ち、A33抗原以外の蛋白)の発現を促すものを包含する。この異種蛋白は、標識または診断マーカーとして有用なものであっても、また、治療薬として有用なものであってもよい。故に本発明の一つの目的は、特に腫瘍細胞、そしてとりわけ結腸直腸癌または胃癌細胞において目的とする遺伝子の発現を制御できる、プロモーター活性を有する単離されたDNA配列を提供することである。
調節配列(例えば、配列番号1を含む配列またはその生物活性変異体)は、目的とする異種遺伝子と機能的に結合でき、これらの核酸配列、それらを含む発現ベクター、ならびにそれらを含む細胞もまた本発明の範囲内にある。調節配列がA33配列の生物活性変異体を包含し得るように、それらもまた(またはその代わりに)目的とする異種遺伝子の生物活性変異体を包含し得る。目的とする異種遺伝子は、治療用遺伝子産物、例えばアデノウイルス蛋白(例えばE1A)、プロアポトーシス蛋白(例えば、Bak、Bax、SIVA、Par-4、Bcl-2、チミジンキナーゼ、またはカスパーゼ)、腫瘍壊死因子、またはインターロイキン(例えば、IL-2、IL-10、IL-12、またはIL-23)をコードすることができる。アデノウイルス蛋白がコードされている場合、それは任意のアデノウイルス血清型のものであってよい。同様に、アデノウイルスベクターが作製され使用される場合、それは任意の血清型のアデノウイルスであってよい(例えば、血清型2、血清型5、血清型3、または血清型35)。
本発明のさらなる側面は、ヒトA33遺伝子プロモーターの領域に対応するポリヌクレオチド配列 配列番号1は、他の何らかのプロモーター配列、例えば照射、低酸素、フリーラジカルなどに応答するための配列とさらに結合できるという事である。
本発明はさらに、宿主細胞において外来DNAを発現させる方法を提供し、その方法は、所望ポリペプチドをコードしている外来DNAまたはこのDNAが発現されるRNAと機能的に結合した、ポリヌクレオチド配列 配列番号1のDNAプロモーターモジュールを含む、本発明に係るDNAプロモーター分子または組換えウイルスベクターを含む、介入組み替え発現DNA組み立て物を、宿主細胞に導入することを含む。
本明細書で使用する「異種遺伝子」という語は、他のDNA配列と結合した、目的とするアミノ酸配列または蛋白をコードしているDNA配列を指し、この結合は天然には見いだされない。
塩基対-105〜塩基対+307のヒト遺伝子A33プロモーターの領域に対応する、ポリヌクレオチド配列 配列番号1、または、1もしくはそれ以上のヌクレオチドの挿入、置換、または除去によって修飾されたこのポリヌクレオチド配列のフラグメントまたは変異体(これは実質的に同等の機能を有する)を含む、単離されたDNA配列;
それに機能的に結合した、目的とする異種遺伝子の発現を制御できる、直上に記載された単離されたDNA配列に従う、プロモーター活性を有する配列;
他の任意のプロモーター活性に関連する、直上に記載された単離されたDNA配列に従う、プロモーター活性を有する配列(例えば、別のプロモーター配列、例えば照射、低酸素またはフリーラジカルに応答する配列);
(a) 上記のDNA配列に従う、プロモーター活性を有するDNA配列(例えば、プロモーター配列は腫瘍細胞における異種遺伝子の発現の制御に特異的である);および、
(b) このプロモーター配列に機能的に結合した少なくとも一つの異種遺伝子(ここでこのプロモーター配列は、この、少なくとも一つの異種遺伝子の発現を制御する(例えば、治療遺伝子));
を含む、組換えDNA発現の組み立て物;
腫瘍細胞が結腸腫瘍細胞である、本明細書に記載の組み立て物;
異種遺伝子が、E1A遺伝子、hsv-TK遺伝子のような自殺遺伝子、E3アデノウイルスゲノム領域、IL-10、IL-12またはIL-23のようなインターロイキンの遺伝子より成る群から選ばれる、本明細書に記載の組み立て物;
プロモーター活性を有するDNA配列がさらに、他の何らかのプロモーター配列(例えば、照射、低酸素またはフリーラジカルに応答する配列)を含む、またはそれに関連していることが見いだされている、本明細書に記載の組み立て物;
(i) 塩基対-105〜塩基対+307のヒトA33遺伝子プロモーターの領域に対応する、ポリヌクレオチド配列 配列番号1、または、1もしくはそれ以上のヌクレオチドの挿入、置換、または除去によって修飾されたこのポリヌクレオチド配列のフラグメントまたは変異体(これは実質的に同等の機能を有する)を含む、プロモーター活性を有するDNA配列;および、
(ii) プロモーター活性を有するこのDNA配列に機能的に結合した少なくとも一つの異種遺伝子(ここでこのプロモーター配列は、この、少なくとも一つの異種遺伝子の発現を制御する(例えば、治療遺伝子));
を含むベクター;
本明細書に記載の医薬組成物の有効量を患者に投与することを特徴とする、結腸直腸腫瘍に罹患している患者においてこの疾患を治療するための方法。
癌は、細胞の無秩序な増殖を特徴とする種類の疾患または異常として理解されるようになっている。無秩序な分割する細胞は、直接隣接する組織に侵入し、または遠隔部位に転移し得る。根本的な原因は、細胞の増殖および分化の調節に関わる蛋白をコードしている遺伝子の特別な小集団の発現に影響を及ぼすDNAの損傷であると考えられる。突然変異または過剰発減すると癌を引き起こす遺伝子はプロトオンコジーンとして知られ、突然変異遺伝子自身はオンコジーンである。
アデノウイルスE1Aは、網膜芽腫腫瘍抑制蛋白およびその類縁蛋白ならびにp300およびCBP転写コアクチベーターと相互作用して、細胞周期の進行を調節解除し、その結果p53安定化と最終的にはp53依存性のアポトーシスを導く、広く研究されている小さなDNA腫瘍ウイルス癌蛋白である。p53欠失細胞において、Bcl-2ファミリーの成員であるBAXおよびBAKはp53非依存性アポトーシスを促進する。より詳細には、E1Aは、BAK調節因子MCL-1のダウンレギュレーションおよびこれに続くプロアポトーシス性BAKの遊離によってBAK依存性アポトーシスを促進し、それがBax依存性アポトーシスを導く。さらに、E1Aは、c-FLIP-short発現を弱めることにより、腫瘍壊死因子αで仲介されるカスパーゼ-8の活性化を増強し、それがサイトカインTNF-αに対して細胞を感受性とし、そのようにしてp-53非依存性アポトーシスを促進する(Cuconati et al., Genes Dev. 17:2922-2932, 2003)。故にE1A発現は、細胞の増殖と、多くのp-53依存性および非依存性経路を介したその後のアポトーシスを誘発すると考えられる。上記のように、本配列は、異種E1A遺伝子(またはその生物活性変異体)をコードしている配列のみならず、他のプロアポトーシス遺伝子をコードしている配列をも包含し得る。p53経路にあるこれらのうち1またはそれ以上が包含され得る。
プロモーター配列、目的遺伝子、およびその他任意の本明細書に記載のエレメントを含むものを包含する、適当なベクターの組み立てを、標準的な結合、制限、およびクローニング技術(これらは当分野で周知である)を用いて達成することができる。特定部位のDNA部分または配列を、供給者に指示された条件の下で、およそ3-16時間にわたる適当な制限酵素による処理を用いて取得する。一般に、制限結果は、TAE溶液(40mMトリアセタート、2mM Na2EDTA・2H2O、pH8.5)中のアガロースゲル(0.8-1.6%)で、エチルブロミドを利用した電気泳動分離によって確認し、トランスイルミネーター(Ultraviolet products Inc., Upland, CA)中のUV光で可視化できる。結紮は、供給者(New England Biolabs Inc., Beverly, MA)のプロトコルに従い、バクテリオファージT4 DNAリガーゼを用いて実施できる。挿入物:ベクター比1:1〜3:1を使用し、以下の式を用いてフラグメント間の比率を算出する:
本発明に係る組み立て物またはベクターは、適当な担体に運搬させて、注射、経口投与または局所的に、必要な時に患者に投与することができる。適当な担体は、水性、脂質、リポソーム性などとすることができる。
実施例1. A33抗原mRNA発現レベルおよびプロモーター活性
半定量的実時間ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いて10種類の異なる悪性または非悪性哺乳動物セルラインで、A33抗原mRNA発現レベルを分析した。
上記の観察をRT-PCR以外の技術を用いて支持するため、A33プロモーター転写活性を、以下のようなデュアルルシフェラーゼ遺伝子リポーターアッセイを用いて解析した。
ヒトアデノウイルス発現系は、哺乳動物細胞におけるそれらの遺伝子導入および蛋白発現能力の故に、広く利用されており、それらの組み立てに要する方法およびプロトコルは当分野で周知である。
漸増する感染多重度(MOI)のウイルスでLoVo細胞を形質導入することにより、AV22EL E1A発現を立証した。感染の72時間後に細胞溶解液を集め、M73抗体を使用する免疫ブロッティングによりE1A蛋白発現を確認した。
AV22ELの腫瘍溶解能をインビトロ細胞毒性試験を用いて以下のように分析した。3種のヒト結腸癌セルライン(LoVo、HT29、およびT84)、2種のヒトメラノーマセルライン(SB2およびA375N)、1つのヒト乳癌セルライン(T47D)、1つのウシ内皮セルライン(BAEC)、2種のヒト胎児肺線維芽細胞セルライン(HFL-1およびWI-38)、および1つのヒト肝細胞癌セルライン(Hep-3B)を、ウェルあたり1x104細胞の密度で24ウェルプレートに撒いた。翌日、細胞を、1〜1000の範囲のMOIでAV22ELまたはAd-WTに感染させた。感染の10日後にクリスタルバイオレットで細胞を染色し、撮影した。
これらの結果は図4Aと極めて整合性があり、AV22ELの選択的腫瘍溶解能をさらに裏付けるものである。
これらの結果は、AV22ELは混合集団において全ての細胞に感染するものの、結腸癌セルラインに対してのみ腫瘍溶解性であることを示唆している。また、上記の結果は、AV22ELが結腸癌細胞に対して選択的に腫瘍溶解性であることを明白に立証している。
AV22ELの選択性を確認する代替戦略として、選択された悪性および正常セルラインにおいてウイルス転写を分析した。簡潔に述べると、細胞をウェルあたり1x105細胞の密度で6ウェルプレートに撒いた。翌日、細胞をMOI 50でAV22ELまたはAd-WTのいずれかに2時間暴露した。次にウイルス含有培地を取り除き、細胞を72時間培養した。次いでLi et al. (2001) Cancer Res. 61:6428-36に従ってウイルス力価を測定した。
これらのデータはさらに、A33陽性結腸癌細胞に対するAV22ELの選択能力を支持するものである。
無血管性腫瘍のインビボ環境を模した多細胞スフェロイドがインビトロ腫瘍モデルとしてしばしば使用される。故にAV22ELの特異性および腫瘍溶解活性を、ヒトメラノーマA375N細胞またはヒト結腸癌LoVo細胞より成る多細胞スフェロイドで分析した。
これらの結果は、結腸癌細胞に対するAV22ELの選択的腫瘍溶解能をさらに裏付けるものであり、このウイルスが腫瘍様環境にある細胞に有効であることを証明している。
AV22ELのインビボ腫瘍溶解能を解明するため、5〜6週齢ヌードマウスの脇腹に、5.0x106ヒト結腸癌LoVo細胞またはヒトSB2メラノーマ細胞のいずれかで構成される発癌性接種材料を皮下注射によって異種移植した。次に、キャリパー測定を利用して腫瘍体積を週に2回測定し、その体積が100mm3に達したならばマウスを無作為に分離した。次いでこれらの群をAV22EL(マウスあたり1x1010ウイルス粒子)または媒質(PBS)のいずれかで無作為に処置したが、これらはいずれも1、4、および7日目に腫瘍内注射によって投与した。しかる後、動物を感染の55日後まで調査した。
これらのデータは、AV22ELがインビボ結腸癌腫瘍に対して潜在的に腫瘍溶解性であると証明することにより、AV22ELのインビボ応用を支持するものである。
結腸癌の治療は常に転移疾患の治療を必要とする。故に、マウスにおいて肝転移を促進するインビボ系が開発された。次にこれらの動物を利用して、確立された肝転移の増殖に対するAV22EL全身投与の治療的可能性を決定した。
AV22ELは、性別にかかわらず、処置動物11例のうち10例(90%)で肝転移性結節の出現を減少させた。対照的に、Ad-βgalまたは媒質対照での処置は、各々1/10(10%)および0/4(0%)の動物で結節の出現を減少させた。代表的な肝臓を図8Aに示す。巨視的観察は全てヘマトキシリン-エオシン染色を用いて確認し、代表的画像を図8Bに示す。投与されたアデノウイルスが肝転移を標的としたことを確認するため、平行してAd-βgal感染およびβ-ガラクトシダーゼ染色を使用した。
図8Bに示すように、AV22ELへの長期暴露は肝毒性の形態学的徴候を何ら伴わない。にもかかわらず、AV22ELおよび対照で処置された動物における肝機能を評価する標準的生化学試験を実施した。表2に示すように、ASTおよびALPレベルの同時増加を伴う血清アルブミンレベル低下を特徴とする肝機能変化の特徴的徴候が、非処置、Ad-βgal、および媒質処置された転移動物に検出された。対照的に、AV22ELに暴露された動物は正常な血清アルブミン、ALT、およびALPレベルを呈し、これは正常な肝機能を示唆している。
この結果は、AV22ELが肝毒性がないだけでなく、ウイルスのインビボ適応を支持することを証明している。
併用療法は、癌患者における化学療法の有効性を改善する古典的アプローチである。結腸癌治療の治療戦略としての、一般的に使用されている化学療法薬である5-FU、およびAV22ELの併用の有用性を調査するため、さらなるインビトロ実験を行った。
このように、A33抗原プロモーターは結腸癌細胞における選択的複製能を付与する。これらのデータは、AV22ELが抗癌治療薬として有効であるかも知れないことを示唆している。
Claims (41)
- 配列番号1を含む第一調節配列またはその生物活性変異体を含む単離されたDNA配列であって該調節配列またはその生物活性変異体は、目的とする異種遺伝子と機能的に結合している時、目的とする当該異種遺伝子の発現を促進することができる前記DNA配列。
- 生物活性変異体が配列番号1と少なくとも50%一致する配列を含む、請求項1に記載の単離されたDNA配列。
- 生物活性変異体が少なくとも1個のヌクレオチドの挿入または除去によって配列番号1と相違している、請求項1に記載の単離されたDNA配列。
- 生物活性変異体が少なくとも1個のヌクレオチドの置換によって配列番号1と相違している、請求項1に記載の単離されたDNA配列。
- ストレス刺激により活性化された第二調節配列をさらに含む、請求項1に記載の単離されたDNA配列。
- 第二調節配列が低酸素応答エレメントまたはストレス蛋白に本来付随しているプロモーターを含む、請求項5に記載の単離されたDNA配列。
- 請求項1-6のいずれかに記載の単離されたDNA配列を含む発現ベクター。
- 発現ベクターがプラスミド、コスミド、または人工染色体である、請求項7に記載の発現ベクター。
- 発現ベクターがウイルスベクターである、請求項7に記載の発現ベクター。
- ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項9に記載の発現ベクター。
- 請求項7-10のいずれかに記載の発現ベクターを含む、単離された細胞。
- 配列番号1を含む第一調節配列またはその生物活性変異体、およびそれに機能的に結合した目的とする異種遺伝子を含む核酸配列。
- 生物活性変異体が配列番号1と少なくとも50%一致する配列を含む、請求項12に記載の核酸配列。
- 生物活性変異体が少なくとも1個のヌクレオチドの挿入または除去によって配列番号1と相違している、請求項12に記載の核酸配列。
- 生物活性変異体が少なくとも1個のヌクレオチドの置換によって配列番号1と相違している、請求項12に記載の核酸配列。
- ストレス刺激により活性化された第二調節配列をさらに含む、請求項12に記載の核酸配列。
- 第二調節配列が、低酸素応答エレメント、反応性酸素種応答エレメント、NFkB応答エレメント、ストレス蛋白に本来付随しているプロモーター、またはCArGモチーフを含む、請求項16に記載の核酸配列。
- 目的とする異種遺伝子が治療遺伝子産物をコードしており、該核酸配列が所望により内部リボソーム進入部位(IRES)を含む、請求項12に記載の核酸配列。
- 治療遺伝子生成物がアデノウイルス蛋白、プロアポトーシス蛋白、腫瘍壊死因子、またはインターロイキンである、請求項18に記載の核酸配列。
- アデノウイルス蛋白がE1Aである、請求項19に記載の核酸配列。
- プロアポトーシス蛋白がBak、Bax、SIVA、Par-4、Bcl-2、チミジンキナーゼ、またはカスパーゼである、請求項19に記載の核酸配列。
- インターロイキンがIL-10、IL-12、またはIL-23である、請求項19に記載の核酸配列。
- 請求項12-22のいずれかに記載の核酸配列を含む発現ベクター。
- 発現ベクターがプラスミド、コスミド、または人工染色体である、請求項23に記載の発現ベクター。
- 発現ベクターがウイルスベクターである、請求項23に記載の発現ベクター。
- ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項25に記載の発現ベクター。
- アデノウイルスベクターが腫瘍溶解性アデノウイルスである、請求項26に記載の発現ベクター。
- 請求項23に記載の発現ベクターを含む単離された細胞。
- 請求項23に記載の発現ベクターを含む医薬組成物。
- 該組成物が経口投与、静脈内投与、または肝内動脈投与用に調合されている、請求項29に記載の医薬組成物。
- アデノウイルス蛋白が血清型5、血清型3、または血清型35のアデノウイルスのものである、請求項19に記載の核酸配列。
- 医薬の製造における、請求項12-22のいずれかに記載の核酸配列の用途。
- 癌の治療用医薬の製造における、請求項12-22のいずれかに記載の核酸配列の用途。
- 癌が結腸直腸癌である、請求項33に記載の核酸配列の用途。
- 結腸直腸癌をもつまたは結腸直腸癌を発症する危険性があると考えられる患者を治療する方法であって、配列番号1を含む第一調節配列またはその生物活性変異体、およびそれに機能的に結合した抗結腸直腸癌物質をコードしている異種遺伝子を含む核酸配列を患者に投与することを含む方法。
- 患者が人間であり、該方法が、治療を必要とする人間を同定する工程をさらに含む、請求項35に記載の方法。
- 異種遺伝子がE1Aをコードしている、請求項35に記載の方法。
- 核酸配列が発現ベクター中に入っている、請求項35に記載の方法。
- 発現ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項38に記載の方法。
- 患者を第二の治療レジメンに付すことを含む、請求項35に記載の方法。
- 第二の治療レジメンが、5-フルオロウラシル(5-FU)、カペシタビン(Xeloda(登録商標))、ロイコボリン(LV;ホリン酸)、およびオキサリプラチン(Eloxatin(登録商標))より成る群から選ばれるアジュバント化学療法薬の投与を含む、請求項40に記載の方法。
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