JP2021508328A - Ccr4のn末端組換えタンパク質及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】CCR4のN末端タンパク質配列を解明し、CCR4のN末端タンパク質構造を分析することで、CCR4 N末端組換えタンパク質を効率的に合成できる。
【選択図】なし
Description
である。
である。
2).上記組換えタンパク質のアミノ酸配列はSEQ ID NO.1に示す、1)に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
3).上記誘導体は、上記組換えタンパク質のコンカテマー、又は上記組換えタンパク質と免疫グロブリンFc断片との融合タンパク質である、1)に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
4).上記誘導体は上記組換えタンパク質の三量体であり、そのアミノ酸配列はSEQ ID NO.2に示す、1)に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
5).上記誘導体は上記組換えタンパク質と免疫グロブリンFc断片との融合タンパク質であり、そのアミノ酸配列はSEQ ID NO.3に示す、1)に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
6).1)〜5)のいずれか1項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体を含む、医薬組成物。
7).CCR4とCCR4のリガンドとの結合を阻害する薬物を製造するための、1)〜5)のいずれか1項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体、又は6)に記載の医薬組成物の使用。
8).CCR4シグナル伝達に係る疾患又は状態の治療又は予防に用いる薬物を製造するための、1)〜5)のいずれか1項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体、又は6)の医薬組成物の使用。
9).上記CCR4シグナル伝達に係る疾患又は状態が、1)全身性アレルギー反応又は過敏性反応などのアレルギー性疾患、2)クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎および腸炎などの炎症性腸疾患、3)皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、皮膚筋炎、および蕁麻疹などの乾癬および炎症性皮膚疾患、5)血管炎、6)脊椎関節症、7)強皮症、8)アレルギー性喘息、運動誘発性喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患などの喘息および呼吸器アレルギー疾患、9)関節炎,多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、腎炎などの自己免疫疾患、10)同種移植拒絶反応および移植片対宿主病などの移植拒絶反応、11)皮膚T細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病のような白血病、リンパ腫、および他の血液由来の癌、12)アテローム性動脈硬化症、筋炎、神経変性疾患、脳炎、髄膜炎、肝炎、腎炎などの悪い炎症を抑制する必要を有する他の疾患、13)固形腫瘍および転移性腫瘍を含めた癌、例えば胃癌、肝癌、腎臓癌、腸癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、前立腺癌、神経系腫瘍を含む、8)に記載の使用。
10).上記CCR4シグナル伝達に係る疾患又は状態は癌である、8)に記載の使用。
11).1)〜5)のいずれか1項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体、又は6)に記載の医薬組成物の、CCR4とCCR4のリガンドとの結合を阻害するための使用。
12).1)〜5)のいずれか1項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体、又は6に記載の医薬組成物の、CCR4シグナル伝達に係る疾患又は状態の治療又は予防のための使用。
1.CCR4のN末端タンパク質N−CCR4は、CCR4とCXCR4タンパク質配列の疎水性アラインメント(http://www.bioinfo.mpg.de/AlignMe/AlignMe_MSA.html)、CCR4タンパク質配列のギブスの自由エネルギーΔG(ΔG predictor sever v 1.0,http://dgpred.cbr.su.se)によって予測したものである(図1A、B)。
N−CCR4タンパク質配列は:
(N−CCR4)3のDNAコドン最適化した配列は、制限酵素切断部位NdeIとBamHIにより、pET22b(+)ベクター(Novagen、Cat.No.69744−3)にクローニングし、Transettaコンピテントセルへ(TransGen Biotech、商品番号:CD801−01)形質転換した。菌液は、1:100で新たなLB培地に接種し、オーバーナイト振盪しながら培養した。菌液のOD600は0.6になった際、終濃度で1mMになるようにIPTG(amresco,cat:0487−1G)を加え、25℃、220rpm/minで10時間誘導発現した。細胞はPBSで再縣濁した後、高圧バクテリアブレーカー(JN−02C低温超高圧連続フローセルディスラプター)で細胞粉砕し、ニッケルカラム(BBI、商品番号C600793)に結合して、100mM イミダゾール Tris−HCl(pH 8.0)を含むバッファーで溶出して精製し、2L PBSで透析を両回行った。誘導前のctrlサンプル、誘導後のlysサンプル、フロースルー液のFtサンプル,洗浄のwサンプル、30mM イミダゾールで溶出したサンプル、100mM イミダゾールで溶出したサンプル、500mM イミダゾールで溶出したサンプルを用いて、12%SDS−PAGEジェルに電気泳動し、検出した(図1C)。
ネズミのκIIIシグナルベプチド−(N−CCR4)3−Fc DNA配列は、KpnIとBamHIを介してpCEP4ベクターにクローニングした。ネズミのκIIIシグナルベプチドは分泌シグナルペプチドであり、Fcはヒト由来のIgG1 Fcである。PEI(上海起発生物試薬株式会社、商品番号24765−2)で構築したプラスミドを、293FT細胞へトランスフェクションし、トランスフェクション後の3日目に上清を回収し、protein A Pre−Packed Gravity Column(BBI、商品番号C600951)で精製した。溶出Elutionサンプルを用いて10%SDS−PAGEによって検出した(図1D)。
GST−プルダウン試験は2つのタンパク質の間の相互作用の有無を検証できるものであり、GST−プルダウン試験によって(N−CCR4)3とCCL22との相互作用の存在を検証した。
CCL22 DNA配列に対してコドン最適化して、酵素消化サイトであるNdeI、BamHIとHindIIIを介して、pET22bベクターへCCL22およびGSTをクローニングした。Transettaコンピテント細胞を形質転換した。菌液は、1:100で新たなLB培地に接種し、オーバーナイト振盪しながら培養した。菌液のOD600は0.6になった際、終濃度で1mMになるようにIPTG(amresco,cat:0487−1G)を加え、20℃、210rpm/minで10時間誘導発現した。細胞はPBSで再縣濁した後、高圧バクテリアブレーカーで細胞粉砕し、GST アガロース(BBI、商品番号C600031)結合してオーバーナイトした。150mM NaCl、1mM DTT(amresco、商品番号0281−5G)、10mM Tris−HCl(pH 8.0)バッファーを用いて10倍のカラム体積で洗浄し、さらに、10mM還元型グルタチオン(BBI、商品番号70−18−8)、150mM NaCl、1mM DTT Tris−HCl(pH 8.0)バッファーで溶出して精製し、2L PBSでの透析を両回行った。
pGEX−6P−1プラスミド(GE、商品番号27−4597−01)は、Transettaコンピテント細胞に形質転換した。菌液は、1:100で新たなLB培地に接種し、オーバーナイト振盪しながら培養した。菌液のOD600は0.6になった際、終濃度で1mMになるようにIPTG(Amresco,cat:0487−1G)を加え、25℃、210 rpm/minで10時間誘導発現した。細胞はPBSで再縣濁した後、高圧バクテリアブレーカーで細胞粉砕し、GST アガロース(BBI、商品番号C600031)と結合してオーバーナイトした。10mM Tris−HCl、150mM NaCl、1mM DTT(Amresco、商品番号0281−5G)バッファーを用いて10倍のカラム体積で洗浄し、さらに、10mM還元型グルタチオン(BBI、商品番号70−18−8)、150mM NaCl、1mM DTT Tris−HCl(pH 8.0)バッファーで溶出して精製し、2L PBSで透析を両回行った。
120ng CCL22−GST、GSTタンパク質は、別々に360ng(N−CCR4)3と混合し、それぞれに20ul GST アガロースを加えて、液体が600ulになるようにPBSを補充した。4℃で4時間回転結合した。PBS+0.1%トリトン−100で3回、PBSで3回洗浄した。beadsの表面のタンパク質は、30ul 1x loading bufferに溶解され、3分間沸騰させ、高速遠心分離した。上清から1ulを取って、12%SDS PAGEに付し、シルバーステイン(Beyotime Biotechnology、快速シルバーステインキット、商品番号P0017S)によって検出した。図2に示すように、(N−CCR4)3とCCL22の間には相互作用を存在している。
走化性試験は、従来、細胞の走化性移動のモデルを観測するものであり、本発明はそれにより(N−CCR4)3によるTreg細胞の走化性の抑制作用を検証した。
Claims (10)
- CCケモカインレセプター4のN末端部分のアミノ酸配列を有する、組換えタンパク質又はその誘導体。
- 上記組換えタンパク質のアミノ酸配列がSEQ ID NO.1に示す、請求項1に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
- 上記誘導体が、上記組換えタンパク質のコンカテマー、又は上記組換えタンパク質と免疫グロブリンFc断片との融合タンパク質である、請求項1に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
- 上記誘導体が上記組換えタンパク質の三量体コンカテマーであり、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO.2に示す、請求項1に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
- 上記誘導体が上記組換えタンパク質と免疫グロブリンFc断片との融合タンパク質であり、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO.3に示す、請求項1に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体を含む、医薬組成物。
- CCR4とCCR4のリガンドとの結合を阻害する薬物を製造するための、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体、又は請求項6の医薬組成物の使用。
- CCR4シグナル伝達に係る疾患又は状態の治療又は予防に用いる薬物を製造するための、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体、又は請求項6の医薬組成物の使用。
- 上記CCR4シグナル伝達に係る疾患又は状態が、1)全身性アレルギー反応又は過敏性反応などのアレルギー性疾患、2)クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎および腸炎などの炎症性腸疾患、3)皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、皮膚筋炎、および蕁麻疹などの乾癬および炎症性皮膚疾患、5)血管炎、6)脊椎関節症、7)強皮症、8)アレルギー性喘息、運動誘発性喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患などの喘息および呼吸器アレルギー疾患、9)関節炎,多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、腎炎などの自己免疫疾患、10)同種移植拒絶反応および移植片対宿主病などの移植拒絶反応、11)皮膚T細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病などの白血病、リンパ腫、および他の血液由来の癌、12)アテローム性動脈硬化症、筋炎、神経変性疾患、脳炎、髄膜炎、肝炎、腎炎などの悪い炎症を抑制する必要を有する他の疾患、13)固形腫瘍および転移性腫瘍を含めた癌、例えば胃癌、肝癌、腎臓癌、腸癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、前立腺癌、神経系腫瘍を含む、請求項8に記載の使用。
- 上記CCR4シグナル伝達に係る疾患又は状態が、癌である、請求項8に記載の使用。
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