CN118255899A - 一种IL2-IL2Rα异源复合物蛋白及其衍生物 - Google Patents

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CN118255899A CN202311804590.9A CN202311804590A CN118255899A CN 118255899 A CN118255899 A CN 118255899A CN 202311804590 A CN202311804590 A CN 202311804590A CN 118255899 A CN118255899 A CN 118255899A
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曹卫荣
武玉芬
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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种IL2‑IL2Rα变体的复合物蛋白及其应用，本发明的IL2‑IL2Rα复合物通过在IL2和IL2Rα之间引入二硫键及增加酸性条件下IL2和IL2Rα的亲和力的突变，最终获得具有与IL2Rα具有更低亲和力的分子，同时提高了分子的稳定性及选择性生物活性。

Description

一种IL2-IL2Rα异源复合物蛋白及其衍生物
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种IL2-IL2Rα变体的复合物蛋白及其应用。
背景技术
人白细胞介素-2(interleukin-2，IL2)具有4个反平行的、两亲性α螺旋组成，分子量约15kD，是肿瘤浸润淋巴细胞的关键生长因子。IL2通过与淋巴细胞表面的IL2受体结合并传导信号到胞内，IL2受体是由α、β、γ三条链组成的异聚体。IL2Rβ和IL2Rγ对于IL2的信号传导至关重要，而IL2Rα对于信号传导不是必需的，但可以赋予IL2对受体的高亲和力结合。静息状态的效应T细胞和NK细胞不产生IL2Rα，且对IL2没有响应。而Treg细胞(调节性T细胞)在体内表达高水平的IL2Rα，因此，正常情况下IL2会优先刺激Treg细胞增殖。
α亚基的存在让IL2和β、γ亚基的结合能力增强了约100倍，但也介导了IL2的毒副作用，包括但不限于IL2可引起发热、呕吐等一般症状，还可导致水盐代谢紊乱和肾、肝、心、肺等功能异常等，严重的副作用例如：毛细血管渗漏综合征甚至会使患者不得不中止治疗。以IL2为基础的细胞因子治疗具有扩增和激活效应T细胞和NK细胞的能力，为癌症患者提供了免疫治疗的选择。基于IL2的抗肿瘤作用，阿地白介素(Aldesleukin)于1992年FDA批准用于黑色素瘤和肾细胞癌的临床治疗，但是接受高剂量IL2治疗的患者经常经历严重的副作用。严重的不良反应和免疫抑制Treg细胞的优先扩增,同时由于IL2的分子量小，体内半衰期短，限制了重组IL2在癌症治疗中的应用。
为了突破IL2药物的局限性，目前国内外药企设计的IL2主要通过延长半衰期及氨基酸突变降低IL2与IL2Rα的结合，使IL2不能激活Treg细胞的策略。对于IL2-IL2Rα复合物的研究主要为Alkermes公司的ALKS4230(专利WO2020249693A1的序列1)，其是一种新型工程化IL2-IL2Rα融合蛋白，是在IL2分子的C端融合了IL2Rα亚基的胞外区，这样一来就会阻止IL2与高亲和力的IL2Rαβγ亚基结合，但并不影响与IL2Rβγ亚基结合，因此就可以选择性激活肿瘤杀伤免疫细胞。本发明的IL2-IL2Rα复合物通过在IL2和IL2Rα之间引入二硫键及增加酸性条件下IL2和IL2Rα的亲和力的突变，最终获得具有与IL2Rα具有更低亲和力的分子，同时提高了分子的稳定性及选择性生物活性，有望衍生出原创性的IL2-IL2Rα复合物药物。
发明内容：
本申请涉及一种具有一个或多个氨基酸突变的IL2Rα变体或其衍生物，及IL2Rα变体或其衍生物的缀合物、编码多肽和核酸分子、载体、宿主细胞、药物组合物、制药用途和治疗方法。
第一方面，本申请涉及一种融合蛋白，其包含：(a)包含白介素-2(IL2)多肽的第一多肽；和(b)包含白介素-2受体α(IL2Rα)多肽的第二多肽；并且其中所述融合蛋白具有IL2活性。
在一些具体的实施方案中，所述的融合蛋白，所述第一多肽是野生型或包含如下(1)-(3)任一项所示突变或其任意组合：
(1)：F42C
(2)：E61C
(3)：E68C。
在一些具体的实施方案中，所述的融合蛋白，所述第二多肽是野生型或包含如下(1)-(5)任一项所示突变或其任意组合：
(1)：S39R
(2)：S39W
(3)：H120W
(4)：S39C
(5)：L42C
在一些具体的实施方案中，所述第一多肽的突变为：E61C，第二多肽的突变为：S39C；或所述第一多肽的突变为：E68C，第二多肽的突变为：L42C；或所述第一多肽的突变为F42C，第二多肽的突变为：L42C。
在一些具体的实施方案中，所述融合蛋白还包括Fc区。
在一些具体的实施方案中，所述Fc区可以是野生型，也可以是突变型的，例如：含有以下突变：L234A、L235A、P329A、P331S。
在一些具体的实施方案中，所述融合蛋白包含在第一多肽与第二多肽之间的起到融合作用的接头。
在一些具体的实施方案中，融合蛋白包含为甘氨酸/丝氨酸接头的接头。此类甘氨酸/丝氨酸接头可以包含氨基酸残基的任何组合，包括但不限于肽GGGS或GGGGS或其重复序列，包括这些给出的肽的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个重复序列。
在一些具体的实施方案中，所述甘氨酸/丝氨酸接头包含(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n或(GGGGS)n的氨基酸序列，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数。
在一些具体的实施方案中，所述的融合蛋白，所述第二多肽的氨基酸序列如：SEQID NO:1-SEQ ID NO:3任一项所示或与上述序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，所述的融合蛋白，所述第一多肽的氨基酸序列如：SEQID NO:4所示或与上述序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
在一些具体的实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如：SEQ ID NO:5-SEQ IDNO:10任一项所示或与上述序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本申请涉及一种核酸，其编码所述的融合蛋白。
在一些具体的实施方案中，本申请涉及一种载体，其包含根据所述的核酸。
在一些具体的实施方案中，本申请涉及一种宿主细胞，其包含根据所述的核酸或所述的载体。
在一些具体的实施方案中，本申请的宿主细胞优选真核细胞，优选哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、转基因哺乳动物细胞和植物细胞。
第二方面，本申请涉及一种药物组合物，其包含(a)所述的融合蛋白、所述的核酸、所述的载体或所述的宿主细胞；以及(b)药学上可接受的赋形剂。
第三方面，本申请涉及一种生产所述的融合蛋白的方法，其包括：在合适的条件下培养所述的宿主细胞，并且回收所述融合蛋白。
在一些具体的实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
在一些具体的实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、植物细胞、转基因哺乳动物细胞或细菌细胞。
在一些具体的实施方案中，其中所述宿主细胞选自CHO细胞、HEK293细胞、NS0细胞、Per C6细胞、BHK细胞和COS细胞。
第四方面，一种治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，其包括向所述受试者给予有效量的所述的融合蛋白、所述的核酸、所述的载体、所述的宿主细胞或所述的药物组合物。
在一些具体的实施方案中，其中所述疾病或障碍是癌症。
在一些具体的实施方案中，其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、卵巢癌、结直肠癌、结肠癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、鳞状细胞癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、病毒相关癌症、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金或非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、骨髓瘤、唾液腺癌、肾癌、基底细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食道癌、或头颈癌及其任何组合。
第五方面，本申请涉及一种联合用药的方法，具体而言，本申请涉及一种治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，其进一步包括向所述受试者给予第二药剂。
在一些具体的实施方案中，其中所述第二药剂是PD-1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、TIM3拮抗剂、GITR拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG3拮抗剂或其任何组合。
在一些具体的实施方案中，其中所述第二药剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM3抗体、抗KIR抗体、抗GITR抗体、抗LAG3抗体或其任何组合。
在一些具体的实施方案中，其中所述第二药剂是细胞因子抑制剂。
在一些具体的实施方案中，其中所述细胞因子抑制剂靶向IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF、IFN-γ或其任何组合中的一种或多种。
在一些具体的实施方案中，其中将所述融合蛋白经由局部、表皮粘膜、鼻内、口服、阴道、直肠、舌下、局部、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外或胸骨内途径给予。
在一些具体的实施方案中，所述PD-1或PD-L1抑制剂是生物治疗剂或小分子。优选地，PD-1或PD-L1抑制剂是单克隆抗体、人源化抗体、全人抗体、融合蛋白或其组合。优选地，PD-1或PD-L1抑制剂包含一种或多种抗PD-1抗体，包括但不限于：纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Cindilimab)和卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)、替雷利珠单抗(Tislelizumab)、SG001或其组合。
在一些实施方案中，所述CTLA-4抑制剂包括但不限于：ZALIFRELIMAB(泽弗利单抗)、BMS-986218、Quavonlimab(MK-1308)、Botensilimab(AGEN1181)、ADG-116等。
附图说明：
图1：IL2-IL2Rα突变体示意图。
图2：IL2-IL2Rα突变体二硫键检测结果。
图3：IL2-IL2Rα突变体与IL2Rα亲和力的ELISA检测结果。
图4：IL2-IL2Rα突变体对Mo7e细胞增殖能力的检测结果。
图5：IL2-IL2Rα突变体对NK92细胞增殖能力的检测结果。
图6：IL2-IL2Rα突变体对人PBMC中CD8+T细胞的STAT5磷酸化的检测结果。
图7：IL2-IL2Rα突变体对人PBMC中Treg细胞中的STAT5磷酸化的检测结果。
图8A：IL2-IL2Rα突变体抑制A375荷瘤小鼠的体积变化结果。
图8B：IL2-IL2Rα突变体抑制A375荷瘤小鼠的单个肿瘤体积变化结果。
图8C：IL2-IL2Rα突变体抑制A375荷瘤小鼠体重的影响结果。
具体实施方式：
以下列举的实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
定义
“白介素-2”或“IL2”指来自任何脊椎动物来源的任何天然或重组IL2，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，以及驯养或农业哺乳动物，除非另有说明。所述术语涵盖未加工的IL2以及通过细胞中的加工产生的任何形式的IL2(即IL2的成熟形式)。所述术语还涵盖IL2的天然存在的变体和片段(例如剪接变体或等位基因变体)，以及具有天然存在的IL2的IL2活性的非天然存在的变体。
“IL2受体α”、“IL2Rα”或“IL2Ra”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然或重组IL2α，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，以及驯养或农业哺乳动物，除非另有说明。所述术语还涵盖IL2Rα的天然存在的变体(例如剪接变体或等位基因变体)，或具有IL2Rα活性的非天然存在的变体。人IL2经由通过其受体系统IL2R的信号传导发挥其生物学作用。IL2及其受体(IL2R)是T细胞增殖和其他对免疫应答重要的基本功能所需要的。人IL2Rα链含有219个氨基酸的胞外结构域、19个氨基酸的跨膜结构域和13个氨基酸的胞内结构域。IL2Rα(IL2R-α)的分泌的胞外结构域可用于本文所述的融合蛋白中。
“多肽”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，所述链的长度没有上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可以含有修饰，例如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键形成。“蛋白质”或“融合蛋白”可以包含一种或多种多肽。
术语“片段”或“变体”或“突变体”包括保留参考多肽的至少一些特性(例如IL2对于IL2Rα的结合活性)的任何多肽。多肽片段包括蛋白质水解片段以及缺失片段，但是不包括天然存在的全长多肽(或成熟多肽)。本申请涉及的多肽结合结构域或结合分子的变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或非天然存在的。非天然存在的变体可以使用本领域中已知的诱变技术来产生。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。
“融合”或“融合蛋白”包含框内连接至第二氨基酸序列的第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列在自然界中并非天然地与所述第二氨基酸序列连接。通常存在于分开的蛋白质中的氨基酸序列可以在融合多肽中聚在一起，或者通常存在于相同蛋白质中的氨基酸序列可以以新的排列方式置于融合多肽中，例如，IL2蛋白与IL2-Rα蛋白的融合。例如，通过化学合成，或通过产生和翻译多核苷酸来产生融合蛋白，所述多核苷酸中肽区域以理想的关系被编码。融合蛋白可以进一步包含通过共价非肽键或非共价键与第一氨基酸序列缔合的第二氨基酸序列。转录/翻译后，完成了一种蛋白质。以此方式，可以将多种蛋白质或其片段掺入单个多肽中。“可操作地连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，两个多肽之间的可操作的连接将两个多肽框内融合在一起以产生单个多肽融合蛋白。在特定方面，所述融合蛋白进一步包含第三多肽，所述第三多肽可以包括接头序列。
“Fc区”(片段可结晶区)、“Fc结构域”或“Fc”是指抗体的重链的C末端区，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)上的Fc受体的结合，或与经典补体系统的第一成分(C1q)的结合。因此，Fc区包含抗体的除了第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如CH1或CL)之外的恒定区。Fc区可以是天然序列Fc，包括任何同种异型变体或变体Fc(例如，非天然存在的Fc)。
实施例1突变体增加酸性条件与IL2亲和力的检测
基于肿瘤微环境的酸性条件，通过分析IL2与IL2Rα复合物的结构(PDBID:1Z92)，采用Pymol、coot及Discovery Studio软件对IL2Rα与IL2相互作用的残基进行突变。选择在pH6.0条件下增加亲和力并且突变后对能量影响较小的氨基酸，即第39位的丝氨酸分别突变为色氨酸及精氨酸(S39W、S39R)。同时研究发现，IL2Rα的120位组氨酸可能为其与IL2相互作用的pH开关，我们选择突变为对能量影响较小的色氨酸，即H120W。将上述突变后序列与Fc进行重组表达，命名为IL2Rα-S39R、IL2Rα-S39W、IL2Rα-H120W。
将IL2固定在生物传感器上。将传感器分别浸入用0.02％PBST缓冲液梯度稀释的IL2Rα及IL2Rα-S39R、IL2Rα-S39W、IL2Rα-H120W蛋白分析物中，蛋白起始浓度为100nM，分别设置7个浓度梯度，100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.56nM，进行亲和力分析实验。配体与分析物结合和解离时间分别为120s和300s，根据结合曲线由分析软件回归计算出亲和力数据，数据如表1所示。从结果我们看出IL2Rα-S39R、IL2Rα-S39W、IL2Rα-H120W在pH7.4的条件下与野生型IL2Rα的亲和力相当；在pH6.0的条件下IL2Rα-H120W突变相比野生型IL2Rα提高近4倍(KD值)，仍保持与pH7.4条件下相当的结合能力，我们成功的获得酸性条件增强IL2与IL2Rα亲和力的突变体IL2Rα-H120W。
表1：IL2Rα突变体与IL2亲和力的检测结果
氨基酸序列如下：
IL2Rα-S39W(SEQ ID NO:1)
ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKWGSLYMLCTGNSSHSSWDNQC
QCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIY
HFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGGGGGSGGGGSG
GGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP
IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IL2Rα-S39R(SEQ ID NO:2)
ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKRGSLYMLCTGNSSHSSWDNQC
QCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIY
HFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGGGGGSGGGGSG
GGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP
IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IL2Rα-H120W序列(SEQ ID NO:3)：
ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQ
CTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYW
FVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGGGGGSGGGGSGG
GGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK
FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
实施例2IL2-IL2Rα突变体设计
通过Uniprot(Accession Number：P60568)获得野生型IL2的氨基酸序列，经过结构分析设计IL2的变体与Fc(N297A)进行重组，命名为IL2-IL2Rα-mu-Fc。即IL2-IL2Rα-mu-Fc中工程化的IL2变体的C和N末端对应于野生型IL2中的残基74和75(参见序列4划线处)，并且天然IL2末端通过2个G氨基酸接头(GG Linker)连接(参见序列5划线处)，同时将125位游离的半胱氨酸突变为S。
通过分析IL2与IL2Rα复合物的结构(PDB ID:1Z92)，采用Pymol、coot及DiscoveryStudio软件分析，对复合物相互作用位点进行半胱氨酸突变。尽量选取突变后不影响蛋白三维结构及远离分子内二硫键周围的残基。最终将对应野生型IL2的第F42、E61、E68及IL2Rα的第S39、L42突变为半胱氨酸，即IL2为F42C、E61C、E68C；IL2Rα为S39C、L42C整合入IL2-IL2Rα-mu-Fc复合物中，形成IL2的E61C和IL2Rα的S39C突变配对IL2-IL2Rα-M1、IL2的E68C和IL2Rα的L42C突变配对IL2-IL2Rα-M2及IL2的F42C和IL2Rα的L42C突变配对IL2-IL2Rα-M3(结构示意图参见图1)。
氨基酸序列如下：
野生型IL2序列(SEQ ID NO:4)：
IL2-IL2Rα-mu-Fc序列(SEQ ID NO:5)：
IL2-IL2Rα-M1序列(SEQ ID NO:6)：
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IL2-IL2Rα-M2序列(SEQ ID NO:7)：
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IL2-IL2Rα-M3序列(SEQ ID NO:8)：
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实施例3IL2-IL2Rα突变体表达、纯化及二硫键鉴定
将IL2-IL2Rα-M1、IL2-IL2Rα-M2及IL2-IL2Rα-M3克隆至pCDNA3.1载体上，采用哺乳动物细胞(Hek293F)表达体系进行蛋白表达。收集上清，将其装载于预先经PB缓冲液平衡的Protein A/G柱子上。通过pH 2.7的0.1M的甘氨酸溶液洗脱目的蛋白至预先加有pH 9.0的1M Tris-HCL中和缓冲液中，最后将蛋白交换至PBS缓冲液中备用。IL2-IL2Rα-M1、IL2-IL2Rα-M2及IL2-IL2Rα-M3样品通过盐酸胍变性、碘乙酰胺烷基化及胰酶消化后，通过液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)进行鉴定。通过UNIFI软件进行处理，结果IL2-IL2Rα-M1成功的检测到图2中显示的肽段。其中实线为已知的IL2及IL2Rα分子内分别形成的二硫键；通过分析结果确定：IL2-IL2Rα-M1对应野生型IL2的61位及IL2Rα的39位之间形成了二硫键(参见图2中虚线所示)。
实施例4突变体设计及ELISA检测其与IL2Rα亲和力
IL2Rα-H120W突变确定能增加其酸性条件亲和力，我们将IL2-IL2Rα-M1及IL2-IL2Rα-M3分别加入H120W突变，并与去除hIgG1 Fc受体结合功能的L234A、L235A、P329A、P331S突变的Fc变体进行重组制备融合蛋白，分别获得IL2-IL2Rα-mu1、IL2-IL2Rα-mu2分子。
IL2-IL2Rα-mu1序列(SEQ ID NO:9)：
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IL2-IL2Rα-mu2序列(SEQ ID NO:10)：
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采用哺乳动物细胞Hek293F表达体系进行蛋白表达，通过ELISA法测定抗体与重组野生型IL2Rα蛋白的亲和力。将His标签的IL2Rα蛋白以1μg/ml的浓度包被酶标板，4℃过夜；PBST洗3遍后，每孔加入200μl的封闭液，室温封闭2h。洗涤3遍后，加入500nM、125nM、31.25nM、7.81nM、1.95nM、0.49nM、0.12nM、0.07nM、0.018nM、0.004nM、0.001nM稀释的IL2-IL2Rα-mu1及IL2-IL2Rα-mu2分子，以野生型IL2及ALKS4230的Fc标签的分子为对照，室温孵育1小时；PBST洗3遍后，通过HRP标记的抗IL2多克隆抗体，室温孵育1小时；PBST洗3遍，加入TMB显色液及终止液，450nm下读取OD值。所得亲和力如图3所示，500nM浓度下的OD值见表2。结果可见，本发明的IL2-IL2Rα-mu2分子相对于IL2及对照分子ALKS4230-Fc最大程度的降低了与IL2Rα的结合。
表2 500nM浓度下突变体与IL2Rα结合的OD值
实施例5BLI检测IL2-IL2Rα突变体与IL2Rβ亲和力
采用Octet RED96e(Fortebio)检测ALKS4230-Fc及IL2-IL2Rα-mu1、IL2-IL2Rα-mu2与IL2Rβ的亲和力，将IL2Rβ固定在生物传感器上。将传感器分别浸入用0.02％PBST缓冲液梯度稀释的ALKS4230-Fc、IL2-IL2Rα-mu1及IL2-IL2Rα-mu2蛋白分析物中，蛋白起始浓度为1000nM，分别设置7个浓度梯度，进行亲和力检测实验。配体与分析物结合和解离时间分别为120s和300s。根据结合曲线由分析软件回归计算出亲和力数据，结果如表3所示。结果表明IL2-IL2Rα-mu1、IL2-IL2Rα-mu2及ALKS4230-Fc对IL2Rβ的结合能力相当(KD值)。
表3：IL2-IL2Rα-mu2与IL2Rβ结合的亲和力
实施例6IL2及IL2-IL2Rα突变体对中亲合力受体IL2Rβ/γ介导的细胞增殖能力的检测
Mo7e为只表达IL2Rβ、γ，不表达IL2Rα的细胞系，依据在不同IL2、IL2-IL2Rα-mu1及IL2-IL2Rα-mu2的浓度下Mo7e细胞的增殖速率，检测IL2或其变体的生物学活性。
离心收集处于对数生长期的Mo7e细胞，用PBS洗涤3次，重悬于基础培养液中，配制成每mL含2.0×105个细胞的细胞悬液，置于96孔板中，每孔90μL细胞。加入10μL不同浓度的用基础培养液配置的IL2、IL2-IL2Rα-mu1或IL2-IL2Rα-mu2，置于37℃、5％CO2条件下，培养72小时。将等体积的含有荧光素酶的CellTiter-Glo加入每孔中，通过酶标仪读取自发光数值。结果如图4所示，IL2、IL2-IL2Rα-mu1及IL2-IL2Rα-mu2的促细胞增殖的Ec50值分别为1.9nM、5.5nM及5.66nM；结果表明，变体在促Mo7e细胞的增殖能力上仍保持较好的结合。
实施例7IL2-IL2Rα突变体对高亲合力受体IL2Rαβ/γ介导的细胞增殖能力的检测
NK92为表达IL2Rα、β、γ的细胞系，依据在不同IL2、IL2-IL2Rα-mu1或IL2-IL2Rα-mu2的浓度下NK92的增殖速率，检测IL2或其变体的生物学活性。NK92细胞培养在75％ MEMA(GOIBCO产品目录号：12561-056)+12.5％FBS+12.5％马血清+0.2mM肌醇+0.02mM叶酸+200U/ml IL2培养基中。离心收集处于对数生长期的NK92细胞，用PBS洗涤3次，重悬于无IL2的培养液中，配制成每mL含2.0×105个细胞的细胞悬液，置于96孔板中，每孔90μL细胞。加入10μL不同浓度的用基础培养液配置的IL2、IL2-IL2Rα-mu1或IL2-IL2Rα-mu2，置于37℃、5％CO2条件下，培养72小时。将等体积的含有荧光素酶的CellTiter-Glo加入每孔中，通过酶标仪读取自发光数值。结果如图5所示，IL2、IL2-IL2Rα-mu1或IL2-IL2Rα-mu2的促细胞增殖的Ec50值分别为0.017nM、0.26nM及0.23nM；结果表明，由于IL2-IL2Rα-mu1或IL2-IL2Rα-mu2变体降低了和IL2Rα的结合，所以相对IL2在很大程度上降低了促NK92细胞的增殖活性。
实施例8IL2-IL2Rα突变体对PBMC细胞STAT5磷酸化的影响
基础培养基：RPMI 1640+10％胎牛血清
细胞表面抗体混合物：CD4抗体BUV395(BD 564724)、CD8抗体BB700(BD 566452)、CD25抗体BV421(BD 564033)、染色缓冲液(BD 566349)
胞内抗体混合物：FOXP3抗体AF647(BD 560045)、pSTAT5抗体AF488(BD 612598)、染色缓冲液(BD 566349)，以上产品来自BD Biosciences
复苏人PBMC细胞并于37℃过夜培养，收集PBMC细胞并用基础培养基调整至16×106cells/mL，取50μL接种于96孔板中，37℃孵育20分钟。将IL2、ALKS4230-Fc、IL2-IL2Rα-mu1及IL2-IL2Rα-mu2用基础培养基稀释浓度至200nM、50nM、12.5nM、3.125nM、0.781nM、0.195nM、0.049nM、0.012nM，取50μL加入50μL PBMC中，37℃培养25分钟。之后立即用预热的固定液37℃固定细胞10分钟后采用染色缓冲液洗涤细胞2次。加入200μL预冷的渗透液，冰上破膜30分钟，染色缓冲液洗涤细胞两次，弃上清。加入FcR blocker，4℃孵育10分钟。加入30μL细胞表面抗体混合物，室温染色30分钟，洗涤细胞两次，弃上清。加入40μL胞内抗体混合物，室温染色30分钟后洗涤细胞两次，重悬细胞采用流式细胞仪检测。CD8+T细胞定义为CD4-CD8+的细胞，Treg定义为CD4+CD25+Foxp3+的细胞。统计CD8+T细胞和Treg中pSTAT5占比结果如图6、图7及表4所示。结果表明，IL2-IL2Rα-mu1及IL2-IL2Rα-mu2变体相比IL2大大降低了和IL2Rα的结合，导致其对Treg细胞的激活能力明显小于IL2，但对CD8+T细胞的激活与IL2类似。同时，IL2-IL2Rα-mu1及IL2-IL2Rα-mu2相比ALKS4230-Fc对于Treg细胞的激活能力也减弱了近6倍，而对CD8+T细胞的激活能力类似。
表4IL2及其变体对人CD8+T细胞及Treg细胞的STAT5磷酸化活性
样品 CD8+T细胞 Treg细胞
IL2 0.433 ND
ALKS4230-Fc 0.416 0.098
IL2-IL2Rα-mu1 0.785 0.570
IL2-IL2Rα-mu2 0.410 0.354
(注：ND，未检测到，表示IL2在Treg细胞STAT5磷酸化活性较高，在实验中浓度范围内无法准确的得到Ec50值)
实施例9局部PBMC模型检测IL2-IL2Rα-mu1对黑色素瘤的影响
本发明在局部PBMC肿瘤异种移植模型中评估了IL2-IL2Rα-mu1的单一治疗功效。将4×106个A375黑素瘤细胞和5×105个人PBMC与基质胶1：1混合后接种到NCG免疫缺陷小鼠中。在移植当天，通过尾静脉注射给荷瘤小鼠施用的0.2mg/kg的IL2-IL2Rα-mu1或PBS对照，一周给药一次。治疗28天后，在对照组中，平均肿瘤体积为2244.6±232.6mm3(平均值±标准误差)。与对照组相比，造成96％的肿瘤抑制率(肿瘤体积88.6±16.2mm3)(图8A)。单个肿瘤体积的结果显示在图8B(多条线的含义代表多只小鼠)中；各实验组的体重变化并不显著(图8C)，表明治疗得到了良好的耐受。
综合以上实验数据可知：本申请获得的IL2-IL2Rα复合物在保持与IL2和IL2Rβ的亲和力的前提下，最大程度降低了与IL2Rα的结合能力，同时提高了分子的稳定性及选择性生物活性，例如：选择性激活肿瘤杀伤免疫细胞(CD8+T细胞)，同时避免免疫抑制性细胞的扩增(Treg细胞)，此外，肿瘤杀伤实验的结果表明：本申请获得的IL2-IL2Rα复合物能够有效的抑制黑素瘤细胞的增殖，并且动物体内耐受性良好。
以上描述地仅是优选实施方案，其只作为示例而不限制实施本发明所必需特征的组合。所提供的标题并不意指限制本发明的多种实施方案。术语例如“包含”、“含”和“包括”不意在限制。此外，除非另有说明，没有数词修饰时包括复数形式，以及“或”、“或者”意指“和/或”。除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的意思与本领域技术人员通常理解的相同。
本申请中提及的所有公开物和专利通过引用方式并入本文。不脱离本发明的范围和精神，本发明的所描述的方法和组合物的多种修饰和变体对于本领域技术人员是显而易见的。虽然通过具体的优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所要求保护的本发明不应该被不适当地局限于这些具体实施方式。事实上，那些对于相关领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的多种变体意在包括在随附的权利要求的范围内。

Claims (25)

1.一种融合蛋白，其包含：(a)包含白介素-2(IL2)多肽的第一多肽；和(b)包含白介素-2受体α(IL2Rα)多肽的第二多肽；并且其中所述融合蛋白具有IL2活性。
2.权利要求1所述的融合蛋白，所述第一多肽是野生型或包含如下(1)-(3)任一项所示突变或其任意组合：
(1)：F42C
(2)：E61C
(3)：E68C。
3.权利要求1-2任一项所述的融合蛋白，所述第二多肽是野生型或包含如下(1)-(5)任一项所示突变或其任意组合：
(1)：S39R
(2)：S39W
(3)：H120W
(4)：S39C
(5)：L42C。
4.权利要求3所述的融合蛋白，所述第一多肽的突变为：E61C，第二多肽的突变为：S39C；或所述第一多肽的突变为：E68C，第二多肽的突变为：L42C；或所述第一多肽的突变为F42C，第二多肽的突变为：L42C。
5.权利要求1-4任一项所述的融合蛋白，所述第一多肽的氨基酸序列如：SEQ ID NO:4所示或与上述序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；所述第二多肽的氨基酸序列如：SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3任一项所示或与上述序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
6.权利要求1-5任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如：SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:10任一项所示或与上述序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
7.一种核酸，其编码根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白。
8.一种载体，其包含根据权利要求7所述的核酸。
9.一种宿主细胞，其包含根据权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的载体。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其是真核细胞。
11.根据权利要求9-10任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、转基因哺乳动物细胞和植物细胞。
12.一种药物组合物，其包含(a)根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求7所述的核酸、根据权利要求8所述的载体或根据权利要求9至11中任一项所述的宿主细胞；以及(b)药学上可接受的赋形剂。
13.一种生产根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括：在合适的条件下培养根据权利要求9至11中任一项所述的宿主细胞，并且回收所述融合蛋白。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
15.根据权利要求13-14任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、植物细胞、转基因哺乳动物细胞或细菌细胞。
16.根据权利要求13-15任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自CHO细胞、HEK293细胞、NS0细胞、Per C6细胞、BHK细胞和COS细胞。
17.一种治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，其包括向所述受试者给予有效量的根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求7所述的核酸、根据权利要求8所述的载体、根据权利要求9-11任一项所述的宿主细胞或根据权利要求12所述的药物组合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述疾病或障碍是癌症。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、卵巢癌、结直肠癌、结肠癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、鳞状细胞癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、病毒相关癌症、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金或非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、骨髓瘤、唾液腺癌、肾癌、基底细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食道癌、或头颈癌及其任何组合。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者给予第二药剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述第二药剂是PD-1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、TIM3拮抗剂、GITR拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG3拮抗剂或其任何组合。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述第二药剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM3抗体、抗KIR抗体、抗GITR抗体、抗LAG3抗体或其任何组合。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述第二药剂是细胞因子抑制剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述细胞因子抑制剂靶向IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF、IFN-γ或其任何组合中的一种或多种。
25.根据权利要求17至24中任一项所述的方法，其中将所述融合蛋白经由局部、表皮粘膜、鼻内、口服、阴道、直肠、舌下、局部、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外或胸骨内途径给予。
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