CN113698467A - Il-6变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及IL‑6变体及其用途。具体地，本发明涉及一种IL‑6变体，其具有与野生型IL‑6相当的对IL‑6R的结合亲和力，同时能够阻断IL‑6的信号通路，其中所述IL‑6变体在野生型IL‑6的选自以下各项的一个或多个位置上具有取代突变：Y31、G35、W157、D160、S118、V121和S176。

Description

IL-6变体及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及具有取代突变的白细胞介素6(IL-6)变体，其与野生型IL-6具有相当的对IL-6R的结合亲和力，同时阻断IL-6信号通路，可用于预防和/或治疗与IL-6相关的疾病或病症。
背景技术
白细胞介素-6(IL-6)是由活化的单核细胞、巨噬细胞、T细胞、内皮细胞及成纤维细胞等分泌的一种具有多种效能的细胞因子，其与许多其他细胞因子一起，参与免疫反应、血管生成、炎症、骨代谢相关的过程。IL-6的主要作用与其作为辅因子参与B淋巴细胞的分化、其成熟和转化成分泌免疫球蛋白的浆细胞相关。除此之外，IL-6促进活化的免疫细胞上的IL-6受体表达，并诱导Т细胞产生IL-2。该细胞因子刺激T淋巴细胞的增殖和造血反应。就产物的细胞来源多样性和生物效应的目标而言，IL-6为参与实现免疫和炎性反应的最活跃细胞因子之一。IL-6有很多的靶细胞，包括巨噬细胞、肝细胞、静止的T细胞、活化的B细胞和浆细胞等。在肝脏及其它靶器官和靶细胞中，许多生物功能被发现与造血系统和淋巴系统中的IL-6有关。这些功能中有些是有利的，有些则与病理状态有关。
已表明，IL-6的促炎和抗炎作用之间的失衡导致各种自身免疫性疾病、慢性炎症和骨质疏松症、牛皮癣，且其过度产生导致不同形式的癌症。正常情况下，人体血清中IL-6的浓度非常低，约为1-5pg/ml，但是在病理状态下，如慢性类风湿性关节炎、脓血症、膀胱癌、心肌黏液瘤时，IL-6浓度快速升高，甚至可以达到μg/ml。所以，开发IL-6活性抑制剂已成为人们大力研究的课题。
IL-6是通过受体复合物促进细胞应答的细胞因子家族成员，所述受体复合物由信号转导糖蛋白gp130的至少一个亚基和IL-6受体(“IL-6R”)(还称gp80)组成。IL-6R还可以可溶形式(“sIL-6R”)存在。首先IL-6与IL-6R以较低亲和力结合，相互作用并与gp130以高亲和力结合，激发下游信号传导从而发挥其多种生物学效应。参见Jones，SA，J.Immunology，175：3463-3468(2005)。目前针对阻断IL-6信号通路的药物主要有IL-6抗体(见CN102924596B)、IL-6R抗体(见CN101454345B)、可溶性gp130(sgp130)分子(见US8895012)、信号通路中的一些小分子药(见US8716303)以及IL-6R拮抗剂(SANT-7)。
本发明提供了具有取代突变的IL-6变体，其与野生型IL-6具有相当的对IL-6R的结合亲和力，同时能够阻断IL-6信号通路。
发明内容
本发明提供了具有取代突变的IL-6变体，其与野生型IL-6具有相当的对IL-6R的结合亲和力，同时能够阻断IL-6信号通路。
本发明人证实了本发明的IL-6变体在保持与IL-6R的结合亲和力的同时，抑制了在HepG2细胞中IL-6诱导的触珠蛋白的转录，并显著降低在Panc-1细胞中IL-6诱导的STAT3磷酸化水平。
具体地，在第一方面，本发明提供了一种IL-6变体，其与野生型IL-6具有相当的对IL-6R的结合亲和力，同时阻断IL-6的信号通路。
在优选的实施方案中，本发明提供的IL-6变体具有选自SEQ ID NO：1的位置上Y31、G35、W157、D160、S118、V121或S176的一个或多个取代突变。
在一个具体的实施方案中，本发明提供的IL-6变体与SEQ ID NO：1所示的野生型IL-6相比，具有选自Y31D、G35F、S118R、V121D、W157R、D160R或S176A的一个或多个取代突变。
在更优选的实施方案中，本发明提供的IL-6变体与SEQ ID NO：1所示的野生型IL-6相比，具有Y31D、G35F、W157R和D160R的取代突变或Y31D、G35F、S118R、V121D、W157R、D160R和S176A的取代突变。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供的IL-6变体具有SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列；或者与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。
另一方面，本发明提供的IL-6变体具有SEQ ID NO：2的氨基酸位置1-184或SEQ IDNO：3的氨基酸位置1-184所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：2的氨基酸位置1-184或SEQID NO：3的氨基酸位置1-184所示的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。
第二方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含本发明第一方面所述的IL-6变体和抗体的Fc部分，在一个优选的实施方案中，所述抗体的Fc部分源自人IgG，优选源自人IgG1。
在进一步的实施方案中，本发明的融合蛋白由本发明第一方面所述的IL-6变体与抗体的Fc部分融合形成。优选地，本发明的融合蛋白中的IL-6变体的N-末端或C-末端直接地或间接地融合至抗体Fc部分的C-末端或N-末端；优选地，所述IL-6变体的N-末端或C-末端直接融合至抗体Fc部分的C-末端或N-末端；优选地，所述IL-6变体的N-末端或C-末端通过肽接头间接地融合至抗体Fc部分的C-末端或N-末端。
在优选的实施方案中，本发明的融合蛋白具有如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
第三方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗与IL-6相关的疾病或病症的药物组合物，其包含本发明所述的IL-6变体或本发明所述的融合蛋白，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
具体地，根据本发明所述的IL-6相关的疾病是炎性疾病、肿瘤、感染性疾病或自身免疫性疾病。其中所述炎性疾病包括但不限于，类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、全身发作幼年特发性关节炎、骨关节炎、败血症、哮喘、间质性肺疾病、炎性肠疾病、系统性硬化症、眼内炎症、格雷夫斯病、子宫内膜异位、系统性硬化症、成人斯蒂尔病、淀粉样蛋白A淀粉样变性、风湿性多肌痛、缓解型血清阴性对称性滑膜炎伴凹陷性水肿、白塞氏病、葡萄膜炎、移植物抗宿主病和TNFR(肿瘤坏死因子受体)-相关周期性综合征；所述肿瘤包括但不限于多发性骨髓瘤、白血病、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、恶病质、黑素瘤、子宫颈癌、卵巢癌、淋巴瘤、胃肠道癌、肺癌、前列腺癌、肾细胞癌、转移性肾癌、实体瘤、非小细胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、膀胱癌、口腔癌、骨髓增生性肿瘤、B细胞淋巴增生性疾病和浆细胞白血病、非小细胞肺癌、神经胶质瘤；所述感染性疾病包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类T淋巴细胞病毒(HTLV)、脑型疟疾、泌尿道感染和脑膜炎球菌感染；所述自身免疫性疾病包括但不限于细胞因子风暴(CRS)、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、多肌炎、包括巨细胞性动脉炎、高安动脉炎在内的血管炎综合症、冷球蛋白血症、髓过氧化物酶抗嗜中性粒细胞胞质抗体相关新月体性肾小球肾炎、类风湿血管炎、克罗恩病、复发性多软骨炎、获得性血友病A和自身免疫性溶血性贫血。最优选地，所述IL-6相关的疾病选自多发性硬化症、神经胶质瘤、细胞因子风暴(CRS)或系统性红斑狼疮。
第四方面，本发明提供了编码本发明所述的IL-6变体或编码本发明所述的融合蛋白的核酸分子。
第五方面，本发明提供了包含本发明所述核酸分子的载体。
第六方面，本发明提供了包含本发明所述载体的宿主细胞。
第七方面，本发明涉及根据本发明所述的IL-6变体或本发明所述的融合蛋白或本发明所述的药物组合物或本发明所述的核酸分子或本发明所述的载体或本发明所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防IL-6相关疾病或病症的药物中的用途；具体地，所述与IL-6相关的疾病或病症选自炎性疾病、肿瘤、感染性疾病或自身免疫性疾病。
第八方面，本发明提供了治疗和/或预防与IL-6相关的疾病的方法，所述IL-6相关的疾病选自炎性疾病、肿瘤、感染性疾病或自身免疫性疾病，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述的IL-6变体或本发明所述的融合蛋白或根据本发明的组合物。
发明的详细描述
除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属的领域中的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实践或测试本发明的实施方案，但以下描述示例性的方法和/或材料。尽管本文参考了许多现有技术公开，但这种参考文献并不构成承认任何这些文献形成本领域公知常识的一部分。虽然可在本发明的实践或测试中使用与本文描述的方法、装置和材料相似或等同的任何方法、装置和材料，但现在描述优选的方法、装置和材料。
如本文中所用，术语“白细胞介素-6”和“IL-6”是指天然存在的IL-6，包括天然存在的同种型和与天然存在的IL-6功能相当的变体。如本文中所用，IL-6包括所有哺乳动物物种的IL-6，所述哺乳动物包括人类、犬科、动物、猫科动物、鼠科动物、灵长类动物、马科动物和牛科动物。非限制性示例性人IL-6氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。如本文中所用，“IL-6R”是指白细胞介素6受体(IL-6R)的任何重组或天然存在形式，也被称为分化群126(CD126)，或其能维持IL-6受体活性的变体或同系物，例如与IL-6R相比至少有50％、80％、90％、95％、96％、97％，98％，99％或100％的活性。
IL-6一般通过与IL-6R形成复合物，然后再与gp130相互作用。单独的IL-6或IL-6R不与gp130结合。本发明人通过设计IL-6的变体，使其可以维持或提高与IL-6R的结合能力，但降低或缺失与gp130结合，使下游信号传导中断，从而用于预防和/或治疗IL-6相关的疾病或病症。
本发明提供了一种IL-6变体，其与野生型IL-6具有相当的对IL-6R的结合亲和力，同时阻断IL-6的信号通路。
如本文中所用，术语“亲和力”指分子X(例如IL-6)的单一结合位点及其结合配偶物Y(例如IL-6R)之间非共价相互作用的强度总和。除非另外指出，否则如本文所用，“亲和力”指反映结合对子的成员之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)代表，解离常数是解离速率常数和缔合速率常数(分别是koff和kon)的比例。因此，等同的亲和力可以包含不同的速率常数，只要速率常数的比例保持相同。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的一个具体方法是表面等离子体共振法(SPR)。
本发明提供了一组IL-6变体，所述IL-6变体与野生型IL-6的氨基酸序列相比，具有选自Y31D、G35F、S118R、V121D、W157R、D160R或S176A的一个或多个点突变。
在本发明的上下文中，两核酸或氨基酸序列之间的百分比同一性是通过以最佳方式比对此两个序列而决定的，其中将要被比较的核酸或氨基酸序列相对于用于此两序列间最佳比对的参照序列可包括添加或缺失。百分比同一性是通过确定该两序列之间核苷酸或氨基酸相同的位置的数目、通过将此相同位置的数目除以比较窗中位置的总数以及通过将所获得的结果乘以100以获得此两序列之间的百分比同一性而计算出。
在本发明的上下文中，与本发明所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列，是指，例如在一个或多个连续或不连续的氨基酸被取代的情况下，在取代中所取代的氨基酸被“等价”氨基酸所代替。在此，所述“等价氨基酸”意指可能取代一个结构氨基酸、而不改变本发明所示蛋白的生物学活性的任意氨基酸。
可以根据其与它们所取代的氨基酸的结构同源性、或者根据可能生成的各种抗原结合蛋白间生物活性比较测试的结果，来确定等价氨基酸。
作为非限制性实例，下面表1总结了可以实施而不导致相应修饰的多肽的生物活性显著变化的可能取代；在同一条件下自然可以做相反的取代。
表1
Figure BDA0002498227730000061
Figure BDA0002498227730000071
在决定了适当的变异氨基酸残基后，以含有编码人IL-6基因的碱基序列的载体为模板，利用通常使用的PCR(聚合酶链式反应)法引入突变，从而得到编码IL-6变体的基因。根据需要，将该基因重组到适当的表达载体中，使其在大肠杆菌细胞或哺乳类细胞中表达，表达的IL-6可能就包含在培养上清中，通过常规方法，将它纯化分离出来，评价它对IL-6R的结合活性以及IL-6的信息传递的中和活性。
本发明所用术语“生物学性质”或“活性”或“生物活性”在本文可互换使用，并且包括(但不限于)对IL-6R的亲和力、稳定性和体内免疫原性。上述性质和特征可通过本领域公认的技术观察、测量或评价，包括(但不限于)ELISA测定、竞争性ELISA测定或KINEXA、表面等离子体共振分析、体外或体内(非限制性地)的中和分析、受体结合、细胞因子或生长因子的产生和/或分泌、信号转导和从不同来源(包括人、灵长类动物或任何其他来源)获得的组织切片的免疫组织化学。
本申请中使用的与本发明变体的活性相关的术语“抑制”或“中和”是指基本上阻碍、制止、防止、限制、减慢、中止、破坏、停止、降低或转化例如被抑制物的发展或严重程度，包括(但不限于)上述生物活性(例如IL-6变体)或性质、疾病或病症的能力。由于本发明的IL-6变体与sIL-6R结合导致IL-6活性的抑制或中和，优选地共计至少约20、30、40、50、60、70、80、90、95％或者更多。
另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含本发明第一方面所述的IL-6变体和抗体的Fc部分。术语“Fc部分”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个优选的实施方案中，所述抗体的Fc部分源自人IgG，优选源自人IgG1。IgG Fc区包含IgG CH2结构域和IgG CH3结构域。人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基。
在进一步的实施方案中，本发明的融合蛋白由本发明所述的IL-6变体与抗体的Fc部分融合形成。本发明的融合蛋白中的IL-6变体直接地或间接地融合至抗体Fc部分的C-末端或N-末端，优选地，所述IL-6变体融合至抗体Fc部分的C末端。优选地，所述与IL-6变体通过肽接头间接地融合至抗体Fc部分的C-末端或N-末端。
另一方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗与IL-6相关的疾病的药物组合物，其包含本发明所述的IL-6变体或本发明所述的融合蛋白，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明提供了编码本发明所述的IL-6变体或编码本发明所述的融合蛋白的核酸分子。
本发明提供了包含本发明所述核酸分子的载体。术语“载体”包括能够转运其结合的另一种核酸的核酸分子，包括质粒和病毒载体，但不限于此。某些载体能够在其被注射的宿主细胞中彼此自主复制，而其他载体可整合到宿主细胞基因组中，因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导其功能性结合的基因表达。这种载体在本申请中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”、“重组载体”)。″表达载体″是指含有调节序列的DNA载体，所述调节序列将指导适当宿主细胞的肽合成。这通常指结合RNA聚合酶并启动mRNA转录的启动子，以及指导mRNA翻译成多肽的核糖体结合位点和起始信号。多核苷酸序列在适当位置和正确的阅读框内加入表达载体，随后载体转化适当的宿主细胞，能够产生所述多核苷酸序列编码的多肽。示例性表达载体及其使用的技术描述于下述出版物：Old等.，Principles of Gene Manipulation：An Introduction to Genetic Engineering，BlackwellScientific Publications，第4版，1989；Sambrook等.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989；Sambrook等.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001；Gorman，″High Efficiency Gene Transfer into Mammalian Cells，″DNACloning，第II卷，Glover，D.M.，编，IRLPress，Washington，D.C.，pp.143190(1985)。
本发明提供了包含本发明所述载体的宿主细胞。包含本发明的重组载体(整合到宿主染色体中以及未被整合两种)的宿主细胞也可称为“重组宿主细胞”。宿主细胞包括用重组载体，或者编码本发明的IL-6变体或其融合蛋白的多核苷酸转化的细胞。转化可以用任何熟知的将多核苷酸导入宿主细胞中的方法实现，包括例如：将多核苷酸包装在病毒中(或在病毒载体)并用病毒(或载体)转导宿主细胞，或者用本领域熟悉的转染程序，如美国专利Nos.4,399,216、4,912,040、4,740,461、和4,959,455所示例。这些专利在此处通过引用结合到本文中。特别指出，将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法是本领域熟悉的，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、凝聚胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、在脂质体中包装该多核苷酸和直接将DNA注射入细胞核。用于本发明的优选宿主细胞为CHO细胞(例如АТССCRL-9096)、NS0细胞、SP2/0细胞、COS细胞(АТСС，例如CRL-1650、CRL-1651)和HeLa(АТССCCL-2)。用于本发明的另外宿主细胞包括植物细胞、酵母细胞、其他哺乳动物细胞和原核细胞。本申请中使用的术语“宿主细胞”包括单个细胞的后代，并且由于天然、偶然或有意突变和/或变化，后代不一定与初始亲本细胞完全相同。
另一方面，本发明涉及根据本发明所述的IL-6变体或本发明所述的融合蛋白或本发明所述的药物组合物或本发明所述的核酸分子或本发明所述的载体或本发明所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防IL-6相关的疾病或病症的药物中的用途；具体地，所述与IL-6相关的疾病或病症选自炎性疾病、肿瘤、感染性疾病或自身免疫性疾病。
另一方面，本发明提供了治疗和/或预防IL-6相关的疾病或病症的方法，所述IL-6相关的疾病或病症选自炎性疾病、肿瘤、感染性疾病或自身免疫性疾病，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的IL-6变体或本发明所述的融合蛋白或根据本发明的组合物。
如用于本文中，术语“治疗和/或预防”指本文中所述的治疗性和/或预防性措施。治疗和/或预防的方法采用向受试者施用本发明所述的IL-6变体或其融合蛋白或包含其的药物组合物，所述受试者例如患有IL-6相关疾病或病症(例如炎症和癌症)或易患此种疾病或病症的受试者，以预防、治愈、延迟所述疾病或病症或复发的疾病或病症、减少其严重性，或减轻其一个或多个症状，或者延长受试者的存活至超过不存在此种治疗时预期的存活。
术语“IL-6相关的疾病或病症”包括与IL-6活性相关的疾病状态和/或症状，包括但不限于药物或治疗(例如放射疗法，细胞疗法)的副作用(例如细胞因子风暴)，以及特征为包括升高的IL-6的症状的特发性病症。示例性IL-6相关的疾病或病症包括但不限于炎性疾病(例如炎性自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮)，癌症(例如前列腺癌，弥散性大细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤和肾细胞癌)，和癌症相关的病症(例如食欲缺乏和恶病质)。具体地，根据本发明所述的IL-6相关的疾病是炎性疾病、肿瘤、感染性疾病或自身免疫性疾病。其中所述炎性疾病包括但不限于，类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、全身发作幼年特发性关节炎、骨关节炎、败血症、哮喘、间质性肺疾病、炎性肠疾病、系统性硬化症、眼内炎症、格雷夫斯病、子宫内膜异位、系统性硬化症、成人斯蒂尔病、淀粉样蛋白A淀粉样变性、风湿性多肌痛、缓解型血清阴性对称性滑膜炎伴凹陷性水肿、白塞氏病、葡萄膜炎、移植物抗宿主病和TNFR(肿瘤坏死因子受体)-相关周期性综合征；所述肿瘤包括但不限于多发性骨髓瘤、白血病、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、恶病质、黑素瘤、子宫颈癌、卵巢癌、淋巴瘤、胃肠道癌、肺癌、前列腺癌、肾细胞癌、转移性肾癌、实体瘤、非小细胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、膀胱癌、口腔癌、骨髓增生性肿瘤、B细胞淋巴增生性疾病和浆细胞白血病、非小细胞肺癌、神经胶质瘤；所述感染性疾病包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类T淋巴细胞病毒(HTLV)、脑型疟疾、泌尿道感染和脑膜炎球菌感染；所述自身免疫性疾病包括但不限于细胞因子风暴(CRS)、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、多肌炎、包括巨细胞性动脉炎、高安动脉炎在内的血管炎综合症、冷球蛋白血症、髓过氧化物酶抗嗜中性粒细胞胞质抗体相关新月体性肾小球肾炎、类风湿血管炎、克罗恩病、复发性多软骨炎、获得性血友病A和自身免疫性溶血性贫血。最优选地，所述IL-6相关的疾病选自多发性硬化症、神经胶质瘤、细胞因子风暴(CRS)或系统性红斑狼疮。
附图说明
图1显示IL-6变体及其与Fc的融合蛋白在大鼠中的血清循环半衰期。
图2显示通过RT-PCT检测HepG2细胞中触珠蛋白的转录水平，其中GAPDH为内参。
图3显示通过Western Blot检测Panc-1细胞中p-STAT3的表达水平。
以下具体实施方式仅用于说明本发明的目的，而不是限制本发明的保护范围。本领域技术人可以采用本领域已知的手段或方法，在其基础上进行各种变化和修饰，只要能够实现本发明的功能。
具体实施方式
实施例1、带6His标记的IL-6变体(IL-6-MH1)及其与Fc的融合蛋白(IL-6M1-Fc)的制备
1.1带6His标记的IL-6变体(IL-6-MH1)及其与Fc的融合蛋白(IL-6M1-Fc)的氨基酸以及核苷酸序列
与野生型IL-6(参见UniProtKB的P05231.1，SEQ ID NO：1)相比，IL-6-MH1具有以下氨基酸突变：Y31D/G35F/W157R/D160R。
野生型IL-6的氨基酸序列：
PVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM
SEQ ID NO：1；
委托金斯瑞生物科技有限公司合成编码IL-6-MH1的多核苷酸序列。
带6His标记的IL-6变体(IL-6-MH1)的氨基酸序列和核苷酸序列分别如下：
IL-6-MH1的氨基酸序列：
PVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRDILDFISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQRLQRMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQMHHHHHH SEQ ID NO：2；
编码IL-6-MH1的核苷酸序列：
CCAGTGCCACCTGGAGAGGACAGCAAGGATGTGGCTGCTCCACACAGGCAGCCTCTGACCTCTTCCGAGAGGATCGACAAGCAGATCCGGGACATCCTGGACTTCATCAGCGCCCTGCGGAAGGAGACATGCAACAAGTCTAATATGTGCGAGAGCTCTAAGGAGGCCCTGGCTGAGAACAATCTGAACCTGCCCAAGATGGCTGAGAAGGATGGCTGCTTCCAGTCTGGCTTTAATGAGGAGACCTGTCTGGTGAAGATCATCACAGGCCTGCTGGAGTTCGAGGTGTACCTGGAGTATCTGCAGAACAGATTTGAGTCCAGCGAGGAGCAGGCCCGCGCTGTGCAGATGTCTACCAAGGTGCTGATCCAGTTCCTGCAGAAGAAGGCCAAGAATCTGGACGCTATCACCACACCTGATCCAACCACAAACGCCTCCCTGCTGACAAAGCTGCAGGCTCAGAATCAGAGGCTGCAGCGGATGACCACACACCTGATCCTGAGATCCTTCAAGGAGTTTCTGCAGTCTTCCCTGAGAGCCCTGCGCCAGATGCATCATCATCATCATCAT
SEQ ID NO：5；
Fc的氨基酸序列如下：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：4；
IL-6-M1-Fc的氨基酸序列：
PVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRDILDFISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQRLQRMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQMEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：7；
IL-6-M1-Fc的核苷酸序列：
CCAGTGCCACCTGGAGAGGACAGCAAGGATGTGGCTGCTCCACACAGGCAGCCTCTGACCTCTTCCGAGAGGATCGACAAGCAGATCCGGGACATCCTGGACTTCATCAGCGCCCTGCGGAAGGAGACATGCAACAAGTCTAATATGTGCGAGAGCTCTAAGGAGGCCCTGGCTGAGAACAATCTGAACCTGCCCAAGATGGCTGAGAAGGATGGCTGCTTCCAGTCTGGCTTTAATGAGGAGACCTGTCTGGTGAAGATCATCACAGGCCTGCTGGAGTTCGAGGTGTACCTGGAGTATCTGCAGAACAGATTTGAGTCCAGCGAGGAGCAGGCCCGCGCTGTGCAGATGTCTACCAAGGTGCTGATCCAGTTCCTGCAGAAGAAGGCCAAGAATCTGGACGCTATCACCACACCTGATCCAACCACAAACGCCTCCCTGCTGACAAAGCTGCAGGCTCAGAATCAGAGGCTGCAGCGGATGACCACACACCTGATCCTGAGATCCTTCAAGGAGTTTCTGCAGTCTTCCCTGAGAGCCCTGCGCCAGATGGAGCCTAAGAGCTGCGACAAGACCCATACATGCCCACCATGTCCAGCTCCTGAGCTGCTGGGAGGACCATCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGCACCCCCGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTTAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACCAAGCCAAGGGAGGAGCAGTACAACTCTACCTATCGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGCCCTGCCAGCTCCCATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCACAGGTGTACACACTGCCCCCTTCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCTTCTGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCAGAGAACAATTACAAGACCACACCACCCGTGCTGGACTCCGATGGCAGCTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGATAAGTCTCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTAGCTGCTCTGTGATGCATGAGGCTCTGCACAATCATTATACACAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCCGGCAAGTAA
SEQ ID NO：8。
1.2表达IL-6-MH1和IL-6-M1-Fc融合蛋白
通过热激法将得到的含有编码IL-6-MH1和IL-6-M1-Fc融合蛋白的表达载体分别转化到DH5α(购自天根生化科技有限公司)中，利用质粒提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取不包含内毒素的质粒。随后，将获得的分别包含编码IL-6-MH1和IL-6-M1-Fc融合蛋白的核苷酸序列的质粒分别转染到293F细胞(购自天根生化科技有限公司)中进行表达。采用珠海恺瑞生物科技有限公司转染试剂，按照制造商的说明书进行转染。具体操作步骤如下：将含有转染试剂的离心管中所有液体转移至含质粒的离心管中，轻轻吹打混匀；室温下静置10分钟制备出质粒-载体复合物；从恒温摇床中取出293F细胞，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回CO2恒温摇床中培养，3小时后加入适量抗生素(氨苄青霉素和卡那霉素，购自生工生物)。转染24小时后加入600μl 293F细胞蛋白表达增强剂KE-293(购自珠海恺瑞生物科技有限公司)，以增加产物表达量；5天后分别收集表达IL-6-MH1和IL-6-M1-Fc融合蛋白的细胞培养液。
1.3纯化IL-6-MH1和IL-6-M1-Fc融合蛋白
分别收集上一步骤表达IL-6-MH1和IL-6-M1-Fc融合蛋白的细胞培养液后，离心过滤去掉细胞，通过蛋白A色谱法纯化IL-6-M1-Fc融合蛋白，通过Ni-NTA色谱法纯化IL-6-MH1。
蛋白A色谱法纯化IL-6-M1-Fc融合蛋白：使用20mM pH7.4的磷酸盐缓冲液(PB)作为平衡缓冲液、20mM pH7.4的磷酸盐缓冲液(PB)作为洗涤缓冲液以及100mM pH 2.7甘氨酸溶液作为洗脱缓冲液。具体步骤如下：收集上一步骤表达IL-6-M1-Fc融合蛋白的细胞培养液；在1000g转速下离心10min去掉细胞；在14000g转速下离心10min，两次，保留上清。用15mL平衡缓冲液平衡蛋白A柱；以2ml/min的流速上样；使用洗涤缓冲液，以2ml/min的流速除去蛋白杂质；使用洗脱缓冲液以2ml/min的流速收集目的蛋白。
Ni-NTA色谱法纯化IL-6-MH1：使用pH为7.5，含有25mmol/L的Tris-HCl、100mmol/LNaCl、5％甘油、5mmol/L咪唑的平衡缓冲液；pH为7.5，含有25mmol/L Tris-HCl、100mmol/LNaCl、5％甘油和20mmol/L咪唑的洗涤缓冲液；以及pH为7.5，含有25mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl、5％甘油和200mmol/L咪唑的洗脱缓冲液。具体步骤如下：收集上一步骤表达IL-6-MH1的细胞培养液；在1000g转速下离心10min去掉细胞；在14000g转速下离心10min，两次，保留上清。用15mL平衡缓冲液平衡Ni-NTA柱子；以2ml/min的流速上样；用洗涤缓冲液以2ml/min的流速除去蛋白杂质；使用洗脱缓冲液以2ml/min的流速收集目的蛋白。
实施例2、带6His标记的IL-6变体(IL-6-MH2)及其与Fc的融合蛋白(IL-6-M2-Fc)的制备
2.1带6His标记的IL-6变体(IL-6-MH2)及其与Fc的融合蛋白(IL-6-M2-Fc)的氨基酸以及核苷酸序列
与野生型IL-6(SEQ ID NO：1)相比，本发明的IL-6变体具有以下突变：
Y31D/G35F/S118R/V121D/W157R/D160R/S176A；
委托金斯瑞生物科技有限公司合成编码IL-6-MH2的多核苷酸序列。
带6His标记的IL-6变体(IL-6-MH2)的氨基酸序列和编码其的核苷酸序列分别如下：
IL-6-MH2的氨基酸序列：
PVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRDILDFISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMRTKDLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQRLQRMTTHLILRSFKEFLQASLRALRQMHHHHHH
SEQ ID NO：3；
编码IL-6-MH2的核苷酸序列：
CCAGTGCCACCTGGAGAGGACTCTAAGGATGTGGCTGCTCCACACAGGCAGCCTCTGACCTCTTCCGAGAGAATCGACAAGCAGATCCGCGACATCCTGGACTTCATCAGCGCCCTGCGGAAGGAGACATGCAACAAGTCTAATATGTGCGAGAGCTCTAAGGAGGCCCTGGCTGAGAACAATCTGAACCTGCCCAAGATGGCTGAGAAGGATGGCTGCTTCCAGTCTGGCTTTAATGAGGAGACCTGTCTGGTGAAGATCATCACAGGCCTGCTGGAGTTCGAGGTGTACCTGGAGTATCTGCAGAACAGGTTTGAGTCCAGCGAGGAGCAGGCCAGGGCTGTGCAGATGCGGACCAAGGACCTGATCCAGTTCCTGCAGAAGAAGGCCAAGAATCTGGACGCTATCACCACACCTGATCCAACCACAAACGCCTCCCTGCTGACAAAGCTGCAGGCTCAGAATCAGAGGCTGCAGCGGATGACCACACACCTGATCCTGAGATCCTTCAAGGAGTTTCTGCAGGCCAGCCTGAGAGCTCTGCGCCAGATGCATCATCATCATCATCAT
SEQ ID NO：6；
Fc的氨基酸序列如下：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：4；
IL-6-M2-Fc的氨基酸序列：
PVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRDILDFISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMRTKDLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQRLQRMTTHLILRSFKEFLQASLRALRQMEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：9；
IL-6-M2-Fc的核苷酸序列：
CCAGTGCCACCTGGAGAGGACTCTAAGGATGTGGCTGCTCCACACAGGCAGCCTCTGACCTCTTCCGAGAGAATCGACAAGCAGATCCGCGACATCCTGGACTTCATCAGCGCCCTGCGGAAGGAGACATGCAACAAGTCTAATATGTGCGAGAGCTCTAAGGAGGCCCTGGCTGAGAACAATCTGAACCTGCCCAAGATGGCTGAGAAGGATGGCTGCTTCCAGTCTGGCTTTAATGAGGAGACCTGTCTGGTGAAGATCATCACAGGCCTGCTGGAGTTCGAGGTGTACCTGGAGTATCTGCAGAACAGGTTTGAGTCCAGCGAGGAGCAGGCCAGGGCTGTGCAGATGCGGACCAAGGACCTGATCCAGTTCCTGCAGAAGAAGGCCAAGAATCTGGACGCTATCACCACACCTGATCCAACCACAAACGCCTCCCTGCTGACAAAGCTGCAGGCTCAGAATCAGAGGCTGCAGCGGATGACCACACACCTGATCCTGAGATCCTTCAAGGAGTTTCTGCAGGCCAGCCTGAGAGCTCTGCGCCAGATGGAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACCCATACATGCCCACCATGTCCAGCTCCTGAGCTGCTGGGAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGCACCCCCGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTTAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCTAAGACCAAGCCAAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATCGGGTGGTGAGCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGCCCTGCCAGCTCCCATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCACAGGTGTACACACTGCCCCCTTCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCTTCTGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCAGAGAACAATTACAAGACCACACCACCCGTGCTGGACAGCGATGGCTCTTTCTTTCTGTATTCTAAGCTGACCGTGGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTTTCTTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAATCATTATACACAGAAGAGCCTGTCTCTGTCCCCCGGCAAGTAA SEQ ID NO：10。
2.2表达IL-6-MH2和IL-6-M2-Fc融合蛋白
通过热激法将得到的含有编码IL-6-MH2和IL-6-M2-Fc融合蛋白的表达载体分别转化到DH5α(购自天根生化科技有限公司)中，利用质粒提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取不包含内毒素的质粒。随后，将获得的分别包含编码IL-6-MH2和IL-6-M2-Fc融合蛋白的核苷酸序列的质粒分别转染到293F细胞中进行表达。采用珠海恺瑞生物科技有限公司转染试剂，按照制造商的说明书进行转染。具体操作步骤如下：将含有转染试剂的离心管中所有液体转移至含质粒的离心管中，轻轻吹打混匀；室温下静置10分钟制备出质粒-载体复合物；从恒温摇床中取出293F细胞(购自天根生化科技有限公司)，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回CO2恒温摇床中培养，3小时后加入适量抗生素(氨苄霉素和卡那霉素，购自生工生物)。转染24小时后加入600μl 293F细胞蛋白表达增强剂KE-293(购自珠海恺瑞生物科技有限公司)，以增加产物表达量；5天后分别收集表达IL-6-MH1和IL-6-M1-Fc融合蛋白的细胞培养液。
2.3纯化IL-6MH2和IL-6M2-Fc融合蛋白
IL-6-MH2和IL-6-M2-Fc融合蛋白的纯化方法分别同IL-6-MH1和IL-6-M1-Fc融合蛋白，通过Ni-NTA色谱法纯化IL-6-MH2，通过蛋白A色谱法纯化IL-6-M2-Fc融合蛋白。
实施例3、血清循环半衰期测定
对SD(Sprague Dawley)远交群大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)以20ug/kg的剂量分别单次皮下注射以下样品：IL-6-MH1、IL-6-MH2、IL-6-M1-Fc、IL-6-M2-Fc。并于注射样品0，2，4，8，16，32，64，128h后从眼眶静脉取血，并在1000rpm转速下离心5min，并分离血浆。然后用ELISA试剂盒(IL-6检测试剂盒，购自依科赛生物)检测血浆中样品浓度。本实验具体采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-6单抗包被于酶标板上，血浆中和标准品(试剂盒中已知浓度的IL-6)中的IL-6会与单抗结合形成免疫复合物，游离的成分被洗去；加入生物素化的抗人IL-6抗体，生物素化抗人IL-6抗体与酶标板上结合的标准品或血浆中的IL-6结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去；加入辣根过氧化物酶标记的亲合素，亲合素与生物素特异性结合，游离的成分被洗去。加入显色底物(显色剂)，在反应孔中有IL-6存在的情况下，辣根过氧化物酶使无色的显色剂变蓝，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-6浓度与OD450值之间呈正相关，绘制标准曲线求出标本中IL-6浓度。
结果发现，如图1所示，融合Fc的IL-6变体IL-6-M1-Fc和IL-6-M2-Fc半衰期明显增加。
实施例4、IL-6变体对IL-6R的亲和力的测定
使用表面等离子体共振生物传感器来测量IL-6变体对IL-6R(购自北京义翘神州生物技术有限公司)的结合动力学和亲合力。亲和力分析通过SPR进行分析，所用仪器为Biacore,T200(购自GE Healthcare)；流动相(GE,BR-1006-69)。除非另有说明，可以从GE公司购买本测定所需所有试剂和材料。
通过胺偶联方法将适量的蛋白IL6R固定在传感芯片CM5(GE Healthcare)上并且捕获目标蛋白，其中用pH5.0的稀释液(GE,BR-1003-51)将IL-6R稀释至10μg/mL，进行氨基偶联；选用IL-6R抗体(购自Affinity Biosciences)、IL-6(购自金斯瑞生物科技有限公司)、IL-6-MH1、IL-6-MH2为分析物，检测其与IL-6R间的亲和力。分析物梯度稀释后(100nM,50nM,25nM,10nM,5nM)，以流速10μl/min的流速流入芯片，分析物与IL-6R结合时间180s，解离时间600s。为了再生传感芯片，使用Glycine-HCl，pH3.0溶液(GE,BR-1003-57)进行再生，时间为30s，流速为30μl/min。检测样品依次为IL-6R抗体、IL-6-MH1、IL-6-MH2、IL-6。基于结合速率常数ka(1/Ms)和解离速率常数kd(1/s)(其是从通过测量获得的传感图计算的动力学参数)计算每个样品对于人IL-6R的KD(M)。Biocore T200评价软件(GE Healthcare)用于计算每个参数。
表2.变体IL-6-MH1和IL-6-MH2对IL-6R的亲和力
Figure BDA0002498227730000191
Figure BDA0002498227730000201
结果表明，本发明获得的IL-6变体IL-6-MH1和IL-6-MH2与IL-6相比，对IL-6R具有相当的亲和力。变体IL-6MH1和IL-6MH2维持与IL-6R的结合能力,有利于阻断IL-6的信号通路传导。
实施例5、在HepG2细胞中检测IL-6变体对IL-6诱导的触珠蛋白转录水平的影响
本实施例中，在细胞水平上检测IL-6变体对IL-6的信号通路的阻断。根据报道(参见Identification of Two Novel Regions of Human IL-6Responsible for ReceptorBinding and Signal Transduction；Brakenhoff etal.J Immunol 153:1744-1753,1994.05)IL-6诱导的信号通路可以激发触珠蛋白的表达。在本实施例中，通过采取RT-PCR法，考察本发明的IL-6变体IL-6-M1和IL-6-M2在HepG2细胞中对IL-6诱导的触珠蛋白转录水平的影响。
首先，将HepG2细胞培养于24孔板中，所用培养基：含有10％FBS(购自gibco公司)的MEM培养基(购自gibco公司)，铺满细胞后，平行地设置以下组实验：1)仅加入10ng IL-6(购自金斯瑞生物科技有限公司)；2)同时加入10ng IL-6和4ug的IL-6-MH1变体；3)同时加入10ng IL-6和4ug的IL-6-MH2变体；4)同时加入10ng IL-6和4ug的IL-6R抗体(购自Affinity Biosciences)，作为阳性对照。溶解以上IL-6及IL-6变体IL-6-MH1和IL-6-MH2所用的缓冲液为：25mM Tris-HCl(pH7.5),100mM NaCl,5％甘油。
18h后破碎细胞，采用RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，TRNzol Universal总RNA提取试剂)提取RNA，采用反转录试剂盒(天根生化科技有限公司，FastKing cDNA第一链合成试剂盒)反转录获取cDNA，检测触珠蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)转录水平，以GAPDH为内参，得到的结果见图2。
从图2的结果可以看出：在IL-6刺激下，触珠蛋白转录水平提高了5.5倍。但是在加入IL-6的同时加入IL-6-MH1变体或IL-6-MH2变体的情况下，触珠蛋白转录水平明显下降。说明IL-6-MH1变体或IL-6-MH2变体使信号传导中断，阻断了IL-6的信号通路传导。
实施例6、在Panc-1细胞中检测IL-6变体对IL-6诱导的STAT3磷酸化水平的影响
本实施例中，在细胞水平上检测IL-6变体对IL-6诱导的信号通路的阻断。根据IL-6stimulates STAT3 and Pim-1kinase in pancreatic cancer celllines.Pancreas.2012July；41(5):773–781的报道，IL-6的信号通路可以诱导p-STAT3的表达。具体实验：将Panc-1细胞培养于6孔板，所用培养基为含有10％FBS(购自gibco公司)的MEM(购自gibco公司)培养基；铺满细胞后，平行地设置以下实验组：1)不作任何处理的Panc-1细胞，记作NC组；2)仅加入100ng IL-6；3)加入100ng IL-6后，加入40μg的IL-6-MH1变体；4)加入100ng IL-6后，加入40μg的IL-6-MH2变体；5)加入40μg的IL-6R抗体(货号DF6466，购自Affinity Biosciences)。溶解以上IL-6及IL-6变体IL-6-MH1和IL-6-MH2以及IL-6R抗体所用的缓冲液为：25mM Tris-HCl(pH7.5),100mM NaCl,5％甘油。1h后，破碎细胞，提取蛋白，采用Western blot检测p-STAT3的含量，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为对照，得到结果见图3。
从图3的结果可以看出，IL-6诱导p-STAT3的表达增加，而IL-6的变体IL-6-MH1和IL-6-MH2均能抑制IL-6诱导的p-STAT3的表达增加。同样说明IL-6-MH1变体或IL-6-MH2变体结合IL-6R形成的复合体使下游信号传导中断，阻断了IL-6的信号通路传导。
序列表
<110> 甘李药业股份有限公司
<120> IL-6变体及其用途
<130> 380092CG
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 184
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg
1 5 10 15
Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile
20 25 30
Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn
35 40 45
Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu
50 55 60
Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu
65 70 75 80
Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val
85 90 95
Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala
100 105 110
Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys
115 120 125
Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn
130 135 140
Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp
145 150 155 160
Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met
180
<210> 2
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(184)
<223> 带6His标记的IL-6变体（IL-6-MH1）
<400> 2
Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg
1 5 10 15
Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Asp Ile
20 25 30
Leu Asp Phe Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn
35 40 45
Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu
50 55 60
Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu
65 70 75 80
Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val
85 90 95
Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala
100 105 110
Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys
115 120 125
Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn
130 135 140
Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Arg Leu Gln Arg
145 150 155 160
Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met His His His His His His
180 185 190
<210> 3
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(184)
<223> 带6His标记的IL-6变体（IL-6-MH2）
<400> 3
Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg
1 5 10 15
Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Asp Ile
20 25 30
Leu Asp Phe Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn
35 40 45
Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu
50 55 60
Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu
65 70 75 80
Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val
85 90 95
Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala
100 105 110
Arg Ala Val Gln Met Arg Thr Lys Asp Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys
115 120 125
Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn
130 135 140
Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Arg Leu Gln Arg
145 150 155 160
Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ala
165 170 175
Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met His His His His His His
180 185 190
<210> 4
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 5
<211> 570
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(570)
<223> 编码IL-6-MH1的核苷酸序列
<400> 5
ccagtgccac ctggagagga cagcaaggat gtggctgctc cacacaggca gcctctgacc 60
tcttccgaga ggatcgacaa gcagatccgg gacatcctgg acttcatcag cgccctgcgg 120
aaggagacat gcaacaagtc taatatgtgc gagagctcta aggaggccct ggctgagaac 180
aatctgaacc tgcccaagat ggctgagaag gatggctgct tccagtctgg ctttaatgag 240
gagacctgtc tggtgaagat catcacaggc ctgctggagt tcgaggtgta cctggagtat 300
ctgcagaaca gatttgagtc cagcgaggag caggcccgcg ctgtgcagat gtctaccaag 360
gtgctgatcc agttcctgca gaagaaggcc aagaatctgg acgctatcac cacacctgat 420
ccaaccacaa acgcctccct gctgacaaag ctgcaggctc agaatcagag gctgcagcgg 480
atgaccacac acctgatcct gagatccttc aaggagtttc tgcagtcttc cctgagagcc 540
ctgcgccaga tgcatcatca tcatcatcat 570
<210> 6
<211> 570
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(570)
<223> 编码IL-6-MH2的核苷酸序列
<400> 6
ccagtgccac ctggagagga ctctaaggat gtggctgctc cacacaggca gcctctgacc 60
tcttccgaga gaatcgacaa gcagatccgc gacatcctgg acttcatcag cgccctgcgg 120
aaggagacat gcaacaagtc taatatgtgc gagagctcta aggaggccct ggctgagaac 180
aatctgaacc tgcccaagat ggctgagaag gatggctgct tccagtctgg ctttaatgag 240
gagacctgtc tggtgaagat catcacaggc ctgctggagt tcgaggtgta cctggagtat 300
ctgcagaaca ggtttgagtc cagcgaggag caggccaggg ctgtgcagat gcggaccaag 360
gacctgatcc agttcctgca gaagaaggcc aagaatctgg acgctatcac cacacctgat 420
ccaaccacaa acgcctccct gctgacaaag ctgcaggctc agaatcagag gctgcagcgg 480
atgaccacac acctgatcct gagatccttc aaggagtttc tgcaggccag cctgagagct 540
ctgcgccaga tgcatcatca tcatcatcat 570
<210> 7
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(416)
<223> IL-6-M1-Fc的氨基酸序列
<400> 7
Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg
1 5 10 15
Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Asp Ile
20 25 30
Leu Asp Phe Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn
35 40 45
Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu
50 55 60
Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu
65 70 75 80
Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val
85 90 95
Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala
100 105 110
Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys
115 120 125
Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn
130 135 140
Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Arg Leu Gln Arg
145 150 155 160
Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
180 185 190
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
195 200 205
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
210 215 220
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
225 230 235 240
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
245 250 255
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
260 265 270
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
275 280 285
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
290 295 300
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
305 310 315 320
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
325 330 335
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
340 345 350
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
355 360 365
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
370 375 380
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
385 390 395 400
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 8
<211> 1251
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1251)
<223> IL-6-M1-Fc的核苷酸序列
<400> 8
ccagtgccac ctggagagga cagcaaggat gtggctgctc cacacaggca gcctctgacc 60
tcttccgaga ggatcgacaa gcagatccgg gacatcctgg acttcatcag cgccctgcgg 120
aaggagacat gcaacaagtc taatatgtgc gagagctcta aggaggccct ggctgagaac 180
aatctgaacc tgcccaagat ggctgagaag gatggctgct tccagtctgg ctttaatgag 240
gagacctgtc tggtgaagat catcacaggc ctgctggagt tcgaggtgta cctggagtat 300
ctgcagaaca gatttgagtc cagcgaggag caggcccgcg ctgtgcagat gtctaccaag 360
gtgctgatcc agttcctgca gaagaaggcc aagaatctgg acgctatcac cacacctgat 420
ccaaccacaa acgcctccct gctgacaaag ctgcaggctc agaatcagag gctgcagcgg 480
atgaccacac acctgatcct gagatccttc aaggagtttc tgcagtcttc cctgagagcc 540
ctgcgccaga tggagcctaa gagctgcgac aagacccata catgcccacc atgtccagct 600
cctgagctgc tgggaggacc atccgtgttc ctgtttcctc caaagcccaa ggataccctg 660
atgatctctc gcacccccga ggtgacatgc gtggtggtgg acgtgtccca cgaggacccc 720
gaggtgaagt ttaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gaccaagcca 780
agggaggagc agtacaactc tacctatcgg gtggtgtccg tgctgacagt gctgcaccag 840
gattggctga acggcaagga gtataagtgc aaggtgagca ataaggccct gccagctccc 900
atcgagaaga ccatctctaa ggccaagggc cagcctagag agccacaggt gtacacactg 960
cccccttccc gcgaggagat gaccaagaac caggtgagcc tgacatgtct ggtgaagggc 1020
ttctatcctt ctgacatcgc tgtggagtgg gagtccaatg gccagccaga gaacaattac 1080
aagaccacac cacccgtgct ggactccgat ggcagcttct ttctgtatag caagctgacc 1140
gtggataagt ctcggtggca gcagggcaac gtgtttagct gctctgtgat gcatgaggct 1200
ctgcacaatc attatacaca gaagtccctg agcctgtctc ccggcaagta a 1251
<210> 9
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(416)
<223> IL-6-M2-Fc的氨基酸序列
<400> 9
Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg
1 5 10 15
Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Asp Ile
20 25 30
Leu Asp Phe Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn
35 40 45
Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu
50 55 60
Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu
65 70 75 80
Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val
85 90 95
Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala
100 105 110
Arg Ala Val Gln Met Arg Thr Lys Asp Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys
115 120 125
Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn
130 135 140
Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Arg Leu Gln Arg
145 150 155 160
Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ala
165 170 175
Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
180 185 190
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
195 200 205
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
210 215 220
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
225 230 235 240
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
245 250 255
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
260 265 270
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
275 280 285
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
290 295 300
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
305 310 315 320
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
325 330 335
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
340 345 350
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
355 360 365
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
370 375 380
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
385 390 395 400
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 10
<211> 1251
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1251)
<223> IL-6-M2-Fc的核苷酸序列
<400> 10
ccagtgccac ctggagagga ctctaaggat gtggctgctc cacacaggca gcctctgacc 60
tcttccgaga gaatcgacaa gcagatccgc gacatcctgg acttcatcag cgccctgcgg 120
aaggagacat gcaacaagtc taatatgtgc gagagctcta aggaggccct ggctgagaac 180
aatctgaacc tgcccaagat ggctgagaag gatggctgct tccagtctgg ctttaatgag 240
gagacctgtc tggtgaagat catcacaggc ctgctggagt tcgaggtgta cctggagtat 300
ctgcagaaca ggtttgagtc cagcgaggag caggccaggg ctgtgcagat gcggaccaag 360
gacctgatcc agttcctgca gaagaaggcc aagaatctgg acgctatcac cacacctgat 420
ccaaccacaa acgcctccct gctgacaaag ctgcaggctc agaatcagag gctgcagcgg 480
atgaccacac acctgatcct gagatccttc aaggagtttc tgcaggccag cctgagagct 540
ctgcgccaga tggagcctaa gtcctgcgac aagacccata catgcccacc atgtccagct 600
cctgagctgc tgggaggacc aagcgtgttc ctgtttcctc caaagcccaa ggataccctg 660
atgatctctc gcacccccga ggtgacatgc gtggtggtgg acgtgtccca cgaggacccc 720
gaggtgaagt ttaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgctaa gaccaagcca 780
agggaggagc agtacaactc cacctatcgg gtggtgagcg tgctgacagt gctgcaccag 840
gattggctga acggcaagga gtataagtgc aaggtgagca ataaggccct gccagctccc 900
atcgagaaga ccatctctaa ggccaagggc cagcctagag agccacaggt gtacacactg 960
cccccttccc gcgaggagat gaccaagaac caggtgagcc tgacatgtct ggtgaagggc 1020
ttctatcctt ctgacatcgc tgtggagtgg gagtccaatg gccagccaga gaacaattac 1080
aagaccacac cacccgtgct ggacagcgat ggctctttct ttctgtattc taagctgacc 1140
gtggataagt ccagatggca gcagggcaac gtgttttctt gctccgtgat gcatgaggct 1200
ctgcacaatc attatacaca gaagagcctg tctctgtccc ccggcaagta a 1251

Claims (10)

1.一种IL-6变体，其具有选自SEQ ID NO：1的位置上Y31、G35、W157、D160、S118、V121或S176的一个或多个取代突变。
2.根据权利要求1所述的IL-6变体，其与野生型IL-6的氨基酸序列相比，具有选自Y31D、G35F、S118R、V121D、W157R、D160R或S176A的一个或多个取代突变。
3.根据权利要求1所述的IL-6变体，其与野生型IL-6相比，具有Y31D、G35F、W157R和D160R的取代突变或Y31D、G35F、S118R、V121D、W157R、D160R和S176A的取代突变。
4.根据权利要求1所述的IL-6变体，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸位置1-184或SEQ IDNO：3的氨基酸位置1-184所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：2的氨基酸位置1-184或SEQID NO：3的氨基酸位置1-184所示的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列。
5.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含权利要求1-4中任一项所述的IL-6变体和抗体的Fc部分，所述抗体的Fc部分源自人IgG，优选源自人IgG1；优选地，所述IL-6变体的N-末端或C-末端直接地或间接地融合至抗体的Fc部分的C-末端或N-末端；更优选地，所述IL-6变体的N-末端或C-末端直接融合至抗体的Fc部分的C-末端或N-末端；更优选地，所述IL-6变体的N-末端或C-末端通过肽接头间接地融合至抗体的Fc部分的C-末端或N-末端。
6.一种药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的IL-6变体或权利要求5所述的融合蛋白，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
7.编码权利要求1-4中任一项所述的IL-6变体或权利要求5所述的融合蛋白的核酸分子。
8.包含权利要求7所述的核酸分子的载体。
9.包含权利要求8所述的载体的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞选自植物细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞和原核细胞；更优选地所述宿主细胞选自CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、COS细胞和HeLa细胞。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的IL-6变体、根据权利要求5所述的融合蛋白、根据权利要求6所述的药物组合物、根据权利要求7所述的核酸分子、根据权利要求8所述的载体或根据权利要求9所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防IL-6相关疾病或病症的药物中的用途；优选地，所述IL-6相关疾病或病症选自炎性疾病、肿瘤、感染性疾病或自身免疫性疾病；具体地，其中所述炎性疾病包括但不限于，类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、全身发作幼年特发性关节炎、骨关节炎、败血症、哮喘、间质性肺疾病、炎性肠疾病、系统性硬化症、眼内炎症、格雷夫斯病、子宫内膜异位、系统性硬化症、成人斯蒂尔病、淀粉样蛋白A淀粉样变性、风湿性多肌痛、缓解型血清阴性对称性滑膜炎伴凹陷性水肿、白塞氏病、葡萄膜炎、移植物抗宿主病和TNFR(肿瘤坏死因子受体)-相关周期性综合征；所述肿瘤包括但不限于多发性骨髓瘤、白血病、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、恶病质、黑素瘤、子宫颈癌、卵巢癌、淋巴瘤、胃肠道癌、肺癌、前列腺癌、肾细胞癌、转移性肾癌、实体瘤、非小细胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、膀胱癌、口腔癌、骨髓增生性肿瘤、B细胞淋巴增生性疾病和浆细胞白血病、非小细胞肺癌、神经胶质瘤；所述感染性疾病包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类T淋巴细胞病毒(HTLV)、脑型疟疾、泌尿道感染和脑膜炎球菌感染；所述自身免疫性疾病包括但不限于细胞因子风暴(CRS)、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、多肌炎、包括巨细胞性动脉炎、高安动脉炎在内的血管炎综合症、冷球蛋白血症、髓过氧化物酶抗嗜中性粒细胞胞质抗体相关新月体性肾小球肾炎、类风湿血管炎、克罗恩病、复发性多软骨炎、获得性血友病A和自身免疫性溶血性贫血；最优选地，所述IL-6相关疾病或病症选自多发性硬化症、神经胶质瘤、细胞因子风暴(CRS)或系统性红斑狼疮。
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