JP2021507710A - 血液脳関門を通過してウイルスベクターを送達するための方法および組成物 - Google Patents

血液脳関門を通過してウイルスベクターを送達するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して細胞への形質導入を増強する表面結合ペプチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を本明細書において開示する。また、ＢＢＢを通過して細胞への形質導入を増強するポリペプチドの挿入を含む修飾ＡＡＶカプシドタンパク質、および修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を本明細書において開示する。特異性ペプチドを提供する。また、脳および／または中枢神経系の細胞に核酸を投与／送達する、医薬製剤および方法を開示する。

Description

優先権の記載
本出願は、米国特許法３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）の下、２０１７年１２月１９日出願の米国仮特許出願第６２／６０７，６６２号の利点を主張し、この全内容を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
配列表の電子出願に関する記載
米国特許法３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．第１．８２１条の下に提出され、５４７０−８３０ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題し、３８，７６８バイトのサイズで、２０１８年１２月１９日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより出願された、ＡＳＣＩＩテキストフォーマットの配列表は、紙面による複写の代わりに提供する。この配列表は、この開示を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
本発明では、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過してＡＡＶベクターを送達するための組成物および方法を示す。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、治療遺伝子送達の最も有望な媒体のうちの１つであり、数十年の間、利用および開発されている。大規模な前臨床試験のため、ｒＡＡＶベクターによる臨床試験が、ますます進行しており、盲患者および血友病患者において大きな成功を収めている。ｒＡＡＶベクターはまた、神経障害に対するプラットフォームとしての見込みをも示している。げっ歯類における実質内注入では、同定されている１２種のＡＡＶ血清型の中でもＡＡＶ血清型７、８および９を含む、一部の血清型は、ニューロンに効率的に形質導入する能力を実証した。臨床試験の大多数により採用されている実質内注入により、ＡＡＶベクターを脳の局所領域に良好に送達することが可能となることは注目に値するが、ほとんどの神経変性障害は、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、レット症候群、およびハンチントン病等、複数領域における細胞傷害が関与する。ＡＡＶ９は、静脈内注入後に、脳実質細胞および血液脳関門（ＢＢＢ）内皮の部分に形質導入する優れた能力を有する。ＡＡＶ９を全身投与すると、新生児脳ではニューロンへの広範な遺伝子導入が生じるが、成人ではニューロンへの形質導入はそれほど有効ではない。したがって、ＢＢＢは依然として、全身投与による中枢神経系（ＣＮＳ）へのＡＡＶ媒介遺伝子送達の大きな障害となっている。
本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過してウイルスベクターを送達し、細胞への形質導入を増強するための組成物および方法を提供することにより、当技術分野におけるこれまでの欠点を克服する。
本発明の態様は、表面結合ペプチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、ＡＡＶ粒子の表面に結合するペプチドが、Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、ＧＳＨ、ＨＩＶ−１ ＴＡＴ（４８〜６０）、ＡｐｏＥ（１５９〜１６７）２、レプチン３０（６１〜９０）、ＴＨＲ、ＰＢ５−３、ＰＢ５−５、ＰＢ５−１４、またはこれらの任意の組合せである、ＡＡＶ粒子に関する。
種々の実施形態では、ＡＡＶは、表１に列挙する血清型、または表１に列挙する血清型の任意の組合せである。
種々の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ９．４５または任意のバリアント、ミュータントあるいはこれらの組合せである。
種々の実施形態では、ＡＡＶ粒子の表面に結合するタンパク質は、１ＡＡＶ粒子あたり約２０００タンパク質分子〜１ＡＡＶ粒子あたり約４×１０７タンパク質分子の範囲の量で、ＡＡＶ粒子表面上に存在する。
種々の実施形態では、粒子は、異種核酸分子を含む。
種々の実施形態では、表面結合ペプチドは、表面結合タンパク質を欠くＡＡＶ粒子と比較して、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する形質導入活性が増強されている。
種々の実施形態では、表面結合タンパク質を含むＡＡＶ粒子は、脳および／または中枢神経系の細胞への形質導入活性が増強されている。
本発明の別の態様は、上記のＡＡＶ粒子を、薬学的に許容される担体中に含む医薬製剤に関する。
本発明の別の態様は、脳および／または中枢神経系の細胞に核酸を送達する方法に関する。方法は、上記のＡＡＶ粒子、または上記の医薬製剤と細胞を接触させるステップを含む。
本発明の別の態様は、対象の脳および／または中枢神経系の細胞に核酸を投与する方法に関する。方法は、上記のＡＡＶ粒子、または上記の医薬製剤を対象に投与するステップを含む。実施形態では、ＡＡＶ粒子は、全身投与される。実施形態では、対象は、ヒト対象である。
本発明の別の態様は、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８〜５８９番目に対応するアミノ酸の位置にポリペプチドの挿入を含む、修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質に関する。ポリペプチドは、Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、ＧＳＨ、ＨＩＶ−１ ＴＡＴ（４８〜６０）、ＡｐｏＥ（１５９〜１６７）２、レプチン３０（６１〜９０）、ＴＨＲ、ＰＢ５−３、ＰＢ５−５、またはＰＢ５−１４である。
一部の実施形態では、挿入されたポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮおよびＣの両末端にグリシンをさらに含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、表１に列挙するＡＡＶ血清型または表１に列挙する血清型の任意の組合せである。
一部の実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質である。
本発明の別の態様は、上記修飾ＡＡＶカプシドタンパク質のいずれか１つの修飾ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸分子に関する。
一部の実施形態では、核酸分子は、ベクター内に含まれる。
本発明の別の態様は、上記の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子に関する。
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、表１に列挙するＡＡＶ血清型または表１に列挙する血清型の任意の組合せである。
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ９．４５または任意のバリアント、ミュータントあるいはこれらの組合せである。
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、異種核酸分子をさらに含む。
一部の実施形態では、異種核酸分子は、治療ポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、挿入されたポリペプチドを欠くカプシドを有する対照ＡＡＶ粒子と比較して、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する形質導入活性が増強されている。
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、挿入されたポリペプチドを欠くカプシドを有する対照ＡＡＶ粒子と比較して、脳および／または中枢神経系の細胞への形質導入活性が増強されている。
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、対象の皮質、線条体、視床、小脳および脊髄の１つまたは複数への形質導入が増強されている。
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、対象のアストロサイト、ＣＣ１＋オリゴデンドロサイト；脳全体のＮｅｕＮ＋細胞、中脳チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）＋ドーパミン作動性ニューロン、カルビンジン＋小脳プルキンエ細胞、介在ニューロン集団およびＣＤ３１＋内皮細胞を含む神経細胞サブタイプの１つまたは複数への形質導入が増強されている。
本発明の別の態様は、薬学的に許容される担体中に、上記の修飾カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を含む医薬製剤、または上記の修飾カプシドタンパク質を含む医薬製剤に関する。
本発明の別の態様は、脳および／または中枢神経系の細胞に核酸を投与する方法であって、上記の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子、または上記の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含む医薬製剤と上記細胞を接触させるステップを含む方法に関する。
本発明の別の態様は、対象の脳および／または中枢神経系の細胞に核酸を送達する方法であって、上記の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子、または上記の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含む医薬製剤を上記対象に投与するステップを含む方法に関する。
方法の一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子または医薬製剤は、全身投与される。方法の一部の実施形態では、対象は、ヒト対象である。
本発明の別の態様は、障害または疾患の有益な治療における医薬としての使用のための本発明の、上記のＡＡＶベクター、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶビリオンおよび／または組成物に関する。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下に示す本発明の説明において、さらに詳細に取り組む。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞毒性を有さずにアデノ随伴ウイルス８型（ＡＡＶ８）による形質導入を増強するペプチドのスクリーニングを示す図である。ペプチドの細胞毒性を、ＭＴＴアッセイを使用して測定した。その後、種々の濃度のペプチドを細胞に加え４８時間置いた。 ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞毒性を有さずにアデノ随伴ウイルス８型（ＡＡＶ８）による形質導入を増強するペプチドのスクリーニングを示す図である。１０Ｅ＋０４ｖｇ／細胞のＡＡＶ８とペプチドとの種々の複合体の形質導入効率を、ＨＥＫ２９３およびＨｕｈ７細胞株において試験した。ＡＡＶ８形質導入のみの群と比較して、＊ｐ＜０．０５である。 ＴＨＲペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで、特には、脳において、ＡＡＶ８形質導入を有意に増強することを示す図である。５Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶ８−ＬｕｃのみまたはＡＡＶ８と０．１ｍＭのペプチドとの複合体を、静脈内注入により投与した。注入後１週に、ｉｎ ｖｉｖｏでの発光イメージングについて測定した。 ＴＨＲペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで、特には、脳において、ＡＡＶ８形質導入を有意に増強することを示す図である。５Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶ８−ＬｕｃのみまたはＡＡＶ８と０．１ｍＭのペプチドとの複合体を、静脈内注入により投与した。注入後１週に、光子シグナルを算出した。データは、５匹のマウスの平均および標準偏差を表す。ＡＡＶ８処置のみを受けた対照マウスと比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１および＊ｐ＜０．０５である。 ＴＨＲペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで、特には、脳において、ＡＡＶ８形質導入を有意に増強することを示す図である。５Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶ８−ＬｕｃのみまたはＡＡＶ８と０．１ｍＭのペプチドとの複合体を、静脈内注入により投与した。注入後３週に、マウスを安楽死させ、組織を回収してＤＮＡ抽出を行った。種々の組織ライセートのルシフェラーゼの相対発現レベルを個別に判定した。データは、５匹のマウスの平均および標準偏差を表す。ＡＡＶ８処置のみを受けた対照マウスと比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１および＊ｐ＜０．０５である。 ＴＨＲペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで、特には、脳において、ＡＡＶ８形質導入を有意に増強することを示す図である。５Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶ８−ＬｕｃのみまたはＡＡＶ８と０．１ｍＭのペプチドとの複合体を、静脈内注入により投与した。注入後３週に、マウスを安楽死させ、組織を回収してＤＮＡ抽出を行った。種々の組織ライセートのベクターコピー数を個別に判定した。データは、５匹のマウスの平均および標準偏差を表す。ＡＡＶ８処置のみを受けた対照マウスと比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１および＊ｐ＜０．０５である。 ペプチド極性がＡＡＶ８形質導入に有意には作用しなかったことを示す図である。ＡＡＶ８または複合体の投与後７日目に、発光発現についてイメージングを取得した。 ペプチド極性がＡＡＶ８形質導入に有意には作用しなかったことを示す図である。種々の群における肝臓および肝臓を除く全身についての平均ルシフェラーゼシグナルを算出した。データは、５匹のマウスの平均および標準偏差を表す。ＡＡＶ８処置のみを受けた対照マウスと比較して、＊＜０．０５である。 ペプチド極性がＡＡＶ８形質導入に有意には作用しなかったことを示す図である。注入後３週に、マウスを安楽死させ、組織を回収してＤＮＡ抽出を行った。肝臓および脳におけるルシフェラーゼの相対発現レベルを個別に判定した。データは、５匹のマウスの平均および標準偏差を表す。ＡＡＶ８処置のみを受けた対照マウスと比較して、＊＜０．０５である。 ペプチド極性がＡＡＶ８形質導入に有意には作用しなかったことを示す図である。注入後３週に、マウスを安楽死させ、組織を回収してＤＮＡ抽出を行った。肝臓および脳におけるベクターコピー数を個別に判定した。データは、５匹のマウスの平均および標準偏差を表す。ＡＡＶ８処置のみを受けた対照マウスと比較して、＊＜０．０５である。 ＴＨＲがｉｎ ｖｉｖｏで、特には、脳において、用量依存的にＡＡＶ８形質導入を増強することを示す図である。ＡＡＶ８または種々の用量の複合体の投与後３および７日目に、発光発現についてイメージングを取得した。 ＴＨＲがｉｎ ｖｉｖｏで、特には、脳において、用量依存的にＡＡＶ８形質導入を増強することを示す図である。種々の用量のＴＨＲで処置したマウスにおける肝臓および肝臓を除く全身についての平均ルシフェラーゼシグナルを算出した。ＡＡＶ８処置のみを受けた対照マウスと比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１および＊ｐ＜０．０５である。 ＴＨＲがｉｎ ｖｉｖｏで、特には、脳において、用量依存的にＡＡＶ８形質導入を増強することを示す図である。肝臓、脳および脾臓における遺伝子コピー数を個別に判定した。ＡＡＶ８処置のみを受けた対照マウスと比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１および＊ｐ＜０．０５である。 ＡＡＶ８とのＴＨＲ結合が形質導入の増強に必要であることを示す図である。ＡＡＶ８またはＴＨＲおよびＡＡＶ８の投与後３、７、１４および２１日目に、発光発現についてイメージングを取得した。 ＡＡＶ８とのＴＨＲ結合が形質導入の増強に必要であることを示す図である。種々の群における肝臓についての平均ルシフェラーゼシグナルを算出した。データは、５匹のマウスの平均および標準偏差を表す。ＡＡＶ８処置のみを受けた対照マウスと比較して、＊＜０．０５である。 ＡＡＶ８とのＴＨＲ結合が形質導入の増強に必要であることを示す図である。脳におけるルシフェラーゼの相対発現レベルを個別に判定した。データは、５匹のマウスの平均および標準偏差を表す。ＡＡＶ８処置のみを受けた対照マウスと比較して、＊＜０．０５である。 ＡＡＶ８とのＴＨＲ結合が形質導入の増強に必要であることを示す図である。脳におけるベクターコピー数を個別に判定した。データは、５匹のマウスの平均および標準偏差を表す。ＡＡＶ８処置のみを受けた対照マウスと比較して、＊＜０．０５である。 ＴＨＲがＡＡＶ８の生物学的性質に干渉しないことを示す図である。ＨＥＫ２９３およびＨｕｈ７細胞に１Ｅ＋０８のＡＡＶ８／ｌｕｃのみ、またはＡＡＶ８とＴＨＲとの複合体を、種々の濃度で形質導入した。４８時間後、ルシフェラーゼ発現を分析した。データは、３つの別々の感染の平均を表し、標準偏差をエラーバーにより示す。 ＴＨＲがＡＡＶ８の生物学的性質に干渉しないことを示す図である。ＴＨＲのＮａｂ力価に対する作用。最初に、１Ｅ＋０８のＡＡＶ８／ｌｕｃを５０μｌで、種々の濃度のＴＨＲとともに４℃で２時間インキュベートした。次いで、等容量の、種々の希釈の血清またはＰＢＳを３７℃で加え１時間置き、次いで、ＡＡＶとペプチドとの混合物および血清を細胞に加えた。最後に、形質導入後４８時間の後に細胞を溶解してルシフェラーゼアッセイを行い、Ｎａｂ力価を評価した。データは、３つの別々の感染の平均を表し、標準偏差をエラーバーにより示す。 ＴＨＲが血中のＡＡＶ８クリアランスを低下させることによりＡＡＶ８形質導入を増強したことを示す図である。マウスは、２Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ８／Ｌｕｃと０．１ｍＭのＴＨＲペプチドとのインキュベートした複合体で、後眼窩注入により免疫した。２日目および７日目にルシフェラーゼ発現を撮像した。 ＴＨＲが血中のＡＡＶ８クリアランスを低下させることによりＡＡＶ８形質導入を増強したことを示す図である。マウスは、２Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ８／Ｌｕｃと０．１ｍＭのＴＨＲペプチドとのインキュベートした複合体で、後眼窩注入により免疫した。 ＴＨＲが血中のＡＡＶ８クリアランスを低下させることによりＡＡＶ８形質導入を増強したことを示す図である。同時に、注入後種々の時点で、後眼窩神経叢から血液を採取し、ウイルス力価をｑＰＣＲにより試験した。 ＴＨＲが、ＡＡＶ８とＴＨＲとの複合体への曝露後、ＡＡＶ８の結合能を用量依存的に、およびｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞における経細胞輸送を時間依存的に、ベースライン活性化未満で増強することを示す図である。ＡＡＶ８のみ、またはＡＡＶ８とトランスフェリンもしくはＴＨＲとの複合体で処理したＨｕｈ７細胞の結合能を試験した。形質導入した細胞を４℃で１時間インキュベートし、次いで、ゲノムコピー数を測定し、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。すべての処理を３つ組で実施した。ＡＡＶ８処理のみを行った細胞と比較して、＊ｐ＜０．０５である。 ＴＨＲが、ＡＡＶ８とＴＨＲとの複合体への曝露後、ＡＡＶ８の結合能を用量依存的に、およびｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞における経細胞輸送を時間依存的に、ベースライン活性化未満で増強することを示す図である。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を単層形態に培養し、次いで、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８とＴＨＲとを個別に、またはＡＡＶ８−ＴＨＲ複合体のいずれかとともにインキュベートし、次いで、種々の時点で基底チャンバー内の培地を採取し、ウイルス力価をｑＰＣＲにより分析した。すべての処理を３つ組で実施した。ＡＡＶ８処理のみを行った細胞と比較して、＊ｐ＜０．０５である。 ＴＨＲペプチドが、ＡＡＶ８に結合するヒトトランスフェリンと競合することを示す図である。希釈したＨＳＡ（１：１００および１：１０００００の生理学的濃度）、ペプチド対照（１：１００および１：１０００００希釈）、ＴＨＲ（１：１００および１：１０００００希釈）およびＰＢＳ対照を使用して、Ｈｕｈ７細胞上のＡＡＶ８カプシドをｉｎ ｖｉｔｒｏで遮断した。次いで、ヒトトランスフェリン（１：１００の生理学的濃度）を混合物に個別に加え、トランスフェリン抗体を使用してプルダウンし、ＡＡＶ８の遺伝子コピー数をｑＰＣＲにより測定した。 ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞が、ＡＡＶ８とＴＨＲとの複合体に曝露後、ベースライン活性化を維持することを示す図である。種々の処理による膜透過性アッセイを、ＦＩＴＣ−デキストランを用いて行った。透過性の有意差は、認められなかった。 ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞が、ＡＡＶ８とＴＨＲとの複合体に曝露後、ベースライン活性化を維持することを示す図である。ウエスタンブロットにより、種々の群において初期から後期の時点で、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞における主要結合タンパク質ＺＯ−１の発現レベルの類似が示された。ＧＡＰＤＨは、同等タンパク質のローディングコントロールとして示す。 脳における神経細胞形質導入を生じる、ＴＨＲとｓｃＡＡＶ８−ＣＢｈ−ｅＧＦＰとの複合体の静脈内注入を示す図である。２×１０１１ｖｇのｓｃＡＡＶ８−ＣＢｈ−ｅＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ８−ｅＧＦＰ−０．４ｍＭ ＴＨＲのいずれかを、マウス（ｎ＝３）に後眼窩注入した。ＡＡＶ８のＥＧＦＰ発現（緑色）の代表的画像では、マウス脳の皮質においてＣＤ３１（赤色、内皮細胞マーカー）と共局在させ、ＤＡＰＩ（青色）とマージし、４週間後に撮像して評価した。スケールバーは５０μｍである（対物レンズ２０×光軸）。 脳における神経細胞形質導入を生じる、ＴＨＲとｓｃＡＡＶ８−ＣＢｈ−ｅＧＦＰとの複合体の静脈内注入を示す図である。２×１０１１ｖｇのｓｃＡＡＶ８−ＣＢｈ−ｅＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ８−ｅＧＦＰ−０．４ｍＭ ＴＨＲのいずれかを、マウス（ｎ＝３）に後眼窩注入した。ＡＡＶ８のＥＧＦＰ発現（緑色）の代表的画像では、マウス脳の皮質においてＧＦＡＰ（赤色、アストロサイトマーカー）と共局在させ、ＤＡＰＩ（青色）とマージし、４週間後に撮像して評価した。スケールバーは５０μｍである（対物レンズ２０×光軸）。 脳における神経細胞形質導入を生じる、ＴＨＲとｓｃＡＡＶ８−ＣＢｈ−ｅＧＦＰとの複合体の静脈内注入を示す図である。２×１０１１ｖｇのｓｃＡＡＶ８−ＣＢｈ−ｅＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ８−ｅＧＦＰ−０．４ｍＭ ＴＨＲのいずれかを、マウス（ｎ＝３）に後眼窩注入した。ＡＡＶ８のＥＧＦＰ発現（緑色）の代表的画像では、マウス脳の海馬ＣＡ１領域においてＮｅｕＮ（赤色、神経細胞マーカー）と共局在させ、ＤＡＰＩ（青色）とマージし、４週間後に撮像して評価した。スケールバーは５０μｍである（対物レンズ２０×光軸）。 ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのファージディスプレイスクリーニングにより同定したＰＢ５−３ペプチドの模式図である。１×１０１１のＰｈ．Ｄ−１２ ｍｅｒライブラリーをＣ５７ＢＬマウスに注入した。２時間後、脳を回収し、ファージを単離して、次のラウンドでマウスにおいて増殖させた。増殖を総計５サイクル繰り返した。最終サイクルの後、脳親和性を有するファージを単離し、１×１０１０粒子のＡＡＶ９でコーティングしたプレートに適用した。洗浄後、ＡＡＶ９結合ファージを回収し、増幅して、次のラウンドで単離した。 ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのファージディスプレイスクリーニングにより同定したＰＢ５−３ペプチドの模式図である。１×１０１１のＰｈ．Ｄ−１２ ｍｅｒライブラリーをＣ５７ＢＬマウスに注入した。２時間後、脳を回収し、ファージを単離して、次のラウンドでマウスにおいて増殖させた。増殖を総計５サイクル繰り返した。最終サイクルの後、脳親和性を有するファージを単離し、１×１０１０粒子のＡＡＶ９でコーティングしたプレートに適用した。４回の選定ラウンドの後、ＡＡＶ９結合ファージを配列決定した。 ＰＢ５−３ペプチドのＡＡＶ９との結合特異性を示す図である。１×１０１０粒子のＡＡＶ９によるコーティング後、１×１０１１の用量の種々のファージを９６ウェルプレートに加え、インキュベートした。洗浄後、結合したファージの数を検出した。 ＰＢ５−３ペプチドのＡＡＶ９との結合特異性を示す図である。１×１０１０粒子のＡＡＶ９によるコーティング後、１×１０１１の用量の種々のファージを９６ウェルプレートに加え、インキュベートした。９６ウェルプレートを、血清型６、８および９由来の１×１０１０粒子のＡＡＶベクター／ウェルで一晩コーティングした。洗浄後、１×１０１１のＰＢ５−３ファージを加え、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ファージ粒子を検出した。 ＰＢ５−３がｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＡＶ９形質導入を特異的に増強することを示す図である。１×１０４細胞を、種々の濃度のＰＢ５−３ペプチドとともに４８時間インキュベートした。細胞増殖をＭＴＴアッセイにより分析した。 ＰＢ５−３がｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＡＶ９形質導入を特異的に増強することを示す図である。１×１０４細胞を、種々の濃度のＰＢ５−３ペプチドとともに４８時間インキュベートした。１×１０９粒子の用量のＡＡＶ９／ｌｕｃベクターをＰＢ５−３ペプチドとともに４℃で２時間インキュベートし、次いで、混合物を種々の細胞に適用し、２日間インキュベートした。細胞ライセートのルシフェラーゼ発現を検出した。 ＰＢ５−３がｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＡＶ９形質導入を特異的に増強することを示す図である。１×１０４細胞を、種々の濃度のＰＢ５−３ペプチドとともに４８時間インキュベートした。１×１０９粒子の用量のＡＡＶ９／ｌｕｃベクターをＰＢ５−３ペプチドとともに４℃で２時間インキュベートし、次いで、混合物を種々の細胞に適用し、２日間インキュベートした。比較のために、ＡＡＶ９感染の直前に、ＰＢ５−３を細胞に加えた。 他の血清型由来のＡＡＶベクター上のＰＢ５−３が増強されないことを示す図である。血清型２由来の１×１０９粒子のＡＡＶ／ｌｕｃベクターをＰＢ５−３ペプチドとともに４℃で２時間インキュベートした。ＡＡＶベクターとペプチドとの複合体をＨｕｈ７またはｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞に適用した。２日後、このような細胞のライセートを回収してルシフェラーゼ分析を行った。 他の血清型由来のＡＡＶベクター上のＰＢ５−３が増強されないことを示す図である。血清型６由来の１×１０９粒子のＡＡＶ／ｌｕｃベクターをＰＢ５−３ペプチドとともに４℃で２時間インキュベートした。ＡＡＶベクターとペプチドとの複合体をＨｕｈ７またはｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞に適用した。２日後、このような細胞のライセートを回収してルシフェラーゼ分析を行った。 他の血清型由来のＡＡＶベクター上のＰＢ５−３が増強されないことを示す図である。血清型８由来の１×１０９粒子のＡＡＶ／ｌｕｃベクターをＰＢ５−３ペプチドとともに４℃で２時間インキュベートした。ＡＡＶベクターとペプチドとの複合体をＨｕｈ７またはｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞に適用した。２日後、このような細胞のライセートを回収してルシフェラーゼ分析を行った。 ＡＡＶ９／ＰＢ５−３複合体の全身投与後にマウスにおいて脳形質導入が増強されることを示す図である。１×１０１０粒子のＡＡＶ９／ｌｕｃベクターをＰＢ５−３とともに４℃で２時間インキュベートした。複合体をＣ５７ＢＬマウスに後眼窩静脈を介して注入した。指示時点で、マウスのイメージングを実施した。代表的イメージングを示す。 ＡＡＶ９／ＰＢ５−３複合体の全身投与後にマウスにおいて脳形質導入が増強されることを示す図である。１×１０１０粒子のＡＡＶ９／ｌｕｃベクターをＰＢ５−３とともに４℃で２時間インキュベートした。複合体をＣ５７ＢＬマウスに後眼窩静脈を介して注入した。指示時点で、マウスのイメージングを実施した。ルシフェラーゼ発現を示す。結果は、５匹のマウスの平均および標準偏差を表した。 ＡＡＶ９／ＰＢ５−３複合体の全身投与後にマウスにおいて脳形質導入が増強されることを示す図である。１×１０１０粒子のＡＡＶ９／ｌｕｃベクターをＰＢ５−３とともに４℃で２時間インキュベートした。複合体をＣ５７ＢＬマウスに後眼窩静脈を介して注入した。指示時点で、マウスのイメージングを実施した。ＡＡＶゲノムコピー数を示す。結果は、５匹のマウスの平均および標準偏差を表した。 全身投与後のマウスにおいて、他のＡＡＶ血清型による脳形質導入に対するＰＢ５−３の作用が存在しないことを示す図である。それぞれ５×１０１０または１×１０１０粒子の用量の血清型６または８由来のＡＡＶ／ｌｕｃベクターを、ＰＢ５−３とともに４℃で２時間インキュベートした。複合体をＣ５７ＢＬマウスに後眼窩静脈を介して注入した。ＡＡＶ注入後５および１０日目に、マウスのイメージングを実行した。５匹のマウスの代表的イメージングを示す。 ＰＢ５−３がＡＡＶ９透過性を向上させることを示す図である。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を培養してトランズウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）内に単層を形成し、ＡＡＶ９のみ、またはインキュベートしたＡＡＶ９−０．１ｍＭ ＴＨＲ複合体とともにインキュベートした。指示時点で、基底チャンバー内の培地を採取し、ウイルスゲノムコピー数をｑＰＣＲにより分析した。すべての処理を３つ組で実施した。ＡＡＶ９のみを有する細胞と比較して、＊ｐ＜０．０５である。
ここで、本発明は、添付の図面を参照して説明し、ここで本発明の代表的実施形態を示す。ただし、本発明は、種々の形態により例示することができ、本明細書に示す実施形態に制限されるものとして解釈すべきではない。むしろ、本開示が徹底的および完全であり、本開示により本発明の範囲が当業者に十分に伝わるように、このような実施形態を提供する。
他に定義しない限り、本明細書において使用する、すべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において本発明の説明に使用する用語は、特定の実施形態を単に説明するためのものであり、本発明を制限することは意図しない。本明細書において言及する、すべての公開文献、特許出願、特許、受託番号および他の参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
本発明の明細書および添付の特許請求の範囲におけるＡＡＶカプシドタンパク質のすべてのアミノ酸位置の指定は、ＶＰ１カプシドサブユニットの採番（天然ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドタンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７８０またはＹＰ６８０４２６）に従う。本明細書に記載のように修飾すると、ＡＡＶｃａｐ遺伝子に挿入した場合、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３カプシドサブユニットの修飾が生じ得ることが当業者により理解される。あるいは、カプシドサブユニットは、独立的に発現して、１つまたは２つのみのカプシドサブユニット（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１＋ＶＰ２、ＶＰ１＋ＶＰ３またはＶＰ２＋ＶＰ３）の修飾を達成し得る。
定義
以下の用語を本発明の明細書および添付の特許請求の範囲において使用する。
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に他に指示しない限り、複数形をも含むことを意図する。
その上、測定可能な値、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さの程度、用量、時間、温度等に言及する場合、本明細書において使用する用語「約」は、特定の量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％または、さらには±０．１％の差異を包含することを意味する。
また、本明細書において使用する場合、「および／または」は、列挙した関連する項目の１つまたは複数の可能なありとあらゆる組合せを指示および包含し、ならびに選択肢（「または」）により解釈する場合、組合せの不足を指示および包含する。
本明細書において使用する場合、移行句「から本質的になる」は、特許請求の範囲が、特許請求の範囲に列挙する特定の物質またはステップ、ならびに主張する発明の「基本的および新規の特性（複数可）に実質的に影響しない特定の物質またはステップ」を包含すると解釈されることを意味する。Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ，５３７ Ｆ．２ｄ ５４９，５５１〜５２，１９０ ＵＳＰＱ ４６１，４６３（ＣＣＰＡ １９７６）（強調は原著による）を参照、またＭＰＥＰ ２１１１．０３条を参照されたい。したがって、用語「から本質的になる」は、本発明の特許請求の範囲において使用する場合、「含む」と等価であると解釈されることを意図しない。
文脈上他に指示しない限り、本明細書に記載する本発明の種々の特徴は、任意の組合せで使用可能であることを特に意図する。
その上、本発明ではまた、本発明の一部の実施形態において、本明細書に示す任意の特徴または特徴の組合せが、除外または省略可能であることを検討する。
さらなる例示としては、例えば、特定のアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択可能であることを明細書により示す場合、この言葉はまた、そのようなそれぞれの副組合せを本明細書において明示的に示すように、アミノ酸が、例えば、Ａ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみ等のようなアミノ酸（複数可）の任意のサブセットから選択可能であることを示す。その上、このような言葉はまた、特定のアミノ酸の１つまたは複数を（例えば、否定的条件により）否定可能であることを示す。例えば、特定の実施形態では、そのようなそれぞれの可能な否定を本明細書において明示的に示すように、アミノ酸は、Ａ、ＧまたはＩではなく；Ａではなく；ＧまたはＶではない等とする。
本明細書において使用する場合、用語「低減させる（ｒｅｄｕｃｅ）」、「低減させる（ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「低減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」および類似の用語は、少なくとも約２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはこれを超える減少を意味する。
本明細書において使用する場合、用語「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅｓ）」、「増強（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」および類似の用語は、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはこれを超える増加を示す。
用語「パルボウイルス」は、本明細書において使用する場合、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーを包含し、自己複製パルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む。自律パルボウイルスは、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、エリスロウイルス（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）、デンソウイルス（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、イテラウイルス（Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ）、およびコントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）属のメンバーを含む。例となる自律パルボウイルスとしては、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、トリパルボウイルス、ネコ汎血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケンパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス、および現在既知または後に発見される他の任意の自律パルボウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。他の自律パルボウイルスは、当業者に既知である。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社）を参照されたい。
本明細書において使用する場合、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および現在既知または後に発見される他の任意のＡＡＶを含むが、これらに限定されない。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社）を参照されたい。多数の比較的新しいＡＡＶ血清型およびクレードが、同定されている（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：６３８１〜６３８８；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３−：３７５〜３８３；および表１を参照）。
ＡＡＶおよび自律パルボウイルスの種々の血清型のゲノム配列、ならびに天然末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質およびカプシドサブユニットの配列は、当技術分野において既知である。このような配列は、文献または公開データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋに見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を参照されたく、これらの開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列を教示するために、参照により本明細書に組み込む。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３−：３７５〜３８３；国際特許公開ＷＯ第００／２８０６１号、ＷＯ第９９／６１６０１号、ＷＯ第９８／１１２４４号；および米国特許第６，１５６，３０３号を参照されたく、これらの開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列を教示するために、参照により本明細書に組み込む。また、表１を参照されたい。
自律パルボウイルスおよびＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ ６９＆７０（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社）にさらに詳細に記載されている。また、ＡＡＶ２（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５〜１０）、ＡＡＶ４（Ｐａｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７〜５８）、ＡＡＶ５（Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：３３６１〜７１）およびＣＰＶ（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７〜５２０およびＴｓａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１４５６〜６４）の結晶構造の記載を参照されたい。
用語「親和性」は、本明細書において使用する場合、ある特定の細胞または組織へのウイルスの選択的侵入、任意選択でその後の、例えば、組換えウイルスの、ウイルスゲノムが保有する配列（複数可）の細胞における発現（例えば、転写、および任意選択で翻訳）、目的の異種核酸（複数可）の発現を指す。
本明細書において使用する場合、「全身的親和性」および「全身的形質導入」（および等価な用語）は、本発明のウイルスカプシドまたはウイルスベクターが、全身の組織（例えば、脳、肺、骨格筋、心臓、肝臓、腎臓および／または膵臓）に、親和性を呈し、および／または形質導入することを示す。本発明の実施形態では、中枢神経系（例えば、脳、神経細胞等）の全身的形質導入を観察する。他の実施形態では、心筋組織の全身的形質導入を達成する。
本明細書において使用する場合、「選択的親和性」または「特異的親和性」は、ウイルスベクターのある特定の標的細胞および／もしくはある特定の組織への送達、ならびに／またはある特定の標的細胞および／もしくはある特定の組織への特異的形質導入を意味する。
他に指示しない限り、「効率的形質導入」または「効率的親和性」あるいは類似の条件は、適する対照を参照することにより（例えば、それぞれが対照の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％またはこれを超える形質導入または親和性で）判定することができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、神経細胞および心筋細胞について、効率的に形質導入するか、または効率的親和性を有する。適する対照は、所望の親和性および／または形質導入プロファイルを含む多様な因子に依存する。
同様に、ウイルスが、標的組織について「効率的に形質導入しない」か、または「効率的親和性を有しない」か、あるいは類似の条件であるかどうかを、適する対照を参照することにより判定することができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、肝臓、腎臓、生殖腺および／または生殖細胞について、効率的に形質導入しない（すなわち、効率的親和性を有しない）。特定の実施形態では、組織（複数可）（例えば、肝臓）への形質導入（例えば、望ましくない形質導入）は、所望の標的組織（複数可）（例えば、骨格筋、横隔膜筋、心筋および／または中枢神経系の細胞）への形質導入の２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下のレベルである。
本発明の一部の実施形態では、本発明のカプシドを含むＡＡＶ粒子は、複数の表現型により、ある特定の組織／細胞への効率的形質導入が可能であること、および望ましくない形質導入が、ある特定の組織／細胞に対して非常に低いレベルであること（例えば、形質導入の低減）を実証することができる。
本明細書において使用する場合、用語「ポリペプチド」は、他に指示しない限り、ペプチドとタンパク質の両方を包含する。
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）であり得るが、代表的実施形態では、１本鎖または２本鎖のいずれかのＤＮＡ配列である。
本明細書において使用する場合、「単離した」ポリヌクレオチド（例えば、「単離したＤＮＡ」または「単離したＲＮＡ」）は、天然に存在する生物もしくはウイルスの他の成分の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離したポリヌクレオチド、例えば、細胞もしくはウイルス構造成分、またはポリヌクレオチドと結合することが一般的にわかっている他のポリペプチドもしくは核酸を意味する。代表的実施形態では、「単離した」ヌクレオチドは、出発物質と比較して少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはこれを超えて濃縮する。
同様に、「単離した」ポリペプチドは、天然に存在する生物またはウイルスの他の成分の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離したポリペプチド、例えば、細胞もしくはウイルス構造成分、またはポリペプチドと結合することが一般的にわかっている他のポリペプチドもしくは核酸を意味する。代表的実施形態では、「単離した」ポリペプチドは、出発物質と比較して少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはこれを超えて濃縮する。
「単離した細胞」は、通常、天然の状態で結合する他の成分から分離した細胞を指す。例えば、単離した細胞は、培養培地中の細胞および／または本発明の薬学的に許容される担体中の細胞であり得る。したがって、単離した細胞は、対象に送達および／または導入することができる。一部の実施形態では、単離した細胞は、対象から取り出し、本明細書に記載のようにｅｘ ｖｉｖｏで操作し、次いで、対象に戻す細胞であり得る。
本明細書において使用する場合、ウイルスベクターまたはウイルス粒子もしくはウイルス粒子の集団の「単離」または「精製」（または文法的等価物）により、ウイルスベクターまたはウイルス粒子もしくはウイルス粒子の集団を、出発物質の他の成分の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離することを意味する。代表的実施形態では、「単離した」または「精製した」ウイルスベクターまたはウイルス粒子もしくはウイルス粒子の集団は、出発物質と比較して少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはこれを超えて濃縮する。
「治療ポリペプチド」は、細胞もしくは対象におけるタンパク質の欠如もしくは異常に起因する症候を軽減、低減、予防、遅延および／もしくは安定化可能なポリペプチド、ならびに／または、さもなければ対象に利点、例えば、抗がん作用もしくは移植生存性の向上もしくは免疫応答の誘導を付与するポリペプチドである。
用語「治療（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ）」（およびこの文法的変形形態）により、対象の症状の重症度が、低減、少なくとも部分的に向上もしくは安定化すること、ならびに／または少なくとも１つの臨床症候のいくらかの軽減、緩和、減少もしくは安定化が達成されること、ならびに／または疾患もしくは障害の進行が遅延することを意味する。
用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（およびこの文法的変形形態）は、本発明の方法の非存在下で発生するものと比較した、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症候（複数可）の発症の予防および／もしくは遅延、ならびに／または疾患、障害および／もしくは臨床症候（複数可）の発症の重症度の低減を指す。予防は、例えば、疾患、障害および／または臨床症候（複数可）が全く存在しない等、完全であることもある。また、予防は部分的であり、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症候（複数可）の発生、ならびに／または発症の重症度が、本発明の非存在下で発生するものより実質的に低くなり得る。
「治療有効」量は、本明細書において使用する場合、対象にいくらかの向上または利点をもたらすのに十分な量である。言い換えれば、「治療有効」量は、対象の少なくとも１つの臨床症候において、いくらかの軽減、緩和、減少または安定化をもたらす量である。当業者は、いくらかの利点が対象にもたらされる限り、治療作用が完全または治癒的である必要はないことを理解する。
「予防有効」量は、本明細書において使用する場合、本発明の方法の非存在下で発生するものと比較した、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症候の発症の予防および／もしくは遅延に、ならびに／または対象における疾患、障害および／もしくは臨床症候の発症の重症度の低減および／もしくは遅延に十分な量である。当業者は、いくらかの予防的利点が対象にもたらされる限り、予防のレベルが完全である必要はないことを理解する。
用語「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸分子」は、本明細書において互換的に使用し、ウイルスには天然に存在しない核酸配列を指す。一般には、異種核酸分子または異種ヌクレオチド配列は、（例えば、細胞および／または対象への送達のための）目的のポリペプチドおよび／または非翻訳ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームを含む。
本明細書において使用する場合、用語「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」は、核酸送達媒体として機能するウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を指し、これは、ビリオン内にパッケージングされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含む。あるいは、一部の文脈では、用語「ベクター」は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡのみを指すために使用し得る。
「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、１つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは一般に、ウイルス生成のために、シスの末端反復（ＴＲ）（複数可）のみを必要とする。他のすべてのウイルス配列は、不要であり、トランスに供給され得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、１つまたは複数のＴＲ配列のみを保持して、ベクターにより効率的にパッケージングすることが可能な導入遺伝子のサイズを最大化する。構造および非構造タンパク質をコードする配列は、（例えば、ベクター、例えば、プラスミドから、または配列をパッケージング細胞内に安定に組み込むことにより）トランスに提供し得る。本発明の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ配列）、任意選択で、２つのＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含み、これは典型的に、ベクターゲノムの５’および３’末端に存在し、異種核酸に近接するが、これに連続する必要はない。ＴＲは、相互に同一または異なり得る。
用語「末端反復」または「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成し、逆位末端反復として機能する（すなわち、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込みおよび／またはプロウイルスレスキュー等を媒介する）、任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲまたは非ＡＡＶ ＴＲであり得る。例えば、非ＡＡＶ ＴＲ配列、例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ−１９）の配列、または他の任意の適するウイルス配列（例えば、ＳＶ４０複製の起点として作用するＳＶ４０ヘアピン）は、ＴＲとして使用することができ、これは、切断、置換、欠失、挿入、および／または付加によりさらに修飾することができる。さらに、ＴＲは、部分的にまたは完全に合成であってもよく、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉらによる米国特許第５，４７８，７４５号に記載の「ダブルＤ配列」が挙げられる。
「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、それらに限定されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２を含む任意のＡＡＶ、または既知もしくは後に発見される他の任意のＡＡＶ由来であり得る（例えば、表１を参照）。ＡＡＶ末端反復は、末端反復が、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスレスキュー等を媒介する限り、天然の末端反復配列を有する必要はない（例えば、天然ＡＡＶ ＴＲ配列は、挿入、欠失、切断および／またはミスセンス変異により変異させ得る）。
ＡＡＶタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、ともに相互作用して正２０面体対称のＡＡＶカプシドを形成するカプシドタンパク質である。ＶＰ１．５は、米国特許出願公開第２０１４／００３７５８５号に記載されているＡＡＶカプシドタンパク質である。
本発明のウイルスベクターはさらに、国際特許公開ＷＯ第００／２８００４号およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載されている、「標的化」ウイルスベクター（例えば、特異的親和性を有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＴＲとウイルスカプシドとが、異なるパルボウイルス由来である）であり得る。
本発明のウイルスベクターはさらに、国際特許公開ＷＯ第０１／９２５５１号（この開示は、この全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されている、２重鎖のパルボウイルス粒子であり得る。したがって、一部の実施形態では、２本鎖（２重鎖）ゲノムを本発明のウイルスカプシド内にパッケージングすることができる。
さらに、ウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む、他の修飾を含み得る。
「キメラ」カプシドタンパク質は、本明細書において使用する場合、カプシドタンパク質のアミノ酸配列において野生型と比較して１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個等）のアミノ酸残基の置換、ならびにアミノ酸配列において野生型と比較して１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個等）のアミノ酸残基の挿入および／または欠失により修飾されているＡＡＶカプシドタンパク質を意味する。一部の実施形態では、あるＡＡＶ血清型由来の完全または部分的ドメイン、機能領域、エピトープ等は、異なるＡＡＶ血清型の対応する野生型ドメイン、機能領域、エピトープ等と、任意の組合せで置換して、本発明のキメラカプシドタンパク質を生成することができる。キメラカプシドタンパク質の生成は、当技術分野において周知のプロトコールに従って実行することができ、多数のキメラカプシドタンパク質が、文献ならびに本明細書に記載されており、これは、本発明のカプシドに含み得る。
本明細書において使用する場合、用語「アミノ酸」は、天然に存在する任意のアミノ酸、この修飾形態、および合成アミノ酸を包含する。
天然に存在する左旋性の（Ｌ−）アミノ酸は、表２に示す。
あるいは、アミノ酸は、修飾アミノ酸残基であってもよく（非限定的な例を表４に示す）、および／または翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化）により修飾したアミノ酸であってもよい。
さらに、天然に存在しないアミノ酸は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５〜４９（２００６）により記載されている「非天然」アミノ酸であり得る。このような非天然アミノ酸は、目的の分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に結合させるために、有利に使用することができる。
血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する形質導入の増強ならびに／または脳および／もしくは中枢神経系の細胞への形質導入の増強のための表面結合ペプチドを有するウイルスベクター
本発明は、ある特定のペプチドが表面に結合するＡＡＶビリオンにより、形質導入特性が増強され、および／または血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力が増強されたという予想外の発見に基づく。したがって、一実施形態では、本発明では、表面結合ペプチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、ＡＡＶ粒子の表面に結合するペプチドが、ａ）Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、ｂ）ＧＳＨ、ｃ）ＨＩＶ−１ ＴＡＴ（４８〜６０）、ｄ）ＡｐｏＥ（１５９〜１６７）２、ｅ）レプチン３０（６１〜９０）、ｆ）ＴＨＲ、ｇ）ＰＢ５−３、ｈ）ＰＢ５−５、ｉ）ＰＢ５−１４、およびｊ）上記（ａ）〜（ｉ）の任意の組合せからなる群から選択される、ＡＡＶ粒子を提供する。このようなペプチドのそれぞれのアミノ酸配列は、本明細書の表５、６および７に示す。一実施形態では、ＰＢ５−３をＡＡＶ９粒子の表面に結合させる。一実施形態では、ＰＢ５−５をＡＡＶ９粒子の表面に結合させる。一実施形態では、ＰＢ５−１４をＡＡＶ９粒子の表面に結合させる。一部の実施形態では、ペプチドは、形質導入特性を増強し、および／またはＡＡＶ粒子のＢＢＢを通過する能力を増強することが既知であるか、または後に同定され得る。一部の実施形態では、ペプチドは、ファージディスプレイペプチドライブラリーから、例えば、本明細書に記載の方法により選択（例えば、同定）され得る。
本発明の一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、１つまたは２つ以上の表面結合ペプチドを含んでもよく、これは、本明細書の表５、６および７に示す、任意のペプチドまたはペプチドの組合せであり得る。ペプチドは、任意の組合せおよび／または存在する他のペプチドとの相対比率で存在し得る。
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子の表面に結合するペプチドは、１ＡＡＶ粒子あたり約２０００ペプチド分子〜１ＡＡＶ粒子あたり約４×１０７ペプチド分子の範囲の量でＡＡＶ粒子表面上に存在してもよく、この範囲内の任意の値を含む。
本発明のＡＡＶ粒子は、表１に列挙する血清型、または表１に列挙する血清型の任意の組合せのＡＡＶであり得る。
一部の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子は、単独または任意の組合せによる、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ９．４５、あるいは本明細書に記載、現在既知の、または後に同定される任意のＡＡＶのミュータントまたはバリアントであり得る。本発明のＡＡＶ粒子は、例えば、２０１７年３月１５日出願の米国仮特許出願第６２／４７１，７６２号に記載されている、任意の「ハプロイド」ＡＡＶ粒子であってもよく、この全内容は、参照により本明細書に組み込む。
一部の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子は、国際特許公開ＷＯ第００／２８００４号およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載されている、「標的化」ウイルスベクター（例えば、特異的親和性を有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＴＲとウイルスカプシドとが異なるパルボウイルス由来である）であり得る。
一部の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子は、国際特許公開ＷＯ第０１／９２５５１号に記載されている２重鎖パルボウイルス粒子であり得る（この開示は、この全体を参照により本明細書に組み込む）。したがって、一部の実施形態では、２本鎖（２重鎖）ゲノムを本発明のウイルスカプシド内にパッケージングすることができる。
本発明のＡＡＶ粒子の一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子の表面に結合するペプチドは、１ＡＡＶ粒子あたり約２０００タンパク質分子〜１ＡＡＶ粒子あたり約４×１０７タンパク質分子の範囲の（例えば、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、２９，０００、３０，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、２９，０００、３０，０００、３１，０００、３２，０００、３３，０００、３４，０００、３５，０００、３６，０００、３７，０００、３８，０００、３９，０００、４０，０００、４１，０００、４２，０００、４３，０００、４４，０００、４５，０００、４６，０００、４７，０００、４８，０００、４９，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７または４×１０７の、２０００〜４×１０７の本明細書において明示的には示さない任意の数を含む）量で、ＡＡＶ粒子表面上に存在し得る。１ＡＡＶ粒子あたりのペプチド分子の数は、当技術分野において既知および本明細書の実施例の項において例証するプロトコールに従って決定することができる。
一部の実施形態では、表面結合ペプチドを含むＡＡＶ粒子は、表面結合ペプチドを欠くＡＡＶ粒子と比較して、血液脳関門を通過する形質導入活性が増強され、ならびに／または脳および／もしくは中枢神経系の細胞における形質導入活性が増強されている。したがって、ＡＡＶ粒子に結合するペプチド分子の数は、表面結合ペプチドを欠くＡＡＶ粒子と比較して、ＡＡＶ粒子の血液脳関門を通過する形質導入活性を増強し、ならびに／または脳および／もしくは中枢神経系の細胞への形質導入を増強する量であり得る。
一部の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子は、異種核酸分子を含み得る。
一部の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの種々の適用に適する様々な望ましい表現型を示すように設計した合成ウイルスベクターであり得る。したがって、一実施形態では、本発明では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを含む、ＡＡＶ粒子であって、上記カプシドが、カプシドタンパク質ＶＰ１を含み、上記カプシドタンパク質ＶＰ１が、１つまたは２つ以上の第１のＡＡＶ血清型およびカプシドタンパク質ＶＰ３由来であり、上記カプシドタンパク質ＶＰ３が、１つまたは２つ以上の第２のＡＡＶ血清型由来であり、上記第１のＡＡＶ血清型の少なくとも１つが、上記第２のＡＡＶ血清型の少なくとも１つと異なる、ＡＡＶ粒子を、任意の組合せで提供する。
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質ＶＰ２を含むカプシドであって、上記カプシドタンパク質ＶＰ２が、１つまたは２つ以上の第３のＡＡＶ血清型由来であり、１つまたは２つ以上の上記第３のＡＡＶ血清型の少なくとも１つが、上記第１のＡＡＶ血清型および／または上記第２のＡＡＶ血清型と異なる、カプシドを、任意の組合せで含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載するＡＡＶカプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ１．５を含み得る。ＶＰ１．５は、米国特許出願公開第２０１４／００３７５８５号に記載されており、ＶＰ１．５のアミノ酸配列は、本明細書において提供する。
一部の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質ＶＰ１．５を含むカプシドであって、上記カプシドタンパク質ＶＰ１．５が、１つまたは２つ以上の第４のＡＡＶ血清型由来であり、１つまたは２つ以上の上記第４のＡＡＶ血清型の少なくとも１つが、上記第１のＡＡＶ血清型および／または上記第２のＡＡＶ血清型と異なる、カプシドを、任意の組合せで含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載するＡＡＶカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質ＶＰ２を含み得る。
また、本発明では、ＡＡＶカプシドを含む、本発明のＡＡＶ粒子であって、上記カプシドが、カプシドタンパク質ＶＰ１を含み、上記カプシドタンパク質ＶＰ１が、１つまたは２つ以上の第１のＡＡＶ血清型およびカプシドタンパク質ＶＰ２由来であり、上記カプシドタンパク質ＶＰ２が、１つまたは２つ以上の第２のＡＡＶ血清型由来であり、上記第１のＡＡＶ血清型の少なくとも１つが、上記第２のＡＡＶ血清型の少なくとも１つと異なる、ＡＡＶ粒子を、任意の組合せで提供する。
一部の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質ＶＰ３を含むカプシドであって、上記カプシドタンパク質ＶＰ３が、１つまたは２つ以上の第３のＡＡＶ血清型由来であり、上記１つまたは２つ以上の第３のＡＡＶ血清型の少なくとも１つが、上記第１のＡＡＶ血清型および／または上記第２のＡＡＶ血清型と異なる、カプシドを、任意の組合せで含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載するＡＡＶカプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ１．５を含み得る。
本発明ではさらに、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを含む、ＡＡＶ粒子であって、上記カプシドが、カプシドタンパク質ＶＰ１を含み、上記カプシドタンパク質ＶＰ１が、１つまたは２つ以上の第１のＡＡＶ血清型およびカプシドタンパク質ＶＰ１．５由来であり、上記カプシドタンパク質ＶＰ１．５が、１つまたは２つ以上の第２のＡＡＶ血清型由来であり、上記第１のＡＡＶ血清型の少なくとも１つが、上記第２のＡＡＶ血清型の少なくとも１つと異なる、ＡＡＶ粒子を、任意の組合せで提供する。
一部の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質ＶＰ３を含むカプシドであって、上記カプシドタンパク質ＶＰ３が、１つまたは２つ以上の第３のＡＡＶ血清型由来であり、１つまたは２つ以上の上記第３のＡＡＶ血清型の少なくとも１つが、上記第１のＡＡＶ血清型および／または上記第２のＡＡＶ血清型と異なる、カプシドを、任意の組合せで含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載するＡＡＶカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質ＶＰ２を含み得る。
本明細書に記載するＡＡＶ粒子のカプシドの一部の実施形態では、１つまたは２つ以上の上記第１のＡＡＶ血清型、１つまたは２つ以上の上記第２のＡＡＶ血清型、１つまたは２つ以上の上記第３のＡＡＶ血清型および１つまたは２つ以上の上記第４のＡＡＶ血清型は、表１に列挙するＡＡＶ血清型からなる群から、任意の組合せで選択される。
本発明のＡＡＶ粒子の一部の実施形態では、本明細書に記載するＡＡＶカプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ２を欠く。
本発明のＡＡＶ粒子の一部の実施形態では、カプシドは、キメラカプシドＶＰ１タンパク質、キメラカプシドＶＰ２タンパク質、キメラカプシドＶＰ３タンパク質および／またはキメラカプシドＶＰ１．５タンパク質を含み得る。
本発明のＡＡＶ粒子の一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ ＡＡＶ２／８／９、Ｈ−ＡＡＶ８２、Ｈ−ＡＡＶ９２、Ｈ−ＡＡＶ８２Ｇ９、ＡＡＶ２／８ ３：１、ＡＡＶ２／８ １：１、ＡＡＶ２／８ １：３またはＡＡＶ８／９であり得る。
本明細書に記載する他のカプシドタンパク質と、および／または現在既知もしくは後に開発される他のカプシドタンパク質と任意の組合せで本発明のＡＡＶ粒子のカプシドに含まれ得るＡＡＶカプシドタンパク質の非限定的な例としては、ＬＫ３、ＬＫ０１−１９、ＡＡＶ−ＤＪ、Ｏｌｉｇ００１、ｒＡＡＶ２−ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ−ＬｉＣ、ＡＡＶ０Ｋｅｒａｌ、ＡＡＶ−Ｋｅｒａ２、ＡＡＶ−Ｋｅｒａ３、ＡＡＶ ７ｍ８、ＡＡＶ１，９、ＡＡＶｒ３．４５、ＡＡＶクローン３２、ＡＡＶクローン８３、ＡＡＶ−Ｕ８７Ｒ７−Ｃ５、ＡＡＶ ＳｈＨ１３、ＡＡＶ ＳｈＨ１９、ＡＡＶ Ｌ１−１２、ＡＡＶ ＨＡＥ−１、ＡＡＶ ＨＡＥ−２、ＡＡＶバリアントＳｈＨ１０、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ ＬＳ１−４、ＡＡＶ Ｌｓｍ、ＡＡＶ１２８９、ＡＡＶ ＨＳＣ１−１７、ＡＡＶ２Ｒｅｃ１−４、ＡＡＶ８ＢＰ２、ＡＡＶ−Ｂ１、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶ２呈示ペプチド、ＡＡＶ２−ＧＭＮ、ＡＡＶ９呈示ペプチド、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９呈示ペプチド、ＡＡＶｐｏ２．１、ＡＡＶｐｏ４、ＡＡＶｐｏ５、ＡＡＶｐｏ６、ＡＡＶｒｈ、ＡＡＶ Ｈｕ、ＡＡＶ−Ｇｏ．１、ＡＡＶ−ｍｏ．１、ＢＡＡＶ、ＡＡＡＶ、ＡＡＶ８Ｋ１３７Ｒ、ＡＡＶ Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ ２６５挿入ＡＡＶ２／２６５Ｄ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ３ ＳＡＳＴＧ、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ８Ｇ９、ＡＡＶ２チロシンミュータントＡＡＶ２Ｙ−Ｆ、ＡＡＶ８Ｙ−Ｆ、ＡＡＶ９Ｙ−Ｆ、ＡＡＶ６Ｙ−Ｆ、ＡＡＶ６．２ならびにこれらの任意の組合せが挙げられる。
非限定的な例としては、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質およびＡＡＶ粒子のウイルスカプシドは、例えば、国際特許公開ＷＯ第００／２８００４号に記載のように、これらが、別のウイルス、任意選択で別のパルボウイルスまたはＡＡＶ由来のカプシドサブユニットのすべてまたは部分を含み得る点で、キメラであり得る。
以下の公開文献では、野生型カプシドタンパク質および／または現在既知もしくは後に同定される他のキメラもしくはバリアントカプシドタンパク質との任意の組合せで、本発明のＡＡＶ粒子のカプシド内に組み込むことが可能な、キメラまたはバリアントカプシドタンパク質を記載している。
Ｌ Ｌｉｓｏｗｓｋｉ，ＡＰ Ｄａｎｅ，Ｋ Ｃｈｕ，Ｙ Ｚｈａｎｇ．ＳＣ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｍ，ＥＭ Ｗｉｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ＡＡＶ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｌｉｖｅｒ ｍｏｄｅｌ Ｎａｔｕｒｅ，５０６（２０１４），ｐｐ．３８２〜３８６（ＬＫ０３および他のＬＫ０１−１９）
Ｇｒｉｍｍ Ｄ，Ｌｅｅ ＪＳ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｄｅｓａｉ Ｔ，Ａｋａｃｈｅ Ｂ，Ｓｔｏｒｍ ＴＡ，Ｋａｙ ＭＡ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｖｉａ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎｔｅｒｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００８ Ｊｕｎ；８２（１２）：５８８７〜９１１．（ＡＡＶ−ＤＪ）
Ｐｏｗｅｌｌ ＳＫ，Ｋｈａｎ Ｎ，Ｐａｒｋｅｒ ＣＬ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ Ｇ，Ｇｒａｙ ＳＪ，ＭｃＣｏｗｎ ＴＪ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｔｒｏｐｉｓｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１６ Ｎｏｖ；２３（１１）：８０７〜８１４．（Ｏｌｉｇ００１）
Ｔｅｒｖｏ ＤＧ，Ｈｗａｎｇ ＢＹ，Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ Ｓ，Ｇａｊ Ｔ，Ｌａｖｚｉｎ Ｍ，Ｒｉｔｏｌａ ＫＤ，Ｌｉｎｄｏ Ｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ，Ｋｕｌｅｓｈｏｖａ Ｅ，Ｏｊａｌａ Ｄ，Ｈｕａｎｇ ＣＣ，Ｇｅｒｆｅｎ ＣＲ，Ｓｃｈｉｌｌｅｒ Ｊ，Ｄｕｄｍａｎ ＪＴ，Ｈａｎｔｍａｎ ＡＷ，Ｌｏｏｇｅｒ ＬＬ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＤＶ，Ｋａｒｐｏｖａ ＡＹ．Ａ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＡＡＶ Ｖａｒｉａｎｔ Ｐｅｒｍｉｔｓ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎｅｕｒｏｎ．２０１６ Ｏｃｔ １９；９２（２）：３７２〜３８２．（ｒＡＡＶ２−ｒｅｔｒｏ）
Ｍａｒｓｉｃ Ｄ，Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ Ｌ，Ｃｕｒｒｌｉｎ Ｓ，Ｍａｒｋｕｓｉｃ ＤＭ，Ｔｓｅｎｇ ＹＳ，Ｈｅｒｚｏｇ ＲＷ，Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ，Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓ．Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｕｒ ｄｅ Ｆｏｒｃｅ：ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｄ ｒａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｄｅｒｉｖｅ ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｎｏｖ；２２（１１）：１９００〜９．（ＡＡＶ−ＬｉＣ）
Ｓａｌｌａｃｈ Ｊ，Ｄｉ Ｐａｓｑｕａｌｅ Ｇ，Ｌａｒｃｈｅｒ Ｆ，Ｎｉｅｈｏｆｆ Ｎ，Ｒｕｂｓａｍ Ｍ，Ｈｕｂｅｒ Ａ，Ｃｈｉｏｒｉｎｉ Ｊ，Ａｌｍａｒｚａ Ｄ，Ｅｍｉｎｇ ＳＡ，Ｕｌｕｓ Ｈ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｓ，Ｈａｃｋｅｒ ＵＴ，Ｈａｌｌｅｋ Ｍ，Ｎｉｅｓｓｅｎ ＣＭ，Ｂｕｎｉｎｇ Ｈ．Ｔｒｏｐｉｓｍ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｔｏ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｍａｙ；２２（５）：９２９〜３９．（ＡＡＶ−Ｋｅｒａ１、ＡＡＶ−Ｋｅｒａ２およびＡＡＶ−Ｋｅｒａ３）
Ｄａｌｋａｒａ Ｄ，Ｂｙｒｎｅ ＬＣ，Ｋｌｉｍｃｚａｋ ＲＲ，Ｖｉｓｅｌ Ｍ，Ｙｉｎ Ｌ，Ｍｅｒｉｇａｎ ＷＨ，Ｆｌａｎｎｅｒｙ ＪＧ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＤＶ．Ｉｎ ｖｉｖｏ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｕｔｅｒ ｒｅｔｉｎａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｉｔｒｅｏｕｓ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１３ Ｊｕｎ １２；５（１８９）：１８９ｒａ７６．（ＡＡＶ ７ｍ８）
Ａｓｕｒｉ Ｐ，Ｂａｒｔｅｌ ＭＡ，Ｖａｚｉｎ Ｔ，Ｊａｎｇ ＪＨ，Ｗｏｎｇ ＴＢ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＤＶ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｆｅｂ；２０（２）：３２９〜３８．（ＡＡＶ１．９）
Ｊａｎｇ ＪＨ，Ｋｏｅｒｂｅｒ ＪＴ，Ｋｉｍ ＪＳ，Ａｓｕｒｉ Ｐ，Ｖａｚｉｎ Ｔ，Ｂａｒｔｅｌ Ｍ，Ｋｅｕｎｇ Ａ，Ｋｗｏｎ Ｉ，Ｐａｒｋ ＫＩ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＤＶ．Ａｎ ｅｖｏｌｖｅｄ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖａｒｉａｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ａｐｒ；１９（４）：６６７〜７５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．２８７．（ＡＡＶ ｒ３．４５）
Ｇｒａｙ ＳＪ，Ｂｌａｋｅ ＢＬ，Ｃｒｉｓｗｅｌｌ ＨＥ，Ｎｉｃｏｌｓｏｎ ＳＣ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ，ＭｃＣｏｗｎ ＴＪ，Ｌｉ Ｗ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｃｒｏｓｓｅｓ ｔｈｅ ｓｅｉｚｕｒｅ−ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ（ＢＢＢ）．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｍａｒ；１８（３）：５７０〜８（ＡＡＶクローン３２および８３）
Ｍａｇｕｉｒｅ ＣＡ，Ｇｉａｎｎｉ Ｄ，Ｍｅｉｊｅｒ ＤＨ，Ｓｈａｋｅｔ ＬＡ，Ｗａｋｉｍｏｔｏ Ｈ，Ｒａｂｋｉｎ ＳＤ，Ｇａｏ Ｇ，Ｓｅｎａ−Ｅｓｔｅｖｅｓ Ｍ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．２０１０ Ｆｅｂ；９６（３）：３３７〜４７．（ＡＡＶ−Ｕ８７Ｒ７〜Ｃ５）
Ｋｏｅｒｂｅｒ ＪＴ，Ｋｌｉｍｃｚａｋ Ｒ，Ｊａｎｇ ＪＨ，Ｄａｌｋａｒａ Ｄ，Ｆｌａｎｎｅｒｙ ＪＧ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＤＶ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｌｉａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９ Ｄｅｃ；１７（１２）：２０８８〜９５．（ＡＡＶ ＳｈＨ１３，ＡＡＶ ＳｈＨ１９，ＡＡＶ Ｌ１−１２）
Ｌｉ Ｗ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＳ，Ｚｈｉｊｉａｎ Ｗ，Ｇｒｉｅｇｅｒ ＪＣ，Ｐｉｎｇ−Ｊｉｅ Ｘ，Ｄｒｏｕｉｎ ＬＭ，Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ，Ｐｉｃｋｌｅｓ ＲＪ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ＡＡＶ ｖａｒｉａｎｔｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＣＦＴＲ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｃｉｌｉａｔｅｄ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９ Ｄｅｃ；１７（１２）：２０６７〜７７．（ＡＡＶ ＨＡＥ−１、ＡＡＶ ＨＡＥ−２）
Ｋｌｉｍｃｚａｋ ＲＲ，Ｋｏｅｒｂｅｒ ＪＴ，Ｄａｌｋａｒａ Ｄ，Ｆｌａｎｎｅｒｙ ＪＧ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＤＶ．Ａ ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖａｒｉａｎｔ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ Ｍｕｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００９ Ｏｃｔ １４；４（１０）：ｅ７４６７．（ＡＡＶバリアントＳｈＨ１０）
Ｅｘｃｏｆｆｏｎ ＫＪ，Ｋｏｅｒｂｅｒ ＪＴ，Ｄｉｃｋｅｙ ＤＤ，Ｍｕｒｔｈａ Ｍ，Ｋｅｓｈａｖｊｅｅ Ｓ，Ｋａｓｐａｒ ＢＫ，Ｚａｂｎｅｒ Ｊ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＤＶ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｏ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００９ Ｍａｒ １０；１０６（１０）：３８６５〜７０．（ＡＡＶ２．５Ｔ）
Ｓｅｌｌｎｅｒ Ｌ，Ｓｔｉｅｆｅｌｈａｇｅｎ Ｍ，Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ ＪＡ，Ｌａｕｆｓ Ｓ，Ｗｅｎｚ Ｆ，Ｆｒｕｅｈａｕｆ Ｓ，Ｚｅｌｌｅｒ ＷＪ，Ｖｅｌｄｗｉｊｋ ＭＲ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ（ＡＡＶ）ｂｙ ａｐｐｌｙｉｎｇ ａｎ ＡＡＶ ｒａｎｄｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００８ Ａｕｇ；３６（８）：９５７〜６４．（ＡＡＶ ＬＳ１−４、ＡＡＶ Ｌｓｍ）
Ｌｉ Ｗ，Ａｓｏｋａｎ Ａ，Ｗｕ Ｚ，Ｖａｎ Ｄｙｋｅ Ｔ，ＤｉＰｒｉｍｉｏ Ｎ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＳ，Ｇｏｖｉｎｄａｓｗａｍｙ Ｌ，Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ，Ｌｅｉｃｈｔｌｅ Ｓ，Ｒｅｄｍｏｎｄ ＤＥ Ｊｒ，ＭｃＣｏｗｎ ＴＪ，Ｐｅｔｅｒｍａｎｎ ＫＢ，Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ ＮＥ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｕｆｆｌｅｄ ＡＡＶ ｇｅｎｏｍｅｓ：ａ ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００８ Ｊｕｌ；１６（７）：１２５２〜６０．（ＡＡＶ１２８９）
Ｃｈａｒｂｅｌ Ｉｓｓａ Ｐ，Ｄｅ Ｓｉｌｖａ ＳＲ，Ｌｉｐｉｎｓｋｉ ＤＭ，Ｓｉｎｇｈ ＭＳ，Ｍｏｕｒａｖｌｅｖ Ａ，Ｙｏｕ Ｑ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｒｏｐｉｓｍ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｎｅｗ ｐｒｉｍａｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｙｂｒｉｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｐｒｉｍａｔｅ ｒｅｔｉｎａ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ．２０１３；８：ｅ６０３６１．（ＡＡＶＨＳＣ１−１７）
Ｈｕａｎｇ Ｗ，ＭｃＭｕｒｐｈｙ Ｔ，Ｌｉｕ Ｘ，Ｗａｎｇ Ｃ，Ｃａｏ Ｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒｏｗｎ Ｆａｔ Ｖｉａ Ｏｒａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｖｅｃｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６ Ｊｕｎ；２４（６）：１０６２〜９．（ＡＡＶ２ Ｒｅｃ １−４）
ＣｒｏｎｉｎＴ，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ＬＨ，Ｈａｎｔｚ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｂｉｐｏｌａｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０１４；６：１１７５〜１１９０（ＡＡＶ８ＢＰ２）
Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ＳＲ，Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ Ｚ，Ｈａｒｒｉｓ ＡＦ，Ｍａｉｔｌａｎｄ ＳＡ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ ＪＳ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｍａ Ｓ，Ｓｈａｒｍａ ＲＢ，Ｇｒａｙ−Ｅｄｗａｒｄｓ ＨＬ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＡ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＡＫ，Ａｌｏｎｓｏ ＬＣ，Ｐｕｎｚｏ Ｃ，Ｗａｇｎｅｒ ＫＲ，Ｍａｇｕｉｒｅ ＣＡ，Ｋｏｔｉｎ ＲＭ，Ｍａｒｔｉｎ ＤＲ，Ｓｅｎａ−Ｅｓｔｅｖｅｓ Ｍ．Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｙｉｅｌｄｓ ＡＡＶ−Ｂ１ Ｃａｐｓｉｄ ｆｏｒ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６ Ａｕｇ；２４（７）：１２４７〜５７．（ＡＡＶ−Ｂ１）
Ｄｅｖｅｒｍａｎ ＢＥ，Ｐｒａｖｄｏ ＰＬ，Ｓｉｍｐｓｏｎ ＢＰ，Ｋｕｍａｒ ＳＲ，Ｃｈａｎ ＫＹ，Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ａ，Ｗｕ ＷＬ，Ｙａｎｇ Ｂ，Ｈｕｂｅｒ Ｎ，Ｐａｓｃａ ＳＰ，Ｇｒａｄｉｎａｒｕ Ｖ．Ｃｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄｓ ＡＡＶ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｂｒａｉｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｆｅｂ；３４（２）：２０４〜９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３４４０．（ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ）
Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ Ｎ，Ｓｈｅｎ Ｓ，Ｙａｄａｖ Ｓ，Ｄｅｂｂｉｎｋ Ｋ，Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ Ｌ，Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ，Ａｓｏｋａｎ Ａ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｌｉｖｅｒ−ｄｅｔａｒｇｅｔｅｄ ＡＡＶ９ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄ ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ｊｕｎ；１９（６）：１０７０〜８．（ＡＡＶ９由来のミュータントＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．４７）
Ｙａｎｇ Ｌ，Ｊｉａｎｇ Ｊ，Ｄｒｏｕｉｎ ＬＭ，Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ，Ｃｈｅｎ Ｃ，Ｑｉａｏ Ｃ，Ｐｕ Ｄ，Ｈｕ Ｘ，Ｗａｎｇ ＤＺ，Ｌｉ Ｊ，Ｘｉａｏ Ｘ．Ａ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｅｖｏｌｖｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００９ Ｍａｒ １０；１０６（１０）：３９４６〜５１．（ＡＡＶＭ４１）
Ｋｏｒｂｅｌｉｎ Ｊ，Ｓｉｅｂｅｒ Ｔ，Ｍｉｃｈｅｌｆｅｌｄｅｒ Ｓ，Ｌｕｎｄｉｎｇ Ｌ，Ｓｐｉｅｓ Ｅ，Ｈｕｎｇｅｒ Ａ，Ａｌａｗｉ Ｍ，Ｒａｐｔｉ Ｋ，Ｉｎｄｅｎｂｉｒｋｅｎ Ｄ，Ｍｕｌｌｅｒ ＯＪ，Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ Ｒ，Ａｒａｐ Ｗ，Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ ＪＡ，Ｔｒｅｐｅｌ Ｍ．Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｇｕｉｄｅｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｒａｎｄｏｍ Ｃａｐｓｉｄ Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６ Ｊｕｎ；２４（６）：１０５０〜６１．（ＡＡＶ２呈示ペプチド）
Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ＪＣ，Ｋｅｉｓｅｒ ＮＷ，Ｏｋｕｌｉｓｔ Ａ，Ｍａｒｔｉｎｓ Ｉ，Ｗｉｌｓｏｎ ＭＳ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ ＢＬ．Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ ｉｓ ｔｈｅ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＡＡＶ Ｔｈａｔ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｂｒａｉｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１４ Ｏｃｔ １４；３：ｅ２０２．（ＡＡＶ２−ＧＭＮ）
Ｖａｒａｄｉ Ｋ，Ｍｉｃｈｅｌｆｅｌｄｅｒ Ｓ，Ｋｏｒｆｆ Ｔ，Ｈｅｃｋｅｒ Ｍ，Ｔｒｅｐｅｌ Ｍ，Ｋａｔｕｓ ＨＡ，Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ ＪＡ，Ｍｕｌｌｅｒ ＯＪ．Ｎｏｖｅｌ ｒａｎｄｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ａｕｇ；１９（８）：８００〜９．（ＡＡＶ９呈示ペプチド）
Ｍｉｃｈｅｌｆｅｌｄｅｒ Ｓ，Ｖａｒａｄｉ Ｋ，Ｒａｕｐｐ Ｃ，Ｈｕｎｇｅｒ Ａ，Ｋｏｒｂｅｌｉｎ Ｊ，Ｐａｈｒｍａｎｎ Ｃ，Ｓｃｈｒｅｐｆｅｒ Ｓ，Ｍｕｌｌｅｒ ＯＪ，Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ ＪＡ，Ｔｒｅｐｅｌ Ｍ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅｆｏｌｄ ｓｐｉｋｅ ｃａｐｓｉｄ ｄｏｍａｉｎ ｔｏ ｒｅ−ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ８ ａｎｄ ＡＡＶ９ ｉｎ ｖｉｖｏ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（８）：ｅ２３１０１．（ＡＡＶ８およびＡＡＶ９呈示ペプチド）
Ｙｕ ＣＹ，Ｙｕａｎ Ｚ，Ｃａｏ Ｚ，Ｗａｎｇ Ｂ，Ｑｉａｏ Ｃ，Ｌｉ Ｊ，Ｘｉａｏ Ｘ．Ａ ｍｕｓｃｌｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ＡＡＶ２ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｔｒｏｐｉｓｍ ｏｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９ Ａｕｇ；１６（８）：９５３〜６２．
Ｍｉｃｈｅｌｆｅｌｄｅｒ Ｓ，Ｌｅｅ ＭＫ，ｄｅＬｉｍａ−Ｈａｈｎ Ｅ，Ｗｉｌｍｅｓ Ｔ，Ｋａｕｌ Ｆ，Ｍｕｌｌｅｒ Ｏ，Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ ＪＡ，Ｔｒｅｐｅｌ Ｍ．Ｖｅｃｔｏｒｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００７ Ｄｅｃ；３５（１２）：１７６６〜７６．
Ｍｕｌｌｅｒ ＯＪ，Ｋａｕｌ Ｆ，Ｗｅｉｔｚｍａｎ ＭＤ，Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ Ｒ，Ａｒａｐ Ｗ，Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ ＪＡ，Ｔｒｅｐｅｌ Ｍ．Ｒａｎｄｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３ Ｓｅｐ；２１（９）：１０４０〜６．
Ｇｒｉｆｍａｎ Ｍ，Ｔｒｅｐｅｌ Ｍ，Ｓｐｅｅｃｅ Ｐ，Ｇｉｌｂｅｒｔ ＬＢ，Ａｒａｐ Ｗ，Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ Ｒ，Ｗｅｉｔｚｍａｎ ＭＤ．Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００１ Ｊｕｎ；３（６）：９６４〜７５．
Ａｎｎｅ Ｇｉｒｏｄ，Ｍａｒｔｉｎ Ｒｉｅｄ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｅ Ｗｏｂｕｓ，Ｈａｒａｌｄ Ｌａｈｍ，Ｋｒｉｓｔｉｎ Ｌｅｉｋｅ，Ｊｕｒｇｅｎ Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｄｅｌｅａｇｅ＆Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈａｌｌｅｋ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃａｐｓｉｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｌｌｏｗ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０５２〜１０５６（１９９９）
Ｂｅｌｌｏ Ａ，Ｃｈａｎｄ Ａ，Ａｖｉｌｅｓ Ｊ，Ｓｏｕｌｅ Ｇ，Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ Ａ，Ｋｏｂｉｎｇｅｒ ＧＰ．Ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｐｉｇ ｔｉｓｓｕｅｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｅ ｍｏｓｔ ｍａｊｏｒ ｏｒｇａｎｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１４ Ｏｃｔ ２２；４：６６４４．（ＡＡＶｐｏ２．１，ＡＡＶｐｏ４、ＡＡＶｐｏ５およびＡＡＶｐｏ６）
Ｇａｏ Ｇ，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ＬＨ，Ａｌｖｉｒａ ＭＲ，Ｌｕ Ｙ，Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ，Ｚｈｏｕ Ｘ，Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ．Ｃｌａｄｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｒｅ ｗｉｄｅｌｙ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００４ Ｊｕｎ；７８（１２）：６３８１〜８．（ＡＡＶ ｒｈおよびＡＡＶ Ｈｕ）
Ａｒｂｅｔｍａｎ ＡＥ，Ｌｏｃｈｒｉｅ Ｍ，Ｚｈｏｕ Ｓ，Ｗｅｌｌｍａｎ Ｊ，Ｓｃａｌｌａｎ Ｃ，Ｄｏｒｏｕｄｃｈｉ ＭＭ，ｅｔ ａｌ．Ｎｏｖｅｌ ｃａｐｒｉｎｅ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｃａｐｓｉｄ（ＡＡＶ−Ｇｏ．１）ｉｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｔｅ ＡＡＶ−５ ａｎｄ ｈａｓ ｕｎｉｑｕｅ ｔｒｏｐｉｓｍ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００５；７９：１５２３８〜１５２４５．（ＡＡＶ−Ｇｏ．１）
Ｌｏｃｈｒｉｅ ＭＡ，Ｔａｔｓｕｎｏ ＧＰ，Ａｒｂｅｔｍａｎ ＡＥ，Ｊｏｎｅｓ Ｋ，Ｐａｔｅｒ Ｃ，Ｓｍｉｔｈ ＰＨ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｃａｐｓｉｄ ｇｅｎｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒａｔ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｄｅｆｉｎｅ ｔｗｏ ｎｅｗ ＡＡＶ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｉｓｔａｎｔｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＡＡＶ−５．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００６；３５３：６８〜８２．（ＡＡＶ−ｍｏ．１）
Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｍ，Ｋａｔａｎｏ Ｈ，Ｂｏｓｓｉｓ Ｉ，Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ＪＡ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｏｖｉｎｅ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００４；７８：６５０９〜６５１６．（ＢＡＡＶ）
Ｂｏｓｓｉｓ Ｉ，Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ＪＡ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｖｉａｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＡＶ）ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＡＶ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００３；７７：６７９９〜６８１０．（ＡＡＡＶ）
Ｃｈｅｎ ＣＬ，Ｊｅｎｓｅｎ ＲＬ，Ｓｃｈｎｅｐｐ ＢＣ，Ｃｏｎｎｅｌｌ ＭＪ，Ｓｈｅｌｌ Ｒ，Ｓｆｅｒｒａ ＴＪ，Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＪＳ，Ｃｌａｒｋ ＫＲ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＰＲ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００５ Ｄｅｃ；７９（２３）：１４７８１〜９２．（ＡＡＶバリアント）
Ｓｅｎ Ｄ，Ｇａｄｋａｒｉ ＲＡ，Ｓｕｄｈａ Ｇ，Ｇａｂｒｉｅｌ Ｎ，Ｋｕｍａｒ ＹＳ，Ｓｅｌｏｔ Ｒ，Ｓａｍｕｅｌ Ｒ，Ｒａｊａｌｉｎｇａｍ Ｓ，Ｒａｍｙａ Ｖ，Ｎａｉｒ ＳＣ，Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ Ｎ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ａ，Ｊａｙａｎｄｈａｒａｎ ＧＲ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ８ ｃａｐｓｉｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｉｔｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ａｐｒ；２４（２）：１０４〜１６．（ＡＡＶ８ Ｋ１３７Ｒ）
Ｌｉ Ｂ，Ｍａ Ｗ，Ｌｉｎｇ Ｃ，Ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ Ｋ，Ｈｕａｎｇ ＬＹ，Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ａ，Ａｓｌａｎｉｄｉ ＧＶ．Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｘｐｏｓｅｄ Ｌｙｓｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｌｅａｄｓ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＡＡＶ２，Ｂｕｔ Ｎｏｔ ＡＡＶ８，Ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｍｕｒｉｎｅ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５ Ｄｅｃ；２６（６）：２１１〜２０．
Ｇａｂｒｉｅｌ Ｎ，Ｈａｒｅｅｎｄｒａｎ Ｓ，Ｓｅｎ Ｄ，Ｇａｄｋａｒｉ ＲＡ，Ｓｕｄｈａ Ｇ，Ｓｅｌｏｔ Ｒ，Ｈｕｓｓａｉｎ Ｍ，Ｄｈａｋｓｎａｍｏｏｒｔｈｙ Ｒ，Ｓａｍｕｅｌ Ｒ，Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ＡＡＶ２ ｃａｐｓｉｄ ａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｒｉｎｅ，ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，ｏｒ ｌｙｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｉｔｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ａｐｒ；２４（２）：８０〜９３．
Ｚｉｎｎ Ｅ，Ｐａｃｏｕｒｅｔ Ｓ，Ｋｈａｙｃｈｕｋ Ｖ，Ｔｕｒｕｎｅｎ ＨＴ，Ｃａｒｖａｌｈｏ ＬＳ，Ａｎｄｒｅｓ−Ｍａｔｅｏｓ Ｅ，Ｓｈａｈ Ｓ，Ｓｈｅｌｋｅ Ｒ，Ｍａｕｒｅｒ ＡＣ，Ｐｌｏｖｉｅ Ｅ，Ｘｉａｏ Ｒ，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ＬＨ．Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｒａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｙｉｅｌｄｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１５ Ａｕｇ １１；１２（６）：１０５６〜６８．（ＡＡＶ Ａｎｃ８０Ｌ６５）
Ｓｈｅｎ Ｓ，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ ＥＤ，Ｔｒｏｕｐｅｓ ＡＮ，Ｂｒｏｗｎ ＳＭ，Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ Ｎ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ，Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ，Ａｓｏｋａｎ Ａ．Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ ｏｎｔｏ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｃａｐｓｉｄｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１３ Ｏｃｔ ４；２８８（４０）：２８８１４〜２３．（ＡＡＶ２Ｇ９）
Ｌｉ Ｃ，Ｄｉｐｒｉｍｉｏ Ｎ，Ｂｏｗｌｅｓ ＤＥ，Ｈｉｒｓｃｈ ＭＬ，Ｍｏｎａｈａｎ ＰＥ，Ａｓｏｋａｎ Ａ，Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ，Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１２ Ａｕｇ；８６（１５）：７７５２〜９．（ＡＡＶ２ ２６５挿入ＡＡＶ２／２６５Ｄ）
Ｂｏｗｌｅｓ ＤＥ，ＭｃＰｈｅｅ ＳＷ，Ｌｉ Ｃ，Ｇｒａｙ ＳＪ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＪＪ，Ｃａｍｐ ＡＳ，Ｌｉ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｂ，Ｍｏｎａｈａｎ ＰＥ，Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅ １ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｆｅｂ；２０（２）：４４３〜５５（ＡＡＶ２．５）
Ｍｅｓｓｉｎａ ＥＬ，Ｎｉｅｎａｂｅｒ Ｊ，Ｄａｎｅｓｈｍａｎｄ Ｍ，Ｖｉｌｌａｍｉｚａｒ Ｎ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｊ，Ｍｉｌａｎｏ Ｃ，Ｂｏｗｌｅｓ ＤＥ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ３ｂ ｕｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｏｃｔ；２３（１０）：１０３１〜４２．（ＡＡＶ３ ＳＡＳＴＧ）
Ａｓｏｋａｎ Ａ，Ｃｏｎｗａｙ ＪＣ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＪＬ，Ｌｉ Ｃ，Ｈｅｇｇｅ Ｊ，Ｓｉｎｎｏｔｔ Ｒ，Ｙａｄａｖ Ｓ，ＤｉＰｒｉｍｉｏ Ｎ，Ｎａｍ ＨＪ，Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ，ＭｃＰｈｅｅ Ｓ，Ｗｏｌｆｆ Ｊ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｍｕｓｃｌｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０ Ｊａｎ；２８（１）：７９〜８２．（ＡＡＶ２ｉ８）
Ｖａｎｃｅ Ｍ，Ｌｌａｎｇａ Ｔ，Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｗ，Ｗｏｏｄａｒｄ Ｋ，Ｍｕｒｌｉｄｈａｒａｎ Ｇ，Ｃｈｕｎｇｆａｔ Ｎ，Ａｓｏｋａｎ Ａ，Ｇｉｌｇｅｒ Ｂ，Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇ Ｊ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ，Ｈｉｒｓｃｈ ＭＬ．ＡＡＶ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＭＰＳ１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｏｒｎｅａｌ Ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６ Ｆｅｂ ２２；６：２２１３１．（ＡＡＶ８Ｇ９）
Ｚｈｏｎｇ Ｌ，Ｌｉ Ｂ，Ｍａｈ ＣＳ，Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ Ｌ，Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ，Ｃｏｏｐｅｒ Ｍ，Ｈｅｒｚｏｇ ＲＷ，Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｉ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＫＨ Ｊｒ，Ｗｅｉｇｅｌ−Ｖａｎ Ａｋｅｎ ＫＡ，Ｈｏｂｂｓ ＪＡ，Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓ，Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ａ．Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅｓ ｌｅａｄ ｔｏ ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｔ ｌｏｗｅｒ ｄｏｓｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００８ Ｊｕｎ ３；１０５（２２）：７８２７〜３２．（ＡＡＶ２チロシンミュータントＡＡＶ２ Ｙ−Ｆ）
Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａ Ｈ，Ｄｉｎｃｕｌｅｓｃｕ Ａ，Ｌｉ Ｑ，Ｍｉｎ ＳＨ，Ｃｈｉｏｄｏ Ｖ，Ｐａｎｇ ＪＪ，Ｚｈｏｎｇ Ｌ，Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ａ，Ｌｅｗｉｎ ＡＳ，Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ ＷＷ．Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｒｅｔｉｎａ ｂｙ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｍｕｔａｎｔ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９ Ｍａｒ；１７（３）：４６３〜７１．（ＡＡＶ８ Ｙ−ＦおよびＡＡＶ９ Ｙ−Ｆ）
Ｑｉａｏ Ｃ，Ｚｈａｎｇ Ｗ，Ｙｕａｎ Ｚ，Ｓｈｉｎ ＪＨ，Ｌｉ Ｊ，Ｊａｙａｎｄｈａｒａｎ ＧＲ，Ｚｈｏｎｇ Ｌ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ａ，Ｘｉａｏ Ｘ，Ｄｕａｎ Ｄ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ６ ｃａｐｓｉｄ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｔｏ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｏｃｔ；２１（１０）：１３４３〜８（ＡＡＶ６ Ｙ−Ｆ）
Ｃａｒｌｏｎ Ｍ，Ｔｏｅｌｅｎ Ｊ，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｅｒｒｅｎ Ａ，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ＬＨ，Ｒｅｕｍｅｒｓ Ｖ，Ｓｂｒａｇｉａ Ｌ，Ｇｉｊｓｂｅｒｓ Ｒ，Ｂａｅｋｅｌａｎｄｔ Ｖ，Ｈｉｍｍｅｌｒｅｉｃｈ Ｕ，Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ，Ｄｅｐｒｅｓｔ Ｊ，Ｄｅｂｙｓｅｒ Ｚ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｌｕｎｇ ｂｙ ｆｅｔａｌ ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒＡＡＶ２／６．２ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｄｅｃ；１８（１２）：２１３０〜８．（ＡＡＶ６．２）
ＰＣＴ公開ＷＯ第２０１３１５８８７９号（リジンミュータント）
ＶＰ１およびＶＰ３の任意の組合せ、ならびに存在する場合、ＡＡＶ血清型の任意の組合せ由来のＶＰ１．５およびＶＰ２を利用して、本明細書に記載のＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ粒子を生成可能であることが理解される。例えば、ＡＡＶ血清型の任意の組合せ由来のＶＰ１タンパク質は、ＡＡＶ血清型の任意の組合せ由来のＶＰ３タンパク質と組み合わせることが可能であり、それぞれのＶＰ１タンパク質は、種々の血清型との任意の比率で存在することが可能であり、それぞれのＶＰ３タンパク質は、種々の血清型との任意の比率で存在することが可能であり、ＶＰ１およびＶＰ３タンパク質は、種々の血清型との任意の比率で存在することが可能である。存在する場合、ＡＡＶ血清型の任意の組合せ由来のＶＰ１．５および／またはＶＰ２タンパク質が、ＡＡＶ血清型の任意の組合せ由来のＶＰ１およびＶＰ３タンパク質と組合せることが可能であり、それぞれのＶＰ１．５タンパク質は、種々の血清型との任意の比率で存在することが可能であり、それぞれのＶＰ２タンパク質が、種々の血清型との任意の比率で存在することが可能であり、それぞれのＶＰ１タンパク質は、種々の血清型との任意の比率で存在することが可能であり、それぞれのＶＰ３タンパク質は、種々の血清型との任意の比率で存在することが可能であり、ＶＰ１．５および／またはＶＰ２タンパク質が、ＶＰ１およびＶＰ３タンパク質と組合せて種々の血清型との任意の比率で存在することが可能であることがさらに理解される。
例えば、それぞれのウイルスタンパク質および／またはそれぞれのＡＡＶ血清型は、任意の比率で組み合わせてもよく、これはＡ：Ｂ、Ａ：Ｂ：Ｃ、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ：Ｅ、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ：Ｅ：Ｆ、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ：Ｅ：Ｆ：Ｇ、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ：Ｅ：Ｆ：Ｇ：Ｈ、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ：Ｅ：Ｆ：Ｇ：Ｈ：ＩまたはＡ：Ｂ：Ｃ：Ｄ：Ｅ：Ｆ：Ｇ：Ｈ：Ｉ：Ｊの比率であってもよく、この場合、Ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００等であってもよく、Ｂは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００等であってもよく、Ｃは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００等であってもよく、Ｄは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００等であってもよく、Ｅは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００等であってもよく、Ｆは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００等であってもよく、Ｇは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００等であってもよく、Ｈは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００等であってもよく、Ｉは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００等であってもよく、Ｊは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００等であってもよい。
また、ＶＰ１、ＶＰ１．５、ＶＰ２および／またはＶＰ３カプシドタンパク質のいずれかが、任意の組合せ、ならびに同一のタンパク質型に対する、および／または異なるカプシドタンパク質に対する比率で、キメラカプシドタンパク質として、本発明のＡＡＶ粒子のカプシドに存在し得ることが理解される。
一部の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子は、ある特定の実施形態において、脳および／または中枢神経系の細胞に対する全身的または選択的親和性を有し得る、ウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子は、肝臓に対する親和性が低減し得る。
本発明ではさらに、本発明のウイルスベクターまたはＡＡＶ粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤であり得る組成物を提供する。
一部の非限定的な例では、本発明では、３回軸ループ４のアミノ酸配列において修飾を含むカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ１．５、ＶＰ２および／またはＶＰ３）を含むＡＡＶ粒子、ならびに修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドおよびウイルスベクターを提供する。本発明者らは、このループを修飾すると、（ｉ）肝臓への形質導入の低減、（ｉｉ）内皮細胞を通過する移動の増強、（ｉｉｉ）全身的形質導入、（ｉｖ）筋肉組織（例えば、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋）への形質導入の増強、および／または（ｖ）脳組織（例えば、ニューロン）への形質導入の向上を非限定的に含む１つまたは複数の望ましい特性を、修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスベクターに付与し得ることを発見した。したがって、本発明では、従来のＡＡＶベクターと関連する制限の一部に取り組む。例えば、ＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９ベクターに基づくベクターは、これらが内皮細胞の関門を容易に通過するため、核酸の全身送達に対して魅力的であるが、ｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９を全身投与するとベクターのほとんどが肝臓に送達され、これにより他の重要な標的組織、例えば、骨格筋への形質導入が低減する。
本発明の実施形態では、脳および／または中枢神経系の細胞への本発明のＡＡＶ粒子による形質導入は、本明細書に記載の表面結合ペプチドを欠くＡＡＶ粒子による形質導入レベルよりも、少なくとも約５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍またはこれを超えて高い。
特定の実施形態では、本発明の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質は、３回軸ループ４のアミノ酸配列（例えば、天然ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸位置５７５〜６００番目［包括的］または別のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質の対応する領域）において１つまたは複数の修飾を含む。本明細書において使用する場合、アミノ酸配列における「修飾」は、置換、挿入および／または欠失を含み、このそれぞれには、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはこれを超えるアミノ酸が関与し得る。特定の実施形態では、修飾は、置換である。例えば、特定の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個またはこれを超える、あるＡＡＶの３回軸ループ４由来のアミノ酸は、天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸位置５７５〜６００番目または別のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質の対応する位置に置換により導入し得る。しかし、本発明の修飾ウイルスカプシドは、あるＡＡＶカプシド由来のアミノ酸が別のＡＡＶカプシドに置換により導入されるＡＡＶカプシドに限定されず、置換および／または挿入されたアミノ酸は、任意の供給源由来であってもよく、さらに、天然に存在するか、または部分的もしくは完全に合成であってもよい。
本明細書に記載のように、多数のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質の核酸およびアミノ酸の配列は、当技術分野において既知である。したがって、天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸位置５７５〜６００番目（包括的）またはアミノ酸位置５８５〜５９０番目（包括的）に「対応する」アミノ酸は、他の任意のＡＡＶに対して（例えば、配列アラインメントを使用することにより）容易に決定することができる。
一部の実施形態では、本発明では、本発明の修飾カプシドタンパク質が、現在既知または後に発見される任意のＡＡＶのカプシドタンパク質を修飾することにより生成可能であることを検討する。さらに、修飾するＡＡＶカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａもしくは３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２カプシドタンパク質、あるいは表１に示すＡＡＶのいずれか）であり得るが、これらに限定されない。当業者は、ＡＡＶカプシドタンパク質への多様な操作が、当技術分野において既知であり、本発明が、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質の修飾に限定されないことを理解する。例えば、修飾するカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶ（例えば、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１および／もしくはＡＡＶ１２、または現在既知もしくは後に発見される他の任意のＡＡＶに由来する）と比較して、変異を既に有し得る。また、このようなＡＡＶＶカプシドタンパク質は、本発明の範囲内に存在する。
例えば、一部の実施形態では、修飾するＡＡＶカプシドタンパク質は、天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質配列のアミノ酸２６４の直後にアミノ酸挿入を含んでもよく（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ第２００６／０６６０６６号を参照）、および／またはＰＣＴ公開ＷＯ第２００９／１０８２７４号に記載のようにＨＩループが変異したＡＡＶであってもよく、および／または精製を容易とするためポリＨｉｓ配列を含むように修飾したＡＡＶであってもよい。別の説明的な例としては、ＡＡＶカプシドタンパク質は、挿入または置換として、そこに組み込むペプチド標的化配列を有し得る。さらに、ＡＡＶカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質に置換により導入および／または挿入されている、別のＡＡＶ由来の大型のドメインを含み得る。
したがって、特定の実施形態では、修飾するＡＡＶカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶに由来し得るが、カプシドタンパク質に挿入および／もしくは置換により導入され、ならびに／または１つもしくは複数のアミノ酸の欠失により変異している、１つまたは複数の外来配列（例えば、天然のウイルスに対して外因性である配列）をさらに含む。
したがって、特定のＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１もしくはＡＡＶ１２カプシドタンパク質、または表１に示すＡＡＶのいずれかに由来のカプシドタンパク質等）について本明細書において言及する場合、天然カプシドタンパク質ならびに本発明の修飾以外の変異を有するカプシドタンパク質を包含することを意図する。このような変異は、置換、挿入および／または欠失を含む。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、天然ＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満または７０個未満のアミノ酸の挿入（本発明の挿入以外）をそこに含む。本発明の実施形態では、カプシドタンパク質は、天然ＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満または７０個未満のアミノ酸の置換（本発明によるアミノ酸置換以外）を含む。本発明の実施形態では、カプシドタンパク質は、天然ＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上または７０個以上のアミノ酸の欠失（本発明のアミノ酸欠失以外）を含む。
したがって、例えば、用語「ＡＡＶ２カプシドタンパク質」は、天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７８０を参照）ならびに天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質配列において置換、挿入および／または欠失を含むもの（前項に記載するような）を有するＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、天然ＡＡＶカプシドタンパク質配列を有するか、または天然ＡＡＶカプシドタンパク質配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％類似もしくは同一のアミノ酸配列を有する。例えば、特定の実施形態では、「ＡＡＶ２」カプシドタンパク質は、天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質配列、ならびに天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質配列と少なくとも約７５％、８０％＜８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％類似または同一の配列を包含する。
２つ以上のアミノ酸配列間の配列類似性または同一性を判定する方法は、当技術分野において既知である。配列類似性または同一性は、当技術分野において既知の標準的技術を使用して判定することができ、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２，４８２（１９８１）の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４（１９８８）の類似方法の検索、このようなアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、マディソン、ＷＩ州）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２，３８７〜３９５（１９８４）により記載されているＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、または検査による技術を含むが、これらに限定されない。
別の適するアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３〜４１０（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，５８７３〜５７８７（１９９３）に記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６，４６０〜４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから入手した。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用し、これは、任意選択で、デフォルト値に設定する。パラメータは、動的値であり、特定の配列の組成および検索する目的の配列に対する特定のデータベースの組成に応じて、プログラムそれ自体により確立するが、値は、補正して感度を高め得る。
さらに、追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９〜３４０２により報告されているｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴである。
本発明の一部の実施形態では、修飾は、天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸位置５８５〜５９０番目（包括的）の領域（ＶＰ１採番を使用）または他のＡＡＶの対応する位置（天然ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドタンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７８０またはＹＰ６８０４２６）、すなわち、天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸位置５８５〜５９０番目（ＶＰ１採番）に対応するアミノ酸において行い得る。他のＡＡＶ血清型または修飾ＡＡＶカプシドにおける、天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質の５８５〜５９０番目「に対応する」アミノ酸位置は、当業者に明らかであり、配列アラインメント技術（例えば、ＷＯ第２００６／０６６０６６号の図７を参照）および／または結晶構造解析（Ｐａｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７〜５８）を使用して容易に決定し得る。
例えば、挿入および／または欠失を既に含むＡＡＶカプシドタンパク質に修飾を導入して、すべての下流配列の位置を転位することができる。この場合、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸位置５８５〜５９０番目に対応するアミノ酸位置もやはり、当業者に容易に同定可能である。例えば、カプシドタンパク質は、アミノ酸位置２６４番目の後に挿入を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質であり得る（例えば、ＷＯ第２００６／０６６０６６号を参照）。天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質の５８５〜５９０番目の位置に見出されるアミノ酸（例えば、ＲＧＮＲＱＡ（配列番号１））は、ここでは５８６〜５９１番目の位置であるが、やはり当業者に同定可能である。
一部の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子は、例えば、米国特許第５，８６３，５４１号に記載されている「カプシド媒体」として使用され得る、修飾ウイルスカプシドを含み得る。修飾ウイルスカプシドによりパッケージングされ、細胞に導入され得る分子は、異種ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、有機低分子、金属またはこれらの組合せを含む。
異種分子（例えば、核酸、タンパク質、ペプチド等）は、ＡＡＶ感染において天然に見出されない分子、例えば、野生型ＡＡＶゲノムによりコードされない分子として定義される。さらに、治療的に有用な分子は、ウイルスカプシドの外部に結合して、標的宿主細胞に分子を導入し得る。このような結合分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、有機低分子、金属、炭水化物、脂質および／またはポリペプチドを含み得る。本発明の一実施形態では、治療的に有用な分子は、カプシドタンパク質に共有結合させる（すなわち、共役または化学的に結合する）。分子に共有結合させる方法は、当業者に既知である。
また、本明細書に記載する修飾ウイルスカプシドは、新規のカプシド構造に対する抗体の産生において利用される。さらなる代替として、外因性アミノ酸配列を修飾ウイルスカプシドに挿入して、細胞に抗原呈示させ、例えば、対象に投与して、外因性アミノ酸配列に対する免疫応答を引き起こし得る。
他の実施形態では、目的のポリペプチドまたは機能性ＲＮＡをコードする核酸を送達する本発明のウイルスベクターの投与の前および／または同時に（例えば、相互に数分または数時間以内に）、ウイルスカプシドを投与して、ある特定の細胞部位を遮断することができる。例えば、カプシドを送達して肝細胞上の細胞受容体を遮断することができ、その後および／または同時に、肝細胞への形質導入を低減させ得る、送達ウイルスベクターを投与し、他の標的（例えば、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋）への形質導入を増強することができる。
代表的実施形態によれば、修飾ウイルスカプシドは、本発明によるウイルスベクターの前および／または同時に対象に投与することができる。さらに、本発明では、本発明の修飾ウイルスカプシドおよび本発明のウイルスベクターを含む、組成物および医薬製剤を提供する。
本発明のＡＡＶ粒子の一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質への修飾は、「選択的」修飾であり得る。この方法は、ＡＡＶ血清型間のサブユニット全体または大型ドメインの交換による先行の研究とは大いに異なる（例えば、国際特許公開ＷＯ第００／２８００４号およびＨａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：２７６８〜２７７４を参照）。特定の実施形態では、「選択的」修飾により、約２０、１８、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３または２未満の連続したアミノ酸の挿入および／または置換および／または欠失が生じる。
修飾カプシドタンパク質およびカプシドは、現在既知または後に同定される、他の任意の修飾をさらに含み得る。
ウイルスカプシドは、標的化配列を含む（例えば、ウイルスカプシドにおいて置換または挿入した）標的化ウイルスカプシドであってもよく、これは、ウイルスカプシドを、所望の標的組織（複数可）上に存在する細胞表面分子と相互作用するように方向づける（例えば、国際特許公開ＷＯ第００／２８００４号およびＨａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：２７６８〜２７７４を参照）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：３５３〜３６１（２００６）［ＡＡＶカプシドサブユニットの５２０および／または５８４番目の位置でのインテグリン受容体結合モチーフＲＧＤの挿入について記載］；および米国特許第７，３１４，９１２号［ＡＡＶ２カプシドサブユニットのアミノ酸位置４４７、５３４、５７３および５８７番目の後にＲＧＤモチーフを含むＰ１ペプチドの挿入について記載］。挿入に耐えるＡＡＶカプシドサブユニット内の他の位置は、当技術分野において既知である（例えば、４４９および５８８番目）。
例えば、本発明のＡＡＶ粒子のウイルスカプシドの一部は、目的の標的組織のほとんど（例えば、肝臓、骨格筋、心臓、横隔膜筋、腎臓、脳、胃、腸、皮膚、内皮細胞および／または肺）に対して相対的に非効率的親和性を有し得る。標的化配列は、このような低形質導入ベクターに有利に組み込み、これによりウイルスカプシドに、所望の親和性、および任意選択で、特定の組織（複数可）に対する選択的親和性を付与することができる。標的化配列を含む、ＡＡＶカプシドタンパク質、カプシドおよびベクターは、例えば、国際特許公開ＷＯ第００／２８００４号に記載されている。別の可能性として、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５〜４９（２００６））により記載されているような、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸を、低形質導入ベクターを所望の標的組織（複数可）に再度方向づける手段として、ＡＡＶカプシドサブユニットの直行性部位に組み込むことができる。このような非天然アミノ酸を有利に使用して、グリカン（マンノース − 樹状細胞標的化）；特定のがん細胞型への標的化送達のためのＲＧＤ、ボンベシンまたは神経ペプチド；特定の細胞表面受容体、例えば、増殖因子受容体、インテグリン等を標的化したファージディスプレイにより選択されたＲＮＡアプタマーまたはペプチドを非限定的に含む、ＡＡＶカプシドタンパク質に、目的の分子を化学的に結合させることができる。アミノ酸を化学的に修飾する方法は、当技術分野において既知である（例えば、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照）。
代表的実施形態では、標的化配列は、感染を特定の細胞型（複数可）に方向づける、ウイルスカプシド配列（例えば、自律パルボウイルスカプシド配列、ＡＡＶカプシド配列、または他の任意のウイルスカプシド配列）であり得る。
別の非限定的な例としては、ヘパリン結合ドメイン（例えば、呼吸器合胞体ウイルスヘパリン結合ドメイン）を、ＨＳ受容体（例えば、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５）に典型的には結合しないカプシドサブユニット内に挿入または置換により導入して、得られるミュータントにヘパリン結合を付与し得る。
Ｂ１９は、この受容体としてグロボシドを使用して、初代赤血球前駆細胞に感染する。Ｂ１９の構造は、８Åの分解能まで決定されている。グロボシドに結合するＢ１９カプシドの領域では、アミノ酸３９９〜４０６番目の間、βバレル構造Ｅ〜Ｆの間のループ外領域がマッピングされている。したがって、Ｂ１９カプシドのグロボシド受容体結合ドメインは、ＡＡＶカプシドタンパク質に置換により導入して、これを含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターの標的を赤血球細胞とし得る。
代表的実施形態では、外因性標的化配列は、修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターの親和性を変化させるペプチドをコードするアミノ酸配列であり得る。特定の実施形態では、標的化ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在し得るか、あるいは、完全または部分的に合成され得る。例となる標的化配列としては、細胞表面受容体および糖タンパク質に結合するリガンドおよび他のペプチド、例えば、ＲＧＤペプチド配列、ブラジキニン、ホルモン、ペプチド増殖因子（例えば、上皮増殖因子、神経成長因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ等）、サイトカイン、メラニン細胞刺激ホルモン（例えば、α、βまたはγ）、神経ペプチドおよびエンドルフィン等、ならびにこれらのコグネート受容体を細胞の標的とする能力を保持するこれらの断片が挙げられる。他の例示的ペプチドおよびタンパク質としては、サブスタンスＰ、ケラチノサイト増殖因子、神経ペプチドＹ、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン２、ニワトリ卵白リゾチーム、エリスロポエチン、ゴナドリベリン、コルチコスタチン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔａｔｉｎ）、βエンドルフィン、ロイシンエンケファリン、リモルフィン（ｒｉｍｏｒｐｈｉｎ）、αネオエンケファリン、アンジオテンシン、ニューマジン（ｐｎｅｕｍａｄｉｎ）、血管作動性腸ペプチド、ニューロテンシン、モチリン、およびこれら上記の断片が挙げられる。またさらなる代替としては、毒素（例えば、破傷風毒素または蛇毒、例えば、αブンガロトキシン等）由来の結合ドメインは、標的化配列としてカプシドタンパク質に置換により導入することができる。またさらなる代表的実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｃｌｅｖｅｓにより記載されているように（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：Ｒ３１８（１９９７））「非古典的」輸入／輸出シグナルペプチド（例えば、線維芽細胞増殖因子１および２、インターロイキン１、ＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質等）のＡＡＶカプシドタンパク質への置換により修飾することができる。また、特定の細胞による取込みを方向づけるペプチドモチーフを包含し、例えば、ＦＶＦＬＰ（配列番号２）ペプチドモチーフによって肝細胞による取込みが引き起こされる。ファージディスプレイ技術、ならびに当技術分野において既知の他の技術を使用して、目的の任意の細胞型を認識するペプチドを同定し得る。
標的化配列は、受容体（例えば、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質またはプロテオグリカン）を含む、細胞表面結合部位を標的とする任意のペプチドをコードし得る。細胞表面結合部位の例としては、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、および他のグリコサミノグリカン；ムチン、糖タンパク質、およびガングリオシド上に見出されるシアル酸部分；ＭＨＣ Ｉ糖タンパク質；マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、ガラクトース等を含む膜糖タンパク質上に見出される炭水化物成分が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、ヘパラン硫酸（ＨＳ）またはヘパリン結合ドメインは、（例えば、さもなければＨＳまたはヘパリンに結合しないＡＡＶの）ウイルスカプシドに置換により導入する。ＨＳ／ヘパリン結合が、アルギニンおよび／またはリジンに富む「塩基性パッチ」により媒介されることは当技術分野において既知である。例となる実施形態では、配列は、ＢＸＸＢモチーフ（配列番号３）に従い、この場合、「Ｂ」は塩基性残基であり、Ｘは中性および／または疎水性である。非限定的な一例としては、ＢＸＸＢは、ＲＧＮＲ（配列番号４）である。特定の実施形態では、ＢＸＸＢは、天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸位置２６２〜２６５番目、または別のＡＡＶのカプシドタンパク質の対応する位置と置換する。
適する標的化配列の非限定的な他の例としては、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：１０４０〜１０４６（２００３）により同定された、冠動脈内皮細胞を標的とするペプチド（共通配列ＮＳＶＲＤＬＧ／Ｓ（配列番号５）、ＰＲＳＶＴＶＰ（配列番号６）、ＮＳＶＳＳＸＳ／Ａ（配列番号７））；Ｇｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：９６４〜９７５（２００１）により記載されている腫瘍標的化ペプチド（例えば、ＮＧＲ、ＮＧＲＡＨＡ（配列番号８））；Ｗｏｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：６８３〜６９３（２００６）により記載されている肺または脳標的化配列（ＱＰＥＨＳＳＴ（配列番号９）、ＶＮＴＡＮＳＴ（配列番号１０）、ＨＧＰＭＱＫＳ（配列番号１１）、ＰＨＫＰＰＬＡ（配列番号１２）、ＩＫＮＮＥＭＷ（配列番号１３）、ＲＮＬＤＴＰＭ（配列番号１４）、ＶＤＳＨＲＱＳ（配列番号１５）、ＹＤＳＫＴＫＴ（配列番号１６）、ＳＱＬＰＨＱＫ（配列番号１７）、ＳＴＭＱＱＮＴ（配列番号１８）、ＴＥＲＹＭＴＱ（配列番号１９）、ＱＰＥＨＳＳＴ（配列番号２０）、ＤＡＳＬＳＴＳ（配列番号２１）、ＤＬＰＮＫＫＴ（配列番号２２）、ＤＬＴＡＡＲＬ（配列番号２３）、ＥＰＨＱＦＮＹ（配列番号２４）、ＥＰＱＳＮＨＴ（配列番号２５）、ＭＳＳＷＰＳＱ（配列番号２６）、ＮＰＫＨＮＡＴ（配列番号２７）、ＰＤＧＭＲＴＴ（配列番号２８）、ＰＮＮＮＫＴＴ（配列番号２９）、ＱＳＴＴＨＤＳ（配列番号３０）、ＴＧＳＫＱＫＱ（配列番号３１）、ＳＬＫＨＱＡＬ（配列番号３２）およびＳＰＩＤＧＥＱ（配列番号３３））；Ｈａｊｉｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＴＣＭ １６：８０〜８８（２００６）により記載されている血管標的化配列（ＷＩＦＰＷＩＱＬ（配列番号３４）、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号３５）、ＣＮＧＲＣ（配列番号３６）、ＣＰＲＥＣＥＳ（配列番号３７）、ＧＳＬ、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（配列番号３８）、ＣＧＲＲＡＧＧＳＣ（配列番号３９）、ＣＫＧＧＲＡＫＤＣ（配列番号４０）およびＣＶＰＥＬＧＨＥＣ（配列番号４１））；Ｋｏｉｖｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：８８３〜８８８（１９９９）により記載されている標的化ペプチド（ＣＲＲＥＴＡＷＡＫ（配列番号４２）、ＫＧＤ、ＶＳＷＦＳＨＲＹＳＰＦＡＶＳ（配列番号４３）、ＧＹＲＤＧＹＡＧＰＩＬＹＮ（配列番号４４）、ＸＸＸＹ＊ＸＸＸ（配列番号４５）［この場合、Ｙ＊はホスホ−Ｔｙｒである］、Ｙ＊Ｅ／ＭＮＷ（配列番号４６）、ＲＰＬＰＰＬＰ（配列番号４７）、ＡＰＰＬＰＰＲ（配列番号４８）、ＤＶＦＹＰＹＰＹＡＳＧＳ（配列番号４９）、ＭＹＷＹＰＹ（配列番号５０）、ＤＩＴＷＤＱＬＷＤＬＭＫ（配列番号５１）、ＣＷＤＤＧ／ＬＷＬＣ（配列番号５２）、ＥＷＣＥＹＬＧＧＹＬＲＣＹＡ（配列番号５３）、ＹＸＣＸＸＧＰＸＴＷＸＣＸＰ（配列番号５４）、ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ（配列番号５５）、ＬＷＸＸＹ／Ｗ／Ｆ／Ｈ（配列番号５６）、ＸＦＸＸＹＬＷ（配列番号５７）、ＳＳＩＩＳＨＦＲＷＧＬＣＤ（配列番号５８）、ＭＳＲＰＡＣＰＰＮＤＫＹＥ（配列番号５９）、ＣＬＲＳＧＲＧＣ（配列番号６０）、ＣＨＷＭＦＳＰＷＣ（配列番号６１）、ＷＸＸＦ（配列番号６２）、ＣＳＳＲＬＤＡＣ（配列番号６３）、ＣＬＰＶＡＳＣ（配列番号６４）、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号６５）、ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号６６）、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号６７）、ＹＳＧＫＷＧＷ（配列番号６８）、ＧＬＳＧＧＲＳ（配列番号６９）、ＬＭＬＰＲＡＤ（配列番号７０）、ＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号７１）、ＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号７２）、ＣＮＧＲＣ（配列番号７３）およびＧＳＬ）；ならびにＮｅｗｔｏｎ＆Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｐｈａｇｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ １４５〜１６３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（２００８）により記載されている腫瘍標的化ペプチド（ＭＡＲＳＧＬ（配列番号７４）、ＭＡＲＡＫＥ（配列番号７５）、ＭＳＲＴＭＳ（配列番号７６）、ＫＣＣＹＳＬ（配列番号７７）、ＷＲＲ、ＷＫＲ、ＷＶＲ、ＷＶＫ、ＷＩＫ、ＷＴＲ、ＷＶＬ、ＷＬＬ、ＷＲＴ、ＷＲＧ、ＷＶＳ、ＷＶＡ、ＭＹＷＧＤＳＨＷＬＱＹＷＹＥ（配列番号７８）、ＭＱＬＰＬＡＴ（配列番号７９）、ＥＷＬＳ（配列番号８０）、ＳＮＥＷ（配列番号８１）、ＴＮＹＬ（配列番号８２）、ＷＩＦＰＷＩＱＬ（配列番号８３）、ＷＤＬＡＷＭＦＲＬＰＶＧ（配列番号８４）、ＣＴＶＡＬＰＧＧＹＶＲＶＣ（配列番号８５）、ＣＶＰＥＬＧＨＥＣ（配列番号４１）、ＣＧＲＲＡＧＧＳＣ（配列番号３９）、ＣＶＡＹＣＩＥＨＨＣＷＴＣ（配列番号８６）、ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ（配列番号８７）およびＣＶＦＴＳＮＹＡＦＣ（配列番号８８）、ＶＨＳＰＮＫＫ（配列番号８９）、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号３５）、ＣＲＧＤＧＷＣ（配列番号９０）、ＸＲＧＣＤＸ（配列番号９１）、ＰＸＸＳ／Ｔ（配列番号９２）、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（配列番号３８）、ＳＧＫＧＰＲＱＩＴＡＬ（配列番号９３）、Ａ９Ａ／Ｑ）（Ｎ／Ａ）（Ｌ／Ｙ）（Ｔ／Ｖ／Ｍ／Ｒ）（Ｒ／Ｋ）（配列番号９４）、ＶＹＭＳＰＦ（配列番号９５）、ＭＱＬＰＬＡＴ（配列番号７９）、ＡＴＷＬＰＰＲ（配列番号９６）、ＨＴＭＹＹＨＨＹＱＨＨＬ（配列番号９７）、ＳＥＶＧＣＲＡＧＰＬＱＷＬＣＥＫＹＦＧ（配列番号９８）、ＣＧＬＬＰＶＧＲＰＤＲＮＶＷＲＷＬＣ（配列番号９９）、ＣＫＧＱＣＤＲＦＫＧＬＰＷＥＣ（配列番号１００）、ＳＧＲＳＡ（配列番号１０１）、ＷＧＦＰ（配列番号１０２）、ＬＷＸＸＡｒ［Ａｒ＝Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｈ］（配列番号１０３）、ＸＦＸＸＹＬＷ（配列番号５７）、ＡＥＰＭＰＨＳＬＮＦＳＱＹＬＷＹＴ（配列番号１０４）、ＷＡＹ（Ｗ／Ｆ）ＳＰ（配列番号１０５）、ＩＥＬＬＱＡＲ（配列番号１０６）、ＤＩＴＷＤＱＬＷＤＬＭＫ（配列番号５１）、ＡＹＴＫＣＳＲＱＷＲＴＣＭＴＴＨ（配列番号１０７）、ＰＱＮＳＫＩＰＧＰＴＦＬＤＰＨ（配列番号１０８）、ＳＭＥＰＡＬＰＤＷＷＷＫＭＦＫ（配列番号１０９）、ＡＮＴＰＣＧＰＹＴＨＤＣＰＶＫＲ（配列番号１１０）、ＴＡＣＨＱＨＶＲＭＶＲＰ（配列番号１１１）、ＶＰＷＭＥＰＡＹＱＲＥＬ（配列番号１１２）、ＤＰＲＡＴＰＧＳ（配列番号１１３）、ＦＲＰＮＲＡＱＤＹＮＴＮ（配列番号１１４）、ＣＴＫＮＳＹＬＭＣ（配列番号１１５）、Ｃ（Ｒ／Ｑ）Ｌ／ＲＴ（Ｇ／Ｎ）ＸＸＧ（Ａ／Ｖ）ＧＣ（配列番号１１６）、ＣＰＩＥＤＲＰＭＣ（配列番号１１７）、ＨＥＷＳＹＬＡＰＹＰＷＦ（配列番号１１８）、ＭＣＰＫＨＰＬＧＣ（配列番号１１９）、ＲＭＷＰＳＳＴＶＮＬＳＡＧＲＲ（配列番号１２０）、ＳＡＫＴＡＶＳＱＲＶＷＬＰＳＨＲＧＧＥＰ（配列番号１２１）、ＫＳＲＥＨＶＮＮＳＡＣＰＳＫＲＩＴＡＡＬ（配列番号１２２）、ＥＧＦＲ（配列番号１２３）、ＲＶＳ、ＡＧＳ、ＡＧＬＧＶＲ（配列番号１２４）、ＧＧＲ、ＧＧＬ、ＧＳＶ、ＧＶＳ、ＧＴＲＱＧＨＴＭＲＬＧＶＳＤＧ（配列番号１２５）、ＩＡＧＬＡＴＰＧＷＳＨＷＬＡＬ（配列番号１２６）、ＳＭＳＩＡＲＬ（配列番号１２７）、ＨＴＦＥＰＧＶ（配列番号１２８）、ＮＴＳＬＫＲＩＳＮＫＲＩＲＲＫ（配列番号１２９）、ＬＲＩＫＲＫＲＲＫＲＫＫＴＲＫ（配列番号１３０）、ＧＧＧ、ＧＦＳ、ＬＷＳ、ＥＧＧ、ＬＬＶ、ＬＳＰ、ＬＢＳ、ＡＧＧ、ＧＲＲ、ＧＧＨおよびＧＴＶ）が挙げられる。
またさらなる代替としては、標的化配列は、細胞への侵入を標的とする別の分子との化学的結合に使用可能な（例えば、それらのＲ基により化学的に結合可能なアルギニンおよび／またはリジン残基を含み得る）ペプチドであり得る。
別の選択肢としては、本発明の、ＡＡＶカプシドタンパク質またはＡＡＶ粒子のウイルスカプシドは、ＷＯ第２００６／０６６０６６号に記載されている変異を含み得る。例えば、カプシドタンパク質は、天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸位置２６３、７０５、７０８および／もしくは７１６番目にアミノ酸の選択的置換、または別のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質における対応する変異（複数可）を含み得る。加えて、またはあるいは、代表的実施形態では、カプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸位置２６４番目の直後にアミノ酸の選択的挿入、または他のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質における対応する変異を含む。「アミノ酸位置Ｘの直後」により、挿入が指示するアミノ酸位置の直後に存在すことを意図する（例えば、「アミノ酸位置２６４番目の後」は、２６５番目における点挿入、または例えば、２６５〜２６８番目等のさらに大型の挿入を示す）。本発明の前述の実施形態を使用して、本明細書に記載のように細胞または対象に異種核酸を送達することができる。例えば、修飾ベクターを使用して、リソソーム貯蔵障害、例えば、ムコ多糖蓄積障害（例えば、スライ症候群［βグルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、ハーラー・シャイエ症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリポ症候群Ａ［ヘパランスルファミダーゼ（ｓｕｌｆａｍｉｄａｓｅ）］、Ｂ［Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチルＣｏＡ：α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ］、Ｂ［βガラクトシダーゼ］、マロトー・ラミー症候群［Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ］等）、ファブリー病（αガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、または糖原貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸αグルコシダーゼ）を本明細書に記載のように治療することができる。
当業者は、一部のＡＡＶカプシドタンパク質において、対応するアミノ酸位置が、ウイルスに部分的もしくは完全に存在するか、あるいは、完全に存在しないかどうかに応じて、対応する修飾が、挿入および／または置換であることを理解する。同様に、ＡＡＶ２以外のＡＡＶを修飾する場合、特定のアミノ酸位置（複数可）は、ＡＡＶ２における位置と異なり得る（例えば、表３を参照）。本明細書において他に考察するように、対応するアミノ酸位置（複数可）は、周知の技術を使用して、当業者に容易に明らかとなる。
代表的実施形態では、カプシドタンパク質（複数可）における挿入および／または置換および／または欠失により、（ｉ）その領域において親水性ループ構造を維持するアミノ酸、（ｉｉ）ループ構造の立体配置を変化させるアミノ酸、（ｉｉｉ）荷電アミノ酸、および／または（ｉｖ）リン酸化もしくは硫酸化、さもなければ、翻訳後修飾（例えば、糖鎖付加）により電荷を得ることが可能なアミノ酸の、挿入、置換および／または再配置がＡＡＶ２カプシドタンパク質における２６４番目の後に、あるいは対応する変異が別のＡＡＶのカプシドタンパク質において生じる。挿入／置換に適するアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、バリン、ロイシン、リジン、アルギニン、スレオニン、セリン、チロシン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、フェニルアラニン、チロシンまたはグルタミンが挙げられる。特定の実施形態では、スレオニンは、カプシドサブユニット内に挿入または置換により導入する。他の多数のＡＡＶにおける対応する位置の非限定的な例は、表３（位置２）に示す。特定の実施形態では、アミノ酸の挿入または置換は、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはフェニルアラニンである（スレオニン、グルタミン酸またはフェニルアラニンをそれぞれこの位置に有するＡＡＶを除いて）。
本発明のこの態様によれば、一部の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａまたはＡＡＶ３ｂカプシドタンパク質（複数可）のアミノ酸位置２６４番目の後に、あるいは非ＡＡＶ２、非ＡＡＶ３ａもしくは非ＡＡＶ３ｂ配列をそれぞれ含むように修飾されており、および／または１つもしくは複数のアミノ酸の欠失により修飾されている（すなわち、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａまたはＡＡＶ３ｂに由来する）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａまたはＡＡＶ３ｂカプシドタンパク質の対応する位置に、アミノ酸の挿入を含むカプシドタンパク質を含み得る。ＡＡＶ２（またはＡＡＶ３ａもしくはＡＡＶ３ｂ）カプシドサブユニット（複数可）における２６４番目の位置に対応するアミノ酸は、ＡＡＶ２（またはＡＡＶ３ａもしくはＡＡＶ３ｂ）に由来している出発ウイルスにおいて容易に同定可能であり、次いで、本発明に従ってさらに修飾することができる。挿入に適するアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、バリン、ロイシン、リジン、アルギニン、スレオニン、セリン、チロシン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、フェニルアラニン、チロシンまたはグルタミン酸が挙げられる。
他の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子のＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質（複数可）のアミノ酸位置２６５番目、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸位置２６６番目、またはＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸位置２６５番目に、あるいは非ＡＡＶ１、非ＡＡＶ８もしくは非ＡＡＶ９配列をそれぞれ含むように修飾されており、および／または１つもしくは複数のアミノ酸の欠失により修飾されている（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に由来する）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシドタンパク質の対応する位置に、アミノ酸の置換を含み得る。ＡＡＶ１およびＡＡＶ９カプシドサブユニット（複数可）における２６５番目の位置、ならびにＡＡＶ８カプシドサブユニット（複数可）における２６６番目の位置に対応するアミノ酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に由来している出発ウイルスにおいて容易に同定可能であり、次いで、本発明に従ってさらに修飾することができる。挿入に適するアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、バリン、ロイシン、リジン、アルギニン、スレオニン、セリン、チロシン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、フェニルアラニン、チロシンまたはグルタミンが挙げられる。
本発明のＡＡＶ粒子の代表的実施形態では、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸位置２６４番目の後（すなわち、挿入）または別のカプシドタンパク質の対応する位置に、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはフェニルアラニンを含み得る。
本発明のＡＡＶ粒子の他の代表的実施形態では、修飾カプシドタンパク質またはウイルスカプシドは、ＷＯ第２００７／０８９６３２号に記載されているように、１つまたは複数の変異をさらに含み得る（例えば、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸位置５３１番目、または別のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質の対応する位置におけるＥ→Ｋ変異）。
さらなる実施形態では、修飾カプシドタンパク質またはカプシドは、ＷＯ第２００９／１０８２７４号に記載されている変異を含み得る。
別の可能性としては、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３８１：１９４〜２０２（２００８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：７８２７〜３２（２００８））により記載されている変異を含み得る。例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸位置７３０番目においてＹ→Ｆ変異を含み得る。
上記の修飾は、相互に、および／または既知もしくは後に発見される他の任意の修飾と組み合わせて、本発明のカプシドタンパク質またはカプシドに組み込み得る。
代表的実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子またはウイルスベクターは、（ａ）修飾カプシドタンパク質を含む修飾ウイルスカプシド（例えば、修飾ＡＡＶカプシド）であり得るカプシド、および（ｂ）末端反復配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ）を含む、核酸であって、末端反復配列を含む核酸が、ウイルスカプシドによりカプシド形成される、核酸を含み得るか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。核酸は、任意選択で、２つの末端反復（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含み得る。
代表的実施形態では、本発明のウイルスベクターは、目的のポリペプチドおよび／または機能性ＲＮＡをコードする異種核酸を含む、組換えウイルスベクターである。組換えウイルスベクターは、より詳細に以下に説明する。
一部の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、（ｉ）本発明の修飾カプシドタンパク質を有しないウイルスベクターによる形質導入レベルと比較して、肝臓への形質導入が低減しており、（ｉｉ）本発明の修飾カプシドタンパク質を有しないウイルスベクターにより観察されるレベルと比較して、動物対象におけるウイルスベクターによる全身的形質導入の増強を呈し、（ｉｉｉ）本発明の修飾カプシドタンパク質を有しないウイルスベクターによる移動レベルと比較して、内皮細胞を通過する移動の増強を実証し、および／または（ｉｖ）筋組織（例えば、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋）への形質導入における選択的増強を呈し、および／または（ｖ）本発明の修飾カプシドタンパク質を有しないウイルスベクターによる形質導入レベルと比較して、脳組織（例えば、ニューロン）への形質導入が向上する。さらに、本発明の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、標的組織への効率的形質導入または形質導入の増強を実証する。
ある特定の実施形態において、本発明の、カプシドタンパク質、ウイルスカプシド、ウイルスベクターおよびＡＡＶ粒子は、それらの天然状態において存在または見出されるカプシドタンパク質、カプシド、ウイルスベクターおよびＡＡＶ粒子を除外することが、当業者により理解される。
本発明の別の態様は、ＡＡＶカプシドの３回軸スパイクカプシドドメインに隣接する位置におけるポリペプチドの挿入である、アミノ酸配列の修飾を含むＡＡＶカプシドタンパク質に関する。詳細には、挿入部位は、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８および５８９番目（ＶＰ１位置）に対応する。このようなカプシドタンパク質は、本明細書において、「修飾ＡＡＶカプシドタンパク質」と呼ぶ。挿入されるポリペプチドは、本明細書に記載のように、ＰＢ５−３、ＰＢ５−５、ＰＢ５−１４、Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、ＧＳＨ、ＨＩＶ−１ ＴＡＴ（４８〜６０）、ＡｐｏＥ（１５９〜１６７）２、レプチン３０（６１〜９０）、およびＴＨＲから選択される。実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸のペプチドリンカーは、挿入されるポリペプチド配列のＮ末端、Ｃ末端、または両末端に含まれる。これにより、ＡＡＶカプシドへのポリペプチド挿入の結合部において可動性がもたらされ、ベクターの形質導入活性の増強においてこのようなポリペプチドが機能するのに必要な任意の構造の保存を確実とする。リンカーは、３次構造に影響することなくスペーサーとして作用する、任意のアミノ酸（複数可）、例えば、グリシン、セリンまたはグリシンとセリンとの組合せ（例えば、ＧＧＧ、ＧＧＳ、ＧＳＳ、ＧＧ、ＧＳ、ＳＳ等）であり得る。
修飾するＡＡＶカプシドは、任意のＡＡＶ血清型または血清型の組合せであり得る（例えば、表１に列挙するもの）。ＡＡＶカプシドはさらに、本明細書に記載のキメラカプシドタンパク質であり得る。
上記の挿入に加えて、修飾カプシドはまた、本明細書に記載するような、さらなる修飾を含み得る（例えば、追加の挿入、欠失またはアミノ酸置換を含む）。実施形態では、修飾カプシドタンパク質は、挿入されるポリペプチドの適切な形質導入機能に必要とされるもの以外の追加の挿入を含まない。実施形態では、修飾カプシドタンパク質は、欠失を含まない。実施形態では、修飾カプシドタンパク質は、アミノ酸の置換を含まない。
本発明の別の態様では、修飾カプシドタンパク質は、例えば、Ｍｉｃｈｅｌｆｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（ＰＬｏＳ Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｉｓｓｕｅ ８，ｅ２３１０１（２０１１））にそれぞれ記載されているように、ＡＡＶ９のアミノ酸５８９〜５９０番目または別のＡＡＶ血清型の対応するアミノ酸位置に、本明細書に記載のリンカー（複数可）を伴う、または伴わない、挿入されたポリペプチドを含む。本発明の別の態様では、修飾カプシドタンパク質は、例えば、Ｍｉｃｈｅｌｆｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（ＰＬｏＳ Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｉｓｓｕｅ ８，ｅ２３１０１（２０１１））にそれぞれ記載されているように、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０〜５９１番目または別のＡＡＶ血清型の対応するアミノ酸位置に、本明細書に記載のリンカー（複数可）を伴う、または伴わない、挿入されたポリペプチドを含む。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸分子に関する。核酸分子は、ベクター内に含み得る（例えば、操作または生成を容易とするために）。多様なベクターは、当技術分野において既知であり、本明細書において提供する。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子、例えば、組換えＡＡＶ粒子に関する。ＡＡＶ粒子は、任意のＡＡＶ血清型またはＡＡＶ血清型の組合せであり得る。このような血清型の例は、表１に提供する。実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ９．４５血清型である。また、バリアントおよびミュータントならびにこれらの組合せを包含する。
本発明の実施形態では、脳および／または中枢神経系の細胞または組織へのＡＡＶ粒子による形質導入は、適切な対照（例えば、カプシドインサートを欠くこと以外は同一のＡＡＶ粒子）による形質導入レベルよりも、少なくとも約５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍またはこれよりも高い。
本発明の実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子は、ポリペプチドインサートにより付与される場合、対象（例えば、ヒト）の血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する形質導入活性が増強されている。この活性は、適切な対照、例えば、ポリペプチドインサートを欠くこと以外は同一のＡＡＶ粒子の活性と比較して増強される。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、対象（例えば、ヒト）の脳および／または他の中枢神経系細胞の細胞への形質導入活性が、適切な対照と比較して、増強されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、対象（例えば、ヒト対象）の皮質、線条体、視床、小脳および／または脊髄への形質導入活性が、適切な対照と比較して、増強されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、対象の、アストロサイト、ＣＣ１＋オリゴデンドロサイト；脳全体のＮｅｕＮ＋細胞、中脳チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）＋ドーパミン作動性ニューロン、カルビンジン＋小脳プルキンエ細胞、介在ニューロン集団および／またはＣＤ３１＋内皮細胞を含む神経細胞サブタイプへの形質導入が、適切な対照と比較して、増強されている。
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、異種核酸分子（例えば、本明細書に記載するような）を含む。一部の実施形態では、異種核酸分子は、治療ポリペプチドをコードする。治療ポリペプチドは、当技術分野において既知であり、多くの例となる治療ポリペプチドを本明細書において記載する。
本発明の別の態様は、本明細書に記載する修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶ粒子、例えば、組換えＡＡＶ粒子を含む医薬製剤に関する。ＡＡＶ粒子は、薬学的に許容される担体中に含む。
本発明の別の態様は、脳および／または中枢神経系の細胞に核酸分子を投与または送達する方法に関する。方法は、核酸分子（例えば、異種核酸分子）を含む、本明細書に記載する修飾ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ粒子と細胞を接触させるステップを含む。あるいは、またはさらに、方法は、修飾ＡＡＶカプシドおよび異種核酸分子を有するＡＡＶ粒子を含む医薬製剤と細胞を接触させるステップを含む。投与は、対象、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに対して（例えば、全身投与により）であり得る。
ウイルスベクターを生成する方法
本発明では、本発明のＡＡＶ粒子を生成する方法をさらに提供する。したがって、本発明では、ＡＡＶ粒子を生成する方法であって、ａ）ＡＡＶ粒子の会合に必要とされる、すべての機能および遺伝子を、組み合わせてもたらす１つまたは複数のプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトするステップ、ｂ）パッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株に１つまたは複数の核酸構築物を導入して、ＡＡＶ粒子の会合に必要とされる、すべての機能および遺伝子を、組み合わせてもたらすステップ、ｃ）ＡＡＶ粒子の会合に必要とされる、すべての機能および遺伝子を、組合せてもたらす、１つまたは複数の組換えバキュロウイルスベクターを宿主細胞に導入するステップ、ならびに／あるいはｄ）ＡＡＶ粒子の会合に必要とされる、すべての機能および遺伝子を、組合せてもたらす、１つまたは複数の組換えヘルペスウイルスベクターを宿主細胞に導入するステップを含む方法を提供する。本発明のウイルスベクターを生成する様々な方法の非限定的な例は、Ｃｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｇｒｅｉｇｅｒ（「Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ」Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．３：１６００２（２０１６））およびＧｒｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ＨＥＫ２９３ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｈａｒｖｅｓｔ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＧＭＰ ＦＩＸ ａｎｄ ＦＬＴ１ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖｅｃｔｏｒ」Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２４（２）：２８７〜２９７（２０１６））に記載されており、この全内容は、参照により本明細書に組み込む。
一代表的実施形態では、本発明において、ＡＡＶ粒子を生成する方法であって、（ａ）少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ配列）を含む鋳型核酸、ならびに（ｂ）鋳型核酸の複製およびＡＡＶカプシドへのカプシド形成に十分なＡＡＶ配列（例えば、本発明のＡＡＶカプシドをコードする、ＡＡＶ ｒｅｐ配列およびＡＡＶ ｃａｐ配列）を細胞に提供するステップを含む方法を提供する。任意選択で、鋳型核酸は、少なくとも１つの異種核酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、鋳型核酸は、２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、これらは、異種核酸配列に対して（存在する場合）５’および３’に位置するが、これらに直接連続する必要はない。
鋳型核酸およびＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた鋳型核酸を含むウイルスベクターが細胞内で生成されるような条件下で提供する。方法は、細胞からウイルスベクターを採取するステップをさらに含み得る。ウイルスベクターは、培地から、および／または細胞を溶解することにより採取することができる。
細胞は、ＡＡＶウイルス複製に対して許容性の細胞であり得る。当技術分野において既知の適する任意の細胞を利用し得る。特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。別の選択肢としては、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失した機能をもたらす、トランス相補性パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス相補性細胞であり得る。
ＡＡＶ複製およびカプシド配列は、当技術分野において既知の任意の方法により提供し得る。現在のプロトコールでは、典型的に、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を単一プラスミド上に発現させる。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列は、そのようにすることが好都合であるとしても、ともに提供する必要はない。ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクターにより提供し得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドのアデノウイルスまたはヘルペスウイルスのベクターにより提供し得る（例えば、欠失させたアデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域に挿入する）。また、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ベクターを利用して、ＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現させ得る。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターが、エピソーム性であるが、連続的細胞分裂を通して多くのコピー数を維持することである（すなわち、「ＥＢＶに基づく核エピソーム」と名付けられた、染色体外エレメントとして細胞に安定に組み込まれる、Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７を参照）。
さらなる代替としては、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞に安定に組み込まれ得る。
典型的には、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、このような配列のレスキューおよび／またはパッケージングを防ぐためにＴＲと近接させない。
鋳型核酸は、当技術分野において既知の任意の方法を使用して、細胞に提供し得る。例えば、鋳型は、非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルスのベクターにより供給することができる。特定の実施形態では、鋳型核酸は、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスのベクターにより供給する（例えば、欠失させたアデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域に挿入する）。別の例示としては、Ｐａｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５０２５が、ＡＡＶ ＴＲと近接するレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルスベクターについて記載している。また、ＥＢＶベクターを利用して、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上記のように、鋳型を送達し得る。
別の代表的実施形態では、鋳型核酸を、ｒＡＡＶウイルスを複製することにより提供する。さらに他の実施形態では、鋳型核酸を含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体に安定に組み込む。
ウイルス力価を増強するために、ＡＡＶの増殖性感染を促進する、ヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を細胞に提供し得る。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野において既知である。典型的には、このような配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターにより提供する。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスまたはウイルスベクター、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５、ならびに米国特許第６，０４０，１８３号および第６，０９３，５７０号により記載されているような、効率的ＡＡＶ生成を促進するヘルパー遺伝子のすべてを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドにより提供することができる。
さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体に埋め込むか、または安定な染色体外エレメントとして維持したヘルパー配列で細胞をパッケージングすることにより提供し得る。一般には、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオンにパッケージングすることができず、例えば、ＴＲと近接しない。
当業者は、ＡＡＶ複製ならびにカプシド配列およびヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を単一のヘルパー構築物上に提供することが有利であり得ることを理解する。このヘルパー構築物は、非ウイルスまたはウイルス構築物であり得る。非限定的な一例示としては、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含む、ハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであり得る。
一実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより供給する。このベクターは、鋳型核酸をさらに含み得る。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列および／または鋳型ｒＡＡＶは、アデノウイルスの欠失した領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）に挿入し得る。
さらなる実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより供給する。この実施形態によれば、鋳型ｒＡＡＶは、鋳型プラスミドとして提供し得る。
別の例示的実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより提供し、鋳型ｒＡＡＶは、プロウイルスとして細胞に組み込む。あるいは、鋳型ｒＡＡＶは、染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶに基づく核エピソームとして）細胞内に維持される、ＥＢＶベクターにより提供する。
さらに例となる実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーにより提供する。鋳型ｒＡＡＶは、別々に複製するウイルスベクターとして提供することができる。例えば、鋳型ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ粒子または第２の組換えアデノウイルス粒子により提供することができる。
前述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的に、アデノウイルス複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス５’および３’シス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列、および存在する場合、鋳型ｒＡＡＶは、アデノウイルス骨格に埋め込み、５’および３’シス配列と近接させて、このような配列をアデノウイルスカプシドにパッケージングし得る。上記のように、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、一般に、ＴＲと近接させず、このような配列をＡＡＶビリオンにパッケージングしない。
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４〜１２）では、アデノウイルスとＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子との両方を含むキメラヘルパーについて記載している。
また、ヘルペスウイルスは、ＡＡＶパッケージング方法において、ヘルパーウイルスとして使用する。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（複数可）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、スケーラブルなＡＡＶベクター生成スキームを有利に容易とし得る。ＡＡＶ−２ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）ベクターは、記載されている（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９８６およびＷＯ第００／１７３７７号）。
さらなる代替としては、本発明のウイルスベクターを、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５〜４３により記載のように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子および鋳型ｒＡＡＶを送達するバキュロウイルスベクターを使用して、昆虫細胞において生成し得る。
ヘルパーウイルスが混入していないＡＡＶベクター株は、当技術分野において既知の任意の方法により入手し得る。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に識別し得る。ＡＡＶはまた、ヘパリン基質に対する親和性に基づいて、ヘルパーウイルスから分別し得る（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９７３）。欠失した複製欠損ヘルパーウイルスを使用して、混入した任意のヘルパーウイルスを複製不可能とすることができる。ＡＡＶウイルスのパッケージングを媒介するために、アデノウイルスの初期遺伝子発現のみが必要とされるため、さらなる代替として、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーを利用し得る。後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスミュータントは、当技術分野において既知である（例えば、ｔｓ １００Ｋおよびｔｓ １４９アデノウイルスミュータント）。
組換えウイルスベクター
本発明では、核酸分子を細胞に投与する方法であって、本発明のウイルスベクター、ＡＡＶ粒子、組成物および／または医薬製剤と細胞を接触させるステップを含む方法を提供する。
本発明は、核酸を対象に送達する方法であって、本発明のウイルスベクター、ＡＡＶ粒子、組成物および／または医薬製剤を対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
本発明の対象は、任意の動物であってもよく、一部の実施形態では、対象は、哺乳動物であり、一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は、免疫治療および／または遺伝子治療のプロトコールにより治療可能な障害を有するか、またはこのリスクを有する。このような障害の非限定的な例としては、デュシェンヌ型またはベッカー型筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィー、血友病Ａ、血友病Ｂ、多発性硬化症、真性糖尿病、ゴーシェ病、ファブリー病、ポンペ病、がん、関節炎、筋消耗；うっ血性心不全または抹消動脈疾患を含む心疾患；内膜過形成；てんかん、ハンチントン病、パーキンソン病またはアルツハイマー病を含む神経障害、自己免疫疾患、嚢胞性線維症、サラセミア、ハーラー症候群、スライ症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群、クラッベ病、フェニルケトン尿症、バッテン病、脊髄脳失調症、ＬＤＬ受容体欠損、高アンモニア血症、貧血、関節炎；黄斑変性症を含む網膜変性障害、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害、および腫瘍形成がんを含むがんが挙げられる。
本明細書に記載する方法では、本発明のウイルスベクター、ＡＡＶ粒子および／または組成物あるいは医薬製剤は、全身経路を介して（例えば、静脈内、動脈内、腹腔内等に）本発明の対象に投与／送達し得る。一部の実施形態では、ウイルスベクターおよび／または組成物は、脳室内、嚢内、実質内、頭蓋内および／またはくも膜下腔内の経路を介して対象に投与し得る。特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターおよび／または医薬製剤は、静脈内に投与する。
本発明のウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの細胞への核酸分子の送達に有用である。特には、ウイルスベクターは、哺乳動物細胞を含む動物細胞への核酸分子の送達または導入に、有利に利用することができる。
目的の任意の異種核酸配列（複数可）は、本発明のウイルスベクターにより送達し得る。目的の核酸分子は、治療ポリペプチド（例えば、医療用または獣医学用）および／または免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）を含む、ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
治療ポリペプチドは、嚢胞性線維症膜貫通制御タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ミニおよびマイクロジストロフィンを含む、例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０；米国特許出願公開第２００３／０１７１３１号；国際公開ＷＯ第２００８／０８８８９５号、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３７１４〜１３７１９（２０００）；およびＧｒｅｇｏｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：６５７〜６４（２００８）を参照）、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ−１、抗炎症ポリペプチド、例えば、ＩカッパＢドミナントミュータント、サルコスパン（ｓａｒｃｏｓｐａｎ）、ユートロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３４９）、ミニユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子等）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、βグロブリン、αグロブリン、スペクトリン、α１−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、βグルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、αインターフェロン、βインターフェロン、インターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等）、ペプチド増殖因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、神経栄養因子３および４、脳由来神経栄養因子、骨形態形成タンパク質［ＲＡＮＫＬおよびＶＥＧＦを含む］、グリア細胞由来増殖因子、形質転換増殖因子αおよびβ等）、リソソーム酸αグルコシダーゼ、αガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死増殖因子α可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、カルシウム処理を調節する分子（例えば、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＰＰ１阻害物質１およびこれらの断片［例えば、ＷＯ第２００６／０２９３１９号およびＷＯ第２００７／１００４６５号］）、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２型のノックダウンを引き起こす分子、例えば、切断型構成的活性ｂＡＲＫｃｔ、抗炎症因子、例えば、ＩＲＡＰ、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、モノクローナル抗体（単鎖モノクローナル抗体を含む；例となるＭａｂはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｍａｂ）、神経ペプチドおよびこの断片（例えば、ガラニン、神経ペプチドＹ（米国特許第号７，０７１，１７２を参照）、血管新生阻害物質、例えば、バソヒビンおよび他のＶＥＧＦ阻害物質（例えば、バソヒビン２［ＷＯ ＪＰ２００６−０７３０５２号公報を参照］））を含むが、これらに限定されない。他の例示的な異種核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、および腫瘍壊死因子）、がん治療において使用される薬剤耐性を付与するタンパク質、腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳリガンド、およびそれを必要とする対象において治療作用を有する他の任意のポリペプチドをコードする。また、ＡＡＶベクターを使用して、モノクローナル抗体および抗体断片、例えば、ミオスタチンに対する抗体または抗体断片を送達し得る（例えば、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：５８４〜５９０（２００５）を参照）。
ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をコードする配列を含む。レポーターポリペプチドは、当技術分野において既知であり、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの遺伝子を含むが、これらに限定されない。
任意選択で、異種核酸分子は、分泌されるポリペプチド（例えば、その天然状態で分泌されるポリペプチドであるか、または例えば、当技術分野において既知の分泌シグナル配列との動作可能な結合により、分泌されるように改変されているポリペプチド）をコードする。
あるいは、本発明の特定の実施形態では、異種核酸分子は、アンチセンス核酸分子、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載されているもの）、スプライセオソームにより媒介されるトランススプライシングを引き起こすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む、遺伝子サイレンシングを媒介する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１参照）、および他の非翻訳ＲＮＡ、例えば、「ガイド」ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，８６９，２４８号）等をコードし得る。例となる非翻訳ＲＮＡとしては、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍の治療および／もしくは予防用、ならびに／または化学療法による障害の予防のための心臓への投与用）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー用）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍の治療および／または予防用）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管疾患の治療用、例えば、Ａｎｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１３２〜１４２（２００８）およびＬｉ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．２６：５１〜５５（２００５）を参照）；ホスホランバン阻害またはドミナントネガティブ分子、例えば、ホスホランバンＳ１６Ｅ（例えば、心血管疾患の治療用、例えば、Ｈｏｓｈｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８６４〜８７１（２００２）を参照）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、てんかん用）、ならびに病原体およびウイルスに対するＲＮＡｉ（例えば、Ｂおよび／またはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス等）が挙げられる。
さらに、選択的スプライシングを方向づける核酸配列を送達することができる。例えば、ジストロフィンエクソン５１の５’および／または３’スプライス部位に対して相補性のアンチセンス配列（または他の阻害配列）は、Ｕ１またはＵ７核内低分子（ｓｎ）ＲＮＡプロモーターと組み合わせて送達して、このエクソンのスキッピングを誘導することができる。例えば、アンチセンス／阻害配列（複数可）に対して５’に位置するＵ１またはＵ７ ｓｎＲＮＡプロモーターを含むＤＮＡ配列は、本発明の修飾カプシドによりパッケージングおよび送達することができる。
また、ウイルスベクターは、宿主細胞染色体上の座位との相同性を共有し、再結合する、異種核酸分子を含み得る。この方法を利用して、例えば、宿主細胞における遺伝子の欠損を修正することができる。
また、本発明では、例えば、ワクチン接種のための、免疫原性ポリペプチド、ペプチドおよび／またはエピトープを発現する、ウイルスベクターを提供する。核酸分子は、当技術分野において既知の目的の任意の免疫原をコードしてもよく、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶまたはＳＩＶ ｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、がん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原等由来の免疫原を含むが、これらに限定されない。
パルボウイルスのワクチンベクターとしての使用は、当技術分野において既知である（例えば、Ｍｉｙａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：８５０７；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，９１６，５６３号、Ｍａｚｚａｒａ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，９０５，０４０号、米国特許第５，８８２，６５２号、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，８６３，５４１号を参照）。抗原は、パルボウイルスカプシドに存在し得る。あるいは、免疫原または抗原は、組換えベクターゲノム内に導入した異種核酸分子から発現し得る。本明細書に記載し、および／または当技術分野において既知である、目的の任意の免疫原または抗原は、本発明のウイルスベクターにより提供することができる。
免疫原性ポリペプチドは、それらに限定されないが、免疫応答の誘発、ならびに／または微生物、細菌、原生動物、寄生虫、真菌および／またはウイルスの感染症および疾患を含む、感染症および／もしくは疾患からの対象の防御に適する、任意のポリペプチド、ペプチド、および／またはエピトープであり得る。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルソミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルス免疫原、例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）表面タンパク質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質、またはウマインフルエンザウイルス免疫原）またはレンチウイルス免疫原（例えば、ウマ感染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原、例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶまたはＳＩＶ基質／カプシドタンパク質、ならびにＨＩＶまたはＳＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物）であり得る。また、免疫原性ポリペプチドは、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルス免疫原、例えば、ラッサ熱ウイルスヌクレオカプシドタンパク質およびラッサ熱エンベロープ糖タンパク質）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアウイルス免疫原、例えば、ワクシニアＬ１またはＬ８遺伝子産物）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、エボラウイルス免疫原、またはマールブルグウイルス免疫原、例えば、ＮＰおよびＧＰ遺伝子産物）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦおよび／またはＳＦＳウイルス免疫原）、またはコロナウイルス免疫原（例えば、感染性ヒトコロナウイルス免疫原、例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質、またはブタ感染性胃腸炎ウイルス免疫原、あるいはトリ感染性気管支炎ウイルス免疫原）であり得る。免疫原性ポリペプチドは、さらに、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）、ムンプス免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素もしくは他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎等）免疫原、および／または免疫原として当技術分野において現在既知もしくは後に同定される他の任意のワクチン免疫原であり得る。
あるいは、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍またはがん細胞抗原であり得る。任意選択で、腫瘍またはがん抗原は、がん細胞の表面上に発現する。例となるがんおよび腫瘍細胞抗原は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１（１９９１））に記載されている。他の例示的ながんおよび腫瘍抗原としては、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、βカテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｔ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４）、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００ ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＣＥＡ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、Ｐ−１５、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９）；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）、ＣＡ １２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ））、ＴＡＧ ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９、ＮＳＥ、ＤＵ−ＰＡＮ−２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ−１、ＣＡ７２−４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ−ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３）；ムチン抗原（国際特許公開ＷＯ第９０／０５１４２号）；テロメラーゼ；核基質タンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；および／あるいは次のがん：メラノーマ、腺癌、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんおよび他の任意のがんまたは現在既知もしくは後に同定される悪性疾患（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ．（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１〜９１を参照）と関連することが現在既知または後に発見される抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
さらなる代替としては、異種核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞において望ましく生成される、任意のポリペプチド、ペプチドおよび／またはエピトープをコードし得る。例えば、ウイルスベクターを培養した細胞に導入し、発現した遺伝子産物をこれから単離し得る。
目的の異種核酸分子（複数可）が、適切な制御配列と動作可能に結合し得ることが、当業者により理解される。例えば、異種核酸分子は、発現制御エレメント、例えば、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、および／またはエンハンサー等と動作可能に結合し得る。
さらに、目的の異種核酸分子（複数可）の発現の制御は、例えば、スプライシング活性を特異的部位で選択的に遮断する、オリゴヌクレオチド、低分子および／または他の化合物の存在または非存在によって種々のイントロンの選択的スプライシングを制御することにより、転写後レベルで達成することができる（例えば、ＷＯ第２００６／１１９１３７号に記載されているように）。
当業者は、所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて、多様なプロモーター／エンハンサーエレメントを使用可能であることを理解する。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成性または誘導性であり得る。プロモーター／エンハンサーは、天然または外来であってもよく、天然または合成の配列であり得る。外来により、転写開始領域を導入する野生型宿主に転写開始領域が見出されないことを意図する。
特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療する対象に由来し得る。代表的実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列に由来し得る。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般に、目的の標的細胞（複数可）において機能するように選択される。さらに、特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳動物プロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成性または誘導性であり得る。
誘導性発現制御エレメントは、異種核酸配列（複数可）の発現に対する制御をもたらすことが望ましい適用において、典型的に有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または組織に好適なプロモーター／エンハンサーエレメントであってもよく、筋特異的または好適（心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または好適を含む）、神経組織特異的または好適（脳特異的または好適を含む）、眼特異的または好適（網膜特異的および角膜特異的を含む）、肝臓特異的または好適、骨髄特異的または好適、膵臓特異的または好適、脾臓特異的または好適、および肺特異的または好適プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例となる誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、Ｔｅｔ ｏｎ／ｏｆｆエレメント、ＲＵ４８６誘導プロモーター、エクジソン誘導プロモーター、ラパマイシン誘導プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
異種核酸配列（複数可）が標的細胞において、転写され、次いで翻訳される実施形態では、一般に、挿入したタンパク質コード配列の効率的翻訳のために、特定の開始シグナルを含む。このような外因性翻訳制御配列は、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含んでもよく、天然および合成の両方の多様な起源であり得る。
本発明によるウイルスベクターにより、分裂および非分裂細胞を含む広範な細胞に異種核酸分子を送達するための手段を提供する。ウイルスベクターを利用して、例えばポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで、またはｅｘ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子治療のために、目的の核酸分子を細胞に送達することができる。ウイルスベクターは、それを必要とする対象に核酸を送達して、例えば、免疫原性または治療ポリペプチドあるいは機能性ＲＮＡを発現させる方法において、さらに有用である。この方法では、ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡは、対象においてｉｎ ｖｉｖｏで生成することができる。対象がポリペプチドの欠損を有するため、対象は、ポリペプチドを必要とし得る。さらに、対象におけるポリペプチドまたは機能性ＲＮＡの生成により、いくらかの有益な作用を付与し得るため、方法を実行し得る。
また、ウイルスベクターを使用して、目的のポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを、（例えば、バイオリアクターとして対象を用いて、ポリペプチドを生成するか、または機能性ＲＮＡの対象に対する作用を、例えば、スクリーニング方法に関連して観察することにより）培養した細胞または対象において生成し得る。
一般には、本発明のウイルスベクターを利用して、ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡをコードする異種核酸分子を送達し、治療ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡの送達に有益な、任意の障害または疾患状態を治療および／または予防し得る。例示的な疾患状態としては、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通制御タンパク質）および他の肺疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（βグロブリン）、貧血（エリスロポエチン）および他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（βインターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞株由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（反復を除去するＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、てんかん（ガラニン、神経栄養因子）、および他の神経障害、がん（エンドスタチン、アンジオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳリガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；ＶＥＧＦまたは多剤耐性遺伝子産物であるｍｉｒ−２６ａに対するＲＮＡｉ［例えば、肝細胞癌用］を含むＲＮＡｉ）、真性糖尿病（インスリン）、デュシェンヌ型（ジストロフィン、ミニジストロフィン、インスリン様増殖因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］；ミオスタチン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗炎症ポリペプチド、例えば、ＩカッパＢドミナントミュータント、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィンに対するＲＮＡｉ；エクソンスキッピングを誘導するジストロフィン遺伝子におけるスプライス部位に対するアンチセンスまたはＲＮＡｉ［例えば、ＷＯ第２００３／０９５６４７号を参照］、エクソンスキッピングを誘導するＵ７ ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス［例えば、ＷＯ第２００６／０２１７２４号を参照］、およびミオスタチンまたはミオスタチンペプチドに対する抗体または抗体断片）およびベッカー型を含む筋ジストロフィー、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー症候群（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症（アデノシンデアミナーゼ）、糖原貯蔵障害（例えば、ファブリー病［αガラクトシダーゼ］およびポンペ病［リソソーム酸αグルコシダーゼ］）および他の代謝障害、先天性肺気腫（α１アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイサックス病（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ）、網膜変性疾患（ならびに他の眼および網膜疾患；例えば、黄斑変性症のためのＰＤＧＦ、および／またはバソヒビンもしくは他のＶＥＧＦ阻害物質、または例えば、Ｉ型糖尿病における網膜障害を治療／予防する他の血管新生阻害物質）、固形臓器の疾患、例えば、脳疾患（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、アストロサイトーマ［エンドスタチン、アンジオスタチンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、神経膠芽腫［エンドスタチン、アンジオスタチンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］を含む）、肺疾患、腎臓疾患、うっ血性心不全または抹消動脈疾患（ＰＡＤ）を含む心臓疾患（例えば、プロテインホスファターゼ阻害物質Ｉ（Ｉ−１）およびこの断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を制御するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、β２アドレナリン受容体、β２アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２型のノックダウンを引き起こす分子、例えば、切断型構成的活性ｂＡＲＫｃｔ；カルサルシン（ｃａｌｓａｒｃｉｎ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害またはドミナントネガティブ分子、例えば、ホスホランバンＳ１６Ｅ等の送達による）、関節炎（インスリン様増殖因子）、関節疾患（インスリン様増殖因子１および／または２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓの送達による）、心臓移植の生存の向上（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様増殖因子Ｉ）、腎性貧血（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（抗炎症因子、例えば、ＩＲＡＰおよびＴＮＦアルファ可溶性受容体）、肝炎（αインターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠損（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２およびＳＣＡ３を含む脊髄脳失調症、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明はさらに、臓器移植後に使用して、移植の成功率を向上させ、および／または臓器移植もしくは補助治療の負の副作用を低減させることができる（例えば、サイトカイン産生を遮断する、免疫抑制剤または阻害性核酸の投与により）。別の例としては、骨形態形成タンパク質（ＢＮＰ２、７等、ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦを含む）を骨移植とともに、例えば、破壊または外科的切除後に、がん患者において投与することができる。
また、本発明を使用して、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）を生成することができる。例えば、本発明のウイルスベクターを使用して、非多能性細胞、例えば、成体線維芽細胞、皮膚細胞、肝細胞、腎細胞、脂肪細胞、心臓細胞、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞等に幹細胞関連核酸（複数可）を送達することができる。幹細胞と関連する因子をコードする核酸は、当技術分野において既知である。幹細胞および多能性と関連するこのような因子の非限定的例としては、Ｏｃｔ−３／４、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３および／またはＳＯＸ１５）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４および／またはＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（例えば、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃおよび／またはＮ−ｍｙｃ）、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８が挙げられる。
また、本発明を実行して、代謝障害、例えば、糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子）、リソソーム貯蔵障害、例えば、ムコ多糖蓄積障害（例えば、スライ症候群［βグルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、ハーラー・シャイエ症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリポ症候群Ａ［ヘパランスルファミダーゼ］、Ｂ［Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチルＣｏＡ：α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ］、Ｂ［βガラクトシダーゼ］、マロトー・ラミー症候群［Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ］等）、ファブリー病（αガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、または糖原貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸αグルコシダーゼ）を治療および／または予防することができる。
遺伝子導入は、疾患状態の治療を理解および提供するのに、実質的な使用可能性を有する。欠陥遺伝子が既知でありクローン化されている、多数の遺伝性疾患が存在する。一般に、上記の疾患状態は、通常、一般的に潜性遺伝する酵素の欠損状態、および制御性または構造性タンパク質が関与することがあり、典型的に顕性遺伝する、酵素の不均衡状態の２つのクラスに分類される。欠損状態の疾患では、遺伝子導入を使用して、正常遺伝子を罹患組織に導入して補充療法を行うと同時に、アンチセンス変異を使用して疾患の動物モデルを作製することができる。疾患の不均衡状態では、遺伝子導入を使用して、モデル系において疾患状態を作製し、次いで、これを使用して疾患状態に拮抗させることができる。したがって、本発明によるウイルスベクターにより、遺伝性疾患の治療および／または予防が可能となる。
また、本発明によるウイルスベクターを利用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで機能性ＲＮＡを細胞に提供し得る。機能性ＲＮＡが細胞において発現すると、例えば、特定の標的タンパク質の細胞による発現が減少し得る。したがって、機能性ＲＮＡを投与して、これを必要とする対象において特定のタンパク質の発現を低減させることができる。また、機能性ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に投与して、遺伝子発現および／または細胞生理機能を制御し、例えば、細胞もしくは組織培養系を、またはスクリーニング方法において最適化することができる。
加えて、本発明によるウイルスベクターは、診断およびスクリーニング方法に利用され、これにより、目的の核酸が、細胞培養系、あるいは遺伝子導入動物モデルにおいて、一過性または安定に発現する。
また、本発明のウイルスベクターは、当業者に明らかであるように、それらに限定されないが、遺伝子標的化、クリアランス、転写、翻訳等を評価するプロトコールにおける使用を含む、様々な非治療目的に使用することができる。また、ウイルスベクターは、安全性（拡散、毒性、免疫原性等）を評価する目的に使用することができる。例えば、このようなデータは、米国食品医薬品局により、臨床的有効性の評価前の規制承認プロセスの一部と考えられている。
さらなる態様としては、本発明のウイルスベクターを使用して、対象における免疫応答をもたらし得る。この実施形態によれば、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むウイルスベクターを対象に投与することができ、免疫原性ポリペプチドに対する活性免疫応答を対象に開始させる。免疫原性ポリペプチドは、本明細書において上記のとおりである。一部の実施形態では、防御免疫応答が誘発される。
「活性免疫応答」または「活性免疫」は、Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｉｎ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ １１７（Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ ｅｄ．，１９８５）において「免疫原との遭遇後の宿主組織および細胞の関与。これは、リンパ細網組織における免疫担当細胞の分化および増殖を伴い、抗体の合成または細胞により媒介される反応性の発現あるいは両方をもたらす。」により特徴づけられる。言い換えれば、活性免疫応答を、感染またはワクチン接種による免疫原への曝露後に宿主により開始させる。活性免疫は、同文献に記載されているように「予め形成された物質（抗体、伝達因子、胸腺移植、インターロイキン２）を能動的に免疫した宿主から非免疫宿主へ伝達すること」により獲得される、受動免疫と対比させることができる。
「防御」免疫応答または「防御」免疫は、本明細書において使用する場合、免疫応答によって、疾患の発症が予防または低減される点において、いくらかの利点が対象に付与されることを示す。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、疾患、特には、がんまたは腫瘍の治療および／または予防において（例えば、がんもしくは腫瘍の形成を防ぐことにより、がんもしくは腫瘍の退縮を引き起こすことにより、および／または転移を防ぐことにより、および／または転移性結節の増殖を防ぐことにより）有用であり得る。防御作用は、治療の利点がこの任意の不利益を凌ぐ限り、完全または部分的であり得る。
特定の実施形態では、異種核酸分子を含むウイルスベクターまたは細胞は、以下に記載するように、免疫原性有効量で投与することができる。
また、本発明のウイルスベクターは、１つまたは複数のがん細胞抗原（もしくは免疫原性に関して類似する分子）またはがん細胞に対する免疫応答をもたらす他の任意の免疫原を発現するウイルスベクターを投与することにより、がん免疫治療のために投与することができる。例えば、がん細胞抗原をコードする異種核酸を含むウイルスベクターを投与して、例えば、がんを有する患者を治療し、および／または対象におけるがんの発症を防ぐことにより、対象におけるがん細胞抗原に対して、免疫応答をもたらすことができる。ウイルスベクターは、本明細書に記載するように、ｉｎ ｖｉｖｏで、またはｅｘ ｖｉｖｏでの方法を使用して、対象に投与し得る。あるいは、がん抗原を、ウイルスカプシドの一部として発現させるか、さもなければ、ウイルスカプシドと結合させることができる（例えば、上記のように）。
別の代替としては、当技術分野において既知の他の任意の治療核酸（例えば、ＲＮＡｉ）またはポリペプチド（例えば、サイトカイン）を投与して、がんを治療および／または予防することができる。
本明細書において使用する場合、用語「がん」は、腫瘍を形成するがんを包含する。同様に、用語「癌組織」は、腫瘍を包含する。「がん細胞抗原」は、腫瘍抗原を包含する。
用語「がん」は、当技術分野において理解される意味、例えば、身体の遠位部位に拡散（すなわち、転移）する可能性を有する組織の制御されない増殖を有する。例となるがんとしては、メラノーマ、腺癌、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんおよび他の任意のがんまたは現在既知もしくは後に同定される悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。代表的実施形態では、本発明において、腫瘍形成がんを治療および／または予防する方法を提供する。
また、用語「腫瘍」は、例えば、多細胞生物における未分化細胞の異常な腫瘤として、当技術分野において理解される。腫瘍は、悪性または良性であり得る。代表的実施形態では、本明細書に開示する方法を使用して、悪性腫瘍を予防および治療する。
用語「がん治療」、「がんの治療」および等価な用語により、がんの重症度を低減するか、もしくは少なくとも部分的に除去し、ならびに／または疾患の進行を遅延させ、および／もしくは制御し、ならびに／または疾患を安定させることを意図する。特定の実施形態では、このような用語は、がんの転移を、予防もしくは低減もしくは少なくとも部分的に除去し、および／または転移性結節の増殖を予防もしくは低減もしくは少なくとも部分的に除去することを示す。
用語「がんの予防」または「がん予防」および等価な用語により、方法によって、がんの発症の発生率および／または重症度を少なくとも部分的に除去もしくは低減および／または遅延させることを意図する。言い換えれば、対象におけるがんの発症において尤度もしくは確率を低減し、および／または対象におけるがんの発症を遅延させ得る。
免疫応答が、免疫調節サイトカイン（例えば、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、ωインターフェロン、τインターフェロン、インターロイキン１α、インターロイキン１β、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、インターロイキン１４、インターロイキン１８、Ｂ細胞増殖因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、単球走化性タンパク質１、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびリンホトキシン）により増強され得ることは、当技術分野において既知である。したがって、免疫調節サイトカイン（好ましくは、ＣＴＬ誘導サイトカイン）を、ウイルスベクターと組み合わせて対象に投与し得る。
サイトカインは、当技術分野において既知の任意の方法により投与し得る。外因性サイトカインを対象に投与し得るか、あるいは、サイトカインをコードする核酸を、適するベクターを使用して対象に送達して、サイトカインをｉｎ ｖｉｖｏで産生させ得る。
対象、医薬製剤、および投与方法
本発明によるウイルスベクターおよびＡＡＶ粒子は、獣医学および医療の両方の適用に利用される。適する対象は、トリおよび哺乳動物の両方を含む。用語「トリ」は、本明細書において使用する場合、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、オウム、インコ等を含むが、これらに限定されない。用語「哺乳動物」は、本明細書において使用する場合、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ等を含むが、これらに限定されない。ヒト対象は、新生児、乳幼児、若年、成人および老年の対象を含む。
代表的実施形態では、対象は、本発明の方法を「必要としている」。
特定の実施形態では、本発明では、薬学的に許容される担体、および任意選択で、他の薬剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、アジュバント、希釈剤等の中に、本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドおよび／またはＡＡＶ粒子を含む医薬組成物を提供する。注入では、担体は、典型的に液体である。他の投与方法では、担体は、固体または液体のいずれかであり得る。吸入投与では、担体は、呼吸用であり、任意選択で、固体または液体の粒状形態であり得る。対象への投与または他の薬学的使用では、担体は、無菌および／または生理学的に適合性である。
「薬学的に許容される」により、毒性がなく、さもなければ望ましくない物質、すなわち、いかなる望ましくない生物学的作用をも引き起こすことなく対象に投与し得る物質を意味する。
本発明の一態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸分子を細胞に導入する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適する標準的形質導入方法に従って、適切な感染多重度で細胞に導入し得る。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞型および数、ならびに特定のウイルスベクターに応じて変化することがあり、過度の実験を必要とせずに当業者により判定することができる。代表的実施形態では、少なくとも約１０３感染単位、任意選択で、少なくとも約１０５感染単位を細胞に導入する。
ウイルスベクターを導入する細胞（複数可）は、それらに限定されないが、神経細胞（末梢性および中枢神経系の細胞、特には、脳細胞、例えば、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトを含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、および角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば、腸および呼吸器の上皮細胞）、筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、平滑筋細胞および／または横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（膵島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌ）、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞等を含む、任意の型であり得る。代表的実施形態では、細胞は、任意の前駆細胞であり得る。さらなる可能性としては、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であり得る。またさらなる代替としては、細胞は、がんまたは腫瘍細胞であり得る。その上、細胞は、上に示すような、任意の原種由来であり得る。
ウイルスベクターは、修飾した細胞を対象に投与する目的でｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に導入することができる。特定の実施形態では、対象から細胞を採り出しておき、ウイルスベクターをそこに導入し、次いで、細胞を投与して対象に戻す。対象から細胞を採り出してｅｘ ｖｉｖｏで操作した後、対象に導入して戻す方法は、当技術分野において既知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照）。あるいは、組換えウイルスベクターを、ドナー対象由来の細胞に、培養した細胞に、または他の任意の適する供給源由来の細胞に導入し、これを必要とする対象（すなわち、「レシピエント」対象）に細胞を投与することができる。
ｅｘ ｖｉｖｏでの核酸送達に適する細胞は、上記のとおりである。対象に投与する細胞の用量は、対象の年齢、症状および種、細胞型、細胞により発現させる核酸、投与方法等に応じて変化する。典型的には、１用量あたり、少なくとも約１０２〜約１０８細胞、または少なくとも約１０３〜約１０６細胞を、薬学的に許容される担体を用いて投与する。特定の実施形態では、ウイルスベクターにより形質導入した細胞を、治療有効量または予防有効量で、医薬担体と組み合わせて対象に投与する。
一部の実施形態では、ウイルスベクターを細胞に導入し、細胞を対象に投与して、送達されたポリペプチド（例えば、導入遺伝子として、またはカプシドにより発現した）に対する免疫原性応答を誘発することができる。典型的には、免疫原性有効量のポリペプチドを発現する一定量の細胞を、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与する。「免疫原性有効量」は、医薬製剤を投与した対象におけるポリペプチドに対する活性免疫応答の誘発に十分な、発現するポリペプチドの量である。特定の実施形態では、用量は、（上に定義する）防御免疫応答をもたらすのに十分な量である。付与される防御の程度は、免疫原性ポリペプチドを投与する利点がこの任意の不利益を凌ぐ限り、完全または永久である必要はない。
本発明のさらなる態様は、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを対象に投与する方法である。本発明によるウイルスベクターおよび／またはカプシドの、これを必要とするヒト対象または動物への投与は、当技術分野において既知の任意の手段によってであり得る。任意選択で、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、治療有効量または予防有効量で、薬学的に許容される担体を用いて送達する。
本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、さらに投与して、（例えば、ワクチンとして）免疫原性応答を誘発することができる。典型的には、本発明の免疫原性組成物は、免疫原性有効量のウイルスベクターおよび／またはカプシドを、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む。任意選択で、用量は、（上に定義する）防御免疫応答をもたらすのに十分な量である。付与される防御の程度は、免疫原性ポリペプチドを投与する利点がこの任意の不利益を凌ぐ限り、完全または永久である必要はない。対象および免疫原は、上記のとおりである。
対象に投与するウイルスベクターおよび／またはカプシドの用量は、投与方法、治療および／または予防する疾患または症状、それぞれの対象の状態、特定のウイルスベクターもしくはカプシド、または送達される核酸等に依存し、通例の方法で決定することができる。治療作用を達成するための例となる用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５形質導入単位、任意選択で、約１０８〜約１０１３形質導入単位の力価である。
特定の実施形態では、２回以上の投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回等またはこれを超える投与）を行って、様々な間隔、例えば、１時間ごと、１日ごと、１週間ごと、１月ごと、１年ごと等の期間にわたって、所望のレベルの遺伝子発現を達成し得る。
例となる投与方法としては、経口、直腸内、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルによる）、頬側（例えば、舌下）、膣内、くも膜下腔内、眼内、経皮、ｉｎ ｕｔｅｒｏ（子宮内）（またはｉｎ ｏｖｏ（胚内））、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格筋、横隔膜筋および／または心筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、脳内、および関節内）、局所（例えば、気道表面を含む、皮膚および粘膜の両表面へ、ならびに経皮投与）、リンパ内等、ならびに組織または器官への直接注入（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳へ）が挙げられる。また、投与は、腫瘍へ（例えば、腫瘍またはリンパ節内または付近に）行い得る。最も適する経路は、いかなる場合においても、治療および／または予防する症状の性質および重症度、ならびに使用する特定のベクターの性質に依存する。
ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流（任意選択で、脚および／または腕の分離式肢灌流；例えば、Ａｒｒｕｄａ ｅｔ ａｔ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８〜３４６４を参照）、および／または筋肉内への直接注入により送達することができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、対象（例えば、筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤを有する対象）の四肢（腕および／または脚）に、四肢灌流、任意選択で、分離式肢灌流（例えば、静脈内または関節内への投与による）により投与する。本発明の実施形態では、本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、「流体力学的」技術を利用せずに、有利に投与することができる。先行技術のベクターの組織送達（例えば、筋肉へ）は、流体力学的技術（例えば、大量の静脈内／静脈内投与）により増強されることが多く、これは、脈管構造における圧力を高め、内皮細胞障壁を通過するベクターの能力を促進する。特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、流体力学的技術、例えば、大容量注入および／または血管内圧の上昇（例えば、正常収縮期圧よりも高く、例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％以下の、正常収縮期圧を超える血管内圧の上昇）を用いずに、投与することができる。このような方法により、流体力学的技術と関連する副作用、例えば、浮腫、神経損傷および／または区画症候群が低減または回避され得る。
また、本発明を実行して、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉまたは他の機能性ＲＮＡ（例えば、リボザイム）を生成し、全身送達することができる。
注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液のいずれか、注入前の液体における溶解もしくは懸濁に適する固形として、または乳濁液として、従来の形態で調製することができる。あるいは、一般には、本発明のウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを、全身的ではなく局所的方法により、例えば、持続性または徐放性製剤により、投与し得る。さらに、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、外科的に移植可能な基質に結合させて送達することができる（例えば、米国特許出願公開第２００４／００１３６４５号明細書に記載されている）。
ウイルスベクターおよびウイルスカプシドは、脳および／またはＣＮＳの組織の細胞に投与することができ、本発明の非存在下で観察されるものよりも広範に分布するウイルスベクターまたはカプシドが有利にもたらされ得る。
特定の実施形態では、本発明の送達ベクターを投与して、遺伝性障害、神経変性障害、精神障害および腫瘍を含む、ＣＮＳの疾患を治療し得る。ＣＮＳの例示的疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥレット症候群、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊髄または頭部損傷による外傷、テイサックス病、レッシュ・ナイハン病、てんかん、脳梗塞；気分障害（例えば、うつ、双極性感情障害、持続性感情障害、続発性気分障害）を含む精神障害、統合失調症、薬物依存症（例えば、アルコール依存症および他の物質依存症）、神経症（例えば、不安、強迫性障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、産後うつ）、精神病（例えば、幻覚および妄想）、認知症、妄想症、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛障害、摂食または体重障害（例えば、肥満症、悪液質、神経性食欲不振症、および過食症）ならびにＣＮＳのがんおよび腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＮＳの障害は、網膜、後索、および視神経が関与する眼科疾患（例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症および他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢黄斑変性症、緑内障）を含む。
すべてではないが、ほとんどの眼科疾患および障害は、３種の徴候：（１）血管新生、（２）炎症、および（３）変性のうちの１つまたは複数と関連する。本発明の送達ベクターを利用して、抗血管新生因子；抗炎症因子；細胞変性を遅延させ、細胞の節約を促進させ、または細胞増殖を促進させる因子、および前述の組合せを送達することができる。
例えば、糖尿病性網膜症は、血管新生により特徴づけられる。糖尿病性網膜症は、１つまたは複数の抗血管新生因子を、眼内（例えば、硝子体内）または眼周囲（例えば、テノン領域下）のいずれかに送達することにより治療することができる。また、１つまたは複数の神経栄養因子を、眼内（例えば、硝子体内）または眼周囲のいずれかに同時送達し得る。
ブドウ膜炎は、炎症が関与する。１つまたは複数の抗炎症因子は、本発明の送達ベクターの眼内（例えば、硝子体または前房）投与により投与することができる。
対照的に、網膜色素変性症は、網膜変性により特徴づけられる。代表的実施形態では、網膜色素変性症は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼内（例えば、硝子体投与）により治療することができる。
加齢黄斑変性症は、血管新生および網膜変性症の両方が関与する。この障害は、１つもしくは複数の神経栄養因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内（例えば、硝子体）に、および／または１つもしくは複数の抗血管新生因子を眼内もしくは眼周囲（例えば、テノン領域下）に投与することにより治療することができる。
緑内障は、眼圧の上昇および網膜神経節細胞の減少により特徴づけられる。緑内障の治療は、興奮毒性傷害から細胞を防御する１つまたは複数の神経保護薬を、本発明の送達ベクターを使用して投与することを含む。このような薬剤は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカイン、および神経栄養因子を、眼内に、任意選択で、硝子体内に送達することを含む。
他の実施形態では、本発明を使用して、てんかん発作を治療し、例えば、てんかん発作の発症、発生率または重症度を低減し得る。てんかん発作のための治療的処置の有効性は、行動学的（例えば、揺れ、眼または口のチック）および／または電子記録による手段（ほとんどのてんかん発作は、電子記録特性の異常を有する）により評価することができる。したがって、本発明をまた使用して、複数の経時的なてんかん発作を特徴とする、てんかんを治療することができる。
代表的な一実施形態では、ソマトスタチン（またはこの活性断片）を本発明の送達ベクターを使用し、脳に投与して、下垂体腫瘍を治療する。この実施形態によれば、ソマトスタチン（またはこの活性断片）をコードする送達ベクターは、微量注入により下垂体に投与する。同様に、このような治療を使用して、先端巨大症（下垂体からの増殖ホルモンの異常分泌）を治療することができる。ソマトスタチンの、核酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００３０６）およびアミノ酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１６６；加工活性ペプチドであるソマトスタチン２８およびソマトスタチン１４を含む）の配列は、当技術分野において既知である。
特定の実施形態では、ベクターは、米国特許第７，０７１，１７２号に記載の分泌シグナルを含み得る。
本発明の代表的実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、全身投与後、ＣＮＳに（例えば、脳または眼に）送達される。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、脊髄、脳幹（延髄、橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体；後頭葉皮質、側頭葉皮質、頭頂葉皮質および前頭葉皮質を含む大脳、基底核、海馬ならびに偏桃体（ｐｏｒｔａａｍｙｇｄａｌａ））、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、および下丘に導入され得る。また、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、末梢投与後、眼の種々の領域、例えば、網膜、角膜および／または視神経に送達され得る。
ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺により）送達して、送達ベクターをさらに分散投与し得る。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、さらに、血液脳関門が撹乱されている状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）において、ＣＮＳへ血管内投与し得る。
ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、それらに限定されないが、くも膜下腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、糖、例えば、マンニトールの存在下で）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房内）および眼周囲（例えば、テノン領域下）送達、ならびに運動ニューロンへの逆行送達による筋肉内送達を含む、当技術分野において既知の任意の経路により、ＣＮＳの所望の領域（複数可）に投与することができる。
特定の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、液体製剤で、ＣＮＳにおける所望の領域または区画への直接注入（例えば、定位的注入）により投与する。他の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、所望の領域への局所適用により、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与により提供し得る。眼への投与は、液滴の局所適用によってであり得る。さらなる代替としては、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、固体の徐放製剤として投与し得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照）。
またさらなる実施形態では、ウイルスベクターを逆行輸送に使用して、運動ニューロンが関与する疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）等）を治療および／または予防し得る。例えば、ウイルスベクターは、筋組織に送達することができ、そこからニューロンに移動し得る。
一部の実施形態では、本発明において、ＡＡＶ粒子に結合するＢＢＢを通過可能なペプチドを同定する方法であって、ａ）ペプチドのファージペプチドライブラリーを対象に注入するステップ、ｂ）ＢＢＢを通過したファージペプチドライブラリーのファージを含む中枢神経系（ＣＮＳ）組織を採取するステップ、ｃ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでファージを増幅するステップ、ｄ）ファージをＡＡＶ粒子とともにインキュベートするステップ、ｅ）ＡＡＶ粒子に結合したファージを回収するステップ、ｆ）ステップｄ）〜ｅ）を少なくとも約３サイクル繰り返すステップ、およびｇ）最終サイクルにおいて回収したファージを配列決定し、これによりＡＡＶ粒子に結合する、ＢＢＢを通過可能なペプチドを同定するステップを含む方法を提供する。ファージライブラリーは、任意の既知および／または後に作製されるファージライブラリーであってもよく、Ｐｈ．Ｄ．−１２ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を含むが、これに限定されない。ＣＮＳ組織は、これらに限定されないが、脊髄、脳幹（延髄、橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体；後頭葉皮質、側頭葉皮質、頭頂葉皮質および前頭葉皮質を含む大脳、基底核、海馬ならびに偏桃体）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、および下丘を含む、ＣＮＳの任意の組織であり得る。一部の実施形態では、方法は、脳組織を採取するステップを含む。ファージの増幅は、当技術分野において既知の任意の技術により実施し得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏでファージをインキュベートするステップ、ファージをＡＡＶ粒子とともにインキュベートするステップ、およびＡＡＶ粒子に結合したファージを回収するステップの反復（例えば、サイクル）（例えば、ステップｄ）〜ｅ）の繰返し）は、少なくとも約２〜約５サイクル、例えば、約２、３、４または５サイクル実施し得る。一部の実施形態では、ステップｄ）〜ｅ）の繰返しは、少なくとも約３サイクル実施し得る。一部の実施形態では、ステップｄ）〜ｅ）の繰返しは、少なくとも約４サイクル実施し得る。ＡＡＶ粒子は、それらに限定されないが、ＡＡＶ８および／またはＡＡＶ９を含む、本発明の任意のＡＡＶビリオンであり得る。一部の実施形態では、方法において、ファージをＡＡＶ９粒子とともに（例えば、複数のＡＡＶ９粒子とともに）インキュベートするステップを提供する。
本発明は、次の採番した項のいずれかにより、さらに説明する。
１．表面結合ペプチドを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、上記ＡＡＶ粒子の表面に結合する上記ペプチドが、
ａ）Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、
ｂ）ＧＳＨ、
ｃ）ＨＩＶ−１ ＴＡＴ（４８〜６０）、
ｄ）ＡｐｏＥ（１５９〜１６７）２、
ｅ）レプチン３０（６１〜９０）、
ｆ）ＴＨＲ、
ｇ）ＰＢ５−３、
ｈ）ＰＢ５−５、
ｉ）ＰＢ５−１４、および
ｊ）上記（ａ）〜（ｉ）の任意の組合せ
からなる群から選択される、ＡＡＶ粒子。
２．上記ＡＡＶが、表１に列挙する血清型、または表１に列挙する血清型の任意の組合せである、項１に記載のＡＡＶ粒子。
３．上記ＡＡＶが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ９．４５または任意のバリアント、ミュータントあるいはこれらの組合せである、項１に記載のＡＡＶ粒子。
４．上記ＡＡＶ粒子の表面に結合する上記タンパク質が、１ＡＡＶ粒子あたり約２０００タンパク質分子〜１ＡＡＶ粒子あたり約４×１０７タンパク質分子の範囲の量で、上記ＡＡＶ粒子表面上に存在する、前項のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
５．異種核酸分子を含む、前項のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
６．上記表面結合ペプチドを含む上記ＡＡＶ粒子が、上記表面結合タンパク質を欠くＡＡＶ粒子と比較して、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する形質導入活性が増強されている、前項のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
７．上記表面結合ペプチドを含む上記ＡＡＶ粒子が、脳および／または中枢神経系の細胞への形質導入活性が増強されている、前項のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
８．前項のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子を、薬学的に許容される担体中に含む医薬製剤。
９．脳および／または中枢神経系の細胞に核酸を投与する方法であって、項１〜７のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または項８に記載の医薬製剤と上記細胞を接触させるステップを含む方法。
１０．対象の脳および／または中枢神経系の細胞に核酸を送達する方法であって、項１〜７のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または項８に記載の医薬製剤を上記対象に投与するステップを含む。
１１．上記ＡＡＶ粒子が、全身投与される、項９に記載の方法。
１２．上記対象が、ヒト対象である、項９〜１１に記載の方法。
１３．ＡＡＶ９のアミノ酸５８８〜５８９番目に対応するアミノ酸の位置にポリペプチドの挿入を含む、修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、上記ポリペプチドが、
ａ）ＰＢ５−３、
ｂ）ＰＢ５−５、
ｃ）ＰＢ５−１４、
ｄ）Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、
ｅ）ＧＳＨ、
ｆ）ＨＩＶ−１ ＴＡＴ（４８〜６０）、
ｇ）ＡｐｏＥ（１５９〜１６７）２、
ｈ）レプチン３０（６１〜９０）、および
ｉ）ＴＨＲ
からなる群から選択される、ＡＡＶカプシドタンパク質。
１４．挿入された上記ポリペプチドが、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮおよびＣの両末端にグリシンをさらに含む、項１３に記載の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質。
１５．表１に列挙するＡＡＶ血清型または表１に列挙する血清型の任意の組合せである、項１３または１４に記載の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質。
１６．ＡＡＶ９カプシドタンパク質である、項１３〜１５のいずれか１項に記載の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質。
１７．項１３〜１６のいずれか１項に記載の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸分子。
１８．ベクター内に含まれる、項１７に記載の核酸分子。
１９．項１３〜１６のいずれか１項に記載の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子。
２０．表１に列挙するＡＡＶ血清型または表１に列挙する血清型の任意の組合せである、項１９に記載のＡＡＶ粒子。
２１．上記ＡＡＶが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ９．４５または任意のバリアント、ミュータントあるいはこれらの組合せである、項１９〜２０のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
２２．異種核酸分子を含む、項１９〜２１のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
２３．上記異種核酸分子が、治療ポリペプチドをコードする、項２２に記載のＡＡＶ粒子。
２４．挿入された上記ポリペプチドを欠くカプシドを有する対照ＡＡＶ粒子と比較して、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する形質導入活性が増強されている、項１９〜２３のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
２５．挿入された上記ポリペプチドを欠くカプシドを有する対照ＡＡＶ粒子と比較して、脳および／または中枢神経系の細胞への形質導入活性が増強されている、項１９〜２４のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
２６．対象の皮質、線条体、視床、小脳および脊髄の１つまたは複数への形質導入が増強されている、項１９〜２５のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
２７．対象のアストロサイト、ＣＣ１＋オリゴデンドロサイト；脳全体のＮｅｕＮ＋細胞、中脳チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）＋ドーパミン作動性ニューロン、カルビンジン＋小脳プルキンエ細胞、介在ニューロン集団およびＣＤ３１＋内皮細胞を含む神経細胞サブタイプの１つまたは複数への形質導入が増強されている、項１９〜２６のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
２８．項１９〜２７のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または項１３〜１７のいずれか１項に記載の修飾カプシドタンパク質を、薬学的に許容される担体中に含む医薬製剤。
２９．脳および／または中枢神経系の細胞に核酸を投与する方法であって、項１９〜２７のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または項２８に記載の医薬製剤と上記細胞を接触させるステップを含む方法。
３０．対象の脳および／または中枢神経系の細胞に核酸を送達する方法であって、項１９〜２７のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または項２８に記載の医薬製剤を上記対象に投与するステップを含む方法。
３１．上記ＡＡＶ粒子または医薬製剤が、全身投与される、項３０に記載の方法。
３２．上記対象が、ヒト対象である、項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
本発明を説明したが、以下の実施例において、さらに詳細にこれを説明する。この実施例は、単に例示目的のために本明細書に含まれ、本発明を制限することを意図していない。
［実施例１］
非侵襲的方法の中でも、ＢＢＢシャトルペプチドは、入手の容易さ、低い免疫原性、および高い化学的万能性のため、前臨床研究および臨床試験におけるこれらの可能性を立証している。ＢＢＢシャトルペプチドは、ＢＢＢ完全性を破壊することなく、多様なカーゴを脳実質内に輸送することが可能な分子である。いくつかの標的化ペプチドが、ＢＢＢを通過して脳に送達する能力を有することが明らかとなっている。例えば、万能性ＢＢＢシャトルペプチドであるＡｎｇｉｏｐｅｐ−２は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１の媒介によりＢＢＢを通過して、多種多様な粒子を効率的に輸送することができる。
細胞株およびペプチド。
ＨＥＫ２９３細胞およびヒトＨｕｈ７細胞を、熱失活した１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍＬ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持した。内在性ＴｆＲ１を欠く、異型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−ＴＲＶＢ細胞は、Ｄｒ．Ｔ．Ｅ．ＭｃＧｒａｗ（Ｗｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＮＹ）により好意的に提供いただき、５％のＦＢＳを添加したＦ１２混合培地（Ｌｏｎｚａ社、米国）中に増殖させた。ヒト脳毛細血管内皮ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国）を、コラーゲンＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）でコーティングした皿に播種し、０．０２５％のＶＥＧＦ、０．０２５％のＬＯＮＧ（登録商標）Ｒ３ ＩＧＦ−Ｉ、０．０２５％のｈＥＧＦ、０．００２５％のｈＢＦＧＦ、０．０１％のヒドロコルチゾン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および２．５％のＦＢＳを添加したＥＢＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ社、米国）中で増殖させた。すべての細胞は、３７℃および５％のＣＯ２で維持した。純度＞９５％のペプチドはすべて、Ｎｅｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（ＭＡ州、米国）およびＫａｒｅＢａｙ Ｂｉｏｃｈｅｍ社（ＮＪ州、米国）により合成された。ペプチド（原液、１０ｍＭ）を、１０％のＤＭＳＯを添加したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中に溶解した。５’−ＦＡＭ標識ＴＨＲペプチドは、ノースカロライナ大学（ＵＮＣ）チャペルヒルのＨｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｒｒａｙ（ＨＴＰＳＡ）Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにより合成された。
プラスミド構築物。
ヒトＴｆＲ１を発現するプラスミドｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＦＲ−２０（Ａｄｄｇｅｎｅ ５５１４４）をＡｄｄｇｅｎｅ社から購入した。ｍＣｈｅｒｒｙ−ｍＴｆＲ−２０と名付けられたプラスミドは、ＰＣＲにより次のように構築された。マウスＴｆＲ１遺伝子を、フォワードプライマー５−ＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＧＣＣＡＧＡＴＣＡＧ−３（配列番号１３１）およびリバースプライマー５−ＡＡＴＡＧＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＣＴＣＡＴＴＧＴＣＡＡＴＡＴＴＣＣＡＡＡＴ−３（配列番号１３２）を有するプラスミドｐＡｃＧＰ６７ＡマウスＴｆＲ（Ａｄｄｇｅｎｅ １２３９２）により増幅し、プラスミドのヒトＴｆＲ１遺伝子をｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＦＲ−２０と交換した。
ウイルス生成。
ＣＢＡプロモーターにより駆動する、ルシフェラーゼを発現する組換えＡＡＶ８完全粒子（ＡＡＶ８／ｌｕｃ）を、これまでに記載されているように、ＨＥＫ２９３細胞における３重トランスフェクションを使用して生成した。簡潔には、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドｐＴＲ／ＣＢＡ−ｌｕｃ、ＡＡＶ８ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むＡＡＶヘルパープラスミド、およびＡｄヘルパープラスミドｐＸＸ６８０を、ＨＥＫ２９３細胞内に同時トランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間に、ＨＥＫ２９３細胞を採取し、溶解した。上清をＣｓＣｌ勾配超遠心分離に供した。ＡＡＶを含む画分を採取し、ウイルス力価は、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０装置およびＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ（Ｒｏｃｈｅ社、米国）、ならびに逆位末端反復（ＩＴＲ）領域上の相同配列に結合するように設計された１対のプライマーを使用して判定した。
ＭＴＴアッセイ。
３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを実施して、ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＭＴＴ細胞増殖アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）により製造者の指示に従って、細胞に対するペプチドの細胞毒性を測定した。４８ウェルプレート内で増殖させた細胞に、ＡＡＶ８／ｌｕｃとペプチドとの複合体を形質導入した。４８時間後、培地を除去し、新たな培養培地と交換した。ＭＴＴ １０μｌを細胞に加え、３７℃で４時間インキュベートし、次いで、ＳＤＳ−ＨＣｌ溶液１００μｌをウェル内に加え、３７℃で４時間さらにインキュベートし、その後、Ｖｉｃｔｏｒ装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社、ＭＡ州）により５７０ｎｍで吸収を測定した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入アッセイ。
ＡＡＶ形質導入前の少なくとも４〜５時間に、４８ウェルプレート内に各ウェルあたり１Ｅ＋０５細胞の密度で細胞を播種した。１細胞あたり１Ｅ＋０４ベクターゲノム（ｖｇ）のＡＡＶ８／ｌｕｃウイルスを細胞に感染させ、４８時間後に回収した。製造者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ＷＩ州）に従って、ルシフェラーゼ活性を測定した。
中和アッセイ。
Ｈｕｈ７またはＨＥＫ２９３細胞を、各ウェルあたり５Ｅ＋０４細胞の密度で４８ウェルプレート内に播種した。ＡＡＶ８／ｌｕｃと種々の濃度のＴＨＲとの複合体を４℃で２時間インキュベートし、次いで、２倍希釈のマウスＡＡＶ８血清を、１細胞あたり１Ｅ＋０４ｖｇの、ＡＡＶ８／ｌｕｃウイルス、またはＡＡＶ８／ｌｕｃとＴＨＲとの複合体とともに、３７℃で１時間インキュベートした。最終混合物を細胞に加え、３７℃で４８時間インキュベートした。細胞を受動的溶解バッファー（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ＷＩ州）で溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した。Ｎａｂ力価は、ルシフェラーゼ活性が無血清対照よりも５０％低かったときの最大希釈として定義した。
ＡＡＶ８結合アッセイ。
ＡＡＶ８／ｌｕｃとＴＨＲまたはヒトアポトランスフェリンタンパク質（Ｓｉｇｍａ社、６１６３９５、米国）との複合体を４℃で２時間インキュベートし、１００００ｖｇのＡＡＶ８／ｌｕｃウイルスのみまたは複合体を、１ウェルあたり４Ｅ＋０５の細胞密度のＨｕｈ７細胞に４℃で加え１時間置き、次いで、ＤＰＢＳで３回洗浄した。最後に、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ＆ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、米国）を用いて細胞から抽出し、ｑＰＣＲにより、ルシフェラーゼプライマーおよび参照ＧＡＰＤＨプライマーを用いて定量した。
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞株についての経細胞輸送アッセイ。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）−ＣＯＬコラーゲンコーティング膜インサート（０．４μｍ孔ポリカーボネート膜および６．５ｍｍのインサートを有する２４ Ｗｅｌｌ Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｓｉｇｍａ社、米国）内のＥＢＭ−２培養培地中にｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を１ウェルあたり５Ｅ＋０４細胞の密度で播種した。培地は、２〜３日ごとに交換した。約２週間後、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、無血清ＥＢＭ−２培地中に培養し、ＡＡＶ８、またはウイルスとペプチドとの複合体で処理した。種々の指示時点で、基底チャンバー内の培地を採取した。ウイルス力価は、ｑＰＣＲにより、確立された手順に従って算出し、プライマーをＩＴＲ領域に対して設計した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの透過性アッセイ。
ＦＩＴＣと共役したデキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン）を使用して、製造者の指示に従って、透過性アッセイを実施した。簡潔には、指示時点において、ＦＩＴＣ−デキストランを、コラーゲンでコーティングした細胞インサート上に播種した細胞に加え、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、インサートを除去し、基底チャンバーに残存する培地を採取し、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用して、それぞれ４８５および５３０ｎｍの励起および発光波長で、ＦＩＴＣ−デキストランの蛍光強度について分析した。すべての処理は、３つ組で実施した。
ウエスタンブロットアッセイ。
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞におけるＺＯ−１タンパク質の発現を判定した。プロテアーゼ阻害物質カクテル（Ｓｉｇｍａ社、米国）を添加したＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ社、米国）中に細胞を回収した。サンプルは、４〜１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＴＧＸ（商標）プレキャストタンパク質ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国）上で泳動させ、ニトロセルロース膜に転写した。５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の脱脂乳で膜をブロッキングした後、特異性ＺＯ−１モノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、３３−９１００、米国）とともにインキュベートし、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＤＰＢＳ（ＰＢＳＴ）により大規模な洗浄を行い、次いで、西洋わさびペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）とともにＲＴで１時間インキュベートした。膜をＰＢＳＴで大規模に洗浄し、増強化学発光検出（ＥＣＬ、Ｔｈｅｒｍｏ社、米国）により免疫ブロットを可視化した。
免疫蛍光法。
カバーガラス上に増殖させた５０〜７０％コンフルエントなＣＨＯ−ＴＲＶＢ細胞内に、リポフェクタミン３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を使用して、プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＦＲ−２０およびｍＣｈｅｒｒｙ−ｍＴｆＲ−２０を個別にトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間の後、カバーガラスを洗浄し、１ｎＭの５−ＦＡＭ−ＴＨＲとともに３７℃で１時間インキュベートし、次いで、細胞を０．２Ｍのグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２で酸洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド中に４℃で３０分間固定した。最後に、ＤＡＰＩを１：５，０００希釈により、ＲＴで５分間使用した。カバーガラスを載せ、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ−８３蛍光マイクロスコープ上で撮像した。
ＡＡＶ８競合結合アッセイ。
ＴＨＲ競合結合分析では、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇレジン（Ｔｈｅｒｍｏ社、米国）１系あたり１０μｌを、ヒトトランスフェリン抗体またはヤギＩｇＧ抗体対照１μｇとともに４℃で一晩インキュベートした。翌日、はじめに、１Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶ８／ｌｕｃを、生理学的濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、種々の希釈のＴＨＲもしくはＰＥＰＸＴ−１対照ペプチドまたはＰＢＳとともに氷上で２時間インキュベートし、次いで、１：１００希釈の生理学的濃度のヒトトランスフェリンを複合体に加え、氷上でさらに２時間インキュベートした。その後、混合物をｐｒｏｔｅｉｎ Ｇレジンとトランスフェリン抗体との複合体に加え、４℃で一晩インキュベートした。最後に、複合体を低温のＤＰＢＳで３回、厳密に洗浄した。複合体からＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲに適用して、１細胞あたりのＡＡＶゲノムコピー数をｌｕｃ特異性プライマーを使用して判定した。
動物試験。
５〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、ＭＥ州）から最初に購入した。すべてのマウスは、ＵＮＣはチェペルヒルの特定の無菌施設で維持し、すべての手順は、ＵＮＣの動物実験委員会により承認された。ペプチドとともにインキュベートしたＡＡＶ８／Ｌｕｃを、後眼窩注入によりマウスに投与した。Ｄ−ルシフェリン基質（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ社、パイントップ、ＡＺ州）の腹腔内注入後に、指示時点で、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ウォルサム、ＭＡ州）を使用して、ルシフェラーゼ発現を撮像した。生物発光画像は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ウォルサム、ＭＡ州）を使用して分析した。注入後種々の時点で、血液を後眼窩神経叢から採取し、ウイルス力価をｑＰＣＲにより試験した。
組織におけるルシフェラーゼ発現の定量。
イメージング研究後１週間の後、イメージング試験に利用した動物を犠死させ、心臓、肝臓、脾臓、骨格筋および脳の組織を採取し、刻んで受動的溶解バッファー中に均質化した。次いで、ライセートを１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞残屑を除去した。上清を９６ウェルプレートに移して、上記のようにルシフェラーゼ活性分析を行った。組織ライセートにおける総タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、フィラデルフィア、ＰＡ州）を使用して測定した。
組織におけるＡＡＶゲノムコピー数の測定。
刻んだ種々の組織の総ｇＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ＆ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、米国）を用いて単離した。ルシフェラーゼ遺伝子をｑＰＣＲアッセイにより測定した。マウスラミン遺伝子は、内部対照として作用した。
組織学的処理および免疫組織化学的検査。
注入後４週間にマウスを麻酔し、ＤＰＢＳ ２５ｍｌの後、ＤＰＢＳ中４％の氷冷パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）１５ｍｌで経心的に灌流した。脳を抽出し、４％のＰＦＡ中に４℃で一晩後固定した。次いで、脳をＤＰＢＳ中３０％のスクロースにより４℃で一晩脱水した。脳全体の連続浮遊切片４０μｍをクリオスタット（Ｃｒｙｏｓｔａｔ）（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）で切断した。浮遊切片について、１次および２次抗体を用いて、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を実施した。簡潔には、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ＭＯ州）を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（ＴＢＳＴ）に、浮遊脳切片をＲＴで３０分間浸透させ、次いで、３％のロバ血清（Ｓｉｇｍａ社、Ｄ９６６３、セントルイス、ＭＯ州）を含む０．０５％のＴＢＳＴにより、ＲＴで１時間ブロッキングした。切片は、ブロッキングバッファー中に希釈した１次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。翌日、組織切片を０．０５％のＴＢＳＴにより洗浄し、適切な２次抗体とともにブロッキングバッファー中ＲＴで２時間インキュベートした。最後に、切片を洗浄し、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ＭＯ州）を用いてスライド上に載せた。Ｏｌｙｍｐｕｓ落射蛍光顕微鏡下で、一般的ＧＦＰ発現について、全脳を調べた。最も大量のＧＦＰ発現を有する領域について、Ｚスタック共焦点イメージングを取得した。すべての画像は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ上で、２０−対物レンズを使用して取得した。この試験において使用した１次および２次抗体は、次のとおり：ウサギ抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、ＭＡ州、ａｂ６５５６）、ヤギ抗ＣＤ３１（Ａｂｃａｍ社）、マウス抗ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡＢ３７７、ビレリカ、ＭＡ州）、ラット抗ＧＦＡＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１３−０３００、米国）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８共役ロバ抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ２１２０６）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４共役ロバ抗ヤギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ１１０５８）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４共役ロバ抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ２１２０３）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４共役ロバ抗ラット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ２１２０９）であった。
統計学的分析。
すべての定量的データは、平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。ｐ≦０．０５のみを統計学的有意差であると考えた。グラフは、少なくとも３回の独立したアッセイから取得したデータセットを表す。
ＡＡＶ８とペプチドとの複合体はｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶ８形質導入に影響する。
ＡＡＶ８形質導入を増強した、潜在的かつ機能性のペプチドを同定するために、発明者らは、表５および表６に示す、いくつかの報告されたペプチドをスクリーニングした。はじめに、発明者らは、種々の濃度のペプチドの細胞に対する細胞毒性を試験した。０．００１ｍＭまたは０．０１ｍＭのペプチドをＨＥＫ２９３細胞またはＨｕｈ７細胞に加え４８時間置いた場合に、細胞毒性をＭＴＴアッセイにより測定したところ、細胞毒性は、ペプチドで処理した細胞において観察されなかった（図１Ａ）。その後、発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入アッセイを実施した。発明者らは、１００００ｖｇのＡＡＶ８／ｌｕｃおよびペプチドを４℃で２時間インキュベートし、次いで、混合物をＨＥＫ２９３細胞またはＨｕｈ７細胞に適用した。４８時間後、細胞ライセートを採取してルシフェラーゼ分析を行った。結果は、いくつかのペプチド、例えば、ＬＡＨ４、ＨＩＶ−１ ＴＡＴ（４８〜６０）、レプチン３０（６１〜９０）およびＴＨＲが、ＡＡＶ８形質導入を、両細胞株において異なる程度まで有意に増強したことを示した（図１Ｂ、ｐ＜０．０５）。ＴＨＲペプチドは、両細胞株において、ＡＡＶ８のみの群と比較して、ＡＡＶ８形質導入の最も有意な向上を付与した。
発明者らは、ＣＨＯ−ＴＲＶＢ細胞について免疫蛍光アッセイを実施し、ＴＨＲが、マウスＴｆＲ１と相互作用し得ることを示した。ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶ形質導入に対するペプチドの作用をさらに試験するために、０．１ｍＭのペプチドと５Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶ８／ｌｕｃベクターとの複合体をインキュベートし、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに後眼窩静脈を介して注入し、７日目にイメージングを行った。図２Ａおよび２Ｂに示すように、肝臓における導入遺伝子発現は、ペプチドＬＡＨ４、Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、ＴＡＴ、ＡｐｏＥ（１５９〜１６７）２、レプチン３０（６１〜９０）およびＴＨＲで処理したＡＡＶ８ベクターにおいて高くなった。より重要なことには、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイと一致して、ＴＨＲペプチドでは、他の群と比較して全身において、特には脳において、ＡＡＶ８形質導入が全体的に有意に向上した（図２Ｂ）。
結果は、ＴＨＲが、ＢＢＢを通過するＡＡＶ８の能力を増強するための潜在的機能を有することを示唆する。一方、発明者らは、ｌｕｃ遺伝子発現およびウイルスゲノム数を、採取した心臓、肝臓、筋肉および脳組織を用いてｑＰＣＲにより評価した。体内分布分析では、はるかに高いＡＡＶゲノムコピー数が、ペプチドＡｎｇｉｏｐｅｐ−２、ＡｐｏＥ（１５９〜１６７）２、レプチン３０（６１〜９０）およびＴＨＲで処理したＡＡＶ８ベクターの投与を受けているマウスの脳において検出されたことを示した。ＬＡＨ４およびＨＩＶ−１ ＴＡＴ（４８〜６０）ではＡＡＶ８肝臓形質導入が向上したが、脳形質導入に対する作用は存在しなかった（図２Ｃおよび２Ｄ）。このような結果は、ＢＢＢシャトルペプチドにより、ＢＢＢを通過して脳形質導入を増強することが可能なＡＡＶ８ベクターの量を増加させることが可能であることを示す。イメージング結果と一致して、ペプチドＡｎｇｉｏｐｅｐ−２、ＡｐｏＥ（１５９〜１６７）２、レプチン３０（６１〜９０）およびＴＨＲをインキュベートすると、脳におけるＡＡＶ８形質導入が向上した（図２Ｃおよび２Ｄ）。しかし、発明者らが、種々の群において、筋肉におけるＡＡＶ８形質導入の増強を測定できなかったことは興味深い。
ペプチドの極性はＡＡＶ８形質導入に有意に影響しない。
極性が、ペプチドの機能において重要な役割を担うことは周知である。ＢＢＢを通過して脳形質導入を増強するＡＡＶの能力を向上させるためのペプチドのＡＡＶ８ビリオンとの相互作用が非特異性である可能性を除外するために、発明者らは、種々の極性を有する４つの対照ペプチドを設計した（表５）。ペプチドとＡＡＶ８／ｌｕｃとの複合体をインキュベートし、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注入した。ＡＡＶ８投与後７日目に、イメージングを取得した。肝臓および脳における導入遺伝子発現の増強は、達成されなかった（図３）。ウイルス発現もウイルスコピーゲノムも、有意には変化しなかった（図３Ｃおよび３Ｄ）。ペプチドＬＡＨ４およびＨＩＶ−１ ＴＡＴ（４８〜６０）の結果をまとめると、ＢＢＢシャトルペプチドは、実際、ＡＡＶ８ビリオンと特異的には相互作用して、ＢＢＢを通過して脳形質導入を増強するＡＡＶ８の能力を向上させる。
ＴＨＲはｉｎ ｖｉｖｏで種々の組織においてＡＡＶ８形質導入を用量依存的に増強した。
上記の結果に基づくと、ＴＨＲペプチドが最良の機能を果たしたため、ＴＨＲペプチドを次の実験のために選択した。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで観察されたＴＨＲペプチドの作用をさらに検証するために、５または６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、種々の濃度のＴＨＲペプチドを、５Ｅ＋１０粒子のＡＡＶ８／ｌｕｃと組み合わせて、後眼窩注入により投与した。指示時点で、ルシフェラーゼ発現を撮像した。図４Ａおよび４Ｂに示すように、上昇濃度のＴＨＲにより、さらに強力なイメージングシグナルが付与された。同時に、ＡＡＶ８／ｌｕｃとペプチドとの複合体の形質導入効率を定量するために、発明者らが、肝臓、脳および脾臓におけるウイルスゲノム数を測定したところ、結果は、ＴＨＲを用いた３つの群における遺伝子コピー数が、対照群よりも有意に高く増強されたことを示した（図４Ｃ）。ＴＨＲの量が高くなれば、脳におけるベクターゲノムのコピー数も増加した。
ＴＨＲのＡＡＶ８との直接相互作用は形質導入の増強に必要である。
上記の結果はまさに、ＴＨＲがＡＡＶ８形質導入を増強することが可能であることを示した。しかし、ＢＢＢを通過して脳形質導入を増強するＡＡＶ８の能力に対するＴＨＲの作用が、ＴＨＲのＡＡＶ８ビリオンとの直接相互作用を必要とするかどうかは不明である。この目的のために、発明者らは、ＡＡＶ８注入直前に、ＴＨＲペプチドをＡＡＶ８／ｌｕｃベクター（ＡＡＶ８／０．１ｍＭ ＴＨＲ）と混合した。ＡＡＶ８とＴＨＲペプチドとの混合物の全身投与後、種々の時点でイメージングを実施した。肝臓領域における導入遺伝子発現量を算出した。ＴＨＲを適用することにより、ＡＡＶ８肝臓形質導入を遮断した（図５Ａおよび５Ｂ）。また、発明者らは、脳におけるルシフェラーゼ発現およびウイルス分布に基づく有意差を２つの群間には認めなかった（図５Ｃ）。この結果は、ＢＢＢを通過するＡＡＶ８の能力の向上が、ウイルスとＴＨＲペプチドとの直接相互作用を必要とすることを示す。
ＴＨＲはＡＡＶ８の生物学的性質に影響しなかった。
ＴＨＲがＡＡＶ８の生物学的性質に干渉するかどうかを判定するために、発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和アッセイを実施した。図６Ｂに示すように、種々の濃度のＴＨＲは、ＡＡＶ８／ｌｕｃ形質導入が向上する条件下で、ＡＡＶ８／ｌｕｃ中和価に干渉しなかった（図６Ａ）。
ＴＨＲは血中のＡＡＶ８クリアランスを低下させることによりＡＡＶ８形質導入を有意に増強した。
全身投与後、ＴＨＲにより媒介される、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶ８形質導入の増強における細胞外因子を理解するために、発明者らは、高用量（各マウスあたり１Ｅ＋１１ｖｇ）のＡＡＶ８／ｌｕｃ、またはウイルスとＴＨＲとのインキュベートした複合体（ＡＡＶ８−０．１ｍＭ ＴＨＲ）をＣ５７ＢＬ／６マウスへ個別に静脈内投与した後の、血中クリアランス率に対するＴＨＲの役割を利用した。これまでの知見と一致して、ＴＨＲにより、全身と脳の両方においてＡＡＶ８形質導入が増強された（図７Ａおよび７Ｂ）。より重要なことには、図７Ｃに示すように、ＡＡＶ８−０．１ｍＭ ＴＨＲを注入した群では、初期（５分）と後期（４８時間）の両方の時点で、他方の群よりも血中クリアランスの実質的な遅延が一貫して示され、このことにより、ＡＡＶ８形質導入の増強についての説明が可能であり得ることが示唆された。
ＴＨＲはＡＡＶ８の細胞への結合および内皮細胞透過性を増強した。
次いで、発明者らは、ＴＨＲにより増強される形質導入の基本的機構を検討することを選択した。発明者らは、Ｈｕｈ７細胞において結合アッセイを実施した。ＴＨＲをＡＡＶ８とともにインキュベートすると、陽性対照としてのヒトトランスフェリン（ｈＴｆ）の結果と同様に、Ｈｕｈ７細胞表面に結合するＡＡＶ８ビリオンが劇的に増加した（図８Ａ）。その一方、ＴＨＲが、ＢＢＢを通過するＡＡＶ８をどのように媒介するかを解明するために、発明者らは、明確に定義された系においてＢＢＢ ｈＣＭＥＣ／Ｄ３内皮細胞を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの内皮細胞透過性分析を行った。発明者らは、３つの群：ＤＰＢＳでインキュベートしたＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８／ｌｕｃコホート）、ＰＢＳでインキュベートしたＡＡＶ８ベクターの適用直前の培養培地へのＴＨＲの追加（ＡＡＶ８／０．１ｍＭ ＴＨＲコホート）、およびＴＨＲでインキュベートしたＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−０．１ｍＭ ＴＨＲコホート）を設計した。内皮細胞透過性アッセイでは、頂端細胞単層の完全性を判定することは必須である。したがって、発明者らは、はじめに、ＦＩＴＣ−デキストランおよび主要結合タンパク質ＺＯ−１発現の蛍光強度をウエスタンブロット解析によって測定することにより、ＢＢＢ膜の完全性を分析した。結果はまさに、種々の群においてＦＩＴＣ透過性とＺＯ−１タンパク質発現の差異が存在しないことを示した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。ＡＡＶ８ベクターをＴＨＲペプチドとプレインキュベートした場合（ＡＡＶ８−０．１ｍＭ ＴＨＲコホート）、ＡＡＶ８ベクターの適用後１５分を除くあらゆる時点で、ＡＡＶ８透過性の有意な向上が観察されたが（図８Ｂ）、ＡＡＶ８／０．１ｍＭ ＴＨＲとＡＡＶ８とのコホート間に顕著な差は示されず、ＴＨＲのＡＡＶ８との結合が、形質導入の増強に必要であることを、さらに示唆する。このような知見は、ＡＡＶ８のＴＨＲペプチドとの直接相互作用により、ＡＡＶビリオンの細胞表面への結合が増加し、次いで、ＢＢＢを通過する能力が増強されることを実証した。
ＴＨＲはＡＡＶ８ビリオンに結合するヒトトランスフェリンと競合した。
発明者らのこれまでの試験では、いくつかの血清タンパク質（トランスフェリン、アルブミンおよびＡｐｏＢ）が、ＡＡＶ８と直接相互作用してｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＡＡＶ８肝臓形質導入を増強することが可能であることを実証した。さらなる試験では、このようなタンパク質が、ＡＡＶ８ビリオンの同一の位置に競合的に結合することを示す。ＴＨＲがまた、ヒト血清タンパク質と同一のＡＡＶ８ビリオンの位置に結合するかどうかを検討するために、発明者らは、競合アッセイを実施した。はじめに、ＡＡＶ８は、種々の希釈の、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、対照ペプチドＰＥＰＸＴ−１またはＴＨＲとともに４℃で２時間インキュベートし、次いで、ヒトトランスフェリンを混合物にさらに加え１時間置いた。トランスフェリン抗体を使用してトランスフェリン結合ＡＡＶ８ビリオンをプルダウンし、ＡＡＶ８遺伝子コピー数をｑＰＣＲにより測定した。図９に示すように、発明者らのこれまでの報告と一致して、ＨＳＡは、トランスフェリンのＡＡＶ８への結合を遮断し、トランスフェリンのＡＡＶ８への結合の阻害に対する対照ペプチドＰＥＰＸＴ−１の作用は、存在しなかった。高濃度のＴＨＲペプチドを使用した場合、トランスフェリンのＡＡＶ８ビリオンへの結合を遮断する、ＨＳＡと類似の作用が存在した。したがって、ＢＢＢシャトルペプチドは、ヒト血清タンパク質と同一のＡＡＶビリオンの位置に結合することによりＢＢＢを通過する、ＡＡＶ８の能力を向上させる機能を果たす。
ＴＨＲは脳におけるＡＡＶ８のＢＢＢ通過および神経細胞の標的化を促進する。
ＴＨＲとプレインキュベートしたＢａｓ Ｖ８／ｌｕｃベクターにより、脳において高い形質導入が誘導された。ルシフェラーゼ分析結果により、高い形質導入レベルが、内皮細胞または脳実質細胞のいずれに由来するかどうかを識別することは、不可能であった。したがって、発明者らは、０．４ｍＭのＴＨＲと４℃で２時間プレインキュベートした２×１０１１ｖｇのｓｃＡＡＶ８−ＣＢｈ−ｅＧＦＰ（ｓｃＡＡＶ８−ｅＧＦＰ−ＴＨＲ）を静脈内注入した後４週間に、種々の脳細胞における導入遺伝子発現を評価した。ｓｃＡＡＶ８−ＣＢｈ−ｅＧＦＰウイルスまたはｓｃＡＡＶ８−ＣＢｈ−ｅＧＦＰ−ＴＨＲのいずれかで処置したマウスにおいて、脳内皮細胞への効率的な形質導入を観察した（図１１Ａ）。ｓｃＡＡＶ８−ｅＧＦＰ−ＴＨＲの投与を受けたマウスにおいて、ｓｃＡＡＶ８−ＣＢｈ−ｅＧＦＰで処置したマウスにおいて観察されたものよりも高いニューロン形質導入を観察した（図１１Ｃ）。ｓｃＡＡＶ８−ＣＢｈ−ｅＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ８−ｅＧＦＰ−ＴＨＲのいずれかで処置したマウスにおいて、アストロサイト形質導入は、観察されなかった（図１１Ｂ）。このような結果により、ＴＨＲが、ＢＢＢを通過して脳、特には、神経細胞における形質導入を増強するＡＡＶ８の能力を向上させる可能性を有するという見解が確認される。
発明者らの本試験の目的は、ＢＢＢを通過して脳に形質導入するＡＡＶベクターの能力を増強する、ＢＢＢシャトルペプチドを適用する可能性を探索することである。ここで、発明者らは、種々の機構を有するいくつかのペプチドが、全身投与後、ＡＡＶ８の脳形質導入を向上させ、ＴＨＲペプチドが、最良であることを見出した。発明者らはさらに、ＴＨＲが、ＡＡＶ８ビリオンに直接結合し、ＡＡＶ８によるＢＢＢの透過性を、ＴｆＲ１受容体媒介機構を介して向上させることが可能であることを実証した。
まとめると、ここで示されるデータは、明らかに、ＢＢＢシャトルペプチドが、ＡＡＶ８に直接結合し、さらに、脳へのＡＡＶ８形質導入を増強させることが可能であることを初めて実証した。このような結果は、ＢＢＢシャトルペプチドがＡＡＶ形質導入を促進する実現可能性を強力に支持する。この知見は、ＣＮＳ障害を有する患者およびＡＡＶベクターの全身投与を必要とするものにおける臨床試験に最重要である。導入遺伝子発現に対して、およびＡＡＶゲノムコピー数、ＡＡの全身投与
［実施例２］
実施例１では、発明者らは、いくつかのＢＢＢペプチド（特には、ＴＨＲペプチド）が、ＡＡＶ８ビリオンと直接相互作用して、ＢＢＢを通過するＡＡＶ８の能力を向上させることが可能であることを実証した。ＡＡＶ８と比較して、ＡＡＶ９ベクターは、全身投与後にはるかに高い脳形質導入を誘導し、ＡＡＶ９は、臨床試験において、神経障害に広範に提唱されている。しかし、ＴＨＲペプチドは、全身投与後に、ＢＢＢを通過するＡＡＶ９の能力を向上させず、ＡＡＶ９の脳形質導入を増強させることができなかった。以下の試験では、発明者らは、Ｐｈ．Ｄ−１２ｍｅｒライブラリーからペプチド、ＰＢ５−３の単離に成功し、ペプチドＰＢ５−３が、マウスにおいて全身投与後にＢＢＢを通過して脳形質導入を向上させるＡＡＶ９の能力を特異的に増強することを実証した。
ＢＢＢを通過しＡＡＶ９に結合する能力を有するペプチド。
ＢＢＢを通過しＡＡＶ９に結合する能力を有するペプチドを単離するために、発明者らは、はじめに、Ｐｈ．Ｄ−１２ｍｅｒファージライブラリーをＣ５７ＢＬマウスに後眼窩静脈を介して注入した。２時間後、マウスをＰＢＳで灌流し、脳を回収してファージを単離し、増幅した。脳における第１選定ラウンドによるファージライブラリーをマウスに注入して、さらなる選定ラウンドを行った。５ラウンド後、ファージライブラリーを、４８ウェルプレートに結合させることにより負に選択し、次いで、ＡＡＶ９ビリオンでコーティングしたプレートでインキュベートした。洗浄後、ＡＡＶ９結合ファージを回収し、増幅して次の選定サイクルを行った。このような選定は、４サイクル繰り返した（図１２Ａ）。ファージ選定の最終サイクルの後、４０種の個々のファージを配列決定した。３８種のクローンの結果が、利用可能であった（図１２Ｂ）。ペプチドＰＢ５−３を６つのファージにおいて、ＰＢ５−５を３つのファージにおいて、およびＰＢ５−１４を別の３つのファージにおいて検出した。このようなペプチドは、種々の配列を有する（図１２Ｂおよび表７）。
ＰＢ５−３はＡＡＶ９に対する高い特異的結合親和性を実証した。
ファージから単離したペプチドのＡＡＶ９ビリオン結合親和性を試験するために、はじめに、発明者らは、種々のペプチドのＡＡＶ９ビリオンに対する親和性を比較した。種々のファージを有するＡＡＶ９でコーティングしたプレートのインキュベーションおよび数回の洗浄の後、さらに多くのＰＢ５−３ファージが、ＰＢ５−５およびＰＢ５−１４ファージよりもＡＡＶ９に結合したことを検出した（図１３Ａ）。次いで、発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの選定により単離したファージが、ＡＡＶ９に対する特異的結合親和性を示すかどうかを試験した。発明者らは、種々の血清型由来のＡＡＶビリオンでプレートをコーティングした。ＰＢ５−３ファージによるインキュベーション後、ＡＡＶ９コーティングプレート上のファージ数は、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８によるプレートよりも、はるかに高かった（図１３Ｂ）。この結果は、血清型特異性ペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの選定により単離することが可能であることを示す。
ＰＢ５−３ペプチドは細胞株におけるＡＡＶ９形質導入を特異的に増強する。
次いで、発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＡＶ９形質導入に対するＰＢ５−３の作用を調べた。発明者らは、ＭＴＴアッセイに基づいて、ＰＢ５−３ペプチドが、種々の細胞型に対する毒性を有しないことを見出した（図１４Ａ）。ＰＢ５−３をＡＡＶ９ビリオンとインキュベートした場合、Ｈｕｈ７、Ｈｅｌａ、Ｃ２Ｃ１２およびｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を含む種々の細胞株において、形質導入の増強が認められた（図１４Ｂ）。インキュベーションなしでは、ＰＢ５−３は、ＡＡＶ９形質導入を向上させることができなかった（図１４Ｃ）。これまでの試験と一致して、ペプチドとＡＡＶビリオンの直接相互作用が、ＡＡＶ９形質導入の増強に必要とされる。
ＰＢ５−３ペプチドを有する他の血清型由来のＡＡＶのｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入の増強の分析。
ＰＢ５−３のＡＡＶ９に対する特異的作用をさらに検討するために、発明者らは、他の血清型由来のＡＡＶの形質導入に対するＰＢ５−３の作用を試験した。血清型２、６および８由来のＡＡＶベクターをＰＢ５−３とともにインキュベートし、次いで、混合物をＨｕｈ７またはｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞に適用した。ＡＡＶ感染後２日の後に形質導入を検出した。ＡＡＶ２、６または８を有する細胞株のいずれにおいても、形質導入の増強は観察されなかった（図１５Ａ〜Ｃ）。
ＰＢ５−３ペプチドは全身投与後の脳におけるＡＡＶ９形質導入を増強する。
マウスにおけるＡＡＶ９形質導入に対するＰＢ５−３ペプチドの作用を試験するために、発明者らは、ＰＢ５−３ペプチドとプレインキュベートしたＡＡＶ９ベクターを、Ｃ５７ＢＬマウスに後眼窩静脈を介して注入した。ＡＡＶ投与後１、３、７および１４日目に、マウスのイメージングを取得した。図１６に示すように、ＰＢ５−３ペプチドでプレインキュベートしたＡＡＶ９でマウスを処置した場合、脳組織における高い形質導入が観察された。図１６ＡＢでは、代表的イメージングを示す。肝臓における形質導入は、ＡＡＶ９をＰＢ５−３ペプチドとプレインキュベートしたかにかかわらず、類似した（図１６Ｂ）。組織導入遺伝子発現と一致して、他の組織ではなく脳におけるＡＡＶゲノムコピー数は、ＡＡＶ９とＰＢ５−３との複合体の投与を受けたマウスにおいて高くなった（図１６Ｃ）。この結果は、ＰＢ５−３のＡＡＶ９との相互作用が、ＢＢＢを通過して脳形質導入を増強するＡＡＶ９の可能性を向上させることが可能であることを示唆する。
ＰＢ５−３ペプチドは全身投与後に他の血清型由来のＡＡＶの脳形質導入に対して作用しない。
ＰＢ５−３ペプチドが、ＡＡＶ９を除く他のＡＡＶ血清型に効率的には結合することができないというｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果を確認するために、発明者らは、ＰＢ５−３とプレインキュベートしたＡＡＶ６およびＡＡＶ８ベクターを、Ｃ５７ＢＬマウスに後眼窩注入を介して投与した。ＡＡＶ適用後５および１０日目に、マウスのイメージングを行った。ＰＢ５−３とプレインキュベートしたＡＡＶ６およびＡＡＶ８による脳形質導入の増強は、全身投与後に、認められなかった（図１７）。この結果は、ＰＢ５−３のＡＡＶ９に対する特異性をさらに示唆する。
ＰＢ５−３ペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＡＶ９透過性を増強する。
ＰＢ５−３が内皮細胞層を通過するＡＡＶ９の能力に影響するかどうかを試験するために、発明者らは、明確に定義された系においてＢＢＢ ｈＣＭＥＣ／Ｄ３内皮細胞を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの内皮細胞透過性分析を実施した。２つの群：ＤＰＢＳでインキュベートしたＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９コホート）、およびＰＢ５−３とインキュベートしたＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＰＢ５−３コホート）を設計した。ＡＡＶ９ベクターをＰＢ５−３ペプチドとプレインキュベートした場合、指示時点で、内皮細胞透過性の有意な向上が認められた（図１８）。このような知見は、ＡＡＶ９のＰＢ５−３ペプチドとの相互作用により、ＢＢＢを通過するＡＡＶ９の能力が向上したことを示す。
この試験の結果によれば、発明者らはまた、ＡＡＶベクターと相互作用し、ＢＢＢを通過するＡＡＶの能力を向上させ、ＡＡＶの脳形質導入を増強する可能性を有する、臨床適用のためのＡＡＶ血清型特性ペプチドを単離することが可能である。
［実施例３］
中枢神経系（ＣＮＳ）への送達のためのＡＡＶ９ベクター構築物ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４の生成。
本明細書に記載するペプチドをＡＡＶ粒子に表面結合させることに対する代替は、ＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質の文脈において、これらを発現させることである。詳細には、ペプチドは、カプシドにおいて３回軸スパイクカプシドドメイン（例えば、ＡＡＶカプシドのアミノ酸５８８〜５８９番目（ＶＰ１位置））に隣接して発現させることができる。
本明細書に記載するように、ＰＢ５−３、ＰＢ５−５およびＰＢ５−１４のペプチド配列をそれらのカプシドタンパク質に挿入した、ベクターｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘを使用して中枢神経系（ＣＮＳ）へ送達するための、組換えアデノ随伴ウイルス９ベクター（ｒＡＡＶ９）を生成する。ペプチドＰＢ５−３、ＰＢ５−５およびＰＢ５−１４により血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するＡＡＶ９ベクターの能力が増強され、これらを効率的かつ特異的な長期のＣＮＳへの導入遺伝子発現に使用可能であることが期待される。
ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ベクター構築物の生成。
本明細書に記載するように、ＰＢ５−３、ＰＢ５−５およびＰＢ５−１４を保有する、中枢神経系（ＣＮＳ）への送達のための、ＡＡＶベクター構築物を生成する。ｒＡＡＶベクターＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４は、ＰＢ５−３、ＰＢ５−５およびＰＢ５−１４のペプチド配列のアミノ酸（ＡＡ）を、ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘのＡＡＶ９カプシドのＡＡ５８８〜５８９（ＶＰ１位置）に挿入することにより生成する（Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３４，ｐ．２０４〜２０９（２０１６））。次のペプチド配列：ＰＢ５−３：ＱＦＡＡＬＰＶＲＡＨＹＧ−ＮＨ２（配列番号１３３）、ＰＢ５−５：ＡＲＳＬＥＰＡＰＳＲＨＳ−ＮＨ２（配列番号１３４）およびＰＢ５−１４：ＡＩＧＤＫＡＹＴＬＲＰＴ−ＮＨ２（配列番号１３５）を挿入する。必要に応じて、アミノ酸、例えば、グリシンをペプチド配列のＮ末端、Ｃ末端または両方に加えて、ＡＡＶカプシドへのペプチド挿入の結合部に可動性をもたらす。これにより、このようなペプチドがベクターの形質導入活性の増強において機能するのに、いかなる構造も必要とされることを確実とする。
ペプチドＰＢ５−３、ＰＢ５−５およびＰＢ５−１４のｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘベクターへのクローニング。
ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘプラスミドは、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子由来の制御エレメントにより制御され、Ｃｒｅ可逆スイッチを有する、完全長ＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子を含む。ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘプラスミドは、ＡＡＶ２ ＩＴＲと近接する３つの主要エレメント：（ｉ）ｍＣｈｅｒｒｙ ｃＤＮＡの上流で合成ポリアデニル化配列の後の、ヒトＵＢＣ遺伝子の３９８ｂｐの断片からなるｍＣｈｅｒｒｙ発現カセット、（ｉｉ）ＡＡＶ５ ｐ４１プロモーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０８５７１６．１の１６８０〜１９７４）およびＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子由来のスプライシング配列を含む、ＡＡＶ９カプシド遺伝子および制御配列、ならびに（ｉｉｉ）ｌｏｘ７１およびｌｏｘ６６の逆位部位と近接するＳＶ４０ポリアデニル化配列（ｐＡ）を含む、Ｃｒｅ依存スイッチを含む。また、ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘプラスミドは、２つのユニークな制限部位、ＸｂａＩおよびＡｇｅＩをカプシド配列に含む。ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘベクターが機能性Ｒｅｐ遺伝子を欠くため、Ｒｅｐをトランスに提供してウイルスを生成しなければならない。ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘは、Ｒｅｐ−ＡＡＰ ＡＡＶプラスミドとともに、ｒＡＡＶを効率的に生成することができる。
ｒＡＡＶベクターＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４は、ＰＢ５−３、ＰＢ５−５およびＰＢ５−１４のペプチド配列の１２個のアミノ酸（ＡＡ）を、ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘのＡＡＶ９カプシドのＡＡ５８８〜５８９（ＶＰ１位置）に挿入することにより生成する。ＡＡＶプラスミド上の挿入部位と相同な配列の両端上に１５ｂｐの重複を含む、ペプチドＱＦＡＡＬＰＶＲＡＨＹＧ−ＮＨ２（ＰＢ５−３（配列番号１３３））、ＡＲＳＬＥＰＡＰＳＲＨＳ−ＮＨ２（ＰＢ５−５（配列番号１３４））およびＡＩＧＤＫＡＹＴＬＲＰＴ−ＮＨ２（ＰＢ５−１４（配列番号１３５））をコードする、Ｕｌｔｒａｍｅｒオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子合成により合成し、単一の等温反応によりＤＮＡ断片の結合を可能とするｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング手順（Ｔａｋａｒａｂｉｏ社、Ｃａｔ．＃６３８９１１、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ）を使用して、ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘカプシドにクローニングする。Ｍｉｃｈｅｌｆｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（（２０１１）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｔｈｒｅｅｆｏｌｄ Ｓｐｉｋｅ Ｃａｐｓｉｄ Ｄｏｍａｉｎ ｔｏ Ｒｅ−Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ８ ａｎｄ ＡＡＶ９ ｉｎ ｖｉｖｏ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（８））に基づいて、ペプチドＰＢ５−３、ＰＢ５−５およびＰＢ５−１４をカプシド表面上の３回軸スパイク領域に配置して、効率的な形質導入を可能とする。また、ペプチドは、他のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８）またはハイブリッド血清型のカプシドタンパク質における類似部位に、例えば、Ｍｉｃｈｅｌｆｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（（２０１１）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｔｈｒｅｅｆｏｌｄ Ｓｐｉｋｅ Ｃａｐｓｉｄ Ｄｏｍａｉｎ ｔｏ Ｒｅ−Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ８ ａｎｄ ＡＡＶ９ ｉｎ ｖｉｖｏ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（８））に開示の方法により挿入し得る。
Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニング。
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングは、１つまたは複数のＤＮＡ断片の任意のベクターへの迅速で特異的なクローニングのために設計されている。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ酵素は、ＤＮＡ断片（例えば、ＰＣＲにより生成したインサートおよび直線化したベクター）を、１５ｂｐの重複をこれらの末端で認識することにより効率的かつ的確に融合させる。ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘプラスミド上の挿入部位と相同な配列の両端上に１５ｂｐの重複を含む、ペプチドＱＦＡＡＬＰＶＲＡＨＹＧ−ＮＨ２（ＰＢ５−３（配列番号１３３））、ＡＲＳＬＥＰＡＰＳＲＨＳ−ＮＨ２（ＰＢ５−５（配列番号１３４））およびＡＩＧＤＫＡＹＴＬＲＰＴ−ＮＨ２（ＰＢ５−１４（配列番号１３５））をコードする、Ｕｌｔｒａｍｅｒオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を合成し、ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘベクターを、ユニーク制限部位ＸｂａＩを使用して直線化し、ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング反応を実施する。次いで、反応産物をＰｌａｓｍｉｄ Ｓａｆｅ（ＰＳ）ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社、Ｅ３１０５Ｋ）で処理して、いかなる非集合断片をも分解し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して精製する。この反応により、１００ｎｇを越える集合プラスミドが得られる（ＰＳ ＤＮａｓｅ分解ステップ後に残存するＤＮＡの量により決定されるように）。コンピテント細胞は、集合したＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ベクターにより形質転換される。
ＰＢ５−３、ＰＢ５−５およびＰＢ−１４ベクターの中枢神経系（ＣＮＳ）への送達。
ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ベクター構築物の形質導入効率に対する作用をｉｎ ｖｉｖｏで調べ、非修飾ＡＡＶ９ベクターと比較する。ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ならびに非修飾ＡＡＶ９ベクターを使用して、ユビキタスＣＡＧプロモーターにより駆動する１本鎖（ｓｓ）ＧＦＰレポーターベクターをパッケージングする（ｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰ）。ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ならびにＡＡＶ９ベクターが、類似の効率でウイルスを生成することが期待される。１×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）のいずれかのベクターを６週齢のマウスに静脈内注入により投与し、３週間後にＧＦＰ発現による形質導入を評価する。
ベクターのＣＮＳへの形質導入効率を評価するために、いくつかの脳領域、脊髄および網膜の、ＧＦＰ免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）および／または天然ｅＧＦＰ蛍光分析を実施する。ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ベクターが、成体ＣＮＳ全体に高い効率で形質導入することが期待される。さらに、全身組織透明化のための、ＰＡＲＳに基づくＣＬＡＲＩＴＹを実施し、脊髄、皮質および線条体由来の組織の透明化切片による天然ｅＧＦＰ蛍光分析を行う。ほとんどの器官（肝臓、心臓、骨格筋および腎臓）におけるＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ならびにＡＡＶ９の細胞レベルでの親和性が、非修飾ＡＡＶ９ベクターと比較して類似することが期待される。
ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ベクターによるＣＮＳへの遺伝子導入の効率を、非修飾であるが、それ以外は同一のＡＡＶ９ベクターと比較して定量するために、注入後２５日に、いくつかの脳領域に存在するウイルスゲノム数を測定する。ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ベクターが、ＡＡＶ９と比較して、次のＣＮＳ領域：皮質、線条体、視床、小脳および脊髄の１つまたは複数への遺伝子導入効率の増強をもたらすことが期待される。
ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ベクターにより形質導入された細胞型を調べるために、いくつかの細胞型マーカーとのＧＦＰの共局在を分析する。ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ベクターが、アストロサイト、ＣＣ１＋オリゴデンドロサイト；脳全体のＮｅｕＮ＋細胞、中脳チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）＋ドーパミン作動性ニューロン、カルビンジン＋小脳プルキンエ細胞、介在ニューロン集団およびＣＤ３１＋内皮細胞を含む神経細胞サブタイプの１つまたは複数に形質導入することが期待される。天然ＧＦＰ発現は、ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４の投与後１年にわたって脳全体に続いて生じる。ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４が、効率的、特異的かつ長期のＣＮＳへの導入遺伝子発現をもたらすことが期待される。
ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ベクターにより形質導入された、いくつかの細胞型の画分を非修飾ＡＡＶ９ベクターと比較して定量し、信頼できる個々の細胞計数を容易とするために、核局在化ＧＦＰ（ＮＬＳ−ＧＦＰ）をＣＡＧプロモーターの制御下で発現するベクター、ｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰを構築する。ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４の成体静脈内投与により、成体マウスにおける神経およびグリア細胞型、例えば、Ａｌｄｈ１Ｌ１＋アストロサイトの大多数、ＮｅｕＮ＋ニューロン、全脳領域にわたるＯｌｉｇ２＋オリゴデンドロサイト系細胞、脊髄全体のＣｈａｔ＋運動ニューロン、ＴＨ＋中脳ドーパミン作動性ニューロンおよびカルビンジン＋プルキンエ細胞の１つまたは複数が効率的に標的とされることが期待される。
ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ベクターのヒト神経細胞への形質導入効率。
ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４のヒト神経細胞への形質導入効率を判定するために、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する皮質ニューロンおよびアストロサイトについて、３Ｄ分化方法を使用して、ベクターを試験する。個人由来のＨｉＰＳＣ株を３Ｄ大脳皮質様構造（皮質球状体）に分化させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで最大２００日間維持する。成熟した皮質球状体は、表在性および深層の皮質興奮性ニューロンならびに最大２０％のアストロサイトを含む。ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４が、ＧＦＡＰ発現アストロサイト、ＭＡＰ２発現ニューロンおよびインタクトな３Ｄ皮質球状体の１つまたは複数に、非修飾ＡＡＶ９ベクターと比較して、より効率的に形質導入することが期待される。
生成したＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ベクターにより、ＣＮＳへの効率的で広範な遺伝子導入が可能となる。この系の別の重要な利点は、これにより、効率的細胞内輸送、および長期の形質導入に必要な持続性２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）形態への１本鎖ウイルスゲノムの変換（ｄｓＤＮＡゲノムのみがＣｒｅの基質として作用するはずである）を媒介するカプシドが有利となるような選択圧が導入されることである。
プラスミド。
ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘゲノムプラスミドは、ＡＡＶ２ ＩＴＲと近接する３つの主要エレメント：（ｉ）ｍＣｈｅｒｒｙ ｃＤＮＡの上流で合成ポリアデニル化配列４０の後の、ヒトＵＢＣ遺伝子の３９８ｂｐの断片からなるｍＣｈｅｒｒｙ発現カセット、（ｉｉ）ＡＡＶ５ ｐ４１プロモーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０８５７１６．１の１６８０〜１９７４）およびＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子由来のスプライシング配列からなる、ＡＡＶ９カプシド遺伝子および制御配列、ならびに（ｉｉｉ）ｌｏｘ７１およびｌｏｘ６６の逆位部位４３と近接するＳＶ４０ポリアデニル化配列（ｐＡ）からなる、Ｃｒｅ依存スイッチを含む。また、ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘゲノムプラスミドは、２つのユニークな制限部位、ＸｂａＩおよびＡｇｅＩをカプシド配列に含む。
ウイルスの生成および精製。
組換えＡＡＶは、２９３Ｔ細胞（ＡＴＴＣ社）の３重トランスフェクションにより、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して生成する。ウイルス粒子は、トランスフェクション後７２時間に培地から、１２０時間に細胞および培地から回収する。細胞ペレットを２ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８を添加した１０ｍＭのトリス中に再懸濁し、３回凍結融解し、１００Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）により３７℃で少なくとも１時間処理する。ウイルス培地は、５００ｍＭの塩化ナトリウムを添加した８％のポリエチレングリコール８０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いた沈降により濃縮し、トリス−ＭｇＣｌ２中に再懸濁し、次いで、ライセートに加える。次いで、混合したストックを５００ｍＭのＮａＣｌに適合させ、３７℃で３０分間インキュベートし、２０００×ｇで遠心分離することにより清澄化する。次いで、清澄化したストックをイオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ、Ｓｉｇｍａ社；Ｄ１５５６）段階勾配（１５％、２５％、４０％および６０％）により精製する。ウイルスを濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に処方する。ＡＡＶ安定性、収率および感染力を、Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖｅｃｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２４（２０１６）；Ｐ．２８７〜２９７）およびＦｒａｎｃｏｉｓ Ａ．ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．１０（２０１８）；Ｐ．２２３〜２３６）において行ったように試験する。
ウイルス力価。
ウイルス力価は、ｑＰＣＲを使用して直線化ゲノムプラスミドを基準物質として用いて、ＤＮａｓｅＩ耐性ウイルスゲノムの数を測定することにより判定する。ＡＡＶ粒子の感染力は、Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１８）に記載のように、感染性ＡＡＶ粒子を滴定することによりｑＰＣＲによって評価する。
動物。
マウスＧＦＡＰプロモーター（０１２８８６）２３の制御下でＣｒｅを発現するＧＦＡＰ−ＣｒｅマウスおよびＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（０００６６４）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＪＡＸ）から購入する。ｒＡＡＶベクターの静脈内投与は、ウイルスを後眼窩洞（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）に注入することにより実施する。マウスは、予め決定した標本サイズの群にランダムに割り当てる。このような分析から除外するマウスは存在しない。実験では、サンプル群についての盲検を行う。
ベクター体内分布。
６週齢マウスの雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、指示するＡＡＶカプシドにパッケージングした１×１０１１ｖｇのｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰベクター（ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４）を静脈内に注入する。動物は、群にランダムに割り当てる。注入後２５日に、マウスを安楽死させ、組織および指示する脳領域を採取し、−８０℃で凍結する。ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔを使用して、組織サンプルから単離する。ＷＰＲＥエレメントに結合するＰＣＲプライマーを使用してベクターゲノムを検出し、マウスグルカゴン遺伝子に対して特異性のプライマーを使用して、マウスゲノムに対して正規化する。既知濃度の直線化プラスミド基準物質の段階希釈を使用して、絶対定量を実施する。
組織調製、免疫組織化学的検査およびイメージング。
マウスをネンブタールにより麻酔し、０．１Ｍのリン酸バッファー（ＰＢ）によりｐＨ７．４の室温（ＲＴ）で、次いで、新たに調製した氷冷のＰＢ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で経心的に灌流する。脳を４％のＰＦＡ中に一晩後固定し、次いで、ビブラトームにより分割するか、または凍結保護してクリオスタットにより分割する。１０％のヤギまたはロバ血清および０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中の１次および２次抗体を用いて、浮遊切片についてＩＨＣを実施する（ＧＡＤ６７染色に界面活性剤は使用しない）。使用する１次抗体は、マウス抗ＡＡＶカプシド（１：２０；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、０３−６５１５８、クローンＢ１）、ウサギ抗ＧＦＰ（１：１０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ１１１２２）、ニワトリ抗ＧＦＰ（１：１０００；Ａｂｃａｍ社、ａｂ１３９７０）、マウス抗ＣＣ１（１：２００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、ＯＰ８０）、ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：１０００；Ｄａｋｏ社、Ｚ０３３４）、マウス抗ＮｅｕＮ（１：５００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡＢ３７７）、ウサギ抗ＩｂａＩ（１：５００；Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ社、ＣＰ２９０）、マウス抗カルビンジンＤ２８Ｋ（１：２００；Ｓｉｇｍａ社、ＣＢ−９５５）、ウサギ抗カルレチニン（１：１０００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、ＡＢ５０５４）、マウス抗ＧＡＤ６７（１：１０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡＢ５４０６）、モルモット抗ＭＡＰ２（１：１０００、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１８８００４）、マウス抗パルブアルブミン（１：１０００；Ｓｉｇｍａ社）、チロシンヒドロキシラーゼ（１：１０００、Ａｖｅｓ社）およびウサギ抗ＣＤ３１（１：５０；Ａｂｃａｍ社、ａｂ２８３６４）である。
細胞型特異性形質導入の定量。
６週齢の雌マウスを群にランダムに割り当て、ＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ならびに非修飾ＡＡＶ９カプシドにパッケージングした２×１０１２ｖｇのｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰを静脈内に注入する。３週後、マウスを灌流し、上記のように、脳を処理して指示する抗原に対して免疫染色する。細胞型特異的免疫染色および天然ＮＬＳ−ＧＦＰ蛍光の共焦点単一面画像を取得する。最初に計数し、細胞特異性抗原により染色した各細胞を標識し、ＩＨＣチャネルを観察することにより、細胞計数を実施する。次いで、天然ＧＦＰ蛍光が陽性となる、標識したＩＨＣ＋細胞を計数する。カプシド間で形質導入効率に明確な差異が存在するため、計数では、群について盲検しない。
組織透明化。
マウスは、ＰＢＳ中の氷冷した４％のＰＦＡ ６０〜８０ｍＬにより、毎分１４ｍＬの流量で灌流する。次いで、流量を２〜３ｍＬ／分に低減し、ＲＴで２時間継続する。次いで、マウスを個別に構築したカスタムチャンバーに置き、再循環するＲＴのＰＢ中４％アクリルアミド２００ｍＬにより、２〜３ｍＬ／分で一晩灌流した後、ＰＢにより２時間の灌流フラッシュを行って、残留しているポリマー／モノマーを脈管構造から除去する。重合プロセスは、チャンバーを４２℃のウォーターバス内に置き、０．２５％のＶＡ−０４４阻害物質を含む、再循環する脱気ＰＢ ２００ｍＬによる灌流（２〜３ｍＬ／分）を２〜４時間行うことによって送達することにより開始する。次いで、マウスは、ＰＢＳ中８％のＳＤＳ、ｐＨ７．５により７日間灌流する。ＳＤＳを含む溶液は、７日の間に２回新たに交換し、次いで、再循環しないＰＢ ２Ｌによる一晩の灌流により洗い流す。透明化した組織サンプルを、ＲＩＭＳ溶液（屈折率１．４６）を用いてマウントして、イメージングを行う。
ヒトｉＰＳＣ株由来の皮質球状体の生成。
ヒト皮質球状体をｉＰＳＣ株から生成する。簡潔には、２人の対照健常者に由来するｉＰＳＣ株を、次の培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％のＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ、１ｍＭの非必須アミノ酸（１：１００）、ＧｌｕｔａＭａｘ（１：２００）、βメルカプトエタノール（０．１ｍＭ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（１：１００）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中の不活化したマウス胚線維芽フィーダー細胞上で増殖させる。培養物を定期的に試験し、無マイコプラズマ状態に維持する。ｉＰＳＣのコロニーは、ディスパーゼ（０．３５ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりインタクトに分離させ、低接着プレート内の、ドルソモルフィン（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）（５μＭ、Ｓｉｇｍａ社）およびＳＢ−４３１５４２（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ社）を添加したｉＰＳＣ培地中に移し、培地を毎日交換する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化の６日目に、神経球状体をＮＰＣ培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ａ、ビタミンＡ不含Ｂ２７、ＧｌｕｔａＭａｘ（１：１００）、ペニシリンおよびストレプトマイシン；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に移し、この培地には、２４日目までＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、次いで、２５〜４２日目にＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＮＴ３（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。４３日目以降、皮質球状体をＮＰＣ培地中に維持し、この培地は、４日毎に交換する。
皮質球状体の解離およびウイルス感染。
酵素的解離および単層培養では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化（１個人由来の１つのｉＰＳＣ株の２つの独立した神経分化、および別の個人由来のｉＰＳＣ株の１つの分化）の１７０〜２００日目の皮質球状体を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）とともに３７℃で２５分間インキュベートし、ＮＰＣ培地で３回洗浄してＰ−２００ピペットで穏やかに粉砕する。ポリオルニチンおよびラミニンでコーティングしたカバーガラス（１５ｍｍ）上に細胞を約３００，０００細胞／ウェルで播種し、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＮＴ３（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＮＰＣ培地中で最初の２４時間維持し、次いで、増殖因子を含まないＮＰＣ培地中で維持する。
カバーガラス上の増殖した培養物をそれぞれのウイルスに１×１０９ｖｇ／ウェルの力価で感染させ、５日後に４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間固定する。免疫細胞化学検査では、細胞を０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１０分間透過処理し、ＰＢＳ中１０％のヤギ血清で１時間プロッキングする。次いで、カバーガラスを、ブロッキング溶液中に希釈した抗体とともに２時間インキュベートする。核は、ヘキスト３３２５８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１：１０，０００）で可視化する。細胞をＺｅｉｓｓ Ｍ１ Ａｘｉｏｓｃｏｐｅで、４０×対物レンズを使用して撮像する。ＧＦＡＰまたはＭＡＰ２のいずれかで同時標識するＧＦＰ＋細胞の比率は、各実験条件について、１カバーガラスあたり１０の確率場の画像において定量する。提示する結果は、２つの別々の解離および感染実験の平均である。
インタクトな３Ｄ培養物をＡＡＶ９−ＰＢ５−３、ＡＡＶ９−ＰＢ５−５およびＡＡＶ９−ＰＢ５−１４ならびに非修飾ＡＡＶ９ベクターに感染させるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化の１９７日目の単一のヒト皮質球状体を、ＮＰＣ培地中に６×１０９ｖｇ／４００μｌを含む１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ内に一晩移して、７日後に４％のＰＦＡ中で一晩固定する。次いで、固定した球状体を３０％のスクロース中に２４時間移し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で包埋して１４μｍの切片に切断する。免疫組織化学的検査では、切片を、０．３％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳ中の１０％のヤギ血清で１時間ブロッキングする。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８共焦点顕微鏡で画像を収集する。
このような方法のさらなる記載は、Ｍｉｃｈｅｌｆｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（（２０１１）ＰＬｏＳ ＯＮＥ６（８））、Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（（２０１６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｆｅｂ；３４（２）：２０４〜２０９）、Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ＨＥＫ２９３ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｈａｒｖｅｓｔ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＧＭＰ ＦＩＸ ａｎｄ ＦＬＴ１ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖｅｃｔｏｒ」Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６ Ｆｅｂ；２４（２）：２８７〜２９７およびＦｒａｎｃｏｉｓ Ａ．，（２０１８）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８ Ｊｕｌ ２７；１０：２２３〜２３６に見出すことができる。
本発明は、これらのある特定の実施形態の特定の詳細を参照して記載されているが、このような詳細を添付の特許請求の範囲に含む場合を除いて、およびこのような詳細を添付の特許請求の範囲に含む範囲で、このような詳細が本発明の範囲に対する制限であるとみなすべきであるとは、意図していない。
本出願を通して、種々の特許、特許公開および非特許公開文献を参照する。このような特許および公開文献の開示は、これらの全体において、本発明が属する分野の先行技術をさらに十分に説明するために、参照により本出願に組み込む。

Claims (32)

  1. 表面結合ペプチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、前記ＡＡＶ粒子の表面に結合する前記ペプチドが、
    ａ）Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、
    ｂ）ＧＳＨ、
    ｃ）ＨＩＶ−１ ＴＡＴ（４８〜６０）、
    ｄ）ＡｐｏＥ（１５９〜１６７）２、
    ｅ）レプチン３０（６１〜９０）、
    ｆ）ＴＨＲ、
    ｇ）ＰＢ５−３、
    ｈ）ＰＢ５−５、
    ｉ）ＰＢ５−１４、および
    ｊ）上記（ａ）〜（ｉ）の任意の組合せ
    からなる群から選択される、ＡＡＶ粒子。
  2. 前記ＡＡＶが、表１に列挙する血清型、または表１に列挙する血清型の任意の組合せである、請求項１に記載のＡＡＶ粒子。
  3. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ９．４５または任意のバリアント、ミュータントあるいはこれらの組合せである、請求項１に記載のＡＡＶ粒子。
  4. 前記ＡＡＶ粒子の表面に結合する前記タンパク質が、１ＡＡＶ粒子あたり約２０００タンパク質分子〜１ＡＡＶ粒子あたり約４×１０７タンパク質分子の範囲の量で、前記ＡＡＶ粒子表面上に存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
  5. 異種核酸分子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
  6. 前記表面結合ペプチドを含む前記ＡＡＶ粒子が、前記表面結合タンパク質を欠くＡＡＶ粒子と比較して、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する形質導入活性が増強されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
  7. 前記表面結合ペプチドを含む前記ＡＡＶ粒子が、脳および／または中枢神経系の細胞への形質導入活性が増強されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
  8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子を、薬学的に許容される担体中に含む医薬製剤。
  9. 脳および／または中枢神経系の細胞に核酸を投与する方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または請求項８に記載の医薬製剤と前記細胞を接触させるステップを含む方法。
  10. 対象の脳および／または中枢神経系の細胞に核酸を送達する方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または請求項８に記載の医薬製剤を前記対象に投与するステップを含む方法。
  11. 前記ＡＡＶ粒子が、全身投与される、請求項９に記載の方法。
  12. 前記対象が、ヒト対象である、請求項９〜１１に記載の方法。
  13. ＡＡＶ９のアミノ酸５８８〜５８９番目に対応するアミノ酸の位置にポリペプチドの挿入を含む、修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、前記ポリペプチドが、
    ａ）ＰＢ５−３、
    ｂ）ＰＢ５−５、
    ｃ）ＰＢ５−１４、
    ｄ）Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、
    ｅ）ＧＳＨ、
    ｆ）ＨＩＶ−１ ＴＡＴ（４８〜６０）、
    ｇ）ＡｐｏＥ（１５９〜１６７）２、
    ｈ）レプチン３０（６１〜９０）、および
    ｉ）ＴＨＲ
    からなる群から選択される、ＡＡＶカプシドタンパク質。
  14. 挿入された前記ポリペプチドが、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方にグリシンをさらに含む、請求項１３に記載の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質。
  15. 表１に列挙するＡＡＶ血清型、または表１に列挙する血清型の任意の組合せである、請求項１３または１４に記載の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質。
  16. ＡＡＶ９カプシドタンパク質である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質。
  17. 請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸分子。
  18. ベクター内に含まれる、請求項１７に記載の核酸分子。
  19. 請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子。
  20. 表１に列挙するＡＡＶ血清型または表１に列挙する血清型の任意の組合せである、請求項１９に記載のＡＡＶ粒子。
  21. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ９．４５または任意のバリアント、ミュータントあるいはこれらの組合せである、請求項１９〜２０のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
  22. 異種核酸分子を含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
  23. 前記異種核酸分子が、治療ポリペプチドをコードする、請求項２２に記載のＡＡＶ粒子。
  24. 挿入された前記ポリペプチドを欠くカプシドを有する対照ＡＡＶ粒子と比較して、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する形質導入活性が増強されている、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
  25. 挿入された前記ポリペプチドを欠くカプシドを有する対照ＡＡＶ粒子と比較して、脳および／または中枢神経系の細胞への形質導入活性が増強されている、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
  26. 対象の皮質、線条体、視床、小脳および脊髄の１つまたは複数への形質導入が増強されている、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
  27. 対象のアストロサイト、ＣＣ１＋オリゴデンドロサイト；脳全体のＮｅｕＮ＋細胞、中脳チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）＋ドーパミン作動性ニューロン、カルビンジン＋小脳プルキンエ細胞、介在ニューロン集団およびＣＤ３１＋内皮細胞を含む神経細胞サブタイプの１つまたは複数への形質導入が増強されている、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
  28. 請求項１９〜２７のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の修飾カプシドタンパク質を、薬学的に許容される担体中に含む医薬製剤。
  29. 脳および／または中枢神経系の細胞に核酸を投与する方法であって、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または請求項２８に記載の医薬製剤と前記細胞を接触させるステップを含む方法。
  30. 対象の脳および／または中枢神経系の細胞に核酸を送達する方法であって、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または請求項２８に記載の医薬製剤を前記対象に投与するステップを含む方法。
  31. 前記ＡＡＶ粒子または医薬製剤が、全身投与される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記対象が、ヒト対象である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
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