JP2021501125A - 特定成分の含量が増加した茶抽出物を含む脂肪代謝異常の予防又は改善用組成物 - Google Patents

特定成分の含量が増加した茶抽出物を含む脂肪代謝異常の予防又は改善用組成物 Download PDF

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Abstract

本明細書は、特定成分の含量が増加した茶抽出物を含む脂肪代謝異常の予防又は改善用組成物に関し、本明細書に係る製造方法及び組成物を用いて、肥満を含む脂肪代謝異常を副作用を伴うことなく効果的に予防及び治療できるので、関連需要を充足し且つ当該産業の発展を図ることができる。【選択図】図２

Description

本明細書は、特定成分の含量が増加した茶抽出物を含む脂肪代謝異常の予防又は改善用組成物に関する。
肥満とは、体内に脂肪組織が過剰に蓄積した状態のことであり、摂取エネルギーが消費エネルギーよりも多いときに生じ、また、精神的及び社会的要因、遺伝、疾病、薬物などの様々な原因で生じる。２０１０年の世界保健機構（ＷＨＯ）の統計によれば、過体重成人の人口は全世界で約１６億人、肥満人は約４億人であると集計され、毎年２６０万人が肥満と過体重で死亡すると報告された。韓国の場合でも、保健福祉部と疾病管理本部の報告によれば、成人の肥満率は継続的な増加傾向にあり、２０１０年を基準に、３０．８％（男性３６．３％、女性２４．８％）と示された。このように肥満人口は全世界で継続的に増加しており、これに伴う医療費の負担も増加傾向にある。肥満は現代人が患い得る最もありがちな疾病の一つとなった。
肥満は、食餌療法、規則的な運動とともに行動療法のような生活習慣の改善、及び食欲抑制剤や脂肪吸収抑制剤といった薬物にて管理可能である。肥満は慢性疾患であるため、薬物治療を試みる場合に長期間の使用が必要であり、現在国内で３ヶ月以上の長期間の使用が許可された製品としては、食欲抑制剤であるシブトラミン（ｓｉｂｕｔｒａｍｉｎｅ）と脂肪分解酵素抑制剤であるオルリスタット（ｏｒｌｉｓｔａｔ）がある。しかし、これらの肥満治療薬物の大半は、中枢神経系に作用して食欲を調節する向精神性医薬品であるため、頭痛や嘔吐などの副作用を伴い且つ濫用などのおそれがあるという問題点がある。肥満を副作用を伴うことなく効果的に治療できる薬物や食品に対する需要が持続しているだけに、肥満を予防し治療できる天然物由来の製品の発掘が急がれている実情である。
特開２００６−８３１０６号公報 韓国公開特許第１０−２０１２−００６４２９９号公報 韓国公開特許第１０−２０１４−０１０３４８８号公報 韓国公開特許第１０−２００５−００９３８９４号公報 韓国公開特許第１０−２００８−００６６１１５号公報
本明細書は、肥満を含む脂肪代謝異常を予防し治療できる天然物由来の抽出物及び組成物の発掘をその課題とする。
前記課題を解決するために、本明細書は、組成物の総重量を基準に、１〜５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）、０．１〜０．５重量％の（−）−カテキンガレート（（−）−ｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＣＧ）、及び０．８〜４重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を有効成分として含む、脂肪代謝異常の予防又は改善用組成物を提供する。
また、本明細書は、（１）緑茶に水分を調整しバチルス属菌株を接種する段階；（２）４０〜６０℃で保持する段階；（３）７０〜８０℃で熟成する段階；及び（４）水及びＣ１〜Ｃ６のアルコールのいずれか一種以上を加え、５０℃〜８０℃で抽出する段階を含む、脂肪代謝異常の予防又は改善用組成物の製造方法を提供する。
さらに、本明細書は、緑茶抽出物中の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）の含量を極大化させる方法を提供する。
本発明の一側面に係る製造方法及び組成物を用い、肥満を含む脂肪代謝異常を副作用を伴うことなく効果的に予防及び治療できるので、関連需要を充足し且つ当該産業の発展を図ることができる。
本発明の一側面に係る特定成分の含量が増加した緑茶抽出物による体重増加抑制効果を他の群と比べて示したものである。 本発明の一側面に係る特定成分の含量が増加した緑茶抽出物による脂肪組織重量減少効果を他の群と比べて示したものである。 本発明の一側面に係る特定成分の含量が増加した緑茶抽出物による脂肪肝改善効果を他の群と比べて示したものである。 本発明の一側面に係る特定成分の含量が増加した緑茶抽出物による血中中性脂肪改善効果を他の群と比べて示したものである。 本発明の一側面に係る特定成分の含量が増加した緑茶抽出物による脂肪組織炎症反応改善効果を他の群と比べて示したものである。 本発明の一側面に係る特定成分の含量が増加した緑茶抽出物中の成分毎及び条件毎の含量の変化を示したものである。 本発明の一側面に係る特定成分の含量が増加した緑茶抽出物中の総カテキン含量の変化を時間毎及び条件毎に示したものである。 本発明の一側面に係る特定成分の含量が増加した緑茶抽出物中のＧＣＧとＣＧの含量の変化を時間毎及び条件毎に示したものである。
本明細書において、「緑茶抽出物」とは、抽出方法、抽出溶媒、抽出された成分又は抽出物の形態を問わず、ツバキ科に属する常緑樹である茶の木（カメリアシネンシス；Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）から抽出したもの又はバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｐｐ.）を接種して発酵させた茶葉などから抽出したものを含み、該抽出したものを特定の溶媒で分画した分画物を含む。前記茶は、茶の木の葉、花、幹、実、根、茎、及び根の心材から構成された群より選ばれる一種以上が含まれ、好ましくは、葉であってよい。また、前記抽出物の形態は、好ましくは、粉末形態であってよい。前記抽出又は分画は、水、有機溶媒、またはこれらの混合溶媒を用いて行なってよい。有機溶媒は、アルコール、イソプロパノール、アセトン、ヘキサン、エチルアセテート、二酸化炭素、又はこれらのうちの二種以上の混合溶媒を用いてよいが、これらに限定されず、緑茶の有効成分が破壊されない又は最小化した条件で、室温又は加温して抽出又は分画してよい。前記アルコールは、Ｃ１〜Ｃ６の低級アルコールであってよい。抽出又は分画の回数や方法は特に制限されず、例えば、冷浸抽出、超音波抽出、還流冷却抽出、熱水抽出などの方法を用いてよく、好ましくは、冷浸又は加温して有効成分を抽出又は分画しろ過した後、そのろ過液を減圧濃縮して本発明の緑茶抽出物を得てよい。
本明細書において、「薬学的に許容可能」とは、通常の医薬的服用量（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｄｏｓａｇｅ）で利用する際に相当な毒性を避けることにより、動物、より具体的には、ヒトに使用することができるという政府又はこれに準ずる規制機構の承認を受けることができ、又は承認を受け、又は薬局方に列挙され、又はその他一般的な処方として認知されることを意味する。
本明細書において、「薬学的に許容可能な塩」とは、薬学的に許容可能であり、親化合物（ｐａｒｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の好ましい薬理活性を有する本発明の一側面に係る塩を意味する。
本明細書において、「総カテキン」とは、四種のエピカテキン（エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）エピカテキン（ＥＣ）、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、及びエピカテキン３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ））の総和のことを意味する。
本発明は、一側面において、組成物の総重量を基準に、１〜５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）、０．１〜０．５重量％の（−）−カテキンガレート（（−）−ｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＣＧ）、及び０．８〜４重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を有効成分として含む、脂肪代謝異常の予防又は改善用組成物であってよい。
本発明は、他の側面において、組成物の総重量を基準に、１〜５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）、０．１〜０．５重量％の（−）−カテキンガレート（（−）−ｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＣＧ）、及び０．８〜４重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を有効成分として含む組成物を個体に投与することを含む、脂肪代謝異常の予防又は改善方法に関するものであってよい。
本発明は、また他の側面において、脂肪代謝異常の予防又は改善のための組成物の製造に用いるための組成物の総重量を基準に、１〜５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）、０．１〜０．５重量％の（−）−カテキンガレート（（−）−ｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＣＧ）、及び０．８〜４重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物の用途に関するものであってよい。
一具現例として、前記ＧＣＧの含量は、１重量％以上、２重量％以上、２．９重量％以上、２．９２重量％以上、３重量％以上、３．１重量％以上、３．１２重量％以上、３．１５重量％以上、３．３重量％以上、３．５重量％以上、３．８重量％以上、４．０重量％以上、４．２重量％以上、４．４重量％以上、４．６重量％以上、又は４．８重量％以上であってよい。他の具現例として、前記ＧＣＧの含量は、５重量％以下、４．８重量％以下、４．６重量％以下、４．４重量％以下、４．２重量％以下、４重量％以下、３．５重量％以下、３．４重量％以下、３．３重量％以下、３．２重量％以下、３．１２重量％以下、３．１重量％以下、２．９５重量％以下、２．９２重量％以下、２．９重量％以下、２．５１重量％以下、２．４重量％以下、２．２重量％以下、１．５重量％以下、１．８重量％以下、１．５重量％以下、又は１．３重量％以下であってよい。
一具現例として、前記ＣＧの含量は、０．１重量％以上、０．２重量％以上、０．３重量％以上、０．３１重量％以上、０．３５重量％以上、０．３６重量％以上、０．３８重量％以上、０．３９重量％以上、０．４重量％以上、０．４２重量％以上、０．４５重量％以上、又は０．４８重量％以上であってよい。他の具現例として、前記ＣＧの含量は、０．５重量％以下、０．４８重量％以下、０．４６重量％以下、０．４４重量％以下、０．４２重量％以下、０．４重量％以下、０．３９重量％以下、０．３８重量％以下、０．３６重量％以下、０．３５重量％以下、０．３２重量％以下、０．３重量％以下、０．２９重量％以下、０．２８重量％以下、０．２５重量％以下、０．２重量％以下、又は０．１５重量％以下であってよい。
一具現例として、前記ＥＧＣＧの含量は、０．８重量％以上、０．９重量％以上、１．０重量％以上、１．１重量％以上、１．２重量％以上、１．３重量％以上、１．４重量％以上、１．５重量％以上、１．８重量％以上、２重量％以上、２．２重量％以上、２．４重量％以上、２．５重量％以上、２．６重量％以上、２．８重量％以上、３重量％以上、３．２重量％以上、３．４重量％以上、３．６重量％以上、３．７重量％以上、３．８重量％以上、又は３．９重量％以上であってよい。他の具現例として、前記ＥＧＣＧの含量は、４重量％以下、３．９重量％以下、３．８重量％以下、３．７重量％以下、３．６重量％以下、３．４重量％以下、３．２重量％以下、３重量％以下、２．８重量％以下、２．６重量％以下、２．４重量％以下、２．２重量％以下、２重量％以下、１．８重量％以下、１．６重量％以下、１．４重量％以下、１．２重量％以下、１．０重量％以下、又は０．９重量％以下であってよい。
一具現例として、前記組成物中の総カテキンの含量は、組成物の全重量を基準に、１０重量％以下、８重量％以下、７．５重量％以下、７．４５重量％以下、又は７重量％以下であってよい。他の具現例として、前記総カテキンの含量は、６重量％以上、６．５重量％以上、７重量％以上、７．４重量％以上、７．４４重量％以上、７．５重量％以上、８重量％以上、又は９重量％以上であってよい。
前記ＧＣＧ、ＣＧ、ＥＧＣＧ、総カテキンの含量が前記範囲を外れる場合、下記の実験例の効果が奏されない、又は効果の水準が一般の緑茶抽出物と類似したものとなる。
総カテキンの含量は、経時的に安定性が劣化するＥＧＣＧのため安定性が問題になることがあり、したがって、総カテキンの含量を基準とする効能の場合、保たれ難い可能性が高い（図６参照）。本発明の一側面に係る抽出物は、総カテキンの含量が少ないながらも遥かに優れた効果を奏する緑茶抽出物に関するものであって、既存の一般の緑茶抽出物では確認できなかったＧＣＧ成分の含量を極大化して、既存の緑茶抽出物よりも脂肪代謝異常に対する効果の面で顕著に優れた結果を示した（下記の実験例参照）。
一側面において、前記抽出物中のＥＧＣＧ：ＧＣＧの重量比は、２：０．５〜１２．５以上であってよい。一具現例として、前記重量比は、２：０．５以上、２：０．７以上、２：０．９以上、２：１以上、２：１．２以上、２：１．４以上、２：１．５以上、２：１．６以上、２：１．７以上、２：１．８以上、２：２以上、２：２．２以上、２：２．４以上、２：２．６以上、２：２．８以上、２：３以上、２：３．２以上、２：３．４以上、２：３．６以上、２：３．８以上、２：４以上、２：４．２以上、２：４．５以上、２：４．８以上、２：５以上、２：６以上、２：７以上、２：８以上、２：９以上、２：１０以上、２：１１以上、又は２：１２以上であってよい。他の具現例として、前記重量比は、２：１２．５以下、２：１２以下、２：１１以下、２：１０以下、２：９以下、２：８以下、２：７以下、２：６以下、２：５．５以下、２：５以下、２：４．８以下、２：４．６以下、２：４．４以下、２：４．２以下、２：４以下、２：３．８以下、２：３．６以下、２：３．４以下、２：３．２以下、２：３以下、２：２．８以下、２：２．６以下、２：２．４以下、２：２．２以下、２：２以下、２：１．８以下、２：１．６以下、２：１．４以下、２：１．２以下、２：１以下、２：０．８以下、又は２：０．６以下であってよい。好ましくは、２：１．５〜５であってよい。
他の側面において、前記抽出物中のＧＣＧ：ＣＧの重量比は、１：０．０２〜０．３であってよい。一具現例として、前記重量比は、１：０．０２以上、１：０．０３以上、１：０．０４以上、１：０．０５以上、１：０．０８以上、１：０．１以上、１：０．１２以上、１：０．１５以上、１：０．１８以上、１：０．２以上、１：０．２３以上、１：０．２６以上、又は１：０．２８以上であってよい。他の具現例として、前記重量比は、１：０．３以下、１：０．２８以下、１：０．２６以下、１：０．２４以下、１：０．２２以下、１：０．２以下、１：０．１８以下、１：０．１６以下、１：０．１４以下、１：０．１２以下、１：０．１以下、１：０．０８以下、１：０．０６以下、１：０．０４以下、又は１：０．０３以下であってよい。好ましくは、１：０．０５〜０．３であってよい。
前記ＥＧＣＧ：ＧＣＧの重量比又はＧＣＧ：ＣＧの重量比が前記範囲を外れる場合、下記の脂肪代謝異常を予防又は改善する効果が微々たるものとなる、又は一般の緑茶抽出物と類似したものとなる。
一側面において、前記抽出物は、水、Ｃ１〜Ｃ６のアルコール、及びこれらの混合物のいずれか一種以上によって１回以上抽出した抽出物であってよい。一具現例として、前記アルコールはエタノールであってよい。他の具現例として、前記混合物の場合、アルコールの濃度が、２０％（ｖ／ｖ）以上、３０％（ｖ／ｖ）以上、４０％（ｖ／ｖ）以上、５０％（ｖ／ｖ）以上、６０％（ｖ／ｖ）以上、又は７０％（ｖ／ｖ）以上であってよい。また他の具現例として、前記混合物の場合、アルコールの濃度が、８０％（ｖ／ｖ）以下、７０％（ｖ／ｖ）以下、６０％（ｖ／ｖ）以下、５０％（ｖ／ｖ）以下、４０％（ｖ／ｖ）以下、又は３０％（ｖ／ｖ）以下であってよい。前記アルコール濃度の範囲を外れる場合、緑茶中の有効成分が十分に抽出できない、又は抽出された成分が変形及び破壊されることがある。
他の側面において、前記組成物中の前記抽出物の含量は、乾燥重量を基準に１重量％〜１００重量％であってよい。一具現例として、前記抽出物の含量は、１重量％以上、５重量％以上、１０重量％以上、２０重量％以上、３０重量％以上、４０重量％以上、５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上、又は９０重量％以上であってよい。他の具現例として、前記抽出物の含量は、１００重量％以下、９０重量％以下、８０重量％以下、７０重量％以下、６０重量％以下、５０重量％以下、４０重量％以下、３０重量％以下、２０重量％以下、１０重量％以下、５重量％以下、又は３重量％以下であってよい。
一側面において、前記有効成分の投与量は、乾燥重量を基準に５ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日であってよい。一具現例として、前記投与量は、５ｍｇ／ｋｇ／日以上、１０ｍｇ／ｋｇ／日以上、３０ｍｇ／ｋｇ／日以上、５０ｍｇ／ｋｇ／日以上、７０ｍｇ／ｋｇ／日以上、１００ｍｇ／ｋｇ／日以上、１２０ｍｇ／ｋｇ／日以上、１５０ｍｇ／ｋｇ／日以上、１８０ｍｇ／ｋｇ／日以上、２００ｍｇ／ｋｇ／日以上、２５０ｍｇ／ｋｇ／日以上、３００ｍｇ／ｋｇ／日以上、３５０ｍｇ／ｋｇ／日以上、４００ｍｇ／ｋｇ／日以上、５００ｍｇ／ｋｇ／日以上、６００ｍｇ／ｋｇ／日以上、７００ｍｇ／ｋｇ／日以上、８００ｍｇ／ｋｇ／日以上、又は９００ｍｇ／ｋｇ／日以上であってよい。他の具現例として、前記投与量は、１０００ｍｇ／ｋｇ／日以下、９００ｍｇ／ｋｇ／日以下、８００ｍｇ／ｋｇ／日以下、７００ｍｇ／ｋｇ／日以下、６００ｍｇ／ｋｇ／日以下、５００ｍｇ／ｋｇ／日以下、４５０ｍｇ／ｋｇ／日以下、４００ｍｇ／ｋｇ／日以下、３５０ｍｇ／ｋｇ／日以下、３００ｍｇ／ｋｇ／日以下、２５０ｍｇ／ｋｇ／日以下、２００ｍｇ／ｋｇ／日以下、１８０ｍｇ／ｋｇ／日以下、１５０ｍｇ／ｋｇ／日以下、１００ｍｇ／ｋｇ／日以下、５０ｍｇ／ｋｇ／日以下、２０ｍｇ／ｋｇ／日以下、１０ｍｇ／ｋｇ／日以下、又は８ｍｇ／ｋｇ／日以下であってよい。前記投与量の範囲を外れる場合、前記組成物にて所望の効果を達成できない、又は身体が耐え得ない急激な効果が生じることがある。
一側面において、前記組成物の投与経路は経口投与であってよい。
他の側面において、前記脂肪代謝異常は、肥満、高脂血症、及び脂肪肝からなる群より選ばれたいずれか一つに因るものであってよい。
また他の側面において、前記脂肪代謝異常は、体重増加、脂肪組織重量増加、肝組織中脂肪増加、血中中性脂肪増加、及び脂肪組織炎症増加からなる群より選ばれた一つ以上に因るものであってよい。本発明の一側面によって、特定成分の含量が増加した緑茶抽出物は、既存の緑茶抽出物に比べて体重の増加を顕著に抑制させ、これは、脂肪組織重量の顕著な減少に因ることであり、血中中性脂肪増加を顕著に抑制し、肝組織中の脂肪を効果的に減らし、ひいては、脂肪組織炎症反応を顕著に緩和させることを確認した（下記の実験例参照）。
また他の側面において、前記脂肪代謝異常は、ＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）発現増加又は脂肪組織中炎症に因るものであってよい。一具現例として、前記組成物は、アディポネクチンの発現を増加させるものであってよい。
本発明の一側面によって、特定成分の含量が増加した緑茶抽出物は、既存の緑茶抽出物に比べてＭＣＰ−１の発現を顕著に抑制し、且つ抗炎症効能を持つアディポネクチンの発現は顕著に増加させた。したがって、ＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）発現増加又は脂肪組織中炎症による脂肪代謝異常（例えば、肥満、体重増加など）を効果的に予防、治療及び改善できるわけである。
一側面において、当該組成物は、食品又は薬学組成物であってよい。
前記食品組成物の剤形は特に限定されないが、例えば、錠剤、顆粒剤、丸剤、粉末剤、ドリンク剤といった液剤、キャラメル、ゲル、バー、ティーバッグなどに剤形化されてよい。各剤形の食品組成物は、有効成分の他、当該分野において通常的に用いられる成分を剤形又は使用目的に応じて当業者が難なく適宜選定して配合してよく、他の原料と併せて適用した場合、相乗効果が生じることがある。また、前記食品は、健康機能食品であってもよい。
前記組成物は、単純摂取、飲用、注射投与、スプレー投与、又はスクイーズ投与などの様々な方法で投与されてよい。
本発明の一側面に係る食品組成物において、前記有効成分の投与量の決定は、当業者の水準内にあり、且つ投与しようとする対象の年齢、健康状態、合併症などの様々な要因に応じて異なり得る。
本発明の一側面に係る食品組成物は、例えば、チューイングガム、キャラメル製品、キャンデー類、氷果子類、お菓子類などの各種の食品類、清凉飲料、ミネラルウォーター、アルコール飲料などの飲料製品、ビタミンやミネラルなどを含む健康機能性食品類であってよい。
前記の他、本発明の一側面に係る食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含んでよい。その他、本発明の一側面に係る食品組成物は、天然果物ジュース並びに果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含んでよい。これらの成分は、独立で、或いは組み合わせて用いてよい。これらの添加剤の割合はそれほど重要ではないが、本発明の一側面に係る組成物１００質量部当たり０〜約６０重量部の範囲で含まれるのが一般的である。
本発明の一側面に係る前記薬学組成物は、経口、非経口、直腸、局所、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下などに投与されてよい。経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質及び硬質カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、液剤、乳濁剤又はペレット剤であってよいが、これらに制限されるものではない。非経口投与のための剤形は、溶液剤、懸濁剤、乳液剤、ゲル、注射剤、点滴剤、坐剤、パッチ、又はスプレーであってよいが、これらに制限されるものではない。前記剤形は、当該分野の通常的な方法に従い容易に製造することができ、界面活性剤、賦形剤、水和剤、乳化促進剤、懸濁剤、浸透圧調節のための塩又は緩衝剤、着色剤、香辛料、安定化剤、防腐剤、保存剤、又はその他常用する補助剤をさらに含んでよい。
本発明の一側面に係る前記組成物は、薬学的に許容可能な塩を含んでいてもよく、前記塩は、（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等といった無機酸から形成されるか；又は、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンテンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタン−ジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２，２，２］−ｏｃｔ−２−エン−１-カルボン酸、グルコヘプトン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸といった有機酸から形成される酸付加塩（ａｃｉｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｓａｌｔ）；又は、（２）親化合物に存在する酸性プロトンが置換されるときに形成される塩を含んでよい。
本発明の一側面に係る前記薬学組成物の適用量又は投与量は、投与を受ける対象の年齢、性別、体重、病理状態及びその深刻度、投与経路又は処方者の判断によって異なり得る。これらの因子に基づく有効成分の適用量の決定は当業者の水準内にある。
本発明は、また他の側面において、（１）緑茶に水分を調整しサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、及びロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．）からなる群より選ばれる一種以上の菌株を接種する段階；（２）４０〜６０℃で保持する段階；（３）７０〜８０℃で熟成する段階；及び（４）水及びＣ１〜Ｃ６のアルコールのいずれか一種以上を加え、５０℃〜８０℃で抽出する段階を含む、脂肪代謝異常の予防又は改善用組成物を製造する方法であってよい。
本発明は、また他の側面において、（１）緑茶に水分を調整しバチルス属の菌株を接種する段階；（２）４０〜６０℃で保持する段階；（３）７０〜８０℃で熟成する段階；及び（４）水及びＣ１〜Ｃ６のアルコールのいずれか一種以上を加え、５０℃〜８０℃で抽出する段階を含む、緑茶抽出物中の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）の含量を極大化させる方法に関するものであってよい。
一側面において、前記段階（１）の菌株は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｌｉｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｕｓ）、及びロイコノストック・メセントロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）からなる群より選ばれる一種以上であってよい。
一具現例として、前記菌株は、韓国食品研究院の「食品微生物遺伝子銀行」から分譲を受けた菌株であるか、その他研究機関の保有菌株又は常用化された菌株であってよく、具体的に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＡＴＣＣ９７６３）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、ＫＦＲＩ０００１２７）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｌｉｓ、Ｆ４０４１、Ｆ４１６３）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｕｓ、ＫＦＲＩ０００３４４）、及びロイコノストック・メセントロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、ＫＦＲＩ８１８）から選択された菌株であってよい。
他の具現例として、前記緑茶は、乾燥した緑茶葉、例えば、水分含量５重量％未満の乾葉を用いる場合、前記乾葉に水を加えて用いてよい。一側面において、前記水は、水が加えられた緑茶葉の総重量に対し、水分含量が２０重量％以上、２５重量％以上、３０重量％以上、３５重量％以上、４０重量％以上、５０重量％以上、６０重量％以上になるように加えてよい。他の側面において、前記水は、前記水分含量が７０重量％以下、６５重量％以下、６０重量％以下、５０重量％以下、４５重量％以下、３５重量％以下、３０重量％以下になるように加えてよい。前記範囲内で菌株の活性を増進させることができ、且つ緑茶葉の均一な品質保持及び易加工性を増進させることができる。水分含量が前記範囲未満である場合、緑茶葉の均一な品質保持が難しいことがあり、前記範囲を超える場合、緑茶葉同士がくっ付いて加工工程で問題が生じることがあり、最終製品の成分変化の原因にもつながり得る。
他の側面において、前記段階（２）の保持時間は、１２時間〜１２０時間であってよい。一具現例として、前記時間は、１２時間以上、２４時間以上、２８時間以上、３２時間以上、３４時間以上、３６時間以上、４０時間以上、４８時間以上、５０時間以上、６０時間以上、８０時間以上、又は１００時間以上であってよい。他の具現例として、前記時間は、１２０時間以下、１００時間以下、８０時間以下、６０時間以下、５０時間以下、４８時間以下、４０時間以下、３６時間以下、３４時間以下、３２時間以下、２８時間以下、２４時間以下、又は１８時間以下であってよい。
他の側面において、前記段階（３）の熟成時間は、２４〜６０時間であってよい。一具現例として、前記熟成時間は、２４時間以上、２６時間以上、２８時間以上、３０時間以上、３２時間以上、３４時間以上、３６時間以上、４０時間以上、４２時間以上、４４時間以上、４６時間以上、４８時間以上、５０時間以上、５２時間以上、５４時間以上、５６時間以上、又は５８時間以上であってよい。他の例として、前記熟成時間は、６０時間以下、５８時間以下、５６時間以下、５４時間以下、５２時間以下、５０時間以下、４８時間以下、４６時間以下、４４時間以下、４２時間以下、４０時間以下、３８時間以下、３６時間以下、３４時間以下、３２時間以下、３０時間以下、２８時間以下、又は２６時間以下であってよい。
一具現例として、前記段階（２）の保持時間及び段階（３）の熟成時間の一つ以上は、ＧＣＧ又はＣＧの含量を追跡（ｔｒａｃｋｉｎｇ）しながら決めてよい。
前記保持時間及び熟成時間を外れる場合、本発明の一側面に係る成分組成を有する抽出物が製造できないことがある。
一側面において、前記段階（２）の温度は、４０℃以上、４２℃以上、４４℃以上、４５℃以上、４８℃以上、５０℃以上、５２℃以上、５４℃以上、５５℃以上、５７℃以上、又は５８℃以上であってよい。他の側面において、前記段階（２）の温度は、６０℃以下、５８℃以下、５６℃以下、５４℃以下、５２℃以下、５０℃以下、４８℃以下、４６℃以下、４４℃以下、または４２℃以下であってよい。前記温度を外れる場合、十分な成分抽出が難しい又は抽出された成分の変性が起きることがある。
一具現例として、前記段階（３）の温度は、７０℃以上、７２℃以上、７４℃以上、７６℃以上、または７８℃以上であってよい。他の具現例として、前記段階（３）の温度は、８０℃以下、７８℃以下、７６℃以下、７４℃以下、又は７２℃以下であってよい。前記温度を外れる場合、十分な成分抽出が難しい又は抽出された成分の変性が起きることがある。
一具現例として、前記段階（４）の温度は、５０℃以上、５２℃以上、５４℃以上、５６℃以上、５８℃以上、６０℃以上、６２℃以上、６４℃以上、６６℃以上、６８℃以上、７０℃以上、７２℃以上、７４℃以上、７６℃以上、又は７８℃以上であってよい。他の具現例として、前記段階（４）の温度は、８０℃以下、７８℃以下、７６℃以下、７４℃以下、７２℃以下、７０℃以下、６８℃以下、６６℃以下、６４℃以下、６２℃以下、６０℃以下、５８℃以下、５６℃以下、５４℃以下、又は５２℃以下であってよい。前記温度を外れる場合、十分な成分抽出が難しい又は抽出された成分の変性が起きることがあり、最終結果物の効果が顕著に減少することがある。
以下、実施例、実験例、及び剤形例を挙げて本明細書の構成及び効果をより具体的に説明する。なお、これらの例は本明細書に対する理解を助けるための目的から例示したものに過ぎず、本明細書の範疇及び範囲が下記の例によって制限されるものではない。
［実施例１］ＧＣＧ含量が最大化した緑茶の製造
新鮮な茶の木（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ. Ｙａｂｕｋｉｔａ）の葉で作った緑茶（乾葉）に水を加え、水分含量を４０重量％に調整した。これにバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）５×１０６ｃｆｕ／ｇを接種し、５０℃で３日間保持させた。次いで、８０℃で３６〜４８時間熟成し、ＧＣＧ含量が最大化した緑茶を製造した。前記緑茶１００ｇに５０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液１０００ｍｌを加え、６０℃で３時間還流抽出し、ＧＣＧ含量が最大化した緑茶抽出物（収率３２％）を得た。なお、前記方法は一例に過ぎず、ＧＣＧ含量を極大化するための製造方法であれば如何なる方法でも適用可能である。
発酵緑茶抽出物のカテキン含量の比較のために、各サンプルをアライアンス（Ａｌｌｉａｎｃｅ）社製のＷＡＴＥＲＳ ２６９５ ＨＰＬＣで分析し、ＯＤＳ（Ｃ１８）カラムを用いて分析した。前記８０℃での保持時間に応じたＧＣＧを含むカテキン含量を表１に表し、この過程でのＧＣＧ含量を追跡（ｔｒａｃｋｉｎｇ）し、ＧＣＧが最も多量存在する時間帯を確認した。表１中の各数値は、抽出物の総重量に対する当該成分の重量％を示したものである。
（前記表中のＥＣＧは、エピカテキン３−Ｏ−ガレート）その結果、３６〜４８時間が最適であることが分かり、５日が経過すると、ＧＣＧ含量が顕著に低減することを確認した。前記抽出物は、一般の緑茶抽出物に比べて顕著に低いＥＧＣＧ含量（２．０８％）及び総カテキン（７．４４％）を含む反面、一般の緑茶抽出物には存在していないｎｏｎ−ｅｐｉｍｅｒ形態のＧＣＧが生成されるものと示された。このことから、前記過程を通じて特定成分（ＧＣＧ）の含量が増加しており、このような特定成分（ＧＣＧ）の含量が増加した緑茶抽出物の成分組成は緑茶抽出物のそれとは全く異なるといえる。
前記特定成分（ＧＣＧ）の含量が増加した緑茶抽出物に対し、ＧＣＧの含量が１〜５重量％であるときを基準に他の成分を確認した結果、総カテキンは１０重量％以下、ＥＧＣＧは０．８〜４重量％であると示され、ＣＧは０．１〜０．５重量％であると示された。
効能の比較のために、一般的な製造方法による緑茶抽出物（例えば、健康機能食品基準及び規格による告示型緑茶抽出物）を同一の条件で分析した。一般の緑茶抽出物と前記特定成分の含量が増加した緑茶抽出物の成分含量の比較のために、各サンプルをアライアンス（Ａｌｌｉａｎｃｅ）社製のＷＡＴＥＲＳ ２６９５ ＨＰＬＣで分析し、ＯＤＳ（Ｃ１８）カラムを用いて分析した。このような分析結果を下記の表２に表した。下記表中の数値は抽出物の総重量に対する当該成分の重量％（ｗ／ｗ）である。特定成分の含量が増加した緑茶抽出物の場合、前記表１の３６時間での数値を適用した。
（ＥＧＣはエピガロカテキン、ＥＣは（−）エピカテキン、ＥＣＧはエピカテキン３−Ｏ−ガレート）特定成分の含量が増加した緑茶抽出物には、一般の緑茶抽出物に比べて顕著に低いＥＧＣＧ（２．０８重量％）及び総カテキン（７．４４重量％）を含む反面、一般の緑茶抽出物には存在していないｎｏｎ−ｅｐｉｍｅｒ形態のＧＣＧが生成されることが分かった。このことから、特定成分の含量が増加した緑茶抽出物の成分組成は、緑茶抽出物のそれとは全く異なるといえる。
一方、時間や温度などの条件に応じた各成分の安定性を評価した結果、表３に表すように、ＥＧＣＧは、一定の期間以降にその含量が急減し総カテキン含量もそれに伴い低減したのに対し、ＧＣＧ及びＣＧは、相対的に安定して保持されることが分かった（図６〜図８参照）。
［実験例１］特定成分の含量が増加した緑茶抽出物による体重増加抑制
前記実施例１で収得した特定成分の含量が増加した緑茶抽出物による体重増加抑制効果を確認した。
具体的に、８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝９）を各群毎に区分して高脂肪食餌を摂取させながら、一般の緑茶抽出物、特定成分の含量が増加した緑茶抽出物を、それぞれ１５０ｍｇ／ｋｇずつ毎日１０週間経口投与し、１週毎に体重を測定した。一般の緑茶抽出物の投与群でも体重減少が観察されたが、特定成分の含量が増加した緑茶抽出物の投与群における体重減少率がより顕著に大きいことを観察した（図１）。
［実験例２］特定成分の含量が増加した緑茶抽出物による脂肪組織の重量減少効果
実験例１と同様な方法にて実験を行い、１０週後の剖検の際に副睾丸脂肪組織を摘出して重量を測定した。同量の特定成分の含量が増加した緑茶抽出物のほうが、一般の緑茶抽出物に比べ、高脂肪食餌による脂肪組織重量増加をより効率的に抑制したことが分かった（図２）。
［実験例３］特定成分の含量が増加した緑茶抽出物による脂肪肝改善
実験例１と同様な方法にて実験を行い、１０週後の剖検の際に肝組織を摘出して組織病理分析を行った。ホルムアルデヒドで固定後、Ｈ＆Ｅ ｓｔａｉｎｉｎｇをして脂肪に蓄積された脂肪を観察した。その結果、高脂肪食餌にて増加した肝組織中脂肪が、特定成分の含量が増加した緑茶抽出物によって減少しており、これは、同量の一般の緑茶抽出物の脂肪肝抑制効能よりも優れるものであった（図３）。
［実験例４］特定成分の含量が増加した緑茶抽出物による血中中性脂肪改善
実験例１と同様な方法にて実験を行い、１０週後の剖検の際に血液を抽出し、遠心分離にて血漿のみを抽出した。血漿から中性脂肪（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）のレベルを測定した結果、特定成分の含量が増加した緑茶抽出物が高脂肪食餌による血中中性脂肪増加を抑制し、これは、一般の緑茶抽出物の効能よりも優れるものであった（図４）。
［実験例５］特定成分の含量が増加した緑茶抽出物による脂肪組織炎症反応改善
肥満で誘導された脂肪組織増加は脂肪組織への炎症反応を伴うが、これは、肥満のような代謝疾患を引き起こすうえで重要な原因因子と目されている。実験例１と同様な方法にて実験を行い、１０週後に剖検し、脂肪組織から炎症反応に関連したサイトカインの発現を測定した。高脂肪食餌で増加した炎症性分泌物質であるＭＣＰ−１の発現は、特定成分の含量が増加した緑茶抽出物によって減少し、減少していた抗炎症効能を持つアディポネクチンの発現は増加していた。また、同効能は、既存の一般の緑茶抽出物の効能よりも優れることを観察した（図５）。
［剤形例１］軟質カプセル
前記実施例１に従い特定成分が増加した抽出物１５０ｍｇを準備し、ラクトース４４０ｍｇ、とうもろこし澱粉４３０ｍｇ、及びステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合して軟質カプセル充填液を製造した。そして、前記のものとは別に、ゼラチン６６重量部、グリセリン２４重量部、及びソルビトール液１０重量部の割合で軟質カプセルシートを製造し、前記充填液を充填して軟質カプセルを製造した。
［剤形例２］錠剤
前記実施例１に従い特定成分が増加した抽出物１５０ｍｇを準備し、ビタミンＥ １５ｍｇ、ビタミンＣ １５ｍｇ、ガラクトオリゴ糖２５０ｍｇ、乳糖６０ｍｇ、及び麦芽糖１４０ｍｇを混合してから、流動層乾燥機を利用して顆粒化した後、糖エステル（ｓｕｇａｒ ｅｓｔｅｒ）８ｍｇを添加した。該組成物を通常の方法にて打錠して錠剤を製造した。
［剤形例３］ドリンク剤
前記実施例１に従い特定成分が増加した抽出物８０ｍｇを準備し、ビタミンＥ ９ｍｇ、ビタミンＣ ９ｍｇ、ブドウ糖１０ｇ、クエン酸０．６ｇ、及び液状オリゴ糖２５ｇを混合してから、精製水４００ｍｌを加えて瓶に充填した。瓶に充填した後、３０℃で４〜５秒間殺菌してドリンク剤を製造した。
［剤形例４］顆粒剤
前記実施例１に従い特定成分が増加した抽出物１５０ｍｇを準備し、ビタミンＥ ９ｍｇ、ビタミンＣ ９ｍｇ、無水結晶ブドウ糖２５０ｍｇ、及び澱粉５５０ｍｇを混合してから、流動層造粒機を使用して顆粒に成形した後、包に充填して顆粒剤を製造した。
［剤形例５］健康食品
前記実施例１に従い特定成分が増加した抽出物１５０ｍｇを準備し、ビタミン混合物（ビタミンＡアセテート７０μｇ、ビタミンＥ １．０ｍｇ、ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ、ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ、ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ、ビタミンＢ１２ ０．２μｇ、ビタミンＣ １０ｍｇ、ビオチン１０μｇ、ニコチン酸アミド１．７ｍｇ、葉酸５０μｇ）と、無気質混合物（硫酸第一鉄１．７５ｍｇ、酸化亜鉛０．８２ｍｇ、炭酸マグネシウム２５．３ｍｇ、第一リン酸カリウム１５ｍｇ、第二リン酸カルシウム５５ｍｇ、クエン酸カリウム９０ｍｇ、炭酸カルシウム１００ｍｇ、塩化マグネシウム２４．８ｍｇ）と、を配合して健康食品を製造した。
［剤形例６］健康飲料
前記実施例１に従い特定成分が増加した抽出物５０ｍｇを準備し、クエン酸１０００ｍｇ、オリゴ糖１００ｇ、梅濃縮液２ｇ、タウリン１ｇ、残量として精製水を添加して９００ｍＬの健康飲料を製造した。

Claims (17)

  1. 組成物の総重量を基準に、１〜５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）、０．１〜０．５重量％の（−）−カテキンガレート（（−）−ｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＣＧ）、及び０．８〜４重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を有効成分として含む、脂肪代謝異常の予防又は改善用組成物。
  2. 前記抽出物中のＥＧＣＧ：ＧＣＧの重量比は、２：１．５〜５である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記抽出物中のＧＣＧ：ＣＧの重量比は、１：０．０５〜０．３である、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記抽出物は、水、Ｃ１〜Ｃ６のアルコール、及びこれらの混合物のいずれか一種以上によって１回以上抽出した抽出物である、請求項１に記載の組成物。
  5. 当該組成物中の前記抽出物の含量は、乾燥重量を基準に１重量％〜１００重量％である、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記有効成分の投与量は、乾燥重量を基準に５ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１に記載の組成物。
  7. 当該組成物の投与経路は、経口投与である、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記脂肪代謝異常は、肥満、高脂血症、及び脂肪肝からなる群より選ばれたいずれか一つに因る、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記脂肪代謝異常は、体重増加、脂肪組織重量増加、肝組織中脂肪増加、血中中性脂肪増加、及び脂肪組織炎症増加からなる群より選ばれた一つ以上に因る、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記脂肪代謝異常は、ＭＣＰ−１発現増加又は脂肪組織中炎症に因る、請求項１に記載の組成物。
  11. 当該組成物は、アディポネクチンの発現を増加させる、請求項１に記載の組成物。
  12. 当該組成物は、食品又は薬学組成物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. （１）緑茶に水分を調整しサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、及びロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．）からなる群より選ばれる一種以上の菌株を接種する段階；
    （２）４０〜６０℃で保持する段階；
    （３）７０〜８０℃で熟成する段階；及び
    （４）水及びＣ１〜Ｃ６のアルコールのいずれか一種以上を加え、５０℃〜８０℃で抽出する段階；を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の脂肪代謝異常の予防又は改善用組成物を製造する方法。
  14. 前記段階（１）の菌株は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｌｉｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｕｓ）、及びロイコノストック・メセントロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）からなる群より選ばれる一種以上である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記段階（２）の保持時間は、１２時間〜１２０時間である、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記段階（３）の熟成時間は、２４時間〜６０時間である、請求項１３に記載の方法。
  17. （１）緑茶に水分を調整しバチルス属菌株を接種する段階；
    （２）４０〜６０℃で保持する段階；
    （３）７０〜８０℃で熟成する段階；及び
    （４）水及びＣ１〜Ｃ６のアルコールのいずれか一種以上を加え、５０℃〜８０℃で抽出する段階；を含む、緑茶抽出物中の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）の含量を極大化させる方法。
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