JP2021500911A - アデノウイルス及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
特定のアデノウイルスへの曝露は、特定のアデノウイルス血清型に対する免疫応答をもたらし、アデノウイルスベクターの有効性に影響を及ぼす可能性がある。ヒトアデノウイルスによる感染はヒトにおいて一般的であるため、ヒト集団におけるヒトアデノウイルスに対する中和抗体の有病率は高い。個体におけるこのような中和抗体の存在は、ヒトアデノウイルス骨格に基づく遺伝子導入ベクターの有効性を低減すると予想され得る。有効性の低減を回避するための1つの方法は、中和抗体の標的であるアデノウイルスカプシドタンパク質上のエピトープを置き換えることである。カプシドタンパク質上の標的配列は、低い有病率であり、したがって中和抗体がヒト集団において希少である他のアデノウイルスに由来するタンパク質配列で置き換えられ得る。
免疫原性組成物は、本発明における使用のための免疫学的有効量の精製された又は部分的に精製されたヒト又はサル(例えば、チンパンジー)アデノウイルスベクターを含む組成物である。前記組成物は、当該技術分野においてよく知られる方法に従ってワクチン(「免疫原性組成物」とも称される)として製剤化され得る。このような組成物は、免疫応答を増強させるためのアジュバントを含み得る。製剤における各々の構成成分の最適な比は、本開示に鑑みて当業者によく知られる技術によって決定され得る。
本発明の別の一般的な態様は、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法に関する。方法は、例えば、本明細書に記載されるアデノウイルスベクター及び薬学的に許容される担体を含むワクチンを対象に投与することを含み得る。また、本明細書ではワクチンを作製する方法も提供される。方法は、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む。
本発明はまた、以下の非限定的な実施形態を提供する。
2つの新規のチンパンジーアデノウイルス単離物、BB21(JAd2−WTとも命名される)及びBB24(JAd3−WTとも命名される)が同定され、且つ配列決定された。チンパンジーアデノウイルス単離物は、系統学的にヒトアデノウイルス種E(HAdV−E)群に属することが見出された。BB21及びBB24の全ゲノムヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号11及び配列番号12であると決定された。BB21ヘキソン及びファイバーポリペプチド配列は、それぞれ配列番号5及び1であると決定された。BB24ヘキソン及びファイバーポリペプチド配列は、それぞれ配列番号6及び2であると決定された。BB21及びBB24ファイバーポリペプチド配列のアラインメントは、図15において提供される。
pBB21.dE1.dE3(配列番号13;図9)、pBB21.dE1.dE3.5IXP(配列番号14;図10)、pBB24.dE1.dE3(配列番号15;図11)、及びpBB24.dE1.dE3.5IXP(配列番号16;図12)は、単離物BB21及びBB24に基づく全長のE1及びE3欠失アデノウイルスベクターゲノムを保有するプラスミドである。これらのプラスミド内に含有されるAdベクターゲノム配列は、それぞれ配列番号26、配列番号27、配列番号28、及び配列番号29において記載される。これらのプラスミドの各々の内部において、アデノウイルスベクターゲノムは、2つのSwaI制限酵素部位に隣接する(すなわち、1つのSwaI部位が、ベクターゲノムいずれの末端にも位置する)。これらのSwaI部位は、好適なE1補完細胞(HEK293、911、及びPER.C6細胞など)のトランスフェクションによるウイルスレスキューの前にプラスミド骨格からのAdベクターゲノムの切除を容易にすることを意味する。これらのプラスミドによって構成されるAdベクターゲノムはさらに、E1欠失、E3欠失の位置、及び右逆位末端配列(RITR)に隣接して導入される特定の制限酵素部位を保有する。これらの制限酵素部位は、完全Adゲノムプラスミドの文脈において固有なものとして選択された。それらは、前記のそれぞれの位置又はその任意の組合せのいずれかで挿入される1つ以上の導入遺伝子発現カセットを保有するAdベクターの標準的な分子クローニング手法による容易な構築を可能にする「導入遺伝子挿入部位」となる。Adベクターの設計及びプラスミドの構築は、以下の節においてより詳細に記載される。
BB21及びBB24に基づくAdベクターゲノムはそれぞれ、E1欠失、E3欠失、異なる導入遺伝子挿入部位、並びに天然E4オープンリーディングフレーム(orf)6及びorf6/7のヒトアデノウイルス−5(HAdV−5)のものとの置換を含むように設計された。各アデノウイルスのE1領域は、AsiSI制限酵素部位配列を含む導入遺伝子挿入部位により欠失され、且つ置換された。各アデノウイルスのE3領域は、RsrII制限酵素部位配列を含む導入遺伝子挿入部位により欠失され、且つ置換された。別の導入遺伝子挿入部位は、各アデノウイルスの逆位末端配列(ITR)に隣接するPacI制限酵素部位配列の挿入によって作製された。E4 orf6及びorf6/7コード配列を含むBB21及びBB24配列は、それぞれ配列番号30及び配列番号40によって置換された。これらの置換配列は、ある種のAseI部位(クローニング目的のため)を排除する1つのサイレント変異を保有するように改変されたヒトアデノウイルス−5(HAdV−5)のE4 orf6及びorf6/7コード配列(GenBank配列AC_000008の塩基対32914−34077)を含む。
pBB21.dE1.dE3(配列番号13)は、遺伝子合成(GenScript;Piscataway、NJによって実施される)及び標準的な分子クローニング手順のいくつかの工程によって構築された。第一に、所望のAdベクターゲノムの右末端を含有する(すなわち、前述のE3欠失、部分的なE4配列置換、及びRITRに隣接する導入遺伝子挿入部位を内部に持つ)3576bp DNA断片(配列番号31)が合成され、EcoRI−AseI制限断片として、EcoRI及びNdeI消化pBR322(GenBank受入番号−J01749.1)に結合されて、BB21中間体プラスミド1を得た。第二に、所望のAdベクターゲノムの左末端を含有する(すなわち、前述のE1欠失を内部に持つ)4256bp断片(配列番号32)が合成され、SnaBI−EcoRI制限断片として、ZraI及びEcoRI消化BB21中間体プラスミド1に結合されて、BB21中間体プラスミド2を得た。第三に、中間のAdベクターゲノム断片を含有する4077bp断片(配列番号33)が合成され、EcoRI−HpaI制限断片として、EcoRI及びHpaI消化BB21中間体プラスミド2に結合されて、BB21中間体プラスミド3(配列番号34)を得た。第四に、BB21ウイルスゲノム(配列番号11)の18815bp AbsI−EcoRI制限断片が、AbsI及びEcoRI消化BB21中間体プラスミド3に結合されて、最終プラスミドpBB21.dE1.dE3(配列番号13)を得た。
pBB24.dE1.dE3(配列番号15)は、遺伝子合成(GenScriptによって実施される)及び標準的な分子クローニング手順のいくつかの工程によって構築された。第一に、所望のAdベクターゲノムの左及び右末端を含有する(すなわち、前述のE1欠失、E3欠失、部分的なE4配列置換、及びRITRに隣接する導入遺伝子挿入部位を内部に持つ)8144bp DNA断片(配列番号41)が合成され、MfeI−AseI制限断片として、EcoRI及びNdeI消化pBR322(GenBank受入番号−J01749.1)に結合されて、BB24中間体プラスミド1(配列番号42)を得た。第二に、BB24ウイルスゲノム(配列番号12)の22482bp NdeI−EcoRI制限断片が、NdeI及びEcoRI消化BB24中間体プラスミド1に結合されて、最終プラスミドpBB24.dE1.dE3を得た。
それぞれアデノウイルスベクターゲノム配列配列番号38、配列番号39、配列番号46、及び配列番号47を含む、アデノウイルスベクターBB21.FLuc(JAd2NVT003とも命名される)、BB21.RSVF−2A−GLuc(JAd2NVT001とも命名される)、BB24.FLuc(JAd3NVT003とも命名される)、及びBB24.RSVF−2A−GLuc(JAd3NVT001とも命名される)は、対応するAdベクターゲノムプラスミド(すなわち、pBB21.FLuc、pBB21.RSVF−2A−GLuc、pBB24.FLluc、及びpBB24.RSVF−2A−GLuc)のE1補完PER.C6細胞へのトランスフェクションによって作製された。10%ウシ胎仔血清(FBS)及び10mM MgCl2が補充されたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中の接着細胞培養物として増殖されたPER.C6細胞へのトランスフェクションの前に、Adベクターゲノムプラスミドは、SwaIで消化されて、プラスミドから対応するアデノウイルスベクターゲノムを放出した。トランスフェクションは、リポフェクタミントランスフェクション試薬(Invitrogen;Carlsbad、CA)を用いて標準的な手順に従って実施された。ウイルスレスキュートランスフェクションの回収後、PER.C6細胞培養物に対する複数回の連続的な感染ラウンドによって、ウイルスをさらに増幅した。ウイルスを、以前に記載された2工程の塩化セシウム(CsCl)密度勾配超遠心法を用いて粗製のウイルス回収物から精製した(Havenga et al.,「Novel replication−incompetent adenoviral B−group vectors:high vector stability and yield in PER.C6 cells」,J.Gen.Virol.87(8):2135−43(2006))。ウイルス粒子(VP)力価は、以前に記載された分光光度法に基づく手順によって測定された(Maizel et al.,「The polypeptides of adenovirus:I.Evidence for multiple protein components in the virion and a comparison of types 2,7A,and 12」,Virology, 36(1):115−25(1968))。
ヘキソン、又はヘキソン及びファイバー配列において改変されているヒトアデノウイルス4型(HAdV−4)に基づく複製能力がないアデノウイルスベクターを作製するために、E1及びE3欠失、導入遺伝子挿入、並びに下記のとおりのヘキソン及び/又はファイバー置換を内部に持つ完全HAdV−4ベクターゲノムを保有するプラスミドを構築した。導入遺伝子発現カセットを、ベクターのE1欠失に挿入した。HEK293又はPER.C6などのE1補完細胞株へのプラスミドのトランスフェクションは、カプシドタンパク質(ヘキソン、又はヘキソン及びファイバー)が、ある種の類人猿アデノウイルス単離物に由来する異種配列によって置換されているHAdV−4に基づくベクターのレスキューをもたらした。Adベクタープラスミドの設計及び構築は、以下の節において記載される。
ベクター設計及び構築のために使用されるHAdV−4単離物の完全な配列(35990bp)は、以前に決定された(配列番号17)。
ヘキソン及びファイバーコード配列が、類似のHAdV−4がヒトAd種Eに割り当てられているある種のチンパンジーアデノウイルス単離物のもので置換されたHAdV−4に基づくベクターゲノムプラスミドが構築された。これらの構築のためのヘキソン配列ドナーとして機能するアデノウイルス単離物は、部分的なヘキソンヌクレオチド配列が以前にGenBankにおいて(それぞれJN163971及びJN163983の下で)寄託されたPtroAdV−1及びPtroAdV−13である。構築のために使用されるファイバー配列は、本明細書の実施例1において記載される新規のチンパンジーアデノウイルス単離物BB21及びBB24に由来した。ヘキソン及びファイバー配列置換の2つの異なる組合せが、(HAdV−4に基づくベクターゲノムプラスミドの文脈において)作製された:(1)PtroAdV−1ヘキソンヌクレオチド配列は、BB24ファイバーをコードするヌクレオチド配列(配列番号2)と組み合わされ且つ(2)PtroAdV−13ヘキソンヌクレオチド配列は、BB21ファイバー変異体(配列番号58)をコードするヌクレオチド配列と組み合わされた。ヘキソン及びファイバー配列置換の前記第1の組合せを保有する構築されたプラスミドは、それぞれ配列番号51、配列番号52、及び配列番号53に記載されるとおりのAdベクターゲノム配列を内部に持つpAd4.Ptr01.BB24.5orf6(配列番号21;図13)、pAd4.Ptr01.BB24.5orf6.Fluc(配列番号19)、及びpAd4.Ptr01.BB24.5orf6.RSVF−2A−Gluc(配列番号50)である。ヘキソン及びファイバー配列置換の前記第2の組合せを保有する構築されたプラスミドは、それぞれ配列番号55、配列番号56、及び配列番号57に記載されるとおりのAdベクターゲノム配列を含有するpAd4.Ptr13.BB21.5orf6(配列番号22;図14)、pAd4.Ptr13.BB21.5orf6.Fluc(配列番号20)、及びpAd4.Ptr13.BB21.5orf6.RSVF−2A−Gluc(配列番号54)である。
それぞれアデノウイルスベクターゲノム配列配列番号52、配列番号53、配列番号56、及び配列番号57を含む、アデノウイルスベクターAd4Ptr01−BB24.Fluc(Ad4C1NVT003とも命名される)、Ad4Ptr01−BB24.RSVF−2A−GLuc(Ad4C1NVT001とも命名される)、Ad4Ptr13−BB21.Fluc(Ad4C2NVT003とも命名される)、及びAd4Ptr13−BB21.RSVF−2A−GLuc(Ad4C2NVT001とも命名される)は、それぞれSwaI消化AdベクターゲノムプラスミドであるpAd4.Ptr01.BB24.5orf6.FLuc、pAd4.Ptr01.BB24.5orf6.RSVF−2A−GLuc、pAd4.Ptr13.BB21.5orf6.FLuc、及びpAd4.Ptr13.BB21.5orf6.RSVF−2A−GLucのE1補完PER.C6細胞へのトランスフェクションによって作製された。同様に、対照アデノウイルスベクターのAd4.FLuc及びAd4.RSVF−2A−GLucはそれぞれ、プラスミドpAd4.FLuc及びpAd4.RSVF−2A−GLucから作製された。全てのトランスフェクション並びにその後のベクター増幅、精製、及びタイトレーションは、本明細書の実施例1におけるBB21及びBB24に基づくベクターに関して記載されたものと同じ標準的な手順に従ってなされた。
(記載されるとおりに構築されたカプシドタンパク質のヘキソン及びファイバー置換を有する)ホタルルシフェラーゼを発現する組換えアデノウイルスを使用して、カプシドタンパク質のヘキソン及びファイバーの類人猿アデノウイルス由来の相同タンパク質による置換が、抗HAdV−4中和活性を有するヒト血清試料による中和において低減をもたらしたかどうかを判定した。
実施例3〜8は、本明細書で生成された4つの新規のベクターであるアデノウイルスベクターBB21、BB24、Ad4Ptr13−BB21、及びAd4Ptr01−BB24の免疫原性を評価するために実施された実験を記載する。これらの実験では、筋肉内免疫後のマウスにおいて、ベクターにコードされる(モデル)抗原に対する体液性及び細胞性免疫応答を誘導する能力について新規のベクターが評価された。ベクターは、2つの異なる抗原:ホタルルシフェラーゼ(FLuc)及びRSV−FA2−2A−GLuc(RSVF−2A−GLuc)を用いて試験された。RSVF−2A−GLucは、呼吸器多核体ウイルス株A2融合糖タンパク質、口蹄疫ウイルス2Aペプチド、及びガウシアルシフェラーゼ(GLuc)で構成されるキメラタンパク質である。各ベクターは、同じ抗原をコードする導入遺伝子カセットを保有するヒトアデノウイルス26型(HAdV−26、本明細書ではAd26とも称される)に基づくベンチマークベクターと並べて比較された。それぞれの抗原に対する免疫応答は、酵素免疫スポットアッセイ(ELISPOT)、酵素結合免疫吸着測定(ELISA)、及びRSVF−2A−GLuc抗原の場合は呼吸器多核体ウイルス中和アッセイ(VNA)などのよく知られる免疫学的アッセイを用いて測定された。
新規のアデノウイルスベクターBB21及びBB24の細胞性免疫原性を評価するために、Balb/Cマウスを、Ad26.FLuc(陽性対照)、ホタルルシフェラーゼを発現するBB21若しくはBB24ベクター(すなわち、BB21.FLuc又はBB24.FLuc)、又は導入遺伝子をコードしないアデノベクター(空のAd26)で筋肉内において免疫化した。投与のために2つのベクター用量が試験された:マウス毎に109及び1010ウイルス粒子(vp)。免疫化の2週間後、マウスを屠殺し、脾細胞を単離した(図1A)。細胞性免疫応答を、15量体の重複FLucペプチドプールによる一晩の脾細胞刺激後にIFN−γ分泌細胞の相対的な数を測定するエクスビボELISPOTアッセイによって決定した(図1B)。結果は、高用量の免疫化(1010)で、BB21.Fluc及びBB24.Flucにより誘導される細胞性免疫応答が、Ad26.Flucに関して見られる応答とほとんど同程度に高かったことを示す。対照的に、低用量の免疫化(109)で、BB21.Fluc及びBB24.Flucの両方が、Ad26.Flucより高い応答をもたらした。全体的に見て、本発明のFLuc発現組換えBB21及びBB24アデノウイルスベクターにより誘導される細胞性免疫応答は、明らかにマウスにおけるこれらのベクターの強力な免疫原性を示している。
新規の操作されたアデノウイルスベクターAd4Ptr13−BB21の細胞性免疫原性を評価するために、Balb/Cマウスを、それぞれホタルルシフェラーゼ(Fluc)を発現するAd4Ptr13−BB21、Ad26(陽性対照)、若しくはAd4(Ad4Ptr13−BB21の親ベクター)、又は導入遺伝子をコードしないアデノベクターである空のAd26で筋肉内において免疫化した。投与のために2つのベクター用量が試験された:マウス毎に109及び1010ウイルス粒子(vp)。免疫化の2週間後、BB21.Fluc及びBB24.Flucに関して使用されたものと同じ実験構成に従って(図1A)、マウスを屠殺し、脾細胞を単離した。細胞性免疫応答を、15量体の重複FLucペプチドプールによる一晩の脾細胞刺激後にIFN−γ分泌細胞の相対的な数を測定するエクスビボELISPOTアッセイによって決定した(図2)。結果は、高用量の免疫化(1010)で、Ad4Ptr13−BB21.FLucにより誘導される細胞性免疫応答が、ベンチマーク対照ベクターAd26.Flucに関して見られるものとほとんど同程度に高かったが、低用量の免疫化(109)で、Ad4Ptr13−BB21.FLucは、Ad26.Flucより若干高い応答をもたらしたことを示す。
新規の操作されたアデノウイルスベクターAd4Ptr01−BB24.FLucの細胞性免疫原性を評価するために、Balb/Cマウスを、Ad26.FLuc(陽性対照)、FLucを発現するAd4Ptr01−BB24、又は導入遺伝子をコードしないアデノベクターである空のAd26で筋肉内において免疫化した。投与のために2つの用量が試験された:マウス毎に109及び1010ウイルス粒子(vp)。免疫化の2週間後、BB21.Fluc及びBB24.Flucに関して使用されたものと同じ実験構成に従って(図1A)、マウスを屠殺し、脾細胞を単離した。細胞性免疫応答を、15量体の重複FLucペプチドプールによる一晩の脾細胞刺激後にIFN−γ分泌細胞の相対的な数を測定するエクスビボELISPOTアッセイによって決定した(図3)。結果は、高用量で、Ad4Ptr01−BB24.FLucは、明らかにコードされた抗原に対する細胞性免疫応答を誘導し、陽性対照ベクターAd26.Flucについて見られたものに近いがいくぶん低い読み取り値を有したことを示す。
新規のアデノウイルスベクターBB21の免疫原性はさらに、ベクターにコードされた(モデル)ワクチン抗原としてRSV−FA2−2A−GLuc(RSVF−2A−GLuc)を用いて評価された。Balb/Cマウスを、Ad26.RSVF−2A−GLuc(陽性対照)若しくはBB21.RSVF−2A−GLuc(両方ともにマウス毎に108、109及び1010ウイルス粒子)、又はAd26.FLuc若しくはBB21.FLuc(両方ともにマウス毎に1010ウイルス粒子)で筋肉内において免疫化した。8週目にマウスを屠殺し、血清試料及び脾細胞を回収した(図4A)。様々な免疫パラメータを下記のとおりに評価した。
新規のアデノウイルスベクターBB24の免疫原性はさらに、ベクターにコードされた(モデル)ワクチン抗原としてRSV−FA2−2A−GLuc(RSVF−2A−GLuc)を用いて評価された。Balb/Cマウスを、Ad26.RSVF−2A−GLuc(陽性対照)、BB24.RSVF−2A−GLuc、若しくはAd48.RSVF−2A−GLuc(それぞれマウス毎に108、109及び1010ウイルス粒子)又はAd26.FLuc、BB24.FLuc、若しくはAd48.FLuc(それぞれマウス毎に1010ウイルス粒子)で筋肉内において免疫化した。BB21.RSVF−2A−GLucのために使用された同じ実験構成に従って(図4A)、免疫化後8週目にマウスを屠殺し、血液及び脾細胞を回収した。様々な免疫パラメータを下記のとおりに評価した。
新規の操作されたアデノウイルスベクターAd4Ptr01−BB24及びAd4Ptr13−BB21のそれぞれの免疫原性はさらに、ベクターにコードされた(モデル)ワクチン抗原としてRSV−FA2−2A−GLuc(RSVF−2A−GLuc)を用いて評価された。Balb/Cマウスを、Ad26.RSVF−2A−GLuc(陽性対照)、Ad4Ptr01−BB24.RSVF−2A−GLuc、若しくはAd4Ptr13−BB21.RSVF−2A−GLuc(それぞれマウス毎に108、109及び1010ウイルス粒子)又はAd26.FLuc、Ad4Ptr01−BB24.FLuc、若しくはAd4Ptr13−BB21.FLuc(それぞれマウス毎に1010ウイルス粒子)で筋肉内において免疫化した。BB21.RSVF−2A−GLucのために使用された同じ実験構成に従って(図4A)、免疫化後8週目に血液試料及び脾細胞を回収した。様々な免疫パラメータを下記のとおりに評価した。
新規のアデノウイルスワクチンベクターとしてのそれらの潜在的な有用性に関して、本明細書で作製される新規アデノウイルスベクターは、好ましくは、ヒトアデノウイルス血清型HAdV−5及びHAdV−35に基づくベクターなどの、ワクチンベクターとして現在既に開発中の既存のアデノウイルスベクターとは血清学的に異なるであろう。したがって、交差中和試験を、HAdV−4、HAdV−5、HAdV−26、HAdV−35及びHAdV49に基づく新規のアデノウイルスベクターであるBB21、BB24、Ad4Ptr13−BB21、及びAd4Ptr01−BB24並びにいくつかの既存のベクター間で実施した。この目的のため、これらのアデノウイルスベクターの1つに対してそれぞれ産生されるマウス抗血清は、アデノウイルス中和アッセイにおいて各種ベクターの各々に対して試験された。このアッセイのために使用されるマウス抗血清は、マウス当たり1010ベクター粒子によるそれらの免疫化の2週間又は8週間後にBalb/Cマウスから回収された。アデノウイルス中和アッセイは、以前に記載されたとおりに行われた(Spangers et al 2003.J.Clin.Microbiol.41:5046−5052)。簡潔に述べると、1:16の希釈度から始めて、血清を2倍ずつ段階希釈し、続いてホタルルシフェラーゼ(FLuc)を発現するアデノウイルスベクターと事前に混合した後、A549細胞とともに(細胞当たり500個のウイルス粒子の感染の多重度で)一晩インキュベートした。感染の24時間後に測定された感染細胞ライセートにおけるルシフェラーゼ活性レベルは、ベクター感染効率を表した。所与のベクターに対する中和力価は、ベクター感染効率の90%の低減をもたらすことができる最高の血清希釈度として定義された。中和力価は、以下のカテゴリーに任意に分けられた:<16(中和なし)、16〜200、200〜2,000、及び>2,000。
有効なワクチンベクターとしてのそれらの潜在的な使用のために重要なことは、本明細書に記載される新規のアデノウイルスベクターが、ワクチン標的集団における高レベルの既存の抗ベクター体液性免疫によって妨げられないことである。したがって、ベクターBB21、BB24、Ad4Ptr13−BB21、及びAd4Ptr01−BB24はそれぞれ、米国(US)及び欧州連合(EU)に居住する18歳〜55歳までの成人に由来する200名のヒトコホート血清試料内のそれらの血清有病率について評価された。各ベクターは、実施例9において実行され且つ以前に記載されたとおりの標準的なアデノウイルス中和アッセイを実施することによって、ヒト血清試料による中和について試験された(Sprangers et al 2003.J.Clin.Microbiol.41:5046−5052)。簡潔に述べると、1:16の希釈度から始めて、血清を2倍ずつ段階希釈し、続いてホタルルシフェラーゼ(FLuc)を発現するアデノウイルスベクターと事前に混合した後、A549細胞とともに(細胞当たり500個のウイルス粒子の感染の多重度で)一晩インキュベートした。感染の24時間後に測定された感染細胞ライセートにおけるルシフェラーゼ活性レベルは、ベクター感染効率を表した。所与のベクターに対する中和力価は、ベクター感染効率の90%の低減をもたらすことができる最高の血清希釈度として定義された。中和力価は、以下のカテゴリーに任意に分けられた:<16(中和なし)、16〜300、300〜1,000、1000〜4000及び>4000。
臨床試験及びそれ以降に使用されるアデノウイルスベクターは、スケーラブルな無血清アデノウイルス生産プラットフォームで高力価まで容易に生産可能である必要がある。本明細書で懸濁PER.C6細胞又はsPER.C6とも呼ばれる懸濁適応PER.C6(登録商標)細胞は、バイオリアクターでのアデノウイルスベクターの大規模製造を支援し、高力価で臨床グレードのベクター製剤、例えば、HAdV−26又はHAdV−35に基づくE1欠損ベクターを大量にもたらすことが示されているため、このようなプラットフォームとなる(欧州特許第2536829B1号明細書、欧州特許第2350268B1号明細書)。
Claims (27)
- 配列番号1のアミノ酸6〜375と少なくとも98%の同一性を有するファイバーポリペプチドをコードする単離された核酸配列。
- 前記ファイバーポリペプチドが、BB21ファイバーポリペプチド(配列番号1)、BB21ファイバー変異体ポリペプチド(配列番号58)、又はBB24ファイバーポリペプチド(配列番号2)から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の単離された核酸配列。
- 前記単離された核酸配列がさらに、配列番号3又は配列番号4から選択されるアミノ酸配列を含むヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含むヘキソンポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項1又は2に記載の単離された核酸配列。
- 前記ヘキソンポリペプチドが、BB21ヘキソンポリペプチド(配列番号5)又はBB24ヘキソンポリペプチド(配列番号6)から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項3に記載の単離された核酸配列。
- 配列番号3又は配列番号4から選択されるアミノ酸配列を含むヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含むヘキソンポリペプチドをコードする単離された核酸配列。
- 前記ヘキソンポリペプチドが、BB21ヘキソンポリペプチド(配列番号5)又はBB24ヘキソンポリペプチド(配列番号6)から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の単離された核酸配列。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
- アデノウイルスベクターであり、且つ導入遺伝子をさらに含む、請求項7に記載のベクター。
- 請求項7又は8に記載のベクターを含む組換え細胞。
- (a)請求項9に記載の組換え細胞を、前記ベクターを産生するための条件下で増殖させること;
(b)前記組換え細胞から前記ベクターを単離することを含む、
ベクターを作製する方法。 - 請求項8に記載のベクターを含む免疫原性組成物。
- 必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、請求項11に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- (a)少なくとも1つの導入遺伝子;及び
(b)ファイバーポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターであって、前記ファイバーポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸6〜375と少なくとも98%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、アデノウイルスベクター。 - 前記ファイバーポリペプチドが、BB21ファイバーポリペプチド(配列番号1)、BB21ファイバー変異体ポリペプチド(配列番号58)、又はBB24ファイバーポリペプチド(配列番号2)から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項13に記載のアデノウイルスベクター。
- 配列番号3又は配列番号4から選択されるアミノ酸配列を含むヘキソン超可変領域包含ポリペプチドを含むヘキソンポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項13又は14に記載のアデノウイルスベクター。
- 前記ヘキソンポリペプチドが、BB21ヘキソンポリペプチド(配列番号5)又はBB24ヘキソンポリペプチド(配列番号6)から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項15に記載のアデノウイルスベクター。
- 前記アデノウイルスベクターがさらにE1欠失を含む、請求項13〜16のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
- 前記アデノウイルスベクターがさらにE3欠失を含む、請求項13〜17のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
- 前記アデノウイルスベクターが、1種以上のヒトアデノウイルス核酸配列を含むキメラアデノウイルスベクターである、請求項13〜18のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
- 前記ヒトアデノウイルス核酸配列が、ヒトアデノウイルス−4、ヒトアデノウイルス−5、ヒトアデノウイルス−26、又はヒトアデノウイルス−35に由来する、請求項19に記載のアデノウイルスベクター。
- 前記アデノウイルスベクターが、ヒトアデノウイルス−5(hAdV−5)E4 orf6を含む、請求項20に記載のアデノウイルスベクター。
- 前記導入遺伝子が、前記E1欠失部位、前記E3欠失部位、又は右逆位末端配列(rITR)に隣接して位置する、請求項13〜21のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
- 前記アデノウイルスベクターが、配列番号26、配列番号27、配列番号28、及び配列番号29からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項13〜22のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
- 前記アデノウイルスベクターが、配列番号51又は配列番号55から選択される核酸配列を含む、請求項13〜14及び17〜23のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
- 請求項13〜24のいずれかに記載のアデノウイルスベクター及び薬学的に許容される担体を含むワクチン。
- 必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、請求項25に記載のワクチンを前記対象に投与することを含む、方法。
- 請求項13〜24のいずれかに記載のアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む、ワクチンを作製する方法。
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