JP2021168650A - 微生物学においてコロニーカウンターに適用される画像処理方法 - Google Patents

Abstract

【課題】計数性能が改善され、使用が単純化されたコロニーカウンターを提供する。【解決手段】試料中に存在するコロニーの計数装置（３０）において、固体栄養培地および前記試料を収容にするように配設された支持体を収容するように設けられたスペースを備え、一つの検出機構（３５）によって形成された第１および第２の検出機構を含む装置であって、処理ユニット（３６）が、明視野構成において、拡散明表面（１４）による拡散暗表面（２４）の置換、暗視野構成については電界発光ダイオード（２３）の消灯、明視野構成については電界発光ダイオード（１３）の点灯、暗視野構成において、拡散暗表面（２４）による拡散明表面（１４）の置換、明視野構成については電界発光ダイオード（１３）の消灯、暗視野構成については電界発光ダイオード（２３）の点灯、を選択的に制御するように配設されている、装置（３０）。【選択図】図７

Description

本発明は、成長培地中の微生物の検出の分野に関する。本発明は、特に微生物学的分析および品質管理に利用される。本発明はさらに、環境、農産物加工、薬理学、化粧品学、および研究開発の分野においても利用可能である。

本発明は、詳細には、微生物学におけるコロニーカウンターに応用される画像処理方法に関する。

コロニー計数は今日でもなお、少なくない件数が、播種された培地内で目視により観察されるコロニーの手作業による計数によって行なわれている。

それでも、技術的現状においては、予め播種された培地を含む試料の画像を獲得し、その後、獲得した画像を処理してコロニー数を決定することに基づくコロニーの計数装置が存在する。

こうして、トレイの表面上に並んで位置付けされた播種済み試料全体の上部表面を中に含む範囲を走査するように配設された、スキャナタイプの検出システムを含む微生物検出装置について記述している欧州特許第２８０７４８４号明細書が公知である。

その後、画像は、コロニーを識別し計数するために画像処理ソフトウェアによって分析される。このタイプの器具の欠点は、分析対象の試料の各々が、獲得に必要な全時間にわたり照明に付されるということにある。したがって、感光性の微小コロニーを計数する際または感光性マーカーを使用する際には、このタイプの装置を使用することができない。

このタイプの装置の別の欠点は、焦点距離を調整できる光学系が備わっていない場合、培地の支持体が全ての試料について同一であることが必要となるという点にある。装置が焦点距離の調整を可能にする光学系を有する場合、試料全体の獲得に必要な時間は著しく増大することになる。

仏国特許第３０６２１３３号明細書は、試料が播種された培地の中に存在するコロニーの最終的な数の計数に必要な時間を削減し、かつ計数誤差率を低減させることのできる器具および方法を提案することによって、前述の欠点を解決しようとするものである。

しかしながら、時として複雑である予備調節を、微小コロニーに応じて器具上で実施しなければならない。

現在コロニーカウンター上では、複数の公知の光条件調節、特に英語のｄａｒｋ ｆｉｅｌｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙにあたる暗視野観察法の名称で知られている調節が使用されている。

暗視野観察法では、試料の照明は、対物レンズの反対側（透過型）、同じ側（反射型）さらには側面にあってよい。例えば、暗視野観察法は、黒の背景で下側から至近に配置された光を用いて得られる。このタイプの観察法は、全ての小さい粒子または拡散した要素を照らすことができるため、性能が良いが、例えば織物繊維または塵埃など、多くのアーチファクトを出現させる。

白色背景または明視野透過型観察法タイプの調節も同様に使用されている。この調節は、影を目立たせながら、光を吸収するあらゆる障害物の検出を可能にする。明視野透過型観察法は、過度の閃光または反射を創出しないため、非常にロバストであるが、例えば細菌が過度に小さいかまたはそのコントラストが欠如している場合など、一部の事例において感度が不足している。

先に引用したコロニーカウンター上では、ユーザは、いくつかのパラメータを調節しなければならず、コロニーを計数するためのアルゴリズムのタイプおよび照明を定める調節を創出しなければならない。これらのステップは、これらの機械の使用を複雑化する。

欧州特許第２８０７４８４号明細書 仏国特許第３０６２１３３号明細書

本発明の目的は、コロニーカウンターとも呼ばれるコロニーの計数装置の使用を単純化することにある。

本発明の別の目的は、特に、あらゆる細菌叢が探求され同一試料上に極めて多様なコロニーを計数する必要のある、環境計数に関する計数性能を改善することにある。

本発明の第１の態様によると、試料および固体栄養培地を収容するように配設された支持体内に置かれた前記試料の中に存在するコロニーを計数する方法において、
− 明視野構成において前記支持体から透過され前記第１の収集機構によって収集された光からの、第１の検出機構による明視野画像の生成ステップと、
− 暗視野構成において前記支持体から拡散され前記第１の収集機構によって収集された光からの、第２の検出機構による暗視野画像の生成ステップと、
− ２つの画像オペランドの組合せによって得られる、処理ユニットによるいわゆる融合画像の生成ステップであって、画像オペランドの一方がそれぞれ明視野または暗視野画像の反転画像であり、他方の画像オペランドがそれぞれ暗視野または明視野画像である、ステップと、
− 融合画像の処理からの、処理ユニットによるコロニー数を数えるステップと
を含む方法が提案されている。

第１の検出機構および第２の検出機構は、同一であっても明確に異なるものであってもよい。検出機構は例えば、マトリックス光電センサであってもよい。

融合画像を生成するように構成された処理ユニット、およびコロニーの数を数えるように構成された処理ユニットは、同一であっても明確に異なるものであってもよい。処理ユニットは、例えば記憶手段が備わった計算ユニットであり得る。

有利には、融合画像の生成は、２つの画像オペランドの線形組合せ、好ましくは加算によって得ることができる。当然のことながら、複数の画像オペランドを使用してもよく、各々の画像オペランドは、明視野タイプまたは暗視野タイプであり得る。例えば、不透明培地の枠内で性能が良い上からの照明など、他の照明を使用することが可能である。融合画像の処理は、既定の閾値に基づく融合画像の閾値処理を含むことができる。

他の１つの可能性によると、画像の処理は、融合画像からコロニーの数を数えるために駆動されるニューラルネットワークによって実現され得る。

本発明の第２の態様によると、固体栄養培地および前記試料を収容するように配設された支持体を収容するように設けられたスペースを備えた、試料中に存在するコロニーを計数する装置において、
− 明視野構成において前記スペースから、すなわち前記試料が支持体内に存在する場合にはこの試料を通って透過され前記第１の収集機構によって収集された光から、明視野画像を生成するように配設された第１の検出機構と、
− 暗視野構成において前記スペースから、すなわち前記試料が支持体内に存在する場合にはこの試料を通って拡散され前記第１の収集機構によって収集された光から、暗視野画像を生成するように配設された第２の検出機構と、
− ２つの画像オペランドの組合せによって得られる、いわゆる融合画像を生成するように配設された処理ユニットであって、画像オペランドの一方がそれぞれ明視野または暗視野画像の反転画像であり、他方の画像オペランドがそれぞれ暗視野または明視野画像である、処理ユニットと、
− 融合画像の処理からのコロニーの数を数える用ユニットと
を含む装置が提案されている。

有利には、第１および第２の検出機構は、一つの検出機構によって形成されており、処理ユニットは、明視野構成においては、拡散明表面による拡散暗表面の置換、暗視野構成についての電界発光ダイオードの消灯、明視野構成についての電界発光ダイオードの点灯、暗視野構成においては、拡散暗表面による拡散明表面の置換、明視野構成についての電界発光ダイオードの消灯、暗視野構成についての電界発光ダイオードの点灯、を選択的に制御するように配設されている。

１つの可能性によると、第１および第２の検出機構は、明視野構成のための明表面と同時に暗表面も形成する拡散装置をさらに含む一つの検出機構によって形成されている。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明を読む間に明らかとなるものであり、この説明を理解する上で以下の添付図面が参照されるものとする。

図１は、本発明に係る明視野観察法の調節の側面図である。 図２は、図１に係る調節における画素の光度レベルのグラフの図である。 図３は、本発明に係る暗視野観察法の調節の側面図である。 図４は、図３に係る調節における画素の光度レベルのグラフの図である。 図５は、図４の反転のグラフの図である。 図６は、図２および図５の図の重ね合せの画素の光度レベルのグラフの図である。 図７は、本発明に係る装置の一実施形態の概略的な図である。

以下で説明する実施形態は全く限定的なものではないことから、特に、技術的利点を付与するため、または以前の技術的現状から本発明を区別するために特徴の選択が十分なものである場合には、記載されその後他の記載の特徴から切り離されたこの特徴の選択しか含まない、本発明の変形形態を考慮することが可能であろう。この選択には、構造的な細部を含まないか、または技術的利点を付与するためにもしくは以前の技術的現状から本発明を区別するために単独で十分である場合には構造的細部の一部分しか伴わない、好ましくは機能的な少なくとも１つの特徴が含まれる。

以下の説明中、同一の構造または類似の機能を有する要素は、同じ参照番号で呼称されるものとする。

ここで、試料中に存在するコロニーの計数方法について説明する。

図１を参照すると、明視野観察法の器具１０が概略的に表現されている。

観察法の器具１０には、分析対象の試料を含むペトリ皿１２を収容するように配設された支持体１１が備わっている。

観察法の器具１０にはさらに、複数の電界発光ダイオード１３、つまり英語のＬｉｇｈｔ−Ｅｍｉｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅの略であるＬＥＤ、白色表面の拡散器１４、およびマトリクス光電センサ１５が装備されている。

複数の電界発光ダイオード１３および拡散器１４は両方共、ペトリ皿１２との関係において、マトリックス光電センサの反対側に配置されている。

異なる装置は、マトリックス光電センサ１５およびペトリ皿１２が拡散器１４により拡散された光の円錐１６の中にくるような形で、配設されている。円錐は、図中に、点線で表されている。

同様に、ペトリ皿内にコロニーが不在の状態で電界発光ダイオード１３が点灯された場合、マトリックス光電センサ１５によって形成される画像は、白色背景の画像である。

マトリックス光電センサ１５の検出表面上でｘおよびｙに配置された画素の光の強度を、Ｉｆｃ（ｘ，ｙ）と記すことができる。

したがって、マトリックス光電センサ１５である第１の収集機構は、明視野構成で試料により透過された光を収集し明視野画像を生成するように配設される。

図２は、光学軸を備えたマトリックス光電センサ１５の検出表面の縦列（または横列）に沿った画素の強度レベルを例示する。

光の強度Ｉは、縦座標に表されており、一方縦列（または横列）の異なる画素は横座標に表されている。

ここで考察できるように、コロニーが不在の場合、光の強度は、Ｉｃｍａｘと記される、ほぼ２５５に等しい最大値を有する。

一時的に、光の強度は、場合によっては異なるもののＩｆｃｍａｘよりも低い、Ｉｆｃ１、Ｉｆｃ２、Ｉｆｃ３およびＩｆｃ４と記される他の値を有する。

グラフ上では、以下の順序の関係が指摘される。Ｉｆｃ１＜Ｉｆｃ２＜Ｉｆｃ３＜Ｉｆｃ４

値Ｉｆｃ１は、ここではＩｆｃ１＜Ｉｆｃｍａｘとして、マトリックス光電センサ１５が直接受け取る光の遮蔽の存在を示す。

値Ｉｆｃ１に対応する位置ｘ１にコロニーが存在すると推測することができる。

値Ｉｆｃ３およびＩｆｃ４はＩｆｃｍａｘに近いことから、位置ｘ３およびｘ４にはコロニーが存在しないと推測することができる。

値Ｉｆｃ２は、Ｉｆｃ１とそれぞれＩｆｃ３またはＩｆｃ４の値との中間であることから、Ｉｆｃ２に対応する位置ｘ２でのコロニーの存在は疑わしい可能性がある。実際、位置ｘ２は例えば、コロニーの存在ではなくペトリ皿の不透明度の欠如に対応する可能性がある。

それを超えると強度Ｉｆｃがコロニーの存在を示唆するとみなされず、それより下では強度Ｉｆｃがコロニーの存在を示唆するとみなされる閾値Ｉｆｃｓ＜Ｉｆｃｍａｘを決定することにより、閾値処理によって判定を行うことができると考えられる。

グラフ上では、以下の順序の関係が指摘される。Ｉｆｃ１＜Ｉｆｃｓ＜Ｉｆｃ２＜Ｉｆｃ３＜Ｉｆｃ４

この場合、以下の通り判定されるだろう。ｘ１におけるコロニーの存在、ｘ２、ｘ３およびｘ４におけるコロニーの不在。

本発明によると、このような閾値を定めることは有用ではない。

図３を参照すると、暗視野観察法の器具２０が概略的に表されている。

観察法の器具２０には、栄養培地および分析対象の播種済み試料を含むペトリ皿２２を収容するように配設された支持体２１が備わっている。

ペトリ皿２２に関連してより詳細には、位置ｘ１、ｘ２、ｘ３、ｘ４に対応する複数の要素が、ペトリ皿の中味の実体を概略的に表すために言及されている。

以下でより良く理解できるように、黒丸で表された位置ｘ１およびｘ４は、大規模なコロニーの存在を示し、位置ｘ２はより抑えられたコロニーの存在を示し、一方、位置ｘ３はアーチファクトを表す。

観察法の器具２０にはさらに、複数の電界発光ダイオード２３、つまり英語のＬｉｇｈｔ−Ｅｍｉｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅの略であるＬＥＤ、黒色表面の拡散器２４および光学軸を備えたマトリクス光電センサ２５が装備されている。

複数の電界発光ダイオード２３および拡散器２４は両方共、ペトリ皿２２との関係において、マトリックス光電センサの反対側に配置されている。

電界発光ダイオード２３の各々は、収集器２５の光学軸に対して６０°超の角度を成す発光軸を有する。

異なる装置は、マトリックス光電センサ２５が光の円錐内に入らず、ペトリ皿１２が拡散器１４により拡散された光の円錐１６内に入るような形で配設されている。円錐は、図中に、点線で表されている。

同様に、ペトリ皿内にコロニーが不在の状態で、電界発光ダイオード２３が点灯された場合、マトリックス光電センサ２５によって形成される画像は、いかなる光線も直接センサ２５に到達しないことから、黒色背景の画像である。

マトリックス光電センサ２５の検出表面上でｘおよびｙに配置された画素の光の強度を、Ｉｄｆ（ｘ，ｙ）と記すことができる。

したがって、マトリックス光電センサ２５である第２の収集機構は、暗視野構成において試料により拡散された光を収集し暗視野画像を生成するように配設される。

図４は、マトリックス光電センサ２５の検出表面の縦列（または横列）に沿った画素の強度レベルを例示する。

光の強度Ｉｄｆは、縦座標に表されており、一方縦列（または横列）の異なる画素は横座標に表されている。

グラフ上では、以下の順序の関係が指摘される。Ｉｄｆ１＝Ｉｄｆ４＞Ｉｄｆ２＞Ｉｄｆ３

値Ｉｄｆ１およびＩｄｆ４は、マトリックス光電センサ２５による直接的な光の拡散およびその受光の存在を示す。

値Ｉｄｆ３は０に近いことから、位置ｘ３にはコロニーが存在しないと推測することができる。

値Ｉｄｆ２はＩｄｆ１と０との中間であることから、Ｉｄｆ２に対応する位置ｘ２でのコロニーの存在は疑わしい可能性がある。実際、位置ｘ２は例えば、コロニーの存在ではなく、ペトリ皿の不透明度の欠如に対応する可能性がある。

それを超えると強度Ｉｄｆがコロニーの存在を示唆するとみなされ、それより下では強度Ｉｄｆがコロニーの不在を示唆するとみなされる閾値Ｉｄｆｓを決定することにより、閾値処理によって判定を行うことができると考えられる。

グラフ上では、以下の順序の関係が指摘される。Ｉｄｆ１＝Ｉｄｆ４＞Ｉｄｆｓ＞Ｉｄｆ２＞Ｉｄｆ３

この場合、以下の通り判定されるだろう。ｘ１およびｘ４におけるコロニーの存在、ｘ２、ｘ３におけるコロニーの不在。

本発明によると、このような閾値を定めることは有用ではない。

その上、使用される技術に応じて、結果は同じではないということが指摘される。
− 明視野観察法の調節では、ｘ１にコロニーの存在、ｘ２、ｘ３およびｘ４ではコロニーの不在、
− 暗視野観察法の調節では、ｘ１およびｘ４でコロニーの存在、ｘ２、ｘ３ではコロニーの不在

本発明によると、図５に表されているように、暗視野の反転グラフＩｄｆｉｎｖが処理ユニット（図示せず）によって生成される。

反転グラフＩｄｆｉｎｖは、例えば、Ｉｄｆｍａｘ＝２５５で、Ｉｄｆｉｎｖ（ｘ，ｙ）＝Ｉｄｆｍａｘ−Ｉｄｆ（ｘ，ｙ）のような変換によって得ることができる。

その後、本発明によると、画像Ｉｄｆｉｎｖおよび画像Ｉｆｃの加算により、処理ユニットによって、いわゆる融合画像Ｉｆを生成するが、これはＩｆ（ｘ，ｙ）＝Ｉｄｆｉｎｖ（ｘ，ｙ）＋Ｉｆｃ（ｘ，ｙ）と書き表すことができる。このような融合画像は、図６に表されているグラフを呈示し得る。

このようにして得た画像Ｉｆで、画像Ｉｆｃの４つの位置ｘ１〜ｘ４および画像Ｉｄｆの４つの位置ｘ１〜ｘ４に対応する４つの位置ｘ１、ｘ２、ｘ３、ｘ４を観察できる。

グラフ上では、以下の順序の関係が指摘される。Ｉｆ１＝Ｉｆ４＜Ｉｆ２＜Ｉｆ３

同様に、コロニーの位置のマーカーとしてｘ１およびｘ４を取り上げることが可能であるが、その一方でこのことは、明視野で得られた画像しか考慮しない場合には当てはまらなかった。すなわち、暗視野での結果と明視野での結果を関係付けすることによって、判定を改善することが可能となる。

それより下では強度Ｉｆがコロニーの存在を示唆するとみなされ、それを超えると強度Ｉｆがコロニーの不在を示唆するとみなされる閾値Ｉｆｓを決定することにより、閾値処理によって判定を行うことができると考えられる。

グラフ上では、以下の順序の関係が指摘される。Ｉｆ１＝Ｉｆ４＜Ｉｆ２＜Ｉｆｓ＜Ｉｆ３

この場合、以下の通り判定されるだろう。ｘ１およびｘ４ならびにｘ２におけるコロニーの存在、ｘ３におけるコロニーの不在。

処理ユニットは、融合画像の閾値処理から、コロニーの数を数えるように構成され得る。

上述の実施例では、暗視野構成で得た画像の反転画像が使用された。当然のことながら、明視野構成で得た画像の反転画像を決定し、これを暗視野で得た画像に加算することもできる。

上述の実施例では、単純化を理由として、一次元のみに沿った強度の変動が表された。

当然のことながら、１つの曲線によってではなくむしろ１つの表面での強度レベルの変動を例示することができる。実際、センサ１５および２５は、二次元で画像を形成するマトリクスセンサである。

上述の実施例では、画素により強度の変動を表した。本発明を色の変化に拡張することも同様に可能である。

より一般的には、融合画像を２つの画像オペランドの組合せによって得ることができ、画像オペランドの一方はそれぞれ明視野または暗視野画像の反転画像であり、もう一方の画像オペランドはそれぞれ暗視野または明視野画像である。

したがって、例えば、同じ正負符号のＣ１およびＣ２が例えば、０〜１であり、Ｃ１およびＣ２の２つの絶対値の和が１に等しいものとして、Ｉｆ（ｘ，ｙ）＝Ｃ１×Ｉｆｃ（ｘ，ｙ）＋Ｃ２×Ｉｄｆｉｎｖ（ｘ，ｙ）と書き表すことができる。

図７により例示されているように、２つの構成にしたがって同一であるここでは３５と記された検出機構および処理ユニット３６を含む、試料中に存在するコロニーの計数装置３０を想定する本発明に係る一実施形態が表されている。

処理ユニット３６は、以下のものを選択的に制御するように配設されている。
− 明視野構成において、
〇 拡散明表面１４による拡散暗表面２４の置換、
〇 電界発光ダイオード２３の消灯、
〇 電界発光ダイオード１３の点灯、
〇 試料により透過され検出機構３５により収集された光からの明視野画像の生成。
− 暗視野構成において、
〇 拡散暗表面２４による拡散明表面１４の置換、
〇 電界発光ダイオード１３の消灯、
〇 電界発光ダイオード２３の点灯、
〇 試料により拡散され検出機構３５により収集された光からの暗視野画像の生成。

１つの可能性によると、拡散明表面および拡散暗表面は、一方のモードから他方のモードに交互に移行することを可能にする材料で、同じ表面によって実現され得る。このとき、上記置換ステップを実施する必要はもはや無い。

処理ユニット３６は、さらに、いわゆる融合画像を生成しコロニーの数を数えるように構成されている。

当然のことながら、互いに矛盾するか排他的なものではないかぎり、さまざまな組合せにしたがって、本発明の異なる特徴、形態、変形形態および実施形態を互いに結び付けることが可能である。特に、以上で説明した変形形態および実施形態は全て互いに組合せ可能である。

１０ 明視野観察法の器具
１１ 支持体
１２ ペトリ皿
１５ 第１の検出機構
２０ 暗視野観察法の器具
２１ 支持体
２２ ペトリ皿
２５ 第２の検出機構
３０ コロニーの計数装置
３５ 検出機構
３６ 処理ユニット

Claims (6)

1. 試料および固体栄養培地を収容するように配設された支持体内に置かれた前記試料の中に存在するコロニーを計数する方法において、
   − 明視野構成において前記支持体から透過され前記第１の収集機構によって収集された光からの、第１の検出機構（１５）による明視野画像の生成ステップと、
   − 暗視野構成において前記支持体から拡散され前記第１の収集機構によって収集された光からの、第２の検出機構（２５）による暗視野画像の生成ステップと、
   − ２つの画像オペランドの組合せによって得られる、処理ユニット（３６）によるいわゆる融合画像の生成ステップであって、画像オペランドの一方がそれぞれ明視野または暗視野画像の反転画像であり、他方の画像オペランドがそれぞれ暗視野または明視野画像である、ステップと、
   − 融合画像の処理からの、処理ユニット（３６）によるコロニーの数を数えるステップと
   を含む方法。
2. 融合画像の生成が、２つの画像オペランドの線形組合せ、好ましくは加算によって得られる、請求項１に記載の方法。
3. 融合画像の処理が、既定の閾値に基づく融合画像の閾値処理を含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 固体栄養培地および前記試料を収容するように配設された支持体を収容するように設けられたスペースを備えた、試料中に存在するコロニーの計数装置（３０）において、
   − 明視野構成において前記スペースから透過され前記第１の収集機構によって収集された光から、明視野画像を生成するように配設された第１の検出機構（１５、３５）と、
   − 暗視野構成において前記スペースから拡散され前記第１の収集機構によって収集された光から、暗視野画像を生成するように配設された第２の検出機構（２５，３５）と、
   − ２つの画像オペランドの組合せによって得られる、いわゆる融合画像を生成するように配設された処理ユニット（３６）であって、画像オペランドの一方がそれぞれ明視野または暗視野画像の反転画像であり、他方の画像オペランドがそれぞれ暗視野または明視野画像である、処理ユニットと
   を含み、
   − 処理ユニットがさらに、融合画像からコロニーの数を数えるように構成されている
   計数装置（３０）。
5. 試料中に存在するコロニーの計数装置（３０）において、第１および第２の検出機構が、明視野構成については明表面（１４）および電界発光ダイオード（１３）、明視野構成については暗表面（２４）および電界発光ダイオード（２３）をさらに含む一つの検出機構（３５）によって形成されており、処理ユニット（３６）は、明視野構成においては、拡散明表面（１４）による拡散暗表面（２４）の置換、暗視野構成についての電界発光ダイオード（２３）の消灯、明視野構成についての電界発光ダイオード（１３）の点灯、暗視野構成においては、拡散暗表面（２４）による拡散明表面（１４）の置換、明視野構成についての電界発光ダイオード（１３）の消灯、暗視野構成についての電界発光ダイオード（２３）の点灯、を選択的に制御するように配設されている、計数装置（３０）。
6. 第１および第２の検出機構が、明視野構成のための明表面（１４）と同時に暗表面（２４）も形成する拡散装置をさらに含む一つの検出機構（３５）によって形成されている、請求項５に記載の計数装置（３０）。

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