JP2021127294A - ヒトノロウイルス不活化剤 - Google Patents

Abstract

【課題】ＨＮＶの不活化に有効なＨＮＶ不活化剤、及びその使用法を提供する。【解決手段】過炭酸ナトリウムを含有する組成物を有効成分とするＨＮＶ不活化剤であって、過炭酸ナトリウム濃度が０．０２質量％以上となるように水に溶解して使用される、ＨＮＶ不活化剤。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトノロウイルス（ＨＮＶ）の不活化剤に関する。

ノロウイルスは、カリシウイルス科、ノロウイルス属に分類されているエンベロープ（膜状構造）を持たないＲＮＡウイルスであり、酸性（胃酸）に対して強い抵抗力を有し、少量（１０〜１００個程度）で感染することが知られている。
現状では、ノロウイルスに対するワクチンや治療薬は存在しないことから、ウイルスが付着し得る調理器具、衣服、手指等を洗浄・消毒することによる除ウイルスやウイルス不活性化により感染を予防することが重要である。

ノロウイルスは、物理化学的抵抗性が強いため、多くの細菌類に対して有効であるエタノールやカチオン界面活性剤を含む消毒剤等もノロウイルスに対しては一般的な使用法において十分な効果を得られない場合がある。そのため、ノロウイルスの不活化には、塩素系消毒剤（次亜塩素酸ナトリウム等）やヨード剤（ポビドンヨード等）、アルデヒド剤（グルタラール等）、過酢酸製剤等が使用されている。しかし、塩素系消毒剤等では繊維の色柄等を漂白する作用があり、繊維製品や衣類への使用においては制限が生じるという問題がある。

過炭酸ナトリウムは水溶液中で炭酸ナトリウムと過酸化水素に解離し漂白力を発揮することから、酸素系漂白剤として用いられている。過炭酸ナトリウムの漂白力は穏やかで扱いやすく、塩素系漂白剤とは異なり色柄衣類にも使えるという利点がある。

ところで、従来、ヒトに感染するノロウイルスは、実験室における培養系が確立されていなかったため、ノロウイルスの不活化効果を評価するために、その代替ウイルスとして、同じカリシウイルス科のネコカリシウイルス（ＦＣＶ）や、マウスノロウイルス（ＭＮＶ）が用いられていた。しかしながら、ＦＣＶは下痢症感染症でなく呼吸器感染症を引き起こすウイルスであり酸やアルカリに弱く、ＨＮＶとの違いも多数報告されている。また、ＭＮＶはＨＮＶを初めとする他のエンベロープウイルスと比較してアルコールに著しく弱いことが報告されている（非特許文献１）。実際に、非特許文献２では昨今確立されたＨＮＶの培養系において、一部の代替ウイルスにおいて効果があるように思われてきたアルコールはＨＮＶの不活化には不十分であることが報告された。

従来、過炭酸ナトリウムを含有する組成物の水溶液にＦＣＶに対して不活化作用があるという報告が存在するが（特許文献１、非特許文献３，４）、上記の事情を考慮すると、特許文献１と非特許文献３、４でＦＣＶへの効果が報告された過炭酸ナトリウムを含有する組成物の水溶液が、実際にＨＮＶに対してその効果を十分に発揮し得るのかは確かではない。

特開２０１５−７８４７９号公報

Cromeans Theresa et al., Appl. Environ. Microbiol. 80.18 (2014): 5743-5751. Costantini, Veronica, et al. "Human norovirus replication in human intestinal enteroids as model to evaluate virus inactivation." Emerging infectious diseases 24.8 (2018): 1453. Seiichi Tobe et al., J. Oleo Sci. 61, (4) 211-216 (2012) 高木弘隆,杉山知良・医学と薬学・第57巻第3号311-312・2007年3月

本発明は、ＨＮＶの不活化に有効なＨＮＶ不活化剤、及びその使用法を提供することに関する。

２０１６年に、腸管上皮と似た三次元構造体であるヒト小腸オルガノイドｈＳＩＯ：ｈｕｍａｎ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ｏｒｇａｎｏｉｄを用いてＨＮＶの培養に成功したこと（Science,353(6306),1387-1393,2016 Sep23）を受け、本発明者らは、ｈＳＩＯを立体培養し３Ｄオルガノイドを得た後に、３Ｄオルガノイドを分散させて単一細胞を調整し、前記単一細胞を細胞外マトリクス上で単層培養・分化誘導して得られる腸管オルガノイドにＨＮＶを感染させた評価系を構築し、これを用いて酸素系漂白剤を評価したところ、過炭酸ナトリウムが一定濃度以上となるように酸素系漂白剤を使用した場合に、ＨＮＶに対する不活化効果が発揮されることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）〜２）に係るものである。
１）過炭酸ナトリウムを含有する組成物を有効成分とするＨＮＶ不活化剤であって、過炭酸ナトリウム濃度が０．０２質量％以上となるように水に溶解して使用される、ＨＮＶ不活化剤。
２）過炭酸ナトリウムを含有する組成物及び水を含有する処理液に、ＨＮＶで汚染された対象物を浸漬する工程を含む、ＨＮＶの不活化方法であって、処理液中の過炭酸ナトリウム濃度が０．０２質量％以上である、方法。

本発明によれば、衣類、繊維品、調理器具等に付着したＨＮＶを確実に不活化でき、ＨＮＶ感染の拡大を防止又は低減することができる。

＜組成物＞
本発明の組成物は、過炭酸ナトリウムを含有する。
本発明のＨＮＶ不活化剤は、過炭酸ナトリウムによりＨＮＶ不活化効果を発揮し得る。斯かる観点から、過炭酸ナトリウムとしては、有効酸素濃度が９〜１３質量％の過炭酸ナトリウムを用いるのが好ましい。尚、有効濃度は、過マンガンカリウム標準水溶液を用いて２０℃で測定できる。または、ＪＩＳ Ｌ０８８９付属書Ａに記載の方法でも有効酸素濃度は測定できる。

本発明の組成物中における過炭酸ナトリウムの含有量は、ＨＮＶ不活化効果の点から、好ましくは２０質量％以上であって、より好ましくは２５質量％以上、より好ましくは３５質量％以上であり、また、好ましくは９０質量％以下であって、より好ましくは８０質量％以下、より好ましくは７０質量％以下である。また、好ましくは２０〜９０質量％、より好ましくは２５〜８０質量％、より好ましくは３５〜７０質量である。なお、組成物中の過炭酸ナトリウムの濃度は、組成物の調製時の質量比率から求めることができる。

本発明の組成物は、ウイルス不活性化効果を向上させる点から、アルカリ剤を含むことが好ましい。
アルカリ剤としては、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸二水素塩、リン酸水素二塩、及びリン酸三塩から選択される少なくとも１種であることが望ましく、また、ナトリウム塩、カリウム塩及びアンモニウム塩から選択される少なくとも１種の塩であることが望ましい。
斯かるアルカリ剤のうち、好ましくは、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、リン酸三カリウムが挙げられ、より好ましくは、炭酸ナトリウムである。
尚、炭酸ナトリウムとしては、ライト灰、デンス灰等を用いることができる。このうち、平均粒径３００±２００μｍ、更に３００±１００μｍのデンス灰が好ましい。

組成物中のアルカリ剤の含有量は、好ましくは１質量％以上、より好ましくは２質量％以上、より好ましくは１０質量％以上であり、また、好ましくは６０質量％以下、より好ましくは５５質量％以下、より好ましくは５０質量％以下である。また、好ましくは１〜６０質量％、より好ましくは２〜５５質量％、より好ましくは１０〜５０質量％である。

本発明の組成物は、漂白活性化剤を含有することができる。
ここで、漂白活性化剤とは、無機過酸化物と反応することで有機過酸を生成する化合物を意味する。漂白活性化剤としては、疎水性漂白活性化剤が好ましい。具体的には、下記一般式(１)で表されるエステル結合を有する化合物が挙げられる。
Ｒ^１−Ｃ（＝Ｏ）−ＬＧ （１）
〔式中、Ｒ^１は、炭素数８〜１４の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基若しくはアルケニル基、アリール基、又はアルキル基置換アリール基であり、好ましくは炭素数１０〜１４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基である。ＬＧは脱離基である。〕

脱離基ＬＧとしては、例えば、

〔式中、Ｒ^２は２価の飽和炭化水素基を示し、ｐは０又は１を示し、Ｍは水素原子又はアルカリ金属を示す。〕
が挙げられる。なお、Ｒ^３の炭素数は１〜５が好ましい。

漂白活性化剤は、一般式（１）で表される化合物に限定されず、従来一般に用いられてきた漂白活性化剤を用いることができる。
漂白活性化剤としては、テトラアセチルエチレンジアミン、グルコースペンタアセテート、テトラアセチルグリコールウリル、アルカノイル若しくはアルケノイル（これらの基の炭素数は８〜１４）オキシベンゼンカルボン酸又はその塩、アルカノイル又はアルケノイル（これらの基の炭素数は８〜１４）オキシベンゼンスルホン酸塩が挙げられ、アルカノイル若しくはアルケノイル（これらの基の炭素数は８〜１４、漂白効果の点から好ましくは１０〜１４）オキシベンゼンカルボン酸又はその塩、アルカノイル又はアルケノイル（これらの基の炭素数は８〜１４、ＨＮＶ不活化効果の点から好ましくは１０〜１４）オキシベンゼンスルホン酸塩が好ましく、中でもデカノイルオキシベンゼンカルボン酸又はそのナトリウム塩、ドデカノイルオキシベンゼンスルホン酸又はそのナトリウム塩が好ましい。これら漂白活性化剤は、任意の１種又は２種以上の組み合わせを用いることができる。

本発明の組成物中における漂白活性化剤の含有量は、好ましくは０．１質量％以上であって、より好ましくは０．５質量％以上であり、また、好ましくは２０質量％以下であって、より好ましくは１５質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である。また、好ましくは０．１〜２０質量％、より好ましくは０．５〜１５質量％、より好ましくは０．５〜１５質量％である。

本発明の組成物は、界面活性剤を含有することができる。
界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤のいずれをも使用することができる。

ここで、非イオン界面活性剤としては、脂肪族アルコールにアルキレンオキサイドを付加してなる化合物が挙げられ、中でも下記一般式（２）で表される非イオン界面活性剤が好ましい。
Ｒ^３−Ｏ−［（ＥＯ）_ａ／（ＰＯ）_ｂ］−Ｈ （２）
〔式中、Ｒ^３は炭素数が８以上、好ましくは１０以上、より好ましくは１２以上、そして、２２以下、好ましくは１８以下、より好ましくは１４以下のアルキル基、好ましくは直鎖のアルキル基を示す。ＥＯはエチレンオキシ基、ＰＯはプロピレンオキシ基を示す。ａ及びｂは平均付加モル数であって、ａは０以上２０以下の数を示し、ｂは０以上２０以下の数を示し、両者が同時に０となることはない。〕
また、一般式(２)において、ＥＯ基及びＰＯ基が、ランダム及びブロックのいずれの態様で結合していてもよい。

カチオン界面活性剤としては、下記一般式（３）で表される第４級アンモニウム塩が好ましく用いられる。

〔式中、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７は、少なくとも１つが直鎖又は分岐鎖の炭素数６以上、２０以下、好ましくは８以上、１８以下のアルキル基又はアルケニル基を示し、残りが炭素数１以上、３以下アルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。また、Ｌ⁻は有機又は無機の陰イオン基を示す。〕

これら第４級アンモニウム塩の具体例としては、以下の化合物が挙げられる。

〔式中、ｈは６以上、２０以下、好ましくは８以上、１８以下の数、ｇ及びｄは同一又は異なって、それぞれ独立に、６以上、２０以下、好ましくは８以上、１８以下の数を示し、Ｒ^８は炭素数１以上、３以下のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示し、Ｑ⁻は、有機又は無機の陰イオン基、好ましくは、Ｃｌ⁻、Ｂｒ⁻等のハロゲンイオン、ＣＨ_３ＳＯ_４ ⁻、ＣＨ_３ＣＨ_２ＳＯ_４ ⁻等のアルキルサルフェートイオン、又はＣ_１１Ｈ_２３ＣＯＯ⁻、ＣＨ_３ＣＯＯ⁻等の脂肪酸イオンを示す。〕

これらの中でも、ジオクチルジメチルアンモニウム塩、ジデシルジメチルアンモニウム塩、ジドデシルジメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルジメチルエチルアンモニウム塩、及びヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩からなる群から選択されるカチオン界面活性剤が好ましい。

両性界面活性剤としては、カルボベタイン、スルホベタイン、ヒドロキシスルホベタインなどが挙げられる。

アニオン界面活性剤としては、アルキル硫酸エステル塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸又はその塩、アルカンスルホン酸又はその塩、飽和又は不飽和脂肪酸塩、アルキル又はアルケニルエーテルカルボン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸エステルなどが挙げられる。これらの中でもアルキルベンゼンスルホン酸又はその塩が好ましい。

本発明の組成物中における界面活性剤の含有量は、ウイルス除去性を確保する観点から、好ましくは０．５質量％以上であって、より好ましくは０．７５質量％以上、より好ましくは１質量％以上であり、また、好ましくは１５質量％以下であって、より好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。また、好ましくは０．５〜１５質量％、より好ましくは０．７５〜１０質量％、より好ましくは１〜６質量％、更に好ましくは１〜３質量％である。

本発明の組成物は、更にポリマーとしてアクリル酸系重合体を含有することができる。
アクリル酸系重合体としては、アクリル酸、メタクリル酸及びそれらの塩から選ばれる一種以上の単量体〔以下、アクリル酸系単量体という〕に由来する単量体構成単位を有する重合体が挙げられ、前記アクリル酸系単量体の単独重合体又は前記アクリル酸系単量体を単量体構成単位として含む共重合体を挙げることができる。
前記アクリル酸系単量体の単独重合体としては、アクリル酸、メタクリル酸及びその塩から選ばれる単量体の単独重合体を挙げることができる。前記アクリル酸系単量体の共重合体としてはアクリル酸、メタクリル酸及びそれらの塩から選ばれる少なくとも１種と、これら化合物と共重合可能な不飽和結合を有する化合物、より好ましくはビニル系単量体又はアリル系単量体との共重合体を挙げることができる。共重合体はアクリル酸もしくはメタクリル酸に由来する単量体構成単位が共重合体を形成している全単量体構成単位中、３０モル％以上、好ましくは５０モル％以上、より好ましくは８０モル％以上を占めるものが挙げられる。
これら単独重合体及び共重合体において、塩はアルカリ金属、アルカリ土類金属及びアミンから選ばれる陽イオンとの塩が好ましい。すなわち、塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アミン塩が挙げられ、ナトリウム塩又はカリウム塩が好ましい。なお塩構造の単量体構成単位の割合は一部であっても全部であってもよく、当該重合体の中和度によって変更することができる。

アクリル酸系単量体と共重合可能な単量体としては、ビニル系単量体が挙げられる。ビニル系単量体としては、アルキル基の炭素数が８以上、好ましくは１０以上、そして、４０以下、好ましくは３６以下のアクリル酸アルキルエステル、アルキル基の炭素数が８以上、好ましくは１０以上、そして、４０以下、好ましくは３６以下のメタクリル酸アルキルエステル、マレイン酸、無水マレイン酸、ヒドロキシエチルアクリル酸、ヒドロキシエチルメタクリル酸、エチレン、プロピレン、ｎ−ブテン、イソブテン、ペンテン、イソプレン、２−メチル−１−ブテン、ｎ−ヘキセン、２−メチル−１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、４−メチル−１−ペンテン、２−エチル−１−ブテン、スチレン、α−メチルスチレン、ビニルトルエン、ビニルナフタレン、インデン、ブタジエン、シクロペンタジエン、ジシクロペンタジエンが挙げられる。これらの中でもマレイン酸、無水マレイン酸、ヒドロキシエチルアクリル酸、ヒドロキシエチルメタクリル酸等の水溶性単量体及びこれらの単量体の塩が好ましい。
これらのうち、アクリル酸、メタクリル酸及びその塩から選ばれる単量体からなる単独重合体が好ましい。該単独重合体の塩はカリウム塩又はナトリウム塩が好ましい。

ハンドリング性と分散性の観点から、アクリル酸ポリマーの重量平均分子量は３０００〜７００００が好ましい。重量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより、アセトニトリルと水の混合溶液（リン酸緩衝液）を展開溶媒とし、ポリアクリル酸を標準物質として測定することができる。

本発明の組成物には、上記成分以外に通常粉末状の漂白剤組成物に添加される公知の成分を添加することもできる。例えば水；芒硝等のその他の無機塩；蛍光増白剤；金属イオン封鎖剤；染料や顔料のような着色剤；その他香料、シリコーン類、殺菌剤、紫外線吸収剤等の種々の微量添加物を必要に応じて配合することができる。

本発明の組成物は、粉末である。ここで粉末は、粒状、顆粒状を含む。
粉末の組成物は、粉末成分のみを混合して得ることもできるし、粉末成分と液状成分とを混合して得ることもできる。
例えば、過炭酸ナトリウムや漂白活性化剤は予め粒子として配合してもよい。過炭酸ナトリウム粒子は、過炭酸ナトリウムの粉末を水や過酸化水素等で造粒したもの、非イオン界面活性剤、アクリル酸系重合体等を用いて被覆したものが挙げられる。
組成物の平均粒子径は、好ましくは２５０μｍ以上、より好ましくは３００μｍ以上であり、また、好ましくは１０００μｍ以下、より好ましくは８００μｍ以下である。ここで、平均粒子径は、日本工業規格ＪＩＳ Ｋ００６９（１９９２）記載の乾式篩分け法による粒度分布を基に、５０％粒径の値を用いた。
また、嵩密度は、好ましくは６００ｇ／ｃｍ^３以上、より好ましくは７００ｇ／ｃｍ^３以上であり、また、好ましくは１１００ｇ／ｃｍ^３以下、より好ましくは１０００ｇ／ｃｍ^３以下である。
更に、溶解時の水溶液のｐＨは、好ましくは９．０以上、より好ましくは９．５以上、また、好ましくは１１．５以下、より好ましくは１１．０以下である。ｐＨはＪＩＳ Ｋ ３３６２；２００８の項目８．３に従って２０℃において測定する。

＜ＨＮＶの不活化＞
本発明の組成物は、水で希釈して使用され、ＨＮＶで汚染された対象物の当該ウイルスの不活化に用いられる。水は水道水や風呂の残り湯を使用することができる。
すなわち、本発明の組成物を用いたＨＮＶの不活化方法は、本発明の組成物及び水を含有する処理液（酸素系漂白剤組成物を水で希釈した溶液）に、ＨＮＶで汚染された対象物（処理対象物）を浸漬又は接触させる工程を含むものである。

なお、ノロウイルスは、ゲノム塩基配列の相同性に基づき７つの遺伝子群（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ、ＧＩ〜ＧVII）に分けられ、中でもヒトに感染するＨＮＶはＧＩ９種（ＧＩ.1、ＧＩ.２、ＧＩ.３、ＧＩ.４、ＧＩ.５、ＧＩ.６、ＧＩ.７、ＧＩ.８、ＧＩ.９）、ＧII１９種（ＧII.１、ＧII.２、ＧII.３、ＧII.４、ＧII.５、ＧII.６、ＧII.７、ＧII.８、ＧII.９、ＧII.１０、ＧII.１２、ＧII.１３、ＧII.１４、ＧII.１５、ＧII.１６、ＧII.１７、ＧII.２０、ＧII.２１、ＧII.２２）、ＧIV１種（ＧIV.１）であるが、本発明におけるＨＮＶは、これらのいずれの遺伝子型のものであっても良い。

ＨＮＶで汚染された対象物としては、衣料、寝具、カーペット、カーテン、鞄、靴のような繊維製品、調理器具、洗濯槽、浴槽、トイレ等が挙げられる。処理対象物は、組成物を前記のように水で希釈した溶液（処理液）に浸漬又は接触するのが好ましい。
処理液中の組成物の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．３質量％以上であり、また、好ましくは１．５質量％以下、より好ましくは１質量％以下である。

そして、処理液中の過炭酸ナトリウムの濃度は、ＨＮＶの不活化の点から、０．０２質量％以上であり、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。また、溶解性の点から、好ましくは１４質量％以下、より好ましくは１質量％以下である。また、好ましくは０．０２〜１４質量％、より好ましくは０．１〜１質量％、より好ましくは０．２〜１質量％である。この濃度となるように、本発明の組成物と水とを混合することが好ましい。

処理液中のアルカリ剤の濃度は、好ましくは０．０２質量％以上であり、より好ましくは０．１質量％以上である。また、溶解性の点から、好ましくは２２質量％以下、より好ましくは１質量％以下である。また、好ましくは０．０２〜２２質量％、より好ましくは０．１〜２２質量％、より好ましくは０．１〜１質量％である。この濃度となるように、本発明の組成物と水とを混合することが好ましい。

また、処理液と処理対象物との浴比（処理液／処理対象物の質量比）は、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上であり、また、好ましくは２００以下、より好ましくは１００以下である。浸漬が困難な処理対象物には、処理液を塗布することができ、さらには処理効果高めるために、処理液を浸漬した紙、ラップ、布等で処理対象を覆うことができる。

処理液の温度は、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上、そして、好ましくは５０℃以下、より好ましくは４０℃以下である。浸漬は、通常、組成物を、水（２０〜２５℃）又はぬるま湯（３０〜４０℃）に溶解させた処理液中で行うのが好ましい。
処理時間は、好ましくは５分以上、より好ましくは１０分以上、より好ましくは１５分以上であり、また、好ましくは１２０分以下、より好ましくは６０分以下、より好ましくは３０分以下である。また、好ましくは５〜１２０分、より好ましくは５〜６０分、より好ましくは１０〜６０分である。
特に、ぬるま湯（３０〜４０℃）を用いる場合は５〜３０分、水（２０〜２５℃）を用いる場合は３０〜６０分浸漬処理するのが好ましい。

処理は、適当な容器中で実施できる。処理対象物が衣類等の繊維製品の場合、洗濯機の洗濯槽中で行うこともでき、浸漬中、任意に撹拌してもよい。
処理対象物が繊維製品の場合、浸漬後は、衣類を取出し、余分な処理液を絞る等して除去して、洗濯に供することができる。また、処理液中に放出された汚染の程度又は衛生上の観点から、必要に応じて、浸漬後の対象物を水で濯ぐことができる。

実施例１〜１０、比較例１
常法に従い、過炭酸ナトリウムを含有する粉末状の組成物Ａ〜Ｋを表１に記載の溶解濃度となるように水（オートクレーブした水道水）に懸濁させて調製した処理液（表１に主要成分の処理液中の組成を示す）について、以下に示す方法により、ＨＮＶ（ＨｕＮｏＶ）不活化効果を評価した。結果を表１に併せて示す。
その結果、処理液中の過炭酸ナトリウム濃度が０．０２％以下の比較例ではＨＮＶの増殖を抑制できなかった。その一方、処理液中の過炭酸ナトリウム濃度が０．０２％以上の実施例においてはＨＮＶの増殖を抑制することが分かった。特に、ぬるま湯での処理によって、ＨＮＶの増殖を遺伝子数（５０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）の定量下限未満にまで抑制し、完全に不活化できた。

＜評価法＞
（１）ｈｕｍａｎ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ｏｒｇａｎｏｉｄ（ｈＳＩＯ）の培養
ｈＳＩＯは４８ウェルプレート上でマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６２３１）に包埋し三次元培養した。培地はＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｈｕｍａｎ）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳＴ−０６０１０）を用いた。培地交換・継代・９６ウェルプレートを用いた単層化の手技はユーザーマニュアルに従った。トリプシン処理後２日間はアノイキスを阻害するために培地に終濃度１０μＭとなるようにＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤であるＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ Ｙ−２７６３２（富士フィルム和光純薬，０３６−２４０２３）を添加した。５００ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，１２６３４０１０）に５ｍＬのＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，３５０５０−０６１）、５ｍＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ，１５６３００８０）、５ｍＬのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ，１５１４０１２２）を添加することで基本培地を作成した。基本培地とＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ ＭｅｄｉｕｍのコンポーネントＡとを等量混合することで分化培地を作成した。９６ウェルプレートで単層化させた細胞に分化培地を１ｗｅｌｌあたり２００μＬずつ２日間隔で交換しながら計６日間分化を誘導した。

（２）ＨＮＶ（ＨｕＮｏＶ）含有糞便の１０％乳剤の作成
糞便の１０％乳剤はＧII．４型のＨＮＶ罹患者糞便から作成した。プロテアーゼ阻害剤であるｃＯｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１１６９７４９８００１）１錠を５０ｍＬのＤ−ＰＢＳ（−）に懸濁した。糞便１ｇに対して１０ｍＬのｃＯｍｐｌｅｔｅ含有Ｄ−ＰＢＳ（−）で懸濁し、試験管ミキサーでよく混合した。４℃で２０分間静置した後に、２，０００×ｇ ４℃で１０分間遠心した。上清を新たなチューブに回収し、感染実験に供するまで−８０℃に保存した。

（３）ＨＮＶの不活化処理と分化ｈＳＩＯへの感染
ＨＮＶ含有１０％糞便乳剤を分化培地で１０倍に希釈し、１ｍＬのシリンジとＭｉｌｌｅｘ ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＳＬＨＶＲ０４ＮＬ）を用いて濾過した。ＰＡ微量遠心チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ，３５７４４８）中で濾過した糞便溶液５μＬ（２．８×１０^６ ＨＮＶ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｙ相当）と表１に示す所定濃度の過炭酸ナトリウムを含有する組成物の懸濁液（処理液）４５μＬとを混合し、表１に示す所定の温度と時間で反応させた。次いでこの薬剤処理された糞便溶液に、１ｍｇ／ｍＬのｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ,Ａ９６４７）を含む基本培地 １．４５ｍＬを添加した。遠心チューブを固定角ロータＴＬＡ−５５（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）にセットしＯｐｔｉｍａ ＭＡＸ−ＴＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてＲｍａｘにおいて１８６０４７×ｇの遠心力（５５，０００ｒｐｍ相当）で１．５時間超遠心した後に上清を除去した。ペレットを１００μＬの分化培地で懸濁し、ｈＳＩＯへの感染溶液とした。ウェル中の既存の培地を除去した６〜７日間分化誘導後のｈＳＩＯに上述の方法で調製した感染溶液をアプライした。インキュベートは３７℃で３時間実施した。３００μＬの基本培地で３回洗浄した後に、終濃度が１２５ｐｐｍとなるようにブタ胆汁抽出物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂ８６３１−１００Ｇ）を加えた分化培地を２５０μＬ添加し３７℃ ５％ＣＯ_２の条件下でサンプリングのタイミングまで培養した。培養開始直後（ｄａｙ ０）と培養３日後（ｄａｙ ３）に１０μＬの上清を回収した。回収した上清はＲＴ−ｑＰＣＲに供するまで−８０℃で保存した。尚、薬剤溶液に代わり基本培地を用いて同様の操作を行い調製したｈＳＩＯへの感染溶液を薬剤非処理のコントロールとした。

（４）ＲＴ−ｑＰＣＲ
回収した上清中のＨＮＶ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｙ数の定量にはノロウイルス検出キット Ｇ１／Ｇ２（東洋紡，ＦＩＫ−２７３）を用いた。操作はプロトコールに従った。ＰＣＲ増幅とデータ測定はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０II（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
測定されたウイルス量に基づき、Ａ：ＨＮＶが検出下限にまで不活化されている、Ｂ：ＨＮＶを検出するがコントロール（薬剤処理無し）よりも減少、Ｃ：コントロール（薬剤処理無し）と同等にＨＮＶが増殖している、の３段階で評価した。

Claims (9)

1. 過炭酸ナトリウムを含有する組成物を有効成分とするヒトノロウイルス不活化剤であって、過炭酸ナトリウム濃度が０．０２質量％以上となるように水に溶解して使用される、ヒトノロウイルス不活化剤。
2. 過炭酸ナトリウムを含有する組成物がアルカリ剤を含有する、請求項１に記載のヒトノロウイルス不活化剤。
3. アルカリ剤が炭酸ナトリウムである、請求項２に記載のヒトノロウイルス不活化剤。
4. 水の温度が２０〜５０℃である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒトノロウイルス不活化剤。
5. 過炭酸ナトリウムを含有する組成物及び水を含有する処理液に、ヒトノロウイルスで汚染された対象物を浸漬又は接触する工程を含む、ヒトノロウイルスの不活化方法であって、処理液中の過炭酸ナトリウム濃度が０．０２質量％以上である、方法。
6. 過炭酸ナトリウムを含有する組成物がアルカリ剤を含有する、請求項５に記載の方法。
7. アルカリ剤が炭酸ナトリウムである、請求項６に記載の方法。
8. ２０〜５０℃の処理液で５〜１２０分浸漬する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 対象物が繊維製品である請求項５〜８のいずれか１項記載の方法。