JP2021095395A - 抗体分離のための溶液 - Google Patents

Abstract

【課題】 試料に含まれるＩｇＧ４を精度よく分離する溶液を提供すること。【解決手段】 Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに、少なくともＩｇＧ４を含有し得る抗体試料を添加前および／または添加後に平衡化する平衡化液であって、以下の（ａ）から（ｃ）式の条件を少なくともすべて満たす組成である平衡化液。（ａ）式：電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］≦−０．８１×緩衝能力値＋１２．５、（ｂ）式：緩衝能力値＞０、（ｃ）式：電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］＞０【選択図】 図３

Description

本発明は、抗体分離のための溶液に関する。本発明は、具体的には、試料に含まれるＩｇＧ４を精度よく分離するために使用する平衡化液に関する。

近年、ガンや免疫疾患等の治療に抗体を含む医薬品（抗体医薬品）が用いられている。抗体医薬品に用いる抗体は、遺伝子工学的手法により得られた、当該抗体を発現可能な細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等）を培養後、カラムクロマトグラフィー等を用いて高純度に精製し製造されている。しかし、近年の研究により、そのようにして製造される抗体は酸化、還元、異性化、糖鎖付加等の修飾を受けることで多様な分子の集合体となっていることが判明しており、薬効や安全性への影響が懸念されている。特に、抗体に結合している糖鎖構造は、抗体医薬品の活性、動態、および安全性に大きな影響を与えることが報告されており、詳細な糖鎖構造の解析が重要である（非特許文献１）。また、リウマチ等の疾患では、血液中の抗体に付加される糖鎖構造の変化が知られており（非特許文献２および３）、抗体に付加された糖鎖構造を分析することで疾患を診断できる可能性がある。

抗体医薬に用いる抗体の糖鎖構造を分析する方法として、糖鎖の切り出しを含むＬＣ−ＭＳ分析（特許文献１および特許文献２）が主に実施されている。しかしながら、前記分析方法では非常に煩雑な操作を伴い、多大な時間を要する。より簡便な抗体の分子構造の分析方法としては、クロマトグラフィーによる分析が挙げられる。具体的には、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、抗体を分子量に基づき分離することで凝集体や分解物の分離および定量が可能である。また、イオン交換クロマトグラフィーにより、抗体分子が有する電荷の違いを分離できる。しかしながら前述したクロマトグラフィーによる分析では、糖鎖構造等の抗体分子の微小な構造変化を識別できないため、得られる分析結果は限定的であった。

一方、不溶性担体に固定化されたアフィニティーリガンドと抗体との親和性に基づく分析により抗体の性能を測定、判断できることが報告されている（特許文献３）。しかし、糖鎖構造の違いによる抗体の分離、特に糖鎖構造の違いによるヒト由来抗体の分離は行われていなかった。

特開２０１６−１９４５００号公報 特開２０１６−０９９３０４号公報 ＷＯ２０１３／１２０９２９号

ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ， ３４（２）， ８３−８８（２０１３） Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０、３７３（２００８） Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、７、１１２０５（２０１６）

本発明は、抗体分離のための溶液を提供することを課題とする。本発明は、具体的には、試料に含まれるＩｇＧ４を精度よく分離するために使用する平衡化液を提供することを課題とする。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質を利用することにより糖鎖構造の違いに基づき抗体を分離できること、および該Ｆｃ結合性タンパク質に抗体を吸着させる際に用いる平衡化液として、試料に含まれるＩｇＧ４を精度よく分離できる溶液組成を見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下の通り例示できる。

［１］
Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムの、平衡化液であって、
以下の（ａ）から（ｃ）式の条件を少なくともすべて満たす組成である平衡化液。
（ａ）式：電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］≦−０．８１×緩衝能力値＋１２．５
（ｂ）式：緩衝能力値＞０
（ｃ）式：電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］＞０
［２］
平衡化液が以下の（ｄ）式の条件をさらに満たす組成である、［１］に記載の平衡化液。
（ｄ）式：電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］＞０．２４
［３］
少なくともＩｇＧ４を含有し得る抗体試料の分析に適用される、［１］または［２］に記載の平衡化液。

［４］
少なくともＩｇＧ４を含有し得る抗体試料が血液由来の試料である、［３］に記載の平衡化液。

［５］
Ｆｃ結合性タンパク質が、以下の（１）〜（４）のいずれかのポリペプチドである、［１］〜［４］の何れかに記載の平衡化液：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換されたポリペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも２７番目のバリンがグルタミン酸に、２９番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、３５番目のチロシンがアスパラギンに、４８番目のグルタミンがアルギニンに、７５番目のフェニルアラニンがロイシンに、９２番目のアスパラギンがセリンに、１１７番目のバリンがグルタミン酸に、１２１番目のグルタミン酸がグリシンに、１７１番目のフェニルアラニンがセリンに、および１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換されたポリペプチド；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも２７番目のバリンがグルタミン酸に、２９番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、３５番目のチロシンがアスパラギンに、４８番目のグルタミンがアルギニンに、７５番目のフェニルアラニンがロイシンに、９２番目のアスパラギンがセリンに、１１７番目のバリンがグルタミン酸に、１２１番目のグルタミン酸がグリシンに、および１７１番目のフェニルアラニンがセリンに置換されたポリペプチド；
（４）上記（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列を含み、但し当該アミノ酸配列において、上記置換以外の位置において、１または数個のアミノ酸変異を含む、ポリペプチド。

［６］
少なくともＩｇＧ４を含有する抗体試料からＩｇＧ４を分離する方法であって、
（１）ＩｇＧ４を含有する抗体試料を、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに添加し抗体を前記担体に吸着させる工程、
（２）前記（１）の前または後に［１］または［２］に記載の平衡化液を添加し前記カラムを平衡化する工程、および
（３）前記平衡化されたカラムに溶出液を添加し、吸着された抗体を溶出させる工程
を含む、方法。

本発明により、検出対象とするＩｇＧ４をＩｇＧ４以外の抗体を含むタンパク質から精度よく分離できる。また、ＩｇＧ４に結合した糖鎖に基づくＩｇＧ４の分離パターンを得ることもできる。

抗体を含む血清またはヒトミエローマ血漿由来抗体を、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラムで、本発明の条件の範囲内の平衡化緩衝液を用いて分析した際の分離パターンを示す図。 抗体を含む血清またはヒトミエローマ血漿由来抗体を、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラムで、本発明の条件の範囲外の平衡化緩衝液を用いて分析した際の分離パターンを示す図。 抗体を含む血清を、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラムで分析した際の分離パターンを分類分けした図。 ヒトアルブミンを、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルを充填したカラムで、本発明の条件の範囲内の平衡化緩衝液を用いて分析した際の分離パターンを示す図。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラム（以下、単に「Ｆｃ結合性タンパク質カラム」とも記載）を利用して検出対象とするＩｇＧ４を分離するための平衡化液を提供する。同溶液を、「本発明の平衡化液」または「本発明の平衡化緩衝液」ともいう。

本発明の平衡化液は、具体的には、以下の工程（１）から（３）を含む、抗体を分離する方法に適用する平衡化液であってよい：
（１）Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに抗体を含有する溶液を添加し、該抗体を該担体に吸着する工程；
（２）平衡化液を添加して、該カラムを平衡化する工程；
（３）前記担体に吸着した抗体を溶出液（または以下「溶出緩衝液」と記載）を用いて溶出し、抗体の分離パターンを得る工程。

工程（１）から（３）を、それぞれ、「吸着工程」および「平衡化工程」、「溶出工程」ともいう。

本発明により、分離された抗体が得られてよい。すなわち、本発明を用いた一態様は、Ｆｃ結合性タンパク質カラムを利用して抗体を分離することにより分離された抗体を製造するための平衡化液であってもよい。すなわち、溶出工程の一態様は、担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出し、溶出された抗体を得る工程であってもよい。言い換えると、溶出工程の一態様は、担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出する工程と、溶出された抗体を得る工程を含んでいてもよい。

本発明により、抗体の分離パターンに係るデータ（以下、単に「分離データ」とも記載）が得られてよい。すなわち、本発明の一態様は、Ｆｃ結合性タンパク質カラムを利用して抗体を分離することにより抗体の分離データを製造するための平衡化液として用いてもよい。すなわち、溶出工程の一態様は、担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出し、抗体の分離データを得る工程であってもよい。言い換えると、溶出工程の一態様は、担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出する工程と、抗体の分離データを得る工程を含んでいてもよい。

抗体の分離データを指標として、被検者における疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、及び／又は加齢の進行度合いを検出してもよい。すなわち、抗体の分離データは、被検者における疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、及び／又は加齢の進行度合いを検出するための指標として用いられるデータとみなしてよい。具体的には、被検者から得た抗体をＦｃ結合性タンパク質カラムを利用して分離することにより得られる分離データを指標として、該被検者における疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、及び／又は加齢の進行度合いを検出できる。すなわち、本発明は、被検者から得た抗体をＦｃ結合性タンパク質カラムを利用して分離することにより得られる分離データを指標として、該被検者における疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、及び／又は加齢の進行度合いを精度よく検出するための平衡化液として提供してもよい。疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、及び／又は加齢の進行度合いを総称して、「リスク」ともいう。「リスクの検出」、「リスクの評価」、および「リスクの判定」は、同義に用いられてよい。
＜吸着工程＞
吸着工程は、Ｆｃ結合性タンパク質カラムに、抗体を含有する溶液を添加し、該抗体を該担体に吸着する工程である。

「抗体」とは、Ｆｃ領域を含む分子を意味する。抗体は、Ｆｃ領域からなるものであってもよく、Ｆｃ領域に加えて他の領域を含んでいてもよい。Ｆｃ領域としては、免疫グロブリンのＦｃ領域が挙げられる。抗体は、糖鎖が付加されていてよい。抗体は、例えば、少なくともそのＦｃ領域に糖鎖が付加されていてよい。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。抗体の由来は、特に制限されない。抗体は、単一の生物に由来するものであってもよく、２種またはそれ以上の生物の組み合わせに由来するものであってもよい。抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはそれらのバリアント（ｖａｒｉａｎｔ、例えばアミノ酸置換体）であってもよい。抗体としては、免疫グロブリンが挙げられる。免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥが挙げられる。免疫グロブリンとしては、特に、ＩｇＧが挙げられる。ＩｇＧとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が挙げられる。また、抗体としては、二重特異性抗体（バイスペシフィック抗体）、Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合抗体、Ｆｃ領域と薬物との複合体（ＡＤＣ）等の人工的に構造改変した抗体も挙げられる。抗体は、例えば、抗体医薬であってもよい。抗体医薬としては、抗ＴＮＦ−α抗体であるインフリキシマブや抗ＩＬ−６抗体であるトシリズマブ、癌遺伝子ＨＥＲ２に対する抗体であるトラスツズマブ、ＰＤ−１に対するＩｇＧ４抗体であるニボルマブなどが挙げられる。抗体は、例えば、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、マウス骨髄腫由来細胞（Ｓｐ２／０細胞）、ＮＳ０細胞、ハイブリドーマ細胞等の生産細胞により生産できる。

糖鎖として、特に抗体の分離に寄与し得る糖鎖としては、Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ０Ｆ＋ＧＮ、Ｇ１Ｆａ、Ｇ１Ｆｂ、Ｇ１Ｆ＋ＧＮ、Ｇ２、Ｇ２Ｆ、Ｇ１Ｆ＋ＳＡ、Ｇ２Ｆ＋ＳＡ、Ｇ２Ｆ＋２ＳＡ、Ｇ２Ｆ＋ＧＮ、Ｇ２＋ＳＡ、Ｇ２＋２ＳＡ、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３が挙げられる。

ヒト由来の抗体は、通常、シアル酸を有する抗体を含有する。ヒト由来の抗体におけるシアル酸を有する抗体の含有量は、例えば、抗体の総含有量に対して、重量比で、０．１％〜２０％程度であり得る。ヒト由来の抗体においては、シアル酸が糖鎖末端に２つ結合することが多い。さらに、ヒト由来の抗体は、通常、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ（「＋ＧＮ」の表記）を、抗体の総含有量に対して、重量比で、１％〜２０％程度含有し得る。一方、ハムスターおよびマウス由来の抗体には、通常、バイセクティングＧｌｃＮＡｃは存在せず、糖鎖末端のシアル酸結合数は０〜１個である。

吸着工程に供される抗体は、複数種類の抗体分子を含有する混合物であってよい。吸着工程に供される抗体は、具体的には、糖鎖構造の異なる複数種類の抗体分子を含有する混合物であってよい。吸着工程に供される抗体は、より具体的には、Ｆｃ領域に付加された糖鎖構造の異なる複数種類の抗体分子を含有する混合物であってよい。

リスクの検出を目的とする場合は、被検者から得た抗体を用いて本発明の平衡化液を実施すればよい。

「被検者」とは、単に測定の対象とするヒト個体、またはリスクの検出の対象とするヒト個体を意味する。ここでいう被検者を、後述する対照被検者と区別して、「標的被検者」ともいう。被検者は、それに由来する抗体試料を利用できるものであれば、すなわち、抗体試料を取得できるか、既に取得したものであれば、特に制限されない。被検者は、男性であってもよく、女性であってもよい。被検者は、子供、若者、中年、老人等、いずれの年代の個体であってもよい。被検者は、健常者であってもよく、そうでなくてもよい。
「抗体試料」とは、抗体を含有する試料を意味する。抗体試料としては、血液（全血）、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液等の血液試料；尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水等の血液由来成分を含み得る試料（以下「血液由来の試料」とも記載）；肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節等の組織の断片（組織片）や細胞；それらから分離された抗体が挙げられる。抗体試料は、そのまま、または適宜前処理に供してから、吸着工程に用いてよい。前処理は、例えば、定法により実施してよい。前処理としては、遠心分離やカラムによる精製が挙げられる。具体的には、例えば、ガンマグロブリンを精製して吸着工程に用いてもよい。抗体試料は、抗体を含有する溶液の形態で吸着工程に用いられる。すなわち、抗体試料は、適宜、抗体を含有する溶液の形態に調製して吸着工程に用いてよい。例えば、上記例示したような抗体試料またはその前処理物を、適宜、液体媒体で溶解、懸濁、分散、または溶媒交換等して、抗体を含有する溶液として吸着工程に用いてよい。そのような液体媒体については、例えば、後述する平衡化液についての記載を準用できる。液体媒体は、平衡化液と同一であってもよく、なくてもよい。

「Ｆｃ結合性タンパク質」とは、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するタンパク質を意味する。Ｆｃ結合性タンパク質は、所望の抗体分離パターンが得られるものであれば、特に制限されない。抗体は、例えば、抗体の糖鎖構造（例えば、Ｆｃ領域の糖鎖構造）の違いに基づくＦｃ結合性タンパク質との親和性の違いに基づき、分離できる。抗体とＦｃ結合性タンパク質の親和性（具体的には、抗体の糖鎖構造）は、例えば、抗体の薬効等の機能と相関し得る。また、抗体とＦｃ結合性タンパク質の親和性（具体的には、抗体の糖鎖構造）は、例えば、被検者におけるリスクと相関し得る。すなわち、Ｆｃ結合性タンパク質は、例えば、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有し、かつ抗体の糖鎖構造（例えば、Ｆｃ領域の糖鎖構造）の違いを認識できるタンパク質であるのが好ましい。Ｆｃ結合性タンパク質としては、ヒトＦｃ結合性タンパク質が挙げられる。ヒトＦｃ結合性タンパク質としては、ヒトに見出されるＦｃ結合性タンパク質やそのバリアントが挙げられる。ヒトＦｃ結合性タンパク質として、具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域のアミノ酸配列の全長配列または部分配列を含むタンパク質が挙げられる。ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域のアミノ酸配列としては、天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目までのグルタミンまでの領域が挙げられる。ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域のアミノ酸配列の部分配列としては、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域のうち、少なくともＦｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧのＦｃ領域）に結合する機能を発現し得る領域のアミノ酸配列が挙げられる。ヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、以下の（ｉ）や（ｉｉ）のポリペプチドが挙げられる。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基において１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入、または欠失を含むポリペプチド。

前記（ｉｉ）の一態様としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４０）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、ポリペプチド（特開２０１５−０８６２１６号公報）が挙げられる。
（１）配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
（２）配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（３）配列番号１の２９番目のフェニルアラニンがロイシンまたはセリンに置換
（４）配列番号１の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
（５）配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、またはヒスチジンに置換
（６）配列番号１の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（７）配列番号１の４８番目のグルタミンがヒスチジンまたはロイシンに置換
（８）配列番号１の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンに置換
（１０）配列番号１の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１１）配列番号１の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（１２）配列番号１の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３）配列番号１の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号１の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１の６５番目のセリンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（１７）配列番号１の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、またはチロシンに置換
（１８）配列番号１の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号１の７８番目のアラニンがセリンに置換
（２０）配列番号１の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
（２１）配列番号１の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２２）配列番号１の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
（２３）配列番号１の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
（２４）配列番号１の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２５）配列番号１の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
（２６）配列番号１の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
（２７）配列番号１の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
（２８）配列番号１の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２９）配列番号１の１１９番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３０）配列番号１の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
（３１）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（３２）配列番号１の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（３３）配列番号１の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
（３４）配列番号１の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
（３５）配列番号１の１６７番目のセリンがグリシンに置換
（３６）配列番号１の１６９番目のセリンがグリシンに置換
（３７）配列番号１の１７１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（３８）配列番号１の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、またはイソロイシンに置換
（３９）配列番号１の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号１の１９２番目のグルタミンがリジンに置換
また、前記（ｉｉ）の別の態様としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（４１）から（５７）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、ポリペプチド（特開２０１６−１６９１９７号公報）が挙げられる。
（４１）配列番号１の２９番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはロイシンに置換
（４２）配列番号１の３９番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（４３）配列番号１の４８番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４４）配列番号１の５１番目のチロシンがセリンに置換
（４５）配列番号１の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（４６）配列番号１の７７番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（４７）配列番号１の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（４８）配列番号１の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４９）配列番号１の１１２番目のグルタミンがロイシンに置換
（５０）配列番号１の１１７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（５１）配列番号１の１１９番目のリジンがアスパラギンまたはグルタミン酸に置換
（５２）配列番号１の１４０番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（５３）配列番号１の１４２番目のロイシンがグルタミンに置換
（５４）配列番号１の１７１番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（５５）配列番号１の１７５番目のロイシンがアルギニンに置換
（５６）配列番号１の１８０番目のアスパラギンがセリンに置換
（５７）配列番号１の１８８番目のイソロイシンがバリンに置換
また、前記（ｉｉ）のさらに別の態様としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（５８）から（６１）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、ポリペプチド（特開２０１６−１６９１９７号公報）が挙げられる。
（５８）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（５９）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（６０）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（６１）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
また、前記（ｉｉ）のさらに別の態様としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において上記（１）から（６１）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、ポリペプチドが挙げられる。

前記（ｉｉ）としては、特に、以下の（ｉｉ−１）〜（ｉｉ−３）のポリペプチドが挙げられる。
（ｉｉ−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換されたポリペプチド；
（ｉｉ−２）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも２７番目のバリンがグルタミン酸に、２９番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、３５番目のチロシンがアスパラギンに、４８番目のグルタミンがアルギニンに、７５番目のフェニルアラニンがロイシンに、９２番目のアスパラギンがセリンに、１１７番目のバリンがグルタミン酸に、１２１番目のグルタミン酸がグリシンに、１７１番目のフェニルアラニンがセリンに、および１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換されたポリペプチド；
（ｉｉ−３）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも２７番目のバリンがグルタミン酸に、２９番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、３５番目のチロシンがアスパラギンに、４８番目のグルタミンがアルギニンに、７５番目のフェニルアラニンがロイシンに、９２番目のアスパラギンがセリンに、１１７番目のバリンがグルタミン酸に、１２１番目のグルタミン酸がグリシンに、および１７１番目のフェニルアラニンがセリンに置換されたポリペプチド。

Ｆｃ結合性タンパク質は、Ｆｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧのＦｃ領域）に結合する機能を有する限りにおいて、上記例示したＦｃ結合性タンパク質（例えば、前記（ｉ）または（ｉｉ）のポリペプチド）のアミノ酸配列において、「一または数個」のアミノ酸変異（例えば、置換、挿入、または欠失）を含むポリペプチドであってもよい。「一または数個」とは、例えば、１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、更に好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個であってよい。「一または数個」のアミノ酸変異は、例えば、上記（１）から（６１）のアミノ酸置換から選択される上記例示したＦｃ結合性タンパク質が有するアミノ酸置換が保存されるように生じてよい。言い換えると、「一または数個」のアミノ酸変異は、例えば、上記（１）から（６１）のアミノ酸置換から選択される上記例示したＦｃ結合性タンパク質が有するアミノ酸置換以外の位置に生じてよい。

Ｆｃ結合性タンパク質は、Ｆｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧのＦｃ領域）に結合する機能を有する限りにおいて、上記例示したＦｃ結合性タンパク質（例えば、前記（ｉ）または（ｉｉ）のポリペプチド）のアミノ酸配列に対し高い相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。「高い相同性」とは、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を意味してよい。「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）および／または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよい。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）等のアラインメントプログラムを利用して決定できる。例えば、「アミノ酸配列の同一性」とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例えば、上記（１）から（６１）のアミノ酸置換から選択される上記例示したＦｃ結合性タンパク質が有するアミノ酸置換が保存されるように生じてよい。言い換えると、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例えば、上記（１）から（６１）のアミノ酸置換から選択される上記例示したＦｃ結合性タンパク質が有するアミノ酸置換以外の位置に生じてよい。

Ｆｃ結合性タンパク質は、例えば、Ｆｃ結合性タンパク質をコードする遺伝子を有する宿主に同遺伝子を発現させることにより製造できる。Ｆｃ結合性タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、クローニング、化学合成、変異導入、またはそれらの組み合わせにより取得できる。宿主は、Ｆｃ結合性タンパク質を発現できるものであれば、特に制限されない。宿主としては、動物細胞、昆虫細胞、微生物が挙げられる。動物細胞としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、Ｓｆ９、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４が挙げられる。微生物としては、酵母や細菌が挙げられる。酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ等のＰｉｃｈｉａ属酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母が挙げられる。細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉとしては、Ｗ３１１０株、ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株が挙げられる。また、Ｆｃ結合性タンパク質は、例えば、Ｆｃ結合性タンパク質をコードする遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。

「不溶性担体」とは、本発明においてカラムに通液される液体（例えば、平衡化液や溶出液等の、抗体の吸着または溶出に用いる液体）に対して不溶性である担体を意味する。不溶性担体は、Ｆｃ結合性タンパク質を共有結合で固定化するための官能基（例えばヒドロキシ基）を備えていてよい。不溶性担体としては、ジルコニア、ゼオライト、シリカ、皮膜シリカ等の無機系物質に由来した担体、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然有機高分子物質に由来した担体、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリレート、ビニルポリマー等の合成有機高分子物質に由来した担体が挙げられる。

Ｆｃ結合性タンパク質は、適宜、不溶性担体に固定化できる。Ｆｃ結合性タンパク質は、例えば、不溶性担体に備わるＦｃ結合性タンパク質を共有結合で固定化するための官能基（例えばヒドロキシ基）を利用して、共有結合で不溶性担体に固定化できる。例えば、不溶性担体が表面にヒドロキシ基を備える場合、活性化剤を用いて当該ヒドロキシ基からＦｃ結合性タンパク質と共有結合可能な活性化基を形成し、当該活性化基とＦｃ結合性タンパク質とを共有結合することができる。ヒドロキシ基に対する活性化剤の具体例として、エピクロロヒドリン（活性化基としてエポキシ基を形成）、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（活性化基としてエポキシ基を形成）、トレシルクロリド（活性化基としてトレシル基を形成）、ビニルブロミド（活性化基としてビニル基を形成）が挙げられる。また、ヒドロキシ基をアミノ基やカルボキシル基等に変換した後、活性化剤を作用させて活性化することもできる。アミノ基やカルボキシル基等に対する活性化剤の具体例として、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（活性化基としてマレイミド基を形成）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（活性化基としてカルボニルイミダゾール基を形成）、ハロゲン化酢酸（活性化基としてハロゲン化アセチル基を形成）が挙げられる。

Ｆｃ結合性タンパク質カラムに抗体を含有する溶液を添加することにより、抗体を担体に吸着できる。抗体を含有する溶液は、例えば、ポンプ等の送液手段を用いてカラムに添加できる。液体をカラムに添加することを、「液体をカラムに送液する」ともいう。抗体を含有する溶液の添加量、液相の種類、液相の送液速度、カラム温度等の吸着工程の実施条件は、抗体が担体に吸着する限り、特に制限されない。吸着工程の実施条件は、抗体の種類、Ｆｃ結合性タンパク質の種類、不溶性担体の種類、カラムのスケール等の諸条件に応じて適宜設定できる。液相としては、後述する平衡化液が挙げられる。送液速度は、例えば、カラムの内径が４．６ｍｍの場合に、０．１ｍＬ／分〜２．０ｍＬ／分、０．２ｍＬ／分〜１．５ｍＬ／分、または０．４ｍＬ／分〜１．２ｍＬ／分であってよい。送液速度は、例えば、カラムの内径の２乗に比例するように設定してよい。カラム温度は、例えば、０℃〜５０℃であってよい。
＜平衡化工程＞
平衡化工程は、担体に吸着した抗体を平衡化液（同様の意味で「平衡化緩衝液」とも記載）を用いて、カラムを平衡化する工程である。抗体を含有する溶液をカラムに添加する前に、平衡化液を用いてカラムを平衡化してよい。すなわち、本発明は、吸着工程の前に、カラムに平衡化液を添加し、カラムを平衡化する工程を含んでいてよい。

平衡化することで、Ｆｃ結合性タンパク質に結合しない、またはカラムに添加する際の抗体を含有する溶液では結合するが平衡化緩衝液では結合しない抗体をカラムから除くことができる。平衡化を行うことで担体に結合しなかった抗体を含む画分を未吸着画分といい、抗体を含有する溶液をカラムに添加後、検出されるピークが平衡化中に最小値を取るまでの領域の画分のことをいう。未吸着画分と溶出液添加後に検出されるピーク領域とは分離時間として離れている方が分離精度が高く好ましく、特に未吸着画分と溶出液添加後に検出されるピーク領域との間の検出値が一定値を取っていると、平衡化工程により未吸着画分がカラムから十分に除かれたことがわかり好ましい。ここでいう一定値とは同一の値以外にも検出値が一定の傾きをもって変化する状態をも含める。

本発明は、体液に含まれる検出対象とするＩｇＧ４を精度よく分離する溶液である平衡化液に関する、特に、未吸着画分とＩｇＧ４とを精度よく分離でき、Ｆｃ結合性タンパク質と結合可能なＩｇＧ４以外の抗体（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３）を含んでいてもＩｇＧ４を精度よく分離可能な平衡化液に関する。検出対象とするＩｇＧ４とは、後述する溶出工程においてヒトミエローマ血漿由来ＩｇＧ４の溶出時間と同様な時間に溶出されることで定義付けられるＩｇＧ４のことをいい、前記未吸着画分に含有されるＩｇＧ４は含まない。本明細書において、ＩｇＧ４とは補足のない限り前記未吸着画分に含まれるＩｇＧ４は含まない。

平衡化液としては、水性緩衝液が挙げられる。平衡化液として、具体的には、ｐＨ５．０から８．０の弱酸性から弱アルカリ性緩衝液が挙げられる。緩衝液の成分は、緩衝液のｐＨ等の諸条件に応じて適宜選択できる。緩衝液の成分としては、リン酸、酢酸、ギ酸、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳ（３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、クエン酸、コハク酸、グリシン、ピペラジンが挙げられる。また、緩衝液にさらに塩を加えてもよく、塩化ナトリウムや塩化カリウム等の同業者が容易に想定し得る塩であれば特に限定されない。

検出対象とするＩｇＧ４と分離することが好ましい物質として、Ｆｃ結合性タンパク質にほとんど結合しないＩｇＧ２やＩｇＧ以外のタンパク質が挙げられる。Ｆｃ結合性タンパク質への結合能はＩｇＧ１およびＩｇＧ３が高く、ＩｇＧ４はＩｇＧ１およびＩｇＧ３と比較すると低い。そのため平衡化液として、抗体がＦｃ結合性タンパク質に強く結合する組成の溶液を用いた場合に、ＩｇＧ４がＦｃ結合性タンパク質に吸着し溶出液を添加することで溶出される。一方、平衡化液として、抗体がＦｃ結合性タンパク質に弱く結合する組成の溶液を用いた場合、検出対象とするＩｇＧ４が平衡化中に溶出してしまい、ＩｇＧ２およびＩｇＧ以外のタンパク質を含む未吸着画分のピークと重なってしまう。そのため、平衡化液は検出対象とするＩｇＧ４が吸着するように調整する必要があり、本発明では該平衡化液が以下の（ａ）から（ｃ）式の範囲内である組成となることを見出した。なお、（ａ）から（ｃ）式より、平衡化液の組成の範囲として緩衝能力値＜１５．４３および電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］＜１２．５をさらに導くことができる。
（ａ）式：電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］≦−０．８１×緩衝能力値＋１２．５
（ｂ）式：緩衝能力値＞０
（ｃ）式：電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］＞０
電気伝導度は緩衝液の成分および加える塩からなる値であり、含まれるイオンの量を反映する。イオンはＦｃ結合性タンパク質または担体との静電的な吸着能に関与しており、電気伝導度が高いほどＦｃ結合性タンパク質または担体との抗体の吸着能が低下する。また緩衝能力値とは、緩衝液に滴下した塩酸または水酸化ナトリウムのモル数を滴下後に変動したｐＨで割ることで得られた値のことをいい（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５２、５２５（１９２２）参照）、本発明では平衡化緩衝液のｐＨから０．１から０．２の幅で塩酸を用いて変動させた際の平衡化緩衝液１Ｌあたりに滴下した塩酸ミリモル数（ｍｍｏｌｅ）を変動した実測のｐＨで割ることで得られた値を緩衝能力値とした。緩衝能力値が高い程、高い緩衝能を有していることを示す。同一の緩衝液の成分を用いた場合、緩衝能力値が高い程、緩衝液の成分の濃度が高いことを意味し、電気伝導度も増加する。電気伝導度が同一の値であっても緩衝能力値の違いによって抗体の吸着能が変化することから、緩衝能力値もＦｃ結合性タンパク質または担体と抗体との吸着能を変動させる要因であることがわかる。

抗体試料として抗体以外の測定対象でないタンパク質を含む試料を測定する場合、当該タンパク質が後述する溶出工程後に溶出することで検出対象であるＩｇＧ４の溶出ピークに近接し、ＩｇＧ４の分離能が低下するおそれがある。平衡化液の電気伝導度が低いと、測定対象でないタンパク質とＦｃ結合性タンパク質との静電相互作用が強くなり、後述する溶出工程まで当該タンパク質が結合し続けることになると推測される。前記タンパク質の溶出工程後の混入を抑制するため、（ａ）から（ｃ）式に加えて以下の（ｄ）式の範囲内である組成とすると、ＩｇＧ４の分離精度が向上するため好ましい。
（ｄ）式：電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］＞０．２４
＜溶出工程＞
溶出工程は、担体に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出する工程である。

すなわち、カラムに溶出液を添加することにより、担体に吸着した抗体を溶出できる。溶出液の種類、溶出液の送液形式、液相の送液速度、カラム温度等の溶出工程の実施条件は、所望の態様で抗体が分離される限り、例えば、所望の抗体の分離データが得られる限り、特に制限されない。溶出工程の実施条件は、抗体の種類、Ｆｃ結合性タンパク質の種類、不溶性担体の種類、カラムのスケール等の諸条件に応じて適宜設定できる。溶出液としては、抗体とＦｃ結合性タンパク質との親和性を弱めるものを用いることができる。溶出液としては、溶出前の液相（例えば、平衡化液）よりもｐＨが低い水性緩衝液が挙げられる。溶出液として、具体的には、ｐＨ２．５から４．５の酸性緩衝液が挙げられる。例えば、溶出前の液相（例えば、平衡化液）がｐＨ５．０から８．０の弱酸性から弱アルカリ性緩衝液である場合に、溶出液がｐＨ２．５から４．５の酸性緩衝液であってよい。緩衝液の成分は、緩衝液のｐＨ等の諸条件に応じて適宜選択できる。緩衝液の成分としては、リン酸、酢酸、ギ酸、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳ（３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、クエン酸、コハク酸、グリシン、ピペラジンが挙げられる。

溶出液の送液形式は、例えば、グラジエント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）であってもよく、イソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）であってもよい。溶出液の送液形式は、特に、グラジエントであってよい。すなわち、溶出は、特に、液相中の溶出液の比率を増大させることにより実施されてよい。グラジエントは、例えば、リニアグラジエント（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）であってもよく、ステップワイズグラジエント（ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ）であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。グラジエントは、具体的には、例えば、１０分〜６０分、１５分〜５０分、または２０分〜４０分で液相中の溶出液の比率が０％（ｖ／ｖ）から１００％（ｖ／ｖ）に増大するように設定されてよい。送液速度は、例えば、カラムの内径が４．６ｍｍの場合に、０．１ｍＬ／分〜２．０ｍＬ／分、０．２ｍＬ／分〜１．５ｍＬ／分、または０．４ｍＬ／分〜１．２ｍＬ／分であってよい。送液速度は、例えば、カラムの内径の２乗に比例するように設定してよい。カラム温度は、例えば、０℃〜５０℃であってよい。

溶出工程により、分離された抗体が得られてよい。分離された抗体は、例えば、同抗体を含有する溶出画分として得られてよい。すなわち、分離された抗体を含有する溶出画分を分取することにより、分離された抗体が得られる。溶出画分は、例えば、常法により分取できる。溶出画分は、具体的には、例えば、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等により分取できる。さらに、分離された抗体を溶出画分から回収してもよい。分離された抗体は、例えば、常法により溶出画分から回収できる。分離された抗体は、具体的には、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法により溶出画分から回収できる。

溶出工程により、抗体の分離データ（すなわち、抗体の分離パターンに係るデータ）が得られてよい。抗体の分離データは、被検者におけるリスクを検出するための指標として用いてもよく、特に制限されない。抗体の分離データとしては、抗体の分離パターンの特徴が挙げられる。抗体の分離パターンの特徴を、単に、「特徴」ともいう。すなわち、分離データを得る工程は、例えば、抗体の分離パターンを得る工程と、抗体の分離パターンの特徴を抽出する（すなわち、抗体の分離パターンからその特徴を抽出する）工程を含んでいてもよい。抗体の分離パターンは、検出器により抗体を検出することにより得られる。検出器としては、ＵＶ検出器や質量検出器が挙げられる。抗体の分離パターンとしては、抗体の溶出時のクロマトグラムが挙げられる。特徴としては、抗体の分離パターンから得られる、被検者におけるリスクと相関するパラメータが挙げられる。特徴として、具体的には、溶出ピーク（すなわち、溶出した抗体のピーク）の特徴が挙げられる。溶出ピークの特徴として、具体的には、ピーク面積、ピーク溶出時間、ピーク幅、ピーク検出数、ピーク高さが挙げられる。ピーク面積やピーク高さ等の特徴の抽出の対象となる溶出ピークを、「対象ピーク」ともいう。溶出ピークの特徴としては、特に、ピーク面積やピーク高さが挙げられる。抗体の分離パターンは、そのまま、または適宜、ベースラインの補正等の補正を実施してから、特徴の抽出に用いてよい。

特徴は、絶対値であってもよく、相対値であってもよい。相対値としては、他の溶出ピーク（すなわち、対象ピーク以外のいずれかの溶出ピーク）の値に対する比率または差分や、全溶出ピーク（すなわち、対象ピークを含む全ての溶出ピーク）の値の合計に対する比率または差分が挙げられる。相対値としては、特に、他の溶出ピークの値に対する比率や、全溶出ピークの値の合計に対する比率が挙げられる。他の溶出ピークとしては、１つの溶出ピークを用いてもよく、２つまたはそれ以上の溶出ピークを組み合わせて用いてもよい。例えば、ピーク面積として、具体的には、ピーク面積％が挙げられる。「ピーク面積％」とは、全溶出ピークの面積の合計値に対する対象ピークの面積の比率（％）を意味する。また、例えば、ピーク高さとして、具体的には、ピーク高さ％が挙げられる。「ピーク高さ％」とは、全溶出ピークの高さの合計値に対する対象ピークの高さの比率（％）を意味する。特徴は、内部標準物質で得られたピークに基づく補正や被検者の性質に基づく補正等の、補正がなされていてもよい。例えば、特徴は、被検者の年齢に基づいて補正がなされていてもよい。すなわち、例えば、特徴が被検者の年齢に影響を受ける場合、抽出された特徴を被検者の年齢に基づいて補正してから、後述する検出工程に用いてよい。被検者の年齢に基づいて補正された特徴は、例えば、加齢以外の症状についてのリスクの検出に利用でき得る。
＜検出工程＞
検出工程は、分離データ（すなわち、抗体の分離パターンに係るデータ）を指標として、被検者におけるリスク（すなわち、疾患の有無、疾患の発症リスク、疾患の進行度合い、及び／又は加齢の進行度合い）を検出する工程であり、前述した溶出工程の後に行ってもよい。

疾患としては、免疫細胞の活性（例えば、損傷作用や貪食作用）に影響を受ける疾患が挙げられる。免疫細胞としては、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージが挙げられる。

疾患として、具体的には、がん、自己免疫疾患、感染症、アレルギー、炎症疾患が挙げられ、特に本発明ではＩｇＧ４の検出評価が可能であることから自己免疫疾患の一つでもあるＩｇＧ４関連疾患が挙げられる。これらの疾患は、いずれも、免疫細胞の活性に影響を受ける疾患であり得る。

がんとしては、脳腫瘍、乳がん、子宮体がん、子宮頚がん、卵巣がん、食道がん、胃がん、虫垂がん、大腸がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、副腎がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、中皮腫、頭頚部がん、腎がん、肺がん、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、前立腺がん、精巣腫瘍、腎細胞がん、膀胱がん、横紋筋肉腫、皮膚がん、肛門がんが挙げられる。がんとしては、特に、膵がん、胃がん、乳がん、大腸がん、腎がんが挙げられる。

自己免疫疾患としては、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、多発性硬化症、慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、原発性胆汁性胆管炎、自己免疫性膵炎、高安動脈炎、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病、橋本病、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病、１型糖尿病、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、天疱瘡、膿疱性乾癬、尋常性乾癬、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、尋常性白斑、サットン後天性遠心性白斑・サットン母斑、原田病、自己免疫性視神経症、自己免疫性内耳障害、特発性無精子症、習慣性流産、リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、シェーグレン症候群、ＩｇＧ4関連疾患、血管炎症候群、混合性結合組織病が挙げられる。自己免疫疾患としては、特に、リウマチやシェーグレン症候群が挙げられる。

感染症としては、細菌感染症、真菌感染症、寄生性原虫感染症、寄生性蠕虫感染症、ウイルス感染症が挙げられる。細菌感染症としては、レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、腸球菌、リステリア、髄膜炎菌、淋菌、病原性大腸菌、クレブシエラ、プロテウス、百日咳菌、緑膿菌、セラチア、シトロバクター、アシネトバクター、エンテロバクター、マイコプラズマ、クロストリジウム、リケッチア、クラミジア等の各種細菌による感染症；結核、非結核性抗酸菌症、コレラ、ペスト、ジフテリア、赤痢、猩紅熱、炭疽、梅毒、破傷風、ハンセン病、レジオネラ肺炎、レプトスピラ症、ライム病、野兎病、Ｑ熱が挙げられる。真菌感染症としては、アスペルギルス症、カンジダ症、クリプトコッカス症、白癬菌症、ヒストプラズマ症、ニューモシスチス肺炎（カリニ肺炎）が挙げられる。寄生性原虫感染症としては、アメーバ赤痢、マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症、クリプトスポリジウム症が挙げられる。寄生性蠕虫感染症としては、エキノコックス症、日本住血吸虫症、フィラリア症、回虫症、広節裂頭条虫症が挙げられる。ウイルス感染症としては、インフルエンザ、ウイルス性肝炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性結膜炎、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、成人T細胞白血病、エボラ出血熱、黄熱、風邪症候群、狂犬病、サイトメガロウイルス感染症、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ−１９）、進行性多巣性白質脳症、水痘・帯状疱疹、単純疱疹、手足口病、デング熱、日本脳炎、伝染性紅斑、伝染性単核球症、天然痘、風疹、急性灰白髄炎（ポリオ）、麻疹、咽頭結膜熱（プール熱）、マールブルグ出血熱、腎症候性出血熱、ラッサ熱、流行性耳下腺炎、ウエストナイル熱、ヘルパンギーナ、チクングニア熱が挙げられる。感染症は、例えば、日和見感染症であってもよい。

アレルギーとしては、アナフィラキシーショック、アレルギー性鼻炎、結膜炎、気管支喘息、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、薬剤性溶血性貧血、顆粒球減少症、血小板減少症、グッドパスチャー症候群、血清病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ、糸球体腎炎、過敏性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、接触性皮膚炎、アレルギー性脳炎、移植拒絶反応、結核性空洞、類上皮細胞性肉芽腫が挙げられる。

炎症疾患としては、炎症性サイトカインにより誘導される疾患が挙げられる。炎症性サイトカインとしては、ＩＬ−６やＴＮＦ−αが挙げられる。炎症疾患として、具体的には、脳炎、骨髄炎、髄膜炎、神経炎、眼の炎症（涙腺炎、強膜炎、上強膜炎、角膜炎、脈絡網膜炎、網膜炎、脈絡網膜炎、眼瞼炎、結膜炎、ぶどう膜炎、等）、耳の炎症（外耳炎、中耳炎、内耳炎、等）、乳腺炎、心炎（心内膜炎、心筋炎、心膜炎、等）、血管炎（動脈炎、静脈炎、毛細血管炎、等）、呼吸器の炎症（副鼻腔炎、鼻炎、咽頭炎、喉頭炎、気管炎、気管支炎、細気管支炎、肺炎、胸膜炎、縦隔炎、等）、口腔の炎症（口内炎、歯肉炎、歯肉口内炎、舌炎、扁桃炎、シラデン炎、耳下腺炎、口唇炎、歯髄炎、鼻炎、等）、消化器の炎症（食道炎、胃炎、胃腸炎、腸炎、小腸炎、大腸炎、十二指腸炎、回腸炎、虫垂炎、直腸炎、等）、皮膚炎、蜂巣炎、汗腺炎、関節炎、皮膚筋炎、筋炎、滑膜炎、腱炎、脂肪織炎、骨炎、骨髄炎、骨膜炎、腎炎、輸尿管炎、膀胱炎、尿管炎、卵巣炎、卵管炎、子宮内膜炎、子宮頸管炎、膣炎、外陰炎、精巣炎、精巣上体炎、前立腺炎、精嚢膀胱炎、亀頭炎、包皮炎、絨毛膜羊膜炎、臍帯炎、臍炎、肝炎、上行性胆管炎、胆嚢炎、膵炎、腹膜炎、下垂体炎、甲状腺炎、副甲状腺炎、副腎炎、リンパ管炎、リンパ節炎が挙げられる。炎症疾患としては、特に、膵炎が挙げられる。

ＩｇＧ４関連疾患としては、血液中のＩｇＧ４が高値であり、病変組織へのＩｇＧ４陽性形質細胞の浸潤などが認められる慢性炎症性疾患が挙げられ、具体的には、前記ＩｇＧ４に関連した、Ｍｉｋｕｌｉｃｚ病、ｋｕｔｔｎｅｒ腫瘍、涙腺炎、ＩｇＧ４関連眼疾患、ＩｇＧ４関連呼吸器疾患、炎症性偽腫瘍、縦隔線維症、腸炎、硬化性胆管炎、ＩｇＧ４関連肝障害、自己免疫性膵炎、ＩｇＧ４関連腎臓病、後腹膜線維症、前立腺炎、自己免疫性下垂体炎、甲状腺炎、肥厚性硬膜炎、ＩｇＧ４関連リンパ節症、関節炎、炎症性腹部大動脈瘤、動脈周囲炎が挙げられる。

疾患として、具体的には、悪液質や加齢関連疾患も挙げられる。加齢関連疾患としては、フレイル（虚弱）、サルコペニア、ロコモティブシンドロームが挙げられる。悪液質やこれらの加齢関連疾患は、いずれも、炎症疾患でもあり得る。

被検者におけるリスクの検出としては、被検者においてリスクがあるかないかの判定や、被検者においてリスクが高いか低いかの判定が挙げられる。

疾患の有無の検出としては、被検者が現在疾患を発症している可能性があるかないかの判定や、被検者が現在疾患を発症している可能性が高いか低いかの判定が挙げられる。また、疾患の発症リスクの検出としては、被検者が将来疾患を発症する可能性または発症した場合に重症化する可能性があるかないかの判定や、被検者が将来疾患を発症する可能性または発症した場合に重症化する可能性が高いか低いかの判定が挙げられる。また、疾患の進行度合いの検出としては、被検者における現在の疾患の進行度合い（例えば重症度）が大きいか小さいかの判定が挙げられる。また、加齢の進行度合いの検出としては、被検者における現在の加齢の進行度合い（例えば重症度）が大きいか小さいかの判定が挙げられる。

すなわち、「被検者においてリスクがある」とは、例えば、被検者が現在疾患を発症している可能性があること、被検者が将来疾患を発症する可能性があること、および／または被検者が将来疾患を発症した場合に重症化する可能性があることを意味してよい。「被検者においてリスクがない」とは、例えば、被検者が現在疾患を発症している可能性がないこと、被検者が将来疾患を発症する可能性がないこと、および／または被検者が将来疾患を発症した場合に重症化する可能性がないことを意味してよい。「被検者においてリスクが高い」とは、例えば、被検者が現在疾患を発症している可能性が高いこと、被検者が将来疾患を発症する可能性が高いこと、被検者が将来疾患を発症した場合に重症化する可能性が高いこと、被検者における現在の疾患の進行度合いが大きいこと、および／または被検者における現在の加齢の進行度合いが大きいことを意味してよい。「被検者においてリスクが低い」とは、例えば、被検者が現在疾患を発症している可能性が低いこと、被検者が将来疾患を発症する可能性が低いこと、被検者が将来疾患を発症した場合に重症化する可能性が低いこと、被検者における現在の疾患の進行度合いが小さいこと、および／または被検者における現在の加齢の進行度合いが小さいことを意味してよい。

検出工程は、例えば、分離データの値の高低（すなわち、分離データの値が高いか低いか）を指標として実施できる。分離データの値の高低は、例えば、分離データの値を所定の閾値と比較することにより決定できる。言い換えると、検出工程は、例えば、分離データの値を閾値と比較する工程を含んでいてよい。すなわち、「分離データの値が高い」とは、例えば、分離データの値が閾値を基準として高いことを意味してよい。「分離データの値が閾値を基準として高い」とは、例えば、分離データの値が閾値以上であること、分離データの値が閾値超であること、または分離データの値が閾値よりも統計学的に有意に高いことを意味してよい。「分離データの値が閾値を基準として高い」とは、具体的には、例えば、分離データの値が閾値の１．０１倍以上、１．０２倍以上、１．０３倍以上、１．０５倍以上、１．０７倍以上、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、１．７倍以上、２倍以上、２．５倍以上、または３倍以上であることを意味してもよい。また、「分離データの値が低い」とは、例えば、分離データの値が閾値を基準として低いことを意味してよい。「分離データの値が閾値を基準として低い」とは、例えば、分離データの値が閾値以下であること、分離データの値が閾値未満であること、または分離データの値が閾値よりも統計学的に有意に低いことを意味してよい。「分離データの値が閾値を基準として低い」とは、具体的には、例えば、分離データの値が閾値の０．９９倍以下、０．９８倍以下、０．９７倍以下、０．９５倍以下、０．９３倍以下、０．９倍以下、０．８５倍以下、０．８倍以下、０．７倍以下、０．６倍以下、０．５倍以下、０．４倍以下、または０．３倍以下であることを意味してもよい。

分離データの値は、例えば、閾値を基準に、危険範囲に区分されてよい。分離データの値は、例えば、閾値を基準に、非危険範囲に区分されてよい。分離データの値は、具体的には、例えば、閾値を基準に、危険範囲と非危険範囲とに区分されてもよい。「危険範囲」とは、分離データの値について、被検者においてリスクがある可能性が高い範囲を意味してよい。「非危険範囲」とは、分離データの値について、被検者においてリスクがない可能性が高い範囲を意味してよい。すなわち、分離データの値が危険範囲にあれば、被検者においてリスクがある、またはリスクが高いと判定してよい。一方、分離データの値が非危険範囲にあれば、被検者においてリスクがない、またはリスクが低いと判定してよい。

なお、「或る分離データが或る基準を満たす（例えば、低いもしくは高い、または或る範囲にある）場合に被検者においてリスクがある、ない、高い、または低いと判定する」とは、少なくとも当該基準を満たす範囲において被検者においてリスクがある、ない、高い、または低いと判定されることを意味し、当該基準を満たさない範囲において被検者においてリスクが判定されることを要求しない。しかし、一態様においては、「或る分離データが或る基準を満たす（例えば、低いもしくは高い、または或る範囲にある）場合に被検者においてリスクがある、ない、高い、または低いと判定する」場合、当該基準を満たさない範囲において、それぞれ、被検者においてリスクがない、ある、低い、または高いと判定してもよい。

閾値は、例えば、分離データの種類や所望の判定精度等の諸条件に応じて、当業者が適宜設定できる。閾値は、例えば、疾患や加齢等の判定対象の症状ごとに設定されてよい。閾値を決定する手段は、特に制限されない。閾値は、例えば、集団を２群に区分するためのデータ解析に利用される公知の手法に従って決定できる。

閾値は、例えば、対照被検者から得た抗体試料の分離データの値に基づいて決定できる。対照被検者から得た抗体試料の分離データを、「対照分離データ」ともいう。対照分離データは、閾値の決定に用いられることにより、検出工程に用いられてよい。対照分離データは、具体的には、閾値の決定に用いられることにより、分離データとの比較に用いられてよい。言い換えると、検出工程は、例えば、分離データを対照分離データと比較する工程を含んでいてよい。

対照被検者としては、陽性対照や陰性対照が挙げられる。「陽性対照」とは、リスクがある、または高いと判定され得る被検者を意味してよい。「陰性対照」とは、リスクがない、または低いと判定され得る被検者を意味してよい。陽性対照としては、上記例示したような疾患（特に、リスクの検出対象となる疾患と同一の疾患）に罹患している、または罹患したことがある個体や、加齢が進行した個体、それらの組み合わせの性質を有する個体が挙げられる。陰性対照としては、上記例示したような疾患（特に、リスクの検出対象となる疾患と同一の疾患）に罹患していない、または罹患したことがない個体や、加齢が進行していない個体、それらの組み合わせの性質を有する個体が挙げられる。閾値は、陽性対照について測定された分離データの値のみに基づいて決定してもよく、陰性対照について測定された分離データの値のみに基づいて決定してもよく、陽性対照と陰性対照の両方について測定された分離データの値に基づいて決定してもよい。閾値は、通常、陽性対照と陰性対照の両方について測定された分離データの値に基づいて決定してよい。陽性対照と陰性対照の人数は、リスクの判定が所望の精度で可能となる閾値が得られる限り、特に制限されない。陽性対照と陰性対照の人数は、それぞれ、１人であってもよく、２人またはそれ以上であってもよい。陽性対照と陰性対照の人数は、それぞれ、通常、複数名であってよい。陽性対照と陰性対照の人数は、それぞれ、例えば、５人以上、１０人以上、２０人以上、または５０人以上であってもよい。陽性対照と陰性対照の人数は、それぞれ、例えば、１００００人以下、１０００人以下、または１００人以下であってもよい。

陽性対照について測定された分離データの値のみに基づいて閾値を決定する場合には、例えば、陽性対照の複数個体で測定された分離データの値の上限から下限までの範囲から選択される値、例えば平均値、を閾値として設定してもよい。また、例えば、陽性対照の複数個体で測定された分離データの値の分布において、陽性対照の所定の割合が危険範囲に含まれるように閾値を決定してもよい。所定の割合とは、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または１００％であってよい。

陰性対照について測定された分離データの値のみに基づいて閾値を決定する場合には、例えば、陰性対照の複数個体で測定された分離データの値の上限から下限までの範囲から選択される値、例えば平均値、を閾値として設定してもよい。また、例えば、陰性対照の複数個体で測定された分離データの値の分布において、陰性対照の所定の割合が非危険範囲に含まれるように閾値を決定してもよい。所定の割合とは、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または１００％であってよい。

陽性対照について測定された分離データの値と陰性対照について測定された分離データの値の両方に基づいて閾値を決定する場合には、例えば、陽性対照の所定の割合が危険範囲に含まれ、且つ、陰性対照の所定の割合が非危険範囲に含まれるように閾値を決定してもよい。陽性対照の内の危険範囲に含まれるものの割合、および、陰性対照の内の非危険範囲に含まれるものの割合は、いずれも高い方が好ましい。これらの割合は、それぞれ、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または１００％であってよい。これらの割合の両方を高くすることが難しい場合は、例えば、本発明による判定結果の利用目的等の諸条件に応じて、いずれかの割合が優先的に高くなるように閾値を設定してもよい。例えば、偽陰性率を下げるためには、陽性対照の内の危険範囲に含まれるものの割合が優先的に高くなるように閾値を設定してよい。

閾値の決定は、例えば、ソフトウェアを用いて実施してもよい。例えば、統計解析ソフトウェアを用い、陰性対照と陽性対照とを統計学的に最も適切に判別できるような閾値を決定してもよい。そのようなソフトウェアとしては、「Ｒ」等の統計解析ソフトウェアが挙げられる。

また、対照被検者としては、標的被検者自体も挙げられる。すなわち、例えば、被検者における分離データの変動を指標として、被検者におけるリスクを判定してもよい。「分離データの値が高い」ことには、分離データの値が増大した場合が包含されてよい。「分離データの値が増大した」とは、具体的には、分離データの値が過去の値と比較して増大したことを意味してよい。また、「分離データの値が低い」ことには、分離データの値が低下した場合が包含されてよい。「分離データの値が低下した」とは、具体的には、分離データの値が過去の値と比較して低下したことを意味してよい。すなわち、閾値としては、過去の値も挙げられる。「過去の値」とは、標的被検者から過去の或る時点で得た抗体試料の分離データの値を意味する。過去の或る時点における標的被検者は、例えば、陽性対照であってもよく、陰性対照であってもよい。

被検者における分離データの変動を指標とする場合、被検者におけるリスクの増減を判定してもよい。「リスクがある、または高い」ことには、リスクが増大した場合が包含されてよい。「リスクが増大した」とは、具体的には、リスクが過去の或る時点と比較して増大したことを意味してよい。また、「リスクがない、または低い」ことには、リスクが低下した場合が包含されてよい。「リスクが低下した」とは、具体的には、リスクが過去の或る時点と比較して低下したことを意味してよい。

なお、「或る分離データを得てリスクの検出の指標とする」とは、当該分離データの値そのものを得てリスクの検出の指標とする場合に限られず、当該分離データの値を反映する他の値を得て検出の指標とすることも包含される。例えば、溶出ピークを溶出開始してから早い順で第１〜第４ピークと定義した場合、「第１ピークのピーク面積％を得てリスクの検出の指標とする」とは、第１ピークのピーク面積％の値そのものを得てリスクの検出の指標とする場合に限られず、第２〜第４ピークのピーク面積％の合計値等の、第１ピークのピーク面積％の値を反映する他の値を得て検出の指標とすることも包含される。いずれの場合にも、リスクの検出に用いられる測定値や閾値等の数値は、分離データの種類に応じて、適宜補正して用いられる。例えば、溶出ピークが第１〜第４ピークからなる場合、第１ピークのピーク面積％の値をＸ、第２〜第４ピークのピーク面積％の合計値をＹとすると、「Ｘ＝１００％−Ｙ」の関係が成立する。よって、第１ピークのピーク面積％の値そのもの（すなわち、「Ｘ」）に代えて第２〜第４ピークのピーク面積％の合計値（すなわち、「Ｙ」）を検出の指標とする場合、「Ｘが或る基準を満たす（例えば、低いもしくは高い、または或る範囲にある）」とは、「Ｙの補正値（すなわち、「１００％−Ｙ」）が当該基準を満たす」と読み替えるものとする。

リスクの検出結果は、被検者に対してリスクを低減するための処置（以下、「リスク軽減処置」ともいう）を実施するかを決定するための指標として用いてもよい。言い換えると、本発明の検出方法を実施することにより、被検者に対してリスク軽減処置を実施するかを決定するための指標が得られる。すなわち、例えば、本発明における検出方法により被検者においてリスクがある、または高いと判定された場合に、被検者に対してリスク軽減処置を実施すると決定してよい。本発明における検出方法は、例えば、単独で、または他の手段と組み合わせて、被検者に対してリスク軽減処置を実施するかを決定するための指標として用いてよい。例えば、本発明の検出方法により被検者においてリスクがある、または高いと判定された症状について、他の手段により確定診断を実施してから、被検者に対してリスク軽減処置を実施すると決定してもよい。リスク軽減処置は、医療行為であってもよく、非医療行為であってもよい。リスク軽減処置としては、上記例示したような疾患や加齢の予防や治療が挙げられる。すなわち、本発明は、例えば、疾患や加齢等の症状の予防または治療方法を提供してよい。予防または治療方法は、例えば、本発明の検出方法を実施する工程、および本発明の検出方法により被検者においてリスクがある、または高いと判定された場合に、被検者に対して予防または治療を実施する工程を含む、疾患や加齢等の症状の予防または治療方法であってよい。具体的には、本発明の検出方法により被検者においてリスクがある、または高いと判定された症状について予防または治療を実施してよい。予防または治療は、例えば、各症状についての一般的な手段（例えば、投薬や外科手術）により実施できる。

本発明により、検出対象とするＩｇＧ４をＩｇＧ４以外の抗体を含むタンパク質と精度よく分離できる。また、ＩｇＧ４に結合した糖鎖に基づくＩｇＧ４の分離パターンを得ることもできる。検出対象とするＩｇＧ４の分離パターンにより、例えば、被検者の抗体を特定の疾患や加齢等の症状についてのリスクに特徴的な糖鎖構造に基づいて分離した分離データを精度よく取得でき、基準となる分離データとの比較することにより、簡便にそのようなリスクを検出可能となる。また、疾患に対する何らかの処置（投薬、手術等）の前及び／又は後において分離データを取得して、基準となる分離データと比較することにより、疾患の治療経過のモニタリングや当該処置に対する方針の決定の精度が向上する。基準となる分離データとしては、対照被検者の分離データが挙げられる。基準となる分離データとして、具体的には、同一被検者の別の時点（例えば、健常時や同一疾患を発症している時点）での分離データ、健常者の分離データ、同一疾患を発症している異なる患者の分離データ、前記処置に対して奏効性の違いが得られる２群またはそれ以上の群に分ける際の基準となる分離データが挙げられる。

例えば、健常者（モデル）の分離データをモデル分離データとし、被験者の分離データをモデル分離データと比較することによって、何らかの疾病を有するリスクや疾病を発症するリスク等のリスクを評価可能となる。さらに、モデルと被験者の分離データの差の要因となるピークの画分を分取することで、健常者（モデル）と被験者との抗体の糖鎖パターンの差が抽出できる。また、患者本人のある時点での分離データをモデル分離データとし、同一患者の別の時点での分離データとモデル分離データとを比較することで、当該患者の疾患のモニタリングを行うこともできる。なお、２つの異なる検体群を比較する場合、統計的確率（Ｐ値）を用いて２つの異なる検体群から得られた前記分離データの差が有意な差であるかを評価できる。Ｐ値が小さくなると、前記評価結果は有意になるといわれており、Ｐ値が有意水準未満の場合、前記評価結果は統計的に有意な差があるといえる。有意水準は一般的に５％である。

本発明によるＦｃ結合性タンパク質に対する抗体の親和性の強さは、当該抗体が結合した結合性物質に対する損傷もしくは貪食作用を持つナチュラルキラー細胞および単球、マクロファージ等の免疫細胞の活性に影響を与えるため、当該親和性の違いを検出することで、ナチュラルキラー細胞および単球、マクロファージによる損傷または貪食作用に影響を受ける疾患の発症リスクを評価可能となる。当該疾患としては、がん、自己免疫疾患、感染症、アレルギー、炎症疾患、ＩｇＧ４関連疾患が挙げられる。感染症としては、日和見感染症が挙げられる。日和見感染症とは健康な状態では感染症を起こさないような病原体が原因で発症する感染症である。病原体としては、ウイルス、細菌、真菌、原虫が挙げられる。また、ワクチン接種や罹患によって獲得した抗体の免疫細胞に対する活性化への効果も、Ｆｃ結合性タンパク質に対する抗体の親和性の強さから評価できる。当該獲得した抗体の血液中の量を測定する他に、当該抗体のＦｃ結合性タンパク質に対する親和性の強さを測定することで、感染症に対する発症のリスクを精度よく予測することもできる。

以下、非限定的な実施例を参照して本発明をより具体的に説明する。

＜Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルの調製＞
実施例１ ＦｃＲ９アミノ酸置換体（ＦｃＲ９＿Ｆ）の作製
ＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製したＦｃＲ９（配列番号２）に対し、Ｆｃ結合性タンパク質の１７６番目のバリン（配列番号１に記載のアミノ酸番号で１７６番目のバリン）をフェニルアラニンに置換したＦｃ結合性タンパク質を作製した。具体的にはＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ９（ＷＯ２０１５／１９９１５４号）に対し、ＰＣＲを用いてアミノ酸の置換を行ない、ＦｃＲ９のうちＦｃ結合性タンパク質の１７６番目のバリンをフェニルアラニンに置換したＦｃ結合性タンパク質を作製した。

なおＦｃＲ９（配列番号２）は、配列番号４に示す野生型ＦｃγＲＩＩＩ細胞外領域を含むＦｃ結合性タンパク質において、４３番目のバリンをグルタミン酸に（配列番号１では２７番目に相当）、４５番目のフェニルアラニンをイソロイシンに（配列番号１では２９番目に相当）、５１番目のチロシンをアスパラギンに（配列番号１では３５番目に相当）、６４番目のグルタミンをアルギニンに（配列番号１では４８番目に相当）、９１番目のフェニルアラニンをロイシンに（配列番号１では７５番目に相当）、１０８番目のアスパラギンをセリンに（配列番号１では９２番目に相当）、１３３番目のバリンをグルタミン酸に（配列番号１では１１７番目に相当）、１３７番目のグルタミン酸をグリシンに（配列番号１では１２１番目に相当）および１８７番目のフェニルアラニンをセリンに（配列番号１では１７１番目に相当）アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質である。

以下、各Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
（１）ＦｃＲ９（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ９（ＷＯ２０１５／１９９１５４号）を鋳型ＤＮＡとし、配列番号５（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとし、配列番号６（５’−ＣＡＴＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＡＡＣＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＡＧＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとして、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することでＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物をＶ１７６ｐ１とした。

（２）ＦｃＲ９（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ９（ＷＯ２０１５／１９９１５４号記載）を鋳型ＤＮＡとし、配列番号７（５‘−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとし、配列番号８（５’−ＣＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＧＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとして、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することでＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物をＶ１７６ｐ２とした。
（３）（１）で得られたＶ１７６ｐ１と（２）で得られたＶ１７６ｐ２とを１：１で混合したものをＰＣＲ産物とし、表２に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを実施し、Ｖ１７６ｐ１とＶ１７６ｐ２を連結したＰＣＲ産物Ｖ１７６ｐを得た。

（４）（３）で得られたＶ１７６ｐを鋳型ＤＮＡとし、配列番号５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとし、配列番号７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとし、表３に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なうＰＣＲを実施した。これによりＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９）の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。得られたポリヌクレオチドをＶ１７６ｐ３とした。

（５）（４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ニッポンジーン製）を形質転換した。
（６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出した。
（７）得られたプラスミドのヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズ製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号５（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）または配列番号７（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。配列解析の結果、Ｆｃ結合性タンパク質の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換されたＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９＿Ｆ（配列番号９）を発現する形質転換体を得た。なお前記フェニルアラニンは配列番号９において１９２番目に位置する。

実施例２ システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓ）の作製
（１）実施例１で作製したＦｃＲ９＿Ｆ（配列番号９）に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号１０に記載のポリヌクレオチドを含んだ発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ９＿Ｆを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１１（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとし、配列番号１２（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとし、表３に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。
（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製の発現ベクターｐＴｒｃ−ＰｅｌＢＶ３にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃ−ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓを得た。
（４）ｐＴｒｃ−ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を、配列番号１３（５’−ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’）または配列番号１４（５’−ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシーケンス用プライマーに使用した以外は、実施例１（７）と同様の方法で行なった。

発現ベクターｐＴｒｃ−ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓで発現されるポリペプチドＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓのアミノ酸配列を配列番号１５に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１６にそれぞれ示す。なお配列番号１５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までが改良ＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。

実施例３ ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓの調製
（１）実施例２で作製したＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓを発現する形質転換体を２Ｌのバッフルフラスコに入った１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよびカルベニシリン１００ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（１）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽（バイオット製）を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。
（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧ（ＩｓｏＰｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ＴｈｉｏＧａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。
（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により菌体を回収した。
（５）回収した菌体を２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
（６）（５）で得られた上清を、あらかじめ２０ｍＭのリン酸緩衝液（８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１２ｍＭリン酸水素二ナトリウム）（ｐＨ７．０）で平衡化した１４０ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０Ｍ（東ソー製）を充填したＶＬ３２×２５０カラム（メルクミリポア製）に流速５ｍＬ／分でアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。
（７）（６）で得られた溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＩｇＧセファロース（ＧＥヘルスケア製）９０ｍＬを充填したＸＫ２６／２０カラム（ＧＥヘルスケア製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。なお溶出液は、溶出液量の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性付近に戻した。
前記精製により、高純度のＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓを約２０ｍｇ得た。

実施例４ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９＿Ｆ）固定化ゲルの作製
（１）２ｍＬの分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー製：液体クロマトグラフィー用充填剤）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、実施例３で調製したＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓを４ｍｇ反応させることにより、ＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲルを得た。
（２）（１）で作製したＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲル１．２ｍＬをφ４．６ｍｍ×７５ｍｍのステンレスカラムに充填してＦｃＲ９＿Ｆカラムを作製した。

＜Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルを用いた抗体分離＞
実施例５ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９＿Ｆ）固定化ゲルを用いた抗体を含む血清およびヒトミエローマ血漿由来抗体の分離
（１）１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）の平衡化緩衝液を調製し、電気伝導度計（堀場製作所社製）を用いて電気伝導度を測定、およびｐＨメーター（堀場製作所社製）を用いて平衡化緩衝液のｐＨから０．１から０．２の幅で塩酸を用いて変動させた際の平衡化緩衝液１Ｌあたりに滴下した塩酸ミリモル数（ｍｍｏｌｅ）を変動した実測のｐＨで割ることで得られた値を緩衝能力値として測定した。
（２）インフォームドコンセントを得た被験者から採血した血液を遠心し、血清を得た。該血清をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）で１０倍希釈した後、０．２μｍ径のフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に通すことで測定サンプルを調製した。
（３）実施例４で作製したＦｃＲ９＿Ｆカラムを高速液体クロマトグラフィー装置（東ソー製）に接続し、（１）で調製した平衡化緩衝液で平衡化した。（２）で調製した測定サンプル（ａ）、および測定サンプル（ｂ）として０．５ｍｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４のヒトミエローマ血漿由来抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を流速１．０ｍＬ／ｍｉｎにて１０μＬ添加した。
（４）流速１．０ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化緩衝液で５分洗浄後、溶出緩衝液５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）によるｐＨグラジエント（２５分で５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）が１００％となるグラジエント）で吸着したガンマグロブリンを溶出し、分離パターンを得た。

比較例１ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９＿Ｆ）固定化ゲルを用いたヒトミエローマ血漿由来抗体の分離
測定サンプルとして（ａ）から（ｃ）の０．５ｍｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍＬのヒトミエローマ血漿由来抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を流速１．０ｍＬ／ｍｉｎにて１０μＬ添加した他は、実施例１と同様な方法でガンマグロブリンの分離パターンを得た。
（ａ）ＩｇＧ１
（ｂ）ＩｇＧ２
（ｃ）ＩｇＧ３。

実施例５および比較例１の結果をまとめて図１に示す。実施例５および比較例１で用いた平衡化緩衝液（電気伝導度２．４ｍＳ／ｃｍ、緩衝能力値３．２）は、本発明の平衡化緩衝液の条件の範囲内である。実施例５の測定サンプル（ａ）である血清では溶出時間５分から２０分の領域において溶出が確認された。また、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３、ＩｇＧ４（比較例１（ａ）および（ｃ）、実施例５（ｂ））においても溶出時間５分から２０分の領域において溶出が確認されたことから血清（実施例５（ａ））の溶出ピークはＩｇＧ１およびＩｇＧ３、ＩｇＧ４に由来することがわかる。一方、ＩｇＧ２（比較例１（ｂ））においてはカラムを平衡化緩衝液で洗浄していた溶出時間０から５分の領域で大部分の溶出（未吸着画分）が確認された。ヒトミエローマ血漿のＩｇＧの結果から、該平衡化緩衝液を用いることで、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３と、ＩｇＧ２の溶出ピークの中間領域にＩｇＧ４が溶出することがわかり、さらに溶出緩衝液を導入後にＩｇＧ４が溶出することからＦｃ結合性タンパク質にＩｇＧ４が平衡化時には吸着していることがわかる。さらにＩｇＧ４の分離ピークがＩｇＧ１と同様に複数のピークに分離していることがわかる。Ｆｃ結合性タンパク質に対する結合能の違いは同一クラスのＩｇＧであった場合、主にＩｇＧに結合している糖鎖の違いによることが知られていることから、ＩｇＧ４に結合している糖鎖の違いでもってＩｇＧ４が複数のピークに分離されていることもわかる。

比較例２ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９＿Ｆ）固定化ゲルを用いた抗体を含む血清およびヒトミエローマ血漿由来抗体の分離
平衡化緩衝液として１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、さらに測定サンプルとして（ａ）から（ｅ）を用いた他は、実施例５と同様な方法でガンマグロブリンの分離パターンを得た。
（ａ）実施例５（２）と同様な方法で調製した測定サンプル
（ｂ）ＩｇＧ１
（ｃ）ＩｇＧ２
（ｄ）ＩｇＧ３
（ｅ）ＩｇＧ４。

比較例２の結果を図２に示す。比較例２で用いた平衡化緩衝液（電気伝導度１４．４ｍＳ／ｃｍ、緩衝能力値３．２）は、本発明の平衡化緩衝液の条件の範囲外である。比較例２の測定サンプル（ａ）である血清では溶出時間１０分から２０分の領域において溶出が確認された。また、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３（比較例２（ｂ）および（ｄ））においても溶出時間１０分から２０分の領域において溶出が確認されたことから血清（比較例２（ａ））の溶出ピークはＩｇＧ１およびＩｇＧ３に由来することがわかる。一方、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４（比較例２（ｃ）および（ｅ））においては溶出時間１０分から２０分の領域にはピークが確認されず、カラムを平衡化緩衝液で平衡化していた溶出時間０から５分の領域で大部分の溶出が確認された。平衡化緩衝液で平衡化中に溶出したということは、Ｆｃ結合性タンパク質に対する結合力が弱いことを意味する。そのため、ＩｇＧ４はカラムに対する未吸着画分に溶出するため、精度よく分離できないことがわかる。ヒトミエローマ血漿由来ＩｇＧ４の分離パターンを本発明の平衡化緩衝液の条件の範囲内である実施例５（ｂ）と範囲外である比較例２（ｄ）とで比較すると、条件の範囲内である実施例５（ｂ）ではＩｇＧ４に由来するピークが未吸着画分の溶出領域から大きく離れていることがわかる。本発明の条件の範囲内である平衡化緩衝液を用いることでＩｇＧ４のＦｃ結合性タンパク質に対する結合力が向上していることがわかり、また未吸着画分に対してＩｇＧ４が精度よく分離できていることがわかる。

実施例６ 平衡化緩衝液の組成の違いによる抗体を含む血清の分離挙動の評価
（１）平衡化緩衝液として、（ａ）から（ｇ）の組成のクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、測定サンプルとして血清を用い、さらに平衡化緩衝液で１０分間洗浄した他は、実施例５と同様な方法でガンマグロブリンの分離パターンを得た。
（ａ）１ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｂ）１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｃ）１０ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｄ）２０ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｅ）１ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｆ）１０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｇ）２５ｍＭのクエン酸緩衝液
（２）得られた分離パターンを基に、以下の指標を基に●、×に分類分けを行った。
●：溶出緩衝液導入開始後にＩｇＧ４を含む画分の溶出が見られる条件
×：溶出緩衝液導入開始後にＩｇＧ４を含む画分の溶出が見られない条件。

比較例３ 平衡化緩衝液の組成の違いによる抗体を含む血清の分離挙動の評価
平衡化緩衝液として、（ａ）から（ｎ）の組成のクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた他は、実施例６と同様な方法でガンマグロブリンの分離パターンを分類分けした。
（ａ）１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む０．１ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｂ）１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｃ）１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｄ）２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｅ）３００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｆ）１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｇ）５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｈ）１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｉ）１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｊ）３０ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｋ）１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｌ）５０ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｍ）１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｎ）８０ｍＭのクエン酸緩衝液。

実施例６および比較例３の結果をまとめて表４および図３に示す。平衡化緩衝液の電気伝導度および緩衝能力値、分類分けをまとめた表４から、実施例６で用いた平衡化緩衝液は本発明の平衡化緩衝液の条件の範囲内であり、比較例３で用いた平衡化緩衝液は本発明の平衡化緩衝液の条件の範囲外であることがわかる。

図３は電気伝導度および緩衝能力値を基に分類分けをプロットしたものである。図３から分類分けと電気伝導度および緩衝能力値の間に相関があることがわかり、電気伝導度および緩衝能力値がともに高い程、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３のみ溶出が見られ、電気伝導度および緩衝能力値がともに低い程、ＩｇＧ４の溶出緩衝液導入後の溶出が見られることがわかる。この結果を基にＩｇＧ４を精度よく分離するための電気伝導度および緩衝能力値の境界領域を求めることができる。
具体的には、●と×の境界線として１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１ｍＭのクエン酸緩衝液と２５ｍＭのクエン酸緩衝液との電気伝導度および緩衝能力値の線から●の領域を示す（ａ）式（電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］≦−０．８１×緩衝能力値＋１２．５）が得られる。なお図示していないが、平衡化緩衝液として緩衝能を有する化合物を添加することから、（ｂ）式（緩衝能力値＞０）および（ｃ）式（電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］＞０）を設定した。

これらの式を組み合わせることで、●の分離パターンを得ることができる領域は（ａ）から（ｃ）式のすべての条件を満たす溶液となる。
実施例７ 平衡化緩衝液の組成の違いによるアルブミンの分離挙動の評価
平衡化緩衝液として、（ａ）から（ｃ）の組成のクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、測定サンプルとして平衡化緩衝液で１ｍｇ／ｍＬに希釈したヒトアルブミン溶液（カタログ番号：ａｂ２０５８０８、ａｂｃａｍ社製）を流速１．０ｍＬ／ｍｉｎにて１０μＬ添加した他は、実施例５と同様な方法でアルブミンの分離パターンを得た。
（ａ）１ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｂ）３ｍＭのクエン酸緩衝液
（ｃ）５ｍＭのクエン酸緩衝液。

実施例７の結果を図４に示す。実施例６の結果より、クエン酸緩衝液として１ｍＭから２０ｍＭの範囲内であれば、本発明の平衡化緩衝液の条件の範囲内であることから、実施例７の平衡化緩衝液（ａ）から（ｃ）は、いずれも本発明の平衡化緩衝液の条件の範囲内である。
ヒトアルブミンの分離パターンを図４に示す。溶出液導入に伴うピーク形成後のアルブミンの溶出を評価すると、平衡化緩衝液として３ｍＭおよび５ｍＭのクエン酸緩衝液（図４（ｂ）および（ｃ））を用いたときは、１ｍＭのクエン酸緩衝液（図４（ａ））を用いたときと比較して、溶出液導入開始後のアルブミン溶出が大きく減少した。クエン酸の濃度が３ｍＭ未満になると、静電相互作用の影響が強く出るために、測定対象であるＩｇＧ以外のタンパク質の一部が、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルに結合したと推測される。この結果から、アルブミンを含む血液由来の試料等の測定サンプルを評価する際には、＞１ｍＭのクエン酸緩衝液（電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］＞０．２４）を用いると、溶出液導入後のアルブミンの溶出を抑制でき、精度よくＩｇＧ４を測定できることがわかる。

Claims (6)

1. Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムの、平衡化液であって、以下の（ａ）から（ｃ）式の条件を少なくともすべて満たす組成である平衡化液。
   （ａ）式：電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］≦−０．８１×緩衝能力値＋１２．５
   （ｂ）式：緩衝能力値＞０
   （ｃ）式：電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］＞０
2. 平衡化液が以下の（ｄ）式の条件をさらに満たす組成である、請求項１に記載の平衡化液。
   （ｄ）式：電気伝導度［ｍＳ／ｃｍ］＞０．２４
3. 少なくともＩｇＧ４を含有し得る抗体試料の分析に適用される、請求項１または２に記載の平衡化液。
4. 少なくともＩｇＧ４を含有し得る抗体試料が血液由来の試料である、請求項３に記載の平衡化液。
5. Ｆｃ結合性タンパク質が、以下の（１）〜（４）のいずれかのポリペプチドである、請求項１〜４の何れか１項に記載の平衡化液：
   （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換されたポリペプチド；
   （２）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも２７番目のバリンがグルタミン酸に、２９番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、３５番目のチロシンがアスパラギンに、４８番目のグルタミンがアルギニンに、７５番目のフェニルアラニンがロイシンに、９２番目のアスパラギンがセリンに、１１７番目のバリンがグルタミン酸に、１２１番目のグルタミン酸がグリシンに、１７１番目のフェニルアラニンがセリンに、および１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換されたポリペプチド；
   （３）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも２７番目のバリンがグルタミン酸に、２９番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、３５番目のチロシンがアスパラギンに、４８番目のグルタミンがアルギニンに、７５番目のフェニルアラニンがロイシンに、９２番目のアスパラギンがセリンに、１１７番目のバリンがグルタミン酸に、１２１番目のグルタミン酸がグリシンに、および１７１番目のフェニルアラニンがセリンに置換されたポリペプチド；
   （４）上記（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列を含み、但し当該アミノ酸配列において、上記置換以外の位置において、一または数個のアミノ酸変異を含む、ポリペプチド。
6. 少なくともＩｇＧ４を含有する抗体試料からＩｇＧ４を分離する方法であって、
   （１）ＩｇＧ４を含有する抗体試料を、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに添加し抗体を前記担体に吸着させる工程、
   （２）前記（１）の前または後に請求項１または２に記載の平衡化液を添加し前記カラムを平衡化する工程、および
   （３）前記平衡化されたカラムに溶出液を添加し、吸着された抗体を溶出させる工程
   を含む、方法。

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