CN114478787B - 一种抗Gd-IgA1单克隆抗体及用于IgA肾病辅助诊断ELISA试剂盒 - Google Patents

一种抗Gd-IgA1单克隆抗体及用于IgA肾病辅助诊断ELISA试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN114478787B
CN114478787B CN202111560005.6A CN202111560005A CN114478787B CN 114478787 B CN114478787 B CN 114478787B CN 202111560005 A CN202111560005 A CN 202111560005A CN 114478787 B CN114478787 B CN 114478787B
Authority
CN
China
Prior art keywords
iga1
igan
kit
iga
monoclonal antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111560005.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114478787A (zh
Inventor
王惠明
王刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hefei Shenghuikang Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Wuhan Shenghuikang Bio Medicine Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Shenghuikang Bio Medicine Technology Co ltd filed Critical Wuhan Shenghuikang Bio Medicine Technology Co ltd
Priority to CN202111560005.6A priority Critical patent/CN114478787B/zh
Publication of CN114478787A publication Critical patent/CN114478787A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114478787B publication Critical patent/CN114478787B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种抗Gd‑IgA1单克隆抗体及用于IgA肾病(IgAN)辅助诊断ELISA试剂盒。本发明提供的人Gd‑IgA1 Elisa试剂盒能够很好的识别Gd‑IgA1标准品，在所测1.25‑100ng/mL范围内，呈线性相关，且不与正常IgA1蛋白发生反应。所述试剂盒可用于诊断和区分正常人、非IgAN肾病患者及IgAN肾病患者，其中IgAN肾病患者血清Gd‑IgA1水平显著高于正常人、非IgAN肾病患者。以血清Gd‑IgA1>8275ng/mL为临界值，本发明试剂盒诊断IgAN的敏感性为73.33％，特异性为83.33％，AUC为0.8022。该试剂盒适用于IgAN的临床辅助诊断。

Description

一种抗Gd-IgA1单克隆抗体及用于IgA肾病辅助诊断ELISA试 剂盒
技术领域
本发明属于生物医药行业体外诊断领域，主要涉及一种抗Gd-IgA1单克隆抗体及用于IgA肾病（IgAN）辅助诊断ELISA试剂盒。
背景技术
IgA肾病（IgAN）是最常见的原发性肾小球肾炎，是终末期肾脏病的主要原因之一，成年人全球年发病率高于2.5/10万，亚洲人群更为常见。目前，IgAN的诊断还必须依赖肾穿刺活检，但肾穿刺为有创性检查，在对病人造成痛苦的同时，还有感染风险。此外，肾穿刺活检取材局限，并不能全面评估肾脏受损程度；反复行肾穿刺活检监测疾病活动度及评估药物治疗效果也不现实。因此，开发无创性的检测手段，对疾病的确诊及疗效观察具有非常重要的临床价值。另一方面，由于肾脏有极强的代偿能力，通常情况下，肾功能下降低于50%，都不会表现出明显的临床症状。因此，肾病患者一般在有明显血尿、蛋白尿或肾功能不全时才会被发现，此时患者的肾损伤已经十分严重，甚至不可逆。由于IgAN的预后与诊断时的肾功能、蛋白尿水平和高血压有关，如何早发现、早诊断、早治疗，对IgAN患者尤为关键。而目前市场上尚缺乏相关检测方法。
IgAN是一种慢性进展性疾病，致病机制十分复杂，涉及多种途径；但糖基化异常的IgA1（Gd-IgA1）在患者肾小球内沉积，导致肾小球损伤是多种致病途径的共同终点。研究表明，检测血清Gd-IgA1水平可用于辅助诊断IgAN；此外，Gd-IgA1的表达水平还与IgAN的进展及预后密切相关。在以往的研究中，测量Gd-IgA1的表达水平多采用基于蜗牛凝集素（Helixaspersa，HAA）检测体系，然而HAA凝集素的多糖识别活性稳定性较差，不适用于大规模研究和临床诊断。除此之外，市场上尚无可以用于临床的Gd-IgA1检测产品。
发明内容
基于上述背景技术，本发明要解决的技术问题是提供一种适用于临床检测、快速且高灵敏地诊断IgAN患者的非侵入性诊断试剂盒或/和非侵入性诊断方法。
针对此，本发明首先提供了一种抗Gd-IgA1单克隆抗体，所述单克隆抗体的基因序列和氨基酸序列如表1所示。其中，抗Gd-IgA1单克隆抗体能特异性识别人Gd-IgA1，可以通过免疫组织化学、免疫荧光及Elisa等方法检测组织（或体液）样本中的沉积（或游离）的Gd-IgA1。
表1. 抗Gd-IgA1单克隆抗体重链和轻链的基因序列与氨基酸序列
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE006
优选地，所述单克隆抗体的轻链编码序列具有与SEQ ID NO.1至少90%以上同一性的核苷酸序列和重链编码序列具有SEQ ID NO.2至少90%以上同一性的核苷酸序列。
优选地，本发明所述的抗Gd-IgA1单克隆抗体通过以下方式获得：①委托第三方公司合成Gd-IgA1绞链区的抗原表位多肽，其序列为：VPST(GalNAc)PPT(GalNAc)PS(GalNAc)PS(GalNAc)TPPT(GalNAc)PSPS-NH2，GalNAc代表N-乙酰半乳糖胺。②将Gd-IgA1抗原表位肽与载体蛋白KLH偶联后，免疫BALB/c小鼠。③免疫完成后，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 SP2/0融合制备杂交瘤细胞。④采用ELISA方法以Gd-IgA1抗原表位肽和人Gd-IgA1筛选产生抗Gd-IgA1单克隆抗体的细胞株。
优选地，本发明还委托第三方公司对产生该抗体的杂交瘤细胞株进行测序，获得了该抗体的重链和轻链基因序列和氨基酸序列（表1），从而使得该抗体可以永久保存，防止杂交瘤细胞株退化所带来的风险。获得抗体序列后，还可以方便的对抗体进行人源化改造，有利于构建嵌合抗体或人源化抗体。
另一方面，本发明还提供了一种能定量检测人血清或血浆样本中Gd-IgA1水平的ELISA检测试剂盒，该试剂盒适用于IgAN的临床辅助诊断，主要包括以下几个方面：①IgAN与其它慢性肾病的鉴别诊断；②IgAN的早期诊断；③IgAN患病风险评估；④动态监测IgAN疾病活动度；⑤评估药物治疗效果。
优选地，所述试剂盒是由抗Gd-IgA1单克隆抗体预包被酶标板、人Gd-IgA1标准品、样本稀释液、浓缩洗涤液、HRP标记抗人IgA1多克隆抗体、TMB显色液和终止液组成。
优选地，抗Gd-IgA1单克隆抗体预包被酶标板是以ELISA包被缓冲液（0.05mol/LpH 9.6碳酸盐缓冲液）将本发明中的抗Gd-IgA1单克隆抗体预包被至96孔酶标板，包被浓度为1-5μg /mL, 包被量0.05～0.25μg /孔。
优选地，人Gd-IgA1标准品通过以下方法获得：①采集多发性骨髓瘤患者血清，将血清用50%硫酸铵沉淀；②收集沉淀用0.01M PBS溶解并透析；③用DEAE-cellulose离子交换色谱分离纯化得到血清Ig；④利用Jacalin-agarose亲和层析得到IgA1；⑤用SephadexG-200尺寸排阻色谱分离获得IgA1单体；⑥Protein G亲和纯化去除残留的IgG；⑦利用10mU/mL神经氨酸酶和半乳糖苷酶在0.01mol/L醋酸盐缓冲液（pH 5）中孵育3h；⑧再次利用Jacalin-agarose亲和层析得到Gd-IgA1；⑨BCA法进行蛋白定量并按500ng/支分装-80度冷冻；⑩以真空冷冻干燥机冻干后，密封并保存于-80度备用。
优选地，样本稀释液为含1~3%BSA、0.1~0.5%深海鱼明胶、0.02~0.05%叠氮化钠的0.01mol/L，pH7.2～7.4的PBS。
优选地，浓缩洗涤液为含0.5~1% Tween20的0.1mol/L，pH7.2～7.4的PBS，使用前用去离子水稀释10倍。
优选地，HRP标记抗人IgA1多克隆抗体为购自三鹰生物公司的商用抗体，以抗体稀释液（含1~3%BSA、0.1~0.5%深海鱼明胶、0.02~0.05%柳硫汞的0.01mol/L，pH7.2～7.4的PBS）配制为1-10μg/mL。
优选地，TMB显色液为购自碧云天生物公司的商用TMB显色液（货号：P0209）。
优选地，终止液为购自碧云天生物公司的商用TMB显色终止液（货号：P0215）。
本发明的有益效果是：
1）本发明提供的人Gd-IgA1 Elisa试剂盒能够很好的识别Gd-IgA1标准品，在所测1.25-100ng/mL范围内，呈线性相关，且不与正常IgA1蛋白发生反应。
2）所述试剂盒可用于诊断和区分正常人、非IgAN肾病患者及IgAN肾病患者，其中IgAN肾病患者血清Gd-IgA1水平显著高于正常人、非IgAN肾病患者。以血清Gd-IgA1 > 8275ng/mL为临界值，本发明试剂盒诊断IgAN的敏感性为73.33%，特异性为83.33%，AUC为0.8022。
3）该试剂盒适用于IgAN的临床辅助诊断，主要包括以下几个方面：①IgAN与其它慢性肾病的鉴别诊断；②IgAN的早期诊断；③IgAN患病风险评估；④动态监测IgAN疾病活动度；⑤评估药物治疗效果。
附图说明
图1是人Gd-IgA1 Elisa试剂盒与HAA凝集素检测体系的比较实验。实线标准曲线，虚线为两种检测方法与正常IgA1蛋白反应OD值；从上至下，依次是线性（Anti-GdlgA1）、线性（HAA）、Anti-GdlgA1 和HAA；
图2是人Gd-IgA1 Elisa试剂盒检测不同肾病患者和正常人血清Gd-IgA1水平；
图3是人Gd-IgA1 Elisa试剂盒检测诊断IgAN的ROC曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语均属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1.抗人Gd-IgA1单克隆抗体的制备
本实施例提供一种抗人Gd-IgA1单克隆抗体的制备方法，具体方法步骤包括：
1）委托第三方公司合成Gd-IgA1绞链区的抗原表位多肽，其序列为：VPST(GalNAc)PPT(GalNAc)PS(GalNAc)PS(GalNAc)TPPT(GalNAc)PSPS-NH2，GalNAc代表N-乙酰半乳糖胺；
2）称取20mg Gd-IgA1抗原表位肽溶解于5mL偶联缓冲液(0.1M MES，pH4.7)中，配成4mg/mL的多肽溶液；
3）利用Imject™ EDC mcKLH Spin Kit（ThermoFisher公司）将Gd-IgA1抗原表位肽与载体蛋白KLH偶联并离心脱盐，实验步骤按照说明书进行；
4）使用偶联好的Gd-IgA1抗原表位肽免疫BALB/c小鼠，共免疫程序为：初免80μg/50μL/只，次免和三免40μg/50μL/只，免疫间隔2周；三免后第4天采集血清检测滴度，对血清效价达到1:100000的小鼠，三免后2周进行冲击免疫，剂量40μg/50μL/只。
5）冲击免疫后第3天，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 SP2/0融合制备杂交瘤细胞，以HAT培养基37℃、饱和湿度、5% CO2培养融合细胞。
6）采用ELISA方法以Gd-IgA1抗原表位肽筛选阳性细胞株进行亚克隆。
7）以常规有限稀释法进行亚克隆。亚克隆板第5天以Gd-IgA1抗原表位肽和人Gd-IgA1包板进行间接Elisa检测，筛选阳性细胞株。
8）将筛选到的细胞株进行扩大培养用于冻存、腹水制备及杂交瘤测序，其中杂交瘤测序交由第三方公司完成。
9）将制得的小鼠腹水以Protein G纯化，制得抗人Gd-IgA1单克隆抗体。
10）抗体亚型鉴定：以抗体亚型鉴定试剂盒检测发现该抗体为IgG2b型鼠单克隆抗体。
实施例2 人Gd-IgA1 Elisa试剂盒的制备
本发明提供的人Gd-IgA1 Elisa试剂盒是由抗人Gd-IgA1单克隆抗体预包被酶标板、人Gd-IgA1标准品、样本稀释液、浓缩洗涤液、HRP标记抗人IgA1多克隆抗体、TMB显色液和终止液组成。
其中，抗人Gd-IgA1单克隆抗体预包被酶标板的制备方法包括如下步骤：
1）以ELISA包被缓冲液（0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液）将抗人Gd-IgA1单克隆抗体预包被至96孔酶标板，包被浓度为1-5μg/mL，包被量50μL/孔，4℃包被过夜。
2）用5%的BSA（以0.01mol/L，pH 7.2～7.4的PBS配制）封闭，每孔100μL，37℃温育1h，洗板3次，拍干。
3）每孔加入200μL酶标板稳定剂（博升生物），在室温孵育60分钟。
4）吸去酶标板稳定剂，将酶标板在吸水纸上拍干，37℃烘干箱干燥90min。
5）使用真空封装机将酶标板密封于铝箔封口袋，4℃保存。
其中，人Gd-IgA1标准品通过以下方法获得：
1）收集多发性骨髓瘤患者血清，将血清用50%硫酸铵沉淀；
2）收集沉淀用0.01M PBS溶解并透析；
3）DEAE-cellulose离子交换色谱分离纯化得到血清Ig；
4）利用Jacalin-agarose亲和层析得到IgA1；
5）用Sephadex G-200尺寸排阻色谱分离获得IgA1单体；
6）Protein G亲和纯化去除残留的IgG；
7）利用10 mU/mL神经氨酸酶和半乳糖苷酶在0.01mol/L醋酸盐缓冲液（pH 5）中孵育3h；
8）再次利用Jacalin-agarose亲和层析得到Gd-IgA1；
9）BCA法进行蛋白定量并按500ng/支分装-80度冷冻；
10）以真空冷冻干燥机冻干后，密封并保存于-80度备用。
其中，样本稀释液为含1~3%BSA、0.1~0.5%深海鱼明胶、0.02~0.05%叠氮化钠的0.01mol/L，pH7.2～7.4的PBS；
其中，浓缩洗涤液为含0.5~1% Tween20的0.1mol/L，pH7.2～7.4的PBS，使用前用去离子水稀释10倍；
其中，HRP标记抗人IgA1多克隆抗体为购自三鹰生物公司的商用抗体，以抗体稀释液（含1~3%BSA、0.1~0.5%深海鱼明胶、0.02~0.05%柳硫汞的0.01mol/L，pH7.2～7.4的PBS）配制为1-10μg/mL；
其中，TMB显色液为购自碧云天生物公司的商用TMB显色液（货号：P0209）；
其中，终止液为购自碧云天生物公司的商用TMB显色终止液（货号：P0215）。
实施例3 人Gd-IgA1 Elisa试剂盒的检测方法
利用本发明（实施例2）的人Gd-IgA1 Elisa试剂盒在检测人血清或血浆中Gd-IgA1水平的应用，其步骤是：
1）配置标准品：①首次使用时，以1mL样本稀释液溶解标准品至500ng/mL作为储存液，储存液可以分装冻存，每次使用时取出1份，以避免标准品反复冻融。②取1支EP管，加入样本稀释液160μL，再加入标准品储存液40μL，配制成100ng/mL，标记为C1。③另取6支EP管，每管加样本稀释液100μL，依次标记为C2-C7。④从C1管中取100μL标准品加入C2，充分混匀；再从C2管中取100μL标准品加入C3, 充分混匀；依此类推。⑤所得C1-C7标准品浓度依次为：100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56 ng/mL。
2）样品准备：将待测血清或其它样品用样本稀释液按1:500-1000稀释备用。
3）配置洗涤液：以去离子水将浓缩洗涤液稀释10倍备用。
4）从试剂盒中取出酶标板，将样品和标准品分别加入酶标板中，每孔50μL；同时设空白孔，加入50μL样本稀释液。
5）加样完成后，轻振酶标板混匀孔中样品，封板膜封板，置37℃温箱孵育1小时。
6）弃去孔中溶液，每孔加入350μL洗涤液,洗板4次，最后一次在吸水纸上拍干。
7）每孔加入HRP标记抗人IgA1多克隆抗体50μL，封板膜封板，37℃孵育30min。
8）重复步骤6），每孔加入TMB显色液50μL，室温避光反应15-30分钟。
9）每孔加入50μL TMB显色终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值（OD450nm）。
10）以空白孔和标准品孔的OD值，作标准曲线，计算检测孔Gd-IgA1浓度，乘以样品稀释位数，获得样品Gd-IgA1浓度。
实施例4 人Gd-IgA1 Elisa试剂盒与HAA凝集素检测体系的比较实验
1）按实施例3所述方法配制Gd-IgA1标准品。
2）按实施例2所述方法制备IgA1蛋白，但不以神经氨酸酶和半乳糖苷酶处理，并参考步骤1配制浓度依次为：100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56 ng/mL的正常IgA1蛋白。
3）按实施例3所述本发明中的人Gd-IgA1 Elisa试剂盒检测方法进行实验，并制作标准曲线。
4）HAA凝集素检测体系，制作标准曲线的步骤如下：①以ELISA包被缓冲液（0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液）将抗人IgA1单克隆抗体包被至96孔酶标板，包被浓度为5μg/mL包被量50μL/孔, 4℃包被过夜。②封闭：向包被好的酶标板中，每孔加入100μL含5%BSA的PBS溶液，室温封闭2小时，每孔加入350μL洗涤液,洗板2次。③将配制好的标准品和正常IgA1蛋白（步骤3中配制）依次加入包被好的酶标板中，每孔50μL；同时设空白孔，加入50μL样本稀释液。④加样完成后，轻振酶标板混匀孔中样品，封板膜封板，置37℃温箱孵育1小时。⑤弃去孔中溶液，每孔加入350μL洗涤液,洗板4次，最后一次在吸水纸上拍干。⑥每孔加入50μL生物素标记HAA凝集素（PBS溶解为2μg/mL，Sigma-Aldrich公司），封板膜封板，37℃孵育2小时。⑦洗板4次，每孔加入50μL HRP标记链霉亲和素（PBS 1:10000稀释，Abcam公司），封板膜封板，37℃孵育1小时。⑧洗板4次，每孔加入TMB显色液50μL，室温避光反应15-30分钟。⑨每孔加入50μL TMB显色终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值（OD450nm）。⑩以空白孔和标准品孔的OD值，作标准曲线。
实验结论：人Gd-IgA1 Elisa试剂盒能够很好的识别Gd-IgA1标准品，在所测1.25-100ng/mL范围内，呈线性相关；HAA凝集素检测体系也能够很好的识别Gd-IgA1标准品，在所测1.25-100ng/mL范围内，呈线性相关；二者均不与正常IgA1蛋白发生反应（图1）。
实施例5 利用人Gd-IgA1 Elisa试剂盒检测不同肾病患者和正常人血清Gd-IgA1水平
1）收集正常人血清、非IgAN肾病患者血清及IgAN肾病患者血清各30例。
2）按实施例3所述本发明中的人Gd-IgA1 Elisa试剂盒检测方法进行实验，检测不同肾病患者和正常人血清Gd-IgA1水平。
实验结论：正常人血清、非IgAN肾病患者血清及IgAN肾病患者血清Gd-IgA1水平分别为：6383.18±2961.46、6548.96±3282.68和15107.38±10259.28 ng/mL。其中，IgAN肾病患者血清Gd-IgA1水平显著高于正常人、非IgAN肾病患者（图2）。以血清Gd-IgA1 >8275ng/mL为临界值，诊断IgAN的敏感性为73.33%，特异性为83.33%，AUC为0.8022（图3）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 一种抗Gd-IgA1单克隆抗体及用于IgA肾病辅助诊断ELISA试剂盒
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
gacgtggtgc tgacccagac cccccccccc ctgtccgtgg ccatcggcca gtccgtgtcc 60
atctcctgca agtcctccca gtccctggtg cccaccgacg gcaagaccta cctgcactgg 120
ctgctgcagt cccccggcca gtcccccaag ctgctgatct accaggtgtc caacctgggc 180
tccggcgtgc ccgaccggtt ctccggcacc ggctcccaga aggacttcac cctgaagatc 240
tcccgggtgg aggccgagga cctgggcgtg tactactgcg tgcaggccac ccactccccc 300
ctgaccttcg gcctgggcac caagctggag ctgcagcggg ccgacgccgc ccccaccgtg 360
tccatcttcc ccccctcctc cgagcagctg acctccggcg gcgcctccgt ggtgtgcttc 420
ctgaacaact tctaccccaa ggacatcaac gtgaagtgga agatcgacgg ctccgagcgg 480
cagaacggcg tgctgaactc ctggaccgac caggactcca aggactccac ctactccatg 540
tcctccaccc tgaccctgac caaggacgag tacgagcggc acaactccta cacctgcgag 600
gccacccaca agacctccac ctcccccatc gtgaagtcct tcaaccggaa cgagtgc 657
<210> 2
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 2
gagctgcagc tgcaggagtc cggccccggc ctggtgaagc cctcccagtc cctgtccctg 60
acctgctccg tgaccggcta ctccatccgg accaactact ggggctggat ccggaagttc 120
cccggcaaca agatggagtg gatgggctac atcaccctgt ccggcggcac ctactacaac 180
ccctccctga agtcccggat ctccatcacc cgggacacct ccaagaacca gttcttcctg 240
cagctgacct ccgtgaccac cgaggacacc gccacctact actgcacccg gtggggcaac 300
tggtacttcg acttctgggg ccccggcacc aaggtgaccg tgtcccccgc caagaccacc 360
gccccctccg tgtaccccct ggcccccgtg tgcggcggca ccaccggctc ctccgtgacc 420
ctgggctgcc tggtgaaggg ctacttcccc gagcccgtga ccctgacctg gaactccggc 480
tccctgtcct ccggcgtgca caccttcccc gccctgctgc agtccggcct gtacaccctg 540
tcctcctccg tgaccgtgac ctccaacacc tggccctccc agaccatcac ctgcaacgtg 600
gcccaccccg cctcctccac caaggtggac aagaagatcg agccccgggt gcccatcacc 660
cagaacccct gcccccccct gaaggagtgc cccccctgcg ccgcccccga cctgctgggc 720
ggcccctccg tgttcatctt cccccccaag atcaaggacg tgctgatgat ctccctgtcc 780
cccatggtga cctgcgtggt ggtggacgtg tccgaggacg accccgacgt gcagatctcc 840
tggttcgtga acaacgtgga ggtgcacacc gcccagaccc agacccaccg ggaggactac 900
aactccaccc tgcgggtggt gtccgccctg cccatccagc accaggactg gatgtccggc 960
aaggagttca agtgcaaggt gaacaaccgg gccctgccct cccccatcga gaagaccatc 1020
tccaagcccc ggggccccgt gcgggccccc caggtgtacg tgctgccccc ccccgccgag 1080
gagatgacca agaaggagtt ctccctgacc tgcatgatca ccggcttcct gcccgccgag 1140
atcgccgtgg actggacctc caacggccgg accgagcaga actacaagaa caccgccacc 1200
gtgctggact ccgacggctc ctacttcatg tactccaagc tgcgggtgca gaagtccacc 1260
tgggagcggg gctccctgtt cgcctgctcc gtggtgcacg agggcctgca caaccacctg 1320
accaccaaga ccatctcccg gtccctgggc aag 1353
<210> 3
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 3
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Pro Leu Ser Val Ala Ile Gly
1 5 10 15
Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val Pro Thr
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Leu Leu Gln Ser Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gln Lys Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala
85 90 95
Thr His Ser Pro Leu Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys Leu Glu Leu Gln
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 4
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 4
Glu Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Asn
20 25 30
Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Thr Leu Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu
65 70 75 80
Gln Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Trp Gly Asn Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Pro Gly Thr Lys Val
100 105 110
Thr Val Ser Pro Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Asn Thr Trp Pro
180 185 190
Ser Gln Thr Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Val Pro Ile Thr Gln Asn Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Leu Lys Glu Cys Pro Pro Cys Ala Ala Pro Asp Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
245 250 255
Ile Ser Leu Ser Pro Met Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
260 265 270
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
275 280 285
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
290 295 300
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
305 310 315 320
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Arg Ala Leu Pro Ser Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Arg Gly Pro Val Arg Ala Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Met Thr Lys Lys Glu Phe Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Met Ile Thr Gly Phe Leu Pro Ala Glu Ile Ala Val Asp
370 375 380
Trp Thr Ser Asn Gly Arg Thr Glu Gln Asn Tyr Lys Asn Thr Ala Thr
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
405 410 415
Gln Lys Ser Thr Trp Glu Arg Gly Ser Leu Phe Ala Cys Ser Val Val
420 425 430
His Glu Gly Leu His Asn His Leu Thr Thr Lys Thr Ile Ser Arg Ser
435 440 445
Leu Gly Lys
450

Claims (10)

1.一种抗Gd-IgA1单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体具有SEQ ID NO.3所示的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO.4所示的重链氨基酸序列。
2.如权利要求1所示的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链编码序列具有与SEQ ID NO.1至少90%以上同一性的核苷酸序列和重链编码序列具有SEQ ID NO.2至少90%以上同一性的核苷酸序列。
3.一种定量检测人血清或血浆样本中Gd-IgA1水平的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：权利要求1或2任一项所述的抗Gd-IgA1单克隆抗体预包被的酶标板、人Gd-IgA1标准品、样本稀释液、浓缩洗涤液、HRP标记抗人IgA1多克隆抗体、TMB显色液和终止液。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，抗Gd-IgA1单克隆抗体预包被的酶标板是以包含0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液的ELISA包被缓冲液将权利要求1或2中所述的抗Gd-IgA1单克隆抗体预包被至96孔酶标板，包被浓度为1-5μg/mL，包被量0.05～0.25μg/孔。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述人Gd-IgA1标准品通过以下方法获得：①采集多发性骨髓瘤患者血清，将血清用50%硫酸铵沉淀；②收集沉淀用0.01M PBS溶解并透析；③用DEAE-cellulose离子交换色谱分离纯化得到血清Ig；④利用Jacalin-agarose亲和层析得到IgA1；⑤用Sephadex G-200尺寸排阻色谱分离获得IgA1单体；⑥Protein G亲和纯化去除残留的IgG；⑦利用10 mU/mL神经氨酸酶和半乳糖苷酶在0.01mol/L pH 5醋酸盐缓冲液中孵育3h；⑧再次利用Jacalin-agarose亲和层析得到Gd-IgA1；⑨BCA法进行蛋白定量并按500ng/支分装-80度冷冻；⑩以真空冷冻干燥机冻干后，密封并保存于-80度备用。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液为含1~3% BSA、0.1~0.5%深海鱼明胶、0.02~0.05%叠氮化钠的0.01mol/L，pH 7.2～7.4的PBS。
7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含0.5~1% Tween20的0.1mol/L，pH 7.2～7.4的PBS，使用前用去离子水稀释10倍。
8.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述HRP标记抗人IgA1多克隆抗体为购买的商用抗体，以含1~3% BSA、0.1~0.5%深海鱼明胶、0.02~0.05%柳硫汞的0.01mol/L，pH 7.2～7.4的PBS的抗体稀释液配制为1-10μg /mL。
9.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述TMB显色液为购买的商用TMB显色液；所述终止液为购买的商用TMB显色终止液。
10.权利要求1-2任一项所述的单克隆抗体或权利要求3-9任一项所述的试剂盒在制备用于IgAN的临床辅助诊断试剂中的用途，所述辅助诊断是①IgAN与其它慢性肾病的鉴别诊断或②IgAN的早期诊断或③IgAN患病风险评估或④动态监测IgAN疾病活动度或⑤评估IgAN药物治疗效果。
CN202111560005.6A 2021-12-20 2021-12-20 一种抗Gd-IgA1单克隆抗体及用于IgA肾病辅助诊断ELISA试剂盒 Active CN114478787B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111560005.6A CN114478787B (zh) 2021-12-20 2021-12-20 一种抗Gd-IgA1单克隆抗体及用于IgA肾病辅助诊断ELISA试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111560005.6A CN114478787B (zh) 2021-12-20 2021-12-20 一种抗Gd-IgA1单克隆抗体及用于IgA肾病辅助诊断ELISA试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114478787A CN114478787A (zh) 2022-05-13
CN114478787B true CN114478787B (zh) 2022-09-13

Family

ID=81494787

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111560005.6A Active CN114478787B (zh) 2021-12-20 2021-12-20 一种抗Gd-IgA1单克隆抗体及用于IgA肾病辅助诊断ELISA试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114478787B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117512146A (zh) * 2023-11-30 2024-02-06 上海市闵行区中心医院 一种与肾病相关的生物标志物及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110672854A (zh) * 2019-09-11 2020-01-10 北京大学第一医院(北京大学第一临床医学院) 一种用于血清学诊断IgA肾病的分子探针
TWI774099B (zh) * 2019-10-29 2022-08-11 國防醫學院 針對ＩｇＡ腎病變之快速、非侵犯性的檢測個體之半乳糖缺陷ＩｇＡ１表現之診斷試劑組及其方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114478787A (zh) 2022-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2748613B1 (en) Oxmif as a diagnostic marker
CN111349161B (zh) 抗cd19抗体的单克隆抗体及其应用
KR102366820B1 (ko) 진단을 위한 세포 표면 전립선암 항원
EP2698633B1 (en) Psa assay method and reagent therefor
CN112394179B (zh) Fmc63 car-t细胞免疫原性elisa检测试剂盒
CN114478787B (zh) 一种抗Gd-IgA1单克隆抗体及用于IgA肾病辅助诊断ELISA试剂盒
EP3088890B1 (en) Method for measuring soluble gpc3 protein
CN108697796A (zh) 对于ADV感染的检测和诊断有用的由细胞杂交瘤产生和分泌的对人腺病毒（ADV）的pIII抗原具有特异性的单克隆抗体
US20140363832A1 (en) Molecular marker for the early detection of malignant pleural mesothelioma and the methods of its expression analysis using blood and pleural effusion samples
EP1947460B1 (en) Method of measuring ptx3 with high sensitivity
CN107690439B (zh) Igf-1r抗体及其诊断癌症的用途
CN114755420B (zh) 碳青霉烯酶联合检测试剂盒
CN107746430B (zh) 一种gp73 c端抗原的制备及其应用
EP3239711A2 (en) Method for measuring anti-drug antibody
CN104861062B (zh) 高致病性禽流感病毒h5n1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒
US10648987B2 (en) Methods and compositions relating to anti-HcTnT-N69 antibody for detection of cardiac disorders
CN106093401B (zh) 一种检测胸苷激酶1的诊断试剂盒
KR102350259B1 (ko) Igf-1r 항체 및 암의 진단을 위한 그의 용도
JP3337523B2 (ja) β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ−ゼのサンドイッチ免疫測定法、および該測定法に用いるモノクロ−ナル抗体
CN113621059B (zh) 一种β2-微球蛋白检测试剂盒及其临床应用
EP2772501B1 (en) Monoclonal antibody capable of specifically recognizing asparagine synthase
EP4130740A1 (en) Measuring method for fragment including 7s-domain of human type-iv collagen, and kit to be used therefor
US20130130276A1 (en) Method for detecting gastric cancer
CN116789826A (zh) 抗人lilrb2全人源单域抗体及其应用
JP2003344414A (ja) Ｒｃａｓ１の測定方法、及びｒｃａｓ１測定用キット

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230817

Address after: 430072 Hubei Province, Wuhan city Wuchang District of Wuhan University Luojiashan

Patentee after: WUHAN University

Address before: 430074 No. 04, floor 5, building B10, phase I, Wuhan hi tech medical device Park, No. 818, Gaoxin Avenue, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province

Patentee before: WUHAN SHENGHUIKANG BIO-MEDICINE TECHNOLOGY Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240627

Address after: Room 405, Building A1, Phase I, Zhong'an Chuanggu Science and Technology Park, No. 900 Wangjiang West Road, High tech Zone, Hefei City, Anhui Province, 230031

Patentee after: Hefei Shenghuikang Medical Technology Co.,Ltd.

Country or region after: China

Address before: 430072 Hubei Province, Wuhan city Wuchang District of Wuhan University Luojiashan

Patentee before: WUHAN University

Country or region before: China