JP2021052786A - 単分散貴金属ナノ結晶の双角錐鋳型合成 - Google Patents

Abstract

【課題】混合貴金属ナノ結晶試料からサイズおよび形状の多分散度（ばらつき）が極めて低い貴金属双角錐ナノ結晶の試料を形成する方法を提供する。【解決手段】この試料は高純度、実質的に単分散のプラズモン金双角錐ナノ結晶を含有する試料を含む。また、貴金属双角錐ナノ結晶を種結晶粒子として用いて、二次双晶金属ナノ結晶を成長させる方法を提供する。成長させるための種双角錐ナノ結晶と同様、二次ナノ結晶は双晶ナノ結晶であり、サイズおよび形状の多分散度が極めて低いことを特徴とする。これらの方法で成長させた二次双晶ナノ結晶は、肥大した金属双角錐ナノ結晶、および様々な先端形状を有する異方性の「ダンベル」形状を持ったナノ結晶を含む。また、貴金属双角錐ナノ結晶をプラズモンヒーターとして用い、プラズモン光熱放射−熱変換を経て、反応液を加熱する方法を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照

本出願は２０１５年６月８日に出願された米国仮特許出願番号62/172,481に優先権主張するものであり、これにより、そのすべての内容は参照により含まれる。

国の権利に対する参照

本発明は国立衛生研究所からの助成番号NIH 5T32GM008720のもとで米国政府の援助で行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。

貴金属ナノ粒子は表面増強ラマン分光法、薬物送達および治療学、触媒、および非線形光学などの多種多様な潜在的用途を有するナノテクノロジーの新興分野に不可欠な要素となってきている。局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）および局所場増強は構造およびサイズに依存するので、ナノ構造の精密設計および合成により金属材料の光学的性質の利用や操作が可能になっている。さらに、単分散コロイドナノ粒子を高収率で得ることはこれらの材料を広範囲で使用する上で、重要な手段である。金の双角錐は注目すべきサイズと形状の単分散性を示す。理論計算により、局所場増強は、ナノロッドまたは鋭い先端を有する他の形状よりも双角錐でより強いことが予測されている。しかしながら、直接合成ではおおよそ３０％の双角錐が得られるのみであり、残りは形状不純物、すなわち、ナノロッド（約１０％）および疑似球形 粒子（約６０％）である（Liu, M. & Guyot-Sionnest, P. Mechanism of silver(i)-assisted growth of gold nanorods and bipyramids. J. Phys. Chem. B 109, 22192-22200 (2005)を参照）。収率は界面活性剤臭化セチルトリブチルアンモニウムを用いるとわずかに改善されるが、高純度の金双角錐は、いまだ合成法のみの使用では実現されていない（Kou, X. et al. Growth of gold bipyramids with improved yield and their curvature-directed oxidation. Small 3, 2103-2113 (2007)を参照）。

核酸の増幅法は化学者、生物学者および医学者にとって、重要で価値のあるツールの代表であり、すべての研究分野で広く利用されてきている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はこれらの技術の中の 代表的な標準法であり、多くの学術領域に亘る応用でほぼ例外なく用いられてきている（Ishmael F.T., Stellato C., Principles and applications of polymerase chain reaction: basic science for the practicing physician. Annals of Allergy, Asthma & Immunology. 2008; 101(4):437-43を参照）。ＰＣＲはヒトゲノムプロジェクトの完遂において重要な役割を演じ、それ以前には分からなかった遺伝子および遺伝性の情報をもたらした（Adams M., Kelley J., Gocayne J., Dubnick M., Polymeropoulos M., Xiao H., Merril C., Wu A., Olde B., Moreno R., et al., Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project. Science. 1991; 252(5013):1651-6を参照）。さらに、現在のＰＣＲの応用は実時間での生体関連分子の早期検出から、合成自己組織化のための核酸の足場の合成に亘っている（Garibyan L., Avashia N., Polymerase Chain Reaction. J Invest Dermatol. 2013;,133(3):e6; and Buβkamp H., Keller S., Robotta M., Drescher M., Marx A., A new building block for DNA network formation by self-assembly and polymerase chain reaction. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 2014;10:1037-46.を参照）。この技術の多くの分野への有用な応用にも拘わらず、熱サイクルの必要性という大きな制限を抱えている。熱サイクル手順、および精密な温度制御が可能なサーマルサイクラーなどの高額で大きな装置の必要性は、この試験の持ち運び性を大きく制限し、看護拠点計画での使用を妨げている。さらに、これらの分野でのＰＣＲプロセスのスピードとそれに伴う効率を高めたいという要求がある。早期検出、迅速な診断および高い持ち運び性はエボラ危機やジカ危機などの新しい突発的伝染の発見や同定には不可欠である（Kurosaki Y., Takada A., Ebihara H., Grolla A., Kamo N., Feldmann H., Kawaoka Y., Yasuda J., Rapid and simple detection of Ebola virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 2007; 141(1):78-83.を参照）。

混合貴金属ナノ結晶試料からサイズおよび形状の多分散度（ばらつき）が極めて低い貴金属双角錐ナノ結晶の試料を形成する方法を提供する。また、貴金属双角錐ナノ結晶を種結晶粒子として用いて、二次双晶金属ナノ結晶を成長させる方法を提供する。成長させるための種双角錐ナノ結晶と同様、二次ナノ結晶はサイズおよび形状の多分散度が極めて低いことを特徴とする双晶ナノ結晶である。貴金属双角錐ナノ結晶をプラズモンヒーターとして用い、プラズモン光熱放射−熱変換を経て、反応液を加熱する方法を提供する。これらの応用は、ＰＣＲなどの核酸増幅手順、段階的熱誘導酵素反応スキームを含む。

金属双角錐ナノ結晶および少なくとも１種の別の型の金属ナノ結晶を含む出発試料から金属双角錐ナノ結晶試料を形成する方法の一実施態様は以下の工程：出発試料および塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムの水溶液を作製する工程；金属双角錐ナノ結晶を前記水溶液から凝集させるのに十分な時間および温度に前記水溶液を保持する工程；および凝集した金属双角錐ナノ結晶を溶液から分離し、金属ナノ結晶の少なくとも８５％が金属双角錐ナノ結晶である金属ナノ結晶を提供する工程を含む。

双晶金属双角錐ナノ結晶から二次双晶金属ナノ結晶を成長させる方法の一実施態様は、以下の工程：種金属双角錐ナノ結晶、少なくとも１種の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤、金属前駆体分子、および還元剤を含む溶液を調製する工程；還元剤が前駆体分子中の金属を還元し、金属が種金属双角錐ナノ結晶面に析出し、それによって二次双晶金属ナノ結晶を成長させる条件で溶液を保持する工程を含む。

双晶金属双角錐ナノ結晶から二次双晶金属ナノ結晶を成長させる方法の別の実施態様は以下の工程：種金属双角錐ナノ結晶、少なくとも１種の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤、および酸化エッチング剤を含む溶液を調製する工程；酸化エッチング剤が種金属双角錐ナノ結晶を酸化して、双晶金属ナノロッドナノ結晶を形成する条件で溶液を保持する工程；双晶金属ナノロッドナノ結晶、少なくとも１種の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤、金属前駆体分子、および還元剤を含む溶液を調製する工程；および還元剤が前駆体分子中の金属を還元して、金属が双晶金属ナノロッドナノ結晶面に析出し、それによって二次双晶金属ナノ結晶を成長させる条件で溶液を保持する工程を含む。

本発明の方法のいくつかの実施態様では、１種のみの陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤を用いる。一方、いくつかの実施態様では２成分の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤を用いる。

双晶金属双角錐ナノ結晶から成長できる双晶金属ナノ結晶は、双晶ナノロッドナノ結晶、双晶長尺状双角錐ナノ結晶、双晶球状多面体ナノ結晶、双晶二錘ナノ結晶、双晶二錘形状の本体および双角錐形状の末端を含むダンベル形を有する双晶ナノ結晶、双晶二錘形状の本体および多数の双晶棒状の末端を含むダンベル形を有する双晶金属ナノ結晶、および双晶二錘形状の本体および多数の双晶球状の末端を含むダンベル形を有する双晶金属ナノ結晶を含む。

化学反応物を含む反応混合物を光熱加熱する方法の一実施態様は：反応混合物を金属双角錐ナノ結晶と接触させること；および金属双角錐ナノ結晶を放射線で照射すること（ここで金属双角錐ナノ結晶は放射線を吸収し、光熱照射−熱変換を経て、反応混合物を加熱する）を含む。化学反応物は、例えば、ＤＮＡ分子および／または酵素などの生体分子を含んでもよい。金属双角錐ナノ結晶は、金属ナノ結晶の少なくとも８５％が金属双角錐ナノ結晶で、前記金属双角錐ナノ結晶は８％未満の多分散度を有する金属ナノ結晶試料の一部として加えてもよい。前記方法は、反応溶液の様々な化学反応を調節するために用いることができる。

化学反応を光熱調節する方法の一実施態様は：（ａ）２つ以上の化学反応物、および金属ナノ結晶の少なくとも８５％がプラズモン金属双角錐ナノ結晶であり、前記プラズモン金属双角錐ナノ結晶は８％未満の多分散度を有する金属ナノ結晶試料を含む反応溶液の調製；および（ｂ）反応溶液を電磁波スペクトルの可視光領域、電磁波スペクトルの赤外領域、または両方の波長を有する放射線で溶液を照射すること（ここでプラズモン金属双角錐ナノ結晶は放射線を吸収し、プラズモン光熱照射−熱変換を経て、反応混合物を、２つ以上の化学反応物間の化学反応を調節する温度に加熱する）を含む。

標的核酸分子を増幅する方法の一実施態様は：（ａ）標的核酸分子；プライマー核酸鎖；遊離ヌクレオチド；核酸ポリメラーゼ；および、金属ナノ結晶の少なくとも８５％がプラズモン金属双角錐ナノ結晶であり、前記プラズモン金属双角錐ナノ結晶は８％未満の多分散度を有する金属ナノ結晶試料を含む反応溶液の調製；および（ｂ）複数回の光熱サイクルを通じて反応溶液を循環させることを含む。それぞれの光熱サイクルは（ｉ）反応溶液を電磁波スペクトルの可視光領域、電磁波スペクトルの赤外領域、または両方の波長を有する放射線で溶液を照射すること（ここでプラズモン金属双角錐ナノ結晶は放射線を吸収し、プラズモン光熱照射−熱変換を経て、反応混合物を、標的核酸分子が変性を起こす温度に加熱する）；および（ｉｉ）プライマー核酸鎖が変性した標的核酸分子をアニールし、アニールされたプライマー核酸鎖から出発して核酸の新たな鎖が合成されて新しい標的核酸分子を形成する温度に反応溶液を冷却することを含む。

酵素反応を 熱的に制御する方法の一実施態様は：（ａ）酵素、基質分子、および金属ナノ結晶の少なくとも８５％がプラズモン金属双角錐ナノ結晶であり、前記プラズモン金属双角錐ナノ結晶は８％未満の多分散度を有する金属ナノ結晶試料を含む反応溶液の調製；および（ｂ）反応溶液を電磁波スペクトルの可視光領域、電磁波スペクトルの赤外領域、または両方の波長を有する放射線で溶液を照射すること（ここでプラズモン金属双角錐ナノ結晶は放射線を吸収し、プラズモン光熱照射−熱変換を経て、第１の温度から第２の温度に反応溶液を加熱する）を含む。前記第１の温度では、酵素が基質分子と酵素−基質複合体を形成する活性状態にあって、基質分子を生成物分子に変換し、第２の温度では、酵素は失活して基質分子から解離する。

いくつかの実施態様では、上述の双角錐ナノ結晶は双角錐ナノ結晶の構造およびサイズによって、可視から赤外までの光を吸収できるので、反応溶液の照射は可視光（４００ｎｍ）から赤外光（１２００ｎｍ）の範囲の光源で提供されてもよい。

本発明の他の原理的特徴および利点は以下の図面、詳細な説明、および添付の請求項のレビューに基づき、当業者に明らかになるであろう。

本発明の実例となる実施態様を以下に図面を参照して説明する。ここで同じ数字は同じ要素を意味する。

金属双角錐ナノ結晶の形状制御の略図。（金属双角錐ナノ結晶は本発明では金属双角錐とも呼ばれる。）双角錐から派生する特徴的な構造を生成する様々な経路が示されている。

塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム（ＢＤＡＣ）を用いる枯渇凝集による精製で得られた双角錐の略図。 ＢＤＡＣでの枯渇凝集による精製で得られた双角錐のＵＶ−可視−ＮＩＲスペクトル。 はＢＤＡＣでの枯渇凝集による精製で得られた双角錐の 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像。 図２Ｃ中の元の種金属双角錐ナノ結晶から再成長した様々なサイズの双角錐のＴＥＭ像。パネル１−５に示した双角錐は図２Ｅ中の曲線６−１０に相当する。 精製した（上のパネルの１−５）および再成長した双角錐（下のパネルの６−１０）の規格化した吸光スペクトル。差し込み図は精製した双角錐の縦方向表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）の拡大スペクトルを示す。ＬＳＰＲピークの半値全幅（ＦＷＨＭ）は１から１０に対してそれぞれ、５８、６０、６３、６０、５９、７３、１１３、１２１、１２６および１５４ｎｍすなわち２１．４、２０．７、１９．７、２０．７、２１．０、１７．０、１１．０、１０．３、９．８および８．１ｅＶと測定された。

単一（一成分とも表される）の界面活性剤（１−５：左パネル）および二成分界面活性剤（６−１０：右パネル）で精製した双角錐種結晶から再成長した単分散構造のＴＥＭ像。影付きの矢印は再成長の特定の条件を示す（詳細な条件は表１も参照）。すべてのスケールバーはそれぞれ低倍率で２００ｎｍ、高倍率で５０ｎｍである。 界面活性剤（１−５は図３Ａの１−５に該当する）で再成長した構造の規格化したＵＶ−可視−ＮＩＲスペクトル。 それぞれ界面活性剤（６−１０は図３Ａの６−１０に該当する）で再成長した構造の規格化したＵＶ−可視−ＮＩＲスペクトル。詳細なサイズ測定結果は表３を参照のこと。

双角錐の周期的双五角錘四面体双晶形成の略図。灰色の部分は成長方向に対して垂直な双角錐の断面を示す。それぞれの双晶形成面はＴ１からＴ５とラベルが付けられている。右の図は、ビーム方向に関して基板上の双角錐の可能な配向のほとんどを示す。 図３Ａ、パネル１の再成長双角錐のＨＲ−ＴＥＭ像。 図３Ａ、パネル２の再成長双角錐のＨＲ−ＴＥＭ像。 図３Ａ、パネル３の再成長双角錐のＨＲ−ＴＥＭ像。 図３Ａ、パネル７の再成長双角錐のＨＲ−ＴＥＭ像。 図３Ａ、パネル８の再成長双角錐のＨＲ−ＴＥＭ像。 図３Ａ、パネル９の再成長双角錐のＨＲ−ＴＥＭ像。 図３Ａ、パネル６の再成長双角錐のＨＲ−ＴＥＭ像。 図３Ａ、パネル１０の再成長双角錐のＨＲ−ＴＥＭ像。粒子の先端および中央の白色の四角で印をつけた部分は格子縞を測定した場所を示す。すべてのスケールバーは２０ｎｍである。

ＢＤＡＣで１２０℃、１０分、３０分、および９０分（パネル１から３に示す）加熱して得られた、酸化エッチングした構造のＴＥＭ像。下のパネルは低倍率の像である。すべてのスケールバーは高倍率、低倍率それぞれに対して５０ｎｍおよび２００ｎｍである。 加熱時間を増した結果得られたエッチングされた構造の規格化したＵＶ−可視−ＮＩＲスペクトル。

図５Ａのパネル３の酸化エッチングされたナノロッドから一成分界面活性剤を用いて再成長させた単分散ナノロッドのＴＥＭ（左列）およびＨＲ−ＴＥＭ（中央列および右列）像。 図５Ａのパネル３の酸化エッチングされたナノロッドから単分散ナノロッドのＴＥＭ（左列）およびＨＲ−ＴＥＭ（中央列および右列）像。影付きの矢印は、再成長の特定の条件を示す（詳細な条件は表１も参照）。粒子の先端および中央の白色の四角で印をつけた部分は格子縞を測定した場所を示す。 一成分界面活性剤を用いて再成長させた構造の規格化したＵＶ−可視−ＮＩＲスペクトル（１−５は図６Ａの１−５に相当する）、および二成分界面活性剤を用いて再成長させた構造の規格化したＵＶ−可視−ＮＩＲスペクトル（６は図６Ｂの６に相当する）。詳細なサイズ測定結果は表３を参照のこと。スケールバーは倍率の低い方から高い方へ、２００ｎｍ、５０ｎｍ、および２０ｎｍおよび１ｎｍ。

精製した双角錐（１−５は１１０、１００、９５、７０、および６０μＬの種結晶溶液に相当する）のＴＥＭ像。スケールバーは１００ｎｍである。 ＬＳＰＲの関数としての精製のためのＢＤＡＣ濃度。 双角錐の長さの関数としての精製のためのＢＤＡＣ濃度。 １００ｎｍを超えて合成された双角錐で精製を試みたときの双角錐および疑似球状不純物の共凝集を示すＴＥＭ像。スケールバーは２００ｎｍである。詳細な説明は、補足説明１も参照のこと。

種結晶１００μＬ（パネル１−４）および種結晶５μＬ（パネル５−６）を用い、異なる濃度の反応物（H⁺、Ag⁺、および種粒子）を用いた再成長で得られた肥大した双角錐のＴＥＭ像。 異なる量のAgNO₃（パネル１−３）およびHCl（パネル４−６）で再成長した双角錐のＴＥＭ像。詳細な合成条件は表１も参照のこと。０．１Ｍ臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を含む成長溶液中の高濃度の金前駆体（１０ｍＭより多い）は、双角錐の結晶構造に影響を及ぼしうるＣＴＡＢ−Ａｕ複合体の形成を引き起こし、結果として粗い表面となる（図８Ａのパネル１−４）。さらに、種結晶溶液の容量が少なすぎると不安定な成長を引き起こし、好ましくない形状の不純物を生じる（図８Ａのパネル５−６）。図８Ａおよび図８Ｂの全てのスケールバーは、それぞれ、２００ｎｍおよび５０ｎｍである。

０．１Ｍの一成分界面活性剤ＢＤＡＣ（０．９ｍＬ）の存在下で、４ｍＭのHAuCl₄、４ｍＭのAgNO₃、１規定HCl、および４０ｍＭのアスコルビン酸の成長溶液を用いて再成長した構造のＴＥＭ像。 ０．１Ｍの一成分界面活性剤ＣＴＡＢ（０．９ｍＬ）の存在下で、４ｍＭのHAuCl₄、４ｍＭのAgNO₃、１規定HCl、および４０ｍＭアスコルビン酸の成長溶液を用いて再成長した構造のＴＥＭ像。 ０．１Ｍの一成分界面活性剤塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）（０．９ｍＬ）の存在下で、４ｍＭのHAuCl₄、４ｍＭのAgNO₃、１規定HCl、および４０ｍＭのアスコルビン酸の成長溶液を用いて再成長した構造のＴＥＭ像。ＢＤＡＣまたはＣＴＡＣ中での再成長のための種結晶の調製では、双角錐種結晶１００μＬを８０００ｇで８分間遠心分離し、１ｍＭのＢＤＡＣまたはＣＴＡＣで洗浄し、これを２回繰り返し、その後、さらに再成長させるために１ｍＭのＢＤＡＣまたはＣＴＡＣ１００μＬに再分散した。ＢＤＡＣおよびＣＴＡＢ像のスケールバーは５０ｎｍ、ＣＴＡＣ像では２００ｎｍである。

２ｍＭのHAuCl₄、２ｍＭのAgNO₃、１規定HCl、および２０ｍＭのアスコルビン酸、および二成分界面活性剤ＢＤＡＣ／ＣＴＡＢの成長溶液を用いて再成長した双角錐のＴＥＭ像。 ２ｍＭのHAuCl₄、２ｍＭのAgNO₃、１規定HCl、および２０ｍＭのアスコルビン酸、および二成分界面活性剤ＣＴＡＣ／ＢＤＡＣの成長溶液を用いて再成長した双角錐のＴＥＭ像。 ＣＴＡＣ／ＣＴＡＢ２成分条件で再成長した双角錐のＴＥＭ像および界面活性剤の双角錐表面への結合を提示する実例となる略図。黒い界面活性剤はＣＴＡＢを表し、露出部はＣＴＡＣが結合した表面を表す。ＣＴＡＣはおそらくその弱い結合によって先端部での特異的成長の原因となっている。 ＣＴＡＣまたはＢＤＡＣなしで、図１０Ｃパネル４と同一のＣＴＡＢ量を用いて、再成長した双角錐のＴＥＭ像。最小限の先端部過成長のみが観察される。全てのスケールバーは２００ｎｍである。

成長溶液から残ったAu³⁺を用いて酸化エッチングした双角錐のＴＥＭ像。再成長溶液は、２ｍＭのHAuCl₄（５０μＬ）、２ｍＭのAgNO₃（１０μＬ）、１規定HCl（２０μＬ）および１０ｍＭのアスコルビン酸（８μＬ）を０．１ＭのＣＴＡＢ０．９ｍＬと共に含む。なお、［アスコルビン酸］／［HAuCl₄］のモル比が、標準成長溶液では１．６であるのと比較して、このケースでは０．８である。

図３Ａのパネル７の二成分界面活性剤で、異なる量のAgNO₃およびHClの添加なしで成長させた構造のＴＥＭ像。成長溶液は、２ｍＭのHAuCl₄（５０μＬ）、１規定HCl（２０μＬ）の代わりにナノ純水２０μＬおよび１０ｍＭのアスコルビン酸（８μＬ）を、１ｍＭ（左パネル）、２ｍＭ（中央パネル）おおよび４ｍＭ（右パネル）の濃度の１０μＬのAgNO₃、二成分界面活性剤［ＣＴＡＣ］：［ＣＴＡＢ］＝９０：１と共に含む。 さらなるHClを用いて、図３Ａ、パネル６と同様に再成長させた構造のＴＥＭ像。成長条件は１規定HCl３０μＬを用いたほかは図３Ａ、パネル６の条件と同一である。 二成分界面活性剤［ＣＴＡＣ］：［ＣＴＡＢ］＝９００：１で再成長させた構造のＴＥＭ像。再成長条件は図３Ａで用いた条件と本質的に同一で、１は標準成長溶液、２はHClなし、３はAgNO₃なし、４はHClなしでかつAgNO₃なし、５は５倍のAgNO₃である。すべてのスケールバーは低倍率および高倍率それぞれに対して２００ｎｍおよび５０ｎｍである。

双角錐の周期的双五角錘四面体双晶形成の略図。それぞれの双晶形成面はＴ１からＴ５とラベルが付けられている。２つの灰色の部分は成長方向およびＴ４とＴ５間の内面に対して垂直な双角錐の断面を示す。式は図４Ａの配向１中の構造の測定された先端角（θ）と平均ステップ長（ｓ）の間の関係を示す。

精製直後および室温に５０日保存した後の双角錐のＵＶ−可視−ＮＩＲスペクトル。 １００ｍＭのＣＴＡＢの存在下、１２０℃で酸化エッチングした双角錐のＵＶ−可視−ＮＩＲスペクトル。１０分、１５分、３０分、９０分、３００分および９００分後に、バイアル瓶を室温の水で冷却し、酸化プロセスを停止した。 １００ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭのＣＴＡＢで１２０℃、１０分加熱したスペクトル。

、図５Ａのパネル２の中のエッチングされた米粒状粒子から標準成長溶液（パネル１）、およびAgNO₃なしかつ一成分界面活性剤ＣＴＡＢを含む成長溶液（パネル２）で再成長させた構造のＴＥＭ像。 図５Ａのパネル３中のエッチングされた棒状粒子から二成分界面活性剤［ＣＴＡＣ］：［ＣＴＡＢ］＝９０：１を含む標準成長溶液で再成長させた構造のＴＥＭ像。すべてのスケールバーは２００ｎｍである。

ＩＲ発光ダイオード（ＬＥＤ）に感光させた標的核酸分子および双角錐ナノ結晶を含む溶液を示す模式図。ＩＲ・ＬＥＤは、オン／オフを繰り返す。オンの時は、溶液は加熱され、ＤＮＡの変性が起こる。オフの時は、溶液は冷えてプライマーのアニールが起こる。一旦アニールされると、ポリメラーゼの延長が起こる。ＩＲ・ＬＥＤはその後再びオンに戻り、溶液を加熱し変性を促進する。このプロセスは超高速循環である。アニーリング段階の間、累積した生成物は、異なるＬＥＤで励起されフォトダイオードで検出される蛍光色素によって検出される。

図１６の反応フローのための二つのＬＥＤ、ファン冷却システムおよびフォトダイオード検出器の配置を示す図。双角錐ナノ結晶は第１のＬＥＤで励起され、均一かつ局所的な加熱を提供する。

図１６の反応フローの間の二つのＬＥＤとファンの時間的な使用を示すグラフ。反応溶液の温度変動も示されている。第１のＬＥＤによる励起は温度の上昇を引き起こす。溶液が所望の温度に達すると、そのＬＥＤは切られ、ファンが溶液の冷却を始める。溶液が十分に冷却されると、第２のＬＥＤが蛍光色素を励起するためにオンになり、増幅の実時間データを提供する。溶液が所望の温度まで冷却されるとファンがオフとなり第１のＬＥＤが再びオンとなって溶液を再加熱し、熱サイクルを促進する。

金双角錐ナノ結晶（ＡｕＢＰ−シリカ粒子）でコートされたシリカの吸収スペクトル。約８７５ｎｍにピークを示している。 ＡｕＢＰ−シリカ粒子のＴＥＭ像。スケールバー＝５０ｎｍ。

ＡｕＢＰ−シリカ粒子の吸収スペクトルで、約７８０ｎｍにピークを示している。 ８５０ｎｍＬＥＤで、オン１Ｗおよびオフ０Ｗの入力電流で照射した反応溶液の温度変化。

ペグ化した双角錐−シリカコア−シェルナノ粒子を１０倍希釈試料で測定したＵＶ−可視スペクトル。

ペグ化した双角錐−シリカコア−シェルナノ結晶を含む溶液に対する脱イオン水中、最大ピーク波長８４６ｎｍでの加熱速度および冷却速度のグラフ。

ペグ化した双角錐−シリカコア−シェルナノ結晶を含む溶液に対する、光学密度１４．１および２１．５での加熱速度および冷却速度のグラフ。 ペグ化した双角錐−シリカコア−シェルナノ結晶を含む１４．１ＯＤの試料に対する０．４Ａ（最下段のパネル）から１．５Ａ（最上段のパネル）までの電流に対する熱サイクル。 ペグ化した双角錐−シリカコア−シェルナノ結晶を含む１４．１ＯＤの試料に対する０．４Ａ（最下段のパネル）から１．５Ａ（最上段のパネル）までの電流に対する熱サイクル。 ペグ化した双角錐−シリカコア−シェルナノ結晶を含み、光学密度６．３、１４．１、および２１．５を有する試料に対する、５、１０および２５μＬ（それぞれ１２，１５および３０μＬの液体ワックス）での加熱速度および冷却速度のグラフ。

ＬＥＤ照射９０サイクル前の双角錐ナノ結晶の形態。 ＬＥＤ照射９０サイクル後の双角錐ナノ結晶の形態。 ＬＥＤで照射前後の吸収のグラフ。

０．１％ＢＳＡを含むＲＴ−ＰＣＲ反応溶液のサイクル数の関数としての実時間（ＲＴ）蛍光で測定した核酸増幅を示すグラフ。 ０．１％ＢＳＡを含むＲＴ−ＰＣＲ反応溶液のサイクル数の関数としての実時間蛍光で測定した核酸増幅を示すグラフ。 ０．３％ＢＳＡを含むＲＴ−ＰＣＲ反応溶液のサイクル数の関数としての実時間（ＲＴ）蛍光で測定した核酸増幅を示すグラフ。 ０．３％ＢＳＡを含むＲＴ−ＰＣＲ反応溶液のサイクル数の関数としての実時間（ＲＴ）蛍光で測定した核酸増幅を示すグラフ。 ０．５％ＢＳＡを含むＲＴ−ＰＣＲ反応溶液のサイクル数の関数としての実時間蛍光で測定した核酸増幅を示すグラフ。 ０．５％ＢＳＡを含むＲＴ−ＰＣＲ反応溶液のサイクル数の関数としての実時間（ＲＴ）蛍光で測定した核酸増幅を示すグラフ。

表１の第１部。一成分または二成分界面活性剤を用いた再成長条件。すべての全反応体積はすべての試験で一定（１．０８８ｍＬ）に保った。＊ＡＡ＝アスコルビン酸、ＢＰ＝双角錐、ｐＨ＝計算値。 表１の第２部。一成分または二成分界面活性剤を用いた再成長条件。すべての全反応体積はすべての試験で一定（１．０８８ｍＬ）に保った。＊ＡＡ＝アスコルビン酸、ＢＰ＝双角錐、ｐＨ＝計算値。

発明の詳細な説明

混合貴金属ナノ結晶試料からサイズおよび形状の多分散度が極めて低い貴金属双角錐ナノ結晶の試料を形成する方法を提供する。前記試料は高純度、実質的に単分散のプラズモン金双角錐ナノ結晶を含有する試料を含む。また、貴金属双角錐ナノ結晶を種結晶粒子として用いて、二次双晶金属ナノ結晶を成長させる方法を提供する。成長させるための種双角錐ナノ結晶と同様、二次ナノ結晶はサイズおよび形状の多分散度が極めて低いことを特徴とする双晶ナノ結晶である。これらの方法で成長させた二次双晶ナノ結晶は、肥大した金属双角錐ナノ結晶、二錘ナノ結晶、球状多面体、長尺状双角錐および様々な先端形状を有する異方性の「ダンベル」形状を持ったナノ結晶を含む。熱的に誘導される核酸増幅などの化学反応および段階的に熱的に誘導される酵素反応に、貴金属双角錐ナノ結晶をプラズモンヒーターとして用いる方法もまた提供される。

貴金属双角錐は図４Ａに図示されるように、面心立方構造中に１０個の高指数小平面（ファセット）を含む双五角錐結晶(penta-twinned crystal)である。双角錐は、図４Ａの成長方向［１１０］で示される長さ方向の長軸およびそれらの幅を貫通する短軸で特徴づけられる。

本明細書の方法を用いて、高純度で実質的に単分散の貴金属双角錐ナノ結晶を、ナノロッドおよびナノ粒子（例えば疑似球状ナノ結晶）を含む様々なサイズおよび形状を有する貴金属ナノ結晶混合物を含有する出発試料から分離することができる。前記混合金属ナノ結晶試料を作製する方法は 知られている（Liu, M. & Guyot-Sionnest, P. Mechanism of silver(i)-assisted growth of gold nanorods and bipyramids. J. Phys. Chem. B 109, 22192-22200 (2005)）を参照）。少なくとも１種の別の型の金属ナノ結晶を含む出発試料から金属双角錐ナノ結晶の高純度試料を形成する方法の一実施態様は以下の工程：出発試料および塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム（ＢＤＡＣ）の水溶液を調製する工程；金属双角錐ナノ結晶を前記水溶液から枯渇凝集を経て凝集させるのに十分な時間および温度に前記水溶液を保持する工程；および凝集した金属双角錐ナノ結晶を溶液から分離する工程を含む。これらの方法のいくつかの実施態様は、金属ナノ結晶の少なくとも７５％が金属双角錐ナノ結晶である最終金属ナノ結晶試料を提供することができる。この実施態様は、金属ナノ結晶の少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％が金属双角錐ナノ結晶である最終金属ナノ結晶試料を提供する実施態様を含む。さらに、この方法は、金属ナノ結晶のサイズ多分散度が１０％以下である最終金属ナノ結晶試料を提供することができる。この実施態様は、金属ナノ結晶のサイズ多分散度が８％以下、５％以下、３％以下および２％以下である最終金属ナノ結晶試料を提供する方法を含む。試料の金属双角錐ナノ結晶純度および多分散度を決定する方法を実施例１で述べる。

一般に、金属双角錐ナノ結晶は、高度の試料形状均一性を有する他の金属ナノ結晶から分離されるので、望ましくは、凝集した金属双角錐ナノ結晶の平均長は約１００ｎｍより短い。例えば、約６５ｎｍから約９５ｎｍの範囲の長さを有する実質的にサイズが単分散の金双角錐ナノ結晶を８５％以上の純度で得ることができる。溶液から凝集した双角錐ナノ結晶の長さは成長溶液中のＢＤＡＣ界面活性剤の濃度を調製することによって制御できる。

一旦形成されると、最初に精製された双角錐ナノ結晶は、以下に述べるように、二次双晶金属ナノ結晶の種媒介成長の種結晶として用いることができる。二次双晶金属ナノ結晶の長さはそれが成長した種双角錐ナノ結晶の長さより大きい。例えば、二次ナノ結晶は、実質的に単分散の長さ１００ｎｍ以上、１５０ｎｍ以上または２００ｎｍ以上で成長する。これらの二次金属ナノ結晶はナノ結晶のサイズ多分散度１０％以下で成長する。このことは、金属ナノ結晶のサイズ多分散度が８％以下、５％以下、３％以下および２％以下である二次金属ナノ結晶試料を提供する方法の実施態様を含む。

一般に、金属双角錐ナノ結晶から二次双晶金属ナノ結晶を成長させる方法は以下の工程：種金属双角錐ナノ結晶、少なくとも１種の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤、金属前駆体分子、および還元剤を含む溶液を調製する工程、および還元剤が前駆体分子中の金属を還元して、その金属が種金属双角錐ナノ結晶面に析出させ、それによって二次双晶金属ナノ結晶を成長させる条件で溶液を保持する工程を含む。ナノ結晶成長溶液に用いられる陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤の例として、ＣＴＡＣ、ＣＴＡＢ、ＢＤＡＣ、およびこれらの２つ以上の混合物が挙げられる。二次ナノ結晶成長方法のいくつかの実施態様では肥大した双角錐ナノ結晶である二次ナノ結晶を形成するために、一成分界面活性剤（すなわち一成分だけの界面活性剤）を用いる。成長方法の別の実施態様ではダンベル形状を有する二次ナノ結晶を形成するために、二成分界面活性剤（すなわち２種の界面活性剤の混合物）を用いる。

金属前駆体分子は成長溶液中の還元剤によって還元できる１価または多価状態の金属を含む分子である。金属前駆体分子は、例えば、金属含有無機または有機酸、あるいは塩であってもよい。クロロ金酸（HAuCl_４）は金双角錐種ナノ結晶から二次双晶金ナノ結晶を成長させるのに用いることができる金前駆体分子の一例である。他の金属前駆体分子には塩化金（Ｉ）、塩化金（ＩＩＩ）、および塩化カリウム金（ＩＩＩ）が含まれる。

還元剤は金属前駆体分子中の金属を還元する。Ｌ−アスコルビン酸は、前駆体分子の還元に適した還元剤の一例である。他の還元剤には、ヒドロキシルアミン塩酸塩、ヒドロキノン、クエン酸、アミン類、アニリン、ピリジン、およびグリシンが挙げられる。成長溶液中の還元剤の濃度は、金属前駆体分子を完全に還元するのに十分に高くてもよい。代わりに、以下により詳細に述べる通り、二次ナノ結晶が成長する前にナノ結晶をエッチングできるように、金属前駆体分子を過剰に供給してもよい。

種双角錐ナノ結晶、金属前駆体分子、および還元剤に加えて、二次成長溶液はｐＨ調整液、銀塩、またはこれらの両方を含んでもよい。ｐＨ調整液（塩酸（HCl）などの強酸であってもよい）は、成長溶液のｐＨを下げて、還元剤による金属前駆体分子の還元速度を遅くする。還元速度が遅くなると、より高いｐＨの類似の反応条件で作製された二次双晶金属ナノ結晶よりも高いアスペクト比を有する二次双晶金属ナノ結晶を誘導することができる。

銀塩は成長溶液中で１価の銀イオンを供給し、種双角錐ナノ結晶の小平面に銀の薄膜（例えばモノレイヤー）のアンダーポテンシャル析出をもたらす。硝酸銀（AgNO₃）はそのような銀塩の例である。他の銀塩には、フッ化銀、酢酸銀および硫酸銀などの水に可溶な銀塩が含まれる。この銀の薄膜はそれが析出した小平面を安定化し、したがって、これらの小平面上への二次ナノ結晶の成長速度に影響する。結果として、銀は二次双晶金属ナノ結晶の最終形状の調整に用いることができる。実例としては、二次双晶金属ナノ結晶を成長させる方法のいくつかの実施態様では、銀塩は二成分界面活性剤系と組み合わせて用いられ、種双角錐ナノ結晶の先端の横方向の過成長を促進する。このことは実施例１で説明する。

最初の金属双角錐ナノ結晶を成長させ凝集させる最適な条件および二次双晶金属ナノ結晶を成長させる最適条件は、種ナノ結晶および二次ナノ結晶の所望のサイズおよび単分散度、並びに二次ナノ結晶の所望の形状を含む様々な因子に依存する。例えば、種ナノ結晶および二次ナノ結晶は、室温または室温付近の温度（例えば、約２０℃から約４０℃の範囲の温度（約２５℃から約３５℃の範囲の温度を含む）で、１日（２４時間）以下の反応時間（例えば、約１時間から約１２時間の反応時間）をかけて成長する。しかしながら、これらの範囲以外の反応温度および時間を用いてもよい。上に指摘したように、成長溶液のｐＨはナノ結晶の比率および形状に影響し、したがって、状況に応じて選択されなければならない。実例としては、本発明のいくつかの実施態様におけるナノ結晶成長溶液のｐＨ値は約１．５から約４の範囲である。このことは成長溶液のｐＨ値が約１．７から約３．７の範囲である方法の実施態様を含む。さらに、既定の成長溶液に含まれる特定の反応物およびそれらの溶液中の濃度を、成長したナノ結晶の最終形状およびサイズを調整するために選択することもできる。様々な成長溶液中の反応物およびそれらの濃度の効果に関わる指針を実施例１で提供する。

二次金属ナノ結晶の所望の形状に応じて、成長溶液は一成分陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤を含んでもよく、または陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤の組み合わせを含んでもよい。例えば、ＣＴＡＢまたは他の四級アンモニウムを一成分界面活性剤として用いて、肥大した金属双角錐ナノ結晶を種金属双角錐ナノ結晶から成長させることができる。二次金属双角錐ナノ結晶は種双角錐ナノ結晶の形状を維持しているが少なくとも一方向で種双角錐ナノ結晶より大きい。二次双角錐結晶の成長は双角錐の長軸および短軸に沿って同一の成長をした等方性であってもよい。代わりに、成長は、双角錐の長軸または短軸方向に沿って速い成長をして、それらの種双角錐ナノ結晶よりもそれぞれ高いアスペクト比または低いアスペクト比の二次双角錐結晶を与える異方性であってもよい。

対照的に、二成分界面活性剤を用いて、ダンベル形状を有する二次双晶金属ナノ結晶を成長させてもよい。ダンベル形状のナノ結晶は、両端を様々な先端部構造でおおわれた中央部分すなわち「本体」を含み、本体とそれぞれの先端部分の間のナノ結晶に狭窄部を有する。ダンベルの本体部分は、一般に、二錘形状であり、１０個の小平面を持った双五角錐である。実施例１で説明する通り、それら自体が多重双晶である先端部構造は、反応溶液および条件に応じて、棒状、球状（疑似球状を含む）、または双角錐であってもよい。ダンベル形状のナノ結晶を図１の右側に図示する。

二成分界面活性剤は第１の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤および第２の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤を含む。第２の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤は、種金属双角錐ナノ結晶に対して第１の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤より低い結合親和性を有する。例えば、金ナノ結晶の成長に対して、ＣＴＡＣおよびＣＴＡＢをそれぞれ第１および第２の四級アンモニウム界面活性剤として用いることができる。ここで、ＣＴＡＢはＣＴＡＣよりも金双角錐に対して低い結合親和性を有している。二次ナノ結晶の成長の間、種金属双角錐ナノ結晶に対して低い結合親和性を有する界面活性剤は、双角錐の先端部に局在化し、結果として、双角錐結晶の残りの部分と比較して双角錐先端部で過成長を促進する。二つの界面活性剤のモル比は、広範囲にわたって変えることができるが、典型的には第１の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤が高い濃度で存在する。実例としては、第１と第２の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤のモル比は、約９：１から９０００：１の範囲であってよい。このことは、第１と第２の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤のモル比が約９０：１から９００：１の範囲にある成長液実施態様を含む。

上記の通り、ｐＨ調整液および／または銀塩をダンベルの先端形状を調整するために成長溶液に加えることができる。さらに、２種の界面活性剤の比および様々な反応物の濃度を、所望のサイズと先端形状を持った双晶ナノ結晶ダンベルを得るために調整することができる。実例としては、二次ナノ結晶成長溶液は、双角錐形状の末端を有するダンベル形状の二次ナノ結晶を成長させるために、硝酸銀などの銀塩を含んでもよい。代わりに、二次ナノ結晶成長溶液は、多重双晶棒状を有するダンベル形状の二次ナノ結晶を成長させる目的で、HClなどのｐＨ調整液を含んでもよい。成長溶液がｐＨ調整液および銀塩の両方を含んでいる場合は、双角錐と球状の両方の形状を有するダンベル形状のナノ結晶が成長する。様々な成長溶液中の反応物およびそれらの濃度の効果に関わる指針を実施例１で提供する。

任意に、二次ナノ結晶を成長させる前に金属双角錐種ナノ結晶を酸化的にエッチングすることができる。この酸化エッチング工程により、さらに幅広い種類の形状で二次双晶金属ナノ結晶を成長させることが可能になる。従って、二次晶金属ナノ結晶を金属双角錐ナノ結晶から成長させるための方法のいくつかの実施態様は、金属双角錐種ナノ結晶、少なくとも１種の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤、および酸化性エッチング剤を含む第１の溶液を調製する工程；酸化性エッチング剤が種金属双角錐ナノ結晶を酸化し、双晶金属ナノロッドナノ結晶を形成するのに十分な条件で最初の溶液を保持する工程；双晶金属ナノロッドナノ結晶、少なくとも１種の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤、金属前駆体分子、および還元剤を含む第２の溶液を調製する工程；および還元剤が前駆体分子中の金属を還元し、金属が双晶金属ナノロッドナノ結晶面に析出し、それによって、二次双晶金属ナノ結晶を成長させるのに十分な条件で第２の溶液を保持する工程を含む。エッチング工程は双角錐ナノ結晶小平面および鋭い形状の先端の高エネルギーの特質を利用しており、これにより弱い酸化剤によるエッチングさえも可能になる。適切な酸化性エッチング剤の例としては、溶存酸素分子および多価金属イオンが挙げられる。後者は成長溶液中の金属前駆体分子の不完全還元によって溶液中に存在してもよい。例えば、Au³⁺陽イオンを金双角ナノ結晶の酸化性エッチング薬として用いてもよい。

双晶金属ナノロッドナノ結晶が形成されると、ナノロッドから成長する二次双晶金属ナノ結晶のサイズおよび形状を決めるために、界面活性剤の選択、成長溶液の組成、成長溶液中の反応物の濃度を調整することができる。例えば、二次ナノ結晶成長溶液中にＣＴＡＢなどの１成分陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤および硝酸銀などの銀塩を用いて、長尺状双角錐形状を有する二次金ナノ結晶をナノロッドナノ結晶から成長させることができる。二次ナノ結晶成長溶液中にＣＴＡＢなどの１成分陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤およびHClなどのｐＨ調整液を用いて、球状多面体形状を有する二次金ナノ結晶をナノロッドナノ結晶から成長させることができる。二次ナノ結晶成長溶液中にＣＴＡＢなどの１成分陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤、HClなどのｐＨ調整液および硝酸銀などの銀塩を用いて、二錘形状を有する二次金ナノ結晶をナノロッドナノ結晶から成長させることができる。二錘形状、長尺状双角錐形状、および球状多面体形状の略図を図１の左下に示す。

種金属双角錐ナノ結晶と同時に、二成分界面活性剤を用いて種金属ナノロッドナノ結晶を結合し、ダンベル形状の二次ナノ結晶を成長させることができる。種ナノロッドナノ結晶から成長したダンベル形状の二次ナノ結晶は、もとのナノロッドナノ結晶よりも短い長さおよび／または低アスペクト比を有することがある。

また、サイズ単分散性の高い貴金属双角錐ナノ結晶および／またはそこから成長した二次双晶金属ナノ結晶の試料をプラズモン加熱する方法を提供する。金属双角錐ナノ結晶のプラズモン光熱活性は、照射源によるそれらの電子の励起、および、ナノ結晶中の多重トラップ状態の存在に基づく熱としての非放射型での吸収エネルギーの放射の結果である。本明細書に記述した方法は、高純度でかつ極めて低い多分散度プラズモン金属双角錐ナノ結晶を含む金属ナノ結晶試料を提供するので、プラズモン加熱で精密な熱の制御を達成することができる。

プラズモン加熱では、熱的に調節された反応を起こして１つ以上の反応生成物を生成する少なくとも２つの化学反応物を含む反応溶液中に、貴金属双角錐ナノ結晶（および／またはそこから成長した二次双晶金属ナノ結晶）を含む。反応溶液が、貴金属双角錐ナノ結晶で吸収されて貴金属双角錐ナノ結晶を励起する放射線で照射されると、ナノ結晶は吸収された光のエネルギーを熱エネルギーに変え、それによって反応溶液の温度を上げる。温度の変化は二つの反応物間の反応を調整するように変えることができる。温度の変化には、溶液中の特定の反応種に応じて、化学反応の開始、反応の停止、または反応速度を上げることあるいは下げることによる化学反応速度の変更が含まれる。反応溶液は、例えば、水溶液または１種以上の有機溶媒を含む非水系溶液であってもよい。

金属双角錐ナノ結晶の光学的およびプラズモン特性は、ナノ結晶のサイズと長さに直接対応する。このことはナノ結晶が異方性で、２つ以上の定義寸法を持っているからである。特に、双角錐では横（短）軸および縦（長）軸の両方が電磁波スペクトルの大きく異なる領域に光学的吸光度を有している。したがって、所与のプラズモン加熱では吸光度プロファイルを、使用する双角錐ナノ結晶の全体のサイズと各寸法を調整することによって、選択的に合わせることができる。例えば、実施例２の金双角錐では、縦方向のピークは横方向に比べて３倍の吸光度を示し、近赤外（ＮＩＲ）または赤外領域にある。このことは金ナノ結晶を用いた光熱の応用では入射光もまたＮＩＲまたはＩＲであることを意味している。

プラズモン金属双角錐ナノ結晶はそれらの熱安定性を強化する材料、水分散性を強化する材料、および／またはそれらの溶液中で凝集する傾向を低減するために表面電荷を与える材料でコーティングしてもよい。表面コーティングはまたナノ結晶に反応性表面官能基を付与するために用いてもよい。表面官能基は基板の官能基と反応してナノ結晶と基板の間に共有結合を形成する。コーティングは、双角錐ナノ結晶の全体の形状を形作るナノ結晶表面の少なくとも一部を覆う薄膜であることが望ましい。生物医学的用途に用いられるナノ結晶では、コーティングはまた生体適合性であることが望ましい。

シリカ（二酸化ケイ素）はコーティングとして用いることができる材料の例である。シリカコーティングは生体適合性があり溶液安定性のあるナノ結晶を提供し、また、反応性表面官能基化を提供する。シリカコーティングしたナノ結晶は当初の合成で達成された高レベル単分散性を維持するが、より安定性が高く溶液起因の分解に対して抵抗性を持つ。シリカコーティングした金双角錐ナノ結晶を反応溶液の精密な温度制御での使用を実施例２および３で説明する。これらの実施例で述べるように、励起パルスの長さと頻度を制御することによって精密に調整された反応温度条件を達成することができる。

反応溶液中のプラズモン金属双角錐ナノ結晶の最適濃度は、少なくとも部分的には、対象とする用途での熱的な必要性に依存する。実例としては、いくつかの用途で、プラズモン金属双角錐ナノ結晶は、１から５の範囲の光学密度となる濃度で存在する。このことは、プラズモン金属双角錐ナノ結晶が２から４の範囲の光学密度となる濃度で存在することを含む。溶液の光学密度を決定する方法は以下の実施例２で述べる。

金属双角錐ナノ結晶（および／またはそこから成長した二次双晶金属ナノ結晶）をプラズモン光熱放射−熱変換を経て反応溶液を加熱するのに用いることができるプラズモン加熱には、核酸分子を増幅する方法が含まれる。金属双角錐ナノ結晶は、鎖置換増幅およびローリングサイクル増幅を含む等温増幅手順、およびＰＣＲなどの熱サイクル増幅の両方で熱を発生するのに用いることができる。核酸増幅法では金属双角錐ナノ結晶を増幅反応溶液に含む。反応溶液は次に、金属双角錐ナノ結晶で吸収される可視光および／または赤外光で照射され、放射エネルギーが熱エネルギーに変換され、それにより反応溶液の温度を上げ、核酸増幅プロセスを開始する。

双角錐ナノ結晶のプラズモン光熱特性を用いた溶液温度の精密制御能は熱サイクルＰＣＲにとって非常に望ましい。ＰＣＲの従来の熱サイクル手順は、大きく高価な温度制御装置を必要としており、ＰＣＲ試験の持ち運び性を大きく制限し、看護拠点計画での使用を妨げている。さらに、プラズモン金属双角錐ナノ結晶は電磁波スペクトルのＮＩＲ領域（すなわち７００ｎｍから１０００μｍ）を含む電磁波スペクトルのＩＲ領域（すなわち７００ｎｍから２μｍ）で吸収するので、反応溶液中の酵素、核酸、または他の生体分子を分解することなくナノ結晶の光熱活性化がなされる。

増幅反応溶液の組成は実施される増幅の型に依存する。しかしながら、一般に、反応溶液は、プラズモン金属双角錐ナノ結晶、増幅する標的核酸分子、プライマー核酸鎖、遊離ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼを含む。反応溶液に存在するさらなる成分としては、緩衝液、反応物を安定化する添加剤、およびまたは増幅阻害を低減するする添加剤、核酸の複製の実時間モニタリングを可能にする蛍光プローブが含まれる。プラズモン金属双角錐ナノ結晶を、高純度で非常に低い多分散度を有する金属双角錐ナノ結晶を含む金属ナノ結晶試料の一部として添加してもよい。実例としては、反応溶液に添加される金属ナノ結晶試料は少なくとも８５％のプラズモン金属双角錐ナノ結晶を含む。プラズモン金属双角錐ナノ結晶は８％未満の低多分散度を有する。サイズと形状の多分散度が非常に低い金属双角錐ナノ結晶高純度試料は本明細書に述べられ、実施例１に示される方法を用いて、混合貴金属ナノ結晶の試料から得ることができる。

光活性化熱サイクルＰＣＲは２つ以上の異なる温度間での、精密かつ繰り返しのサイクルに基づくので、高い純度と高い単分散性の金属双錐ナノ結晶によって提供される精密な熱制御はその用途に適している。光活性化熱サイクルＰＣＲを経て標的核酸分子を増幅する方法の一実施態様を図１６に図示する。この方法は標的核酸分子１６０２；プライマー核酸鎖１６０４；遊離ヌクレオチド（示されていない）；ＤＮＡポリメラーゼ（示されていない）；およびプラズモン金属双角錐ナノ結晶１６０６（パネル（ａ））を含む金属ナノ結晶試料を含む反応溶液を調製する工程、次に複数回の光熱サイクル１６０７を経由して反応溶液を循環する工程を含む。それぞれの光熱サイクルは、入射光源１６０８からの入射光で反応溶液を照射する工程（ここで、プラズモン金属双角錐ナノ結晶は入射光を吸収し、プラズモン光熱放射−熱変換を経て反応溶液を、標的核酸分子の変性を引き起こす第１の温度まで加熱する）（パネル（ｂ））；次に、プライマー核酸鎖が変性された標的核酸分子をアニールし（パネル（ｃ））、アニールされたプライマー核酸鎖から始まって新たな標的核酸鎖が合成されて（パネル（ｄ））、新たな標的核酸分子１６１０が形成される（パネル（ｅ））低い温度に、反応溶液を冷却する工程が含まれる。

核酸増幅装置の一実施態様の模式図を図１７に示す。装置はバイアル瓶などの容器１７０１に反応溶液１７００を含む。ＩＲ光源１７０８は反応溶液１７００の上方に位置し、反応溶液を照射しプラズモン加熱を引き起こすように構成される。装置は任意に入射光１７０５が反応溶液の上に集束するように構成されたレンズ１７０３などの集束光学部品、および容器に空気を送り冷却速度を上げるように構成されたファン１７０７を含んでもよい。図１７に示す実施態様では、核酸分子は蛍光プローブで標識されており、装置は反応溶液１７００を照射してプローブを励起するように構成された第２の光源１７０９を含んでいる。装置はさらに、励起されたプローブから放射される蛍光１７１３をモニターするように構成されたＣＣＤカメラなどの検出器１７１１を含む。

図１８のグラフに、ＰＣＲ熱サイクル中の、光源、検出器、およびファンの経時的な使用状況を、反応溶液温度の変化に沿って示す。説明上、この例における光源はＬＥＤであり、検出器はＣＣＤカメラである。しかしながら、ＩＲレーザーなどの他の光源、および光電子増倍管などの検出器を用いることもできる。グラフに示すように、第１のＬＥＤ（ＬＥＤ１）による反応溶液中のプラズモン金属双角錐ナノ結晶の励起は溶液の温度上昇を引き起こす。溶液が二重鎖の変性の所望温度に達すると、ＬＥＤは遮断され、ファンが溶液を冷却し始める。一旦、溶液が第２の所望温度に達すると、第２のＬＥＤ（ＬＥＤ２）が点灯し、核酸分子に結合した蛍光色素分子を励起して、増幅プロセスを実時間でモニターする。溶液が十分に冷却されるとファンが停止され、ＬＥＤ１が再点灯され、熱サイクルが継続される。核酸増幅手順のサイクル回数は、複製の所望の度合いに依存する。

サイクルの最初の段階の間（図１６のパネル（ｂ））、反応は、プライマーのハイブリダイゼーションに備えて二本鎖の標的核酸分子の変性を誘導する温度に急速に加熱される。典型的には、この温度は約９０℃から約９５℃の範囲である。サイクルの次の段階では、反応は、プライマー核酸鎖が変性標的核酸分子の分離された鎖にアニーリングするのを促進し、アニールされたプライマー核酸鎖から始まる成長を経て、核酸分子が延長するのを促進する温度に冷却される。ＰＣＲ増幅法のいくつかの実施態様では、プライマー核酸鎖の変性標的核酸分子へのアニーリング、および核酸の鎖延長は、単一の温度で単一の工程で行われ、典型的にはその温度は約７０℃から約７５℃の範囲である。代わりに、アニーリングと鎖延長工程を、二つの異なる温度で行うこともできる。この時、前者は、典型的には約４０℃から約７０℃の範囲で行われ、後者は典型的には約７０℃から約７５℃の範囲で行われる。

金属双角錐ナノ結晶は非常に効率のよいプラズモンヒーターなので、光熱サイクルを非常に短くできる。例えば、標的核酸分子を増幅する方法のいくつかの実施態様では、光熱サイクルは１分間に少なくとも３回のサイクルの割合で行われる。このことは、光熱サイクルが１分間に少なくとも２回サイクルの割合で行われる方法の実施態様を含む。光熱サイクルが一旦完結すると、反応溶液は保存またはゲル電気泳動などの続く処理のために室温（すなわち約２３度）以下に冷却される。

金属双角錐ナノ結晶（および／またはそこから成長した二次双晶金属ナノ結晶）をプラズモン光熱放射−熱変換を経て反応溶液を加熱するために用いることができるその他のプラズモン加熱には、熱制御酵素反応を行う方法が含まれる。熱制御酵素反応では、金属双角錐ナノ結晶を１つ以上の酵素および基質分子を含む反応溶液に含み、反応溶液は次に可視光および／または赤外光で照射される。放射線は金属双角錐ナノ結晶で吸収され、熱エネルギーに変換され、それにより反応溶液の温度を、酵素が活性状態である初期温度から酵素が不活性状態であるより高い温度に上げる。酵素が活性の時は、酵素は基質分子と酵素−基質複合体を形成しており、基質分子は酵素との相互作用の結果、新たな生成物に変換される。酵素が失活すると、基質分子は酵素から解離し、酵素反応は停止する。異なる活性化温度および失活温度を有する複数の異なる酵素が反応溶液に存在すると、溶液中のプラズモン金属双角錐による光熱加熱を反応溶液の温度を、それぞれの温度で異なる酵素が選択的に活性化し、失活させるように、段階的な方法で上げるのに用いることができる。様々な酵素および 基質分子を用いることができる。適切な基質分子の例には、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含む核酸分子などの生体分子が含まれる。二つの異なる酵素の選択的でかつ段階的な活性化を用いたプラスミドＤＮＡ基質分子の段階的消化を実施例３で述べる。

〔実施例１〕金属双角錐ナノ結晶および二次双晶金属ナノ結晶の合成

この実施例では界面活性剤として塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム（ＢＤＡＣ）を用いた枯渇凝集による様々なサイズの金双角錐の精製について説明し、さらに精製した生成物を種結晶として用いて、サイズおよび形状の高単分散性をもつ別の二次双晶金属ナノ結晶を成長させることを示す。

〔結果〕

〔双角錐の精製および肥大化〕金双角錐を、種媒介成長を用いてLiuとGuyot-Sionnestusingの方法にしたがって合成し、次に枯渇凝集により精製した。ＢＤＡＣはミセル濃度が同じ濃度のＣＴＡＢよりも著しく高い（おおよそ２．６倍以上、補足説明１を参照）ので、精製にはＢＤＡＣを選択した。（Liu, M. & Guyot-Sionnest, P. Mechanism of silver(i)-assisted growth of gold nanorods and bipyramids. J. Phys. Chem. B 109, 22192-22200 (2005)を参照）。ミセル濃度が高いとより低い界面活性剤濃度で凝集が起こり、高界面活性剤濃度で一般に生じる溶液の高粘度、溶解度の問題、および球状ミセルからロッド状あるいはひも状ミセルへの予期せぬ転移などの問題点を避けるのに役立つ。図２Ｂに代表的なＵＶ−可視スペクトルを示し、図２Ｃに９０％以上に高度に生成された金双角錐のＴＥＭ像を示す。（他のサイズについては図２Ｄ、パネル１−５、および図７Ａも参照)。精製では枯渇引力を利用して、高い結晶面面積を持ったナノ粒子、この場合は双角錐、を選択的に凝集させる。引力の強さは二つのナノ粒子の接近の際に生じる純水の体積に比例し、同様にナノ粒子の接触可能面積に比例する。従って、双角錐などの大きな接触可能面積の粒子が選択的に凝集し、一方、球状不純物などの低接触可能面積の粒子は上澄みに残る。（１：合成したままの双角錐、２：上澄み、３：精製した双角錐、図７Ａおよび詳細な手順とＴＥＭ像も参照)。双角錐および疑似球状不純物両方の結晶面面積が大きくなると、１００ｎｍより大きい双角錐は疑似球状不純物から分離するのが次第に難しくなり、結果として望ましくない共凝集となる。（図７Ｄ）

ナノ結晶の形状純度および多分散度の決定にはＴＥＭを用いた。純度はＴＥＭ像を撮影し、少なくとも２００個のナノ結晶の中から相対的な純度を計数して決定した。多分散度は、ＴＥＭ像から少なくとも５０個のナノ粒子の長さと幅を計測して求めた。測定値は装置の画像キャプチャーソフトウエアで、または、ImageJプログラムを用いて求めることができる。

純粋な単分散金双角錐が得られると、新たな形状またはサイズの異なる別の様々な金ナノ構造を種媒介成長と同様のプロセスで双角錐から合成できる。この場合に用いられる「種」は単分散なので、これらの転換で得られる生成物もまた形状とサイズの多分散度がわずか２から５％の範囲の単分散である。精製した双角錐を種結晶として用いることにより、合成と分離両方のサイズの制限を克服でき、高純度でかつ１００ｎｍを超えるまで粒子サイズを大きくすることができるようになる。図２ＤのＴＥＭ像、図２Ｅ、曲線６−１０のＵＶ−可視スペクトルは異なる量の双角錐種結晶を添加するか成長溶液の反応物の濃度を調整して得られた再成長双角錐のサイズの範囲を示す。（合成条件および詳細なサイズ測定結果は図２６Ａおよび図２６Ｂの表１、第一部および第２部を参照)。ＬＳＰＲピークの半値全幅（ＦＷＨＭ）は５８から１５３ｎｍの間であり、ナノロッドの値（約１００から２００ｎｍすなわち６．２から１２．４ｅＶ）と比べて遜色ないこれらの値は、また、双角錐の単分散性を裏付けている。成長溶液のｐＨを変えてもAgNO₃の量を変えても再成長の間にアスペクト比がわずかに変わっているのが観察される（図８Ｂ）。（Ye, X., Zheng, C., Chen, J., Gao, Y. & Murray, C. B. Using binary surfactant mixtures to simultaneously improve the dimensional tunability and monodispersity in the seeded growth of gold nanorods. Nano Lett. 13, 765-771 (2013) およびChen, H., Shao, L., Li, Q. & Wang, J. Gold nanorods and their plasmonic properties. Chem. Soc. Rev. 42, 2679-2724 (2013)を参照）。

〔双角錐ダンベル〕双角錐の肥大化に加えて、合成条件を変えた双角錐の再成長により、金ナノ粒子のツールボックスに加えられるいくつかの新たな構造を生み出すが、また、より単純な形状のナノ構造のまだ解明されていない成長機構に関する強力な洞察力をも提供する。金ナノスフェアおよび金ナノロッドの再成長についてはよく研究されており、ナノロッドのダンベルへの転換はナノ粒子の成長条件の複雑さを示している。しかしながら、ナノスフェアでもナノロッドでも双角錐が持つ複雑な結晶小平面および双晶は提供できていない。まず、異なる界面活性剤（ＣＴＡＢ、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）およびＢＤＡＣ）、併せてそれらの混合物を用いて、双角錐の再成長を比較した。それぞれの界面活性剤を用いた標準成長溶液で、いずれの構造変化においてもサイズの増大が支配的であった。ＣＴＡＢでの双角錐のサイズの増大が、ＢＤＡＣと比べても、ＣＴＡＣと比べても、最も良好な形状均一性および表面平滑性を示した（図３Ａ、パネル１、図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃ）。これらの結果はＣＴＡＢとＢＤＡＣの結合親和性の違い（すなわちBr^-＞Cl^-）およびAg+の存在下で金表面へのアンダーポテンシャル析出の程度を考慮することにより説明できる。（Liu, M. & Guyot-Sionnest, P. Mechanism of silver(i)-assisted growth of gold nanorods and bipyramids. J. Phys. Chem. B 109, 22192-22200 (2005); Nikoobakht, B. & El-Sayed, M. A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods (nrs) using seed-mediated growth method. Chem. Mater. 15, 1957-1962 (2003);Langille, M. R., Personick, M. L., Zhang, J. & Mirkin, C. A. Defining rules for the shape evolution of gold nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 134, 14542-14554 (2012) およびLohse, S. E., Burrows, N. D., Scarabelli, L., Liz-Marzan, L. M. & Murphy, C. J. Anisotropic noble metal nanocrystal growth: The role of halides. Chem. Mater. 26, 34-43 (2013)を参照）ＣＴＡＣでの再成長は、残留ＣＴＡＢを除去するためのＣＴＡＣでの遠心分離が粒子の安定性を損なうので、ランダムな凝集形状成長および凝集をもたらす。臭素陰イオンの対イオンとしての陽イオン性の先端基を用いたナノロッドの成長についての報告によれば、先端基がより大きいと、アスペクト比が高くなり成長速度が遅くなる。このことは結合親和性がより高いことを意味し、粒子表面により安定な二重層が生成する。（Kou, X. et al. Growth of gold bipyramids with improved yield and their curvature-directed oxidation. Small 3, 2103-2113 (2007); Nikoobakht, B. & El-Sayed, M. A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods (nrs) using seed-mediated growth method. Chem. Mater. 15, 1957-1962 (2003); Kou, X. et al. Growth of gold nanorods and bipyramids using cteab surfactant. J. Phys. Chem. B 110, 16377-16383 (2006) および Kou, X. et al. One-step synthesis of large-aspect-ratio single-crystalline gold nanorods by using ctpab and ctbab surfactants. Chem. Eur. J. 13, 2929-2936 (2007)を参照）。今回の観察結果および文献は、Ag+イオンの存在下での界面活性剤の親和性はＣＴＡＢ＞ＢＤＡＣ＞ＣＴＡＣの順に大きくなることを示唆している。

３つの可能な二成分界面活性剤の組み合わせ、すなわちＣＴＡＢ／ＣＴＡＣ、ＣＴＡＢ／ＢＤＡＣおよびＢＤＡＣ／ＣＴＡＣ（それぞれ図１０Ｃ、１０Ｂ、および１０Ａ）で系統的な研究を行った。モル比を変更しても、先端での過成長はＢＤＡＣ／ＣＴＡＢでは観察されず、ＣＴＡＣ／ＢＤＡＣでわずかに観察された。興味深いことに、二成分系での界面活性剤のモル比は、界面活性剤双角錐の再成長、特に先端領域での再成長に大きな影響を示した。これまで、キャッピング材としての混合界面活性剤は、金ナノロッドのアスペクト比、金ナノロッドおよび四面体状金ナノ三脚（tripods）のAg先端過成長を調整するのに用いられてきた（Nikoobakht, B. & El-Sayed, M. A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods (nrs) using seed-mediated growth method. Chem. Mater. 15, 1957-1962 (2003); Kou, X. et al. One-step synthesis of large-aspect-ratio single-crystalline gold nanorods by using ctpab and ctbab surfactants. Chem. Eur. J. 13, 2929-2936 (2007); Park, K. & Vaia, R. A. Synthesis of complex au/ag nanorods by controlled overgrowth. Adv. Mater. 20, 3882-3886 (2008) および Ali Umar, A. & Oyama, M. High-yield synthesis of tetrahedral-like gold nanotripods using an aqueous binary mixture of cetyltrimethylammonium bromide and hexamethylenetetramine. Cryst. Growth Des. 9, 1146-1152 (2008)参照）。しかしながら、それぞれの成分の成長に対する役割は、相互作用の複雑さのために、まだ曖昧である。前述の通り、ＣＴＡＢの結合親和性はＣＴＡＣのそれよりも大きい。しかしながら、ＣＴＡＣ：ＣＴＡＢの比が９０：１と９００：１の間にまで増加すると、ＣＴＡＣが表面積の一部を占有するような平衡が存在する。明らかに、ＣＴＡＣは先端領域に偏在し、ＣＴＡＢのＣＴＡＣを上回る結合優先性が最小となる。この場合、ＣＴＡＣで覆われたあまり保護されていない末端での成長の結果、塩化物の形状指向性を利用した先端過成長が観察されることになる。比が高すぎでも低すぎても、あるいは純粋なＣＴＡＢが用いられると、表面が一成分界面活性剤で均一に覆われているのでサイズの増大が優先的な成長モードとなり、先端の成長は観察されない（図３Ａ、パネル１および図１０Ｃおよび１０Ｄ）。

反応条件を注意深く修正することにより、ダンベル状双角錐の先端形状を成長溶液の成分の役割をさらに確実にするように制御することができる。図３Ｂおよび３Ｃに一成分（図３Ｂ）または二成分（図３Ｃ）界面活性剤を用いた双角錐からの種々の単分散再成長構造のＴＥＭ像およびＵＶ−可視スペクトルを示す。球状、ロッド状および双角錐状先端を含む双角錐先端における劇的な変化が二成分界面活性剤で観察された。これらの実験における双角錐の標準成長溶液は、９１．９μＭのHAuCl₄、１８．４μＭのAgNO₃,、０．０１８４規定のHClおよび１４７μＭのＬアスコルビン酸からなる。図３Ａから３Ｃでは［アスコルビン酸］／［HAuCl₄］のモル比はAu³⁺からAu^０への還元を確実にするために１．６とした。用いるアスコルビン酸が少ないと残ったAu³⁺が酸化剤として作用し、エッチング過程が優先的となり、その結果短い双角錐となる（図１１）。これらの反応で形状を変える主な因子はHClおよびAgNO₃である。Au³⁺の還元速度は溶液のｐＨを高くすると速くなり、存在する結晶面に沿って速い析出を引き起こし、小さいアスペクト比を有するすべての方向に成長したナノロッドとなることが報告されている。（Kim, F., Sohn, K., Wu, J. & Huang, J. Chemical synthesis of gold nanowires in acidic solutions. J. Am. Chem. Soc. 130, 14442-14443 (2008) およびSohn, K. et al. Construction of evolutionary tree for morphological engineering of nanoparticles. ACS Nano 3, 2191-2198 (2009)参照）成長溶液のｐＨは標準成長溶液では１．７４、HClなしの成長溶液では３．６２であった。いずれの条件でも、Ag⁺の還元はアスコルビン酸の酸化還元電位が高いため無視できる。アンダーポテンシャル析出による成長の間に、銀の単分子層を金の特定の表面に析出させて表面を安定化させ、成長速度を遅くすることができる。構造中の全ての小平面の成長速度は銀イオンのアンダーポテンシャル析出による表面被覆度に依存し、それゆえ、特定の小平面の異なる成長速度がナノ粒子の最終的な構造を決定する。

図３Ａ、パネル２および図３Ａ、パネル７の結果は、鋭い頂点を持った短軸に沿った支配的成長を示している。標準成長溶液での成長と比較すると、HClなし、ｐＨ３．６２の双角錐ではすべての方向で速い成長速度であることが予測される。しかしながら、より容易に先端領域に接近できその結果アンダーポテンシャル析出となるAg⁺イオンの存在のために、先端での成長速度は非常に阻害されていた。先端領域の高曲率の結果、界面活性剤の充填密度が双角錐面よりも低くなり、界面活性剤領域内部でのAg⁺のためのさらなる空間を作る。この結果双角錐の長軸に沿って階段状小平面が形成され、それによって両端の双角錐先端が鋭くなる。二成分界面活性剤での成長では、ＣＴＡＢ層の被覆度が低く、先端領域に沿った成長を促進するので、一成分界面活性剤の場合よりも先端での過成長の増加を示した。二成分界面活性剤では、HClなしでより多い、またはより少ないAgNO₃を添加すると伸長はわずかで、特に先端で幅方向の制限のない成長となり、長軸に沿った成長の阻害の増大が粒子の形状を大きく変えることを示している（図１２Ａ）。

同様に、AgNO₃なし、ｐＨ１．７６での実験では、Ag⁺イオンが存在しないため成長が早いが、アスコルビン酸の還元力が低減されるｐＨのためにHClおよびAgNO₃両方が存在しない場合よりも遅い成長が予測される。低ｐＨであるがAg⁺イオンが存在しないために、反応は制御された成長を可能にする速度で進行し、通常はこのｐＨでは、双角錐に対し階段状結晶小平面を生じ、ナノロッド状の構造の成長が促進される結果となる。特定の成長小平面を遮るAg⁺イオンがないと、一成分ＣＴＡＢ界面活性剤系で成長した双角錐は、低アスペクト比（約２．３）で不明瞭な先端を持って合成され；一成分界面活性剤の一様な被覆およびAg⁺のアンダーポテンシャル析出の欠落により、すべての方向に一様に成長が起こる（図３Ａ、パネル３）。興味深いことに、二成分界面活性剤系ではロッド状先端が形成される（図３Ａ、パネル８）。上記の場合と同様、先端領域での過成長は二成分系でのＣＴＡＢの表面被覆が低いことから生じると信じられている。Ag⁺が存在しない場合、過成長が促進され、階段状構造が回避されて、先端でロッド状構造を形成する。

図３Ａ、パネル４および図３Ａ、パネル９に、HClおよびAgNO₃共になしでの双角錐の再成長を示す。この場合、HClなしまたはAgNO₃なしいずれかの前述の二つの場合よりも成長速度が速いと予測される。非常に速い析出およびAg⁺阻害がないことにより、Au⁰原子の速い付加が、双角錐の階段状表面ですべての方向で一様に起こる。この結果、一成分界面活性剤および二成分界面活性剤系のいずれでも、元の双角錐形状を維持した粒子となる。二成分界面活性剤でのアスペクト比は、一成分界面活性剤の場合よりも上述の通りＣＴＡＢの被覆が少ないためにわずかに高く、先端での成長が少し優先的となってわずかに長尺状粒子となる。

その一方で、AgNO₃を更に添加すると（標準成長条件の５倍より多く）、二成分界面活性剤では、一成分界面活性剤よりも先端でのＣＴＡＢの被覆が少なくなり先端部の著しい形状変化を示す。双角錐と同等のはっきりと異なる結晶構造が両末端の先端で形成されている（図３Ａ、パネル１０）。しかしながら、無視できる変化がＣＴＡＢ一成分界面活性剤で観察された。これらの結果は、ＣＡＴＣ界面活性剤からの不十分な保護がAg⁺のアンダーポテンシャル析出の阻害に、より敏感であり、末端への接近を容易にし、結果として著しい形状変化となったことを示している。この場合、酸をさらに添加しても、一成分界面活性剤および二成分界面活性剤いずれでも変化は無視できる結果となる（図８Ａおよび８Ｂ、および図１２Ｂ）。図３Ｂおよび３ＣのＵＶ−可視スペクトルは、成長条件による再成長双角錐の様々な構造変化を反映している。ほとんどの再成長構造は長さの変化を示すので、狭い幅を持った縦方向プラズモンピークの著しいピークシフトを示す。

一成分界面活性剤および二成分界面活性剤での個々の再成長双角錐の結晶構造を高分解能ＴＥＭ（ＨＲ−ＴＥＭ）（図４Ｂ−４Ｉ）および高速フーリエ変換（ＦＦＴ）パターン（示されていない）で決定した。図４Ｂに一成分界面活性剤および標準成長溶液で再成長させた肥大した双角錐のＴＥＭ像を示す。ＦＦＴパターンは粒子の先端部および中央部で明瞭な格子縞を示した。このことは両方の縞が成長軸、および長軸に沿った双晶に平行であることを示している。格子縞の間隔は直接測定により双角錐の（１１１）小平面に相当する０．２３４ｎｍと確認された。ＦＦＴパターンは図４Ａの配向１に対応する双角錐の回折パターンを示した。ＦＦＴパターンの指数付けされた反射は、以下の格子定数に相当する：ｄ_１１１＝０．２３４ｎｍ、ｄ_２２０＝０．１４３ｎｍ、ｄ_２２２＝０．１１８ｎｍ、ｄ_２００およびｄ_０２０＝０．２０４ｎｍ、ｄ_３１１＝０．１２２ｎｍ、ｄ_４００＝０．１０２ｎｍ、ｄ_４２０＝０．０９１ｎｍ。（１１⁻１）、（３１１）、および（２２０）に指数付けされた反射はＴ３およびＴ４から散乱したものである。（２⁻００）、（０２０）、および（２２０）に指数付けされた反射はＴ１からのものである。指数付けされていない残りの反射は多重散乱効果により誘発されたものである。すべての測定値はバルク結晶のデータと比較して±２％の誤差範囲内で、報告された値とよく一致しており、再成長双角錐が面心立方構造を持った双五角錘であることを示している。一成分界面活性剤または二成分界面活性剤のいずれでかで得られたすべての再成長双角錐は図４Ｂの双角錐と同一のＦＦＴパターンを有することが確認された。図４Ｂの先端角（θ）は双角錐２７．０２±１．３５°であると測定され、約３．５原子の平均段長さ（ｓ）を持つ（１１７）高指数小平面に相当する（図１３Ａ）。しかしながら、この高指数小平面の同一性は双角錐の先端角が異なれば、その先端角により変化する。先端角が図４Ｂの双角錐より小さければ、平均段長さ（ｓ）は３．５より大きく、｛１１ｌ｝（ｌ＞７）と指数付けされる。同様に、先端角が双角錐のそれより大きければ、平均段長さ（ｓ）は３．５より小さく、｛１１ｌ｝（ｌ＜７）と指数付けされる。興味深いことに、ダンベル状双角錐のＨＲ−ＴＥＭ像（図４Ｈ）およびＦＦＴは両先端部で多重双晶球状構造を示す。図４Ｈに相当するＦＦＴの円反射は以下の格子定数に相当する：それぞれｄ_１１１＝０．２２９ｎｍ、ｄ_２２０＝０．１４３ｎｍおよびｄ_２００＝０．２０３ｎｍ。

〔双角錐の酸化エッチング〕金双角錐は、また、溶液の溶存酸素分子を利用して酸化エッチングを行うことができる。金原子の酸化と還元を繰り返すと、時間依存性熟成プロセスによりナノ粒子をゆっくりと成形することができる。過酸化水素などの添加酸化剤はエッチングプロセスを促進し、原子の引き抜きと付加を通じてナノ粒子を再成形することが示されているが、不十分な形状およびサイズ分散度の粒子に終わっている。金双角錐の純度およびそれらに固有の単分散性を利用して、このエッチングプロセスは別の単分散構造を創り出すのに適応されてきた。双角錐小平面および鋭い先端の高エネルギー性により、これらの高反応性粒子は弱い酸化薬であってもエッチング薬としての酸素の影響を受けやすい。図５Ａに示すように、０．１ＭのＢＤＡＣ存在下で１２０℃で反応が進行して、双角錐は先端部でエッチングが始まり、連続的に浸食されて米粒形状となり、最終的に棒状となる。図５ＢのＵＶ−可視スペクトルは、ＴＥＭ像に見られるような構造変化に一致する連続的な変化を示す。保護剤およびエッチング薬としてＢＤＡＣが存在すると、精製された金双角錐は４個のAu⁰原子のAu⁺への４電子酸化を促進し塩化金の塩を形成して、同時に酸素分子を水に還元する。高温の系は次にナノ粒子表面で不均化を起こし、表面に戻ってAu⁰原子を低エネルギーかつ低欠陥部で析出させる。このプロセスは、粒子が最小エネルギーになるまで、この場合は金ナノロッドになるまで、欠陥部で連続的に原子を取り去りそれらを欠陥部に置き直すことを繰り返す。室温でも、同様の動的プロセスが起こるが、１日に２ｎｍ未満のＬＳＰＲピークの青色シフトという結果になっている（図１４Ａ）。このことは、反応の熱力学的特性を示しており、また、双角錐のナノロッドへのエッチングは温度を上げることによってさらに促進されることを示している。ＣＴＡＢを保護剤およびエッチング薬として用いると、反応は遅くなり、図５Ａ、パネル２のものに類似の構造を得るにはほぼ一桁長い時間を要する（図１４Ｂ、ここで右から左までの時間間隔は、以下の通りである：加熱前、１０分、１５分、３０分、９０分、３００分、および９００分）。濃度を界面活性剤の臨界ミセル濃度（１ｍＭ）に下げるとエッチング反応速度を上げることができ、ナノ粒子の酸化化学種からの保護を減少させることは注目すべきことである（図１４Ｃ）。

再成長方法を他の構造に拡大するために、単分散のエッチングされた構造を種結晶として用いて、一成分界面活性剤および二成分界面活性剤の両方で再成長構造を合成した。図６Ａ−６Ｃにエッチングで得られた棒状の粒子を用いた再成長構造のＴＥＭ像およびＵＶ−可視スペクトルを示す。一成分界面活性剤および二成分界面活性剤を用いたエッチングされた粒子からの成長挙動は極めて類似しており、おそらく金双角錐の先端に影響する鋭い先端がないことによることが確認されている。興味深いことに、エッチングで得られた米粒形状の粒子は、標準成長溶液を再成長に用いると、双角錐の元の構造に逆転換する（図１５Ａおよび１５Ｂ）。一方、標準成長溶液での棒状の粒子の再成長は、完全には双角錐には逆転換できず、代わりに双角錐の鋭い先端がない二錘を形成する。（図６Ａ、パネル１）。双角錐と同じ成長条件を適用すると、エッチングされた粒子を用いて、５００ｎｍから８００ｎｍの間の短波長領域におよぶプラズモン共鳴で、二錘から短いダンベルへの新しい型のナノ構造が合成された。一成分界面活性剤または二成分界面活性剤を用いてエッチングされた棒状の粒子から得られたすべての再成長構造はまた図４Ｂの双角錐と同様のＦＦＴパターンを持つことが確認された。

〔考察〕

再成長方法では、双角錐形状に基づいた様々な新しい金ナノ粒子形状の合成に成功した。双角錐の純度および単分散性により、増大した双角錐、球状先端、鋭い先端、およびロッド状の先端をもったダンベル、二錘、および球状多面体に亘って、双角錐と同様に純粋で均一な生成物が得られる。一成分界面活性剤での双角錐の成長は、アスペクト比の制御と同様に、２００ｎｍをはるかに超える長さに、また、ＮＩＲ範囲内の縦方向プラズモン共鳴ピークに制御できるように調整できる。二成分界面活性剤系での再成長から、粒子表面への特定の界面活性剤の局在化についての知見が得られる。酸と銀の濃度の変更と併用すると、ユニークな形状を生じる機会が得られる。さらに、双角錐構造の高エネルギー特性は、エッチング薬として酸素分子のみを用いて制御できる酸化エッチングを可能にし、同じ手順を用いて、さらに再成長させた高度に単分散のナノ米粒およびナノロッド構造を創り出す。最終的に、高度に単分散であるが双晶構造の双角錐から始まる様々な成長条件では、かつてない狭い分布を持った広範囲のサイズと形状の貴金属ナノ粒子の創出が可能である。

〔方法〕

〔材料および装置〕すべての化学品は市販品供給業者から購入し、さらなる精製はせずに用いた。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ、Bioxtra、≧９９．０％）、塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム（ＢＤＡＣ、陽イオン洗剤）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ、≧９８．０％)、クエン酸三ナトリウム塩二水和物（≧９９．５％、BioUltra、分子生物学用）、テトラクロロ金酸三水和物（HAuCl₄・3H₂O）、Ｌ−アスコルビン酸（Bioxtra、≧９８．０％）はSigma Aldrichから購入し、硝酸銀（AgNO₃、≧９９．８％）、水素化ホウ素ナトリウム（NaBH₄、≧９９％）はFlukaから購入し、塩酸（HCl、１規定）は Fisher scientificから購入した。ナノ純水（１８．２ＭΩ、Barnstead Nanopure、Thermo Scientific、MA、USA）をすべての実験で用いた。ガラスバイアル瓶はKimble chaseから購入した（４ｍＬおよび２０ｍＬ、NJ、USA)。すべてのガラス機器は新たに調製した王水（HCl：HNO₃体積比３：１）で洗浄し、続いて大量の水ですすいだ。RCT Basic（IKA、NC、US）をマグネティックスターラーに用いた。ＵＶ−可視スペクトルは、Synergy H4（Biotek、VT、USA）およびCary 5000 UV-Vis-NIR（Agilent、CA、USA）で測定した。ホルムバール／カーボン支持膜銅グリッド（Ted Pella, Inc. Redding、CA、USA）およびＴＥＭ（Tecnai G2 F30 Super Twin microscope、300 kVおよびTecnai G2 Spirit、200 kV、FEI、OR、USA）をＴＥＭ分析に用いた。

〔金双角錐の合成および精製〕金双角錐は文献の方法にしたがって合成した。（Liu, M. & Guyot-Sionnest, P. Mechanism of silver(i)-assisted growth of gold nanorods and bipyramids. J. Phys. Chem. B 109, 22192-22200 (2005)を参照）。簡単に述べると、超純水を１８．９５ｍｌ、１０ｍＭのHAuCl₄を０．２５ｍｌおよび新たに調製した１０ｍＭのクエン酸ナトリウムを０．５ｍｌ用いて金の種結晶を調製し、氷冷した新鮮な１０ｍＭのNaBH₄を０．３ｍｌ、室温でマグネティックスターラーを用い５００ｒｐｍで撹拌しながら加えた。反応混合物を２時間撹拌し、使用前に１週間熟成した（熟成後、種結晶溶液は１か月安定で、再現性の良い双角錐の合成結果が得られる）。双角錐を、０．１ＭのＣＴＡＢを１０ｍＬ、０．０１ＭのHAuCl₄を０．５ｍＬ、０．０１ＭのAgNO₃,を０．１ｍＬ、１規定のHClを０．２ｍＬ、０．１Ｍのアスコルビン酸を０．０８ｍＬ、および様々な量の種結晶溶液を含む溶液中で成長させた；種結晶の体積は図７Ａのパネル１−５および表２に対応して１１０、１００、９５、８０および６０μＬ。溶液を４００ｒｐｍで穏やかに撹拌し、油浴中、３０℃で２時間保持した。コロイドを１３，０００ｇ、３０℃で１５分遠心分離し、１ｍＭのＣＴＡＢ１０ｍＬで洗浄し、これを２回行った。上澄みを除去後、沈殿物を１ｍＭのＣＴＡＢ溶液３ｍＬに再分散して、さらに精製した。大量の０．５ＭのＢＤＡＣ溶液および超純水を粗製双角錐溶液３ｍＬに加え、所望のＢＤＡＣ濃度の溶液１０ｍＬを得た。所望のＢＤＡＣ濃度は金双角錐のサイズに依存し、実験的に決定した（図７Ｂおよび７Ｃ）。用いたＢＤＡＣの濃度は、種結晶溶液６０、７０、９５、１００および１１０μＬで調製した双角錐に対応して、それぞれ２３０、２６０、３１０、３２０、および３５０ｍＭであった。溶液を混合し、インキュベータ中３０℃、１１時間静置した。得られた桃色の上澄みを注意深く除去し、１ｍＭのＣＴＡＢを３ｍＬバイアル瓶に加え、沈殿物を再分散した。次にバイアル瓶を１分間超音波処理した。得られた精製溶液（色は茶色）を８０００ｇで８分間遠心分離し、１ｍＭのＣＴＡＢ１ｍＬで洗浄し、これを２回繰り返して、過剰のＢＤＡＣを除去した。最後に、精製した双角錐を１ｍＭのＣＴＡＢ溶液１．５ｍＬに再分散させて、すべての再成長反応に用いた。８０μＬの種結晶溶液で調製した図２Ｃの精製双角錐をすべての再成長反応の種結晶として用いた。

〔双角錐のサイズの制御〕金双角錐のサイズは異なる濃度の成長溶液を用いても、異なる量の精製した種結晶溶液を用いても制御できる。再成長溶液の典型的な調製では、０．１ＭのＣＴＡＢ溶液０．９ｍＬを、マグネティックスターラーを用いて４００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃５分間油浴中に保持した。次にHAuCl_4、AgNO₃、HClおよびアスコルビン酸を表１に詳述するように順に加え、５分間保持した。最後に、一定量の精製した双角錐の種結晶溶液（表１）を加え、２時間保持した。反応体積を一定に保つために、変量した精製した双角錐の種結晶溶液を１ｍＭのＣＴＡＢ溶液で０．１ｍＬに調節した。得られた溶液を７０００ｇで８分間遠心分離し、１ｍＭのＣＴＡＢで洗浄し、これを２回繰り返して、次のキャラクタリゼーション用に１ｍＭのＣＴＡＢに再分散させた。

〔ナノ粒子の形状の制御〕様々な先端と特徴的な形状の構造は、表１に詳述したように、成長溶液の変更と併用して、一成分界面活性剤または二成分界面活性剤を用いて制御できる。一成分界面活性剤での手順は、化学品を加える条件を除いて、双角錐の肥大化と同様である。HClなし、AgNO₃なし、またはそれら両方なしでの合成では、代わりに、同じ量のナノピュア水を成長溶液に加えた。過剰量のAgNO₃,では、高濃度の溶液を標準再成長溶液と同量で用いた。精製双角錐種結晶溶液１００μＬのＣＴＡＢ（１ｍＭ）溶液を調製した再成長溶液に加え、２時間保持した。二成分界面活性剤を用いた再成長溶液の典型的な調製では、０．１ＭのＣＴＡＣを、マグネティックスターラーを用いて４００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で５分間油浴中に保持した。精製双角錐種結晶溶液１００μＬを７０００ｇで遠心分離し、所望の濃度のＣＴＡＢ溶液０．１ｍＬに再分散し、界面活性剤（ＣＴＡＣおよびＣＴＡＢ）間の比を調節した。精製双角錐種結晶を用いた反応物を上記と同様に加え、３０℃に２時間保持して反応を完結させた。得られた溶液を７０００ｇで８分間遠心分離し、１ｍＭのＣＴＡＢで洗浄し、これを２回繰り返して、次のキャラクタリゼーション用に１ｍＭのＣＴＡＢに再分散した。

〔双角錐の酸化エッチング〕酸化エッチングでは、精製した双角錐ＣＴＡＢ（１ｍＭ）溶液１００μＬを 他の試薬を含まない１００ｍＭのＢＤＡＣ溶液９００μＬに加えた。加熱中の蒸気の漏れを防ぐためにねじ蓋付きガラスバイアル瓶をテフロンテープで密封した。密封したバイアル瓶を１２０℃で予熱した油浴中に置き、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで撹拌しながら保持した。（密封した容器を加熱するとフラスコ内の圧力が高まるので注意すること。いかなる漏れも反応を促進するので、適切にバイアル瓶を密封することは反応速度を制御する上でも重要である。）１０分、１５分、３０分、６０分、９０分および２１０分後に、バイアル瓶を水浴で室温まで冷却し、酸化プロセスを停止した。得られた溶液を８０００ｇで８分間遠心分離し、１ｍＭのＣＴＡＢで洗浄し、これを２回繰り返して、次の再成長とキャラクタリゼーション用に１ｍＭのＣＴＡＢ１００μＬに再分散した。再成長の詳細な条件は表１を参照。

〔補足説明１〕枯渇凝集の概念は１９５８年にAsakuraとOosawaによって提案され、２０１０年にParkによって、ナノ粒子の精製技術に応用された。（Asakura, S. & Oosawa, F. Interaction between particles suspended in solutions of macromolecules. J. Polym. Sci. 33, 183-192 (1958) およびPark, K., Koerner, H. & Vaia, R. A. Depletion-induced shape and size selection of gold nanoparticles. Nano Lett. 10, 1433-1439 (2010)参照）。最初に精製されたナノ粒子系はナノロッドおよびナノスフェアを含んでいた。Parkはナノ粒子が凝集し始める時を予測するモデルを提案した。下の式１に示す簡単な式は、有効なミセル濃度とナノ粒子の接触面積をポテンシャルＵと関係づけている。|U| ≒ 4-5k_BTの時、粒子が溶液から凝集し始める。（Leal-Calderon, F. et al. Aggregation phenomena in water-in-oil emulsions. Langmuir 12, 872-874 (1996)参照）

（式１）

上記式１で、

は界面活性剤ミセルの半径、

はナノ粒子の接触可能面積、

は界面活性剤濃度、

は界面活性剤の臨界ミセル濃度、

は界面活性剤ミセルの凝集の数、

はアボガドロ数、

はボルツマン定数、

は温度である。双角錐の接触面積の計算では、形状を１０個の等価の三角形をもつ五角双角錐と仮定した。界面活性剤ミセルの定数はすべて文献から得た。

ＢＤＡＣを枯渇凝集に選択した理由は、ＣＴＡＢよりも有効ミセル濃度が高いことにある。ＢＤＡＣでは、ｒｍ＝２．４ｎｍ、ｃｍｃ＝０．０００５Ｍ、ｎ＝６２であり、ＣＴＡＢでは、ｒｍ＝３．０ｎｍ、ｃｍｃ＝０．００１Ｍ、ｎ＝１６２である。この結果、有効ミセル濃度はおおよそ２．６倍高く、凝集のポテンシャルはおおよそ２．０９倍高くなる（ミセルサイズが小さいことによる）。１０個の等価面を持つ双角錐は、本質的には５個の面を持つ同じサイズのナノロッドと比べて、実際には相対的に接触面積が小さいので、高いミセル濃度が必要となる。

精製双角錐の範囲はわずか６８ｎｍから９５ｎｍであるが、一方、種媒介成長で得られる双角錐のサイズの範囲はそれらより短くも長くもなる。短い双角錐は、精製に必要なＢＤＡＣ濃度が約４００ｍＭ以上なので精製が難しい。この高さの濃度では、凝集が妥当な時間枠内に起こるには粘度が高くなりすぎる。９５ｎｍより大きく合成された双角錐では、疑似球状不純物も比例して大きい。これらの不純物が大きく成長するので、それらは、より球状でなくなり、より小平面化する。これらの小平面は双角錐と共凝集し始めるのに十分なサイズとなり、サイズ選択性に基づくあらゆる精製の可能性を効果的に防ぐ。

〔実施例２〕ＩＲ光誘起ＰＣＲ

この実施例では、金双角錐ナノ結晶の光励起ＰＣＲでの使用について説明する。

双角錐シリカコアシェルナノ結晶の合成およびそのペグ化

オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ、試薬級、９８％）はSigma Aldrichから購入した。メトキシ（ポリエチレングリコール）シラン（ＭＷ＝５０００）はLaysan Bioから購入した。すべての化学品は市販品供給業者から購入し、さらなる精製はせずに用いた。ナノ純水（１８．２ＭΩ、Barnstead Nanopure、Thermo Scientific、MA、USA）をすべての実験で用いた。RCT Basic and heating block（IKA、NC、US）をマグネティックスターラーと加熱に用いた。

双角錐を、０．１ ＭのＣＴＡＢを１０ ｍｌ、０．０１ ＭのHAuCl₄,を０．５ ｍｌ、０．０１ ＭのAgNO₃,を０．１ ｍｌ、１ 規定のHClを０．２ ｍｌ、０．１ Ｍのアスコルビン酸を０．０８ ｍｌおよび種結晶溶液を３０μｌ含む溶液中で成長させた。精製した双角錐を１ ｍＭのＣＴＡＢ溶液１．５ ｍｌに再分散し、シリカコーティングに用いた。双角錐シリカコアシェルナノ結晶の合成では、５ｍｌの双角錐のＣＴＡＢ（１ｍＭ）溶液５００μＬを脱イオン化水５００μＬと５ｍｌのバイアル瓶中で混合した。この溶液中で、０．１ＭのＮａＯＨ１．３μｌを加えてｐＨを１０から１０．４の間に調整し、次にＴＥＯＳ（２０ｖ／ｖ％エタノール溶液）８μｌを３０℃で加えて、すぐに１分間撹拌した。ＴＥＯＳを添加後、一晩、溶液を穏やかに撹拌した。溶液を１５００ｇで１５分間遠心分離し、脱イオン水１ｍＬ（２回繰り返す）とエタノール（２回繰り返す）で洗浄し、次にエタノール９５０μｌに再分散した。

ペグ化には、１０ｍＭのメトキシ（ポリエチレングリコール）シランエタノール溶液５０μｌを加え、渦攪拌しながら２時間保持した。最後に、得られた溶液を１５００ｇで１０分間遠心分離し、１ｍＬのエタノール（２回繰り返す）と脱イオン水（２回繰り返す）で洗浄し、次に脱イオン水に再分散した。洗浄と洗浄の間に数秒間の超音波処理が必要だった。ナノ結晶の光学密度の決定には、ＵＶ−可視スペクトルをUV-2401PC (Shimadzu, Kyoto, Japan)と吸収クベット（ウルトラミクロセル、体積＝５０μｌ、光路長＝１０ｍｍ、Mullheim, Germany）で測定した。スペクトルを図２１に示す。

双角錐シリカコアシェルナノ結晶のＬＥＤによるプラズモン加熱

赤外ＬＥＤ（ピーク波長８５０ｎｍ、金属コアＰＣＢに装着、順方向電流７００ｍＡ、順方向電圧１２．４Ｖ、LZ4-00R608, LED Engine, CA, USA）を用いて双角錐シリカコアシェルナノ結晶をプラズモン加熱し、ソースメータ(Keithley-2636A, Tektronix, Inc., OR, USA)で制御した。20.0 mm Focus Spot Top Lens Fiber Coupling (10356, Carclo Optics, PA, USA)を用いて、試料に光を集束した。青色ＬＥＤ（５ｍｍ、ピーク波長４８０ｎｍ、順方向電圧３．２Ｖ、順方向電流２０ｍＡ、４．１ｃｄ、C503B-BCN-CV0Z0461, CREE, Inc., NC, USA）および FITC Excitation Filter（中心波長＝４７５ｎｍ、バンド幅＝３５ｎｍ、MF475-35, Thorlabs, Inc., NJ, USA）をSYBR Green Iの励起に用い、分光計（USB4000, Ocean Optics, Inc., FL, USA）を用いて実時間ＰＣＲの蛍光信号を検出した。ＵＳＢ型熱電対測定器（USB-TC01, National Instruments, TX, USA）およびＫ型絶縁熱電対（5SC-TT-K-40-36, OMEGA Engineering, INC. CT, USA）を用いて温度を測定し、記録した。ＬＥＤを用いた熱サイクル、ソースメータ、蛍光測定、冷却ファン、および温度測定はLabVIEWプログラムで制御した。

異方性の金コアシリカシェル双角錐ナノ結晶は電磁波スペクトルの異なる領域に光学的吸収を有し、図１９Ｂに示す双角錐ナノ結晶は横方向（短軸）と縦方向（長軸）でそれぞれ５２０ｎｍ付近と８７５ｎｍ付近にピークをもつ（図１９Ａ）ことが観察された。また、ＬＥＤパルスの長さと頻度を制御すると、異なる固定温度条件を実現できることも観察された。例えば、図２０Ａに示す吸収スペクトルをもつ金コアシリカシェル双角錐ナノ結晶では、図２０Ｂに示すように、溶液温度６０℃と６５℃を実現できた。

加熱速度および冷却速度を決定するために、脱イオン水中で８４６ｎｍの最大ピーク波長をもつペグ化した双角錐シリカコアシェルナノ結晶を用いて、７２℃と９５℃間の３０熱サイクルを実施した。図２２に示すように、異なる光学密度をもつナノ結晶５μｌと液体ワックス（CHO-1411, Bio-Rad Laboratories, Inc., CA, USA）を用いて、ナノ結晶の光学密度に対応した、冷却および加熱速度を決定した。図２３Ａに示すように、光学密度１４．１および２１．５のナノ結晶（１２μｌ液体ワックス）１０μｌを用いて、注入電流に対応した冷却および加熱速度を決定した。０．４Ａからの電流での１４．１ＯＤおよび２１．５ＯＤの試料の熱サイクルをそれぞれ図２３Ｂと２３Ｃに示す。光学密度６．３、１４．１、および２１．５の試料を、５、１０、および２５μｌ（それぞれ、液体ワックス１２，１５および３０μｌ）用いて、試料体積に対応した 冷却および加熱速度を決定した。結果を図２３Ｄに示す。

ＬＥＤ照射９０サイクル前後で、双角錐ノ結晶のスペクトル（図２４Ｃ）およびそれらの形態（図２４Ａ：照射前、２４Ｂ：照射後）には変化がなかった。

実時間ＰＣＲ研究

Ｍ１３ｍｐ１８の１本鎖ＤＮＡ、長さ１００塩基対の単位複製配列をNew England BioLabs, Inc.から購入し、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用いた。ＨＰＬＣで精製した順方向プライマー（ＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣＣＴＣＴＧＴＡＧＣＣＧＴＴＧＣＴ）および逆方向プライマー（ＧＣＴＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴＴＡＡＡＧＧＣＣＧＣＴＴ）をIntegrated DNA Technologiesから購入し、KAPA2G Fast DNAポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、KAPA2G Buffer A (5 X)およびKAPA dNTP Mix (それぞれ１０ｍＭ)をKAPA Biosystemsから購入した。SYBR Green I (×10,000) はMolecular Probes, Inc.から得た。

図２５Ａ−２５ＦのＲＴ−ＰＣＲでは、プラズモンＰＣＲの反応混合物は、１４．１ＯＤの双角錐シリカコアシェルナノ結晶、KAPA2G Buffer A (1 X)、dNTPs（それぞれ０．２μＭ）順方向プライマー（５μＭ）、逆方向プライマー（５μＭ）、KAPA2G Fast DNAポリメラーゼ（０．２Ｕ／μｌ）、ＢＳＡ（図２５Ａおよび図２５Ｂでは０．１％、図２５Ｃおよび図２５Ｄでは０．３％、図２５Ｅおよび図２５Ｆでは０．５％、ｖｏｌ／ｖｏｌ）、Ｍ１３ｍｐ１８の１本鎖ＤＮＡ鋳型（０．１μｇ／ｍｌ）、SYBR Green I（１．５Ｘ）を含む。ＲＴ−ＰＣＲは７２℃−９５°Ｃの間の熱サイクルを４０サイクル行った。７５℃、取得時間０．５秒で、蛍光により、反応を実時間でモニターした。

ゲル電気泳動では、Agarose HSパウダーをDenville scientific, Inc.から購入し、10×TBE緩衝液をBio-Rad Laboratories, Inc.から購入して最終濃度０．５に希釈した。PAGE GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000X水溶液をBiotium, Inc.から購入した。Gel Loading Dye Purple (×6) はNew England BioLabs, Inc.から得た。

ＤＮＡ断片を（１％）アガロースゲル電気泳動で分離した。ゲルはアガロースを0.5×TBE緩衝液に溶解して調製した。試料の投入は、ＤＮＡを等体積比でアガロースゲルローディング色素と混合し、ゲルに９０Ｖをかけた。ＤＮＡを可視化するため、新たに調製した3×PAGE GelRed Nucleic Acid溶液でゲルを５分間染色し、Gel Doc XR+ System, Bio-Rad Laboratories, Inc.で画像化した。

〔実施例３〕熱制御酵素反応

この実施例では、ＤＮＡプラスミドの２段階消化の光活性化熱制御での金双角錐ナノ結晶の使用について説明する。（ペグ化したコアシェルナノ結晶の合成は、実施例２に記載。）

ＤＮＡ消化では、プラスミドpBR322 DNA（長さ４３６１塩基対の二本鎖環状）および制限酵素EcoRI-HF（１００，０００単位／ｍｌ）とBsmI（１０，０００単位／ｍｌ）をNew England BioLabs, Inc.から購入し、10×CutSmart Bufferは制限酵素と共に供給された。

pBR322 DNAプラスミド１μｇを10×CutSmart緩衝液（１×最終濃度）、EcoRI-HF制限酵素１００単位、およびBsmI制限酵素１０単位と混合し、３７℃で１５分間（EcoRI-HF酵素の最適条件）消化し、次に温度を６５℃に上げて１５分間（BsmI酵素の最適条件であり、EcoRI-HF酵素を失活させる）、合計消化時間３０分で消化した。BsmI酵素は８０℃まで２０分間加熱して失活させた。 得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にかけ、Gel Doc XR+ System, Bio-Rad Laboratories, Inc.で画像化した。

本明細書で用いられる語「実例となる(illustrative)」は、例（example, instance, or illustration）として挙げることを意味する。明細書で「実例となる」として記述されたいかなる側面すなわち狙いも、必ずしも、他の側面すなわち狙いを超えて好ましいあるいは利点があると解釈されるものではない。さらにこの発明においておよび、特に定めのない限り、「１つの（「a」または「an」）は「一つ以上」を意味する。

本発明の実例となる実施態様についての前述の説明は、説明のために示したものである。網羅的であることあるいは発明を開示された正確な形に限定することを意図しておらず、また、上記の教示に照らして変更が可能であり、本発明の実例から習得されてもよい。 実施態様は、本発明の原理を説明するために、また、当業者が本発明を様々な実施態様で、また期待される特定の用途に適するように様々な変更をして利用できるように、本発明の実際の応用として選択し、説明したものである。本発明の範囲はこの文書に添付した請求項およびそれらと同等のもので規定される。

Claims (48)

1. 金属双角錐ナノ結晶および少なくとも１種の別の型の金属ナノ結晶を含む出発試料から金属双角錐ナノ結晶の試料を形成する方法であって：
   出発試料および塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムを含む水溶液を調製すること；
   前記水溶液を、金属双角錐ナノ結晶を前記水溶液から凝集させるのに十分な時間および温度に保持すること；および
   前記凝集した金属双角錐ナノ結晶を前記溶液から分離し、金属ナノ結晶の少なくとも８５％が金属双角錐ナノ結晶である金属ナノ結晶を提供することを含む方法。
2. 前記金属双角錐ナノ結晶が１００ｎｍ未満の平均長および８％未満のサイズ多分散度を有する請求項１の方法。
3. 前記金属双角錐ナノ結晶が金双角錐ナノ結晶である請求項１の方法。
4. 金属双角錐ナノ結晶から二次双晶金属ナノ結晶を成長させる方法であって：
   種金属双角錐ナノ結晶、少なくとも１種の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤、金属前駆体分子、および還元剤を含む溶液を調製すること；および
   前記還元剤が前記前駆体分子中の金属を還元し、前記金属が前記種金属双角錐ナノ結晶面に析出し、それによって二次双晶金属ナノ結晶を成長させる条件で、溶液を保持することを含む方法。
5. 前記種金属双角錐ナノ結晶および前記二次双晶金属ナノ結晶が８％未満のサイズ多分散度を有し、前記種金属双角錐ナノ結晶が１００ｎｍ未満の平均長を有し、前記二次双晶金属ナノ結晶が１００ｎｍより長い平均長を有する請求項４の方法。
6. 前記溶液が、溶液中で１価の銀イオンを供給する銀塩、溶液のｐＨを下げて金属前駆体分子の還元速度を低減するｐＨ調整液、またはそれらの組み合わせをさらに含む請求項４の方法。
7. 前記金属が金であり、前記銀塩が硝酸銀であり、かつ前記ｐＨ調整液が塩酸である請求項６の方法。
8. 前記溶液が１成分の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤のみを含む請求項４の方法。
9. 前記二次双晶金属ナノ結晶が前記種金属双角錐ナノ結晶の双角錐形状を維持している請求項８の方法。
10. 前記溶液が第１の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤および第２の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤を含み、前記第２の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤は、前記種金属双角錐ナノ結晶に対して前記第１の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤より低い結合親和性を有する請求項４の方法。
11. 前記第１の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤が塩化セチルトリメチルアンモニウムであり、かつ前記第２の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤が臭化セチルトリメチルアンモニウムである請求項１０の方法。
12. 塩化セチルトリメチルアンモニウムの臭化セチルトリメチルアンモニウムに対するモル比が９：１から９００：１の範囲である請求項１１の方法。
13. 前記溶液が溶液中で１価の銀イオンを供給する銀塩、溶液のｐＨを下げて前記金属前駆体分子の還元速度を低減するｐＨ調整液、またはそれらの組み合わせをさらに含む請求項１０の方法。
14. 前記金属が金であり、前記銀塩が硝酸銀であり、かつ前記ｐＨ調整液が塩酸である請求項１３の方法。
15. 前記二次双晶金属ナノ結晶がダンベル形状である請求項１０の方法。
16. 前記溶液が銀塩を含み、かつ前記二次双晶金属ナノ結晶は二錘形状の本体および双角錐形状の末端を含むダンベル形状のナノ結晶を含む請求項１３の方法。
17. 前記溶液がｐＨ調整液を含み、かつ前記二次双晶金属ナノ結晶は二錘形状の本体および多重双晶棒状の末端を含むダンベル形状のナノ結晶である請求項１３の方法。
18. 前記溶液がｐＨ調整液および銀塩を含み、かつ前記二次双晶金属ナノ結晶は二錘形状の本体および多重双晶球状形状の末端を含むダンベル形状のナノ結晶である請求項１３の方法。
19. 金属双角錐ナノ結晶から二次双晶金属を成長させる方法であって：
    種金属双角錐ナノ結晶、少なくとも１種の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤、および酸化エッチング剤を含む溶液を調製すること；
    前記酸化エッチング剤が前記種金属双角錐ナノ結晶を酸化して、双晶金属ナノロッドナノ結晶を形成する条件に前記溶液を保持すること；
    双晶金属ナノロッドナノ結晶、少なくとも１種の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤、金属前駆体分子、および還元剤を含む溶液を調製すること；および
    前記還元剤が前記前駆体分子中の金属を還元し、金属が双晶金属ナノロッドナノ結晶面に析出し、それによって二次双晶金属ナノ結晶を成長させるのに十分な条件で第２の溶液を保持すること
    を含む前記方法。
20. 前記酸化エッチング剤が溶存酸素分子である請求項１９の方法。
21. 前記種金属双角錐ナノ結晶および前記二次双晶金属ナノ結晶が８％未満のサイズ多分散度を有する請求項１９の方法。
22. 前記溶液が１成分陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤のみを含み、かつ溶液中で１価の銀イオンを供給する銀塩、溶液のｐＨを下げて前記金属前駆体分子の還元速度を低減するｐＨ調整液、またはそれらの組み合わせをさらに含む請求項１９の方法。
23. 前記金属が金であり、前記銀塩が硝酸銀であり、かつ前記ｐＨ調整液が塩酸である請求項２２の方法。
24. 前記溶液が銀塩を含み、かつ前記二次双晶金属ナノ結晶が長尺状双角錐ナノ結晶である請求項２２の方法。
25. 前記溶液がｐＨ調整液を含み、かつ前記二次双晶金属ナノ結晶が球状多面体ナノ結晶である請求項２２の方法。
26. 前記溶液が銀塩およびｐＨ調整液を含み、かつ前記二次双晶金属ナノ結晶が金属二錘ナノ結晶である請求項２２の方法。
27. 前記溶液が第１の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤および第２の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤を含み、前記第２の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤は、前記双晶金属ナノロッドナノ結晶に対して前記第１の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤より低い結合親和性を有する請求項１９の方法。
28. 前記第１の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤は塩化セチルトリメチルアンモニウムであり、かつ前記第２の陽イオン性四級アンモニウム界面活性剤は臭化セチルトリメチルアンモニウムである請求項２７の方法。
29. 前記溶液が溶液中で１価の銀イオンを供給する銀塩、溶液のｐＨを下げるｐＨ調整液、またはそれらの組み合わせをさらに含む請求項２７の方法。
30. 前記金属が金であり、前記銀塩が硝酸銀であり、かつ前記ｐＨ調整液が塩酸である請求項２９の方法。
31. 前記二次双晶金属ナノ結晶がダンベル形状である請求項２７の方法。
32. 前記二次双晶金属ナノ結晶は二錘形状の本体および双角錐形状の末端を含むダンベル形状のナノ結晶である請求項３１の方法。
33. 二錘形状の本体および双角錐形状の末端を含む双角錐金属ナノ結晶。
34. 二錘形状の本体および形状の多重双晶棒状の末端を含む双角錐金属ナノ結晶。
35. 二錘形状の本体および形状の多重双晶球形状の末端を含む双角錐金属ナノ結晶。
36. 双晶ナノロッドナノ結晶、双晶長尺状双角錐ナノ結晶、双晶球状多面体ナノ結晶、および双晶二錘ナノ結晶から選択される双晶金属ナノ結晶。
37. 化学反応を光熱調節する方法であって：
    ２種以上の化学反応物および金属ナノ結晶を含み、少なくとも８５％がプラズモン金属双角錐ナノ結晶であり、前記プラズモン金属双角錐ナノ結晶は８％未満の多分散性を有する反応溶液を調製すること；および
    前記反応溶液を電磁波スペクトルの可視光領域、電磁波スペクトルの赤外領域、または両方の波長を有する放射線で溶液を照射し、前記プラズモン金属双角錐ナノ結晶は放射線を吸収し、プラズモン光熱照射−熱変換を経て、前記反応混合物を２種以上の化学反応物間の化学反応を調節する温度に加熱することを含む方法。
38. 標的核酸分子を増幅する方法であって：
    標的核酸分子；プライマー核酸鎖；遊離ヌクレオチド；核酸ポリメラーゼ；および金属ナノ結晶を含み、前記金属ナノ結晶の少なくとも８５％はプラズモン金属双角錐ナノ結晶であり、前記プラズモン金属双角錐ナノ結晶は８％未満の多分散性を有する反応溶液を調製すること；および
    複数回の光熱サイクルを通じて反応溶液を循環させることを含み、
    前記光熱サイクルは、
    前記反応溶液を電磁波スペクトルの可視光領域、電磁波スペクトルの赤外領域、または両方の波長を有する放射線で溶液を照射し、前記プラズモン金属双角錐ナノ結晶は放射線を吸収し、プラズモン光熱照射−熱変換を経て、前記反応溶液を、標的核酸分子が変性を起こす温度に加熱すること；および
    プライマー核酸鎖が変性した標的核酸分子をアニールし、アニールされたプライマー核酸鎖から出発して核酸の新たな鎖が合成されて新しい標的核酸分子を形成する温度に反応溶液を冷却することを含む、方法。
39. 前記反応溶液が標的核酸分子に結合する蛍光プローブ分子を含み、かつ前記方法が前記蛍光分子を励起し得られた蛍光をモニターすることを含む請求項３８の方法。
40. 前記プラズモン金属双角錐ナノ結晶が金双角錐ナノ結晶である請求項３８の方法。
41. 前記金双角錐ナノ結晶がシリカでコートされている請求項４０の方法。
42. 前記反応溶液が２から４の範囲の光学密度を有する請求項４０の方法。
43. 前記反応溶を１分間当り少なくとも２回の光熱サイクルの割合で光熱サイクルに循環させる請求項３８の方法。
44. 酵素反応を熱的に制御する方法であって：
    酵素；基質分子；および金属ナノ結晶試料を含み、金属ナノ結晶の少なくとも８５％がプラズモン金属双角錐ナノ結晶であり、前記プラズモン金属双角錐ナノ結晶は８％未満の多分散度を有する反応溶液を調製すること；および
    反応溶液を電磁波スペクトルの可視光領域、電磁波スペクトルの赤外領域、または両方の波長を有する放射線で溶液を照射し、前記プラズモン金属双角錐ナノ結晶は放射線を吸収し、プラズモン光熱照射−熱変換を経て、第１の温度から第２の温度に反応溶液を加熱することを含み、前記第１の温度では、前記酵素が基質分子と酵素−基質複合体を形成する活性状態にあり、前記基質分子を生成物分子に変換し、前記第２の温度では、前記酵素は失活して前記基質分子から解離する、方法。
45. 前記基質分子がＤＮＡプラスミドであり、かつ前記酵素がＤＮＡ消化酵素である請求項４４の方法。
46. 前記反応溶液が、第１の温度では基質分子と酵素−基質複合体を形成しない不活性状態にあるが、第２の温度では前記生成物分子と酵素−基質複合体を形成する活性状態に変わり、前記生成物分子を新たな生成物分子に転換する第２の酵素をさらに含む請求項４４の方法。
47. ＤＮＡ分子を含む反応混合物を光熱加熱する方法であって：
    反応混合物を金属双角錐ナノ結晶と接触させること；および
    金属双角錐ナノ結晶を放射線で照射し、ここで金属双角錐ナノ結晶は放射線を吸収し、光熱照射−熱変換を経て、反応混合物を加熱すること
    を含む方法。
48. 酵素を含む反応混合物を光熱加熱する方法であって：
    反応混合物を金属双角錐ナノ結晶と接触させること；および
    金属双角錐ナノ結晶を放射線で照射し、ここで金属双角錐ナノ結晶は放射線を吸収し、光熱照射−熱変換を経て、反応混合物を加熱すること
    を含む方法。

Images