JP2021040656A - 核酸をプロービングおよびマッピングするためのrna誘導型システム - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2014年8月19日に提出された米国仮特許出願第62/039,341号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、(a)核酸を、ヌクレアーゼ活性を有するか、または保持しているCas9タンパク質およびガイドRNAを含む複合体と、複合体が核酸に結合し、核酸を切断するが、核酸から容易に解離しない(すなわち、核酸に結合したままであり、切断された鎖の両方を保持する条件下で)接触させること、および(b)ステップ(a)の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、そのような条件は、Mg2+などの二価カチオンの存在を含む。いくつかの実施形態では、ステップ(a)とステップ(b)の間に少なくとも1つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じる複合体の少なくとも1つのコンポーネントが標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは天然PAM部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは人工PAM部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、Cas9はCas9の変化バージョンである。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは切断型(truncated)ガイドRNAである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドは、ガイドRNAのシード領域、すなわちPAM部位に隣接する4〜7ヌクレオチドだけを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、(a)核酸を、ヌクレアーゼ活性を有するか、または保持しているCas9タンパク質およびガイドRNAを含む複合体と、複合体が核酸に結合し、核酸を切断せず、核酸から容易に解離しない条件下で接触させること、および(b)ステップ(a)の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、そのような条件は、Mg2+などの二価カチオンの欠如を含む。いくつかの実施形態では、ステップ(a)とステップ(b)の間に少なくとも1つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じる複合体の少なくとも1つのコンポーネントが標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは天然PAM部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは人工PAM部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、Cas9はCas9の変化バージョンである。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは切断型ガイドRNAである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドは、ガイドRNAのシード領域、すなわちPAM部位に隣接する4〜7ヌクレオチドだけを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、(a)核酸を、(例えばD10A/H840A dCas9)などの酵素的に不活性な、またはヌクレアーゼ欠損のCas9タンパク質およびガイドRNAを含む複合体と、複合体が核酸を切断せず、核酸から容易に解離しない条件下で接触させること、および(b)ステップ(a)の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、ステップ(a)とステップ(b)の間に少なくとも1つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じる複合体の少なくとも1つのコンポーネントが標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは天然PAM部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは人工PAM部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、Cas9はCas9の変化バージョンである。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは切断型ガイドRNAである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドは、ガイドRNAのシード領域、すなわちPAM部位に隣接する4〜7ヌクレオチドだけを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、(a)核酸を、Cas9ニッカーゼ(すなわち、Cas9 D10A変異体またはH840A変異体などのCas9タンパク質のニック形成変異体)およびガイドRNAを含む複合体と、複合体が核酸から容易に解離しない条件下で接触させること、および(b)ステップ(a)の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、ステップ(a)とステップ(b)の間に少なくとも1つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じる複合体の少なくとも1つのコンポーネントが標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは天然PAM部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは人工PAM部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、Cas9はCas9の変化バージョンである。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは切断型ガイドRNAである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドは、ガイドRNAのシード領域、すなわちPAM部位に隣接する4〜7ヌクレオチドだけを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、(a)ガイドRNAが核酸から容易に解離しない条件下で核酸をガイドRNAと接触させること、および(b)ステップ(a)の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、ステップ(a)とステップ(b)の間に少なくとも1つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じるガイドRNA−DNA複合体は標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、標識またはタグはテール上にある。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは天然PAM部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは人工PAM部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、PAM部位に隣接する配列への結合を必要としない。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは切断型ガイドRNAである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドRNAは、ガイドRNAのシード領域、すなわちPAM部位に隣接する4〜7ヌクレオチドだけを含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は反復DNAの領域であり、シグナルは増幅される。いくつかの実施形態では、標的核酸はガイドRNAの添加前に変性される。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、(a)RNAが核酸に結合する条件下で核酸をRNAと接触させること、および(b)ステップ(a)の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、ステップ(a)とステップ(b)の間に少なくとも1つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じるRNA−DNA複合体は標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、標識またはタグはテール上にある。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は反復DNAの領域であり、シグナルは増幅される。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、(a)核酸を、二本鎖の不安定化/開鎖試薬およびガイドRNAまたはRNAと、複合体が形成されて核酸に結合して複合体が核酸から容易に解離しない条件下で接触させること、および(b)ステップ(a)の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、ステップ(a)とステップ(b)の間に少なくとも1つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じる複合体の少なくとも1つのコンポーネントは標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、標識またはタグはテール上にある。いくつかの実施形態では、Cas9はCas9の変化バージョンである。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは切断型ガイドRNAである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドは、ガイドRNAのシード領域、すなわちPAM部位に隣接する4〜7ヌクレオチドだけを含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は反復DNAの領域であり、シグナルは増幅される。不安定化試薬(一本鎖DNA安定化剤を含む)には、ヘリカーゼ、複製タンパク質A(RPA)、大腸菌の一本鎖結合タンパク質(SSB)、ベタイン、ベタイン/グリシン、ホルムアミド、尿素、DMSOなどが含まれる。二本鎖開鎖試薬には、プライモソームタンパク質PriA、三本鎖形成bis−PNA、ガンマPNAなどが含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、(a)、無細胞系でRNAを合成すること、(b)核酸をRNAおよび他のコンポーネントと接触させることであって、これにより複合体が形成され、前記複合体が核酸から容易に解離しないこと、および(c)ステップ(b)の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、ステップ(b)とステップ(c)の間に少なくとも1つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じる複合体の少なくとも1つのコンポーネントは標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、標識またはタグはテール上にある。いくつかの実施形態では、Cas9はCas9の変化バージョンである。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは切断型ガイドRNAである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドは、ガイドRNAのシード領域、すなわちPAM部位に隣接する4〜7ヌクレオチドだけを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、(a)複合体が核酸の一方の鎖中にニックを誘導する条件下で、核酸を、Cas9タンパク質のニック形成変異体および特異的位置を標的とするガイドRNAを含む複合体と接触させること、(b)ニックの3′末端をヌクレオチドで伸長させること、(c)ステップ(b)の生成物を検出するステップ、およびDNAがシーケンシングされるようにステップ(b)を繰り返すことを含む、標的シーケンシングに関する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは標識されている。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは末端リン酸で標識されている。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは4つ以上のリン酸を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、切断可能な結合を介して塩基で標識されている。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは可逆的ターミネーターである。いくつかの実施形態では、塩基における標識により可逆的な終止がもたらされる。いくつかの実施形態では、糖の3′または2′位における修飾により可逆的な終止がもたらされる。いくつかの実施形態では、4つのヌクレオチド全てが同時に伸長に利用可能である。いくつかの実施形態では、単一分子検出方法が用いられる。いくつかの実施形態では、単一分子は、線状のひも(linear string)として分析される。いくつかの実施形態では、核酸は細胞中でin situで分析される。核酸が細胞中でin situで分析されるいくつかの実施形態では、細胞は分析前に固定される。いくつかの実施形態では、in situで分析される核酸はDNA分子であり、分析前にRNA分子が除去される。いくつかの実施形態では、試薬を用いて、ニック形成後に核酸から複合体が取り除かれる。いくつかの実施形態では、ステップ(b)とステップ(c)の間に少なくとも1つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、Cas9はCas9の変化バージョンである。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは切断型ガイドRNAである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドは、ガイドRNAのシード領域、すなわちPAM部位に隣接する4〜7ヌクレオチドだけを含む。
いくつかの実施形態では、ニックの3′末端が修飾ヌクレオチドで伸長される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドはビオチン修飾されている。いくつかの実施形態では、取り込まれたビオチンを用いて、例えば自身が標識されている(または標識される)ストレプトアビジン/ニュートラアビジンまたは抗ビオチン抗体との相互作用を介して、標的DNAを標識する。いくつかの実施形態では、取り込まれたビオチンを用いて、例えば、磁気ビーズもしくはアガロースビーズなどのビオチンコーティングされた捕捉材料にまたは表面に自身が結合している(または結合する)ストレプトアビジン/ニュートラアビジンまたは抗ビオチン抗体との相互作用を介して、標的DNAを捕捉する。いくつかの実施形態では、Cas9/gRNAによって導かれるニック形成および捕捉を助けるように修飾されている塩基の取込みを用いて、溶液中で行われる反応中で、核酸試料の特異的な1または複数の部分を単離する。この実施形態では、例えば、ニック形成およびビオチン化dUTPの取込み後、生成物を、ビーズ上のストレプトアビジンがゲノムのビオチン化部分に結合できる長さの時間(例えば、1時間)、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズと反応させる。その後、磁石を適用し、固相ビーズに結合しているゲノムの標的部分を上清から分離することにより、目的の標的領域を単離する。上清は捨てられる。種々の程度の洗浄ストリンジェンシーおよび上清の除去の後、選択されたゲノムDNAは、当該技術分野で公知の方法により(例えば、90℃超に加熱することにより)、ビーズから分離される。その後、サイズ選択、ポリッシング(polishing)、バーコード化、テーリング(tailing)、ライブラリー作製、クラスター増幅、ロロニー(rolony)増幅などから選択されるステップを含み得る、当業者に公知の次世代シーケンシングの方法およびデバイスなどにより、捕捉された分子をシーケンシングすることができる。核酸試料の一部またはサブセットを選択または濃縮するための本明細書に記載のニック形成および取込みのアプローチは、伸長により複数のビオチンを取り込むことが可能になって捕捉効率が向上される限り、ガイドRNA/Cas9の結合と比べて利点がある。もう1つの利点は、標的が捕捉可能になるまでにgRNA/cas9結合、ニック形成、および伸長の3つのステップが必要なので、オフターゲットな捕捉が減少することである。この選択方法は、既存のアプローチ(例えば、Sureselect)よりクリーンであり、オフターゲット配列がより少ないので、シーケンシングが少なくなる。いくつかの実施形態では、ライゲーション反応などニックの5′末端で、例えばビオチン化オリゴヌクレオチドのライゲーションなどの反応を行う。いくつかの実施形態では、DNA二本鎖のセンスおよびアンチセンス鎖を分離することができる。この態様では、一方の鎖がgRNA/Cas9結合により、またはビオチン化ヌクレオチドの取込みにより捕捉され、他方は上清から回収される。あるいは、二本鎖の、gRNA結合により置換された鎖は、一本鎖結合タンパク質、ヒドロキシアパタイト、または配列特異的オリゴヌクレオチドへの結合により捕捉することができる。
いくつかの実施形態では、gRNAにより導かれるニック形成が、表面に結合した標的核酸、すなわちDNAで行われるか、あるいは、ニック形成が行われた後、DNAを表面に結合させる。いくつかの実施形態では、その後、ニックの3′末端が用いられてDNAシーケンシングを開始させることができる。ニックの3′末端により、ポリメラーゼに基づくシーケンシング、例えばイルミナ社の合成によるシーケンシング(sequencing by synthesis)が可能になる。ニックの3′末端および5′末端の両方により、例SOLID(ライフテクノロジーズ社(Life Technologies))などのライゲーションに基づくシーケンシング、およびライゲーションによるシーケンシング(コンプリートゲノミックス社(Complete Genomics Inc))が支持される。いくつかの実施形態では、ゲノムDNAは長さが長いままで保持され、これが表面に結合する前または結合した後にニック形成が行われる。いくつかの実施形態では、DNAを表面に結合させ、その長さに沿った配列または特徴を分析できるように伸展させるか、または伸長させる。そのような分析は、光学顕微鏡、電子顕微鏡、X線顕微鏡、または走査型プローブ顕微鏡を用いて行われ得る。いくつかの実施形態では、分析が光学的方法により行われる場合、表面上に配置されたポリヌクレオチド上でのシーケンシング反応に対して全反射照明(Total Internal Reflection)またはエバネッセント光/導波管イメージングが行われる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、線状化されるが、表面に結合しなくてもよい。いくつかの実施形態では、線状化は、ポリヌクレオチドが一方の末端で結合して流れの中でぶら下がる(dangle)ことによって起こる。いくつかの実施形態では、標的核酸、すなわちDNAは、流体力学的抗力により実質的に線状にされる。いくつかの実施形態では、DNAは、ナノスリット、ナノチャネル、またはナノグルーブ中に配置されることによりナノコンファインメント(nano-confinement)によって伸展される。いくつかの実施形態では、線状DNAは実質的に直鎖状(straight)である。いくつかの実施形態では、gRNAによって導かれるニックは、長い線状ポリヌクレオチド上の複数の選択された配列位置で行われる、合成によるシーケンシングを導く。この実施形態では、ポリメラーゼ酵素(例えば、9 Degree Northもしくはその変異体またはPhi29もしくはその変異体)が、合成によるシーケンシングにおいて検出可能なヌクレオチドを取り込むことによりニックからの伸長を行う。この検出は、(Ion Torrentシーケンシングにおけるように)pHを介したものであり得る。いくつかの実施形態では、検出はヌクレオチド上の蛍光標識を介したものである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、蛍光標識されていることに加え、可逆的ターミネーターとしても働き、それにより、当該技術分野で公知の方法(例えば、イルミナ社またはLasergen社のシーケンシング)により、逐次的な4色シーケンシングを行うことができる。取り込まれるヌクレオチドは、lightning terminators(Lasergen社)であってもよく、光切断可能な部分はUV光により切断される。いくつかの実施形態では、gRNA/Cas9複合体形成に続くシーケンシングは、選択的または標的化されたシーケンシングを行うことを目的とする。その他の実施形態では、gRNAは縮重位置の少なくとも一部を含み、ゲノム中に分布する複数の開始部位からシーケンシングが開始され、これは特定の遺伝子座に選択的ではない。いくつかの実施形態では、DNAが細胞内にあるが、ニック形成が起こる。いくつかの実施形態では、細胞は固定されている。例えば、ニック形成は、DNAがシーケンシングされる蛍光in situシーケンシング(FISSEQ)反応の一部を形成し得る。いくつかの実施形態では、ニック形成を用いて、細胞内のゲノムDNA中にニックを誘導し、その後、例えばPhi29などの標準的な鎖置換ポリメラーゼによる分岐またはローリングサークル増幅により、ニックに隣接した領域の増幅を開始する。その後、増幅産物に対してシーケンシングを行う。あるいは、TrueSeq(Helicos Bio社/SeqLL社)などの単一分子シーケンシング法を用いて、ニック形成されたゲノムDNAをニックから直接シーケンシングする。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の配列または結合部位の位置を検出する方法であって、(a)複合体が核酸から容易に解離しない条件下で、核酸をCas9タンパク質およびガイドRNAを含む複合体と接触させること;(b)ナノポアまたはナノギャップに核酸を通過させること;および(c)結合位置を分析すること、を含む方法に関する。いくつかの実施形態では、単一分子検出方法が用いられる。いくつかの実施形態では、単一チャネル記録が用いられる。いくつかの実施形態では、単一分子は線状のひもとして分析される。
いくつかの実施形態では、本発明は、ガイドRNAオフターゲット結合部位を検出する方法であって、(a)複合体が核酸から容易に解離しない条件下で、核酸をCas9タンパク質およびガイドRNAを含む複合体と接触させること、(b)結合位置を検出すること、(c)標的化された結合位置を決定すること、(d)オフターゲット結合の位置を決定すること、および(e)オフターゲット結合の位置によりオフターゲット結合の配列のアイデンティティーを決定することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、標識を用いて目印を与え、これを参照して標的結合またはオフターゲット結合を決定することができる。いくつかの実施形態では、標識は、核酸上の物理地図を作成する結合試薬を含む。いくつかの実施形態では、結合試薬は、非乱雑gRNA(non-promiscous gRNA)、制限酵素、ニッカーゼ酵素、オリゴヌクレオチドなどの1または複数であってもよい。いくつかの実施形態では、単一分子検出方法を用いる。いくつかの実施形態では、単一分子は線状のひもとして分析される。
いくつかの実施形態では、本発明は、染色体またはゲノムの領域のコピー数を決定する方法であって、(a)標的核酸配列を、コピー数を決定する対象の染色体またはゲノム領域に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質ならびに参照染色体および/またはゲノム領域に相補的な部分およびCas9タンパク質と接触させること、(b)コピー数を決定する対象の染色体/ゲノム領域からのシグナルと参照染色体またはゲノム領域からのシグナルとの比率を得ることを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は異数性の検出に応用される。いくつかの実施形態では、異数性はトリソミー21である。いくつかの実施形態では、コピー数を決定する対象の遺伝子座はLSI 21q22.13−q22.2である。
いくつかの実施形態では、本発明は、Her2増幅の程度を決定する方法であって、(a)標的核酸配列を、Her2遺伝子座に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質ならびに参照遺伝子座に相補的な部分およびCas9タンパク質と接触させること、および(b)参照遺伝子座と比べたHer2遺伝子座からのシグナルの比率を得ることを含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子融合の発生率を決定する方法であって、(a)標的核酸配列を、第1のゲノム遺伝子座に相補的な部分を有するガイドRNAプローブ配列およびCas9タンパク質ならびに第2のゲノム遺伝子座に相補的な部分を有するガイドRNAプローブ配列およびCas9タンパク質と接触させること、(b)第1および第2の遺伝子座間の共局在イベントを検出することであって、遺伝子融合がゲノム領域間の任意の融合であるステップを含む方法に関する。ある態様では、共局在の結果、プローブは互いに隣接する。
いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子融合の発生率を決定する方法であって、(a)標的核酸配列を、ゲノム遺伝子座(第1の遺伝子座)に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質ならびに隣接ゲノム遺伝子座(第2の遺伝子座)に(参照に準じて)相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させること、および(b)第1および第2の遺伝子座間の共局在イベントが検出されないかを決定することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、ALKなどの未分化リンパ腫キナーゼに適用される(図12参照)。いくつかの実施形態では、方法はROS1に適用される。ROS1はインスリン受容体ファミリーの受容体型チロシンキナーゼである。いくつかの実施形態では、アッセイは非小細胞肺癌の診断において適用される。
いくつかの実施形態では、本発明は、ゲノム領域の再編成を検出する方法であって、(a)ゲノムDNA試料を、ゲノム領域の特異的サブ領域に相補的な部分を各々有する複数のガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることであって、各サブ領域に対するgRNAが、他のサブ領域に対するgRNAからの区別を可能にするコードを含んでいること、および(b)ゲノムDNAをイメージングし、コードを解読し、コードのオーダーを参照と比較することであって、ほぼ目的のゲノム領域の長さにわたってコードが共局在していること、を含む方法に関する。いくつかの実施形態では、gRNAはテールでコードされている。いくつかの実施形態では、コードの解読は、テールのコード化部分を解読分子(decoder molecule)と接触させることにより行われ、そのような解読分子には、DNAまたはタンパク質プローブが含まれる。いくつかの実施形態では、ゲノム再編成を決定することに加え、特定のゲノムセグメントの異なるアレルも区別される。いくつかの実施形態では、異なるゲノムセグメントに対してと同様に、異なるアレルに対して異なるコードを用いることができる。いくつかの実施形態では、目的の領域は、ゲノムのBRCA1および/またはBRCA2領域である。いくつかの実施形態では、目的の領域はMHCまたはHLA領域である。いくつかの実施形態では、目的の領域は、MMR遺伝子、MLH1−PMS2およびMSH2−EPCAM−MSH6の周辺の領域であり、遺伝性非ポリポーシス大腸癌(HNPCC)の診断または分析において用いることができる。いくつかの実施形態では、各ゲノムセグメントに対して複数のgRNAが用いられ、そのような複数のガイドRNAの各々は同じコードで標識されている。
いくつかの実施形態では、ゲノムDNAの鎖が線状のひもとして分析される。いくつかの実施形態では、DNAは伸展される。いくつかの実施形態では、ナノポア/ナノギャップ分析が行われる。いくつかの実施形態では、ヒト第4染色体および第10染色体上の3.3kbのD4Z4リピート含有遺伝子座上の反復単位の数を計数(enumerate)する方法が用いられる。いくつかの実施形態では、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD)の患者を診断または分析するためにD4ZA領域の評価を用いる。いくつかの実施形態では、方法は、テロメアサブユニット反復数を計数するために用いられる。いくつかの実施形態では、方法は、セントロメア反復数を計数するために用いられる。いくつかの実施形態では、方法は、メジャーサテライト反復数を計数するために用いられる。いくつかの実施形態では、方法は、マイナーサテライト反復数を計数するために用いられる。
ある態様では、Cas9仲介in situハイブリダイゼーションを行うための方法は、目的の染色体領域またはゲノム領域に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と標的核酸配列を接触させるステップを含み、ガイドRNAおよびCas9タンパク質が、標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、目的の染色体領域またはゲノム領域が、フローセル中に配列され、in situハイブリダイゼーションの試薬および洗浄試薬が、目的の染色体領域またはゲノム領域の上に流される。ある態様では、複合体の位置は、蛍光、化学発光、エレクトロルミネセンス、比色検出などを含む群の方法を用いて検出される。
いくつかの実施形態では、本発明は、特異的アレルの存在を決定する方法であって、(a)標的核酸配列を、検出対象のアレルに相補的なシード部分(PAM部位に隣接する最初の4〜7ヌクレオチド)を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させること、および(b)核酸と共局在したgRNA/Cas9の存在を検出することを含む方法に関する。
ある態様では、特異的配列を検出するための診断方法であって、(a)標的核酸配列を、標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させるステップ、(b)表面上の位置で複合体を捕捉するステップ、(c)複合体中にのみ存在し、標的核酸配列上には存在しない標識により、その位置で捕捉された複合体を検出するステップを含む方法が提供される。ある態様では、特異的配列を検出するための診断方法であって、(a)標的核酸配列を、標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させるステップ、(b)表面上の位置で複合体を捕捉するステップ、(c)複合体中にのみ存在し、cas9/gRNA上に存在しない標識により、その位置で捕捉された複合体を検出するステップを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、アッセイは、ラテラルフローアッセイ、ディップスティックアッセイ、ペーパーマイクロフルイディクスアッセイ(paper microfluidics assay)、ドットブロットアッセイ、マイクロアレイアッセイの一部として行われる。いくつかの実施形態では、アッセイは診断的アッセイである。
いくつかの実施形態では、本発明は、同じ試料上で免疫組織化学(IHC)およびgRNA/cas9仲介in situハイブリダイゼーション(ISH)を組み合わせる方法であって、(a)標的クロマチン内の標的核酸配列を、標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させるステップであって、ガイドRNAおよびCas9タンパク質が、標的核酸配列に共局在して複合体を形成するステップ、(b)標的クロマチンをタンパク質結合試薬と接触させるステップ、および(c)ガイドRNA/cas9複合体とタンパク質結合試薬の比較位置を検出するステップを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、タンパク質結合試薬は抗体である。いくつかの実施形態では、タンパク質結合試薬はアプタマーである。いくつかの実施形態では、ガイドRNA/Cas9複合体およびタンパク質結合試薬はそれぞれ異なる標識をされている。いくつかの実施形態では、IHC試薬およびガイドRNA/Cas9 ISH試薬は一緒に添加される。いくつかの実施形態では、IHC試薬およびガイドRNA/Cas9 ISH試薬は連続して、すなわち次々と添加される。いくつかの実施形態では、ガイドRNA/Cas9 ISHは変性ステップを必要としないので、IHCを実施するためにタンパク質およびクロマチンの構造はインタクトなままである。いくつかの実施形態では、ガイドRNA/Cas9複合体を用いてクロマチンの特定の部分が単離され、分析方法を用いて、単離されたクロマチン上に存在するタンパク質が検出される。
いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸配列を検出する方法であって、(a)標的核酸配列を、標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させるステップであって、ガイドRNAおよびCas9タンパク質が、標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、ガイドRNAが、3′テール配列を含み、前記テールが、プローブ配列に相補的であるか、またはプライマーとして作用できるステップ、および(b)複合体を検出することにより標的核酸配列を検出するステップを含む方法に関する。ある態様では、テールは、gRNA結合位置のすぐ近傍の配列に相補的な配列を含む。ある態様では、テールは、二本鎖の置換鎖に相補的な配列を含む。ある態様では、二本鎖の標的鎖の一方がガイドRNAにより隔離され、他方の鎖が他の試薬と結合できるように開鎖される。例示的な試薬としては、一本鎖結合タンパク質、標識されていてもよい相補的オリゴヌクレオチド、または鎖に相補的なテールの一部が含まれ得る。ある態様では、テールは、DNA PAINTのためのドッキング部位またはハンドルを含む。いくつかの実施形態では、もう一方の鎖とのCas9/ガイドRNA複合体は安定化される。いくつかの実施形態では、RPAなどの一本鎖結合タンパク質またはオリゴヌクレオチドもしくはそのアナログ/模倣物が置換鎖に結合することにより、Cas9/ガイドRNA複合体が他方の鎖と安定化され得る。いくつかの実施形態では、安定化効果は、天然二本鎖の再ジッピング(re-zipping)による競合の減少によるものである。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を標識または標的化する方法であって、(a)核酸を、ガイドRNAと非標準的PAM配列に隣接して結合するように変化させたCas9タンパク質とを含む標識複合体に、複合体が核酸に結合する条件下で接触させるステップ、および(b)ステップ(a)の生成物を分析するステップを含む方法に関する。ある態様では、ステップ(a)とステップ(b)の間に少なくとも1つの洗浄ステップがあってもよく、gRNAの結合を促進するために、補助的な試薬が供給されてもよい。
プロトコール
gRNA合成プロトコール:
PCRアセンブリーを以下の通り行う。
・12μLのQ5 DNA ポリメラーゼ 2×マスターミックス(NEB社)
・3μLの10μM T7フォワードプライマー
・3μLの10μM バーコードリバースプライマー
・3μLの10μM Sp.gRNA.spli60(フォワード)
・3μLの10μM gRNA.end(リバース)
1.98℃、30秒
2.98℃、10秒
3.52℃、20秒
4.72℃、15秒
5.ステップ2から29サイクル繰り返す
6.72℃、2分
7.4℃で維持
・5.8μlのRNase−Free水
・2.5μl AmpliScribe T7−Flash 10×Reaction Buffer(イルミナ社)
・1.8μl 100mM ATP
・1.8μl 100mM CTP(+2μL Cy3−dUTP)
・1.8μl 100mM GTP
・1.8μl 100mM UTP
・2μl 100mM DTT
・0.5μl RiboGuard RNase Inhibitor
・5μl DNA鋳型
・2.0μl AmpliScribe T7−Flash Enzyme Solution
・1:1モル比の修飾されるNTPと修飾されたNTPを加える(例えば、0.9μlのUTPと0.9μlのUTP−Cy3)。
参照用のテールに単一のバーコードを有する1μgのgRNAは、25pmolのRNAとする。Cas9タンパク質およびgRNAを通常モル比1:1で混合して、Cas9−gRNA複合体を形成させる。野生型Cas9、ニッカーゼCas9、およびヌクレアーゼ欠損またはdead Cas9の複合体化にも同じ反応条件を用いることができる。野生型Cas9を用いる場合には、MgClを除いてもよく、その目的は切断を防ぐことである。発現用プラスミド、野生型Cas9、ヌクレアーゼ欠損Cas9、およびCas9ニッカーゼはAddgene社から入手可能である。プラスミドは、好適な宿主中で発現させることができ、タンパク質は、発現タンパク質中のHisタグの利用などの当該技術分野で公知の方法により精製することができる。より多くのgRNAが確実にCas9と複合体化するように、Cas9とgRNAをより高い比率(例えば、3:1)で用いることもできる。活性複合体は通常、37℃で15分間プレインキュベートすることにより形成される。反応バッファーは様々であり得る。例示的なバッファーとしては、20mM HEPES、100mM NaCl、5mM MgCl2、0.1mM EDTA、pH6.5;20mM Tris−HCl、100mM KCl、5mM MgCl2、5%グリセロール、1mM DTT、pH7.5;および1×PBS、5mM MgCl2、0.5%Tween−20、pH7.0が挙げられる。活性複合体は、すぐに用いることもでき、4℃で数週間保存することもできる。
このアッセイでは、試料は顕微鏡スライド(またはカバースリップスライド)に固定されている。スライドは、コプリンジャー中でインキュベートしてもよく、反応体積をさらに最小限に抑えるためおよびプロセスを自動化するために、フローチャンバーまたはフローセル中でアセンブルしてもよい。反応は以下の順番で行われ、特に断りのない限り、スライドはコプリンジャー中でインキュベートされる(フローチャンバーについて、情報を括弧で示す)。1×PBSおよび0.5%Tween−20と共に2分間インキュベートする(フローチャンバーの2倍量で洗浄し、各洗浄間に30秒間インキュベートする)。1×PBSおよび0.5%トリトンX−100と共に5分間インキュベートする(フローチャンバーの2倍量で洗浄し、各洗浄間に2分間インキュベートする)。0.1N HClと5分間インキュベートする(フローチャンバーの2倍量で洗浄し、各洗浄間に2分間インキュベートする)。1×PBSおよび0.5%Tween−20と共に2分間インキュベートする(フローチャンバーの2倍量で洗浄し、各洗浄間に30秒間インキュベートする)。Cas9バッファー中で5分間インキュベートする(フローチャンバーの2倍量で洗浄し、各洗浄間に30秒間インキュベートする)。この時間を用いて、37℃のCas9バッファー中でCas9−gRNAを予め複合体化するか、または冷蔵された複合体を37℃に温めることができる。通常は、5μMのgRNAおよび5μMのCas9を、試料当たり25μL容積の中で複合体化させる。25μLのCas9−gRNA複合体を含むCas9バッファーを加え、湿度室で37℃にて4時間インキュベートする。あるいは、取外し可能なゴム接着剤で密封して37℃でインキュベートする。37℃でCas9バッファー中にて5分間のインキュベーションを2回行うことにより洗浄する(フローチャンバーの4倍量で洗浄し、各洗浄間に30秒間インキュベートする)。1×PBSおよび0.5%Tween−20と2分間インキュベートする(フローチャンバーの2倍量で洗浄し、各洗浄間に30秒間インキュベートする)。場合により、必要であれば、各試料に20μLの2×SCCおよび0.5%Tween−20に1μMオリゴプローブを加えることによりプロービングし、湿度室で15分間インキュベートする。あるいは、インキュベーション前に取外し可能なゴム接着剤で密封する。1×PBSおよび0.5%tween−20中で2分間のインキュベートを2回行うことにより洗浄する(フローチャンバーの4倍量で洗浄し、各洗浄間に30秒間インキュベートする)。10μLの褪色防止用顕微鏡封入剤およびDAPIでマウントし、マニキュア液(例えば、AntiFadeまたはVectaShield)で密封する。スライドはすぐにイメージング可能であり、あるいは暗所で一週間保存することもできる。場合によっては、HClステップを省くことができる。
両面テープまたはシート(Adhesive Research社または3M社の)を用いて、目的の試料を含むカバーグラスまたはスライドと第2のカバーグラスまたはスライドとの間に挟まれた障壁を作ることにより、フローセルを作成することができる。フローセルを作成するためのシステムがIbidi社から市販されており、用いることができる(sticky−Slide VI0.4またはsticky−Slide I Luer)。ここで、細胞、染色体、またはDNAが堆積されたスライドまたはカバーグラスをフローセルの粘着性部分に付着させて、基板上にフローセルを作成する。入口領域中へと手作業でピペッティングし、出口領域中で毛細管作用により吸い取る(例えば、吸取り紙を使用する)ことにより、試薬をフローセル中へと流す。あるいは、流体を動かすための自動試薬流動交換システムおよびマルチウェイバルブ(multi-way valve)により試薬を流す。これは、シリンジポンプ、圧力駆動流、および吸引を用いて実現することができる。自動システムは、フローセルがローディングされる顕微鏡またはイメージング機器に組み込まれている。
例えばゲルプラグ法を用いて細胞から抽出されたオスのゲノムDNA(プロメガ社またはノバジェン社)またはDNAを、ビニルシラン(7−オクテニルトリクロロシラン)でコーティングされたカバーグラス上にコーミングする。これは、カバーグラス(例えば、22×22mm)を、カバーグラスの大部分をカバーする0.5M MESバッファー溶液(例えば、22×22mmのカバーグラスに対して1〜1.5ml)中にDNAを含む容器(trough)に浸漬し、DNA末端が表面コーティングに結合可能になり(通常は、1分〜10分)、その後、容器からカバーグラスを引き出すことにより行われる。容器中のDNAの濃度は、所望の密度のコーミングされたDNAが得られるように調整することができる。例えば、0.5ng/μLまでの濃度が、個々の伸展されたDNA分子を分解可能な適切な密度を与え得る。その後、カバーグラスは、一定の速度(例えば、300μm/s)でDNA溶液から引き出され、カバーグラスを引き出す際の後退メニスカス(receding meniscus)の力によりDNAを伸展させることができる。必要に応じて、その後、約10〜20ジュール/cm2の紫外線照射エネルギーを用いてカバーグラス上にDNAを架橋結合させる。必要に応じて、前述のようにカバーグラス上にフローセルを形成する。コーミングされたDNAは、コーミングプロセス中またはその後にYOYO−1などの1または複数のインターカレーション色素を用いて染色することによって可視化することができる。DNA塩基対とYOYO−1染色の比率5:1〜10:1が通常用いられる。
最初に、フローセル作成のためのコーミングされたゲノムDNAが挟まれたカバーグラスを、PBS tweenおよびPBSで洗浄することにより水和する。必要に応じて、Blockaid(ライフテクノロジーズ社)で基板をブロッキングする。必要に応じて、Cas9反応バッファーでフローセル全体を洗浄する。Cas9−gRNAを37℃で予め複合体化させ、その後、フローセルに加え、30分〜1時間インキュベートする。反応バッファーなどのバッファーおよびPBS tween20およびPBSで全体を洗浄することにより反応を停止させる。
フローセルが水和されたままであるようにし、Cas9/gRNAが形成された後、200μlのホルムアミド、20μlのsds、120μlのblockaid、40μlの20×ssc、および20μlの水のハイブリダイゼーションバッファー中の、テールに対するDNAプローブを加えることにより複合体をイメージングする。
ハイブリダイゼーションバッファー中のイメージング溶液にDNA PAINTイメージャープローブを加えて、超分解能に必要な確率論的なオンとオフのパターンを得る。テール上の配列に相補的な配列またはテールに結合するプローブ上の配列に相補的な、図6Aおよび図6Bおよび同様な実験で用いた、PAINT配列は、/5Alex647N/TAGATGTATAAAAAAATTTAATAAGGT/3AlexF647N、または/5ATTO647NN/TAGATGTATAAAAAAA/3ATTO647NN/であった。
以下のイメージャー鎖であるP9イメージャー:ACCTTATTA、を用いてDNA PAINT法を行うことにより、図6Bに示されるような超分解能イメージングを行うことができる。これは、P9ハンドル(ドッキング配列)を含むテールに結合するか、P9ハンドル、すなわちTAATAAGGT、を含むテールに既に結合しているプローブに結合する。DNA PAINTをイメージングするための好適なバッファーは、5mM Tris pH8、10mM MgCl2、1mM EDTA pH8、および0.05%Tween−20である。ニコン社のNIS Elementsソフトウェアを用いて15〜30分間動画を撮影することができ、LabVIEWで書かれたDNA PAINTのImage Analysis画像解析コードを用いて超解像度画像を構築することができる(Jungmann et al Nano Lett., 2010, 10 (11), pp 4756-4761参照。
(37℃で10分間プレインキュベートした)Cas9−gRNA複合体アセンブリーを、バッファー溶液の存在下でDNAに加え、37℃で1時間インキュベートする。必要に応じて、Cas9/gRNAが結合したDNAを精製する。その後、DNAの伸展が望まれる場合、反応液を0.5M MES溶液中に希釈し、gRNA/cas9複合体で修飾されたDNAをビニルシランカバーグラス表面上にコーミングする。図6Cでこのアプローチを用いた。
用いるガイドRNAのサイズに応じて、複数の異なる精製方法を用いて標的DNA/gRNA/Cas9複合体を単離することができ、そのような方法としては、分子ふるい、アフィニティー精製(例えば、ストレプトアビジンビーズへのデスチオビオチンまたは切断可能なリンカーの結合の利用)、または透析膜が含まれる。
Cas9−gRNAが標的DNA上の特異的位置でdsDNA鋳型に結合する。標的DNAは天然ゲノムの形態であってよく、反応はインビボで行われる。標的DNAは、細胞中にあってよく、あるいは、生物を表面に固定して、反応をin situで行う。これらの場合、ゲノムの空間的位置が保存されたままであることが好ましい。さらに、標的DNAは抽出されてもよく、反応はエクスビボで行われる。抽出された標的DNAは表面上または流体システム(例えば、ナノチャネル)中に固定化されてもよく、反応はエクスビボで行われる。
配列の線的な位置が保存されるように、(例えば、ゲルプラグ中での抽出を行うことにより)ゲノムDNAを細胞から抽出して、長い長さで維持することができる。これは、ゲノム中の配列の構成決定に重要な有用性がある。本明細書に記載のALK、BRCA、FSHM、およびHER2の例が示すように、ゲノムの構成中の構造の多様性(SV)が疾患につながり得る。しかし、白血病におけるBcr−ABLの転座などの特定のSVはGleevacなどの薬物によって標的化することができ、したがって、白血病患者がこの薬物によって標的化可能な転座を有するかどうかを決定することは重要である。
本明細書に記載の方法は、細胞または核内のゲノムの一部の空間的位置を決定し、そのような空間的位置が遺伝子制御およびゲノム機能にどのように影響するかを決定することに関する。特異的ゲノム配列の細胞中での空間的位置は、それらの配列に特異的なgRNAを用いて標的化することができる。固定された細胞中のゲノムDNA上でgRNA/Cas9仲介ニックが形成され、in situでゲノムDNAに対して蛍光に基づくシーケンシングが行われる。Lee et al, 2015:(Nat Protoc. 2015, 10(3):442-58)に記載さるように、ガラス底のディッシュ上で細胞を成長させるか、または組織切片を当該技術分野で公知の方法によりマウントする。細胞は固定される(例えば、10%ホルマリンのPBS溶液を25℃で15分または100%メタノールを−20℃で20分使用)。PBSおよびトリトンX−100を用いてならびにPBSのみを用いて洗浄を行う。必要に応じて、尿素を加えて、ニック形成されたDNAからgRNA/Cas9を除去する。必要に応じて、RNaseを用いてRNAを除去する。
SiN膜を作製し、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて直径20nmのナノポアをドリルする(Janssen, X. J. A.; Jonsson, M. P.; Plesa, C.; Soni, G. V.; Dekker C.; Dekker, N. H. Nanot variant echnology 2012, 23 (47), 475302)。その後、膜をポリジメチルシロキサン(PDMS)の層でペイントして、静電容量を低減し、シグナル・ノイズ比を改善する。膜によって隔てられた上部および底部のリザーバーを含むフローセル中に膜をマウントし、その後、2つのリザーバーに1M KCl、10mM Tris、1mM EDTA、pH8を満たす。核酸重合体は上部リザーバーに加えられ、電圧が上部リザーバー(−ve)と底部リザーバー(+ve)の間に印加され、ポアを通る実質的に線状の電気泳動的に駆動される核酸重合体の輸送が可能になる。電流は、Axopatch 200B増幅器およびDigidata 1322A DAQデジタイザーを備えたイオンチャネル記録システムを用いて記録される。記録は、Transalyzer Matlabパッケージを用いて分析される(Plesa, C.; Dekker, C. Nanotechnology 2015, 26 (8), 084003参照)。データは、核酸重合体がナノポアに入る際の電流遮断の増大、さらにその後の、gRNA/Cas9結合領域がポアの狭いくびれを通過する際の遮断の断続的増大について分析される。
Her2/Erbb2診断のためのCas9−gRNA複合体の作成
Her2(Human Genome Organization Gene Nomenclature CommitteeによるErbb2としても知られる)遺伝子配列が、種々のオンラインリポジトリ、例えばNCBIワールドワイドウェブサイトncbi.nlm.nih.gov/gene/2064で入手可能である。
1または複数のコードまたはバーコードハンドル(プローブのドッキング部位)がgRNAに付加され得る。原理は、DNA試料に会合したCas9−gRNA複合体のアイデンティティーを決定することである。これは、gRNAハンドルに特異的な検出可能な「デコーダー」プローブをハイブリダイズさせることによりなされる。gRNAハンドルは、1または複数のバーコードを含み得、バーコードは種々の方法で配置され得、例えば連続的にまたは互いに部分的に重複してスタッキングされる。後者により、マルチプレックスバーコードの全体的な長さの短縮が可能になり、所与のgRNAハンドル長での多重化能力(multiplexing capability)を向上させる。
全ての浸潤性乳癌にin situハイブリダイゼーション技術を用いたHer2状態の決定が推奨される。現在認められている臨床診断法の最近の総説に、種々の臨床アッセイの現在の課題がハイライトされている(参照文献:Franchet C, Filleron T, Cayre A, Mounie E, Penault-Llorca F, Jacquemier J, Macgrogan G, Arnould L, Lacroix-Triki M. Instant-quality fluorescence in-situ hybridization as a new tool for HER2 testing in breast cancer: a comparative study. Histopathology. 2014 Jan;64(2):274-83)。
図1は、マウス胚性線維芽細胞の核のメジャーサテライト領域およびマイナーサテライト領域ならびにテロメア領域のin situ Cas9−gRNAプロービングに関する。蛍光標識UTPを用いて、マウスメジャーサテライト反復(Cy5)、マイナーサテライト反復(Alexa−488)、およびテロメア(Cy3)を標的化するための3種のgRNAを合成した(図1の説明:(A)メジャーサテライト、(B)マイナーサテライト、(C)テロメア、(D)ゲノムDNAのDAPI染色、および(E)重ね合わせ写真)。本明細書に記載のプロトコールに従って、gRNAをCas9と複合体化させた後、PFA固定試料に加えた。パターンは、これらの標的で予想されるプロービング(Guenatri M, Bailly D, Maison C, Almouzni G. Mouse centric and pericentric satellite repeats form distinct functional heterochromatin. J Cell Biol. 2004 Aug 16;166(4):493-505参照)と一致する。63倍/1.40油浸対物レンズならびに各蛍光チャネルに適したLED光源およびフィルターを備えたツァイス社のAxio Observer Z1で写真を撮影した。図1に関連する説明:A、メジャーサテライト;B、マイナーサテライト;C、テロメア;DNAのDAPI染色;E、重ね合わせ。
図2は、図1の対照実験に関する。図1と同様のCas9プロービングプロトコールを用いて、マウスメジャーサテライト反復(Cy5)、マイナーサテライト反復(Alexa−488)、およびテロメア(Cy3)を標的化する一般的に使用されるFISHオリゴヌクレオチドを用いた。DNAのDAPI染色(D)を除いて、他の蛍光シグナルは、図1で取り込まれた写真より拡散しており、顕微鏡上でコンストラクトを強くする必要があった。(図2の説明:(A)メジャーサテライト、(B)マイナーサテライト、(C)テロメア、(D)ゲノムDNAのDAPI染色、および(E)重ね合わせ写真)。変性がないことで、これらのFISHオリゴは、その標的へのハイブリダイズが妨げられ、さらに核の外側で凝集した。63倍/1.40油浸対物レンズならびに各蛍光チャネルに適したLED光源およびフィルターを備えたツァイス社のAxio Observer Z1で写真を撮った。図1に関連する説明:A、メジャーサテライト;B、マイナーサテライト;C、テロメア;DNAのDAPI染色;E、重ね合わせ。
図3は、天然Cas9の結合活性および切断が独立しており、マグネシウムイオンの有無に依存することを示す、Cas9−gRNAゲルシフトおよび切断アッセイに関する。以下のように調製した反応液:2pmolのヌクレアーゼ活性Cas9(NEB社)、2pmolの合成Grna(位置L22116のラムダDNAを標的化)、および0.2pmolの2kb PCR増幅DNA断片(ラムダDNA L21333−L23332由来)を混合し、5Mm MgCl2の存在下(レーン1)またはマグネシウム非存在下(レーン2)で、37℃で1時間インキュベートした。レーン1は、マグネシウム存在下での二次切断産物を示しており、レーン2は、切断産物が存在しないが、複合体がまだ結合していることにより生じる小さな上側へのシフトを示している。レーン3およびレーン4は、Cas9タンパク質を反応液から省いたこと以外は、それぞれレーン1および2と同様の条件下で行われた。レーン3および4では切断およびシフトは観察されなかった。
図4A〜図4Lは、gRNAテールバーコードおよびプロービングの例に関する。図4Aは、Cas9タンパク質(1)、および突出テトラループ(tetraloop)(3)とバーコードを有する突出gRNAテール(4)とを有する複合体化したgRNA(2)を示している。バーコードは、検出可能な部分または標識(6)を有する、ハイブリダイゼーションプローブ(5)により検出される。図4Bは、gRNAテールが2個以上のバーコードによってコードされ得ることを示す図である。図4Bには2個のバーコードが描かれており(4および7)、これらは、検出可能な部分または標識(6)を有するそれらの各ハイブリダイゼーションプローブ(5および8)によって検出することができる。図4C中、ハイブリダイゼーションプローブは、シグナルを増幅するために、複数の検出可能な部分または標識(9)を有し得る。図4D中、検出可能な部分は、直接検出可能でなくてもよく(10)、検出可能な部分への特異的親和性を有する、二次的な検出可能な薬剤(11)の使用が必要であってもよい。この二次的薬剤は、検出されているシグナルを検出または増幅するための、検出可能な部分または標識(12)を有する。図4E〜図4Iは、ローリングサークル増幅を介してgRNAテールをプロービングする方法を示す図である。図4Eは、Cas9タンパク質(1)、および突出テトラループ(3)とバーコード(4)を有するgRNAテールとを有する複合体化したgRNA(2)を示している。バーコードの検出は、バーコードに対する親和性をプローブの1つの領域に有し、標識プローブがハイブリダイズする標的部位(14)を別の領域に有する、環状ハイブリダイゼーションプローブ(13)によりなされる。図4Fは、環状プローブ(13)が、gRNAテール(16)を伸長させるためのローリングサークル増幅ポリメラーゼ(15)の鋳型としての機能を果たし得ることを示している。図4Gは、ローリングサークル増幅により、多様な密接して局在する標識プローブハイブリダイズ標的部位(18)を有する、局在する増幅されたハイブリダイゼーションプローブ(17)が形成されることを示している。図4Hは、検出可能なプローブ(19)を添加することによりシグナル増幅gRNAテールプローブ(20)を生じさせることによって、標識プローブハイブリダイズ標的部位を検出可能にできることを示す図である。図4Iは、図4Hと同様のローリングサークル増幅されたプローブ(20)を示す図であり、gRNAバーコードに環状プローブがハイブリダイズせずに生成および標識(21)されることにより、gRNA自体の上でのローリングサークル増幅および標識ステップが避けられる。このgRNAから離れて生成されるプローブは、図4Aに示されているようなgRNAテールのバーコード領域(4)に領域(5)を介してハイブリダイズすることができる。図4J〜図4Lは、核酸自己アセンブリーを介してgRNAテールをプロービングする方法を示す図である。図4Jは、核酸プローブのお互いへの連続的な線状アセンブリーを示す図である。バーコードハイブリダイズ領域(5)、アセンブリー領域(21)、および標識(6)で構成される第1の断片が最初にgRNAテールバーコード(図4A、4)にハイブリダイズする。21または22または23に部分的に相補的な標識アセンブリー断片(22および23)の混合物が加えられ、反応液中に部分的に相補的な断片が存在する限り、これらは自己アセンブルする。ここでは構造の一部だけが描かれている。これは、以前に記載されているハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)と同様である。Dirks RM, Pierce NA. Triggered amplification by hybridization chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Oct 26;101(43):15275-8参照。図4Kは、多分岐核酸プローブデンドリマー構造自己アセンブリーを示す図である。バーコードハイブリダイズ領域(5)、アセンブリー領域(24)、および標識(6)で構成される第1の断片が最初にgRNAテールバーコード(図4A、4)にハイブリダイズする。24または25または26に部分的に相補的である標識されたアセンブリー断片(24、25、および26)の混合物が加えられ、反応液中に部分的に相補的な断片が存在する限り、これらは多分岐構造へと自己アセンブルする。ここでは構造の一部だけが描かれている。この種の核酸デンドリマーは以前に報告されている。Li Y, Tseng YD, Kwon SY, D'Espaux L, Bunch JS, McEuen PL, Luo D. Controlled assembly of dendrimer-like DNA. Nat Mater. 2004 Jan;3(1):38-42参照。図4Lは、シグナルを直線的に増幅するための核酸プローブの分岐部のアセンブリーを示す図である。バーコードハイブリダイズ領域(5)、アセンブリー領域(27)で構成される第1の断片が最初にgRNAテールバーコード(図4A、4)にハイブリダイズする。27または29または30に部分的に相補的な標識されたアセンブリー断片(29および30)の混合物が加えられ、これらは自己アセンブルすることができる。検出可能なプローブ(28)が、反応液中に部分的に相補的な断片が存在する限り、アセンブリー断片(27)および(30)の一部にハイブリダイズすることができる。ここでは構造の一部だけが描かれている。これは以前に報告されている分岐DNA(bDNA)と同様である。Collins ML, Irvine B, Tyner D, Fine E, Zayati C, Chang C, Horn T, Ahle D, Detmer J, Shen LP, Kolberg J, Bushnell S, Urdea MS, Ho DD. A branched DNA signal amplification assay for quantification of nucleic acid targets below 100 molecules/ml. Nucleic Acids Res. 1997 Aug 1;25(15):2979-84参照。
図5Aは、ラテラルフロー検査システムの表面に結合しているCas9−gRNA複合体に関する。調べられるDNAの集団がシステム上にローディングされ、ラテラルフローによりこれが検査ゾーンに移動され、そこで標的特異的Cas9−gRNAが特異的DNAに結合する。残りのDNAはアッセイの末端まで流れ続け、対照ゾーンで捕捉されるが、標的DNAは検査ゾーンでCas9−gRNA複合体に結合したままである。DNA検出は、核酸染色によって、またはDNAへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションによって、またはDNAへの検出可能なプローブの共有結合によって、または検出可能な部分を有する特異的オリゴヌクレオチドプライマーもしくはユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー存在下でのDNAの酵素増幅(例えば、等温増幅)によって行うことができる。ラテラルフローアッセイでしばしば使用される検出可能な部分としては、金ナノ粒子または銀ナノ粒子が含まれる。その他の部分、例えばビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、フルオレセインが、二次的な検出剤と組み合わせて一般的に使用される(例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、またはフルオレセインに特異的な、金または銀でコーティングされた抗体)。図5Bは、疎水性または電荷など、DNAまたはタンパク質を保持するための異なる特性を有する2つの材料を用いたラテラルフローシステムに関する。例えば、ニトロセルロース膜は、DNAよりもタンパク質を選択的に保持し、一方、ナイロン膜はタンパク質よりDNAに結合する。検査対象のDNA集団をローディングすると、Cas9−gRNA複合体が標的DNAに結合する。DNAに結合したCas9は、検査ゾーンでDNA保持膜によって保持されるが、非結合Cas9は通過して、対照ゾーンでタンパク質保持膜に結合する。DNAと共にCas9−gRNA複合体を検出するための検出を行う。gRNAは本明細書に記載の方法によりプロービングされる。あるいは、Cas9タンパク質自体が部分(例えば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、フルオレセイン)を有していてもよい。図5Cは、調べられるDNAの集団が最初に分子相互作用(例えば、電荷、疎水性、共有結合性相互作用、または親和性相互作用、例えばビオチン−ストレプトアビジン)により検査ゾーンの表面で捕捉される、ラテラルフローシステムに関する。その後、Cas9−gRNAを、検査ゾーンで表面に捕捉された標的DNAに結合させる。残りの未反応Cas9−gRNAは通過して、対照ゾーンで捕捉される。DNAと共にCas9−gRNA複合体を検出するための検出を行う。gRNAは本明細書に記載の方法でプロービングされる。あるいは、Cas9タンパク質自体が部分(例えば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、フルオレセイン)を有していてもよい。
ガイドRNA/Cas9複合体を用いた標的DNAのプロービング
ガイドRNAをインビトロで設計、調製、発現、および精製した。一本鎖DNA(ssDNA)オリゴヌクレオチドを合成する(IDT社またはCustomArray社のチップ)。これらのオリゴはインビトロRNA合成のためのT7転写開始部位、およびプロービングに用いられる3′末端テールを形成するための伸長部を含む。T7 RNA合成を行い、RNAを精製する。
ガイドRNA/Cas9複合体を用いた標的DNAのプロービング
Michalet et al (Dynamic Molecular Combing, Science 1999)に従い、ヒトゲノムDNA(ノバジェン社)を0.5M MESバッファーpH5.5で約0.2ng/μlに希釈し、ビニルシランコーティングされた基板(ゲノミックビジョン社、パリ)上での分子コーミングを行った。簡潔に述べると、これは、ラングミュア−ブロジェット(Langmuir-Blodgett)のセットアップと同様に、ビニルシランコーティングされたカバーグラスをDNA含有溶液中に浸し、その後、固定された速度でこれを引き上げることを含む。これは、「後退メニスカス」の機構により基板上にDNAを伸展させる働きをした。DNAが溶液から完全に引き上げられた際、これを10,000マイクロジュール/平方センチメートルでUV架橋結合した。これにより、表面上で一方向的に整列された大量のDNAが得られた。注意深くDNA調製した場合、YOYO−1などのDNA染色を用いてメガベースの長さのDNAを可視化することができる。
図7は、BRCA1遺伝子座に適用された位置決め赤−緑−青(RGB)バーコード化システムに関する。BRCA1遺伝子およびBRCA2遺伝子内の大きな再編成は、男女両方において乳癌および卵巣癌感受性の重要なマーカーである。再編成は、癌の発症リスクおよび適切な処置についての情報をもたらし得る。[Judkins T, Rosenthal E, Arnell C, Burbidge LA, Geary W, Barrus T, Schoenberger J, Trost J, Wenstrup RJ, Roa BB. Clinical significance of large rearrangements in BRCA1 and BRCA2. Cancer. 2012 Nov 1;118(21):5210-6.; Liede A, Karlan BY, Narod SA. Cancer risks for male carriers of germline mutations in BRCA1 or BRCA2: a review of the literature. J Clin Oncol. 2004 Feb 15;22(4):735-42]。これらの大きな再編成の範囲は非常に広く、これらの再編成の特徴解析には通常、PCR増幅DNAのサンガーシーケンシングが用いられる。本発明者らのgRNA/Cas9プロービング戦略は、遺伝子座に沿った特異的色パターン(表3、位置決めコード)を用いて、BRCA遺伝子座の全長を高密度(100bp当たり約1個のプロービング部位)で標識する。その遺伝子座内の再編成された任意の領域について、色パターンが変化し、これらの大きな再編成を同定することができる。本発明者らのアプローチは、シーケンシングに代わる簡便な選択肢を提供する。本発明者らのアプローチはさらに、急性骨髄性白血病などのその他の癌、Bushy症候群(Bushy syndrome)などの発達障害、および自閉症などの神経発達疾患におけるその他の同様な再編成を検出するために用いられる。本アプローチを適用できる別のカテゴリーの再編成としては、免疫細胞受容体のVDJ組換えが挙げられる。
図8は、gRNA/cas9複合体に標的化される特異的位置に適用されたDNA折り紙バーコードに関する。各バーコードは、gRNAが標的化する位置に固有である。BRCA1遺伝子およびBRCA2遺伝子は、サンガーシーケンシングでのみ検出可能な、より小さな挿入および欠失を含む様々な大きさのゲノム再編成を受け易い。本発明者らのgRNA/Cas9プロービング戦略は、各gRNA/Cas9標的部位に固有のバーコードを用いて、高密度(100bp当たり約1個のプロービング部位)で各BRCA遺伝子座の全長を標識する。このバーコードは、以前に報告されているように蛍光折り紙バーコードの形態をとる[Lin C, Jungmann R, Leifer AM, Li C, Levner D, Church GM, Shih WM, Yin P. Submicrometre geometrically encoded fluorescent barcodes self-assembled from DNA. Nat Chem. 2012 Oct;4(10):832-9]。各バーコードを解読することにより(表3、折り紙コード)、各gRNA/Cas9および遺伝子座上のその位置が同定され、これは、遺伝子座内の再編成された領域、欠失、および挿入に関する情報を提供する。このレベルの分解能は、適切な癌の処置を決定する際に医師が考慮に入れることができる。本発明者らのアプローチは、シーケンシングに代わる選択肢を提供する。本発明者らのアプローチは、その他の癌、発達障害、および神経発達疾患における他の同様な再編成の検出にも用いられる。本アプローチを適用できる別のカテゴリーの再編成としては、免疫細胞受容体のVDJ組換えが挙げられる。
図9A〜図9Bは、gRNA/Cas9ニックからのポリメラーゼ伸長に関する。図9Aは、gRNAおよびCas9のD10A変異体によって切断される標的DNAのトップ鎖(top strand)を示している。図9Bは、gRNAおよびCas9のH840A変異体によって切断される標的DNAのボトム鎖(bottom strand)を示している。曲がった矢印は、ニックからのプライマー伸長の方向を示している。プライマー伸長を用いて、標的領域を標識するか、または標的領域のシーケンシングを開始することができる。本発明者らのgRNA/Cas9ニックおよびシーケンシングアプローチは、ゲノム上でシーケンシング開始部位を正確に標的化して配置することができる。簡潔に述べると、gRNA/Cas9ニッカーゼは、目的の標的位置でDNA鎖にニックを形成する。その後、gRNA/Cas9が、界面活性剤、変性剤、または温度などの複数の方法のいずれかにより外される。その後、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼおよび標識されたdNTPを加えることにより、ニック部位からDNAを伸長させる。このgRNA/Cas9ニック開始法は多数の目的のゲノム領域に適用することができる。反復領域、例えばセントロメアDNAは、多数の短い反復のため、本質的にシーケンシングおよびアラインメントが難しい。ゲノム再編成は、しばしば、より小さな変異を含む。さらに、多くのゲノム再編成は特徴解析が不十分であり、再編成または融合の位置は未知である。
図10はPAM部位を見つけるためにCHOPCHOPを用いた場合に得られる出力のダイアグラムである。CHOCHOPは、所与の遺伝子座上のgRNA/Cas9標的およびオフターゲットを見つけてスコア化するための多くのオンラインツールで使用されるアルゴリズムの1つである[Tessa G. Montague; Jose M. Cruz; James A. Gagnon; George M. Church; Eivind Valen. (2014). CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42. W401-W407]。このダイアグラムはHer2エキソン上の標的サーチの図示的出力を表している。小さい三角形は、Her2エキソン上のgRNA/Cas9標的部位を表す。標的配列のリストを抽出し、オフターゲットがないまたは少ない標的のみを維持するように整理した後、gRNAを設計するために用いることができる。このツールは他の遺伝子座のgRNA/Cas9標的を見つけるために用いられる。イントロンおよびエキソンの両方または遺伝子座の外側の標的を見つけるために他のツールを用いることができる。
図11は、high−fidelityポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いたガイドRNAのインビトロ転写のためのDNA鋳型のアセンブリーに関する。この戦略は、2個のユニバーサルオリゴヌクレオチドである、インビトロ転写のためのT7 RNAポリメラーゼ認識モチーフの部分をさらに含むフォワードPCRプライマーである、Fwd−T7−gRNA;およびgRNAスキャフォールドであるgRNA.split60に基づく。さらに2種類の特異的オリゴヌクレオチドである、目的の標的に特異的な配列であるSp.gRNA.split60;およびマルチプレックス鎖検出のためのバーコードハンドルをさらに含むリバースPCRプライマーであるRev−B1−gRNA.18もある。示唆される融解温度(Tm)も記載されている。この設計は、費用対効果が高く、増幅エラーを最小限に抑え、小スケールまたは大スケールのオリゴヌクレオチドに適している。DNA鋳型は、一度増幅すれば、PCRで再増幅して鋳型を作製および永続化することができ、これは新規合成より費用対効果が高い。PCRアセンブリーに要する時間は1時間未満である。PCR後、鋳型DNAにT7 RNAポリメラーゼミックスを加えることによりインビトロ転写(IVT)によりgRNAを合成する。
図12はALK転座のCas9−gRNA標的化の模式図である。この図は、2つの融合領域が知られている場合に、特異的バーコードを有するgRNA/Cas9を用いることにより融合の発生率を検出できることを示している。ALK遺伝子座は、染色体内および染色体間の両方の再編成および逆位を受け易い。臨床的な結果が有害である7種のそのような再編成が知られている[Solomon B, Varella-Garcia M, Camidge DR. ALK gene rearrangements: a new therapeutic target in a molecularly defined subset of non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol. 2009 Dec;4(12):1450-4]。本発明者らのgRNA/Cas9プロービング戦略は、各遺伝子座に関連する色を用いて、特異的座領域を高密度(100bp当たり約1個のプロービング部位)で標識する。この戦略は、遺伝子融合および逆位の検出に有用である。2つの標識された遺伝子座が隣接する場合、それらのそれぞれの標識が共局在シグナルとして検出される。再編成の場合、2つのシグナルはもはや共局在せず、かなり離れている。逆位の場合、シグナルは共局在しないが、まだ同じ近傍にある。信頼性を高めるためには、(ALK染色体再編成による)遺伝子融合の場合、またはALK逆位の場合に、異なる共局在の組合せを提供する第3の遺伝子座を標識する。そのようなALK欠損の検出は、未分化大細胞リンパ腫(ALK−NPM1融合)、肺腺癌(ALK−EML4の融合および逆位)、および特定の小児神経芽細胞腫などの複数の癌の同定に重要である。特定のALK再編成に対しては治療法が存在する。複数のその他の疾患が遺伝子融合により特徴付けられており、本発明者らのアプローチに適している。遺伝子融合標的のいくつかの例としては、ABL1−BCR、AML1−RUNX1T1、AML1−ETV6、BCL−2−IGH、BCL−2−MLT、C−Myc−IGH、COL1A1−PDGFB、CycD1−IGH、ETV6−TRKC、ETV6−JAK、FLI1−EWS、PAX8−PPARG、PML−NR1B1、TCR−RBTN2、SS18−SSXが挙げられる
本発明の態様は以下を含む。
付記1
標的核酸配列をシーケンシングする方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることを含み、
前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸の鎖にニックを形成するCas9ニッカーゼであり、前記ニックからプライマー伸長が開始されて相補鎖を鋳型として成長鎖が形成されることにより、前記標的核酸がシーケンシングされる
前記方法。
付記2
前記シーケンシングが、前記成長鎖への個々のヌクレオチドの付加を検出することを含む、付記1に記載の方法。
付記3
前記ヌクレオチドが、蛍光標識されている、付記2に記載の方法。
付記4
前記ヌクレオチドA、C、G、Tが、それぞれ異なる標識をされており、各塩基付加サイクル中に溶液で供給される、付記2に記載の方法。
付記5
前記ヌクレオチドが可逆的ターミネーターであり、合成による逐次シーケンシングが行われる、付記2に記載の方法。
付記6
前記ヌクレオチドが末端リン酸で標識されており、リアルタイムシーケンシングが行われる、付記2に記載の方法。
付記7
前記標的核酸配列が、線状のひも(linear string)として分析される、付記1に記載の方法。
付記8
前記標的核酸配列が、実質的に伸展された線状のひもとして分析される、付記1に記載の方法。
付記9
前記ニックからのシーケンシングの開始が、標的核酸線状ひも上の複数の部位から開始される、付記1に記載の方法。
付記10
各核酸上の複数の部位および複数の標的核酸上の複数の部位が並行して分析される、付記1に記載の方法。
付記11
ゲノムの1または複数の領域がシーケンシングされる、付記1に記載の方法。
付記12
前記gRNA/Cas9複合体が、ニック形成後に除去される、付記1に記載の方法。
付記13
前記核酸が、細胞中でin situで分析される、付記1に記載の方法。
付記14
前記核酸が細胞中でin situで分析され、前記細胞が分析前に固定される、付記1に記載の方法。
付記15
分析前にRNA分子が除去される、付記1に記載の方法。
付記16
標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることであって、
ここで、前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記ガイドRNAは、3′テール核酸配列を含む、前記接触させること;
検出可能なプローブ配列を前記3′テール配列にハイブリダイズさせること;および
前記検出可能なプローブ配列を検出することにより前記標的核酸配列を検出すること
を含む前記方法。
付記17
前記3′テール配列が、プライマーとして働くことができる、付記16に記載の方法。
付記18
前記3′テール配列が、前記gRNAの結合位置のすぐ近くの配列に相補的な配列を含む、付記16に記載の方法。
付記19
前記3′テール配列が、DNA PAINTのためのドッキング部位またはハンドルを含む、付記16に記載の方法。
付記20
標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることを含み、
前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記標的核酸は線状のひもとして分析される
前記方法。
付記21
前記線状のひもが、表面上、フローストリーム(flow stream)中、またはマイクロチャネルもしくはナノチャネル中で伸展される、付記20に記載の方法。
付記22
前記線状のひもが、一方の末端が表面に付着し、且つ第2の末端が光または磁気ピンセット、物理化学的結合、フローストリーム中でのぶら下がり(dangling)を含む牽引力に付着することにより伸展される、付記20に記載の方法。
付記23
前記核酸に沿った1または複数の複合体の結合位置が検出される、付記20に記載の方法。
付記24
複数の複合体の結合位置により、単一分子マップの構築が可能になる、付記20に記載の方法。
付記25
前記gRNAが、反復DNAを標的とし、1または複数の反復単位の位置が検出される、付記20に記載の方法。
付記26
前記gRNAが、DNA上の単一コピー配列を標的とする、付記20に記載の方法。
付記27
複数のgRNAが、単一ゲノム遺伝子座を標的とする、付記20に記載の方法。
付記28(空欄)
付記29
複数の単一コピー遺伝子座が、各々の遺伝子座に特異的なgRNAによって標的化される、付記20に記載の方法。
付記30
ある遺伝子座への結合が、別の遺伝子座への結合と区別可能である、付記20に記載の方法。
付記31
複数のgRNAが、各々の遺伝子座に結合する、付記20に記載の方法。
付記32
前記線状のひもが、クロマチン繊維である、付記20に記載の方法。
付記33
前記線状のひもが、染色体内で折り畳まれている、付記20に記載の方法。
付記34
前記線状のひもが、染色体内で折り畳まれており、前記染色体が、中期または有糸分裂期の染色体である、付記20に記載の方法。
付記35
標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることを含み、
前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記標的核酸は、ナノポアまたはナノギャップを、特性を変化させるように横切るか、または通過し、
前記変化した特性を検出することにより前記複合体の結合を検出することによって前記標的核酸配列を検出する
前記方法。
付記36
前記核酸に沿った1または複数の複合体の結合位置が、イオン電流、電子トンネル、または光学的検出を含む方法によって検出される、付記35に記載の方法。
付記37
前記ガイド中の認識配列が比較的短く、前記ガイドの残りの部分が、縮重塩基またはユニバーサル塩基を含み、前記標的核酸に沿った多数の結合部位を可能にしている、付記35に記載の方法。
付記38
複数の複合体の結合位置により、単一分子マップの構築が可能になる、付記35に記載の方法。
付記39
標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることを含み、
前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記複合体を検出することにより前記標的核酸配列を検出する
前記方法。
付記40
前記ガイドRNAが検出可能な標識を含む、付記39に記載の方法。
付記41
前記Cas9タンパク質が検出可能な標識を含む、付記39に記載の方法。
付記42
前記複合体が検出可能な標識を含む、付記39に記載の方法。
付記43
前記複合体がナノポアによって検出される、付記39に記載の方法。
付記44
前記複合体が電子顕微鏡によって検出される、付記39に記載の方法。
付記45
前記複合体が走査型プローブ顕微鏡によって検出される、付記39に記載の方法。
付記46
前記複合体がカンチレバーによって検出される、付記39に記載の方法。
付記47
前記複合体が水晶発振子マイクロバランスによって検出される、付記39に記載の方法。
付記48
前記複合体が電界効果トランジスターによって検出される、付記39に記載の方法。
付記49
前記ガイドRNAが、プローブ配列に相補的な3′テール配列を含む、付記39に記載の方法。
付記50
前記ガイドRNAが、検出可能な標識を含むプローブ配列に相補的な3′テール配列を含み、前記プローブ配列が前記3′テール配列に結合される、付記39に記載の方法。
付記51
前記ガイドRNAが、複数の検出可能な標識を含むプローブ配列に相補的な3′テール配列を含み、前記プローブ配列が前記3′テール配列に結合される、付記39に記載の方法。
付記52
前記ガイドRNAが、検出可能な標識を含むプローブ配列に相補的な3′テール配列を含み、前記プローブ配列が前記3′テール配列に結合され、前記プローブ配列が増幅される、付記39に記載の方法。
付記53
前記ガイドRNAが、プローブまたは検出可能な標識に対する結合対として3′テール配列を含む、付記39に記載の方法。
付記54
前記標的核酸が二本鎖ゲノムDNAである、付記39に記載の方法。
付記55
前記標的核酸が染色体DNAである、付記39に記載の方法。
付記56
前記標的核酸が、基板上で伸長される、付記39に記載の方法。
付記57
前記標的核酸が、平面状の表面上で伸長される、付記39に記載の方法。
付記58
前記標的核酸が、ポア内で伸長される、付記39に記載の方法。
付記59
前記標的核酸が、チャネル内で伸長される、付記39に記載の方法。
付記60
前記Cas9タンパク質が、野生型Cas9、cas9ニッカーゼ、またはヌクレアーゼ欠損Cas9である、付記39に記載の方法。
付記61
検出可能な標識が、前記Cas9タンパク質に直接または間接的に結合されている、付記39に記載の方法。
付記62
検出可能な標識が、前記ガイドRNAに直接または間接的に結合されている、付記39に記載の方法。
付記63
検出可能な標識を、前記複合体に直接または間接的に結合させる、付記39に記載の方法。
付記64
前記Cas9タンパク質が、前記標的核酸の鎖にニックを形成するCas9ニッカーゼであり、前記ニックから相補鎖を鋳型としてプライマー伸長が開始されることにより前記標的核酸がシーケンシングされる、付記39に記載の方法。
付記65
前記Cas9タンパク質が、前記標的核酸の鎖にニックを形成するCas9ニッカーゼであり、前記ニックから前記相補鎖を鋳型としてプライマー伸長が開始されて検出可能な標識が取り込まれることにより前記標的核酸が検出される、付記39に記載の方法。
付記66
前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質が組み合わせられた後に、前記標的核酸と接触させられる、付記39に記載の方法。
付記67
前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質が組み合わせられた後に、試料内の前記標的核酸と接触させられる、付記39に記載の方法。
付記68
前記ガイドRNAが、シード領域配列を含む、付記39に記載の方法。
付記69
ガイドRNAが、前記ガイドRNAの非シード領域に、縮重位置もしくは縮重配列またはユニバーサル塩基を含む、付記39に記載の方法。
付記70
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を各々有する複数のガイドRNA配列と接触させることを含む、付記39に記載の方法。
付記71
前記標的核酸が溶液試料内にある、付記39に記載の方法。
付記72
前記標的核酸が基板上に存在する、付記39に記載の方法。
付記73
前記標的核酸が基板に結合している、付記39に記載の方法。
付記74
前記標的核酸が細胞内にある、付記39に記載の方法。
付記75
標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有し且つ3′プライマー伸長部を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることであって、
ここで、前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成する、前記接触させること;
前記プライマーを鋳型に沿って伸長させて1または複数の検出可能な標識を伸長産物に取り込ませること;および
前記1または複数の検出可能な標識を検出することにより前記標的核酸配列を検出すること
を含む前記方法。
付記76
標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有し且つ3′プライマー伸長部を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることであって、
ここで、前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成する、前記接触させること;
前記プライマーをローリングサークル増幅鋳型に沿って伸長させて、複数の検出可能な標識をローリングサークルコンカテマー中に取り込ませること;および
前記複数の検出可能な標識を検出することにより前記標的核酸配列を検出すること
を含む前記方法。
Claims (76)
- 標的核酸配列をシーケンシングする方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることを含み、
前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸の鎖にニックを形成するCas9ニッカーゼであり、前記ニックからプライマー伸長が開始されて相補鎖を鋳型として成長鎖が形成されることにより、前記標的核酸がシーケンシングされる
前記方法。 - 前記シーケンシングが、前記成長鎖への個々のヌクレオチドの付加を検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、蛍光標識されている、請求項2に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドA、C、G、Tが、それぞれ異なる標識をされており、各塩基付加サイクル中に溶液で供給される、請求項2に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが可逆的ターミネーターであり、合成による逐次シーケンシングが行われる、請求項2に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが末端リン酸で標識されており、リアルタイムシーケンシングが行われる、請求項2に記載の方法。
- 前記標的核酸配列が、線状のひも(linear string)として分析される、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸配列が、実質的に伸展された線状のひもとして分析される、請求項1に記載の方法。
- 前記ニックからのシーケンシングの開始が、標的核酸線状ひも上の複数の部位から開始される、請求項1に記載の方法。
- 各核酸上の複数の部位および複数の標的核酸上の複数の部位が並行して分析される、請求項1に記載の方法。
- ゲノムの1または複数の領域がシーケンシングされる、請求項1に記載の方法。
- 前記gRNA/Cas9複合体が、ニック形成後に除去される、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸が、細胞中でin situで分析される、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸が細胞中でin situで分析され、前記細胞が分析前に固定される、請求項1に記載の方法。
- 分析前にRNA分子が除去される、請求項1に記載の方法。
- 標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることであって、
ここで、前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記ガイドRNAは、3′テール核酸配列を含む、前記接触させること;
検出可能なプローブ配列を前記3′テール配列にハイブリダイズさせること;および
前記検出可能なプローブ配列を検出することにより前記標的核酸配列を検出すること
を含む前記方法。 - 前記3′テール配列が、プライマーとして働くことができる、請求項16に記載の方法。
- 前記3′テール配列が、前記gRNAの結合位置のすぐ近くの配列に相補的な配列を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記3′テール配列が、DNA PAINTのためのドッキング部位またはハンドルを含む、請求項16に記載の方法。
- 標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることを含み、
前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記標的核酸は線状のひもとして分析される
前記方法。 - 前記線状のひもが、表面上、フローストリーム(flow stream)中、またはマイクロチャネルもしくはナノチャネル中で伸展される、請求項20に記載の方法。
- 前記線状のひもが、一方の末端が表面に付着し、且つ第2の末端が光または磁気ピンセット、物理化学的結合、フローストリーム中でのぶら下がり(dangling)を含む牽引力に付着することにより伸展される、請求項20に記載の方法。
- 前記核酸に沿った1または複数の複合体の結合位置が検出される、請求項20に記載の方法。
- 複数の複合体の結合位置により、単一分子マップの構築が可能になる、請求項20に記載の方法。
- 前記gRNAが、反復DNAを標的とし、1または複数の反復単位の位置が検出される、請求項20に記載の方法。
- 前記gRNAが、DNA上の単一コピー配列を標的とする、請求項20に記載の方法。
- 複数のgRNAが、単一ゲノム遺伝子座を標的とする、請求項20に記載の方法。
- (空欄)
- 複数の単一コピー遺伝子座が、各々の遺伝子座に特異的なgRNAによって標的化される、請求項20に記載の方法。
- ある遺伝子座への結合が、別の遺伝子座への結合と区別可能である、請求項20に記載の方法。
- 複数のgRNAが、各々の遺伝子座に結合する、請求項20に記載の方法。
- 前記線状のひもが、クロマチン繊維である、請求項20に記載の方法。
- 前記線状のひもが、染色体内で折り畳まれている、請求項20に記載の方法。
- 前記線状のひもが、染色体内で折り畳まれており、前記染色体が、中期または有糸分裂期の染色体である、請求項20に記載の方法。
- 標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることを含み、
前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記標的核酸は、ナノポアまたはナノギャップを、特性を変化させるように横切るか、または通過し、
前記変化した特性を検出することにより前記複合体の結合を検出することによって前記標的核酸配列を検出する
前記方法。 - 前記核酸に沿った1または複数の複合体の結合位置が、イオン電流、電子トンネル、または光学的検出を含む方法によって検出される、請求項35に記載の方法。
- 前記ガイド中の認識配列が比較的短く、前記ガイドの残りの部分が、縮重塩基またはユニバーサル塩基を含み、前記標的核酸に沿った多数の結合部位を可能にしている、請求項35に記載の方法。
- 複数の複合体の結合位置により、単一分子マップの構築が可能になる、請求項35に記載の方法。
- 標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることを含み、
前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記複合体を検出することにより前記標的核酸配列を検出する
前記方法。 - 前記ガイドRNAが検出可能な標識を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記Cas9タンパク質が検出可能な標識を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記複合体が検出可能な標識を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記複合体がナノポアによって検出される、請求項39に記載の方法。
- 前記複合体が電子顕微鏡によって検出される、請求項39に記載の方法。
- 前記複合体が走査型プローブ顕微鏡によって検出される、請求項39に記載の方法。
- 前記複合体がカンチレバーによって検出される、請求項39に記載の方法。
- 前記複合体が水晶発振子マイクロバランスによって検出される、請求項39に記載の方法。
- 前記複合体が電界効果トランジスターによって検出される、請求項39に記載の方法。
- 前記ガイドRNAが、プローブ配列に相補的な3′テール配列を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記ガイドRNAが、検出可能な標識を含むプローブ配列に相補的な3′テール配列を含み、前記プローブ配列が前記3′テール配列に結合される、請求項39に記載の方法。
- 前記ガイドRNAが、複数の検出可能な標識を含むプローブ配列に相補的な3′テール配列を含み、前記プローブ配列が前記3′テール配列に結合される、請求項39に記載の方法。
- 前記ガイドRNAが、検出可能な標識を含むプローブ配列に相補的な3′テール配列を含み、前記プローブ配列が前記3′テール配列に結合され、前記プローブ配列が増幅される、請求項39に記載の方法。
- 前記ガイドRNAが、プローブまたは検出可能な標識に対する結合対として3′テール配列を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記標的核酸が二本鎖ゲノムDNAである、請求項39に記載の方法。
- 前記標的核酸が染色体DNAである、請求項39に記載の方法。
- 前記標的核酸が、基板上で伸長される、請求項39に記載の方法。
- 前記標的核酸が、平面状の表面上で伸長される、請求項39に記載の方法。
- 前記標的核酸が、ポア内で伸長される、請求項39に記載の方法。
- 前記標的核酸が、チャネル内で伸長される、請求項39に記載の方法。
- 前記Cas9タンパク質が、野生型Cas9、cas9ニッカーゼ、またはヌクレアーゼ欠損Cas9である、請求項39に記載の方法。
- 検出可能な標識が、前記Cas9タンパク質に直接または間接的に結合されている、請求項39に記載の方法。
- 検出可能な標識が、前記ガイドRNAに直接または間接的に結合されている、請求項39に記載の方法。
- 検出可能な標識を、前記複合体に直接または間接的に結合させる、請求項39に記載の方法。
- 前記Cas9タンパク質が、前記標的核酸の鎖にニックを形成するCas9ニッカーゼであり、前記ニックから相補鎖を鋳型としてプライマー伸長が開始されることにより前記標的核酸がシーケンシングされる、請求項39に記載の方法。
- 前記Cas9タンパク質が、前記標的核酸の鎖にニックを形成するCas9ニッカーゼであり、前記ニックから前記相補鎖を鋳型としてプライマー伸長が開始されて検出可能な標識が取り込まれることにより前記標的核酸が検出される、請求項39に記載の方法。
- 前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質が組み合わせられた後に、前記標的核酸と接触させられる、請求項39に記載の方法。
- 前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質が組み合わせられた後に、試料内の前記標的核酸と接触させられる、請求項39に記載の方法。
- 前記ガイドRNAが、シード領域配列を含む、請求項39に記載の方法。
- ガイドRNAが、前記ガイドRNAの非シード領域に、縮重位置もしくは縮重配列またはユニバーサル塩基を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を各々有する複数のガイドRNA配列と接触させることを含む、請求項39に記載の方法。
- 前記標的核酸が溶液試料内にある、請求項39に記載の方法。
- 前記標的核酸が基板上に存在する、請求項39に記載の方法。
- 前記標的核酸が基板に結合している、請求項39に記載の方法。
- 前記標的核酸が細胞内にある、請求項39に記載の方法。
- 標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有し且つ3′プライマー伸長部を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることであって、
ここで、前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成する、前記接触させること;
前記プライマーを鋳型に沿って伸長させて1または複数の検出可能な標識を伸長産物に取り込ませること;および
前記1または複数の検出可能な標識を検出することにより前記標的核酸配列を検出すること
を含む前記方法。 - 標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有し且つ3′プライマー伸長部を有するガイドRNA配列およびCas9タンパク質と接触させることであって、
ここで、前記ガイドRNAおよび前記Cas9タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成する、前記接触させること;
前記プライマーをローリングサークル増幅鋳型に沿って伸長させて、複数の検出可能な標識をローリングサークルコンカテマー中に取り込ませること;および
前記複数の検出可能な標識を検出することにより前記標的核酸配列を検出すること
を含む前記方法。
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