JP2021013380A - ミトコンドリアを単離するための製品および方法 - Google Patents
ミトコンドリアを単離するための製品および方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021013380A JP2021013380A JP2020173126A JP2020173126A JP2021013380A JP 2021013380 A JP2021013380 A JP 2021013380A JP 2020173126 A JP2020173126 A JP 2020173126A JP 2020173126 A JP2020173126 A JP 2020173126A JP 2021013380 A JP2021013380 A JP 2021013380A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- filter
- mitochondria
- lumen
- centrifuge tube
- pore size
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 42
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 23
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 12
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 11
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 11
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 11
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 claims description 10
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 claims description 10
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 claims description 7
- 229920000271 Kevlar® Polymers 0.000 claims description 7
- 239000005041 Mylar™ Substances 0.000 claims description 7
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000004761 kevlar Substances 0.000 claims description 7
- 239000000123 paper Substances 0.000 claims description 7
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 7
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 7
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 claims description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 238000009736 wetting Methods 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 17
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 19
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 15
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 11
- 102000006404 Mitochondrial Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010058682 Mitochondrial Proteins Proteins 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 8
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 8
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 231100000582 ATP assay Toxicity 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M mitoTracker Red Chemical compound [Cl-].C1=CC(CCl)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 2
- 238000007422 luminescence assay Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000006676 mitochondrial damage Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 206010018852 Haematoma Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000004065 mitochondrial dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 1
- 230000006686 mitochondrial oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 230000006540 mitochondrial respiration Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5021—Test tubes specially adapted for centrifugation purposes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/06—Hydrolysis; Cell lysis; Extraction of intracellular or cell wall material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/06—Fluid handling related problems
- B01L2200/0631—Purification arrangements, e.g. solid phase extraction [SPE]
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0681—Filter
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
- G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration
Abstract
【課題】ミトコンドリアを単離するための製品および方法の提供。【解決手段】組織からの無傷生存ミトコンドリアの迅速単離のための濾過装置、キットおよび方法が記載され、ミトコンドリアは、ナイロンメッシュフィルタを通した分別濾過により単離される。ミトコンドリアは、記載される濾過装置、キットおよび方法を使用して、３０分未満で単離され得る。【選択図】なし
Description
関連出願への相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み入れられる、２０１４年６月１３日に出願された米国出願第６２／０１２，０４５号の利益を主張する。
連邦政府資金による研究開発
本出願は、参照により本明細書に組み入れられる、２０１４年６月１３日に出願された米国出願第６２／０１２，０４５号の利益を主張する。
連邦政府資金による研究開発
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＨＬ１０４６４２の下での米国政府援助によりなされた。政府は、本出願においてある特定の権利を有する。
本発明は、臨床状況において使用され得る無傷生存ミトコンドリアを単離するための濾過装置、キットおよび方法に関する。
ミトコンドリアは、赤血球以外の体内の全ての細胞内に存在し、多くの重要な細胞および代謝プロセスに関与している（ｖａｎ Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ９：１０３１−１０４２，２００２；Ｓｚａｂａｄｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）２３：８４−９４ ｄｏｉ：０．１１５２／ｐｈｙｓｉｏｌ．０００４６．２００７，２００８；Ｃｈａｎ，Ｃｅｌｌ １２５：１２４１−１２５２，２００６；Ｐｉｃａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６，ｅ１８３１７，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１８３１７，２０１１）。これらの多くの機能のため、ミトコンドリア損傷は、有害な影響を有し得る（Ｃｈａｎ，Ｃｅｌｌ １２５：１２４１−１２５２，２００６）。ミトコンドリア機能および機能不全を調査するために、いくつかのミトコンドリア単離方法が説明されている。最も早く発表されたミトコンドリア単離の記事は、１９４０年代まで遡るようである（Ｂｅｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｔ Ｒｅｃ ６０：４４９−４５５，１９３４；Ｃｌａｕｄｅ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ８４：６１−８９，１９４６；Ｈｏｇｅｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １７２：６１９−６３５，１９４８；Ｅｒｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９１（３ Ｐｔ ２），２２７ｓ−２５５ｓ，１９８１）。１つの試みは、乳鉢内での肝臓組織の粉砕に続く塩溶液中での低速での遠心分離によるミトコンドリア単離を実証した（Ｂｅｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｔ Ｒｅｃ ６０：４４９−４５５，１９３４；Ｅｒｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９１（３ Ｐｔ ２），２２７ｓ−２５５ｓ，１９８１）。他のグループは、元の手順を拡張し、分別遠心分離に基づく組織分画を実証した（Ｃｌａｕｄｅ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ８４：６１−８９，１９４６；Ｈｏｇｅｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １７２：６１９−６３５，１９４８；Ｅｒｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９１（３ Ｐｔ ２），２２７ｓ−２５５ｓ，１９８１）。これらの初期の方法は、多くの場合均質化および／または分別遠心分離を組み込んでいる、現在の当技術分野において知られている技法の基礎を形成した（Ｐａｌｌｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８０：３−４４，２００７；Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４４３：６６−７４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１３．０８．００７，２０１３；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖｉｚａｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ １０：２５３−２６２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｉｔｏ．２００９．１２．１４８，２０１０；Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｕｎｉｔ ３．３，ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４３０３０．ｃｂ０３０３ｓ０４，２００１；Ｆｒｅｚｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２：２８７−２９５，２００７；Ｗｉｅｃｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ４：１５８２−１５９０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．１５１，２００９；Ｇｏｓｔｉｍｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ（４３），ｐｉｉ：２２０２，ｄｏｉ：１０．３７９１／２２０２，２０１０）。均質化および遠心分離ステップの数は、プロトコル間で様々である。これらの反復ステップは、ミトコンドリア単離のための時間を増加させ、最終的に生存率を低下させる。さらに、手作業による均質化は、適切に制御されない場合、ミトコンドリア損傷、および一貫性のない結果をもたらし得る（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４４３：６６−７４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１３．０８．００７，２０１３；Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１８：２１３−２２３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１１．０７．０１７，２０１１）。
本開示は、少なくとも部分的に、分別濾過により高収率および高純度で生存呼吸可能ミトコンドリアが単離され得るという発見に基づく。特に、出願人らは、約５μｍから約２０μｍ、例えば約６μｍ、８μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１５μｍ、または約１８μｍの細孔サイズを有するフィルタによって、ミトコンドリアが濾液中に収集され得、一方細胞残屑および他の細胞小器官は、フィルタにより保持されることを見出した。したがって、本明細書は、例えば、生存呼吸可能ミトコンドリアを単離するための濾過装置、キットおよび方法を提供する。
一態様において、本開示は、遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１および第２の端部とを有し、各端部は開口を有する、管状本体と；ルーメン内に配置および固定される第１のフィルタであって、約３０μｍから約５０μｍ、例えば約３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、または約４８μｍの細孔サイズを有するフィルタと；ルーメン内に第１のフィルタに隣接して配置および固定され、約５μｍから約２０μｍ、例えば約６μｍ、８μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１５μｍ、または約１８μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタとを有する濾過装置を提供する。いくつかの実施形態において、濾過装置は、ルーメン内に第１のフィルタおよび第２のフィルタに隣接して配置および固定され、約１５μｍから約５０μｍ、例えば約１８μｍ、２０μｍ、２２μｍ、２５μｍ、２８μｍ、３０μｍ、３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、または約４８μｍの細孔サイズを有する第３のフィルタを有してもよい。いくつかの実施形態において、第１のフィルタおよび第３のフィルタは、同じ細孔サイズ、例えば３０μｍ、３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、４８μｍ、または約５０μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態において、第２のフィルタおよび第３のフィルタは、同じ細孔サイズ、例えば１５μｍ、１６μｍ、１７μｍ、１８μｍ、１９μｍ、または約２０μｍの細孔サイズを有する。一実施形態において、濾過装置は、無菌であってもよい。いくつかの実施形態において、第１、第２および第３のフィルタは、ナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、紙、またはそれらの任意の組み合わせを含む。さらに別の実施形態において、遠心分離管は、５０ｍＬの遠心分離管である。
別の態様において、本開示は、少なくとも１個、例えば２個、３個、５個または１０個以上の上述の濾過装置、例えば、遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１および第２の端部とを有し、各端部は開口を有する、管状本体と；ルーメン内に配置および固定される第１のフィルタであって、約３０μｍから約５０μｍ、例えば約３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、または約４８μｍの細孔サイズを有するフィルタと；ルーメン内に第１のフィルタに隣接して配置および固定され、約５μｍから約２０μｍ、例えば約６μｍ、８μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１５μｍ、または約１８μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタとを有する装置を有するキットを提供する。一実施形態において、キットは、３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を有する第１の溶液と；第１の溶液１ｍＬ当たり２ｍｇのサブチリシンＡ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ａ）を有する第２の溶液と；第１の溶液１ｍＬ当たり１０ｍｇのＢＳＡを有する第３の溶液と；第１の溶液１ｍＬ当たり１ｍｇのＢＳＡを有する第４の溶液と；５０ｍＬの遠心分離管と；１．５ｍＬの微小遠心分離管とを含んでもよい。いくつかの実施形態において、５０ｍＬの遠心分離管および１．５ｍＬの微小遠心分離管は、無菌である。
さらに別の態様において、本開示は、生存呼吸可能ミトコンドリアを単離するための方法を提供する。方法は、生存ミトコンドリアを有する細胞ホモジネートを提供することと；上述の濾過装置、例えば、遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１および第２の端部とを有し、各端部は開口を有する、管状本体と；ルーメン内に配置および固定される第１のフィルタであって、約３０μｍから約５０μｍ、例えば約３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、または約４８μｍの細孔サイズを有するフィルタと；ルーメン内に第１のフィルタに隣接して配置および固定され、約５μｍから約２０μｍ、例えば約６μｍ、８μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１５μｍ、または約１８μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタとを有する装置を提供することと；任意選択で、濾過装置を比較的直立位置に位置付けることと；細胞ホモジネートが、第１のフィルタ、続いて第２のフィルタに接触して、それらを通して濾過され、それにより濾液を形成するように、細胞ホモジネートを第１の端部の開口内に導入することと；濾液を収集し、それにより生存ミトコンドリアを単離することとを含んでもよい。
一実施形態において、方法は、３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含む溶液中で、組織、例えば哺乳動物組織、例えば組織生検からの哺乳動物組織を均質化し、それにより細胞ホモジネートを提供することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、細胞ホモジネートを導入する前に、３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含む溶液１ｍＬ中の１ｍｇのＢＳＡを含む溶液で、第２のフィルタを湿潤させることを含んでもよい。一実施形態において、方法は、濾液を収集する前に、装置を約１×ｇで３分間遠心分離することを含んでもよい。いくつかの実施形態において、濾液は、４℃で５分間９０００ｒｐｍで遠心分離される。一実施形態において、細胞ホモジネートは、無菌ガラス粉砕容器内で組織を均質化することにより提供され得る。
別段に定義されていない限り、本明細書において使用されている技術的用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書において、本発明における使用のための方法および材料が記載されているが、当該技術分野において知られている他の好適な方法および材料もまた使用され得る。材料、方法、および例は例示のみを目的としており、限定を意図するものではない。本明細書において言及されるすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照することによりその全体が組み入れられる。不一致が生じる場合は、定義を含めて本明細書が優先される。
本発明の他の特徴および利点は、以下の記載および図から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。
分別遠心分離および／またはＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離を使用した以前に説明されたミトコンドリア単離方法は、典型的には、完了するのに６０から１００分を必要とする。本明細書に記載されるのは、組織からのミトコンドリアの迅速な単離のための濾過装置、キットおよび方法である。本明細書に記載のある特定の方法は、組織解離器および分別濾過を使用する。この方法では、手作業の均質化を組織解離器の標準化された均質化サイクルで置き換えることができ、これによって、手作業の均質化では容易に達成されない組織の均一および一貫した均質化が可能となる。組織解離後に、細胞ホモジネートは、ナイロンメッシュフィルタを通して濾過され、これにより反復的遠心分離ステップが排除される。その結果、ミトコンドリア単離は、３０分未満で実行され得る。本明細書に記載の濾過装置、キットおよび方法を使用した典型的な単離は、０．１８±０．０４ｇ（湿潤重量）の組織試料から、約２×１０１０個の生存した呼吸可能なミトコンドリアを得ることができる。
本明細書に記載の濾過装置は、無傷生存ミトコンドリアを、３０分以内で、例えば２８分、２５分または２０分以内で迅速に単離するために使用され得る。ミトコンドリアを単離する方法において、標準的な分別遠心分離の代わりに分別濾過を使用することにより、標準的な分別遠心分離プロトコルを使用した場合よりも、手順時間が大幅に削減され、ミトコンドリアがより少ない機械的ストレスに供される。例えば、いくつかの遠心分離ステップを組み込んだプロトコルは、ミトコンドリアを単離するのに６０分から１００分を要し得る（Ｆｒｅｚｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２：２８７−２９５，２００７；Ｗｉｅｃｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ４：１５８２−１５９０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．１５１，２００９；Ｇｏｓｔｉｍｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ（４３），ｐｉｉ：２２０２，ｄｏｉ：１０．３７９１／２２０２，２０１０；Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１８：２１３−２２３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１１．０７．０１７，２０１１；Ｍａｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０４：Ｈ９６６−Ｈ９８２，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００８８３．２０１２，２０１３）。本発明の濾過装置、キットおよび単離方法の別の利点は、組織均質化が標準化されるという点である。組織解離器は、標準化されたサイクルを提供し、一貫した再現性のある結果を生成する。これは、使用者による変動性および非一貫性に曝される手作業の均質化とは対照的である。本発明の方法により提供される単離時間枠は、臨床的および手術治療的介入に適合する（Ｍａｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０４：Ｈ９６６−Ｈ９８２，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００８８３．２０１２，２０１３；ＭｃＣｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９６：Ｈ９４−Ｈ１０５，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００５６７．２００８，２００９）。
装置
本明細書に記載の濾過装置は、以下でさらに説明され、図１に示される複数のフィルタを収容するように構成された本体（例えば管状本体）を特徴とする。本体（１０）は、遠心分離管（９０）内に適合するような形状であってもよい。本体（１０）および遠心分離管（９０）は、任意のサイズであってもよい。本体（１０）は、それぞれ開口（３０）および（７０）を有する第１および第２の端部（２０）および（８０）を有する。本体は、試料が一方の端部で本体内に設置され、ルーメン（４０）を通って移動し、例えば重力、毛管作用、および／または遠心分離により、本体内に配置された少なくとも２つのフィルタを通して試料が進行した後に、反対の端部で回収され得るように、ルーメン（４０）を有する。一方または両方の端部（２０および／または８０）は、それぞれ開口を有するが、いくつかの実施形態において、例えば無菌性を保つ、および／または濾液を収集するための領域を提供するために可逆的にキャップされ得ることが、当業者に理解されるであろう。典型的には、本体は、本体の長さに沿ってほぼ円形の断面を有する。しかしながら、本体の断面は、任意の所望の形状、例えば楕円形、正方形、長方形、三角形等であってもよいことが、当業者に理解されるであろう。いくつかの実施形態において、本体が市販の遠心分離管（９０）、例えば５０ｍＬの遠心分離管内に受容され得るように、断面はほぼ円形である。管状本体（１０）は、任意の当該技術分野において知られた材料、例えばポリプロピレンまたはポリスチレンから構築されてもよいことが、当業に理解されるであろう。本体の一方の端部、例えば端部（８０）は、遠心分離管内への本体の挿入を容易化するために、および／または本体内のフィルタ（複数を含む）の保持を補助するために、テーパ型構成（図１に示される）を有してもよい。
本明細書に記載の濾過装置は、以下でさらに説明され、図１に示される複数のフィルタを収容するように構成された本体（例えば管状本体）を特徴とする。本体（１０）は、遠心分離管（９０）内に適合するような形状であってもよい。本体（１０）および遠心分離管（９０）は、任意のサイズであってもよい。本体（１０）は、それぞれ開口（３０）および（７０）を有する第１および第２の端部（２０）および（８０）を有する。本体は、試料が一方の端部で本体内に設置され、ルーメン（４０）を通って移動し、例えば重力、毛管作用、および／または遠心分離により、本体内に配置された少なくとも２つのフィルタを通して試料が進行した後に、反対の端部で回収され得るように、ルーメン（４０）を有する。一方または両方の端部（２０および／または８０）は、それぞれ開口を有するが、いくつかの実施形態において、例えば無菌性を保つ、および／または濾液を収集するための領域を提供するために可逆的にキャップされ得ることが、当業者に理解されるであろう。典型的には、本体は、本体の長さに沿ってほぼ円形の断面を有する。しかしながら、本体の断面は、任意の所望の形状、例えば楕円形、正方形、長方形、三角形等であってもよいことが、当業者に理解されるであろう。いくつかの実施形態において、本体が市販の遠心分離管（９０）、例えば５０ｍＬの遠心分離管内に受容され得るように、断面はほぼ円形である。管状本体（１０）は、任意の当該技術分野において知られた材料、例えばポリプロピレンまたはポリスチレンから構築されてもよいことが、当業に理解されるであろう。本体の一方の端部、例えば端部（８０）は、遠心分離管内への本体の挿入を容易化するために、および／または本体内のフィルタ（複数を含む）の保持を補助するために、テーパ型構成（図１に示される）を有してもよい。
装置は、ルーメン内に配置および固定される第１のフィルタ（５０）を含み、フィルタは、約３０μｍから約５０μｍ、例えば約３０μｍ、３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、４８μｍ、または約５０μｍの細孔サイズを有する。第１のフィルタは、任意の当技術分野において知られたフィルタ材料、例えばナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、紙、またはそれらの任意の組み合わせから構築されてもよい。装置はまた、ルーメン内に第１のフィルタに隣接して配置および固定され、約５μｍから約２０μｍ、例えば約５μｍ、６μｍ、８μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１５μｍ、１８μｍ、または約２０μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタ（６０）を含む。第２のフィルタは、任意の当技術分野において知られたフィルタ材料、例えばナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、紙、またはそれらの任意の組み合わせから構築されてもよい。第１および第２のフィルタは、それらが互いに接触するように、またはいくらかの距離だけ離れて離間するように本体内に位置付けられてもよい。例えば、第１および第２のフィルタは、本体の使用目的および／または長さに依存して、少なくともまたは約０．５ｍｍ、例えば少なくとももしくは約１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、８ｍｍ、１ｃｍ、２ｃｍ、５ｃｍ、または少なくとももしくは約１０ｃｍの距離だけ離して本体内に配置されてもよい。
装置は、任意選択で、ルーメン内に第１のフィルタおよび第２のフィルタに隣接して配置および固定され、約１５μｍから約５０μｍ、例えば約１５μｍ、１８μｍ、２０μｍ、２２μｍ、２５μｍ、２８μｍ、３０μｍ、３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、４８μｍ、または約５０μｍの細孔サイズを有する第３のフィルタを含んでもよい。第３のフィルタは、任意の当技術分野において知られたフィルタ材料、例えばナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、紙、またはそれらの任意の組み合わせから構築されてもよい。第３のフィルタは、第１のフィルタと第２のフィルタとの間に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、第３のフィルタは、第１のフィルタと第１の開口との間に、すなわち、第１のフィルタよりも第１の開口の近くに配置される。他の実施形態において、第３のフィルタは、第２のフィルタと第２の開口との間に、すなわち、第２のフィルタよりも第２の開口の近くに配置される。第３のフィルタは、第１のフィルタおよび／もしくは第２のフィルタに接触するように配置されてもよく、または、３つのフィルタは、均一に離間しても、もしくは不均一に離間してもよい。例えば、第３のフィルタが第１のフィルタと第２のフィルタとの間に配置される場合、第１および第３のフィルタは、互いに接触してもよく、あるいは、少なくともまたは約０．５ｍｍ離れて、例えば少なくとももしくは約１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、８ｍｍ、１ｃｍ、２ｃｍ、５ｃｍ、または少なくとももしくは約１０ｃｍ離れていてもよく；第３および第２のフィルタは、互いに接触してもよく、あるいは、少なくともまたは約０．５ｍｍ離れて、例えば少なくとももしくは約１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、８ｍｍ、１ｃｍ、２ｃｍ、５ｃｍ、または少なくとももしくは約１０ｃｍ離れていてもよい。
いくつかの場合において、使用目的に依存してさらなるフィルタ（例えば、第４のフィルタ、第５のフィルタ、第６のフィルタ等）が追加されてもよいことが、当業者に理解されるであろう。いくつかの実施形態において、装置は、無菌である。フィルタは、任意の当技術分野において知られた方法を使用して、例えば、接着剤の使用、圧入、および／または、フィルタをルーメン内に保持させるようにルーメン壁を構成することにより（例えば、ルーメン壁が隆起部、溝、もしくは他の保持要素を有するように設計することにより）本体内に固定され得ることが、当業者に理解されるであろう。
キット
本開示はまた、生存ミトコンドリアを単離するための、本明細書に記載の濾過装置を特徴とするキットを提供する。そのようなキットは、少なくとも１個、例えば２個、３個、５個または１０個の上述の濾過装置を含む。キットは、本明細書に記載のミトコンドリア単離方法を実行するのに有用な１種または複数種の溶液をさらに含んでもよい。例えば、キットは、３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含む第１の溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、第１の溶液１ｍＬ当たり２ｍｇのサブチリシンＡを含む第２の溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、第１の溶液１ｍＬ当たり１０ｍｇのＢＳＡを含む第３の溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、不活性ヒト血清アルブミンまたはアセチル化ヒト血清アルブミンを含む溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、第１の溶液１ｍＬ当たり１ｍｇのＢＳＡを含む第４の溶液を含んでもよい。いくつかの場合において、キットは、濾過装置を適合させることができる５０ｍＬの遠心分離管を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、１．５ｍＬの微小遠心分離管を含んでもよい。いくつかの一実施形態において、５０ｍＬの遠心分離管および１．５ｍＬの微小遠心分離管は、無菌である。
本開示はまた、生存ミトコンドリアを単離するための、本明細書に記載の濾過装置を特徴とするキットを提供する。そのようなキットは、少なくとも１個、例えば２個、３個、５個または１０個の上述の濾過装置を含む。キットは、本明細書に記載のミトコンドリア単離方法を実行するのに有用な１種または複数種の溶液をさらに含んでもよい。例えば、キットは、３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含む第１の溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、第１の溶液１ｍＬ当たり２ｍｇのサブチリシンＡを含む第２の溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、第１の溶液１ｍＬ当たり１０ｍｇのＢＳＡを含む第３の溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、不活性ヒト血清アルブミンまたはアセチル化ヒト血清アルブミンを含む溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、第１の溶液１ｍＬ当たり１ｍｇのＢＳＡを含む第４の溶液を含んでもよい。いくつかの場合において、キットは、濾過装置を適合させることができる５０ｍＬの遠心分離管を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、１．５ｍＬの微小遠心分離管を含んでもよい。いくつかの一実施形態において、５０ｍＬの遠心分離管および１．５ｍＬの微小遠心分離管は、無菌である。
ミトコンドリアを単離する方法
例示的方法において、無傷生存ミトコンドリアは、組織、例えば哺乳動物組織、例えば組織生検からの哺乳動物組織から単離される。例えば、哺乳動物からの組織は、例えばメスを用いて切り刻み、３００ｍＭスクロース；１０ｍＭのＫ＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含有する第１の溶液中で、電動式乳棒を有する無菌ガラス粉砕容器（Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）内で、４℃で５から１０秒間均質化することができる。次いで、第１の溶液１ｍＬ当たり２ｍｇのサブチリシンＡを含有する溶液をホモジネートに添加し、氷上で１０分間インキュベートする。
例示的方法において、無傷生存ミトコンドリアは、組織、例えば哺乳動物組織、例えば組織生検からの哺乳動物組織から単離される。例えば、哺乳動物からの組織は、例えばメスを用いて切り刻み、３００ｍＭスクロース；１０ｍＭのＫ＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含有する第１の溶液中で、電動式乳棒を有する無菌ガラス粉砕容器（Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）内で、４℃で５から１０秒間均質化することができる。次いで、第１の溶液１ｍＬ当たり２ｍｇのサブチリシンＡを含有する溶液をホモジネートに添加し、氷上で１０分間インキュベートする。
氷上でのインキュベーション後、細胞ホモジネートを、本明細書に記載のように、比較的直立に位置付けられた無菌濾過装置に導入する。いくつかの実施形態において、ある体積の細胞ホモジネート、例えば約１００μＬ、２００μＬ、３００μＬ、４００μＬ、５００μＬ、６００μＬ、７００μＬ、８００μＬ、９００μＬ、１ｍＬ、１．５ｍＬ、２ｍＬ、２．５ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、３５ｍＬ、４０ｍＬ、４５ｍＬ、または約５０ｍＬを、第１の端部の開口内に、細胞ホモジネートが第２のフィルタに接触する前に第１のフィルタに接触するように導入し、例えば重力または遠心分離により両方のフィルタを通過した後に、管、例えば遠心分離管、バイアル、微小遠心分離管、または試験管内に濾液を収集し、無傷の生存呼吸可能ミトコンドリアを単離する。代替として、またはそれに追加して、濾過装置は、濾液を収集することができるキャップを第２の端部に有してもよく、重力または遠心分離により濾液が第１のフィルタ、第２のフィルタ、および存在する場合には第３のフィルタを通って流動した後に、キャップを開ける、またはねじって外して濾液を収集することができる。いくつかの実施形態において、ある体積の細胞ホモジネートを、約３０μｍから約５０μｍ、例えば約３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、または約４８μｍの細孔サイズを有するフィルタに通過させることができ、任意選択で、濾液を、約１５μｍから約５０μｍ、例えば約１８μｍ、２０μｍ、２２μｍ、２５μｍ、２８μｍ、３０μｍ、３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、または約４８μｍの細孔サイズを有する別のフィルタに通過させてから、約５μｍから約２０μｍ、例えば約６μｍ、８μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１５μｍ、または約１８μｍの細孔サイズを有するフィルタに通過させることができる。
細胞ホモジネートを濾過装置に導入する前に、３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含む溶液１ｍＬ中の１ｍｇのＢＳＡを含む溶液で、約５μｍから約２０μｍ、例えば約６μｍ、８μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１５μｍ、または約１８μｍの細孔サイズを有するフィルタを湿潤させてもよい。本明細書に記載の方法において常に必要とされるわけではないが、濾液収集は、装置を例えば１×ｇで３分間遠心分離することにより容易化され得ることが、当業者により理解される。ミトコンドリアは、濾液を４℃で５分間９０００ｒｐｍで遠心分離することにより濃縮され得ることが、当業者により理解される。
いくつかの一般的なプロトコルを以下で説明するが、これらは、本明細書に記載の方法のいずれにおいても使用することができ、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
実施例１：原液
無傷の生存呼吸可能ミトコンドリアを単離するために、以下の溶液を調製した。本発明の方法を使用してミトコンドリアを成功裏に単離するために、全ての溶液および組織試料を氷上に保持し、ミトコンドリアの生存を保つべきである。氷上に維持された場合であっても、単離されたミトコンドリアは、経時的に機能活性の低下を示す（Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４２：３２５−３３２，１９６７）。全ての溶液は、可能な場合には事前に調製されるべきである。
１ＭのＫ−ＨＥＰＥＳ原液（ＫＯＨでｐＨを７．２に調整）。
０．５ＭのＫ−ＥＧＴＡ原液（ＫＯＨでｐＨを８．０に調整）。
１ＭのＫＨ２ＰＯ４原液。
１ＭのＭｇＣｌ２原液。
均質化緩衝液（ｐＨ７．２）：３００ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＫ−ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭのＫ−ＥＧＴＡ。４℃で保存した。
呼吸緩衝液：２５０ｍＭのスクロース、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＫ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、および０．５ｍＭのＫ−ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）。４℃で保存した。
１０×ＰＢＳ原液：８０ｇのＮａＣｌ、２ｇのＫＣｌ、１４．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４、および２．４ｇのＫＨ２ＰＯ４を、１Ｌの再蒸留Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．４）に溶解させた。
１００ｍＬの１０×ＰＢＳを１Ｌの再蒸留Ｈ２Ｏに滴下することにより、１×ＰＢＳを調製した。
４ｍｇのＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ａを１．５ｍＬの微小遠心分離管に量り入れることにより、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ａ原液を調製した。使用するまで−２０℃で保存した。
２０ｍｇのＢＳＡを１．５ｍＬの微小遠心分離管に量り入れることにより、ＢＳＡ原液を調製した。使用するまで−２０℃で保存した。
無傷の生存呼吸可能ミトコンドリアを単離するために、以下の溶液を調製した。本発明の方法を使用してミトコンドリアを成功裏に単離するために、全ての溶液および組織試料を氷上に保持し、ミトコンドリアの生存を保つべきである。氷上に維持された場合であっても、単離されたミトコンドリアは、経時的に機能活性の低下を示す（Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４２：３２５−３３２，１９６７）。全ての溶液は、可能な場合には事前に調製されるべきである。
１ＭのＫ−ＨＥＰＥＳ原液（ＫＯＨでｐＨを７．２に調整）。
０．５ＭのＫ−ＥＧＴＡ原液（ＫＯＨでｐＨを８．０に調整）。
１ＭのＫＨ２ＰＯ４原液。
１ＭのＭｇＣｌ２原液。
均質化緩衝液（ｐＨ７．２）：３００ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＫ−ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭのＫ−ＥＧＴＡ。４℃で保存した。
呼吸緩衝液：２５０ｍＭのスクロース、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＫ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、および０．５ｍＭのＫ−ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）。４℃で保存した。
１０×ＰＢＳ原液：８０ｇのＮａＣｌ、２ｇのＫＣｌ、１４．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４、および２．４ｇのＫＨ２ＰＯ４を、１Ｌの再蒸留Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．４）に溶解させた。
１００ｍＬの１０×ＰＢＳを１Ｌの再蒸留Ｈ２Ｏに滴下することにより、１×ＰＢＳを調製した。
４ｍｇのＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ａを１．５ｍＬの微小遠心分離管に量り入れることにより、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ａ原液を調製した。使用するまで−２０℃で保存した。
２０ｍｇのＢＳＡを１．５ｍＬの微小遠心分離管に量り入れることにより、ＢＳＡ原液を調製した。使用するまで−２０℃で保存した。
実施例２：ミトコンドリア単離
組織解離および分別濾過を使用したミトコンドリアの単離における手順ステップの概要を説明した図を、図２に示す。２つの６ｍｍ生検穿孔試料を、解離Ｃ管内の５ｍＬの均質化緩衝液に移し、試料を組織解離器の１分間の均質化プログラムを使用して均質化した（Ａ）。サブチリシンＡ原液（２５０μＬ）を解離Ｃ管内のホモジネートに添加し、１０分間氷上でインキュベートした（Ｂ）。氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管内に、事前に湿潤させた４０μｍメッシュフィルタを通してホモジネートを濾過し、次いで２５０μＬのＢＳＡ原液を濾液に添加した（Ｃ）。氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離内に、新しい事前に湿潤させた４０μｍのメッシュフィルタを通して濾液を再び濾過した（Ｄ）。氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管内に、新しい事前に湿潤させた１０μｍのメッシュフィルタを通して濾液を再び濾過した（Ｅ）。濾液を１．５ｍＬの微小遠心分離管に移し、４℃で１０分間９０００×ｇで遠心分離した（Ｆ）。上清を除去し、ミトコンドリアを含有するペレットを再び懸濁させ、１ｍＬの呼吸緩衝液に組み合わせた（Ｇ）。
組織解離および分別濾過を使用したミトコンドリアの単離における手順ステップの概要を説明した図を、図２に示す。２つの６ｍｍ生検穿孔試料を、解離Ｃ管内の５ｍＬの均質化緩衝液に移し、試料を組織解離器の１分間の均質化プログラムを使用して均質化した（Ａ）。サブチリシンＡ原液（２５０μＬ）を解離Ｃ管内のホモジネートに添加し、１０分間氷上でインキュベートした（Ｂ）。氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管内に、事前に湿潤させた４０μｍメッシュフィルタを通してホモジネートを濾過し、次いで２５０μＬのＢＳＡ原液を濾液に添加した（Ｃ）。氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離内に、新しい事前に湿潤させた４０μｍのメッシュフィルタを通して濾液を再び濾過した（Ｄ）。氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管内に、新しい事前に湿潤させた１０μｍのメッシュフィルタを通して濾液を再び濾過した（Ｅ）。濾液を１．５ｍＬの微小遠心分離管に移し、４℃で１０分間９０００×ｇで遠心分離した（Ｆ）。上清を除去し、ミトコンドリアを含有するペレットを再び懸濁させ、１ｍＬの呼吸緩衝液に組み合わせた（Ｇ）。
単離直前に、サブチリシンＡを１ｍＬの均質化緩衝液に溶解した。単離直前に、ＢＳＡを１ｍＬの均質化緩衝液に溶解した。６ｍｍ生検試料穿孔を使用して２つの新鮮な組織試料を収集し、氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管内で１×ＰＢＳ中で保存した。２つの６ｍｍ組織穿孔試料を、５ｍＬの氷冷均質化緩衝液を含有する解離Ｃ管に移した。組織解離器上に解離Ｃ管を取り付け、事前設定されたミトコンドリア単離サイクル（６０秒の均質化）を選択することにより、組織を均質化した。
解離Ｃ管を取り除いて、アイスペールに移した。サブチリシンＡ原液（２５０μＬ）をホモジネートに添加し、転倒混和し、ホモジネートを氷上で１０分間インキュベートした。４０μｍのメッシュフィルタを氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管上に設置し、均質化緩衝液でフィルタを予め湿潤させ、ホモジネートを氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管内に濾過した。
新しく調製したＢＳＡ原液（２５０μＬ）を濾液に添加し、転倒混和した。（このステップは、ミトコンドリアタンパク質決定が必要である場合には省略した。）４０μｍのメッシュフィルタを氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管上に設置し、均質化緩衝液でフィルタを事前に湿潤させ、ホモジネートを氷上の５０ｍＬ円錐遠心分離管内に濾過した。１０μｍのフィルタを氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管上に設置し、均質化緩衝液でフィルタを事前に湿潤させ、ホモジネートを氷上の５０ｍＬ円錐遠心分離管内に濾過した。濾液を２つの事前に冷却された１．５ｍＬの微小遠心分離管に移し、４℃で１０分間９０００×ｇで遠心分離した。上清を除去し、ペレットを再び懸濁させ、１ｍＬの氷冷呼吸緩衝液に組み合わせた。
実施例３：ＡＴＰアッセイ
単離されたミトコンドリアの代謝活性を決定するために、ＡＴＰアッセイキットを使用してＡＴＰ発光アッセイを行った。プロトコル、試薬および標準は、アッセイキットに提供されていた。手順の要約を以下に記載する。
単離されたミトコンドリアの代謝活性を決定するために、ＡＴＰアッセイキットを使用してＡＴＰ発光アッセイを行った。プロトコル、試薬および標準は、アッセイキットに提供されていた。手順の要約を以下に記載する。
キット試薬を室温に平衡化した。凍結乾燥ＡＴＰペレットを１，１７０μＬの再蒸留水に溶解することにより、１０ｍＭのＡＴＰ原液を調製した。ＡＴＰ標準原液および調製されたミトコンドリア試料を氷上で保存した。
基質緩衝溶液（５ｍＬ）を、凍結乾燥基質溶液のバイアルに添加し、穏やかに混合し、暗所に設置した。呼吸緩衝液（１００μＬ）を、黒色の不透明底部９６ウェルプレートの全てのウェルに添加した。調製された試料からのミトコンドリア（１０μＬ）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。試料を３つ組で播種し、標準用の列および陰性対照（呼吸緩衝液）用の３つのウェルを含めた。哺乳動物細胞溶解溶液（５０μＬ）を、標準および対照を含む全てのウェルに添加した。９６ウェルプレートを３７℃で５分間、オービタルシェーカー上で１２５ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーションの間、ＡＴＰ標準を、１０ｍＭのＡＴＰ原液から０．１ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ、および０．０００１ｍＭのＡＴＰの濃度で調製し、氷上で保存した。インキュベーション後、１０μＬのＡＴＰ標準を、プレートマップ（図５）上に示されるように対応するウェルに添加した。このプレートマップは、ＡＴＰアッセイ用に標準（Ａ１〜Ａ１２）、ミトコンドリア試料（Ｂ１〜Ｃ６）、および陰性対照（Ｃ７〜Ｃ９）を設定する方法を示している。アッセイの間、１００μＬの呼吸緩衝液、５０μＬの哺乳動物細胞溶解溶液、および５０μＬの再構成基質溶液を全てのウェル（Ａ１〜Ｃ９）に添加した。再構成された基質溶液（５０μＬ）を各ウェルに添加し、９６ウェルプレートを、オービタルシェーカー上で１２５ｒｐｍで５分間、３７℃でインキュベートした。
プレートをＯｐｅｎ Ｇｅｎ５ １．１１ソフトウェアにより制御された分光光度計で読み出した。より高い値は、増加したＡＴＰレベルおよびより高い代謝活性に関連している。
実施例４：代表的結果
６ｍｍ生検穿孔を使用して組織試料を得た。組織重量は０．１８±０．０４ｇ（湿潤重量）であった。粒子サイズ計数により決定された単離されたミトコンドリアの数は、骨格筋において２．４×１０１０±０．１×１０１０ミトコンドリア、および肝臓調製物において２．７５×１０１０±０．１×１０１０ミトコンドリアであった（図３Ａ）。また、比較を可能とするために、血球計によりミトコンドリア数を決定した。血球計により決定した場合、ミトコンドリアの数は少なく見積もられ、骨格筋において０．１１×１０１０±０．０４×１０１０ミトコンドリア、および肝臓調製物において０．３４×１０１０±０．０９×１０１０ミトコンドリアであった（図３Ａ）。サイズに基づく粒子カウンタにより決定されたミトコンドリア直径を、図３Ｂに示す。代表的なトレースは、単離されたミトコンドリアが、以前の報告と一致して、０．３８±０．１７μｍの平均直径で１つのピーク下に局在することを示している（Ｈｏｇｅｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １７２：６１９−６３５，１９４８）。
６ｍｍ生検穿孔を使用して組織試料を得た。組織重量は０．１８±０．０４ｇ（湿潤重量）であった。粒子サイズ計数により決定された単離されたミトコンドリアの数は、骨格筋において２．４×１０１０±０．１×１０１０ミトコンドリア、および肝臓調製物において２．７５×１０１０±０．１×１０１０ミトコンドリアであった（図３Ａ）。また、比較を可能とするために、血球計によりミトコンドリア数を決定した。血球計により決定した場合、ミトコンドリアの数は少なく見積もられ、骨格筋において０．１１×１０１０±０．０４×１０１０ミトコンドリア、および肝臓調製物において０．３４×１０１０±０．０９×１０１０ミトコンドリアであった（図３Ａ）。サイズに基づく粒子カウンタにより決定されたミトコンドリア直径を、図３Ｂに示す。代表的なトレースは、単離されたミトコンドリアが、以前の報告と一致して、０．３８±０．１７μｍの平均直径で１つのピーク下に局在することを示している（Ｈｏｇｅｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １７２：６１９−６３５，１９４８）。
ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより決定されたミトコンドリアタンパク質／ｇ（湿潤重量）出発組織は、骨格筋および肝臓試料においてそれぞれ４．８±２．９ｍｇ／ｇ（湿潤重量）および７．３±３．５ｍｇ／ｇ（湿潤重量）であった（図３Ｃ）。
透過型電子顕微鏡によりミトコンドリア純度を決定したが、これを図３Ｄに示す。ミトコンドリアは、電子密度が高いように観察され、破砕または損傷しているのは０．０１％未満である。非ミトコンドリア粒子による汚染は、０．００１％未満である。
以前に説明されたように、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄにより、ミトコンドリア生存率を決定した（Ｍａｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０４：Ｈ９６６−Ｈ９８２，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００８８３．２０１２，２０１３；ＭｃＣｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９６：Ｈ９４−Ｈ１０５，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００５６７．２００８，２００９）。本発明の方法は、膜電位を維持する単離されたミトコンドリアを生成する（図４Ａ〜Ｃ）。これらの画像は、ミトコンドリアが膜電位を維持したことを示している。矢印は、膜電位を有さないミトコンドリアまたは残屑を示す（図４Ａ）。
発光アッセイキットを使用してＡＴＰを決定した。ＡＴＰアッセイのプレートマップを図５に示す。ＡＴＰ標準は、２つ組で播種した。ミトコンドリア試料および陰性対照は、３つ組で播種した。ＡＴＰ含量は、骨格筋および肝臓試料においてそれぞれ１０．６７±４．３８ｎｍｏｌ／ｍｇミトコンドリアタンパク質および１４．８３±４．３６ｎｍｏｌ／ｍｇミトコンドリアタンパク質であった（図４Ｄ）。
以前に説明されたように、クラーク型電極を使用して、ミトコンドリア呼吸を評価した（Ｍａｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０４：Ｈ９６６−Ｈ９８２，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００８８３．２０１２，２０１３；ＭｃＣｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９６：Ｈ９４−Ｈ１０５，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００５６７．２００８，２００９）。ミトコンドリア酸素消費速度は、骨格筋において１７８±１７ｎＭ Ｏ２／分／ｍｇミトコンドリアタンパク質、および肝臓調製物において１７６±２３ｎＭ Ｏ２／分／ｍｇミトコンドリアタンパク質であった。呼吸調節率（ＲＣＩ）値は、骨格筋および肝臓試料調製物においてそれぞれ２．４５±０．３４および２．６７±０．１７であった（図４Ｅ）。これらの結果は、ミトコンドリアを単離するために手作業の均質化および分別遠心分離を使用した以前の研究において報告されたものに類似している（Ｍａｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０４：Ｈ９６６−Ｈ９８２，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００８８３．２０１２，２０１３；ＭｃＣｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９６：Ｈ９４−Ｈ１０５，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００５６７．２００８，２００９）。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて、説明してきたが、上記説明は本発明を例示することを意図し、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定する意図はないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内である。
本発明をその詳細な説明と併せて、説明してきたが、上記説明は本発明を例示することを意図し、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定する意図はないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内である。
Claims (20)
- 生存ミトコンドリアを単離するための方法であって、
生存ミトコンドリアを含む細胞ホモジネートを提供することと；
遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１および第２の端部とを備え、各端部は開口を備える、管状本体と、
前記ルーメン内に配置および固定される第１のフィルタであって、約３０μｍから約５０μｍの細孔サイズを有するフィルタと；
前記ルーメン内に前記第１のフィルタに隣接して配置および固定され、約５μｍから約２０μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタと
を備える濾過装置を提供することと；
前記細胞ホモジネートが、前記第１のフィルタ、続いて前記第２のフィルタに接触して、それらを通して濾過され、それにより濾液を形成するように、前記細胞ホモジネートを前記第１の端部の前記開口内に導入することと；
前記濾液を収集し、それにより前記生存ミトコンドリアを単離することと
を含む、上記方法。 - 前記濾過装置は、前記ルーメン内の前記第１のフィルタと前記第２のフィルタとの間に配置および固定され、約１５μｍから約５０μｍの細孔サイズを有する第３のフィルタを備える、請求項１に記載の方法。
- ３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含む溶液中で組織を均質化し、それにより前記細胞ホモジネートを提供することを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記細胞ホモジネートを導入する前に、３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含む溶液１ｍＬ中の１ｍｇのＢＳＡを含む溶液で、前記第２のフィルタを湿潤させることを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記濾液を収集する前に、前記装置を１×ｇで３分間遠心分離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記濾液は、４℃で５分間９０００ｒｐｍで遠心分離される、請求項１に記載の方法。
- 前記細胞ホモジネートは、無菌ガラス粉砕容器内で組織を均質化することにより提供される、請求項１に記載の方法。
- 遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１および第２の端部とを備え、各端部は開口を備える、管状本体と、
前記ルーメン内に配置および固定される第１のフィルタであって、約３０μｍから約５０μｍの細孔サイズを有するフィルタと；
前記ルーメン内に前記第１のフィルタに隣接して配置および固定され、約５μｍから約２０μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタと
を備える濾過装置。 - 前記ルーメン内に前記第１のフィルタおよび前記第２のフィルタに隣接して配置および固定され、約１５μｍから約５０μｍの細孔サイズを有する第３のフィルタを備える、請求項８に記載の装置。
- 無菌である、請求項８に記載の装置。
- 前記第１のフィルタは、ナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、または紙を含む、請求項８に記載の装置。
- 前記第１のフィルタは、約４０μｍのサイズを有する細孔を備える、請求項８に記載の装置。
- 前記第２のフィルタは、ナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、または紙を含む、請求項８に記載の装置。
- 前記第２のフィルタは、約１０μｍのサイズを有する細孔を備える、請求項８に記載の装置。
- 前記第３のフィルタは、ナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、または紙を含む、請求項９に記載の装置。
- 前記第３のフィルタは、約２０μｍのサイズを有する細孔を備える、請求項９に記載の装置。
- 前記遠心分離管は、５０ｍＬの遠心分離管である、請求項８に記載の装置。
- 遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１および第２の端部とを備え、各端部は開口を備える、管状本体と、
前記ルーメン内に配置および固定される第１のフィルタであって、約３０μｍから約５０μｍの細孔サイズを有するフィルタと；
前記ルーメン内に前記第１のフィルタに隣接して配置および固定され、約５μｍから約２０μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタと
を備える濾過装置を備えるキット。 - ３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含む第１の溶液と；
前記第１の溶液１ｍＬ当たり２ｍｇのサブチリシンＡを含む第２の溶液と；
前記第１の溶液１ｍＬ当たり１０ｍｇのＢＳＡを含む第３の溶液と；
前記第１の溶液１ｍＬ当たり１ｍｇのＢＳＡを含む第４の溶液と；
５０ｍＬの遠心分離管と；
１．５ｍＬの微小遠心分離管と
をさらに備える、請求項１８に記載のキット。 - 前記５０ｍＬの遠心分離管および前記１．５ｍＬの微小遠心分離管は、無菌である、請求項１９に記載のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2023195719A JP2024026111A (ja) | 2014-06-13 | 2023-11-17 | ミトコンドリアを単離するための製品および方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201462012045P | 2014-06-13 | 2014-06-13 | |
| US62/012,045 | 2014-06-13 | ||
| JP2017517221A JP6779866B2 (ja) | 2014-06-13 | 2015-06-12 | ミトコンドリアを単離するための製品および方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017517221A Division JP6779866B2 (ja) | 2014-06-13 | 2015-06-12 | ミトコンドリアを単離するための製品および方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023195719A Division JP2024026111A (ja) | 2014-06-13 | 2023-11-17 | ミトコンドリアを単離するための製品および方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021013380A true JP2021013380A (ja) | 2021-02-12 |
| JP2021013380A5 JP2021013380A5 (ja) | 2021-03-25 |
| JP7389733B2 JP7389733B2 (ja) | 2023-11-30 |
Family
ID=53499081
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017517221A Active JP6779866B2 (ja) | 2014-06-13 | 2015-06-12 | ミトコンドリアを単離するための製品および方法 |
| JP2020173126A Active JP7389733B2 (ja) | 2014-06-13 | 2020-10-14 | ミトコンドリアを単離するための製品および方法 |
| JP2023195719A Pending JP2024026111A (ja) | 2014-06-13 | 2023-11-17 | ミトコンドリアを単離するための製品および方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017517221A Active JP6779866B2 (ja) | 2014-06-13 | 2015-06-12 | ミトコンドリアを単離するための製品および方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023195719A Pending JP2024026111A (ja) | 2014-06-13 | 2023-11-17 | ミトコンドリアを単離するための製品および方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11491480B2 (ja) |
| EP (1) | EP3154694A1 (ja) |
| JP (3) | JP6779866B2 (ja) |
| CN (1) | CN106536056B (ja) |
| AU (3) | AU2015274367B2 (ja) |
| CA (1) | CA2952121A1 (ja) |
| WO (1) | WO2015192020A1 (ja) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11491480B2 (en) | 2014-06-13 | 2022-11-08 | Children's Medical Center Corporation | Products and methods to isolate mitochondria |
| US20170151287A1 (en) | 2015-11-30 | 2017-06-01 | Flagship Ventures Management, Inc. | Methods and compositions of chondrisomes |
| WO2017124037A1 (en) | 2016-01-15 | 2017-07-20 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic use of mitochondria and combined mitochondrial agents |
| CA3037284A1 (en) | 2016-09-19 | 2018-03-22 | Mitogenetics, Llc | Materials and methods for producing and using mitochondrial preparations |
| WO2018058026A1 (en) | 2016-09-26 | 2018-03-29 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Mitochondrial epigenetic reprogramming and transplant |
| WO2019181106A1 (ja) * | 2018-03-19 | 2019-09-26 | 株式会社村田製作所 | 濾過装置 |
| US20210238534A1 (en) | 2018-05-08 | 2021-08-05 | Children`S Medical Center Corporation | Automated Isolation of Viable Mitochondria |
| WO2020008805A1 (ja) * | 2018-07-05 | 2020-01-09 | 富士フイルム株式会社 | 細胞分割装置 |
| CN109321512A (zh) * | 2018-11-19 | 2019-02-12 | 山东省农作物种质资源中心 | 一种利用分级孔筛富集植物线粒体的方法 |
| CN109550529A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-04-02 | 苏州康容生物医疗科技有限公司 | 一种分段式过滤加样尖 |
| US20220145330A1 (en) | 2019-02-10 | 2022-05-12 | The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads | Modified mitochondrion and methods of use thereof |
| EP3935161A4 (en) * | 2019-03-08 | 2023-02-15 | Synvitrobio, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR ACELLULAR BIOLOGICAL REACTIONS |
| WO2020227682A1 (en) * | 2019-05-08 | 2020-11-12 | Children's Medical Center Corporation | Treating cancer |
| CN110791475B (zh) * | 2019-11-26 | 2021-07-20 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 骨骼肌组织线粒体的提取方法 |
| AU2021246112A1 (en) | 2020-04-03 | 2022-11-10 | Cellvie Inc. | Enhancement of adoptive cell transfer |
| IT202000007180A1 (it) * | 2020-04-03 | 2021-10-03 | Tecniplast Spa | Dispositivo di screening microbiologico, in particolare per la raccolta e concentrazione di materiale organico e inorganico presente in un liquido, e apparecchiatura per l’allevamento di specie animali acquatiche da laboratorio equipaggiata con detto dispositivo |
| DE102020216578B4 (de) | 2020-12-28 | 2023-02-09 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eingetragener Verein | Vorrichtung und Verfahren zur Separation von unterschiedlich großen Partikeln in einer Flüssigkeit und Verwendungen der Vorrichtung |
| CA3233989A1 (en) | 2021-10-06 | 2023-04-13 | Nina DUMAUTHIOZ | Enhancing adoptive cell transfer by promoting a superior population of adaptive immune cells |
| CN114958719A (zh) * | 2022-05-29 | 2022-08-30 | 上海市第十人民医院 | 一种从组织中快速提取高浓度线粒体的方法 |
| WO2023237789A1 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Cellvie Ag | Composition and method for cryopreservation of mitochondria |
| WO2023237788A1 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Cellvie Ag | Mitochondria as a targeted delivery platform |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2854143A (en) * | 1957-02-13 | 1958-09-30 | Ohio Commw Eng Co | Centrifugal stratifier with plural filter means |
Family Cites Families (96)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2561043A (en) | 1946-07-12 | 1951-07-17 | Agrashell Inc | Apparatus for grinding combustible materials |
| US3826255A (en) | 1972-06-22 | 1974-07-30 | Hudson Oxygen Therapy Sales Co | Intermittent positive pressure breathing manifold |
| YU41046B (en) | 1974-08-22 | 1986-10-31 | Schering Ag | Medicine inholating device |
| US4279890A (en) | 1975-10-08 | 1981-07-21 | Chattem, Inc. | Cosmetic facial powder containing walnut shell flour |
| US4268460A (en) | 1977-12-12 | 1981-05-19 | Warner-Lambert Company | Nebulizer |
| US4253468A (en) | 1978-08-14 | 1981-03-03 | Steven Lehmbeck | Nebulizer attachment |
| DE3151275C2 (de) | 1981-12-24 | 1986-07-10 | SKF GmbH, 8720 Schweinfurt | Befestigungsvorrichtung für Werkzeuge |
| US4649911A (en) | 1983-09-08 | 1987-03-17 | Baylor College Of Medicine | Small particle aerosol generator for treatment of respiratory disease including the lungs |
| JPH087215B2 (ja) | 1987-08-24 | 1996-01-29 | シュティフツング・フュア・ディアグノスティッシュ・フォルシュンク | 抗原および／又は抗体の検出方法および検出用の試験キット |
| DE4038076A1 (de) | 1990-11-29 | 1992-06-04 | Stockhausen Chem Fab Gmbh | Abrasivum in kosmetischen produkten und verfahren zur herstellung und verwendung desselben |
| DE4143639C2 (de) * | 1991-12-02 | 2002-10-24 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren |
| US5858784A (en) | 1991-12-17 | 1999-01-12 | The Regents Of The University Of California | Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery |
| US6867197B1 (en) | 1995-03-30 | 2005-03-15 | Mitokor | Method of targeting conjugate molecules to mitochondria |
| CN1187196A (zh) | 1995-06-08 | 1998-07-08 | 普罗金工业有限公司 | 用于提取dna的方法和装置 |
| US6693086B1 (en) | 1998-06-25 | 2004-02-17 | National Jewish Medical And Research Center | Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes |
| US20080275005A1 (en) | 1998-11-25 | 2008-11-06 | Murphy Michael P | Mitochondrially targeted antioxidants |
| CN1133568C (zh) | 1999-01-18 | 2004-01-07 | 地球制药株式会社 | 气溶胶扩散喷雾器 |
| US7097832B1 (en) | 1999-03-30 | 2006-08-29 | Myocardial Therapeutics, Inc. | Intramyocardial injection of autologous bone marrow |
| US6562864B1 (en) | 1999-09-02 | 2003-05-13 | Drake Larson | Catechin multimers as therapeutic drug delivery agents |
| US6562563B1 (en) | 1999-11-03 | 2003-05-13 | Mitokor | Compositions and mehtods for determining interactions of mitochondrial components, and for identifying agents that alter such interactions |
| EP1416986A4 (en) | 2001-06-29 | 2005-12-14 | Becton Dickinson Co | INTRADERMIC DISTRIBUTION OF VACCINES AND GENE THERAPEUTIC AGENTS VIA MICROCANNULE |
| WO2003012050A2 (en) | 2001-07-31 | 2003-02-13 | Northeastern University | Mitochondrial genome replenishment |
| US6777227B2 (en) | 2002-01-09 | 2004-08-17 | John L. Ricci | Bio-reactor and cell culture surface with microgeometric surfaces |
| AU2003233428B2 (en) | 2002-04-01 | 2008-07-31 | The University Of Texas Medical Branch | Treatment of lung disorder |
| US20030199464A1 (en) | 2002-04-23 | 2003-10-23 | Silviu Itescu | Regeneration of endogenous myocardial tissue by induction of neovascularization |
| ATE485031T1 (de) | 2002-06-28 | 2010-11-15 | Protiva Biotherapeutics Inc | Verfahren und vorrichtung zur herstellung von liposomen |
| US7125434B2 (en) | 2002-12-19 | 2006-10-24 | Millipore Corporation | Deep gradient-density filter device |
| CN104225574B (zh) | 2003-02-04 | 2017-01-11 | 科内尔研究基金会 | 用于防止线粒体通透性改变的方法 |
| CA2521217C (en) | 2003-04-01 | 2013-05-14 | United States Of America Department Of Veteran's Affairs | Stem-cell, precursor cell, or target cell-based treatment of multi-organ failure and renal dysfunction |
| CN1832763A (zh) | 2003-06-05 | 2006-09-13 | 森特利昂公司 | 编码纤维母细胞生长因子的质粒用于治疗与高胆固醇血症或糖尿病相关的血管生成缺陷 |
| EP2567693B1 (en) | 2003-07-16 | 2015-10-21 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Lipid encapsulated interfering RNA |
| US8616195B2 (en) | 2003-07-18 | 2013-12-31 | Novartis Ag | Nebuliser for the production of aerosolized medication |
| NZ592917A (en) | 2003-09-15 | 2012-12-21 | Protiva Biotherapeutics Inc | Stable polyethyleneglycol (PEG) dialkyloxypropyl (DAA) lipid conjugates |
| WO2006054296A2 (en) | 2004-11-17 | 2006-05-26 | Spectrum Dynamics Llc | Methods of detecting prostate cancer |
| EP1742958B1 (en) | 2004-03-15 | 2017-05-17 | City of Hope | Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna |
| WO2005095230A1 (en) | 2004-03-29 | 2005-10-13 | The Procter & Gamble Company | Aerosol |
| WO2005103229A2 (en) | 2004-04-15 | 2005-11-03 | Regents Of The University Of Minnesota | Transgenomic mitochondria, transmitochondrial cells and organisms, and methods of making and using |
| US7745651B2 (en) | 2004-06-07 | 2010-06-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods of use |
| US7799565B2 (en) | 2004-06-07 | 2010-09-21 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Lipid encapsulated interfering RNA |
| JP2008512350A (ja) | 2004-07-01 | 2008-04-24 | イェール ユニバーシティ | 標的化され、そして高密度で薬物が負荷されるポリマー性物質 |
| WO2006059329A1 (en) | 2004-12-01 | 2006-06-08 | Hadasit Medical Research Services & Development Limited | Platelet-derived microparticles for therapy |
| AU2006206187B2 (en) | 2005-01-24 | 2011-03-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Fc-fusion constructs binding to phosphatidylserine and their therapeutic use |
| US7431222B2 (en) | 2005-06-03 | 2008-10-07 | Monterrosa Christopher H | Aerosol spray masking device |
| US20070015777A1 (en) | 2005-07-14 | 2007-01-18 | Myogen, Inc. | Use of Inhibitors of the Ubiquitin Proteasome Pathway as a Method of Increasing Contractility of the Heart |
| WO2007048046A2 (en) | 2005-10-20 | 2007-04-26 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Sirna silencing of filovirus gene expression |
| US8101741B2 (en) | 2005-11-02 | 2012-01-24 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Modified siRNA molecules and uses thereof |
| DE102005054628A1 (de) | 2005-11-16 | 2007-05-24 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Verfahren zur Herstellung von permanenten humanen Zelllinien |
| US7915399B2 (en) | 2006-06-09 | 2011-03-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Modified siRNA molecules and uses thereof |
| WO2008021484A2 (en) | 2006-08-16 | 2008-02-21 | Eutropics Pharmaceuticals | Assay system to identify therapeutic agents |
| US7923984B2 (en) | 2007-01-19 | 2011-04-12 | The Regents Of The University Of Michigan | Universal, wireless, nano-optical voltmeters |
| EP2641617A1 (en) * | 2007-05-02 | 2013-09-25 | THE McLEAN HOSPITAL CORPORATION | Methods and compositions for mitochondrial replacement therapy |
| IL183818A0 (en) | 2007-06-10 | 2007-10-31 | Shimon Harpaz | Uniformly abrasive confectionery product and process therefor |
| US20090202606A1 (en) | 2008-01-25 | 2009-08-13 | Viromed Co., Ltd. | Treatment and Prevention of Cardiac Conditions Using Two or More Isoforms of Hepatocyte Growth Factor |
| PT2300614E (pt) | 2008-02-04 | 2016-03-02 | Yissum Res Dev Co | Métodos e composições para tratamento de distúrbios mitocondriais |
| WO2009127060A1 (en) | 2008-04-15 | 2009-10-22 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Novel lipid formulations for nucleic acid delivery |
| WO2010075116A2 (en) * | 2008-12-15 | 2010-07-01 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid purification apparatus and method |
| CA3151965A1 (en) | 2008-12-18 | 2010-07-15 | Dicerna Pharmaceuticals, Inc. | Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression |
| US20100249214A1 (en) | 2009-02-11 | 2010-09-30 | Dicerna Pharmaceuticals | Multiplex dicer substrate rna interference molecules having joining sequences |
| JP5612279B2 (ja) | 2009-06-26 | 2014-10-22 | 日本合成化学工業株式会社 | 心筋梗塞非ヒト動物モデル及びその作製方法 |
| CA2767127A1 (en) | 2009-07-01 | 2011-01-06 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors |
| CA2767129C (en) | 2009-07-01 | 2015-01-06 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing apolipoprotein b |
| WO2011019807A2 (en) | 2009-08-11 | 2011-02-17 | The Johns Hopkins University | Measurement of mitochondrial membrane potential to assess organ dysfunction |
| CN101693884B (zh) | 2009-10-21 | 2012-05-23 | 宁夏中联达生物有限公司 | 一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法 |
| EP2516320A4 (en) * | 2009-12-23 | 2015-03-04 | Cytovera Inc | PARTICULATE FILTERING SYSTEM AND METHOD |
| US8527209B2 (en) | 2010-06-24 | 2013-09-03 | The Invention Science Fund I, Llc | Rejuvenation or preservation of germ cells |
| US8658614B2 (en) | 2010-08-13 | 2014-02-25 | The University of Texas Health Science Center | Aptamer-containing compositions and methods for targeting E-selectin |
| US8338178B2 (en) | 2010-10-28 | 2012-12-25 | The Invention Science Fund I, Llc | Mitochondrial enhancement of cells |
| WO2012085833A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Nebulizer device |
| US20130022666A1 (en) | 2011-07-20 | 2013-01-24 | Anna Brzezinska | Methods and compositions for transfer of mitochondria into mammalian cells |
| WO2013035101A1 (en) | 2011-09-11 | 2013-03-14 | Minovia Therapeutics Ltd. | Compositions of functional mitochondria and uses thereof |
| US8648034B2 (en) | 2011-12-09 | 2014-02-11 | Changhua Christian Hospital | Method and applications of peptide-mediated mitochondrial delivery system |
| US8927268B2 (en) * | 2012-02-17 | 2015-01-06 | Invent Biotechnologies, Inc. | Rapid membrane isolation method for animal and plant samples |
| WO2013171752A1 (en) | 2012-05-16 | 2013-11-21 | Minovia Therapeutics Ltd. | Compositions and methods for inducing angiogenesis |
| LT3401400T (lt) | 2012-05-25 | 2019-06-10 | The Regents Of The University Of California | Būdai ir kompozicijos, skirtos rnr molekulės nukreipiamai tikslinės dnr modifikacijai ir rnr molekulės nukreipiamam transkripcijos moduliavimui |
| HUE033757T2 (en) | 2012-07-12 | 2017-12-28 | Khondrion Ip B V | Chromanil derivatives for the treatment of mitochondrial disease |
| US8895312B2 (en) | 2012-08-20 | 2014-11-25 | The Regents Of The University Of California | Nanofluidic platform for single mitochondria analysis |
| US20140106004A1 (en) | 2012-10-12 | 2014-04-17 | Bing Lou Wong | Hemoglobin-based oxygen carrier-containing pharmaceutical composition for cancer targeting treatment and prevention of cancer recurrence |
| DE202013012597U1 (de) | 2012-10-23 | 2017-11-21 | Toolgen, Inc. | Zusammensetzung zum Spalten einer Ziel-DNA, umfassend eine für die Ziel-DNA spezifische guide-RNA und eine Cas-Protein-codierende Nukleinsäure oder ein Cas-Protein, sowie deren Verwendung |
| EP4234696A3 (en) | 2012-12-12 | 2023-09-06 | The Broad Institute Inc. | Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
| PT2921557T (pt) | 2012-12-12 | 2016-10-19 | Massachusetts Inst Technology | Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências |
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| WO2014093694A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes |
| ES2576128T3 (es) | 2012-12-12 | 2016-07-05 | The Broad Institute, Inc. | Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias con dominios funcionales |
| DK2898075T3 (en) | 2012-12-12 | 2016-06-27 | Broad Inst Inc | CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF IMPROVED SYSTEMS, PROCEDURES AND ENZYME COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION |
| WO2014113638A1 (en) | 2013-01-17 | 2014-07-24 | Aer Devices, Inc. | Multi-use albuterol maintenance therapy formulations and devices therefor |
| US9421222B2 (en) | 2013-04-15 | 2016-08-23 | London Health Sciences Centre Research Inc. | Treatment of compartment syndrome |
| US9781909B2 (en) | 2013-07-17 | 2017-10-10 | University Of Manitoba | Mito-Ob: a transgenic mouse model for obesity |
| US10017566B2 (en) | 2013-11-12 | 2018-07-10 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Growth differentiation factor (GDF) for treatment of diastolic heart failure |
| US11491480B2 (en) | 2014-06-13 | 2022-11-08 | Children's Medical Center Corporation | Products and methods to isolate mitochondria |
| US20170290763A1 (en) | 2014-09-30 | 2017-10-12 | Taiwan Mitochondrion Applied Technology Co., Ltd. | Composition with exogenous mitochondria as active ingredients and use thereof and cell repairing method therefor |
| JP7015169B2 (ja) | 2015-02-26 | 2022-02-02 | ミノヴィア セラピューティクス リミテッド | 機能性ミトコンドリアで富化された哺乳動物細胞 |
| US9790490B2 (en) | 2015-06-18 | 2017-10-17 | The Broad Institute Inc. | CRISPR enzymes and systems |
| US20170151287A1 (en) | 2015-11-30 | 2017-06-01 | Flagship Ventures Management, Inc. | Methods and compositions of chondrisomes |
| WO2017124037A1 (en) | 2016-01-15 | 2017-07-20 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic use of mitochondria and combined mitochondrial agents |
| WO2018092839A1 (ja) | 2016-11-16 | 2018-05-24 | 国立大学法人北海道大学 | 心不全の治療及び／又は予防に用いるための心筋幹細胞の製造方法 |
| EP3923963A4 (en) | 2019-02-15 | 2022-11-23 | Children's Medical Center Corporation | TREATMENT OF HEART FAILURE |
-
2015
- 2015-06-12 US US15/318,557 patent/US11491480B2/en active Active
- 2015-06-12 CN CN201580039651.4A patent/CN106536056B/zh active Active
- 2015-06-12 CA CA2952121A patent/CA2952121A1/en active Pending
- 2015-06-12 AU AU2015274367A patent/AU2015274367B2/en active Active
- 2015-06-12 WO PCT/US2015/035584 patent/WO2015192020A1/en active Application Filing
- 2015-06-12 EP EP15733576.1A patent/EP3154694A1/en active Pending
- 2015-06-12 JP JP2017517221A patent/JP6779866B2/ja active Active
-
2020
- 2020-10-14 JP JP2020173126A patent/JP7389733B2/ja active Active
-
2021
- 2021-02-25 AU AU2021201217A patent/AU2021201217A1/en not_active Abandoned
-
2022
- 2022-10-05 US US17/960,655 patent/US20230219081A1/en active Pending
-
2023
- 2023-02-01 AU AU2023200521A patent/AU2023200521A1/en active Pending
- 2023-11-17 JP JP2023195719A patent/JP2024026111A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2854143A (en) * | 1957-02-13 | 1958-09-30 | Ohio Commw Eng Co | Centrifugal stratifier with plural filter means |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CELL BIOLOGY(THIRD EDITION) A LABORATORY HANDBOOK, vol. 2006, Vol.2, JPN6019009544, pages 69 - 77, ISSN: 0004910106 * |
| FREE RADICAL BIOLOGY & MEDICINE, vol. 2007, Vol.42, JPN6019009543, pages 1039 - 1048, ISSN: 0004910107 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2015274367A1 (en) | 2017-01-12 |
| JP2017518767A (ja) | 2017-07-13 |
| AU2023200521A1 (en) | 2023-03-02 |
| US11491480B2 (en) | 2022-11-08 |
| AU2015274367B2 (en) | 2020-11-26 |
| AU2021201217A1 (en) | 2021-03-11 |
| US20230219081A1 (en) | 2023-07-13 |
| CA2952121A1 (en) | 2015-12-17 |
| US20170120237A1 (en) | 2017-05-04 |
| CN106536056A (zh) | 2017-03-22 |
| WO2015192020A1 (en) | 2015-12-17 |
| CN106536056B (zh) | 2021-07-16 |
| JP2024026111A (ja) | 2024-02-28 |
| JP6779866B2 (ja) | 2020-11-04 |
| EP3154694A1 (en) | 2017-04-19 |
| JP7389733B2 (ja) | 2023-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6779866B2 (ja) | ミトコンドリアを単離するための製品および方法 | |
| Trovato et al. | A new medical device rigeneracons allows to obtain viable micro‐grafts from mechanical disaggregation of human tissues | |
| JP6854471B2 (ja) | 神経細胞の密集体 | |
| Williams et al. | Three molecular steps of aminoglycoside ototoxicity demonstrated in outer hair cells | |
| Hongo et al. | The effect of a p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor on cellular senescence of cultivated human corneal endothelial cells | |
| Haseleu et al. | Studying subcellular detail in fixed astrocytes: dissociation of morphologically intact glial cells (DIMIGs) | |
| ES2842084T3 (es) | Diagnóstico por espectrometría de masas de septicemia sin hemocultivo | |
| JP2014502847A (ja) | 腫瘍細胞及び組織培養 | |
| BR112012030678B1 (pt) | Método para purificação de células-tronco da geleia de wharton e método de cultivo de células-tronco mesenquimais | |
| Helms et al. | Generation of primary cultures of bovine brain endothelial cells and setup of cocultures with rat astrocytes | |
| US20230184744A1 (en) | INTERTUMORAL HOMOGENEITY DETERMINED BY MiCK ASSAY | |
| JP6893645B6 (ja) | 細胞の膜電位／膜電流の測定方法 | |
| Banerjee et al. | Autophagy in platelets | |
| Dungan et al. | The life and times of cellular senescence in skeletal muscle: friend or foe for homeostasis and adaptation? | |
| TWI662130B (zh) | 分離循環癌細胞之方法 | |
| Choi et al. | Assaying microtubule nucleation by the γ-tubulin ring complex | |
| López-Marqués et al. | Imaging of lipid uptake in Arabidopsis seedlings utilizing fluorescent lipids and confocal microscopy | |
| Perez et al. | Tau assembly into filaments | |
| Klose et al. | Impact of heart failure on the behavior of human neonatal stem cells in vitro | |
| RU2464563C1 (ru) | Способ выделения микровезикул эритроцитов | |
| US20150219619A1 (en) | Methods of and assay products for, determining the predisposition of a subject to disease states characterised by free radical induced dna damage | |
| Korvala et al. | Check for updates Chapter 15 Purification of Bacterial-Enriched Extracellular Vesicle Samples from Feces by Density Gradient Ultracentrifugation Nadiya Byts, Olha Makieieva, Artem Zhyvolozhnyi, Genevieve Bart | |
| Gopalakrishnan et al. | Comprehensive protocols for culturing and molecular biological analysis of IBD patient-derived colon epithelial organoids | |
| Subedi et al. | Isolation of Proteins from Extracellular Vesicles (EVs) for Mass Spectrometry-Based Proteomic Analyses | |
| WO2019091034A1 (zh) | 一种提取动物组织线粒体的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201112 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20201112 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210107 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211222 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220322 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220520 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220622 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221101 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230131 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230330 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230427 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230712 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231012 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20231020 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231117 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7389733 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |